CN103588876A - 一种生产人源化抗体或抗原结合片段的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生产人源化抗体或抗原结合片段的方法。该方法包括：获得非人类生物针对某一抗原的抗体的重链可变区和轻链可变区序列；将其与人胚系抗体的氨基酸序列对比；分别选择与非人源抗体重链可变区和轻链可变区同源性最高的人胚系抗体氨基酸序列；分别构建人胚系抗体重链和轻链可变区框架的文库并组装为完整的框架组装文库；表达所述的框架区组装文库，从中筛选能够与所述的抗原结合的人源化的重链可变区和轻链可变区，制备人源化重链可变区和轻链可变区的人源化抗体或抗原结合片段。本发明避免了在抗体工程化过程中对抗体结构分析的依赖，同时能够对抗体的表达、稳定性进行筛选，能最大程度保持人源化抗体的亲和力。

Description

一种生产人源化抗体或抗原结合片段的方法

技术领域

本发明属于生物免疫领域，涉及一种生产人源化抗体或抗原结合片段的方法。

发明背景

自从杂交瘤技术^[1]建立后，人们生产并鉴定了大量鼠单克隆抗体(mAb)。其中很多被用于人类疾病的诊断，如癌症、传染性疾病、自身免疫病和其它疾病。然而，由于其能在人类患者中广泛引发人抗鼠抗体(HAMA)反应^[2]，使其在治疗上述疾病的临床应用中受到限制。高达50%的患者在服用鼠杂交瘤来源的抗体后，发生了HAMA反应^[3]，这严重危及这些抗体药物的安全性、功效和生物学半衰期。另外，鼠源抗体的恒定区也无法直接诱导人免疫效应器官产生治疗效应。期望通过人杂交瘤技术^[4]和人类疱疹病毒(EBV)介导B淋巴细胞转化^[5]来生产人用抗体的努力获得有限的成功，其广泛应用分别受到缺乏富有活力的人杂交瘤融合伴侣及EBV转化克隆不稳定性的限制^[6]。由于大量围绕非人源抗体用于人的限制探讨，多种转化非人源抗体序列进入人源抗体序列并被称为人源化的策略，被用于开发制造针对人类疾病的有效治疗试剂。

鼠源抗体人源化的两种主要方法为理论推理法(Rational method)和实验设计法(Empiricalmethod)。抗体人源化的理论推理方法特征为通过抗体结构建模、设计多种抗体突变体并评估其靶点结合力或其它功能特性。如果设计的突变体未产生所期许的结果,则开始新一轮的设计和功能评估。推理方法包括但不局限于互补决定区（CDR）移植、表面重塑和表面人源化(super-humanization)及人递呈肽段(human string content)优化等。在上述推理方法中，CDR移植是使用最广泛的方法。使用CDR移植方法生产的人源化抗体，含有被移植到人源抗体框架区上的来自亲本鼠源mAb的6个CDR的氨基酸序列。业已证实，人源化抗体中低含量(~5%)的非人源序列能有效降低人源化抗体在人体中的免疫原性及延长血清半衰期^[7]。

遗憾的是，单纯的CDR序列移植产生的抗体通常比亲本鼠源mAb结合抗原能力弱，有时候亲和力降低高达几百分之一^[8]。为了恢复人源化抗体的高亲和力，必须进一步改造以优化其抗原结合区域的结构通常用来自亲本鼠源抗体的匹配序列取代抗体可变区中框架区的关键氨基酸来实现。这些框架区氨基酸通常参与维持CDR环构象，尽管某些框架区氨基酸本身也可直接与抗原接触^[9]，由此可见，由理论推理方法进行抗体人源化面临着相当多的不确定因素。此外，由于该技术依赖结构生物学，这对于很多实验室来说并不容易，其广泛应用亦受到限制。

与推理方法相比，实验法不需要抗体的结构信息，其依赖大库容文库的构建和富集淘筛技术如噬菌体展示、核糖体展示，酵母菌展示或通过高通量筛选技术等。这些实验方法依赖于筛选技术而非推测突变对抗体结构的影响，包括但不限于构建框架区文库、靶向淘筛、框架区置换和抗体人源化工程(humaneering)。然而，这些方法的成功主要依赖于大容量文库的构建，因为大容量的抗体库更容易分离高亲和力抗体。

