CN102858800A - 人源化抗体 - Google Patents
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Abstract
本公开内容涉及来源于骆驼科(Camelidae)物种常规抗体库的人源化抗体。具体地,本公开内容提供包含骆驼科动物VH结构域以及λ轻链或κ轻链型骆驼科动物VL结构域的抗体,其特征在于所述VH结构域和/或VL结构域中存在至少一个人源化氨基酸替换。
Description
技术领域
本发明涉及来源于骆驼科(Camelidae)物种常规抗体库的新的人源化抗体。
背景技术
单克隆抗体已被广泛地用作研究工具,并且越来越多地被用作治疗或诊断试剂。目前有超过20种不同的单克隆抗体已经获得监管部门的批准以用于治疗多种不同的疾病,其中包括癌症、炎症、自身免疫病、感染性疾病、哮喘、心血管疾病和移植排斥,而且在开发过程中的单克隆抗体药物的数量也在逐年增加。
啮齿类动物(特别是鼠)单克隆抗体由于其非人源性的相关问题(特别是其在人类宿主中的免疫原性)因而在人类治疗中的实用性具有局限。为了尽可能地降低人类对治疗性抗体药物的免疫应答,单克隆抗体技术已经从完全小鼠抗体发展到嵌合抗体(小鼠的可变结构域被嫁接到人IgG的骨架上)、人源化抗体(小鼠的CDR被嫁接到人IgG的骨架上)、“完全人”抗体(来源于合成文库和非免疫文库或来源于经免疫的表达部分人IgG库的转基因小鼠)。
许多可以生产针对治疗性目的之靶标抗原的完全人或“人源化”单克隆抗体的技术平台已被开发。这些平台中的每一个都有其独特的特点和潜在的缺陷。
小鼠单克隆抗体的人源化最初通过将小鼠的可变结构域与人的恒定结构域结合而实现,产生具有约70%人源成份的所谓“嵌合抗体”。随后,更进一步的人源化通过将小鼠单克隆抗体的互补决定区(complementarity-determining region,CDR)嫁接到人抗体可变抗体结构域的框架区上实现。此外,发现存在于这些框架区中的一些氨基酸残基与CDR或抗原相互作用,而后使人源化抗体中的这些氨基酸回复突变以提高结合。(Almagro等Frontiers in Bioscience,13:1619-1633(2008))。使用这种方法改造的单克隆抗体在人源化后与人类的VH和VL结构域序列有较高程度的一级序列同源性,但缺点是其可能以不具备人样结构的高变环(hypervariable loop)来结束,这是因为并非所有小鼠编码的CDR都使用标准的折叠和标准折叠的组合,而在人抗体中则没有这种情况发生(Almagro等,Mol.Immunol.34:1199-1214(1997);Almagro等,Immunogen.47:355-63(1998))。更糟糕的是人源化此类抗体通常需要进行大量的突变(其过程复杂且费时),由于人源化需要进行大量的改变并且鼠源库中主要使用Vκ结构域(而所有人抗体中约一半具有Vλ结构域),抗体还有丧失亲和力和效力的风险。替代性的人源化方法包括表面重塑(resurfacing)或镶饰(veneering),其中只替换暴露于溶剂的与人不同的框架残基,而保留埋藏的或部分埋藏的残基和参与结构域间接触的残基(Padlan E.(1991)Mol Immunol.)。更加严格的方法是SDR移植,其中将CDR移植到人FR上,但除此之外,将CDR中的残基突变成人的对应残基,同时仅保留与抗原接触的特异性决定残基(SpecificityDetermining Residue(SDR))(Kashmiri S.V.S.等(2005)Methods)。
作为对人源化小鼠单克隆抗体潜在的改进,“完全人”单克隆抗体可以通过两种非常不同的方法生产。第一种方法是从完全合成的人类组合抗体文库(例如MorphoSys)中筛选或者从非免疫抗体文库(Vaughan T.J.等(1996)Nat Biotechnol.,Cambridge AntibodyTechnology;de Haard H.J.等(1999)J Biol Chem.,DYAX)中筛选。这种方法的潜在缺点是,这些文库只是接近于人类种系中天然存在的功能多样性,因而其多样性是较有限的。此外,使用这种方法产生的抗体不包含体内选择的CDR,因为它们出现在通过主动免疫获得的抗体中,因而通常必须进行亲和力成熟(affinity maturation)以提高其对靶标抗原的亲和力。亲和力成熟是一个耗时的过程,其可能会大大增加筛选出抗体的时间。此外,在亲和力成熟过程中,某些氨基酸残基可能会被改变,这可能对所得的抗体的结合特异性或稳定性和产生具有负面影响(Wu等,J.Mol.Biol.368:652-65(2007))。
另一种“完全人”平台是基于用人类种系的抗体编码序列进行改造以取代鼠免疫球蛋白编码区的转基因小鼠(例如HuMab、Medarex)。这些系统的优点是:抗体是使用靶标抗原通过主动免疫而产生的,即它们具有针对抗原的高初始亲和力,并且不需要或只需最低限度地对原始抗体进行抗体改造以使它们更加人源化。然而,转基因小鼠品系必然是高度近交的,这对于抗体应答的强度和多样性具有不利影响。该平台的另一个缺点是在一些转基因小鼠系统中由于人类Fc/小鼠Fc受体相互作用可能导致B细胞成熟障碍。
另一种平台是基于免疫非人灵长类动物(特别是食蟹猴(cynomologous monkey))。由于猴子与人类的免疫球蛋白之间氨基酸序列具有高度一致性,因此推断在猴子中产生的抗体将几乎不需要或不需要为使其适用于人类治疗而额外地对可变结构域进行“人源化”(见WO93/02108)。但是,在这些灵长类动物化抗体(primatized antibody)中经常发现VH中CDR1和CDR2形成的非人类典型的折叠组合。
发明内容
本发明提供“人源化”单克隆抗体(抗原结合多肽)平台,其避免了现有技术中人源化或完全人抗体平台所发现的部分或全部缺点,并且其可产生针对广泛的具有治疗意义的靶标抗原具有高度特异性和亲和力的抗体,同时最大限度地减小其在人类宿主中的免疫原性。
已经发现,来自于骆驼科(Camelidae)动物常规抗体的VH和VL结构域与人抗体VH和VL结构域在框架区表现出高度的氨基酸序列一致性。事实上,骆驼科动物常规的VH结构域与人类VH结构域之间以及骆驼科动物常规的VL结构域与人类VL结构域之间的序列一致性程度可以接近于在人类与其他灵长类动物物种(例如食蟹猴)之间所观察到的程度,而这远远高于根据人类和骆驼科动物之间的进化距离所预期的程度。该发现是出人意料的,因为骆驼科动物抗体重链可变结构域(variable domainof heavy-chain camelid antibody,VHH)并未显示出与人类的可变结构域具有高度的序列同源性。
此外,已经发现骆驼科动物VH和VL结构域的高变环(H1、H2、L1、L2和L3)与人类VH和VL结构域的高变环通常表现出高度的结构同源性,考虑到人类与骆驼科动物之间的进化距离,这又是意料之外的。骆驼科动物常规抗体(或更确切地说是该抗体的高变环)与人抗体之间的高度结构同源性也同样出人意料,这是因为已有报道骆驼科动物抗体重链的高变环在构象和长度上与人类和小鼠VH中相应的环差异很大(见综述De Genst等,Develop Compo Immunol.30:187-98(2006))。
与人抗体框架区具有氨基酸一级序列的高度同源性、抗原结合位点(包括高变环)与人抗体结合位点具有的高度结构同源性以及骆驼科动物常规抗体可由与人类有很大进化距离的远交动物种群主动免疫获得的事实导致鉴定了骆驼科动物的常规抗体作为有吸引力的起点用于改造得到在人类治疗中具有潜在应用的单克隆抗体。
另外,大量新的常规骆驼科动物抗体已被测序,并且将骆驼科动物VH结构域和VL结构域的氨基酸序列与人VH和VL序列进行比较分析。从这些分析中,鉴定了骆驼科动物VH或VL序列中数个关键的氨基酸位置,这些位置处的氨基酸残基在骆驼科动物与人VH和VL之间存在显著差异。该信息促进了新的人源化策略,其中骆驼科动物VH和/或VL结构域中的一个或更多个特定位置被替换为人VH或VL序列中相应位置的氨基酸。
因此,在第一个方面中,本发明提供抗体,其包含骆驼科动物VH结构域以及λ轻链型(Vλ)或κ轻链型(Vκ)骆驼科动物VL结构域,其特征在于在所述VH结构域和/或所述VL结构域中存在至少一个氨基酸替换,所述氨基酸替换选自以下:
(a)所述骆驼科动物VH结构域中的氨基酸替换,其中所述骆驼科动物VH结构域中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人VH结构域序列中相应位置上所发现的氨基酸,所述位置根据Kabat选自:H1、H5、H7、H11、H12、H13、H14、H29、H30、H37、H40、H48、H67、H68、H69、H71、H74、H77、H78、H80、H81、H82b、H83、H84、H85、H86、H89、H93、H94和H108;以及
(b)所述骆驼科动物VL结构域中的氨基酸替换,其中对λ轻链型的骆驼科动物VL结构域(Vλ)而言,所述骆驼科动物Vλ结构域中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人Vλ结构域序列中相应位置上所发现的氨基酸,所述位置根据Kabat选自:L1、L2、L3、L7、L8、L9、L11、L14、L15、L17、L18、L19、L20、L38、L39、L40、L42、L44、L46、L47、L49、L58、L59、L60、L66、L67、L69、L70、L71、L72、L74、L76、L78、L80、L84和L103;对κ轻链型的骆驼科动物VL结构域(Vκ)而言,所述骆驼科动物Vκ结构域中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人Vκ结构域序列中相应位置上所发现的氨基酸,所述位置根据Kabat为:K1、K3、K4、K7、K9、K11、K12、K13、K14、K15、K18、K19、K36、K42、K43、K45、K46、K58、K63、K70、K77、K78、K79、K80、K83、K100、K103、K104和K106。
在第二个方面中,本发明提供抗体,其包含骆驼科动物VH结构域,其中所述骆驼科动物VH结构域中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人VH结构域序列中相应位置上所发现的氨基酸,所述位置根据Kabat编号为H1、H5、H7、H11、H12、H13、H14、H29、H30、H37、H40、H48、H67、H68、H69、H71、H74、H77、H78、H80、H81、H82b、H83、H84、H85、H86、H89、H93、H94或H108;和/或包含属于λ轻链型的骆驼科动物VL结构域(Vλ),其中所述骆驼科动物Vλ结构域中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人Vλ结构域序列中相应位置上所发现的氨基酸,所述位置根据Kabat编号为L1、L2、L3、L7、L8、L9、L11、L14、L15、L17、L18、L19、L20、L38、L39、L40、L42、L44、L46、L47、L49、L58、L59、L60、L66、L67、L69、L70、L71、L72、L74、L76、L78、L80、L84或L103;和/或包含属于κ轻链型的骆驼科动物VL结构域(Vκ),其中所述骆驼科动物Vκ结构域中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人Vκ结构域序列中相应位置上所发现的氨基酸,所述位置根据Kabat编号为K1、K3、K4、K7、K9、K11、K12、K13、K14、K15、K18、K19、K36、K42、K43、K45、K46、K58、K63、K70、K77、K78、K79、K80、K83、K100、K103、K104或K106。
在另一个实施方案中,骆驼科动物种系结构域(即在全部或大多数所分析的体细胞突变(somatically mutated)结构域中所观察到的)中存在的框架残基中不同于最佳匹配人类种系家族成员中存在之相应残基或者与人类种系家族相应共有序列中存在之残基相比为次优的一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人类种系和/或共有序列中相应位置上所发现的氨基酸。次优的是,当骆驼科动物种系结构域中的这些残基与比对时在最佳匹配人类种系中所存在的残基一致时,由体细胞突变引入的与人类种系结构域不同的突变残基(即在体细胞突变骆驼科动物结构域中以较低的频率出现)。
在多个实施方案中,VH结构域中使骆驼科动物种系所编码残基转换成最佳匹配人类种系家族成员中所存在之残基或共有人类种系家族之残基的突变如下:
在一个实施方案中,H1位的氨基酸被替换。在非限制性的实施方案中,H1位的氨基酸被替换为Q或E。
在一个实施方案中,H7位的氨基酸被替换。在非限制性的实施方案中,H7位的氨基酸被替换为S。
在一个实施方案中,H11位的氨基酸被替换。在非限制性的实施方案中,H11位的氨基酸被替换为V。
在一个实施方案中,H12位的氨基酸被替换为K。
在一个实施方案中,H13位的氨基酸被替换为K,或次优选为R或Q。
在一个实施方案中,H14位的氨基酸被替换为P。
在一个实施方案中,H29位的氨基酸被替换为V,或次优选为F。
在一个实施方案中,H30位的氨基酸被替换为S。
在一个实施方案中,H37位的氨基酸被替换为V或I,或次优选为F。
在一个实施方案中,H40位的氨基酸被替换为A。
在一个实施方案中,H48位的氨基酸被替换为I。
在一个实施方案中,H67位的氨基酸被替换为V。
在一个实施方案中,H68位的氨基酸被替换为T。
在一个实施方案中,H69位的氨基酸被替换为M,或次优选为I或S。
在一个实施方案中,H71位的氨基酸被替换为R或V,或次优选为A、E或T。
在一个实施方案中,H74位的氨基酸被替换。在非限制性的实施方案中,H74位的所述氨基酸可替换为S或次优选为A。
在一个实施方案中,H77位的氨基酸替换S或次优选为T。
在一个实施方案中,H78位的氨基酸被替换为V或L,或次优选为A。
在一个实施方案中,H80位的氨基酸被替换为M。
在一个实施方案中,H81位的氨基酸被替换为K。
在一个实施方案中,H83位的氨基酸被替换为R或次优选为K。
在一个实施方案中,H84位的氨基酸被替换为A或次优选为T。
在一个实施方案中,H85位的氨基酸用替换为A。
在一个实施方案中,H86位的氨基酸被替换为D。
在一个实施方案中,H94位的氨基酸被替换为R,或次优选为K或T。
在一个实施方案中,H108位的氨基酸被替换为M或次优选为L或T。
下列为VH结构域中的另一些突变,其转换与人类种系结构域不同的体细胞突变残基,而骆驼科动物种系结构域中的这些残基与最佳匹配之人类种系中所存在的残基一致:
在一个实施方案中,H5位的氨基酸被替换为L或次优选为V。
在一个实施方案中,H82b位的氨基酸被替换为S。
在一个实施方案中,H89位的氨基酸被替换为V或次优选为L。
在一个实施方案中,H93位的氨基酸被替换为A或次优选为T。
Vλ轻链型中,将骆驼科动物种系所编码残基转换为最佳匹配人类种系家族成员或次优地转换为人类种系家族共有序列的最优选突变是:
在一个实施方案中,L1位的氨基酸被替换为S。
在一个实施方案中,L2位的氨基酸被替换为Y。
在一个实施方案中,L3位的氨基酸被替换为E。
在一个实施方案中,L7位的氨基酸被替换为D或次优选为P或L。
在一个实施方案中,L8位的氨基酸被替换为R或P或次优选为A、S、L或H。
在一个实施方案中,L9位的氨基酸被替换为P或次优选为A。
在一个实施方案中,L11位的氨基酸被替换为A、V、S或F或者次优选为L或H。
在一个实施方案中,L14位的氨基酸被替换为T、S或A。
在一个实施方案中,L15位的氨基酸被替换为P或次优选为L或T。
在一个实施方案中,L17位的氨基酸被替换为Q或E或者次优选为A。
在一个实施方案中,L18位的氨基酸被替换为R或S或者次优选为K。
在一个实施方案中,L19位的氨基酸被替换为V或P或A。
在一个实施方案中,L20位的氨基酸被替换为R或次优选为S。
在一个实施方案中,L39位的氨基酸被替换为H或次优选为P。
在一个实施方案中,L40位的氨基酸被替换为P。
在一个实施方案中,L42位的氨基酸被替换为K或次优选为T。
在一个实施方案中,L47位的氨基酸被替换为M。
在一个实施方案中,L58位的氨基酸被替换为V。
在一个实施方案中,L59位的氨基酸被替换为P或次优选为S。
在一个实施方案中,L60位的氨基酸被替换为D或次优选为E。
在一个实施方案中,L66位的氨基酸被替换为S或次优选为N或T。
在一个实施方案中,L67位的氨基酸被替换为S或L或者次优选为P。
在一个实施方案中,L69位的氨基酸被替换为T或N。
在一个实施方案中,L70位的氨基酸被替换为T或次优选为M、I或A。
在一个实施方案中,L71位的氨基酸被替换为V或次优选为A或T。
在一个实施方案中,L72位的氨基酸被替换为S或I或者次优选为T或L。
在一个实施方案中,L74位的氨基酸被替换为A或次优选为G。
在一个实施方案中,L76位的氨基酸被替换为S或T。
在一个实施方案中,L78位的氨基酸被替换为V或次优选为A、T或I。
在一个实施方案中,L80位的氨基酸被替换为S或A或者次优选为T或P。
在一个实施方案中,L84位的氨基酸被替换为A或S。
在一个实施方案中,L103位的氨基酸被替换为K。
下列为Vλ轻链型中的另一些突变,其转换与人类种系结构域不同的体细胞突变残基,而骆驼科动物种系结构域中的这些残基与最佳匹配之人类种系中所存在的残基一致:
在一个实施方案中,L38位的氨基酸被替换为Q。
在一个实施方案中,L44位的氨基酸被替换为P。
在一个实施方案中,L46位的氨基酸被替换为L。
在一个实施方案中,L49位的氨基酸被替换为Y。
下面所列为Vκ型轻链中最优选的突变,其将骆驼科动物种系所编码残基转换为最佳匹配人类种系家族成员或者次优地转换为人类种系家族共有序列:
在一个实施方案中,K1位的氨基酸被替换为A或次优选为D或N。
在一个实施方案中,K4位的氨基酸被替换为L或次优选为M。
在一个实施方案中,K7位的氨基酸被替换为S或次优选为T。
在一个实施方案中,K9位的氨基酸被替换为L或D。
在一个实施方案中,K11位的氨基酸被替换为V或L。
在一个实施方案中,K12位的氨基酸被替换为K、P或A或者次优选为S。
在一个实施方案中,K13位的氨基酸被替换为K或V。
在一个实施方案中,K14位的氨基酸被替换为T。
在一个实施方案中,K15位的氨基酸被替换为V或L或者次优选为T。
在一个实施方案中,K18位的氨基酸被替换为P或R或者次优选为Q。
在一个实施方案中,K19位的氨基酸被替换为A。
在一个实施方案中,K36位的氨基酸被替换为Y或次优选为F或L。
在一个实施方案中,K39位的氨基酸被替换为K。
在一个实施方案中,K42位的氨基酸被替换为K。
在一个实施方案中,K43位的氨基酸被替换为A或P或者次优选为V。
在一个实施方案中,K45位的氨基酸被替换为K。
在一个实施方案中,K46位的氨基酸被替换为L或次优选为R。
在一个实施方案中,K58位的氨基酸被替换为V。
在一个实施方案中,K63位的氨基酸被替换为S。
在一个实施方案中,K68位的氨基酸被替换为G。
在一个实施方案中,K70位的氨基酸被替换为D或次优选为E。
在一个实施方案中,K77位的氨基酸被替换为S或次优选为C。
在一个实施方案中,K78位的氨基酸被替换为L。
在一个实施方案中,K79位的氨基酸被替换为Q或E。
在一个实施方案中,K80位的氨基酸被替换为P或A或者次优选为S。
在一个实施方案中,K83位的氨基酸被替换为F或V或者次优选为I。
在一个实施方案中,K100位的氨基酸被替换为Q。
在一个实施方案中,K103位的氨基酸被替换为K。
在一个实施方案中,K104位的氨基酸被替换为V。
在一个实施方案中,K106位的氨基酸被替换为I。
下列为Vκ型轻链中次优选的突变,其转换与人类种系结构域不同的体细胞突变残基,而骆驼科动物种系结构域中的这些残基与最佳匹配之人类种系中所存在的残基一致:
在一个实施方案中,K3位的氨基酸被替换为Q或次优选为R。
在第二个方面中,本发明提供编码根据本发明第一个方面之抗体的多核苷酸分子。
在另一个方面中,本发明提供了包含所述多核苷酸分子(与允许抗体在宿主细胞表达或在无细胞表达系统中转录和翻译的调控序列有效连接)的表达载体,还提供含有所述表达载体的宿主细胞或无细胞表达系统。
在又一个方面中,本发明提供了生产重组抗体的方法,其包括在允许抗体表达的条件下培养所述宿主细胞或无细胞表达系统以及回收所表达的抗体。
附图说明
图1-显示ELISA的结果,其中经IL1-β免疫的大羊驼(llama)的血清在免疫后第0天及第28天用来检测IL1-β抗体的存在。
图2(SEQ ID NO:1~23)-示意与IL-1β发生免疫反应的两种Fab(编号为1E2和1F2)之“人源化”变体的氨基酸序列。根据与最接近的人类种系的比对,提出了在1E2和1F2的VH和Vλ框架区具有突变。除了完全人源化的(hum)和野生型的(wt)V区域以外,还提出了只有三个野生型残基保留的“安全变体”(safe)。
图3-显示ELISA的结果,其中使用重组表达的Fab来检测其与biot-IL-1Beta结合的能力。为此,利用包被有抗myc包被的Maxisorp板捕获Fab。加入生物素化的人IL-1β,然后使用经HRP缀合的链霉亲和素检测所结合的细胞因子。
图4-显示噬菌体ELISA的结果,其中检测了展示Fab 1E2和1F2之人源化变体的噬菌体与IL-1β的结合。
图5-显示ELISA的结果,其中检测了嵌合1E2与IL-1β的结合。
图6-显示成熟的大羊驼(Llama glama)VH框架区1(FR1)共有序列与人类种系VH FR1共有序列(VH1~VH7,SEQ ID NO:25~31)的比较。(A)VH1-46大羊驼FR1共有序列(SEQ ID NO:24)。(B)VH3-11大羊驼FR1共有序列(SEQ ID NO:32)。(C)VH3-21大羊驼FR1共有序列(SEQ ID NO:33)。(D)VH3-23大羊驼FR1共有序列(SEQ ID NO:34)。(E)VH3-48大羊驼FR1共有序列(SEQ ID NO:35)。(F)~(G)VH3-66大羊驼FR1共有序列(SEQ ID NO:36)。(H)VH3大羊驼FR1共有序列(SEQID NO:37)。(I)~(J)VH4-30-4大羊驼FR1共有序列(SEQ ID NO:38)。
图7-显示成熟的大羊驼VH框架区2(FR2)共有序列与人类种系VH FR2共有序列(VH1~VH7,SEQ ID NO:40~46)的比较。(A)VH1-46大羊驼FR2共有序列(SEQ ID NO:39)。(B)VH3-11大羊驼FR2共有序列(SEQ ID NO:47)。(C)VH3-21大羊驼FR2共有序列(SEQ ID NO:48)。(D)VH3-23大羊驼FR2共有序列(SEQ ID NO:49)。(E)VH3-48大羊驼FR2共有序列(SEQ ID NO:50)。(F)~(G)VH3-66大羊驼FR2共有序列(SEQ ID NO:51)。(H)VH3大羊驼FR2共有序列(SEQ ID NO:52)。(I)~(J)VH4-30-4大羊驼FR2共有序列(SEQ ID NO:53)。
图8-显示成熟大羊驼VH框架区3(FR3)共有序列与人类种系VH FR3共有序列(VH1~VH7,SEQ ID NO:55~61)的比较。(A)VH1-46大羊驼FR3共有序列(SEQ ID NO:54)。(B)~(C)VH3-11大羊驼FR3共有序列(SEQ ID NO:62)。(D)~(E)VH3-21大羊驼FR3共有序列(SEQID NO:63)。(F)~(G)VH3-23大羊驼FR3共有序列(SEQ ID NO:64)。(H)VH3-48大羊驼FR3共有序列(SEQ ID NO:65)。(I)~(J)VH3-66大羊驼FR3共有序列(SEQ ID NO:66)。(K)~(L)VH3大羊驼FR3共有序列(SEQ ID NO:67)。(M)~(N)VH4-30-4大羊驼FR3共有序列(SEQ IDNO:68)。
图9-显示成熟的阿尔帕卡羊驼(Llama pacos)VH框架区1(FR1)共有序列与人类种系VH FR1共有序列(VH1~VH7,SEQ ID NO:25~31)的比较。(A)VH1-46阿尔帕卡羊驼FR1共有序列(SEQ ID NO:69)。(B)VH3-66阿尔帕卡羊驼FR1共有序列(SEQ ID NO:70)。(C)VH3-48阿尔帕卡羊驼FR1共有序列(SEQ ID NO:71)。(D)VH3阿尔帕卡羊驼FR1共有序列(SEQ ID NO:72)。(E)~(F)VH4-30-4阿尔帕卡羊驼FR1共有序列(SEQ ID NO:73)。
图10-显示成熟阿尔帕卡羊驼VH框架区2(FR2)共有序列与人类种系VH FR2共有序列(VH1~VH7,SEQ ID NO:40~46)的比较。(A)VH1-46阿尔帕卡羊驼FR2共有序列(SEQ ID NO:74)。(B)~(C)VH3-66阿尔帕卡羊驼FR2共有序列(SEQ ID NO:75)。(D)VH3-48阿尔帕卡羊驼FR2共有序列(SEQ ID NO:76)。(E)~(F)VH3阿尔帕卡羊驼FR2共有序列(SEQ ID NO:77)。(G)~(H)VH4-30-4阿尔帕卡羊驼FR2共有序列(SEQ ID NO:78)。
图11-显示成熟阿尔帕卡羊驼VH框架区3(FR3)共有序列与人类种系VH FR3共有序列(VH1~VH7,SEQ ID NO:55~61)的比较。(A)VH1-46阿尔帕卡羊驼FR3共有序列(SEQ ID NO:79)。(B)VH3-66阿尔帕卡羊驼FR3共有序列(SEQ ID NO:80)。(C)~(D)VH3-48阿尔帕卡羊驼FR3共有序列(SEQ ID NO:81)。(E)VH3阿尔帕卡羊驼FR3共有序列(SEQ ID NO:82)。(F)~(G)VH4-30-4阿尔帕卡羊驼FR3共有序列(SEQ ID NO:83)。
图12-显示成熟大羊驼VL1-44共有序列的框架区1(FR1)序列(SEQID NO:84)与人类种系VL(λ)FR1共有序列的比较。(A)与人VL1~VL6 FR1序列(SEQ ID NO:85~90)的比对。(B)与人VL7~VL10 FR1序列(SEQ ID NO:91~94)的比对。
图13-显示成熟大羊驼VL1-44共有序列的框架区2(FR2)序列(SEQID NO:95)与人类种系VL(λ)FR2共有序列的比较。(A)与人VL1~VL6 FR2序列(SEQ ID NO:96~101)的比对。(B)与人VL7~VL10 FR2序列(SEQ ID NO:102~105)的比对。
