CN104583236A - 高度多样的组合抗体文库 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了获得自骆驼科动物物种的免疫文库，其包含属于至少7个人种系抗体链的抗体链。所述文库中大量人种系抗体链家族的存在有助于所述文库在产生针对人靶抗原之抗体中的有用性。从所述文库产生的抗体具有低固有免疫原性。

Description

高度多样的组合抗体文库
发明背景
1.发明领域
本发明一般涉及获得自骆驼科动物物种的抗体文库，并且更特别地涉及包含对应于在野生型人抗体中使用的那些链家族之链家族的骆驼科动物抗体文库。
2.相关领域描述
随着展示方法(例如核糖体展示、噬菌体展示和细胞表面展示)的出现，抗体文库已经成为用于抗体研究和开发的越来越重要的资源。抗体文库在设计和构建方式上不同。最重要的文库是为鉴定和分离治疗性抗体而开发的那些。Ponsel等，“High Affinity，Developability and Functional Size：The Holy Grail of Combinatorial Antibody Library Generation，”Molecules2011，16，3675-3700提供了概述。
自然界利用体细胞高突(somatic hypermutation，SHM)来产生高亲和力抗体。已经开发出许多亲和力成熟技术来模拟SHM。成熟技术的目标一般是在所选择的中度亲和力候选者中引入一定程度的多样性，随后在逐渐提高的选择压力下进行重复选择。期望提供这样的文库，所述文库提供具有高早熟亲和力的抗体。根据Perelson等，可直接从组合抗体文库获得的亲和力(即，不存在亲和力成熟)一般与文库大小相关(Perelson，A.S.；Oster，G.F. Theoretical studies of clonal selection：Minimal antibodyrepertoire size and reliability of self-non-self discrimination.J.Th eor.Biol.1979，81，645-670)。
亲和力/文库大小相关性可容易地从概率的角度来理解：文库越大，从其可用的结构单元(building block)生成高亲和力抗体的概率越大。然而，大小本身并不是答案，文库的质量至少同样重要。如由Ponsel等，“Functional library size...matters more than absolute library size.”(Ponsel等，同上，3676页)所述。
自然界依赖于抗体结构单元(特别是重链(VH)和轻链(VL))的随机组合。人抗体的生成例如利用7个VH家族和16个VL家族(10个λ家族和6个κ家族)，其非常有助于人抗体的多样性。期望抗体文库将包含大量的抗体家族以便接近自然界中的多样性。
由来自健康人供体的抗体构建的原初抗体文库(antibodylibrary)原则上包含完整的人抗体链。与免疫文库相比，原初文库不太适于开发高亲和力治疗性抗体。此外，已经发现原初文库之链多样性的重要部分在标准筛选和富集方案的选择压力下丧失。
由获得自被感染人类的抗体构建的免疫文库具有产生高亲和力治疗性抗体的潜力。预期这样的文库可包含完整的人抗体链。然而，被感染的人供体的免疫系统常常严重受损，导致低质量的免疫文库。事实上，目标治疗性抗体几乎当然地处理特征在于减弱患者免疫系统的疾病。
在许多情况下，不可能通过免疫健康人供体来获得抗原特异性抗体。用危及生命的或有毒的抗原来免疫在伦理上不可能。其他抗原不触发人类的稳健(robust)免疫应答，或者根本没有免疫应答。
可通过免疫实验动物(例如小鼠或大鼠)来获得抗原特异性抗体。然而，这样的动物往往是严重近交的，这降低了免疫应答的多样性。此外，鼠抗体与人种系仅共有有限数量的抗体链家族。
Dreier等，2011年12月8日的美国专利申请公开号2011/0300140公开了用于通过免疫骆驼科动物物种(大羊驼(Lama glama))来产生高亲和力抗体的方法。该文献报道了在家族λ3、λ5和λ8中Vλ链的分离。未报道Vκ链。
