JP2024008945A - 膵島細胞の増殖を促進する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 本発明は、膵島細胞、特に島細胞の増殖を促進する方法に関する。【解決手段】特に、本発明は、HGF-METアゴニスト、例えばMETアゴニスト抗体またはそのフラグメントの投与により、膵島細胞の増殖を促進する方法に関する。本発明は更に、本発明の方法に用いるためのHGF-METアゴニスト、例えばMETアゴニスト抗体またはそのフラグメント、前記アゴニストを含む医薬組成物に関する。【選択図】図１８

Description

本発明は、膵島細胞、特にβ島細胞の増殖を促進する方法に関する。特に、本発明は、HGF-METアゴニスト、例えばMETアゴニスト抗体またはそのフラグメントの投与により、膵島細胞の増殖を促進する方法に関する。本発明は更に、本発明の方法において使用するためのHGF-METアゴニスト、例えばMETアゴニスト抗体またはそのフラグメント、および前記アゴニストを含む医薬組成物に関する。

膵島、すなわちランゲルハンス島は、内分泌組織の領域であり、いわゆる「密集経路」で膵臓に位置する細胞である。膵島には、α、β、γ、δ、およびε細胞が含まれ、その各々が膵臓の内分泌作用の役割を担っている。特に、α細胞とβ細胞は、血糖値の調節に特に重要である。

１型糖尿病は、ランゲルハンス島の膵細胞、特にβ島細胞の免疫介在性破壊により特徴づけられる自己免疫疾患である。この進行性変性は、インスリン産生の機能障害をもたらし、それによって高血糖値を誘発する。典型的には、臨床症状の発症はβ細胞の質量の80～95％減少と関連付けられる（Klinke, PloS One 3: e1374, 2008）。β細胞を再生させ、免疫機構による進行性破壊からそれらの細胞を保護することが、糖尿病患者における満たされていない重要な医療ニーズであり、糖尿病研究における至高の目標（Holy Grail）でもある。

異なる病因メカニズムにより特徴づけられるが、２型糖尿病もまたランゲルハンス島変性を引き起こす。実際、２型糖尿病はインスリン抵抗性の下での異常なインスリン産生により特徴づけられ、高血糖値を引き起し、その結果β細胞がインスリン要求量の増加を補うことができなくなる（Christoffersen他、Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 297:1195-201, 2009）。２型糖尿病では、β島細胞は欠陥のあるインスリン産生を示し、病期末期には、細胞自身が破壊しうる。

膵島細胞の変性を患っている患者、例えば糖尿病患者の現行の管理方法は、インスリン投与を用いるまたは用いない、食事制限を使用するものである。しかしながら、このアプローチは、症状の根本的な病因に作用するものではない。従って新規治療法が必要とされている。

驚くべきことに、METアゴニストが膵島細胞の増殖を促進することが今ここで同定された。更に、産生された膵島細胞は機能的であり、インスリン産生の回復と血糖の正常化をもたらした。

膵島細胞の増殖と再生は、根本的な病因を本明細書に記載の方法により治療することができるという面で、糖尿病の治療において特に重要である。これは、症状をコントロールしようと試みる、現行の病状管理に対する有意な改善である。

膵島細胞の増殖の促進は、１型糖尿病の早期の患者を治療する際に特に重要である。典型的には、１型糖尿病の症状は、青年期で明らかになる。しかしながら、病理を診断する時には、患者の島β細胞の大部分が既に破壊されている（50％超、例えば70％または80％の破壊）。ランゲルハンス島細胞の破壊は急速に起こり、結果として有効な治療的介入の時間窓は非常に狭い。

例えば、自己免疫介在性島細胞破壊を低減させるための努力の一環として、免疫抑制薬が、新たに診断された１型糖尿病患者の治療法として研究されている。しかしながら、免疫抑制薬は、最初の臨床的有益性を示すのに数カ月を要する。これが行われると、治療開始後ほぼ半年間、膵臓のβ細胞が破壊され続け、しばしば完全に破壊されてしまう。結果として、免疫抑制薬の使用は無駄になる。この極めて重大な時間窓の間、島（β）細胞を維持することは、糖尿病患者にとって全く満たされていない医療ニーズである。

驚くべきことに、本明細書で証明される通り、METアゴニスト（例えばMETアゴニスト抗体）は膵島細胞集団を維持するだけでなく、それらの増殖と再生を促進することができる。HGFをトランスジェニックに過剰発現する動物がβ細胞増殖の変化を示すと記載されているが、外因性の生来でないMET結合性アゴニストが何らかの効果を有するのかどうかは知られておらず、不明であった。驚くべきことに、生来でないMETアゴニストの投与が、糖尿病において島細胞レベルを維持できることだけでなく、それらの増殖と再生も促進できることが証明された。島細胞増殖を促進することのできる臨床治療薬の提供が、本発明において初めて解決される、糖尿病療法での長年にわたる切実な要望である。

従って、第一の態様では、対象にHGF-METアゴニストを投与することを含む、膵島細胞増殖を促進する方法が提供される。

更なる態様では、抑制されたインスリン産生を示す対象においてインスリン産生を促進する方法であって、対象にHGF-METアゴニストを投与することを含む方法が提供される。好ましい態様では、当該方法は、増加した膵島細胞増殖を誘導することにより特徴づけられる。

更なる態様では、対象にHGF-METアゴニストを投与することを含む、糖尿病の治療方法が提供される。好ましい実施態様では、当該方法は増加した膵島細胞増殖を誘導することにより特徴づけられる。

更なる態様では、本明細書に提供される方法に用いるための、HGF-METアゴニストが提供される。

更なる態様では、HGF-METアゴニストと、薬学的に許容される賦形剤または担体とを含む、本明細書に提供される方法に用いるための医薬組成物が提供される。

全ての態様の好ましい実施形態において、HGF-METアゴニストは抗METアゴニスト抗体である。

METアゴニスト抗体処置は、健常マウスの基礎代謝を変更しない。ランゲルハンス島細胞に対するMETアゴニスト抗体の生物学的作用をインビボで評価するために、雄雌両方の成熟BALB/cマウスを0、3、10または30 mg/kgの精製71D6抗体で３か月の期間に渡り全身処置した（合計48匹の動物で、６匹のマウス／性別／群）。抗体を週２回腹腔内（i.p.）注射により投与した。体重と空腹時血糖を、全実験期間に渡り毎月測定した。（Ａ）体重の経時変化。（Ｂ）基礎血糖の経時変化。 METアゴニスト抗体処置は、健常マウスの基礎代謝を変更しない。ランゲルハンス島細胞に対するMETアゴニスト抗体の生物学的作用をインビボで評価するために、雄雌両方の成熟BALB/cマウスを0、3、10または30 mg/kgの精製71D6抗体で３か月の期間に渡り全身処置した（合計48匹の動物で、６匹のマウス／性別／群）。抗体を週２回腹腔内（i.p.）注射により投与した。体重と空腹時血糖を、全実験期間に渡り毎月測定した。（Ａ）体重の経時変化。（Ｂ）基礎血糖の経時変化。 ＭＥＴアゴニスト抗体処置は、健常マウスにおけるランゲルハンス島増殖を促進する。図１の凡例に記載される通り、71D6 METアゴニスト抗体の濃度を増加させながら、成熟BALB-cマウスを慢性処置した。実験の終わりに、マウスを犠牲にし、剖検に供した。膵臓を抽出し、組織学的分析のため処理し、パラフィン包埋した。切片をヘマトキシリンとエオシンで染色し、顕微鏡検査し、写真撮影した。画像をImage Jソフトウェアを使って解析し、ランゲルハンス島の数とサイズを計測した。（Ａ）平均ランゲルハンス島密度。（Ｂ）平均ランゲルハンス島サイズ。（Ｃ）ヘマトキシリンとエオシン染色した膵臓切片の代表的画像。倍率：400×。 ＭＥＴアゴニスト抗体処置は、健常マウスにおけるランゲルハンス島増殖を促進する。図１の凡例に記載される通り、71D6 METアゴニスト抗体の濃度を増加させながら、成熟BALB-cマウスを慢性処置した。実験の終わりに、マウスを犠牲にし、剖検に供した。膵臓を抽出し、組織学的分析のため処理し、パラフィン包埋した。切片をヘマトキシリンとエオシンで染色し、顕微鏡検査し、写真撮影した。画像をImage Jソフトウェアを使って解析し、ランゲルハンス島の数とサイズを計測した。（Ａ）平均ランゲルハンス島密度。（Ｂ）平均ランゲルハンス島サイズ。（Ｃ）ヘマトキシリンとエオシン染色した膵臓切片の代表的画像。倍率：400×。 METアゴニスト抗体処置は、健常マウスにおけるランゲルハンス島細胞増殖を促進する。上述した通り、71D6 METアゴニスト抗体の濃度を増加させながら、成熟BALB-cマウスを慢性処置した。膵臓切片を抗インスリン抗体を使った免疫組織化学により分析した。図面は100×の倍率で顕微鏡下撮影した代表的画像を示す。 METアゴニスト抗体は、１型糖尿病のマウスモデルにおいて基礎血糖を正常化する。β細胞を選択的に殺傷する化学薬品でありかつ実験動物にて１型糖尿病を誘発するために用いられる標準化合物であるストレプトゾトシン（STZ）を、24時間毎に連続５日間に渡り40 mg/kgの用量で雌BALB-cマウス中にi.p.注射した。最後の注射の一週間後、STZ処置したマウスを、基礎血糖に基づいて、各々７匹のマウスから成る４つの治療群にランダムに割り付け、その各群は(i) 賦形剤のみ（STZ）、(ii) 精製71D6抗体（STZ＋71D6）、(iii)精製71G2抗体（STZ＋71G2）、(iv) 精製71G3抗体（STZ＋71G3）での処置を受けた。抗体は８週間に渡り週２回、１ mg/kgの用量で腹腔内（i.p.）注射により投与した。追加の５番目の治療群は、STZまたは抗体を何も投与しない７匹のマウスを含み、それは健常対照（CTRL）として働いた。実験期間の間、基礎血糖をモニタリングした。（Ａ）基礎血糖の経時変化。（Ｂ）治療６週時の基礎血糖。 METアゴニスト抗体は、１型糖尿病のマウスモデルにおいてランゲルハンス島再生を促進する。STZを注射したBALB-cマウスを図４の凡例中に記載の通り1 mg/kgの71D6、71G2または71G3で処置した。抗体処置の８週間後、マウスを犠牲にし、剖検に供した。膵臓切片をヘマトキシリンとエオシンで染色し、顕微鏡検査し、写真撮影した。ランゲルハンス島のデジタル画像をImage J ソフトウェアを使って解析した。ランゲルハンス島の数、密度およびサイズをデジタルデータ解析により求めた。（Ａ）平均ランゲルハンス島密度。（Ｂ）平均ランゲルハンス島サイズ。（Ｃ）ヘマトキシリンとエオシン染色した膵臓切片の代表的画像。倍率：200×。 METアゴニスト抗体は、１型糖尿病のマウスモデルにおいてランゲルハンス島再生を促進する。STZを注射したBALB-cマウスを図４の凡例中に記載の通り1 mg/kgの71D6、71G2または71G3で処置した。抗体処置の８週間後、マウスを犠牲にし、剖検に供した。膵臓切片をヘマトキシリンとエオシンで染色し、顕微鏡検査し、写真撮影した。ランゲルハンス島のデジタル画像をImage J ソフトウェアを使って解析した。ランゲルハンス島の数、密度およびサイズをデジタルデータ解析により求めた。（Ａ）平均ランゲルハンス島密度。（Ｂ）平均ランゲルハンス島サイズ。（Ｃ）ヘマトキシリンとエオシン染色した膵臓切片の代表的画像。倍率：200×。 METアゴニスト抗体は、１型糖尿病のマウスモデルにおいて膵島細胞の再生を促進する。STZを注射したBALB-cマウスを、上記の通り1 mg/kgの71D6、71G2または71G3で処置した。膵臓切片を抗インスリン抗体を使った免疫組織化学により分析した。この図は、200×の倍率で顕微鏡下撮影した画像を表す。 METアゴニスト抗体は、２型糖尿病のマウスモデルにおいて基礎血糖を正常化する。雌db/dbマウスを各々５匹のマウスから成る４つの治療群にランダムに割り付け、その各群は (i) 賦形剤のみ（PBS）、(ii) 精製71D6抗体、(iii)精製71G2抗体、(iv) 精製71G3抗体での処置を受けた。抗体は８週間に渡り週２回、１ mg/kgの用量で腹腔内（i.p.）注射により投与した。C57BL6/Jマウスを非糖尿病対照動物として使用した。全実験期間の間、基礎血糖をモニタリングした。（Ａ）基礎血糖の経時変化。（Ｂ）治療８週時の基礎血糖。 METアゴニスト抗体は、２型糖尿病のマウスモデルにおけるランゲルハンス島の再生を促進する。雌db/dbマウスを図７の凡例中に記載の通り、71D6、71G2または71G3で処置した。処置の８週間後、マウスを犠牲にし、剖検に供した。膵臓を回収し、組織学用に処理し、パラフィン包埋した。組織切片をヘマトキシリンとエオシンで染色し、顕微鏡検査し、写真撮影した。ランゲルハンス島をImage Jソフトウェアを使って解析し、島の数、密度およびサイズを概算した。（Ａ）平均ランゲルハンス島密度。（Ｂ）平均ランゲルハンス島サイズ。（Ｃ）ヘマトキシリンとエオシンで染色した膵臓切片の代表的画像。倍率：200×。 METアゴニスト抗体は、２型糖尿病のマウスモデルにおけるランゲルハンス島の再生を促進する。雌db/dbマウスを図７の凡例中に記載の通り、71D6、71G2または71G3で処置した。処置の８週間後、マウスを犠牲にし、剖検に供した。膵臓を回収し、組織学用に処理し、パラフィン包埋した。組織切片をヘマトキシリンとエオシンで染色し、顕微鏡検査し、写真撮影した。ランゲルハンス島をImage Jソフトウェアを使って解析し、島の数、密度およびサイズを概算した。（Ａ）平均ランゲルハンス島密度。（Ｂ）平均ランゲルハンス島サイズ。（Ｃ）ヘマトキシリンとエオシンで染色した膵臓切片の代表的画像。倍率：200×。 METアゴニスト抗体は、２型糖尿病のマウスモデルにおいてランゲルハンス島細胞の再生を促進する。雌db/dbマウスを上記の通り、71D6、71G2または71G3で処置した。膵臓切片を抗インスリン抗体を使った免疫組織化学により分析した。図は100×の倍率で顕微鏡下撮影した代表的画像を示す。 NODマウスにおける血糖値。血糖は、ヒト用の試験紙（multiCare（登録商標）Biochemical Systems International社）を使ってランダム給餌（すなわち非空腹状態）の動物において測定した。６週の時点で、NODマウスは前糖尿病状態、すなわち約110 mg/dLの平均血糖を示した。７週時から出発して、動物を本明細書に記載の通りの処置に供した。実験の全期間にわたって週１回血糖をモニタリングした。連続２週間にわたって250 mg/dL（水平の点線）よりも大きい血糖値を示した場合に、その動物を糖尿病と見なした。 糖尿病発症の分析。（Ａ）糖尿病マウスの割合の経時変化。垂直の点線は、治療の開始時点を示す。（Ｂ）糖尿病発症のカプラン・マイヤー解析。Prismソフトウェア（Graph Pad）を使って統計解析を実施した。マンテル・コックス検定、ログランク傾向検定およびゲーハン・ブレスロー・ウィルコクソン検定は、全て0.001未満のp値を与え、このことは曲線間の差が統計上有意であることを示す。 非空腹時血糖の経時分析。血糖をランダム給餌（すなわち非空腹状態）の動物において上記の通り週１回測定した。糖尿病の発症データと一致して、血糖値は次の正確な順序に従った：CONTROL＞CD3＞71D6＞COMBO。 ブドウ糖負荷試験（GTT）。犠牲にする前に、全ての動物をブドウ糖負荷試験（GTT）に供した。このために、動物を一晩断食させた。翌朝、血糖とインスリンの測定用に血液サンプルを採取した。ブドウ糖溶液（200μLのPBS中3 g/kg）を腹腔内注射し、その３分後に第二の血液サンプルを採取した。血糖濃度は上述の通り試験片を使って測定した。Ultra-Sensitive Mouse Insulin ELISAキット（Crystal Chem）を使ってインスリン濃度を測定した。（Ａ）ゼロ時の血糖。（Ｂ）３分時の血糖。（Ｃ）ゼロ時のインスリン濃度。（Ｄ）３分時のインスリン濃度。 剖検時の体重と、体重に対する肝重量。（Ａ）体重。軽減された糖尿病表現型と一致して、対照群に比較して治療群において体重がわずかに（有意ではないが）高かった。（Ｂ）体重に対する肝重量。いずれの群においても体重に対する肝重量に有意な差は認められなかった。このことは、71D6で誘導される肝臓増殖（別のマウス系統で観察した）が、系統特異性であることを示唆する。 膵臓切片の組織学的分析。膵臓サンプルをパラフィン包埋し、組織学的分析用に処理した。組織切片をヘマトキシリンとエオシン（H&E）で染色し、顕微鏡検査した。各治療群の代表的画像が示される。倍率：200×。 インスリン発現の免疫組織化学的分析。膵臓切片を抗インスリン抗体で染色し、顕微鏡により分析した。各治療群の代表的画像が示される。倍率：40×。 インスリン発現の高解像度顕微鏡分析。膵臓切片を上記の通り抗インスリン抗体で染色した。各治療群の代表的顕微鏡画像が示される。倍率：200×。 マウス血漿における抗インスリン自己抗体。全てのマウスから並びに幼若な前糖尿病状態の雌NODマウス（寿命の７週時）から剖検時に採集した血漿サンプルを、マウスIAA（インスリン自己抗体）ELISAキット（Fine Test）を使って分析した。この分析により、前糖尿病状態のマウス（最も右側の群）に比較して、大部分のマウスが高濃度の抗インスリン抗体を示すことが明らかになった。異なる母集団間に全く統計上の有意差は認められなかった。COMBO治療群のマウスは低レベルの方への傾向を示した。71D6治療群のマウスは、それぞれ低レベルと高レベルの自己抗体を有する２つの亜集団に明白に分類することができた。それらの結果は更なる調査を必要とするが、これらは抗CD3抗体処置も71D6処置もどちらもこの系での自己抗体の産生に影響を与えず、むしろ下流に作用して糖尿病の発症を予防するまたは遅らせるという仮説を全体的に強く裏付ける。〔詳細な説明〕