因此，抗体人源化需要一种更好的方法。本发明中将阐述一种新的人源化方法和利用该方法产生的人源化抗体。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提供一种生产人源化抗体或抗原结合片段的方法。

本发明的另一目的是提供利用该方法制备的人源化抗体或抗原结合片段。

本发明的又一目的是提供含有该人源化抗体或抗原结合片段的组合物。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

本文阐述了一种新颖的人源化方法，该法避免了对抗体结构研究及构建大容量文库的要求相比以前的方法更能有效地产生人源化抗体。

一种生产人源化抗体或抗原结合片段的方法，包括：

（1）获得非人类生物针对某一抗原的抗体的重链可变区和轻链可变区序列，

（2）将非人源抗体重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列与人胚系抗体的氨基酸序列对比，

（3）分别选择与非人源抗体重链可变区和轻链可变区同源性最高的人胚系抗体氨基酸序列，

（4）构建人胚系抗体重链可变区框架的文库，包含编码多个重链可变区的核酸序列，其中每个重链可变区包含框架1（FR1）、框架2（FR2）、框架3（FR3）和框架4（FR4），所述的每一个核酸序列独立地选自同源的人胚系抗体重链可变区的相应框架区和非人源抗体的互补决定区（CDR），

（5）构建人胚系抗体轻链可变区框架的文库，包含编码多个轻链可变区的核酸序列，其中每个轻链可变区包含框架1（FR1）、框架2（FR2）、框架3（FR3）和框架4（FR4），每一个核酸序列独立地选自同源的人胚系抗体轻链可变区的相应框架区和非人源抗体的互补决定区（CDR），

（6）将所述的人胚系抗体重链可变区框架文库和轻链可变区框架文库组装为完整的框架组装文库，

（7）表达所述的框架区组装文库，

（8）从表达的框架组装文库中筛选能够与所述的抗原结合的人源化的重链可变区和轻链可变区，

（9）制备包含人源化重链可变区和轻链可变区的人源化抗体或抗原结合片段。

所述的框架组装文库的表达和人源化重链可变区和人源化轻链可变区的筛选通过噬菌体展示技术进行。在本发明中，框架区组合文库被表达后通过噬菌体展示筛选人源化的抗体可变区，两轮或更多轮为好。

在本发明的所选用的具体操作中，不止一个的人源化抗体重链可变区、轻链可变区从框架区组合库中筛出；该方法还包括从宿主细胞中筛选出高表达量的人源化抗体重链可变区、轻链可变区。

在本发明的所选用的具体操作中，至少一个人源化的重链可变区和人源化的轻链可变区在宿主细胞中具有高表达水平，即表达量>5mg/L。

在本发明的所选用的具体操作中，不止一个的人源化抗体重链可变区、轻链可变区用于FASEBA系统（表达、生物物理性质和亲和力快速筛选系统，Fast Screen for Expression,Biophysical-properties and Affinity system）筛选。

本发明具体实施例包含啮齿类动物抗体的人源化，特别是鼠源抗体的人源化。

与人源化抗体相关的本发明的其它方面或根据本发明实施例而产生的抗原结合片段，也包括使用该抗体和片段的方法。

有益效果：本发明避免了在抗体工程化过程中对抗体结构分析的依赖，同时能够对抗体的表达、稳定性进行筛选，极大程度提高抗体人源化的成功率，并能最大程度保持人源化抗体的亲和力。

本发明的其它方面特征，优势从下列描述来说是不言自明的，包括本发明的详细描述，首选实施例和附加的要求。

附图说明

图1.用标准单字母密码给出aM可变重链(VH)和轻链(VL)的氨基酸序列。下划线是如Kabat等定义的CDR1、2和3区。c为常规残基；s为体细胞突变；r为稀有残基；v为微调区残基。