图14-显示成熟大羊驼VL1-44共有序列的框架区3(FR3)序列(SEQID NO:106)与人类种系VL(λ)FR3共有序列的比较。(A)与人VL1至VL8 FR3序列(SEQ ID NO:107~114)的比对。(B)与人VL9~VL10FR3序列(SEQ ID NO:115~116)的比对。
图15-显示成熟大羊驼VL2框架区1(FR1)共有序列与人类种系VLFR1共有序列(VK1~VK10,SEQ ID NO:118~125)的比较。(A)大羊驼VL2-11 FR1共有序列(SEQ ID NO:117)的比对。(B)~(C)大羊驼VL2-18 FR1共有序列(SEQ ID NO:126)的比对。
图16-显示成熟大羊驼VL2框架区2(FR2)共有序列与人类种系VLFR2共有序列(VK1~VK10)的比较。(A)VL2-11大羊驼FR2共有序列(SEQ ID NO:127)的比对。(B)~(C)VL2-18大羊驼FR2共有序列(SEQID NO:128)的比对。
图17-显示成熟大羊驼VL2框架区3(FR3)共有序列与人类种系VLFR3共有序列(VK1~VK10,SEQ ID NO:130~139)的比较。(A)VL2-11大羊驼FR3共有序列(SEQ ID NO:129)的比对。(B)~(C)VL2-18大羊驼FR3共有序列(SEQ ID NO:140)的比对。
图18-显示成熟大羊驼VL3框架区1(FR1)共有序列与人类种系VLFR1共有序列(VL1~VL10,SEQ ID NO:85~94)的比较。(A)VL3-19大羊驼FR1共有序列(SEQ ID NO:141)的比对。(B)~(C)VL3-25大羊驼FR1共有序列(SEQ ID NO:142)的比对。
图19-显示成熟大羊驼VL3框架区2(FR2)共有序列与人类种系VLFR2共有序列(VL1~VL10,SEQ ID NO:96~105)的比较。(A)VL3-19大羊驼FR2共有序列(SEQ ID NO:143)的比对。(B)~(C)VL3-25大羊驼FR2共有序列(SEQ ID NO:144)的比对。
图20-显示成熟大羊驼VL3框架区3(FR3)共有序列与人类种系VL(λ)FR3共有序列(VL1~VL10,SEQ ID NO:130~139)的比较。(A)VL3-19大羊驼FR3共有序列(SEQ ID NO:145)的比对。(B)~(C)VL3-25大羊驼FR3共有序列(SEQ ID NO:146)的比对。
图21-显示成熟大羊驼VL5框架区1(FR1)共有序列(SEQ IDNO:147)与人类种系VL FR1共有序列的比较。(A)与人类种系VL1~VL6 FR1序列(SEQ ID NO:85~90)的比对。(B)与人类种系VL7~VL10FR1序列(SEQ ID NO:91~94)的比对。
图22-显示成熟大羊驼VL5框架区2(FR2)共有序列(SEQ IDNO:148)与人类种系VL FR2共有序列的比较。(A)与人类种系VL1~VL6 FR2序列(SEQ ID NO:96~101)的比对。(B)与人类种系VL7~VL10 FR2序列(SEQ ID NO:102~105)的比对。
图23-显示成熟大羊驼VL5框架区3(FR3)共有序列(SEQ IDNO:149)与人类种系VL FR3共有序列的比较。(A)与人类种系VL1~VL6 FR3序列(SEQ ID NO:150~155)的比对。(B)与人类种系VL7~VL10 FR3序列(SEQ ID NO:156~159)的比对。
图24-显示成熟大羊驼VL8-61框架区1(FR1)共有序列(SEQ ID NO:160)与人类种系VL FR1共有序列的比较。(A)与人类种系VL1~VL6FR1序列(SEQ ID NO:85~90)的比对。(B)与人类种系VL7~VL10 FR1序列(SEQ ID NO:91~94)的比对。
图25-显示成熟大羊驼VL8-61框架区2(FR2)共有序列(SEQ ID NO:161)与人类种系VL FR2共有序列的比较。(A)与人类种系VL1~VL6FR2序列(SEQ ID NO:96~101)的比对。(B)与人类种系VL7~VL10FR2序列(SEQ ID NO:102~105)的比对。
图26-显示成熟大羊驼VL8-61框架区3(FR3)共有序列(SEQ IDNO:162)与人类种系VL FR3共有序列的比较。(A)与人类种系VL1~VL6 FR3序列(SEQ ID NO:107~112)的比对。(B)与人类种系VL7~VL10 FR3序列(SEQ ID NO:113~116)的比对。
图27-显示成熟大羊驼Vκ框架区1(FR1)共有序列与人类种系VL(κ)FR1共有序列(VK1~VK5,(SEQ ID NO:164~168))的比较。(A)大羊驼VK1 FR1共有序列(SEQ ID NO:163)的比对。(B)大羊驼VK2FR1共有序列(SEQ ID NO:169)的比对。(C)大羊驼VK4 FR1共有序列(SEQ ID NO:170)比对。
图28-显示成熟大羊驼Vκ框架区2(FR2)共有序列与人类种系VL(κ)FR2共有序列(VK1~VK5,(SEQ ID NO:172~176))的比较。(A)大羊驼VK1 FR2共有序列(SEQ ID NO:171)的比对。(B)大羊驼VK2FR2共有序列(SEQ ID NO:177)比对。(C)大羊驼VK4FR2共有序列(SEQ ID NO:178)的比对。
图29-显示成熟大羊驼Vκ框架区3(FR3)共有序列与人类种系VL(κ)FR3共有序列(VK1~VK5,(SEQ ID NO:180~184))的比较。(A)大羊驼VK1 FR3共有序列(SEQ ID NO:179)的比对。(B)大羊驼VK2FR3共有序列(SEQ ID NO:185)的比对。(C)大羊驼VK4 FR3共有序列(SEQ ID NO:186)的比对。
图30-显示人Vκ序列(VK1-13、VK2-28、VK4-1)中特定位置上和与每个人Vκ序列最同源的骆驼科动物(大羊驼)序列中相应位置上不同氨基酸残基的利用百分比。(A)FR1和CDR1中特定Kabat位置上的氨基酸利用百分比(虚线部分)。(B)FR2、CDR2、FR3和CDR3中特定Kabat位置上的氨基酸利用百分比。
图31-显示人VL1序列(VL1-44)中特定位置上和与人类序列最同源的骆驼科动物(大羊驼)序列中相应位置上不同氨基酸残基的利用百分比。
图32-显示特定人VL2序列(VL2-11和VL2-18)中特定位置上和与每个人类序列最同源的骆驼科动物(大羊驼)序列中相应位置上不同氨基酸残基的利用百分比。(A)CDR1、FR1、CDR2和FR2中选定的位置。(B)FR2和CDR3中选定的位置。
图33-显示特定人VL3序列(VL3-19和VL3-25)中特定位置上和与每个人类序列最同源的骆驼科动物(大羊驼)序列中相应位置上不同氨基酸残基的利用百分比。(A)CDR1、FR1和CDR2中选定的位置。(B)FR2、CDR3和FR3中选定的位置。
图34-显示人VL5序列(VL5-37)中特定位置上和与人类序列最同源的骆驼科动物(大羊驼)序列中相应位置上不同氨基酸残基的利用百分比。
图35-显示人VL8序列(VL8-61)中特定位置上和与人类序列最同源的骆驼科动物(大羊驼)序列中相应位置上不同氨基酸残基的利用百分比。
图36-显示人VH1序列(VH1-46)中特定位置上和与人类序列最同源的骆驼科动物(大羊驼)序列中相应位置上不同氨基酸残基的利用百分比。
图37-显示选定的人VH3序列(VH3-21、VH3-48、VH3-23、VH3-66、VH3-11)中特定位置上和与人类序列最同源的骆驼科动物(大羊驼)序列中相应位置上不同氨基酸残基的利用百分比。(A)FR1、CDR1和FR2中选定的位置。(B)CDR2中选定的位置。(C)FR3中选定的位置。
图38-显示人VH4序列(VH4-30-4)中特定位置上和与人类序列最同源的骆驼科动物(大羊驼)序列中相应位置上不同氨基酸残基的利用百分比。
图39-显示人类种系序列(HJ3)中特定位置上和与人类序列最同源的骆驼科动物(大羊驼)序列中相应位置上不同氨基酸残基的利用百分比。
图40-显示人VH1序列(VH1-46)中特定位置上和与人类序列最同源的骆驼科动物(阿尔帕卡羊驼)序列中相应位置上不同氨基酸残基的利用百分比。
图41-显示人VH3序列(VH3-48和VH3-66)中特定位置上和与人类序列最同源的骆驼科动物(阿尔帕卡羊驼)序列中相应位置上不同氨基酸残基的利用百分比。(A)FR1、CDR1、FR2和CDR2中选定的位置。(B)CDR2和FR3中选定的位置。
图42-显示人VH4序列(VH4-30-4)中特定位置上和与人类序列最同源的骆驼科动物(阿尔帕卡羊驼)序列中相应位置上不同氨基酸残基的利用百分比。
发明详述
本发明涉及来源于骆驼科物种常规抗体库的对期望靶标抗原具有特异性的人源化抗体。
因此,在第一方面中,本发明提供了抗体,更具体的是骆驼科动物来源之抗体的人源化变体,其包含骆驼科动物VH结构域以及λ轻链型(Vλ)或κ轻链型(Vκ)的骆驼科动物VL结构域,其特征在于在所述VH结构域和/或所述VL结构域中存在至少一个氨基酸替换,所述氨基酸替换选自以下:
a)所述骆驼科动物VH结构域中的氨基酸替换,其中所述骆驼科动物VH结构域中一个或更多个位置的氨基酸被替换为人VH结构域序列中相应位置上存在的氨基酸,所述位置根据Kabat选自:H1、H5、H7、H11、H12、H13、H14、H29、H30、H37、H40、H48、H67、H68、H69、H71、H74、H77、H78、H80、H81、H82b、H83、H84、H85、H86、H89、H93、H94和H108;和
b)所述骆驼科动物VL结构域中的氨基酸替换,其中对λ轻链型的骆驼科动物VL结构域(Vλ)而言,所述骆驼科动物Vλ结构域中一个或更多个位置的氨基酸被替换为人Vλ结构域序列中相应位置上存在的氨基酸,所述位置根据Kabat选自:L1、L2、L3、L7、L8、L9、L11、L14、L15、L17、L18、L19、L20、L38、L39、L40、L42、L44、L46、L47、L49、L58、L59、L60、L66、L67、L69、L70、L71、L72、L74、L76、L78、L80、L84和L103;对κ轻链型的骆驼科动物VL结构域(Vκ)而言,所述骆驼科动物Vκ结构域中一个或更多个位置的氨基酸被替换为人Vκ结构域序列中相应位置上存在的氨基酸,所述位置根据Kabat选自:K1、K3、K4、K7、K9、K11、K12、K13、K14、K15、K18、K19、K36、K42、K43、K45、K46、K58、K63、K70、K77、K78、K79、K80、K83、K100、K103、K104和K106。在下文中,本发明的不同方面会更详细地定义。除非有明确相反的指示,由此定义的每一方面可以与任何其他方面组合。特别是,任何被作为优选或有利的特征可与任何其他被作为优选或有利的特征组合。
定义
术语“抗体”以其最广泛的含义使用,涵盖特异性识别靶标抗原的单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如,双特异性抗体)、抗体片段、免疫粘附素(immunoadhesin)和抗体-免疫粘附素嵌合体。抗体片段的非限制性实例包括单可变结构域(VH、VL或Vκ)(Skerra A.和Pluckthun,A.(1988)Science 240:1038-41)、单链抗体(例如,ScFv)(Bird,R.E.等,(1988)Science 242:423-26;Huston,J.S.等,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-83)、Fab、(Fab′)2或本领域技术人员所熟知的其他片段。
本发明抗体中的VL结构域可以是Vλ类型或Vκ类型。除非另外说明,本文所使用的术语“VL结构域”以其广义使用,指κ类型免疫球蛋白轻链的可变结构域(Vκ)和λ类型免疫球蛋白轻链的可变结构域(Vλ)二者。术语“骆驼科动物VL结构域”和“骆驼科动物来源的VL结构域”是指分离自骆驼科动物物种的VL结构域(或者Vκ类型或者Vλ类型,除非另外说明),以及其相对于天然骆驼科动物VL结构域包含一个或更多个氨基酸替换、插入或缺失的改造变体。
术语“骆驼科动物VH结构域”是指骆驼科动物的任何已知重链同种型(包括γ、ε、δ、α或μ同种型)的VH结构域,以及其相对于天然骆驼科动物VH结构域包含一个或更多个氨基酸替换、插入或缺失的改造变体。术语“骆驼科动物VH结构域”仅指骆驼科动物常规抗体的VH结构域,而不包括骆驼科动物VHH结构域。
术语“骆驼科动物VH结构域”或“骆驼科动物VL结构域”是指分别包含由常规的骆驼科免疫球蛋白可变区基因序列编码之氨基酸序列的VH结构域或VL结构域。编码骆驼科动物VH和/或VL结构域(λ或κ轻链)的常规骆驼科免疫球蛋白基因序列可得自天然存在的免疫球蛋白基因(包括但不限于,从骆驼科动物(例如经期望抗原免疫的骆驼科动物)得到的种系、重排或体细胞突变的免疫球蛋白基因),或者得自来源于天然存在的常规骆驼科免疫球蛋白基因序列的合成基因(包括但不限于,已经改变成包含“异源CDR或框架区序列”的天然存在的骆驼科免疫球蛋白基因,或者从头产生的免疫球蛋白基因(其包含天然存在的常规骆驼科免疫球蛋白基因序列的共有序列或嵌合体))的合成基因。术语“骆驼科动物VH结构域”不包括骆驼科VHH结构域。
术语“异源CDR或框架区序列”包括由骆驼科动物VH或VL(Vλ/Vκ)结构域产生的任何CDR或框架区氨基酸序列改变。
术语“相应位置”是指,根据在Kabat等,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第五版.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD.,1983(其通过引用全部并入本文)中所提出的编号系统,在人VH或VL(Vλ/Vκ)结构域序列中相同编号位置的氨基酸。
术语“人VH结构域序列”广泛包括由人类种系编码的任何抗体重链可变区序列或其部分,及其衍生物。人VH结构域序列的合适的非限制性示例包括人重链种系V、D和/或J区序列,成熟的人VH结构域序列(包括体细胞突变VH结构域),和共有人类种系或成熟人VH结构域序列,或其部分。术语“人VL结构域序列”定义类似。共有序列合适的非限制性示例及其产生方法在美国648213中描述。
术语“来源于”是指生物体的成熟可变区氨基酸序列与来自同一生物体的种系编码的V、D和/或J区氨基酸序列之间的同源性程度。认为与特定种系编码的V、D和/或J区氨基酸序列具有最高程度同源性的可变区“来源于”该种系序列。
术语“种系序列”是指由存在于生物体基因组DNA中的未重排的免疫球蛋白V、D和/或J区或其一部分所编码的氨基酸序列。
本文可以参考属于某家族或与某家族成员匹配的骆驼科动物VH或VL(Vλ/Vκ)结构域。除非另外说明,否则均基于与人VH或VL(Vλ或Vκ)结构域序列的比对将骆驼科动物VH和VL(Vλ或Vκ)结构域“分配”到特定家族或家族成员。因此,本文可将与人VH3家族(而不是VH1、VH2或VH4等)的VH结构域比对最接近的骆驼科动物VH结构域标识为“骆驼科动物VH3结构域”。本文可将与人VH1家族的VH结构域比对最接近的骆驼科动物VH结构域称作“骆驼科动物VH1结构域”。本文可将与人VH4家族的VH结构域比对最接近的骆驼科动物VH结构域称作“骆驼科动物VH4结构域”。类似的,除非另外说明,否则根据与已知家族或家族成员的人VL(Vλ或Vκ)结构域的比对,将骆驼科动物VL(Vλ或Vκ)结构域分配到特定类型。因此,本文可将与κ类型的人VL结构域比对最接近的骆驼科动物VL结构域称作为“骆驼科动物Vκ结构域”,简称为“Vκ”;而本文可将与λ类型的人VL结构域比对最接近的骆驼科动物VL结构域称作“骆驼科动物Vλ结构域”,简称为“Vλ”。
在VK结构域分类中,根据与最接近人亚类型比对,可将骆驼科动物Vκ结构域分配到特定的亚类型。因此,本文可将与人Vκ1、Vκ2和Vκ4比对最接近的骆驼科动物Vκ结构域分别称作“骆驼科动物Vκ1、骆驼科动物Vκ2和骆驼科动物Vκ4”结构域。
还可以根据最匹配的人类种系序列将骆驼科动物VH和VL(Vλ或Vκ)结构域进行分类。因此,例如,本文可将与人VH3-23种系比对最接近的骆驼科动物VH结构域称作骆驼科动物VH3-23结构域,等等。类似的,本文可将与人Vκ1-46种系比对最接近的骆驼科动物Vκ结构域确定为骆驼科动物Vκ1-46结构域。
此外,还可以根据最匹配的人类种系,将由重链或κ/λ轻链结构域的J区段编码的FR4区进行分类。因此,例如,本文可将与人JH3种系比对最接近的骆驼科动物重链可变结构域的FR4称作骆驼科动物JH3区,并且编码FR4的C端部分对人源化或种系化(germlining)尤其有意义。
已知骆驼科动物物种包括两种不同类型的抗体;经典的(或“常规”的)抗体和重链抗体。
本文使用的术语“常规抗体”是指任何同种型的抗体,包括IgA、IgG、IgD、IgE或IgM。骆驼科动物本源的或天然的“常规”抗体通常是异四聚体糖蛋白,由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连,而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链中不同。每条重链和轻链链内也具有规则间隔的二硫桥。每条重链在一端(N端)具有可变结构域(VH),其后是若干恒定结构域。每条轻链在一端(N端)具有可变结构域(VL)而在另一端具有恒定结构域(CL),轻链的恒定结构域与重链的第一个恒定结构域对齐,轻链的可变结构域与重链的可变结构域对齐。认为特定氨基酸残基形成轻、重链可变结构域之间的界面。
术语“重链抗体”是指已知在骆驼科物种中天然存在的第二种类型的抗体,该抗体天然缺失轻链(Hamers-Casterman等,Nature.1993;363;446-8)。重链抗体(heavy-chain antibody,HCAb)由共价二硫键连接的两条重链组成。HCAb中每条重链的一端具有可变结构域。为将它们与骆驼科动物“常规”抗体重链的可变结构域(VH)区分开,HCAb的可变结构域被称为“VHH”。VHH结构域与VH结构域完全不同,它们由骆驼科动物基因组中的不同基因区段编码。
Vλ轻链结构域中的第一、第二和第三高变环在本文中被称为L1(λ)、L2(λ)和L3(λ),并可定义为包含VL结构域中的第24~33位(L1(λ)、第50~56位(L2(λ)和第89~97位(L3(λ)残基(残基编号根据Kabat,CDR定义根据CHothia(见http://www.bioinf.orq.Uk/abs/#cdrdef))。Vκ轻链结构域中的第一、第二和第三高变环在本文中被成为L1(κ)、L2(κ)和L3(κ),并可定义为包含VK结构域中的第24~33位(L1(λ)、第50~56位(L2(λ)和第89~97位(L3(λ)残基(残基编号根据Kabat,CDR定义根据CHothia(见http://www.bioinf.orq.Uk/abs/#cdrdef))。VH结构域中的第一、第二和第三高变环在本文中被称为H1、H2和H3,并可定义为包含VH结构域中的第26~32..34位(H1)、第52~56位(H2)和第95~102位(H3,其长度非常不等)残基(残基编号根据Kabat,CDR定义根据CHothia(见http://www.bioinf.orq.Uk/abs/#cdrdef))。
除非另有说明,术语L1、L2和L3分别是指VL结构域的第一、第二和第三高变环,并且包括来自骆驼科动物Vκ和Vλ同种型二者的高变环。术语H1、H2和H3分别是指VH结构域的第一、第二和第三高变环,并且包括来自骆驼科动物任何已知重链同种型的高变环,包括γ、ε、δ、α或μ。
高变环L1、L2、L3、H1、H2和H3可以各自包括“互补决定区”(或“CDR”)的一部分。术语“高变环”和“互补决定区”不是严格意义的同义词,因为高变环(HV)是基于结构定义的(在http://www.bioinf.org.Uk/abs/#cdrdef网页中称为Chothia定义),而互补决定区(CDR)是基于序列可变性定义的(在前述网页中称为Kabat定义;Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.,1983),并且HV和CDR的范围在某些VH和VL结构域中可以不同。按照Kabat(序列可变性)、Chothia(结构)、AbM或基于接触进行的定义可见于上文早先提到的Andrew C.R.Martin′s Bioinformatics Group在UCL的网页(http://www.bioinf.org.Uk/abs/#cdrdef)。
Vλ结构域的CDR通常被定义为包含下列氨基酸:第24~34位残基(L1(λ),在人Vλ种系中由11、12、13或14个残基组成)、第50~56位残基(L2(λ),在人Vλ种系中由7、11或12个残基组成)和第89~97位残基(L3(λ),在大多数体细胞突变的人抗体中由9至11个残基组成(Knappik等,J.Mol.Biol.296:57-86(1999)));根据Kabat编号。
Vκ结构域的CDR通常被定义为包含下列氨基酸:第24~34位残基(L1(κ),在人Vκ种系中由11、12、16或17个残基组成)、第50~56位残基(L2(κ),在人Vκ种系中由7个残基组成)和第89~97位残基(L3(κ),在大多数体细胞突变的人抗体中由10个残基组成(Knappik等,J.Mol.Biol.296:57-86(1999)));根据Kabat编号。VH结构域的CDR通常被定义为包含下列氨基酸:第31~35B位残基(H1,由存在于人类种系VH中的5、6或7个残基组成)、第50~65位残基(H2,由存在于人类种系VH中的16、17、18或19个残基组成)和第95~102位残基(H3,其长度高度多变);编号根据Kabat。因此,HV可以包含在相应的CDR中,并且本文中关于VH和VL结构域的“高变环”也应解释为也包括相应的CDR,反之亦然,除非另有说明。在分析体细胞突变和种系VH以及体细胞突变的Vκ和Vλ序列(表1至37)的过程中,使用根据Kabat的CDR定义(基于可变性)。
可变结构域保守性较高的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR(分别为FR1、FR2、FR3和FR4),主要是采取β-片层构型,通过三个高变环相连接。每条链中的高变环通过FR而紧密联系在一起,并与其他链中的高变环一起促成抗体之抗原结合位点的形成。对抗体的结构分析表明序列与通过互补决定区形成的结合位点形状之间的关系(Chothia等,J.Mol.Biol.227:799-817(1992);Tramontano等,J.Mol.Biol,215:175-182(1990))。尽管它们具有高度序列可变性,但六个环中有五个只采取了主链构象一小部分,称为“典型结构”。这些构象首先取决于环的长度,其次取决于环和框架区中某些位置关键残基的存在(其通过包装、氢键键合或决定不寻常主链构象的能力来确定构象)。
恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合,但表现出多种不同的效应功能,如抗体参与抗体依赖的细胞毒性(antibody-dependent cellularcytotoxicity,ADCC)、补体依赖的细胞毒性(complement-dependentcytotoxicity,CDC)、抗体依赖性细胞吞噬(antibody dependent cellularphagocytosis,ADCP)或FcRn结合。
在本发明的所有方面和实施方案中,骆驼科(或骆驼科动物)物种(本发明抗原结合多肽的高变环或CDR来源于此)可以是骆驼(camel)、大羊驼(llama)、单峰驼(dromedary)、小羊驼(vicunia)、原驼(guanaco)和阿尔帕卡羊驼(alpaca),以及由其杂交的任何物种。大羊驼(Lamaglama)、阿尔帕卡羊驼(Lama pacos)和单峰驼(Camelus dromedarius)是本发明所有方面优选的骆驼科物种。
所谓“来自于骆驼科物种的VH结构域或VL结构域的高变环或互补决定区”是指高变环(HV)或CDR具有的氨基酸序列与由骆驼科免疫球蛋白基因编码的高变环或CDR的氨基酸序列一致或基本一致。此处的“免疫球蛋白基因”包括种系基因、已经历重排的免疫球蛋白基因以及体细胞突变基因。因此,来自于骆驼科物种VH或VL结构域的HV或CDR的氨基酸序列可以与存在于成熟的骆驼科常规抗体中的HV或CDR的氨基酸序列一致。本文中的术语“来自于”表明了结构关系,意思是本发明的人源化抗体的HV或CDR代表了最初由骆驼科免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列(或其略微发生改变的变体)。但是,对于制备本发明抗原结合多肽的生产方法而言,该术语并不一定意味着特定的关系。正如下面将要讨论地,若干方法可以用来制备包含HV或CDR(其氨基酸序列与最初由骆驼科免疫球蛋白基因编码的序列一致(或基本上一致))的人源化抗体。
为明确起见,术语“骆驼科动物常规抗体的VH结构域”和“来自于骆驼科物种的VH结构域”可同义使用,其包含这样的VH结构域,即合成的或经改造之重组基因(包括密码子经优化的合成基因)的产物,该VH结构域具有的氨基酸序列与骆驼科免疫球蛋白基因(种系的、重排的或体细胞突变的)编码之VH结构域的氨基酸序列一致(或基本一致)。类似地,术语“骆驼科动物常规抗体的VL结构域”和“来自于骆驼科物种的VL结构域”可同义使用,其包含这样的VL结构域,即合成的或经改造之重组基因(包括密码子经优化的合成基因)的产物,该VL结构域具有的氨基酸序列与骆驼科免疫球蛋白基因(种系的、重排的或体细胞突变的)编码之VL结构域的氨基酸序列一致(或基本一致)。
本发明的人源化抗体通常是重组表达的多肽,也可以是嵌合多肽。术语“嵌合多肽”是指通过将不连续存在的两个或更多个肽片段相邻放置而产生的人工(非天然)多肽。此定义中包括“物种”嵌合多肽,其由两个或更多个物种(例如骆驼科动物和人)编码的肽片段相邻放置形成。
本发明的人源化抗体不是天然的人抗体(特别是人类自身抗体),因为至少存在骆驼科动物的VH结构域和/或骆驼科动物的VL结构域。术语“天然的人抗体”是指在人对象中天然表达的抗体。本发明范围内不包括具有与天然人抗体或其片段的氨基酸序列具有100%一致性的氨基酸序列的抗体,其中天然抗体或片段不是嵌合的,并且在氨基酸序列上也没有受到任何经改造的变化(不包括体细胞突变)。
骆驼科动物VH和VL结构域的人源化
已经认识到骆驼科动物的常规抗体库为制备可用作人治疗剂的抗体提供了有利的起点,这是因为以下的因素(在美国12/497239中讨论,其通过引用并入本文):
1)骆驼科动物VH和VL结构域与其人类对应物之间的高序列同源性百分比。
