JP7173618B2 - アルファ－シヌクレインに対する抗体およびその用途 - Google Patents

Description

本発明は、アルファ－シヌクレイン抗体およびその用途に関する技術である。

アルファ－シヌクレイン（α－Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ、α－ｓｙｎ）は、ニューローンの前シナプス末端で主に発現し、正常状態では自然に折り畳まれない状態の単量体として存在する。アルファ－シヌクレインは随意または不随意運動の開始と停止を制御する重要な一種のニューロトランスミッターであるドーパミンの放出を規制することを助ける。特に、アルファ－シヌクレインの機能はシナプス活動の増加および年を取るに連れて重要であり、神経退化の重要な因子である。

しかし、病的な状態において、アルファ－シヌクレインは、液滴（ｄｒｏｐｌｅｔ）、リン脂質二重膜または脂質膜などとの結合および相互作用により構造的変化を起こして折り畳み、またはフォールディングされたα－ヘリカル形態の２次構造を形成して、二量体（ｄｉｍｅｒ）、オリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）および／または線維状形態の分子を含む凝集体を形成する。

このようなアルファ－シヌクレイン凝集体は、細胞に毒性を誘発することが知られており、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、ＰＤ）、パーキンソン疾患性認知症（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｄｅｍｅｎｔｉａ、ＰＤＤ）、多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｔｒｏｐｈｙ、ＭＳＡ）、レビー小体認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ ｗｉｔｈ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｉｅｓ、ＤＬＢ）、その他多様な疾患の神経細胞内で発見される異常なタンパク質凝集体であるレビー小体の主成分である。またアルファ－シヌクレインのリン酸化、またはユビキチン化のような翻訳後修飾も、アルファ－シヌクレインの凝集および神経毒性と関連があることがと知られている。アルファ－シヌクレインは動物実験および細胞実験でもドーパミン神経細胞を死滅させ炎症反応を誘発し、実験動物でパーキンソン病症と類似の運動症状を誘発することが知られている。また、アルファ－シヌクレイン凝集はパーキンソン病、パーキンソン疾患性認知症、レビー小体認知症、多系統萎縮症およびその他多数の神経軸索疾患を含むシヌクレイン病（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ）と呼ばれる一群の神経退行性疾患の病因に関連があることが知られている。

さらに、パーキンソン疾患患者の脳脊髄液および血漿サンプルからオリゴマー形態およびモノマー形態のアルファ－シヌクレインがすべて発見され、これは、小さい分子量のアルファ－シヌクレイン凝集体が細胞膜を透過して細胞外空間に接近し得るのを示す。また、フォールディングされたアルファ－シヌクレインがエキソサイトーシスにより細胞から放出された後、プリオンタンパク質のように、細胞間伝達によって脳の一領域から他の領域に伝達され得ることが明らかになった。

よって、アルファ－シヌクレインがパーキンソン疾患のようなシヌクレイン病の治療剤開発の標的になっている。主要開発戦略は、凝集体形成抑制、遺伝子サイレンシングおよび凝集体除去を含む。前者の場合、Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ－３－ｇａｌｌａｔｅ（ＥＧＣＧ）、３－（１，３－ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｏｌ－５－ｙｌ）－５－（３－ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｙｌ）－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌｅ（ａｎｌｅ１３８ｂ、ＣＬＲ０１２０およびプロリルオリゴペプチダーゼ抑制剤ＫＹＰ－２０４７９を含む。

低分子化合物の場合、標的特異的結合力が低下し、低い半減期によって高い用量を投与しなければならない。抗体は、低分子化合物と比較して標的特異的であり、高い半減期を示すが、疾患治療の可能性を高めるためには、高い結合力で凝集体に選好的に結合する抗体が必要である。したがって、アルファ－シヌクレイン凝集体の異常な蓄積に関連した疾患の治療のために、アルファ－シヌクレイン、特にアルファ－シヌクレインの凝集体に選好的に結合できる抗体の開発が必要である。

本明細書では、アルファ－シヌクレイン、特に、アルファ－シヌクレイン凝集体に特異的に結合できる抗体またはその抗原結合断片を提供しようとする。前記アルファ－シヌクレインに対する抗体またはその抗原結合断片は、アルファ－シヌクレインを特異的に認識して結合でき、特に、アルファ－シヌクレインのＣ－末端部位に結合するものであってもよい。

本発明の一例は、アルファ－シヌクレインまたはアルファ－シヌクレイン凝集体に特異的に結合して、対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）の神経系でアルファ－シヌクレインの水準を減少させる抗体を提供する。さらに具体的に、本発明の抗体またはその抗原結合断片はアルファ－シヌクレイン凝集体、具体的に、アミロイドフィブリル（ａｍｙｌｏｉｄ ｆｉｂｒｉｌｓ）、プロトフィブリル（ｐｒｏｔｏｆｉｂｒｉｌｓ）およびオリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ））、特にアミロイドフィブリルに対して高い結合親和性を有し、アルファ－シヌクレインモノマー（ｍｏｎｏｍｅｒ）に対して低い結合親和性を有する抗体またはその抗原結合断片に関するものである。

本発明による抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）アルファ－シヌクレインまたはアルファ－シヌクレイン凝集体に特異的な結合、（ｉｉ）対象の神経系でアルファ－シヌクレイン、またはアルファ－シヌクレイン凝集体の水準減少、（ｉｉｉ）神経細胞間アルファ－シヌクレインまたはその凝集体の移動（ｃｅｌｌ－ｔｏ－ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）減少または阻害、および（ｖｉ）神経細胞によるアルファ－シヌクレインまたはその凝集体の食細胞作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ｕｐｔａｋｅ）の増進からなる群より選択された１種以上の活性を有するものであってもよい。好ましくは、本発明による抗体またはその抗原結合断片は、前記活性（ｉ）～（ｉｖ）を全て有するものであってもよい。

本発明の一例は、アルファ－シヌクレイン、特にアルファ－シヌクレイン凝集体に特異的に結合できる抗体またはその抗原結合断片を含むシヌクレイン病の予防、軽減、改善または治療用組成物に関するものである。

本発明の一例は、アルファ－シヌクレイン、特にアルファ－シヌクレイン凝集体に特異的に結合できる抗体またはその抗原結合断片を、これを必要とする対象に投与する段階を含むシヌクレイン病の予防、軽減、改善または治療方法に関するものである。前記抗体またはその抗原結合断片の投与量は、対象の神経系で、さらに詳しくは、神経系の神経細胞外領域でアルファ－シヌクレイン、特にアルファ－シヌクレイン凝集体の水準を減少させる有効量であってもよい。

本発明の一例は、アルファ－シヌクレイン、特にアルファ－シヌクレイン凝集体に特異的に結合できる抗体またはその抗原結合断片を含む、対象の神経系で、さらに詳しくは、神経系の神経細胞外領域でアルファ－シヌクレイン、特にアルファ－シヌクレイン凝集体の水準を減少させる方法または神経系の神経細胞外領域でアルファ－シヌクレイン、特にアルファ－シヌクレイン凝集体の水準を減少させる用途に関するものである。

本発明の一例は、アルファ－シヌクレイン、特にアルファ－シヌクレイン凝集体に特異的に結合できる抗体またはその抗原結合断片を含む、対象の神経系で、さらに詳しくは、神経細胞間アルファ－シヌクレインまたはその凝集体の移動（ｃｅｌｌ－ｔｏ－ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）減少または阻害させる方法、または神経系の神経細胞間アルファ－シヌクレインまたはその凝集体の移動（ｃｅｌｌ－ｔｏ－ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）減少または阻害させる用途に関するものである。

本発明の一例は、アルファ－シヌクレイン、特にアルファ－シヌクレイン凝集体に特異的に結合できる抗体またはその抗原結合断片を含む、対象の神経系でミクログリア（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）によるアルファ－シヌクレインまたはその凝集体の食細胞作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ｕｐｔａｋｅ）を増加させる方法、または対象の神経系でミクログリア（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）によるアルファ－シヌクレインまたはその凝集体の食細胞作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ｕｐｔａｋｅ）を増加させる用途に関するものである。

以下、本発明をさらに詳しく説明する。
本発明は、アルファ－シヌクレイン、特にアルファ－シヌクレイン凝集体に特異的に結合できる抗体またはその抗原結合断片を提供しようとする。前記アルファシヌクレインに対する抗体またはその抗原結合断片は、ベータ（β）－あるいはガンマ（γ）－シヌクレインに結合せずアルファ－シヌクレインを特異的に認識して結合でき、アミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ）およびタウ（ｔａｕ）の凝集体に結合せずアルファ－シヌクレインの凝集体に特異的に結合するものであってもよい。

本願において、用語“抗原”または“免疫原”は、例えば、抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその免疫学的に機能的な抗原結合断片）が結合でき、動物で抗原に結合できる抗体の生産に使用できる分子または分子の一部を意味する。抗原は、異なる抗体またはその断片と相互作用できる一つ以上のエピトープを含むことができる。本願による一実施形態において、抗原は、アルファ－シヌクレインタンパク質またはアルファ－シヌクレイン凝集体であってもよい。具体的に、前記アルファ－シヌクレイン凝集体は、アミロイドフィブリル（ａｍｙｌｏｉｄ ｆｉｂｒｉｌｓ）、プロトフィブリル（ｐｒｏｔｏｆｉｂｒｉｌｓ）およびオリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ））、特にアミロイドフィブリルであってもよい。本発明によるアルファ－シヌクレインまたはその凝集体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、特にアルファ－シヌクレインのＣ－末端部位に結合するものであってもよい。Ｎ－末端を認識するアルファ－シヌクレイン抗体は、アルファ－シヌクレイン関連疾患を通称するシヌクレイン病に属する多系統萎縮症のような他の疾病の凝集体は認識できないのに対し、Ｃ－末端部位を認識するアルファ－シヌクレイン抗体は、パーキンソン疾病だけでなく、その他の多様なシヌクレイン病疾患の凝集体も認識するという長所を有する。

本願において、用語“中和”は、結合タンパク質が抗原に特異的に結合する時、前記抗原の生物学的活性を抑制または減少することである。一実施形態で、中和タンパク質または中和抗体は、抗原（アルファ－シヌクレインまたはアルファ－シヌクレイン凝集体）に結合して、対象の神経系で神経細胞外領域で抗原の水準を少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％を減少させるか、神経細胞外領域で抗原の水準増加を事前に予防することができる。

本願において、“アルファ－シヌクレイン”は、ＳＮＣＡ遺伝子によってコーディングされる１４０個残基アミノ酸から構成されたネイティブα－Ｓｙｎ（ＮＣＢＩ ＩＤ：ＮＰ＿０００３３６）であって、全長の非処理されたものはもちろん、処理された多様な形態のものを含む。また、自然に現れるアルファ－シヌクレインの変異体、例えば突然変異、スプライス変異体または対立変異体をさらに含むものである。変異体としては、１４０個の残基タンパク質のほか、エクソン３およびエクソン５が欠失した１２６個および１１２個の残基タンパク質形態も存在する（ＣＡＧ３３３９．１）。また、ＳＮＣＡ遺伝子の特定多型性（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）またはミスセンス（ｍｉｓｓｅｎｓｅ）突然変異がパーキンソン疾患の発生と関連性があると知られており、このような突然変異体も含まれる。アルファ－シヌクレインのホモログであるベータ－およびガンマ－シヌクレインが存在する。一実施形態において、本願による抗体は、アルファ－シヌクレインを特異的に認識する。アルファ－シヌクレインのアミノ酸配列は配列番号２２５で表される。

本願において、“アルファ－シヌクレイン凝集体”は、アルファ－シヌクレインの構造（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の変化によるものであって、オリゴマー、プロトフィブリル、フィブリルおよび／または前記構造のうちの一つ以上を含む構造または凝集体を含む。

本明細書で提供される抗体が抗原と認識するアルファ－シヌクレインは、ヒトアルファ－シヌクレイン、サルアルファ－シヌクレイン（例えば、Ｒｈｅｓｕｓアルファ－シヌクレイン）、マウスアルファ－シヌクレイン、ラットアルファ－シヌクレインなどの哺乳動物アルファ－シヌクレインから選択されたものであってもよく、例えば、ヒトアルファ－シヌクレインはアルファ－シヌクレイン（ＮＣＢＩ ＩＤ：ＮＰ＿０００３３６）であってもよいが、これに制限されるわけではない。本明細書に異なって言及されない限り、アルファ－シヌクレインはヒトアルファ－シヌクレインを指して称するものであり得、本明細書で提供される抗体またはその抗原結合断片はヒトアルファ－シヌクレインだけでなく、サル（例えば、Ｒｈｅｓｕｓ）、ラット、および／またはマウスアルファ－シヌクレインにも特異的な結合能を有するものであってもよい。

前記抗体またはその抗原結合断片が結合するアルファ－シヌクレインのＣ－末端部位に結合し、具体的に、ヒトアルファ－シヌクレインタンパク質は、配列番号１２６のアミノ酸配列で、Ｃ－末端領域、例えば、１１０番残基～１２０番残基または１１１番残基～１２２番残基を含む連続する少なくとも１１個または１２個のアミノ酸から構成されたペプチドを含むＣ－末端領域であってもよい。本発明による抗体またはその抗原結合断片は、前記抗原認識部位を認識してアルファ－シヌクレイン凝集体に対する高い親和度で結合することが確認された。

本明細書において、“親和性または親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）”は、抗体またはその抗原結合断片と抗原の間の相互作用の強度であり、抗体または抗原結合断片のＣＤＲ配列、および／または抗体または抗原結合断片の物理化学的特性（親水性／疎水性、静電気的特性など）、抗原の大きさ、形状、および／または電荷のような抗原の特徴などによって決定できる。このような親和度を決定する方法は、当業界に公示されており、通常解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ、ＫＤ）で示すことができるが、これに制限されるわけではない。

本明細書において、“アルファ－シヌクレインタンパク質またはアルファ－シヌクレイン凝集体に特異的結合する”とは、アルファ－シヌクレインタンパク質またはアルファ－シヌクレイン凝集体に対する親和度が他の抗原と比較して相対的に高いことを意味するものであって、例えば、アルファ－シヌクレイン凝集体、具体的に、アミロイドフィブリル（ａｍｙｌｏｉｄ ｆｉｂｒｉｌｓ）、プロトフィブリル（ｐｒｏｔｏｆｉｂｒｉｌｓ）およびオリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ）、特にアミロイドフィブリルに対して親和度がＯｃｔｅｔおよびＳＰＲ分析でそれぞれ０．１×１０^－１０Ｍ～２×１０^－１０Ｍ、または０．０５×１０^－１０Ｍ～０．３×１０^－９Ｍであるが、これに制限されるわけではない。

本発明の一例による軽鎖および重鎖を含むヒト化アルファ－シヌクレイン抗体、例えば、Ｈｕ１１Ｆ１１＿（ｖｅｒ．１）、Ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）、およびＨｕ１１Ｆ１１＿ＡＢＬ２－４の場合、キメラアルファ－シヌクレイン抗体に比べて高い食細胞作用促進活性を示す。Ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．１）、Ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）、Ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．３）、Ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．４）、ＡＢＬ２－４の場合、キメラアルファ－シヌクレイン抗体に比べてフィブリルの神経細胞膜結合に対する高い抑制能を示し、Ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）、Ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．４）、ＡＢＬ２－４の場合、キメラアルファ－シヌクレイン抗体と比較して、アルファ－シヌクレイン過発現細胞から分泌されたアルファ－シヌクレインの他の神経細胞への伝播に対する高い抑制能を示す。アルファ－シヌクレイン凝集体に対する結合力、例えば、ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙでは測定した結合力は、キメラアルファ－シヌクレイン抗体と類似するか優れた活性を有する。

本発明によるアルファ－シヌクレイン抗体は、適用対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）の神経系で神経細胞の外に分泌されたアルファ－シヌクレイン凝集体が細胞外空間（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｐａｃｅ）での正常細胞に移動して該当神経細胞を一種の感染させる作用を抑制し（ｉｎｈｉｂｉｔ ｃｅｌｌ－ｔｏ－ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）、また、ミクログリアが細胞外空間に位置するアルファ－シヌクレイン凝集体に対する食細胞作用促進能を有する。アルファ－シヌクレイン凝集体は、プリオンのように、一つの細胞から他の細胞に伝播しながら該当正常細胞内にもアルファ－シヌクレイン、特にアルファ－シヌクレイン凝集体が脳全般に広がりながらシヌクレイン病を招く。したがって、アルファ－シヌクレイン凝集体は、脳神経細胞に対して毒性があり、脳神経細胞死滅（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、脳炎症反応（ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）を起こすことがよく知らされている。したがって、アルファ－シヌクレイン凝集体が脳の様々な部位に広がりながら脳細胞死滅と脳炎症反応が増加し、これによってシヌクレイン病、例えば、パーキンソン病が進行しながら確認される脳細胞死滅およびこれによる行動、認知機能の障害が現れる。

よって、本発明のアルファ－シヌクレイン抗体は、アルファ－シヌクレインまたはアルファ－シヌクレイン凝集体の神経細胞間移動を抑制して、アルファ－シヌクレイン凝集体が脳の多様な領域に広がる現象を防止することができ、また、ミクログリアの食細胞作用を促進して、対象神経系で神経細胞の外部に存在するアルファ－シヌクレイン凝集体自体の減少または除去によってシヌクレイン病の重要な原因であるアルファ－シヌクレイン凝集体の水準を減少させて、脳神経細胞死滅および脳炎症反応を減らし、さらに、シヌクレイン病、例えばパーキンソン病の症状および病の進行を改善、軽減または予防する効果を期待することができる。

また、本発明によるアルファ－シヌクレイン抗体は、（ｉ）アルファ－シヌクレインまたはアルファ－シヌクレイン凝集体の神経細胞間移動を抑制、および（ｉｉ）ミクログリアの食細胞作用の促進による脳神経系のアルファ－シヌクレイン凝集体の水準減少と関連して二つの機能を全て遂行できる点から優れた活性を有する（本願ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ結果参考）。特に、現在まで臨床試験が進行中であるか論文に公開されたアルファ－シヌクレイン抗体は、前記（ｉ）および（ｉｉ）活性のうちの一つの活性を有するので、これは、本願のアルファ－シヌクレイン抗体は知られたアルファ－シヌクレイン抗体に比べて優れたシヌクレイン病の予防または治療に長所があるのを示す。したがって、本願発明によるアルファ－シヌクレイン抗体は、アルファ－シヌクレイン凝集体の除去および減少と、病因としての作用を抑制する効能がさらに優れており、したがって、シヌクレイン病またはこれに関連した症状的疾病（例、認知障害など）にさらに効果的である。

