CN1445243A - 抗人巨细胞病毒人源中和性基因工程Fab抗体 - Google Patents

Abstract

抗人巨细胞病毒人源中和性基因工程Fab抗体，命名HCMV－Fab－2、HCMV－Fab－6，包括Fab段、基因产物及其应用。其主要特征在于此重组抗体是由存在于抗体轻链和重链基因可变区中的高变区(CDRs)特异性基因序列决定的并在原核和真核细胞中获得有效表达的特异性结合HCMV的功能性中和抗体。其今后的可能用途在于利用此中和抗体CDR区或部分或全基因，可在原核、酵母、昆虫和真核细胞及任何表达系统中生产此抗体，可在临床上预防或治疗HCMV感染相关疾病。

Description

抗人巨细胞病毒人源中和性基因工程Fab抗体

本发明涉及预防和治疗用人源基因工程单克隆抗体的制备及应用，尤其是特异性针对人巨细胞病毒的中和性基因工程单克隆抗体。

自1975年B淋巴细胞杂交瘤细胞融合技术问世以来，单克隆抗体作为一类用于基础研究、实验室诊断、临床治疗和预防的新型产物，其运用价值和开发前景已获得普遍的肯定。分子生物学和分子免疫学的研究发展导致了基因工程抗体的产生和发展，通过抗体分子基因水平的重组可获得多种多样的特异性鼠源及人源抗体，使对单克隆抗体的研究有了突破性进展并越来越显示出其重要意义及实际运用前景。80年代末90年代初噬菌体抗体基因库技术的兴起和整个基因工程抗体技术研究领域的发展，使当今世界人源或基因工程抗体的开发研究取得很大进展并已由基础研究阶段步入实质性应用研究和开发阶段。目前美国FDA批准上市或待批的生物制品中，各种形式的单克隆抗体和基因工程抗体占到一定比例，目前已批准上市的67种生物制品中，治疗和预防用单克隆抗体和基因工程抗体共有9种。正在待批中的抗体有54种。其中已批准上市并且产生巨大经济和社会效益的四种人源化基因工程抗体中，其中有一种即为抗病毒基区工程抗体，其商品名为“SynagisTM″，为人源化抗呼吸道合病毒(RSV)基因工程抗体，而来源于噬菌体抗体库筛选的人源抗RSV病毒基因工程抗体已被批准进入II期临床，另一种抗病毒抗体抗乙型肝炎表面抗原抗体也在审批之中。

至今为止，大多数病毒性疾病无特异性治疗药物。人巨细胞病毒感染在人群中发生率很高，约为40-90％。先天性人巨细胞病毒感染率约为1％，且往往伴有比较严重的后果，如儿童智力发育迟滞和听力损伤。人巨细胞病毒也可通过血制品和器官移植传播。在器官移植者中，人巨细胞病毒感染可降低移植的成功率。近年的流行病学调查结果显示，人巨细胞病毒感染可影响HIV感染的进展。对人巨细胞病毒感染主要使用抗病毒制剂控制，但主要问题是药物副作用较大。许多证据表明体液免疫在控制人巨细胞病毒感染方面具有重要作用，如给患者静脉输注免疫球蛋白，这一方法在许多器官移植中心已成为对接受移植者术后采取的常规措施之一。而目前使用人源基因工程产品替代血制品已成为国内外研究的一大方向，并正在逐步走向成功。我们通过噬菌体抗体库技术获得人源基因工程抗体，验证其是否可作为替代免疫球蛋白作为控制器官移植者术后HCMV感染的常规措施，为临床应用奠定坚实的基础。用纯鼠源单克隆抗体预防和治疗病毒性疾病在国际上尚无任何批准的先例，鼠源抗体人用最大的不利之处为异源蛋白，在人体内易引起遗传免疫排斥而使抗体失效并引起免疫性疾病。因此，特异性抗病毒人源中和性抗体是病毒性疾病预防和治疗的最有前景的生物制品之一。人源抗病毒基因工程抗体的研究除已成功的抗RSV抗体外，通过噬菌体表面呈现系统，基因工程抗体库技术和分子生物学手段的联合运用，这一领域的研究已取得重大进展。目前已研制成功的人源抗病毒全抗体有抗以下病毒的抗体：呼吸道合胞病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙肝病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、汉坦病毒、流行性感冒病毒等。人源抗人巨细胞病毒基因工程抗体制剂的研制成功，将为国内外首创，有可能获一类新药证书。

