IT201800000535A1 - Procedimenti per la cura del cancro. - Google Patents
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Description
PROCEDIMENTI PER LA CURA DEL CANCRO
CAMPO DELL'INVENZIONE
La presente invenzione si riferisce al trattamento del cancro utilizzando anticorpi o frammenti anticorpali dotati di attività agonista sul recettore MET. In particolare, l'invenzione riguarda il trattamento del cancro colorettale utilizzando anticorpi agonisti o frammenti anticorpali anti-MET, con particolare riferimento al cancro colorettale associato all’infiammazione cronica e/o alle mutazioni genetiche nel colon e nel tratto gastrointestinale in generale. L'invenzione riguarda inoltre il trattamento della fibrosi intestinale utilizzando anticorpi agonisti anti-MET.
CONTESTO
HGF è una citochina pleiotropica di origine mesenchimale che media una matrice caratteristica di funzioni biologiche quali la proliferazione cellulare, la motilità, la differenziazione e la sopravvivenza. Il recettore di HGF, noto anche come METMET, è espresso da una varietà di tessuti inclusi tutti gli epiteli, l'endotelio, cellule muscolari, cellule neuronali, osteoblasti, cellule ematopoietiche e vari componenti del sistema immunitario. Il segnale di HGF e MET svolge un ruolo essenziale durante lo sviluppo embrionale, dove guida la migrazione di cellule precursori e ne regola la sopravvivenza o morte cellulare.
Negli adulti, il segnale di HGF/MET è normalmente quiescente e viene ripreso durante la guarigione delle ferite e la rigenerazione dei tessuti. Alcuni cancri e tumori dirottare HGF / MET segnalazione per promuovere la sopravvivenza e la proliferazione del tumore nell'organismo ospite.
Pertanto, inibire l'asse HGF-MET è diventato un obiettivo popolare per il trattamento anti-cancro. L'uso di un agonista di HGF-MET come terapia anti-cancro non è stata precedentemente dimostrata.
Il cancro colorettale è il terzo tumore più comune in termini di incidenza, con un tasso di sopravvivenza a 5 anni di circa il 65%. I soggetti particolarmente a rischio sono quelli con malattia infiammatoria intestinale, o predisposizioni genetiche (ad esempio quelli con una storia di ereditario senza poliposi cancro colorettale (HNPCC o sindrome di Lynch), la sindrome di Gardner, o poliposi adenomatosa familiare (FAP)). Il trattamento con la chirurgia (per esempio colectomia) e / o chemioterapia e la radioterapia può essere efficace, ma portare alla perdita significativa nel tenore di vita. V'è quindi la necessità di terapie efficaci per il cancro del colon-retto.
SOMMARIO DELL'INVENZIONE
HGF è un noto fattore pro-oncogenico che svolge un ruolo chiave nella tumorigenesi dei vari tessuti e organi, compreso il tratto gastro-intestinale (Gherardi et al. Nat Rev Cancer 12:89-103, 2012; Vermeulen et al. Nat Biol Cell.12: 468-476, 2010; Samamé Pérez-Vargas et al. Int J Mol Sci.14: 18.056-18.077, 2013; Stein et al. Nat Med.15: 59-67, 2009, ciascuno dei quali è qui incorporato per riferimento). Di conseguenza, inibire HGF-MET è diventato un obiettivo popolare per il trattamento anti-cancro. Tuttavia, è sorprendentemente identificato qui che un agonista di HGF-MET agisce come terapia anticancro efficace.
Pertanto, in un primo aspetto, l'invenzione fornisce un metodo di trattamento del cancro in un soggetto, il metodo comprendendo la somministrazione al soggetto un agonista HGF-MET. In certe forme di realizzazione preferite, l'agonista HGF-MET è un anti-MET anticorpo agonista o frammento antigene stesso.
Sorprendentemente, un agonista HGF-MET (ad esempio un anticorpo agonista anti-MET) è particolarmente efficace come terapia per il cancro colorettale, come dimostrato qui. Senza voler essere legati alla teoria, si ipotizza che la stimolazione del segnale HGF-MET promuove rigenerazione e omeostatiche meccanismi di cellule epiteliali intestinali, bagnatura quindi il meccanismo potenzialmente oncogeni (Nakamura et al, J Gastroenterol Hepatol 1:..188-202, 2011, qui incorporato per riferimento).
In un ulteriore aspetto, l'invenzione fornisce un metodo per il trattamento della fibrosi colorettale in un soggetto, il metodo comprendente la somministrazione a un soggetto un agonista HGF-MET.
Vantaggiosamente, si è dimostrato anche qui che gli agonisti HGF-Met sono sorprendentemente efficaci nel trattamento del cancro colorettale in viscere infiammate. Inoltre, vantaggiosamente, è anche qui dimostrato che agonisti HGF-Met sono sorprendentemente efficace nel trattamento della fibrosi retto in viscere infiammate.
Ciò è particolarmente vantaggioso poiché i pazienti affetti da infiammazione retto sono ad aumentato rischio di cancro colorettale e anche da fibrosi. Ad esempio, pazienti affetti da malattia infiammatoria intestinale (IBD, cioè la malattia di Crohn o colite ulcerosa) sono predisposti al cancro colorettale e saranno vantaggiosamente beneficiare dei metodi qui descritti. Inoltre, agonisti HGF-Met possono anche alleviare i sintomi della sottostante IBD stessa. Pertanto i metodi dell'invenzione porterà ad un effetto sinergico in pazienti con IBD cui cancro colorettale in questi pazienti può essere trattata e, inoltre, IBD del paziente viene trattato. Analogamente, i metodi dell'invenzione porterà ad un effetto sinergico in pazienti con IBD cui fibrosi colorettale in questi pazienti può essere trattata e, inoltre, viene anche trattata l'IBD del paziente.
Pertanto, in una ulteriore forma di realizzazione preferita, il metodo dell'invenzione è un metodo di trattamento del cancro colorettale in un paziente o soggetto identificati come ad aumentato rischio di cancro colorettale. In alcune forme di realizzazione, il soggetto è stato diagnosticato infiammazione colorettale prima della somministrazione dell'agonista HGF-MET. In certe forme di realizzazione dei metodi qui descritti, il soggetto ha IBD (colite ulcerosa o morbo di Crohn). In preferite tali forme di realizzazione, l'agonista HGF-MET somministrata al soggetto è un anticorpo agonista anti-MET.
Analogamente, in una ulteriore forma di realizzazione preferita, il metodo dell'invenzione è un metodo di trattamento della fibrosi retto in un paziente o soggetto identificati come ad aumentato rischio di fibrosi colorettale. In alcune forme di realizzazione, il soggetto è stato diagnosticato infiammazione colorettale prima della somministrazione dell'agonista HGF-MET. In certe forme di realizzazione dei metodi qui descritti, il soggetto ha IBD (colite ulcerosa o morbo di Crohn). In preferite tali forme di realizzazione, l'agonista HGF-MET somministrata al soggetto è un anticorpo agonista anti-MET.
In un ulteriore aspetto è previsto un agonista HGF-MET per l'uso in metodi di trattamento del cancro (ad esempio cancro colorettale) in un soggetto come qui descritto. In preferite tali forme di realizzazione, l'agonista HGF-MET è un anti-MET anticorpo agonista o frammento antigene stesso.
In un ulteriore aspetto è previsto un agonista HGF-MET per l'uso in metodi di trattamento della fibrosi colorettale in un soggetto come qui descritto. In preferite tali forme di realizzazione, l'agonista HGF-MET è un anti-MET anticorpo agonista o frammento antigene stesso.
In un ulteriore aspetto viene fornita una composizione farmaceutica per l'uso in metodi di trattamento del cancro (cancro colorettale esempio) come qui descritto, in cui la composizione farmaceutica comprende un agonista HGF-MET e un eccipiente o veicolo farmaceuticamente accettabile. In preferite tali forme di realizzazione, l'agonista HGF-MET è un anti-MET anticorpo agonista o frammento antigene stesso.
In un ulteriore aspetto viene fornita una composizione farmaceutica per l'uso in metodi di trattamento della fibrosi colorettale come qui descritto, in cui la composizione farmaceutica comprende un agonista HGF-MET e un eccipiente o veicolo farmaceuticamente accettabile. In preferite tali forme di realizzazione, l'agonista HGF-MET è un anti-MET anticorpo agonista o frammento antigene stesso.
In una forma di realizzazione preferita di tutti gli aspetti dell'invenzione, il soggetto o paziente è un essere umano.
In una forma di realizzazione preferita di tutti gli aspetti dell'invenzione, l'agonista HGF-MET è un agonista completo.
In una forma di realizzazione preferita di tutti gli aspetti dell'invenzione, l'agonista HGF-MET è un anticorpo agonista anti-MET.
FIGURE
Figura 1. Modello di carcinogenesi del colon AOM/DSS: peso corporeo e indice di attività della malattia (DAI) nel tempo. Il cancro colorettale colite-dipendente è stata indotto in topi BALB-c tramite somministrazione i.p. di azoxymethane (AOM) alla dose di 12,5 mg7kg, seguito da tre cicli di solfato di sodio destrano (DSS) in acqua potabile ad una concentrazione del 6%. Ciascun ciclo consisteva in 7 giorni di trattamento DSS seguiti da 14 giorni di acqua normale. Partendo dal giorno 1, i topi sono stati randomizzati in 4 braccia che hanno ricevuto il trattamento con: (i) solo veicolo (PBS); (Ii) l'anticorpo MET-agonista 71D6 alla dose di 1 mg/kg; (Iii) l'anticorpo MET agonistica 71D6 alla dose di 5 mg / kg; (Iv) il MET anticorpo antagonista 74C8-OA alla dose di 5 mg / kg. Un ulteriore, quinto braccio di controllo conteneva 7 topi che avevano ricevuto nessun AOM-DSS o anticorpi e servivano di controllo sano. Gli anticorpi sono stati consegnati per iniezione ip due volte a settimana. Durante tutto il corso dell'esperimento, peso del mouse è stata monitorata su base regolare, ed i sintomi clinici della colite ulcerosa sono stati valutati determinando sangue fecale, emorragia rettale e consistenza delle feci. Ciascun parametro è stato assegnato un punteggio da 0 (assenza del sintomo) a 3 (manifestazione massima del sintomo). Punteggi relativi ai singoli parametri sono stati sommati per dare origine alla DAI che varia da 0 a 9. (A) Il peso corporeo nel tempo. (B) DAI nel corso del tempo.
Figura 2. Modello di carcinogenesi del colon AOM/DSS: lunghezza del colon e peso specifico. Il cancro colite-associato è stato indotto in topi BALB / c come descritto nella legenda della Figura 1. All’autopsia, i campioni del colon sono stati raccolti e lavati attraverso. I tessuti sono stati pesati e la loro lunghezza è stato determinato utilizzando un righello. (A) lunghezza del colon. (B) Peso specifico del colon.
Figura 3. Modello di carcinogenesi del colon AOM/DSS: immagini rappresentative di tumori intestinali. Il cancro colite-associato è stato indotto in topi BALB-cc come descritto per la Figura 1. All’autopsia, i campioni del colon sono stati raccolti e lavati. Dopo la misurazione della lunghezza e del peso, i colon sono stati aperti con un taglio longitudinale e colorati con 1% di soluzione Alcian blue per evidenziare i bordi tumorali. campioni del colon sono stati analizzati ponendo il tessuto appiattito sotto uno stereomicroscopio con il loro interno (lumen) lato verso la lente, e fotografati. Ingrandimento: 1X.
Figura 4. Modello di carcinogenesi del colon AOM/DSS: analisi del numero medio di tumori, del volume medio dei tumori e del carico totale tumorale. Il cancro colite-associato è stato indotto in topi BALB / c come descritto per la Figura 1, e carcinogenesi è stata quantificata utilizzando uno stereomicroscopio. (A) numero di tumore. Il numero di polipi del colon in ogni campione è stato segnato direttamente. (B) Il volume medio del tumore. fotografie tumorali sono stati analizzati utilizzando il software Immagine J (Instututes Nazionale della Salute) e il volume dei polipi è stato calcolato con la formula V = 3⁄4π (X / 2) · (Y / 2) 2, dove V è il volume del polip, e X e Y sono maggiori e minori dimensioni della sezione polip, rispettivamente (in mm). (C) carico totale del tumore. carico tumorale totale (volume) è stato calcolato moltiplicando il volume del tumore media per il numero di tumori in ogni mouse.
Figura 5. Modello di carcinogenesi del colon AOM/DSS: analisi istologica dei campioni del colon. Il cancro colite associata è stata indotta in topi BALB / c come descritto nella Figura 1 legenda. A seguito di trasformazione del tessuto e paraffina, campioni del colon sono stati tagliati con un microtomo e preparati per istologiche e analisi immunoistochimica. Qui, vi mostriamo le immagini rappresentative delle sezioni del colon colorate con ematossilina eosina. Ingrandimento: 100X.
Figura 6. Modello di carcinogenesi del colon AOM/DSS: analisi immunoistochimica di deposizione di collagene. Il cancro colite associata è stata indotta in topi BALB / c come descritto nella Figura 1 legenda. sezioni del colon sono stati analizzati mediante immunoistochimica. Qui, vi mostriamo le immagini rappresentative delle sezioni del colon colorati con picro-sirius rosso, che mette in luce deposizione di collagene, un segno distintivo di fibrosi dei tessuti. Ingrandimento: 400X.
Figura 7. Modello di carcinogenesi del colon AOM/DSS: analisi immunoistochimica di contenuti miofibroblasti. Il cancro colite associata è stata indotta in topi BALB / c come descritto nella Figura 1 legenda. sezioni del colon sono stati analizzati mediante immunoistochimica. Qui, vi mostriamo le immagini rappresentative delle sezioni del colon colorati con actina del muscolo liscio (α-SMA) anticorpi anti-alfa, che specificamente identificano miofibroblasti. accumulo miofibroblasti è un segno distintivo di fibrosi. Ingrandimento: 400X.
Figura 8. Modello di carcinogenesi del colon AOM/DSS: analisi immunoistochimica dell'espressione di TGF-β. Il cancro colite associata è stata indotta in topi BALB / c come descritto nella Figura 1 legenda. sezioni del colon sono stati analizzati mediante immunoistochimica. Qui, vi mostriamo le immagini rappresentative delle sezioni del colon colorati con anti-fattore di crescita trasformante beta (TGF-β) anticorpi. segnalazione di TGF-β è stato dimostrato essere frequentemente liberalizzato nei tumori umani, tra cui il cancro colorettale. Mentre nelle cellule normali o premaligne solito agisce come un soppressore del tumore, nel cancro avanzato è spesso sovraespresso e il selettore di inibizione della crescita di un oncogeno una promuovendo così la proliferazione delle cellule tumorali e l'invasione.
Figura 9. Modello di carcinogenesi del colon con AOM: lunghezza del colon e peso specifico.
Il carcinoma colorettale mutagenesi indotta è stata indotta in topi BALB / c con la somministrazione ip di azoxymethane (AOM) alla dose di 5 mg / kg una volta alla settimana per 6 settimane. Partendo dal giorno 1, i topi sono stati randomizzati in 2 bracci di 21 topi ciascuno che hanno ricevuto un trattamento con 71D6 (alla dose di 5 mg / kg) o il solo veicolo (PBS). Anticorpo è stato somministrato due volte alla settimana per iniezione ip. Un ulteriore, terzo braccio di controllo conteneva 7 topi che avevano ricevuto nessun AOM o anticorpi e servito come il controllo sano. I topi sono stati sacrificati 8 settimane dopo l'ultima iniezione AOM, cioè 14 settimane dopo l'esperimento iniziato. All'autopsia, due punti sono stati raccolti e lavati attraverso. due punti espiantati sono stati misurati utilizzando un righello e pesati. (A) lunghezza del colon. peso specifico (B) Colon.
Figura 10. Modello di carcinogenesi del colon con AOM: incidenza e numero dei tumori. Il cancro colorettale mutagenesi indotta è stata indotta in topi BALB / c come descritto nella Figura 9 legenda. Seguendo misurazioni, due punti veniva aperto longitudinalmente per esporre masse tumorali. I tessuti sono stati colorati ex vivo con una soluzione Alcian Blu 1% al fine di evidenziare i confini tumorali. Polipi sono state contate utilizzando uno stereo-microscopio. (A) incidenza tumorale. (B) Il numero medio del tumore.
Figura 11. Modello di carcinogenesi del colon con AOM: immagini rappresentative di tumori del colon. Immagini rappresentative dei tumori quantificati nella Figura 10. Le frecce indicano masse tumorali macroscopicamente evidenti. Ingrandimento: 1X.
Figura 12. Modello murino di infiammazione intestinale: misurazione del peso corporeo, dell’Indice di Attività della Malattia (DAI) e della lunghezza del colon. Destrano solfato di sodio (DSS) è stato aggiunto all'acqua potabile di topi Balb / c per 10 giorni. Il giorno 10, il trattamento DSS è stata interrotta e topi sono stati messi di nuovo in acqua normale. Partendo dal giorno 1, i topi sono stati randomizzati in 7 bracci che hanno ricevuto il trattamento con 71G3, 71D6, 71G2 (alla dose di 1 mg / kg o 5 mg / kg) o il solo veicolo (PBS). Un ulteriore, braccio di controllo ottava non ha ricevuto DSS o anticorpi e servito come il controllo sano. I topi sono stati sacrificati il giorno 12, cioè 2 giorni dopo la somministrazione DSS è stata interrotta. All'autopsia, due punti sono stati raccolti, lavati con, e la loro lunghezza è stato determinato utilizzando un righello. Dopo la misurazione, i due punti sono stati inclusi in paraffina e processati per l'analisi istologica. Durante tutto il corso dell'esperimento, il peso del mouse è stato monitorato su base regolare, ed i sintomi clinici della colite ulcerosa sono stati valutati determinando sangue nelle feci, sanguinamento rettale e consistenza delle feci. Ciascun parametro è stato assegnato un punteggio da 0 (assenza del sintomo) a 3 (manifestazione massima del sintomo). Punteggi relativi ai singoli parametri sono stati sommati per dare origine alla DAI che varia da 0 a 9. (A) Il peso corporeo nel tempo (% rispetto al tempo 0). (B) DAI nel corso del tempo. (C) lunghezza Colon all'autopsia. Dati dei 1 mg / kg braccia e delle 5 mg / kg bracci sono mostrati nei grafici separate per chiarezza. (A) Peso corporeo nel tempo (% rispetto al tempo 0). (B) DAI nel corso del tempo. (C) lunghezza Colon all'autopsia. Dati dei 1 mg / kg braccia e delle 5 mg / kg bracci sono mostrati nei grafici separate per chiarezza. (A) Peso corporeo nel tempo (% rispetto al tempo 0). (B) DAI nel corso del tempo. (C) lunghezza Colon all'autopsia. Dati dei 1 mg / kg braccia e delle 5 mg / kg bracci sono mostrati nei grafici separate per chiarezza.