图2.用于产生框架区组装库的PCR策略。

图3.用于构建框架区组装库的噬菌粒载体。将V_L和V_H基因插入LacZ启动子控制下的载体。然后分别在含人IgG1重链第一恒定区和人κ轻链恒定区的框架内表达V_H和V_L基因。

图4.首次噬菌体展示筛选。对c-Myc肽进行两轮噬菌体展示淘选。在每轮淘选后，从洗脱的噬菌体合并物中随机挑选约100株噬菌体克隆。扩增每一株噬菌体克隆，ELISA测定其与c-Myc的结合。

图5.亲和力排序。A.FASEBA载体的初始结构，其含有捕获标签(BSA12)和检测标签(His标签)。BSA12能够以高亲和力结合BSA。可通过BSA12和BSA之间的相互作用将BSA12-融合蛋白捕获到BSA-包被的固态表面，例如ELISA板上。可易于通过用抗His-标签抗体测定捕获在ELISA板上的BSA12融合蛋白的量。B.来自FASEBA库的Fab克隆的亲和分级。将BSA固定在CM-5传感器芯片的表面上。然后将待捕获的Fab-BSA12融合蛋白注入芯片表面。注入含c-Myc的重组蛋白，记录SPR图谱。用BIA评估3.0软件分析不同Fab-BSA12蛋白的SPR数据。

图6.可溶性人源化Fab的表征。A.可溶性Fab与抗原的结合能力的ELISA分析。B.Fab的SRP图谱的测定。非红色线代表真实的SPR图谱，而红色线代表其1:1拟合曲线。

图7.通过ELISA进行人化评估。将纯化的鼠和人源化Fab包被在ELISA板上。洗涤和封闭后，通过山羊抗人IgG/HRP检测结合在板上的Fab。在450nm处测量OD值。

图8.筛选得到的克隆与野生型表达水平的对比。在所检测的约1,000株克隆中，720株克隆显示出比野生型Fab克隆(横线表示野生型表达水平)更高的表达水平。

具体实施方式

本发明从分析待人源化的亲本单克隆抗体的序列信息开始,通过大量人源序列比对，从大部分同源的人类种系抗体序列中选择框架区序列建模。将重组后人类种系框架区与原始鼠源CDR重组构建噬菌体展示文库。然后通过噬菌体展示技术筛选与抗原高亲结合的噬菌体克隆。接着用FASEBA(Fast Screening for Expression,Biophysical-properties and Affinity，快速筛选表达、生物物理学性质和亲和力)系统进行淘选后噬菌体库的表达筛选。FASEBA系统是种专利技术平台（参考文献：WO2011020183；US20120178110），其能够以高通量方式筛选针对靶点的高表达水平、高生物物理学性质和高亲和力抗体。经FASEBA系统筛选后，采用亲和力排序(affinity ranking)来进一步分离对抗原具有高亲和力的抗体。

实施例1

1.1.亲本单克隆抗体的克隆及序列测定

抗c-Myc多肽的鼠源杂交瘤单克隆抗体样品来源于GenScript Inc(货号RP11731)。该鼠源mAb在下文中简称为aM。

使用TRIzol(Invitrogen,Carlsbad,CA)从aM杂交瘤细胞aM中提取总RNA。使用Omniscript反转录试剂盒(QIAGEN,Shanghai,China)反转录产生cDNA。以得到的cDNA为模板,通过如下引物PCR扩增aM的V_H和V_L基因：用于V_L基因扩增的正向引物为5’-TTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCC-3’(SEQ ID NO.1)，反向引物为5’-GGTGCAGCCACCGTACGTTTGATTTC-3’(SEQ ID NO.2)；用于V_H基因扩增的正向引物为5’-CATGGCCGAGGTGCAGCTGGCTAGC-3’(SEQ ID NO.3)，反向引物为5’-TGCGGCCCCATTTGCGGCCGCAGAG-3’(SEQ ID NO.4)。随后将V_H和V_L基因的PCR产物克隆到pUC57-T载体(GenScript)中并测序。

