BR112021003559A2 - anticorpo biespecífico, molécula de ácido nucleico isolada, vetor, célula hospedeira, método para preparar o anticorpo biespecífico, conjugado, kit, uso do anticorpo biespecífico e composição farmacêutica - Google Patents

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Peng Zhang
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Abstract

ANTICORPO BIESPECÍFICO, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADA, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA PREPARAR O ANTICORPO BIESPECÍFICO, CONJUGADO, KIT, USO DO ANTICORPO BIESPECÍFICO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA. A presente invenção refere-se ao campo do tratamento de tumor e imunologia molecular e, especificamente, a um anticorpo bifuncional anti-VEGFA/PD-1, uma composição farmacêutica do mesmo e uso desses. Especificamente, o anticorpo bifuncional anti-VEGFA/PD-1 compreende uma primeira região funcional de proteína dirigida ao VGEFA e uma segunda região funcional de proteína dirigida ao PD-1. O anticorpo bifuncional da presente invenção pode especificamente se ligar ao VEGFA e PD-1, e inibir a angiogênese induzida pelo tumor, tendo assim, boa perspectiva de aplicação.

Description

“ANTICORPO BIESPECÍFICO, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADA, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA PREPARAR O ANTICORPO BIESPECÍFICO, CONJUGADO, KIT, USO DO ANTICORPO BIESPECÍFICO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA” Campo da invenção
[0001] A presente invenção se refere aos campos de tratamento de tumor e imunobiologia, particularmente a um anticorpo bifuncional anti-PD-1/VEGFA, uma composição farmacêutica do mesmo e seu uso. Especificamente, a presente invenção se refere a um anticorpo bifuncional anti-PD-1 humano/VEGFA humano, uma composição farmacêutica do mesmo e seu uso. Descrição relacionada ao estado da técnica
[0002] O tumor, especialmente um tumor maligno, é uma doença grave que ameaça a saúde no mundo de hoje e é a segunda principal causa de morte entre várias doenças. Nos últimos anos, a incidência da doença vem aumentando notavelmente. O tumor maligno é caracterizado por má resposta ao tratamento, alta taxa de metástase tardia e por mau prognóstico. Embora os métodos convencionais de tratamento (como radioterapia, quimioterapia e tratamento cirúrgico) adotados clinicamente atualmente aliviem em grande medida a dor e prolonguem o tempo de sobrevida, os métodos apresentam grandes limitações e é difícil melhorar ainda mais sua eficácia.
[0003] Existem dois estágios distintos de crescimento do tumor, ou seja, desde um estágio de crescimento lento sem vasos sanguíneos até um estágio de proliferação rápida com vasos sanguíneos. A angiogênese permite que o tumor adquira nutrição suficiente para completar o estágio de troca de vasos sanguíneos e, se não houver angiogênese, o tumor primário não terá mais de 1-2 mm e, portanto, a metástase não pode ser realizada.
[0004] O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) é um fator de crescimento que pode promover a divisão e proliferação de células endoteliais, promover a formação de novos vasos sanguíneos e melhorar a permeabilidade dos vasos sanguíneos, e se liga aos receptores do fator de crescimento endotelial vascular na superfície celular e desempenha um papel ativando as vias de transdução do sinal da tirosina quinase. Em tecidos tumorais, células tumorais e macrófagos e mastócitos invadindo tumores podem secretar VEGF de alto nível, estimular células endoteliais vasculares tumorais em uma forma parácrina, promover proliferação e migração de células endoteliais, induzir angiogênese, promover crescimento contínuo de tumor, melhorar permeabilidade vascular, causa deposição de fibrina nos tecidos circundantes e promove a infiltração de células mononucleares, fibroblastos e células endoteliais, o que facilita a formação de estroma tumoral e entrada de células tumorais em novos vasos sanguíneos, e promove metástase tumoral. Portanto, a inibição da angiogênese tumoral é considerada um dos métodos de tratamento tumoral mais promissores atualmente. A família VEGF inclui: VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD e PIGF. Receptores de fator de crescimento endotelial vascular (VEGFRs) incluem VEGFR1 (também conhecido como Flt1), VEGFR2 (também conhecido como KDR ou Flk1), VEGFR3 (também conhecido como Flt4) e Neuropilina-1 (NRP-1). Os três primeiros receptores são semelhantes em estrutura, pertencem a uma superfamília de tirosina quinase e são compostos por uma região extra-
membrana, um segmento transmembrana e uma região intra- membrana, onde a região extra-membrana é composta por um domínio semelhante a imunoglobulina, e a região intra- membrana é uma região de tirosina quinase. O VEGFR1 e o VEGFR2 estão localizados principalmente na superfície das células endoteliais vasculares, e o VEGFR3 está localizado principalmente na superfície das células endoteliais linfáticas.
[0005] Moléculas da família VEGF possuem afinidades diferentes para esses receptores. O VEGFA atua principalmente em combinação com VEGFR1, VEGFR2 e NRP-1. VEGFR1 é o primeiro receptor encontrado e tem uma afinidade mais alta para VEGFA do que VEGFR2 em condições fisiológicas normais, mas tem uma atividade de tirosinase mais baixa no segmento intracelular do que VEGFR2 (Ma Li, J. Journal of Birth Health and Heredity, 24 (5):146-148 (2016)).
[0006] O VEGFR2 é o regulador primário da angiogênese e engenharia vascular e tem uma atividade de tirosina quinase muito maior do que o VEGFR1. O VEGFR2, após a ligação ao ligante VEGFA, medeia a proliferação, diferenciação e similares de células endoteliais vasculares, bem como o processo de formação de vasos sanguíneos e a permeabilidade dos vasos sanguíneos (Roskoski R Jr. et al., Crit Rev Oncol Hematol, 62 (3): 179-213 (2007)). O VEGFA, após a ligação ao VEGFR2, medeia a expressão transcricional de genes de proteínas intracelulares relacionadas através da via de sinalização PLC-γ-PKC-Raf-MEK-MAPK a jusante e, portanto, promove a proliferação de células endoteliais vasculares (Takahashi T et al., Oncogene, 18 (13): 2221-2230 (1999)).
[0007] VEGFR3 é um dos membros da família da tirosina quinase e expressa principalmente células endoteliais vasculares embrionárias e células endoteliais linfáticas adultas, e VEGFC e VEGFD se ligam a VEGFR3 para estimular a proliferação e migração de células endoteliais linfáticas e promover a neogênese dos vasos linfáticos; NRP-1 é uma proteína de transmembrana não-tirosina quinase e que é incapaz de traduzir os sinais biológicos independentemente, e é capaz de mediar a sinalização somente após formar um complexo com um receptor de tirosina quinase VEGF. (Ma Li, Chinese Journal of Birth Health and Heredity, 24 (5):146-148 (2016)).
[0008] VEGFA e VEGFR2 estão envolvidos principalmente na regulação da angiogênese, onde antes e depois da ligação de VEGFA a VEGFR2, uma reação em cascata de vários sinais intermediários nas vias a montante e a jusante é formada e, finalmente, as funções fisiológicas são alteradas por proliferação, sobrevivência, migração, aumento da permeabilidade e infiltração em tecidos periféricos, etc. de células endoteliais (Dong Hongchao et al., setembro de 2014, Journal of Modern Oncology, 22 (9): 2231-3).
[0009] Atualmente, existem vários anticorpos monoclonais humanizados direcionados ao VEGF humano, particularmente VEGFA, como o bevacizumab, que foi aprovado pela Food and Drug Administration para o tratamento de vários tumores, como câncer de pulmão de células não pequenas, carcinoma de células renais, cervical câncer e câncer colorretal metastático em sucessão durante 2004.
[0010] O receptor-1 de morte celular programada (PD-1), também conhecido como CD279, é um receptor de superfície de membrana de glicoproteína transmembrana do tipo I, pertence à superfamília de imunoglobulinas CD28 e é comumente expresso em células T, células B e células mieloides. PD-1 tem dois ligantes naturais, PD-L1 e PD-L2. Tanto PD-L1 quanto PD-L2 pertencem à superfamília B7 e são expressos constitutivamente ou indutivelmente na superfície da membrana em uma variedade de células, incluindo células não hematopoiéticas e uma variedade de células tumorais. PD-L1 é expresso principalmente em células T, células B, DC e células endoteliais microvasculares e uma variedade de células tumorais, enquanto PD-L2 é expresso apenas em células apresentadoras de antígeno, como células dendríticas e macrófagos. A interação entre PD-1 e seus ligantes pode inibir a ativação da linfa, a proliferação de células T e a secreção de citocinas como IL-2 e IFN-γ.
[0011] Um grande número de pesquisas mostra que um microambiente tumoral pode proteger as células tumorais de serem danificada por células imunes, a expressão de PD-1 em linfócitos infiltrados no microambiente tumoral é regulada positivamente e vários tecidos tumorais primários são PD-L1 positivos em imunohistoquímica análise, como câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer de ovário, câncer de pele, câncer de cólon e glioma. Enquanto isso, a expressão de PD-L1 no tumor está significativamente correlacionada com o mau prognóstico de pacientes com câncer. O bloqueio da interação entre PD-1 e seus ligantes pode promover a imunidade de células T específicas do tumor e aumentar a eficiência de eliminação imunológica das células tumorais. Um grande número de ensaios clínicos mostra que os anticorpos direcionados a PD-1 ou PD-L1 podem promover a infiltração de células T CD8+ em tecidos tumorais e regular para cima fatores efetores imunológicos antitumorais, como IL-2, IFN-γ, granzima B e perforina, inibindo assim eficazmente o crescimento de tumores.
[0012] Além disso, os anticorpos anti-PD-1 também podem ser usados no tratamento de infecções crônicas virais. As infecções crônicas virais são frequentemente acompanhadas por uma perda da função das células T efetoras específicas do vírus e uma redução em seu número. A interação entre PD-1 e PD-L1 pode ser bloqueada pela injeção de um anticorpo PD-1, inibindo assim efetivamente a exaustão das células T efetoras na infecção viral crônica.
[0013] Devido à ampla perspectiva antitumoral e à eficácia surpreendente dos anticorpos PD-1, é amplamente aceito na indústria que os anticorpos direcionados à via PD-1 trarão avanços no tratamento de uma variedade de tumores: para o tratamento de não-câncer de pulmão de células pequenas, carcinoma de células renais, câncer de ovário e melanoma (Homet MB, Parisi G., et al., terapia Anti-PD-1 em melanoma. Semin Oncol. 2015 Jun; 42 (3): 466-473) , e linfoma e anemia (Held SA, Heine A, et al., Avanços na imunoterapia de leucemia mieloide crônica CML. Curr Cancer Drug Targets 2013 Set; 13 (7): 768-74).
[0014] O anticorpo bifuncional, também conhecido como anticorpo biespecífico, é um medicamento específico que tem como alvo dois antígenos diferentes simultaneamente e pode ser produzido por purificação através da imuno-seleção. Além disso, o anticorpo biespecífico também pode ser produzido por engenharia genética, o que tem certas vantagens devido à flexibilidade correspondente em aspectos como a otimização de sítios de ligação, consideração da forma sintética e rendimento. Atualmente, foi demonstrado que o anticorpo biespecífico existe em mais de 45 formas (Müller D, Kontermann RE. Anticorpos biespecíficos para imunoterapia do câncer: perspectivas atuais. BioDrugs 2010; 24: 89-98). Uma série de anticorpos biespecíficos foram desenvolvidos na forma de IgG-ScFv, nomeadamente a forma Morrison (Coloma MJ, Morrison SL Design e produção de novos anticorpos biespecíficos tetravalentes. Nat Biotechnol., 1997; 15: 159- 163), que tem foi demonstrado ser uma das formas ideais dos anticorpos biespecíficos devido à sua semelhança com a forma IgG naturalmente existente e vantagens na engenharia, expressão e purificação de anticorpos (Miller BR, Demarest SJ, et al., Stability engineering of scFvs for the development de anticorpos biespecíficos e multivalentes. Protein Eng Des Sel 2010; 23: 549-57; Fitzgerald J, Lugovskoy A. Rational engineering of anticorpo therapeutics targeting multiple oncogene pathways. MAbs 2011; 3: 299-309).
[0015] Atualmente, há uma necessidade de desenvolver um medicamento de anticorpo bifuncional direcionado a PD-1 e VEGF (por exemplo, VEGFA). Sumário
[0016] Por meio de pesquisa aprofundada e esforços criativos, e com base no anticorpo monoclonal VEGFA comercialmente disponível Avastin (bevacizumab) e 14C12H1L1 adquirido antes (consulte a publicação de patente chinesa nº CN106977602A), os inventores adquiriram um anticorpo bifuncional humanizado denominado VP101, que é capaz de ligação simultânea a VEGFA e PD-1 e bloqueando a ligação de VEGFA a VEGFR2 e de PD-1 a PD-L1.
[0017] Os inventores descobriram surpreendentemente que
VP101 é capaz de: - ligar-se efetivamente a PD-1 na superfície de células imunes humanas, aliviando a imunossupressão mediada por PD-L1 e PD-1 e promovendo a secreção de IFN-γ e IL-2 por células imunes humanas; - inibir eficazmente a proliferação de células endoteliais vasculares induzidas por VEGFA e, assim, inibir a angiogênese induzida por tumor; e/ou - tendo o potencial de ser usado para preparar medicamentos para prevenir e tratar tumores malignos, como câncer de fígado, câncer de pulmão, melanoma, tumor renal, câncer de ovário e linfoma.
[0018] A presente invenção será detalhada abaixo.
[0019] Um aspecto da presente invenção se refere a um anticorpo biespecífico, que compreende: - uma primeira região funcional de proteína direcionada a VEGFA, e - uma segunda região funcional de proteína direcionada a PD- 1; preferencialmente, - a primeira região funcional da proteína é um anticorpo anti-VEGFA ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, uma região variável da cadeia pesada do anticorpo anti-VEGFA compreendendo HCDR1-HCDR3 com sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 15-17 respectivamente, e uma região variável da cadeia leve do anticorpo anti-VEGFA compreendendo LCDR1-LCDR3 com sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 18-20 respectivamente; e - a segunda região funcional de proteína é um anticorpo anti- PD-1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, uma região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-PD-1 compreendendo HCDR1-HCDR3 com sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 21 -23 respectivamente, e uma região variável de cadeia leve do anticorpo anti-PD-1 compreendendo LCDR1-LCDR3 com sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 24-26 respectivamente.