2)骆驼科动物VH和VL结构域的CDR与其人类对应物之间的高度结构同源性(即人样典型折叠结构(human-like canonical fold structure)和典型折叠结构的人样组合)。
包含骆驼科动物VH和/或VL结构域的抗体用于人类治疗的效用可以通过天然骆驼科动物VH和VL结构域的“人源化”来进一步改善,例如使得它们在人类宿主中具有更小的免疫原性。人源化的总体目的是产生这样的分子,当引入人类对象时,其VH和VL结构域表现出尽可能小的免疫原性,同时保留由亲本VH和VL结构域所形成之抗原结合位点的特异性和亲和力。
一种人源化的方法(所谓的“种系化”)包括改造骆驼科动物VH或VL结构域的氨基酸序列,使其更接近于人VH或VL结构域的序列。
对于选择待改变的骆驼科动物氨基酸残基(在给定的VH或VL结构域)和选择合适的替换氨基酸残基二者来说,对骆驼科动物VH(或VL)结构域与人类VH(或VL)结构域之间同源性的确定是人源化过程的关键步骤。
根据大量新的骆驼科动物VH(和VL)结构域序列(通常是已知结合靶标抗原的体细胞突变VH(或VL)结构域)与人类种系VH(或VL)序列、人VH(和VL)共有序列的比对,以及阿尔帕卡羊驼的种系序列信息,开发出人源化的方法。这种方法使得能够鉴定出骆驼科动物VH(或VL)结构域中通常与人类种系VH(或VH)结构域中显示出错配的特定残基作为用于候选的替换残基。就在大羊驼中产生的大量体细胞突变抗体V结构域与和人类种系不同的种系编码的框架区残基(和互补决定残基)进行比对,并鉴定了对于人源化和种系化而言的优选突变。此外,鉴定了通过体细胞突变引入的差异(其在大多数的其他骆驼科动物家族成员中与人类种系一致),这些被归类为次优突变。
在对任何给定的骆驼科动物VH(或VL)结构域进行人源化时,下文概括出了用于以下的原则:(i)选择被替换的“骆驼科动物”氨基酸残基以及(ii)选择用于进行替换的“人类”氨基酸。
人源化方法概述
步骤1.选择与待人源化的骆驼科动物成熟序列具有最高同源性/同一性的人类(种系)家族和该家族的成员。对于任何给定骆驼科动物VH(或VL)结构域而言确定最匹配人类种系的一般方法如下所述。
步骤2.选择特定的人类种系家族成员用于对其进行种系化。优选为具有最高同源性的种系或来自同一家族的另一个种系家族成员。
步骤3.根据与所选择的人类种系最接近的骆驼科动物序列的氨基酸使用列表来确定种系化所考虑的优选位置。
步骤4.尝试改变骆驼科动物序列中与最接近的人类种系不同的氨基酸,FR残基的种系化与CDR残基相比是更优选的。
a.优选的是与选择用于进行种系化的人类种系不同的位置,对于它们来说骆驼科动物序列中存在的氨基酸与所选择的种系不匹配,并且在同一亚类型的其他种系中未发现(由V以及J编码的FR氨基酸)。
b.在种系化过程中还可以处理以下位置,这些位置与所选择的人类种系家族成员不同,但其用于同一家族的其他种系中。
c.还可处理与所选择的人类种系的其他错配(例如,因为额外的体细胞突变)。
可以使用以下方法来确定与给定的骆驼科动物VH(或VL)结构域最匹配的人类种系:
在分析骆驼科和人类种系VH和VL之间序列一致性的百分比前,可先确定典型折叠,其可用于识别具有H1和H2或者L1和L2(及L3)典型折叠之相同组合的人类种系区段家族。随后,可选择那些与目的骆驼科动物可变结构域具有高度序列同源性的人类种系家族成员用于计算序列同源性。高变环L1、L2、L3、H1和H2之正则标准类型(Chothiacanonical classes)的确定可通过使用在网站www.bioinf.org.uk/abs/chothia.html.page上公开可用的生物信息学工具进行。该程序的输出结果显示了在数据文件中需要的关键残基。在这些数据文件中,显示出关键残基的位置以及每个位置上允许的氨基酸。抗体可变结构域序列被作为输入,并首先与按Kabat编码系统编码的共有抗体序列进行比对。典型折叠的分析采用了一系列来自于Martin和Thornton发明的自动化方法的关键残基模板(Martin等,J.Mol.Biol.263:800-815(1996))。各个框架区的边界可使用IMGT编码方案分配,该编码系统是Chothia编码方案的改编(Lefranc et al,NAR 27:209-212(1999);http://imgt.cines.fr)。
使用已知特定的人类种系V区段(其使用与H1和H2或者L1和L2(及L3)同样的典型折叠组合),可以确定就序列同源性而言最佳匹配的家族成员。使用生物信息学工具可以确定骆驼科VH和VL结构域的框架氨基酸序列与由人类种系编码的相应序列之间的序列一致性百分比,但也可以手动比对这些序列。人类免疫球蛋白序列可以从若干蛋白质数据库中确定,如VBase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)或Pluckthun/Honegger数据库(http://www.bioc.unizh.ch/antibody/Sequences/Germline)。为了比较人类序列与骆驼科VH或VL结构域的V区,可以使用序列比对算法(如通过像www.expasy.ch/tools/#align的网站可获得的),而对于有限的序列也可进行手动比对。可以选出与每条链的框架区1、2和3具有最高程度同源性的具有相同典型折叠组合的人类种系的轻链和重链序列家族,并与目的骆驼科可变结构域进行比较;FR4也与人类种系的JH和JK或JL区进行比较。
注意,在计算序列同源性的整体百分比时,使用与具有相同典型折叠组合的人类种系家族最匹配的序列来评估FR1、FR2和FR3的残基。只计算了与具有相同典型折叠的组合的同一家族中最匹配的成员或其他成员不同的残基(注:不包括FR1中任何引物编码的差异)。然而,为了人源化的目的,框架区中与其他人类种系家族成员一致的残基(其不具备相同的典型折叠的组合)可以考虑用于人源化,然而事实上,根据上述严格的条件,这些都被归为“阴性的”。这种假设是基于用于人源化的“混合与匹配(mix and match)”法,其中FR1、FR2、FR3和FR4均被分别与其最匹配的人类种系序列进行比较,并且人源化的分子因此包含了不同FR的组合,正如Qu及其同事(Qu等,Clin.Cancer Res.5:3095-3100(1999))和Ono及其同事(Ono等,Mol.Immunol.36:387-395(1999))所做的一样。
用于人源化的氨基酸位置核心列表
根据骆驼科动物成熟VH和VL结构域与人类种系的VH/VL共有序列的比对,以及与最接近的人类种系序列的比对,已确定骆驼科动物VH结构域和VL结构域中的以下残基作为候选残基用于替换:
根据Kabat编号,骆驼科动物VH结构域的H1、H5、H7、H11、H12、H13、H14、H29、H30、H37、H40、H48、H67、H68、H69、H71、H74、H77、H78、H80、H81、H82b、H83、H84、H85、H86、H89、H93、H94或H108;
根据Kabat编号,骆驼科动物Vλ结构域的L1、L2、L3、L7、L8、L9、L11、L14、L15、L17、L18、L19、L20、L38、L39、L40、L42、L44、L46、L47、L49、L58、L59、L60、L66、L67、L69、L70、L71、L72、L74、L76、L78、L80、L84或L103。
根据Kabat编号,骆驼科动物Vκ结构域的K1、K3、K4、K7、K9、K11、K12、K13、K14、K15、K18、K19、K36、K42、K43、K45、K46、K58、K63、K70、K77、K78、K79、K80、K83、K100、K103、K104或K106。
应当将这些列表视为骆驼科动物VH框架氨基酸位置的核心系列,和Vλ和Vκ框架氨基酸位置的核心系列(在向对骆驼科动物VH或Vλ或Vκ结构域(意图人源化)而言一致的人类种系之特定人类种系进行种系化时,该位置可考虑改变)。每个核心系列中的氨基酸位置都存在于框架区FR1、FR2、FR3或FR4中。
因此,本发明提供了包含骆驼科动物VH结构域的抗体,其中,H1、H5、H7、H11、H12、H13、H14、H29、H30、H37、H40、H48、H67、H68、H69、H71、H74、H77、H78、H80、H81、H82b、H83、H84、H85、H86、H89、H93、H94或H108位置(根据Kabat)中一个或更多个位置上的天然氨基酸被替换为除骆驼科动物VH结构域中上述位置上天然存在的氨基酸以外的氨基酸。尤其是,H1、H5、H7、H11、H12、H13、H14、H29、H30、H37、H40、H48、H67、H68、H69、H71、H74、H77、H78、H80、H81、H82b、H83、H84、H85、H86、H89、H93、H94或H108位置中一个或更多个位置上的氨基酸可被替换为人VH结构域序列中相应位置上的氨基酸。
本发明提供了包含骆驼科动物Vλ结构域(Vλ)的抗体,其中,L1、L2、L3、L7、L8、L9、L11、L14、L15、L17、L18、L19、L20、L38、L39、L40、L42、L44、L46、L47、L49、L58、L59、L60、L66、L67、L69、L70、L71、L72、L74、L76、L78、L80、L84或L103位置(根据Kabat)中一个或更多个位置上的天然氨基酸被替换为除骆驼科动物Vλ结构域中上述位置上天然存在的氨基酸以外的氨基酸。尤其是,L1、L2、L3、L7、L8、L9、L11、L14、L15、L17、L18、L19、L20、L38、L39、L40、L42、L44、L46、L47、L49、L58、L59、L60、L66、L67、L69、L70、L71、L72、L74、L76、L78、L80、L84或L103位置中一个或更多个位置上的氨基酸可被替换为人Vλ结构域序列中相应位置上的氨基酸。
本发明提供了包含骆驼科动物Vκ结构域(Vκ)的抗体,其中,K1、K3、K4、K7、K9、K11、K12、K13、K14、K15、K18、K19、K36、K42、K43、K45、K46、K58、K63、K70、K77、K78、K79、K80、K83、K100、K103、K104或K106位置(根据Kabat)中一个或更多个位置上的天然氨基酸被替换为除骆驼科动物Vκ结构域中上述位置上天然发现的氨基酸以外的氨基酸。尤其是,K1、K3、K4、K7、K9、K11、K12、K13、K14、K15、K18、K19、K36、K42、K43、K45、K46、K58、K63、K70、K77、K78、K79、K80、K83、K100、K103、K104或K106位置中一个或更多个位置的氨基酸可被替换为人Vκ结构域序列中相应位置上的氨基酸。
根据本发明的抗体可包含骆驼科动物VH结构域(其包含在上述核心列表中任何一个或更多个VH氨基酸位置上的氨基酸替换)与骆驼科动物Vλ或Vκ结构域(其包含在上述核心列表中任何一个或更多个Vλ或Vκ氨基酸位置上的氨基酸替换)的组合。
待替换到核心列表中H1、H5、H7、H11、H12、H13、H14、H29、H30、H37、H40、H48、H67、H68、H69、H71、H74、H77、H78、H80、H81、H82b、H83、H84、H85、H86、H89、H93、H94或H108中每个位置上的氨基酸可以是满足以下的任何氨基酸:a)不是起始骆驼科动物VH结构域中该位置上的天然氨基酸,和b)可见于一个或更多个人VH结构域序列中相应位置上。
类似的,待替换到核心列表中L1、L2、L3、L7、L8、L9、L11、L14、L15、L17、L18、L19、L20、L38、L39、L40、L42、L44、L46、L47、L49、L58、L59、L60、L66、L67、L69、L70、L71、L72、L74、L76、L78、L80、L84或L103中每个位置上氨基酸可以是满足以下的任何氨基酸:a)不是起始骆驼科动物Vλ结构区中该位置上的天然氨基酸,和b)可见于一个或更多个人Vλ结构域序列中相应位置上。
类似的,待替换到核心列表中K1、K3、K4、K7、K9、K11、K12、K13、K14、K15、K18、K19、K36、K42、K43、K45、K46、K58、K63、K70、K77、K78、K79、K80、K83、K100、K103、K104或K106中每个位置上的氨基酸可以是满足以下的任何氨基酸:a)不是起始骆驼科动物Vκ结构区中该位置的天然氨基酸,和b)可见于一个或更多个人Vκ结构域序列中相应位置上。
骆驼科动物VH或VL向特定VH或VL类型或亚类型的种系化
已经确定了另一系列氨基酸残基,其与骆驼科动物VH或VL结构域向特定人类种系类型或亚类型的种系化特别相关。因此,在一些具体的实施方案中本发明提供如下:
包含与人VH3结构域同源之骆驼科动物VH结构域的抗体,其中,所述骆驼科动物VH结构域中H1、H5、H13、H14、H29、H37、H40、H74、H77、H78、H83、H84、H86或H94(根据Kabat)中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人VH3结构域序列中相应位置上存在的氨基酸。
包含与人VH1结构域同源之骆驼科动物VH结构域的抗体,其中,所述骆驼科动物VH结构域中H1、H7、H11、H12、H13、H69、H71、H78、H80或H86(根据Kabat)中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人VH1结构域序列中相应位置上存在的氨基酸。
包含与人VH4结构域同源之骆驼科动物VH结构域的抗体,其中,所述骆驼科动物VH结构域中H1、H30、H48、H67、H68、H71、H81、H84、H85或H86(根据Kabat)中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人VH4结构域序列中相应位置上存在的氨基酸。
包含与人Vλ1结构域同源之骆驼科动物Vλ结构域的抗体,其中,所述骆驼科动物Vλ结构域的L11、L14、L18、L19、L69、L74、L76或L80(根据Kabat)中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人VL1结构域序列中相应位置上存在的氨基酸。
包含与人Vλ2结构域同源之骆驼科动物Vλ结构域的抗体,其中,所述骆驼科动物Vλ结构域的L8、L14、L15、L17、L18、L39、L42、L47、L58、L59或L80(根据Kabat)中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人Vλ2结构域序列中相应位置上存在的氨基酸。
包含与人Vλ3结构域同源之骆驼科动物Vλ结构域的抗体,其中,所述骆驼科动物Vλ结构域的L1、L2、L3、L5、L7、L8、L9、L11、L14、L15、L19、L20、L60、L66、L69、L70、L71、L72、L76、L78或L84(根据Kabat)中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人Vλ3结构域序列中相应位置上存在的氨基酸。
包含与人Vλ5结构域同源之骆驼科动物Vλ结构域的抗体,其中,所述骆驼科动物Vλ结构域的L2、L11、L17、L19、L40、L70、L72或L80(根据Kabat)中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人Vλ5结构域序列中相应位置上存在的氨基酸。
包含与人Vλ8结构域同源之骆驼科动物Vλ结构域的抗体,其中,所述骆驼科动物Vλ结构域的L2、L11、L60、L67、L80、L81或L84(根据Kabat)中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人Vλ8结构域序列中相应位置上存在的氨基酸。
包含与人Vκ1结构域同源之骆驼科动物Vκ结构域的抗体,其中,所述骆驼科动物Vκ结构域的K1、K4、K11、K12、K13、K15、K42、K43、K70、K77、K79、K80或K83(根据Kabat)中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人Vκ1结构域序列中相应位置上存在的氨基酸。
包含与人Vκ2结构域同源之骆驼科动物Vκ结构域的抗体,其中,所述骆驼科动物Vκ结构域的K7、K9、K12、K14、K18、K36、K46、K63、K77、K79或K83(根据Kabat)中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人Vκ2结构域序列中相应位置上存在的氨基酸。
包含与人Vκ4结构域同源之骆驼科动物Vκ结构域的抗体,其中,所述骆驼科动物Vκ结构域的K9、K11、K12、K13、K15、K18、K19、K39、K43、K45、K58、K68、K78、K80或K83(根据Kabat)中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人Vκ4结构域序列中相应位置上存在的氨基酸。
选择替换氨基酸的原理
为了选择要替换进骆驼科动物VH(或Vλ或Vκ)结构域中选定的替换氨基酸位置的合适的替换氨基酸,可再次参考将骆驼科动物VH(或Vλ或Vκ)结构域氨基酸序列与人VH(或Vλ或Vκ)结构域氨基酸序列(通常是人类种系VH(或Vλ或Vκ)序列以及种系JH(或Jλ或Jκ)序列),或特定VH(或Vλ或Vκ)家族或该家族成员的共有序列进行比对。
可以采取若干不同的方法来选择“人类”残基,以替换本文所确定的一个或更多个位置上骆驼科动物天然氨基酸残基。首先,可以选择在最匹配/一致的人类种系VH或Vλ或Vκ结构域(或者至少是与骆驼科动物起始VH或Vλ或Vκ结构域非常匹配的人类种系,优选同一家族的成员或作为该家族中最匹配人类种系序列的成员)相应位置上存在的替换人类氨基酸残基。为任何给定骆驼科动物VH或Vλ或Vκ结构域选择最匹配之人类种系序列的方法在以上给出。
其次,可从最常使用的人类种系中为VH或Vλ或Vκ家族或家族成员(骆驼科动物VH/Vλ/Vκ结构域被分配其中)选择替换人类残基。例如,如果骆驼科动物VH结构域被确定为属于VH3家族,那么最常使用的人VH3种系家族成员V3-23可用作替换氨基酸残基的来源。使用序列比对来确定与骆驼科动物VH/Vλ/Vκ结构域序列中待替换氨基酸残基对应的人类残基。以下表1至3列出了优选的人VH、Vλ和Vκ种系,其为属于特定家族或家族成员的骆驼科动物VH/Vλ/Vκ结构域提供替换人类氨基酸残基的来源。
表1-优选的VH种系:
表2-优选的Vκ种系
表3-优选的Vλ种系
最后,在第三种方法中,可从任何其他的人类种系VH或Vλ或Vκ结构域序列(包括来自另一种系家族的VH或Vλ或Vκ结构域)中选择替换人类氨基酸残基。在这种情况下,可以较少地考虑起始骆驼科动物VH结构域与所选择的人VH种系之间的整体序列同源性;仅仅是在人类种系中发现的一个替换残基(可能在类似的局部序列背景中)可能就足够了。
以上列举的方法的组合可用于单个骆驼科动物VH或Vλ或Vκ结构域;允许将从两个或更多个不同的人类种系中得到的替换氨基酸残基进行混搭。对于任何给定的骆驼科动物VH或Vλ或Vκ结构域而言,可以视具体情况来决定是否决定替换本文所确定的一个或更多个位置上的天然骆驼科动物残基,尤其是核心列表(骆驼科动物VH结构域的H1、H5、H7、H11、H12、H13、H14、H29、H30、H37、H40、H48、H67、H68、H69、H71、H74、H77、H78、H80、H81、H82b、H83、H84、H85、H86、H89、H93、H94或H108;骆驼科动物Vλ结构域的L1、L2、L3、L7、L8、L9、L11、L14、L15、L17、L18、L19、L20、L38、L39、L40、L42、L44、L46、L47、L49、L58、L59、L60、L66、L67、L69、L70、L71、L72、L74、L76、L78、L80、L84或L103;骆驼科动物Vκ结构域的K1、K3、K4、K7、K9、K11、K12、K13、K14、K15、K18、K19、K36、K42、K43、K45、K46、K58、K63、K70、K77、K78、K79、K80、K83、K100、K103、K104或K106)中的氨基酸位置。
当对给定的VH或Vλ或Vκ结构域进行人源化时,作为第一步,通常可以通过比对骆驼科动物序列和基准人类序列(其可以是特定种系序列或共有序列)来确定待改变的潜在残基。可以选择在核心列表(对于VH或Vλ或Vκ,视情况而定)所确定的位置上错配(即不与人类序列一致)的骆驼科动物的残基用来替换为相应的人类残基(根据上述标准选择)。
在一些情况下,可以决定将所有错配的骆驼科动物残基替换为相应的人类残基。在另一些情况下,可以决定不改变一个或更多个特定位置的残基,例如这是因为其对抗体结构的重要性(例如,抗体结合位点的构象)。可以排除另一些残基(即不改变),因为它们出现在其他人类种系(在整个VH/Vλ/Vκ上不一定是最匹配的)中相同序列背景中,因此被认为是人类的。此外,人们可以考虑“错配”残基的位置,即一般优选改变FR1、FR2和FR3中的错配残基,而CDR中的错配残基可在更高的程度上被容忍。人们还可考虑错配残基是否是暴露至溶剂中的。相比于暴露至溶剂的残基,可以在更大范围内接受内部的和未暴露至溶剂的错配残基。
除了本文描述的种系化方法外,还可以通过“镶饰”实现人源化,其中只考虑替换折叠分子表面上暴露至溶剂的错配残基。
VL第1、2*、3、5、7、8、10、11、12、13*、14、15、16、17、18、20、22、37*39、40、41、42、43*、45、46*、49*、57、59、60、63、65、66、67、68、69、70、72、74、76、77、79、80、81、83、85*、99*、100、101*、103、105和106位的残基是暴露的、大部分暴露的或部分埋藏的,并且可以考虑在人源化过程中进行突变(星号表示在两种不同VL中不一致)。VH第1、3、5、7、8、10、11、13、14、15、16、17、19、21、23、25、26、28、30、40、41、42、43、44、46、66*、68、70、72、73、74、75、76、77*、79*、81、82a*、82b、83、84、85、87、88*、89、104*、105、108、110、112和113位的残基是暴露的、大部分暴露的或部分埋藏的,并且也可在人源化过程中诱变(Padlan,Mol Immunol.31:169-217(1994))。通过使用这些列表,可从所述核心列表中选择暴露至溶剂的骆驼科动物VL和VH候选残基用于突变,从而进行之后的镶饰过程。
如以下所解释的,人源化过程可以反复进行,或者可采取文库方法。例如,人们可以制备一系列给定起始骆驼科动物VH或Vλ或Vκ的“人源化”变体,其中氨基酸残基的不同组合被替换。之后可以测定这些变体对靶标抗原的结合亲和力,以及功能的其他参数/指标,包括人类宿主中的潜在或实际免疫原性。
可以根据骆驼科动物VH结构域序列中的局部序列背景,或根据需要尽可能少的人类T细胞表位的存在,来从[骆驼科动物的起始VH或Vλ或Vκ结构域中]每个选择待改变位置上可能替换残基的集合中选择特定的替换人类残基。
因此当为给定的骆驼科动物VH或Vλ或Vκ结构域的人源化选择合适的残基时,可首先考虑最匹配的人类种系(即与CDR中合适的典型折叠结构序列同源性最高),但还可考虑与错配的典型折叠(例如,不同长度的CDR)序列存在高度同源性的种系,还有同一家族(不一定是最匹配的)中的其他人类种系家族成员,甚至是不同家族的人类种系。
优选替换——VH
考虑到上述的标准,已鉴定了表4所列举的氨基酸替换适合骆驼科动物VH结构域的人源化。因此本发明的主题包括但不限于,包含骆驼科动物VH结构域的抗体,所述结构域包含表4中所列举的一个或更多个氨基酸替换,或其任何组合。在每种情况下,由位于左侧栏中所示位置上的骆驼科动物VH序列编码的氨基酸可被替换为该位置上的一个优选人类残基(如右侧栏中所列)。表4还表明了哪些变化被认为对于特定的人类VH家族或家族成员最相关,但不应当将其当做一种限制。在表4中描述了骆驼科动物种系中与人类种系不同的残基(如由差异残基的高频出现所推出的),优选的改变是将骆驼科动物残基转换成与CDR 1和CDR2典型折叠组合一致的最优人类种系中所存在的残基。这些结论来自图36、37和38,其示出了体细胞突变大羊驼VH中与最匹配的人类种系家族成员不同的残基,以及在全部人类种系家族中所存在的残基。所述图还表明,尽管频率较低,但人类种系残基时常出现在体细胞突变的VH区中,因此相信回复突变成人类种系中所存在的残基应该是可行的。此外,图40、41和42示出了相同类型的分析,但是是针对阿尔帕卡羊驼种系VH。
表4-优选的骆驼科动物VH替换
在一个具体的实施方案中,本发明包括包含骆驼科动物VH结构域的人源化抗体,所述VH结构域包含表4所列举的至少一个氨基酸改变,其中所述骆驼科动物VH结构域来源于大羊驼(Lama glama)或阿尔帕卡羊驼(Lama pacos)。
根据本发明的人源化抗体还可包含骆驼科动物VH结构域,所述VH结构域包含表4所列举的两个或更多个特定氨基酸替换的任何组合。同样,所述骆驼科动物VH结构域可来源于大羊驼(Lama glama)或阿尔帕卡羊驼(Lama pacos)。
向特定人VH序列进行种系化
基于骆驼科动物成熟的(功能性抗原结合)VH(和VL或Vκ)结构域序列与其最一致的人类种系进行的比对,产生了一系列的氨基酸替换,这些氨基酸替换在给定的骆驼科动物VH(和VL或Vκ)结构域向特定人类种系序列进行种系化时尤其有用。这些人类序列可以是(但不必)与选择用于人源化的特定骆驼科动物序列最匹配的人类种系。
以下是对于向特定人类种系VH亚类型进行人源化的优选替换组(每种情况下,所列位置上天然的骆驼科动物编码之残基可替换为以下给出的特定氨基酸):
Hu VH3-21:H1 E、H13 K、H77 S、H83 R、H84 A
在一个具体实施方案中,本发明提供了包含骆驼科动物VH结构域(优选来源于大羊驼或阿尔帕卡羊驼)的抗体,所述VH结构域与人VH3-21序列匹配并在所述位置上包含以上列举氨基酸中的一个或更多个或全部。
Hu VH3-48:H1 E、H77 S、H83 R、H84 A
在一个具体实施方案中,本发明提供了包含骆驼科动物VH结构域(优选来源于大羊驼或阿尔帕卡羊驼)的抗体,所述VH结构域与人VH3-48序列匹配并在所述位置上包含以上列举氨基酸中的一个或更多个或全部。
Hu VH3-23:H1 E、H74 S、H83 R、H84 A
在一个具体实施方案中,本发明提供了包含人源化骆驼科动物VH结构域(优选来源于大羊驼或阿尔帕卡羊驼)的抗体,所述VH结构域与人VH3-23序列匹配并在所述位置上包含以上列举氨基酸中的一个或更多个或全部。
Hu VH3-66:H1 E、H29 V、H37 V、H40 A、H74 S、H83 R、H84 A、H94 R