本发明的目的是通过基因工程手段和噬菌体表面表达技术结合运用，直接从人抗体基因库中筛选出有中和活性的抗人巨细胞病毒基因工程单克隆抗体，获得其抗体基因，为将来可能的临床抗病毒预防和治疗提供可行性的特异性抗体药物。

本发明陈述的抗人巨细胞病毒人源中和性基因工程Fab抗体包括：1、抗人巨细胞病毒人源中和性基因工程Fab抗体HCMV-Fab-2、HCMV-Fab-6，包括Fab抗体基因、基因产物及其应用。其主要特征在于此重组抗体是由存在于抗体轻链和重链基因可变区中的高变区(CDRs)特异性基因序列决定的并在原核和真核细胞中获得有效表达的特异性结合人巨细胞病毒的功能性中和抗体。2、抗人巨细胞病毒人源中和性基因工程Fab抗体HCMV-Fab-2、HCMV-Fab-6，其主要特征在于：抗体蛋白功能由存在于抗体基因轻链和重链可变区的决定族互补区域CDR1、CDR2和CDR3中特异性核苷酸序列决定的，其相应的氨基酸序列构成了抗体的特异性抗原结合区域，是抗人巨细胞病毒人源中和性基因工程Fab抗体可变区核苷酸和氨基酸序列。3、抗人巨细胞病毒人源中和性基因工程Fab抗体HCMV-Fab-2、HCMV-Fab-6，其主要基因特征在于：特异性的轻链和重链可变区基因来源于对人源抗人巨细胞病毒抗体基因库的特异性富积筛选表达，其轻链(VL)和重链各自相应的三个CDR区序列为本抗体特有的全新序列。重链(VH)三个CDR区的氨基酸序列包括：CDR1为GYALS；CDR2为GIIPIVGLTNYAQRFAG；CDR3为TGGPRALTGIDAFDI。轻链(VL)三个CDR区的氨基酸序列包括：HCMV-Fab-2：CDR1为RASQHIGTYLN；CDR2为GASTLOG；CDR3为QQSSEPPYT。HCMV-Fab-6：CDR1为RSSQSLVGSDGNIYLS；CDR2为KVSNRDS；CDR3为MQDVHWPPT；4、抗人巨细胞病毒人源中和性基因工程Fab抗体HCMV-Fab-2、HCMV-Fab-6，其特征在于：为一种在原核细胞中获得稳定有效表达的基因重组的人源抗人巨细胞病毒中和性基因工程单克隆抗体Fab抗体，由重链Fd段和Kappa链组成。5、抗人巨细胞病毒人源中和性基因工程Fab抗体HCMV-Fab-2、HCMV-Fab-6，其主要功能特征在于：特异性识别人巨细胞病毒，具有抗人巨细胞病毒感染的中和活性。6、抗人巨细胞病毒人源中和性基因工程Fab抗体HCMV-Fab-2、HCMV-Fab-6，其特征在于：利用上述获得的中和性抗体可变区，Fab或全抗体基因，可以在原核细胞、酵母细胞、真核细胞及任何重组病毒系统中表达和生产此抗体基因或以此为基础的改建后的含有此抗体基因任何其他基因，获得具有中和人巨细胞病毒感染的抗体产物，其基因表达产物可望在临床上用于预防和治疗由人巨细胞病毒感染引起的疾病。7、抗人巨细胞病毒人源中和性基因工程Fab抗体HCMV-Fab-2、HCMV-Fab-6，其特征在于：根据发表的抗人巨细胞病毒中和抗体HCMV-Fab-2、HCMV-Fab-6的可变区中的CDR区特异性核苷酸或氨基酸序列，可在体外人工合成与此相同的抗体轻重链6个CDR区的核苷酸序列或编码相同氨基酸的核苷酸序列，从而获得相同的抗体基因或用于相关基因的改造，而获得抗人巨细胞病毒的中和抗体或相关蛋白或多肽产物。

传统的利用杂交瘤细胞技术获得人源单克隆抗体相当困难，而且建立的细胞系通常不稳定，基因易丢失。本发明陈述的人源抗人巨细胞病毒中和性基因工程抗体，是在获得抗体基因的基础上获得基因产物的表达，此抗体基因可随着质粒DNA在细菌内的复制而稳定复制，并可根据不同需要任意改建抗体基因，从而获得一种可行性的临床预防和治疗用抗体制剂。