Figura 13. Modello murino di infiammazione intestinale: immagini istologiche rappresentative. Topi BALB / c sono stati esposti a destrano solfato sodico (DSS) come descritto nella Figura 12 legenda. All'autopsia, due punti sono stati raccolti, misurati, e quindi inclusi in paraffina e processati per l'analisi istologica. sezioni del colon sono state colorate con ematossilina ed eosina, esaminati al microscopio, e fotografati. braccio sperimentale, la dose di anticorpo e l'ingrandimento sono indicati vicino a ciascuna immagine.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA
Come usato qui, i termini "proteina MET" o "MET antigene" o "MET" vengono usati in modo intercambiabile e si riferiscono alla tirosina chinasi recettore che, nella sua forma wild-type, si lega al fattore di crescita degli epatociti (HGF). “MET” come qui utilizzato si riferisce a MET umano se non diversamente specificato. I termini “proteina umana MET” o “recettore MET umana” o “MET umana” o “hMET” sono usati in modo intercambiabile per riferirsi a MET umano (GenBank numero di accesso: X54559), compreso il nativo proteina MET umano naturalmente espresso nell'ospite umano e / o sulla superficie di linee cellulari umane, così come le forme ricombinanti e loro frammenti e anche naturalmente presenti forme mutanti. I termini “mouse MET proteine” o “mouse MET recettore” o “mouse MET” o “mMET” sono usati in modo intercambiabile per riferirsi a topo MET (GenBank numero di accesso: NM_008591), includendo la proteina MET nativa del mouse espressa naturalmente nell'host del mouse e / o sulla superficie del mouse linee cellulari coltivate, così come forme e frammenti ricombinanti e anche in natura forme mutanti.
Come qui usato, “HGF-MET agonisti” e “agonista MET” sono usati in modo intercambiabile per riferirsi ad agenti non native che promuovono segnalazione tramite la proteina MET - cioè agenti diversi HGF che legano MET e aumentano segnalazione MET. attività agonista sul legame di MET da agonisti MET è indicato con risposte molecolari e / o cellulari che (almeno parzialmente) imitare il risposte molecolari e cellulari indotte dal legame HGF-MET. Metodi adatti per misurare l'attività agonista MET sono qui descritti, inclusi gli esempi. Un “agonista pieno” è un agonista MET che aumenta segnalazione MET in risposta al legame in misura almeno simili, e opzionalmente superiore, la misura in cui il MET aumenti segnalazione in risposta al legame del ligando nativo HGF. Esempi del livello del MET segnalazione indotta da agonisti “pieno”,
agonisti HGF-Met possono essere piccole molecole, proteine quali anticorpi o frammenti di legame di antigene, aptameri o proteine di fusione di legame. Un esempio particolare di un agonista MET è un anticorpo agonista anti-MET.
Come qui usato, “trattamento” o “trattare” si riferisce a una terapia efficace della relativa condizione (cancro (ad esempio cancro colorettale) o fibrosi) - cioè, un miglioramento della salute del soggetto. Il trattamento può essere un trattamento terapeutico o profilattico - che è, il trattamento terapeutico di soggetti affetti dalla condizione, o il trattamento profilattico di un soggetto in modo da ridurre il rischio di contrarre la condizione o la gravità della condizione, una volta contratta. trattamento terapeutico può essere caratterizzata da un miglioramento della salute del soggetto rispetto a prima del trattamento. trattamento terapeutico può essere caratterizzata da un miglioramento della salute del soggetto rispetto ad un soggetto di controllo comparabile che non ha ricevuto il trattamento.
Come qui usato, il termine "anticorpo" comprende un'immunoglobulina avente una combinazione di due pesanti e due catene leggere aventi significativa attività specifica immuno-reattivo ad un antigene di interesse (ad esempio MET umano). I termini “anticorpi anti-MET” o “anticorpi MET” sono usati in modo intercambiabile qui per riferirsi ad anticorpi che mostrano specificità immunologica per la proteina MET umana. “Specificità” MET umana non esclude cross-reazione con specie omologhi di MET. In particolare, “agomAbs” come usato qui si riferisce MET anticorpi che si legano ad entrambi MET umano e topo MET.
“Anticorpo” come usato qui comprende anticorpi di qualsiasi classe umano (ad esempio IgG, IgM, IgA, IgD, IgE) e sottoclassi / isotipi loro (ad esempio IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1). Anticorpo come qui usato si riferisce ad anticorpi modificati. Gli anticorpi modificati comprendono forme sintetiche di anticorpi che sono alterati in modo tale che essi non sono naturalmente presenti, ad esempio, anticorpi che comprendono almeno due porzioni di catena pesante ma non due catene pesanti completi (ad esempio, dominio cancellato anticorpi o minibodies); forme multispecifici di anticorpi (per esempio, bispecifici, trispecific, etc.) modificati per legarsi a due o più differenti antigeni o epitopi differenti su un singolo antigene); molecole a catena pesante uniti a molecole scFv e simili. Inoltre, il termine “anticorpo modificato” comprende forme multivalenti di anticorpi (ad esempio, trivalente, tetravalente, ecc, anticorpi che si legano a tre o più copie dello stesso antigene).
Gli anticorpi qui descritti possono avere funzione effettrice anticorpo, per esempio uno o più di anticorpo-dipendente citotossicità cellulo-mediata (ADCC), complementare citotossicità dipendente (CDC) e anticorpo fagocitosi cellulare dipendente (ADCP). In alternativa, in alcune forme di realizzazione gli anticorpi per l'uso secondo l'invenzione hanno una regione Fc che è stato modificato in modo tale che le funzioni di uno o più effettrici, ad esempio tutte le funzioni effettrici, sono abrogate.
Anticorpi comprendono catene leggere e pesanti, con o senza un legame covalente interchain tra loro. Un suo frammento legante antigene di un anticorpo comprende frammenti peptidici che presentano specifica attività immuno-reattiva allo stesso antigene come anticorpo (es MET). Esempi di frammenti leganti antigene includono frammenti scFv, i frammenti Fab, frammenti e 2 (ab ') F.
Come usato qui, i termini "regione variabile" e "dominio variabile" vengono usati in modo intercambiabile e sono destinati ad avere significato equivalente. Il termine "variabile" si riferisce al fatto che alcune parti dei domini variabili VH e VL differiscono ampiamente in sequenza tra anticorpi e sono utilizzati nel legame e la specificità di ciascun anticorpo particolare per il suo antigene bersaglio. Tuttavia, la variabilità non è distribuito in modo uniforme in tutti i domini variabili degli anticorpi. Si è concentrata in tre segmenti chiamati "loop" ipervariabili in ciascuno dei domini VL e il dominio VH che fanno parte del sito di legame dell'antigene. Il primo, secondo e terzo anse ipervariabili del dominio catena leggera Vlambda sono indicati nel presente documento come L1 (λ), L2 (λ) e L3 (λ) e può essere definito come comprendente i residui 24-33 (L1 (λ), costituito da 9, 10 o 11 residui amminoacidici), 49-53 (L2 (λ), composto da 3 residui) e 90-96 (L3 (lambda), costituiti da 5 residui) nel dominio VL (Morea et al. , Metodi 20, 267-279, 2000). Il primo, secondo e terzo anse ipervariabili del dominio catena leggera VKappa sono indicati qui come L1 (κ), L2 (κ) e L3 (κ) e può essere definito come comprendente i residui 25-33 (L1 (κ), consistente 6, 7, 8, 11, 12 o 13 residui), 49-53 (L2 (κ), composto da 3 residui) e 90-97 (L3 (κ), composto da 6 residui) nel dominio VL (Morea et al., metodi 20, 267-279, 2000). Il primo, secondo e terzo anse ipervariabili del dominio VH sono indicati qui come H1, H2 e H3 e può essere definito come comprendente i residui 25-33 (H1, composta da 7, 8 o 9 residui), 52-56 (H2 , costituito da 3 o 4 residui) e 91-105 (H3, altamente variabile in lunghezza) nel dominio Vh (Morea et al., Methods 20, 267-279, 2000).
Se non diversamente indicato, i termini L1, L2 e L3 si riferiscono rispettivamente al primo, secondo e terzo anse ipervariabili di un dominio VL, e comprendono anse ipervariabili ottenuti su entrambi isotipi Vkappa e Vlambda. I termini H1, H2 e H3 sono riferiti rispettivamente al primo, secondo e terzo anse ipervariabili del dominio VH, e comprendono anse ipervariabili ottenute da qualsiasi dei noti isotipi catena pesante, compreso γ, ε, δ, α o μ.
L'ipervariabile loop L1, L2, L3, H1, H2 e H3 possono ciascuno comprendere parte di una "regione determinanti la complementarietà" o "CDR", come definito di seguito. I termini "ciclo ipervariabile" e "regione determinanti la complementarietà" non sono strettamente sinonimi, poiché le anse ipervariabili (HVS) sono definiti sulla base della struttura, mentre regioni determinanti la complementarietà (CDR) sono definite in base alla variabilità di sequenza (Kabat et al. , sequenze di proteine di interesse immunologico, Servizio Sanitario 5th ed. pubblico, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991) e i limiti del HVs ei CDR possono essere diversi in alcuni domini VH e VL.
Le CDR dei domini VL e VH in genere può essere definito come comprendente i seguenti amminoacidi: residui 24-34 (CDRL1), 50-56 (CDRL2) e 89-97 (CDRL3) nella catena leggera dominio variabile, ei residui 31 -35 o 31-35b (CDRH1), 50-65 (CDRH2) e 95-102 (CDRH3) nella catena pesante dominio variabile; (Kabat et al., Sequenze di proteine di interesse immunologico, Servizio 5th Ed. Public Health, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991). Così, il HVs può essere compresa entro i corrispondenti CDR e riferimenti qui effettuati al "loop" ipervariabili di domini VH e VL deve essere interpretato nel senso che comprende anche le CDRs corrispondenti, e viceversa, se non diversamente indicato.
Le porzioni più altamente conservate dei domini variabili sono chiamate regione strutturale (FR), come di seguito definito. I domini variabili delle catene pesanti e leggere native comprendono ciascuno FRs quattro (FR1, FR2, FR3 e FR4, rispettivamente), in gran parte adottando una configurazione β-sheet, collegati da tre anse ipervariabili. Le anse ipervariabili in ogni catena sono tenute insieme in prossimità dall'FRS ed, con le anse ipervariabili dell'altra catena, contribuiscono alla formazione del sito di legame di antigene di anticorpi. analisi strutturale di anticorpi rivelato la relazione tra la sequenza e la forma del sito di legame formata dalle regioni determinanti la complementarietà (Chothia et al, J. Mol Biol 227, 799-817, 1992;.... Tramontano et al, J. mol. Biol, 215, 175-182, 1990). Nonostante la loro elevata variabilità di sequenza, di cinque dei sei loop adottare solo un piccolo repertorio di conformazione principale catena, chiamato “strutture canoniche”. Queste conformazioni sono innanzitutto determinato dalla lunghezza delle boccole e dall'altro dalla presenza di residui chiave in determinate posizioni nelle anse e nelle regioni strutturali che determinano la conformazione attraverso il loro imballaggio, legami idrogeno o la capacità di assumere Main- insolito conformazioni di catena.
Come qui usato, il termine "CDR" o "regione determinanti la complementarietà" si intendono i non contigui siti antigenici combinando trovati all'interno della regione variabile dei due polipeptidi a catena pesante e leggera. Queste regioni particolari sono stati descritti da Kabat et al., J. Biol.
Chem.252, 6609-6616, 1977, di Kabat et al., Sequenze di proteine di interesse immunologico, 5ª ediz. Servizio Public Health, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991 da Chothia et al., J. Mol. Biol.196, 901-917, 1987 e da MacCallum et al., J. Mol. Biol.262, 732-745, 1996, in cui le definizioni includono sovrapposizioni o sottoinsiemi dei residui di amminoacidi rispetto contro l'altro. I residui di amminoacidi che comprendono i REC quali definiti da ciascuno dei riferimenti sopra citati sono esposti per il confronto. Preferibilmente,
Tabella 1: definizioni CDR.
<1>la numerazione dei residui segue la nomenclatura di Kabat et al., supra
<2>la numerazione dei residui segue la nomenclatura dei Chothia et al., supra
<3>la numerazione dei residui segue la nomenclatura di MacCallum et al., supra
Come qui usato, il termine “regione strutturale” o “FR regione” comprende i residui amminoacidici che fanno parte della regione variabile, ma non fanno parte dei REC (ad esempio, utilizzando la definizione di Kabat di CDR). Pertanto, un quadro di regione variabile è compreso fra circa 100-120 amminoacidi in lunghezza, ma comprende solo gli amminoacidi di fuori dei REC.. Per l'esempio specifico di una catena pesante dominio variabile e per le CDR come definito da Kabat et al, regione strutturale 1 corrisponde al dominio della regione variabile comprendente gli amminoacidi 1-30; regione quadro 2 corrisponde al dominio della regione variabile che comprende gli amminoacidi 36-49; regione quadro 3 corrisponde al dominio della regione variabile che comprende gli amminoacidi 66-94, e regione strutturale 4 corrisponde al dominio della regione variabile dagli amminoacidi 103 alla fine della regione variabile. Le regioni framework per la catena leggera sono analogamente separati da ciascuno dei sinistri luce regione CDR variabili. Allo stesso modo, utilizzando la definizione di CDR da Chothia et al. o McCallum et al. i confini della regione quadro sono separati dai rispettivi termini CDR come descritto sopra. In realizzazioni preferite le CDR sono come definiti da Kabat.
In naturalmente anticorpi, le sei CDR presenti su ciascun anticorpo monomerico sono brevi sequenze non contigue di aminoacidi che sono posizionati in modo da formare il sito di legame dell'antigene come anticorpo assume la sua configurazione tridimensionale in un ambiente acquoso. Il resto dei domini variabili pesanti e leggeri show less variabilità inter-molecolari in sequenza amminoacidica e sono definiti regioni cornice. Regioni cornice adottano sostanzialmente una conformazione β-sheet e le CDR formano anse che collegano, e in alcuni casi fanno parte, la struttura β-sheet. Così, queste regioni cornice agiscono per formare un ponteggio che prevede il posizionamento delle sei CDR nell'orientamento corretto inter-catena, interazioni non covalenti. Il sito di legame dell'antigene formato dai CDR posizionate definisce una superficie complementare alla epitopo dell'antigene immunoreattiva. Questa superficie complementare promuove il legame dell'anticorpo al epitopo dell'antigene immunoreattiva non covalente. La posizione di CDR può essere facilmente identificato da un ordinario esperto nel ramo.
Come qui usato, il termine “regione cerniera” comprende la porzione di una molecola a catena pesante che unisce il dominio CH1 al dominio CH2. Questa regione cerniera comprende circa 25 residui ed è flessibile, permettendo così le due regioni di legame antigene N-terminale di muoversi indipendentemente. regioni di cerniera possono essere suddivise in tre domini distinti: (. Roux et al, J. Immunol 161, 4083-4090, 1998.) superiore, medio, e domini cerniera inferiore. anticorpi MET comprendenti una regione cerniera “pienamente umana” può contenere una delle sequenze della regione cerniera mostrati nella Tabella 2 che segue.
Tabella 2: sequenze cerniera umani.
Come qui usato il termine “dominio CH2” comprende la porzione di una molecola a catena pesante che si estende, per esempio, da circa 244 residui al residuo 360 di un anticorpo utilizzando schemi di numerazione convenzionali (residui 244 a 360, numerazione di Kabat sistema e residui 231- 340, sistema di numerazione europea;... Kabat et al, sequenze di proteine di immunologica interesse, Health Service 5th Ed pubblica, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) Il dominio CH2 è unico nel senso che non è strettamente accoppiato con un altro dominio. Piuttosto, due N-legati ramificata catene di carboidrati sono interposti tra i due domini CH2 di una molecola di IgG nativa intatta. è anche ben documentato che il dominio CH3 estende dal dominio CH2 al C-terminale della molecola IgG e comprende circa 108 residui.
Come qui usato, il termine “frammento” si riferisce ad una parte o porzione di una catena di anticorpo o anticorpo comprendente meno residui di ammino acidi di un anticorpo o anticorpo intatto catena o completa. Il termine “frammento legante antigene” si riferisce ad un frammento polipeptidico di un'immunoglobulina o anticorpo che si lega all'antigene o compete con l'anticorpo intatto (cioè, con l'anticorpo intatto da cui sono stati ricavati) per l'antigene di legame (cioè, il legame specifico di MET) . Come qui usato, il termine “frammento” di una molecola di anticorpo include frammenti leganti l'antigene di anticorpi, per esempio, un dominio di catena leggera dell'anticorpo variabile (VL), un dominio variabile anticorpo catena pesante (VH), un anticorpo a catena singola (scFv ), un frammento ab 2 un frammento Fab un frammento Fd un frammento Fv un frammento di anticorpo singolo dominio (DAB) F ( '),,,, e. Frammenti possono essere ottenuti, ad esempio, via chimica o enzimatica trattamento di una catena anticorpale o anticorpo integra o completa o con mezzi ricombinanti.
Come qui usato, “Oggetto” e “paziente” sono usati in modo intercambiabile per riferirsi a un individuo umano.
Metodo di trattamento del cancro
Un trattamento efficace del cancro con un agonista HGF-MET non è stato precedentemente dimostrato.
È sorprendentemente dimostrato qui che la somministrazione di un agonista HGF-MET (cioè un agonista del MET che non è HGF) tratta efficacemente il cancro in due modelli. In particolare, l'agonista MET trattata cancro colorettale in un modello di mutagenesi, dove topi con mutazioni genetiche sono stati trattati in modo tale che l'incidenza del tumore e il numero di tumori è ridotta rispetto a controlli non trattati, e anche, inoltre vantaggiosamente, rispetto alla somministrazione del nativo MET ligando (HGF). Inoltre, la somministrazione di un agonista MET hanno impedito lo sviluppo di tumori in un modello di intestinale (retto) formazione di tumori infiammazione indotta. In particolare, un agente antagonista del MET non è riuscito a curare il cancro in entrambi i modelli.
Pertanto, in un primo aspetto viene fornito un metodo di trattamento del cancro comprendente la somministrazione ad un soggetto che ne necessita un agonista HGF-MET. È previsto anche un agonista HGF-Met (ad esempio un anticorpo agonista MET) per l'uso nel trattamento del cancro.
Tumori particolarmente adatte ad essere trattate secondo i metodi descritti in questa sede includono tumori di origine epiteliale. Tumori particolarmente adatte ad essere trattate secondo i metodi rivendicati sono tumori gastrointestinali, ad esempio: cancro esofageo, cancro dello stomaco, cancro pancreatico, cancro al fegato, cistifellea cancro, cancro colorettale e cancro anale.