本明細書中で用いる場合、「膵島細胞」は、「ランゲルハンス島」としても知られる膵臓の島細胞を指し、α、βおよびδ島細胞に加えて島間質を含む。膵島細胞を同定する手段は当業者に知られており、例えば細胞生検の組織学的検査が知られている。

本明細書中で用いる場合の島細胞増殖の促進とは、HGF-METアゴニストを投与している対象において介入前の対象に比べて膵島細胞の増殖の増加を指す。同様に、島細胞増殖の促進は、HGF-METアゴニストを投与していない、対応するCONTROL（対照）対象に比較して、HGF-METアゴニストを投与した対象での膵島細胞の増加を指すことができる。膵島細胞増殖は、島密度（１mm²当たりの数）の増加、島サイズ（例えば面積）の増加、または島密度と島サイズの両方の増加により特徴づけられる。

本明細書中で用いる場合のβ島細胞の増殖の促進とは、介入前のその対象におけるものに比較した、HGF-METアゴニストを投与した対象におけるβ島細胞の増殖の増加を指す。同様に、β島細胞の増殖の促進とは、HGF-METアゴニストを投与していない同等のコントロール（対照）対象に比較して、HGF-METアゴニストを投与した対象における膵島細胞の増加を指す。膵島細胞の増殖は、島密度（１mm²当たりの数）の増加、島サイズ（例えば面積）の増加、または島密度と島サイズの両方の増加により特徴づけることができる。

本明細書中で用いる場合のインスリン産生の促進は、介入前の対象におけるものに比較して、HGF-METアゴニストを投与した対象における（β）島細胞によるインスリン産生の増加を指すことができる。同様に、インスリン産生の促進は、HGF-METアゴニストを投与していない同等のコントロール（対照）対象に比較して、HGF-METアゴニストを投与した対象における（β）島細胞によるインスリン産生の増加を指すことができる。インスリン産生は、血漿インスリン濃度の増加、β細胞密度の増加、β細胞面積の増加、インスリン陽性島細胞の密度および／または数の増加のうちの１つもしくは複数、またはそれらの尺度の任意組み合わせにより特徴づけることができる。

本明細書中で用いる場合の、膵臓組織移植とは、対象への任意の膵臓組織の移植を指す。移植は完全な臓器移植、すなわち完全な膵臓移植、または部分的膵臓移植であり得る。移植は、膵島移植と呼ばれることもある、膵島または島細胞の移植であってもよい。

本明細書中で用いる場合、「HGF-METアゴニスト」および「METアゴニスト」は、METタンパク質、すなわちMETと結合してMETのシグナル伝達を増加させるHGF以外の物質を介してシグナル伝達を促進する、非天然の物質を指すために互換的に使用される。METアゴニストによるMETの結合に対するアゴニスト活性は、HGF-MET結合によって誘導される分子応答および細胞応答を（少なくとも部分的に）模倣する、分子応答および／または細胞応答により指摘される。METアゴニスト活性を測定する適当な方法が、実施例をはじめとして本明細書中に記載される。「完全アゴニスト」は、生来のHGFリガンドの結合に応答してMETシグナル伝達が増加する程度と少なくとも類似している程度、および場合によりそれを超える程度に、結合に応答してMETシグナル伝達を増加させるMETアゴニストである。METシグナル伝達を測定する種々の方法により測定されるような、「完全アゴニスト」により誘導されるMETシグナル伝達のレベルの例が、本明細書中に提供される。

免疫抑制薬とも称される免疫抑制性物質は、本明細書中で用いる場合、対象において免疫応答を低減または阻害することが意図された治療薬、例えば抗炎症剤および寛容化剤を指す。免疫抑制薬の例としては、チェックポイント阻害薬（例えばPD-L1分子、CTLA4分子（例えばアバテセプト））、TNF阻害薬（例えば抗TNF抗体、エタネルセプト）、免疫寛容化樹状細胞、抗CD3抗体、抗炎症性サイトカイン（例えばIL-10）が挙げられる。

HGF-METアゴニストは小分子、結合タンパク質、例えば抗体もしくは抗原結合フラグメント、アプタマーまたは融合タンパク質であり得る。METアゴニストの特定例は抗METアゴニスト抗体である。

本明細書中で用いる場合、「治療（処置）」または「治療する（処置する）」とは、関連する状態の有効治療、すなわち対象者の健康の改善を指す。治療は、治療的処置であっても予防的処置であってもよく、すなわち、その状態を患っている対象の治療的処置、またはその状態に罹患するリスクを減少させるまたはいったん罹患した状態の重篤度を減少させるような対象の予防的処置であることができる。治療的処置は、処置前に比較して対象の健康の改善によって特徴付けることができる。治療的処置は、処置を受けなかった同等のコントロール（対照）対象に比較して、該対象の健康の改善により特徴づけることができる。治療的処置は、処置前に比較して対象の健康の安定化、すなわち対象の病状の進行の抑制によって特徴付けることもできる。予防的処置は、治療されなかったコントロール（対照）対象（またはコントロール対象の母集団）に比較して、対象者の健康の改善により特徴づけることができる。

本明細書中で用いる場合、「抗体」という用語は、目的の抗原（例えばヒトMET）に対する有意な特異的免疫反応活性を有する二本の重鎖と二本の軽鎖との組み合わせを有する免疫グロブリンを包含する。「抗MET抗体」または「MET抗体」という用語は、ヒトMETタンパク質に対して免疫学的特異性を示す抗体を指すために本明細書中で互換的に用いられる。ヒトMETに対する「特異性」は、METの種同族体との交差反応を排除しない。特に、本明細書中で用いる「agomAbs」は、ヒトMETとマウスMETの両方に結合するMET抗体を指す。

本明細書中で用いる場合の「抗体」は、任意のヒトクラス（例えばIgG、IgM、IgA、IgD、IgE）並びにそのサブクラス／アイソタイプ（例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1）の抗体を包含する。本明細書中で用いる場合の抗体は改変抗体も指す。改変抗体には、それらが天然に存在しないように改変されている合成形態の抗体、例えば少なくとも２つの重鎖部分を含むが２本の完全な重鎖を含まない抗体（例えばドメイン欠失抗体またはミニボディ）；２以上の異なる抗原にまたは単一抗原上の異なるエピトープに結合するように改変された抗体の多重特異性形態（例えば二重特異性、三重特異性など）；scFv分子に連結された重鎖分子等が含まれる。加えて、「改変抗体」という用語は、多価形態の抗体（例えば同一抗原の３以上のコピーに結合する三価、四価等の抗体）を包含する。

本明細書中に記載の抗体は、抗体エフェクター機能、例えば抗体依存性細胞介在性細胞毒性（ADCC）、補体依存性細胞毒性（CDC）および抗体依存性細胞貧食（ADCP）作用の１つまたは複数を有しうる。あるいは、幾つかの実施形態では、本発明に従って使用するための抗体は、１以上のエフェクター機能、例えば全てのエフェクター機能が無効になるように改変されているFc領域を有する。

抗体は、軽鎖と重鎖を含み、その間に鎖間共有結合を有するものと有さないものがある。抗体の抗原結合フラグメントは、抗体と同じ抗原（例えばMET）に対する特異的な免疫反応性活性を示すペプチドフラグメントを包含する。抗原結合フラグメントの例としてscFvフラグメント、Fabフラグメント、およびF(ab)2フラグメントが挙げられる。

本明細書では、「可変領域」と「可変ドメイン」は互換的に使用され、同等な意味を持つことが意図される。「可変」という用語は、可変ドメインVHとVLの幾つかの部分の配列が抗体間で広範囲に異なっていて、対応する標的抗原への個々の特定抗体の結合と特
異性にそれを利用するという事実を意味する。しかし可変性は、抗体の可変ドメインの全体に均一に分布しているわけではない。可変性は、VLドメインとVHドメインそれぞれの中にあって抗原結合部位を形成する「超可変ループ」と呼ばれる３つの区画に集中している。Vラムダ軽鎖ドメインの第１、第２、第３の超可変ループを本明細書ではL1（λ）、L2（λ）、L3（λ）と呼び、VLドメイン内の残基24～33（9個、または10個、または11個のアミノ酸残基からなるL1（λ））、残基49～53（3個の残基からなるL2（λ））および残基90～96（5個の残基からなるL3（λ））を含むと定義することができる（Morea他、Methods 第20巻、267～279頁、2000年）。Vカッパ軽鎖ドメインの第１、第２、第３の超可変ループを本明細書ではL1（κ）、L2（κ）、L3（κ）と呼び、VLドメイン内の残基25～33（6個、または7個、または8個、または11個、または12個、または13個のアミノ酸残基からなるL1（κ））、残基49～53（3個の残基からなるL2（κ））および残基90～97（6個の残基からなるL3（κ））を含むと定義することができる（Morea他、Methods 第20巻、267～279頁、2000年）。VHドメインの第１、第２、第３の超可変ループを本明細書ではH1、H2、H3と呼び、VHドメイン内の残基25～33（7個、または8個、または9個の残基からなるH1）、52～56（3個または4個の残基からなるH2）および残基91～105（長さが超可変的であるH3）を含むと定義することができる（Morea他、Methods 第20巻、267～279頁、2000年）。

特に断らない限り、L1、L2、L3という用語は、それぞれ、VLドメインの第1、第2、第3の超可変ループを意味し、VカッパアイソタイプとVラムダアイソタイプの両方から得られる超可変ループを包含する。H1、H2、H3という用語は、それぞれ、VHドメインの第1、第2、第3の超可変ループを意味し、既知の任意の重鎖アイソタイプ（γ、ε、δ、α、μが含まれる）から得られる超可変ループを包含する。

超可変ループL1、L2、L3、H1、H2、H3は、それぞれ、下に定義する「相補性決定領域」すなわち「CDR」の部分を含んでいる。「超可変ループ」と「相補性決定領域」という用語は、厳密には同義語ではない。というのも、超可変ループ（HV）は構造に基づいて決まるのに対し、相補性決定領域（CDR）は配列可変性に基づいて決まり（Kabat他、"Sequences of Proteins of Immunological Interest"、第5版、公衆衛生局、国立衛生研究所（NIH）、ベセスダ、メリーランド州、1991年）、いくつかのVHドメインとVLドメインではHVとCDRの制限が異なる可能性があるためである。

VLドメインとVHドメインのCDRは、典型的には以下のアミノ酸を含むと定義される：軽鎖可変ドメインの残基24～34（CDRL1）、残基50～56（CDRL2）および残基89～97（CDRL3）と、重鎖可変ドメインの残基31～35または31～35b（CDRH1）、残基50～65（CDRH2）および残基95～102（CDRH3）；（Kabat他、"Sequences of Proteins of Immunological Interest"、第5版、公衆衛生局、国立衛生研究所(NIH)、ベセスダ、メリーランド州、1991年）。従ってHVを対応するCDRの中に含めることができ、本明細書でVHドメインとVLドメインの「超可変ループ」に言及するときには、特に断わらない限り、対応するCDRも包含し、逆も同様であると解釈すべきである。

可変ドメインのより高度に保存された部分は、下に定義するように、フレームワーク領域（FR）と呼ばれる。天然型の重鎖と軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、大部分がβシート配置を採用していて３つの超可変ループによって接続された４つのFR（それぞれFR1、FR2、FR3、FR4）を含んでいる。それぞれの鎖の中の超可変ループはFRによって一緒に近接に保持され、そして他の鎖からの超可変ループと共同して、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。抗体の構造分析から、配列と、相補性決定領域によって形成される結合部位の形状との間の関係が明らかになった（Chothia他、J. Mol. Biol. 第227巻、799～817頁、1992年；Tramontano他、J. Mol. Biol、第215巻、175～182頁、1990年）。6つのループのうちの５つは、配列可変性が大きいにもかかわらず、採用している主鎖コンホメーション（立体配置）のレパートリーが非常に少なく、「標準的（canonical）構造」と呼ばれている。これらのコンホメーションは、第１にループの長さによって、第２にループ内とフレームワーク領域内の所定の位置にある鍵となる残基の存在によって決まり、それらの残基が、折り畳み（パッキング）、水素結合、通常ではない主鎖コンホメーションを取る能力を通して、そのコンホメーションを決定している。

本明細書では、「CDR」すなわち「相補性決定領域」という用語は、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチド両方の可変領域の中に見いだされる不連続な抗原結合部位を意味する。これらの特別な領域は、Kabat他、J. Biol. Chem. 第252巻、6609～6616頁、1977年、Kabat他、"Sequences of Proteins of Immunological Interest"、第5版、公衆衛生局、国立衛生研究所(NIH)、ベセスダ、メリーランド州、1991年と、Chothia他、J. Mol. Biol. 第196巻、901～917頁、1987年、MacCallum他、J. Mol. Biol. 第262巻、732～745頁、1996年に記載されている。これら文献の中の定義には、互いに比較した時の、アミノ酸残基の重複またはサブセットが含まれる。上に引用した文献のそれぞれによって定義されるCDRを包含するアミノ酸残基を比較のために示す。「CDR」という用語は、配列比較に基づいてKabatが定義したCDRであることが好ましい。

本明細書では、「フレームワーク領域」すなわち「FR領域」という用語には、可変領域の一部であるがCDRの一部ではない（例えばCDRに関するKabatの定義を用いる場合）アミノ酸残基が含まれる。従って可変領域フレームワークは長さが約100～120アミノ酸残基であるが、CDRの外側のアミノ酸だけを含んでいる。重鎖可変ドメインの具体例に関してと、Kabatらによって定義されるCDRに関しては、フレームワーク領域１は、アミノ酸1～30を包含する可変領域のドメインに対応し、フレームワーク領域２は、アミノ酸36～49を包含する可変領域のドメインに対応し、フレームワーク領域３は、アミノ酸66～94を包含する可変領域のドメインに対応し、フレームワーク領域４は、可変領域のアミノ酸103から可変領域の終末部までのドメインに対応する。軽鎖のフレームワーク領域は同様に各々の軽鎖可変領域CDRによって隔てられている。同様に、ChothiaらまたはMacCallumらによるCDRの定義を用いると、フレームワーク領域の境界は、上記の通りそれぞれのCDR終末部によって隔てられている。好ましい実施態様では、CDRはKabatによって定義される。

天然型の抗体では、各モノマー抗体の表面に存在する６つのCDRは、特別な位置にある短くて不連続なアミノ酸配列であり、抗体が水性環境で三次元配置を取ると抗原結合部位を形成する。重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの残部は、分子間のアミノ酸配列の可変性がより小さく、フレームワーク領域と呼ばれる。フレームワーク領域は大部分がβシートコンホメーションを採用しており、CDRは、βシート構造をつなぐループを形成し、ある場合にはβシート構造の一部を形成する。従って、これらフレームワーク領域は足場を形成する働きをし、鎖間非共有相互作用によって６つのCDRを正しい向きでの位置決定に備える。位置が決まったCDRによって形成される抗原結合部位は、免疫反応性抗原の表面のエピトープと相補的な表面を規定する。この相補的な表面が、免疫反応性抗原エピトープに抗体が非共有結合するのを促進する。CDRの位置は、当業者が容易に特定することができる。

本明細書では、「ヒンジ領域」という用語に、CH1ドメインをCH2ドメインに接続している重鎖分子の部分が含まれる。このヒンジ領域は約25個の残基を含んでいて可撓性があるため、２つのＮ末端抗体結合領域は独立に動くことができる。ヒンジ領域は３つの異なるドメインに分けることができ、すなわち上部ヒンジ、中央部ヒンジ、下部ヒンジのドメインに分けることができる。（Roux他、J. Immunol. 第161巻、4083～4090頁、1998年）。「完全にヒト」ヒンジ領域を含むMET抗体は、下記の表２に示したヒンジ領域配列の１つを含有することができる。