Dreier等，2011年7月7日的美国专利申请公开号2011/0165621公开了用于人源化通过免疫骆驼科动物物种所获得之抗体的方法。该文献提出了以下家族之链的人源化方案：重链：VH1、VH3和VH4；Vλ链：Vλ1、Vλ2、Vλ3、Vλ5和Vλ8；以及Vκ链Vκ1、Vκ2和Vκ4。
Schofield等“Application of Phage Display to High ThroughputAntibody Generation and Characterization，”Genome Biol.(2007)报道了包含超过1010种人抗体的高质量噬菌体展示文库。该出版物提供了多种抗体链的使用频率的概述。Vκ1和Vλ6是使用最频繁的轻链。
因此，需要来自非人动物的抗体文库，其中呈现大量人抗体链家族。
特别需要来自非人动物的抗体文库，其中呈现人抗体链Vλ6。
发明内容
本发明涉及来源于骆驼科动物物种的抗体文库，所述文库包含属于以下人抗体链家族中至少之一的抗体链：VH6、Vκ3和Vλ6。优选包含属于人Vλ6家族之抗体链的抗体文库。
附图说明
图1是存在于Schofield等，同上的文库中之人链家族的使用频率的图示。来源：http：//openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php？img＝2258204_gb-2007-8-11-r254-3&query＝the&fields＝all&favor＝none&it＝none&sub＝none&uniq＝0&sp＝none&req＝4&simCollection＝2583049_pone.0003793.g005&npos＝35&prt＝3。
图2是与人抗体中的重链家族的使用(每对的右手条)相比，本发明的骆驼科动物抗体文库中的人重链家族使用(每对的左手条)的图示。
图3是与人抗体中的κ链家族的使用(每对的右手条)相比，本发明的骆驼科动物抗体文库中的人κ链家族使用(每对的左手条)的图示。
图4是与人抗体中的λ链家族的使用(每对的右手条)相比，本发明的骆驼科动物抗体文库中的人VH1链家族使用(每对的左手条)的图示。
图5是与人抗体中的λ链家族的使用(每对的右手条)相比，本发明的骆驼科动物抗体文库中的人VH3链家族使用(每对的左手条)的图示。
图6是与人抗体中的λ链家族的使用(每对的右手条)相比，本发明的骆驼科动物抗体文库中的人Vκ1链家族使用(每对的左手条)的图示。
图7是与人抗体中的λ链家族的使用(每对的右手条)相比，本发明的骆驼科动物抗体文库中的人Vλ1链家族使用(每对的左手条)的图示。
图8示出了Vλ种系6。
图9是参照人VH家族和种系基因对应物之每个VH家族(VH1、VH3、VH4、VH5和VH7)的骆驼科动物VH种系基因的比对。同一性％表示VH种系的每个骆驼(野骆驼(Camel ferus))和大羊驼(羊驼(Lamapacos)或骆马(lama vicugna))框架(FR1+FR2+FR3)与参照FR氨基酸序列(ref，此处为人VH种系对应物)所共有的相同氨基酸(点)的百分比。
图10是参照人Vλ家族和种系基因对应物之每个Vλ家族(Vλ1、Vλ2、Vλ3、Vλ4、Vλ5、Vλ6、Vλ7、Vλ8、Vλ9和Vλ10)的骆驼科动物Vλ种系基因的比对。同一性％表示Vλ种系的每个骆驼(野骆驼)和大羊驼(羊驼或骆马)框架(FR1+FR2+FR3)与参照FR氨基酸序列(ref，此处为人Vλ种系对应物)所共有的相同氨基酸(点)的百分比。
图11是骆驼科动物Vκ家族与相应的人种系的比对。同一性％表示Vκ种系的每个骆驼(野骆驼)和大羊驼(羊驼或骆马)框架(FR1+FR2+FR3)与参照FR氨基酸序列(ref，此处为人Vκ种系对应物)所共有的相同氨基酸(点)的百分比。
图12示出骆驼科动物(羊驼和野骆驼)VH基因和相应的引物。
图13示出骆驼科动物(羊驼、野骆驼和大羊驼)Vλ基因和相应的引物。
图14示出骆驼科动物(羊驼、野骆驼和大羊驼)Vκ基因和相应的引物。