Tumori associati con infiammazione cronica sono anche particolarmente adatti ad essere trattati secondo le modalità previste. Ad esempio, il cancro al fegato è associato con l'infiammazione causata da infezione da virus dell'epatite, il cancro allo stomaco è associato con l'infiammazione causata da infezione da Helicobacter pylori, e il cancro colorettale è associata ad infiammazione intestinale. Di conseguenza, in alcune forme di realizzazione, il metodo è un metodo di trattamento di un cancro associato con infiammazione cronica. In certe realizzazioni, il metodo è un metodo di trattamento del cancro al fegato. In certe realizzazioni, il metodo è un metodo di trattamento del cancro dello stomaco.
Come qui dimostrato, agonisti HGF-Met sono particolarmente efficaci nel trattamento del cancro colorettale. Pertanto, in una forma di realizzazione preferita dei metodi qui descritti, il metodo è un metodo di trattamento del cancro colorettale.
È previsto anche un agonista HGF-Met (ad esempio un anticorpo agonista MET) per l'uso nel trattamento del cancro colorettale.
Trattamento del cancro, come il cancro del colon-retto, può essere un trattamento terapeutico o profilattico - cioè, il trattamento terapeutico di soggetti affetti dalla condizione, o il trattamento profilattico di un soggetto in modo da ridurre il rischio di contrarre la condizione o la gravità della condizione una volta contratta. Pertanto, in certe forme di realizzazione, il trattamento del cancro (come cancro colorettale) è terapeutico. In certe realizzazioni, il trattamento terapeutico può essere caratterizzata da una diminuzione del numero di tumori o polipi cancerose in un soggetto che è stato somministrato un agonista MET rispetto a prima della somministrazione dell'agonista MET. In certe forme di realizzazione, il trattamento del cancro (come cancro colorettale) può essere caratterizzata da una diminuzione delle dimensioni o il volume di tumori o polipi cancerose rispetto a prima della somministrazione dell'agonista MET.
In ulteriori forme di realizzazione di metodi per il trattamento del cancro colorettale, il trattamento terapeutico può essere ulteriormente caratterizzata da una diminuzione della estensione della fibrosi colon nel soggetto rispetto a prima della somministrazione dell'agonista MET. Mezzi per determinare l'entità della fibrosi sarebbe familiare all'esperto e comprendono, ad esempio, determinare il grado di deposizione di collagene in una biopsia rappresentativo.
In certe forme di realizzazione, il trattamento del cancro, per esempio cancro colorettale, può essere trattamento profilattico. In certe realizzazioni, il trattamento profilattico può essere caratterizzata da una diminuzione del numero di tumori o polipi cancerose in un soggetto (o popolazione di soggetti) che è stato somministrato un agonista Met rispetto ad un soggetto di controllo (o frazione di soggetti di controllo) che ha non è stato somministrato un agonista del MET. In certe realizzazioni, il trattamento profilattico di cancro, per esempio il cancro colorettale, può essere caratterizzata da una diminuzione delle dimensioni o il volume di tumori o polipi cancerose in un soggetto (o popolazione di soggetti) che è stato somministrato un agonista Met rispetto ad un controllo soggetto (o popolazione di soggetti di controllo) che non ha ricevuto un agonista MET.
In ulteriori forme di realizzazione, il trattamento profilattico di cancro colorettale può essere ulteriormente caratterizzata da una diminuzione della estensione della fibrosi del colon in un soggetto (o popolazione di soggetti) che è stato somministrato un agonista MET rispetto ad un soggetto di controllo (o frazione di soggetti di controllo) che non è stato somministrato un agonista MET. Mezzi per determinare l'entità della fibrosi sarebbe familiare all'esperto e comprendono, ad esempio, determinare il grado di deposizione di collagene in una biopsia rappresentativo.
Come sarà apprezzato dal tecnico del ramo, un “controllo soggetto” come qui utilizzato si riferisce ad un oggetto di stato di malattia paragonabile al soggetto somministrato l'agonista HGF-MET.
Metodo di trattamento della fibrosi colorettale
È inoltre sorprendentemente dimostrato qui che la somministrazione di un agonista HGF-MET (cioè un agonista del MET che non è HGF) tratta efficacemente la fibrosi colorettale. Un soggetto è particolarmente suscettibile di fibrosi colorettale quando soffrono di infiammazione intestinale.
Di conseguenza, in un ulteriore aspetto è previsto un metodo per trattare fibrosi colorettale, comprendente la somministrazione a un soggetto un agonista HGF-MET. Mezzi per determinare l'estensione della fibrosi in un soggetto sarebbe familiare all'esperto e comprendono, ad esempio, determinare il grado di deposizione di collagene in una biopsia rappresentativo.
In certe forme di realizzazione dei metodi per il trattamento della fibrosi colorettale, il trattamento può essere un trattamento terapeutico. In certe realizzazioni, il trattamento terapeutico può essere caratterizzata da una diminuzione della estensione della fibrosi colon nel soggetto rispetto a prima della somministrazione dell'agonista MET. In certe realizzazioni, il trattamento terapeutico può essere caratterizzata da una diminuzione della estensione della fibrosi colon nel soggetto rispetto ad un soggetto di controllo che non è stato somministrato un agonista MET.
In certe forme di realizzazione, il trattamento del cancro colorettale può essere trattamento profilattico. In certe realizzazioni, il trattamento profilattico può essere caratterizzata da una diminuzione della estensione della fibrosi del colon in un soggetto (o popolazione di soggetti) che è stato somministrato un agonista MET rispetto ad un soggetto di controllo (o frazione di soggetti di controllo) che non è stata somministrato un agonista MET.
Come sarà apprezzato dal tecnico del ramo, un “controllo soggetto” come qui utilizzato si riferisce ad un oggetto di stato di malattia paragonabile al soggetto somministrato l'agonista HGF-MET.
Soggetto o paziente
Come qui dimostrato sorprendentemente, la somministrazione di un agonista HGF-MET tratta efficacemente cancro in un soggetto. Inoltre è stato dimostrato che gli agonisti HGF-Met sono particolarmente efficaci nel trattamento del cancro colorettale, specialmente in pazienti predisposti oa rischio di sviluppare il cancro colorettale.
I pazienti a maggior rischio di cancro del colon-retto sono quelli che hanno maggiori probabilità di sviluppare il cancro del colon-retto rispetto ad un individuo sano il resto comparabili. Fattori noti per aumentare il rischio di tumore del colon-retto includono, per esempio, all'età di> 65 anni, sesso maschile, il fumo, l'obesità, una maggiore assunzione di alcol, aumentata assunzione di carne rossa o trasformati. I metodi qui descritti nel trattamento del tumore colorettale sarà particolarmente efficace nel trattamento di soggetti aventi uno o più di questi fattori di rischio.
Di conseguenza, in certe forme di realizzazione viene fornito un metodo di trattamento del cancro colorettale comprendente la somministrazione ad un soggetto che ne necessita un agonista HGF-MET, in cui il soggetto è stato identificato come un aumentato rischio di cancro colorettale. In certe tali realizzazioni, il soggetto ha uno o più fattori di rischio selezionati dal gruppo costituito da: all'età di> 65 anni, sesso maschile, il fumo, l'obesità, una maggiore assunzione di alcol, aumento di colore rosso o l'assunzione di carni lavorate.
Alcune condizioni genetiche sono anche noti fattori di rischio di sviluppare il cancro del colon-retto. Ad esempio, ereditaria nonpolyposis cancro colorettale (HNPCC o sindrome di Lynch), sindrome di Gardner, e poliposi adenomatosa familiare (FAP) sono sindromi noti per aumentare il rischio di un soggetto sviluppare il cancro colorettale. Di conseguenza, in alcune forme di realizzazione, il soggetto ha una predisposizione a sviluppare il cancro colorettale. In alcune tali forme di realizzazione, il soggetto ha sindrome FAP, HNPCC o Gardner.
Un fattore di rischio significativo per il cancro del colon-retto e anche per la fibrosi del colon-retto è l'infiammazione intestinale, in particolare l'infiammazione del colon-retto. Identificazione soggetti con infiammazione colorettale sarebbero nella capacità della persona esperta. Ad esempio, infiammazione del colon-retto può essere identificato visivamente via endoscopica, istologicamente tramite biopsia, o misurando un marker di infiammazione retto come calprotectina fecale. infiammazione retto è caratteristico dei pazienti affetti da malattia infiammatoria intestinale, per esempio morbo di Crohn o colite ulcerosa.
Come dimostrato negli esempi, metodi qui descritti sono particolarmente efficaci nei soggetti con infiammazione colorettale. In un modello di infiammazione intestinale, un agonista HGF-MET efficacemente ridotto sia il carico tumorale e la fibrosi del colon-retto.
Pertanto, in forme di realizzazione di tutti gli aspetti dei metodi rivendicati, il soggetto è stato diagnosticato infiammazione colorettale prima della somministrazione dell'agonista HGF-MET. In certe realizzazioni, il soggetto ha malattia infiammatoria intestinale (IBD), per esempio morbo di Crohn o colite ulcerosa.
Somministrazione
Si comprenderà che, come qui usato, la somministrazione di un agonista HGF-MET (per esempio un anticorpo agonista anti-MET) ad un soggetto si riferisce alla somministrazione di una quantità efficace del agonista.
In alcune forme di realizzazione, l'agonista HGF-MET viene somministrato alla dose nell'intervallo da circa 0,1 mg / kg a circa 10 mg / kg per dose. In alcune forme di realizzazione, l'agonista HGF-MET viene somministrato in una dose compresa tra 0,5 mg / kg a circa 10 mg / kg. Cioè, una dose di circa 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 mg / kg. In certe forme di realizzazione preferite, l'agonista HGF-MET viene somministrato alla dose nell'intervallo da circa 1 mg / kg a circa 5 mg / kg. In certe forme di realizzazione preferite, l'agonista HGF-MET viene somministrato alla dose di 1 mg / kg o 5 mg / kg.
percorsi adatti per la somministrazione dell'agonista HGF-MET (per esempio un anticorpo agonista anti-MET) ad un soggetto sarebbe familiare all'esperto. Preferibilmente l'agonista MET viene somministrata per via parenterale. In certe forme di realizzazione preferite, l'agonista HGF-MET viene somministrato per via sottocutanea (sc), per via endovenosa (iv), intradermica (id), intramuscolare (im) o intraperitoneale (ip). In certe forme di realizzazione preferite, l'agonista HGF-MET è un anticorpo agonista MET e viene somministrato per via endovenosa.
L'agonista HGF-MET (ad esempio anticorpo agonista anti-MET) può essere somministrato secondo un regime che mantiene un livello efficace dell'agonista nel soggetto. La persona esperta è a conoscenza idonei regimi di dosaggio. Ad esempio, in alcune forme di realizzazione, l'agonista HGF-MET (es MET agonista anticorpo) viene somministrato secondo un regime di dosaggio di almeno una volta alla settimana - cioè, una dose viene somministrata all'incirca ogni 7 giorni o più frequentemente. In alcune forme di realizzazione, l'agonista HGF-MET (es MET agonista anticorpo) viene somministrata 1-3 volte alla settimana (ad esempio 1, 2 o 3 volte a settimana). In certe forme di realizzazione preferite, l'agonista HGF-MET (es MET agonista anticorpo) viene somministrato due volte a settimana. In certe forme di realizzazione preferite, l'agonista HGF-MET è un anticorpo agonista MET e viene somministrato una volta alla settimana o due volte alla settimana.
Per i metodi qui descritti, l'agonista HGF-MET (es MET agonista anticorpo) viene somministrato per un periodo sufficiente ad ottenere un trattamento efficace. L'esperto è in grado di determinare il periodo di trattamento necessari per ogni singolo paziente. In alcune forme di realizzazione, l'agonista HGF-MET (ad esempio un anticorpo agonista MET) viene somministrato per un periodo di trattamento di almeno 1 settimana. In alcune forme di realizzazione, l'agonista HGF-MET (ad esempio un anticorpo agonista MET) viene somministrato per un periodo di trattamento di almeno 2 settimane, almeno 3 settimane o almeno 4 settimane. In alcune forme di realizzazione, l'agonista HGF-MET (ad esempio un anticorpo agonista MET) viene somministrato per un periodo di trattamento di almeno 1 mese, almeno 2 mesi o almeno 3 mesi. In certe forme di realizzazione preferite, l'agonista HGF-MET è un anticorpo agonista MET e viene somministrato per un periodo di trattamento di 3 mesi.
Si apprezzerà che l'agonista HGF-MET (ad esempio un anticorpo agonista MET) può essere somministrato secondo una qualsiasi combinazione delle dosi descritte, regimi di dosaggio e periodi di trattamento. Ad esempio, a certe forme di realizzazione, l'agonista HGF-MET (ad esempio un anticorpo agonista MET) può essere somministrato secondo un regime di dosaggio di due volte a settimana, ad una dose da 1mg / kg a 5 mg / kg per un periodo di almeno 3 mesi. Altre forme di realizzazione dei metodi includono esplicitamente altre combinazioni delle dosi recitate, regimi di dosaggio e periodi di trattamento.
HGF-MET agonisti
Si è dimostrato negli esempi di seguito che un agonista HGF-Met tratta efficacemente il cancro, in particolare il cancro del colon-retto. E 'inoltre dimostrato che un agonista HGF-Met tratta efficacemente la fibrosi del colon-retto. Pertanto, in tutti gli aspetti dell'invenzione, un agonista HGF-MET deve essere somministrato ad un soggetto o paziente per trattare la condizione indicata (cioè cancro (ad esempio cancro colorettale) o fibrosi colorettale). “HGF-MET agonisti” e “MET agonisti” sono usati in modo intercambiabile per riferirsi agli agenti non native che promuovono segnalazione tramite la proteina MET - vale a dire gli agenti diversi da HGF che legano il MET e aumentare la segnalazione MET. Tali agenti possono essere piccole molecole, proteine quali anticorpi o frammenti di legame di antigene, aptameri o proteine di fusione di legame. Un esempio particolare di un agonista MET è un anticorpo agonista anti-MET.
attività agonista sul legame di MET dagli agonisti MET qui descritti è indicato da molecolare e / o le risposte cellulari che (almeno parzialmente) imitano le risposte molecolari e cellulari indotte dal legame HGF-MET.
Metodi per la determinazione del MET agonismo secondo l'invenzione, ad esempio anticorpi agonisti MET e frammenti leganti antigene, sarebbero familiare all'esperto. Ad esempio, MET agonismo può essere indicata da risposte molecolari come fosforilazione del recettore MET e / o risposte cellulari, per esempio quelli rilevabili in una cella di diffusione test, un test anti-apoptosi e / o un saggio morfogenesi di ramificazione.
agonismo MET può essere determinata dal livello di fosforilazione del recettore MET dopo il legame. In questo contesto, un MET anticorpo agonista o Frammento Fab, per esempio, provoca autofosforilazione del MET in assenza di recettore-ligando - cioè legame del frammento di anticorpo o antigene vincolante ai risultati MET in fosforilazione di MET l'assenza di HGF. La fosforilazione di MET può essere determinata mediante saggi noti nella tecnica, ad esempio Western Blotting o fosfo-MET ELISA (come descritto in Basilico et al., J Clin Invest.124, 3172-3186, 2014, qui incorporato per riferimento).
MET agonismo può alternativamente essere misurata mediante l'induzione di risposte cellulari HGF-like. agonismo MET può essere misurata mediante saggi come una cellula dispersione test, un test anti-apoptosi e / o un saggio morfogenesi di ramificazione. In questo contesto, un agonista MET, ad esempio un anticorpo o suo frammento di legame all'antigene, induce una risposta in saggi cellulari come questi che assomiglia (almeno parzialmente) la risposta osservata a seguito dell'esposizione ad HGF.
Ad esempio, un agonista MET (per esempio un anticorpo agonista MET) può aumentare dispersione cellulare in risposta all'anticorpo rispetto alle cellule esposte ad un anticorpo di controllo (ad esempio IgG1).
A titolo di ulteriore esempio, un agonista MET (per esempio un anticorpo agonista MET) può presentare una potenza protettivo contro l'apoptosi indotta da farmaci con un'EC50 inferiore a 32 nM. A titolo di ulteriore esempio, un agonista MET (per esempio un anticorpo agonista MET) possono presentare una vitalità cellulare Emax superiore al 20% rispetto alle cellule non trattate.
A titolo di ulteriore esempio, un agonista MET (per esempio un anticorpo agonista MET) può aumentare il numero di sportelli ogni sferoide in preparati sferoidali cellule esposte al frammento di anticorpo o antigene vincolante.
Si preferisce che gli agonisti MET impiegati secondo l'invenzione promuovere MET segnalazione ad una grandezza di almeno il 70% del ligando naturale, HGF - cioè che gli agonisti sono “agonisti pieni”. In alcune forme di realizzazione, gli agonisti MET promuovono la segnalazione ad una grandezza di almeno 80%, opzionalmente almeno 85%, almeno il 90%, almeno il 95% o almeno 96%, almeno il 97%, almeno il 98%, a almeno il 99% o almeno il 100% di HGF.
In alcune forme di realizzazione, se il MET agonismo viene determinato usando un saggio di fosforilazione, l'agonista MET, ad esempio un anticorpo MET, presenta una potenza di MET con un'EC50 di <1nM. In alcune forme di realizzazione, l'agonista MET, ad esempio un anticorpo MET, mostra una potenza di MET agonismo di un Emax di almeno 80% (in percentuale massima attivazione HGF-indotta).
In alcune forme di realizzazione, se MET agonismo è misurata in un saggio di dispersione cellulare, l'agonista MET, ad esempio un anticorpo o MET Frammento Fab, induce un aumento della dispersione cellulare per almeno equivalente a 0,1 nM omologa HGF quando la concentrazione di anticorpi è 0,1- 1 nm.
In alcune forme di realizzazione, se il MET agonismo è misurata in un saggio anti-apoptosi, l'agonista MET (per esempio un anticorpo o suo frammento MET) presenta un'EC50 non più di 1.1x quella di HGF. In alcune forme di realizzazione, se il MET agonismo viene misurata in un test antiapoptosi, l'agonista MET (per esempio, un anticorpo o suo frammento MET) presenta una vitalità cellulare Emax superiore al 90% a quella osservata per HGF.
In alcune forme di realizzazione, se il MET agonismo è misurata in un saggio di morfogenesi di ramificazione, le cellule trattate con l'agonista MET (ad esempio un anticorpo o MET Frammento Fab) mostrano più del 90% del numero di sportelli ogni sferoide indotto dalla stessa (non zero) concentrazione di HGF.
agonisti HGF-Met particolarmente preferiti in tutti gli aspetti della presente invenzione sono MET-anticorpi anti agonisti, anche qui chiamato “MET anticorpi agonisti”, “anticorpi agonisti” e varianti grammaticali loro. In altre parole, MET anticorpi agonisti (o frammenti di legame antigene loro) per l'uso secondo l'invenzione legano MET e favorire segnalazione cellulare mediante MET.