[0020] Em algumas concretizações da presente invenção, o anticorpo biespecífico é fornecido, em que: - o anticorpo anti-VEGFA ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é selecionado a partir de Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, um fragmento de região determinante de complementaridade, um anticorpo de cadeia única, um anticorpo humanizado, um quimérico anticorpo e um diacorpo; e/ou, - o anticorpo anti-PD-1 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é selecionado a partir de Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, um fragmento de região determinante de complementaridade, um anticorpo de cadeia única, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico e um diacorpo.
[0021] Em algumas concretizações da presente invenção, o anticorpo biespecífico está na forma IgG-scFv.
[0022] Em algumas concretizações da presente invenção, a primeira região funcional de proteína é uma imunoglobulina, uma região variável de cadeia pesada da imunoglobulina compreendendo HCDR1-HCDR3 com sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 15-17 respectivamente, e uma variável de cadeia leve região da imunoglobulina compreendendo LCDR1-LCDR3 com as sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 18-20 respectivamente; e a segunda região funcional de proteína é um anticorpo de cadeia única, uma região variável de cadeia pesada do anticorpo de cadeia única compreendendo HCDR1-HCDR3 com sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 21-23, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve do anticorpo de cadeia simples compreendendo LCDR1-LCDR3 com sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 24-26 respectivamente; ou, - a primeira região funcional de proteína é um anticorpo de cadeia única, uma região variável de cadeia pesada do anticorpo de cadeia única compreendendo HCDR1-HCDR3 com sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 21-23, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve do único anticorpo de cadeia compreendendo LCDR1-LCDR3 com sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 24-26 respectivamente; e a segunda região funcional de proteína é uma imunoglobulina, uma região variável de cadeia pesada da imunoglobulina compreendendo HCDR1-HCDR3 com sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 15-17 respectivamente, e uma região variável de cadeia leve da imunoglobulina compreendendo LCDR1- LCDR3 com sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 18-20, respectivamente.
[0023] Em uma concretização específica da presente invenção, um anticorpo biespecífico é fornecido, o qual compreende: - uma primeira região funcional de proteína direcionada a VEGFA, e - uma segunda região funcional de proteína direcionada a PD- 1; em que: - a primeira região funcional de proteína é uma imunoglobulina, uma região variável de cadeia pesada da imunoglobulina compreendendo HCDR1-HCDR3 com sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 15-17 respectivamente, e uma região variável de cadeia leve da imunoglobulina compreendendo LCDR1-LCDR3 com as sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NOs: 18-20 respectivamente; e a segunda região funcional de proteína é um anticorpo de cadeia única, uma região variável de cadeia pesada do anticorpo de cadeia única compreendendo HCDR1-HCDR3 com sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 21-23, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve do anticorpo de cadeia simples compreendendo LCDR1-LCDR3 com sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 24-26 respectivamente; ou, - a primeira região funcional de proteína é um anticorpo de cadeia única, uma região variável de cadeia pesada do anticorpo de cadeia única compreendendo HCDR1-HCDR3 com sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 21-23, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve do único anticorpo de cadeia compreendendo LCDR1-LCDR3 com sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 24-26 respectivamente; e a segunda região funcional de proteína é uma imunoglobulina, uma região variável de cadeia pesada da imunoglobulina compreendendo HCDR1-HCDR3 com sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 15-17 respectivamente, e uma região variável de cadeia leve da imunoglobulina compreendendo LCDR1- LCDR3 com sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NOs: 18-20, respectivamente.
[0024] Em algumas concretizações da presente invenção, o anticorpo biespecífico é fornecido, em que:
- a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina é apresentada na SEQ ID NO: 5 e a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve da imunoglobulina é apresentada na SEQ ID NO: 7; e a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo de cadeia única é apresentada na SEQ ID NO: 9, e a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo de cadeia simples é apresentada na SEQ ID NO: 11; ou, - a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo de cadeia simples é apresentada na SEQ ID NO: 9, e a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo de cadeia simples é apresentada na SEQ ID NO: 11 ; e a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina é apresentada na SEQ ID NO: 5, e a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve da imunoglobulina é apresentada na SEQ ID NO:
7.
[0025] Em algumas concretizações da presente invenção, o anticorpo biespecífico é fornecido, em que: - a imunoglobulina compreende uma região não CDR derivada de uma espécie diferente de murina, como de um anticorpo humano.
[0026] Em algumas concretizações da presente invenção, o anticorpo biespecífico é fornecido, em que: - a imunoglobulina compreende regiões constantes derivadas de um anticorpo humano; preferencialmente, - as regiões constantes da imunoglobulina são selecionadas a partir de regiões constantes de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humana.
[0027] Em algumas concretizações da presente invenção, o anticorpo biespecífico é fornecido, em que: - a região constante da cadeia pesada da imunoglobulina é a região C da cadeia 1 de Ig humana ou região C da cadeia 4 de Ig humana, e sua região constante da cadeia leve é a região C da cadeia kappa de Ig humana.
[0028] Em algumas concretizações da presente invenção, as regiões constantes da imunoglobulina são humanizadas. Por exemplo, cada região constante da cadeia pesada é a região C da cadeia Ig gama-1, ACESSÃO: P01857, e cada região constante da cadeia leve é a região C da cadeia kappa de Ig, ACESSÃO: P01834.
[0029] Em algumas concretizações da presente invenção, o anticorpo biespecífico é fornecido, em que a primeira região funcional da proteína e a segunda região funcional da proteína estão ligadas diretamente ou através de um fragmento de ligação; preferivelmente,
[0030] - o fragmento de ligação é (GGGGS) m, em que m é um número inteiro positivo, tal como 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, e GGGGS (SEQ ID NO: 14) é uma unidade constituinte do ligante.
[0031] Em algumas concretizações da presente invenção, o anticorpo biespecífico é fornecido, em que os números da primeira região funcional da proteína e da segunda região funcional da proteína são, cada um, independentemente 1, 2 ou mais.
[0032] Em algumas concretizações da presente invenção, o anticorpo biespecífico é fornecido, em que 1 imunoglobulina e 2 anticorpos de cadeia simples, de preferência dois anticorpos de cadeia única idênticos, estão presentes.
[0033] Em algumas concretizações da presente invenção, o anticorpo biespecífico é fornecido, em que a imunoglobulina é uma IgG, IgA, IgD, IgE ou IgM, de preferência uma IgG, como uma IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.
[0034] Em algumas concretizações da presente invenção, o anticorpo biespecífico é fornecido, em que o anticorpo de cadeia única está ligado ao C-terminal da cadeia pesada da imunoglobulina. Uma vez que uma imunoglobulina tem duas cadeias pesadas, duas moléculas de anticorpo de cadeia única estão ligadas a uma molécula de imunoglobulina. De preferência, as duas moléculas de anticorpo de cadeia simples são idênticas.
[0035] Em algumas concretizações da presente invenção, o anticorpo biespecífico é fornecido, onde dois anticorpos de cadeia única estão presentes, e um terminal de cada anticorpo de cadeia única está ligado ao terminal C ou ao terminal N de uma das duas cadeias pesadas de a imunoglobulina.
[0036] Em algumas concretizações da presente invenção, uma ligação dissulfeto está presente entre o VH e o VL do anticorpo de cadeia simples. Métodos para introduzir uma ligação dissulfeto entre o VH e VL de um anticorpo são bem conhecidos na técnica, ver, por exemplo, US 5.747.654; Rajagopal et al., Prot. Engin. 10 (1997) 1453-1459; Reiter et al., Nat. Biotechnol. 14 (1996) 1239-1245; Reiter et al., Protein Engineering 8 (1995) 1323-1331; Webber et al., Molecular Immunology 32 (1995) 249-258; Reiter et al., Immunity 2 (1995) 281-287; Reiter et al., JBC 269 (1994) 18327-18331; Reiter et al., Inter. J. of Cancer 58 (1994) 142-149; ou Reiter et al., Cancer Res. 54 (1994) 2714-2718, que são aqui incorporados por referência.
[0037] Em algumas concretizações da presente invenção, o anticorpo biespecífico é fornecido, em que o anticorpo biespecífico se liga a uma proteína VEGFA e/ou uma proteína PD-1 com um KD inferior a 10-5 M, tal como inferior a 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M ou 10-10 M ou menos; de preferência, o KD é medido por um instrumento de interação molecular Fortebio.
[0038] Em algumas concretizações da presente invenção, o anticorpo biespecífico é fornecido, onde: - o anticorpo biespecífico se liga à proteína VEGFA com uma EC50 de menos de 1 nM, menos de 0,5 nM, menos de 0,2 nM, menos de 0,15 nM ou menos de 0,14 nM; preferencialmente, o EC50 é detectado por ELISA indireto; e/ou, - o anticorpo biespecífico se liga à proteína PD-1 com um EC50 menor que 1 nM, menor que 0,5 nM, menor que 0,2 nM, menor que 0,17 nM, menor que 0,16 nM ou menor que 0,15 nM; preferencialmente, o EC50 é detectado por ELISA indireto.
[0039] Outro aspecto da presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica o anticorpo biespecífico de acordo com qualquer concretização da presente invenção.
[0040] A presente invenção também se refere a um vetor que compreende a molécula de ácido nucleico isolada da presente invenção.
[0041] A presente invenção também se refere a uma célula hospedeira compreendendo a molécula de ácido nucleico isolada da presente invenção ou compreendendo o vetor da presente invenção.
[0042] Outro aspecto da presente invenção se refere a um método para preparar o anticorpo biespecífico de acordo com qualquer concretização da presente invenção, que compreende a cultura da célula hospedeira da presente invenção em uma condição adequada e o isolamento do anticorpo biespecífico das culturas de células.
[0043] Outro aspecto da presente invenção refere-se a um conjugado, compreendendo um anticorpo biespecífico e uma fração conjugada, em que o anticorpo biespecífico é o anticorpo biespecífico de acordo com qualquer concretização da presente invenção, e a fração conjugada é um marcador detectável; de preferência, a porção conjugada é um radioisótopo, uma substância fluorescente, uma substância luminescente, uma substância colorida ou uma enzima.
[0044] Outro aspecto da presente invenção refere-se a um kit compreendendo o anticorpo biespecífico de acordo com qualquer concretização da presente invenção ou compreendendo o conjugado da presente invenção; preferivelmente, - o kit compreende ainda um segundo anticorpo capaz de se ligar especificamente ao anticorpo biespecífico; opcionalmente, o segundo anticorpo compreende ainda um marcador detectável, como um radioisótopo, uma substância fluorescente, uma substância luminescente, uma substância colorida ou uma enzima.
[0045] Outro aspecto da presente invenção refere-se ao uso do anticorpo biespecífico de acordo com qualquer concretização da presente invenção na preparação de um kit para detectar a presença ou nível de VEGFA e/ou PD-1 em uma amostra.
[0046] Outro aspecto da presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo biespecífico de acordo com qualquer concretização da presente invenção ou compreendendo o conjugado da presente invenção; opcionalmente, compreende ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0047] O anticorpo biespecífico da presente invenção ou a composição farmacêutica da presente invenção pode ser formulado em qualquer forma de dosagem conhecida no campo farmacêutico, tal como comprimido, pílula, suspensão, emulsão, solução, gel, cápsula, pó, grânulo, elixir, trocisco, supositório, injeção (incluindo solução injetável, pó estéril para injeção e solução concentrada para injeção), inalante e spray. A forma de dosagem preferida depende do modo de administração pretendido e da utilização terapêutica. A composição farmacêutica da presente invenção deve ser estéril e estável nas condições de fabricação e armazenamento. Uma forma de dosagem preferida é uma injeção. Essas injeções podem ser soluções injetáveis estéreis. Por exemplo, as soluções de injeção estéreis podem ser preparadas pelo seguinte método: uma quantidade necessária do anticorpo biespecífico da presente invenção é adicionada em um solvente apropriado e, opcionalmente, outros ingredientes desejados (incluindo, mas não se limitando a, reguladores de pH, surfactantes , adjuvantes, intensificadores de força iônica, agentes isotônicos, conservantes, diluentes ou qualquer combinação dos mesmos) são adicionados ao mesmo tempo, seguido por filtração e esterilização. Além disso, as soluções de injeção estéreis podem ser preparadas como pós- liofilizados estéreis (por exemplo, por secagem a vácuo ou liofilização) para armazenamento e uso convenientes. Esses pós-liofilizados estéreis podem ser dispersos em um transportador adequado (por exemplo, água estéril livre de pirogênio) antes do uso.
[0048] Além disso, o anticorpo biespecífico da presente invenção pode estar presente em uma composição farmacêutica na forma de dose unitária para facilidade de administração. Em algumas concretizações, a dose unitária é de pelo menos 1 mg, pelo menos 5 mg, pelo menos 10 mg, pelo menos 15 mg, pelo menos 20 mg, pelo menos 25 mg, pelo menos 30 mg, pelo menos 45 mg, pelo menos 50 mg, pelo menos 75 mg ou pelo menos 100 mg. Quando a composição farmacêutica está em uma forma de dosagem líquida (por exemplo, injeção), ela pode compreender o anticorpo biespecífico da presente invenção a uma concentração de pelo menos 0,1 mg/mL, tal como pelo menos 0,25 mg/mL, pelo menos 0,5 mg/mL, pelo menos 1 mg/mL, pelo menos 2,5 mg/mL, pelo menos 5 mg/mL, pelo menos 8 mg/mL, pelo menos 10 mg/mL, pelo menos 15 mg/mL, pelo menos 25 mg/mL, pelo menos 50 mg/mL, pelo menos 75 mg/mL ou pelo menos 100 mg/mL.
[0049] O anticorpo biespecífico ou a composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrado por qualquer método adequado conhecido na técnica, incluindo, mas não limitado a, oral, bucal, sublingual, ocular, tópico, parenteral, retal, intratecal, intracisternal, inguinal, via intravesical, tópica (por exemplo, pó, pomada ou gota) ou nasal. No entanto, para muitos usos terapêuticos, a via/modo de administração preferencial é parenteral (como injeção intravenosa, injeção subcutânea, injeção intraperitoneal e injeção intramuscular). Os versados na técnica apreciarão que a via e/ou modo de administração irá variar dependendo da finalidade pretendida. Em uma concretização preferida, o anticorpo biespecífico ou a composição farmacêutica da presente invenção é administrado por infusão ou injeção intravenosa.