图15示出VH1引物1与VH1FR1的前23bp之比对的一个实例。该比对的实例说明了特异于V家族扩增的引物是如何设计的。通过将属于相同家族(此处的一个实例为VH1家族)之V种系基因的所有框架1(FR1)进行比对来产生V家族特异性引物。从羊驼WGS和HTG、野骆驼WGS和任何可用的序列数据库或者未公开或公开的文献中收集和注释的所有已发现的V种系序列提取所有的FR1家族V特异性。WGS表示全基因组鸟枪测序项目并且HTG或HTGS表示高通量基因组序列。点表示与参照序列(此处在该实例中由VH1-引物1表示)相比相同的核苷酸。此处VH1-引物1是允许在13位用G或C退火的简并引物；对于引物合成，S表示G/C。
发明详述
以下是本发明的详细描述。
定义
“抗体”(Ab)和“免疫球蛋白”(Ig)是糖蛋白，其表现出与(靶)抗原的特异性结合。已知骆驼科动物物种具有两种不同类型的抗体；经典的或“常规”的抗体还有重链抗体。
本文使用的术语“骆驼科动物抗体”是指任何同种型的常规骆驼科动物抗体，包括IgA、IgG、IgD、IgE或IgM。自然的或天然存在的“常规”骆驼科动物抗体通常是异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成。
术语“抗体链”与术语“抗体结构域”交换使用，并且是指抗体的重链或轻链。
术语“抗体文库”是指用于筛选和/或组合成完整抗体所展示的抗体和/或抗体片段的集合。抗体和/或抗体片段可在核糖体上、在噬菌体上或在细胞表面(特别是在酵母细胞表面)上展示。
如果人抗体链与该家族的其他成员具有至少80％的序列同源性，则认为人抗体链属于特异性“抗体链家族”。基于该定义，已经鉴定出23个人抗体链家族：7个重链(VH)家族；6个Vκ轻链家族；以及10个Vλ轻链家族。因此，如果人抗体链与Vλ6家族的其他成员具有至少80％的序列同源性，则认为人抗体链属于人家族Vλ6。已经发现，通常，抗体链与其他家族的成员具有小于70％的序列同源性。
如果骆驼科动物抗体链与该家族的人种系序列具有至少80％的序列同源性，则认为骆驼科动物抗体链属于特异性人抗体链家族。优选地，序列同源性至少为85％，更优选为90％，仍更优选为至少95％。
骆驼科动物抗体可获得自骆驼科物种的外周血或特定组织，例如脾。抗体可获得自正常的健康动物，或者来自于患病的动物。然而，优选地，在用靶抗原主动免疫动物从而引发针对靶抗原的免疫应答(其中动物产生与靶抗原发生免疫反应的骆驼科动物常规抗体)之后，从所述动物获得骆驼科动物抗体。在US 2011/0300140中描述了免疫骆驼科动物的方案，其公开内容通过引用并入本文。
过程通常将包括免疫骆驼科(Camilidae)物种的动物(包括但不限于大羊驼和羊驼(alcapas))。优选地，所述动物属于远交(outbred)种群，这有助于免疫应答的强度和多样性。主动免疫之后，可从经免疫的动物分离外周血淋巴细胞或活检组织(例如淋巴结或脾活检组织)。可筛选所收获的淋巴细胞以产生针对靶抗原的常规骆驼科动物抗体。对于构建原初抗体文库，不进行这样的筛选。
可使用编码骆驼科动物VH和VL结构域的核酸(通过主动免疫或通过其他方式获得的)来制备骆驼科动物文库，例如Fab文库，如在US2011/0300140中所述。
还可构建编码骆驼科动物常规抗体之VH和/或VL结构域的表达载体文库以获得扩增的基因区段，每个基因区段包含编码骆驼科动物常规抗体之VH和/或VL结构域的核苷酸序列。构建所述表达载体文库包括以下步骤：
a)扩增编码骆驼科动物常规抗体之VH和/或VL结构域的核酸分子的区以获得扩增的基因区段，每个基因区段包含编码骆驼科动物常规抗体之VH结构域的核苷酸序列或者编码骆驼科动物常规抗体之VL结构域的核苷酸序列；以及
b)将在a)中获得的基因区段克隆到表达载体中，以使得每个表达载体包含至少编码VH结构域的基因区段和/或编码VL结构域的基因区段，由此获得表达载体文库。
步骤a)可通过任何合适的扩增技术(例如PCR)来进行。在使用PCR的情况下，重要的是选择适当的引物。使用次优的引物导致失去有价值的多样性，因为属于重要人家族的抗体链可逃脱分离和检测。例如，以往属于人VH6、Vκ3或Vλ6家族的链已经逃脱分离和/或检测，原因是使用的引物不适用于属于这些家族的序列。