本明細書では、「CH2ドメイン」という用語には、通常の番号付け方法を用いると、抗体のほぼ残基244から残基360までに及ぶ重鎖分子の部分が含まれる（Kabat番号付け法では残基244～360；EU番号付け法では残基231～340；Kabat他、"Sequences of Proteins of Immunological Interest"、第5版、公衆衛生局、国立衛生研究所(NIH)、ベセスダ、メリーランド州（1991年））。CH2ドメインは他のドメインと密接に対合しないという点がユニークである。むしろ、２本のＮ結合した炭化水素分岐鎖が、完全な天然型IgG分子の２つのCH2ドメインの間に挿入されている。CH3ドメインがIgG分子のCH2ドメインからＣ末端まで延びていて、約108個の残基を含んでいることも文献に明確に記載されている。

本明細書では、「フラグメント」という用語は、抗体または抗体鎖のうちで、無傷のまたは完全な抗体または抗体鎖より少ない数のアミノ酸残基を含む箇所または部分を意味する。「抗原結合フラグメント」という用語は、抗原に結合するか、抗原結合（すなわちMETへの特異的結合）を目当てに完全抗体（すなわちそれらの起源となる完全抗体）と競合する、免疫グロブリンまたは抗体のポリペプチドフラグメントを意味する。本明細書では、抗体分子の「フラグメント」という用語には、抗体の抗原結合フラグメント（例えば抗体軽鎖可変ドメイン（VL）、抗体重鎖可変ドメイン（VH）、一本鎖抗体（scFv）、F(ab')2フラグメント、Fabフラグメント、Fdフラグメント、Fvフラグメント、単一ドメイン抗体フラグメント（DAb））が含まれる。フラグメントは、例えば無傷のまたは完全な抗体または抗体鎖の化学的処理もしくは酵素処理によって、または組み換え手段によって得ることができる。

本明細書で使用される場合、「対象」および「患者」は、ヒトの固体を指すために互換的に用いられる。「コントロール（対照）対象」とは、介入を受けていない同等の対象を指す。

本出願全体を通して、「含む」という用語は、具体的に言及された全ての特徴、並びに任意選択の、追加の、特定されていない特徴を包含すると解釈すべきである。本明細書で使用する場合、「含む」という用語の使用は、具体的に言及された特徴以外の特徴が１つも存在しない（すなわち「から成る」）実施形態も開示する。

治療法
本明細書では、HGF-METアゴニスト（特にMETアゴニスト抗体）が健常な対象の膵島細胞の増殖を促進することが実証される。また、METアゴニスト（特にMETアゴニスト抗体）が、膵島細胞の枯渇または損傷を経験している対象において膵島細胞を変性から保護することも実証される。更に、HGF-METアゴニスト（特にMETアゴニスト抗体）は、これらの対象の膵島細胞を保護するだけでなく、膵島細胞集団が枯渇または変性している対象において新しい膵島細胞の増殖と再生を促進する。更に、METアゴニストの投与によって誘発された新しい膵島細胞は、インスリン産生を回復させるので高度に機能的である。

膵島細胞の増殖を促進することは、糖尿病（特に１型糖尿病だけでなく２型糖尿病も）などの状態の根本的な病態生理を治療するので、特に有利である。既存の治療法は、食事療法としばしばインスリン注射を使用して症状を受動的に管理することに頼るものである。これらのアプローチは、疾患の根本的な原因に対処するものでない。本発明において、驚くべきことに、外因性の非天然型のHGF-METアゴニストの投与が膵島細胞の増殖と再生を効果的に促進することが同定された。従って、HGF-METアゴニスト（特にMETアゴニスト抗体）の投与は、膵細胞の分解の問題に対処する、臨床的に意義のある治療法への長年にわたる切実な医療ニーズに対する解決手段となる。

従って、一態様では、対象にHGF-METアゴニストを投与することを含む、膵島細胞の増殖を促進する方法が提供される。対象における膵島細胞の増殖を促進するために用いられるHGF-METアゴニスト、または対象における膵島細胞の増殖を促進するための医薬の製造のためのHGF-METアゴニストの使用も提供される。

更なる態様では、HGF-METアゴニストを対象に投与することを含む、必要とする対象におけるインスリン産生を促進する方法が提供される。この態様の好ましい実施形態では、当該方法は、膵島細胞の増殖の増加を誘発することを特徴とする。対象におけるインスリン産生を促進するために用いられるHGF-METアゴニスト、または対象におけるインスリン産生を促進するための医薬の製造のためのHGF-METアゴニストの使用も提供される。

更なる態様では、対象にHGF-METアゴニストを投与することを含む、糖尿病を治療する方法が提供される。この態様の好ましい実施形態では、当該方法は、膵島細胞の増殖の増加を誘発することを特徴とする。あるいは、または加えて、この方法はインスリン産生を促進することをさらに特徴とする。更なる態様では、糖尿病を治療する方法で使用されるHGF-METアゴニスト（例えばMETアゴニスト抗体）が提供され、HGF-METアゴニストは膵島細胞の増殖を促進する。更に別の態様では、糖尿病を治療する方法で使用するためのHGF-METアゴニストが提供され、HGF-METアゴニストはインスリン産生を促進する。対象の糖尿病を治療するために使用されるHGF-METアゴニスト、または対象の糖尿病を治療するための医薬品を製造するためのHGF-METアゴニストの使用も提供される。

本明細書において実証されるように、HGF-METアゴニスト（特にMETアゴニスト抗体）は、膵島細胞の増殖を促進する。この増殖は、膵島細胞面積の増加と膵臓組織中の島の密度の増加の両方によって特徴付けられる。

従って、本明細書で提供される全ての方法の好ましい実施形態では、当該方法は膵島細胞密度を増加させる。本明細書で提供される全ての方法の好ましい実施形態では、当該方法は膵島細胞面積を増加させる。

本明細書では、HGF-METアゴニスト（例えばMETアゴニスト抗体）が全ての膵島細胞、すなわち、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタおよびイプシロン細胞の増殖を促進することが示されている。従って、本明細書で提供される全ての方法の特定の実施形態では、当該方法は、アルファ細胞、ベータ細胞、ガンマ細胞、デルタ細胞およびイプシロン細胞のいずれか１つまたは複数の増殖を促進する。特定の実施形態では、当該方法は、アルファ細胞の増殖を促進する。特定の実施形態では、当該方法は、ベータ細胞の増殖を促進する。特定の実施形態では、当該方法は、ガンマ細胞の増殖を促進する。特定の実施形態では、当該方法は、デルタ細胞の増殖を促進する。特定の実施形態では、当該方法は、イプシロン細胞の増殖を促進する。

HGF-METアゴニスト（例えばMETアゴニスト抗体）がベータ島細胞の増殖を促進するのに特に有効であることが、本明細書で更に実証される。ベータ細胞はインスリン産生と効果的なグルコース調節に不可欠であり、糖尿病のような状態では分解されるため、これは特に有利である。HGF-METアゴニスト（例えばMETアゴニスト抗体）はベータ細胞の増殖を促進するだけでなく、それにより新しく産生された細胞は非常に機能的であり、インスリンを産生する。

従って、本明細書で提供される全ての方法の好ましい実施形態では、当該方法はベータ島細胞の増殖を促進する。好ましい実施形態では、当該方法はベータ島細胞の密度を増加させる。好ましい実施形態では、当該方法はベータ島細胞の面積を増加させる。好ましい実施形態では、当該方法は、インスリン産生ベータ細胞の増殖を促進する。

本明細書に記載される方法はまた、膵臓組織移植を受ける対象において特に有利である。膵臓組織移植は、膵島細胞が破壊されている対象（糖尿病患者など）で可能な治療法である。そのような移植片は、膵臓全体の移植片、膵臓の一部の部分的移植片、または単離された島の移植片という形態であり得る。どの場合でも、本明細書で提供される方法は、移植された島の生存に加えてそれらの細胞の増殖と拡大を促進するので、そのような移植および移植片を受ける患者において特に有利であろう。

従って、本明細書において提供される全ての方法の実施形態では、当該方法は、膵臓組織の移植を対象に施行することを更に含む。特定の実施形態では、当該方法は、部分的膵臓移植を対象に施行することを更に含む。特定の実施形態では、当該方法は、膵島移植片を対象に投与することを更に含む。そのような全ての実施形態では、HGF-METアゴニスト（例えばMETアゴニスト抗体）の投与および移植片の投与は、任意の順序で、または同時に実行することができる。

更なる態様では、必要とする対象において膵臓組織移植を改善する方法が提供され、この方法は、対象にHGF-METアゴニストを投与することを含む。対象における膵臓組織移植を改善するためのHGF－METアゴニスト、または対象における膵臓組織移植を改善するための医薬の製造のためのHGF-METアゴニストの使用も提供される。「膵臓組織移植の改善」とは、本明細書では、移植後のおよび生着した細胞もしくは組織の増殖後の移植片の生存が改善されることを意味する。

HGF-METアゴニスト（例えばMETアゴニスト抗体）の投与は、１型糖尿病の状況において特に有利である。１型糖尿病は、対象のベータ島細胞の有意でしばしば完全な分解を特徴とする。その結果として、対象はインスリンを産生できず、従って血糖（血中グルコース）を適切にコントロールすることができない。本明細書に示されるように、HGF-METアゴニスト（例えばMETアゴニスト抗体）の投与は、島細胞集団が枯渇している対象においてさえも膵島細胞（特にベータ細胞）を促進することができる。本明細書で提供される方法の結果としてのこれらの新しい島細胞は機能的であり、インスリンを産生する。従って、１型糖尿病患者は、本明細書で提供される方法から恩恵を受けるだろう。

従って、本明細書で提供される全ての方法の特定の実施形態では、対象は１型糖尿病を有する。

２型糖尿病は異なる病因メカニズムにより特徴づけられるが、（１型と同様に）ランゲルハンス島の変性を引き起こす。例えば、２型糖尿病に特徴的なインスリン抵抗性は、より多くのインスリンを産生することを対象のベータ細胞に要求し、最終的に膵島細胞の消耗と変性に至る。従って、膵島細胞、特にベータ細胞の再生は、２型糖尿病患者にとっても同様に満たされていない医療ニーズである。本明細書に示されているように、HGF-METアゴニスト（例えばMETアゴニスト抗体）は、２型糖尿病のモデルにおいて膵島細胞の増殖を促進し、ベータ細胞数の増加、インスリン産生の増加、従って血糖調節の改善をもたらす。

従って、本明細書で提供される全ての方法の特定の実施形態では、対象は２型糖尿病を有する。

インビトロ法
本明細書では、膵島細胞の増殖がHGF-METアゴニストにより促進されることが実証される。HGF-METアゴニスト（METアゴニスト抗体など）は、インビボ（in vivo）で重要な効果があるだけでなく、膵島細胞のインビトロ（in vitro）増殖にも有利に用いられる。膵島細胞のインビトロでの増殖を促進することは、例えば、島細胞移植片の準備において重要である。移植の準備で分離された膵島は、in vitroでの生存率が制限される。単離された膵島細胞をHGF-METアゴニスト（例えば抗METアゴニスト抗体）と接触させると、インビトロでの単離された膵島細胞の生存が延長される。その結果、効果的な移植のためのウインドウが延長され、移植された島のより多くの割合が生存可能になるだろう。同様に、移植される単離された島は、提供される方法に従ってHGF-METアゴニストを使用して拡大させることができ、それによって移植に利用可能な細胞集団を増加させることができる。

従って、更なる態様では、膵島細胞を含む細胞集団または組織の増殖を促進するためのインビトロ方法が提供され、この方法は、細胞集団または組織をHGF-METアゴニストと接触させることを含む。好ましい態様において、HGF-METアゴニストはMETアゴニスト抗体である。本発明はまた、膵島細胞または膵臓移植片をHGF-METアゴニスト、好ましくはMETアゴニスト抗体と接触させることを含む、膵島細胞または膵臓移植片を保存するエクスビボ（ex vivo；生体外）方法に関する。

対象または患者
本明細書に示されるように、METアゴニスト（例えばMETアゴニスト抗体）の投与は、機能的な膵島細胞の増殖を促進する。膵島細胞の増殖を促進することは、糖尿病、特に１型糖尿病と最近診断された患者、またはいわゆる「前糖尿病」の患者にとっても特に重要である。

典型的には、１型糖尿病の症状は青年期に現れる。しかしながら、病理が診断された時、患者の膵臓ベータ細胞の大部分がすでに破壊されている（50％超、例えば70％または80％の破壊）。ランゲルハンス島細胞の変性は、特に臨床症状が明らかになり、糖尿病の診断が最も一般的に行われるときに急速に発症する。その結果、効果的な治療介入の時間窓は狭い。これは、免疫抑制薬（膵島細胞の変性を制限するため）による治療が、診断直後、できれば６週間以内で最も効果的であるという事実によって証明される。

従って、本明細書で提供される方法の特定の実施形態では、対象は糖尿病と診断されており、METアゴニスト（例えばMETアゴニスト抗体）の初回投与が診断から６週間以内である。好ましくは、初回投与は、診断から５週間以内、４週間以内、または３週間以内である。

特定の実施形態では、対象は「前糖尿病」を有する。そのような実施形態では、「前糖尿病」は空腹時血漿グルコース（FPG）、経口ブドウ糖負荷試験（OGTT）、またはFPGとOGTTの両方の閾値に関する米国糖尿病境界（ADA）の閾値に従って定義することができる。

ADAの定義によれば、「前糖尿病」は空腹時血糖の障害、つまりFPGが少なくとも100 mg/dL（5.6ミリモル/L）であるが、126 mg/dL（7.0 ミリモル/L）未満であることを特徴とする。前糖尿病症は、耐糖能障害、すなわちOGTTの結果が少なくとも140 mg/dL（7.8ミリモル/L）であるが200 mg/dL（11.1ミリモル/L）未満である状態により特徴づけることもできる。空腹時血糖が126 mg/dL（7.0ミリモル/L）以上の患者は、糖尿病と診断される程度に低下した空腹時血糖を有する。200 mg/dL（11.1ミリモル/L）以上のOGTTを有する患者は、糖尿病と診断される程度に悪化した耐糖能障害を有する。

まだ部分的なグルコース調節を示している対象（例えば、糖尿病の早期段階にある対象、または「前糖尿病」）において膵島細胞の増殖を促進することは、これらの対象がまだ機能している島細胞の集団を有するだめ、特に有利である。従って、本発明による方法は、そのような患者が機能性の膵島細胞を有する期間を延長することができる。

従って、特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、前糖尿病を治療する方法である。

本明細書で提供される方法の特定の実施形態は、対象は5.6ミリモル/Lを超える空腹時グルコース（FPG）を示す。特定の実施形態では、対象は6.1ミリモル/Lを超える空腹時グルコース（FPG）を示す。特定の実施形態では、対象は5.6ミリモル/Lより大きく7.0ミリモル/L未満の空腹時グルコース（FPG）を示す。特定の実施形態では、対象は7.0ミリモル/L以上の空腹時グルコースを示す。

本明細書で提供される方法の特定の実施形態では、対象は100 mg/dLを超える空腹時グルコースを示す。特定の実施形態では、対象は110 mg/dLを超える空腹時グルコースを示す。特定の実施形態では、対象は100 mg/dLを超えかつ126 mg/dL未満の空腹時グルコース（FPG）を示す。特定の実施形態では、対象は110 mg/dLより大きくかつ126 mg/dL未満の空腹時グルコースを示す。特定の実施形態では、対象は126 mg/dL以上の空腹時グルコースを示す。

本明細書で提供される方法の特定の実施形態では、対象は7.8ミリモル/Lを超えるOGTTを示す。特定の実施形態では、対象は7.8ミリモル/Lより大きくかつ11.1ミリモル/L未満の空腹時グルコースを示す。特定の実施形態では、対象は11.1ミリモル/L以上の空腹時グルコースを示す。

本明細書で提供される方法の特定の実施形態では、対象は140 mg/dLを超えるOGTTを示す。特定の実施形態では、対象は140 mg/dLより大きくかつ200 mg/dL未満の空腹時グルコースを示す。特定の実施形態では、対象は200 mg/dL以上の空腹時グルコースを示す。

本明細書で提供される方法の特定の実施形態では、対象は青年期であり、すなわち、対象は年齢が10～19歳、例えば12～18歳である。

既に記載した通り、本明細書に提供される方法は、島細胞レベルが枯渇しているが機能的な島細胞集団をまだ有している対象にとって特に有利である。この理由は、当該方法が残った島細胞の生存力を促進し、そして同時に新たな島細胞の増殖と再生を促進することができるためである。

従って、本明細書で提供される全ての方法の特定の実施形態では、対象は健常個体よりも少なくとも50％小さい、膵島細胞の集団を有することにより特徴づけられる。特定の実施形態では、対象は健常個体よりも少なくとも70％、場合により少なくとも80％、少なくとも90％、または少なくとも95％小さい膵島細胞の集団を有する。特定の実施形態では、対象は健常個体よりも約70％～約80％小さい膵島細胞の集団を有する。

自己抗体による膵島細胞の破壊は、臨床的症状が明らかになり、糖尿病が診断される前のしばらくの間、起こり得る。この期間の間、島細胞抗原に対する自己抗体が検出され、膵島細胞の破壊が進行中であることを示す。本明細書中で提供される方法は、特に対象がまだ症候性でない場合に、そのような抗体が検出できるという点で、対象にとって特に有利であろう。この理由は、それらの対象が、当該方法を用いて保護し再生することができる機能性の島細胞集団をまだ有しているためである。