[0050] O anticorpo biespecífico ou a composição farmacêutica fornecida neste documento pode ser usado sozinho ou em combinação, ou usado em combinação com agentes farmaceuticamente ativos adicionais (por exemplo, um medicamento quimioterápico para tumor). Tal agente farmaceuticamente ativo adicional pode ser administrado antes, simultaneamente ou subsequentemente à administração do anticorpo biespecífico da presente invenção ou da composição farmacêutica da presente invenção.
[0051] Na presente invenção, o regime de administração pode ser ajustado para atingir a resposta desejada ideal (por exemplo, uma resposta terapêutica ou profilática). Por exemplo, pode ser uma administração única, pode ser várias administrações ao longo de um período de tempo ou pode ser caracterizada pela redução ou aumento da dose proporcionalmente ao grau de emergência do tratamento.
[0052] Outro aspecto da presente invenção refere-se ao uso do anticorpo biespecífico de acordo com qualquer concretização da presente invenção ou o conjugado da presente invenção na preparação de um medicamento para prevenir e/ou tratar um tumor maligno, em que preferencialmente, o tumor maligno é selecionado de câncer de cólon, câncer retal, câncer de pulmão, como câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de fígado, câncer de ovário, câncer de pele, glioma, melanoma, tumor renal, câncer de próstata, câncer de bexiga, câncer gastrointestinal, câncer de mama, câncer cerebral e leucemia.
[0053] Outro aspecto da presente invenção refere-se ao uso do anticorpo biespecífico de acordo com qualquer concretização da presente invenção ou o conjugado da presente invenção na preparação: (1) um medicamento ou agente para detectar o nível de VEGFA em uma amostra, um medicamento ou agente para bloquear a ligação de VEGFA a VEGFR2, um medicamento ou um agente para regular negativamente a atividade ou nível de VEGFA, um medicamento ou agente para aliviar a estimulação de VEGFA na proliferação de células endoteliais vasculares, um medicamento ou agente para inibir a proliferação de células endoteliais vasculares, ou um medicamento ou agente para bloquear a angiogênese tumoral; e/ou (2) um medicamento ou agente para bloquear a ligação de PD-1 a PD-L1, um medicamento ou agente para regular negativamente a atividade ou nível de PD-1, um medicamento ou agente para aliviar a imunossupressão de PD-1 em um organismo, um medicamento ou agente para promover a secreção de IFN-γ em linfócitos T, ou um medicamento ou um agente para promover a secreção de IL-2 em linfócitos T.
[0054] Em uma concretização da presente invenção, o uso é não terapêutico e/ou não para diagnóstico.
[0055] Outro aspecto da presente invenção se refere a um método in vivo ou in vitro que compreende a administração a uma célula de uma quantidade eficaz do anticorpo biespecífico de acordo com qualquer concretização da presente invenção ou o conjugado da presente invenção, e o método é selecionado a partir de: (1) um método para detectar o nível de VEGFA em uma amostra, um método para bloquear a ligação de VEGFA a VEGFR2, um método para regular negativamente a atividade ou nível de VEGFA, um método para aliviar a estimulação de VEGFA na proliferação de células endoteliais vasculares, um método para inibir a proliferação de células endoteliais vasculares, ou um método para bloquear a angiogênese tumoral; e/ou (2) um método para bloquear a ligação de PD-1 a PD-L1, um método para regular negativamente a atividade ou nível de PD-1, um método para aliviar a imunossupressão de PD-1 em um organismo, um método para promover a secreção de IFN-γ em linfócitos T, ou um método para promover a secreção de IL-2 em linfócitos T.
[0056] Em uma concretização da presente invenção, o método in vitro não é terapêutico e/ou não é diagnóstico.
[0057] No experimento in vitro da presente invenção, o anticorpo anti-VEGFA e o anticorpo bifuncional anti-VEGFA/PD- 1 podem inibir a proliferação de células HUVEC, e o anticorpo anti-PD-1 e o anticorpo anti-VEGFA/PD-1 o anticorpo bifuncional pode promover a secreção de IFN-γ e/ou IL-2 e ativar a reação imune.
[0058] Outro aspecto da presente invenção se refere a um método para prevenir e/ou tratar um tumor maligno, que compreende a administração a um sujeito em necessidade de uma quantidade eficaz do anticorpo biespecífico de acordo com qualquer concretização da presente invenção ou o conjugado da presente invenção, em que, de preferência, o tumor maligno é selecionado de câncer de cólon, câncer retal, câncer de pulmão, como câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de fígado, câncer de ovário, câncer de pele, glioma, melanoma, tumor renal, câncer de próstata, câncer de bexiga, câncer gastrointestinal, câncer de mama, câncer cerebral e leucemia.
[0059] Uma faixa não limitante típica de uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz do anticorpo biespecífico da presente invenção é de 0,02-50 mg/kg, tal como 0,1-50 mg/kg, 0,1-25 mg/kg ou 1-10 mg/kg. Deve-se observar que a dose pode variar de acordo com o tipo e gravidade do sintoma a ser tratado. Além disso, aqueles versados na técnica apreciarão que para qualquer paciente em particular, o regime de administração particular será ajustado ao longo do tempo de acordo com as necessidades do paciente e o julgamento profissional do médico; a gama de doses aqui apresentadas são apenas para fins ilustrativos e não limitam a utilização ou âmbito da composição farmacêutica da presente invenção.
[0060] Na presente invenção, o sujeito pode ser um mamífero, como um ser humano.
[0061] É fornecido o anticorpo biespecífico ou o conjugado de acordo com qualquer concretização da presente invenção para uso na prevenção e/ou tratamento de um tumor maligno, em que, de preferência, o tumor maligno é selecionado de câncer de cólon, câncer retal, câncer de pulmão, tal como não pequeno câncer de células de pulmão, câncer de fígado, câncer de ovário, câncer de pele, glioma, melanoma, tumor renal,
câncer de próstata, câncer de bexiga, câncer gastrointestinal, câncer de mama, câncer cerebral e leucemia.
[0062] É fornecido o anticorpo biespecífico ou conjugado de acordo com qualquer concretização da presente invenção para uso em: (1) detectar o nível de VEGFA em uma amostra, - bloqueando a ligação de VEGFA a VEGFR2, - diminuir a atividade ou nível de VEGFA, - aliviar a estimulação de VEGFA na proliferação de células endoteliais vasculares, - inibir a proliferação de células endoteliais vasculares, ou - bloquear a angiogênese tumoral; e/ou (2) bloqueando a ligação de PD-1 a PD-L1, - regulando para baixo a atividade ou nível de PD-1, - aliviando a imunossupressão de PD-1 em um organismo, - promovendo a secreção de IFN-γ em linfócitos T, ou - promovendo a secreção de IL-2 em linfócitos T.
[0063] Os medicamentos com anticorpos, especialmente os anticorpos monoclonais, alcançaram boa eficácia no tratamento de várias doenças. Os métodos experimentais tradicionais para adquirir esses anticorpos terapêuticos são imunizar animais com o antígeno e adquirir anticorpos direcionados ao antígeno nos animais imunizados, ou melhorar aqueles anticorpos com menor afinidade para o antígeno por maturação de afinidade.
[0064] As regiões variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada determinam a ligação do antígeno; a região variável de cada cadeia contém três regiões hiper-variáveis chamadas Regiões Determinantes de Complementaridade (CDRs) (CDRs da cadeia pesada (Cadeia H) compreendem HCDR1, HCDR2 e HCDR3, e CDRs da cadeia leve (Cadeia L) compreendem LCDR1, LCDR2, e
LCDR3, que são nomeados por Kabat et al., ver Bethesda Md, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication (1-3) 1991: 91-3242).
[0065] De preferência, os CDRs também podem ser definidos pelo sistema de numeração IMGT, ver Ehrenmann, Francois, Quentin Kaas e Marie-Paule Lefranc. "IMGT/3D-structure-DB e IMGT/DomainGapAlign: um banco de dados e uma ferramenta para imunoglobulinas ou anticorpos, receptores de células T, MHC, IgSF e MhcSF." Nucleic acid research 38.suppl_1 (2009): D301- D307.
[0066] As sequências de aminoácidos das regiões CDR das sequências de anticorpo monoclonal em (1) a (13) abaixo foram analisadas por meios técnicos bem conhecidos pelos versados na técnica, por exemplo, pelo banco de dados VBASE2 e de acordo com a definição IMGT, e o os resultados são os seguintes: (1) Bevacizumab
[0067] A sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada é apresentada na SEQ ID NO: 5, e a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve é apresentada na SEQ ID NO: 7.
[0068] As sequências de aminoácidos das 3 regiões CDR de sua região variável da cadeia pesada são as seguintes: HCDR1: GYTFTNYG (SEQ ID NO: 15) HCDR2: INTYTGEP (SEQ ID NO: 16) HCDR3: AKYPHYYGSSHWYFDV (SEQ ID NO: 17)
[0069] As sequências de aminoácidos das 3 regiões CDR de sua região variável de cadeia leve são as seguintes: LCDR1: QDISNY (SEQ ID NO: 18) LCDR2: FTS (SEQ ID NO: 19)
LCDR3: QQYSTVPWT (SEQ ID NO: 20) (2) 14C12H1L1
[0070] A sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada é apresentada na SEQ ID NO: 9, e a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve é apresentada na SEQ ID NO: 11.
[0071] As sequências de aminoácidos das 3 regiões CDR de sua região variável da cadeia pesada são as seguintes: HCDR1: GFAFSSYD (SEQ ID NO: 21) HCDR2: ISGGGRYT (SEQ ID NO: 22) HCDR3: ANRYGEAWFAY (SEQ ID NO: 23)
[0072] As sequências de aminoácidos das 3 regiões CDR de sua região variável de cadeia leve são as seguintes: LCDR1: QDINTY (SEQ ID NO: 24) LCDR2: RAN (SEQ ID NO: 25) LCDR3: LQYDEFPLT (SEQ ID NO: 26) (3) VP101
[0073] As sequências de aminoácidos das 9 regiões CDR de suas cadeias pesadas são as seguintes: HCDR1: GYTFTNYG (SEQ ID NO: 15) HCDR2: INTYTGEP (SEQ ID NO: 16) HCDR3: AKYPHYYGSSHWYFDV (SEQ ID NO: 17) HCDR4: GFAFSSYD (SEQ ID NO: 21) HCDR5: ISGGGRYT (SEQ ID NO: 22) HCDR6: ANRYGEAWFAY (SEQ ID NO: 23) HCDR7: QDINTY (SEQ ID NO: 24) HCDR8: RAN (SEQ ID NO: 25) HCDR9: LQYDEFPLT (SEQ ID NO: 26)
[0074] As sequências de aminoácidos das 3 regiões CDR de sua região variável de cadeia leve são as seguintes:
LCDR1: QDISNY (SEQ ID NO: 18) LCDR2: FTS (SEQ ID NO: 19) LCDR3: QQYSTVPWT (SEQ ID NO: 20)
[0075] Na presente invenção, a menos que definido de outra forma, os termos científicos e técnicos usados neste documento têm os significados geralmente compreendidos por aqueles versados na técnica. Além disso, as operações laboratoriais de cultura de células, genética molecular, química de ácido nucleico e a imunologia aqui utilizada são os procedimentos de rotina amplamente utilizados nos campos correspondentes. Entretanto, a fim de compreender melhor a presente invenção, as definições e explicações dos termos relevantes são fornecidas abaixo.
[0076] Tal como aqui utilizado, quando se refere à sequência de aminoácidos da proteína VEGFA (GenBank ID: NP_001165097.1), inclui o comprimento total da proteína VEGFA, bem como uma proteína de fusão de VEGFA, tal como um fragmento fundido a um Fc fragmento de proteína de IgG de camundongo ou humano (mFc ou hFc). No entanto, aqueles versados na técnica apreciarão que na sequência de aminoácidos da proteína VEGFA, mutações ou variações (incluindo, mas não se limitando a, substituições, deleções e/ou adições) podem ser geradas naturalmente ou artificialmente introduzidas sem afetar suas funções biológicas. Portanto, na presente invenção, o termo "proteína VEGFA" deve incluir todas essas sequências, incluindo suas variantes naturais ou artificiais. Além disso, ao descrever o fragmento de sequência da proteína VEGFA, também inclui os fragmentos de sequência correspondentes em suas variantes naturais ou artificiais. Em uma concretização da presente invenção, a sequência de aminoácidos da proteína VEGFA é mostrada como a parte sublinhada da SEQ ID NO: 1 (sem os últimos 6 His, um total de 302 aminoácidos).
[0077] Tal como aqui utilizado, quando se refere à sequência de aminoácidos da proteína VEGFR2 (também conhecida como KDR, GenBank ID: NP_002244), inclui o comprimento total da proteína VEGFR2 ou o fragmento extracelular VEGFR2-ECD de VEGFR2, ou um fragmento compreendendo VEGFR2-ECD, e também inclui uma proteína de fusão de VEGFR2-ECD, como um fragmento fundido a um fragmento de proteína Fc de IgG de camundongo ou humano (mFc ou hFc). No entanto, aqueles versados na técnica apreciarão que na sequência de aminoácidos da proteína VEGFR2, mutações ou variações (incluindo, mas não se limitando a, substituições, deleções e/ou adições) podem ser geradas naturalmente ou introduzidas artificialmente sem afetar suas funções biológicas. Portanto, na presente invenção, o termo "proteína VEGFR2" deve incluir todas essas sequências, incluindo suas variantes naturais ou artificiais. Além disso, ao descrever o fragmento de sequência da proteína VEGFR2, também inclui os fragmentos de sequência correspondentes em suas variantes naturais ou artificiais. Em uma concretização da presente invenção, a sequência de aminoácidos do fragmento extracelular VEGFR2-ECD de VEGFR2 é mostrada como a parte ondulada sublinhada de SEQ ID NO: 4 (766 aminoácidos).
[0078] Tal como aqui utilizado, a menos que especificado de outra forma, o VEGFR é VEGFR1 e/ou VEGFR2; a sua sequência de proteína específica é uma sequência conhecida na técnica anterior e pode ser feita referência à sequência descrita na literatura existente ou no GenBank. Por exemplo, VEGFR1
(VEGFR1, NCBI Gene ID: 2321); VEGFR2 (VEGFR2, NCBI Gene ID: 3791).