アルファ－シヌクレイン凝集体に対する高い親和度を有する本願による抗体または抗原結合断片は、アルファ－シヌクレイン凝集体形成を減少させることができ、脳の凝集体の濃度を低めることができる。また、アルファ－シヌクレイン凝集体に対する高い親和度を有する本願による抗体または抗原結合断片は、中枢神経系の外でのアルファ－シヌクレイン凝集体形成を減少させることができ、結局、血液脳関門を境界にしたアルファ－シヌクレイン形態の間の平衡状態を変更させて、中枢神経系内の凝集体の濃度を低める効果をもたらすことができる。

これは、抗体を、例えばこれに制限されるのではないが、より簡便な皮下注射のような方式で投与しても十分な効能を得ることができるため、臨床で大きな長所がある。さらに、アルファ－シヌクレイン凝集体に対する高い親和度を有する本願による抗体または抗原結合断片は、アルファ－シヌクレイン凝集体形成および／または蓄積および／または 細胞間伝達を抑制および／または減少させることができ、脳で凝集体の濃度を低めることができる。また、アルファ－シヌクレイン凝集体に対する高い親和度を有する本願による抗体または抗原結合断片は、中枢神経系の外でのアルファ－シヌクレイン凝集体形成を減少させることができ、結局、血液脳関門を境界にしたアルファ－シヌクレイン形態の間の平衡状態を変更させて、中枢神経系内の凝集体の濃度を低める効果をもたらすことができる。また、本理論で限定するのではないが、本願による抗体または抗原結合断片は、単量体の除去による凝集体形成抑制、または単量体と凝集体を全て除去することができる。

本明細書で提供されるアルファ－シヌクレインタンパク質またはアルファ－シヌクレイン凝集体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、自然に生産されたものでなくてもよい（ｎｏｎ－ｎａｔｙｕｒａｌｌｙ ｏｃｕｒｒｉｎｇ；例えば、化学的合成または組み換え的に生産されたものであってもよい）。前記のような組換技術は、当該技術分野に広く公知されている。

本明細書において、“抗体”は、任意のアイソタイプの完全な免疫グロブリン、または標的抗原への結合のために完全な抗体と競争できる抗原結合断片を意味する。例えば、キメラ、ヒト化、完全ヒトまたは二重特異的抗体またはこれらの抗原結合断片を含む。抗体は、それ自体で抗原結合タンパク質の一種でもある。完全な抗体は、一般に少なくとも２個の全長重鎖と２個の全長軽鎖を含むが、一部の場合に抗体が単に重鎖のみを含んでもよい。

抗体またはその抗原結合断片は、ただの単一源（ｓｏｕｒｃｅ）に由来するか、またはキメラであってもよい、キメラ抗体は、２種類の異なる抗体に由来する部分を含み、以下、より詳細に記述される。抗体またはその抗原結合断片は、ハイブリドーマ、組換えＤＮＡ技術または完全な抗体の酵素的または化学的切断によって生産される。他の言及がなければ、本願において、用語、抗体は、２個の全長重鎖と２個の全長軽鎖を含む抗体はもちろん、これらの誘導体、変異体、断片、および突然変異体を含み、これらの例は以下の記述の通りである。

一実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体、二重特異的抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、抗体模倣体（または合成抗体）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合体（または抗体接合体）、およびその断片を含むが、これに限定されず、本願に開示された多様な形態の抗体を含む。一実施形態において、本願に開示された抗体の抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、単一体である断片（ｓｃＦｖ）、ジアボディまたは重鎖可変領域と軽鎖可変領域とがスペーサーを通じて連結された単一鎖の単鎖抗体分子であってもよい。

本願において、“軽鎖”は、抗原またはエピトープに対する結合特異性を提供するのに十分な可変領域配列を有する全長の軽鎖およびその断片を含む。全長軽鎖は、可変領域ドメインＶＬ、および不変領域ドメインＣＬを含む。軽鎖の可変領域ドメインは、軽鎖ポリペプチドのアミノ末端に存在する。軽鎖の種類には、カッパおよびラムダ鎖が含まれる。

本願において、“重鎖”は、抗原またはエピトープに対する結合特異性を提供するのに十分な可変領域配列を有する全長重鎖およびその断片を含む。全長重鎖は、可変領域ドメインＶＨおよび３個の不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。ＶＨドメインは重鎖ポリペプチドのアミノ末端に存在し、ＣＨドメインはカルボキシ末端に存在し、ＣＨ３がカルボキシ－末端に最も近く位置する。重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブタイプを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブタイプを含む）、ＩｇＭおよびＩｇＥのアイソタイプを含む。

本明細書に記載された“抗原結合断片”は、抗原に対する特異的結合能を有する抗体の一部またはこれを含むポリペプチドを意味する。例えば、抗原結合断片は、抗原（例えば、エピトープ）と相互作用して、抗体に抗原に対する特異性および／または親和性を付与するアミノ酸残基を含む抗体の一部またはこれを含むポリペプチドであってもよい。このような抗原結合断片は典型的に、一つ以上の“相補性決定部位”（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ、ｏｒ ＣＤＲ）を含むことができ、ここに加えて、一つ以上の“フレームワーク”領域を含むことができる。ＣＤＲは抗体の抗原結合の特異性と親和性に寄与するアミノ酸配列であり、フレームワーク領域はこれらＣＤＲの適切な形態（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を維持するのに寄与するアミノ酸配列部位であって、抗原結合領域と抗原の間に結合を促進することができる。
本願に使用された、抗体または免疫グロブリンの鎖（重鎖または軽鎖）の“抗原結合断片”は全長鎖と比較して一部のアミノ酸が欠如したが、抗原に特異的に結合できる抗体の一部を含むものである。このような断片は、標的抗原に特異的に結合でき、または他の抗体または抗原結合断片と特定のエピトープに結合するために競争できるという側面から、生物学的に活性があるといえる。一態様において、このような断片は全長軽鎖または重鎖内に存在する少なくとも一つのＣＤＲを含み、一部の実施形態において、単鎖、重鎖および／または軽鎖、またはその一部を含む。このような生物学的活性断片は、組換えＤＮＡ技術によって生産されるか、または、例えば、完全な抗体を酵素的または化学的切断して生産できる。免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片には、これに制限されるのではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体および単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃなど）を含む。また、これに制限されるのではないが、ヒト、マウス、ラット、カメリドまたはウサギを含む任意の哺乳動物に由来し得る。本明細書に開示された一つ以上のＣＤＲのような抗体の機能的な部分は、第２のタンパク質または低分子化合物と共有結合で連結され、特定の標的に対する標的治療剤として使用できる。

本願において、“Ｆａｂ断片”は、１個の軽鎖と、ＣＨ１および可変領域のみを含む一つの重鎖から構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は、他の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。

本願において、“Ｆｃ”領域は、抗体のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む重鎖断片を二分子含む。これら２個の重鎖断片は、２個以上のジスルフィド結合およびＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって結合されている。

本願において、“Ｆａｂ’断片”は、Ｆａｂ断片に重鎖のＣＨ１とＣＨ２ドメインの間に存在する領域を追加的に含んで、二分子のＦａｂ’断片の二つの重鎖の間で鎖間ジスルフィド結合が形成され、Ｆ（ａｂ’）２分子を形成することができる。

本願において、“Ｆ（ａｂ’）２断片”は、先に記述したように、２個の軽鎖、および可変領域、ＣＨ１とＣＨ１とＣＨ２ドメインの間に不変領域の一部を含む重鎖２分子を含んで、２分子の重鎖の間で鎖間ジスルフィド結合が形成される。したがって、Ｆ（ａｂ’）２断片は２個のＦａｂ’断片から構成され、前記二つのＦａｂ’断片はこれら間のジスルフィド結合によって会合されている。

本願において、“Ｆｖ領域”は、重鎖および軽鎖の可変領域を含むが、不変領域は含まない抗体である。

本願において、“単鎖抗体”は、重鎖および軽鎖可変領域が柔軟なリンカーによって連結された抗原結合領域の単一ポリペプチド鎖である。例えば、前記単鎖抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域が単一鎖形態に連結されたｓｃＦｖ、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、およびＦｃが単一鎖形態に連結されたｓｃＦｖ－Ｆｃなどからなる群より選択された１種以上であってもよい。単鎖抗体は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号を参照することができる。

本願において、“２価の抗原結合タンパク質”または“２価抗体”は、２個の抗原結合部位を含む。このような２価抗体に含まれている２個の抗原結合部位は、同一の抗原特異性を有するか、またはそれぞれ異なる抗原に結合する二重特異的抗体であってもよい。本願において、“多重特異的抗原結合タンパク質”または“多重特異的抗体”は、二つ以上の抗原またはエピトープを標的にするものである。

本願において、“二特異的”、“二重特異的”抗原結合タンパク質または抗体は、２個の異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗原結合タンパク質または抗体である。このような二特異的抗体は、多重特異的抗原結合タンパク質または多重特異的抗体の一種であって、公知の多様な方法、例えば、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結によって生産できる。

本願において、“二特異的”、“二重特異的”抗原結合タンパク質または抗体は、２個の異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗原結合タンパク質または抗体である。このような二特異的抗体は、多重特異的抗原結合タンパク質または多重特異的抗体の一種であって、公知の多様な方法、例えば、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片あるいはｓｃＦｖ断片の連結によって生産できる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎｎ、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９０、７９：３１５－３２１；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２、１４８：１５４７－１５５３などを参照することができる。二特異的抗原結合タンパク質または抗体の２個の抗原結合部位が結合する２個の互いに異なるエピトープは、同一または異なるタンパク質標的に位置できる。本願による一実施形態において、本願による抗体は、血液脳関門を通過して伝達されるために伝達体に対する結合を追加的に含む二重特異的抗体の形態を取ることができる。血液脳関門を通じて薬物を伝達するための一つ方法は、細胞に内在したグルコースおよびアミノ酸伝達体、インスリンまたはトランスフェリンの受容体媒介トランスサイトーシスのような伝達システムの使用を含む。

本願において、“コンジュゲート”は、本願に開示された抗体またはその抗原結合断片と他の分子、特に後述する血液脳関門伝達体または治療剤とのキメラ分子を称するものである。コンジュゲートで、本願による抗体またはその抗原結合断片は、他の分子と、例えば、共有結合またはファンデルワールスまたは疎水性相互作用による物理的力、カプセル化、包埋化（ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）または前記組み合わせを含む方法によって物理的に結合される。一実施形態によるコンジュゲートで、本願による抗体またはその抗原結合断片は、ペプチドリンカーを通じて連結できる。

本願はまた、本願に開示された一つ以上のアミノ酸配列と実質的な配列同一性を有する一つ以上のアミノ酸配列を含む。実質的同一性とは、本願は、配列変異が存在する本願に開示された効果を維持することを意味する。一実施形態で開示された重鎖可変領域と約９０％、９５％、または９９％同一性を有する。他の実施形態で開示された軽鎖可変領域と約９０％、９５％、または９９％同一性を有する。例えば、本願に開示された抗体または抗原結合断片の配列と９０％、９５％、または９９％同一性を示す変異体の場合、任意の変異はＣＤＲよりは可変領域の骨格から発生する。

本発明によるアルファ－シヌクレインまたはその凝集体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３の相補性決定部位を含む重鎖可変領域；およびＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３の相補性決定部位を含む軽鎖可変領域を含むことができる。

一具体例で、前記抗－アルファ－シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、下記のＣＤＲ配列を含むことができる：
配列番号１および配列番号６のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ－ＣＤＲ１）、
配列番号２～４および配列番号７～８のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ－ＣＤＲ２）、
配列番号５および配列番号９のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ－ＣＤＲ３）、
配列番号１０および配列番号１３のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ－ＣＤＲ１）、
配列番号１１および配列番号１４のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ－ＣＤＲ２）、および
配列番号１２および配列番号１５のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ－ＣＤＲ３）。

前記重鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３のアミノ酸配列と軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３のアミノ酸配列を表１および表２に整理した：

一具体例において、前記抗－アルファ－シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ－ＣＤＲ１）、配列番号２～４のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ－ＣＤＲ２）、および配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域；および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ－ＣＤＲ１）、配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ－ＣＤＲ２）、および配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を含むことができる。

また、前記抗－アルファ－シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ－ＣＤＲ１）、配列番号７～８のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ－ＣＤＲ２）、および配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域；および配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ－ＣＤＲ１）、配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ－ＣＤＲ２）、および配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を含むことができる。

他の具体例において、前記抗－アルファ－シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、
Ｈ－ＣＤＲ１のＮ－末端側に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ－ＦＲ１）であって、配列番号１６～１７および配列番号３５～４０のアミノ酸配列のうちの一つを含むポリペプチド断片を含み、
Ｈ－ＣＤＲ１とＨ－ＣＤＲ２の間に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ－ＦＲ２）であって、配列番号１８～１９および配列番号４１～４４のアミノ酸配列のうちの一つを含むポリペプチド断片を含み、
Ｈ－ＣＤＲ２とＨ－ＣＤＲ３の間に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ－ＦＲ３）であって、配列番号２０～３１および配列番号４５～５０のアミノ酸配列のうちの一つを含むポリペプチド断片を含み、
Ｈ－ＣＤＲ３のＣ末端に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ－ＦＲ４）であって、配列番号３２～３４および配列番号５１～５２のアミノ酸配列のうちの一つを含むポリペプチド断片を含み、
Ｌ－ＣＤＲ１のＮ－末端側に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ－ＦＲ１）であって、配列番号５３～５８および配列番号７１～７７のアミノ酸配列のうちの一つを含むポリペプチド断片を含み、
Ｌ－ＣＤＲ１とＬ－ＣＤＲ２の間に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ－ＦＲ２）であって、配列番号５９～６１および配列番号７８～８１のアミノ酸配列のうちの一つを含むポリペプチド断片を含み、
Ｌ－ＣＤＲ２とＬ－ＣＤＲ３の間に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ－ＦＲ３）であって、配列番号６２～６７および配列番号８２～８８のアミノ酸配列のうちの一つを含むポリペプチド断片を含み、および／または
Ｌ－ＣＤＲ３のＣ末端に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ－ＦＲ４）であって、配列番号６８～７０および配列番号８９のアミノ酸配列のうちの一つを含むポリペプチド断片を含むものであってもよい。

本明細書でフレームワークに使用可能なアミノ酸配列として、重鎖可変領域フレームワーク配列を表３および表４に、軽鎖可変領域フレームワーク配列を表５および表６に例示した。

他の具体例において、前記抗－アルファ－シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１および配列番号６のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ－ＣＤＲ１）、配列番号２～４および配列番号７～８のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ－ＣＤＲ２）、配列番号５および配列番号９のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域を含むことができ、
前記重鎖可変領域は、配列番号１６～１７および配列番号３５～４０のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ－ＦＲ１）、配列番号２０～３１および配列番号４５～５０のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ－ＦＲ２）、配列番号２０～３１および配列番号４５～５０のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ－ＦＲ３）、および配列番号３２～３４および配列番号５１～５２のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ－ＦＲ４）を含むことができる。さらに詳しくは、前記重鎖可変領域は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨ－ＦＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨ－ＦＲ２、配列番号２９～３１のアミノ酸配列のうちの一つを含むＨ－ＦＲ３、および配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨ－ＦＲ４を含むことができる。

また、前記抗－アルファ－シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１０および配列番号１３のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ－ＣＤＲ１）、配列番号１１および配列番号１４のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ－ＣＤＲ２）、および配列番号１２および配列番号１５のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を含むことができ、
前記軽鎖可変領域は、追加的に、配列番号５３～５８および配列番号７１～７７のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ－ＦＲ１）、配列番号５９～６１および配列番号７８～８１のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ－ＦＲ２）、配列番号６２～６７および配列番号８２～８８のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ－ＦＲ３）、および配列番号６８～７０および配列番号８９のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ－ＦＲ４）を含むことができる。さらに詳しくは、前記軽鎖可変領域は、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＬ－ＦＲ１、配列番号５９のアミノ酸配列を含むＬ－ＦＲ２、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＬ－ＦＲ３、および配列番号３４のアミノ酸を含むＬ－ＦＲ４を含むことができる。

但し、本発明による抗－アルファ－シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１、２および５のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１－ＣＤＲ３と配列番号１０、１１、および１２のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１－ＣＤＲ３を含み、配列番号１６、１８、２０および３２のアミノ酸配列からなる重鎖ＦＲ１－ＦＲ４と配列番号５３、５９、６２および６８のアミノ酸配列からなる軽鎖ＦＲ１－ＦＲ４とを有するマウス抗体またはキメラ抗体またはその抗原結合断片を含まない。また、本発明による抗－アルファ－シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号６、７および９のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１－ＣＤＲ３と配列番号１３、１４、および１５のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１－ＣＤＲ３を含み、配列番号３５、４１、４５および５１のアミノ酸配列からなる重鎖ＦＲ１－ＦＲ４と配列番号７１、７８、８２および８９のアミノ酸配列からなる軽鎖ＦＲ１－ＦＲ４とを有するマウス抗体またはキメラ抗体またはその抗原結合断片を含まない。具体的な例として、配列番号９０の重鎖可変領域配列（ｃｈ１１Ｆ１１－ＶＨ）と配列番号１０９の軽鎖可変領域配列（ｃｈ１１Ｆ１１－ＶＬ）を含む抗体または配列番号１０２の重鎖可変領域配列（ｃｈ１１Ｆ１１－ＶＨ）と配列番号１１６の軽鎖可変領域配列（ｃｈ１１Ｆ１１－ＶＬ）を含むＣｈ３Ａ９抗体は、本発明による抗アルファ－シヌクレイン抗体に含まれない。

本発明の具体的な一例による抗－アルファ－シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ－ＣＤＲ１）、配列番号２～４のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ－ＣＤＲ２）、および配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域；および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ－ＣＤＲ１）、配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ－ＣＤＲ２）、および配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を含むことができ、
前記重鎖可変領域は、配列番号１６～１７のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ－ＦＲ１）、配列番号１８～１９のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ－ＦＲ２）、配列番号２０～３１のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ－ＦＲ３）、および配列番号３２～３４のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ－ＦＲ４）を含み、
前記軽鎖可変領域は、配列番号５３～５８のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ－ＦＲ１）、配列番号５９～６１のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ－ＦＲ２）、配列番号６２～６７のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ－ＦＲ３）、および配列番号６８～７０のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ－ＦＲ４）を含むことができる。

好ましくは、本発明の具体的な一例による抗－アルファ－シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１、配列番号２および配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨ－ＦＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨ－ＦＲ２、配列番号２９～３１のアミノ酸配列のうちの一つを含むＨ－ＦＲ３、および配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨ－ＦＲ４を含むことができ、前記軽鎖可変領域は、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＬ－ＦＲ１、配列番号５９のアミノ酸配列を含むＬ－ＦＲ２、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＬ－ＦＲ３、および配列番号３４のアミノ酸配列を含むＬ－ＦＲ４を含むことができる。