在第一实施方案中，本发明的抗体文库包含属于至少7个，优选至少10个，更优选至少12个，甚至更优选至少15个人抗体链家族的抗体链。该实施方案利用了抗体文库的功能大小比绝对大小更重要的发现。考虑具有相等绝对大小(假设1010抗体)的两个抗体文库，A和B。文库A包含仅5个不同家族的抗体链，而文库B包含10个不同家族的抗体链。可容易地看到文库B在亲和力成熟方案(例如链改组)中提供更多的可能排列(permutation)。因此，与文库A相比，文库B提供产生高亲和力抗体的更大概率，即使这两个文库的绝对大小相等。
文库多样性同样重要的是更好的表位覆盖，因为更大的多样性提高了能够靶向功能上和/或治疗上相关的抗原上之表位的可能性。文库多样性同样重要的是提高鉴定具有期望的第二特性(secondary properties)的抗体分子的概率，所述第二特性例如结合特异性、与靶抗原直向同源物的交叉反应性、稳定性、易于制备等。
该实施方案文库的另一个重要方面是其示出大量的人链家族。鼠抗体文库可以是高度多样的，因为鼠种系中大量的Vκ家族。因此，鼠抗体文库满足功能大小的标准，在此基础上可预期当针对特异性靶标筛选时这样的文库产生大量的高亲和力抗体。然而，许多这些“选中物(hit)”是无法使用的，因为其相异于人抗体。其他选中物可能需要这样广泛的人源化改造以使其丧失其亲和力的大部分。然而，本发明的文库产生需要很少人源化改造的抗体。
已经发现大多数或所有抗体链家族均通过多个独特的基因来表达。例如，Vλ1链家族至少有五个不同基因。该发现为甚至更大的文库多样性打开了大门。本发明的一个重要方面是开发允许从大于一个基因的抗体库(pool)提取给定抗体链家族的引物。
在第二实施方案中，本发明的抗体文库包含至少一个以下人链家族的抗体链：VH6、Vκ3和Vλ6。该实施方案是基于这样的观察，每个这些家族对于人种系抗体的多样性是足够重要的以值得努力建立骆驼科动物抗体文库以及开发扩增和分离它们所必需的适当引物，所述骆驼科动物抗体文库大到足以包含可收获量的这些家族的链。
在第三实施方案中，本发明的抗体文库包含至少三个人家族VH3、Vκ1和Vλ6的成员；优选地，四个人家族VH1、VH3、Vκ1和Vλ6的成员；仍更优选地，五个人家族VH1、VH3、Vκ1、Vλ1和Vλ6的成员；甚至更优选地，六个人家族VH1、VH3、Vκ1、Vλ1、Vλ2和Vλ6的成员；最优选地，七个人家族VH1、VH3、Vκ1、Vκ2、Vλ1、Vλ2和Vλ6的成员。该实施方案反映了这样的认识，在自然界中，抗体链的这些组合，虽然分别表示1.5％、3.1％、4.7％、6.3％和7.8％的可能排列，但是其表示约50％至大于80％的人抗体。由此可见，包含这些链之组合的文库产生有用治疗性抗体的概率很高，即使这样的文库的绝对大小相对较小。
应理解，为上面三个实施方案给出的标准并不相互排斥，并且一个特定文库可满足两个实施方案以及可能所有三个的标准。例如，包含所有23个人家族之链的文库将一定满足所有三个实施方案的标准。
说明性实施方案/实施例的描述
以下是仅以实施例的方式给出的本发明的某些实施方案的描述。
实施例1
包括引物序列的扩增方案的描述
按照Dreier等的美国专利申请公开2011/0300140中所公开的进行了免疫、PBL分离、RNA提取和cDNA制备。
如由de Haard等(JBC 1999)所述，用cDNA作为模板并且使用与可变结构域的框架1(FR1)(BACK引物)以及恒定结构域的末端(FOR引物)特异性退火的引物通过PCR来扩增Fab片段。基于从全基因组鸟枪(WGS)数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ABRR00000000)、高通量基因组(HTG)数据库以及测序的扩增子所获得的来自骆驼科动物(羊驼、野骆驼和大羊驼)的种系序列来设计引物的序列。图9至11示出骆驼科动物VH、Vλ和Vκ家族与相应的人种系的比对。将这些序列用作模板来设计表1至3中所述的FR1引物。骆驼科动物种系序列和相应的FR1引物的概述在图12至14中示出。