従って、特定の実施形態では、対象は、血清中で検出可能な島細胞抗原に対する自己抗体を有する。このような好ましい実施形態では、対象は糖尿病と診断されていない。幾つかの実施形態では、当該方法は対象の血清中の島細胞抗原に対する自己抗体のレベルを測定するステップと、そのレベルが健常対象に特徴的なレベルと比較して上昇している場合、METアゴニスト（例えばMETアゴニスト抗体）を投与するステップを含む。

成人の潜在的自己免疫性糖尿病（LADA）患者は、本明細書に提供さえる方法から特に恩恵を受けるだろう。LADAは、その進行が若年に診断される糖尿病よりも通常は遅い、糖尿病の一形態である。LADAは、Ｃペプチドの検出とともに、血糖コントロールの障害（例えば高血糖）により特徴づけることができる。対象は、膵島細胞に対する検出可能な抗体も有しうる。LADA患者での膵島細胞（特にβ島細胞）の変性はより遅延型である。結果として、そのような患者は機能性の島細胞集団をより長く保持するだろうと予想される。本明細書中に提供される方法は、残った島細胞の生存を促進することができ、それと同時に新しい島細胞の増殖と再生を促進することができるため、LADA患者に特に有益であろう。

従って、特定の実施形態では、対象はLADAを有する。特定の実施形態では、当該方法はLADAを治療する方法である。

本明細書中に記載の方法は、膵臓組織移植を受ける対象において特に有利である。膵臓組織移植は、膵島細胞がすでに破壊されている対象（糖尿病患者など）で可能な治療法である。そのような移植は、完全な膵臓移植、膵臓の一部の部分移植、または単離された島の移植の形態であることができる。全ての場合において、本明細書に提供される方法は、移植された島の生存並びにそれらの細胞の増殖と拡大を促進するため、そのような移植および移植片を受ける患者において特に有利である。

従って、本明細書で提供される全ての方法の特定の実施形態では、対象は以前に膵臓組織移植を受けたことがある。特定の実施形態では、対象は以前に完全膵臓移植を受けたことがある。特定の実施形態では、対象は以前に部分臓器移植を受けたことがある。特定の実施形態では、対象は、以前に膵島移植を受けたことがある。

本明細書に提供される全ての方法の好ましい実施形態では、対象は１型糖尿病を有する。本明細書で提供される全ての方法の好ましい実施形態では、対象は２型糖尿病を有する。

本明細書の他の箇所に記載の通り、提供される方法は、膵臓組織移植の状況において特に有利である。この状況において、当該方法は、移植された膵島細胞の増殖を促進するという点で特に有利である。しかしながら、当該方法は、膵島細胞を採取することができる健常対象、すなわちドナー対象に投与する時にも有利である。本明細書中で実証されるように、健常対象へのHGFアゴニスト（特にMETアゴニスト抗体）の投与は、副作用なしにそれらの膵島細胞の増殖を促進する。従って、移植用に膵臓組織を採取する予定となっている健常対象、すなわちドナー対象は、本明細書に提供される方法に従ったHGF-METアゴニスト（例えばMETアゴニスト抗体）の投与から恩恵を受けるだろう。その理由は、そうすることでそれらの膵島細胞の増殖を促進し、その結果、移植用により多くの細胞を提供できるからである。加えて、ドナーが生存ドナーである場合には、HGF-METアゴニスト投与後に残存する島細胞集団がより大きくなるだろう。

従って、提供される方法の特定の実施形態では、対象は健常なドナー対象である。

全ての態様の好ましい実施形態では、対象または患者は哺乳類、特にヒトである。

全ての態様の好ましい実施形態では、対象は当該方法が必要な対象であり、すなわち
それを必要とする対象に当該方法が施行される。
併用療法

本明細書で提供される方法に従って投与されるHGF-METアゴニストは、免疫抑制療法との併用療法として投与されると特に有利である。これは、免疫抑制薬が自己免疫を介した島細胞破壊を減少させることができるためである。しかしながら、この保護を有効にするためには、数週間または数カ月の期間にわたる免疫抑制薬の反復投与を必要とし得る。この遅滞期の間、島細胞は変性し続け、しばしば免疫抑制薬が臨床効果を果たす時間までに完全に破壊してしまう位に変性し続ける。本発明に従ったHGF-METアゴニストの投与は、島細胞の生存を延長することができる。従って、免疫抑制薬が有効性となる治療域（ウィンドウ）が長くなり、このことは併用療法が対象の島細胞を保護する上で有効である可能性が高いことを意味する。更に、島細胞の生存を延長することと同様に、本明細書中に提供される方法はそれらの増殖を促進する。従って、免疫抑制薬が膵島細胞の破壊を減少させ、それと並行してMETアゴニスト投与の結果として新しい島細胞の増殖と拡張を促進する、より長期の効果的治療ウィンドウ（時間窓）の結果として、併用療法はより効果的である。

従って、本明細書で提供される全ての方法および第二の医学的適応症の特定の実施形態では、対象に１または複数の免疫抑制薬が投与される。従って、特定の実施形態では、膵島細胞増殖を促進するため、インスリン産生を促進するため、および／または対象の糖尿病を治療するための、１以上の免疫抑制薬と組み合わせて使用するためのHGF-METアゴニストも提供される。１以上の免疫抑制薬による治療を受けている対象において、膵島細胞の増殖を促進するため、インスリン産生を促進するためおよび／または糖尿病を治療するために使用されるHGF-METアゴニストも提供される。

免疫抑制薬は、膵島細胞の自己免疫によって媒介される分解を低減する。特定の実施形態では、１または複数の免疫抑制薬は、以下からなるリストから選択される：シクロスポリンＡ；ミコフェノール酸、ビタミンD3、抗CD3抗体、抗IL-21抗体、抗CD20抗体（例えばリツキシマブ）、抗CTLA4抗体、抗TNFα抗体（例えばインフリキシマブ）、抗IL1α抗体、抗IL1β抗体、抗CD4抗体、抗CD45抗体、CTLA4分子（例えばアバタセプト）、TNFα阻害薬（例えばエタネルセプト）、PD-L1分子、IL-1受容体アンタゴニスト（例えばアナキンラ）、ペグ化顆粒球コロニー刺激因子（例えばペグフィルグラスチム）、ヒト組換えIFN-α、IL-10、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（GAD）-65、寛容化インスリンペプチド（例えばインスリンB：9-23、プロインスリンペプチド19-A3）、HSP60のDiaPep277、制御性Ｔ細胞（Treg）、および寛容化樹状細胞。例えば、GAD-65とIL-10は、例えば、両分子を発現するトランスジェニック細菌（例えばラクトコッカス）として一緒に投与することができる。

METアゴニスト（例えばMETアゴニスト抗体）と免疫抑制薬との投与の組み合わせは、早期の糖尿病を示す対象、またはグルコース調節障害を示す対象にとって特に有利である。特に好ましい患者または対象は、本明細書の「対象または患者」の項目において記載されているものである。

例えば、それは5.6ミリモル/Lより大きく、例えば5.6ミリモル/Lより大きく、かつ7.0ミリモル/L未満である空腹時血糖値を示す対象において特に有利であり得る。これらの患者は一部の膵島細胞が枯渇しているが、膵島細胞の集団をまだ残している。本明細書で提供される方法に従って免疫抑制薬とMETアゴニストを併用することにより、残存している島細胞集団を分解から保護し、新しい島細胞の増殖を促進することができる。

特定の実施形態では、本明細書で提供される方法および第２の医療適応症の使用は、抗糖尿病薬と組み合わせられる。糖尿病治療の例には、インスリン、食事の管理、メトホルミン、スルホニル尿素、チアゾリジンジオン、ジペプチジルペプチダーゼ-4阻害薬、SGLT2阻害薬、およびグルカゴン様ペプチド１類似体が含まれる。従って、特定の実施形態では、膵島細胞増殖を促進するため、インスリン産生を促進するため、および／または対象の糖尿病を治療するため、抗糖尿病薬と併用されるHGF-METアゴニストも提供される。また、膵島細胞の増殖を促進するため、インスリン産生を促進するため、および／または抗糖尿病薬による治療を受けている対象の糖尿病を治療するためのHGF-METアゴニストが提供される。

本明細書に提供される方法および第２の医療適応の使用は、インスリンの投与と更に有利に組み合わせることができる。インスリン療法は、本明細書で提供される方法が島細胞集団を増やしている期間中に、分解した島細胞集団の症状を管理することができる。

従って、本明細書に提供される方法および第２の医療適応の使用の全ての態様の特定の実施形態では、少なくとも毎日、すなわち少なくとも１日１回、場合によりより頻繁に対象にインスリンが投与される。

投与
本明細書で使用される場合、対象へのHGF-METアゴニスト（例えば抗METアゴニスト抗体）の投与は、有効量のアゴニストの投与を指すことが理解されるだろう。

特定の実施形態では、HGF-METアゴニスト（例えば抗METアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメント）は、１回量あたり約0.1 mg/kg～約40 mg/kg の範囲の用量で投与される。特定の実施形態では、HGF-METアゴニスト（例えば抗METアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメント）は、0.5 mg/kg～約35 mg/kg、任意で約1 mg/kgの範囲の用量で投与される。約30 mg/kgまで。特定の好ましい実施形態では、HGF-METアゴニスト（例えば抗METアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメント）は、約1 mg/kg～約10 mg/kgの範囲の用量、すなわち、約1、2、3、4、5、6、7、8、9または10 mg/kgの用量で投与される。特定の好ましい実施形態において、HGF-METアゴニスト（例えば抗METアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメント）は、1 mg/kg、3 mg/kg、10 mg/kgまたは30 mg/kgの用量で投与される。

HGF-METアゴニスト（例えば抗METアゴニスト抗体）を対象に投与するための適切な経路は、当業者に周知であろう。好ましくは、METアゴニストは非経口的に投与される。特定の好ましい実施形態では、HGF-METアゴニストは、経口または口から（p.o.）、皮下（s.c.）、静脈内（i.v.）、皮内（i.d.）、筋肉内（i.m.）または腹腔内（i.p.）に投与される。特定の好ましい態様において、HGF-METアゴニストはMETアゴニスト抗体であり、静脈内投与される。

HGF-METアゴニスト
本発明の全ての局面において、HGF-METアゴニストは対象または患者に投与されることになる。「HGF-METアゴニスト」と「METアゴニスト」は互換的に使用され、METタンパク質を介したシグナル伝達を促進する非天然型の薬剤、すなわちMETに結合してMETシグナル伝達を増加させるHGF以外の薬剤を指すために用いられる。そのような薬剤は、小分子、抗体または抗原結合フラグメントなどの結合タンパク質、アプタマーまたは融合タンパク質であり得る。 METアゴニストの特定の例は、抗METアゴニスト抗体である。

本明細書に記載のMETアゴニストによるMETの結合に対するアゴニスト活性は、HGF-MET結合によって誘導される分子応答および細胞応答を（少なくとも部分的に）模倣する分子応答および／または細胞応答によって示される。

本発明に従って、例えば、METアゴニスト抗体および抗原結合フラグメントによりMETアゴニスト作用性（agonism）を決定するための方法は、当業者に周知であろう。例えば、METアゴニスト作用性は、MET受容体のリン酸化および／または細胞応答、例えば細胞散乱アッセイ、抗アポトーシスアッセイおよび／または分枝形態アッセイにおいて検出可能であるもの等の分子応答により示すころとができる。

METアゴニスト作用性（アゴニズム）は、結合時のMET受容体のリン酸化レベルによって決定され得る。この状況では、METアゴニスト抗体または抗原結合フラグメントは、例えば、受容体－リガンド間の結合の欠損下でMETの自己リン酸化を引き起こす。すなわち、抗体または抗原結合フラグメントがMETに結合すると、HGFの不在下でMETのリン酸化が起こる。METのリン酸化は、当技術分野で公知のアッセイにより、例えばウエスタンブロット法またはホスホ-MET ELISA（Basilico他、J Clin Invest. 124巻、3172-3186頁、2014年に記載；これは参考により本明細書に組み入れられる）、決定することができる。

METアゴニスト作用性は、あるいはHGF様細胞応答の誘導によって測定することもできる。 METアゴニスト作用性は、細胞散乱アッセイ、抗アポトーシスアッセイ、および／または分枝形態形成アッセイなどのアッセイを使って測定することができる。これに関連して、METアゴニスト、例えば抗体または抗原結合フラグメントは、例えばHGFへの暴露後に観察される応答に（少なくとも部分的に）似ているような細胞アッセイでの応答を誘導する。

例えば、METアゴニスト（例えばMETアゴニスト抗体）は、対照抗体（例えばIgG1）に曝露された細胞と比較して、抗体応答性の細胞散乱を増加させることができる。

更なる例として、METアゴニスト（例えばMETアゴニスト抗体）は、32 nM未満のEC50で、薬物誘発性アポトーシスに対する保護力を示し得る。更なる例として、METアゴニスト（例えばMETアゴニスト抗体）は、未処置の細胞と比較して20％を超えるEmax細胞生存力を示し得る。

更なる例として、METアゴニスト（例えばMETアゴニスト抗体）は、抗体または抗原結合フラグメントに曝露された細胞スフェロイド調製物中のスフェロイドあたりの分枝の数を増加させることができる。

本発明に従って使用されるMETアゴニストは、METシグナル伝達を天然リガンドであるHGFの少なくとも70％の大きさに促進することが好ましく、すなわち、アゴニストが「完全アゴニスト」であることが好ましい。特定の実施形態では、METアゴニストは、HGFの少なくとも80％、場合により少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％または少なくとも100％の大きさにシグナル伝達を促進する。

特定の実施形態では、METアゴニズム（受容体活性化作用）がリン酸化アッセイを使用して決定される場合、METアゴニスト、例えばMET抗体は、1 nM未満のEC50を有する、METに対する効力を示す。特定の実施形態では、METアゴニスト、例えばMET抗体は、METアゴニズムに関して少なくとも80％のEmax（最大HGF誘発性活性化の百分率として）の効力を示す。

特定の実施形態では、METアゴニズムが細胞散乱アッセイで測定される場合、METアゴニスト、例えばMET抗体または抗原結合フラグメントは、抗体濃度が0.1～1 nMである場合に少なくとも0.1 nMの相同HGFに等しい細胞散乱の増加を誘導する。

特定の実施形態では、METアゴニズムが抗アポトーシスアッセイで測定される場合、METアゴニスト（例えば、MET抗体またはそのフラグメント）は、HGFのそれの1.1倍以下のEC50を示す。特定の実施形態では、METアゴニズムが抗アポトーシスアッセイで測定される場合、METアゴニスト（例えば、MET抗体またはそのフラグメント）は、HGFについて観察されたものに比較して90％を超えるEmax細胞生存率を示す。

特定の実施形態では、METアゴニズムが分枝形態形成アッセイで測定される場合、METアゴニスト（例えば、MET抗体または抗原結合フラグメント）で処置された細胞は、同じ（ゼロでない）HGF濃度により誘導されるスフェロイドあたりの分枝の数の90％超を示す。

本発明の全ての態様で特に好ましいHGF-METアゴニストは、抗METアゴニスト抗体であり、これは本明細書中で「METアゴニスト抗体」、「アゴニスト抗体」およびそれの文法的変形としても称される。言い換えれば、本発明に従って使用するためのMETアゴニスト抗体（またはその抗原結合フラグメント）はMETに結合し、METを介した細胞シグナル伝達を促進する。

実施例に示されるように、METアゴニスト抗体71D6および71G2は、膵島細胞の増殖、特に島β細胞の増殖を効果的に促進する。71D6および71G2は、METのSEMAドメインのエピトープ、特にSEMAのβプロペラのブレード４または５のエピトープに結合する。従って、METのSEMAドメイン上のエピトープ、特にSEMAのβプロペラのブレード４－５に結合するMETアゴニスト抗体は、膵島細胞の増殖、特にベータ細胞の増殖を促進することが実証された。

従って、特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、METアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することを含み、抗体または抗原結合フラグメントは、METのSEMAドメインのエピトープに結合する。特定の好ましい実施形態において、抗体またはそのフラグメントは、SEMA βプロペラのブレード上に位置するエピトープに結合する。特定の実施形態では、エピトープは、SEMAのβプロペラのブレード４または５に位置する。特定の好ましい実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、METのアミノ酸314～372の間に位置するエピトープに結合する。

実施例に示されるように、71D6を含むMETのSEMAドメインに結合するMETアゴニスト抗体は、残基Ile367および残基Asp371を含むMET上のエピトープに結合することが分かった。これらの残基のいずれかでの変異は、METへの抗体の結合を減弱させ、その２つの残基の変異は結合を完全に無効にする。

従って、特定の好ましい実施形態では、本明細書に記載の方法は、METアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメント（断片）を投与することを含み、ここで前記抗体または抗原結合フラグメントは、アミノ酸残基Ile367を含むエピトープを認識する。特定の好ましい実施形態では、本明細書に記載の方法は、METアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することを含み、ここで前記抗体または抗原結合フラグメントは、アミノ酸残基Asp371を含むエピトープを認識する。

特定の好ましい実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、METのアミノ酸残基Ile367およびAsp372を含むエピトープに結合する。

SEMAドメインに結合するMETアゴニスト抗体と同様に、他のMETドメインに結合するアゴニスト抗体も本明細書に記載される。例えば、71G3はMETのPSIドメイン上のエピトープに結合する。実施例で実証されるように、抗体71G3はまた、試験した全てのモデルにおいて膵島細胞の増殖を促進することができる。