本発明の具体的な一例による抗－アルファ－シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ－ＣＤＲ１）、配列番号７～８のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ－ＣＤＲ２）、および配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域；および配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ－ＣＤＲ１）、配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ－ＣＤＲ２）、および配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を含むことができ、
前記重鎖可変領域は、配列番号３５～４０のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ－ＦＲ１）、配列番号４１～４４のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ－ＦＲ２）、配列番号４５～５０のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ－ＦＲ３）、および配列番号５１～５３のアミノ酸配列のうちの一つを含む重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ－ＦＲ４）を含み、
前記軽鎖可変領域は、配列番号７１～７７のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ－ＦＲ１）、配列番号７８～８１のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ－ＦＲ２）、配列番号８２～８８のアミノ酸配列のうちの一つを含む軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ－ＦＲ３）、および配列番号８９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ－ＦＲ４）を含むことができる。

全長の軽鎖および重鎖で、可変領域および不変領域は約１２個以上のアミノ酸長さの“Ｊ”領域によって結合され、重鎖はまた、約１０個以上のアミノ酸の“Ｄ”領域を含む。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２ｎｄ ｅｄ．、Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ、Ｗ．、ｅｄ．）１９８９、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓを参照することができる。典型的に、抗体の軽鎖／重鎖対の可変領域が抗原結合部位を形成する。

免疫グロブリン鎖の可変領域は一般に全体的構造が同一であり、“相補的決定部位または領域またはドメイン”またはＣＤＲと称される３個の超可変領域によってつながる比較的に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。重鎖／軽鎖対を構成する各鎖由来の可変領域のＣＤＲは、典型的にフレームワーク領域によって整列されて的タンパク質（アルファ－シヌクレイン）の特定エピトープと特異的に結合する構造を形成する。自然発生軽鎖および重鎖可変領域のこのような要素は、Ｎ－末端からＣ－末端まで典型的に次の順序で含まれる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４。可変領域で、これらそれぞれに該当するアミノ酸配列の位置は、Ｋａｂａｔナンバリングシステム（Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８７ ａｎｄ １９９１、ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）、またはＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ、１９８７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８－８８３に記載されたものに従う。

本明細書に開示された多様な重鎖および軽鎖可変領域は、表７および表８に開示される。このようなそれぞれの可変領域は、完全な抗体のそれぞれの重鎖および軽鎖を形成するために、前記重鎖および軽鎖不変領域に結合できる。また、このように生成されたそれぞれの重鎖および軽鎖配列はまた完全な抗体構造を形成するために組合わせられ得る。例えば、本発明による抗－アルファ－シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号９０～１０１または配列番号１０２～１０８のアミノ酸配列のうちの一つの重鎖可変領域と、配列番号１０９～１１５または配列番号１１６～１２３のアミノ酸配列のうちの一つの軽鎖可変領域を含み、さらに詳しくは、配列番号９０～１０１のアミノ酸配列のうちの一つの重鎖可変領域と配列番号１０９～１１５のアミノ酸配列のうちの一つの軽鎖可変領域を含むか、配列番号１０２～１０８のアミノ酸配列のうちの一つの重鎖可変領域と配列番号１１６～１２３のアミノ酸配列のうちの一つの軽鎖可変領域を含むことができる。

本発明の具体的な一例で、抗－アルファ－シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号９８～１０１のアミノ酸配列のうちの一つの重鎖可変領域と、配列番号１１５のアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含むことができるか（例、Ｈｕ１１Ｆ１１＿（ｖｅｒ．１）、Ｈｕ１１Ｆ１１＿（ｖｅｒ．２）、Ｈｕ１１Ｆ１１＿（ｖｅｒ．３）、Ｈｕ１１Ｆ１１＿（ｖｅｒ．４）、など）、または配列番号９２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１１３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むことができる（例、Ｈｕ１１Ｆ１１＿（ＡＢＬ２－４）抗体）。

但し、前記抗－アルファ－シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号９０の重鎖可変領域および配列番号１０９の軽鎖可変領域からなるもの、および配列番号１０２の重鎖可変領域および配列番号１１６の軽鎖可変領域からなるものは除外される。

一実施形態による抗体または抗原結合断片の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を表７および表８に例示した。

また、一実施形態による抗体または抗原結合断片の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の組み合わせと不変領域を含む、例示的な抗体を表９に記載した。

本明細書に開示された重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、完全な抗体の重鎖および軽鎖を形成するために、それぞれ重鎖不変領域および軽鎖不変領域に結合できる。このように生成されたそれぞれの重鎖および軽鎖は適切に組み合わせられて重鎖－軽鎖組み合わせを成すことができ、前記重鎖－軽鎖組み合わせは多量体を形成（例えば、ＩｇＧタイプ抗体の場合、二量体を形成）して完全な抗体構造を成すことができる。

前記不変領域は、免疫グロブリン（例えば、ヒト免疫グロブリン）重鎖不変領域および軽鎖不変領域から適切に選択できる。例えば、重鎖不変領域はＩｇＧ１重鎖不変領域、ＩｇＧ３重鎖不変領域、またはＩｇＧ４重鎖不変領域であってもよく、軽鎖不変領域はカッパ不変領域またはラムダ軽鎖不変領域であってもよいが、これに制限されるわけではなく、抗体安定性、製造可能性、抗原親和性、および／またはその他目的とする特徴などのために、他の類型の不変領域または変形された不変領域を適切に選択して使用することができ、これは当業者が明確に分かる事項である。

他の実施形態において、前記表７および表８に開示された重鎖可変領域および軽鎖各可変領域は互いに自由に組み合わせられて多様な抗体を形成することができ、単一鎖形態に連結されてｓｃＦｖのような単鎖抗体を形成することもできる。

本明細書に開示された抗体は、本明細書に開示された他の抗体と特定領域または配列を共有する。一実施形態では、抗体または抗原結合断片の不変領域を共有することができる。他の実施形態では、Ｆｃ領域を共有することができる。

一例で、本明細書で提供される抗－アルファ－シヌクレイン抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってもよい。他の例で、前記抗－アルファ－シヌクレイン抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、または動物由来抗体であってもよい。他の例で、前記抗－アルファ－シヌクレイン抗体は、組み換え的または化学的に合成されたものであってもよい。

一実施形態において、本明細書に開示された抗体の抗原結合断片または抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片、ミニボディ、ジアボディ、およびｓｃＦｖなどの単鎖抗体分子からなる群より選択された１種以上であってもよい。

他の実施形態で、本願に提供された抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体であり、多様なイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、またはＩｇＤ）であってもよく、特に、ＩｇＧ１－、ＩｇＧ２－ＩｇＧ３－またはＩｇＧ４－類型、例えば、ＩｇＧ１－またはＩｇＧ２－類型であってもよい。

また他の実施形態において、抗－アルファ－シヌクレイン抗体は、前記記載された軽鎖または重鎖のみからなるものであってもよい。他の実施形態において、抗－アルファ－シヌクレイン抗体は、軽鎖可変領域または重鎖可変領域のみからなるものであってもよい。

当業者であれば、抗体が本明細書に開示された一つ以上のＣＤＲを含む場合、開示された各ＣＤＲは互いに独立的に選択されて組み合わせられ得るのを理解するはずである。したがって、１、２、３、４、５、または６個の独立的に選択されたＣＤＲを有する抗体が生成され得る。また、組み合わせのためにＣＤＲが選択される時、同じ種類のＣＤＲが反復的に使用されず、例えば、抗体は一般に二つのＣＤＲＨ２領域を含んで製造されないということを当業者であれば分かるはずである。

一実施形態において、前記抗体は、モノクローナル抗体または多クローン抗体であってもよい。本明細書に開示された抗体は、アルファ－シヌクレインに結合するモノクローナル抗体を含む。モノクローナル抗体は、当該技術分野に公知された任意の技術を使用して製造できる。例えば、免疫化された形質転換動物から収穫された脾臓細胞を不滅化させることによって生産できる。ハイブリドーマ細胞株によって分泌されたモノクローナル抗体は、当該技術分野に公知された技術を使用して精製することができる。

他の具体例において、前記抗体は、動物由来抗体（例えば、マウス抗体など）、キメラ抗体（例えば、マウス－ヒトキメラ抗体）、ヒト化抗体、またはヒト抗体であってもよい。抗体はまた、多様な目的のために多様な方式で変形できる。キメラおよびヒト化抗体がさらに提供される。キメラ抗体は、異なる抗体に由来するポリペプチド断片が共有結合で連結されて、免疫学的に機能的な軽鎖、重鎖またはその断片を形成する抗体である。

このようなモノクローナル抗体で、典型的に抗体の非－抗原認識部分を構成する特定のアミノ酸残基がヒト抗体の相応するアイソタイプの相応する残基と相同性になるように変形する。ヒト化は、例えば、公知された多様な方法を用いて、齧歯類可変領域の少なくとも一部をヒト抗体の相応する領域で置換することによって行われる（米国特許第５，５８５，０８９号および第５，６９３，７６２号；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４－１５３６）。

完全ヒト抗体は、内因性免疫グロブリンの生成が欠乏してヒト抗体を生成することができる形質転換動物（通常、マウス）を免疫化させることによって生成される。完全ヒト抗体はまた、ファージ－ディスプレイライブラリー（ｐｈａｇｅ－ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ）に由来し得る。完全ヒト抗体を使用すれば、マウスまたはマウス－由来のｍＡｂをヒトに投与することによって誘発することがある免疫原性反応およびアレルギー反応を最少化することができる。

一実施形態において、本願のヒトアルファ－シヌクレイン抗体は、ファージディスプレイ方法によって選別される。ファージスクリーニングによって選別したアルファ－シヌクレイン特異的な単一クローンファージ抗体を全体ＩｇＧ（ｆｕｌｌ ＩｇＧ）形態に変換するために組換え方法を用いた。抗－アルファ－シヌクレイン抗体の組換え製造のために各単一クローンファージ抗体の配列を確保する。確保した配列において、重鎖可変領域配列は重鎖不変領域配列に、軽鎖可変領域配列は軽鎖不変領域配列に移植した後、コドン最適化（ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）方法によってアミノ酸配列を核酸配列に変更する。確保した核酸配列を動物細胞培養用ベクターにクローニングした後、ＣＨＯ細胞などのタンパク質生産用宿主細胞に前記ベクターを用いて形質転換して、培養する。前記培養液に含まれている抗体を精製するために親和度クロマトグラフィーなどの精製技術を用いて組換え抗体を分離精製する。

他の具体例において、前記抗体は、自然から発見される抗体の典型的な構造を有するか、変形された構造を有する抗体であってもよい。

前記典型的な構造を有する抗体は、互いに異なる二つのポリペプチド鎖（即ち、重鎖および軽鎖）を含む構造的単位体を含む多量体構造を有することができる。前記互いに異なる二つのポリペプチド鎖は、全長軽鎖（約２５ｋＤａ）および全長重鎖（約５０～７０ｋＤａ）を含むことができる。各鎖は、特徴的な折りたたみパターンを示し、約９０～１１０個アミノ酸からなる、数個の免疫グロブリンドメインから構成されている。このようなドメインは、抗体ポリペプチドを構成している基本単位体である。各鎖のアミノ－末端部分は、典型的に抗原を認識する部分である可変領域またはＶ領域と称される部分を含む。カルボキシ－末端部分は、アミノ－末端より進化的により保存され、不変領域またはＣ領域と称される部分を含む。ヒト軽鎖は、一般にカッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖として分類され、これらそれぞれは、一つの可変領域および一つの不変領域を含む。重鎖は、一般にミュー（μ）、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）またはエプシロン（ε）鎖として分類され、これらはそれぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥイソタイプと定義される。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むが、これに制限されない複数のサブタイプを有する。重鎖不変領域は、典型的に効果器機能を示す一つ以上のドメインを含む。重鎖不変領域ドメインの数はイソタイプによって変わる。ＩｇＧ重鎖は、例えば、それぞれＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３と公知された３個のＣ領域ドメインを含む。本明細書に開示された抗体は、このようなイソタイプおよびサブタイプのうちの任意の一つであってもよい。一実施形態において、前記抗－アルファ－シヌクレイン抗体は、ＩｇＧイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４サブタイプであってもよい。

本明細書に開示された抗体はまた、前記本明細書に開示された抗体の変異体である。例えば、抗原の一部は、前記開示された重鎖または軽鎖、可変領域またはＣＤＲ配列の一つ以上の残基で保存的（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）アミノ酸置換を含む。当業者であれば、公知された技術を使用して本明細書に開示されたポリペプチドの適切な変異体を決定することができるはずである。当業者であれば、ポリペプチドにおいて活性に重要であると思われない領域を変異体の標的にして、活性を破壊しないながらもタンパク質を変化させることができる部位を探し出すことができるはずである。

本願はまた、本願に開示された抗体の誘導体を提供する。誘導体化された抗体は、抗体またはその断片に目的とする特性、例えば、特定の用途で増加された半減期を提供する任意の分子または物質を含むことができる。誘導体化された抗体は、例えば、検出可能（または標識化）残基（例：放射性、比色性、抗原性または酵素分子、検出可能なビーズ（例：磁気または電子密度（例：金）ビーズ）、または他の分子（例：ビオチンまたはストレプトアビジン）に結合する分子）、治療的または診断的残基（例：放射性、細胞毒性、または薬学的活性残基）、または特別な用途（例えば、対象体、例えば、ヒト対象体に投与、またはその他の生体内または試験管内使用）のための抗体の適合性を増加させる分子を含むことができる。

他の実施形態は、抗体のＦｃ領域にアルファ－シヌクレイン結合タンパク質が融合された２個の融合タンパク質を含む二量体に関するものである。前記二量体は、例えば、融合タンパク質をコーディングする遺伝子融合体を適切な発現ベクター内に挿入し、組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞内で遺伝子融合体を発現させ、発現した融合タンパク質が抗体分子と類似に組み合わせられるようにすることによって製造することができ、ここで鎖間ジスルフィド結合がＦｃ残基の間に形成されて二量体が得られる。

本願で使用された用語“Ｆｃポリペプチド”は、抗体のＦｃ領域に由来するポリペプチドであって、野生型または突然変異形態を含む。二量体化を促進するヒンジ領域を含む切断された形態のポリペプチドもさらに含まれる。Ｆｃ残基を含む融合タンパク質およびこれから形成されたオリゴマーは、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇカラムを用いた親和性クロマトグラフィーで容易に分離できるという長所がある。

他の様態において、本願はまた、本願による前記抗体または抗原結合断片をコーディングする分離されたポリヌクレオチドを提供する。他の様態において、本願はまた、本願による前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。また他の様態において、本願はまた、本願による前記発現ベクターで形質転換された原核または真核細胞または細胞株を提供する。

また他の様態において、本願はまた、前記本願による細胞を前記抗体または抗原結合断片が発現するのに十分な条件で培養する段階；および前記細胞株から抗体またはその抗原結合断片を分離する段階を含む、アルファ－シヌクレインに特異的に結合する分離された抗体またはその抗原結合断片の製造方法を提供する。

また、本明細書に開示された抗体または抗原結合断片は、多様な有用性を有する。例えば、特異的結合分析、親和度に基づいたアルファ－シヌクレイン精製、またはアルファ－シヌクレイン拮抗剤の究明のためのスクリーニング方法などに使用することができる。一実施形態において、本願による抗体は、アルファ－シヌクレイン凝集体の形成抑制、神経系からアルファ－シヌクレイン凝集体の除去、アルファ－シヌクレイン凝集体の細胞間移動抑制、アルファ－シヌクレイン凝集体に対する食細胞作用による細胞外アルファ－シヌクレイン凝集体の除去および減少に有用であり得る。

本願による抗体は、アルファ－シヌクレインまたはアルファ－シヌクレイン凝集体に関連した多様な疾患の検出および／または治療に使用することができる。例えば、疾患は、アルファ－シヌクレインまたはアルファ－シヌクレイン凝集体に関する疾病、症状または疾患の検出、治療、軽減、緩和に有用である。また、本願による抗体は、アルファ－シヌクレインまたはアルファ－シヌクレイン凝集体に関連した多様な疾患または症状の診断またはアルファ－シヌクレインまたはアルファ－シヌクレイン凝集体の有無検出に使用することができる。

本発明による抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）アルファ－シヌクレインまたはアルファ－シヌクレイン凝集体に特異的な結合、（ｉｉ）対象の神経系でアルファ－シヌクレイン、またはアルファ－シヌクレイン凝集体の水準減少、（ｉｉｉ）神経細胞間アルファ－シヌクレインまたはその凝集体の移動（ｃｅｌｌ－ｔｏ－ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）減少または阻害、および（ｖｉ）神経細胞によるアルファ－シヌクレインまたはその凝集体の食細胞作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ｕｐｔａｋｅ）の増進からなる群より選択された１種以上の活性を有するものであってもよい。好ましくは、本発明による抗体またはその抗原結合断片は、前記活性（ｉ）～（ｉｖ）を全て有するものであってもよい。

本発明の一例は、アルファ－シヌクレイン、特にアルファ－シヌクレイン凝集体に特異的に結合できる抗体またはその抗原結合断片を含むシヌクレイン病の予防、軽減、改善または治療用組成物に関するものである。

本発明の一例は、アルファ－シヌクレイン、特にアルファ－シヌクレイン凝集体に特異的に結合できる抗体またはその抗原結合断片を、これを必要とする対象に投与する段階を含むシヌクレイン病の予防、軽減、改善または治療方法に関するものである。前記抗体またはその抗原結合断片の投与量は、対象の神経系で、さらに詳しくは、神経系の神経細胞外領域でアルファ－シヌクレイン、特にアルファ－シヌクレイン凝集体の水準を減少させる有効量であってもよい。

本発明の一例は、アルファ－シヌクレイン、特にアルファ－シヌクレイン凝集体に特異的に結合できる抗体またはその抗原結合断片を含む、対象の神経系で、さらに詳しくは、神経系の神経細胞外領域でアルファ－シヌクレイン、特にアルファ－シヌクレイン凝集体の水準を減少させる方法、または神経系の神経細胞外領域でアルファ－シヌクレイン、特にアルファ－シヌクレイン凝集体の水準を減少させる用途に関するものである。

また他の様態において、本願はまた、本願による任意の抗体またはその抗原結合断片を含む組成物またはキットを提供し、前記組成物は薬学または診断組成物として提供でき、薬学組成物は薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含むことができ、診断組成物は診断または検出に必要な試薬を追加的に含むことができる。

本願において、“血液脳関門”またはＢＢＢ（ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）は、脳および脊椎とその周辺循環系との間に存在する脳の毛細血管内皮細胞膜内にタイト結合（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）によって形成された障壁である。このような障壁は非常に堅固で、約６０Ｄａ分子量の低分子物質が脳に通過することも制限する。脳の血液脳関門、脊椎の血管脊髄障壁、そして網膜の血管網膜障壁は、中枢神経系内の連続的な毛細血管障壁であって、通常ＢＢＢと称する。