以下的优先实施例对本发明作详细说明，但不意味着限制本发明的内容，在这些实施例中，为说明本发明，采用噬菌体表达载体为pComb3(BarbasC，IIIetal，Proc.Natl.Acas.SciUSA1991，89：10164-10168)。所用主要菌株为商品化产品XLI-Blue(美国Strategene公司)。所用噬菌体为M13K07。人巨细胞病毒为AD169株。

实施例1-6为抗人巨细胞病毒人源中和性基因工程Fab抗体的筛选制备方法；实施例7为抗人巨细胞病毒人源中和性基因工程抗体HCMV-Fab-2、HCMV-Fab-6的基因特征；实例8-12为抗人巨细胞病毒人源中和性基因工程抗体HCMV-Fab-2、HCMV-Fab-6的蛋白及功能特征。

实例1，人源IgGFab段基因的PCR扩增：用淋巴细胞分离液从人巨细胞病毒正常感染者外周抗凝血中分离淋巴细胞，用Tril-Zon(美国Gibco，BRL)提取总细胞RNA，用Olig-HCMV-Fab引物将提取的RNA通过逆转录酶(美国Gibco，BRL)逆转录成cDNA，用一组特异性IgGFabGamma链、Kampa链及Lamda链引物，对人源轻链和重链Fab基因进行PCR扩增。PCR条件为：94℃1分钟，54℃1分钟、72℃2分钟，35个循环(PE480)，上述PCR产物分别经琼脂糖凝胶回收，经过DNA纯化柱Spin-X(美国Gibco，BRL)纯化后，获得650-700bp左右的Kamba、Lamda和Fd链PCR产物，如说明书附图1所示，是Fab抗体轻链和重链的扩增结果：1-8栏是重链Fd段扩增结果；9栏是核酸标准品DL2000；10-15栏是λ链扩增结果；16-18栏是κ链扩增结果。

实例2，噬菌体抗体基因库的建立：将不同引物合成的Kamba和Lamda链PCR产物混合，将不同引物合成的Fd链混合，分别用SacI/XbaI和XhoI/SpeI克隆入噬菌体载体pComb3，将克隆入轻，重链基因的pComb3载体DNA连接产物经乙醇沉淀后，用10ul蒸溜水悬起，电转导入事先制备好的200ul电转菌XLI-Blu，(电转条件为：Bio-Red电转仪，0.2cm电转杯，2.5K伏)，电转后加10mlSOC培养液，37℃1小时，加入10ml带有氨苄青霉素和四环素的SB培养液，37℃1小时，加入80-100ml前述SB，37℃2小时后加入辅助噬菌体M13K07(1×1012)，1小时后加入卡那霉素(70ug/ml)，37℃摇床培养过夜。用4％PEG8000和3％NaCl沉淀噬菌体上清，经9000rpm，20分钟，4℃离心后，用2ml0.02MPBSPH7.4重悬沉淀，建立噬菌体抗体库，分装保存于-20℃冰柜中。

实例3，用于抗体库富集筛选的人巨细胞病毒抗原的制备：人巨细胞病毒颗粒的纯化：所用病毒为HEL细胞培养的人巨细胞病毒AD169株上清(病毒所张素香老师惠赠)。将上清在4000rpm离心10分钟，弃去细胞碎片，然后超声裂解上清，再次4000rpm离心10分钟，将纯化的的抗原进行SDS-PAGE分析和WesternBlot鉴定，即可制成人巨细胞病毒抗原。

实例4，噬菌体抗体库的特异性富集筛选：用0.1MNaHCO3(pH8.6)的溶液包被纯化的人巨细胞病毒抗原(0.5-1μg/ml)，每孔55μl，4℃过夜；次日用1×PBST洗去未吸附的抗原，用4％的脱脂奶37℃封闭1小时，弃封闭液；每孔加入50μl噬菌体抗体库，37℃孵育2小时，弃去孔中未结合的噬菌体，用1×TBST(50mMTris-HCl，150mMNaCl，0.5％Tween20，pH7.5)洗液冲洗各孔，冲洗时，用带有吸头的移液器反复吹打，共洗10-20遍，以充分洗去未吸附的噬菌体；最后用ddH2O洗两遍，吸净孔中的液体；每孔加入50μlGly-HCl(pH2.2)的洗脱液，室温孵育10分钟。加入适量的2MTris，以中和洗脱下来的噬菌体；将洗脱的噬菌体立即加入2ml新鲜制备的XLI-Blu菌液中(OD600＝1)，室温孵育15-20分钟；然后转入250ml三角瓶中，加入SB10ml(氨苄青霉素：20μg/ml，四环素：10μg/ml)，立即取10μl涂氨苄青霉素平皿，以滴定噬菌体；三角瓶与37℃振荡培养1小时，加入100mlSB(氨苄青霉素：100μg/ml)，37℃1小时后，加入辅助噬菌体M13K07 1ml，37℃振荡培养2小时，加入卡那霉素(终浓度70μg/ml)，37℃培养过夜。如此反复筛选4-5次。