[0079] Tal como aqui utilizado, quando se refere à sequência de aminoácidos da proteína PD-1 (proteína 1 de morte celular programada, NCBI GenBank: NM_005018), inclui o comprimento total da proteína PD-1 ou o fragmento extracelular PD-1ECD de PD-1 ou um fragmento compreendendo PD-1ECD, e também inclui uma proteína de fusão de PD-1ECD, como um fragmento fundido a um fragmento de proteína Fc de um camundongo ou IgG humano (mFc ou hFc). No entanto, será apreciado por aqueles versados na técnica que na sequência de aminoácidos da proteína PD-1, mutações ou variações (incluindo, mas não se limitando a substituições, deleções e/ou adições) podem ser geradas naturalmente ou introduzidas artificialmente sem afetar suas funções biológicas. Portanto, na presente invenção, o termo "proteína PD-1" deve incluir todas essas sequências, incluindo suas variantes naturais ou artificiais. Além disso, ao descrever o fragmento de sequência da proteína PD-1, também inclui os fragmentos de sequência correspondentes em suas variantes naturais ou artificiais.
[0080] Tal como aqui utilizado, o termo EC50 refere-se à concentração para 50% do efeito máximo, ou seja, a concentração que pode causar 50% do efeito máximo.
[0081] Tal como aqui utilizado, o termo "anticorpo" refere- se a uma molécula de imunoglobulina que geralmente consiste em dois pares de cadeias polipeptídicas (cada par com uma cadeia "leve" (L) e uma cadeia "pesada" (H)). Em um sentido geral, a cadeia pesada pode ser interpretada como uma cadeia polipeptídica com um peso molecular maior em um anticorpo, e a cadeia leve se refere a uma cadeia polipeptídica com um peso molecular menor em um anticorpo.
As cadeias leves são classificadas como cadeias leves κ e λ.
As cadeias pesadas são geralmente classificadas como μ, δ, γ, α ou ε, e os isotipos de anticorpos são definidos como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente.
Nas cadeias leves e nas cadeias pesadas, a região variável e a região constante estão ligadas por uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, e a cadeia pesada também compreende uma região "D" de cerca de 3 ou mais aminoácidos.
Cada cadeia pesada consiste em uma região variável da cadeia pesada (VH) e uma região constante da cadeia pesada (CH). A região constante da cadeia pesada consiste em 3 domínios (CH1, CH2 e CH3). Cada cadeia leve consiste em uma região variável de cadeia leve (VL) e uma região constante de cadeia leve (CL). A região constante da cadeia leve consiste em um domínio CL.
A região constante do anticorpo pode mediar à ligação de imunoglobulinas aos tecidos ou fatores do hospedeiro, incluindo a ligação de várias células do sistema imunológico (por exemplo, células efetoras) ao primeiro componente (C1q) do sistema complemento clássico.
As regiões VH e VL podem ser subdivididas em regiões altamente variáveis (chamadas de Regiões Determinantes de Complementaridade (CDRs)), entre as quais se distribuem regiões conservativas chamadas de regiões estruturais (FRs). Cada VH e VL consiste em 3 CDRs e 4 FRs organizados do terminal amino ao terminal carboxil na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis (VH e VL) de cada par de cadeia pesada/cadeia leve forma locais de ligação do anticorpo, respectivamente.
A atribuição de aminoácidos às regiões ou domínios pode ser baseada em Sequências de Proteínas de Interesse Imunológico de Kabat (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 e 1991)), ou Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196 (1987): 901-917; Chothia et al. Nature 342 (1989): 878-883 ou a definição de sistema de numeração IMGT, ver Ehrenmann, Francois, Quentin Kaas e Marie-Paule Lefranc. "IMGT/3D-structure-DB e IMGT/DomainGapAlign: um banco de dados e uma ferramenta para imunoglobulinas ou anticorpos, receptores de células T, MHC, IgSF e MhcSF." Nucleic acid research 38.suppl_1 (2009): D301-D307. Em particular, a cadeia pesada também pode compreender mais de 3 CDRs, tais como 6, 9 ou 12. Por exemplo, no anticorpo biespecífico da presente invenção, a cadeia pesada pode ser um ScFv com o terminal C do cadeia de anticorpo IgG ligada a outro anticorpo e, neste caso, a cadeia pesada compreende 9 CDRs. O termo "anticorpo" não é limitado por qualquer método específico para a produção de anticorpos. Por exemplo, o anticorpo inclui, em particular, um anticorpo recombinante, um anticorpo monoclonal e um anticorpo policlonal. Os anticorpos podem ser isotipos diferentes, como o anticorpo IgG (por exemplo, subtipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE ou IgM.
[0082] Tal como aqui utilizado, o termo "fragmento de ligação ao antígeno", também conhecido como "porção de ligação ao antígeno", refere-se a um polipeptídeo compreendendo o fragmento de um anticorpo de comprimento total, que mantém a capacidade de se ligar especificamente ao mesmo antígeno ao qual o anticorpo de comprimento total liga- se e/ou compete com o anticorpo de comprimento total pela ligação específica a um antígeno. Ver genericamente,
Fundamental Immunology, cap. 7 (Paul, W., ed., 2ª edição, Raven Press, NY (1989), que é incorporado por referência neste documento em sua totalidade para todos os fins. Um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo pode ser produzido por técnica de DNA recombinante ou por clivagem enzimática ou química de um anticorpo intacto. Em alguns casos, o fragmento de ligação ao antígeno inclui Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb e fragmento da região determinante de complementaridade (CDR), fragmento de anticorpo de cadeia única (por exemplo, scFv), anticorpo quimérico, diacorpo e polipeptídeo que compreende pelo menos uma porção de um anticorpo suficiente para conferir capacidade de ligação de antígeno específica a um polipeptídeo.
[0083] Como aqui utilizado, o termo "fragmento Fd" refere- se a um fragmento de anticorpo que consiste em domínios VH e CH1; o termo "fragmento Fv" refere-se a um fragmento de anticorpo que consiste nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo; o termo "fragmento de dAb" refere-se a um fragmento de anticorpo que consiste em um domínio VH (Ward et al., Nature 341 (1989): 544 546); o termo "fragmento Fab" refere-se a um fragmento de anticorpo que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH1; e o termo "fragmento F(ab')2" refere-se a um fragmento de anticorpo compreendendo dois fragmentos Fab ligados pela ponte dissulfeto numa região charneira.
[0084] Em alguns casos, o fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo é um anticorpo de cadeia única (por exemplo, scFv) em que os domínios VL e VH são pareados para formar uma molécula monovalente por meio de um ligante que os permite produzir uma única cadeia polipeptídica (ver, por exemplo,
Bird et al., Science 242 (1988): 423 426 e Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85 (1988): 5879 5883). Tais moléculas de scFv podem ter uma estrutura geral: NH2-VL- linker-VH-COOH ou NH2-VH-linker-VL-COOH. Um ligante apropriado na técnica anterior consiste em uma sequência de aminoácidos GGGGS de repetição ou uma variante desta. Por exemplo, um ligante possuindo a sequência de aminoácidos (GGGGS) 4 pode ser usado, e suas variantes também podem ser usadas (Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993): 6444-6448). Outros ligantes úteis na presente invenção são descritos por Alfthan et al., Protein Eng. 8 (1995): 725-731, Choi et al., Eur. J. Immunol. 31 (2001): 94- 106, Hu et al., Cancer Res. 56 (1996): 3055-3061, Kipriyanov et al., J. Mol. Biol. 293 (1999): 41-56, e Roovers et al., Cancer Immunol. (2001).
[0085] Em alguns casos, o fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo é um diacorpo, ou seja, um anticorpo bivalente, no qual os domínios VH e VL são expressos em uma única cadeia polipeptídica. No entanto, o ligante usado é muito curto para permitir o emparelhamento dos dois domínios na mesma cadeia, assim, os domínios são forçados a emparelhar com os domínios complementares na outra cadeia e dois locais de ligação ao antígeno são gerados (ver, por exemplo, Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993): 6444 6448, e Poljak RJ et al., Structure 2 (1994): 1121 1123).
[0086] Os fragmentos de ligação ao antígeno (por exemplo, os fragmentos de anticorpo mencionados acima) de anticorpos podem ser obtidos a partir de determinados anticorpos usando técnicas convencionais conhecidas pelos versados na técnica (por exemplo, técnica de DNA recombinante ou clivagem enzimática ou química), e os fragmentos de ligação ao antígeno de os anticorpos são rastreados quanto à especificidade da mesma forma que os anticorpos intactos.
[0087] Tal como aqui utilizado, a menos que claramente definido de outra forma no contexto, quando se refere ao termo "anticorpo", inclui não apenas anticorpos intactos, mas também fragmentos de anticorpos de ligação ao antígeno.
[0088] Tal como aqui utilizado, os termos "mAb" e "anticorpo monoclonal" referem-se a um anticorpo ou um fragmento deste que é derivado de um grupo de anticorpos altamente homólogos, isto é, de um grupo de moléculas de anticorpo idênticas, exceto para mutações naturais que podem ocorrer espontaneamente. O anticorpo monoclonal tem alta especificidade para um único epítopo em um antígeno. O anticorpo policlonal, em relação ao anticorpo monoclonal, geralmente compreende pelo menos dois ou mais anticorpos diferentes que geralmente reconhecem epítopos diferentes em um antígeno. Os anticorpos monoclonais podem geralmente ser obtidos pela técnica de hibridoma relatada pela primeira vez por Kohler et al. (Nature, 256: 495, 1975), e também podem ser obtidos por técnica de DNA recombinante (por exemplo, ver Patente U.S. 4.816.567).
[0089] Tal como aqui utilizado, o termo "anticorpo quimérico" refere-se a um anticorpo do qual uma parte das cadeias leves e/e pesadas é derivada de um anticorpo (que pode ser derivado de uma espécie específica ou pertencer a uma classe ou subclasse de anticorpo específica), e a outra parte das cadeias leves e/ou pesadas são derivadas de outro anticorpo (que pode ser derivado da mesma espécie ou de espécies diferentes ou pertencer à mesma classe ou subclasse de anticorpos diferentes). Mas em qualquer caso, retém a atividade de ligação para o antígeno alvo (Patente U.S.
4.816.567 de Cabilly et al.; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 (1984): 6851-6855).
[0090] Tal como aqui utilizado, o termo "anticorpo humanizado" refere-se a um anticorpo ou fragmento de anticorpo obtido quando todas ou parte das regiões CDR de uma imunoglobulina humana (anticorpo receptor) são substituídas pelas regiões CDR de um anticorpo não humano (anticorpo doador), em que o anticorpo doador pode ser um anticorpo não humano (por exemplo, de camundongo, rato ou coelho) com especificidade, afinidade ou reatividade esperada. Além disso, alguns resíduos de aminoácidos nas regiões estruturais (FRs) do anticorpo receptor também podem ser substituídos pelos resíduos de aminoácidos de anticorpos não humanos correspondentes ou pelos resíduos de aminoácidos de outros anticorpos para melhorar ou otimizar ainda mais o desempenho de o anticorpo. Para mais detalhes sobre anticorpos humanizados, ver, por exemplo, Jones et al., Nature, 321 (1986): 522-525; Reichmann et al., Nature, 332: 323 329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2 (1992): 593-596 e Clark, Immunol. Today 21 (2000): 397-402.
[0091] Tal como aqui utilizado, o termo "epítopo" refere-se a um local no antígeno ao qual uma imunoglobulina ou anticorpo se liga especificamente. "Epítopo" também é chamado na técnica como um "determinante antigênico". O epítopo ou determinante antigênico geralmente consiste em grupos de superfície quimicamente ativos de uma molécula, como aminoácidos ou carboidratos ou cadeias laterais de açúcar, e geralmente tem características estruturais tridimensionais específicas e características de carga específicas. Por exemplo, o epítopo geralmente inclui pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos consecutivos ou não consecutivos em uma única conformação espacial, que pode ser "linear" ou "conformacional". Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996). Em um epítopo linear, todos os locais de interação entre uma proteína e uma molécula de interação (por exemplo, um anticorpo) existem linearmente ao longo da sequência de aminoácidos primária da proteína. Em um epítopo conformacional, os locais de interação existem entre os resíduos de aminoácidos da proteína que são separados uns dos outros.
[0092] Tal como aqui utilizado, o termo "isolado" refere-se a obtido por meios artificiais a partir do estado natural. Se uma determinada substância ou componente "isolado" aparece na natureza, pode ser que ocorra uma mudança em seu ambiente natural, ou que esteja isolado do ambiente natural, ou ambos. Por exemplo, um certo polinucleotídeo ou polipeptídeo não isolado existe naturalmente em um determinado animal vivo, e o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo com uma pureza elevada isolado de tal estado natural é denominado polinucleotídeo ou polipeptídeo isolado. O termo "isolado" não exclui a existência de substâncias artificiais ou sintéticas ou outras impurezas que não afetam a atividade da substância.
[0093] Tal como aqui utilizado, o termo "vector" refere-se a um veículo de ácido nucleico no qual um polinucleotídeo pode ser inserido. Quando um vetor permite a expressão da proteína codificada pelo polinucleotídeo inserido, o vetor é chamado de vetor de expressão. Um vetor pode ser introduzido em uma célula hospedeira por transformação, transdução ou transfecção, de modo que os elementos da substância genética transportados pelo vetor possam ser expressos na célula hospedeira. Os vetores são bem conhecidos dos versados na técnica, incluindo, mas não se limitando a: plasmídeos; fagemídeos; cosmídeos; cromossomas artificiais, tais como cromossoma artificial de levedura (YAC), cromossoma artificial bacteriano (BAC) ou cromossoma artificial derivado de P1 (PAC); fagos, tais como fagos lambda ou fagos M13, e vírus animais. Os vírus animais que podem ser usados como vetores incluem, mas não estão limitados a, retrovírus (incluindo lentivírus), adenovírus, vírus adeno-associados, vírus herpes (como vírus herpes simplex), poxvírus, baculovírus, papilomavírus e papovavírus (como SV40). Um vetor pode conter uma variedade de elementos que controlam a expressão, incluindo, mas não se limitando a, sequências de promotor, sequências de iniciação de transcrição, sequências de intensificador, elementos de seleção e genes repórter. Além disso, o vetor pode conter ainda um local de início de replicação.
[0094] Tal como aqui utilizado, o termo "célula hospedeira" refere-se a células às quais o vetor pode ser introduzido, incluindo, mas não se limitando a células procarióticas, como E. coli ou Bacillus subtilis, células fúngicas, como células de levedura ou Aspergillus, células de inseto, como Células de drosófila S2 ou Sf9, ou células animais, como fibroblastos, células CHO, células COS, células NSO, células HeLa, células BHK, células HEK 293 ou células humanas.