本願において、“血液脳関門伝達体”は、このような血液脳関門を通過して、本願による抗体または抗原結合断片を伝達できる分子、例えば、ペプチドおよびポリペプチドを含むタンパク質、核酸、抗体、または低分子化合物を含む。

本願において、“治療剤”は、目的とする治療効果のために対象体に投与される分子を称する。対象体は、非ヒト哺乳類、例えば、霊長類またはヒトを含む。治療剤の例としては、ペプチドおよびポリペプチドを含むタンパク質、核酸、抗体、または低分子化合物を含む。他の側面から、治療剤は、一実施形態において、本願による抗体と結合されて、アルファ－シヌクレイン凝集体に関連する疾患の治療剤として使用することができる。

シヌクレイン病で、アルファ－シヌクレインの蓄積が神経退行の典型的な特性を誘導する正確なメカニズムおよびシヌクレイン病の固有の症状が十分に理解されないでいるにもかかわらず、最近の研究はアルファ－シヌクレイン凝集体の異常な形成および蓄積が潜在的なシヌクレイン病の発生および退行性進行に関連するのを暗示している。

本発明によれば、用語“シヌクレイン病”は、病理学的シヌクレイン凝集体を特徴とする全ての神経退行性障害を含む。パーキンソン病、パーキンソン疾患性認知症（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｄｅｍｅｎｔｉａ、ＰＤＤ）、レビー小体認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ ｗｉｔｈ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｉｅｓ、ＤＬＢ）、レビー小体病、レビー小体を伴う認知症、認知症を伴うパーキンソン症候群、多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｔｒｏｐｈｙ、ＭＳＡ）、多発性神経系萎縮および脳鉄沈着を伴う神経変性Ｉ型（ＮＢＩＡ Ｔｙｐｅ Ｉ）を含むいくつかの神経退行性障害は、シヌクレイン病として集合的にグループ化される。また、アルファ－シヌクレイン凝集は、二次的にアルツハイマー疾患でも発見される（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１４、６：７３）。

シヌクレイン病は、共通的な病理学的特性を共有する神経退行性障害の多様なグループである：神経病理的実験で、特有の病変は、ニューロン（ｎｅｕｒｏｎ）および希小突起神経膠（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）の選択された集団内でアルファ－シヌクレインタンパク質の異常な凝集を含んで感知され得る。アルファ－シヌクレイン（最初にＰＡＲＫｌおよびＰＡＲＫ４と判明する）は、新皮質、海馬、歯状回、嗅球、線条体、視床および小脳で広範囲に発現する１４０個アミノ酸のタンパク質である。アルファ－シヌクレインはまた、Ｂ－、Ｔ－、およびＮＫ細胞をはじめとして蛋白球および血小板を含む造血細胞で高く発現する。このような細胞内での正確な役割は知られていないが、巨核球（血小板前駆体）の分化と関連があった。

本願によるアルファ－シヌクレイン凝集体を高い親和度で特異的に認識し、アルファ－シヌクレイン抗体がこのような疾患の診断、または検出に有用に使用できるのを示す。さらに、本願によるアルファ－シヌクレイン凝集体を特異的に認識するアルファ－シヌクレイン抗体は、アルファ－シヌクレイン凝集体の形成を抑制するか、または凝集体を分解し、細胞間凝集体の伝達を抑制して、シヌクレイン病、特にパーキンソン病の治療に効果的に使用することができるのを示す。

本願において、“アルファ－シヌクレイン凝集体に関連する疾患”は、シヌクレイン病と呼ばれる一群の神経退行性疾患であって、ニューロンおよび膠細胞（ｇｌｉａ）集団を含む病巣でアルファ－シヌクレイン凝集体が発見され、ドーパミン性システムの退化、運動能力変化、認知障害およびレビー小体および／またはレビーニューライトの形成のような特徴を有する（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１４、６：７３；ＭｃＫｅｉｔｈ ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（１９９６）４７：１１１３－２４）。このような疾患には、パーキンソン疾患、パーキンソン疾患性認知症、レビー小体認知症、アルツハイマーレビー小体疾患、複合性アルツハイマーおよびパーキンソン病、多系統萎縮症およびその他の多数の神経軸索疾患を含むが、これに制限されるのではない。一実施形態において、本願による抗体は、パーキンソン病の治療に効果的に使用される。

本願において、“有効量”は、一般に、疾患、特にアルファ－シヌクレインに関連する疾患による症状の深刻性および／または発生頻度の減少、疾患、特にアルファ－シヌクレインに関連する疾患による症状および／または疾患発生の根本原因除去、または疾患、特にアルファ－シヌクレインに関連する疾患による症状および／または根本原因発生の予防、および／または疾患、特にアルファ－シヌクレインに関連する疾患による損傷を改善または矯正するのに十分な量を意味する。一部の実施形態において、有効量は、治療的有効量または予防的有効量である。“治療的有効量”は、疾患、特にアルファ－シヌクレインに関連する状態または症状を治療するか、または疾患、特にアルファ－シヌクレインに関連する状態または症状の予防、遅滞、またはその進行を逆転させるほど十分な量である。“予防的有効量”は、対象体に投与される時、意図された通り、疾患、特にアルファ－シヌクレインに関連する疾患の発病または再発、または疾患、特にアルファ－シヌクレインに関連する疾患または関連する症状を予防または遅延させ、その発生の可能性を減少させる量である。完全な治療的または予防的効果は、服用量の１回投与によって発生するよりは、服用量の数回投与によって発生できる。したがって、治療的または予防的有効量は、１回以上の投与によって伝達できる。

本発明の他の様態において、本願は、本願による抗体または抗原結合断片またはこれを含む組成物を用いて、シヌクレイン病を有する対象体の前記疾患治療用用途を提供し、前記抗体または抗原結合断片またはこれを含む組成物は、前記対象体、または対象体の脳で、アルファ－シヌクレイン凝集体の細胞間伝達の抑制、アルファ－シヌクレイン凝集体分解、アルファ－シヌクレイン凝集体形成を抑制、またはアルファ－シヌクレイン凝集体のミクログリアによる食細胞作用の増加を含む。

本明細書において、“治療”は、疾病または疾病症状を減少、緩和、軽減、または除去するか、疾病の症状または病的状態をよりよく耐えられる状態にすること、または疾病の症状または病的状態の悪化速度を遅らせることなどを含む、疾病または疾病の症状または病的状態の軽減または除去に関連する全ての作用を意味することができる。用語“対象”または“患者”は、ヒトまたはヒト患者を含む。

抗体の治療的有効量、および薬学的に許容可能な希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤および／または補助剤を含む薬学的組成物もさらに提供される。また、例えば、このような薬学的組成物を投与することによって、アルファ－シヌクレインに関連した患者を治療する方法が含まれる。生体内投与に使用される薬学的組成物は、典型的に無菌製剤として提供される。一応、薬学的組成物が剤形化されれば、これは、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、結晶、または脱水されるか凍結乾燥された粉末として無菌バイアル内に貯蔵できる。このような剤形は、直ちに使用可能な形態、または投与直前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥される）で貯蔵できる。

薬学的組成物の投与経路は、公知の方法、例えば、経口；静脈内、腹膜内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼球内、動脈内、門脈内、または病巣内経路を通じた注射；持続放出システムまたは移植装置が使用できる。特定の実施形態において、組成物は、ボルス注射によって、または注入または移植装置によって連続的に投与される。

本願による薬学組成物またはキットはシヌクレイン病治療用であって、例えば、前記シヌクレイン病はパーキンソン病、パーキンソン疾患性認知症、レビー小体認知症、アルツハイマーレビー小体疾患、複合性アルツハイマーおよびパーキンソン病、または多系統萎縮症を含む。

また他の様態において、本願による抗体または抗原結合断片またはこれを含む組成物を、シヌクレイン病の治療および／またはアルファ－シヌクレイン凝集体の濃度調節の必要な対象体に投与する段階を含む、前記対象体のシヌクレイン疾病治療または前記対象体でアルファ－シヌクレイン凝集体の濃度を調節する方法を提供する。

一実施形態において、本願による抗体は、ＢＢＢ通過のために伝達体と連結されて使用できる。ＢＢＢを通じて薬物を伝達するための多数の方法が開示されている。例えば、ブラジキニン、またはＨＩＦＵ（Ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｆｏｕｃｕｅｓ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ）のような方法を使用してＢＢＢの浸透圧を瓦解させる方法がある。また、細胞に内在したグルコースおよびアミノ酸伝達体、インスリンまたはトランスフェリンの受容体媒介トランスサイトーシスのような伝達システムの使用または糖タンパク質の活性流出伝達（ｅｆｆｌｕｘ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）を遮断することを含む。

また他の実施形態において、本願による抗体は、他の治療剤と連結されて併合使用されて、アルファ－シヌクレイン凝集体に関連する疾患の治療に使用できる。抗体の治療的有効量、および薬学的に許容可能な希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤および／または補助剤を含む薬学的組成物もさらに提供される。

許容可能な剤形物質は、使用される用量および濃度で受容者に無毒性である。特定の実施形態において、治療的有効量のヒトアルファ－シヌクレイン抗体を含む薬学的組成物が提供される。特定の実施形態において、許容可能な剤形物質は、好ましくは、使用される用量および濃度で患者に無毒性である。一実施形態において、薬学的組成物は、例えば、組成物のｐＨ、オスモル濃度、粘度、透明度、色、等張性、香り、無菌性、安定性、溶解または放出の速度、吸収または浸透の変更、維持または保存のための特定剤形物質を含むことができる。

特定の実施形態において、最適の薬学的組成物は、例えば、目的とする投与経路、伝達方法および目的とする用量に応じて当業者によって決定される（前記ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、参照）。特定の実施形態において、これら組成物は、本願に開示された抗体の物理的状態、安定性、生体内放出速度および生体内クリアランス（ｃｌｅａｒａｎｃｅ）の速度に影響を与えることができる。特定の実施形態において、薬学的組成物中の主なビヒクルまたは担体は、水性または非－水性であってもよい。例えば、適切なビヒクルまたは担体は、可能には、非経口投与用組成物において通常の他の物質で補充された注射用水、生理塩水溶液であってもよい。追加的に、特定の実施形態において、ヒトアルファ－シヌクレイン抗体は、適切な賦形剤、例えば、スクロースを使用して凍結建造物（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｅ）として剤形化できる。

薬学的組成物は非経口伝達可能であり、治療的組成物は目的とするヒトα－Ｓｙｎ結合タンパク質を薬学的に許容可能なビヒクル内に含み、パイロジェンを含まない非経口に許容される水溶液の形態で提供できる。

一応、薬学的組成物が剤形化されれば、これは、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、結晶、または脱水されるか凍結乾燥された粉末として無菌バイアル内に貯蔵できる。このような剤形は、直ちに使用可能な形態、または投与直前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥される）で貯蔵できる。単一－用量投与単位体を生成するためのキットもさらに提供される。投与頻度は、使用された剤形のヒトアルファ－シヌクレイン抗体の薬物動態学的パラメータに左右される。

また、生体外でヒトアルファ－シヌクレイン抗体薬学的組成物を使用するのが好ましいことがある。このような場合に、患者から除去された細胞、組織または器官はヒトアルファ－シヌクレイン抗体薬学的組成物に露出し、その後、細胞、組織および／または器官は後続的に患者内に移植される。特に、ヒトアルファ－シヌクレイン抗体は、ポリペプチドを発現し分泌するために、本願に記載されているような方法を使用して遺伝子操作された特定細胞を移植することによって伝達できる。

また他の様態において、本願による抗体または抗原結合断片を提供する段階；および前記抗体または抗原結合断片をアルファ－シヌクレイン凝集体検出の必要な生物学的試料と接触する段階を含む、生物学的試料でアルファ－シヌクレイン凝集体の検出方法を提供する。生物学的試料は、アルファ－シヌクレイン凝集体の検出が必要な多様な試料を含み、例えば、脳脊髄液、血漿を含む血液または小便を含み、また、細胞、組織または器官を含む。前記方法は、インビトロまたはインビボで行うことができる。インビボイメージングは、例えば、ＰＥＴ（ｐｏｓｉｔｒｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）、ＳＰＥＣＴ（ｓｉｎｇｌｅ ｐｈｏｔｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）、ＮＩＲ（ｎｅａｒ ｉｎｆｒａｒｅｄ）光学イメージングまたはＭＲＩ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ）を用いて行うことができる。

また他の様態において、本願は、シヌクレイン病の診断が必要な対象体でシヌクレイン病を診断する方法であって、前記方法は、前記対象体でアルファ－シヌクレイン凝集体の濃度または細胞内位置を本願による任意の抗体または抗原結合断片で測定／検出する段階；および前記対象体で測定された前記アルファ－シヌクレイン凝集体の濃度または細胞内位置を対照群試料の結果と比較する段階を含み、前記対照群の結果との類似または差は、前記対象体がシヌクレイン病にかかったことを示す。前記方法で、対照群は、正常またはシヌクレイン病にかかった試料であってもよい。検出または診断用途のために、抗体は、典型的に検出可能な標識物質で標識されてもよい。

本願に開示された抗体は、アルファ－シヌクレインに関連する疾患および／または症状を検出、診断、またはモニタリングするための診断の目的に使用できる。一実施形態において、本願による方法は、シヌクレイン病の診断が必要な対象体でシヌクレイン病を診断する方法であって、前記方法は、前記対象体でアルファ－シヌクレイン凝集体の濃度または細胞内位置を本願による抗体または抗原結合断片で測定する段階；および前記対象体で測定された前記アルファ－シヌクレイン凝集体の濃度または細胞内位置を対照群試料の結果と比較する段階を含み、前記対照群の結果との類似または差は、前記対象体がシヌクレイン病にかかったことを示すものである。

前記方法で、対象体は、症状がないか、または症状が現れる前の患者を含むものである。一実施形態において、対照群は、パーキンソン病、レビー小体認知症または多系統萎縮症をを含むシヌクレイン病患者であってもよく、この場合、前記比較段階で対照群との類似性は、前記対象体をシヌクレイン病患者と診断する。他の実施形態において、対照群は、正常人由来の試料の場合、前記比較段階で対照群との差、例えば凝集体濃度の増加は、前記対象体をシヌクレイン病と診断する。また他の実施形態において、前記対象体と対照群の年齢がマッチされ得る。前記方法は、インビボまたは対象体から分離された生物学的試料、例えば、血液、脳脊髄液（ＣＳＦ、Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ）または小便試料で行うことができる。

診断用途のために、抗体は、典型的に検出可能な標識物質で標識されてもよい。適切な標識物質は、放射性同位元素または放射性核種（例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^３５Ｓ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ）、蛍光物質（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタン族蛍光体）、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ）、化学発光基、ビオチニル基、または２次レポーターによって認識されるポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、２次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）が含まれるが、これに制限されるわけではない。

他の様態において、本願の抗体は、アルファ－シヌクレイン凝集体を含む組織の識別に使用できる。特定の実施形態において、抗体は、標識物質で標識され、標識された抗体のアルファ－シヌクレイン凝集体に対する結合が検出される。一実施形態において、アルファ－シヌクレイン凝集体に対する抗体の結合は、生体内で検出される。

他の様態において、本願は、本願に開示された抗体とアルファ－シヌクレイン凝集体への結合に対して競争する試験物質を検出または選別することを開示する。例えば、試験物質の存在または不在で、アルファ－シヌクレイン凝集体を含む溶液内で遊離抗体の量を検出する段階を含む。

遊離抗体、即ち、アルファ－シヌクレイン凝集体に結合されない抗体濃度の増加は、試験分子がアルファ－シヌクレイン凝集体の結合に対して抗体と競争できるのを指示する。一実施形態において、抗体は標識基で標識される。代案的に、試験物質は標識され、遊離した試験物質の量は抗体の存在および不在でモニタリングする。

その他、本願に開示された抗体または抗原結合断片は、多様な有用性を有する。例えば、特異的結合分析、親和度に基づいたアルファ－シヌクレイン精製、またはアルファ－シヌクレイン拮抗剤の究明のためのスクリーニング方法などに使用できる。

本願に開示された抗体は、生物学的試料でアルファ－シヌクレイン、特にレビー小体のようなアルファ－シヌクレイン凝集体の検出およびアルファ－シヌクレイン凝集体を含む細胞または組織の識別に有用である。例えば、アルファ－シヌクレイン抗体は、診断、例えば、生物学的試料、例えば、血漿を含む血液、脳脊髄液（ＣＳＦ、Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ）または小便、組織または細胞内で発現したアルファ－シヌクレイン凝集体を検出し／するか定量する分析、およびこれに基づいたシヌクレイン病の診断に使用できる。

本願に開示された抗体は、アルファ－シヌクレイン、特にアルファ－シヌクレイン凝集体に高い結合力で選好的に結合する。高い親和度を有する本願による抗体または抗原結合断片は、アルファ－シヌクレイン凝集体の形成を減少させることができ、脳の凝集体の濃度を低めることができる。また、アルファ－シヌクレイン凝集体に対する高い親和度を有する本願による抗体または抗原結合断片は、中枢神経系の外でのアルファ－シヌクレイン凝集体の形成を減少させることができ、結局、血液脳関門を境界とするアルファ－シヌクレイン形態間の平衡状態を変更させて、中枢神経系内の凝集体の濃度を低める効果をもたらすことができる。また、高い親和度によって低い投与量で投与できる長所がある。これは、抗体を、例えば、これに制限されるのではないが、より簡便な皮下注射のような方式で投与しても十分な効能を得ることができるため、臨床で大きな長所がある。

本願に開示された抗体は、アルファ－シヌクレイン凝集体を効果的に除去するか、分解を促進することができ、アルファ－シヌクレインの細胞間伝達を抑制することができ、アルファ－シヌクレインの凝集体の蓄積に関連する疾患の治療に有用に使用できる。