在一个具体实施方案中,本发明提供了包含人源化骆驼科动物VH结构域(优选来源于大羊驼或阿尔帕卡羊驼)的抗体,所述VH结构域与人VH3-66序列匹配并在所述位置上包含以上列举氨基酸中的一个或更多个或全部。
Hu VH3-11:H1 Q、H13 K、H14 P、H37 I、H77 S、H78 L、H83 R、H84 A、H94 R
在一个具体实施方案中,本发明提供了包含人源化骆驼科动物VH结构域(优选来源于大羊驼或阿尔帕卡羊驼)的抗体,所述VH结构域与人VH3-11序列匹配并在所述位置上包含以上列举氨基酸中的一个或更多个或全部。
Hu VH3-66:H1 E、H29 V、H37 V、H40 A、H74 S、H78 L、H83 R、H84 A、H86 D、H94 R
在一个具体实施方案中,本发明提供了包含骆驼科动物VH结构域(优选来源于大羊驼或阿尔帕卡羊驼)的抗体,所述VH结构域与人VH3-66序列匹配并在所述位置上包含以上列举氨基酸中的一个或更多个或全部。
Hu VH3-48:H1 E、H77 S、H83 R、H84 A、H86 D
在一个具体实施方案中,本发明提供了包含骆驼科动物VH结构域(优选来源于大羊驼或阿尔帕卡羊驼)的抗体,所述VH结构域与人VH3-48序列匹配并在所述位置上包含以上列举氨基酸中的一个或更多个或全部。
Hu VH1-46:H1 Q、H11 V、H12 K、H13 K、H69 M、H71 R、H78 V、H80 M
在一个具体实施方案中,本发明提供了包含骆驼科动物VH结构域(优选来源于大羊驼)的抗体,所述VH结构域与人VH1-46序列匹配并在所述位置上包含以上列举氨基酸中的一个或更多个或全部。
Hu VH1-46:H1 Q、H7 S、H11 V、H12 K、H69 M、H71 R、H78 V、H80 M、H86 D
在一个具体实施方案中,本发明提供了包含骆驼科动物VH结构域(优选来源于阿尔帕卡羊驼)的抗体,所述VH结构域与人VH1-46序列匹配并在所述位置上包含以上列举氨基酸中的一个或更多个或全部。
Hu VH4-30-4:H1 Q、H30 S、H48 I、H67 V、H68 T、H71 V、H81 K、H84 A、H85 A
在一个具体实施方案中,本发明提供了包含骆驼科动物VH结构域(优选来源于大羊驼)的抗体,所述VH结构域与人VH4-30-4序列匹配并在所述位置上包含以上列举氨基酸中的一个或更多个或全部。
Hu VH4-30-4:H1 Q、H30 S、H48 I、H67 V、H68 T、H71 V、H81 K、H84 A、H85 A、H86 D
在一个具体实施方案中,本发明提供了包含骆驼科动物VH结构域(优选来源于阿尔帕卡羊驼)的抗体,所述VH结构域与人VH4-30-4序列匹配并在所述位置上包含以上列举氨基酸中的一个或更多个或全部。
每个上列的实施方案还可以在108位额外地包含氨基酸L。
优选的替换——VKappa(Vκ)和VLamba(Vλ)
已经鉴定了表5所列举的氨基酸替换适合骆驼科动物VL结构域的人源化。因此本发明的主体包括但不限于,包含骆驼科动物VL结构域的抗体,所述VL结构域包含表5中所列的一个或更多个氨基酸替换,或其任何组合。在每种情况下,由位于左侧栏中所示位置上的骆驼科动物VL序列编码的氨基酸可被替换为该位置上的一个优选人类残基(如表5右侧栏中所列)。在表5中描述了骆驼科动物种系中与人类种系不同的残基(如由差异残基的高频出现得出的),并且优选的改变是那些将骆驼科动物残基转换成与CDR 1和CDR2典型折叠组合一致的最优人类种系中所存在的残基。这些结论来自图30(对于Vκ)和图31至35(对于Vλ),其示出了体细胞突变大羊驼Vκ/Vλ中与最匹配的人类种系家族成员不同的残基,以及在全部人类种系家族中所存在的残基。该表还表明,尽管频率较低,但人类种系残基时常出现在体细胞突变的Vκ/Vλ区中,因此相信回复突变成人类种系中所存在的残基是可行的。
表5-优选的骆驼科动物Vκ和Vλ替换
在具体的实施方案中,本发明包括包含骆驼科动物Vκ或Vλ结构域的人源化抗体,所述Vκ或Vλ结构域包含表5中所列举的至少一个氨基酸改变,其中所述骆驼科动物Vκ或Vλ结构域来源于大羊驼(Lamaglama)或阿尔帕卡羊驼(Lama pacos))。
根据本发明的人源化抗体还可包含骆驼科动物Vκ或Vλ结构域,所述Vκ或Vλ结构域包含表5中所列举的两个或更多个特定氨基酸替换的任何组合,同样,其中所述骆驼科动物Vκ或Vλ结构域来源于大羊驼(Lama glama)或阿尔帕卡羊驼(Lamapacos))。
向特定人Vκ或Vλ序列进行种系化
基于骆驼科动物成熟的(功能性抗原结合)Vκ或Vλ结构域序列与其最一致的人类种系进行的比对,得到了一系列氨基酸替换,这些氨基酸替换在给定的骆驼科动物VL结构域向特定的人类种系序列进行种系化时尤其有用。这些人类序列可以是(但不必)与选择用于人源化的特定骆驼科动物序列最匹配的人类种系。
以下是对于向特定人类种系Vλ家族成员进行人源化的优选替换组(每种情况下,所列位置上天然的骆驼科动物编码之残基可替换为以下给出的特定氨基酸):
Vλ1-44:L11 A、L14 T、L18 R、L19 V、L38 Q、L69 T、L74 A、L76 S、L80 S。
在一个具体实施方案中,本发明提供了包含骆驼科动物Vλ结构域(优选来源于大羊驼)的抗体,所述Vλ结构域与人类Vλ1-44序列匹配并在所述位置上包含以上列举氨基酸中的一个或更多个或全部。
Vλ2-11:L8 R、L17 Q、L18 S、L39 H、L42 K、L47 M、L58 V、L59 P、L80 A
在一个具体实施方案中,本发明提供了包含骆驼科动物Vλ结构域(优选来源于大羊驼)的抗体,所述Vλ结构域与人类Vλ2-11序列匹配并在所述位置上包含以上列举氨基酸中的一个或更多个或全部。
Vλ2-18:L3 A、L14 S、L15 P、L17 Q、L18 S、L39 H、L47 M、L58 V、L80 A
在一个具体实施方案中,本发明提供了包含骆驼科动物Vλ结构域(优选来源于大羊驼)的抗体,所述Vλ结构域与人类Vλ2-18序列匹配并在所述位置上包含以上列举氨基酸中的一个或更多个或全部。
Vλ3-19:L1 S、L3 E、L7 D、L8 P、L11 V、L14 A、L19 V、L20 R、L60D、L69 N、L70 T、L72 S、L76 T、L84 A
在一个具体实施方案中,本发明提供了包含骆驼科动物Vλ结构域(优选来源于大羊驼)的抗体,所述Vλ结构域与人类Vλ3-19序列匹配并在所述位置上包含以上列举氨基酸中的一个或更多个或全部。
Vλ3-25:L1 S、L2 Y、L3 E、L5 M、L8 P、L9 S、L15 P、L66 S、L69 T、L71 V、L78 V
在一个具体实施方案中,本发明提供了包含骆驼科动物Vλ结构域(优选来源于大羊驼)的抗体,所述Vλ结构域与人类Vλ3-25序列匹配并在所述位置上包含以上列举氨基酸中的一个或更多个或全部。
Vλ5-37:L2 P、L11 S、L17 E、L19 A、L 40P、L70 T、L72 I、L80 S
在一个具体实施方案中,本发明提供了包含骆驼科动物Vλ结构域(优选来源于大羊驼)的抗体,所述Vλ结构域与人类Vλ5-37序列匹配并在所述位置上包含以上列举氨基酸中的一个或更多个或全部。
Vλ8-61:L2 T、L11 F、L60 D、L67 L、L80 A、L81 D、L84 S
在一个具体实施方案中,本发明提供了包含骆驼科动物Vλ结构域(优选来源于大羊驼)的抗体,所述Vλ结构域与人类Vλ8-61序列匹配并在所述位置上包含以上列举氨基酸中的一个或更多个或全部。
以下是对于向特定人类种系Vκ家族成员进行人源化的优选替换组(每种情况下,所列位置上天然的骆驼科动物编码之残基可替换为以下给出的特定氨基酸):
Vκ1-13:K11 V、K12 K、K13 K、K15 V、K42 K、K43 A、K70 D、K77S、K79 Q、K80 P、K83 F
在一个具体实施方案中,本发明提供了包含骆驼科动物Vκ结构域(优选来源于大羊驼)的抗体,所述Vκ结构域与人类Vκ1-13序列匹配并在所述位置上包含以上列举氨基酸中的一个或更多个或全部。
Vκ2-28:K7 S、K9 L、K12 P、K14 T、K18 P、K36 Y、K46 L、K63 S、K77 R、K79 E、K83 V
在一个具体实施方案中,本发明提供了包含骆驼科动物Vκ结构域(优选来源于大羊驼)的抗体,所述Vκ结构域与人类Vκ2-28序列匹配并在所述位置上包含以上列举氨基酸中的一个或更多个或全部。
Vκ4-1:K9 D、K11 L、K12 A、K13 V、K15 L、K18 R、K19 A、K39 K、K43 P、K45 K、K58 V、K68 G、K78 L、K80 A、K83 V
在一个具体实施方案中,本发明提供了包含骆驼科动物Vκ结构域(优选来源于大羊驼)的抗体,所述Vκ结构域与人类Vκ4-1序列匹配并在所述位置上包含以上列举氨基酸中的一个或更多个或全部。
每个上列的实施方案还可以在FR4103位残基包含氨基酸替换,优选地,Vκ和Vλ二者的该位置具有K。此外,可以将Vκ中的氨基酸替换引入FR4100位残基,优选地,在该位置具有Q;或者引入FR4104位残基,优选地,具有V。
相比于天然的骆驼科动物VH、VL或Vκ结构域(例如,通过使用靶标抗原主动免疫骆驼科动物而得到的常规骆驼科动物VH、Vλ或Vκ结构域),除本文提供“核心”VH、Vλ或Vκ列表上确定的一个或更多个氨基酸位置上的氨基酸替换外,可以将本发明抗体中的骆驼科动物VH和/或Vλ和/或Vκ结构域改造成包含额外的氨基酸序列改变。在某些实施方案中,所述抗体的VH、Vλ或Vκ结构域可能已经被(独立地)改造成在VH结构域和Vλ/Vκ结构域中一个或两个的框架区FR1、FR2、FR3和FR4中引入多至10个甚至更多个氨基酸替换。
以下提供了可在由骆驼科动物种系J区段编码的FR4残基中得到的用于人源化目的的氨基酸替换列表:
由J区段编码的FR4残基中的氨基酸替换
在另一个实施方案中,本发明提供了包括骆驼科动物VH结构域的抗体,其中,所述所述骆驼科动物VH结构域的FR4编码的H108位(根据Kabat)氨基酸被替换为人VH结构域序列中相应位置上的氨基酸。
可以根据以上讨论的骆驼科动物VH结构域进行人源化的一般原则来选择H 108位的替代残基。具体地,替换“人类”残基可以基于以下来进行选择:与最接近的人类种系序列的比对,或与人类共有序列的比对,或来自与最匹配的人类种系为同一类型或亚类型的人类种系序列,或甚至来自不同类型或亚类型的人类种系。
在一个实施方案中,H 108位的氨基酸被替换,优选替换为L,次优选替换为M。
可根据类似的原理选择Jκ或Jλ中的氨基酸改变。
因此,本发明提供了包含骆驼科动物Vλ或Vκ结构域的抗体,其中,所述骆驼科动物Vλ或Vκ结构域的一个或更多个位置(根据Kabat)上的氨基酸被替换为人Vλ或Vκ结构域序列中相应位置上存在的氨基酸。
在一个实施方案中,所述Vλ结构域与人Vλ结构域同源并且L103位的氨基酸被替换,优选为K或者次优选为E或Q。
在一个实施方案中,所述Vκ结构域与人Vκ结构域同源并且K103位的氨基酸被替换,优选为K或次优选为R。
在一个实施方案中,所述Vκ结构域与人Vκ结构域同源并且K104位置的氨基酸被替换,优选为V。
在一个实施方案中,所述Vκ结构域与人Vκ结构域同源并且K104位置的氨基酸被替换,优选为L。
CDR中的氨基酸改变
除了通过将起始骆驼科动物VH、Vλ或Vκ结构域中的错配氨基酸残基替换为人VH、Vλ或Vκ结构域中存在的等同残基而产生的“人源化”的氨基酸替换之外,还可以在所述骆驼科动物来源之VH、Vλ和Vκ结构域的高变环(CDR)中(尤其在CDR1和/或CDR2中,但也在CDR3中)独立地进行氨基酸替换,同样用于人源化目的。位于与FR交界处的残基是有意义的,因为它们可决定由FR和CDR编码之残基组成的T细胞表位。
以下表格总结了用于对骆驼科动物来源的CDR进行人源化的可能的氨基酸替换。
表6-CDR中的氨基酸替换
因此,本发明的范围延伸至包含骆驼科动物VH结构域的抗体,其中CDR1和/或CDR2和/或CDR3中的一个或更多个氨基酸被替换为人VH结构域序列中相应位置上存在的氨基酸。允许的氨基酸替换包括表6中所总结的那些,它们中的一个或多个可以以任何组合存在。
本发明还包括包含骆驼科动物Vλ或Vκ结构域的抗体,其中CDR1和/或CDR2和/或CDR3中的一个或更多个氨基酸被替换为人Vλ或Vκ结构域序列中相应位置上的氨基酸。允许的氨基酸替换包括表6中所总结的那些,它们中的一个或多个可以以任何组合存在。
对于任何给定的“人源化”骆驼科动物VH、Vλ或Vκ结构域而言,CDR中的氨基酸替换可以在有和没有框架区氨基酸替换的情况下包括在内。当还存在框架区氨基酸替换时,优选的改变包括表4(VH)和表5(Vλ和Vκ)中所有所总结的那些。
当在骆驼科动物VH、Vλ或Vκ结构域的CDR中进行人源化时,可以依据上述框架区种系化方法的一般原则。因此,可以选择向同一家族或家族成员的特定人类种系序列进行种系化,所述人类种系可以是或不是与起始骆驼科动物VH/Vλ/Vκ结构域最匹配的人类种系,或者可以选择向不同家族或家族成员的人类种序列进行种系化。
跨家族的种系化
将成熟的骆驼科动物VH(和Vλ/Vκ)序列(和来源于它们的共有序列)与人VH(以及Vλ/Vκ)结构域(其不是与所述骆驼科动物VH(和Vλ/Vκ)结构域最匹配的人类VH(以及Vλ/Vκ)结构域序列的同一家族(或家族成员))共有序列进行比对,这已经允许产生了一系列氨基酸替换,所述氨基酸替换使得允许使骆驼科动物VH(或Vλ/Vκ)结构域向不同的种系家族或家族成员的人VH(或Vλ/Vκ)结构域序列进行人源化。这些氨基酸替换组列于附图中。
图6至11示出了将与家族VH1、VH3和VH4的人类种系序列最匹配的骆驼科动物VH序列向家族1、3、4、5、6、和7的人类种系或成熟VH序列进行种系化的所有排列组合。图12至26示出了将与Vλ家族1、3、5和8的人类种系序列最匹配的骆驼科动物Vλ序列(表示为VL)向人Vλ家族1、3、4、5、6、7、8、9和10的人类种系或成熟Vλ序列进行种系化的所有排列组合。图27至29示出了将与Vκ家族1和4的人类种系序列最佳比对的骆驼科动物Vκ序列向人Vκ家族1、3、4和5的人类种系或成熟Vκ序列进行种系化的所有排列组合。
可以考虑用于替换以进行人源化的氨基酸位置在各个表中突出显示,所述表比较了骆驼科动物VH、Vλ或Vκ家族的起始共有序列和多个不同的人类种系家族的共有系列。因此,这些表首先可用于选择向哪个人类种系家族或亚家族进行人源化,其次用于选择在人源化过程中考虑的合适的氨基酸替换。如在本文别处所概括的,人源化可以作为反复的过程进行,或者使用允许同时测试多种替换或替换组合的文库方法。
以下的表7列举了来源于图6至11所示比对的氨基酸替换,其可以考虑用于将与人VH1家族最匹配的骆驼科动物序列向人VH3的家族成员进行人源化。优选的人类氨基酸是可用于种系化的家族中最常见的氨基酸。然而,在某些位置上,某些家族成员中所存在的氨基酸可以与相应人类种系家族的共有序列中存在的氨基酸不同。
表7-用于使骆驼科动物VH1向人类VH3进行种系化的替换示例
骆驼科动物VH1 | 人类VH3 |
位点 | 优选地人类氨基酸 |
H9 | G |
H10 | G |
H12 | V |
H13 | O |
H16 | G |
H18 | L |
H19 | R |
H20 | L |
H23 | A |
H27 | F |
H30 | S |
H43 | K |
H48 | V |
H49 | S |
H67 | F |
H69 | I |
H70 | S |
H71 | R |
H73 | N |
H75 | K |
H76 | N |
H78 | L |
H80 | L |
H81 | O |
H82 | M |
H84 | N |
尽管所有的上列替换可用于使骆驼科动物VH1向人VH3进行种系化,但不一定意味着在任一种特定的成熟VH1结构域向人类VH3进行种系化时,必须(或事实上将会)进行所有的这些替换。当然,本领域技术人员将能够根据在本文别处所概括的种系化方法的一般原则从该表中选择合适的替换。
以下示例列举了来源于图27至29的氨基酸替换,其可以考虑用于将与人Vκ1家族最匹配的骆驼科动物序列向人类Vκ3的家族成员进行人源化。优选的人类氨基酸是可用于种系化的家族中最常见的氨基酸。然而,在某些位置上,某些家族成员中所存在氨基酸可以与相应人类种系家族的共有序列中存在的氨基酸不同。
表8-用于使骆驼科动物Vκ1向人类Vκ3进行种系化的替换示例
骆驼科动物Vκ1 | 人类Vκ3 |
位点 | 优选地人类氨基酸 |
L9 | A |
L10 | T |
L13 | L |
L15 | P |
L17 | E |
L19 | A |
L21 | L |
L22 | S |
L43 | A |
L45 | R |
L58 | I |
L60 | A |
L70 | D |
L77 | S |
L80 | P |
L83 | F |
L85 | V |
以下示例列举了来源于图24至26的氨基酸替换,其可以考虑用于将与人Vκ8家族最匹配的骆驼科动物序列向人类Vκ2的家族成员的进行人源化。优选的人类氨基酸是可用于种系化的家族中最常见的氨基酸。然而,在某些位置上,某些家族成员中所存在的氨基酸可以与相应人类种系家族的共有序列中存在的氨基酸不同。
表9-用于使骆驼科动物Vλ8向人类Vλ2进行种系化的替换示例
骆驼科动物Vλ8 | 人类Vλ2 |
位点 | 优选地人类氨基酸 |
L11 | V |
L13 | G |
L17 | O |
L18 | S |
L21 | I |
L22 | S |
L39 | H |
L42 | K |
L45 | K |
L46 | L |
L47 | M |
L60 | D |
L66 | K |
L70 | T |
L72 | S |
L7G | S |
L78 | L |
L80 | A |
以上列举了VH1向VH3、Vκ1向Vκ3和Vλ8向Vλ2进行种系化的示例,以说明如何将图6至29中所存在的序列比对信息用于能够使一个特定家族的骆驼科动物成熟VH(或VL)向不同家族或亚家族的人类种系进行种系化。此处,术语“不同家族或亚家族”是指不是最匹配的人类种系(对于期望进行人源化的骆驼科动物成熟VH或VL而言)所属的任何家族或亚家族。
本发明还提供以包含最主要用在人类免疫系统中的VH和Vλ/Vκ以避免免疫原性风险的抗体为结束的跨家族种系化能力。优选VH3家族和家族成员DP-47(或3-23),Vκ3家族和家族成员DPK22(或A 27),以及具有家族成员DPL11(或2a2)的Vλ2家族(或者具有家族成员DPL5的Vλ1家族,或具有家族成员DPL23的Vλ3家族)。可以使用由Genentech在美国2003190317中所公开的技术和由Morphosys(Knappik等,J Mol.Biol.296:57-86(2000)所公开的技术。
本领域技术人员会理解,图6至29中所存在的序列比对信息提供了骆驼科动物VH、Vλ和Vκ结构域跨家族或亚家族进行种系化的大量可能性。考虑到可使用“混搭”法,可能性的数目还会进一步增加,在所述混搭法中,对于任何给定的骆驼科动物成熟VH或VL结构域而言,FR1、FR2、FR3和FR4中的每一个都可以向相同或不同的人类种系进行种系化。所有由图6至29中存在的序列比对信息所提供的种系化可能性均意在形成本发明的部分主题。因此,本发明的范围延伸至任何包含骆驼科动物VH结构域和/或骆驼科动物VL结构域的人源化骆驼科动物抗体,所述VH结构域和/或VL结构域包含图6至29中所总结的一个或更多个氨基酸替换。
本发明的范围
包含与表4所列举VH替换相似之氨基酸替换的人源化VHH结构域优选不包括在本发明的范围内。
在一个实施方案中,本发明抗体的整个VH结构域和/或整个Vλ/Vκ可来自骆驼科物种。之后对骆驼科VH结构域和/或骆驼科Vλ/Vκ结构域进行蛋白质工程,其中将氨基酸替换引入骆驼科序列的一个或更多个本文所述具体位置中。
在某些实施方案中,可通过用期望的靶标抗原主动免疫骆驼科物种而得到骆驼科高变环(或CDR)。如以下详细讨论和例证的,用靶标抗原免疫骆驼科(天然动物或者改造成表达骆驼科动物物种之免疫球蛋白库的转基因动物)后,可以使用已知技术识别产生对期望抗原具有特异性的(常规骆驼科)抗体的B细胞,并分离编码这些抗体之VH和/或Vλ/Vκ结构域的多核苷酸。
可将分离的骆驼科VH和/或Vλ/Vκ结构域(通过主动免疫而获得)用作改造本发明人源化抗体的基础。从完整的骆驼科VH和/或Vλ/Vκ结构域开始,可以在与起始骆驼科序列不同的VH结构域和/或Vλ/Vκ结构域框架区中进行一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失的改造,包括本文中所述的特定氨基酸位置的替换。原始氨基酸序列中这种改变的目的可以是为了减少可能的不利特性(例如,在人类宿主中的免疫原性)、潜在产物位置的异质化和/或不稳定性(糖基化、脱氨基作用、异构化等),或为了增强分子的某些其他的有利特性(例如溶解度、稳定性、生物利用率等)。在另一些实施方案中,可以在经主动免疫而得到的骆驼科VH和/或Vλ/Vκ结构域之一个或更多个高变环(或CDR)中进行原始氨基酸序列中的改变。引入这些改变的目的是为了增强抗原结合的亲和力和/或特异性;或为了减少认为不利的特性(例如在人类宿主中的免疫原性(所谓的人源化))、潜在产物位置的异质化和/或不稳定性(糖基化、脱氨基作用、异构化等);或为了增强分子的某些其他的有利特性(例如溶解度、稳定性、生物利用率等)。
作为用靶标抗原(或者包含靶标抗原或编码该抗原的多核苷酸的组合物)“主动免疫”的替代,也可以利用患病的骆驼科动物中的免疫应答或骆驼科物种中天然存在的免疫应答作为VH和/或Vλ/Vκ结构域的来源,所述VH和/或Vλ/Vκ结构域源可用作具有期望抗原结合特性的人源化抗体的组分。这些VH/Vλ/Vκ结构域也可以以类似于经主动免疫而获得的VH/Vλ/Vκ结构域的方式用作改造人源化抗体的起点。本发明还包括使用非免疫文库,以及从其中获得/产生的人源化抗体。
在另一些实施方案中,本发明包括“嵌合”抗体分子,其包含来自骆驼科的人源化VH和/或Vλ/Vκ结构域和来自非骆驼科动物抗体的一个或更多个恒定结构域(例如人类编码的恒定区域(或其改造变体))。本发明还延伸至嵌合抗原结合多肽(例如,抗体分子),其中VH和/或Vλ/Vκ结构域之一由骆驼科动物编码但根据本发明进行了人源化,并且其他的可变结构域是非骆驼科动物的(例如,来自人类、啮齿类动物、兔类动物(lagomorph)、非人灵长类动物或软骨鱼)。在这些实施方案中,优选地,VH结构域和Vλ/Vκ结构域二者都来自同一骆驼科动物物种,例如VH和Vλ/Vκ二者都可来自大羊驼或者VH和Vλ/Vκ二者都可来自阿尔帕卡羊驼(在引入改造的氨基酸序列变体之前)。在这些实施方案中,VH结构域和Vλ/Vκ结构域二者都可来源于单个动物,特别是已被主动免疫的单个动物。
人源化抗体的结构
在非限制性的实施方案中,根据本发明的人源化抗体可以包含CH1结构域和/或CL结构域(其氨基酸序列完全或基本上是人的)。当本发明的抗体是作为人类治疗用途的抗体时,抗体的整个恒定结构域或者至少其一部分通常具有完全或基本人的氨基酸序列。因此,本发明的抗体的CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域和CL结构域(以及CH4结构域,如果存在的话)中的一个或多个或者任意组合的氨基酸序列可完全或基本是人的。
有利地,CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域和CL结构域(以及CH4结构域,如果存在的话)可以都具有完全或基本人的氨基酸序列。就人源化或嵌合的抗体或抗体片段的恒定结构域而言,术语“基本上人的”是指氨基酸序列与人恒定结构域至少具有90%、或至少95%、或至少97%、或至少99%的一致性。此处的术语“人的氨基酸序列”是指人免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列,其中包括种系的、重排的和体细胞突变的基因。本发明还涵盖这样的抗体,其包含已被改变的“人”恒定结构域序列(对于人序列,其进行一个或多个氨基酸的添加、缺失或替换)。
正如本文别处所讨论地,预想到可以在重链和/或轻链的恒定结构域(特别是在Fc区中)进行一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失。氨基酸的替换可涉及使用不同的天然氨基酸或者使用非天然的或经修饰的氨基酸来取代被替换的氨基酸。其他结构修饰也是允许的,如改变糖基化模式(例如通过添加或缺失N-或O-连接的糖基化位点来实现)。基于抗体的预期用途,修饰本发明抗体对Fc受体的结合特性可以是期望的,例如用以调节效应功能。例如,可以将半胱氨酸残基引入Fc区中,从而使该区中形成链间二硫键。由此产生的同二聚体抗体可具有提高的内化能力和/或增强的补体介导之细胞杀伤和抗体依赖的细胞毒性(ADCC)。见Caron等,J.Exp.Med.176:1191-1195(1992)以及Shopes,B.J.Immunol.148:2918-2922(1992)。或者,抗体可以被改造成具有双Fc区,从而可具有增强的补体裂解和ADCC的能力。见Stevenson等,Anti-Cancer Drug Design 3:219-230(1989)。本发明还涉及包含本文所述抗体的免疫缀合物,其中所述抗体与细胞毒剂(如化疗剂、毒素(例如,细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素,或其片段)或放射性同位素(即放射性缀合物))相缀合。还可以改造Fc区以延长其半衰期。
在某些实施方案中,本发明可涉及嵌合的骆驼科动物/人抗体,特别是其中VH和Vλ/Vκ结构域完全是骆驼科动物序列(例如大羊驼或阿尔帕卡羊驼),而抗体的其余部分完全是人序列的嵌合抗体。在本发明的一些优选实施方案中,还包括“人源化”或“种系化”的骆驼科抗体以及骆驼科/人嵌合抗体,其中VH和Vλ/Vκ结构域相对于通过主动免疫获得的骆驼科VH和Vλ/Vκ结构域来说在框架区包含一个或多个氨基酸替换。通过使用在人类种系编码的VH或Vλ/Vκ结构域中发现的对应残基取代起始骆驼科VH或Vλ/Vκ结构域中的不匹配氨基酸残基,该“人源化”提高了与人类种系VH或Vλ/Vκ结构域的序列一致性百分比。
本发明还包括经CDR移植的抗体,其中来自于异源抗体的CDR(或高变环)被移植到人VH和VL的框架上,而抗体的其他部分也是完全人来源的,所述异源抗体可来自骆驼科外的其他物种(例如,啮齿类动物、灵长类动物、兔类动物或软骨鱼),或来自不同的骆驼科物种。