Come dimostrato negli esempi, 71D6 è un anticorpo agonista del MET, che tratta in modo efficace il cancro (in particolare cancro del colon-retto) e la fibrosi del colon-retto.71D6 lega un epitopo sul dominio SEMA del MET, in particolare un epitopo sulla lama 4-5 del SEMA β-elica. agonisti MET vincolanti un epitopo sul dominio SEMA del MET, in particolare lama 4-5 del SEMA β-elica sono stati dunque dimostrato di portare a un trattamento efficace del cancro (retto). Anticorpo 71G2 ha effetti simili a 71D6 e si lega anche il dominio SEMA del MET, in particolare lama 4-5 del SEMA βelica.
Così, in certe forme di realizzazione viene fornito un metodo di trattamento del cancro (ad esempio cancro colorettale), o un metodo di trattamento della fibrosi colorettale, comprendente la somministrazione di un anticorpo agonista MET o dell'antigene suo frammento di legame, in cui il frammento di anticorpo o antigene legante si lega un epitopo in il dominio SEMA di MET. In alcune forme di realizzazione preferite, gli anticorpi o loro frammenti lega un epitopo situato su una lama del SEMA β-elica. In alcune forme di realizzazione, l'epitopo è situato sulla lama 4 o 5 di SEMA β-elica. In certe realizzazioni preferite, il frammento di anticorpo o antigene legante si lega un epitopo situato tra amminoacidi 314-372 del MET.
Come mostrato negli esempi, MET anticorpi agonisti legano il dominio SEMA del MET, compresi 71D6 e 71G2, hanno dimostrato di legarsi a un epitopo sul MET che comprende residui Ile367 e Asp371 residuo. La mutazione in uno di questi residui altera legame degli anticorpi al MET, con la mutazione di entrambi i residui completamente abroga vincolante.
Pertanto, in certe forme di realizzazione preferite viene fornito un metodo di trattamento del cancro (ad esempio cancro colorettale), o un metodo di trattamento della fibrosi colorettale, comprendente la somministrazione di un anticorpo agonista MET o dell'antigene suo frammento di legame, in cui il frammento di anticorpo o antigene vincolante riconosce un epitopo comprendente il residuo amminoacidico Ile367. In certe forme di realizzazione preferite viene fornito un metodo di trattamento del cancro (ad esempio cancro colorettale), o un metodo di trattamento della fibrosi colorettale, comprendente la somministrazione di un anticorpo agonista MET o dell'antigene suo frammento di legame, in cui il frammento di anticorpo o antigene vincolante riconosce un epitopo comprendente l'ammino acido residueAsp371.
In certe realizzazioni preferite, il frammento di anticorpo o antigene legante si lega un epitopo comprendente i residui amminoacidici Ile367 e Asp372 del MET.
Nonché MET anticorpi agonisti di legame dominio SEMA, anche qui descritti sono anticorpi agonisti vincolanti altri domini MET. Ad esempio, 71G3 si lega un epitopo sul dominio PSI di MET. Come dimostrato negli esempi, 71G3 anticorpo evidenzia una potenza simile a 71D6 per ridurre l'infiammazione intestinale.71G3 sarà quindi anche essere efficace nel trattamento del cancro colorettale in un modo simile a 71D6. Analogamente, 71G3 sarà anche efficace nel trattamento della fibrosi retto in un modo simile a 71D6.
Così, in certe forme di realizzazione viene fornito un metodo di trattamento del cancro (ad esempio cancro colorettale), o un metodo di trattamento della fibrosi colorettale, comprendente la somministrazione di un anticorpo agonista MET o dell'antigene suo frammento di legame, in cui il frammento di anticorpo o antigene legante si lega un epitopo in il dominio PSI di MET. In certe realizzazioni preferite, il frammento di anticorpo o antigene legante si lega un epitopo situato tra amminoacidi 546 e 562 del MET.
Come mostrato negli esempi, MET anticorpi agonisti di legame dominio PSI del MET, compresi 71G3, hanno dimostrato di legarsi a un epitopo sul MET che comprende residui Thr555. Mutazione a questo residuo completamente abolita legame degli anticorpi agonisti PSI vincolante per il MET.
Pertanto, in certe forme di realizzazione preferite viene fornito un metodo di trattamento del cancro (ad esempio cancro colorettale), o un metodo di trattamento della fibrosi colorettale, comprendente la somministrazione di un anticorpo agonista MET o dell'antigene suo frammento di legame, in cui il frammento di anticorpo o antigene vincolante riconosce un epitopo comprendente il residuo amminoacidico Thr555.
Esempi di anticorpi agonisti MET particolarmente adatti per l'uso nel trattamento del cancro (ad esempio cancro colorettale), o per uso nel trattamento della fibrosi colorettale, sono quelli aventi una combinazione di CDR corrispondenti ai CDR di un anticorpo anti-MET qui descritto. Pertanto, in alcune forme di realizzazione, il frammento di anticorpo o antigene legante comprende una combinazione di VH e VL CDR sequenze corrispondenti ad una combinazione di VH CDR da un anticorpo agonista MET descritta nella Tabella 3 ed il corrispondente combinazione di CDR VL per lo stesso anticorpo in Tabella 4.
In alcune tali forme di realizzazione, il frammento di anticorpo o antigene legante comprende una combinazione di CDR corrispondono a una combinazione di VH CDR di anticorpi MET agonista descritta nella Tabella 3 e la corrispondente combinazione di CDR VL per lo stesso anticorpo nella Tabella 4, e avente inoltre domini VH e VL con almeno il 90%, opzionalmente almeno 95%, opzionalmente almeno 99%, preferibilmente da 100% di identità di sequenza con le corrispondenti sequenze VH e VL dell'anticorpo descritto nella Tabella 6. per chiarire, in tali realizzazioni lo scarto in percentuale l'identità delle sequenze dominio VH e VL non è nelle regioni CDR.
Come dimostrato negli esempi, 71D6 è un anticorpo agonista del MET che è un “agonista completo” del MET. Cioè, il legame di 71D6 al MET, la risposta di segnalazione è simile o addirittura supera la risposta al legame del ligando nativo HGF.71 D6 è dimostrato di trattare efficacemente (colonretto), il cancro. Pertanto in alcune forme di realizzazione preferite viene fornito un metodo di trattamento del cancro (ad esempio cancro colorettale) comprendente la somministrazione di un agonista HGF-MET che è un agonista completo - cioè, un agonista che in seguito al legame promuove MET segnalazione in misura di almeno il 70% di MET segnalazione dopo legame HGF. Esempi di misura MET agonismo e esempi degli effetti di agonisti completi sono già stati descritti nella presente.
Esempi di MET agonisti completi, come anticorpi anti-MET che sono agonisti completi includono 71D6 e 71G2, come dimostrato negli esempi. Pertanto in forme di realizzazione particolarmente preferite viene fornito un metodo di trattamento del cancro (ad esempio cancro colorettale), o un metodo di trattamento della fibrosi colorettale, comprendente la somministrazione di un anticorpo agonista MET o Frammento Fab esso che è un agonista completo del MET. In preferite tali forme di realizzazione, l'anticorpo o suo frammento comprende una combinazione di CDR aventi le corrispondenti sequenze di CDR di anticorpi 71D6 (SEQ ID NO: 30, 32, 34, 107, 109, e 111), di anticorpi 71G2 (SEQ ID NO: 44 , 46, 48, 121, 123, e 125), o di anticorpi 71G3 (SEQ ID NO: 9, 11, 13, 86, 88, e 90).
Nelle realizzazioni preferite di tutti gli aspetti, l'agonista MET è un anticorpo agonista MET o dell'antigene suo frammento di legame avente HCDR1 di [71D6] SEQ ID NO: 30, HCDR2 di SEQ ID NO: 32, HCDR3 di SEQ ID NO: 34, LCDR1 di SEQ ID NO: 107, LCDR2 di SEQ ID NO: 109, e LCDR3 di SEQ ID NO: 111. In tali forme di realizzazione preferite, l'anticorpo o suo frammento di legame comprende antigene: un dominio VH comprendente SEQ ID NO: 163 o una sequenza di almeno 90% identica ad essa, opzionalmente almeno il 95%, almeno il 98% o almeno il 99% identico ad esso; e un dominio VL comprendente SEQ ID NO: 164 o una sequenza di almeno il 95% ad essa eventualmente almeno 98% o almeno il 99% identica ad essa. A titolo di chiarimento, in tali forme di realizzazione lo scarto percentuale identità delle sequenze di dominio VH e VL non è nelle regioni CDR.
MET anticorpi agonisti per uso come qui descritto può assumere varie forme di realizzazione differenti in cui sono presenti sia un dominio VH e un dominio VL. Il termine "anticorpo" qui viene usato nel senso più ampio e comprende, ma non è limitato a, anticorpi monoclonali (comprese piena lunghezza anticorpi monoclonali), anticorpi policlonali, anticorpi multispecifici (ad esempio, anticorpi bispecifici), fintanto che mostrano l'appropriato specificità immunologica per una proteina MET umano e per un mouse MET proteine. Il termine "anticorpo monoclonale" come qui utilizzato si riferisce ad un anticorpo ottenuto da una popolazione di anticorpi sostanzialmente omogenea, cioè i singoli anticorpi comprendenti la popolazione sono identici eccetto per possibili mutazioni presenti in natura che possono essere presenti in quantità minori. Gli anticorpi monoclonali sono altamente specifici, essendo diretti contro un singolo sito antigenico. Inoltre, a differenza di convenzionali (policlonali preparati) anticorpi che tipicamente includono diversi anticorpi diretti contro determinanti differenti epitopi () sul antigene, ciascun anticorpo monoclonale è diretto contro un singolo determinante o epitopo dell'antigene.
"Frammenti anticorpali" comprendono una porzione di un anticorpo piena lunghezza, vincolante generalmente l'antigene o dominio variabile della stessa. Esempi di frammenti anticorpali includono Fab, Fab '(ab F') 2, bi-specifico Fab di, e frammenti Fv, diacorpi, anticorpi lineari, a catena singola molecole anticorpali, una singola catena frammento variabile (scFv) e anticorpi multispecifici formati da frammenti di anticorpo (vedi Holliger e Hudson, Nature Biotechnol.23: 1126-1136, 2005, i cui contenuti sono qui incorporati per riferimento).
Nelle realizzazioni preferite di tutti gli aspetti qui forniti, l'anticorpo agonista MET o frammento legante antigene è bivalente.
In forme di realizzazione non limitativi, gli anticorpi MET qui fornite possono comprendere domini CH1 e / o domini CL, la sequenza amminoacidica della quale è completamente o sostanzialmente umano. Pertanto, uno o più oppure una combinazione del dominio CH1, cerniera regione, dominio CH2, CH3 dominio e il dominio CL (e dominio CH4 se presente) può essere completamente o sostanzialmente umano rispetto alla sua sequenza amminoacidica. Tali anticorpi possono essere di qualsiasi isotipo umano, per esempio IgG1 o IgG4.
Vantaggiosamente, il dominio CH1, cerniera regione, dominio CH2, CH3 dominio e il dominio CL (e dominio CH4 se presenti) possono tutti essere completamente o sostanzialmente sequenza amminoacidica umano. Nel contesto della regione costante di un anticorpo umanizzato o chimerico, o un frammento di anticorpo, il termine "sostanzialmente umano" si riferisce ad un amminoacido di identità di sequenza di almeno il 90%, o almeno 92%, o almeno 95%, o almeno il 97%, o almeno 99% con una regione costante umana. Il termine “sequenza amminoacidica umano” in questo contesto si riferisce ad una sequenza di amminoacidi che è codificata da un gene di immunoglobulina umana, che include linea germinale, riarrangiati e geni mutati somaticamente. Tali anticorpi possono essere di qualsiasi isotipo umano, con IgG4 umana e IgG1 essendo particolarmente preferiti.
anticorpi agonisti MET possono anche comprendere domini costanti di sequenza “umano” che sono stati modificati, da uno o ulteriori aggiunte amminoacidiche, delezioni o sostituzioni rispetto alla sequenza umana, eccetto quelle forme di realizzazione in cui la presenza di una regione cerniera “pienamente umana” è espressamente richiesto. La presenza di una regione cerniera “pienamente umana” nelle anticorpi MET dei dell'invenzione può essere vantaggioso sia per minimizzare immunogenicità e per ottimizzare la stabilità dell'anticorpo.
Gli anticorpi agonisti MET possono essere di qualsiasi isotipo, per esempio IgA, IgD, IgE IgG, IgM o. In forme di realizzazione preferite, gli anticorpi sono di tipo IgG, per esempio IgG1, IgG2a e b, IgG3 o IgG4. IgG1 e IgG4 sono particolarmente preferiti. All'interno di ciascuna di queste sottoclassi è consentito di effettuare sostituzioni di uno o più amminoacidi, inserzioni o delezioni entro la porzione Fc, o per effettuare altre modifiche strutturali, ad esempio per aumentare o ridurre la funzionalità Fcdipendenti.
In forme di realizzazione non limitativi, si contempla che una o più sostituzioni amminoacidiche, inserzioni o delezioni possono essere apportate all'interno della regione costante della pesante e / o la catena leggera, in particolare all'interno della regione Fc. sostituzioni amminoacidiche possono provocare sostituzione dell'acido ammino sostituito con un diverso amminoacido naturale, o con un amminoacido non naturale o modificati. Sono ammessi anche altre modifiche strutturali, quali ad esempio variazioni di schema di glicosilazione (ad esempio mediante aggiunta o delezione di N- o siti di glicosilazione O-linked). A seconda della destinazione d'uso dell'anticorpo MET, può essere desiderabile modificare l'anticorpo dell'invenzione rispetto alle sue proprietà di legame ai recettori Fc, ad esempio per modulare la funzione effettrice.
In alcune forme di realizzazione, gli anticorpi MET possono comprendere una regione Fc di un dato anticorpo isotipo, per esempio IgG1 umana, che viene modificato al fine di ridurre o sostanzialmente eliminare una o più funzioni effettrici anticorpali naturalmente associati a tale isotipo di anticorpo. In forme di realizzazione non limitativi, l'anticorpo MET può essere sostanzialmente privo di qualsiasi funzione anticorpo effettrici. In questo contesto, “funzioni effettrici degli anticorpi” includono uno o più o tutti anticorpo-dipendente citotossicità cellulare (ADCC), complemento-citotossicità (CDC) e fagocitosi cellulare anticorpo-dipendente (ADCP).
La sequenza aminoacidica della porzione Fc dell'anticorpo MET può contenere uno o più mutazioni, quali sostituzioni amminoacidiche, delezioni o inserzioni, che hanno l'effetto di ridurre uno o più funzioni anticorpo effettrici (in confronto ad un anticorpo controparte wild type non avendo detto mutazione). Diversi tali mutazioni sono noti nel campo dell'ingegneria anticorpale. Esempi limitativi non adatti per l'inclusione nelle anticorpi MET qui descritti, comprendono i seguenti mutazioni nel dominio Fc di IgG4 umana o IgG1 umana: N297A, N297Q, LALA (L234A, L235A), AAA (L234A, L235A, G237A) o (residui di aminoacidi numerazione in base al sistema di numerazione UE nel IgG1 umana) D265A.
In certe forme di realizzazione di tutti gli aspetti dell'invenzione, pertanto, l'anticorpo agonista anti-MET è un anticorpo agonista sia MET umano e topo MET.
composizioni farmaceutiche
anche fornito secondo l'invenzione sono composizioni farmaceutiche per l'uso nei metodi descritti qui. Quindi in un ulteriore aspetto dell'invenzione viene fornita una composizione farmaceutica comprendente un agonista HGF-MET, ad esempio un anticorpo agonista anti-MET, e un eccipiente farmaceuticamente accettabile o veicolante per uso in un metodo secondo l'invenzione. Opportuni veicoli ed eccipienti farmaceuticamente accettabili sarebbero familiare all'esperto. Esempi di veicoli farmaceuticamente accettabili ed eccipienti adatti per l'inclusione nelle composizioni farmaceutiche dell'invenzione includono citrato di sodio, glicina, polisorbato (ad esempio polisorbato 80) e soluzione salina.
In alcune forme di realizzazione, l'agonista MET, ad esempio anti-MET anticorpo agonista, viene somministrata al soggetto parenterale, preferibilmente per via endovenosa (iv). In alcune forme di realizzazione l'agonista MET, ad esempio anti-MET anticorpo agonista, viene somministrato come infusione endovenosa continua fino al raggiungimento della dose desiderata.
ESEMPI
L'invenzione verrà ulteriormente compresa facendo riferimento ai seguenti esempi non limitativi sperimentali.
Esempio 1: Generazione di ant-Met anticorpi agonisti - Immunizzazione di lama
Immunizzazioni di lama e la raccolta di linfociti del sangue periferico (PBL) e la successiva estrazione di RNA e l'amplificazione di frammenti di anticorpo sono state eseguite come descritto (De Haard et al, J. Bact 187:..4531-4541, 2005). Due lama adulti (lama an) sono stati immunizzati mediante iniezione intramuscolare di una proteina chimerica consistente del dominio extracellulare (ECD) di umana MET fuso alla porzione Fc di IgG1 umana (MET-Fc, R & D Systems). Ciascuna lama ricevuto un'iniezione a settimana per sei settimane, per un totale di sei iniezioni. Ogni iniezione consisteva in 0,2 mg di proteina in adiuvante incompleto di Freund nel collo divisa in due punti.
I campioni di sangue da 10 ml sono stati raccolti prima e dopo la vaccinazione per studiare la risposta immunitaria. Circa una settimana dopo l'ultima immunizzazione, 400 ml di sangue sono stati raccolti e PBL sono stati ottenuti con il metodo Ficoll-Paque. L'RNA totale è estratto con il metodo del tiocianato fenolo-guanidina (Chomczynski et al, Anal Biochem 162:...156-159, 1987) e utilizzato come modello per la sintesi del DNA casuale usando il kit SuperScriptTM III First-Strand Synthesis System (Life Technologies ). Amplificazione dei cDNA codificanti regioni VH-CH1 dei domini lama IgG1 e VL-CL (K e λ) ed subcloning nella PCB3 fagemide vettore è stata eseguita come descritto (de Haard et al, J Biol Chem 274:..18.218-18.230 , 1999). Il E. coli ceppo TG1 (Olanda Culture Collection di batteri) è stata trasformata utilizzando fagimidi ricombinanti per generare 4 diverse librerie fagiche Fab esprimenti (una lambda ed una biblioteca κ per ogni lama immunizzati). La diversità è nel range di 108-109.