従って、特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、METアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することを含み、ここで前記抗体または抗原結合フラグメントは、METのPSIドメインのエピトープに結合する。特定の好ましい実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、METのアミノ酸546と562の間に位置するエピトープに結合する。

実施例に示されるように、71G3を含むMETのPSIドメインに結合するMETアゴニスト抗体は、残基Thr555を含むMET上のエピトープに結合することが分かった。この残基の変異は、PSI結合アゴニスト抗体のMETへの結合を完全に無効にした。

従って、特定の好ましい実施形態では、本明細書に記載の方法は、METアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することを含み、ここで前記抗体または抗原結合フラグメントは、アミノ酸残基Thr555を含むエピトープを認識する。

本明細書に記載の方法での使用に特に適したMETアゴニスト抗体の例は、本明細書に記載の抗MET抗体のCDRに対応するCDRの組み合わせを有するものである。従って、特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、表３に記載のMETアゴニスト抗体からのVH CDRの組み合わせに対応するVHおよびVL CDR配列の組み合わせ、および表４の同抗体のVL CDRの対応する組み合わせを含む。

特定のこのような実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、表３に記載のMETアゴニスト抗体からのVH CDRの組み合わせに対応するCDRの組み合わせ、および表４の同じ抗体のVL CDRの対応する組み合わせを含み、さらに表６に記載の抗体の対応するVHおよびVL配列と少なくとも90％、場合により少なくとも95％、場合により少なくとも99％、好ましくは100％の配列同一性を有するVHおよびVLドメインを含む。明確化のため、そのような実施形態では、VHおよびVLドメイン配列の同一性％についての許容される変動は、CDR領域には存在しない。

実施例で実証されるように、71D6、71G2および71G3は、METの「完全アゴニスト」であるMETアゴニスト抗体である。すなわち、これらの抗体がMETに結合すると、シグナル伝達応答は、天然HGFリガンドの結合に対する応答と同様か、それを超える。これらの抗体はそれぞれ、膵島細胞の増殖を効果的に促進することが本明細書で実証された。従って、本明細書に記載の全ての態様と方法の特定の好ましい実施形態では、当該方法は、完全アゴニストであるHGF-METアゴニスト、すなわち、HGFが結合する時のMETシグナル伝達と類似またはそれを超える程度に、結合時にMETシグナル伝達を促進するアゴニストを投与することを含む。 METアゴニズムを測定するための例および完全アゴニストの効果の例は、本明細書で既に記載されている。

実施例で実証されるように、完全アゴニストである抗MET抗体などのMET完全アゴニストの例としては、71D6、71G2および71G3が挙げられる。従って、本明細書に記載の全ての方法の特に好ましい実施形態では、当該方法は、METの完全アゴニストであるMETアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することを含む。

METアゴニスト抗体71D6、71G2および71G3はそれぞれ、膵島細胞の増殖を効果的に促進することが立証された。従って、本明細書に記載の全ての態様および方法の好ましい実施形態では、抗体またはフラグメントは、抗体71D6（配列番号30、32、34、107、109、および111）、抗体71G2（配列番号：44、46、48、121、123、および125）、または抗体71G3（配列番号：9、11、13、86、88、および90）の対応するCDR配列を有するCDRの組み合わせを含む。

全ての態様の好ましい実施形態では、METアゴニストは、［71D6］配列番号30のHCDR1、配列番号32のHCDR2、配列番号34のHCDR3、配列番号107のLCDR1、配列番号109のLCDR2、および配列番号111のLCDR3を有するMETアゴニスト抗体またはその抗体結合フラグメントである。

好ましいそのような実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、以下を含む：配列番号163またはそれと少なくとも90％同一、場合により少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％同一の配列を含むVHドメイン；および配列番号164またはそれと少なくとも95％、場合により少なくとも98％または少なくとも99％同一の配列を含むVLドメイン。明確にするために、そのような実施形態では、VHおよびVLドメイン配列の同一性％における許容される変動は、CDR領域にはない。

本明細書に記載される使用のためのMETアゴニスト抗体は、VHドメインとVLドメインの両方が存在する多様な異なる実施形態をとることができる。本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）を含むが、それらがヒトMETタンパク質およびマウスMETタンパク質に対する免疫学的特異性を示す限り、それに限定されない。本明細書で使用する「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量存在する可能性のある自然発生突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原部位に対して向けられる。さらに、典型的には抗原上の異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含む、従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基またはエピトープに対して向けられたものである。

「抗体フラグメント（断片）」は、全長抗体の一部、一般的にはその抗原結合ドメインまたは可変ドメインを含む。抗体フラグメントの例には、Fab、Fab '、F（ab'）2、二重特異性Fab's、およびFvフラグメント、ダイアボディ、線形抗体、一本鎖抗体分子、一本鎖可変フラグメント（scFv）、および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が含まれる（Holliger & Hudson、Nature Biotechnol、23：1126-1136、2005を参照。その内容は参照により本明細書に組み入れられる）。

本明細書で提供される全ての態様の好ましい実施形態では、ＭＥＴアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメントは二価である。

非限定的な実施形態では、本明細書で提供されるMET抗体は、そのアミノ酸配列が完全にまたは実質的にヒトであるCH1ドメインおよび／またはCLドメインを含み得る。従って、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメインおよびCLドメイン（および存在する場合はCH4ドメイン）の１つ以上または任意組み合わせは、そのアミノ酸配列に関して完全にまたは実質的にヒトであり得る。そのような抗体は、任意のヒトアイソタイプ、例えばIgG1またはIgG4のものであり得る。

有利には、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメインおよびCLドメイン（および存在する場合はCH4ドメイン）は全て、完全または実質的にヒトのアミノ酸配列を有し得る。ヒト化またはキメラ抗体または抗体フラグメントの定常領域との関連において、「実質的にヒト」という用語は、少なくとも90％、または少なくとも92％、または少なくとも95％、またはヒト定常領域では少なくとも97％、または少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を指す。この文脈における「ヒトアミノ酸配列」という用語は、生殖系列遺伝子、再構成された遺伝子および体細胞変異遺伝子を含む、ヒト免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を指す。このような抗体は、任意のヒトアイソタイプのものであり得、ヒトIgG4およびIgG1が特に好ましい。

METアゴニスト抗体は、「完全にヒト」のヒンジ領域の存在が明確に必要とされる実施形態を除いて、ヒト配列に対して１以上のアミノ酸の追加、削除、または置換によって変更された「ヒト」配列の定常ドメインを含むことができる。本発明のMET抗体における「完全にヒト」のヒンジ領域の存在は、免疫原性を最小化することおよび抗体の安定性を最適化することの両方に有益であり得る。

METアゴニスト抗体は、任意のアイソタイプ、例えばIgA、IgD、IgE、IgG、またはIgMであってよい。好ましい実施形態では、抗体は、IgGタイプ、例えば、IgG1、IgG2aおよびb、IgG3またはIgG4である。 IgG1およびIgG4が特に好ましい。これらの各サブクラス内で、Fc部分内で1つ以上のアミノ酸の置換、挿入、または削除を行ったり、他の構造変更を行ったりすることができる。

非限定的な実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換、挿入または欠失が、重鎖および／または軽鎖の定常領域内、特にFc領域内で行われ得ることが企図される。アミノ酸置換により、置換されたアミノ酸が、天然に存在する異なるアミノ酸、または非天然または修飾アミノ酸で置換される可能性がある。例えばグリコシル化パターンの変化（例えば、N-またはO-結合グリコシル化部位の付加または欠失による）などの他の構造的改変も可能である。MET抗体の意図する用途に応じて、Fc受容体への結合特性に関して本発明の抗体を改変すること、例えばエフェクター機能を調節することが望ましい場合がある。

特定の実施形態では、MET抗体は、所与の抗体アイソタイプ、例えばヒトIgG1のFc領域を含むことができ、これは、その抗体アイソタイプに天然に関連づけられる１以上の抗体エフェクター機能を低減させるまたは実質的に排除するために改変される。非限定的な実施形態では、MET抗体は、抗体エフェクター機能を実質的に欠いている場合がある。この文脈において、「抗体エフェクター機能」は、抗体依存性細胞傷害（ADCC）、補体依存性細胞傷害（CDC）および抗体依存性細胞貪食（ADCP）の１以上または全てを含む。

MET抗体のFc部分のアミノ酸配列には、１以上の抗体エフェクター機能を低下させる効果（変異を持たない野生型の対応抗体と比較して）があるアミノ酸置換、欠失または挿入などの１以上の変異が含まれる場合がある。そのようないくつかの変異は、抗体工学の分野で知られている。本明細書に記載のMET抗体に含めるのに適した非限定的な例としては、ヒトIgG4またはヒトIgG1のFcドメインにおける以下の変異が挙げられる：N297A、N297Q、LALA（L234A、L235A）、AAA（L234A、L235A、G237A）、またはD265A（ヒトIgG1のEU番号付け法によるアミノ酸残基番号）。

従って、本発明の全ての態様の特定の実施形態では、抗METアゴニスト抗体は、ヒトMETとマウスMETの両方に対するアゴニスト抗体である。

医薬組成物
また、本発明に従って提供されるのは、本明細書に記載の方法で使用するための医薬組成物である。従って、本発明の更なる態様では、HGF-METアゴニスト、例えば抗METアゴニスト抗体と、本発明による方法で使用するための薬学的に許容される賦形剤または担体とを含む医薬組成物が提供される。適切な薬学的に許容される担体および賦形剤は、当業者に周知であろう。本発明の医薬組成物に含めるのに適した薬学的に許容される担体および賦形剤の例には、クエン酸ナトリウム、グリシン、ポリソルベート（例えばポリソルベート80）および生理食塩水が含まれる。

特定の実施形態では、METアゴニスト、例えば抗METアゴニスト抗体は、非経口的に、好ましくは静脈内（i.v.）で対象に投与される。特定の実施形態では、METアゴニスト、例えば抗METアゴニスト抗体は、持続的静脈内注入として投与される。所望の用量が達成されるまで注入される。

特定の実施形態では、METアゴニスト、例えば抗METアゴニスト抗体は、非経口的に、好ましくは腹腔内（i.p.）で対象に投与される。

本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することによって更によく理解されよう。

実施例1：抗METアゴニスト抗体の作製―ラマの免疫化

ラマの免疫化と末梢血リンパ球（PBL）の採集、並びにその後のRNAの抽出と抗体フラグメントの増幅は、記載の通り（De Haard 他、J. Bact. 第187巻：4531～4541頁、2005年）に実施した。２頭の成体ラマ（Lama glama）を、ヒトIgG1のFc部分に融合したヒトMETの細胞外ドメイン（ECD）からなるキメラタンパク質（MET-Fc；R&D Systems社）の筋肉内注射によって免疫化した。それぞれのラマは、毎週１回の注射を６週間に渡り受け、計６回の注射を受けた。各注射は、フロイント不完全アジュバント中の0.2 mgタンパク質で構成され、それを首の２箇所に分割して行った。

免疫化の前後に血液サンプルを10 mL採取して免疫応答を調べた。最後の免疫処置の約１週間後に血液を400 mL採取し、Ficoll-Paque法を用いてPBLを得た。フェノール－グアニジンチオシアネート法（Chomczynski他、Anal. Biochem. 第162巻：156～159頁、1987年）によって全RNAを抽出し、SuperScript^TM III First-Strand Synthesis Systemキット（Life Technologies社）を用いたランダムcDNA合成のための鋳型として使用した。記載の通り（de Haard他、J Biol Chem. 第274巻：18218～18230頁、1999年）、ラマIgG1のVH-CH1領域とVL-CLドメイン（κとλ）をコードするcDNAを増幅し、ファジミドベクターpCB3へのサブクローニングを実施した。組み換えファジミドを用いて大腸菌株TG1（Netherland Culture Collection of Bacteria）を形質転換し、４つの異なるFab発現ファージライブラリー（免疫化したラマ１頭につき１つのλライブラリーと１つのκライブラリー）を作製した。多様性は10⁸～10⁹の範囲であった。

抗原に対する免疫応答をELISAにより調べた。このために、標準的タンパク質工学技術によりヒトMETのECD（UniProtKB # P08581；アミノ酸 1～932）とマウスMETのECD（UniProtKB # P16056.1；アミノ酸 1～931）を取得した。ヒトまたはマウスのMET ECD組み換えタンパク質を固相に固定化し（96ウエルのプレートに100 ng/ウエル）、免疫処置の前（0日目）または後（45日目）にラマ由来血清の逐次希釈液に曝露した。マウス抗ラマIgG1（Daley他、Clin. Vaccine Immunol. 第12巻、2005年）とHRP結合ロバ抗マウス抗体（Jackson Laboratories社）を用いて結合を明らかにした。両ラマともヒトMET ECDに対して免疫応答を示した。ヒトMETの細胞外部分がマウス相同体（オルソログ）と87％相同性を示すという見解と一致して、極めて優れた交差反応性がマウスMET ECDでも観察された。

実施例２：ヒトMETとマウスMETの両方に結合するFabの選択とスクリーニング

標準的なファージ提示プロトコルに従って、上記ライブラリーからFab発現ファージを作製した。選択のため、最初に固定化された組み換えヒトMET ECDにファージを吸着させ、洗浄した後、トリプシンを用いてファージを溶離させた。ヒトMET ECDを用いた２サイクルの選択の後、同じようにしてマウスMET ECD を用いて別の２サイクルを実施した。それと並行して、ヒトMET ECDサイクルとマウスMET ECDサイクルを交互に合計で４サイクル行う方法でもファージを選択した。この２つのアプローチにより選択されたファージを合わせてプールした後、TG1大腸菌を感染させるのに使用した。個々のコロニーを単離した後、IPTG（Fermentas社）を用いてFabの分泌を誘導した。細菌のFab含有ペリプラスム画分を回収し、その画分がヒトとマウスのMET ECDに結合する能力を、表面プラズモン共鳴（SPR）によって調べた。酢酸ナトリウム緩衝液（GE Healthcare社）中でアミンカップリングを利用してヒトまたはマウスのMET ECDをCM-5チップに固定化した。Fab含有ペリプラスム抽出物をBIACORE（登録商標）3000装置（GE Healthcare社）に流速30μL/分で装填した。Fabの解離速度（k_off）を２分間にわたって測定した。固相中のMET ECDと溶液中の粗ペリプラスム抽出液を用いるELISAにより、ヒトMETとマウスMETへのFabの結合を更に特徴づけた。FabはMYCフラグにより遺伝子操作されているため、HRP結合抗MYC抗体（ImTec Diagnostics社）を用いて結合を明らかにした。

SPRとELISAの両方法においてヒトMETとマウスMETの双方に結合したFabを選択し、それらのFabに対応するファージを配列決定した（LGC Genomics社）。交差反応性Fab配列を、VH CDR3配列の長さと内容に基づいて複数のファミリーに分類した。VHファミリーには、IMTG（国際免疫遺伝学情報システム）命名法に基づかない国内番号を付与した。結局、８つのVHファミリーに属する11個の異なるヒト／マウス交差反応性Fabを同定することができた。重鎖可変領域のCDR配列とFR配列を表３に示す。軽鎖可変領域のCDR配列とFR配列を表４に示す。重鎖可変領域と軽鎖可変領域の全アミノ酸配列を表５に示す。重鎖可変領域と軽鎖可変領域の全DNA配列を表６に示す。

種々のFabファミリーと、それらファミリーがヒトMETとマウスMETに結合する能力を表７に示す。

実施例３：mAb中へのFabのキメラ化

選択されたFabフラグメントのVHドメインとVL（κまたはλ）ドメインをコードするcDNAを操作し、ヒトIgG1またはヒトCL（κまたはλ）のCH1、CH2、CH3をコードするcDNAをそれぞれ含有する２つの別々のpUPE哺乳動物発現ベクター（U-protein Express社）中に導入した。

得られたラマ－ヒトキメラIgG1分子の産生（哺乳動物細胞の一過性トランスフェクションによる）と精製（プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによる）をU-protein Express社に外注した。固相中のhMET ECDまたはmMET ECDと、溶液中の漸増する濃度の抗体（０～20 nM）を用いるELISAにより、METへのキメラmAbの結合を調べた。結合は、HRP結合抗ヒトFc抗体（Jackson Immuno Research Laboratories社）を用いて明らかにした。この分析により、全てのラマ－ヒトキメラ抗体がヒトMETとマウスMETにピコモル濃度の親和力で結合し、0.06 nM～0.3 nMの範囲に含まれるEC₅₀を示すことが分かった。結合能（E_max）は、おそらく固定化抗原の中でのエピトープの部分的露出のために、抗体ごとに異なっていたが、ヒトとマウスの背景で同様であった。EC₅₀とE_maxの値を表９に示す。