本发明还包括这样的抗原结合多肽,其中VH或Vλ/Vκ结构域中的任一个是人源化的骆驼科动物VH或Vλ/Vκ结构域,其在本文所述特定位置中的一个或多个处包含氨基酸替换,并且“另一个”可变结构域具有非驼科动物(例如,人)的氨基酸序列。因此,预想到将人源化的骆驼科动物的VH结构域与人Vλ/Vκ结构域配对,或者将人VH结构域与人源化的骆驼科动物Vλ/Vκ结构域配对。这样的配对可以增加可用的抗原结合库(从中挑选具有所需抗原结合特性的高亲和力结合分子)。
本发明还进一步延伸至这样的抗原结合多肽,其中VH结构域和/或Vλ/Vκ结构域的高变环或CDR来自于骆驼科,但相对于骆驼科动物编码的序列来说,其中至少一个所述(骆驼科动物来源的)高变环或CDR被改造成包含一个或多个氨基酸替换、添加或缺失。这些变化包括高变环/CDR的“人源化”。以这种方式改造的骆驼科动物来源之HV/CDR仍可以表现出与由骆驼科动物编码的HV/CDR之氨基酸序列“基本一致”的氨基酸序列。在这种情况下,“基本一致”可允许与骆驼科动物编码的HV/CDR含有不超过一个,或不超过两个氨基酸序列不匹配。
本发明的抗体可以是任何同种型。用于人类治疗用途的抗体类型通常为IgA、IgD、IgE、IgG、IgM型,通常是IgG型,在这种情况下,它们可以属于IgG1、IgG2a和IgG2b、IgG3或IgG4四个亚类中的任何一种。在这些亚类中,允许在Fc部分进行一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失,或进行其他结构修饰,从而例如提高或降低Fc依赖的功能。
本发明的人源化的抗体可以具有广泛的应用,包括在研究中以及在诊断和/或治疗疾病方面,但是作为人类治疗剂特别有用,尤其是以单克隆抗体的形式。
本发明提供了用于生产针对广泛抗原的人源化抗体(特别是单克隆抗体)的平台,并且从广义上讲,本发明不受靶标抗原之精确性质的限制,也不受与靶标抗原结合的特异性或亲和力的限制。然而,在一些具体的非限制性实施方案中,靶标抗原可以是非骆驼科动物的抗原、细菌抗原、病毒抗原或人类抗原。在一个优选的实施方案中,靶标抗原可以是具有特定治疗意义的抗原。术语“具有治疗意义的靶标”是指参与人类或动物疾病或与各疾病相关之作用的形成、发病、发展、介导的靶标。该定义包括这样的靶标,其表达水平和/或活性受到抗体结合的调节(例如受体活性可以受激动剂或拮抗剂抗体的结合而调节),或者其活性和/或表达对疾病有直接或间接的影响。
例如,“人类抗原”可以包括这样的人天然多肽(蛋白质),其行使受体、受体之配体、细胞信号传导分子、激素、细胞因子或细胞因子受体、神经递质等作用。“天然”是指多肽在发育之任何阶段的人体内表达,包括在疾病过程中人体所表达的多肽。
多核苷酸、载体和重组表达
本发明还提供了编码本发明人源化抗体的多核苷酸分子、包含与调节序列有效连接的编码本发明人源化抗体的核苷酸序列的表达载体,其中所述调节序列允许抗体在宿主细胞或无细胞表达系统中表达,以及包含该表达载体的宿主细胞或无细胞表达系统。
编码本发明人源化抗体的多核苷酸分子包括例如重组DNA分子。
本文使用的术语“核酸”、“多核苷酸”或“多核苷酸分子”可互换使用,其是指任何DNA或RNA分子,无论是单链或双链的,并且如果是单链的话,还包括具有其互补序列的分子。在讨论核酸分子时,本文中可根据以5′至3′方向提供序列的标准惯例描述特定核酸分子的序列或结构。在本发明的一些实施方案中,核酸或多核苷酸是“分离”的。当涉及核酸分子时,该术语是指从所述分子来源之生物体的天然基因组中与所述分子直接相连的序列中分离出来的核酸分子。例如,“分离的核酸”可以包括插入到载体(如质粒或病毒载体)中的DNA分子,或是整合到原核或真核细胞或非人类宿主生物体的基因组DNA中的DNA分子。当涉及RNA时,“分离的多核苷酸”主要是指由上述分离的DNA分子编码的RNA分子。或者,该术语可指从在自然状态下(即在细胞或组织内)与其混合(associate)的其他核酸中纯化/分离出来的RNA分子。分离的多核苷酸(DNA或RNA)还可表示通过生物或合成方法直接产生,并在其生产过程中与存在的其他组分分开的分子。
对于本发明人源化抗体的重组产生,可以制备(使用标准的分子生物学技术)编码其的重组多核苷酸并插入到可复制载体中以在选定的宿主细胞或无细胞表达系统中表达。合适的宿主细胞可以是原核生物、酵母或者高级真核细胞(特别是哺乳动物细胞)。可用的哺乳动物宿主细胞系的实例有:通过SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7,ATCC CRL 1651)、人胚胎肾细胞系(293细胞或亚克隆以悬浮培养生长的293细胞,Graham等,J.Gen.Virol.36:59(1977))、幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL10)、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO,Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))、小鼠睾丸支持细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))、小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-AG14(ATCC CRL 1581,ATCC CRL 8287)或NS0(HPA培养物保藏号no.85110503)、猴肾细胞(CV1ATCC CCL70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)、人宫颈癌细胞(HELA,ATCC CCL2)、犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL34)、布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)、人肺细胞(W138,ATCCCCL75)、人肝细胞(Hep G2,HB8065)、小鼠乳腺瘤(MMT 060562,ATCC CCL51)、TRI细胞(Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))、MRC 5细胞、FS4细胞和人肝癌细胞系(Hep G2),以及DSM′sPERC-6细胞系。适合于这些宿主细胞的表达载体也是本领域普遍已知的。
应注意,术语“宿主细胞”一般是指培养细胞系。引入编码本发明抗原结合多肽之表达载体的完整人类个体被明确排除在本发明的范围以外。
在一个重要的方面,本发明还提供了用于生产重组人源化抗体的方法,其包括在允许所述抗原结合多肽表达的条件下,培养包含编码重组抗原结合多肽之多核苷酸(例如表达载体)的宿主细胞(或无细胞表达系统),并回收所表达的抗体。该重组表达方法可用于本发明抗体(包括旨在用于人类治疗用途的单克隆抗体)的大规模生产。用于大规模生产适用于体内治疗用途的重组抗体的合适载体、细胞系和生产方法都是在本领域常规可得的,并为本领域技术人员所熟知。
本发明的另一些方面涉及检测试剂盒,包括诊断试剂盒等,其包含本发明的抗体,还涉及包含本发明抗体的药物制剂。
当所述人源化抗体用于诊断时(例如,当抗体特异性针对作为疾病状态或疾病易感性之生物标志物的抗原时),可方便地提供该抗原结合多肽作为检测试剂盒的组分。诊断检测通常采用标准的免疫测定,如ELISA、放射免疫测定、Elispot等。这种检测试剂盒的组分可基于检测或测定(其旨在使用本发明的抗原结合多肽来实施)的性质而有所改变,但通常还包括使用本发明抗原结合多肽进行免疫测定所需的其他试剂。作为诊断试剂应用的抗体或其抗原结合片段可带有显示标记物(revealing lable),如荧光基团、酶标记或放射性标记。
作为体内治疗应用的人源化抗体通常被配制成与一种或多种可药用稀释剂、载体或赋形剂组合的药物剂型(Remington′s PharmaceuticalSciences,第16版,Osol,A.编,1980)。本发明的抗体通常配制成无菌水溶液,以对有此需要的哺乳动物对象(通常是人类患者)通过静脉内、肌内、腹膜内、脑脊髓内、肿瘤内、口服、瘤周、皮下、滑膜内、鞘内、局部、舌下或吸入途径施用。为预防或治疗疾病,抗体的合适剂量将取决于待治疗之疾病的类型、疾病的严重程度和病程,以及患者的年龄、体重和病史,并由主治医师判断确定。
人源化抗体的生产方法
本发明人源化抗体的生产方法可包括:首先分离具有期望的抗原结合特性之常规骆驼科动物抗体,之后通过如本文所述在VH或VL结构域中进行一个或更多个氨基酸替换,对所述抗体进行人源化。
所述方法的第一步可包括对骆驼科物种进行主动免疫以引起其对靶标抗原的免疫应答,从而产生与靶标抗原发生免疫反应的骆驼科常规抗体。对骆驼科动物免疫的方案在所附实施例中描述。用于免疫的抗原制剂可以是靶标抗原的纯化形式,例如重组表达的多肽或其免疫原性片段。然而,也可使用抗原的未加工制剂(例如表达或编码靶标抗原的细胞或组织制剂、细胞裂解物、细胞上清液或级分(如细胞膜)等)或编码所述靶标抗原的多核苷酸(DNA免疫)进行免疫。
该方法通常涉及骆驼科物种(包括但不限于,大羊驼和阿尔帕卡)动物的免疫,并且有利的是这些动物属于远交种群。但是,还预想到使用包含骆驼科动物常规Ig基因座,或至少其一部分的转基因动物(例如转基因小鼠)。
一个日益感兴趣的话题似乎是体内和体外生成的抗体的互补决定区(CDR的)之间的差异。推测体内选择对于免疫原性、功能性、稳定性具有有利的影响,并因此提高了所产生抗体的可制备性,而体外生成和选择的合成CDR从这些方面具有不利因素。这是很重要的,因为给定的治疗性抗体具有被来自患者的所谓抗独特型抗体应答中和的风险(Lonberg,Nature Biotechnology,23:1117-1125,(2005))。
基于骆驼科动物主动免疫的方法的关键优势在于:所有骆驼科物种都能以大规模的远交种群来维系,其中每只动物都有不同的遗传背景。因此,可采用主动免疫来引起针对目的抗原的强的和多样性的免疫应答,并从中可获得多样的潜在抗原结合分子集合。如所附实施例所示,已发现骆驼科动物的主动免疫可产生具有高度免疫多样性的与靶标抗原结合之Fab片段。不希望受理论的约束,推测人类和骆驼科动物之间的进化距离可能对于针对给定靶标抗原的多样性免疫应答的产生是重要的。相反地,非人灵长类动物在进化上与人类接近,因此在非人灵长类动物和人类之间具有高度同源性的靶标只可以在非人灵长类动物中引起强度和多样性上有限的免疫应答。
如果所产生的抗体与人抗体表现出低的序列和结构同源性(从而需要进行大规模的“蛋白质改造”来产生具有治疗潜能的候选抗体),那么在远交种群(其与人的进化距离远)中使用主动免疫不会是特别有利的。因此,极为重要的是,已显示骆驼科种系(以及体细胞突变的序列)编码的VH和VL结构域与人VH和VL结构域具有非常高的序列和结构同源性。这种高度同源性与大量远交种群的可用性相结合从而产生了非常强大的用于开发作为人类治疗用途的单克隆抗体的平台。
在使用靶标抗原进行主动免疫后,可从经免疫动物中分离出外周血淋巴细胞或活检样品(如淋巴结或脾活检样品),并筛选出产生针对靶标抗原的骆驼科动物常规抗体。如实施例中所示,该阶段中可使用例如淘选(panning)或FACS分选的富集技术以减少待筛选的B细胞库的复杂性。然后,选出抗原特异性B细胞并用于提取总RNA以及随后cDNA合成。编码骆驼科动物本源VH和VL结构域的核酸(特异性针对靶标抗原)可通过PCR进行分离。
得到与靶标抗原发生免疫反应的骆驼科动物常规抗体并不一定要使用主动免疫。还可利用骆驼科动物的自身免疫应答,无论是在动物中天然存在的免疫多样性,或者例如患病动物或已天然暴露于特定病原体的动物(例如通过正常的感染途径)。在这方面,可使用骆驼科动物的非免疫文库。如果骆驼科动物中的“天然”免疫应答已产生与目的靶标抗原结合的抗体,则可利用本文所述的基因改造以及本领域已知的其他标准技术来培养并分离产生该抗体的B细胞或产生该抗体的单克隆细胞培养物和/或确定编码该抗体VH和/或VL结构域的骆驼科动物基因区段的核苷酸序列。了解到该序列的信息,就可以改造出编码如下抗体的重组DNA构建体,所述抗体包含骆驼科动物来源的VH和/或VL或者高变环(或CDR)。
可以将编码骆驼科动物VH和VL结构域的核酸(无论是以主动免疫获得或是以其他方式获得)直接克隆到用于生产本发明抗原结合多肽的表达载体中。特别地,可以将这些序列克隆到还编码人抗体恒定结构域或其一部分的表达载体中以产生嵌合抗体。然而,通常是在克隆和表达人类恒定结构域序列之前,对分离的骆驼科动物VH和VL序列进行进一步操作。
第一步,可使用候选的骆驼科动物VH和VL序列(包括主动免疫后分离的序列)制备骆驼科动物文库(例如Fab文库,如所附实施例中所述地)。然后可针对与靶标抗原的结合来筛选文库(例如使用噬菌体展示技术)。可以对有前景的首选候选物针对与靶标抗原的结合进一步进行检测,例如使用Biacore或合适的生物测定来实现。最后,将最有前景的编码VH和VL结构域的序列与编码人抗体恒定结构域的序列进行框内融合克隆。
为了密码子优化目的,可在编码VH/VL结构域中骆驼科动物来源之序列或其人源化变体的多核苷酸序列中引入改变,以及在多核苷酸序列中进行涉及克隆和/或表达的其他改变,所述优化或改变不改变所编码的氨基酸序列。
在某些方法中,可进行“链改组(chain shuffling)”,其中已知与目的抗原结合的特定可变结构域与一系列相反类型的可变结构域中的一个配对(即VH库与VL库配对或相反亦然)以产生文库以及所得到的针对抗原亲和力和/或特异性进行检测的VH/VL“混杂”组合。或者,VH结构域文库可随机或以分级的方式与VL结构域文库配对,并检测所得到的组合(见Clackson等,Nature,卷352,624-638页,1991)。在该方法中,所述文库可以是来源于骆驼科动物(其表现出对目的抗原具有免疫性(包括已被主动免疫的动物))的重排VH和VL(Vκ或Vλ)的文库。该链改组过程可增加免疫多样性和生产具有显着增强的亲和力的配对。
还可使用逆向的“链改组”方法分离具有有用的抗原结合特性的骆驼科动物VH/VL结构域对,从非骆驼科动物(优选人类)编码的VH/VL结构域组合(其与目的抗原结合)开始。例如,这可以是针对确定之疾病靶标的完全人治疗性抗体。从该VH/VL组合开始,可进行第一轮选择(其中VH结构域被骆驼科动物编码的VL结构域文库“改组”(或反之亦然)),并针对抗原结合检测该配对。然后,可将所选的非骆驼科动物(例如人)VH/骆驼科动物VL的配对进行第二轮选择,其中骆驼科动物编码的VL被骆驼科动物编码的VH文库改组,并针对抗原结合检测该配对。结果,可以产生骆驼科动物VH/骆驼科动物VL的组合,其携带了起始VH/VL组合的表位印迹。使用本文所述的任何方法,该骆驼科动物VH/VL的组合可根据需要进一步被改造/修饰以及与人类编码的恒定结构域结合。
然后对编码骆驼科动物来源的VH结构域和/或骆驼科动物VL结构域的克隆多核苷酸进行改造,以在本文所公开的一个或更多个特定氨基酸位置上引入氨基酸替换。优选的替换包括但不限于,对于VH而言为表4所列举的那些以及对于VL而言为表5所列举的那些,其任选地与本文所公开的任何J片段替换和/或本文所公开的任何CDR替换相组合。
人源化的总体目标是产生这样的分子,当将其引入人对象中时,其中的VH和VL结构域都表现出尽可能小的免疫原性,而保留了由骆驼科动物编码的亲本VH和VL结构域(例如通过主动免疫获得的骆驼科动物VH/VL)形成的抗原结合位点的特异性和亲和力。人源化方案可以反复进行,其中依次引入从骆驼科动物到人的氨基酸改变并且在每个阶段进行测试,直到观察到亲和力显著下降(例如5~10倍)。为了同时测试多个氨基酸改变,还可以使用“文库”法。
文库构建方法
编码骆驼科动物常规抗体之VH和/或VL结构域的表达载体文库的产生方法可包括以下步骤:
a)扩增编码骆驼科动物常规抗体之VH和/或VL结构域的核酸分子区域以获得经扩增的基因区段,每个基因区段均包含编码骆驼科动物常规抗体之VH结构域的核苷酸序列或编码VL结构域的核苷酸序列,以及
b)将a)中获得的基因片段克隆到表达载体中,从而每个表达载体至少包含编码VH结构域的基因区段和/或编码VL结构域的基因区段,由此获得表达载体文库。
步骤a)中被扩增的核酸可包括从骆驼科动物淋巴组织制备的cDNA或基因组DNA,所述淋巴组织包括一种或多种B细胞、淋巴结、脾细胞、骨髓细胞,或其组合。循环中的B细胞是特别优选的。出人意料地发现外周血淋巴细胞(PBL)可作为编码骆驼科动物常规抗体之VH和VL结构域的核酸的来源,即在PBL样品中有足够量的(表达抗体的)浆细胞使得可以进行直接扩增。这是有利的,因为PBL可利用动物(骆驼科动物)的全血样品制备。这就避免了需要使用介入性方法来获取组织活检样品(例如,来自于脾或淋巴结)。这意味着采样程序可视需要而经常重复进行,同时对动物的影响最小。例如,可以主动免疫骆驼科动物,从该动物中抽取第一份血样,并制备PBL,然后使用“加强”剂量的同一抗原或不同抗原再次免疫同一动物,然后抽取第二份血样,并制备PBL。
淋巴组织(例如循环中B细胞)可以取自于被主动免疫的骆驼科动物。还涉及制备非免疫文库和来自于患病骆驼科动物之淋巴组织的文库。
总RNA(或mRNA)可从淋巴组织样品(例如外周血细胞或组织活检样品)中方便地制备,然后使用标准技术转换为cDNA。另外,还可使用基因组DNA作为起始材料。
可以使用多样性文库方法或者B细胞选择方法来构建文库。在多样性文库方法中,可从取自淋巴组织的核酸中扩增VH和VL编码基因区段的库,而不需事先进行B细胞选择。在B细胞选择方法中,可在核酸提取和扩增VH和VL编码之基因区段之前,选择那些展示具有期望抗原结合特性的抗体的B细胞。
可使用多种常规方法来选择表达具有期望抗原结合特性之抗体的骆驼科动物B细胞。例如,B细胞可被荧光标记的单克隆抗体(mAb,特异性识别来源于大羊驼或其他骆驼科动物的常规抗体)和其他荧光染料标记的靶标抗原染色以用于常规IgG的细胞表面展示。然后,利用FACS分离各个双阳性B细胞,并且从各个细胞中提取总RNA(或基因组DNA)。或者,可以对细胞进行体外增殖,然后可筛选含有分泌的IgG的培养上清,再从阳性细胞中提取总RNA(或基因组DNA)。在另一方法中,各个B细胞可经特定基因进行转化或与肿瘤细胞来融合以产生可以“根据需要”进行生长的细胞系,随后从这些细胞中制备总RNA(或基因组DNA)。
除了使用FACS进行分选,还可利用固定化的单克隆抗体(针对骆驼科动物的常规抗体)并随后利用固定化的靶标抗原对表达常规IgG的靶标特异性B细胞进行“淘选”。RNA(或基因组DNA)可从抗原特异性B细胞集合中提取,或者这些集合可被转化并可通过有限稀释或FACS克隆出单个细胞。
B细胞选择方法可包括阳性选择或阴性选择。
无论是使用不进行任何B细胞选择的多样性文库方法或是使用B细胞选择方法,都对从淋巴组织制备出核酸(cDNA或基因组DNA)进行扩增步骤,从而扩增编码各VH或VL结构域的基因区段。
可将从淋巴组织(例如外周B细胞或组织活检样品)中提取的总RNA转化成随机引物cDNA,或者可使用寡dT引物合成cDNA,或者可用Ig特异性寡核苷酸引物合成cDNA,或者可在cDNA合成前使用寡dT纤维素从总RNA中纯化mRNA(即多聚腺苷酸RNA)。可将从B细胞中分离的基因组DNA用于PCR。
可使用与可变结构域5′端退火的FR1引物连同与CH1或Cκ/Cλ区3′端退火的引物进行编码至少VH或VL的重链和轻链(κ和λ)基因区段的PCR扩增,其优势在于:就这些恒定结构域引物而言,每种类型只需要一种引物。该方法使骆驼科动物的Fab得以克隆。或者,可使用与可变结构域的3′端退火的一系列FR4引物用于克隆Fab(融合到编码恒定结构域的载体中)或scFv(单链Fv,其中重链和轻链的可变结构域通过柔性的连接序列相连);或者,可变结构域可在这样的表达载体中克隆,所述表达载体允许产生在哺乳动物细胞上展示的全长IgG分子。
通常扩增以两步进行,在使用非标记引物的第一步中使用大量的cDNA(以保持多样性),在第二步中,使用经标记的引物(其是延伸引物,在5′端引入了限制性酶切位点以进行克隆)在少数几个循环中对扩增产物进行再次扩增。在第二扩增步骤之前,可将第一扩增步骤(使用非标记的引物)中产生的扩增产物进行凝胶纯化以去除多余的引物。或者,可引入启动子序列,其使得可以转录成RNA用于核糖体展示。除了限制性位点以外,还可以引入重组位点(例如Cre-Lox或TOPO位点),后者允许定点插入到适当的载体中。
然后,可将编码骆驼科动物常规VH和VL结构域的经扩增基因区段克隆到适合于VH/VL组合表达为功能性抗原结合多肽的载体中。例如,首先,可将来自B细胞集合(或未进行任何B细胞选择的其他淋巴组织)集合的经扩增VHCH1/VκCκ/VλCλ基因区段分别克隆作为单独的文库(最初的文库),然后在第二步中,通过切下轻链片段并将其连接到编码重链片段的载体中组装成Fab或scFv文库。该两步法支持大型文库的构建,因为PCR产物的克隆是相对低效的(由于限制性酶的消化效果欠佳所致)。通过基于扩增产物序列中少部分重叠的“重叠剪接延伸(splicing-by-overlap extension,SOE)PCR”可生成编码scFv的DNA片段;在PCR中,通过混合编码连接序列的小DNA片段与编码VH和VL的扩增产物,利用其重叠序列形成单个DNA片段。
可以将包含编码VH和VL之基因区段的扩增产物克隆进噬菌体或噬菌粒载体中,其允许使用以噬菌体展示为基础的筛选方法来选择靶标特异性抗体片段。或者,可将扩增产物克隆到允许在酵母细胞上(作为Fab、scFv或全长IgG)或在哺乳动物细胞上(作为IgG)展示的表达载体中。
在另一些实施方案中,可通过使用核糖体展示的扩增产物来避免克隆,其中在扩增引物中包含T7(或其他)启动子序列和核糖体结合位点。在针对结合靶标抗原的筛选后,克隆该集合并对各个克隆进行分析。因为文库的克隆和噬菌体的选择仅限于1010至1012个克隆,因此从理论上讲,与噬菌体展示文库相比,使用该方法可得到更大的免疫库。
当使用B细胞分选时,可将包含编码单个靶标特异性B细胞的VH或VL之基因区段的扩增产物直接克隆到细菌或哺乳动物表达载体中用于生成抗体片段(scFv或Fab)或甚至全长IgG。
与靶标抗原发生免疫反应之克隆的筛选和选择
筛选/选择通常包括将由文库中之克隆编码的表达产物(即以抗原结合多肽形式存在的VH/VL对,如Fab、scFv或抗体)与靶标抗原接触,并选择所编码的VH/VL对表现出期望之抗原结合特性的一个或多个克隆。
噬菌体展示文库可利用固定化的靶标抗原或可溶性(通常是生物素化的)的靶标抗原进行筛选。因其以单体存在并在噬菌体上以单价展示,所以Fab形式允许基于亲和力的筛选,而这对于scFv(由于会发生凝集并在噬菌体上以多价展示)和IgG(二价形式)是不适用的。通常需要两到三轮的筛选才能获得足够富集的靶标特异性结合物。
基于亲和力的筛选可通过在接下来的一轮筛选中降低靶标抗原量来进行,而使用非生物素化靶标进行延长清洗可鉴定出具有极佳亲和力的结合物。
该筛选方法能让使用者追踪(home in on)某些表位,而从固定化靶标上洗脱噬菌体克隆的经典方法是基于pH休克(其使得抗体片段和/或靶标变性),与针对靶标抗原的参照mAb或可溶性受体或细胞因子的竞争导致展示与靶标相关表位结合的抗体片段的噬菌体得以洗脱(这自然也适用于其他展示系统,包括B细胞选择方法)。
使用从细胞或培养上清液制备的周质级分(片段从细胞中“渗漏”入其中),可将从选择产物中取得的单个克隆用于小规模抗原结合多肽(如抗体片段)的生产。表达可由诱导型启动子(例如lac启动子)驱动,这意味着一经加入诱导剂(IPTG),便启动了片段的产生。前导序列确保了片段向周质的转运,在此处片段被适当地折叠并形成分子内二硫桥。
由此产生的粗蛋白级分可用于靶标结合测定(例如ELISA)。对于结合研究来说,从单个克隆制备的噬菌体可用来克服Fab的低表达产量(其通常获得非常低的结合信号)。还可以使用体外受体-配体结合测定来筛选这些蛋白级分,以鉴定拮抗抗体;可以使用基于ELISA的受体-配体结合测定,还可以使用如Alphascreen的高通量测定。也可以通过放射性标记的配体结合测定来进行筛选,其中过表达受体之细胞系的膜级分被固定,后一测定极其灵敏,因为只需要皮摩尔量的放射性细胞因子,这意味着粗蛋白级分中极少量的拮抗性Fab就将给出阳性读数。或者,也可应用FACS进行抗体的筛选,其抑制了荧光标记的细胞因子与细胞上表达的其受体的结合,而FMAT是其高通量的变通方法。
可以将存在于周质级分中的或者通过其六组氨酸标签进行IMAC部分纯化的或者通过G蛋白(已知与Fab的CH1结构域结合)进行部分纯化的Fab直接用于使用细胞的生物测定(其对细菌杂质不敏感)中;或者,来自单个大肠杆菌细胞的Fab可以在哺乳动物系统中再克隆以用于Fab或IgG的表达,并随后在生物测定中进行筛选。
在确定阳性表达载体克隆(即编码与期望靶标抗原结合的功能性VH/VL组合的克隆)后,常规地确定该可变结构域核苷酸序列,并据此推导出其编码的VH和VL结构域的氨基酸序列。
如果需要,Fab(或scFv)编码区域可被再克隆到另一表达平台(例如,细菌表达载体(除了没有用于在噬菌体上展示所必需的基因3以外,其与噬菌粒载体相同))中,从而实现更大规模的编码片段生产和纯化。
纯化的Fab(或scFv)的靶标结合亲和力可以通过表面等离子体共振(例如Biacore)或其他方法确定以及通过使用体外受体-配体结合测定和基于细胞的测定来确定中和效力。
抗原结合的家族(特别是拮抗性Fab(或scFv))可基于序列分析(主要是VH,特别是VH结构域的CDR3的长度和氨基酸序列)来确定。
效力优化
如有需要,可对通过筛选/选择鉴定出的编码对期望靶标抗原具有亲和力的VH/VL组合的克隆进行以下下游步骤,其中对亲和力和/或中和效力进行优化。
每个VH家族表现最佳的成员的效力优化可以通过轻链改组、重链改组或其组合来实现,从而选出在动物中天然存在的亲和力变体。这在最初的骆驼科动物VH/VL结构域选自于主动免疫之骆驼科动物的实施方案中是特别有利的,因为可使用从同一经免疫动物制备的原始文库来进行链改组,从而筛选在同一经免疫动物中产生的亲和力变体。
对于轻链改组而言,可使用编码具有期望抗原结合特征的VH/VL对(例如拮抗性Fab)的VH区(或VHCH1)的基因区段来构建文库,在该文库中编码VH的单个基因区段与文库(所述克隆最初从该文库中挑出)中的轻链集合结合。例如,如果编码VH的区段选自于通过利用靶标抗原进行主动免疫而引起免疫应答的骆驼科动物制备的文库(例如,Fab文库),那么可通过将该VH编码区段与同一经免疫骆驼科动物的轻链(VL)集合结合来构建“链改组”文库。然后,可利用所得到的文库来选择靶标抗原,但要在严格的条件(低靶标浓度、使用溶液中非生物素化的靶标进行彻底清洗)下,以确保分离出最高亲和力的变体。周质级分的解离速率筛选(off-rate screening)也可有助于鉴定出更优的克隆。在经过序列分析并再次克隆到细菌生产载体中后,可对纯化的选定Fab进行亲和力(如通过表面等离子体共振)和效力(如使用生物测定)的检测。