La risposta immunitaria all'antigene è stata studiata mediante ELISA. A tal fine, abbiamo ottenuto i ECDs di MET umana (UniProtKB # P08581; aa 1-932) e del mouse del MET (UniProtKB # P16056.1; aa 1-931) mediante tecniche di ingegneria proteica standard. Umano o il mouse MET ECD proteina ricombinante è stato immobilizzato in fase solida (100 ng / pozzetto in una piastra a 96 pozzetti) ed esposto a diluizioni seriali del siero di lama prima (giorno 0) e dopo (giorno 45) immunizzazione. Binding è stato rivelato utilizzando un IgG1 di topo anti-lama (Daley et al., Clin. Vaccino Immunol.12, 2005) e un anticorpo anti-topo HRP-coniugato asino (Jackson Laboratories). Entrambi i lama visualizzate una risposta immunitaria contro umana MET ECD. In linea con l'idea che la porzione extracellulare del MET umana mostra 87% di omologia con il suo ortologo mouse, con una buona dose di cross-reattività è stata osservata anche con mouse MET ECD.
Esempio 2: selezioni e proiezioni di Fab legame entrambi di topo MET e umana
Fab-fagi che esprimono dalle librerie sopra descritte sono state prodotte secondo protocolli standard di phage display. Per la selezione, fagi sono stati adsorbiti immobilizzato ricombinante umano MET ECD, lavate, e quindi eluiti con tripsina. Dopo due cicli di selezione con umani MET ECD, altri due cicli sono stati eseguiti nello stesso modo utilizzando il mouse MET ECD. In parallelo, abbiamo anche scelto fagi alternando un ciclo MET ECD umano con un mouse MET ciclo ECD, per un totale di quattro cicli. Fagi selezionati dai due approcci sono stati raggruppati insieme e poi utilizzati per infettare TG1 E. coli. colonie individuali sono stati isolati e secrezione di Fab è stata indotta mediante IPTG (Fermentas). La frazione periplasmic Fab contenente dei batteri è stato raccolto e testato per la sua capacità di legare uomo e topo MET ECD di Surface Plasmon Resonance (SPR). Umano o il mouse MET ECD è stato immobilizzato su un chip CM-5 con accoppiamento ammina in tampone acetato di sodio (GE Healthcare). Gli estratti periplasmatiche Fab contenenti stati caricati in un apparato BIACORE 3000 (GE Healthcare) con una portata di 30 microlitri / min. I Fab off-rate (Koff) sono stati misurati nel corso di un periodo di due minuti. Legame di Fab di uomo e topo MET è stato ulteriormente caratterizzato mediante ELISA utilizzando il MET ECD in fase solida ed estratto grezzo periplasmico in soluzione. Poiché Fab sono progettati con una bandiera MYC, vincolante, è stato rivelato utilizzando HRP-coniugati anticorpi anti-MYC (Imtec Diagnostics). I Fab off-rate (Koff) sono stati misurati nel corso di un periodo di due minuti. Legame di Fab di uomo e topo MET è stato ulteriormente caratterizzato mediante ELISA utilizzando il MET ECD in fase solida ed estratto grezzo periplasmico in soluzione. Poiché Fab sono progettati con una bandiera MYC, vincolante, è stato rivelato utilizzando HRP-coniugati anticorpi anti-MYC (Imtec Diagnostics). I Fab off-rate (Koff) sono stati misurati nel corso di un periodo di due minuti. Legame di Fab di uomo e topo MET è stato ulteriormente caratterizzato mediante ELISA utilizzando il MET ECD in fase solida ed estratto grezzo periplasmico in soluzione. Poiché Fab sono progettati con una bandiera MYC, vincolante, è stato rivelato utilizzando HRP-coniugati anticorpi anti-MYC (Imtec Diagnostics).
FAB che legavano sia umana e topo MET sia SPR ed ELISA sono stati selezionati ed i fagi corrispondenti sono stati sequenziati (LGC Genomics). sequenze Fab cross-reattivi sono stati divisi in famiglie basate su VH CDR3 lunghezza della sequenza e il contenuto. famiglie VH hanno ricevuto un numero interno non basata su IMTG (Sistema Immunogenetics informazioni International) nomenclatura. Complessivamente, potremmo identificare 11 differenti umano / topo Fabs crossreattivi appartenenti a 8 famiglie VH. Le sequenze di CDR e FR di catena pesante regioni variabili sono mostrati in Tabella 3. Le sequenze di CDR e FR di catena leggera regioni variabili sono mostrati in Tabella 4. Le sequenze complete di amminoacidi di catena pesante e catena leggera regioni variabili sono riportati nella Tabella 5. Le sequenze di DNA interi di catena pesante e catena leggera regioni variabili sono mostrati nella Tabella 6.
Tabella 3: regioni quadro e sequenze di CDR per domini VH di Fab di legame sia umano e topo MET.
Tabella 4: regioni quadro e sequenze di CDR per domini VL di Fab di legame sia umano e topo MET.
Tabella 5: Variabile dominio amino sequenze di acidi di Fabs vincolanti per entrambi umano e topo MET.
Tabella 6: Variabile sequenze nucleotidiche di dominio Fab di legame sia umano e topo MET.
Le varie famiglie Fab e la loro capacità di legare il MET uomo e topo sono riportati nella Tabella 7.
Tabella 7: Fab di legame sia MET umana (hMET) e mouse MET (mMET).Fab sono raggruppati in famiglie in base alla loro successione VH CDR3. Legame di Fab umana e topo MET ECD è stato determinato Surface Plasmon Resonance (SPR) e mediante ELISA. I valori rappresentano la SPR koff (s-1). valori ELISA rappresentano la densità ottica (OD) a 450 nm (AU, unità arbitrarie). Sia SPR ed ELISA sono state eseguite utilizzando estratti periplasmatiche grezzi. concentrazione Fab nell'estratto non è stato determinato. I valori sono la media di tre misurazioni indipendenti.
Esempio 3: Chimerization di Fab in mAbs
I cDNA codificanti VH e VL (κ o lambda) domini di frammenti Fab selezionati sono stati progettati in due vettori di espressione di mammifero pupe separato (U-proteina Express) contenenti i cDNA codificanti CH1, CH2 e CH3 di IgG1 umana o CL umano (κ o λ), rispettivamente.
Produzione (mediante trasfezione transitoria di cellule di mammiferi) e purificazione (da proteina A cromatografia di affinità) dei risultanti chimerici molecole IgG1 di lama-umano è stata esternalizzata a U-proteina Express. Legame di anticorpi monoclonali chimerici al MET è stato determinato mediante ELISA usando hMET o mMET ECD in fase solida e concentrazioni crescenti di anticorpi (0-20 nM) in soluzione. Legame è stato rivelato utilizzando HRP-coniugati anticorpi Fc anti-umane (Jackson Immuno Research Laboratories). Questa analisi ha rivelato che tutti gli anticorpi chimerici lama-umano legati alla umano e topo incontrato con affinità picomolare, mostrando un'EC50 compresa tra 0,06 nM e 0,3 nM. Capacità di rilegatura (EMAX) varia da anticorpo all'anticorpo, forse a causa di esposizione epitopo parziale l'antigene immobilizzato, ma era simile nell'impostazione umano e topo.
Tabella 9: Il legame di anticorpi monoclonali chimerici di uomo e topo MET come determinato mediante ELISA usando immobilizzato MET ECD in fase solida e concentrazioni crescenti (0-20 nM) di anticorpi in soluzione.valori di EC50 sono espressi come nmol / L. I valori sono espressi come EMAX densità ottica (OD) a 450 nm (AU, unità arbitrarie).
Abbiamo anche analizzato se chimeriche di anticorpi anti-MET destinati a umana nativa e il mouse MET nelle cellule viventi. A tal fine, concentrazioni crescenti di anticorpi (0-100 nM) sono stati incubati con cellule di carcinoma polmonare umano A549 (American Type Culture Collection) o cellule precursori fegato di topo MLP29 (un dono del Prof. Enzo Medico, Università di Torino, Strada Provinciale 142 km 3,95, Candiolo, Torino, Italia;. Medico et al, Mol Biol cellulare 7, 495-504, 1996), che esprimono entrambi i livelli fisiologici di MET. legarsi alle cellule anticorpo è stato analizzato mediante citometria a flusso utilizzando anticorpi ficoeritrina-coniugato anti-umano IgG1 (eBioscience) e un analizzatore ciano ADP (Beckman Coulter). Come vincolante un controllo positivo per umano MET, abbiamo usato un mouse commerciale anticorpo anti-umano MET (R & D Systems) e gli anticorpi anti-topo IgG1 ficoeritrina-coniugato (eBioscience). Come controllo positivo per il mouse MET vincolante abbiamo usato una capra anti-topo commerciale MET anticorpo (R & D Systems) e gli anticorpi anti-capra IgG1 ficoeritrina coniugata (eBioscience). Tutti gli anticorpi visualizzati dose-dipendente legame ad entrambe le cellule umane e di topo con un'EC50 variabile tra 0,2 nM e 2,5 nM. Coerente con i dati ottenuti in ELISA, massimale vincolante (EMAX) varia a seconda delle anticorpo, ma era simile in cellule umane e murine. Questi risultati indicano che gli anticorpi chimerici lama-umano riconoscono MET legata alla membrana nella sua conformazione nativa sia in sistemi cellulari umani e di topo. Valori EC50 ed Emax sono mostrati nella Tabella 10. Tutti gli anticorpi visualizzati dose-dipendente legame ad entrambe le cellule umane e di topo con un'EC50 variabile tra 0,2 nM e 2,5 nM. Coerente con i dati ottenuti in ELISA, massimale vincolante (EMAX) varia a seconda delle anticorpo, ma era simile in cellule umane e murine. Questi risultati indicano che gli anticorpi chimerici lama-umano riconoscono MET legata alla membrana nella sua conformazione nativa sia in sistemi cellulari umani e di topo. Valori EC50 ed Emax sono mostrati nella Tabella 10. Tutti gli anticorpi visualizzati dose-dipendente legame ad entrambe le cellule umane e di topo con un'EC50 variabile tra 0,2 nM e 2,5 nM. Coerente con i dati ottenuti in ELISA, massimale vincolante (EMAX) varia a seconda delle anticorpo, ma era simile in cellule umane e murine. Questi risultati indicano che gli anticorpi chimerici lama-umano riconoscono MET legata alla membrana nella sua conformazione nativa sia in sistemi cellulari umani e di topo. Valori EC50 ed Emax sono mostrati nella Tabella 10. Questi risultati indicano che gli anticorpi chimerici lama-umano riconoscono MET legata alla membrana nella sua conformazione nativa sia in sistemi cellulari umani e di topo. Valori EC50 ed Emax sono mostrati nella Tabella 10. Questi risultati indicano che gli anticorpi chimerici lama-umano riconoscono MET legata alla membrana nella sua conformazione nativa sia in sistemi cellulari umani e di topo. Valori EC50 ed Emax sono mostrati nella Tabella 10.
Tabella 10: Il legame di anticorpi monoclonali chimerici alle cellule umane e di topo come determinato mediante citometria a flusso utilizzando concentrazioni crescenti (0-50 nM) di anticorpi.valori di EC50 sono espressi come nmol / L. I valori sono espressi come EMAX% rispetto ai controlli.
Esempio 4: recettore regioni responsabili per il legame dell'anticorpo
Per mappare le regioni recettore riconosciuti dagli anticorpi leganti sia umano e topo MET (qui di seguito denominato umano / topo equivalenti anticorpi anti-MET), abbiamo misurato la loro capacità di legarsi ad un pannello di proteine ingegnerizzate derivato da MET umano generato come descritto (Basilico et al, J. Biol. Chem.283, 21.267-21.227, 2008). Questo pannello comprende: l'intero MET ECD (Decoy MET); un MET ECD privi domini IPT 3 e 4 (SEMA-PSI-IPT 1-2); un IPT MET ECD carente Domini 1-4 (SEMA-PSI); il dominio SEMA isolato (SEMA); un frammento contenente domini IPT 3 e 4 (IPT 3-4). proteine ingegnerizzate MET sono stati immobilizzati in fase solida ed esposte a concentrazioni crescenti di anticorpi chimerici (0-50 nM) in soluzione. Legame è stato rivelato utilizzando HRP-coniugati anticorpi Fc anti-umane (Jackson Immuno Research Laboratories). Come mostrato in Tabella 11, questa analisi ha rivelato che 7 mAbs riconoscono un epitopo all'interno della SEMA dominio, mentre gli altri 4 riconoscono un epitopo all'interno del dominio PSI.
Tabella 11: Il legame di umano / topo equivalenti anticorpi anti-MET al pannello di MET mutanti di delezione. Il dominio legame MET responsabile per l'anticorpo è indicato nell'ultima colonna a destra.
Per mappare più finemente le regioni di MET responsabili per il legame dell'anticorpo, abbiamo sfruttato l'assenza di reattività crociata tra i nostri anticorpi e lama MET (dell'organismo usati per generare tali immunoglobuline). A tal fine, abbiamo generato una serie di lama-umana e umanolama proteine chimeriche MET che copre l'intero MET ECD come descritto (Basilico et al., J Clin Invest. 124, 3172-3186, 2014). Chimere sono stati immobilizzati in fase solida e quindi esposte a concentrazioni crescenti di anticorpi monoclonali (0-20 nM) in soluzione. Legame è stato rivelato utilizzando HRP-coniugati anticorpi Fc anti-umane (Jackson Immuno Research Laboratories). Questa analisi ha rivelato che 5 mAbs SEMA-binding (71D6, 71C3, 71D4 con, 71A3, 71G2) riconoscono un epitopo localizzato tra aa 314-372 del MET umana, una regione che corrisponde alle lame 4-5 della β- SEMA 7-pale elica (Stamos et al., EMBO J.23, 2325-2335, 2004). Le altre 2 mAbs SEMA poroso (74C8, 72F8) riconoscono un epitopo localizzato tra aa 123-223 e 224-311, rispettivamente, corrispondenti alle pale 1-3 e 1-4 del SEMA β-elica. I mAbs PSI-binding (76H10, 71G3, 76G7, 71G12) non sembravano visualizzare qualsiasi legame significativo per una delle due chimere PSI. Alla luce dei risultati presentati nella tabella 11, questi anticorpi probabilmente riconoscono un epitopo localizzato tra AA 546 e 562 del MET umana. Questi risultati sono riassunti nella Tabella 12. Alla luce dei risultati presentati nella tabella 11, questi anticorpi probabilmente riconoscono un epitopo localizzato tra AA 546 e 562 del MET umana. Questi risultati sono riassunti nella Tabella 12. Alla luce dei risultati presentati nella tabella 11, questi anticorpi probabilmente riconoscono un epitopo localizzato tra AA 546 e 562 del MET umana. Questi risultati sono riassunti nella Tabella 12.
Tabella 12: Mappatura degli epitopi riconosciuti da umani / topo equivalenti anticorpi anti-MET come determinato mediante ELISA. Umano MET ECD (hMET) o lama MET ECD (lMET) così come le proteine chimeriche MET lama-umano (CH1-7) erano immobilizzati in fase solida e quindi esposte a concentrazioni crescenti di mAb.
Esempio 5: saggi di competizione HGF
L'analisi di cui sopra suggeriscono che gli epitopi riconosciuti da alcuni dei umano / topo equivalenti anticorpi anti-MET possono sovrapporsi con quelli impegnata da HGF quando associa al MET (Stamos et al, EMBO J.23, 2325-2335, 2004;. Mercantile et . al, Proc Natl Acad Sci USA 110, E2987-2996, 2013;. Basilico et al, J Clin Invest 124, 3172-3186, 2014).. Per indagare su questa linea, abbiamo testato la competizione tra anticorpi monoclonali e HGF mediante ELISA. Mouse HGF (R & D Systems) umano ricombinante e sono stati biotinilati al N-terminale utilizzando NHS-LC-biotina (Thermo Scientific). -Fc MET proteine, sia umano o il mouse (R & D Systems), è stato immobilizzato in fase solida e poi esposto a 0,3 nM biotinilato HGF, sia umano o il mouse, in presenza di concentrazioni crescenti di anticorpi (0-120 nM). HGF legame MET è stato rivelato utilizzando streptavidina HRP-coniugato (Sigma-Aldrich). Come mostrato in Tabella 13, questa analisi ha permesso di dividere umano / topo equivalenti anti-MET mAbs in due gruppi: concorrenti HGF completi (71D6, 71C3, 71D4 con, 71A3, 71G2), e concorrenti HGF parziali (76H10, 71G3, 76G7, 71G12 , 74C8, 72F8).
Tabella 13: Potere di umano / topo equivalenti anticorpi anti-MET per competere con HGF per il legame al MET come determinato mediante ELISA.Un MET-Fc proteina chimerica (sia umano o mouse) è stato immobilizzato in fase solida ed esposto ad una concentrazione fissa di HGF biotinilato (sia umano o mouse) in presenza di concentrazioni crescenti di anticorpi. HGF legame MET è stato rivelato utilizzando streptavidina HRP-coniugato. concorrenza anticorpo-HGF è espresso come IC50 (la concentrazione che raggiunge il 50% della concorrenza) e IMAX (concorso% massima raggiunta a saturazione).
Come regola generale, leganti SEMA sfollati HGF più efficacemente di leganti PSI. In particolare, quegli anticorpi che riconoscono un epitopo entro lame 4 e 5 del SEMA β-elica erano i più potenti concorrenti HGF (71D6, 71C3, 71D4 con, 71A3, 71G2). Questa osservazione è coerente con l'idea che SEMA lama 5 contiene il sito di legame ad alta affinità per la α-catena di HGF (Merchant et al., Proc Natl Acad Sci USA 110, E2987-2996, 2013). Il dominio PSI non ha mostrato di partecipare direttamente con HGF, ma è stato suggerito di funzionare come un 'cerniera' regolare la sistemazione di HGF tra il dominio SEMA e la regione IPT (Basilico et al., J Clin Invest.124, 3172-3186, 2014). È quindi probabile che mAbs legame PSI (76H10, 71G3, 76G7, 71G12) ostacolare HGF legame MET interferendo con questo processo o per un impedimento sterico, e non per diretta concorrenza con il ligando. Infine, lame 1-3 del SEMA β-elica hanno dimostrato di essere responsabile per il legame della β-catena di HGF, che svolge un ruolo centrale nell'attivazione MET ma solo parzialmente contribuisce alla resistenza di legame HGF-MET bassa affinità (Stamos et al., EMBO J.23, 2325-2335, 2004). Questo potrebbe spiegare il motivo per cui anticorpi monoclonali di legame a quella regione del MET (74C8, 72F8) sono concorrenti parziali di HGF.