[0095] Tal como aqui utilizado, o termo "ligar-se especificamente" refere-se a uma reação de ligação não aleatória entre duas moléculas, tal como uma reação entre um anticorpo e um antígeno que ele visa. Em algumas concretizações, um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno (ou um anticorpo que é específico para um antígeno) significa que o anticorpo se liga ao antígeno com uma afinidade (KD) inferior a cerca de 10-5 M, tal como inferior a cerca de 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M ou 10-10 M ou menos. Em algumas concretizações da presente invenção, o termo "alvo" se refere a ligação específica.
[0096] Tal como aqui utilizado, o termo "KD" refere-se a uma constante de equilíbrio de dissociação para uma interação anticorpo-antígeno específica, a qual é usada para descrever a afinidade de ligação entre o anticorpo e o antígeno. Quanto menor for a constante de dissociação de equilíbrio, mais forte será a ligação anticorpo-antígeno e maior será a afinidade entre o anticorpo e o antígeno. Geralmente, os anticorpos se ligam a antígenos com uma constante de equilíbrio de dissociação (KD) inferior a cerca de 10-5 M, tal como inferior a cerca de 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M ou 10- 10 M ou menos, por exemplo, conforme determinado em um instrumento BIACORE usando ressonância de plasma de superfície (SPR).
[0097] Conforme usado aqui, os termos "anticorpo monoclonal" e "mAb" têm o mesmo significado e podem ser usados indistintamente; os termos "anticorpo policlonal" e "PcAb" têm o mesmo significado e podem ser usados indistintamente; os termos "polipeptídeo" e "proteína" têm o mesmo significado e podem ser usados indistintamente. Além disso, na presente invenção, os aminoácidos são geralmente representados por abreviaturas de uma única letra e de três letras conhecidas na técnica. Por exemplo, a alanina pode ser representada por A ou Ala.
[0098] Tal como aqui utilizado, o termo "excipiente farmaceuticamente aceitável" refere-se a um carreador e/ou veículo que é farmacologicamente e/ou fisiologicamente compatível com o sujeito e o ingrediente ativo, que é bem conhecido na técnica (ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences Editado por Gennaro AR, 19 ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995) e inclui, mas não está limitado a, reguladores de pH, surfactantes, adjuvantes e intensificadores de força iônica. Por exemplo, os reguladores de pH incluem, mas não estão limitados a, tampão fosfato; os surfactantes incluem, mas não estão limitados a, surfactantes catiônicos, aniônicos ou não iônicos, tais como Tween-80; os intensificadores de força iônica incluem, mas não estão limitados a, cloreto de sódio.
[0099] Tal como aqui utilizado, o termo "adjuvante" refere- se a um potenciador imune não específico, que pode aumentar a resposta imune de um organismo a antígenos ou alterar o tipo de resposta imune quando entregue no organismo junto com os antígenos ou entregue no organismo antecipadamente. Existem vários adjuvantes, incluindo mas não se limitando a adjuvante de alumínio (como hidróxido de alumínio), adjuvante de Freund (como adjuvante de Freund completo e adjuvante de Freund incompleto), corynebacterium parvum, lipopolissacarídeo, citocina, etc. O adjuvante de Freund é o mais comumente usado adjuvante em experimentos com animais. O adjuvante de hidróxido de alumínio é mais usado em ensaios clínicos.
[0100] Tal como aqui utilizado, o termo "quantidade eficaz"
refere-se a uma quantidade suficiente para obter ou, pelo menos, obter parcialmente o efeito desejado. Por exemplo, uma quantidade profilaticamente eficaz (por exemplo, para uma doença associada à ligação de PD-1 a PD-L1 ou super-expressão de VEGF, como um tumor) é uma quantidade suficiente para prevenir, parar ou atrasar o início da doença ( por exemplo, uma doença associada à ligação de PD-L1 a PD-L1 ou super- expressão de VEGF, como um tumor); uma quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade suficiente para curar ou pelo menos interromper parcialmente a doença e suas complicações em um paciente que sofre da doença. Está, sem dúvida, dentro da capacidade dos especialistas na técnica determinar essa quantidade eficaz. Por exemplo, a quantidade eficaz para uso terapêutico dependerá da gravidade da doença a ser tratada, do estado geral do sistema imunológico do paciente, da condição geral do paciente, como idade, peso e sexo, o modo do medicamento administração e outros tratamentos administrados simultaneamente, etc. Vantagens da presente invenção:
[0101] O anticorpo biespecífico VP101 pode ligar-se especificamente ao VEGFA bem, bloquear efetivamente a ligação de VEGFA a VEGFR2 e especificamente aliviar a imunossupressão de VEGFA em um organismo e o efeito de promoção de VEGFA na angiogênese; VP101 pode se ligar especificamente ao poço PD- 1, bloquear efetivamente a ligação de PD-1 a PD-L1 e, especificamente, aliviar a imunossupressão de PD-1 em um organismo e ativar a resposta imune. Breve descrição dos desenhos
[0102] FIG. 1 mostra os resultados de detecção de SDS-PAGE do anticorpo bifuncional VP101. As amostras das quatro pistas da esquerda para a direita e suas respectivas quantidades de carga são: anticorpo em tampão de carga de eletroforese de proteína não reduzida, 1 µg; anticorpo em tampão de carga de eletroforese de proteína reduzida, 1 µg; Marcador, 5 μL; BSA, 1 µg.
[0103] FIG. 2 mostra os resultados de detecção de parâmetros cinéticos característicos da ligação do anticorpo VP101 a PD-1.
[0104] FIG. 3 mostra os resultados de detecção de parâmetros cinéticos característicos da ligação do anticorpo BsAbB7 a PD-1.
[0105] FIG. 4 mostra os resultados de detecção de parâmetros cinéticos característicos da ligação do anticorpo BsAbB8 a PD-1.
[0106] FIG. 5 mostra os resultados de detecção de parâmetros cinéticos característicos da ligação do anticorpo 14C12H1L1 a PD-1.
[0107] FIG. 6 mostra os resultados de detecção de parâmetros cinéticos característicos da ligação do anticorpo nivolumab a PD-1.
[0108] FIG. 7 mostra os resultados de detecção de parâmetros cinéticos característicos da ligação do anticorpo VP101 a VEGF.
[0109] FIG. 8 mostra os resultados de detecção de parâmetros cinéticos característicos da ligação do anticorpo BsAbB7 a VEGF.
[0110] FIG. 9 mostra os resultados de detecção de parâmetros cinéticos característicos da ligação do anticorpo BsAbB8 a VEGF.
[0111] FIG. 10 mostra os resultados de detecção de parâmetros cinéticos característicos da ligação do anticorpo bevacizumab ao VEGF.
[0112] FIG. 11 mostra a atividade de ligação do anticorpo VP101 a VEGFA detectada por ELISA indireto.
[0113] FIG. 12 mostra as respectivas atividades de ligação dos anticorpos VP101, BsAbB7, BsAbB8 e bevacizumab a VEGFA- his detectados por ELISA indireto.
[0114] FIG. 13 mostra a atividade de ligação do anticorpo VP101 a PD-1 detectada por ELISA indireto.
[0115] FIG. 14 mostra as respectivas atividades de ligação dos anticorpos VP101, BsAbB7, BsAbB8, 14C12H1L1 e nivolumab a PD-1 detectados por ELISA indireto.
[0116] FIG. 15 mostra a atividade do anticorpo VP101 na competição com VEGFR2 pela ligação a VEGFA detectada por ELISA competitivo.
[0117] FIG. 16 mostra a atividade do anticorpo VP101 na competição com PD-L1 pela ligação a PD-1 detectada por ELISA competitivo.
[0118] FIG. 17 mostra a EC50 de ligação dos anticorpos 14C12H1L1 e VP101 à proteína PD-1 da superfície celular 293T- PD-1 detectada por FACS.
[0119] FIG. 18 mostra a EC50 de ligação dos anticorpos VP101, BsAbB7 e BsAbB8 à proteína PD-1 da superfície celular 293T-PD-1 detectada por FACS.
[0120] FIG. 19 mostra a atividade dos anticorpos VP101 e 14C12H1L1 na competição com PD-L1 pela ligação à proteína de superfície celular PD-1 293T-PD-1 detectada por FACS.
[0121] FIG. 20 mostra a atividade dos anticorpos 14C12H1L1, VP101, BsAbB7, BsAbB8, 14C12H1L e nivolumab na competição com PD-L1 pela ligação à proteína de superfície celular 293T-PD-1
PD-1 detectada por FACS.
[0122] FIG. 21 mostra a bioatividade de neutralização dos anticorpos VP101, BsAbB7 e BsAbB8 no bloqueio de VEGF para ativar a via de sinalização de NFAT.
[0123] FIGO. 22 mostra o efeito de bevacizumab e VP101 na proliferação de células HUVEC.
[0124] FIG. 23 mostra o efeito de VP101 na secreção de IFN- γ em sistema de cultura misto de células DC e PBMC.
[0125] FIG. 24 mostra o efeito de VP101, BsAbB7 e BsAbB8 na secreção de IFN-γ em sistema de cultura misto de células DC e PBMC.
[0126] FIG. 25 mostra o efeito de VP101, BsAbB7 e BsAbB8 na secreção de IL-2 em sistema de cultura misto de células DC e PBMC.
[0127] FIG. 26 mostra o efeito dos anticorpos 14C12H1L1 e VP101 na secreção da citocina IL-2 induzida por cultura mista de células PBMC e Raji-PD-L1 detectadas por ELISA.
[0128] FIG. 27 mostra o efeito dos anticorpos 14C12H1L1 e VP101 na secreção da citocina IFN-γ induzida por cultura mista de células PBMC e Raji-PD-L1 detectadas por ELISA.
[0129] FIG. 28 mostra o efeito dos anticorpos 14C12H1L1, VP101, BsAbB7 e BsAbB8 na secreção da citocina IFN-γ induzida por cultura mista de células PBMC e Raji-PD-L1 detectadas por ELISA.
[0130] FIG. 29 mostra o efeito dos anticorpos 14C12H1L1, VP101, BsAbB7 e BsAbB8 na secreção da citocina IL-2 induzida por cultura mista de células PBMC e Raji-PD-L1 detectadas por ELISA.
[0131] FIG. 30 mostra a inibição do crescimento do tumor por VP101 em diferentes concentrações.
[0132] FIG. 31 mostra o efeito de VP101 em diferentes concentrações no peso corporal de camundongo. Descrição detalhada da invenção
[0133] As concretizações da presente invenção serão descritas em detalhes abaixo com referência aos exemplos. Os versados na técnica entenderão que os exemplos a seguir são usados apenas para ilustrar a presente invenção e não devem ser considerados como limitantes do escopo da presente invenção. Os casos sem as descrições específicas de técnicas ou condições foram realizados de acordo com as tecnologias ou condições descritas na literatura na técnica (por exemplo, ver Guia para Experimentos de Clonagem Molecular, de autoria de J. Sambrook et al., E traduzido por Huang Peitang et al., Terceira edição, Science Press) ou de acordo com o manual do produto. Os reagentes ou instrumentos usados são todos produtos convencionais disponíveis no mercado, se os seus fabricantes não forem especificados.
[0134] Nos seguintes exemplos da presente invenção, o anticorpo comercializado bevacizumab (nome comercial Avastin®) para o mesmo alvo foi adquirido da Roche como um anticorpo de controle ou foi preparado de acordo com o Exemplo de Preparação 4.
[0135] Nos exemplos seguintes da presente invenção, o anticorpo comercializado nivolumab para o mesmo alvo (nome comercial Opdivo®) foi adquirido da BMS como um anticorpo de controle.
[0136] Nos exemplos seguintes da presente invenção, as sequências de aminoácidos dos anticorpos de controle BsAbB7 e BsAbB8 eram idênticas às sequências de aminoácidos de BsAbB7 e BsAbB8 respectivamente na Publicação de Patente Chinesa
CN105175545A. Exemplo de preparação 1: Preparação de proteínas de fusão PD- 1-mFc, PD-1-hFc e PD-L1-hFc
[0137] A preparação das proteínas de fusão PD-1-mFc, PD-1- hFc e PD-L1-hFc e a detecção de eletroforese SDS-PAGE são realizadas por referência completa ao Exemplo de Preparação 1 da Publicação de Patente Chinesa CN106632674A.
[0138] As sequências de aminoácidos e as sequências de nucleotídeos codificantes das proteínas de fusão PD-1-mFc, PD-1-hFc e PD-L1-hFc neste exemplo de preparação são as mesmas de PD-1-mFc, PD-1- hFc e PDL-1-hFc respectivamente no Exemplo de Preparação 1 da Publicação de Patente Chinesa CN106632674A.
[0139] As proteínas de fusão PD-1-mFc, PD-1-hFc e PD-L1-hFc foram assim obtidas. Exemplo de Preparação 2: Expressão e Purificação da Proteína de Fusão VEGFA-His
1. Construção do plasmídeo VEGFA-His
[0140] A amplificação por PCR foi realizada usando cDNA humano de VEGFA (adquirido em Origene) como molde e o fragmento de hVEGFA-His foi purificado e isolado usando um kit de purificação de produto de DNA comum. O fragmento de hVEGFA-His isolado e um vetor de expressão pcDNA3.1 foram digeridos por enzima com XbaI & HindIII-HF e um fragmento do gene alvo foi isolado por extração em gel e ligado a um vetor de expressão linear por ligase de T4. Em seguida, todos os produtos de ligação foram transformados em células DH5a quimicamente competentes e revestidos em uma placa de ágar com Amp. Colônias únicas bem separadas foram selecionadas para identificação por PCR de colônia, clones positivos para
PCR foram inoculados em um meio de cultura LB para cultura e uma solução de bactérias foi retirada e enviada para Guangzhou Invitrogen Biotechnology para verificação de sequenciamento. O alinhamento dos resultados do sequenciamento mostrou que a sequência de inserção do recon positivo estava totalmente correta.
[0141] 2. Expressão e purificação da proteína de fusão VEGFA-His Após o plasmídeo recombinante VEGFA-his ter sido transfectado em células 293F (adquirido na Invitrogen) por 7 dias de acordo com o manual no kit de transfecção de lipofectamina (adquirido na Invitrogen), o meio de cultura foi submetido a centrifugação de alta velocidade, concentração de sobrenadante e troca de tampão em Tampão de ligação A e, em seguida, carregados em uma coluna HisTrap, e as proteínas foram eluídas linearmente com tampão de eluição A. A amostra primária pura foi submetida a troca de tampão em tampão de ligação B com uma coluna de dessalinização HiTrap e carregada em uma coluna HiTrap Q, proteínas foram eluídos linearmente com tampão de eluição B e a amostra alvo foi isolada e o tampão trocado por PBS. A amostra purificada foi adicionada a um tampão de carga de eletroforese de proteína reduzida para detecção de eletroforese SDS-PAGE.