本発明の一例で製造された単クローン抗体が凝集された形態のｎａｔｉｖｅアルファ－シヌクレインを特異的に認識するか否かを測定したドットブロット結果を示す。 本発明の一例で製造された単クローン抗体の親和度をＥＬＩＳＡで測定した結果である。 本発明の一例で製造された単クローン抗体のアルファ－シヌクレイン凝集体に対する選好的結合特異性および親和度をＢＩＡｃｏｒｅで分析した結果である。 図３ａの結果を表で示したものである。 本発明の一例で製造された単クローン抗体のアルファ－シヌクレイン凝集体に対する選好的結合特異性をＯｃｔｅｔで分析した結果である。 図４ａの結果を表で示したものである。 本発明の一例で製造された単クローン抗体がアルファ－シヌクレインの細胞間伝播（ｃｅｌｌ ｔｏ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）を抑制するかを分析する原理（上）および実験結果を示したものである。 本発明の一例で製造された単クローン抗体がヒトアルファ－シヌクレインを過発現するマウス動物モデル（ＴＧ）でアルファ－シヌクレイン凝集体を除去することができるかを、マウスに抗体投与後、ｐ－１２９ α－Ｓｙｎ抗体を用いてマウス脳組織を染色して測定した結果である。図面で、ＨＰはＨｉｐｐｏｃａｍｐｕｓであり、ｐ－１２９ α－ｓｙｎは１２９番目の残基がリン酸化された形態の凝集体のマーカーであり、矢印はリン酸化されたアルファ－シヌクレインを示す。 図６ａと同様な実験であるが、マーカーとして、総アルファ－シヌクレインに対する抗体を使用して染色した結果である。矢印は、ヒトアルファ－シヌクレインを示す。９Ｂ１１、１１Ｆ４、１１Ｆ１１抗体は、総アルファ－シヌクレインの蓄積を効果的に抑制した。 本発明の一例で製造された単クローン抗体がインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）でｍｉｃｒｏｇｌｉｏｓｉｓを減少させることができるかを、マウスに抗体投与後、マーカーとしてＩｂａ－１（ｍｉｃｒｏｇｌｉｏｓｉｓ）抗体を用いてマウスの脳組織を染色して測定した結果であり、矢印は活性化されたミクログリアを意味するものである。 本発明の一例で製造された単クローン抗体がインビボでａｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓを減少させることができるかを、マウスに抗体投与後、マーカーとしてＧＦＡＰ（ａｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓ）抗体を用いてマウスの脳組織を染色して測定した結果であり、矢印は活性化されたアストロサイトを意味するものである。 本発明の一例で単クローン抗体がインビボで炎症性サイトカインを減少させることができるかを、マウスに抗体投与後、マーカーとしてＩＬ－１ベータ（ＩＬ－１β）抗体を用いてマウスの脳組織を染色して測定した結果であり、矢印はＩＬ－１ベータを発現している細胞を示す。 本発明の一例による単クローン抗体がインビボで炎症性サイトカインを減少させることができるかを、マウスに抗体投与後、マーカーとしてＩＬ－６抗体を用いてマウスの脳組織を染色して測定した結果であり、矢印は炎症性サイトカインであるＩＬ－６を発現する細胞を示す。 それぞれ、本発明の一例による単クローン抗体３Ａ９および１１Ｆ１１がヒト脳組織でレビー小体（Ｌｅｗｙ ｂｏｄｙ）およびレビー神経突起（Ｌｅｗｙ ｎｅｕｒｉｔｅｓ）を特異的に認識できるかをそれぞれ測定した結果である。本願による抗体がレビー小体（矢印）およびレビー神経突起（左下の糸のような形状）に結合することを示す。 それぞれ、本発明の一例による単クローン抗体３Ａ９および１１Ｆ１１がヒト脳組織でレビー小体（Ｌｅｗｙ ｂｏｄｙ）およびレビー神経突起（Ｌｅｗｙ ｎｅｕｒｉｔｅｓ）を特異的に認識できるかをそれぞれ測定した結果である。本願による抗体がレビー小体（矢印）およびレビー神経突起（左下の糸のような形状）に結合することを示す。 本発明の一例による抗体のエピトープマッピング結果を図式的に示したものであって、本願による抗体は大部分Ｃ－末端部位に結合することが明らかになった。 本発明の一例によるキメラ抗体およびヒト化抗体のミクログリアのアルファ－シヌクレイン凝集体に対する食細胞作用促進能分析結果を示したものであり、図１０ａはヒト化１１Ｆ１１抗体に関するものであり、図１０ｂはヒト化３Ａ９に関するものである。 本発明の一例によるキメラ抗体およびヒト化抗体のミクログリアのアルファ－シヌクレイン凝集体に対する食細胞作用促進能分析結果を示したものであり、図１０ａはヒト化１１Ｆ１１抗体に関するものであり、図１０ｂはヒト化３Ａ９に関するものである。 本発明の一例によるキメラ抗体およびヒト化抗体がアルファ－シヌクレイン凝集体の神経細胞表面への結合を阻害する能力に関する分析結果である。 本発明の一例によるキメラ抗体およびヒト化抗体がアルファ－シヌクレインを過発現する神経細胞から分泌されて、正常神経細胞にアルファ－シヌクレイン凝集体が移動する細胞間伝播を抑制する効能分析結果である。 本発明の一例で製造されたキメラ抗体とヒト化１１Ｆ１１抗体の親和度をＥＬＩＳＡで測定した結果である。 本発明の一例で製造されたキメラ抗体とヒト化１１Ｆ１１抗体のアルファ－シヌクレイン凝集体に対する選好的結合特異性および親和度をＢＩＡｃｏｒｅで分析した結果である。 本発明の一例で製造されたキメラ抗体がベータ－シヌクレイン、ガンマ－シヌクレイン、あるいはアミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ_１－４２、タウ（ｔａｕ）由来凝集体でないアルファ－シヌクレイン、特にアルファ－シヌクレイン凝集体に特異的に結合する特異性をＥＬＩＳＡおよびドットブロットで分析した結果である。 本発明の一例で製造されたキメラ抗体がベータ－シヌクレイン、ガンマ－シヌクレイン、あるいはアミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ_１－４２、タウ（ｔａｕ）由来凝集体でないアルファ－シヌクレイン、特にアルファ－シヌクレイン凝集体に特異的に結合する特異性をＥＬＩＳＡおよびドットブロットで分析した結果である。 本発明の一例で製造されたキメラ抗体がベータ－シヌクレイン、ガンマ－シヌクレイン、あるいはアミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ_１－４２、タウ（ｔａｕ）由来凝集体でないアルファ－シヌクレイン、特にアルファ－シヌクレイン凝集体に特異的に結合する特異性をＥＬＩＳＡおよびドットブロットで分析した結果である。

以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これは例示的なものに過ぎず、本発明の範囲を制限しようとするのでない。

実施例１：マウスアルファ－シヌクレイン抗体の製造
免疫化
抗原としては、全長（１４０残基）またはＣ－末端２１個の残基が切断されたアルファ－シヌクレイン単量体を３７度のｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｃに入れて、１４日間１０５０ｒｐｍで振って凝集化させ、ソニケーションして使用した。前記製造された１ｍｇ／ｍｌ濃度の１４０個および１１９個残基のアルファ－シヌクレインフィブリルそれぞれをアジュバントと１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）で混合してよく混ぜた。

その次に、前記準備した混合物２００μＬを５～７週齢ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの皮下に注射し、２週後に、同様な方法で製造した混合物２００μＬを追加的に皮下注射してブースティングさせた。ブースティング１週後に血液を採取して、投与抗原を付けたＥＬＩＳＡ方法を使用して免疫化滴定（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｔｅｒａｔｉｏｎ）を行った。その次に、３次ブースティングは、抗原のみを皮下注射した。

ハイブリドーマ生産
その次に、前記のように免疫が完了したマウスの脾臓を除去して、これから細胞を確保した。その次に、脾臓細胞を１０％ＦＢＳが添加されたＨｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）に懸濁させた。ハイブリドーマを製造するために、マウス骨髄種細胞であるＳＰ２／０－Ａｇ１４と脾臓細胞を血清が含まれていないＨｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ培地で混合した後、遠心分離を行って培地を除去した。その次に、細胞ペレットにＰＥＧを添加した後、３７℃で１分間培養して細胞融合を誘導した。

単細胞クローニング
融合２週後に、細胞培養培地を用いてマウスに投与した抗原を付けたＥＬＩＳＡ方法を使用して抗体を生産するマウスＢ細胞との融合を確認した。その次に、ハイブリドーマを用いて単細胞クローニングを行って単クローン抗体を生産するハイブリドーマを総１６個選別した。全長（１４０残基）アルファ－シヌクレイン凝集体を抗原として用いて９Ｂ１１（それぞれ、ＩｇＧ１ ｋａｐｐａ）クローンを得て、Ｃ－末端２１個残基が切断されたアルファ－シヌクレイン凝集体を抗原として用いて３Ａ９および１１Ｆ１１（それぞれ、ＩｇＧ２ｂ ｋａｐｐａ、ＩｇＧ２ｂ ｋａｐｐａ）のクローンを得た。

抗体の精製
１０％ＦＢＳが含まれているＲＰＭＩ１６４０培地で各ハイブリドーマを培養し、抗体生産のためにｓｅｒｕｍのないＳＦＭ培地に培養培地を交替した後、４日ほど培養する。細胞培養上層液を分離して遠心分離した後、０．２２μｍフィルターでろ過した後、ＩｇＧ１タイプはｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ｃｏｌｕｍｎで、残りの抗体はｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｃｏｌｕｍｎで精製した。

可変領域配列決定
可変領域およびＣＤＲ配列は、Ａｈｎ ｅｔ ａｌ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ ２００４、１８（２）：２３７－２４１論文を参照して決定した。ハイブリドーマを培養した後、遠心分離して細胞のみを分離した。分離されたハイブリドーマにトリゾールを入れてＲＮＡを分離し、これを鋳型にしてｃＤＮＡを合成した後、塩基配列分析によって可変領域およびＣＤＲ配列を確認した。したがって、抗体３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１を得た。

実施例２．アルファ－シヌクレイン抗体を用いた抗原結合特異性および結合力分析
実施例２－１：抗－アルファ－シヌクレイン抗体を用いたドットブロット分析
本願による抗体がネイティブ状態での単量体または凝集体に結合するかを分析するために、ドットブロット実験を行った。このために、抗原として５０ｎｇあるいは１００ｎｇのアルファ－シヌクレインモノマーまたはフィブリルタンパク質（ソウル大学校のイ・スンジェ教授ｌａｂで製造する；Ｂａｅ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３２：１３４５４、２０１２）をＤｏｔ ｂｌｏｔ ａｐｐａｒａｔｕｓ（ＢｉｏＲａｄ）を用いてニトロセルロースメンブレンにスポットローディングした。２倍ずつ希釈したモノマーまたはフィブリルタンパク質は、メンブレンの右から左へ順次にローディングした（１２．５、２５、５０、１００ｎｇ）。メンブレンをＴＢＳＴ組成の５％ｎｏｎ－ｆａｔ ｄｒｙ ｍｉｌｋで１時間常温でブロッキングした後、実施例１で製造したアルファ－シヌクレイン抗体を１ｍｇ／ｍｌの濃度で１％ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ含有ＴＢＳＴに入れて、メンブレンと当該抗体を１時間常温でインキュベーションした。その次に、ＴＢＳＴで洗浄した後、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合された２次抗体および基質としてｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｓｃｅｎｃｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＮＥＮ）を製造者の方法通りに使用して信号を分析した。結果は、ＬＡＳ－３０００ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてイメージングした。結果は、図１に記載されている。

図１に示されているように、本願によるアルファ－シヌクレイン抗体は、アルファ－シヌクレインモノマーと比較して、凝集体にのみ選好的に結合することが明らかになった。特に、９Ｂ１１、３Ａ９および１１Ｆ１１は、凝集体にのみ結合することが明らかになった。２７４抗体（Ｂａｅ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１２ Ｓｅｐ ２６；３２（３９）：１３４５４－１３４６９）は、単量体および凝集体に全て結合する比較抗体である。

実施例２－２：抗－アルファ－シヌクレイン抗体を用いたＥＬＩＳＡ分析
本願による抗体の抗原に対する結合力を定量的に分析するために、ＥＬＩＳＡを行った。このために、本願によるアルファ－シヌクレイン抗体を１ｍｇ／ｍｌの濃度で９６ウェルプレートにコーティングした後、ここに１０、１００、１０００、１０，０００ｎｇ／ｍｌ濃度のアルファ－シヌクレインフィブリル凝集体を処理した後、ＰＢＳで洗浄し、その次に、ビオチンが結合された２次抗体およびＨＲＰが結合されたストレプトアビジンを処理した後、基質としてＴＭＢと反応した後に吸光度を測定し、その測定結果を図２に示した。

図２に示されているように、本願による抗体は、凝集体に高い結合力で選好的に結合することが明らかになった。ＥＬＩＳＡ結果を通じて抗体を分析してみれば、凝集体選好的に結合する抗体は０．１×１０^－９Ｍ～２×１０^－９Ｍ程度の親和力を示し、単量体および凝集体に全て結合する抗体はこれより高い～１×１０^－１０Ｍ値を示した。本発明による抗体は、アルファ－シヌクレイン凝集体に高い親和度で選好的に結合し、単一体に対しては凝集体より低いかまたは結合しないため、親和度を導出できなかった。このような結果は、パーキンソン病のようなアルファシヌクレイン病因を有する神経退行性疾患の原因物質を効果的に除去することができるか、活動を抑制することができるのを示すものである。

実施例２－３．抗－アルファ－シヌクレイン抗体を用いたＢＩＡｃｏｒｅ分析
実施例１で製造されたアルファ－シヌクレイン抗体の単量体および凝集体抗原結合に対する定量的分析をＢＩＡｃｏｒｅを使用して行った。

機器は、Ｔ２００（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓ／Ｎ：１５６５８８８）を使用した。ＣｈｉｐはＰｒｏｔｅｉｎ Ａを使用し（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．２９－１２７５－５６）、Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒは１０ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ ｐＨ１．５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．ＢＲ－１００３－５４）、Ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒとａｎａｌｙｔｅ希釈、サンプル希釈緩衝液としてはＨＢＳ－ＥＰを使用した。実施例１で製造されたα－ｓｙｎ抗体（３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１）は１Ｘ ＨＢＳ－ＥＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．ＢＲ－１００６－６９）で希釈し、α－ｓｙｎ単量体（１ｍｇ／ｍｌ）またはフィブリルタンパク質（３ｍｇ／ｍｌ）（ａｎａｌｙｔｅ）は２倍ずつ順次に希釈して、０ｎＭ含む総６個濃度（０、０．３９、１．５６、６．２５、２５、１００ｎＭ）で分析した。キャプチャの場合、単量体は標的ＲＵを８００（ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ）とし、フィブリルは標的ＲＵを１００（ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ）とし、キャプチャｐｈａｓｅをｃｏｎｔａｃｔ ｔｉｍｅを６０秒とし、ｆｌｏｗ ｒａｔｅを３０μｌ／ｍｉｎとし、ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｅｒｉｏｄを１８０秒として行った。ａｓｓｏｃａｔｉｏｎ ｐｈａｓｅではａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｔｉｍｅを１２０秒とし、ｆｌｏｗ ｒａｔｅを３０μｌ／ｍｉｎとし、ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｐｈａｓｅではｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｔｉｍｅを３６０秒とし、ｆｌｏｗ ｒａｔｅを３０μｌ／ｍｉｎとした。Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｐｈａｓｅでは、ｆｌｏｗ ｒａｔｅを３０μｌ／ｍｉｎとして、ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｔｉｍｅを２４０秒（１次）、６０秒（２次）、二回にわたって行った。１：１ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌを使用してｆｉｔｔｉｎｇし、ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅはＢＩＡＣｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅを使用した（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。結果は、図３ａおよび図３ｂに記載されている。

図３ａは、本発明の一例で製造された単クローン抗体のアルファ－シヌクレイン凝集体に対する選好的結合特異性および親和度をＢＩＡｃｏｒｅで分析した結果である。本願による抗体が高い親和度で凝集体に結合することを示す。このような結果は、パーキンソン病のようなアルファ－シヌクレイン病因を有する神経退行性疾患の原因物質を効果的に除去することができるか、活動を抑制することができるのを示すものである。図３ｂは、図３ａの結果を表で示したものである。

図３ａおよび図３ｂの結果に示したように、分析した４個のアルファ－シヌクレイン抗体のうちの前述した他の方法で凝集体に選好的に結合する抗体である、３Ａ９、９Ｂ１１、および１１Ｆ１１がＢＩＡｃｏｒｅでも凝集体にのみ結合することが明らかになり、約１～３×１０^－９Ｍの高い親和度を有することが明らかになった。

実施例２－４．抗－アルファ－シヌクレイン抗体を用いたＯｃｔｅｔ分析
実施例１で製造されたアルファ－シヌクレイン抗体（３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１）の単量体および凝集体抗原結合に対する定量的分析をＯｃｔｅｔを使用して行った。

具体的に、ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒは１Ｘ ＫＢ ｂｕｆｆｅｒ（Ｃａｔ．１８－１０９２）あるいは１Ｘ ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒを１０００ｒｐｍで使用し、ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒはｓｏｄｉｕｍａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ５（１０ｍＭ、Ｃａｔ．１８－１０６８）を使用した。α－ｓｙｎモノマーはα－ｓｙｎ抗原をｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎさせ、フィブリルの場合、テスト抗体をｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎさせた。ｔａｒｇｅｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎは、モノマーの場合、２０μｇ／ｍｌ、フィブリルの場合、０．４μｇ／ｍｌとし、ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎは、モノマーの場合５０ｎＭから、フィブリルの場合１００ｎＭから２倍ずつ順次に希釈して総７個のポイントを設定した。Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ／Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ時間は、モノマーの場合５分／２０分、フィブリルは５分／２５分であり、ＢｉｏｓｅｎｓｏｒはＡＲＧ２を、ｆｉｔｔｉｎｇは１：１ ｆｉｔｔｉｎｇを使用した。結果は、図４に記載されている。図４は、本発明の一例で製造された単クローン抗体のα－Ｓｙｎ凝集体に対する選好的結合特異性をＯｃｔｅｔで分析した結果である。

図４ａに示されているように、３Ａ９、９Ｂ１１および１１Ｆ１１の場合、単量体にはほとんど結合せず（赤い点線ボックス）、凝集体にはよく結合することが明らかになった（赤い点線ボックス内のグラフが上がる）。このような結果はＤｏｔ ｂｌｏｔ、Ｏｃｔｅｔ、ＥＬＩＳＡでの結果と類似あるいは一致する結果であって、テストした４個のα－ｓｙｎ抗体のうちの前記他の方法で凝集体に選好的に結合する抗体である、３Ａ９、９Ｂ１１および１１Ｆ１１がＯｃｔｅｔでも凝集体にのみ結合することが明らかになった。図４ｂは、図４ａの結果を表で示したものである。図４ａおよび図４ｂの結果は、アルファ－シヌクレイン凝集体に選好的に結合することを示し、図１の結果と一致するものである。比較群として使用された＃２７４抗体の場合、単量体および凝集体に全てよく結合することが明らかになった。

実施例３．抗－アルファ－シヌクレイン抗体の細胞間アルファ－シヌクレイン凝集体の伝達抑制効果分析
アルファ－シヌクレイン凝集体の細胞間伝達がアルファ－シヌクレイン凝集体関連疾患の一つの病因として提示されているため、これを抑制することができる抗体は治療剤として有用に使用できるはずである。このために、ＢｉＦＣ（ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）分析を次のように行った。ＢｉＦＣ原理は、図５の上部に図式的に示した。