可在一步PCR或两步PCR中进行大羊驼可变结构域的扩增。对于一步PCR，用于扩增的BACK和FOR引物包含允许将PCR片段克隆到pCB3噬菌粒载体中的限制性位点。对于两步PCR，用未标记引物(没有限制性位点)来进行第一步PCR。分离和纯化扩增子，然后用包含限制性位点的引物进行第二步PCR。BACK引物的限制性位点是ApaLI，而FOR引物的限制性位点是AscI。VH-CH1的BACK和FOR引物的限制性位点分别是SfiI和NotI。或者，可用以限制性位点标记的引物(FOR引物具有AscI位点，而基于FR4的BACK引物具有BsteII位点)来再扩增DNA区段，并将其克隆为VL片段，由此产生包含与人C区组合的大羊驼来源之V区的嵌合Fab。反义引物在表4中示出。
在50μl反应体积中使用Phusion聚合酶(ThermoFischer)和500pM的各引物将PCR进行28个循环(在96℃下1分钟，在60℃下1分钟以及在72℃下1分钟)。
按照在Dreier等的美国专利申请公开2011/0300140中所述进行Fab文库的构建。
表1.用于骆驼科动物VH基因扩增的FR1引物
表2.用于骆驼科Vλ基因扩增的FR1引物
表3.用于骆驼科动物Vκ基因扩增的FR1引物
表4.用于VH、Vλ和Vκ基因扩增的反义引物(5’-3’)
在表中提供的引物序列中以及本文中使用了以下符号：
S-G或C
M-A或C
Y-T或C
K-G或T
W-A或T
R-G或A
N-A、C、T、G、未知或其他的。
因此，已经参照上面讨论的一些实施方案描述了本发明。应认识到，这些实施方案易于进行本领域技术人员公知的多种修改和变化。例如，可通过修改和/或微调PCR引物来修改抗体文库。
除了上面描述的那些之外，还可对本文所述的结构和技术进行许多修改，而不偏离本发明的精神和范围。因此，尽管已经描述了一些具体实施方案，但是这些仅是一些实施例并且不会限制本发明的范围。

Claims (16)

1.抗体文库，其获得自骆驼科动物物种，所述文库包含属于至少七个不同人抗体链家族的抗体链。
2.根据权利要求1所述的抗体文库，其包含一个人抗体链家族中由至少两个不同基因表达的抗体链。
3.根据权利要求1所述的抗体文库，其获得自大羊驼。
4.根据权利要求1所述的抗体文库，其包含属于至少十个不同人抗体链家族的抗体链。
5.根据权利要求1所述的抗体文库，其包含属于至少十二个不同人抗体链家族的抗体链。
6.根据权利要求1所述的抗体文库，其包含属于至少十五个不同人抗体链家族的抗体链。
7.根据权利要求1所述的抗体文库，其包含以下人链家族中的至少一种抗体链：VH6、Vκ3和Vλ6。
8.根据权利要求1所述的抗体文库，其包含人抗体链家族VH3、Vκ1和Vλ6的成员。
9.根据权利要求8所述的抗体文库，其包含人抗体链家族VH1、VH3、Vκ1和Vλ6的成员。
10.根据权利要求9所述的抗体文库，其包含人抗体链家族VH1、VH3、Vκ1、Vλ1和Vλ6的成员。
11.根据权利要求11所述的抗体文库，其包含人抗体链家族VH1、VH3、Vκ1、Vλ1、Vλ2和Vλ6的成员。
12.根据权利要求11所述的抗体文库，其包含人抗体链家族VH1、VH3、Vκ1、Vλ1、Vλ2和Vλ6的成员。
13.根据权利要求12所述的抗体文库，其包含人抗体链家族VH1、VH3、Vκ1、Vκ2、Vλ1、Vλ2和Vλ6的成员。
14.一种用于构建来自骆驼科动物物种之免疫文库的方法，其包括使用具有以下序列的引物在PCR中扩增Fab片段的步骤：GAGGTGCAGSTGGTGGAGTCTGGG
或CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGG。
15.一种用于构建来自骆驼科动物物种之免疫文库的方法，其包括使用具有以下序列的引物在PCR中扩增Fab片段的步骤：GCTACCCAGRTGACCCAGTCTYCCTCC
或GAAATTGTGCTGACCCAGTCTCCGGCC。
16.一种用于构建来自骆驼科动物物种之免疫文库的方法，其包括使用具有以下序列的引物在PCR中扩增Fab片段的步骤：GAGGTTGTGCTGACTCAGCCCAGCTC。
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