可通过将编码轻链改组后选定之克隆的轻链(VL)的基因区段克隆回来自于同一动物(原始VH/VL编码克隆从中选择)的原始重链文库而进行重链改组。或者,可使用CDR3特异性寡核苷酸引物来扩增VH区家族,其可被克隆为集合从而与拮抗性Fab的轻链结合。然后基于亲和力的筛选和解离速率筛选,可鉴定该家族内表现最优的VH。
应当理解,轻链改组和重链改组步骤在实践中可以任一顺序进行,即先进行轻链改组,随后进行重链改组,或先进行重链改组,随后进行轻链改组。这两种可能性都包含在本发明的范围内。
根据具有增强之亲和力和效力的VH/VL对(例如Fab)的轻链或重链,(特别是)CDR的序列可用于生成改造变体(其中组合了若干单个Fab的突变)。已知突变通常可以叠加,这意味着将这些突变进行组合可得到更高的亲和力。
为人类治疗用途而进行的种系化和改换形式(formatting)
可以对选定的编码VH/VL对的表达克隆(其表现出期望的抗原结合特征,例如编码scFv或Fab的噬菌体克隆)的VH和VL编码基因区段经历下游加工步骤并再次克隆到另外的表达平台(例如编码适合于人类治疗用途的抗原结合多肽的形式的载体(例如,具有完全人抗体恒定结构域的全长抗体))中。
有前景的“首选”选定克隆可被改造成在编码VH结构域和/或VL结构域的核苷酸序列中引入一个或多个改变,该改变可改变或不改变VH结构域和/或VL结构域所编码的氨基酸序列。VH或VL结构域序列中的这些改变可包括替换本文所述的特定VH和VL氨基酸残基。具体地,骆驼科动物VH结构域可被改造成引入一个或更多个表4所列举的特定氨基酸替换,而骆驼科动物VL结构域可被改造成引入一个或更多个表5所列举的特定氨基酸替换。
对与人VH3家族成员具有氨基酸同源性的VH结构域进行种系化通常包括替换/替代多个与公开已知的大羊驼、阿尔帕卡或单峰驼(Camelusdromedarius)来源之种系序列不同的残基。允许用于大羊驼、阿尔帕卡或单峰驼(特别是大羊驼)的VH3结构域之种系化/人源化的氨基酸替代包括但不限于:在框架区的第74、83和84位(使用Kabat编号)中的任何一个或其任何组合上进行的氨基酸替换。这样的替换将包括使用不同的氨基酸(其可以是天然或非天然的氨基酸,并且优选是已知出现在人类编码的VH3结构域中对应位置上的氨基酸)代替这些位置上骆驼科动物编码的残基。例如,第74位的丙氨酸可以被替换为丝氨酸,或者保留该位置的丙氨酸,第83位的赖氨酸可以被精氨酸替换,第84位的脯氨酸可以被丙氨酸替换。因此,本发明抗原结合多肽的特定的非限制性的实施方案包括包含表现出与人VH3结构域具有序列同源性的骆驼科动物(更具体地说是大羊驼、阿尔帕卡羊驼或单峰驼)VH结构域的变体,其中VH结构域在第74、83和84位(使用Kabat编号)中一个或多个或所有位置上包含氨基酸替换(相对于骆驼科动物编码的序列而言)。特别地,具有下列替换中的一个或多个或其任何组合的变体是允许的:在第74位A变为S,在第83位将K变为R,或在第84位将P变为A。
一旦知晓首选的VH和VL结构域(需要时,在效力优化后)的氨基酸序列,即可设计VH和VL的合成基因,其中与人类种系不同的残基被优选的人残基(来自于最匹配的人类种系,或使用出现在其他人类种系中的残基,或者甚至是骆驼科动物的野生型残基)替换。在该阶段,编码可变结构域的基因区段可以被再克隆到表达载体中,从而使其在基因合成中或通过克隆到合适的展示载体中而与Fab的人类恒定结构域融合。
得的VH和VL合成基因可以与Fab文库重组,或者经种系化的VH可以与野生型VL重组(反之亦然,称为“杂交”文库)。基于亲和力的筛选允许分离出表现最优的种系化形式,就“杂交”文库而言,可将表现最优的种系化VH与表现最优的种系化VL进行重组。
可使用经种系化之Fab的氨基酸和核苷酸序列信息来生成密码子经优化的合成基因以产生优选同种型(IgG1(适用于ADCC和CDC)、IgG2(适用于有限的效应功能)、IgG4(类似于IgG2,但适用于需要单价结合的情况)的全长人IgG。对于非长期的应用和快速指示,也可制备细菌或哺乳动物细胞来产生人类Fab。
参照以下非限制性的实施例来进一步理解本发明。
实施例1至9示意针对示例抗原(表示为“细胞因子x”)产生抗体的方法,其从免疫大羊驼开始。同样的一般操作方案可适用于任何骆驼科动物物种的任何靶标抗原,因而“细胞因子x”的确切身份并不重要。还针对制备与IL-1Beta结合的Fab对该方法进行举例说明。
在上文的描述以及以下的实施例中引用了多篇出版物,其中每一篇都作为整体通过引用并入本文中。
一般操作方案
实施例1
大羊驼的免疫
大羊驼(Lama glama)的免疫和外周血淋巴细胞的获取以及随后RNA的提取和抗体基因片段的扩增都依照De Haard及其同事所描述的方案进行(De Haard等,J.Bact.187:4531-4541(2005))。通过使用弗氏完全佐剂或适当的动物用佐剂StimuneTM(Cedi Diagnostics BV,TheNetherlands),将重组人类细胞因子x经肌内免疫一只大羊驼。细胞因子x(在被改造的人类细胞系中重组表达)是购买的。在免疫前,冻干的细胞因子x在PBS(Dulbecco)中以250μg/ml的浓度重溶。大羊驼每周接受6次注射,前两次注射每次注射使用100μg细胞因子,后四次注射每次使用50μg进行加强。在末次免疫后4天,从动物中抽取150ml的血液样品(PBL1)并制备血清。末次免疫后十天,抽取第二份150ml的血液样品(PBL2)并制备血清。使用Ficoll-PaqueTM梯度(AmershamBiosciences),将作为大羊驼免疫球蛋白基因来源的外周血淋巴细胞(Peripheral blood lymphocyte,PBL)从血液样品中分离出来,得到1~5×108个PBL。抗体的最大多样性预期与取样的B淋巴细胞数目一致,约为PBL数目的10%(9.2~23.2%)(1~5×107)(De Genst等,Dev.Comp.Immunol.30:187-98(2006))。大羊驼血清中常规抗体的比例达到总免疫球蛋白量的80%,其可以推测出产生常规抗体之B淋巴细胞具有类似比例。因此,150ml血液样品中常规抗体的最大多样性被计算为0.8~4×107个不同分子。根据Chomczynski等Anal.Biochem.162:156-159(1987)的方法从PBL分离出总RNA。
实施例2
通过淘选或FACS分选来富集抗原反应性B细胞(任选)。
为了降低所采样的B细胞库的复杂性使重组的Fab噬菌体展示文库得以有效克隆,通过使用荧光标记的抗原和特异性识别骆驼科动物常规抗体的mAb(作为B细胞标志物)进行FACS分选(Weitkamp等,J.Immunol.Meth.(2003)275:223-237)或通过利用固定化抗原进行过淘选(Lightwood等,J.Immunol.Meth.316:133-143(2006))来富集抗原反应性B细胞。
来自于经免疫动物的PBL通过利用上述Ficoll-Paque密度离心法进行分离。任选地,在室温下,通过将PBL沉淀用20ml的裂解缓冲液(8.29g/L NH4Cl、1.09g/L KHCO3和37mg/L EDTA)重悬,然后以200×g离心10分钟,以裂解一起纯化出的红细胞。同样任选的是去除单核细胞,其通过将它们粘附于T150培养瓶的塑料表面来实现。为此目的,将该细胞重悬在70ml含10%胎牛血清、二聚谷氨酸(Glutamax)、25mM Hepes、青霉素-链霉素(Invitrogen)以及0.38%柠檬酸钠的RPMI(Invitrogen)中,并在37℃和5%CO2的培养箱中孵育2小时。回收包含所选出B细胞的上清液并进行细胞计数。
通过对特异性识别骆驼科动物常规抗体的mAb(使用荧光标记)和靶标抗原(使用另一种荧光染料标记)同时染色来对展示靶标特异性之常规抗体的(活的)B细胞进行大规模FACS分选。通过使用Gough及其同事的操作方案(Gough,Anal.Biochem.173:93-95(1988))或使用TRIzolTM试剂盒(Invitrogen)分选出1,000至100,000个抗原特异性细胞并用于RNA提取。总RNA被转换成随机引物cDNA(作为模板)以用于扩增抗体重链和轻链可变基因(参见实施例3及其后实施例)。
实施例3
可变结构域基因的扩增和克隆。
使用用于RT-PCR的SuperscriptTM III第一链合成系统(SuperscriptIII First-Strand Synthesis System for RT-PCR,Invitrogen)从80μg的PBL RNA中制备出随机引物cDNA。在8个独立反应体系(20μl反应体系)中,在2.5μM随机六核苷酸引物和500μM dNTP存在下,将RNA在65℃热变性5min。随后,根据供应商的说明,将缓冲液和二硫苏糖醇以及640单位的RNasOUT(40单位/μl,Invitrogen)和3200单位的Superscript III逆转录酶(200单位/μl,Invitrogen)加入8×40μl的总最终体积中。在50℃孵育50min后,在85℃孵育5min,然后在1℃孵育1min。加入RNAse H(~4U)并在37℃孵育20min。根据供应商的建议,使用QIAquickTM PCR纯化试剂盒纯化所富集的cDNA并用于PCR。
根据来自于大羊驼和单峰驼的种系序列,设计退火到CH1的3′端和VH的5′和3′端的引物,所操作的序列可以从IMGT和根据De Genst及其同事(De Genst等,Dev.Comp.Immunol.30:187-198(2006))所述的其他数据库中获取。为了设计用于轻链扩增的寡核苷酸,使用重排的和体细胞突变的单峰驼序列(其在研究论文中发表(I.Legssyer,Free UniversityBrussels))。
所有最初的PCR都使用退火到可变结构域5′端的独立BACK引物和退火到CH1之3′端的FOR引物相组合来进行,利用相对大量的随机引物cDNA为模板(高达2.5μl,对应于6μg的总RNA),从而保持最大的多样性。可使用JHFOR引物和Sfi I-标记的VHBACK引物组合再次扩增源自重链的扩增产物(其中JHFOR引物退火到VH的3′端并包含天然存在的BstE II位点,VHBACK引物退火到VH基因的5′端),并且随后克隆为VH片段。轻链V基因通过PCR获得,其使用了一系列退火到恒定结构域3′端的CKFOR或CLFOR引物以及退火到V区5′端的BACK引物。使用延长的CH1 FOR(包含Not I位点)或CKFOR以及CLFOR(包含Asc I位点)引物,再次扩增来自首次PCR反应的扩增产物,并随后克隆为大羊驼Fab片段。或者,使用被限制性酶切位点标记的引物(FOR引物具有Asc I位点,基于FR4的BACK引物具有Xho I位点),DNA区段可被再次扩增并克隆为VL片段,从而形成包含大羊驼来源的、与人类C区相结合的V区的嵌合Fab。
PCR在50μL的反应体系中进行,其使用了PhusionTM聚合酶(Finnzymes)和500pM的每种引物,进行了28个循环(96℃1min,60℃1min以及72℃1min)。使用QIAex-II提取试剂盒(Qiagen),从琼脂糖凝胶纯化所有产物。为了引入限制性酶切位点,作为再扩增的输入物,在100μl的反应体系中使用100~200ng经纯化的DNA片段作为模板。通过对琼脂糖凝胶上4μl“未扩增”的PCR混合物的分析来证实大量的输入,其保证了变异性。
实施例4
一级和二级骆驼科动物Fab库的构建。
为了构建一级重链和两个一级轻链的库,对附带限制性酶切位点的PCR产物进行凝胶纯化,而后进行酶切并与三个不同的VH、Vκ和Vλ家族组合成三个集合。VHCH1片段用Sfi I和Not I酶切,VκCκ和VλCλ片段用ApaL I和Asc I酶切,并被克隆到噬菌粒载体pCB3(与经改造具有多克隆位点的pCES1载体相似)中。使用T4-DNA连接酶(Fermentas),将酶切片段(1~2μg)连接到经酶切并纯化的pCB3(2~4μg)上,在室温孵育几个小时,然后在37℃孵育1~2小时。将针对轻链或重链集合的经脱盐的连接混合物对大肠杆菌TG1进行电穿孔以构建单链的文库。
或者,将经Sfi I和BstE II(存在于VH中)酶切的VH片段(共1.5μg)使用9个单位的T4-DNA连接酶于室温下在100~200μl的反应混合物中连接到4μg经凝胶纯化的载体pCB4(类似于载体pCB3,但没有pIII基因)中。此外,VH基因区段可通过Sfi I和BstE II来克隆,Vκ/Vλ基因区段通过ApaL I和Xho I来克隆,从而产生嵌合Fd和VκCκ和VλCλ。
通过将轻链片段(从制备自轻链库的质粒DNA酶切获得)克隆到包含重链库的质粒集合中而获得Fab文库。从至少3×109个细菌的VL文库(供者载体)中分离的质粒DNA被ApaL I和Asc I酶切用于在受者载体中克隆经凝胶纯化的DNA片段,其中受者载体已经包含重链文库,从而构建独立的具有κ轻链的Fab文库,以及由具有λ轻链的Fab组成的另一文库,其大小为1~10×109个克隆。同样,来自单链文库的VλCλ或VκCκ可以使用ApaL I/Asc I利用琼脂糖凝胶分离出来,并使用相同的限制性酶切位点克隆到VHCH文库载体中。
实施例5
文库的选择
使用辅助噬菌体M13-KO7或VCSM-13以2升的规模进行噬菌体颗粒援救(rescue),其使用代表性数目的来自接种文库的细菌以保证来自每个克隆的至少10个细菌存在于起始接种体中。为进行选择,1013个克隆形成单位与固定在免疫管(MaxisorpTM tubes,Nunc)上或在96孔微量滴定板(MaxisorpTM tubes,Nunc)中的抗原或与可溶性生物素化的抗原一起使用。在随后的几轮选择中,固定化抗原的量减少了10~100倍,第1轮以10μg/ml开始。根据供应商的建议,抗原以每个抗原分子3至10个NHS-生物素(Pierce)分子的比率被生物素化并在生物测定中测试其生物活性。除非另有说明,抗原在第一轮中以1至10nM的浓度被用于选择,在随后的几轮中以10pM至1nM的浓度用于选择。
实施例6
拮抗性细胞因子x特异性Fab的筛选
如Marks等(Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1991))中所述,从单个克隆中制备可溶性Fab,但优选的是单克隆噬菌体(Lee等,Blood108:3103-3111(2006))以提高灵敏度。包含可溶性Fab或展示Fab之噬菌体的培养上清液在具有直接包被抗原的ELISA中进行检测,或通过固定化链霉亲和素捕获。在4℃,重组的人类细胞因子x和链霉亲和素以10μg/ml在0.1M NaHCO3(pH 9.6)的条件下被包被16h。在使用含0.1%(v/v)Tween 20的PBS洗涤3次后,将生物素化的抗原以0.5μg/ml的浓度加入,在室温下孵育30至60分钟。将板在室温下用含有2%(w/v)半脱脂奶粉(Marvel)的PBS或1%酪蛋白溶液(在PBS中)封闭30min。培养上清液用2%(w/v)Marvel/PBS稀释1或5倍并孵育2h;使用抗Myc抗体9E10(其识别重Fd链羧基端的myc肽标记)(5μg/ml)和兔抗小鼠HRP缀合物(Dako)检测所结合的Fab。在最后一次孵育后,使用四甲基联苯胺和H2O2为底物进行染色然后加入0.5倍体积的1M H2SO4终止反应,测定450nm处的光密度。使用寡核苷酸引物M13-反向和geneIII-正向(4)扩增获得的PCR产物或单独的Fd和VκCκ或VλCλ扩增产物进行BstN I或Hinf I指纹图谱分析从而分析在ELISA中得到阳性信号(超过背景2倍)的克隆。
对Fab干扰细胞因子x与其受体结合之能力的筛选在适当的受体-配体结合ELISA中进行。对此,利用经细胞因子x-受体包被的板,将少量的生物素化细胞因子x与培养上清液中的Fab一起孵育,随后使用链霉亲和素HRP缀合物检测所结合的细胞因子x。将阳性命中物进行测序并纯化Fab以用于体外受体-配体测定中确定其效力(IC50),并且在BIAcore中评估它们对被固定化细胞因子x的亲和力。
从单个克隆大规模诱导可溶性Fab片段在包含100μg/ml羧苄青霉素(carbenicillin)和2%葡萄糖的2×TY中以50ml或250ml的规模进行。在37℃培养到OD600值为0.9后,沉淀细胞(2,934×g,10分钟),然后用含有羧苄青霉素和1mM异丙基-1-硫代-D-半乳糖苷(Isopropyl-1-thio-Dgalactopyranoside,IPTG)的2×TY重悬。根据替代性的De Bellis方法(De Bellis和Schwartz,NAR(1990)18(5):1311)(其用0.2%代替2%的葡萄糖),从而允许直接向对数期后期细胞的培养基中加入IPTG。细菌在30℃生长3.5h后通过离心收获(如前);通过用1ml冰冷的PBS重悬细胞沉淀来制备周质部分。在4℃经过2~16小时的颠倒旋转后,通过两步离心法去除原生质球;在以3,400×g离心10分钟后,通过另一离心步骤(其在Eppendorf离心机中以13,000×g离心10分钟)澄清上清液。获得的周质部分被直接用于不同的功能测定(靶标结合ELISA,体外受体-配体结合测定和Biacore)中。
对于测序,使用Qiagen Mini试剂盒(Qiagen),从于30℃培养在包含100μg/ml羧苄青霉素和2%葡萄糖的LB培养基中的5ml培养物中制备质粒DNA,或使用退火到Fab插入物边界之载体引物M13-反向和geneIII-正向的扩增产物。
实施例7
首选Fab的大规模生产和纯化。
通过ApaL I-Not I,在表达载体(称为pCB5)中将来自3到6个不同首选物的Fab插入物进行再克隆,除了没有M13噬菌体的基因3以外,该表达载体与pCB3相同(都包含六组氨酸和与Fd羧基端相融合的c-Myc标签)。同样,使用适当的限制性内切酶组合再克隆V区,随后克隆进基因3缺失载体(其包含人CH1和Cκ或Cλ)中用于表达嵌合Fab。经过指纹图谱分析,再克隆后获得的单个克隆以50ml或250ml的规模培养,并如上所述制备周质部分。使用IMAC纯化Fab片段,并将正确形成的Fab进一步通过使用SuperdexTM 75HR柱(Amersham PharmaciaBiotech)进行尺寸排阻色谱纯化。当进行基于细胞的测定时,需要将样品通过阴离子交换柱(Source30Q,GE Healthcare)以去除内毒素,其中阴离子交换柱在1M NaOH中过夜敏化,并随后用D-PBS进行平衡。产量通过测定在280nm处的光密度来确定,对于Fab其使用的摩尔消光系数为13。
通过体外受体-配体结合测定和Biacore测试经纯化的Fab,以确定Fab片段产生的观察结果与包含基因3之pCB3载体产生的相同。最后Fab的效力通过生物测定来确定。
实施例8
在本实施例中,将针对细胞因子x的大羊驼来源的首选Fab进行人源化,其通过使用靶向少部分框架残基的“软随机突变(softrandomization)”方法并通过在丝状噬菌体表面上单价展示所产生的Fab文库(从而通过基于亲和力的筛选确定具有高亲和力的框架序列(US2003/0190317A1,其通过引用并入本文中))来实现。例如,对于单峰驼来源的种系VH(IGHV1S20)建立了一个小文库,其中第5位(Val,Leu)、第55位(Gly,Ala)、第83位(Ala,Ser)、第95位(Lys,Arg)、第96位(Ser,Ala)和第101位(Met,Val)保留了70%的野生型残基(IMGT编号)。高变环中的氨基酸可以类似的方式处理。
为修正PCR错误或引入额外的特定单个密码子改变,基本上按照Kunkel等,Curr.Protoc.Mol.Biol.CH8U8.1(2001)所述的方案或者从GeneArt定购的“编码变体的合成基因”进行定点突变。用于定点实验的模板是来自人源化Fab克隆的单链DNA。
定点突变也可直接用来为人源化或修饰目的来改变编码野生型或人源化Fab的DNA中有限数目的氨基酸密码子。
选出后,检测单个首选物的亲和力和效力,选择最佳的首选物用于再次改换为人类Fab/IgG形式。
实施例9
人Fab片段和人单克隆抗体的表达。
从人源化的VH和VL区开始,人源化Fab的表达按照Rauchenberger等J.Biol.Chem.278:38194-204(2003)中所述的方案进行。对于人单克隆抗体的表达,构建两个独立的基于pcDNA 3.1载体的表达载体,一个针对轻链载体,一个针对重链构建体。针对轻链的表达载体包含在CMV启动子下游的人类Cκ或人类Cλ序列,以及允许轻链构建体作为Kpn1BsmB1片段克隆到CMV启动子下游并与轻链恒定结构域同读码框的限制性酶切位点。针对重链的表达载体包含在CMV启动子下游的人类CH1-铰链-CH2-CH3序列,以及允许VH构建体作为Kpn1 BsmB1片段克隆到CMV启动子下游并与重链恒定结构域同读码框的限制性酶切位点。
VL和VH片段作为Kpn1 BsmB1片段被克隆到合适的表达载体中,所述载体包含Kozak序列及其后的与各VL或VH序列同读码框的小鼠IgGκ前导序列。这些序列通过基因合成获得并针对在哺乳动物细胞中表达而优化(Geneart)。
对于全长IgG的产生,VH和VL表达载体构建体被共转染到哺乳动物细胞(HEK-293(瞬时转染)或CHO(稳定转染))中。来自瞬时转染细胞或稳定转染细胞的上清液通过蛋白A层析进行纯化。
通过受体结合测定和生物测定检测单克隆抗体或Fab,并选择最佳的首选物用于进一步开发。
实施例10-生成针对IL-1Reta的Fab
除非另有说明,下列研究中使用的材料和操作方案与实施例1-9所用使的类似。
大羊驼被IL-1Beta成功免疫
根据标准的操作方案,使用人类IL-1Beta对两只大羊驼进行免疫(如实施例1所述)。
在免疫前(第0天)和免疫后(第28天),使用ELISA对来自两只大羊驼的血清进行检测,以检测针对IL-1Beta抗体的存在。如图1所示,免疫后,即使在对血清进行10,000倍稀释后,在ELISA中也观察到了针对IL-1Beta的特异性信号。该抗体高效价显示了特异性的和适当的免疫应答。
构建具有丰富多样性的Fab文库
使用de Haard等人(JBC 1999)所述的策略,将从两只经免疫的大羊驼中分离的PBL用于RNA提取、RT-PCR以及将Fab PCR克隆到噬菌粒中以获取具有丰富多样性(2~5×108)的多样性文库。
使用下列引物:
用于克隆lambda轻链的引物
用于克隆kappa轻链的引物
用于克隆重链的无标记引物(步骤1)
用于克隆重链的带标记引物(步骤2)
使用单个(经标记)PCR步骤(30个循环)构建独立的VλCλ和VκCκ文库,以确保较高的克隆多样性。
同时,使用两步PCR(步骤1使用未经标记的引物进行25个循环,随后步骤2使用经标记引物进行10个循环)构建VHCH1文库。
然后,将来自VλCλ和VκCκ文库的轻链分别再克隆至表达VHCH1的载体中,以分别构建大羊驼“λ”和“κ”Fab文库(每只经免疫大羊驼构建两个文库)。使用PCR例行进行文库的质量控制。
随机检测的克隆中有高达93%的克隆包含全长Fab序列,这显示出文库的高品质。
选择人IL-1Beta特异性Fab
使用噬菌体展示技术来确定大量多样性的大羊驼Fab与生物素化的IL-1Beta的结合。使用生物素化的IL-1Beta来捕获以维持该蛋白质的活性构象。经过两轮选择后,观察到与对照相比的良好富集。噬菌体ELISA显示了表达细胞因子特异性Fab克隆的存在(数据未显示)。
通过pH冲击洗脱下与生物素化IL-1Beta结合的噬菌体。使用所得产物的连续稀释物(10-1~10-5)转染新鲜的大肠杆菌TG1细胞。所获得的克隆数目显示了在选择中结合的噬菌体数目。在上面的实施例中,当使用100nM和10nM的biot-IL-1Beta进行选择时,5μl的产物得到了约105个噬菌体。相对于通过非特异性结合获得的102个噬菌体而言,这得到了1000倍的富集。
94个单克隆被培养并被用于产生单克隆噬菌体。这些噬菌体被用于噬菌体ELISA中。在利用生物素化的IL-1Beta进行二轮选择后,许多噬菌体显示出与biot-IL-1Beta的良好结合。
人IL-1Reta特异性Fab与人类种系具有高起始同源性
将靶标特异性VH和Vλ结构域与常见的人类种系(其显示相同的CDR1和CDR2长度以及相应的典型折叠)中的VH和Vλ结构域进行匹配。随后,基于框架区中的序列同源性,选出最接近的人类种系。检查那些不相匹配的氨基酸残基在其他相关人类种系中的存在。如果没有匹配的话,这些残基被看作是异源的。
表10:大羊驼VH与人种系的总体序列同源性
表11:大羊驼VL与人种系的总体序列同源性
讨论与结论:
●基于初次筛选,鉴定出总共14个靶标特异性VH家族、9个靶标特异性Vλ家族和3个Vκ家族。
●这最初的14个抗IL-1Beta WT VH和12个抗IL-1Beta WT VL的集合显示与人类种系具有非常高的序列同源性。
●所述VH结构域中有33%与人类情况具有95%或更高的起始同源性,以及约44%的VL结构域与人类情况具有95%或更高的起始同源性,从而无需再进行人源化。
●VH结构域2D8是VH 1C2的人源化形式,因为与最接近的人类种系相比,它缺少了一个不同的氨基酸残基。其相应的VL结构域(VL 2D8)与最接近的人类种系具有95%的起始同源性,通过1个回复突变(VL2G7),其同源性进一步增加到96%。
●当使用上述方法进行评估时,所有VH和VL结构域无一例外都表现出人的3-D结合位点结构(即与所匹配的人类种系区段中出现的CDR1和CDR2典型折叠的组合相同)(数据未显示)。
Fab 1E2和1F2的人源化
在两个IL-1Beta特异性Fab(编号1E2和1F2)中进行人源化。基于与最接近的人类种系的比对,提出在其VH和Vλ框架区中的突变(图2)。与人VH3家族相匹配的VH的种系化通常涉及许多残基,这些残基在公开已知的大羊驼、阿尔帕卡羊驼或单峰驼(Camelus dromedarius)来源的种系序列中是不同的。例如,可将第71位的丙氨酸(根据Kabat编号)、第83位的赖氨酸和第84位的脯氨酸分别改变为丝氨酸(虽然丙氨酸也存在于某些人类种系的VH3成员中)、精氨酸(虽然许多人类种系VH3中也使用赖氨酸)和丙氨酸。对于轻链可变序列,没有可获得的骆驼科动物种系序列,但很可能在FR中存在许多与人类种系的不同,这将会在大部分的首选抗体中被改变。除了完全人源化的(hum)和野生型(wt)V区以外,还提出只保留了三个野生型残基的“安全变体”(safe)。
Fab 1E2通过逐步法被改换形式,据此,将融合到人类恒定结构域的Vλ的各种形式(wt、safe和完全人源化)与融合到人类恒定CH1结构域的VH的各种形式组合,产生表12所示的Fab。
表12:Fab 1E2形式