キメラ抗MET抗体が生存細胞の中の生来のヒトMETとマウスMETに結合するかどうかも分析した。その目的で、漸増する濃度の抗体（0～100 nM）をA549ヒト肺癌細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC））またはMLP29マウス肝前駆細胞（Enzo Medico教授からの寄贈、トリノ大学、Strada Provinciale 142 km 3.95、カンディオーロ、トリノ、イタリア国；Medico他、Mol Biol Cell 第7巻、495～504頁、1996年）とともにインキュベートした。両細胞ともMETを生理学的レベルで発現する。フィコエリトリン結合抗ヒトIgG1抗体（eBioscience社）とCyAn ADPアナライザー（Beckman Coulter社）を用いるフローサイトメトリーにより、細胞への抗体結合を分析した。ヒトMETへの結合に関する陽性対照として、市販のマウス抗ヒトMET抗体（R&D Systems社）とフィコエリトリン結合抗マウスIgG1抗体（eBioscience社）を使用した。マウスMETへの結合に関する陽性対照として、市販のヤギ抗マウスMET抗体（R&D Systems社）とフィコエリトリン結合抗ヤギIgG1抗体（eBioscience社）を使用した。全ての抗体がヒト細胞とマウス細胞の両方に対して用量依存的結合を示し、EC₅₀は0.2 nM～2.5 nMの間で変動した。ELISAで得られたデータと一致して、最大結合（E_MAX）は抗体によって異なっていたが、ヒト細胞とマウス細胞で同様であった。これらの結果は、ヒト細胞系とマウス細胞系の両方において、ラマ－ヒトキメラ抗体が、膜結合型METをその生来のコンホメーションで認識することを示す。EC₅₀とE_MAXの値を表10に示す。

実施例４：抗体結合を担う受容体領域

ヒトMETとマウスMETの両方に結合する抗体（本明細書では以降、ヒト／マウス同等抗MET抗体と称する）により認識される受容体領域をマッピングするため、記載された通り（Basilico他、J. Biol. Chem. 第283巻、21267～21227頁、2008年）に作製した、ヒトMET由来の遺伝子操作されたタンパク質のパネルに結合するそれら抗体の能力を測定した。このパネルは以下を含んだ：全 MET ECD（デコイMET）；IPTドメイン３と４を欠いたMET ECD（SEMA-PSI-IPT 1-2）；IPTドメイン１～４を欠いたMET ECD（SEMA-PSI）；単離されたSEMAドメイン（SEMA）；IPTドメイン３と４を含むフラグメント（IPT 3-4）。操作されたMETタンパク質を固相に固定化し、漸増する濃度のキメラ抗体（0～50 nM）を含む溶液に曝露した。HRP結合抗ヒトFc抗体（Jackson Immuno Research Laboratories社）を用いて結合を示した。表11に示すように、この分析により、７つのmAbがSEMAドメイン内のエピトープを認識する一方で、他の４つのmAbはPSIドメイン内のエピトープを認識することが明らかになった。

抗体結合を担うMETの領域をより詳細にマッピングするため、当方抗体とラマMET（これらの免疫グロブリンを産生させるのに用いた生物体）との間の交差反応性の不在を調べた。その目的で、全MET ECDに広がる一連のラマ－ヒトおよびヒト－ラマのキメラMETタンパク質を記載の通り（Basilico他、J Clin Invest. 第124巻、3172～3186ページ、2014年）に作製した。キメラを固相に固定化した後、漸増する濃度のmAb（0～20 nM）を含む溶液に曝露した。HRP結合抗ヒトFc抗体（Jackson Immuno Research Laboratories社）を用いて結合を明らかにした。この分析により、５つのSEMA結合mAb（71D6、71C3、71D4、71A3、71G2）が、ヒトMETのアミノ酸314～372に位置するエピトープを認識することが明らかになった。これは、７枚のブレード（羽根）を持つSEMAのβプロペラのブレード４～５に対応する領域である（Stamos他、EMBO J. 第23巻、2325～2335頁、2004年）。他の２つのSEMA結合mAb（74C8、72F8）は、それぞれアミノ酸123～223と224～311の間に位置するエピトープを認識する。その位置は、SEMAのβプロペラのブレード１～３と１～４に対応する。PSI結合mAb（76H10、71G3、76G7、71G12）は、２つのPSIキメラのいずれとも有意な結合を示さないように見えた。表11に示した結果を考慮すると、これらの抗体は、おそらくヒトMETのアミノ酸546～562の間に位置するエピトープを認識するのだろう。これらの結果は表12に要約される。

実施例５：HGF競合アッセイ

上記分析は、幾つかのヒト／マウス同等抗MET抗体により認識されるエピトープが、METに結合する時にHGFにより嵌め込まれるエピトープと重複する可能性があることを示唆している（Stamos他、EMBO J. 第23巻、2325～2335頁、2004年；Merchant他、Proc Natl Acad Sci USA第110巻、E2987～E 2996頁、2013年；Basilico他、J Clin Invest. 第124巻、3172～3186頁、2014年）。この考え方に従って調べるため、ELISAによりmAbとHGFとの間の競合を分析した。組み換えヒトおよびマウスHGF（R&D Systems社）を、NHS-LC-ビオチン（Thermo Scientific社）を使ってＮ末端の所でビオチン化した。ヒトまたはマウスのいずれかのMET－Fcタンパク質（R&D Systems社）を固相に固定化し、抗体の濃度を漸増させながら（0～120 nM）、ヒトまたはマウスの0.3 nMビオチン化HGFに曝露した。METへのHGFの結合を、HRP結合ストレプトアビジン（Sigma-Aldrich社）を用いて明らかにした。表13に示すように、この分析により、ヒト／マウス同等抗MET mAbを２つのグループに分けることができた：すなわち、完全HGF競合体（71D6、71C3、71D4、71A3、71G2）と部分的HGF競合体（76H10、71G3、76G7、71G12、74C8、72F8）。

原則として、SEMA結合体はPSI結合体よりもHGFをより効果的に置換した。特に、SEMAβプロペラのブレード４と５の内部のエピトープを認識する抗体は、最も強力なHGF競合体であった（71D6、71C3、71D4、71A3、71G2）。この知見は、SEMAのブレード５がHGFのα鎖の高親和性結合部位を含むという見解と一致する（Merchant他、Proc Natl Acad Sci USA 第110巻、E2987～E2996頁、2013年）。PSIドメインがHGFと直接関与するとは示されていないが、SEMAドメインとIPT領域の間においてHGFの収容能力を調整する「ヒンジ」として機能することが示唆されている（Basilico他、J Clin Invest. 第124巻、3172～3186ページ、2014年）。従って、PSIに結合するmAb（76H10、71G3、76G7、71G12）は、このプロセスを妨害することによりまたは立体障害により、しかもリガンドとの直接競合によってでなく、METへのHGFの結合を妨害すると思われる。最後に、SEMAのβプロペラのブレード１～３は、HGFのβ鎖の低親和性結合の原因であることが示されており、これはMET活性化に中心的役割を果たすが、HGF-MET結合強度には部分的にしか寄与しない（Stamos他、EMBO J. 第 23巻、2325～2335頁、2004年）。これにより、METのその領域に結合するmAb（74C8、72F8）がなぜHGFの部分的競合体であるかの理由を説明することができる。

実施例６：MET活性化アッセイ
受容体チロシンキナーゼに対して向けられた免疫グロブリンは、その二価性質のために、天然リガンドの作用を模倣する、受容体アゴニスト活性を示し得る。この考えに従って研究するために、受容体活性化アッセイにおいてMET自己リン酸化を促進するヒト／マウス同等抗MET抗体の能力を試験した。A549ヒト肺癌細胞およびMLP29マウス肝前駆細胞から、48時間に渡り血清成長因子を奪取し、次いで漸増する濃度（0～5 nM）の抗体または組み換えHGF（A549細胞、組み換えヒトHGF、R&D Systems社；MLP29細胞、組み換えマウスHGF、R&D Systems社）を用いて感作した。15分間感作した後、細胞を氷冷リン酸塩緩衝生理食塩水（PBS）で２回洗浄した後、記載されている通り（Longati他、Oncogene 第9巻、49～57頁、1994年）溶解させた。タンパク質溶解物を電気泳動で分離し、METのリン酸化型（チロシン 1234-1235）に特異的な抗体を使用して、ヒトであるかマウスであるかに関係なく、ウエスタンブロット法により分析した（Cell Signaling Technology社）。同じ溶解物を、抗－全ヒトMET抗体（Invitrogen社）または抗－全マウスMET抗体（R&D Systems社）を使用したウエスタンブロット法によって分析した。この分析により、全てのヒト／マウス同等抗MET抗体がMETアゴニスト活性を示すことが明らかになった。一部の抗体（71G3、71D6、71C3、71D4、71A3、71G2、74C8）は、HGFに匹敵する程度にMETの自己リン酸化を促進した。他の幾つかの抗体（76H10、76G7、71G12、72F8）は効力が弱く、これは特に低い抗体濃度で明白であった。MET活性化活性とHGF競合活性との間に明確な相関関係は観察されなかった。

より定量的なデータを得るために、抗体のアゴニスト活性を、リン酸化MET ELISAによっても特徴づけた。この目的で、A549細胞とMLP29細胞を上記のように血清飢餓状態にした後、漸増する濃度（0～25 nM）のmAbで感作した。組み換えヒト（A549）HGFまたは組み換えマウス（MLP29）HGFを対照として使用した。細胞を溶解させ、リン酸化METレベルを記載の通りに（Basilico他、J Clin Invest. 第124巻、3172～3186頁、2014年）ELISAにより測定した。簡単に述べると、96ウエルプレートをマウス抗ヒトMET抗体またはラット抗マウスMET抗体（両方ともR&D Systems社）でコーティングし、次いで細胞溶解物とともにインキュベートした。洗浄後、捕捉されたタンパク質をビオチン結合抗ホスホチロシン抗体（Thermo Fishe社）とともにインキュベートし、HRP結合ストレプトアビジン（Sigma-Aldrich社）を用いて結合を明らかにした。

この分析の結果は、ウエスタンブロット法によって得られたデータと一致している。表14に示すように、71G3、71D6、71C3、71D4、71A3、71G2、74C8は、METを強力に活性化したが、一方で76H10、76G7、71G12、72F8は、それほど顕著な効果を引き起こさなかった。いずれの場合でも、全ての抗体がヒト細胞とマウス細胞で同等な効果を示した。

実施例７：散乱アッセイ
ヒト／マウス同等抗MET抗体のアゴニスト活性を生物活性に翻訳できるかどうかを評価するために、ヒトとマウスの両方の上皮細胞を用いて散乱アッセイを実施した。この目的で、HPAF-IIヒト膵腺癌細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC））とMLP29マウス肝前駆細胞を、漸増する濃度の組み換えHGF（ヒトまたはマウス；両方ともR&D Systems社）で感作し、その24時間後に記載の通りに（Basilico他、J Clin Invest. 第124巻、3172～3186ページ、2014年）細胞散乱を顕微鏡検査した。この予備的分析により、HGFで誘導される細胞散乱が、両細胞系において約0.1 nMで飽和に到達するまで直線形であることが明らかになった。これらのHGF標準曲線に基づき、0（HGFが非存在で細胞散乱がまったくない）から４（0.1 nM HGFの存在下で細胞散乱が最大）までのスコア付け方法を創出した。HPAF-II細胞とMLP29細胞を、漸増濃度のヒト／マウス同等抗MET抗体で感作し、24時間後に上記のスコア付け方法を用いて細胞散乱を測定した。表15に示すように、この分析により、試験した全てのmAbがヒト細胞系とマウス細胞系の両方で細胞散乱を促進し、両種で実質的に重複する結果を与えることが明らかになった。71D6と71G2は、HGFとまったく同じ活性を示し；71G3と71A3は、HGFよりも効力がごくわずかに小さく；71C3と74C8は、HGFと同じ活性になるには相当高い濃度を必要とし；71D4、76G7、71G12、72F8はこのアッセイで飽和に到達しなかった。

実施例８：薬物誘発アポトーシスからの保護

いくつかの実験的証拠の系列は、HGFがMET発現細胞に対して有力な抗アポトーシス作用を示すことを示唆している（Nakamura他、J Gastroenterol Hepatol. 第26巻 増補1、188～202頁、2011年による概説）。ヒト／マウス同等抗MET抗体の潜在的抗アポトーシス活性を調べるため、細胞ベースの薬物誘発生存分析を実施した。MCF10Aヒト乳房上皮細胞（ATCC；アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）とMLP29マウス肝前駆細胞を、漸増する濃度のスタウロスポリン（Sigma Aldrich社）とともにインキュベートした。48時間後、CellTiter-Glo（登録商標）キット（Promega社）を用いてVictor X4多標識プレートリーダー（Perkin Elmer社）で全ATP濃度を測定することによって細胞生存率を求めた。この予備的分析から、約50％細胞死を誘導する薬物濃度は、MCF10A細胞では60 nMであり、MLP29細胞では100 nMであることが明らかになった。次に、MCF10A細胞とMLP29細胞を、漸増する濃度（0～32 nM）の抗MET mAbまたは組み換えHGF（ヒトまたはマウス；両方ともR&D Systems社）の存在下にて、上記で求めた濃度の薬物とともにインキュベートした。48時間後、上記のようにして細胞生存率を求めた。表16に示したこの分析の結果は、ヒト／マウス同等抗体が、スタウロスポリンで誘発される細胞死からヒト細胞とマウス細胞を同程度に保護したことを示している。ヒト細胞系またはマウス細胞系において、いくつかのmAb（71G3、71D6、71G2）がHGFと同等かそれよりも優勢な保護活性を示したが、他の分子（76H10、71C3、71D4、71A3、76G7、71G12、74C8、72F8）は部分的保護しか示さなかった。

実施例９：分枝形態形成アッセイ

HGFは多面発現性（pleiotropic）サイトカインであり、独立した複数の生物活性（細胞増殖、運動性、侵入、分化、生存が含まれる）の調和的な制御を促進する。これらの活性全てを良好に再現するための細胞ベースのアッセイは、胚発生の間の管状臓器と管状腺の形成を再現する分枝形態形成アッセイである（Rosario & Birchmeier、Trends Cell Biol. 第13巻、328～335頁、2003年による概説）。このアッセイでは、上皮細胞のスフェロイドを三次元コラーゲンマトリックスの内側に播種し、HGFによって刺激して細管を発芽させ、それが最終的に分枝構造を形成する。これらの分枝状細管は、極性細胞によって囲まれた管腔を掲示するという点で、上皮の腺（例えば乳腺）の中空構造に似ている。このアッセイは、インビトロで実施できる最も完成したHGFアッセイである。

ヒト／マウス同等抗MET抗体がこのアッセイにおいてアゴニスト活性を示すかどうかを調べるため、記載される通り（Hultberg他、Cancer Res. 第75巻、3373～3383頁、2015年）にLOCヒト腎上皮細胞（Michieli他、Nat Biotechnol. 第20巻、488～495頁、2002年）とMLP29マウス肝前駆細胞をコラーゲン層の中に播種した後、漸増する濃度のmAbまたは組み換えHGF（ヒトまたはマウス；両方ともR&D Systems社）に曝露した。分枝形態形成の経時変化を顕微鏡により追跡し、５日後にコロニーを撮影した。分枝形態形成活性の定量は、各スフェロイドについて分枝の数を数えることによって得られた。表17に示すように、試験した全ての抗体が、用量依存的な分枝細管の形成を誘導した。しかしんがら、MET自己リン酸化アッセイおよび細胞散乱アッセイで得られたデータと一致して、71D6、71A3、71G2が最も強力なアゴニスト活性を示し、それは組み換えHGFのものと同様、またはより優勢であった。

実施例10：精細エピトープマッピング

ヒト／マウス同等抗MET抗体により認識されるMETのエピトープを精細にマッピングするため、以下の戦略を採用した。ラマで産生された、ヒトMETに対して向けられた抗体がマウスMETと交差反応するならば、この抗体はおそらく、ヒト（H. sapiens）とマウス（M. musculus）の間で保存されているがヒト（H. sapiens）とマウス（M. musculus）とラマ（L. glama）の間では保存されていない残基（または複数残基）を認識するだろうと推論した。同じ推論を、ラット（R. norvegicus；ドブネズミ）とカニクイザル（M. fascicularis）へと拡張することができる。

この考え方に従って調べるため、ヒトMET（UniProtKB # P08581；アミノ酸 1～932）、マウスMET（UniProtKB # P16056.1；アミノ酸 1～931）、ラットMET（NCBI # NP_113705.1；アミノ酸 1～931）、カニクイザルMET（NCBI # XP_005550635.2；アミノ酸 1～948）、ラマMET（GenBank # KF042853.1；アミノ酸 1～931）のアミノ酸配列を互いにアラインメントさせて比較した。表12を参照して、抗体71D6、71C3、71D4、71A3、71G2（ヒトMETのアミノ酸314～372）並びに抗体76H10と71G3（ヒトMETのアミノ酸546～562）への結合を担うMETの領域内に焦点を絞った。ヒトMETの前方の領域（アミノ酸314～372）には、ヒトMETとマウスMETでは保存されているがラマMETでは保存されていない５つの残基（Ala327、Ser336、Phe343、Ile367、Asp372）が存在する。これらのうちの４残基（Ala327、Ser336、Ile367、Asp372）は、ラットMETとカニクイザルMETでも保存されている。ヒトMETの後方の領域（アミノ酸546～562）には、ヒトMETとマウスMETでは保存されているがラマMETでは保存されていない３つの残基（Arg547、Ser553、Thr555）が存在する。これらのうちの２残基（Ser553とThr555）はラットMETとカニクイザルMETでも保存されている。