図５は、本発明の一例で製造された単クローン抗体がアルファ－シヌクレインの細胞間伝播（ｃｅｌｌ ｔｏ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）を抑制するかを分析する原理（上）および実験結果を示したものである。ここで、青色は核であり、緑色は細胞外に出たアルファ－シヌクレインが他の細胞内に伝播されて他のアルファ－シヌクレインに接して凝集体を形成した時の信号である。

ＢｉＦＣ分析のための細胞培養
アルファ－シヌクレインと半分のＶｅｎｕｓ蛍光タンパク質（Ｖｅｎｕｓ １－αＳｙｎ（Ｖ１Ｓ）、αＳｙｎ－Ｖｅｎｕｓ２（ＳＶ２））をそれぞれ発現するＳＨ－ＳＹ５Ｙヒトニューロブラストーマ細胞株は、実験前まで従前に記述されたように培養された（Ｌｅｅ Ｈ－Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００４；２４：１８８８－１８９６）。実験に先立ち、Ｖ１Ｓ、ＳＶ２を発現する細胞１８０，０００個をカバースリップの上に混合して敷いた後、３日間培養した。継続的なアルファ－シヌクレインの細胞間移動を確認するために、ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅは毎４８時間ごとにｓｕｂ－ｃｕｌｔｕｒｅされた。別途の実験で、６継代（ｐａｓｓａｇｅ）程度で伝達の程度が最大であるのを確認したので（データ示していない）、本実施例で、抗体の細胞間伝達抑制効能は６継代のｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅを用いて分析した。

ＢｉＦＣ実験／抗体処理
イメージング前日、ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅに５０μｇ／ｍｌのＩｇＧまたはテスト抗体（３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１）を追加した。各ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅで現れるＶｅｎｕｓ ｃｈａｎｎｅｌでの信号はアルファ－シヌクレインの凝集による凝集体を示し、これはアルファ－シヌクレインが一つの細胞から他の細胞に移動して生成された凝集体と見なした。このような信号は、ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）で自動分析した（機器設定：ｐｕｎｃｔａ ｓｉｚｅ：０．１～０．４μｍ、ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ：４０００－７０００）。結果は、図５に開示されている。

具体的に、青色は核、緑色は一つの細胞から外に出たアルファ－シヌクレインが他の細胞内のアルファ－シヌクレインに接して凝集体を形成したのを示す。右グラフは、シグナルの強さを示したものである。９Ｂ１１、１１Ｆ１１、および３Ａ９各処理群では、陰性対照群であるＩｇＧと比較して、緑色シグナルを示す細胞の個数が減少するのが分かり、これは本願による抗体が凝集体の細胞間伝達を効果的に抑制することができるのを示すものである。本願による抗体９Ｂ１１、３Ａ９および１１Ｆ１１処理群では、陰性対照群であるＩｇＧと比較して、緑色シグナルを示す細胞の個数が顕著に減少し、これは凝集体に高い親和度で特異的に結合する本願による抗体がアルファ－シヌクレインの細胞間伝播を効果的に抑制することができるのを示すものである。

実施例４．抗－アルファ－シヌクレイン抗体のインビボでのアルファ－シヌクレイン凝集体除去効果分析
本願で製造されたアルファ－シヌクレイン抗体のインビボでの効果を分析するために、ヒトアルファ－シヌクレインを過発現する形質転換マウス（ｍＴｈｙ－１ ｈｕｍａｎ α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ、ＵＣ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）に１０ｍｇ／ｋｇの本願による抗体またはＩｇＧを３ヶ月間毎週腹腔投与した。グループ当り６匹のマウスを使用し、非形質転換マウス（ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ）を対照群として使用した。その次に、灌流を次のように行った。

最後の投与が完了した後、脳内の病理分析のために、人道的規定によって当該動物はｃｈｌｏｒａｌ ｈｙｄｒａｔｅで麻酔がかかった後、０．９％の生理食塩水で心臓灌流された。その次に、灌流された脳の半分（ｓａｇｇｉｔａｌ ｓｅｃｔｉｏｎ）は、リン酸緩衝液中の４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４、４℃）に分析時点まで保管し、他の半分は直ちに冷凍状態に保管した（－７０℃）。

病理学的分析は、次のように行われた。パラホルムアルデヒドに固定された脳半分は、Ｖｉｂｒａｔｏｍｅを用いてｆｒｅｅ－ｆｌｏａｔｉｎｇ方式で４０μｍ厚さの連続切片に切り出した。各投与群の脳内アルファ－シヌクレインの発現程度を確認するために、ｃｏｒｔｅｘ、ｓｔｒｉａｔｕｍ、ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓを含む切片をアルファ－シヌクレイン抗体（凝集体のマーカーであるｐ１２９α－ｓｙｎ抗体、ａｂｃａｍ、ａｂ５９２６４または総アルファ－シヌクレイン抗体、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃２６４２）と４℃で一晩培養した。または星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）の活性程度、ミクログリア（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）の活性程度の確認のために、前記切片をＧＦＡＰ（ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＡＢ５８０４、ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）あるいはＩｂａ１に対する抗体（０１９－１９７４１、Ｗａｋｏ）をそれぞれ処理した。また、脳内炎症（ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）の程度を確認するために、ＩＬ－６（ＮＢ６００－１１３１、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）またはＩＬ－１βに対する抗体（ａｂ９７２２、ａｂｃａｍ）をそれぞれ処理した。１次抗体との培養後に、ビオチンが結合されたｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（１：１００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびＡｖｉｄｉｎ Ｄ－ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（１：２００、ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を処理し、ＤＡＢ（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）で検出した。免疫染色された各切片は、明視野顕微鏡で観察して光学密度を測定した。結果は、図６ａおよび図６ｂに開示されている。図８ａは、本発明の一例で製造された単クローン抗体がヒトα－Ｓｙｎを過発現するマウス動物モデル（ＴＧ）でアルファ－シヌクレイン凝集体を除去することができるかを、マウスに抗体投与後、ｐ－１２９α－Ｓｙｎ抗体を用いてマウス脳組織を染色して測定した結果である。図面において、ＨＰはＨｉｐｐｏｃａｍｐｕｓであり、ｐ－１２９α－ｓｙｎは１２９番目残基がリン酸化された形態の凝集体のマーカーであり、矢印はリン酸化されたアルファ－シヌクレインを示す。

図６ａは、アルファ－シヌクレイン凝集体のマーカーであるｐ－１２９α－Ｓｙｎ抗体（Ｓｅｒ１２９番にリン酸化が起こったアルファ－シヌクレインを認識する抗体）で分析した結果であって、本願による抗体が投与されたＴＧ（ＴｒａｎｓＧｅｎｉｃ）マウスはＩｇＧのみ投与された対照群マウスと比較して、ｃｏｒｔｅｘおよびｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓのＣＡ１およびＣＡ３で凝集体に量が顕著に減ったことが明らかになった（当該部位は、ＩｇＧ試料で矢印のアローヘッドで表示される）。これは、本願による抗体がアルファ－シヌクレインを顕著に除去するすることができるのを示す結果である。ＷＴおよびＩｇＧは陰性対照群であり、抗体２７４は単量体と凝集体の両方ともに結合する比較群である。このような結果は、本願による抗体は凝集体アルファ－シヌクレインの蓄積を効果的に抑制することができ、アルファ－シヌクレイン病因に関連した疾患の予防および／または治療に効果的に使用できるのを示す。

図６ｂは図６ａと同様な実験であるが、マーカーとして、総アルファ－シヌクレイン抗体で染色した結果であり、矢印はヒトアルファ－シヌクレインを示す。ＴＧ ｍｏｕｓｅで増加したヒトアルファ－シヌクレインは抗体投与によって効果的に除去され、このような結果は、本願による抗体がアルファ－シヌクレイン凝集体を効果的に減少させ、パーキンソン疾患のようなシヌクレイン病の治療に効果的に使用できるのを示すものである。９Ｂ１１、１１Ｆ４、１１Ｆ１１抗体は、総アルファ－シヌクレインの蓄積を効果的に抑制した。総アルファ－シヌクレイン検出は、本願による抗体がアルファ－シヌクレイン自体の除去能（ｃｌｅａｒｉｎｇ）および抗体の細胞間伝達（ｃｅｌｌ ｔｏ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）抑制能があるのを示すものである。また、他の側面から、単量体の凝集体への形成の抑制、または単量体を全て除去することができると解釈できる。

実施例５．抗－アルファ－シヌクレイン抗体のＭｉｃｒｏｇｌｉｏｓｉｓおよびＡｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓ減少および炎症性サイトカイン放出減少効果分析
グリオーシス（ｇｌｉｏｓｉｓ）は、ＢＢＢの損傷、ＴＧＦ－ベータまたはインターロイキンのような物質によって触発される、中枢神経系に損傷がある場合、これに対する反応として膠細胞（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ）で起こる非特異的反応である。代表的なものとして、ＭｉｃｒｏｇｌｉｏｓｉｓおよびＡｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓを含み、それぞれＩｂａ－１およびＧＦＡＰタンパク質がマーカーとして使用される。よって、実施例４に記述されているように、本願による抗体をマウスに投与してＭｉｃｒｏｇｌｉｏｓｉｓおよびＡｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓ減少およびこれを触発する炎症性サイトカイン放出減少に及ぼす影響を分析した。分析結果は、図７ａ、図７ｂ、図７ｃおよび図７ｄに開示されている。

図７ａは、本発明の一例で製造された単クローン抗体がインビボ（ｉｎｖｉｖｏ）でｍｉｃｒｏｇｌｉｏｓｉｓを減少させることができるかを、マウスに抗体投与後、マーカーとしてＩｂａ－１（ｍｉｃｒｏｇｌｉｏｓｉｓ）抗体を用いてマウスの脳組織を染色して測定した結果である。矢印は活性化されたミクログリアを意味するものであって、３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１抗体を投与したネズミの脳でミクログリア活性化が顕著に減少しているのが分かる。

図７ｂは、本発明の一例で製造された単クローン抗体がインビボでａｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓを減少させることができるかを、マウスに抗体投与後、マーカーとしてＧＦＡＰ（ａｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓ）抗体を用いてマウスの脳組織を染色して測定した結果である。矢印は活性化されたアストロサイトを意味するものであって、３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１抗体が効果的に有意の水準にａｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓを抑制するのを確認することができた。

図７ｃは、本発明の一例で単クローン抗体がインビボで炎症性サイトカインを減少させることができるかを、マウスに抗体投与後、マーカーとしてＩＬ－１ベータ抗体を用いてマウスの脳組織を染色して測定した結果である。矢印は、ＩＬ－１ベータを発現している細胞を示す。ＩＬ－１ベータは炎症を誘発して多様な神経細胞の死滅および炎症反応を誘導するようになり、本願による抗体を投与したマウスの脳組織でＩＬ－１ベータが顕著に減少したことを示す。

図７ｄは、本発明の一例による単クローン抗体がインビボで炎症性サイトカインを減少させることができるかを、マウスに抗体投与後、マーカーとしてＩＬ－６抗体を用いてマウスの脳組織を染色して測定した結果である。矢印は、炎症性サイトカインであるＩＬ－６を発現する細胞を示す。本願による抗体を投与したマウスの脳組織でＩＬ－６が減少したことを示す。

前記図面に示されているように、本願による抗体は対照群と比較して、ＭｉｃｒｏｇｌｉｏｓｉｓおよびＡｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓを減少させ、これを触発する炎症性サイトカインＩＬ－１ｂｅｔａおよびＩＬ－６の放出を減少させることが明らかになった。

実施例６．抗－アルファ－シヌクレイン抗体のヒト脳組織でのレビー小体検出分析
１０マイクロメートルの厚さのパラフィン包埋されたパーキンソン疾患で死亡した患者の脳組織切片を実施例５に使用された本願による抗体を用いて組織切片内レビー小体とレビー神経突起（ｎｅｕｒｉｔｅ）を次のように染色した。９０％ギ酸で組織切片を３分間処理してａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｔｒｉｅｖａｌを進行させた後、１％ Ｈ２Ｏ２（５０％ ｅｔｈａｎｏｌ ｂａｓｅ）を用いて組織自体のｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ活性を抑制した。組織のｎｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇを防止するために、１０％ ｎｏｒｍａｌ ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍを処理した。その次に、リン酸緩衝液で洗浄した後、本願による３Ａ９、１１Ｆ１１および１１Ｆ１１抗体をａｄｊａｃｅｎｔ ｓｅｃｔｉｏｎに４℃で一晩処理した。リン酸緩衝液で洗浄後、ビオチンが結合されたａｎｔｉ－ヒトＩｇＧ抗体を３７℃で３０分間処理した後、ａｖｉｄｉｎ－ｂｉｏｔｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘを常温で３０分間反応させた（Ｖｅｃｔａｓｔａｔｉｎ Ｅｌｉｔｅｋｉｔ；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。その次に、０．００５％ Ｈ２Ｏ２を含むＤＡＢで発色し、当該ｓｅｃｔｉｏｎを０．５％ｃｒｅｓｙｌ ｖｉｏｌｅｔでカウンター染色して各細胞を区分した。結果は、図８ａおよび図８ｂに開示されている。

図８ａおよび図８ｂは、それぞれ本発明の一例による単クローン抗体３Ａ９および１１Ｆ１１がヒト脳組織でレビー小体（Ｌｅｗｙ ｂｏｄｙ）およびレビー神経突起（Ｌｅｗｙ ｎｅｕｒｉｔｅｓ）を特異的に認識できるかをそれぞれ測定した結果である。本願による抗体がレビー小体（矢印）およびレビー神経突起（左下の糸のような形状）に結合することを示す。

図８ａおよび８ｂに示されているように、本願による抗体はレビー小体およびレビー神経突起に効果的に結合（矢印で表示）ということが明らかになった。このような結果は、ヒト脳組織にあるレビー小体の構成成分であるアルファ－シヌクレイン凝集体に効果的に結合することができるのを意味するものである。ヒト脳に伝達された抗体が効果的にアルファ－シヌクレイン凝集体に特異的に結合できるのを示すものである。このような結果は、本願の抗体が実際のヒト脳組織に存在するアルファ－シヌクレイン凝集体と特異的に結合できるのを示すものであって、アルファ－シヌクレイン病因に関連する疾患の予防および／または治療に効果的に使用できるのを示す。

実施例７．抗－アルファ－シヌクレイン抗体のエピトープ分析
本願による３Ａ９および１１Ｆ１１抗体に対するエピトープマッピングは、ＰＥＰＳＣＡＮ（Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）にペプチドアレイ分析を依頼して行われた。結果は、図９に開示されている。図９は、本発明の一例による抗体のエピトープマッピング結果を図式的に示したものである。

図９に示されているように、本願による抗体はＣ－末端を認識することが明らかになった。本願による抗体は、大部分Ｃ－末端部位に結合することが明らかになった。Ｎ－末端を認識するアルファ－シヌクレイン抗体はアルファ－シヌクレイン関連疾患を通称するシヌクレイン病に属する多系統萎縮症のような他の疾病の凝集体は認識できないのに対し、Ｃ－末端部位を認識するアルファ－シヌクレイン抗体はパーキンソン病だけでなく、その他の多様なシヌクレイン病の凝集体も認識するという長所を有する。特に、先に説明したように、１１０～１２２の間を認識する場合、凝集体選好的な結合を示した。

実施例８．抗アルファ－シヌクレイン（キメラ）抗体の製造
クローニング
ヒト化を進行後に確保した重鎖可変領域および軽鎖可変領域の抗体ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ配列を用いて、短い断片のｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅであるｇｂｌｏｃｋ（ｍ．ｂｉｏｔｅｃｈ）を合成し、これを用いて動物細胞培養用ベクター（ｐｃＤＮＡ３．４）にクローニングした。可変領域前後に重畳したｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅを約２０ｂｐ程度含んでｇｂｌｏｃｋを合成し、ｐｃＤＮＡ３．４ｖｅｃｔｏｒの可変領域を除外した部分をＰＣＲで増幅後に準備して、Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ方法でクローニングした。

Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎおよび発現
前記製造されたベクターをｍａｘｉ－ｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ）して、多量のｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡを確保後、次のように細胞に導入した。形質注入前日、ＥｘｐｉＣＨＯ^ＴＭ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ：Ａ２９１２７）細胞をＥｘｐｉＣＨＯ^ＴＭ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ：Ａ２９１００－０１）培地に３×１０Ｅ６～４×１０Ｅ６ ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ濃度を合わせた後、８％ＣＯ２、３７℃、１２０ｒｐｍで１日間培養した。ＤＮＡ形質注入当日、７×１０Ｅ６～１０×１０Ｅ６ ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、生存率は９５％以上に育った細胞を新鮮な培地を用いて６×１０６ ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌｓ／ｍＬで希釈して準備した。

準備された母細胞への形質注入のために、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ ＣＨＯ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ：Ａ２９１２９）を使用して、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ ＣＨＯ ＆ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ複合体を準備した。冷たいＯｐｔｉＰＲＯ^ＴＭＳＦＭ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ：１２３０９０１９）培地をそれぞれ分注して、滴定濃度で準備したＤＮＡおよびＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭＣＨＯ試薬をそれぞれ接種後、ｍｉｘして常温で５分間定置し、母細胞に接種して形質注入後、培養を始めた。形質注入翌日にはＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ ＣＨＯ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔに含まれているｅｎｈａｎｃｅｒおよびｆｅｅｄを形質注入細胞に接種し、５日後にはｆｅｅｄを追加接種後、８％ ＣＯ２、３７℃、１２０ｒｐｍ条件で１０日間培養して生産を完了した。

生産が完了した培養液の収得のために遠心分離用瓶に培養液を移して４℃、６５００ｒｐｍで３０分間遠心分離後、０．２μｍの大きさのフィルターでフィルタリングを行って、浮遊物を除いた培養液を確保して、その後、精製過程を行った。

抗体の精製
ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１１－００３４－９４）を使用して培養液を精製した。平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．２、１００ｍＭ ＮａＣｌ）を使用して平衡化させた後、回収された培養液をカラムにローディングした。ローディングが完了すれば、５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ ｐＨ５．０で中間洗浄後、５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ ｐＨ３．４を用いて溶出を行った。溶出液に１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ９．０を添加してｐＨ６．０になるように中和した。その後、溶出液をＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ７．４）でバッファー交換および濃縮して、使用時まで４℃に保管した。追加精製が必要な場合、ＨｉＬｏａｄ ２６／６００ ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムに１Ｘ ＰＢＳをバッファーにして１次精製分を通過させて、溶出試料の大きさに基づいて２次精製を行った。前記精製された抗体のアミノ酸配列を質量分析方法で分析し、ｍｏｕｓｅ由来単クローン抗体の可変領域と一致するのを確認した。