Esempio 6: saggi di attivazione MET
A causa della loro natura bivalente, immunoglobuline diretti contro il recettore tirosina chinasi può visualizzare attività agonista del recettore, simulando l'effetto di ligandi naturali. Per indagare su questa linea, abbiamo testato la capacità di umano / topo equivalenti anticorpi anti-MET per promuovere il MET auto-fosforilazione in un test di attivazione del recettore. cellule di carcinoma del polmone umano A549 e cellule precursori fegato di topo MLP29 stati privati di fattori di crescita di siero per 48 ore e quindi stimolate con concentrazioni crescenti (0-5 nM) di anticorpi o ricombinante HGF (cellule A549, umano ricombinante HGF, R & D Systems; MLP29 cellule , mouse ricombinante HGF, R & D Systems). Dopo 15 minuti di stimolazione, le cellule sono state lavate due volte con soluzione salina ghiacciata tamponata con fosfato (PBS) e quindi lisate come descritto (Longati et al., Oncogene 9, 49-57, 1994). lisati proteici sono stati risolti mediante elettroforesi e poi analizzati mediante Western blotting utilizzando anticorpi specifici per la forma fosforilata di MET (tirosine 1234-1235), indipendentemente dal fatto che umana o il mouse (Cell Signaling Technology). Gli stessi lisati sono stati analizzati anche mediante Western blotting utilizzando anticorpi anti-totale MET umani (Invitrogen) o anti-anticorpi totali del mouse MET (R & D Systems). Questa analisi ha rivelato che tutti gli anticorpi equivalenti umano / topo mostrano MET attività agonistica. Alcuni anticorpi promosso MET auto-fosforilazione in misura paragonabile a quella di HGF (71G3, 71D6, 71C3, 71D4 con, 71A3, 71G2, 74C8). Alcuni altri (76H10, 76G7, 71G12, 72F8) erano meno potente, e questo era particolarmente evidente alle concentrazioni anticorpali più bassi. è stata osservata alcuna chiara correlazione tra l'attività di attivazione MET e l'attività HGF-concorrenza. Gli stessi lisati sono stati analizzati anche mediante Western blotting utilizzando anticorpi anti-totale MET umani (Invitrogen) o anti-anticorpi totali del mouse MET (R & D Systems). Questa analisi ha rivelato che tutti gli anticorpi equivalenti umano / topo mostrano MET attività agonistica. Alcuni anticorpi promosso MET auto-fosforilazione in misura paragonabile a quella di HGF (71G3, 71D6, 71C3, 71D4 con, 71A3, 71G2, 74C8). Alcuni altri (76H10, 76G7, 71G12, 72F8) erano meno potente, e questo era particolarmente evidente alle concentrazioni anticorpali più bassi. è stata osservata alcuna chiara correlazione tra l'attività di attivazione MET e l'attività HGF-concorrenza. Gli stessi lisati sono stati analizzati anche mediante Western blotting utilizzando anticorpi anti-totale MET umani (Invitrogen) o anti-anticorpi totali del mouse MET (R & D Systems). Questa analisi ha rivelato che tutti gli anticorpi equivalenti umano / topo mostrano MET attività agonistica. Alcuni anticorpi promosso MET auto-fosforilazione in misura paragonabile a quella di HGF (71G3, 71D6, 71C3, 71D4 con, 71A3, 71G2, 74C8). Alcuni altri (76H10, 76G7, 71G12, 72F8) erano meno potente, e questo era particolarmente evidente alle concentrazioni anticorpali più bassi. è stata osservata alcuna chiara correlazione tra l'attività di attivazione MET e l'attività HGF-concorrenza. Alcuni anticorpi promosso MET auto-fosforilazione in misura paragonabile a quella di HGF (71G3, 71D6, 71C3, 71D4 con, 71A3, 71G2, 74C8). Alcuni altri (76H10, 76G7, 71G12, 72F8) erano meno potente, e questo era particolarmente evidente alle concentrazioni anticorpali più bassi. è stata osservata alcuna chiara correlazione tra l'attività di attivazione MET e l'attività HGF-concorrenza. Alcuni anticorpi promosso MET auto-fosforilazione in misura paragonabile a quella di HGF (71G3, 71D6, 71C3, 71D4 con, 71A3, 71G2, 74C8). Alcuni altri (76H10, 76G7, 71G12, 72F8) erano meno potente, e questo era particolarmente evidente alle concentrazioni anticorpali più bassi. è stata osservata alcuna chiara correlazione tra l'attività di attivazione MET e l'attività HGF-concorrenza.
Per ottenere dati più quantitativa, l'attività agonistica di anticorpi è stato inoltre caratterizzato da fosfo-MET ELISA. A tal fine, le cellule A549 e MLP29 erano siero-fame come sopra e quindi stimolate con concentrazioni crescenti (0-25 nM) di mAb. ricombinante umano (A549) o il mouse HGF (MLP29) è stato utilizzato come controllo. Le cellule sono state lisate e livelli fosfo-MET sono stati determinati mediante ELISA come descritto (Basilico et al., J Clin Invest.124, 3172-3186, 2014). Brevemente, 96 well-piastre sono state rivestite con anticorpi di topo anti-MET umani o ratto anticorpi (entrambi da R & D Systems) e poi incubate con lisati cellulari anti-topo MET. Dopo il lavaggio, le proteine catturate sono state incubate con anticorpi anti-fosfo-tirosina biotina-coniugato (Thermo Fisher), e il legame è stato rivelato utilizzando streptavidina HRP-coniugato (Sigma-Aldrich).
I risultati di questa analisi sono coerenti con i dati ottenuti mediante Western blotting. Come mostrato in Tabella 14, 71G3, 71D6, 71C3, 71D4 con, 71A3, 71G2 e 74C8 potentemente attivi MET, mentre 76H10, 76G7, 71G12 e 72F8 causato un'incidenza meno pronunciata. In ogni caso, tutti gli anticorpi visualizzati effetti analoghi nell'uomo e in cellule di topo.
Tabella 14: attività agonista di umano / topo equivalenti anticorpi anti-MET in cellule umane e di topo come misurato mediante ELISA.cellule di carcinoma del polmone umano A549 e cellule precursori fegato MLP29 topo erano siero-fame e quindi stimolate con concentrazioni crescenti di mAb. Ricombinante HGF umano (hHGF; A549) oppure HGF mouse (mHGF; MLP29) è stato utilizzato come controllo. I lisati cellulari sono stati analizzati mediante ELISA utilizzando anticorpi anti-totale MET per la cattura e anti-fosfo-tirosina anticorpi per rivelare. attività agonistica è espressa come EC50 (nM) e EMAX (% attività HGF).
Esempio 7: test Scatter
Per valutare se l'attività agonistica di umano / topo equivalenti anticorpi anti-MET potrebbe tradursi in attività biologica, abbiamo eseguito test dispersione con entrambe le cellule epiteliali umane e di topo. A tal fine, cellule precursori fegato di topo HPAF-II cellule di adenocarcinoma pancreatico umano (American Type Culture Collection) e MLP29 state stimolate con concentrazioni crescenti di ricombinante HGF (umana o mouse, sia da R & D Systems) e la dispersione delle cellule è stata determinata dopo 24 ore dalla microscopia, come descritto in precedenza (Basilico et al., J Clin Invest.124, 3172-3186, 2014). Questa analisi preliminare ha rivelato che la dispersione delle cellule HGF-indotta è lineare fino a raggiungere la saturazione a circa 0,1 nM in entrambe le linee cellulari.
Sulla base di queste curve standard HGF, abbiamo elaborato un sistema di punteggio da 0 (totale assenza di dispersione cellulare in assenza di HGF) a 4 (dispersione cellule massima in presenza di 0,1 nM HGF). cellule HPAF-II e MLP29 state stimolate con concentrazioni crescenti di umano / topo equivalenti anticorpi anti-MET, e la dispersione delle cellule è stata determinata dopo 24 ore utilizzando il sistema di punteggio sopra descritto. Come mostrato in Tabella 15, questa analisi ha rivelato che tutti mAb testato promossi dispersione cellulare in entrambi i sistemi il topo cellule umane e, con sostanzialmente sovrapposte Risultati su entrambe le specie.71D6 e 71G2 visualizzati la stessa attività di HGF; 71G3 e 71A3 erano solo leggermente meno potente di HGF; 71C3 e 74C8 richiesto sostanzialmente maggiore concentrazione al fine di corrispondere l'attività di HGF; 71D4 con, 76G7, 71G12 e 72F8 non raggiunsero la saturazione in questo saggio.
Tabella 15: Attività biologica di umano / topo equivalenti anticorpi anti-MET, misurata in un saggio basato su cellule scatter. cellule di adenocarcinoma HPAF-II umane pancreatiche e cellule precursori fegato di topo MLP29 state stimolate con concentrazioni crescenti di umano / topo equivalenti anticorpi anti-MET, e la dispersione cellulare è stata determinata dopo 24 ore utilizzando il sistema di punteggio descritto nel testo (0, assenza di cellule dispersione, 4, dispersione cellule massima).
cellule di adenocarcinoma pancreatico umano HPAF-II
cellule precursori fegato di topo MLP29
Esempio 8: Protezione contro l'apoptosi indotta da farmaci
Molte evidenze sperimentali indicano che HGF visualizzare un potente effetto anti-apoptotico sulle cellule MET che esprimono (recensito da Nakamura et al., J Gastroenterol Hepatol.26 Suppl 1, 188-202, 2011). Per testare la potenziale attività anti-apoptotica di umano / topo equivalenti anticorpi anti-MET, abbiamo effettuato test di sopravvivenza indotte da farmaci a base di cellule. umani cellule epiteliali mammarie MCF10A (American Type Culture Collection) e cellule precursori fegato di topo MLP29 sono state incubate con concentrazioni crescenti di staurosporina (Sigma Aldrich). Dopo 48 ore, la vitalità cellulare è stata determinata misurando la concentrazione totale di ATP con il Cell Titer Glo kit (Promega) con un lettore Victor X4 piastra multietichetta (Perkin Elmer). Questa analisi preliminare ha rivelato che la concentrazione di farmaco che ha indotto la morte cellulare di 50% è di 60 nM per le cellule MCF10A e 100 nM per MLP29 cellule. Quindi, abbiamo incubato cellule MCF10A e cellule MLP29 con le concentrazioni del farmaco sopra determinati in presenza di concentrazioni crescenti (0-32 nM) di anti-Met mAbs o ricombinante HGF (umano o mouse, sia da R & D Systems). È stato determinato vitalità cellulare 48 ore più tardi come sopra descritto. I risultati di questa analisi, presentata in Tabella 16, suggeriscono che gli anticorpi equivalenti umano / topo protetti cellule umane e di topo contro la morte cellulare staurosporine indotta in misura paragonabile. Mentre alcuni mAbs visualizzati un'attività protettiva simile o superiore a quella di HGF (71G3, 71D6, 71G2), altre molecole mostrata solo una protezione parziale (76H10, 71C3, 71D4 con, 71A3, 76G7, 71G12, 74C8, 72F8), sia nella cellula umana che nella cellula del mouse sistema.
Tabella 16: Attività biologica di umano / topo equivalenti anticorpi anti-MET misurata mediante un saggio apoptosi indotta da farmaci a base di cellule.umani cellule epiteliali mammarie MCF10A e cellule precursori fegato di topo MLP29 sono state incubate con una concentrazione fissa di staurosporine in presenza di concentrazioni crescenti di anti MET-mAbs o ricombinante HGF (topo umano o), e il contenuto di ATP totale è stata determinata dopo 48 ore. La vitalità cellulare è stata calcolata come% totale relativa contenuto di ATP nelle cellule trattate con né staurosporina né anticorpi, e viene espressa come CE50 EMAX.
Esempio 9: Branching dosaggio morfogenesi
HGF è una citochina pleiotropica che promuove la regolamentazione armonica delle attività biologiche indipendenti, tra cui la proliferazione cellulare, la motilità, l'invasione, la differenziazione e la sopravvivenza. Il saggio basato su cellule che ricapitola meglio tutte queste attività è il saggio morfogenesi di ramificazione, che riproduce la formazione di organi tubolari e ghiandole durante l'embriogenesi (recensito da Rosario e Birchmeier, Trends Celi Biol.13, 328-335, 2003). In questo saggio, uno sferoide di cellule epiteliali è seminato all'interno di una matrice di collagene 3D ed è stimolato da HGF a germogliare tubuli che alla fine formano strutture ramificate. Questi tubuli ramificati assomigliano alle strutture cave di ghiandole epiteliali, ad esempio la ghiandola mammaria, in quanto mostrano un lume circondato da cellule polarizzate. Questo saggio è l'analisi più completa HGF che può essere eseguito in vitro.
Al fine di verificare se umano / topo equivalenti anticorpi anti-MET mostrato attività agonistica in questo saggio, abbiamo seminato cellule epiteliali di rene umano LOC cellule precursori fegato di topo (Michieli et al. Nat Biotechnol.20, 488-495, 2002) e in MLP29 uno strato di collagene come descritto (Hultberg et al., Cancer Res.75, 3.373-3.383, 2015), e poi esposto a concentrazioni crescenti di anticorpi monoclonali o ricombinante HGF (umano o il mouse, sia da R & D Systems). Branching morfogenesi è stata seguita nel tempo da microscopio, e le colonie sono stati fotografati dopo 5 giorni. Quantificazione di ramificazione attività morfogenesi stato ottenuto contando il numero di rami per ciascuno sferoide. Come mostrato in Tabella 17, tutti gli anticorpi indotti testati formazione dose-dipendente dei tubuli ramificati. Però, coerente con i dati ottenuti nei saggi di autofosforilazione di MET e test di scattering cellulare, 71D6, 71A3 e 71G2 hanno mostrato la più potente attività agonistica, simile o superiore a quello dell'HGF ricombinante.
Tabella 17: Branching saggio di morfogenesi.sferoidi di cellule preparazioni di cellule epiteliali di rene LOC umani o cellule precursori fegato di topo MLP29 state seminate in uno strato di collagene e poi incubate con concentrazioni crescenti (0, 0,5, 2,5 e 12,5 nM) di mAb o ricombinante HGF (LOC, umano HGF; MLP29, il mouse HGF). Branching morfogenesi è stata seguita nel tempo da microscopio, e le colonie sono stati fotografati dopo 5 giorni. Ramificazione è stata quantificata contando il numero di rami per ciascuno sferoide (rami primari e rami secondari).
cellule LOC
cellule MLP29
Esempio 10: mappatura epitopi fine
Per finemente mappa gli epitopi di MET riconosciuti da umani / topo equivalenti anticorpi anti-MET abbiamo perseguito la seguente strategia. Abbiamo concluso che, se un anticorpo generato nella lama e diretto contro umano MET cross-reagisce con il mouse il MET, allora questo anticorpo riconosce probabilmente un residuo (o più residui) che è (o sono) conservato tra H. sapiens e M. musculus ma non tra H. sapiens, M. musculus e L. an. Lo stesso ragionamento può essere esteso a R. norvegicus e M. fascicularis.
Per indagare su questa linea, abbiamo allineato e confrontato le sequenze di amminoacidi di umana (UniProtKB # P08581; aa 1-932), mouse (UniProtKB # P16056.1; aa 1-931), ratto (NCBI # NP_113705.1; aa 1-931), Macaco di Giava (NCBI # XP_005550635.2; aa 1-948) e lama MET (GenBank # KF042853.1; aa 1-931) tra di loro. Con riferimento alla Tabella 12, abbiamo concentrato la nostra attenzione all'interno delle regioni di MET responsabile per il legame alla 71D6, 71C3, 71D4 con, 71A3 e anticorpi 71G2 (aa 314-372 del MET umana) e alle 76H10 e 71G3 anticorpi (aa 546- 562 del MET umana). All'interno della ex regione della MET umana (aa 314-372) ci sono cinque i residui che sono conservati in uomo e topo MET, ma non a lama MET (Ala 327, Ser 336, 343 Phe, Ile 367, Asp 372). Di questi, quattro sono anche i residui conservati nel ratto e scimmia cynomolgus MET (Ala 327, Ser 336, Ile 367, Asp 372). All'interno di quest'ultima regione MET umana (aa 546-562) ci sono tre residui che sono conservati in uomo e topo MET, ma non a lama MET (Arg 547, Ser 553, Thr 555). Di questi, due residui sono conservati nel ratto e scimmia cynomolgus MET (Ser 553 e Thr 555).
Utilizzando MET come modello umano, ci mutagenizzato ognuno di questi residui in forme diverse, generando una serie di mutanti MET pienamente umane eccezione dei residui specifici, che sono lama. Quindi, abbiamo testato l'affinità di mAbs selezionati SEMA-binding (71D6, 71C3, 71D4 con, 71A3, 71G2) e mAbs PSI-binding (76H10 e 71G3) per questi mutanti accolti da ELISA. A tal fine, le varie proteine MET sono stati immobilizzati in fase solida (100 ng / pozzetto in una piastra a 96 pozzetti) e quindi esposte a concentrazioni crescenti di anticorpi (0-50 nM) soluzione. Poiché gli anticorpi utilizzati erano nel loro formato regione costante umana, vincolante, è stato rivelato utilizzando HRP-coniugato Fc anticorpo secondario anti-umano (Jackson Immuno Research Laboratories). Wild-tipo umano MET è stato utilizzato come controllo positivo. I risultati di questa analisi sono presentati nella tabella 18.
Tabella 18. Gli epitopi di MET responsabili anticorpo agonista legame rappresentano residui conservati tra H. sapiens, M. musculus, R. norvegicus, M. fascicularis ma non tra le stesse specie e L. an.La rilevanza di residui conservati fra umano, topo, ratto, Macaco di Giava ma non lama MET per il legame di anticorpi monoclonali agonisti è stato testato da ELISA. Wild-type (WT) o mutante (MT) umano MET ECD è stato immobilizzato in fase solida ed esposto a concentrazioni crescenti di anticorpi monoclonali in soluzione. Legame è stato rivelato utilizzando anticorpi anti umani anticorpi secondari Fc. Tutti i valori di legame sono stati normalizzati alla proteina WT e sono espressi come vincolanti% (EMAX) rispetto al WT MET.
I risultati presentati sopra forniscono un quadro preciso e chiaro dei residui rilevanti per il legame con i nostri anticorpi agonisti.
Tutti i leganti SEMA testati (71D6, 71C3, 71D4 con, 71A3, 71G2) sembrano legarsi a un epitopo che contiene 2 aminoacidi essenziali conservati a uomo, topo, cynomolgus e ratto MET, ma non in lama MET situata all'interno della lama 5 della SEMA β-elica: Ile 367 e Asp 372. infatti, la mutazione di Ala 327, Ser 336 o Phe 343 non ha influenzato vincolante a tutti; mutazione di Ile 367 parzialmente compromessa vincolante; mutazione del Ile 367 e 372 Asp completamente abrogato vincolante. Concludiamo che sia Ile 367 e Asp 372 del MET umano sono importanti per il legame con gli anticorpi diretti SEMA-testati.