1.2.人框架区序列的选择

为选择用于aM人源化的人V_H和V_L框架区，分别对aM的V_H和V_L氨基酸序列进行IgBlast(www.IMGT.org)分析。基于其与鼠源aM框架区的最高序列同源性选择人重链和轻链框架区基因序列。

1.3.人源框架区组装库的构建

首先，分别对选择的人源V_H框架区和V_L框架区构建文库，然后将其构建为组装到噬菌粒载体中的Fab框架区组装文库。为了构建人源性V_H框架区文库，分别PCR合成FR1、FR2、FR3和FR4，4个人源抗体框架区序列。然后，通过重叠PCR法将FR1、FR2、FR3和FR4扩增产物混合，退火形成完整的V_H片段。V_H基因的重叠PCR扩增策略如图2所示。构建人源性V_L框架区文库的方法与构建人源性V_H框架区文库的方法相同。用于构建V_H和V_L框架区文库的引物详见表1，具体实验外包至GeneArt公司进行。

1.4.将V区克隆到噬菌粒载体

使用SfiI酶切上一步PCR扩增的人源性V_H和V_L片段，并将其分别连接到GenScript Inc.设计的噬菌粒载体（噬菌粒载体全序列为SEQ ID NO.9）中，以产生人源性Fab噬菌体展示文库。该载体插入V_H和V_L序列后，可在LacZ启动子调控下表达Fab片段(图3)，所述Fab片段含有人重链的第一恒定区(hIgG1C_H1)和人轻链的恒定区(hIgKC_L)。

转化感受态细胞TG1（购自Stratagene公司）后，让含有噬菌体库的细菌在37℃，含100μg/ml氨卞青霉素和25μg/ml卡那霉素的液体培养基中培养，并通过辅助噬菌体(M13KO7)（购自NEB，目录号N0315S）侵染拯救噬菌粒包装phage的能力。通过向离心收集的培养物上清液中加入0.2体积的聚乙二醇(PEG)8000和2.5M NaCl，沉淀噬菌体，并将其重悬于PBS中。

1.5.噬菌体展示库淘选

抗原(c-Myc多肽（序列为EQKLISEEDLEQKLISEEDL由Pepscan公司合成)生物素化处理后，固定在用链霉亲和素预包被的微孔板上。然后用2%(w/v)脱脂奶粉的PBS(2%MPBS)封闭抗原包被板。将含10¹¹个噬菌体的噬菌体库加入抗原包被板中，室温孵育2小时。弃孵育物，用含0.1%Tween20的PBS(PBS-T)洗涤10–20次，接着用PBS洗涤10~20次，除去未结合与非特异结合的噬菌体。随后使用100μl的100mM三乙胺(TEA)孵育10分钟，洗脱与抗原结合的噬菌体，接着立即用50μl的1M Tris-HCl,pH7.5中和收集的洗脱产物。用洗脱的噬菌体侵染对数生长期TG1大肠杆菌(Stratagene)，37℃静置培养30分钟。将侵染后的细胞均匀涂布在含氨卞青霉素(100μg/ml)，葡萄糖(1%w/v)的TYE固体平板上，37℃孵育过夜。挑取噬菌体侵染的单克隆，在96-孔板中培养以扩增噬菌体颗粒。添加M13KO7辅助噬菌体拯救噬菌粒包装phage的能力。通过ELISA方法检测噬菌体与抗原结合能力，或在相似条件下扩增淘筛后噬菌体并开始随后轮次的筛选。通常进行两轮淘筛。

1.6.噬菌体ELISA筛选

为了检测筛选克隆的抗原识别能力，使用10μg/ml抗原c-Myc多肽包被微孔板。经4℃过夜孵育后，用2%MPBS室温封闭1小时，接着用PBS洗涤3次。用4%MPBS将所淘筛的噬菌体培养上清稀释1:2后，加到各包被抗原孔中，室温孵育1小时。用PBS-T将板洗涤3次，再用PBS洗涤3次，接着加入1:5,000稀释到2%MPBS中的小鼠抗M13噬菌体-辣根过氧化物酶(HRP)结合物(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)，室温孵育1小时。用PBST洗涤板3次，接着将100μl四甲基联苯胺(TMB)溶液加入到各孔中，孵育15分钟。最后加入100μl的1M硫酸终止反应。通过在ELISA读数器中检测450nm处的吸收光值记录ELISA读数。