[0142] A proteína de fusão VEGFA-His foi assim obtida.
[0143] A sequência de aminoácidos de VEGFA-His é a seguinte (171 aa):
APMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCC
NDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQENPCGPCSE RRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRRHHHHHH (SEQ ID NO: 1)
sendo que, a parte sublinhada é a sequência de aminoácidos de VEGFA.
[0144] Sequência de nucleotídeos que codifica VEGFA-His (513 bp)
GCACCCATGGCCGAGGGCGGCGGCCAGAACCACCACGAGGTGGTGAAGTTCATGGACGTGT ACCAGAGAAGCTACTGCCACCCCATCGAGACCCTGGTGGACATCTTCCAGGAGTACCCCGA CGAGATCGAGTACATCTTCAAGCCCAGCTGCGTGCCCCTGATGAGATGCGGCGGCTGCTGC AACGACGAGGGCCTGGAGTGCGTGCCCACCGAGGAGAGCAACATCACCATGCAGATCATGA GAATCAAGCCCCACCAGGGCCAGCACATCGGCGAGATGAGCTTCCTGCAGCACAACAAGTG CGAGTGCAGACCCAAGAAGGACAGAGCCAGACAGGAGAACCCCTGCGGCCCCTGCAGCGAG AGAAGAAAGCACCTGTTCGTGCAGGACCCCCAGACCTGCAAGTGCAGCTGCAAGAACACCG
ACAGCAGATGCAAGGCCAGACAGCTGGAGCTGAACGAGAGAACCTGCAGATGCGACAAGCC CAGAAGACATCATCACCATCACCAC (SEQ ID NO: 2) Exemplo de preparação 3: Expressão e purificação da proteína de fusão VEGFR2-hFc
1. Síntese do gene VEGFR2-hFc:
[0145] Os aminoácidos correspondentes ao fragmento extracelular VEGFR2 ECD do gene VEGFR2 (Receptor 2 do fator de crescimento endotelial vascular, NCBI GenBank: NP_002244) foram fundidos com TEV e o fragmento de proteína Fc de IgG humana (hFc), respectivamente (SEQ ID NO: 3). A Genscript foi encarregada de sintetizar a sequência de nucleotídeos de codificação correspondente (SEQ ID NO: 4).
[0146] VEGFR2, Receptor 2 do Fator de Crescimento Endotelial Vascular, NCBI GenBank NP_002244; hFc: região C da cadeia de Ig gama-1, ACESSÃO: P01857, 106- 330;
[0147] Sequência de aminoácidos da proteína de fusão VEGFR2-hFc: (998 aa)
MQSKVLLAVALWLCVETRAASVGLPSVSLDLPRLSIQKDILTIKANTTLQITCRGQRDLDW LWPNNQSGSEQRVEVTECSDGLFCKTLTIPKVIGNDTGAYKCFYRETDLASVIYVYVQDYR SPFIASVSDQHGVVYITENKNKTVVIPCLGSISNLNVSLCARYPEKRFVPDGNRISWDSKK GFTIPSYMISYAGMVFCEAKINDESYQSIMYIVVVVGYRIYDVVLSPSHGIELSVGEKLVL NCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLY TCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKPFVAFGSGMESLVEATVGERVRIPAKYLGYPPPEIKWYK NGIPLESNHTIKAGHVLTIMEVSERDTGNYTVILTNPISKEKQSHVVSLVVYVPPQIGEKS LISPVDSYQYGTTQTLTCTVYAIPPPHHIHWYWQLEEECANEPSQAVSVTNPYPCEEWRSV EDFQGGNKIEVNKNQFALIEGKNKTVSTLVIQAANVSALYKCEAVNKVGRGERVISFHVTR GPEITLQPDMQPTEQESVSLWCTADRSTFENLTWYKLGPQPLPIHVGELPTPVCKNLDTLW KLNATMFSNSTNDILIMELKNASLQDQGDYVCLAQDRKTKKRHCVVRQLTVLERVAPTITG NLENQTTSIGESIEVSCTASGNPPPQIMWFKDNETLVEDSGIVLKDGNRNLTIRRVRKEDE GLYTCQACSVLGCAKVEAFFIIEGAQEKTNLESRENLYFQGTHTCPPCPAPELLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS
LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (S EQ ID NO: 3） sendo que, a parte sublinhada ondulada é a parte ECD de VEGFR2, a parte emoldurada é o local de digestão da enzima TEV e a parte sublinhada sólida é a parte hFc.
[0148] Sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão VEGFR2-hFc: (2997 bp)
ATGCAGAGCAAGGTGCTGCTGGCCGTCGCCCTGTGGCTCTGCGTGGAGACCCGGGCCGCCT CTGTGGGTTTGCCTAGTGTTTCTCTTGATCTGCCCAGGCTCAGCATACAAAAAGACATACT TACAATTAAGGCTAATACAACTCTTCAAATTACTTGCAGGGGACAGAGGGACTTGGACTGG CTTTGGCCCAATAATCAGAGTGGCAGTGAGCAAAGGGTGGAGGTGACTGAGTGCAGCGATG GCCTCTTCTGTAAGACACTCACAATTCCAAAAGTGATCGGAAATGACACTGGAGCCTACAA GTGCTTCTACCGGGAAACTGACTTGGCCTCGGTCATTTATGTCTATGTTCAAGATTACAGA TCTCCATTTATTGCTTCTGTTAGTGACCAACATGGAGTCGTGTACATTACTGAGAACAAAA ACAAAACTGTGGTGATTCCATGTCTCGGGTCCATTTCAAATCTCAACGTGTCACTTTGTGC AAGATACCCAGAAAAGAGATTTGTTCCTGATGGTAACAGAATTTCCTGGGACAGCAAGAAG GGCTTTACTATTCCCAGCTACATGATCAGCTATGCTGGCATGGTCTTCTGTGAAGCAAAAA TTAATGATGAAAGTTACCAGTCTATTATGTACATAGTTGTCGTTGTAGGGTATAGGATTTA TGATGTGGTTCTGAGTCCGTCTCATGGAATTGAACTATCTGTTGGAGAAAAGCTTGTCTTA AATTGTACAGCAAGAACTGAACTAAATGTGGGGATTGACTTCAACTGGGAATACCCTTCTT CGAAGCATCAGCATAAGAAACTTGTAAACCGAGACCTAAAAACCCAGTCTGGGAGTGAGAT GAAGAAATTTTTGAGCACCTTAACTATAGATGGTGTAACCCGGAGTGACCAAGGATTGTAC ACCTGTGCAGCATCCAGTGGGCTGATGACCAAGAAGAACAGCACATTTGTCAGGGTCCATG AAAAACCTTTTGTTGCTTTTGGAA GTGGCATGGAATCTCTGGTGGAAGCCACGGTGGGGGAGCGTGTCAGAATCCCTGCGAAGTA CCTTGGTTACCCACCCCCAGAAATAAAATGGTATAAAAATGGAATACCCCTTGAGTCCAAT CACACAATTAAAGCGGGGCATGTACTGACGATTATGGAAGTGAGTGAAAGAGACACAGGAA ATTACACTGTCATCCTTACCAATCCCATTTCAAAGGAGAAGCAGAGCCATGTGGTCTCTCT GGTTGTGTATGTCCCACCCCAGATTGGTGAGAAATCTCTAATCTCTCCTGTGGATTCCTAC CAGTACGGCACCACTCAAACGCTGACATGTACGGTCTATGCCATTCCTCCCCCGCATCACA TCCACTGGTATTGGCAGTTGGAGGAAGAGTGCGCCAACGAGCCCAGCCAAGCTGTCTCAGT GACAAACCCATACCCTTGTGAAGAATGGAGAAGTGTGGAGGACTTCCAGGGAGGAAATAAA ATTGAAGTTAATAAAAATCAATTTGCTCTAATTGAAGGAAAAAACAAAACTGTAAGTACCC TTGTTATCCAAGCGGCAAATGTGTCAGCTTTGTACAAATGTGAAGCGGTCAACAAAGTCGG GAGAGGAGAGAGGGTGATCTCCTTCCACGTGACCAGGGGTCCTGAAATTACTTTGCAACCT GACATGCAGCCCACTGAGCAGGAGAGCGTGTCTTTGTGGTGCACTGCAGACAGATCTACGT TTGAGAACCTCACATGGTACAAGCTTGGCCCACAGCCTCTGCCAATCCATGTGGGAGAGTT GCCCACACCTGTTTGCAAGAACTTGGATACTCTTTGGAAATTGAATGCCACCATGTTCTCT AATAGCACAAATGACATTTTGATCATGGAGCTTAAGAATGCATCCTTGCAGGACCAAGGAG ACTATGTCTGCCTTGCTCAAGACAGGAAGACCAAGAAAAGACATTGCGTGGTCAGGCAGCT CACAGTCCTAGAGCGTGTGGCACC CACGATCACAGGAAACCTGGAGAATCAGACGACAAGTATTGGGGAAAGCATCGAAGTCTCA TGCACGGCATCTGGGAATCCCCCTCCACAGATCATGTGGTTTAAAGATAATGAGACCCTTG TAGAAGACTCAGGCATTGTATTGAAGGATGGGAACCGGAACCTCACTATCCGCAGAGTGAG GAAGGAGGACGAAGGCCTCTACACCTGCCAGGCATGCAGTGTTCTTGGCTGTGCAAAAGTG GAGGCATTTTTCATAATAGAAGGTGCCCAGGAAAAGACGAACTTGGAATCTAGAGAAAACC TGTATTTTCAGGGCACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACC GTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAG GTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACG TGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCAC GTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTAC AAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCA AAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAA GAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAG TGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGTTGGACTCCG ACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAA
CGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC TCCCTGTCTCCCGGGAAATGA (S EQ ID NO: 4） sendo que, a parte sublinhada ondulada é a parte ECD de VEGFR2, a parte emoldurada é o local de digestão da enzima TEV e a parte sublinhada sólida é a parte hFc.
2. Construção do plasmídeo pUC57simple-VEGFR2-hFc:
[0149] O gene que codifica VEGFR2-hFc sintetizado por Genscript foi clonado em um vetor de expressão pUC57simple (fornecido por Genscript), e um plasmídeo pUC57simple-VEGFR2- hFc foi obtido.
3. Construção do plasmídeo recombinante pcDNA3.1-VEGFR2-hFc:
[0150] O plasmídeo pUC57simple-VEGFR2-hFc foi digerido por enzima (Xba I e BamH I), e o fragmento do gene de fusão VEGFR2-hFc isolado por eletroforese foi ligado ao vetor de expressão pcDNA3.1 (adquirido na Invitrogen) para dar pcDNA3.1-VEGFR2 -hFc, que foi transfectado em células competentes de E. coli DH5a (adquirido em TIANGEN); a transfecção e a cultura foram realizadas de acordo com o manual. As colônias de pcDNA3.1-VEGFR2-hFc positivas foram rastreadas, E. coli foi amplificada de acordo com um método convencional e um kit (adquirido na Tiangen Biotech (Beijing) Co., Ltd., DP103-03) foi então usado e O plasmídeo recombinante pcDNA3.1-VEGFR2-hFc foi extraído de acordo com o manual do kit.
4. Transfecção do plasmídeo recombinante pcDNA3.1-VEGFR2-hFc em células 293F
[0151] O plasmídeo recombinante pcDNA3.1-VEGFR2-hFc foi transfectado em células 293F (adquiridas da Invitrogen) de acordo com o kit de transfecção de lipofectamina (adquirido da Invitrogen).
5. Detecção de eletroforese SDS-PAGE da proteína VEGFR2-hFc
[0152] Após a transfecção do plasmídeo recombinante pcDNA3.1-VEGFR2-hFc em células 293F por 7 dias, o meio de cultura foi submetido a centrifugação de alta velocidade, filtração a vácuo de membrana microporosa e purificação em uma coluna Mabselect SuRe para obter uma amostra de proteína de fusão VEGFR2-hFc , e uma parte da amostra foi adicionada a um tampão de carga de eletroforese de proteína reduzida para detecção de eletroforese SDS-PAGE.
[0153] A proteína de fusão VEGFR2-hFc foi assim obtida. Exemplo de Preparação 4: Preparação de Anticorpo Anti-VEGFA Bevacizumab
[0154] A Publicação de Patente Chinesa CN1259962A é referida para as sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada e da região variável da cadeia leve do anticorpo monoclonal VEGFA comercializado Avastin (bevacizumab). A Genscript foi encarregada de sintetizar sequências de nucleotídeos que codificam a região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve.
[0155] Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de bevacizumab: (123 aa)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYA
ADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVS S （SEQ ID: 5）
[0156] Sequência de nucleotídeos que codifica a região variável da cadeia pesada de bevacizumab: (369 bp)
GAGGTGCAGCTGGTCGAGTCCGGGGGGGGGCTGGTGCAGCCAGGCGGGTCTCTGAGGCTGA GTTGCGCCGCTTCAGGGTACACCTTCACAAACTATGGAATGAATTGGGTGCGCCAGGCACC AGGAAAGGGACTGGAGTGGGTCGGCTGGATCAACACTTACACCGGGGAACCTACCTATGCA GCCGACTTTAAGCGGCGGTTCACCTTCAGCCTGGATACAAGCAAATCCACTGCCTACCTGC AGATGAACAGCCTGCGAGCTGAGGACACCGCAGTCTACTATTGTGCTAAATATCCCCACTA
CTATGGGAGCAGCCATTGGTATTTTGACGTGTGGGGGCAGGGGACTCTGGTGACAGTGAGC AGC (SEQ ID NO: 6)
[0157] Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve de bevacizumab: (107 aa)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIK （SEQ ID NO: 7
[0158] Sequência de nucleotídeos que codifica a região variável da cadeia leve de bevacizumab: (321 pb)
GATATTCAGATGACTCAGAGCCCCTCCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGGGTCACCA TCACATGCAGTGCTTCACAGGATATTTCCAACTACCTGAATTGGTATCAGCAGAAGCCAGG AAAAGCACCCAAGGTGCTGATCTACTTCACTAGCTCCCTGCACTCAGGAGTGCCAAGCCGG TTCAGCGGATCCGGATCTGGAACCGACTTTACTCTGACCATTTCTAGTCTGCAGCCTGAGG
ATTTCGCTACATACTATTGCCAGCAGTATTCTACCGTGCCATGGACATTTGGCCAGGGGAC TAAAGTCGAGATCAAG (SEQ ID NO: 8)
[0159] As regiões constantes da cadeia pesada foram todas da região C da cadeia Ig gama-1, ACESSÃO: P01857; as regiões constantes da cadeia leve eram todas da região C da cadeia kappa de Ig, ACESSÃO: P01834.