Anche i leganti PSI testati (76H10, 71G3) sembrano legarsi a una simile o lo stesso epitopo. In contrasto con l'epitopo SEMA, tuttavia, l'epitopo PSI contiene un solo aminoacido chiave conservata anche in uomo, topo, ratto cynomolgus e MET, ma non in lama MET: Thr 555. In realtà, la mutazione di Arg 547 o Ser 553 ha non influenzare vincolante a tutti, mentre la mutazione di Thr 555 completamente abrogata esso. Concludiamo che Thr 555 rappresenta il fattore determinante per il legame con gli anticorpi diretti PSI-testati.
Esempio 11: progettazione, produzione e caratterizzazione di un unico armato anticorpo antagonista MET-specifica bloccando l'attività biologica del fattore di crescita degli epatociti e cross-reattivi con umano, topo, ratto e scimmia MET
Come dimostrano i risultati presentati finora suggeriscono, tutti gli anticorpi anti-MET descritto in questa attività agonistica visualizzazione del documento, anche se con diversa potenza. Questo dipende dalla capacità della molecola di immunoglobulina, che è bivalente, per stabilizzare l'antigene legato (MET) in una forma dimerica, portando ad un recettore di trans-fosforilazione e l'attivazione. Per generare un anticorpo antagonista MET, anche cross-reattivi con umano, topo, ratto e scimmia MET, abbiamo trasformato un anticorpo agonista bivalente selezionato dal pannello sopra (74C8) in un monovalente, un braccio modulo (74C8-OA) .74C8-OA è costituito da un singolo frammento legante antigene (Fab) fuso con un frammento completo dominio costante (Fc), come descritto in precedenza (Merchant et al, Proc Natl Acad Sci 110:..2987-2996, 2013). L'anticorpo un braccio è stata prodotta in cellule di mammifero e gel purificato come descritto per gli altri anticorpi. La capacità di 74C8-OA di legarsi a umano, topo, ratto e scimmia MET è stata valutata mediante ELISA usando un MET ECD in fase solida e concentrazioni crescenti di anticorpo in soluzione. Questa analisi ha rivelato che 74C8-OA si lega con affinità simile a tutte queste proteine MET. Il legame di 74C8-OA di natale MET è stato determinato mediante citometria di flusso sulle cellule epiteliali umane e di topo che esprimono il MET. Le cellule sono state incubate con concentrazioni crescenti di anticorpo, e vincolante stato rivelato da analisi citofluorimetrica. I risultati ottenuti in questi esperimenti hanno indicato che 74C8-OA si lega a nativo MET sulla superficie delle cellule viventi. Al fine di valutare la capacità di 74C8-OA di spostare HGF umano o il mouse, un saggio di competizione HGF è stata eseguita mediante ELISA. -Fc MET proteine, sia umano o topo, è stato immobilizzato in fase solida e poi esposto a umano biotinilato o HGF topo in presenza di concentrazioni crescenti di anticorpi. legame HGF è stata misurata a cavallo streptavidina rafano coniugata. Questa analisi ha rivelato che 74C8-OA è un dislocatore potente di HGF in entrambi i sistemi umani e topo HGF / MET.
Sia l'attività agonista e antagonista di 74C8-OA sono stati caratterizzati da fosfo-MET ELISA sul mouse e cellule epiteliali umane. Per il saggio di attività agonistica, cellule siero-fame sono state stimolate con concentrazioni crescenti di 74C8-OA, lisate e poi adsorbito su anticorpo di capra antiumano MET (R & D Systems) in fase solida. Fosfo-MET è stato rivelato utilizzando un coniglio anti-PMET (Y1234-Y1235) anticorpo (Cell Signaling) e un anticorpo secondario HRP-coniugato capra anti-coniglio (Pierce). Questa analisi ha rivelato che l'attività agonistica di 74C8-OA è trascurabile a tutte le concentrazioni testate. Per l'attività antagonistica, mouse siero starved e cellule epiteliali umane sono state stimolate con una concentrazione fissa (100 ng / ml) di HGF ricombinante umano (D Systems R &) in presenza di concentrazioni crescenti di 74C8-OA. attivazione MET è stata determinata mediante fosfo-MET ELISA come descritto sopra. Questa analisi ha dimostrato che 74C8-OA mostra una forte attività antagonistica MET inibendo HGF indotta MET auto-fosforilazione.
Concludiamo che l'anticorpo 74C8-OA è un potente anticorpo antagonista MET che, contrariamente agli anticorpi agonisti MET qui forniti, non presenta alcuna significativa attività agonistica MET.
Esempio 12: L'anticorpo agonista 71D6 MET inibisce l'infiammazione indotta fibrosi colorettale cronica e cancerogenesi
Per far luce sul potenziale effetto pro-oncogeno dell'attivazione MET in un ambiente cronica del colon infiammazione, abbiamo confrontato l'effetto farmacologico di un anticorpo MET agonistica (71D6) con quella di un anticorpo antagonista MET (74C8-OA) in un classico due colpito al colon modello di carcinogenesi del mouse. A tal fine, abbiamo esposto otto settimane di età femminile / c topi BALB (Charles River) per una singola iniezione ip con azoxymethane (AOM, un mutageno potente per le cellule epiteliali del tratto gastro-intestinale) alla dose di 12,5 mg / kg seguito da tre cicli di destrano solfato sodico (DSS, un potente induttore di infiammazione del colon e ulcerazione) disciolti nell'acqua potabile ad una concentrazione del 6% (peso / volume). Ciascun ciclo consisteva di infiammatoria 7 giorni di somministrazione DSS seguita da 14 giorni in acqua normale. Il giorno 8, in cui il primo ciclo di DSS ha iniziato, topi sono stati randomizzati in 4 braccia di 11 topi ciascuno che ha ricevuto rispettivamente: (i) solo veicolo (PBS); (Ii) l'anticorpo MET agonistica 71D6 alla dose di 1 mg / kg; (Iii) l'anticorpo MET agonistica 71D6 alla dose di 5 mg / kg; (Iv) il MET anticorpo antagonista 74C8-OA alla dose di 5 mg / kg. Un ulteriore, quinto braccio di controllo conteneva 7 topi che avevano ricevuto nessun AOM-DSS o anticorpi e servivano di controllo sano. I topi sono stati sacrificati 16 giorni dopo il terzo ciclo di DSS è stato interrotto. All'autopsia, due punti sono stati raccolti, lavati attraverso, e la loro lunghezza sono stati determinati. Seguente misura, due punti veniva aperto longitudinalmente e colorate con 1% di soluzione Alcian blu per evidenziare masse tumorali. I tumori sono stati contati e fotografati in uno stereo-microscopio. Al termine di questa procedura, i due punti sono stati fissati in paraformaldeide al 4%, inclusi in paraffina e processati per l'analisi istologica. Durante tutto il corso dell'esperimento, peso topo è stata monitorata su base regolare, ed i sintomi clinici della colite ulcerosa sono stati valutati determinando sangue fecale, emorragia rettale e consistenza delle feci. La quantificazione è stata ottenuta utilizzando un sistema di punteggio standard utilizzato in modelli pre-clinici (Kim et al, J Vis Exp 60, PII:..3678, 2012): ogni parametro segnato da 0 (assenza del sintomo) a 3 (la manifestazione massima di il sintomo). I punteggi relativi ai singoli parametri sono stati sommati per dare luogo alla Disease Activity Index (DAI) che va da 0 a 9. ed i sintomi clinici della colite ulcerosa sono stati valutati determinando sangue fecale, emorragia rettale e consistenza delle feci. La quantificazione è stata ottenuta utilizzando un sistema di punteggio standard utilizzato in modelli pre-clinici (Kim et al, J Vis Exp 60, PII:..3678, 2012): ogni parametro segnato da 0 (assenza del sintomo) a 3 (la manifestazione massima di il sintomo). I punteggi relativi ai singoli parametri sono stati sommati per dare luogo alla Disease Activity Index (DAI) che va da 0 a 9. ed i sintomi clinici della colite ulcerosa sono stati valutati determinando sangue fecale, emorragia rettale e consistenza delle feci. La quantificazione è stata ottenuta utilizzando un sistema di punteggio standard utilizzato in modelli pre-clinici (Kim et al, J Vis Exp 60, PII:..3678, 2012): ogni parametro segnato da 0 (assenza del sintomo) a 3 (la manifestazione massima di il sintomo). I punteggi relativi ai singoli parametri sono stati sommati per dare luogo alla Disease Activity Index (DAI) che va da 0 a 9.
Come mostrato nella figura 1A, l'esposizione a DSS causato una perdita di peso che è aumentato ad ogni ciclo (ciclo 1, fino al 15%, ciclo 2, fino al 20%, ciclo 3, fino al 25%). La DAI aumentato a un punteggio di 3 o superiore durante il ciclo 1 e significativamente peggiorata durante i cicli 2 e 3, raggiungendo valori superiori 4 durante l'ultimo ciclo (Figura 1B). Sorprendentemente, gli animali non riescono a recuperare dopo l'ultimo ciclo e continuato per visualizzare un DAI 3 o superiore, che indica che lo stato infiammatorio non può essere ripristinato in questa fase. Coerentemente con l'idea che HGF promuove l'integrità mucosa del colon e inibisce l'infiammazione, l'anticorpo agonistica 71D6 ridotto la perdita di peso DSS-indotta e accelerata recuperare, così come drammaticamente inibiti i sintomi clinici di infiammazione del colon per tutto l'esperimento come misurato da analisi DAI.
Come determinato all'autopsia, DSS ridotta lunghezza del colon del 30% (Figura 2A), mentre è aumentata peso specifico colon (espressa come grammi / cm) fino a 93% (Figura 2B). In particolare, il trattamento 71D6 sia a 1 e 5 mg / kg impedito colon carenza limitarla alle variazioni non significative, e mantenuto valori di peso specifico colon molto vicine a quelle di topi di controllo sani. Al contrario, l'anticorpo antagonista 74C8-OA MET eseguita simile alla sola sia veicolo in termini di lunghezza del colon e del peso specifico del colon.
Seguendo la lunghezza e la misurazione del peso, colon sono stati aperti con un taglio longitudinale e colorate con 1% di soluzione Alcian blu, come descritto sopra. campioni del colon sono stati analizzati ponendo il tessuto appiattito sotto uno stereomicroscopio con il loro interno (lumen) lato verso la lente, e fotografati. Questa analisi ha rivelato che AOM trattamento / DSS comportato l'induzione di una pletora di polipi a livello della metà del colon, a circa metà strada tra il giunto cieco e l'ano (Figura 3). Sorprendentemente, l'anticorpo agonista 71D6 drasticamente ridotto carcinogenesi colorettale in questo modello, mentre l'antagonista anticorpo 74C8-OA non ha influenzato la formazione del tumore AOM / DSS-indotta affatto. numero tumore è stata valutata contando il numero di polipi che sono stati sporgenti dalla mucosa altrimenti piatto sull'intera colon. Tutti i topi esposti a AOM / DSS visualizzate alcune tumore nel colon. Tuttavia, notevolmente, l'anticorpo agonista 71D6 ridotto il numero di masse tumorali di oltre il 50% (Figura 4A). In particolare, tale riduzione è risultata statisticamente significativa (p <0.05) rispetto al solo veicolo braccio sia a 1 e 5 mg / kg, confermando così l'efficacia del trattamento anche alla dose più bassa testata. Al contrario, l'anti-anticorpo antagonista MET 74C8-OA non ha ridotto significativamente il numero di tumori, ciò implica che il MET attività agonistica e non appena incontrato vincolante è essenziale per inibire la carcinogenesi del colon in presenza di infiammazione persistente. immagini del colon sono stati analizzati utilizzando il software Immagine J (Instututes Nazionale della Salute) e il volume dei polipi è stato calcolato con la formula V = 3⁄4π (X / 2) · (Y / 2) 2, dove V è il volume del polipo, e X e Y sono maggiori e minori dimensioni della sezione polipo, rispettivamente (in mm). Come mostrato in figura 4B, 71D6 ridurre non solo il numero ma anche la dimensione di masse tumorali in modo dose-dipendente (1 mg / kg riduzione del 50%; / kg, riduzione 5 mg, 25%) rispetto al solo veicolo braccio. Ancora più sorprendentemente, 71D6 è molto efficace nel ridurre peso totale del tumore, raggiungendo% di riduzione 77 alla dose di 1 mg / kg e 89% a 5 mg / dose kg (Figura 4C). Non meno importante, il trattamento con l'anti-anticorpo antagonista MET 74C8-OA non intacchi nessuno dei parametri misurati tumorali, cioè numero medio polipo, il volume medio del tumore e carico totale tumorale.71D6 ridurre non solo il numero ma anche la dimensione di masse tumorali in modo dose-dipendente (1 mg / kg riduzione del 50%; / kg, riduzione 5 mg, 25%) rispetto al solo veicolo braccio. Ancora più sorprendentemente, 71D6 è molto efficace nel ridurre peso totale del tumore, raggiungendo% di riduzione 77 alla dose di 1 mg / kg e 89% a 5 mg / dose kg (Figura 4C). Non meno importante, il trattamento con l'anti-anticorpo antagonista MET 74C8-OA non intacchi nessuno dei parametri misurati tumorali, cioè numero medio polipo, il volume medio del tumore e carico totale tumorale.71D6 ridurre non solo il numero ma anche la dimensione di masse tumorali in modo dose-dipendente (1 mg / kg riduzione del 50%; / kg, riduzione 5 mg, 25%) rispetto al solo veicolo braccio. Ancora più sorprendentemente, 71D6 è molto efficace nel ridurre peso totale del tumore, raggiungendo% di riduzione 77 alla dose di 1 mg / kg e 89% a 5 mg / dose kg (Figura 4C). Non meno importante, il trattamento con l'anti-anticorpo antagonista MET 74C8-OA non intacchi nessuno dei parametri misurati tumorali, cioè numero medio polipo, il volume medio del tumore e carico totale tumorale.
A seguito di trasformazione del tessuto e paraffina, campioni del colon sono stati tagliati con un microtomo e preparati per istologiche e analisi immunoistochimica. In primo luogo, le sezioni sono state colorate con ematossilina eosina ed esaminate al microscopio. Questa analisi conferma che AOM trattamento / DSS causato infiammazione cronica della mucosa del colon portando allo sviluppo di grandi lesioni maligne (Figura 5). analisi istologica dei tumori ha rivelato che tutte le lesioni rappresentano adenomi alto grado dell'epitelio del colon (conosciuto anche come carcinoma in situ del colon). Sorprendentemente, l'anticorpo 71D6 sia a dosi quasi completamente soppressa formazione adenoma, mantenendo una normale morfologia della mucosa, sostanzialmente indistinguibile dal gruppo di controllo. L'antagonista anticorpo 74C8-OA, al contrario,
Successivamente, abbiamo determinato se l'infiammazione del colon cronico provocato la fibrosi. A tal fine, le sezioni sono state colorate colon mediante varie tecniche specifiche per la rilevazione di tessuto fibrotico, compreso il metodo picro Sirius rosso, che evidenzia il collagene, e anti-alfa actina del muscolo liscio (α-SMA) anticorpi che specificamente macchia miofibroblasti. Queste analisi ha rivelato che la somministrazione ripetuta DSS causato l'insorgenza di fibrosi massiva nel tessuto del colon. tessuto fibrotico ricco di collagene è particolarmente evidente quando masse tumorali sono presenti (Figura 6). Sorprendentemente, le sezioni del colon derivati da animali trattati con entrambe AOM-DSS e 71D6 mostrato una significativa deposizione di collagene inferiore e fibrosi lieve a 1 mg / kg, nonché alla dose maggiore senza alcuna differenza evidente tra i due. sezioni colon derivati da 74C8-OA-trattati animali esposti in misura di deposizione di collagene e fibrosi paragonabile a quella del braccio della sola veicolo. Un modello simile di distribuzione è stata osservata con α-SMA colorazione, con maggiore presenza di miofibroblasti nella sola braccio di controllo veicolo così come nel braccio 74C8-OA, rispetto ai topi che hanno ricevuto 71D6 alle due dosi (Figura 7).
sezioni del colon sono stati colorati per l'espressione del fattore di crescita trasformante beta (TGF-β). segnalazione di TGF-β è stato dimostrato essere frequentemente liberalizzato nei tumori umani, tra cui il cancro del colon-retto (Massagué, cellulare 134:..251-230, 2008; Xu et al, Hum Mol Genet 16 (SPEC): R14-R20, 2009) . Mentre nelle cellule normali o premaligne solito agisce come un soppressore del tumore, nel cancro avanzato è spesso sovraespresso e il selettore di inibizione della crescita ad uno oncogeno promuovendo così la proliferazione delle cellule tumorali e l'invasione (Nagaraj et al, Expert Opin investig Drugs 19.: 77-91, 2010). La colorazione di sezioni colon con anticorpi anti-TGF-beta rivelato che l'espressione di TGF-β è aumentata dal trattamento AOM-DSS e particolarmente nel tessuto tumorale (Figura 8). In particolare, trattamento con i 71D6 anticorpo agonista livelli TGF-β restaurati paragonabili a quelli osservati in topi sani di controllo sia a 1 ea 5 mg / kg. Al contrario, le sezioni del colon di topi trattati con l'anticorpo antagonista 74C8-OA visualizzati un'espressione TGF-β indistinguibile da quello del solo braccio veicolo.
Questi dati suggeriscono che l'attivazione MET e non blocco è vantaggiosa in patologie infiammatorie croniche dell'intestino, e che la somministrazione di un farmaco MET attivante possa ridurre i segni clinici di infiammazione colon cronica (come la perdita di peso, diarrea, emorragia rettale, sangue nelle feci, ispessimento colon, deposizione di collagene, proliferazione miofibroblasti e fibrosi) e sopprimere lo sviluppo del cancro colorettale cronica infiammazione indotta. Suggeriamo che l'anticorpo 71D6 o altri simili anticorpi agonisti MET possono essere utilizzati in clinica per il trattamento di condizioni patologiche associate con l'infiammazione del colon cronica, tra cui la fibrosi la colite associata e in particolare il cancro.
Esempio 13: L'anticorpo agonista 71D6 MET inibisce la DNA-danneggiamento agente indotta carcinogenesi colorettale
I risultati ottenuti nel modello / DSS AOM suggeriscono che l'attivazione MET utilizzando un anticorpo agonista riduce drasticamente il rischio di sviluppare il cancro del colon-retto, tipicamente associato con infiammazione cronica dell'intestino. Tuttavia, il cancro del colon-retto può anche derivare da mutazioni del gene nelle cellule epiteliali della mucosa del colon che si accumulano durante lunghi periodi di tempo. La particolare sito anatomico di queste cellule epiteliali li espongono a un certo numero di agenti introdotti con il cibo o bevanda che può causare mutazioni del DNA, in particolare se il cibo è contaminato con inquinanti. Inoltre, condizioni patologiche dell'intestino quali disbiosys o permeabilità alterata possono aumentare il verificarsi di mutazioni geniche nella mucosa del colon.