ヒトMETを鋳型として使用し、これらの残基のそれぞれを異なる順列で突然変異させることにより、ラマである特定の残基以外は全てヒトである一連のMET変異体を作製した。次に、選択されたSEMA結合mAb（71D6、71C3、71D4、71A3、71G2）とPSI結合mAb（76H10と71G3）がこれらのMET変異体に対して示す親和性をELISAにより調べた。その目的で、さまざまなMETタンパク質を固相に固定化した（96ウェルのプレートに100 ng／ウエル）後、漸増濃度（0～50 nM）の抗体溶液に曝露した。使用した抗体はヒト定常領域形であったため、HRP結合抗ヒトFc二次抗体（Jackson Immuno Research Laboratories社）を用いて結合を明らかにした。野生型ヒトMETを陽性対照として用いた。この分析の結果を表18に示す。

上に示した結果は、本発明のアゴニスト抗体への結合に関連のある残基の明確で鮮明な描像を提供する。

試験した全てのSEMA結合体（71D6、71C3、71D4、71A3、71G2）は、SEMAのβプロペラのブレード５の中にあってヒトとマウスとカニクイザルとラットのMETでは保存されているがラマMETでは保存されていない２個の重要なアミノ酸（Ile367とAsp372）を含む同じエピトープに結合するように見える。実際、Ala327、Ser336、Phe343の変異は結合に全く影響を与えなかった。一方でIle367の変異は結合を部分的に減弱させ、Ile367とAsp372の変異は結合を完全に無効にした。このことから、ヒトMETのIle367とAsp372の両方が、試験したSEMAに向けられた抗体への結合にとって極めて重要であると結論づけられる。

試験したPSI結合体（76H10、71G3）も同様なまたは同一のエピトープに結合するようである。しかしながら、SEMAエピトープとは異なり、PSIエピトープはヒト、マウス、カニクイザルおよびラットのMETでは保存されているがラマMETでは保存されていない唯一の重要なアミノ酸（Thr555）を含有する。実際、Arg547またはSer553の変異は結合に全く影響を及ぼさなかったが、一方でThr555の変異は完全に結合を無効にした。このことから、試験したPSIに向けられた抗体への結合のためには、Thr555が極めて重要な決定基であると結論づけられる。

実施例11：METアゴニスト抗体は、健常マウスにおいてランゲルハンス島増殖および膵β細胞再生を促進する

膵β細胞に対するMETアゴニスト抗体の生物学的効果をインビボで評価するために、雄雌両方の成熟BALB/cマウス（Charles River）を、3か月間に渡り0、3、10または30 mg/kgの精製71D6抗体で全身処置した（１群あたり性別ごとに６匹のマウスから成る計48匹の動物）。抗体を週２回腹腔内（i.p.）注射により投与した。体重と空腹時血糖濃度を試験期間の間毎月測定した。３か月期間の終わりに、マウスを犠牲にし；膵臓を回収し、パラフィン包埋し、組織学的分析のため処理した。切片をヘマトキシリンとエオシン染色し、顕微鏡検査し、撮影した。画像をImageJ（登録商標）ソフトウェア（National Institutes of Health）を使って解析し、ランゲルハンス島の数とサイズを測定した。

71D6での慢性治療は、雄雌のいずれの動物においても全体重に影響を与えなかった（図１Ａ）。同様に、空腹時動物で測定した基準血糖はいずれの抗体用量でも変化がなかった（図１Ｂ）。他方、膵臓切片の組織学的分析は、71D6アゴニスト抗体での処置が用量依存形式でランゲルハンス島の数を有意に増加させることを示した（図２Ａ）。未処置の対照動物（0 mg/kg）では、膵臓切片の１単位（mm²）あたりの島の数は約３であった。試験した最大用量（30 mg/kg）では、mm²あたりの島の数は６の値に達し；3 mg/kgおよび10 mg/kgの用量では島密度が中間的な数値を示した。71D6での処置は、ランゲルハンス島サイズも有意に増加させた（図２Ｂ）。対照動物では、平均島サイズは約0.01 mm²であった（ヘマトキシリンとエオシンで染色した組織切片の顕微鏡下でのイメージングにより測定した時の、島切片の面積として表す）。3 mg/kgの用量では、平均島面積は0 mg/kgに比較して２倍増加し；10 mg/kgの用量では、対照に比較して３倍増加；30 mg/kgの用量では、処置動物に比較して島サイズは４倍大きかった。ヘマトキシリンとエオシンで染色した膵切片の代表的な画像は図２Ｃに示される。

興味深いことに、抗インスリン抗体を用いた免疫組織化学的分析は、膵臓のβ細胞集団の拡大とインスリン発現の増強をもたらすことを明らかにした（図３）。この知見は、71D6で誘導されるランゲルハンス島のサイズ増加が、膵β細胞の過剰増殖によるものであることを示唆する。更に、増強されたインスリン発現は、それらのβ細胞が健全でありかつ機能的であることを証明する。まとめると、上記結果は、71D6が膵β細胞の分裂促進因子およびプロ再生（pro-regenerative）因子として作用することを示す。

実施例12：METアゴニスト抗体は、１型糖尿病のマウスモデルにおいてランゲルハンス島の増殖と膵β細胞の再生を促進する

アゴニスト作用性抗MET抗体がβ細胞の分裂促進因子として働くという観察結果に促されて、１型糖尿病のマウスモデルにおいてそれらの治療可能性を試験した。低用量のストレプトゾトシン（STZ；β細胞を選択的に致死させる化学物質であり、実験動物において１型糖尿病を誘発させるために用いられる標準化合物である）の複数回投与により、マウスにおいて膵β細胞のアブレーション（焼灼）を果たした。

STZを40 mg/kgの用量で連続５日間に渡り24時間毎に、雌BALB-cマウス（Charles River）中に腹腔内（i.p.）注射した。最後の注射の一週間後に、STZ処置マウスは、未処置のマウスに比較して２倍高い平均基礎血糖を示した（240 mg/dL 対 120 mg/dL）。このことは、この化学薬品がβ細胞を効率的に致死させたことを示唆する。この時点で、各々基礎血糖に基づいて、マウスを７匹のマウスからなる４つの群に無作為に割り付けた：(i) 賦形剤のみ(PBS)、(ii) 精製71D6抗体、(iii) 精製71G2抗体、(iv) 精製71G3抗体、での処置を受ける群。抗体は1 mg/kgの用量で一週間に２回、i.p.注射により投与した。追加の５番目の治療群は、STZも抗体も投与しない７匹の動物を含み、これは健常対照群として働いた。実験は８週間続行した；実験期間の間、血糖をモニタリングした。８週間の最後に、マウスを犠牲にし、剖検に供した。分析用に採血し、膵臓を抽出し、組織学用に処理し、そしてパラフィン包埋した。

図４Ａに示す通り、STZ処置マウスでの基礎血糖値は時間と共に増加し続けた。これは、STZで誘発されるβ細胞損傷が慢性的な膵臓炎を引き起こし、臓器損傷の進行性悪化に至る。興味深いことに、抗体投与は血糖を完全には正常化しなかったが、それをより正常レベルの方に有意に低下させた。処置開始から６週間後（すなわち最終STZ注射から７週間後）、STZのみで処置したマウスは、約250 mg/dLの平均基礎血糖を示し；STZと71D6で処置したマウスは約150 mg/dLの平均基礎血糖を示し；STZと71G2または71G3とで処置したマウスはわずかに高い血糖を示したが、STZ単独治療群よりもまだ有意に低かった。対照の未処置のマウスは、96 mg/dLの平均基礎血糖を示した（図４Ｂ）。

ランゲルハンス島に対するMETアゴニスト抗体の効果を調べるために、膵臓切片をヘマトキシリンとエオシンで染色し、顕微鏡により分析した。ランゲルハンス島のデジタル画像をImageJ（登録商標）ソフトウェア（National Institutes of Health）を使って解析した。ランゲルハンス島の数、密度およびサイズをデジタルデータ解析によって決定した。図５Ａに示すように、STZ投与は、この化合物のみで処置したマウスの膵臓中のランゲルハンス島の数を大幅に減少させた。対照的に、STZと71D6で処置したマウスは、未処置の対照マウスで観察されたものに非常によく似た、より正常なランゲルハンス島密度を示した。STZ処置はランゲルハンス島サイズにも大きな影響を与え；それを６倍超減少（すなわち1/6未満に減少）させた（図５Ｂ）。顕著であるのは、71D6がこの減少に拮抗してそれを1.5倍にまで制限した点である。71G2と71G3を用いた場合にも同様な結果が得られたが、それは同様であるが僅かに少ない効力であった（71D6＞71G2＞71G3の順）。ヘマトキシリンとエオシンで染色した膵臓切片の代表的画像は図５Ｃに示される。

膵臓切片を抗インスリン抗体を使った免疫組織化学により更に分析した。この分析により、STZがランゲルハンス島の数とサイズを減少させるだけでなく、β細胞を大幅に削減し、そして結果としてインスリン産生も大きく減産させることが明らかになった。同様に顕著には、METアゴニスト抗体処置は、STZで誘導される破壊からβ細胞を救済し、インスリン産生を高く維持した。これは、STZのみを投与したマウスに比較して、STZとMETアゴニスト抗体の両方で処置した動物において観察される、より低い血糖値を説明することができるだろう。抗インスリン抗体で染色された膵臓切片の代表的画像が図６に示される。

実施例13：METアゴニスト抗体は、２型糖尿病のマウスモデルにおいてランゲルハンス島の増殖と膵β細胞の再生を促進する

抗METアゴニスト抗体が健常マウスと１型糖尿病モデルにおいて膵β細胞の再生を誘導するという観察結果に促されて、他の関連する適応症において治療可能性を更に試験する
ことにした。２型糖尿病は異なる病因メカニズムにより特徴づけられるが、２型糖尿病もランゲルハンス島の変性を引き起こす。事実、２型糖尿病はインスリン抵抗性の存在下での高インスリン血症を特徴とし、高血糖値を引き起こし、β細胞がインスリンの需要増加を補うことができなくなる（Christoffersen他、Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 297: 1195-1201, 2009）。従って、β細胞の再生は、同じく２型糖尿病患者にとっても満たされていない医療ニーズである。

２型糖尿病におけるアゴニストMET抗体の治療可能性を探るために、db/db肥満マウスモデルを選択した。この動物は、レプチン遺伝子中の突然変異のために、過食症、肥満、高インスリン血症、高血糖症である。肥満は３～４週齢から明らかに現れ、高インスリン血症は２週目あたりに明らかになり始め、そして高血糖症は４～８週の間に発症する。雌db/dbマウスは７週齢でCharles Riverから入手した。１週間後、動物を各５匹のマウスから成る４つの治療群に無作為に割り付け、その各群は(i) 賦形剤のみ(PBS)、(ii) 精製71D6抗体、(iii) 精製71G2抗体、(iv) 精製71G3抗体、での処置を受けた。抗体は1 mg/kgの用量で一週間に２回、i.p.注射により投与した。db/dbマウスのバックグラウンド株はC57BL6/Jであることを考慮して、それらのマウスを健常対照動物として使用した。全実験期間中、血糖をモニタリングした。８週間の処置後（16週齢時）に、マウスを犠牲にし、剖検に供した。膵臓を抽出し、組織学用に処理し、そしてパラフィン包埋した。ランゲルハンス島を可視化するために、組織切片をヘマトキシリンとエオシンで染色した。β細胞およびインスリン産生を抗インスリン抗体を使った免疫組織化学分析により浮き彫りにした。

図７Ａに示す通り、未処置のdb/dbマウスは７週齢時に既にかなり進行した高血糖（約240 mg/dL）を示していた。その後、血糖値は300 mg/dLを超えるプラトーに達するまで着実に増加した。興味深いのは、71D6、71G2および71G3 で処置したマウスは実験期間を通して有意に低い血糖を示したが、対照のC57BL6/Jマウスのそれとは一致しなかった。実験の終わりに、db/db未処置マウスは約330 mg/dLの基礎血糖を示し；71D6で処置したdb/dbマウスは代わりに約140 mg/dLの平均基礎血糖を示し；71G2-および71G3で処置したマウスは約180 mg/dLの基礎血糖を示した（図７Ｂ）。

膵臓切片をヘマトキシリンとエオシンで染色し、顕微鏡により分析し、写真撮影した。ランゲルハンス島をImageJ（登録商標）ソフトウェアを使って解析し、島の数、密度およびサイズを推定した。この解析により、年齢の一致するC57BL6/J対照に比較して、16週時のdb/dbマウスでは、ランゲルハンス島が数とサイズの両方の観点から極端に変性していることが明らかになった。実際に、C57BL6/Jマウスは2.3島／mm²の平均膵島密度を示し、一方で未処置のdb/dbマウスは1.6島／mm²の島密度を示した（図８Ａ）。とりわけ、島密度は71D6で処置したdb/dbマウスで劇的に増加し、健常対照において観察された密度（4.4島／mm²）よりも有意に高い数値に達した。島サイズも、C57BL6/J対照に比較してdb/dbマウスで大幅に減弱した（図８Ｂ）。後者の株では、ランゲルハンス島は0.3 mm²の平均面積を有し、これは未処置のdb/dbマウスで約10分の１に減少した。顕著には、71D6処置は島サイズの減縮を完全に救済し、C57BL6/J健常マウスに特徴的なものと同様であるかまたはそれより大きい値にさえも回復させた。島の数とサイズの両方に関して同様な結果が71G2 および71G3処置で得られたが、その効力はわずかに低かった（71D6＞71G2＞71G3の順）。ヘマトキシリンとエオシンで染色した膵臓切片の代表的画像を図８Ｃに示す。

本発明者らは、71D6のβ細胞集団に特異的に作用するその能力を評価することにより、71D6の生物学的効果を特徴づけた。この目的で、膵臓切片を抗インスリン抗体を使った免疫組織化学により分析した。この分析により、db/dbマウスでの少数の生存している島が
、健常対照に比較して非常に少ないインスリン発現性のβ細胞を含むことが明らかになった（図９）。対照的に、71D6、71G2または71G3で処置したdb/dbマウスはかなり多くの機能的β細胞を含み、それらの細胞はかなり高レベルのインスリンを発現した。これは71D6治療群で特に明白であり、この抗体が71G2と71G3よりもより有力であることを確証する。

これらの結果並びに前の実施例に与えた結果は、71D6、71G2 および71G3 METアゴニスト抗体が、インスリンの正常レベルの維持に貢献するβ細胞の生存と再生を促進することを証明する。機能的β細胞を回復させることが糖尿病の症状と糖尿病患者の生活の質（QOL）を有意に改善することを考えて、本発明者らはアゴニスト抗MET抗体がクリニックでの糖尿病治療のための革新的なツールとなりうることを提案する。

重要なことに、クリニックにMETアゴニスト抗体を転送するための重要な要件は、げっ歯類と非ヒト霊長類をはじめとする前臨床種とのそれらの完全な交差反応性である。実際、本発明者らは、マウスにおいて71D6、71G2および71G3 の治療活性を証明することができた。というのは、それらがヒトMETとマウスMETの間で完全な交差反応性を維持しているからである。更に、71D6はヒト、マウス、ラットおよびサル起源の組織において全く同じ生物活性と効力を惹起する。この種間同等性なしには、記載のMETアゴニスト抗体をヒト初回投与試験（first-in-human）の方に進めることは不可能であるだろう。主にこの理由のために（すなわち前臨床種での同等性の欠如）、従来技術で知られるいずれのアゴニストMET抗体も、前臨床モデルで試験することはできなかったし、それゆえ必要な効果の証明を欠いている。

更にこの道筋に従って、１型と２型糖尿病の両方を治療するための別のアプローチとして、全臓器としてのまたは単離したランゲルハンス島もしくは精製したβ細胞を使用する、膵臓移植が代表される（Kieffer他、J Diabetes Investig. 2017, 印刷前のepub（電子書籍形式）；doi: 10.1111/jdi.12758）。このアプローチは、特に移植術の不十分さと、受容者における移植β細胞の生存率不足に関連して、幾つかの限界がある。本明細書に記載のMETアゴニスト抗体がβ細胞の再生とインスリン分泌を促進する高い能力を有するとすれば、それらは膵臓組織への移植の有用性を改善し、移植を受ける患者でβ細胞集団を増幅させることも可能である。

実施例14：METアゴニスト抗体は、自己免疫１型糖尿病のマウスモデルにおいて、膵臓のβ細胞機能を保存し、糖尿病の発症を予防し、免疫抑制薬と協働作用する
１型糖尿病は膵臓のβ細胞の自己免疫介在性破壊により特徴づけられ、不十分なインスリン分泌を引き起こし、組織が血糖を取り込むことができなくなる。自己抗体介在性β細胞破壊は、高血糖表現型が現れるより前に始まる。インスリン依存性糖尿病と診断された時点で、典型的には青年期の間に、β細胞破壊は既に進行し、元の生き残っているβ細胞の画分がごくわずかとなる。更に、β細胞破壊は非常に急速に進行するため、診断後の治療介入のための枠は非常に狭くなる。

免疫抑制薬は、自己免疫媒介性島細胞破壊を減少させる努力の一環として、新たに診断された１型糖尿病患者のための治療法として研究され続けている。しかしながら、免疫抑制薬は最初の臨床的有益性を示すのに数か月を要する。これが行われると、治療開始後約半年で、膵臓のβ細胞は破壊され続け、しばしば完全に破壊されてしまう。結果として、免疫抑制薬の効力は、無効になるとまでいかなくても、ひどく鈍化される。島β細胞を生存状態に維持すること、またはそれらを一層再生させることは、糖尿病患者にとってほとんど満たされていない医療ニーズである。