1.7.表达量筛选

在大肠杆菌TG1细胞中扩增从淘筛获得的噬菌体，随后制备噬菌粒，将噬菌粒载体中的Fab片段亚克隆到FASEBA载体（参考文献：WO2011020183）中用于随后的表达筛选。该载体可将表达抗体与BSA12融合表达，BSA12为骆驼单域抗体，其能与BSA以4pM的高亲和力结合(图5A)。

随后将含Fab-BSA12-His片段的FASEBA载体，转化到大肠杆菌TG1中用于可溶性表达。将过夜培养的大肠杆菌培养物，1：10转接到含2%葡萄糖的2x YT培养基中，并在30℃培养1小时。然后中速离心收获细菌沉淀并重悬于含1mM IPTG，无葡萄糖等体积的新鲜2x YT培养基中，过夜振荡培养。离心收集含Fab的培养物上清液。

从各孔转移100ul上清液到用3%BSA包被的对应ELISA板孔中。由于BSA12和BSA之间的高亲作用Fab被捕获到ELISA板上。然后利用ELISA检测法，通过山羊抗His标签抗体测定捕获的Fab的量。

1.8.亲和分级和动力学分析

通过BIAcore T200(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)表面等离子共振技术测量人源化Fab变构体和亲本抗体与抗原的结合亲和力。从GE Healthcare购买研究级的CM5传感器芯片和胺偶联试剂盒用于亲和分级。将BSA固定到CM5芯片上，用于亲和分级分析。用含c-Myc标签的重组蛋白作为抗原用于亲和筛选和检测。通过BSA12与BSA的相互作用，在包被BSA的芯片表面捕获Fab-BSA12融合蛋白。然后以30μl/min的流速将c-Myc抗原注入Fab表面(结合1分钟，解离5分钟)。

为了准确分析纯化的Fab，将含c-Myc的重组蛋白固定到传感器芯片上。通过注入各种浓度的可溶性Fab施行结合测定。在每一次结合测量后，用20μl的10mM甘氨酸–盐酸(pH1.5)以20μl/min的流速去除残留的Fab。用BIA评估软件3.0(GE HealthCare,Uppsala Sweden)将每一数据集拟合到简单的1:1Langmuir结合模型中。

1.9.通过Z记分分析及ELISA评估“人源化(humanness)”

Abhinandan和Martin(10)提出了评估抗体序列“人源化程度”的方法，所述方法提供了可帮助预测免疫原性的工具。Z记分为最终界定序列在人源谱中同源性的检测方法。我们通过基于该网站(http://www.bioinf.org.uk/abs/shab/)的服务，将我们的人源化Fab序列(V_H和V_L)的Z记分与原始鼠源aM-V_H和V_L序列的Z记分进行了比较。

ELISA测定，将亲本鼠源或人源化Fabs直接包被在ELISA板上。用PBS彻底洗涤后，用山羊抗人IgG/HRP来测定ELISA板上吸附的Fab的量。通过用酶标仪检测450nm处吸光值来记录ELISA读数。

2.结果

2.1.aM V_H和V_L的序列

选择得到的人aM基因重链框架区基因序列如SEQ ID NO.5,人aM基因轻链框架区基因序列如SEQ ID NO.6,人aM基因重链框架区氨基酸序列如SEQ ID NO.7,人aM基因轻链框架区氨基酸序列如SEQ ID NO.8。

根据参考文献[11-14]测定了aM的关键氨基酸残基，包括常规残基、体细胞突变、稀有残基和微调区残基，并标示在图1中。基于Kabat等的方法[15]确定抗体的CDR和残基数量。