实例5，人IgGFab抗体可溶性表达产物的制备：将带有阳性抗体轻重链基因插入的阳性克隆扩增后按常规方法提取质粒DNA，用SpeI和NheI切除载体中的gIII，变FdgIII融合蛋白为独立表达的蛋白，连接后转化XL1-Blu菌，从过夜生长的氨苄碟子中挑取单个菌落，接种SB或TB细菌培养液，当细菌长至OD600＝0.2-0.3，加入1mMIPTG，在30℃诱导表达10-12小时。收获细菌，离心后加入原培养液1/10体积PBS(0.02MpH7.4)重悬，反复冻融三次，4℃10000rpm离心10分钟，上清即为表达的Fab抗体。备用于进一步的检测和鉴定。阴性对照为载体pComb3转化菌按同样方法制备的细菌裂解液。

实例6，从人巨细胞病毒免疫供体血液中分离淋巴细胞，用PCR技术扩增了人源IgGFab抗体基因，建立了噬菌体抗体基因库，用噬菌体表面呈现技术筛选并从富集筛选后获得的Fab阳性克隆中，最后选出2株阳性克隆，Fab抗体HCMV-Fab-2、HCMV-Fab-6，来源于纯化抗原的筛选。将表达的菌体细胞裂解上清同时检测其对抗人Fab抗体的结合活性及对人巨细胞病毒纯化抗原的抗原结合活性。ELISA结果表明获得2株单抗不仅被抗人IgGFab抗体所识别，同样也识别结合上述纯化人巨细胞病毒颗粒抗原，如说明书附图2所示，是通过ELISA从12株具有高抗Fab活性的克隆中筛选具有抗HCMV活性克隆的结果。

实例7，人IgGFab抗体HCMV-Fab-2、HCMV-Fab-6的可变区基因的核酸序列分析：用QiagenMiniprepKit(美国Qiagen)制备质粒DNA进行核酸序列分析。测序为自动测序。至少3个克隆被用于确定同一相同的序列。所获序列均用DNAStrider(美国微软公司)序列分析软件进行分析处理，并比较Internet网络上基因库中的IgG序列。证实人源抗人巨细胞病毒病毒中和性基因工程Fab抗体HAFab16基因由人IgGγ链Fd和k链组成，其基因特征由VH和VL结构域中的6个CDR区的特异性核甘酸序列和氨基酸构成，序列资料如说明书附图3和附图4所示，图3a是HCMV-Fab-2的轻重链核苷酸和氨基酸序列分析结果。图3b为HCMV-Fab-6的轻重链核苷酸和氨基酸序列分析结果。图4为HCMV-Fab-2、HCMV-Fab-6的轻重链氨基酸序列分析结果。

实例8，间接免疫荧光(IFA)试验检测：将HCMV接种于HF细胞，37℃培养6、24、48、72hrs后，滴加至玻璃底片上，丙酮固定15min，加入Fab表达上清，37℃温育30min，Tween/PBS冲洗，晾干，加入FITC标记的抗Fab抗体，37℃温育30min，冲洗，晾干，伊文氏蓝染色后荧光显微镜观察结果。结果显示，未受感染的HF细胞及感染6、24小时后的HF细胞未观察到荧光，感染48、72小时后的HF细胞中观察到荧光，如说明书附图5所示，是免疫荧光试验结果。图5a为荧光抗体与HCMV结合结果。图5b为荧光抗体与HF细胞结合结果。说明Fab抗体具有很高的特异性，且抗病毒抗体主要结合病毒晚期蛋白。