这些Fab基因作为合成基因向GeneArt(德国)定购,随后在大肠杆菌中产生,并进行纯化以及检测其结合biot-IL-1Beta的能力。为此,利用经抗myc抗体包被的Maxisorp板来捕获Fab。加入生物素化的人IL-1Beta,并使用HRP缀合的链霉亲和素检测所结合的细胞因子。该测定的读数示于以下图3中。
●使用人类相应部分对野生型恒定结构域CH1和Cλ进行替换不影响结合能力。
●1E2的VH结构域的部分(wt Vλ/safe VH)和完全(wt Vλ/hum VH)人源化产生了功能性Fab。
使用表达基因3-Fab融合蛋白的噬菌体检测克隆1F2的人源化变体(图4)。针对每个构建体,从4个独立的克隆制备噬菌体:
●wt 1F2和wt 1E2(与人Cλ和CH1融合的大羊驼Vλ和VH)
●安全变体1F2和安全变体1E2(与人Cλ和CH1融合的部分人源化的Vλ)
●hum 1F2和hum1E2(与人Cλ和CH1融合的完全人源化Vλ和VH)
对针对每个Fab的四个克隆进行检测以克服克隆变异(由于细菌生长、噬菌体生产效率和毒性等所致)。通过利用中性亲和素包被的Maxisorp板捕获生物素化的IL-1Beta以及随后与粗噬菌体提取物(即细菌培养基)孵育来进行噬菌体ELISA。经过充分的洗涤,使用抗M13-HRP单克隆抗体检测所结合的噬菌体。当利用中性亲和素包被的孔(不含生物素化的IL-1Beta)检测时,同样的噬菌体制备物未得到信号(数据未显示)。
●1F2VL和VH结构域之框架区的回复突变到最接近的人类种系成功地产生了保持抗原特异性的部分(safe)和完全(hum)人源化的变体。
使用人类恒定结构域对骆驼科动物可变结构域进行成功的形式改换
IL-1Beta特异性克隆1E2的VL和VH可变结构域被成功融合到人类Cλ和CH1恒定结构域,产生了“嵌合”Fab,对其进行生产和纯化。
通过在37℃诱导4h(o/d)或在28℃诱导16h(o/n),该嵌合1E2Fab从pCB5噬菌粒(Δ基因3)中生产出来。通过在30℃诱导16h,野生型大羊驼1E2Fab从pCB3(包含gene3的噬菌粒)中生产出来。纯化后,这些Fab被加入到具有(变性)或不具有(非变性)DTT的SDS-PAGE中。进行考马斯染色,其很好地显示了这些Fab或其包含的轻链和重链在期望的分子量条带上的出现(未显示)。
利用抗myc抗体包被的Maxisorp板捕获上述纯化的大羊驼和嵌合1E2Fab。在与生物素化的人IL-1Beta一起孵育和充分洗涤后,使用HRP-缀合的链霉亲和素检测结合到Fab上的生物素化IL-1Beta。纯化的大羊驼和嵌合1E2Fab都表现出功能性靶标结合(图5)。这一发现表明了将骆驼科动物来源的可变结构域与人IgG恒定结构域相结合的可行性。
显示功能性抑制靶标的Fab亚群
下表显示了来自以下ELISA实验的OD值。用已知抑制IL-1Beta与其受体结合的小鼠单克隆抗体(由Diaclone SAS提供)包被孔。
将生物素化的IL-1Beta与Fab的周质提取物一起加入到孔中,其中周质提取物是在经过两轮针对生物素化IL-1Beta的筛选后确定的。通过HRP标记的链霉亲和素检测所结合的生物素化IL-1Beta。降低的信号表明特异性Fab与封闭性小鼠单克隆抗体的竞争,这表明具有拮抗作用。
通过加入大量的竞争性小鼠单克隆抗体,向孔G12(表13中的孔12G)加入阳性对照。
表13:竞争测定的结果
鉴定出许多可成功地与封闭性小鼠单克隆抗体竞争的Fab(表13中的阴影格)。对竞争性克隆的序列分析显示,在48个筛选克隆(表13中标记为6A部分)中,三个Fab具有不同的VH。针对拮抗性Fab 1A1(在表13的竞争性试验中信号为0.205)、1B3(信号为0.444)和相关克隆1G1(信号为0.498)以及1C3(信号为0.386)的VH与最接近的人类种系进行序列比对和结构同源性分析显示以下。
这三个与匹配的人类种系都具有非常高的序列同源性,并且具有在人类种系中存在的相同的典型折叠的组合。对于λ轻链,在这三个首选克隆中也观察到了该现象(数据未显示)。Fab 1A1与拮抗性参照单克隆抗体强烈竞争(在基于ELISA的竞争试验中,IC50为12μg/ml),而Fab 1C3几乎不显示竞争(只在浓度超过50μg/ml时)。然而,在生物测定中,1C3(IC50为3μg/ml)比1A1(IC50为10μg/ml)效力更高,这提示它们识别不同的表位。如这些抗体的两个中所发现地,不同拮抗性Fab的高频出现(48个筛选克隆中有3个不同)以及表位识别的差异证明了抗体的高度多样性,这是大羊驼远交特性的结果。与人类种系V区的高度序列同源性再加上(有效力)抗体的高度多样性以及广范的表位覆盖,使得从经免疫骆驼科动物鉴定出治疗性抗体的集合成为可能。
5V 引物编码并且还存在于除3-23以外的所有其它类型3中
83A 存在于除3-23以外的全部VH3家族成员中
95K 也在IGHV3-13/49/66/72以及类型5和7中
96S 不在类型3但在类型1中
127Q 不在人类种系中
整体同源性
84/86框架残基=98%同源性
典型折叠分析
CDR H1类型1/10A(2fbj)
CDR H2类型?
!类似于类型3/10B,但:
!H56(Chothia编号)=λ(允许:SYTNDR)(SEQIDNO:221)
5V 引物编码并且还存在于除3-23以外的所有其它类型3中
83A 存在于除3-23以外的所有VH3家族成员中
95K 也在IGHV3-13/49/66/72以及类型5和7中
96S 不在类型3但在类型1中
127Q 不在人类种系中
整体同源性
84/86框架残基=98%同源性
典型折叠分析
CDR H1类型1/10A(2fbj)
CDR H2类型?
!类似于类型2/10A,但:
!H71(Chothia编号)=R(允许:VAL)
1E 引物编码,还存在于IGHV1-f中
11L 存在于类型2、3、4、6和7中
12R 不在人类种系中
13N 不在人类种系中
78F 存在于类型7中
85G 存在于类型7中
80A 存在于两个类型1成员中
84T 存在于半数类型1成员中
89V 不在人类种系中
93S 存在于多数类型1成员中
97E 存在于多数类型1成员中
127Q 不在人类种系中
整体同源性
79/86框架残基=92%同源性
典型折叠分析
CDR H1类型?
!类似于类型1/10A,但:
!H35(Chothia编号)=D(允许:HENQSYT)(SEQ ID NO:226)
!H80(Chothia编号)=V(允许:LM)
CDR H2类型?
!类似于类型2/10A,但:
!H53(Chothia编号)=E(允许:AGYSKTN)(SEQ ID NO:227)
实施例11
与现成的小鼠单克隆抗体方法相比,以下实施例展示了通过免疫骆驼科动物可实现的功能多样性。
使用小分子量的重组产生之细胞因子免疫10只BALB/c小鼠。在完成免疫步骤后,处死这些动物,将它们的脾细胞永生化以产生杂交瘤。在细胞因子结合ELISA中及随后适当的生物测定中检测由此产生的杂交瘤细胞上清液。可以鉴定出一个高度有效的拮抗剂和一个较弱的拮抗剂。
同样,使用本文所述的一般方法,用同样的重组产生之细胞因子免疫4只大羊驼。在完成免疫步骤后,收获外周B淋巴细胞并提取和纯化其RNA。使用一系列大羊驼的特异性引物,通过使用噬菌体展示技术生成Fab文库。在细胞因子/细胞因子受体结合ELISA中检测这些Fab。可以从前两只大羊驼中鉴定出5个不同的VH家族,从后两只大羊驼中鉴定出6个另外的不同VH家族,其高效地抑制细胞因子/受体的相互作用,这意味着这些VH结构域包含不同的独特CDR(无论是长度还是氨基酸序列方面)。
因此,相对于大量的近交BALB/c小鼠,可以从少量的远杂大羊驼中获得更高的功能多样性。通过主动免疫大羊驼获得的所有VH家族与最接近的人类种系相比表现出很高的序列同源性,并且具有如相匹配的人类种系中一样的CDR1和CDR2形成的典型折叠组合。
实施例12
下表总结了阿尔帕卡羊驼(Lamapacos)种系VH结构域与最匹配的人类种系VH结构域之间的氨基酸序列同源性比较的结果。同源性百分比使用本文针对大羊驼所述的相同算法来计算。阿尔帕卡羊驼的原始VH序列数据未显示:
表14:阿尔帕卡羊驼种系VH与人类种系VH的氨基酸序列同源性
实施例13:产生用于人源化的氨基酸替换
编码成熟骆驼科动物VH结构域的多个cDNA序列被克隆并完全测序。另外,获得了编码骆驼科动物Vλ/Vκ结构域的多个骆驼科动物种系片段的序列。
然后,对这些大量的原始序列信息(未显示)进行生物信息学加工。对于每个原始的骆驼科动物序列,根据本文其他地方所描述的方法,产生了最匹配的人类种系序列。这进而允许产生属于不同家族或亚家族的骆驼科动物VH和Vλ/Vκ结构域的共有序列,并且还允许将每个家族或亚家族的成员直接与和其最匹配的人类种系进行比较。然后将每个骆驼科动物家族或亚家族的共有序列与多个不同的人类种系家族或亚家族的共有序列进行比对和比较。这些序列比对在附图中所示。
总计分析了163个成熟的VH、78个Vκ和148个Vλ序列。对Vκ而言,78个序列中的75个包含如在多数体细胞突变的人Vκ中所观察到的具有9个AA的CDR3,它们均在95位具有脯氨酸,并且这些75个序列中的73个在90位具有谷氨酰胺,这与典型折叠类型1(Knappik等,JMol.Biol.296:57-86(2000))联系在了一起,对人Vκ而言也是这样的。只有2个Vκ具有8个残基的CDR3,1个Vκ具有10个残基的CDR3。对骆驼科动物Vλ的集合而言,148个所分析序列中80个携带具有10个氨基酸残基的CDR3、23个具有9个残基长度的CDR3、2个具有8个残基、30个具有11个残基、8个具有12个残基、4个具有13个残基,1个具有14个残基。这些结果与人类系统相关联,其中在Vλ中观察到CDR3长度有很大改变,92%的体细胞突变的人Vλ具有9至11个残基长度的CDR3(在大羊驼免疫系统中观察到90%)。
根据上述的序列比较,可以1)鉴定骆驼科动物VH和Vλ/Vκ结构域中通常表现为与人VH和Vλ/Vκ序列错配的位置,从而鉴定考虑用于替换的候选残基,和2)计算人VH和Vλ/Vκ结构域序列中每个上述位置上不同氨基酸的利用百分比,从而鉴定每个位置上适当的替换残基。图30至42中总结了利用百分比的数据。
等同物
通过前面的描述,本发明的很多修改和供选择的实施方案对本领域技术人员而言将是显而易见的。因此,本描述仅作为举例说明来解释并且目的是教导本领域技术人员实施本发明的最佳方式。在不背离本发明精神的情况下,结构的细节基本上可以改变,并且保留在所附带的权利要求范围内的所有修饰的独家使用权。本发明意图仅限制所附带的权利要求和使用法规所要求的范围。
本申请中所引用的所有文献和相似的材料(包括专利、专利申请、文章、书、论文、学位论文、网页、图、表、附录和/或附件),无论这些文献和相似材料的形式,都作为整体通过引用清楚的合并入本文中。在一个或更多个所合并的文献和相似材料(包括确定的术语、术语用法、所描述的技术等)与本申请不同或抵触的情况下,以本申请为准。通过下列权利要求意图包含这些等同物。
Claims (73)
1.包含骆驼科动物VH结构域以及λ轻链型(Vλ)或κ轻链型(Vκ)骆驼科动物VL结构域的抗体,其特征在于在所述VH结构域和/或所述VL结构域中存在至少一个氨基酸替换,所述氨基酸替换选自以下:
(a)所述骆驼科动物VH结构域中的氨基酸替换,其中所述骆驼科动物VH结构域中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人VH结构域序列中相应位置上存在的氨基酸,所述位置根据Kabat选自H1、H5、H7、H11、H12、H13、H14、H29、H30、H37、H40、H48、H67、H68、H69、H71、H74、H77、H78、H80、H81、H82b、H83、H84、H85、H86、H89、H93、H94和H108;以及
(b)所述骆驼科动物VL结构域中的氨基酸替换,其中对所述λ轻链型(Vλ)的骆驼科动物VL结构域而言,所述骆驼科动物Vλ结构域中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人Vλ结构域序列中相应位置上存在的氨基酸,所述位置根据Kabat选自L1、L2、L3、L7、L8、L9、L11、L14、L15、L17、L18、L19、L20、L38、L39、L40、L42、L44、L46、L47、L49、L58、L59、L60、L66、L67、L69、L70、L71、L72、L74、L76、L78、L80、L84和L103;对所述κ轻链型(Vκ)的骆驼科动物VL结构域而言,所述骆驼科动物Vκ结构域的一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人Vκ结构域序列中相应位置上存在的氨基酸,所述位置根据Kabat选自K1、K3、K4、K7、K9、K11、K12、K13、K14、K15、K18、K19、K36、K42、K43、K45、K46、K58、K63、K70、K77、K78、K79、K80、K83、K100、K103、K104和K106。
2.根据权利要求1所述的抗体,其中所述骆驼科动物VH结构域与人VH3结构域同源,并且所述骆驼科动物VH结构域中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人VH3结构域序列中相应位置上存在的氨基酸,所述位置根据Kabat为H1、H13、H14、H29、H30、H37、H40、H74、H77、H78、H82b、H83、H84、H86、H89、H93或H94。
3.根据权利要求1或2所述的抗体,其中H74位的氨基酸被替换。
4.根据权利要求3所述的抗体,其中H74位的氨基酸被替换为S或A,优选为S。
5.根据权利要求1或2所述的抗体,其中H83位的氨基酸被替换。
6.根据权利要求5所述的抗体,其中H83位的氨基酸被替换为R或K,优选为R。
7.根据权利要求1或2所述的抗体,其中H84位的氨基酸被替换。
8.根据权利要求7所述的抗体,其中H84位的氨基酸被替换为A或T,优选为A。
9.根据权利要求1或2所述的抗体,其中H94位的氨基酸被替换。
10.根据权利要求9所述的抗体,其中H94位的氨基酸被替换为R。
11.根据权利要求1或2所述的抗体,其中进行下述氨基酸替换中的一个或更多个:
H1位被替换,优选替换为Q或E;
H13位被替换,优选替换为Q、R或K;
H14位被替换,优选替换为P;
H29位被替换,优选替换为F或V;
H30位被替换,优选替换为S、D或G;
H37位被替换,优选替换为V、F或I,最优选为V;
H40位被替换,优选替换为A;
H77位被替换,优选替换为T或S;
H78位被替换,优选替换为L或A,最优选为L;
H82b位被替换,优选替换为S;
H86位被替换,优选替换为D;
H89位被替换,优选替换为V或L,最优选为V;
H93位被替换,优选替换为A或T。
12.根据权利要求1所述的抗体,其中所述骆驼科动物VH结构域与人VH1结构域同源,并且所述骆驼科动物VH结构域中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人VH1结构域序列中相应位置上存在的氨基酸,所述位置根据Kabat为H1、H7、H11、H12、H13、H69、H71、H78、H80或H86。
13.根据权利要求1或12所述的抗体,其中H11位的氨基酸被替换,优选替换为V。
14.根据权利要求1或12所述的抗体,其中H12位的氨基酸被替换,优选替换为K。
15.根据权利要求1或12所述的抗体,其中H13位的氨基酸被替换,优选替换为K。
16.根据权利要求1或12所述的抗体,其中H69位的氨基酸被替换,优选替换为I、M或S,最优选为M。
17.根据权利要求1或12所述的抗体,其中H71位的氨基酸被替换,优选替换为R、A、E或T,最优选为R。
18.根据权利要求1或12所述的抗体,其中H80位的氨基酸被替换,优选替换为M。
19.根据权利要求1或12所述的抗体,其中H86位的氨基酸被替换,优选替换为D。
20.根据权利要求1或12所述的抗体,其中H78位的氨基酸被替换,优选替换为V或A。
21.根据权利要求1或12所述的抗体,其中H1位的氨基酸被替换,优选替换为Q或E。
22.根据权利要求1或12所述的抗体,其中H7位的氨基酸被替换,优选替换为S。
23.根据权利要求1所述的抗体,其中所述骆驼科动物VH结构域与人VH4结构域同源,并且所述骆驼科动物VH结构域中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人VH4结构域序列中相应位置上存在的氨基酸,所述位置根据Kabat为H1、H16、H23、H30、H48、H49、H67、H68、H71、H81、H84、H85、H86。
24.根据权利要求1或23所述的抗体,其中H16位的氨基酸被替换,优选替换为E。
25.根据权利要求1或23所述的抗体,其中H23位的氨基酸被替换,优选替换为A或T。
26.根据权利要求1或23所述的抗体,其中H30位的氨基酸被替换,优选替换为S。
27.根据权利要求1或23所述的抗体,其中H48位的氨基酸被替换,优选替换为I。
28.根据权利要求1或23所述的抗体,其中H1位的氨基酸被替换,优选替换为Q或E。
29.根据权利要求1或23所述的抗体,其中H67位的氨基酸被替换,优选替换为V。
30.根据权利要求1或23所述的抗体,其中H68位的氨基酸被替换,优选替换为T。
31.根据权利要求1或23所述的抗体,其中H71位的氨基酸被替换,优选替换为V。
32.根据权利要求1或23所述的抗体,其中H81位的氨基酸被替换,优选替换为K。
33.根据权利要求1或23所述的抗体,其中H84位的氨基酸被替换,优选替换为A。
34.根据权利要求1或23所述的抗体,其中H85位的氨基酸被替换,优选替换为A。
35.根据权利要求1或23所述的抗体,其中H86位的氨基酸被替换,优选替换为D。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的抗体,其中H108位的氨基酸被替换,优选替换为L。
37.根据权利要求1所述的抗体,其中所述骆驼科动物VL结构域属于λ轻链型(Vλ),并且所述骆驼科动物Vλ结构域中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人Vλ结构域序列中相应位置上存在的氨基酸,所述位置根据Kabat为L1、L2、L3、L5、L7、L8、L9、L11、L14、L15、L17、L18、L19、L20、L38、L39、L40、L42、L44、L46、L47、L49、L58、L59、L60、L66、L67、L69、L70、L71、L72、L74、L76、L78、L80、L81、L84、L103、L104、L108。
38.根据权利要求37所述的抗体,其中所述骆驼科动物Vλ结构域与人Vλ1结构域同源,并且所述骆驼科动物Vλ结构域中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人Vλ1结构域序列中相应位置上存在的氨基酸,所述位置根据Kabat为L11、L14、L18、L19、L38、L69、L74、L76或L80。
39.根据权利要求1或38所述的抗体,其中进行下述氨基酸替换中的一个或更多个:
L11位的氨基酸被替换,优选替换为A或V;
L14位的氨基酸被替换,优选替换为A或T,更优选为A;
L18位的氨基酸被替换,优选替换为R或K,更优选为R;
L19位的氨基酸被替换,优选替换为V;
L38位的氨基酸被替换,优选替换为Q;
L69位的氨基酸被替换,优选替换为T;
L74位的氨基酸被替换,优选替换为A或G;
L76位的氨基酸被替换,优选替换为S或T;
L80位的氨基酸被替换,优选替换为S、T或A。
40.根据权利要求37所述的抗体,其中所述骆驼科动物Vλ结构域与人Vλ2结构域同源,并且其中所述骆驼科动物Vλ结构域中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人Vλ2结构域序列中相应位置上存在的氨基酸,所述位置根据Kabat为L3、L8、L14、L15、L17、L18、L39、L42、L47、L58、L59或L80。
41.根据权利要求1或40所述的抗体,其中进行下述氨基酸替换中的一个或更多个:
L3位的氨基酸被替换,优选替换为A;
L8位的氨基酸被替换,优选替换为A、P或R;
L14位的氨基酸被替换,优选替换为S;
L15位的氨基酸被替换,优选替换为P;
L17位的氨基酸被替换,优选替换为Q;
L18位的氨基酸被替换,优选替换为S;
L39位的氨基酸被替换,优选替换为H或P,更优选为H;
L42位的氨基酸被替换,优选替换为K或T,更优选为K;
L47位的氨基酸被替换,优选替换为M;
L58位的氨基酸被替换,优选替换为V;
L59位的氨基酸被替换,优选替换为P或S;
L80位的氨基酸被替换,优选替换为A。
42.根据权利要求37所述的抗体,其中所述骆驼科动物Vλ结构域与人Vλ3结构域同源,并且所述骆驼科动物Vλ结构域中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人Vλ3结构域序列中相应位置上存在的氨基酸,所述位置根据Kabat为L1、L2、L3、L5、L7、L8、L9、L11、L14、L15、L19、L20、L44、L46、L49、L60、L66、L67、L69、L70、L71、L72、L76、L78或L84。
43.根据权利要求1或42所述的抗体,其中进行下述氨基酸替换中的一个或更多个:
L1位的氨基酸被替换,优选替换为S;
L2位的氨基酸被替换,优选替换为Y;
L3位的氨基酸被替换,优选替换为E;
L5位的氨基酸被替换,优选替换为M;
L7位的氨基酸被替换,优选替换为D或P;
L8位的氨基酸被替换,优选替换为P、S、L或H,优选为P;
L9位的氨基酸被替换,优选替换为S或A;
L11位的氨基酸被替换,优选替换为V;
L14位的氨基酸被替换,优选替换为A或S;
L15位的氨基酸被替换,优选替换为P、L或T,优选为P;
L19位的氨基酸被替换,优选替换为A或V,优选为A;
L20位的氨基酸被替换,优选替换为R或S,优选为R;
L44位的氨基酸被替换,优选替换为P;
L46位的氨基酸被替换,优选替换为L;
L49位的氨基酸被替换,优选替换为Y;
L60位的氨基酸被替换,优选替换为E或D,更优选为E;
L66位的氨基酸被替换,优选替换为S、N或T;
L67位的氨基酸被替换,优选替换为S或P;
L69位的氨基酸被替换,优选替换为T或N;
L70位的氨基酸被替换,优选替换为T、M或I,更优选为T;
L71位的氨基酸被替换,优选替换为A、V或T;
L72位的氨基酸被替换,优选替换为T或S,更优选为T;
L76位的氨基酸被替换,优选替换为S或T,更优选为S;
L78位的氨基酸被替换,优选替换为V、A、T或I,更优选为V或A;
L84位的氨基酸被替换,优选替换为A。
44.根据权利要求37所述的抗体,其中所述骆驼科动物Vλ结构域与人Vλ5结构域同源,并且所述骆驼科动物Vλ结构域中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人Vλ5结构域序列中相应位置上存在的氨基酸,所述位置根据Kabat为L2、L11、L17、L19、L40、L70、L72或L80。
45.根据权利要求1或44所述的抗体,其中进行下述氨基酸替换中的一个或更多个:
L2位的氨基酸被替换,优选替换为P;
L11位的氨基酸被替换,优选替换为L、S或H;
L17位的氨基酸被替换,优选替换为A或E,更优选为A;
L19位的氨基酸被替换,优选替换为A或V;
L40位的氨基酸被替换,优选替换为P;
L70位的氨基酸被替换,优选替换为A或T,更优选为A;
L72位的氨基酸被替换,优选替换为I或L,更优选为I;
L80位的氨基酸被替换,优选替换为S或P,更优选为S。
46.根据权利要求37所述的抗体,其中所述骆驼科动物Vλ结构域与人Vλ8结构域同源,并且所述骆驼科动物Vλ结构域中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人Vλ8结构域序列中相应位置上存在的氨基酸,所述位置根据Kabat为L2、L11、L60、L67、L80、L81或L84。
47.根据权利要求1或46所述的抗体,其中进行下述氨基酸替换中的一个或更多个:
L2位的氨基酸被替换,优选替换为T;
L11位的氨基酸被替换,优选替换为F;
L60位的氨基酸被替换,优选替换为D;
L67位的氨基酸被替换,优选替换为L;
L80位的氨基酸被替换,优选替换为A;
L81位的氨基酸被替换,优选替换为D;
L84位的氨基酸被替换,优选替换为S。
48.根据权利要求37至47中任一项所述的抗体,其中L103位的氨基酸被替换,优选替换为K。
49.根据权利要求1所述的抗体,其中所述骆驼科动物VL结构域属于κ轻链型(Vκ),并且所述骆驼科动物Vκ结构域中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人Vκ结构域序列中相应位置上存在的氨基酸,所述位置根据Kabat为K1、K2、K3、K4、K11、K12、K13、K14、K15、K42、K43、K70、K77、K79、K80、K83、K7、K9、K14、K18、K36、K46、K63、K19、K39、K45、K58、K68、K78、K100、K103、K104或K106。
50.根据权利要求49所述的抗体,其中所述骆驼科动物Vκ结构域与人Vk1结构域同源,并且所述骆驼科动物Vκ结构域中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人Vk1结构域序列中相应位置上存在的氨基酸,所述位置根据Kabat为K1、K2、K4、K11、K12、K13、K15、K42、K43、K70、K77、K79、K80或K83。
51.根据权利要求1或50所述的抗体,其中进行下述氨基酸替换中的一个或更多个:
K2位的氨基酸被替换,优选替换为D、A或N;
K4位的氨基酸被替换,优选替换为M或L;
K11位的氨基酸被替换,优选替换为V;
K12位的氨基酸被替换,优选替换为K;
K13位的氨基酸被替换,优选替换为K;
K15位的氨基酸被替换,优选替换为V或T,最优选为V;
K42位的氨基酸被替换,优选替换为K;
K43位的氨基酸被替换,优选替换为A或V,最优选为A;
K70位的氨基酸被替换,优选替换为D或E,最优选为D;
K77位的氨基酸被替换,优选替换为S或C,更优选为S;
K79位的氨基酸被替换,优选替换为Q;
K80位的氨基酸被替换,优选替换为P或S,最优选为P;
K83位的氨基酸被替换,优选替换为F、I或V,最优选为F。