Al fine di determinare se l'attivazione di MET tramite un anticorpo agonista può influenzare mutagenesi-promosso colorettale carcinogenesi, abbiamo testato la molecola 71D6 in una seguente impostazione. Abbiamo iniettato 7 settimane di età topi BALB / c femmine (Charles River) con il mutageno AOM-specific del colon alla dose di 5 mg / kg una volta alla settimana per 6 settimane. Partendo dal giorno 1, i topi sono stati randomizzati in 2 bracci di 21 topi ciascuno che hanno ricevuto un trattamento con 71D6 (alla dose di 5 mg / kg) o il solo veicolo (PBS). Anticorpo è stato somministrato due volte alla settimana per iniezione ip. Un ulteriore, terzo braccio di controllo conteneva 7 topi che avevano ricevuto nessun AOM o anticorpi e servito come il controllo sano. I topi sono stati sacrificati 8 settimane dopo l'ultima iniezione AOM, cioè 14 settimane dopo l'esperimento iniziato. All'autopsia, due punti sono stati raccolti e lavati attraverso. due punti espiantati sono stati misurati utilizzando un righello e pesati. Seguendo misurazioni, due punti veniva aperto longitudinalmente per esporre masse tumorali. I tessuti sono stati colorati ex vivo con una soluzione Alcian Blu 1% al fine di evidenziare i confini tumorali. I polipi sono stati contati e fotografati in uno stereo-microscopio. Al termine di questa procedura, i due punti sono stati fissati in paraformaldeide al 4%, inclusi in paraffina e processati per l'analisi istologica.
In contrasto AOM / DSS, e coerente con l'assenza di infiammazione, AOM sola non ha influenzato lunghezza del colon (Figura 9A) o peso specifico (Figura 9B) rispetto ai topi di controllo. trattamento 71D6, inoltre, non è cambiata significativamente entrambi i parametri. Tuttavia, mutagenesi AOM indotta fatto seguito nello sviluppo del tumore colorettale, anche se in misura ridotta rispetto al AOM / DSS in termini di incidenza (Figura 10A) e numero (Figura 10B). Questo è coerente con l'idea che l'infiammazione cronica aumenta progressione tumorale in molti organi, compreso l'intestino. È interessante notare che il trattamento con l'anticorpo agonista 71D6 significativamente inibito cancro AOM-promosso: infatti, sia l'incidenza del tumore (Figura 10A) e numero (Figura 10B) è diminuita di circa il 60% nel braccio ricezione 71D6.
La figura 11 mostra due immagini rappresentative di due punti espiantati per ogni braccio. campioni del colon sono state colorate utilizzando una soluzione Alcian Blu 1%. Le frecce indicano masse tumorali macroscopicamente evidenti. sezioni del colon sono stati poi trattati per istologia. Questa analisi ha indicato che i polipi osservati sotto la stereomicroscopio sono adenomi di basso grado, quindi meno maligna di quelli osservati nel modello / DSS AOM.
Esempio 14: Riduzione dell'infiammazione colon da anticorpi agonisti MET
Abbiamo testato se agonistici anticorpi anti-MET potrebbero ridurre l'infiammazione intestinale in un modello di topo, in quanto intestinale (colon-retto) l'infiammazione è un importante fattore di rischio per lo sviluppo di cancro del colon-retto. A tal fine, abbiamo esposto sette settimane di età topi BALB / c femmine (Charles River) per destrano solfato di sodio (DSS) in acqua potabile per 10 giorni. Il giorno 10, il trattamento DSS è stata interrotta e topi sono stati messi di nuovo in acqua normale. Partendo dal giorno 1, i topi sono stati randomizzati in 7 braccia di 7 topi ciascuno che hanno ricevuto un trattamento con 71G3, 71D6, 71G2 (alla dose di 1 mg / kg o 5 mg / kg) o il solo veicolo (PBS). Gli anticorpi sono stati somministrati tre volte alla settimana per iniezione ip. Un ulteriore, braccio di controllo ottava conteneva 7 topi che avevano ricevuto nessun DSS o anticorpi e servito come il controllo sano. I topi sono stati sacrificati il giorno 12, vale a dire 2 giorni dopo la somministrazione DSS è stata interrotta. All'autopsia, due punti sono stati raccolti, lavati con, e la loro lunghezza è stato determinato utilizzando un righello. Dopo la misurazione, i due punti sono stati inclusi in paraffina e processati per l'analisi istologica.
Durante tutto il corso dell'esperimento, peso topo è stata monitorata su base regolare, ed i sintomi clinici di infiammazione intestinale sono stati valutati determinando sangue nelle feci, sanguinamento rettale e consistenza delle feci. La quantificazione è stata ottenuta utilizzando un sistema di punteggio standard utilizzato in modelli pre-clinici (Kim et al, J Vis Exp 60, PII:..3678, 2012): ogni parametro segnato da 0 (assenza del sintomo) a 3 (la manifestazione massima di il sintomo). I punteggi relativi ai singoli parametri sono stati sommati per dare luogo alla Disease Activity Index (DAI) che va da 0 a 9.
Come mostrato in Figura 12, l'esposizione al DSS nel braccio PBS causato una perdita di peso fino al 25%; la DAI aumentata a un punteggio di 4 o superiore; e la lunghezza del colon è stata ridotta fino al 40%. Sorprendentemente, tutti gli anticorpi analizzati invertito questi effetti in modo dosedipendente, mostrando un'attività significativa già alla dose più bassa testata.71D6 era l'anticorpo più potente: dopo un calo transitorio, ha portato il peso corporeo torna a valori normali, paragonabili a quelle osservate nel gruppo PBS; esso frenato l'aumento DAI, inibendo sostanzialmente tutti i sintomi clinici; ed impedito carenza colon, limitandola a variazioni trascurabili.
sezioni del colon sono state colorate con ematossilina eosina ed esaminate al microscopio. Come mostrato nella Figura 13, la somministrazione DSS causato profonda danno alla mucosa del colon. Lo strato epiteliale è apparso eroso e infiltrato con i linfociti. La mucosa del colon è stata diffusa con i siti di ascessi criptici ed è stato pesantemente colonizzata da macrofagi schiumosi, responsabile per la distruzione dei tessuti. linfonodi peri-viscerale apparso allargata. Le ghiandole mucipare stati caratterizzati da atrofia e mostravano marcati deplezione mucinoso, che è stato sostituito con infiltrato infiammatorio compresi macrofagi schiumosi, linfociti e neutrofili. Diverse le ulcere sono stati visibilmente invasi da essudato granulocitica o macrofagi, che porta alla totale scomparsa della componente ghiandolare. Sorprendentemente, topi trattati con entrambi i DSS e gli anticorpi antiagonistici MET visualizzata molto più lievi sintomi di degenerazione e l'infiammazione. Nello specifico, gli elementi di infiammazione acuta sono assenti, compresi macrofagi e granulociti; la mucosa è comparso solo marginalmente ferito, la visualizzazione di scarsa distorsione ghiandolare e rarefazione; mucina secrezione è stata ripristinata, ed erosioni e ulcere erano completamente assenti. Sebbene questi effetti protettivi erano dose-dipendente in tutti i gruppi di anticorpi, che sono già evidenti a 1 mg / kg, indicando che le concentrazioni di anticorpi raggiunti con questa dose sono molto vicino alla saturazione. In questo modello, così, l'anticorpo più efficace sembra essere 71D6, anche se tutti gli anticorpi agonisti testati sono stati efficaci. compresi macrofagi e granulociti; la mucosa è comparso solo marginalmente ferito, la visualizzazione di scarsa distorsione ghiandolare e rarefazione; mucina secrezione è stata ripristinata, ed erosioni e ulcere erano completamente assenti. Sebbene questi effetti protettivi erano dose-dipendente in tutti i gruppi di anticorpi, che sono già evidenti a 1 mg / kg, indicando che le concentrazioni di anticorpi raggiunti con questa dose sono molto vicino alla saturazione. In questo modello, così, l'anticorpo più efficace sembra essere 71D6, anche se tutti gli anticorpi agonisti testati sono stati efficaci. compresi macrofagi e granulociti; la mucosa è comparso solo marginalmente ferito, la visualizzazione di scarsa distorsione ghiandolare e rarefazione; mucina secrezione è stata ripristinata, ed erosioni e ulcere erano completamente assenti. Sebbene questi effetti protettivi erano dose-dipendente in tutti i gruppi di anticorpi, che sono già evidenti a 1 mg / kg, indicando che le concentrazioni di anticorpi raggiunti con questa dose sono molto vicino alla saturazione. In questo modello, così, l'anticorpo più efficace sembra essere 71D6, anche se tutti gli anticorpi agonisti testati sono stati efficaci. erano già evidenti a 1 mg / kg, indicando che le concentrazioni di anticorpi raggiunti con questa dose sono molto vicino alla saturazione. In questo modello, così, l'anticorpo più efficace sembra essere 71D6, anche se tutti gli anticorpi agonisti testati sono stati efficaci. erano già evidenti a 1 mg / kg, indicando che le concentrazioni di anticorpi raggiunti con questa dose sono molto vicino alla saturazione. In questo modello, così, l'anticorpo più efficace sembra essere 71D6, anche se tutti gli anticorpi agonisti testati sono stati efficaci.
Conclusione
Concludiamo che il trattamento con un agonista HGF-MET (in questo caso un anticorpo agonista MET) può essere vantaggioso sia nel trattamento del tumore colorettale associato con infiammazione cronica, e anche nella inibizione dei tumori derivanti da mutazioni nel tessuto del colon. Agonista anticorpo 71D6 ha dimostrato di essere particolarmente efficace nel trattamento di queste condizioni. Altri anticorpi agonisti MET qui descritti (ad esempio 71G3 e 71G2) mostrano anche una potente capacità di ridurre l'infiammazione intestinale paragonabile a 71D6 e pertanto fornire effetti terapeutici e di prevenzione simili.
Inoltre, i risultati qui dimostrano che gli agonisti MET sono più efficaci nel trattamento del cancro (colon-retto) rispetto a quella nativa MET ligando HGF. Yamaji et al. Oncology Reports 26: 335-341, 2011 (qui incorporato per riferimento) descrivono la somministrazione a topi HGF in modelli simili a quelli qui descritti. Tuttavia, HGF non è efficace come agonisti MET come anti-MET anticorpi agonisti - per esempio, HGF solo riduce incidenza di tumori nei topi AOM trattati da 65% a circa il 30% (Yamaji et al, tabella I), rispetto al MET anticorpi agonisti che riducono l'incidenza del tumore a meno del 20% (Figura 10).
Suggeriamo che il trattamento con agonisti MET, anticorpi agonisti particolare MET come 71D6, possono essere utilizzati in clinica per ridurre lo sviluppo di tumori colorettali negli individui predisposti al cancro colorettale, per esempio in pazienti affetti da poliposi adenomatosa familiare (FAP; caratterizzati da APC o mutazioni genetiche MUTYH) o da altre sindromi genetiche, così come quelli predisposti al cancro del colon-retto a causa di condizioni infiammatorie intestinali.
L'invenzione verrà ulteriormente compresa con riferimento ai seguenti clausole:
1. Procedimento per il trattamento del cancro, comprendente la somministrazione a un soggetto che ne necessita un agonista HGF-MET.
2. Il metodo di clausola 1, in cui il cancro è cancro colorettale.
3. Il metodo di clausola 1 o clausola 2, in cui il soggetto è stato identificato come un aumentato rischio di cancro colorettale.
4. Procedimento per il trattamento della fibrosi colorettale, comprendente la somministrazione a un soggetto un agonista HGF-MET.
5. Procedimento secondo una qualsiasi delle clausole 1-4, in cui il soggetto è stato diagnosticato infiammazione colorettale prima della somministrazione dell'agonista HGF-Met.
6. Procedimento secondo una qualsiasi delle clausole 1-5, in cui il soggetto ha malattia infiammatoria intestinale, opzionalmente colite ulcerosa o morbo di Crohn.
7. Procedimento secondo una qualsiasi delle clausole di 1-6, in cui il soggetto ha una storia familiare di poliposi adenomatosa familiare (FAP).
8. Procedimento secondo una qualsiasi delle clausole 1-7, in cui l'agonista HGF-MET viene somministrato in una dose nell'intervallo da 0,1-10 mg / kg per dose.
9. Procedimento secondo una qualsiasi delle clausole 1-8, in cui l'agonista HGF-MET viene somministrato in una dose nell'intervallo da 0,5-10 mg / kg, opzionale, da 1-5 mg / kg. 10. Procedimento secondo una qualsiasi delle clausole 1-9 in cui l'agonista HGF-MET viene somministrato alla dose di 1 mg / kg o 5 mg / kg.
11. Il metodo secondo una qualsiasi delle clausole 1-10, in cui l'agonista HGF-MET viene somministrata almeno una volta alla settimana, facoltativamente 1-3 volte a settimana, opzionalmente due volte a settimana.
12. Il metodo secondo una qualsiasi delle clausole 1-11, in cui il trattamento è un trattamento profilattico.
13. Il metodo secondo una qualsiasi delle clausole 1-11, in cui il trattamento è un trattamento terapeutico.
14. Un agonista HGF-MET per uso in un metodo secondo una qualsiasi delle clausole di 1-13.
15. Una composizione farmaceutica per uso in un metodo secondo una qualsiasi delle clausole 1-13, in cui la composizione farmaceutica comprende un agonista HGF-MET e un eccipiente o veicolo farmaceuticamente accettabile.
16. Procedimento, HGF-MET agonista per l'uso o composizione farmaceutica per l'uso secondo una qualsiasi delle precedenti clausola, in cui l'agonista HGF-MET è un agonista completo del MET.
17. Procedimento, HGF-MET agonista per l'uso o composizione farmaceutica per l'uso secondo una qualsiasi delle precedenti clausola in cui, in cui l'agonista HGF-MET è un agonista anticorpo anti-MET o suo frammento legante antigene.
18. Procedimento, anticorpo per l'uso o composizione farmaceutica per l'uso secondo clausola 17, in cui l'anticorpo anti-MET o suo frammento legante antigene si lega al dominio SEMA del MET, opzionalmente lame 4-5 del SEMA β-elica.
19. Procedimento, anticorpo per l'uso o composizione farmaceutica per l'uso secondo Clausola 17 o clausola 18, in cui l'anticorpo anti-MET o suo frammento legante antigene si lega ad un epitopo comprendente residuo Ile367 e / o Asp372 del MET, eventualmente comprendenti sia residuo Ile367 e Asp372 del MET.
20. Procedimento, anticorpo per l'uso o composizione farmaceutica per l'uso secondo clausola 17, in cui l'anticorpo anti-MET o suo frammento legante antigene si lega al dominio PSI del MET, si lega opzionalmente un epitopo tra i residui 546 e 562 del MET.
21. Procedimento, anticorpo per l'uso o composizione farmaceutica per l'uso secondo Clausola 17 o clausola 20, in cui l'anticorpo anti-MET o suo frammento legante antigene si lega ad un epitopo comprendente residuo Thr555 del MET.
22. Procedimento, anticorpo per l'uso o composizione farmaceutica per l'uso secondo una qualsiasi delle clausole 17-19, in cui l'anti-MET anticorpo agonista o suo frammento legante antigene comprendente la combinazione di VH CDR1, CDR2 e CDR3 sequenze e VL CDR1, CDR2 e CDR3 sequenze di 71D6 o di 71G2.
23. Procedimento, anticorpo per l'uso o composizione farmaceutica per l'uso secondo clausola 22, in cui l'anti-MET anticorpo agonista o suo frammento legante antigene comprende un dominio VH almeno il 90% identica a SEQ ID N.163 e / o comprende un dominio VL almeno il 90% identica a SEQ ID No 164.
24. Procedimento, anticorpo per l'uso o composizione farmaceutica per l'uso secondo una qualsiasi delle clausole 17-23 in cui l'anticorpo agonista anti-Met è un anticorpo IgG4. 25. Procedimento, anticorpo per l'uso o composizione farmaceutica per l'uso secondo una qualsiasi delle clausole 17-24 in cui l'anticorpo agonista anti-MET è 71D6.
26. Procedimento per il trattamento del cancro colorettale in un soggetto, comprendente la somministrazione al soggetto di una quantità efficace di anticorpo anti-MET 71D6.
Claims (14)
- Rivendicazioni 1. Procedimento per il trattamento del cancro, comprendente la somministrazione a un soggetto che ne necessita un agonista HGF-MET, Eventualmente in cui il cancro è cancro colorettale.
- 2. Il metodo di rivendicazione 1, in cui il soggetto è stato identificato come un aumentato rischio di cancro colorettale.
- 3. Procedimento per il trattamento della fibrosi colorettale, comprendente la somministrazione a un soggetto un HGF-agonisti MET.
- 4. Il metodo di ognuna delle rivendicazioni 1-3, in cui il soggetto è stato diagnosticato infiammazione colorettale prima della somministrazione dell'agonista HGF-MET, eventualmente in cui il soggetto ha malattia infiammatoria intestinale.
- 5. Il metodo di ognuna delle rivendicazioni 1-4, in cui il soggetto ha una storia familiare di poliposi adenomatosa familiare (FAP).
- 6. Il metodo di ognuna delle rivendicazioni 1-5, in cui l'agonista HGF-MET viene somministrato alla dose nell'intervallo da 0,1-10 mg / kg per dose, opzionalmente alla dose nell'intervallo da 0,5-10 mg / kg, opzionale, da 1-5 mg / kg, opzionalmente alla dose di 1 mg / kg o 5 mg / kg.
- 7. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-6, in cui l'agonista HGF-MET viene somministrata almeno una volta alla settimana, facoltativamente 1-3 volte alla settimana, opzionalmente due volte a settimana.
- 8. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-7, in cui il trattamento è un trattamento profilattico o terapeutico.
- 9. Un agonista HGF-MET per uso in un metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-8.
- 10. Una composizione farmaceutica per uso in un metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-8, in cui la composizione farmaceutica comprende un agonista HGF-MET e un eccipiente o veicolo farmaceuticamente accettabile.
- 11. Procedimento, HGF-MET agonista per l'uso o composizione farmaceutica per l'uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui l'agonista HGF-MET è un agonista completo del MET.
- 12. Procedimento, HGF-MET agonista per l'uso o composizione farmaceutica per l'uso secondo una qualsiasi rivendicazione precedente, in cui, in cui l'agonista HGF-MET è un agonista anticorpo anti-MET o suo frammento legante antigene.
- 13. Procedimento, anticorpo per l'uso o composizione farmaceutica per l'uso secondo rivendicazione 12, in cui l'anti-MET anticorpo agonista o suo frammento legante antigene comprende la combinazione di VH CDR1, CDR2 e sequenze CDR3 e VL CDR1, CDR2 e CDR3 di 71D6 o di 71G2, eventualmente in cui l'anticorpo agonista anti-MET è 71D6.
- 14. Procedimento per il trattamento del cancro colorettale in un soggetto, comprendente la somministrazione al soggetto di una quantità efficace di anticorpo anti-MET 71D6.
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