前記方法で確認された３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１抗体の可変領域をヒトＩｇＧ１アイソタイプのｂａｃｋｂｏｎｅ可変領域部分に置換してキメラ形態のヒトＩｇＧ１抗体を製作した。前記得られたキメラ抗体のうち、特にＣｈ１１Ｆ１１抗体はＩｇＧ形態の抗体であって、配列番号９０の重鎖可変領域配列（ｃｈ１１Ｆ１１－ＶＨ）と配列番号１０９の軽鎖可変領域配列（ｃｈ１１Ｆ１１－ＶＬ）の組み合わせを含み、Ｃｈ ３Ａ９抗体はＩｇＧ形態の抗体であって、配列番号１０２の重鎖可変領域配列（ｃｈ１１Ｆ１１－ＶＨ）と配列番号１１６の軽鎖可変領域配列（ｃｈ１１Ｆ１１－ＶＬ）の組み合わせを含む。

実施例９：ヒト化抗体の製造
ライブラリーファージ（Ｌｉｂｒａｒｙｐｈａｇｅ）準備
キメラ抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３ ｒｅｓｉｄｕｅにｈｕｍａｎ ｆｒａｍｅｗｏｒｋを結合させながら各ＣＤＲ ｒｅｓｉｄｕｅにｍｏｕｓｅあるいはヒト由来ｓｅｑｕｅｎｃｅが導入されたｍｉｎｉライブラリーを製作した。当該ライブラリーのｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌをクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ、Ｃ０８５７）３４μｇ／ｍｌ、２％グルコース（Ｓｉｇｍａ、Ｇ５４００）および５ｍＭ ＭｇＣｌ_２（Ｓｉｇｍａ、Ｍ２３９３）が含まれている２Ｘ ＹＴ［Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（ＣＯＮＤＡ、１６１２．００）１７ｇ、イースト抽出物（ＣＯＮＤＡ、１７０２．００）１０ｇ、ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ、Ｓ７６５３）５ｇ］培地に接種後、３７℃で３時間程度培養してＯＤ６００値が０．５から０．７になるようにした後、ヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅ）を感染させた後、クロラムフェニコール３４μｇ／ｍｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、カナマイシン（Ｓｉｇｍａ、Ｋ１８７６）７０μｇ／ｍｌ、１ｍＭ ＩＰＴＧ（ＥＬＰＩＳＢＩＯ、ＩＰＴＧ０２５）を添加した２Ｘ ＹＴ培地で３０℃、１６時間培養してファージパッキングを誘導した。その次に、培養液を４５００ｒｐｍ、４℃条件で１５分間遠心分離した後、上澄み液に４％ ＰＥＧ６０００（Ｆｌｕｋａ、８１２５３）と３％ ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ、Ｓ７６５３）を添加してよく溶かした後、氷で１時間反応させた。これを再び４℃条件で８０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離した後、ペレットをＰＢＳで懸濁した後、再び４℃条件で１２０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離してライブラリーファージを含む上澄み液を得て、新しいチューブに入れて使用時まで４℃で保管した。

ファージディスプレイパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）
具体的に、免疫試験管（ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅ、ｍａｘｉｓｏｒｐ ４４４２０２）に１０μｇ／ｍｌ濃度の組換えアルファ－シヌクレイン凝集体をＰＢＳに添加して４℃で一晩試験管表面にタンパク質を吸着させた後、牛血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）３％溶液を試験管に添加して、アルファ－シヌクレイン凝集体が吸着していない表面を保護した。試験管を空けた後、ＢＳＡ ３％溶液に分散した１０^１２ＣＦＵの抗体ファージライブラリーをアルファ－シヌクレイン単量体タンパク質の吸着している免疫試験管に入れて、常温で１時間反応させた（ネガティブ選別）。アルファ－シヌクレイン単量体に非結合したファージを回収してアルファ－シヌクレイン凝集体が付着された免疫試験管に常温で２時間結合させた。その次に、非特異的に結合したファージをＰＢＳ－Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）溶液で５回～３０回洗い落とした後、残っている抗原特異的ファージ抗体を１００ｍＭトリエチルアミン溶液を用いて回収した。回収されたファージを１Ｍトリスバッファー（ｐＨ７．４）で中和させた後、ＥＲ２５３７大腸菌に３７℃で１時間感染させ、感染した大腸菌をカルベニシリンを含有する２Ｘ ＹＴ寒天培地に塗抹して３７℃で一晩培養した。翌日、培養された大腸菌を４ｍｌの２Ｘ ＹＴカルベニシリン培養液に懸濁し、１５％グリセロールを添加して、一部は－８０℃に保管し、残りは次のラウンドのパニングのためにファージを製造した。このような過程を総３ラウンド繰り返して抗原特異的な抗体を増幅させた。パニングラウンドが進行するほど、ＰＢＳ－Ｔを用いた洗浄回数を増加させて抗原特異的ファージを増幅および濃縮した。

単一クローンファージ抗体選別（ｓｉｎｇｌｅ ｃｌｏｎｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）
前記パニングによって得られたファージプール（ｐｈａｇｅ ｐｏｏｌ）からアルファ－シヌクレイン凝集体に特異的に結合する単クローン抗体を選別するために、次のような実験を行った。

濃縮されたプールから単一クローンを分離するために、ＬＢ－テトラサイクリン／カルベニシリン寒天培地に前記ファージプールを塗抹した後、培養して単一コロニーを確保した。その次に、単一クローンをウェル当り４００μｌの２Ｘ ＹＴ－テトラサイクリン／カルベニシリン培地が入った９６深いウェルプレートに接種して一晩育てた後、培養液１０μｌを新たな３９０μｌの２Ｘ ＹＴ－テトラサイクリン／カルベニシリン培地が含まれている９６深いウェルプレートに入れて、３７℃で４時間培養した。前記培養液に１ｍＭ ＩＰＴＧとなるように入れて、３０℃で一晩培養した。一晩培養した培養液を遠心分離して上澄み液を取った。

その次に、次のようにＥＬＩＳＡ方法を使用してアルファ－シヌクレイン凝集体と結合する単一クローン可溶性ｓｃＦｖを発現するクローンを選択された（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ．Ｒａｄｅｒ ａｎｄ Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩ．２０００．Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｉｎ：Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．１ｓｔｅｄ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．ＮＹ．ＵＳＡ．ｐｐ．１１．９－１１．１２）。具体的に、９６ウェルプレートに実施例１－１で選別された７Ｂ７抗体を入れ、４℃で一晩コーティングした。３％ ＢＳＡを各ウェル当り２００μＬずつ入れて３７℃で２時間ブロッキングした。その次に、アルファ－シヌクレイン凝集体と単量体を１００ｎｇ／ｗｅｌｌの濃度でそれぞれローディングした後、３７℃で２時間反応させた。その次に、ＰＢＳ－Ｔ ３００μＬで５回洗浄した。前記準備された単一クローン上澄み液は３％ ＢＳＡと１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）で混合した後、これを前記凝集体および単量体と結合させたプレートに１００μＬずつローディングした後、３７℃で２時間反応させた。その次に、ＰＢＳ－Ｔ ３００μＬで５回洗浄した後、抗－ＨＡ ＨＲＰ結合抗体を入れて３７℃で１時間反応させた後、ＰＢＳ－Ｔで５回洗浄した。ＴＭＢ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ、Ｔ０４４０）１００μＬを入れて発色した後、１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４５０μＬを入れて反応を停止した後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。吸光度が０．５以上であるクローンを結合による陽性反応と見なし、ＢＳＡ非特異的に結合するクローンは排除させた。

ライブラリーで発見されたクローンのＣＤＲ ｒｅｓｉｄｕｅは、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方式で分析を併行して、ｆｒａｍｅｗｏｒｋとの結合に深刻な問題が生じるか、ＣＤＲを除いたｆｒａｍｅｗｏｒｋ部分にＴ－ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅ、Ｂ ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅおよびＭＨＣＩＩ ｅｐｉｔｏｐｅが存在しないクローンを選別した。

その後、次のような重鎖、軽鎖の可変領域の組み合わせで形成された５個抗体に対して、１１Ｆ１１抗体の可変領域をヒトＩｇＧ１アイソタイプのｂａｃｋｂｏｎｅ可変領域部分に置換して５個のＩｇＧ１ ｂａｃｋｂｏｎｅのヒト化抗体を製作した。具体的に、Ｈｕ１１Ｆ１１＿（ＡＢＬ２－４）はＩｇＧ形態の抗体であって、配列番号９２の重鎖可変領域配列（Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ２）と配列番号１１３の軽鎖可変領域配列（Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＬ４）の組み合わせを含み、Ｈｕ１１Ｆ１１＿（ｖｅｒ．１）はＩｇＧ形態の抗体であって、配列番号９８の重鎖可変領域配列（Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ－ｖ１）と配列番号１１５の軽鎖可変領域配列（Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＬｖ３ ４ｃ）の組み合わせを含み、Ｈｕ１１Ｆ１１＿（ｖｅｒ．２）はＩｇＧ形態の抗体であって、配列番号９９の重鎖可変領域配列（Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ－ｖ２）と配列番号１１５の軽鎖可変領域配列（Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＬｖ３ ４ｃ）の組み合わせを含み、Ｈｕ１１Ｆ１１＿（ｖｅｒ．３）はＩｇＧ形態の抗体であって、配列番号１００の重鎖可変領域配列（Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ－ｖ３）と配列番号１１５の軽鎖可変領域配列（Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＬｖ３ ４ｃ）の組み合わせを含む。

Ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．４）は、配列番号１０１の重鎖可変領域配列（Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ－ｖ４）と配列番号１１５の軽鎖可変領域配列（Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＬｖ３ ４ｃ）の組み合わせである。

実施例１０．ヒト化抗体の食細胞促進能分析試験
実施例８で得られたキメラ抗体および実施例９で得られたヒト化抗体であるｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．１）、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．３）、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．４）およびＡＢＬ２－４がミクログリアによる細胞外アルファ－シヌクレイン凝集体の食細胞作用を促進する効能を評価するために食細胞促進能分析試験を次のように行った。

具体的に、マウスミクログリア株であるＢＶ－２をＲＰＭＩ１６４０と１０％ＦＢＳで培養して２Ｘ１０ ６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で準備した後、Ｕ－ｂｏｔｔｏｍ９６ウェルプレートに１００ｕｌずつ分注した。別途の容器にアルファ－シヌクレイン凝集体と実施例８および実施例９で製作されたキメラ１１Ｆ１１あるいはＨｕ１１Ｆ１１＿１１Ｆ１１（ｖｅｒ．１）あるいはＨｕ１１Ｆ１１＿１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）あるいはＨｕ１１Ｆ１１＿１１Ｆ１１（ｖｅｒ．３）あるいはＨｕ１１Ｆ１１＿１１Ｆ１１（ｖｅｒ．４）あるいはＨｕ１１Ｆ１１＿ＡＢＬ２－４抗体を常温で２０分間反応させた後、当該ｍｉｘｔｕｒｅを９６ウェルプレートのＢＶ－２に添加後、１５分間反応した。１，２００ｒｐｍで５分間ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅして、結合していないアルファ－シヌクレイン凝集体と抗体を除去した後、４％ ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅで細胞を固定させ、３回ＰＢＳ ｗａｓｈ以後、０．５％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で細胞をｐｅｒｍｅａｂｌｉｚｅする。シヌクレインを認知する抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を１時間ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎした後、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０が含まれているＰＢＳで３回ｗａｓｈ後、ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ－Ａｌｅｘａ－４８８抗体を１時間ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎし、ｗａｓｈ後、ＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｅｒで分析した。実験結果を図１２ａおよび図１２ｂに示し、これは本発明の一例によるキメラ抗体およびヒト化抗体のミクログリアのアルファ－シヌクレイン凝集体に対する食細胞作用促進能分析結果を示したものである。図１０ａはヒト化１１Ｆ１１抗体に関するものであり、図１０ｂはヒト化３Ａ９に関するものである。

図１０ａおよび図１０ｂに示したように、ＩｇＧ対照群と比較して、本願に記載されたキメラ抗体は約２倍、ヒト化抗体はＢＶ－２によるアルファ－シヌクレイン凝集体のｕｐｔａｋｅを４倍まで増加させた。この中、１１Ｆ１１のヒト化抗体ｖａｒｉａｎｔ、即ち、Ｈｕ１１Ｆ１１＿ＡＢＬ２－４（Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ２とＨｕ１１Ｆ１１－ＶＬ４の組み合わせ）、Ｈｕ１１Ｆ１１＿ｖｅｒ．１（Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ－ｖ１とＨｕ１１Ｆ１１－ＶＬｖ３ ４ｃの組み合わせ）、Ｈｕ１１Ｆ１１＿（ｖｅｒ．２）（Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ－ｖ２とＨｕ１１Ｆ１１－ＶＬｖ３ ４ｃの組み合わせ）は、キメラ１１Ｆ１１抗体と比較して、ＢＶ－２の食細胞促進能力が卓越した。Ｈｕ１１Ｆ１１＿ｖｅｒ．３）（Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ－ｖ３とＨｕ１１Ｆ１１－ＶＬｖ３ ４ｃの組み合わせ）、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．４）（Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ－ｖ４とＨｕ１１Ｆ１１－ＶＬｖ３ ４ｃ）はキメラ１１Ｆ１１抗体と類似の食細胞促進能を示した。

実施例１１：Ｆｉｂｒｉｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ
アルファ－シヌクレイン凝集体が細胞間伝播を通じてとなりの神経細胞に伝染する現象の前哨段階である神経細胞結合を抑制する抗体の効能を分析するためにｆｉｂｒｉｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙを行った。
具体的に、神経細胞株であるＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞にアルファ－シヌクレイン凝集体を１ｕＭ、キメラ１１Ｆ１１抗体、ヒト化１１Ｆ１１ ｖａｒｉａｎｔ、即ち、Ｈｕ１１Ｆ１１＿ｖｅｒ１、Ｈｕ１１Ｆ１１＿ｖｅｒ２、Ｈｕ１１Ｆ１１＿ｖｅｒ３、Ｈｕ１１Ｆ１１＿ｖｅｒ４、Ｈｕ１１Ｆ１１＿ＡＢＬ２－４を各２０ｎＭで１０分間処理した後、細胞を４％ ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅで固定した。Ｗａｓｈ以後、ｎｏｎ－ｐｅｒｍｅａｂｌｅ条件で全ての形態のアルファ－シヌクレインを認知するアルファ－シヌクレイン抗体（ＢＤ）を１：２５０で処理した後にｗａｓｈし、ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅでイメージングした。イメージング直前にＤＡＰＩを処理して細胞核を示した。
その結果、本願の抗体は、ＩｇＧ対照群と比較して、アルファ－シヌクレイン凝集体の細胞膜結合程度を効果的に減少させ、特に１１Ｆ１１のヒト化抗体は、１１Ｆ１１キメラ抗体と比較して、類似するか、さらに効率的に結合程度を減少させた。図１１は、本発明の一例によるキメラ抗体およびヒト化抗体がアルファ－シヌクレイン凝集体の神経細胞表面への結合を阻害する能力に関する分析結果である。
図１１に示したように、本願の抗体は、ＩｇＧ対照群と比較して、アルファ－シヌクレイン凝集体の細胞膜結合程度を最大２３倍まで効果的に減少させ、特に１１Ｆ１１のヒト化抗体は、１１Ｆ１１キメラ抗体と比較して、類似するか、さらに効率的に結合程度を減少させた。ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．１）（Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ－ｖ１とＨｕ１１Ｆ１１－ＶＬｖ３ ４ｃの組み合わせ）、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．３）（Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ－ｖ３とＨｕ１１Ｆ１１－ＶＬｖ３ ４ｃの組み合わせ）、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．４）（Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ－ｖ４とＨｕ１１Ｆ１１－ＶＬｖ３ ４ｃの組み合わせ）は、キメラ１１Ｆ１１抗体と比較して、優れた効能を示し、ＡＢＬ２－４（Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ２とＨｕ１１Ｆ１１－ＶＬ４の組み合わせ）、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）（Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ－ｖ２とＨｕ１１Ｆ１１－ＶＬｖ３ ４ｃの組み合わせ）はキメラ１１Ｆ１１抗体と類似の減少能を示した。

実施例１２：Ｄｕａｌ ｃｈａｍｂｅｒ ａｓｓａｙ
本発明によるヒト化抗体がアルファ－シヌクレイン凝集体の細胞間伝播を抑制する効能をより直接的に分析するために、ｄｕａｌ ｃｈａｍｂｅｒ ａｓｓａｙを行った。ｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｍｅｍｂｒａｎｅがあるｉｎｓｅｒｔにアルファ－シヌクレインを過発現するＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞（ｄｏｎｏｒ ｃｅｌｌ）を、正常ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ ｃｅｌｌ）を１２ウェルプレート内のｃｏｖｅｒｓｌｉｐの上にそれぞれｐｌａｔｉｎｇした後、アルファ－シヌクレイン過発現細胞株が培養されたｉｎｓｅｒｔを上に置いて重ねて一晩培養した。同時に、ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ細胞側に本願の抗体を２０ｎＭ処理した。その後、４％ ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅでｒｅｃｉｐｉｅｎｔ細胞を固定してｗａｓｈした後、０．５％ ＴｒｔｏｎＸ－１００を処理してｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎを形成した。Ｗａｓｈ後、実施例１４と同一なｄｅｔｅｃｔｉｏｎ抗体およびＤＡＰＩを処理し、ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅでイメージングした。
前記分析されたイメージは図１２に示した。

その結果、本発明によるヒト化抗体は、ＩｇＧ対照群と比較して、アルファ－シヌクレイン凝集体のｒｅｃｉｐｉｅｎｔ細胞への伝播程度を効果的に減少させ、特に１１Ｆ１１のヒト化抗体は、１１Ｆ１１キメラ抗体と比較して、類似するか、さらに効率的にアルファ－シヌクレイン凝集体のｒｅｃｉｐｉｅｎｔ細胞への伝播を減少させた。
図１２は、本発明の一例によるキメラ抗体およびヒト化抗体がアルファ－シヌクレインを過発現する神経細胞から分泌されて、正常神経細胞にアルファ－シヌクレイン凝集体が移動する細胞間伝播を抑制する効能分析結果である。ｔｏｐ ｃｈａｍｂｅｒにｐｌａｔｉｎｇされたアルファ－シヌクレイン過発現ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞株はアルファ－シヌクレインを細胞外に分泌し、これは下の１２ウェルプレートにｐｌａｔｉｎｇされた正常ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞株に伝達される。本願の抗体は、ＩｇＧ対照群と比較して、下のプレートの正常ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞株内に流入されるアルファ－シヌクレインの量を顕著に減少させた。特に、本願のヒト化抗体のうちの１１Ｆ１１クローンのヒト化抗体は、キメラ抗体と比較して、下のプレートのｒｅｃｉｐｉｅｎｔ細胞内にアルファ－シヌクレイン流入の減少程度をさらに増加させることが確認された。より具体的に、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）（Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ－ｖ２とＨｕ１１Ｆ１１－ＶＬｖ３ ４ｃの組み合わせ）、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．４）（Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ－ｖ４とＨｕ１１Ｆ１１－ＶＬｖ３ ４ｃの組み合わせ）はキメラ抗体と比較して優れた抑制能を、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．１）（Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ－ｖ１とＨｕ１１Ｆ１１－ＶＬｖ３ ４ｃの組み合わせ）、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．３）（Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ－ｖ３とＨｕ１１Ｆ１１－ＶＬｖ３ ４ｃの組み合わせ）はキメラ抗体と類似の抑制能を示した。