52.根据权利要求50所述的抗体,其中所述骆驼科动物Vκ结构域与人Vk2结构域同源,并且所述骆驼科动物Vκ结构域中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人Vk2结构域序列中相应位置上存在的氨基酸,所述氨基酸根据Kabat为K7、K9、K12、K14、K18、K36、K46、K63、K77、K79或K83。
53.根据权利要求1或52所述的抗体,其中进行下述氨基酸替换中的一个或更多个:
K7位的氨基酸被替换,优选替换为T或S;
K9位的氨基酸被替换,优选替换为L;
K12位的氨基酸被替换,优选替换为P;
K14位的氨基酸被替换,优选替换为T;
K18位的氨基酸被替换,优选替换为P或Q,最优选为P;
K36位的氨基酸被替换,优选替换为Y、F或L,最优选为Y;
K46位的氨基酸被替换,优选替换为L或R,最优选为L;
K63位的氨基酸被替换,优选替换为S;
K77位的氨基酸被替换,优选替换为R;
K79位的氨基酸被替换,优选替换为E;
K83位的氨基酸被替换,优选替换为V或F,更优选为V。
54.根据权利要求50所述的抗体,其中所述骆驼科动物Vκ结构域与人Vk4结构域同源,并且所述骆驼科动物Vκ结构域中一个或更多个位置上的氨基酸被替换为人Vk4结构域序列中相应位置上存在的氨基酸,所述位置根据Kabat为K9、K11、K12、K13、K15、K18、K19、K39、K43、K45、K58、K68、K78、K80或K83。
55.根据权利要求1或54所述的抗体,其中进行下述氨基酸替换中的一个或更多个:
K9位的氨基酸被替换,优选替换为D;
K11位的氨基酸被替换,优选替换为L;
K12位的氨基酸被替换,优选替换为A;
K13位的氨基酸被替换,优选替换为V;
K15位的氨基酸被替换,优选替换为L;
K18位的氨基酸被替换,优选替换为R;
K19位的氨基酸被替换,优选替换为A;
K39位的氨基酸被替换,优选替换为K;
K43位的氨基酸被替换,优选替换为P;
K45位的氨基酸被替换,优选替换为K;
K58位的氨基酸被替换,优选替换为V;
K68位的氨基酸被替换,优选替换为G;
K78位的氨基酸被替换,优选替换为L;
K80位的氨基酸被替换,优选替换为A;
K83位的氨基酸被替换,优选替换为V。
56.根据权利要求50至55中任一项所述的抗体,其中L103位的氨基酸被替换,优选替换为K。
57.根据权利要求50至55中任一项所述的抗体,其中L104位的氨基酸被替换,优选替换为V。
58.根据权利要求50至55中任一项所述的抗体,其中L106位的氨基酸被替换,优选替换为I。
59.根据前述权利要求中任一项所述的抗体,其中所述骆驼科动物VH和/或VL结构域包含至少一个异源CDR、框架区或其部分。
60.根据权利要求59所述的抗体,其中所述异源CDR或框架区得自啮齿类动物、兔类动物、骆驼科动物、灵长类动物或软骨鱼。
61.根据前述权利要求中任一项所述的抗体,其中所述人VH或VL(Vλ或Vκ)结构域序列是体细胞突变的人可变区或其部分。
62.根据前述权利要求中任一项所述的抗体,其中所述人VH或VL(Vλ或Vκ)结构域序列包含共有序列或其部分。
63.根据前述权利要求中任一项所述的抗体,其为Fab、Fab’、F(ab’)2、双特异性Fab’、Fv片段、双抗体、线性抗体、单链可变区片段(scFv)、由抗体片段形成的抗体或多特异性抗体。
64.根据前述权利要求中任一项所述的抗体,其还包含至少一个来自于非骆驼科动物抗体的CH1、CH2或CH3结构域。
65.根据权利要求64所述的抗体,其中所述非骆驼科动物抗体为人抗体。
66.根据前述权利要求中任一项所述的抗体,其包含选自IgG、IgM、IgD、IgE和IgA的人重链恒定区。
67.根据前述权利要求中任一项所述的抗体,其包含人κ或λ轻链恒定区。
68.根据前述权利要求中任一项所述的抗体,其中所述骆驼科动物VH和/或VL结构域来源于骆驼、大羊驼、单峰驼、小羊驼、原驼或阿尔帕卡羊驼。
69.根据前述权利要求中任一项所述的抗体,其中所述骆驼科动物VH和/或VL结构域序列来源于大羊驼或阿尔帕卡羊驼。
70.编码前述权利要求中任一项所述抗体的多核苷酸分子。
71.表达载体,其包含与调控序列有效连接的权利要求70所述多核苷酸,所述调控序列允许所述抗体在宿主细胞或无细胞表达系统中表达。
72.包含权利要求71所述之表达载体的宿主细胞或无细胞表达系统。
73.生产重组抗体的方法,包括在允许所述抗体表达的条件下培养权利要求71所述宿主细胞或无细胞表达系统以及回收所表达的抗体。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109906232A (zh) * | 2016-09-23 | 2019-06-18 | 埃尔斯塔治疗公司 | 包含λ轻链和κ轻链的多特异性抗体分子 |
Families Citing this family (58)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9765148B2 (en) | 2011-03-16 | 2017-09-19 | Argen-X N.V. | Antibodies to CD70 |
CA2835094C (en) * | 2011-05-06 | 2020-12-22 | David Gearing | Anti-nerve growth factor antibodies and methods of preparing and using the same |
WO2012163519A1 (en) * | 2011-05-27 | 2012-12-06 | Dutalys | Antibodies with improved folding stability |
WO2013064700A2 (en) * | 2011-11-03 | 2013-05-10 | Argen-X B.V. | Chimeric polypeptides and methods of use |
JP6283030B2 (ja) * | 2012-08-31 | 2018-02-21 | アルゲン−エックス ビーブイビーエー | 高度に多様なコンビナトリアル抗体ライブラリ |
WO2014033252A1 (en) | 2012-08-31 | 2014-03-06 | arGEN-X BV | Method for producing antibody molecules having inter-species, intra-target cross-reactivity |
EP2719706A1 (en) | 2012-10-15 | 2014-04-16 | Universität Zürich | Bispecific HER2 ligands for cancer therapy |
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MX2015009547A (es) | 2013-01-28 | 2015-11-25 | Evec Inc | Anticuerpo anti-hmgb1 humanizado o fragmento de union al antigeno del mismo. |
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EP2883883A1 (en) | 2013-12-16 | 2015-06-17 | Cardio3 Biosciences S.A. | Therapeutic targets and agents useful in treating ischemia reperfusion injury |
GB201414823D0 (en) | 2014-08-20 | 2014-10-01 | Argen X Bv | Multispecific antibodies |
US10391168B1 (en) | 2014-08-22 | 2019-08-27 | University Of Bern | Anti-CD70 combination therapy |
EP3297672B1 (en) | 2015-05-21 | 2021-09-01 | Harpoon Therapeutics, Inc. | Trispecific binding proteins and methods of use |
MX2018014228A (es) | 2016-05-20 | 2019-08-12 | Harpoon Therapeutics Inc | Proteina de union de albumina sérica de dominio unico. |
US11623958B2 (en) | 2016-05-20 | 2023-04-11 | Harpoon Therapeutics, Inc. | Single chain variable fragment CD3 binding proteins |
EP3461261A4 (en) | 2016-05-20 | 2019-12-04 | Harpoon Therapeutics Inc. | PROTEINS BINDING TO THE VARIABLE MONOCATERARY FRAGMENT OF CD3 |
GB201611123D0 (en) | 2016-06-27 | 2016-08-10 | Euremab Srl | Anti met antibodiesand uses thereof |
CN109689685A (zh) | 2016-07-08 | 2019-04-26 | 斯塔滕生物技术有限公司 | 抗apoc3抗体及其使用方法 |
GB201612337D0 (en) | 2016-07-15 | 2016-08-31 | Argen-X N V | Ant-il-22r antibodies |
WO2018011405A1 (en) | 2016-07-15 | 2018-01-18 | Universität Zürich | Il-13ralpha1 antibodies for use in treatment of atopic inflammation, sepsis and neutropenia |
AU2017363300A1 (en) * | 2016-11-23 | 2019-06-20 | Harpoon Therapeutics, Inc. | Prostate specific membrane antigen binding protein |
US10844134B2 (en) | 2016-11-23 | 2020-11-24 | Harpoon Therapeutics, Inc. | PSMA targeting trispecific proteins and methods of use |
US11535668B2 (en) | 2017-02-28 | 2022-12-27 | Harpoon Therapeutics, Inc. | Inducible monovalent antigen binding protein |
EP3612648A1 (en) | 2017-04-18 | 2020-02-26 | Université Libre de Bruxelles | Biomarkers and targets for proliferative diseases |
JP2020517242A (ja) | 2017-04-21 | 2020-06-18 | スターテン・バイオテクノロジー・ベー・フェー | 抗ApoC3抗体およびその使用方法 |
US10543271B2 (en) | 2017-05-12 | 2020-01-28 | Harpoon Therapeutics, Inc. | Mesothelin binding proteins |
CN110913908B (zh) | 2017-05-12 | 2022-05-27 | 哈普恩治疗公司 | 靶向msln的三特异性蛋白质及使用方法 |
MX2020003915A (es) | 2017-10-13 | 2020-10-08 | Harpoon Therapeutics Inc | Proteinas trispecificas y metodos de uso. |
CA3078799A1 (en) | 2017-10-13 | 2019-04-18 | Harpoon Therapeutics, Inc. | B cell maturation antigen binding proteins |
US10538583B2 (en) | 2017-10-31 | 2020-01-21 | Staten Biotechnology B.V. | Anti-APOC3 antibodies and compositions thereof |
WO2019087115A1 (en) | 2017-10-31 | 2019-05-09 | Staten Biotechnology B.V. | Anti-apoc3 antibodies and methods of use thereof |
CA3079793A1 (en) * | 2017-12-22 | 2019-06-27 | Argenx Bvba | Bispecific antigen binding construct |
IT201800000535A1 (it) | 2018-01-03 | 2019-07-03 | Procedimenti per la cura del cancro. | |
GB201800649D0 (en) | 2018-01-16 | 2018-02-28 | Argenx Bvba | CD70 Combination Therapy |
CA3090321A1 (en) | 2018-02-05 | 2019-08-08 | Stichting Vu | Inverse agonistic anti-us28 antibodies |
WO2019161386A1 (en) * | 2018-02-19 | 2019-08-22 | New York University | Alpha-synuclein single domain antibodies |
US11655293B2 (en) | 2018-02-22 | 2023-05-23 | Universitat Zurich | Ligands to GM-CSF or GM-CSF-receptor for use in leukemia in a patient having undergone allo-HCT |
EP3623382A1 (en) | 2018-09-14 | 2020-03-18 | Universität Zürich | Ligands to gm-csf or gm-csf-receptor for use in leukemia in a patient having undergone allo-hct |
CN112384527B (zh) | 2018-03-23 | 2023-06-27 | 布鲁塞尔自由大学 | Wnt信号传递激动剂分子 |
EP3807401A1 (en) | 2018-06-15 | 2021-04-21 | Universität Bern | LIGANDS TO LIGHT OR ITS RECEPTOR LTßR FOR USE IN HAEMATOLOGIC MALIGNANCIES |
JP7425049B2 (ja) | 2018-09-25 | 2024-01-30 | ハープーン セラピューティクス,インク. | Dll3結合タンパク質および使用方法 |
WO2020080941A1 (en) | 2018-10-16 | 2020-04-23 | Umc Utrecht Holding B.V. | Anti- low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6 antibodies |
EP3883919A1 (en) | 2018-11-21 | 2021-09-29 | Universität Zürich | Photochemically induced conjugation of radiometals to small molecules, peptides and nanoparticles in a simultaneous one-pot reaction |
AU2021224851A1 (en) | 2020-02-21 | 2022-09-15 | Harpoon Therapeutics, Inc. | FLT3 binding proteins and methods of use |
US20230303680A1 (en) | 2020-08-18 | 2023-09-28 | Universität Zürich | A cd25-biased anti-il-2 antibody |
WO2022136344A1 (en) | 2020-12-21 | 2022-06-30 | Université Libre de Bruxelles | Modulation of prdm12 for use in treatment of pain conditions |
EP4277706A1 (en) | 2021-01-15 | 2023-11-22 | Stichting Het Nederlands Kanker Instituut- Antoni van Leeuwenhoek Ziekenhuis | Inducers of senescence, in combination with a selective death receptor 5 (dr5) agonist, for use in a method of treating cancer |
WO2023012348A1 (en) | 2021-08-05 | 2023-02-09 | Immunos Therapeutics Ag | A modified hla-b57 with increased expression levels |
CA3227617A1 (en) | 2021-08-05 | 2023-02-09 | Osiris MARROQUIN BELAUNZARAN | Combination medicaments comprising hla fusion proteins |
WO2023021006A1 (en) | 2021-08-16 | 2023-02-23 | Universität Zürich | Il-1 targeting agents for treatment of pitiyriasis rubra pilaris |
WO2023036849A1 (en) | 2021-09-07 | 2023-03-16 | ETH Zürich | Identifying and predicting future coronavirus variants |
WO2023104933A1 (en) * | 2021-12-07 | 2023-06-15 | new/era/mabs GmbH | Camelid antibodies for use in therapy and diagnosis |
EP4260907A1 (en) | 2022-04-11 | 2023-10-18 | Universität Zürich | Agents for treatment of endometriosis and other benign gynecological neoplasms |
WO2024006975A1 (en) * | 2022-07-01 | 2024-01-04 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods for antibody humanization |
WO2024096735A1 (en) | 2022-10-31 | 2024-05-10 | Stichting Amsterdam UMC | Single domain anti-cd169 antibodies |
WO2024101989A1 (en) | 2022-11-08 | 2024-05-16 | Stichting Amsterdam UMC | Activation inducible antigen receptors for adoptive immunotherapy |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050070692A1 (en) * | 2002-02-28 | 2005-03-31 | Beals John Michael | Anti-interleukin-1 beta analogs |
WO2008070344A2 (en) * | 2006-10-27 | 2008-06-12 | Lpath, Inc. | Compositions and methods for binding sphingosine-1-phosphate |
CN102216328A (zh) * | 2008-07-02 | 2011-10-12 | 阿尔金-X公司 | 骆驼科动物来源的抗原结合多肽 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US648213A (en) | 1899-12-06 | 1900-04-24 | Frederick Meukert Jr | Vehicle-shaft. |
SK285046B6 (sk) | 1991-07-25 | 2006-05-04 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Chimérna protilátka, ktorá sa špecificky viaže na ľudský antigén, farmaceutický prostriedok s jej obsahom, spôsob jej výroby a použitie |
US20020032315A1 (en) | 1997-08-06 | 2002-03-14 | Manuel Baca | Anti-vegf antibodies |
US20090130123A1 (en) * | 2004-06-15 | 2009-05-21 | Erol Fikrig | Antibodies to west nile virus polypeptides |
US8455626B2 (en) * | 2006-11-30 | 2013-06-04 | Abbott Laboratories | Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies |
WO2008142165A1 (en) * | 2007-05-24 | 2008-11-27 | Ablynx N.V. | Amino acid sequences directed against growth factor receptors and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with growth factors and their receptors |
US10214588B2 (en) * | 2007-07-03 | 2019-02-26 | Ablynx N.V. | Providing improved immunoglobulin sequences by mutating CDR and/or FR positions |
CA2723842A1 (en) * | 2008-05-09 | 2009-11-12 | Peter Vanlandschoot | Amino acid sequences directed against integrins and uses thereof |
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050070692A1 (en) * | 2002-02-28 | 2005-03-31 | Beals John Michael | Anti-interleukin-1 beta analogs |
WO2008070344A2 (en) * | 2006-10-27 | 2008-06-12 | Lpath, Inc. | Compositions and methods for binding sphingosine-1-phosphate |
CN102216328A (zh) * | 2008-07-02 | 2011-10-12 | 阿尔金-X公司 | 骆驼科动物来源的抗原结合多肽 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
THIBAUT PELAT ET AL.: "Germline Humanization of a Non-human Primate Antibody that Neutralizes the Anthrax Toxin, by in Vitro and in Silico Engineering", 《JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY》 * |
VERONICA MOREA ET AL.: "Antibody Modeling: Implications for Engineering and Design", 《METHODS》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109906232A (zh) * | 2016-09-23 | 2019-06-18 | 埃尔斯塔治疗公司 | 包含λ轻链和κ轻链的多特异性抗体分子 |
CN109906232B (zh) * | 2016-09-23 | 2023-11-07 | 马伦戈治疗公司 | 包含λ轻链和κ轻链的多特异性抗体分子 |
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