2.2.框架区选择

为了选择适合人可变区的框架区，利用IgBlast搜索法，分别将aM V_H和V_L的氨基酸序列在IMGT数据库（http：//www.imgt.org/vquest/refseqh.html）中与人源抗体序列全谱比对。为排除体细胞突变的潜在免疫原性，我们用种系序列而不是非种系序列作为模板。按照与亲本鼠源抗体序列同一性排列人抗体序列。我们独立选择与亲本鼠源抗体显示最高序列同源性的多种种系模板，从该列表中排除具有与亲本鼠源抗体CDR长度不同的人源序列。进一步排除含有以下情况的序列：(a)罕见的脯氨酸(将刚性引入多肽链中)；(b)半胱氨酸(引入潜在氧化性损伤)残基；和(c)潜在的N-糖基化位点。通过核对上述所有数据并比较每一错配残基对保守性的改变，，分别选择了4个人V_H种系和15个人V_L种系序列作为最佳候选序列。这些序列分别是：重链IGVH7-4-101、IGVH7-4-102、IGVH7-4-103和IGVH7-81-01；轻链IGKV2-3002、IGKV2D-2902、IGKV2-3001、IGKV2-2903、IGKV2-2902、IGKV2-2401、IGKV2D-2901、IGKV2D-3001、IGKV2D-2401、IGKV2D-2801、IGKV2-2801、IGKV2D-4001、IGKV2-4001、IGKV2D-2601和IGKV2D-2602。

2.3.框架区组装库的构建

在所选择的15种V_L种系中，有10种不同的FR1、7种不同的FR2和5种不同的FR3。所有V_L种系中的FR4都相同。在所选择的4种V_H种系中，有2种不同的FR1、两种不同的FR2和4种不同的FR3。所有V_H种系的FR4都相同，各FR片段的序列如表5所示。

用表1所列引物PCR扩增所有V_H和V_L基因的FR片段。每一个V_L或V_H的FR与aM CDRs随机组装，多个FRs与CDRs的随机组装共同产生了V_L/V_H框架区组装库。V_L框架区库多样性为350(10x7x5)，V_H库的多样性为16(2x2x4)。将V_H和V_L库有序地组装到噬菌粒载体中，产生多样性达5,600种不同克隆的Fab噬菌体展示库(图2和图3)。通过单次转化，我们获得5x10⁶个克隆，其约为理论库容大小的1000倍，足以覆盖整个文库的多样性。

2.4.首次噬菌体展示筛选

在c-Myc肽包被的微孔板上淘筛构建的aM框架组装噬菌体库。共进行两轮淘选。每轮淘选后，挑出约100株噬菌体克隆进行ELISA测定，以评估其结合c-Myc肽的能力。第一轮筛选的噬菌体ELISA检测的平均OD值约为0.45，第2轮约为0.95(图4)，这表明通过两轮淘选使c-Myc特异性的噬菌体得到富集。

2.5.第二次表达筛选

为了进一步筛选在大肠杆菌中具有高表达水平的Fab克隆，将第2轮淘选后获得的噬菌体展示库的Fab片段亚克隆到FASEBA载体中用于表达筛选(图5A)。

用BSA包被微孔板，用于FASEBA筛选。然后将含Fab-BSA12融合蛋白的细胞培养物上清液加到对应孔中，室温孵育1小时。洗涤微孔板后，加入抗His IgG/HRP室温孵育以测定捕获在微孔板上的Fab。经TMB显色并终止后，测量OD450吸光值。

在所检测的约1,000株克隆中，720株克隆显示出比野生型Fab克隆(如图8所示，横线表示野生型表达水平)更高的表达水平。在这720株克隆中，选择表达水平最高的40株用于亲和分级检测。

2.6.亲和力分级

将来自FASEBA筛选表达的可溶性Fab蛋白注入到用BSA预包被的CM5传感器芯片表面，用于亲和分级。由于BSA和BSA12之间的高亲作用，与BSA12融合表达的Fab被捕获在CM5芯片上。注入不同浓度的抗原，随后记录并分析Fab和抗原之间的作用图谱(图5B)。通过检测40株高表达量的Fab-BSA12克隆，发现其中大部分人源化的Fab比亲本鼠源Fab展现出更高的亲和力。具有最高亲和力的10株Fab克隆其亲和分级结果见图5B。