[0160] O cDNA da cadeia pesada e o cDNA da cadeia leve do bevacizumab foram clonados no vetor pcDNA3.1, e o plasmídeo de expressão recombinante do anticorpo bevacizumab foi obtido. O plasmídeo recombinante foi transfectado em células 293F. O meio de cultura de células 293F foi purificado e então detectado.
[0161] O anticorpo monoclonal anti-VEGFA Avastin (bevacizumab) foi assim obtido. Exemplo de preparação 5: Preparação e detecção de anticorpo humanizado anti-PD-1 14C12H1L1
[0162] A preparação foi realizada de acordo com os Exemplos 3-4 descritos na Publicação de Patente Chinesa CN106977602A.
[0163] As sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada e da região variável da cadeia leve do anticorpo humanizado 14C12H1L1 e a sequência de nucleotídeos que as codificam são também as mesmas que as descritas nos Exemplos 3-4 da Publicação de Patente Chinesa CN106977602A, e também são fornecidas aqui como segue:
[0164] Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo humanizado 14C12H1L1: (118 aa)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKGLDWVATISGGGRYTYYP DSVKGRFTISRDNSKNNLYLQMNSLRAEDTALYYCANRYGEAWFAYWGQGTLVTVSS （ SEQ ID NO: 9）
[0165] Sequência de nucleotídeos que codifica a região variável da cadeia pesada do anticorpo humanizado 14C12H1L1: (354 pb)
GAAGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGGGGAGGGCTGGTGCAGCCCGGCGGGTCACTGCGACTGA GCTGCGCAGCTTCCGGATTCGCCTTTAGCTCCTACGACATGTCCTGGGTGCGACAGGCACC AGGAAAGGGACTGGATTGGGTCGCTACTATCTCAGGAGGCGGGAGATACACCTACTATCCT GACAGCGTCAAGGGCCGGTTCACAATCTCTAGAGATAACAGTAAGAACAATCTGTATCTGC AGATGAACAGCCTGAGGGCTGAGGACACCGCACTGTACTATTGTGCCAACCGCTACGGGGA
AGCATGGTTTGCCTATTGGGGGCAGGGAACCCTGGTGACAGTCTCTAGT (SEQ ID NO: 10)
[0166] Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo humanizado 14C12H1L1: (107 aa)
DIQMTQSPSSMSASVGDRVTFTCRASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVSGVPSR FSGSGSGQDYTLTISSLQPEDMATYYYCLQYDEFPLTFGAGTKLELK （SEQ ID NO: 11）
[0167] Sequência de nucleotídeos que codifica a região variável da cadeia leve do anticorpo humanizado 14C12H1L1: (321 pb)
GACATTCAGATGACTCAGAGCCCCTCCTCCATGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGGGTCACCT TCACATGCCGCGCTAGTCAGGATATCAACACCTACCTGAGCTGGTTTCAGCAGAAGCCAGG GAAAAGCCCCAAGACACTGATCTACCGGGCTAATAGACTGGTGTCTGGAGTCCCAAGTCGG TTCAGTGGCTCAGGGAGCGGACAGGACTACACTCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCTGAGG
ACATGGCAACCTACTATTGCCTGCAGTATGATGAGTTCCCACTGACCTTTGGCGCCGGGAC AAAACTGGAGCTGAAG (SEQ ID NO: 12)
[0168] O anticorpo humanizado anti-PD-1 14C12H1L1 foi assim obtido. Exemplo de preparação 6: Preparação e identificação de hIgG
[0169] A sequência de IgG de lisozima de ovo de galinha humana (anti-HEL, isto é, IgG humana, abreviada como hIgG) é derivada de uma sequência de região variável da sequência Fab F10.6.6 na pesquisa publicada por Acierno et al., Que é intitulada "A maturação de afinidade aumenta a estabilidade e a plasticidade do domínio Fv de anticorpos anti-proteína" (Acierno et al., J Mol Biol. 2007; 374 (1): 130-46). O método de preparação é o seguinte:
[0170] Nanjing Genscript Biology foi encarregada de realizar a otimização de códons de aminoácidos e síntese de genes em genes de cadeia pesada e leve (sequência completa ou região variável) de anticorpos IgG humanos, e referindo-se às tecnologias padrão introduzidas no "Guia para Experimentos de Clonagem Molecular (Terceira edição) "e usando tecnologias de clonagem molecular padrão, como PCR, digestão enzimática, extração de gel de DNA, transformação de ligação, PCR de colônia ou identificação de digestão enzimática, os genes de cadeia pesada e leve foram respectivamente subclonados no vetor de expressão de cadeia pesada de anticorpo e anticorpo o vetor de expressão da cadeia leve do sistema de expressão de mamífero e os genes da cadeia pesada e leve do vetor de expressão recombinante foram posteriormente sequenciados e analisados. Após a sequência ter sido verificada como correta, os plasmídeos de expressão livres de endotoxina foram preparados em grande escala, e os plasmídeos das cadeias pesada e leve foram transitoriamente co-transfectados em células HEK293 para expressão do anticorpo recombinante. Após 7 dias de cultura, o meio de cultura de células foi coletado e purificado por afinidade usando uma coluna rProtein A (GE), e a qualidade da amostra de anticorpo resultante foi determinada usando SDS-PAGE e técnicas de análise padrão SEC-HPLC.
[0171] O hIgG foi assim obtido e utilizado nos Exemplos 8-9 abaixo. Exemplo 1: Projeto de Sequência, Preparação e Detecção de Cadeias Pesadas e Leves do Anticorpo Bifuncional VP101
1. Projeto de sequência
[0172] A estrutura do anticorpo bifuncional VP101 da presente invenção está na forma Morrison (IgG-scFv), ou seja, terminais C de duas cadeias pesadas de um anticorpo IgG estão cada um ligado a um fragmento scFv de outro anticorpo, e o design da composição principal das cadeias pesada e leve é como mostrado na Tabela 1 abaixo. Tabela 1: Projeto de composição das cadeias pesadas e leves de VP101 Anticorpo Cadeia pesada Cadeia bifunciona Parte Fragmento Parte scFv leve l No. IgG ligante VP101 Bevacizu Linker1 14C12H1V- Bevaci mab-H Linker1- zumab- 14C12L1V L Na Tabela 1 acima:
[0173] (1) Aqueles com "V" marcado no canto inferior direito referem-se à região variável da cadeia pesada correspondente ou à região variável da cadeia leve correspondente. Para aqueles sem rótulo "V", a cadeia pesada ou leve correspondente é o comprimento total compreendendo a região constante. As sequências correspondentes descritas nos exemplos de preparação acima são referidas para as sequências de aminoácidos destas regiões variáveis ou o comprimento total e as sequências de nucleotídeos que as codificam.
[0174] (2) A sequência de aminoácidos do ligante 1 é GGGGSGGGGSGG GGSGGGGS (SEQ ID NO: 13)
2. Expressão e purificação do anticorpo VP101
[0175] A sequência de cDNA de cadeia pesada e a sequência de cDNA de cadeia leve de VP101 foram cada uma clonadas no vetor pUC57simple (fornecido por Genscript) para obter os plasmídeos pUC57simple-VP101H e pUC57simple-VP101L, respectivamente.
[0176] Os plasmídeos pUC57simple-VP101H e pUC57simple- VP101L foram digeridos por enzima (HindIII e EcoRI) e as cadeias pesadas e leves isoladas por eletroforese foram subclonadas no vetor pcDNA3.1 e os plasmídeos recombinantes foram extraídos para co-transfectar células 293F. Após 7 dias de cultura de células, o meio de cultura foi centrifugado em alta velocidade e o sobrenadante foi concentrado e carregado em uma coluna HiTrap MabSelect SuRe. A proteína foi ainda eluída em uma etapa com tampão de eluição, e o anticorpo da amostra alvo VP101 foi isolado e o tampão trocado por PBS.
2. Detecção de anticorpo VP101
[0177] A amostra purificada foi adicionada a um tampão de carga de eletroforese de proteína reduzida e a um tampão de carga de eletroforese de proteína não reduzida e, em seguida, fervida para detecção de eletroforese SDS-PAGE. O eletroferograma de VP101 é mostrado na FIG. 1. A proteína alvo da amostra de proteína reduzida está em 75 kD e 25 kD, e a proteína alvo da amostra de proteína não reduzida (anticorpo único) está em 200 kD.
[0178] A menos que especificado de outra forma, o anticorpo humanizado VP101 usado nas seguintes experiências foi preparado pelo método deste exemplo. Exemplo 2: Detecção de Parâmetros Cinéticos do Anticorpo VP101 Humanizado
1. Detecção de parâmetros cinéticos da ligação do anticorpo humanizado VP101 a PD-1-mFc
[0179] O tampão de diluição da amostra era PBS (0,02% Tween-20, 0,1% BSA, pH 7,4). O anticorpo a 5 μg/mL foi imobilizado em um sensor AHC com a altura de imobilização de cerca de 0,4 nM. O sensor foi equilibrado em um tampão por 60 s, e o anticorpo imobilizado ao sensor ligado a PD-1-mFc a uma concentração de 0,62-50 nM (diluição de gradiente de três vezes) por 120 s, e então o antígeno e o anticorpo dissociado no tampão por 300 s. Os dados foram analisados por ajuste de modelo 1: 1 para obter constantes de afinidade. O software de aquisição de dados foi Fortebio Data Acquisition 7.0, e o software de análise de dados foi Fortebio Data Analysis 7.0. Os parâmetros cinéticos da ligação dos anticorpos VP101, BsAbB7, BsAbB8, 14C12H1L1 e o anticorpo de controle nivolumab a PD-1-mFc são mostrados na Tabela 2 e os resultados de detecção dos parâmetros de característica cinética são mostrados na FIG. 2, FIG. 3, FIG. 4, FIG. 5 e FIG. 6, respectivamente. Tabela 2: Parâmetros cinéticos da ligação do anticorpo humanizado VP101, BsAbB7, BsAbB8, 14C12H1L1 e o anticorpo de controle nivolumab a PD-1-mFc Kon S E Kdis Amostra ID KD (M) S E (kdis) Rmax (nm) (1/Ms) (kon) (1/s) VP101 1,68E-10 3,22E+05 1,44E+04 5,40E-05 3,16E-05 0,14-0,28 BsAbB7 1,62E-10 3,27E+05 2,60E+04 5,30E-05 6,24E-05 0,01-0,11 BsAbB8 4,06E-10 3,39E+05 2,04E+04 1,37E-04 4,61E-05 0,01-0,13 14C12H1L1 1,64E-10 4,55E+05 1,61E+04 7,47E-05 2,98E-05 0,24-0,28 Nivolumab 2,32E-10 5,85E+05 2,03E+04 1,36E-04 3,47E-05 0,02-0,14 KD é uma constante de afinidade; kon é a taxa de ligação do antígeno e do anticorpo; kdis é a taxa de dissociação de antígeno e anticorpo; KD = kdis/kon.
[0180] Os resultados mostram que os anticorpos VP101 e BsAbB7 são equivalentes em termos de afinidade para PD-1-mFc; a constante de afinidade de VP101 para PD-1-mFc é significativamente menor do que a de BsAbB8, sugerindo que VP101 tem melhor atividade de ligação; a constante de taxa de dissociação para VP101 e PD-1-mFc foi significativamente menor do que BsAbB8 e 14C12H1L1, sugerindo que VP101 se liga ao antígeno de forma mais estável com uma taxa de dissociação mais lenta do que a de 14C12H1L1 e BsAbB8.
2. Detecção de parâmetros cinéticos da ligação do anticorpo humanizado VP101 a VEGF-His
[0181] O tampão de diluição da amostra era PBS (0,02% Tween-20, 0,1% BSA, pH 7,4). 1 μg/mL VEGF-His foi imobilizado no sensor HIS1K por 20 s, então o sensor foi equilibrado em um tampão por 60 s, e o VEGF imobilizado no sensor ligado ao anticorpo a uma concentração de 12,34-1000 nM (três diluição de gradiente de duas vezes) por 120 s e, em seguida, o antígeno e o anticorpo se dissociam no tampão por 300 s. Os dados foram analisados por ajuste de modelo 1:1 para obter constantes de afinidade. O software de aquisição de dados foi Fortebio Data Acquisition 7.0, e o software de análise de dados foi Fortebio Data Analysis 7.0.
[0182] Os parâmetros cinéticos da ligação dos anticorpos VP101, BsAbB7, BsAbB8 e o anticorpo de controle bevacizumab a VEGF-His são mostrados na Tabela 3, e os resultados de detecção dos parâmetros cinéticos característicos são mostrados na FIG. 7, FIG. 8, FIG. 9 e FIG. 10 respectivamente. Tabela 3: Parâmetros cinéticos da ligação dos anticorpos VP101, BsAbB7, BsAbB8 e o anticorpo de controle bevacizumab a VEGF-His Kon S E Kdis S E Amostra ID KD (M) Rmax (nm) (1/Ms) (kon) (1/s) (kdis) VP101 5,21E-10 1,55E+05 9,67E+03 8,05E-05 4,66E-05 0,39-0,60 BsAbB7 5,14E-10 1,57E+05 9,67E+03 8,05E-05 4,83E-05 0,36-0,53 BsAbB8 6,33E-10 1,71E+05 1,07E+04 1,08E-04 4,64E-05 0,39-0,56 Bevacizumab 7,24E-10 1,23E+05 7,09E+03 8,90E-05 4,53E-05 0,29-0,41
[0183] Os resultados mostram que os anticorpos VP101 e BsAbB7 são equivalentes em termos de afinidade para o antígeno, e a constante de afinidade de VP101 é significativamente menor do que a de BsAbB8 e o anticorpo de controle bevacizumab, sugerindo que VP101 tem melhor atividade de ligação; a constante de taxa de dissociação de VP101 para VEGF-His é significativamente menor do que a de BsAbB8, sugerindo que VP101 se liga ao antígeno de forma mais estável com uma taxa de dissociação mais lenta do que a de BsAbB8. Exemplo 3: Detecção da atividade de ligação do anticorpo VP101 ao antígeno por ELISA
1. Detecção da atividade de ligação do anticorpo VP101 ao antígeno VEGFA-his por ELISA indireto O método é especificado da seguinte forma:
[0184] A microplaca foi revestida com VEGFA-His e incubada a 37°C durante 2 horas. Após a lavagem, a microplaca foi bloqueada com BSA 1% por 2 horas. Depois de lavada, a microplaca foi adicionada com o anticorpo diluído gradativamente e incubada a 37°C por 30 minutos. Depois de lavada, a microplaca foi adicionada com a solução de trabalho de anticorpo secundário IgG anti-humano de cabra marcada com enzima e incubada por 30 minutos a 37 ° C. Depois de lavada, a microplaca foi adicionada com solução cromogênica TMB para o desenvolvimento da cor por 5 minutos na ausência de luz, e então a solução de parada foi adicionada para encerrar a reação cromogênica. Em seguida, a microplaca foi colocada em um leitor de microplaca imediatamente, e o valor de OD de cada poço na microplaca foi lido a 450 nm. SoftMax Pro 6.2.1 foi usado para analisar e processar os dados.