ＩｇＧ対照群と比較して、アルファ－シヌクレイン凝集体の伝播程度を約２２倍まで効果的に減少させ、特に１１Ｆ１１のヒト化抗体は、１１Ｆ１１キメラ抗体と比較して、類似するか、さらに効率的にアルファ－シヌクレイン凝集体のｒｅｃｉｐｉｅｎｔ細胞への伝播を減少させた。

実施例１３．ヒト化抗体のＥＬＩＳＡ分析試験
前記実施例２－２と実質的に同様な方法で、実施例８で得られたキメラ抗体および実施例９で得られたヒト化抗体の結合力を定量的に分析するためにｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡを行った。

具体的に、それぞれ抗体を０．０４～４００ｎＭの濃度で１／１０ずつ希釈して９６ウェルプレートにコーティングした後、ここに２０００ｎｇ／ｍｌの凝集体を各ウェルに処理した。１ＸＰＢＳで洗浄後、その次にビオチンが結合されたｃａｐｔｕｒｅ抗体およびＨＲＰが結合されたストレプトアビジンを処理した後、基質としてＴＭＢと反応させた後、その吸光度を測定した。結果は、図１３に記載されている。

図１３に示したように、本発明によるヒト化された抗体、特にキメラ１１Ｆ１１に由来したヒト化抗体（ヒト化１１Ｆ１１抗体）は、キメラ１１Ｆ１１クローンと同等な結合力を示すことが確認された。ヒト化抗体、特に１１Ｆ１１由来ｖａｒｉａｎｔである、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．１）、即ち、Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ－ｖ１とＨｕ１１Ｆ１１－ＶＬｖ３ ４ｃの組み合わせ、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）、即ち、Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ－ｖ２とＨｕ１１Ｆ１１－ＶＬｖ３ ４ｃの組み合わせ、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．３）、即ち、Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ－ｖ３とＨｕ１１Ｆ１１－ＶＬｖ３ ４ｃの組み合わせ、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．４）、即ち、Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ－ｖ４とＨｕ１１Ｆ１１－ＶＬｖ３ ４ｃはキメラ１１Ｆ１１クローンと類似の結合力を示すことが確認され、そのＥＣ_５０は１１．５～１５．１ｎＭであって、キメラ１１Ｆ１１抗体のＥＣ_５０である１２．５ｎＭと類似の値を示した。

実施例１４：抗アルファ－シヌクレイン抗体を用いたＢＩＡｃｏｒｅ分析
前記実施例２－３と実質的に同様な方法で、実施例８で得られたキメラ抗体および実施例９で得られたヒト化抗体の結合力をＢＩＡｃｏｒｅを使用して定量的に分析した。前記分析結果を図１４と下記表に示す。

その結果、本願に記載されたヒト化抗体、特に１１Ｆ１１のｖａｒｉａｎｔ、即ち、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）（Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ－ｖ２とＨｕ１１Ｆ１１－ＶＬｖ３ ４ｃの組み合わせ）、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．３）（Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ－ｖ３とＨｕ１１Ｆ１１－ＶＬｖ３ ４ｃの組み合わせ）、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．４）（Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ－ｖ４とＨｕ１１Ｆ１１－ＶＬｖ３ ４ｃ）はキメラ１１Ｆ１１クローンと類似なＫＤ値を示すことが確認され、その結合程度としてはヒト化クローンが０．０２～０．０６×１０^－９ＭのＫＤ、キメラ１１Ｆ１１クローンが０．０２×１０^－９Ｍの低いＫＤ値、即ち、凝集体に対する高い結合力を示した。

実施例１５．ヒト化抗体の生産性評価
１１Ｆ１１キメラ抗体および１１Ｆ１１のヒト化抗体ｖａｒｉａｎｔ４種（Ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．１）、Ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）、Ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．３）、Ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．４））を実施例８に記載された通りｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎおよび培養、１次および２次精製まで完了後、最終的に精製された試料の抗体量および純度を分析した。

抗体量はＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ^ＴＭＮａｎｏＤｒｏｐ^ＴＭ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて測定し、まず、１ＸＰＢＳをｌｏａｄｉｎｇして零点を確定した後、一定量の精製試料をｌｏａｄｉｎｇし、タンパク質の定量に使用される２８０ｎｍのＵＶ波長で試料を測定した。ＮａｎｏＤｒｏｐ^ＴＭで確認された試料の濃度を試料の総体積とかけて総収得量を求めると同時に、総収得量を総体積で割って生産性（ｙｉｅｌｄ（ｇ／Ｌ））を導出した。最終精製産物の純度はＨＬＣ－００１（Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ ｓｅｒｉｅｓ）ＨＰＬＣで分析し、ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬで１Ｘ ＰＢＳ、２００ｍＭ Ａｒｇｉｎｉｎｅ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）のｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅを使用してそのｍａｉｎ ｐｅａｋの比率を定量した。前記生産性分析結果を下記表に示した。

その結果、キメラ１１Ｆ１１抗体および１１Ｆ１１のヒト化ｖａｒｉａｎｔであるｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．１）、即ち、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．１）（Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ－ｖ１とＨｕ１１Ｆ１１－ＶＬｖ３ ４ｃの組み合わせ）、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）（Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ－ｖ２とＨｕ１１Ｆ１１－ＶＬｖ３ ４ｃの組み合わせ）、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．３）（Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ－ｖ３とＨｕ１１Ｆ１１－ＶＬｖ３ ４ｃの組み合わせ）、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．４）（Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ－ｖ４とＨｕ１１Ｆ１１－ＶＬｖ３ ４ｃ）の生産性は、０．０６８～０．４２３ｇ／Ｌであって、ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎで生産される通常の抗体生産収率より優れた。特に、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）、即ち、Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ－ｖ２とＨｕ１１Ｆ１１－ＶＬｖ３ ４ｃの組み合わせは、０．４２３ｇ／Ｌの生産性を示すことによりキメラ１１Ｆ１１抗体の０．２８２ｇ／Ｌより高い生産性を示した。

実施例１６．キメラ抗体のアルファ－シヌクレイン特異的結合評価
キメラ抗体３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１の３種を実施例８によって生産後、当該抗体のアルファ－シヌクレインの結合特異性をそのホモログであるベータ－、ガンマ－シヌクレインとのＥＬＩＳＡと比較した。

このために、ヒトベータ－シヌクレイン（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ１６１４３）タンパク質（ＣＵＳＡＢＩＯ、Ｃａｔ：ＣＳＢ－ＥＰ６２４０９０ＨＵ）、あるいはヒトガンマ－シヌクレイン（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｏ７６０７０）タンパク質（ＣＵＳＡＢＩＯ、Ｃａｔ：ＣＳＢ－ＥＰ０２１９１５ＨＵ）をそれぞれ１００ｎｇ／ｍｌの濃度で９６ウェルプレートにコーティングした後、ｗａｓｈした後に５％ ＢＳＡで２時間ｂｌｏｃｋｉｎｇした。この時、アルファ、ベータ、ガンマ－シヌクレインに全て結合するｐａｎ－Ｓｙｎ抗体（ｓａｎｔａｃｒｕｚ、Ｃａｔ：ＦＬ－１４０、ｓｃ－１０７１７、ｒａｂｂｉｔ）を陽性対照群として使用した。Ｗａｓｈ後、ここに４００ｎＭから０．０４ｎＭまで１／１０ずつ希釈されたキメラ抗体（３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１）を２時間処理した後、ＰＢＳで洗浄し、その次に、ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｈＦｃ抗体にＨＲＰが結合されたｄｅｔｅｃｔｉｏｎ抗体を処理した後、基質としてＴＭＢと反応した後、４５０ｎｍ、６５０ｎｍで吸光度を測定し、陽性対照群の場合、ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ抗体としてｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ抗体にＨＲＰが結合された抗体を使用した。

実験結果を図１５ａおよび図１５ｂに示し、これは本発明の一例によるキメラ抗体（３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１）のヒトベータ－シヌクレインおよびヒトガンマ－シヌクレインに対する非常に低い結合力をＥＬＩＳＡで分析した結果を示したものである。これとは反対に、陽性対照群であるｐａｎ－Ｓｙｎ抗体は、ベータ－およびガンマ－シヌクレインに対して高い結合力を示した。図１５ａは、ヒトベータ－シヌクレインに関するものであり、図１５ｂはヒトガンマ－シヌクレインに関するものである。

また、前記三つの抗体をアミロイドベータ_１－４２（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０５０６７；ＣＡＳ ｎｕｍｂｅｒ：１０７７６１－４２－２）およびタウ（Ｕｎｉｐｏｒｔ：Ｐ１０６３６－８）タンパク質から形成された凝集体とドットブロットで反応させて、当該抗体のアルファ－シヌクレイン凝集体に対する特異的結合力を分析した。その理由は次の通りである。アミロイドベータ_１－４２およびタウは凝集体を形成して退行性神経疾患、特にアルツハイマー病の重要な病因と思われ、当該凝集体はアルファ－シヌクレインの凝集体と同様にオリゴマー、プロトフィブリル、フィブリルなどの構造を有すると知られている。したがって、当該ドットブロットは、キメラ抗体３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１がアルファ－シヌクレインの特異的なシークエンスを認識し、アルファ－シヌクレイン、アミロイドベータ、タウ由来凝集体が凝集体として有する共通的な構造を認識しないことを確認するためのものである。

本実施例のドットブロット方法は前記実施例２－３と実質的に同様な方法で行われ、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔアミロイドベータ_１－４２およびタウタンパク質およびこれに対する凝集体はソウル大学校のイ・スンジェ教授ｌａｂで製造された。Ｓｙｎ－１、６Ｅ１０、Ｔａｕ５は、それぞれアルファ－シヌクレイン、アミロイドベータ_１－４２、タウタンパク質に結合すると知られた抗体である。分析結果は、図１５ｃに記載された。

実験結果を図１５ｃに示し、これは、本願のキメラ抗体である３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１がアルファ－シヌクレイン由来凝集体にのみ特異的に結合し、アミロイドベータ_１－４２およびタウ由来凝集体には結合しないのを示した結果である。これとは異なり、アミロイドベータ_１－４２およびタウにそれぞれ結合すると知られた６Ｅ１０およびＴａｕ５抗体は、ドットブロット上で当該凝集体に結合するのを示した。

前記の結果により、当該キメラ抗体がアルファ－シヌクレインのホモログおよび異なるタンパク質由来凝集体に結合しないのは、当該抗体がターゲットタンパク質にのみ効率的に結合してホモログおよび異なるタンパク質由来凝集体に結合する抗体あるいは薬物と比較してその効能が優れるのを示唆する。

Claims (19)

1. α－Ｓｙｎの凝集体に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
   配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ－ＣＤＲ１）、
   配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ－ＣＤＲ２）、
   配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ－ＣＤＲ３）、
   配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ－ＣＤＲ１）、
   配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ－ＣＤＲ２）、および
   配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ－ＣＤＲ３）
   を含む、抗体またはその抗原結合断片。
2. 重鎖可変領域は、
   配列番号１６～１７および配列番号３５～４０のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ－ＣＤＲ１のＮ－末端に位置する重鎖可変領域フレームワーク１（Ｈ－ＦＲ１）、
   配列番号１８～１９および配列番号４１～４４のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ－ＣＤＲ１とＨ－ＣＤＲ２の間に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ－ＦＲ２）、
   配列番号２０～３１および配列番号４５～５０のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｈ－ＣＤＲ２とＨ－ＣＤＲ３の間に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ－ＦＲ３）、
   および
   配列番号３２～３４および配列番号５１～５２のアミノ酸配列のうちの一つを含むＨ－ＣＤＲ３のＣ末端に位置する重鎖可変領域フレームワーク（Ｈ－ＦＲ４）を含むものである、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
3. 軽鎖可変領域は、
   配列番号５３～５８および配列番号７１～７７のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｌ－ＣＤＲ１のＮ－末端に位置する軽鎖可変領域フレームワーク１（Ｌ－ＦＲ１）、
   配列番号５９～６１および配列番号７８～８１のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｌ－ＣＤＲ１とＬ－ＣＤＲ２の間に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ－ＦＲ２）、
   配列番号６２～６７および配列番号８２～８８のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｌ－ＣＤＲ２とＬ－ＣＤＲ３の間に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ－ＦＲ３）、
   および
   配列番号６８～７０および配列番号８９のアミノ酸配列のうちの一つを含む、Ｌ－ＣＤＲ３のＣ末端に位置する軽鎖可変領域フレームワーク（Ｌ－ＦＲ４）
   を含むものである、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
4. 重鎖可変領域は、
   配列番号９０～９４、及び配列番号９８～１０１から選択されるアミノ酸配列；
   配列番号９０～９４、及び配列番号９８～１０１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の同一性を有する配列；または
   配列番号９０～９４、及び配列番号９８～１０１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有する配列
   を含むものである、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
5. 軽鎖可変領域は、
   配列番号１０９～１１５から選択されるアミノ酸配列；
   配列番号１０９～１１５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の同一性を有する配列；または
   配列番号１０９～１１５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有する配列を含むものである、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
6. 前記抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１２７の重鎖領域と配列番号１２８の軽鎖領域を含み、配列番号１２９の重鎖領域と配列番号１３０の軽鎖領域を含み、配列番号１３１の重鎖領域と配列番号１３２の軽鎖領域を含み、配列番号１３３の重鎖領域と配列番号１３４の軽鎖領域を含み、または配列番号１３５の重鎖領域と配列番号１３６の軽鎖領域を含むものである、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
7. 前記抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ｄｉａｂｏｄｙまたはｓｃＦＶである、請求項１に記載のα－Ｓｙｎの凝集体に結合する分離された抗体またはその抗原結合断片。
8. 前記抗体またはその抗原結合断片は、α－Ｓｙｎ凝集体の細胞間伝達を抑制する；α－Ｓｙｎ凝集体を分解する；またはα－Ｓｙｎ凝集体の形成を抑制する、請求項１～７のうちのいずれか一項に記載のα－Ｓｙｎの凝集体に結合する分離された抗体またはその抗原結合断片。
9. 請求項１～７のうちのいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコーディングする分離されたポリヌクレオチド。
10. 請求項１～７のうちのいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、組成物。
11. 前記組成物は、薬学的に許容可能な担体または賦形剤を追加的に含むα－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙの治療用である、請求項１０に記載の組成物。
12. 前記α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙは、パーキンソン疾患（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、ＰＤ）、パーキンソン疾患性認知症（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓｄｉｓｅａｓｅ ｄｅｍｅｎｔｉａ、ＰＤＤ）、レビー小体認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａｗｉｔｈ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｉｅｓ、ＤＬＢ）、アルツハイマーレビー小体疾患（Ｌｅｗｙ ｂｏｄｙ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ（ＬＢＶ））、複合性アルツハイマーおよびパーキンソン病（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ａｎｄ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ）、または多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｔｒｏｐｈｙ、ＭＳＡ）を含むものである、請求項１１に記載の組成物。
13. 請求項１～７のうちのいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を提供すること；および
    前記抗体またはその抗原結合断片を、α－Ｓｙｎ凝集体の検出が必要な生物学的試料と接触させることを含む、
    生物学的試料でのインビトロα－Ｓｙｎ凝集体検出方法。
14. 対象においてα－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙを診断することを補助するための方法であって、
    インビトロで、前記対象におけるα－Ｓｙｎ凝集体の濃度および／または細胞間位置を、請求項１～７のうちのいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を用いて測定すること；および
    前記対象において測定された前記α－Ｓｙｎ凝集体の濃度および／または細胞間位置を、対照群試料の結果と比較することを含み、
    前記対照群の結果との類似または差は、前記対象がα－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙに罹患したことを示すものである、方法。
15. 前記α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙは、パーキンソン疾患（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、ＰＤ）、パーキンソン疾患性認知症（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓｄｉｓｅａｓｅ ｄｅｍｅｎｔｉａ、ＰＤＤ）、レビー小体認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａｗｉｔｈ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｉｅｓ、ＤＬＢ）、アルツハイマーレビー小体疾患（Ｌｅｗｙ ｂｏｄｙ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ（ＬＢＶ））、複合性アルツハイマーおよびパーキンソン病（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ａｎｄ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ）、または多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｔｒｏｐｈｙ、ＭＳＡ）を含むものである、請求項１４に記載の方法。
16. 請求項１～７のうちのいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片またはこれを含む組成物を含む、対象におけるα－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙの治療のための医薬であって、前記抗体もしくはその抗原結合断片またはこれを含む組成物は、前記対象の脳で、α－Ｓｙｎ凝集体の細胞間伝達を抑制する；α－Ｓｙｎ凝集体を分解する；またはα－Ｓｙｎ凝集体の形成を抑制する、医薬。
17. 前記α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙは、パーキンソン疾患（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、ＰＤ）、パーキンソン疾患性認知症（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓｄｉｓｅａｓｅ ｄｅｍｅｎｔｉａ、ＰＤＤ）、レビー小体認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａｗｉｔｈ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｉｅｓ、ＤＬＢ）、アルツハイマーレビー小体疾患（Ｌｅｗｙ ｂｏｄｙ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ（ＬＢＶ））、複合性アルツハイマーおよびパーキンソン病（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ａｎｄ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ）、または多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｔｒｏｐｈｙ、ＭＳＡ）を含むものである、請求項１６に記載の医薬。
18. 請求項１～７のうちのいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片またはこれを含む組成物を含む、脳細胞でのα－Ｓｙｎ凝集体濃度調節のための医薬であって、前記抗体もしくはその抗原結合断片またはこれを含む組成物は、対象の脳で、α－Ｓｙｎ凝集体の細胞間伝達を抑制する；α－Ｓｙｎ凝集体を分解する；またはα－Ｓｙｎ凝集体の形成を抑制する、医薬。
19. 請求項１～７のうちのいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、対象においてα－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙを診断するためのキットであって、
    前記対象において、α－Ｓｙｎ凝集体の濃度および／または細胞間位置が、前記抗体またはその抗原結合断片で測定され；および
    前記対象で測定された前記α－Ｓｙｎ凝集体の濃度および／または細胞間位置は、対照群試料の結果と比較され、前記対照群の結果との類似または差は、前記対象がα－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙに罹患したことを示すものである、キット。
    

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