METアゴニスト抗体が免疫介在性β細胞破壊を拮抗しうるかどうかおよび１型糖尿病の状況で免疫標的薬と協働しうるかどうかを試験するために、本発明者らは適当なマウスモデルを選択した。NOD/ShiLtJ株（一般にNODと呼ばれる）は、自己免疫１型糖尿病の多遺伝子モデルである。NODマウスでの糖尿病は、高血糖と膵島の白血球浸潤によって特徴付けられる。膵臓のインスリン含量の顕著な減少は雌では約12週齢でそして雄ではそれより数週間後に起こる。NODマウスは、ヒトに観察される病変を最もよく再現する１型糖尿病動物モデルであると考えられる。この株において、高血糖症を緩和するおよび／または糖尿病開始を遅らせることに関してそれらの可能性を研究するため、免疫抑制薬と一緒に幾つかの研究が実施された。特に、リンパ球特異的表面マーカーCD3に対して向けられた抗体は、幾つかの研究において特に有効であることが証明されている（Chatenoud他、Proc Natl Acad Sci USA 91: 123-127, 1994; Chatenoud他、J Immunol 158: 2947-2954, 1997; Gill他、Diabetes 65: 1310-1316, 2016; Kuhn他、Immunotherapy, 8: 889-906, 2016; Kuhn他、J Autoimmun 76: 115-122, 2017）。興味深いことに、それらの研究は、上記免疫標的抗体の経口投与が全身投与に比較して副作用が少ないことを証明した。最も効果的なプロトコルは、連続５日間マウスを処置することと、次いで治療を中止することから構成された（Ochi他、Nat Med. 12: 627-635, 2006）。特に、経口薬の用量がマウス１匹あたり5μg（0.25 mg/kg）を超えると、治療効果が急激に下降した。

本発明者らのアゴニスト作用性抗MET抗体が治療効果を示すかどうかを試験するため、および免疫標的薬とのそれらの潜在的な協働作用を調べるため、72匹の６週齢雌NODマウスをCharles Riverより入手した。ヒト用の試験片（multiCare in; Biochemical Systems International）を使ってランダム給餌（すなわち非空腹状態）動物において血糖を測定した。この時点で、NODマウスは、約110 mg/dLの平均血糖の前糖尿病を示した（図10Ａ）。マウスを各々18匹のマウスから成る４つの異なる治療群に無作為に割り付け、全ての群が血糖に関してできる限り均一であるようにした。７週時から開始し、４つの治療群を以下の通り異なる処置に供した：薬剤無し（CONTROL）；0.15 mg/kg抗CD3抗体（CD3）；3 mg/kg精製71D6抗体（71D6）；0.15 mg/kg抗CD3抗体＋3 mg/kg精製71D6抗体（COMBO）。抗CD3抗体は、100μLのPBS中での強制投与により、１日１回連続５日間に渡り経口投与し、続いてプロトコール通りに中断した。71D6は200μLのPBS中で全実験期間に渡り週２回i.p.投与した。マウスは標準的食餌を用いて適宜に(ad libitum）給餌した。ランダム給餌動物については上記の通りストリップを使って週１回血糖を測定した。それが２週連続で250 mg/dLより高い血糖値を示した時に、その動物を糖尿病と見なした。

文献と一致して、12週時まで糖尿病動物は１匹も記録されなかった（図10Ｂ）。13週時に、対照（CONTROL）群とCD3治療群において糖尿病が出現し始めた。18週時に、対照（CONTROL）動物の50％が糖尿病であり（図10Ｃ）、これは原種株の供給元（The Jackson Lab - 001976 マウス株データシート; https://www.jax.org/strain/001976）により記載された通りであった。21週時に、実験が中断されたとき、対照（CONTROL）マウスの88％が糖尿病であり、その他の治療群は有意に低い値を示した：CD3、47％；71D6、21％；COMBO、14％（図10Ｄ）。糖尿病発症の経時的分析は図11Ａに示される。カプラン・マイヤープロットは図11Ｂに示される。統計分析はPrismソフトウエア（Graph Pad）を使って実施した。マンテル・コックス（Mantel-Cox）検定、ログランク検定、およびゲーハン・ブレスロー・ウィルコクソン（Gehan-Breslow-Wilcoxn）検定は、全て0.001未満のp値を与え、これは曲線間の差が統計上有意であることを示した。

平均非空腹時血糖は、全ての群において一定に増加したが、対照（CONTROL）未処置群でのみ極端に高いレベル（＞450 mg/dL）に達した（図12）。糖尿病発症データと一致して、血糖値は次の正確な順序に従った：CONTROL＞CD3＞71D6＞COMBO。実験の経過の間（４か月）、数匹のマウスが治療に無関係の理由、主として雄マウスのケージ内喧嘩と細菌感染により死亡した（CONTROL、1/18；CD3、1/18；71D6、4/18；COMBO、4/14）。１匹の糖尿病マウスの血糖値が急速に極値（＞550 mg/dL）に達したので、糖尿病診断から３週間後にマウスを犠牲にした。これらの場合、550 mg/dLの値は、死亡後であっても群の平均血糖を計算するために使用した。全てのマウスは、糖尿病であるかどうかに関わらず、21週の終わりに犠牲にした。

犠牲前に、全ての動物をグルコース耐性試験（GTT）に供した。このために、動物を一晩絶食させた。翌朝、血糖とインスリン測定用に血液サンプルを採取した。グルコース溶液（200μL PBS中 3 g/kg）を腹腔内（i.p.）注射し、その３分後に二番目の血液サンプルを採取した。直後にマウスを犠牲にし、肝臓と膵臓をはじめとする主な臓器を分析用に回収した。上述の通り試験片を使って血中グルコース濃度（血糖値）を測定した。インスリン濃度は高感受性マウスインスリンELISAキット（Crystal Chem社）を使って測定した。

血糖値の分析は、次のシナリオを明らかにした。０時の時点では、血糖は対照に比較して治療群で低かった（CONTRL＞CD3＞71D6＞COMBO；図13Ａ）。しかし、グルコース投与の３分後には、血糖は全ての群で同様なレベルに上昇した（＞350 mg/dL；図13Ｂ）。対照的に、COMBO治療群がわずかに高いレベルを示したこと以外は、０時での血中インスリン濃度は非常に低かった（図13Ｃ）。特に、グルコース注射後、インスリン濃度は治療群によって非常に異なるように見え、逆の順序を示した（COMBO＞71D6＞CD3＞CONTROL；図13Ｄ）。NODマウスはそれらの前糖尿病期にインスリンの特有の変調を示す（Amrani他、Endocrinology 139:1115-1124, 1998）ため、それらの絶対値を他の非糖尿病マウス株と直接比較することは困難である。いずれにしても、対照動物は応答しないが、治療群に属する動物は、インスリンを分泌することによりグルコース刺激に応答すると結論付けることができる。

緩和された糖尿病表現型と一致して、対照群に比較して治療群において剖検時の体重はわずかに（有意ではないが）高かった（図14Ａ）。どちらの群でも全体重に対する肝臓重量比には有意な差は認められなかった（図14Ｂ）。このことは、71D6で誘発される肝臓増殖（他のマウス系統で観察された）が系統特異的であることを示唆している。71D6処置マウスでは、剖検の実施中または組織学的分析中に、他の生物学的または病理学的徴候または経過は全く検出されなかった。

膵臓サンプルをパラフィン包埋し、組織学的分析用に処理した。組織切片をヘマトキシリンとエオシンで染色し、顕微鏡により分析した。この分析の結果、CONTROL（対照）群に属する動物の大部分の膵臓がごく少数のランゲルハンス島を含み、可視できるそれらの島は異常に小さく、リンパ球が高度に浸潤していることが明らかになった（図15）。対照的に、CD3治療群のランゲルハンス島は、まだリンパ球細胞で浸潤していたが、より豊富であり、ほとんど変性がなかった。71D6治療群の膵臓切片はCONTROL群とCD3群の両方に比較してより多くのランゲルハンス島を含んでおり、島サイズは平均よりも大きかった；しかしながら、リンパ球による浸潤はまだ明白であった。最後に、COMBO群の膵島は豊富で大きかったが、同様に浸潤が認められた。

抗インスリン抗体で染色した膵臓切片では、大きな治療依存的な差異が観察された（図16）。CONTROL群では、少数の可視できる島の中に、あるとしてもごくわずかな染色が観察された。CD3治療群では、インスリンシグナルはより高かったが、71D6処置動物で観察されたものほどは強くなかった。COMBO治療群で認められる島は、その他の全ての治療群に比較して最高で最大の均一なインスリンシグナルを示した。より高倍率では、それらの特徴を更に詳細に認めることができた（図17）。未処置の動物の島は、あるとしてもごく少数のインスリン産生細胞を含んでいた。対照的に、CD3治療群の島細胞の大部分はインスリン陽性であった。71D6治療群では、島は大きくかつ強く染色された。COMBO群の膵臓は、他の全ての群の中で最大でかつ最多のインスリン産生を有する島を含んでいた。

上述の通り、ランゲルハンス島内のインスリン産生β細胞の数は、治療群で明らかに高かった（COMBO＞71D6＞CD3＞CONTROLの順）。しかしながら、細胞浸潤は非常に不均一であり、島の周辺に動員されるリンパ球細胞の数に関して、様々な治療群の間で大きな差異は何も観察されなかった。これは、治療薬によって異なる２つのメカニズムにより説明することができる。抗CD3抗体の経口送達は免疫応答を排除するよりも免疫原性寛容を誘導するということは十分に確立されている (Chatenoud他、J Immunol 158:2947-2954, 1997)。寛容原性過程は、自己抗体介在性のβ細胞破壊を阻害する、Ｔ調節細胞の活性化と増殖を伴う（Chatenoud Novartis Found Symp 252:279-220, 2003）。これは、CD3群においてなぜ膵β細胞が免疫細胞浸潤にもかかわらず破壊されないかの理由を説明する。他方、前の実施例に提示したデータは、71D6がβ細胞の生存と再生を促進することを示唆している。従って、71D6は、免疫介在性β細胞死に対し拮抗作用しかつβ細胞の増殖を促進するので、重度の免疫細胞浸潤にもかかわらずβ細胞量を維持すると仮定することができる。

抗CD3抗体と抗MET抗体に対する応答における免疫機構の役割を更に調べるために、マウス血漿中の抗インスリン抗体を測定した。この目的で、血漿サンプルを剖検時に全マウスから並びに幼若な前糖尿病状態の雌NODマウス（７週時）から回収し、マウスIAA (インスリン自己抗体）ELISA Kit (Fine Test)を使って分析した。この分析から、大部分のマウスが、前糖尿病マウスに比較して高濃度の抗インスリン抗体を示すことが判明した（図18）。異なる母集団間で統計的に有意な差は認められなかったが、COMBO治療群のマウスはより低レベルへの傾向を示した。71D6治療群のマウスは、それぞれ低および高自己抗体レベルを有する２つの小集団に明らかに分けることができた。それらの結果については当然更なる研究が必要であるが、抗CD3抗体も71D6処置もどちらもこの系での自己抗体の産生に影響を与えず、むしろ下流に作用して糖尿病の発症を予防するまたは遅らせるという仮説を全体的に強める。

要するに、本実験で得られたデータは、71D6処置が１型糖尿病の状況下で膵β細胞の完全性を維持するのに非常に効果的であることを示唆している。全身性71D6処置は、確立された免疫抑制療法よりも効果的であるだけでなく、併用して投与すると後者の（免疫抑制療法の）効果を増加させた。71D6の治療活性の根本となる作用機序は、自己抗体の産生または膵島への免疫細胞の浸潤を妨害するのではなく、むしろβ細胞の生存および／または増殖を促進するその能力に関連すると思われる。これらのデータは、METアゴニスト抗体が単独で、または免疫療法と組み合わせて、１型糖尿病の治療に利用できるという実験的証拠を提供する。

Claims (33)

1. HGF-METアゴニストを対象に投与することを含む、膵島細胞の増殖を促進する方法。
2. 必要とする対象においてインスリン産生を促進する方法であって、対象にHGF-METアゴニストを投与することを含む方法。
3. 対象にHGF-METアゴニストを投与することを含む糖尿病の治療方法。
4. 前記方法が増加された膵島細胞増殖を誘導することにより特徴づけられる、請求項２または３に記載の方法。
5. 前記対象が5.6ミリモル/Lより大きい空腹時血糖値を示す、上記請求項のいずれかに記載の方法。
6. 前記対象が健常個体における細胞集団よりも少なくとも50％小さい、場合により少なくとも70％小さい、場合により約70％～約80％小さい膵島細胞の集団を有することにより特徴づけられる、上記請求項のいずれかに記載の方法。
7. 前記対象が１型糖尿病または２型糖尿病を有する、上記請求項のいずれかに記載の方法。
8. 前記対象が膵臓組織の移植を以前に受けたことがある、上記請求項１のいずれかに記載の方法。
9. 前記対象に膵臓組織移植を施行することを更に含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
10. １または複数の免疫抑制薬を前記対象に投与することを更に含む、上記請求項のいずれかに記載の方法。
11. 前記１または複数の免疫抑制薬が、抗CD3抗体、抗IL-21抗体、CTLA4分子、PD-L1分子、IL-10、グルタミン酸脱炭酸酵素（GAD）-65から成る群より選択される、請求項１０に記載の方法。
12. 前記対象が健常ドナー対象である、請求項１に記載の方法。
13. 前記HGF-METアゴニストの投与が膵島β細胞の増殖を促進する、上記請求項のいずれかに記載の方法。
14. 前記HG-METアゴニストが１回あたり0.1～40 mg/kgの範囲の用量で投与される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記HGF-METアゴニストが0.5～35 mg/kg、場合により１～30 mg/kg、場合により１～10 mg/kgの範囲の用量で投与される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記HGF-METアゴニストが1 mg/kg、3 mg/kg、10 mg/kgまたは30 mg/kgの用量で投与される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記HGF-METアゴニストが一週間に１回、場合により一週間に１～３回、場合により一週間に２回投与される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記方法が糖尿病薬、好ましくはインスリンを前記対象に投与することを更に含む、上記請求項のいずれかに記載の方法。
19. 請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法に用いるためのHGF-METアゴニスト。
20. 請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法に用いるための医薬組成物であって、HGF-METアゴニストと、薬学的に許容される賦形剤または担体とを含む、医薬組成物。
21. 膵島細胞を含む細胞集団または組織の増殖を促進するインビトロ法であって、前記細胞集団をHGF-METアゴニストと接触させることを含む方法。
22. 島細胞または膵臓移植片を保存するエクスビボ（生体外）法であって、前記島細胞または膵臓移植片をHGF-METアゴニストと接触させることを含む方法。
23. 前記HGF-METアゴニストがMETの完全アゴニストである、上記請求項のいずれかに記載の方法、それに使用するためのHGF-METアゴニスト、またはそれに使用するための医薬組成物。
24. 前記HGF-METアゴニストが抗METアゴニスト抗体または抗原結合フラグメントである、上記請求項のいずれかに記載の方法、それに使用するためのHGF-METアゴニスト、またはそれに使用するための医薬組成物。
25. 前記抗MET抗体またはその抗原結合フラグメントが、METのSEMAドメイン、場合によりSEMA βプロペラのブレード４～５に結合する、請求項２４に記載の方法、それに使用するための抗体、またはそれに使用するための医薬組成物。
26. 前記抗MET抗体またはその抗原結合フラグメントが、METの残基Ile367および／またはAsp372を含むエピトープ、場合によりMETの残基Ile367とAsp372の両方を含むエピトープに結合する、請求項２４に記載の方法、それに使用するための抗体、またはそれに使用するための医薬組成物。
27. 前記抗MET抗体またはその抗原結合フラグメントが、METのPSIドメインに結合し、場合によりMETの残基546と562の間のエピトープに結合する、請求項２４に記載の方法、それに使用するための抗体、またはそれに使用するための医薬組成物。
28. 前記抗MET抗体またはその抗原結合フラグメントが、METの残基Thr555を含むエピトープに結合する、請求項２４または請求項２７に記載の方法、それに使用するための抗体、またはそれに使用するための医薬組成物。
29. 前記抗METアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメントが、71D6のVH CDR1、CDR2およびCDR3配列並びにVL CDR1、CDR2およびCDR3配列の組み合わせを含む、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の方法、それに使用するための抗体、またはそれに使用するための医薬組成物。
30. 前記抗METアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号163に対し少なくとも90％同一であるVHドメインを含み、そして／または配列番号164に対し少なくとも90％同一であるVLドメインを含む、請求項２９に記載の方法、それに使用するための抗体、それに使用するための医薬組成物。
31. 前記抗METアゴニスト抗体が71D6である、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の方法、それに使用するための抗体、それに使用するための医薬組成物。
32. 前記抗METアゴニスト抗体がIgG4抗体である、請求項２４～３１のいずれか一項に記載の方法、それに使用するための抗体、それに使用するための医薬組成物。
33. 対象において糖尿病を治療する方法であって、前記対象に有効量の抗MET抗体71D6を投与することを含み、場合により前記対象に少なくとも毎日インスリンを投与することを更に含む方法。