为了精确测量这10株Fab克隆的亲和力，将与其相连的BSA12蛋白标签去除。在大肠杆菌中分别表达并纯化这10株可溶性的Fab，接着用ELISA测定其与抗原的结合能力。在所检测的10株Fab克隆中，5株克隆在相同蛋白浓度时显示出比亲本鼠源Fab更高的ELISA读数(图6A)。

2.7.动力学分析

通过SPR进一步表征由ELISA确定的与抗原结合最强的10个Fab蛋白。分别将待检测的Fab蛋白以80、40、20、10、5nM5种浓度溶解在1xHBS-EP中，随后分别注入预固定抗原的芯片表面，监测解离相持续6分钟，结果见图6B。所检测的所有Fab均显示出良好的1:1Langmuir拟合。人源化Fab和亲本鼠源Fab的动力学数据见表2。计算的人源化变体的K_D比亲本Fab低3-7倍。上述结果表明，人源化Fab变体比亲本抗体具有更高的结合亲和力。

2.8.人源化评估

为了评估人源化Fab的人源化程度，我们比较了人源化Fab氨基酸序列与人源种系序列(表3)。表3中的数据明确显示，5株人源化Fab克隆均显示出比亲本鼠源抗体更高的与人类种系抗体序列同一性。V_H序列与其最接近的人种系序列的序列同一性增加15.3~18.4%，而V_L序列与其最接近的人种系序列的序列同一性增加4.0~8.0%。

近来，Abhinandan和Martint提出将Z记分作为评估抗体人源化的工具^[10]。Z记分被界定为评估一条序列具有人源谱序列程度的量度指标。Z记分为0代表该序列具有与人序列谱的平均相似性。正Z记分代表该序列显示比人序列谱平均程度更高的人序列同源性，负Z记分代表该序列具有较不典型的人源特性。

亲本鼠源Fab(WT)和人源化Fab的Z记分结果列于表4中。人源化Fab的V_H和V_LZ记分低于亲本鼠源抗体，这显示增加了人源化Fab的人源化程度。值得注意的是，人源化Fab V_H的Z记分比VL的Z记分低。

我们进一步应用ELISA检测试验评估抗体的人源化。我们提出的假设是，如果一个抗体含有更多人源化氨基酸残基，它就更容易被抗人抗体识别。在此假设基础上，我们将纯化的亲本鼠源和人源化后的Fab蛋白分别包被在ELISA板上。然后通过兔抗人IgG/HRP检测直接包被在板上的Fab。ELISA读数与工程抗体的人源化程度相关(图7)。结果显示在所检测的克隆中，H6、H8、L1、N13和N14具有比亲本鼠源Fab(WT)更高的OD值，这显示这些Fab含有更多能被抗人抗体识别的人源化氨基酸。上述数据与在Z记分分析中获得的结果一致。

3.结论和讨论

抗体人源化是抗体药物开发的核心技术。尽管几十年前就产生了第一个人源化抗体，但抗体人源化仍面临着诸多技术挑战。

如前所述，目前主要有两类人源化方法，即推理方法和实验方法。推理方法通常包括设计人源化抗体变体以检测结合或其它感兴趣的性质。如果设计的变体被证明不适合，则开始新一轮的设计流程和结合评估。设计流程中成功的关键因素是将特异性从给定的非人源抗体转移到人源抗体过程中，待靶向的残基间结构及物理化学相容性。另一种人源化方法为实验方法，该方法的成功依赖于大抗体库的产生。

为了克服在常规推理方法和实验方法中经常出现的问题，本发明研发出新的策略以产生人源化抗体。命名为框架区组装使抗体人源化的本发明方法，不需要抗体结构知识，从而避免推理方法的不确定性。同时，本发明方法不需要大容量的抗体文库。在实际工作中，框架区文库多样性仅含5,600株克隆，这很容易由单次转化来覆盖。因此，本方法比推理方法和实验方法更简单更有效。此外，在抗体人源化过程中，另一重要问题是完全或部分丧失亲本抗体的亲和力。在大多数情况下，抗体人源化改变了抗体的构象，因此导致人源化抗体的结构不稳定和表达水平低下。在本发明提呈的研究中，通过噬菌体展示、FASEBA系统和亲和分级技术的联合运用，从而筛选出具有比亲本抗体更高抗原结合亲和力和表达水平的人源化抗体。