实例9，体外中和实验：用含10％PS的MEM将Fab抗体1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128进行倍比稀释，然后与含100TCID50的HCMV37℃水浴1hr，感染96孔板内单层HF细胞，阴性对照为抗AAV的人源Fab抗体。在37℃培养72hrs后，观察病毒感染情况。未加Fab抗体的HF细胞在48hrs后出现病变，在加入倍比稀释的Fab抗体的HF细胞组中，在1∶32稀释度前未出现病变，在此稀释度后有病变出现，说明这2株Fab抗体具有中和活性，且在1∶32稀释度以上的粗制Fab抗体可完全中和含100TCID50的病毒，说明HCMV-Fab-2、HCMV-Fab-6为具有较高亲和力的中和抗体，如说明书附图6所示，是病毒中和试验结果。图6a为加入HCMV-Fab-2结果。图6b为加入抗AAV Fab抗体结果。

Claims (7)

1、抗人巨细胞病毒人源中和性基因工程Fab抗体HCMV-Fab-2、HCMV-Fab-6，包括Fab抗体基因、基因产物及其应用。其主要特征在于此重组抗体是由存在于抗体轻链和重链基因可变区中的高变区(CDRs)特异性基因序列决定并在原核和真核细胞中获得有效表达的可特异性结合人巨细胞病毒的功能性Fab抗体。

2、抗人巨细胞病毒人源中和性基因工程Fab抗体HCMV-Fab-2、HCMV-Fab-6，其主要特征在于：抗体蛋白功能由存在于抗体基因轻链和重链可变区的决定簇互补区域(Complementarity-Determining Regions，CDRs)CDR1、CDR2和CDR3中特异性核苷酸序列决定的，其相应的氨基酸序列构成了抗体的特异性抗原结合区域。

3、抗人巨细胞病毒人源中和性基因工程Fab抗体HCMV-Fab-2、HCMV-Fab-6，其主要基因特征在于：特异性的轻链和重链可变区基因来源于对人源抗人巨细胞病毒抗体基因库的特异性富积筛选表达，其轻链(VL)和重链各自相应的三个CDR区序列为本抗体特有的全新序列。重链(VH)三个CDR区的氨基酸序列包括：CDR1为GYALS；CDR2为GIIPIVGLTNYAQRFAG；CDR3为TGGPRALTGIDAFDI。轻链(VL)三个CDR区的氨基酸序列包括：HCMV-Fab-2：CDR1为RASQHIGTYLN；CDR2为GASTLOG；CDR3为QQSSEPPYT。HCMV-Fab-6：CDR1为RSSQSLVGSDGNIYLS；CDR2为KVSNRDS；CDR3为MQDVHWPPT；抗人巨细胞病毒人源中和性基因工程Fab抗体HCMV-Fab-2、HCMV-Fab-6，其特征在于：为一种在原核细胞中获得稳定有效表达的基因重组的人源抗人巨细胞病毒中和性基因工程单克隆Fab抗体，由重链Fd和Kappa链组成。

4、抗人巨细胞病毒人源中和性基因工程Fab抗体HCMV-Fab-2、HCMV-Fab-6，其主要功能特征在于：特异性识别人巨细胞病毒，具有抗人巨细胞病毒感染的中和活性功能。

5、根据上述6条权利要求，抗人巨细胞病毒人源中和性基因工程Fab抗体的用途，其特征在于：利用上述获得的中和性Fab抗体基因，可以在原核细胞、酵母细胞、真核细胞及任何重组病毒系统中表达和生产此抗体基因或以此为基础改建后含有此抗体基因任何其他基因，获得具有中和人巨细胞病毒感染的抗体产物，其基因表达产物可望在临床上用于控制人巨细胞病毒感染。

6、根据权利要求2和3，抗人巨细胞病毒人源中和性基因工程Fab抗体基因的用途，其特征在于：根据发表的抗人巨细胞病毒中和性Fab抗体HCMV-Fab-2、HCMV-Fab-6的可变区中的CDR区特异性核苷酸或氨基酸序列，可在体外人工合成与此相同的抗体轻重链9个CDR区的核苷酸序列或编码相同氨基酸的核苷酸序列，从而获得相同的抗体基因或用于相关基因的改造，而获得抗人巨细胞病毒的中和抗体或相关蛋白或多肽产物。

7、根据权利要求2，3和5，抗人巨细胞病毒人源中和性基因工程Fab抗体基因的用途，其特征在于：根据权利要求2，3中所述的CDR区氨基酸序列为本抗体专有的抗体序列，任何新的工程抗体可变区基因或相关产物基因不应含有与上述任何两种CDR区序列完全相同或仅1-2个氨基酸差异的序列。任何新的工程抗体全抗体基因不应含有权利要求5中所述的特征。

Images