表达水平是评价人源化抗体的重要指标。抗体的高表达水平将大大降低抗体生产的下游花费。FASEBA技术是我们开发用于筛选具有高效表达能力的人源化抗体克隆的关键技术。FASEBA载体具有两个组分特色。一是BSA12单结构域抗体。BSA12能以极高的亲和力与BSA结合。应用BSA12的这种特性将含BSA12的融合蛋白固定在包被BSA的检测板上。FASEBA载体的另一特色组分是含有His检测标签。该标签被来于评估捕获在板上的与BSA12融合表达的蛋白量。由于FASEBA淘筛是在微孔板上进行，这也使得表达水平的高通量筛选成为可能。

综上所述，本文阐述的方法可作为其它抗体人源化的通用方法。

表1

表2

抗体	Ka(1/Ms)	Kd(1/s)	KD(M)
				WT	1.59E+05	1.77E-02	1.11E-07
N14	4.75E+05	7.18E-03	1.51E-08
				N13	3.30E+05	7.03E-03	2.13E-08
H6	3.84E+05	8.87E-03	2.31E-08
				H8	2.93E+05	7.76E-03	2.65E-08
L1	3.87E+05	1.36E-02	3.50E-08

表3人源化抗体与鼠源抗体序列比较

a，人源化克隆与最接近的人胚系氨基酸序列的同源性；

b，原始的鼠抗体与人胚系氨基酸序列的同源性.

表4Z-score评估人源性

表5  15种V_L种系及4种V_H种系中各片段序列

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Claims (8)

1.一种生产人源化抗体或抗原结合片段的方法，包括：

（1）获得非人类生物针对某一抗原的抗体的重链可变区和轻链可变区序列，

（2）将非人源抗体重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列与人胚系抗体的氨基酸序列对比，

（3）分别选择与非人源抗体重链可变区和轻链可变区同源性最高的人胚系抗体氨基酸序列，

（4）构建人胚系抗体重链可变区框架的文库，包含编码多个重链可变区的核酸序列，其中每个重链可变区包含框架1、框架2、框架3和框架4，所述的每一个核酸序列独立地选自同源的人胚系抗体重链可变区的相应框架区和非人源抗体的互补决定区，

（5）构建人胚系抗体轻链可变区框架的文库，包含编码多个轻链可变区的核酸序列，其中每个轻链可变区包含框架1、框架2、框架3和框架4，每一个核酸序列独立地选自同源的人胚系抗体轻链可变区的相应框架区和非人源抗体的互补决定区，

（6）将所述的人胚系抗体重链可变区框架文库和轻链可变区框架文库组装为完整的框架组装文库，

（7）表达所述的框架区组装文库，

（8）从表达的框架组装文库中筛选能够与所述的抗原结合的人源化的重链可变区和轻链可变区，

（9）制备包含人源化重链可变区和轻链可变区的人源化抗体或抗原结合片段。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的框架组装文库的表达和人源化重链可变区和人源化轻链可变区的筛选通过噬菌体展示技术进行。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于至少一个人源化的重链可变区和人源化的轻链可变区选自框架组装文库表达的蛋白。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于至少一个人源化的重链可变区和人源化的轻链可变区在宿主细胞中表达水平>5mg/L。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于至少一个人源化的重链可变区和轻链可变区通过表达、生物物理性质和亲和力快速筛选系统进行筛选。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法制备的人源化抗体或抗原结合片段。

7.包含权利要求6所述的人源化抗体或抗原结合片段的组合物。

8.一种使用权利要求6所述的人源化抗体或抗原结合片段的方法，包括使所述人源化抗体或抗原结合片段与抗原接触。

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