[0185] O resultado da detecção da ligação do anticorpo VP101 ao antígeno VEGFA-His é mostrado na FIG. 11. As intensidades de absorvância em cada dose são mostradas na Tabela 4. O EC50 de ligação do anticorpo foi calculado por ajuste de curva usando a concentração de anticorpo como a abcissa e o valor de absorvância como a ordenada, e os resultados são mostrados na Tabela 4 abaixo. Tabela 4: Ligação de anticorpo bifuncional a VEGFA-his (ELISA indireto) Concentração de Revestimento: VEGFA-His (1 μg/mL) anticorpo (μg/mL) VP101 Bevacizumab 1,0000 3,045 2,943 2,798 2,974 0,3333 3,037 2,861 2,816 2,993 0,1111 2,901 2,689 2,653 2,700 0,0370 2,597 2,460 2,445 2,555 0,0123 2,013 1,914 1,998 2,074 0,0041 1,115 1,086 1,446 1,363 0,0014 0,524 0,496 0,640 0,729 0,0000 0,099 0,091 0,094 0,083 Anticorpo Anti-humano de cabra IgG (H+L), HRP secundário (1:5000) EC50(nM) 0,036 0,035
[0186] Os resultados mostram que o anticorpo VP101 é capaz de se ligar à proteína VEGFA de forma eficiente e sua eficiência de ligação é dependente da dose, e os dois anticorpos são equivalentes em termos de atividade de ligação ao VEGFA humano.
2. Detecção das respectivas atividades de ligação dos anticorpos VP101, BsAbB7 e BsAbB8 ao antígeno VEGFA-His por ELISA indireto O método é especificado da seguinte forma:
[0187] A microplaca foi revestida com VEGFA-His e incubada durante a noite a 4°C. Depois de lavada, a microplaca foi bloqueada com BSA a 1% (dissolvido em PBS) por 2 horas. Depois de lavada, a microplaca foi adicionada com o anticorpo diluído gradativamente e incubada a 37°C por 30 minutos. Depois de ser lavada, a microplaca foi adicionada com a solução de trabalho de cabra anti-IgG Fc humana marcada com peroxidase (Jackson, 109-035-098) e incubada durante 30 minutos a 37 ° C. Depois de lavada, a microplaca foi adicionada com TMB (Neogen, 308177) para o desenvolvimento da cor por 5 minutos na ausência de luz e, em seguida, a solução de parada foi adicionada para encerrar a reação cromogênica. Em seguida, a microplaca foi colocada em um leitor de microplaca imediatamente, e o valor de OD de cada poço na microplaca foi lido a 450 nm. SoftMax Pro 6.2.1 foi usado para analisar e processar os dados.
[0188] O resultado da ligação do anticorpo VP101 ao antígeno VEGFA-His é mostrado na FIG. 12. As intensidades de absorvância em cada dose são mostradas na Tabela 5. O EC50 de ligação do anticorpo foi calculado por ajuste de curva usando a concentração de anticorpo como a abcissa e o valor de absorvância como a ordenada, e os resultados são mostrados na Tabela 5 abaixo. Tabela 5: Atividades de ligação respectivas de VP101, BsAbB7, BsAbB8 e bevacizumab a VEGFA-His (ELISA indireto) Antibody coating: VEGFA-His 1 μg/mL Concentração de anticorpo (μg/mL) VP101 BsAbB7 BsAbB8 Bevacizumab 1,000 3,112 3,090 3,074 3,081 3,070 3,093 3,137 3,138 0,333 3,026 2,961 2,954 2,941 2,946 2,968 3,075 3,086 0,111 2,802 2,684 2,575 2,621 2,631 2,618 2,965 2,999 0,037 1,972 1,876 1,656 1,668 1,756 1,709 2,504 2,503 0,012 0,994 0,915 0,754 0,764 0,809 0,814 1,476 1,454 0,004 0,436 0,391 0,317 0,332 0,347 0,339 0,711 0,700 0,001 0,197 0,177 0,151 0,155 0,159 0,155 0,318 0,311 0 0,083 0,063 0,086 0,076 0,095 0,072 0,066 0,064 Fc de IgG anti-humano de cabra marcado com Anticorpo secundário peroxidase de rábano, HRP (1: 5000) EC50(nM) 0,130 0,171 0,159 0,092
[0189] Os resultados mostram que os anticorpos VP101, BsAbB7, BsAbB8 e bevacizumab podem se ligar à proteína VEGF de forma eficiente e sua eficiência de ligação é dependente da dose, e o anticorpo VP101 tem uma atividade de ligação mais alta ao VEGF humano do que BsAbB7 e BsAbB8.
3. Detecção da atividade de ligação do anticorpo VP101 ao antígeno PD-1 por ELISA indireto O método é especificado da seguinte forma:
[0190] A microplaca foi revestida com PD-1-mFc humano e incubada durante a noite a 4°C. Depois de ser bloqueada com BSA 1% a 37°C por 2 horas, a microplaca foi adicionada com o anticorpo, e então incubada a 37°C por 30 minutos. Depois que a microplaca foi lavada e seca, o anticorpo secundário de cabra anti-IgG humana (H + L) marcado com HRP (Jackson, 109- 035-088) foi adicionado e a microplaca foi incubada a 37°C por 30 minutos. Depois que a microplaca foi lavada e seca, TMB (Neogen, 308177) foi adicionado para o desenvolvimento da cor por 5 minutos, e então a solução de parada foi adicionada para encerrar o desenvolvimento da cor. Em seguida, a microplaca foi colocada em um leitor de microplaca imediatamente, e o valor de OD de cada poço na microplaca foi lido a 450 nm. SoftMax Pro 6.2.1 foi usado para analisar e processar os dados.
[0191] O resultado da detecção da ligação do anticorpo VP101 ao antígeno PD-1 é mostrado na FIG. 13. As intensidades de absorvância em cada dose são mostradas na Tabela 6. Por análise quantitativa do anticorpo VP101 ligado, a simulação da curva foi realizada para obter a EC50 de eficiência de ligação do anticorpo, que é mostrada na Tabela 6 abaixo.
Tabela 6: Ligação de anticorpo bifuncional a PD-1 (ELISA indireto) Revestimento do anticorpo: PD-1- Gradiente de diluição mFc 0.5 μg/mL de anticorpo VP101 Nivolumab 14C12H1L1 0,33μg/ml 3,109 3,063 3,137 3,130 3,298 3,278 1:3 3,016 2,926 3,139 3,140 3,245 3,352 1:9 2,461 2,513 2,802 2,758 3,104 3,155 1:27 1,638 1,675 1,949 1,810 2,352 2,549 1:81 0,787 0,791 0,933 0,990 1,382 1,421 1:243 0,301 0,656 0,348 0,375 0,612 0,596 1:729 0,136 0,145 0,159 0,162 0,253 0,247 0 0,068 0,056 0,053 0,053 0,053 0,053 EC50(nM) 0,06 0.061 0,037
[0192] Os resultados mostram que o anticorpo VP101 é capaz de se ligar à proteína PD-1 de forma eficiente e sua eficiência de ligação é dependente da dose.
4. Detecção das respectivas atividades de ligação dos anticorpos VP101, BsAbB7 e BsAbB8 ao antígeno PD-1 por ELISA indireto O método é especificado da seguinte forma:
[0193] A microplaca foi revestida com PD-1-mFc humano e incubada durante a noite a 4°C. Depois de ser bloqueada com BSA 1% a 37°C por 2 horas, a microplaca foi adicionada com o anticorpo, e então incubada a 37°C por 30 minutos. Após a microplaca ter sido lavada e seca, o anti-IgG Fc de cabra marcado com peroxidase de rábano (Jackson, 109-035-098) foi adicionado e a microplaca foi incubada a 37°C durante 30 minutos. Depois que a microplaca foi lavada e seca, TMB (Neogen, 308177) foi adicionado para o desenvolvimento da cor por 5 minutos, e então a solução de parada foi adicionada para encerrar o desenvolvimento da cor. Em seguida, a microplaca foi colocada em um leitor de microplaca imediatamente, e o valor de OD de cada poço na microplaca foi lido a 450 nm. SoftMax Pro 6.2.1 foi usado para analisar e processar os dados.
[0194] O resultado da detecção da ligação do anticorpo VP101 ao antígeno PD-1 é mostrado na FIG. 14. As intensidades de absorvância em cada dose são mostradas na Tabela 7. Por análise quantitativa do anticorpo VP101 ligado, a simulação da curva foi realizada para dar a EC50 de eficiência de ligação do anticorpo, que é mostrada na Tabela 7 abaixo. Tabela 7: Atividades de ligação respectivas dos anticorpos VP101, BsAbB7, BsAbB8, 14C12H1L1 e nivolumab para PD-1 (ELISA indireto) Concentração Revestimento antígeno: PD-1-mFc 0.5 μg/mL de anticorpo (μg/mL) VP101 BsAbB7 BsAbB8 14C12 H1L1 Nivolumab 0,333 2,717 2,709 2,732 2,755 2,716 2,715 2,947 2,966 2,8232,824 0,111 2,507 2,381 2,318 2,321 2,377 2,409 2,923 2,967 2,7472,758 0,037 1,709 1,616 1,491 1,457 1,522 1,549 2,656 2,694 2,2082,293 0,012 0,916 0,822 0,732 0,711 0,797 0,775 2,049 2,060 1,3481,389 0,004 0,413 0,394 0,333 0,321 0,368 0,351 1,139 1,132 0,6290,638 0,001 0,195 0,191 0,167 0,174 0,181 0,174 0,552 0,541 0,2950,295 0,000 0,140 0,123 0,110 0,103 0,117 0,118 0,254 0,248 0,1520,157 0,000 0,099 0,095 0,089 0,074 0,100 0,081 0,083 0,075 0,0780,084 Anticorpo Fc de IgG anti-humano de cabra marcado com peroxidase de secundário rábano, HRP (1: 5000) EC50(nM) 0,146 0,199 0,173 0,045 0,095
[0195] Os resultados mostram que o anticorpo VP101 pode se ligar à proteína PD-1 de forma eficiente e sua eficiência de ligação é dependente da dose, e o anticorpo VP101 tem uma maior atividade de ligação a PD-1 humana do que BsAbB7 e BsAbB8.
5. Detecção da atividade do anticorpo VP101 na competição com VEGFR2 pela ligação ao antígeno VEGFA por ELISA competitivo O método é especificamente o seguinte:
[0196] A microplaca foi revestida com VEGF-His e incubada a
37°C durante 2 horas. Após a lavagem, a microplaca foi bloqueada com BSA a 1% por 1 hora a 37°C. Depois de lavada, a microplaca foi adicionada com os anticorpos diluídos gradativamente e VEGFR2 ECD-mFc-bio humano (concentração final: 0,02 μg/mL) e incubada em temperatura ambiente por 2 horas. Depois de lavada, a microplaca foi adicionada com solução de trabalho de estreptavidina SA-HRP (1: 4000) marcada com HRP e incubada a 37°C por 30 minutos. Depois de lavada, a microplaca foi adicionada com solução cromogênica TMB para o desenvolvimento da cor por 5 minutos na ausência de luz, e então a solução de parada foi adicionada para encerrar a reação cromogênica. Em seguida, a microplaca foi colocada em um leitor de microplaca imediatamente, e o valor de OD de cada poço na microplaca foi lido a 450 nm. SoftMax Pro 6.2.1 foi usado para analisar e processar os dados.
[0197] Os resultados de detecção são mostrados na FIG 15. As intensidades de absorbância em cada dose são mostradas na Tabela 8. Por análise quantitativa das intensidades de absorbância dos anticorpos ligados, a simulação da curva foi realizada para dar a EC50 de eficiência de ligação dos anticorpos (Tabela 8)
Tabela 8: Detecção de anticorpo em competição com VEGFR2-mFc pela ligação ao antígeno VEGFA-His por ELISA competitivo Revestimento: VEGF-His (2 μg/mL) Concentração de VP101 Bevacizumab anticorpo (μg/mL) 10,000 0,133 0,133 0,103 0,104 3,333 0,161 0,149 0,114 0,109 1,111 0,624 0,563 0,374 0,351 0,370 1,055 1,051 0,905 0,982 0,123 1,059 1,075 0,964 1,049 0,041 1,137 1,068 1,062 1,141 0,014 1,106 1,138 1,010 1,169 0,000 1,155 1,131 1,173 1,153 Receptor VEGFR2 ECD-mFc-bio, 0.02μg/ml Anticorpo secundário SA-HRP（1:4000) EC50 (nM) 5.324 5.086
[0198] Os resultados mostram que o anticorpo VP101 pode se ligar efetivamente ao antígeno VEGFA e inibir a ligação de VEGFR2 a VEGFA, e sua eficiência na inibição da ligação de VEGFR2 a VEGFA é dependente da dose.
6. Detecção do anticorpo VP101 na competição com PD-L1 pela ligação ao antígeno PD-1 por ELISA competitivo O método é especificamente o seguinte:
[0199] A microplaca foi revestida com PD-1-hFc e incubada durante a noite a 4°C. Depois que a microplaca foi bloqueada com BSA a 1% por 2 horas, os anticorpos em diferentes concentrações foram cada um misturados com PD-L1-hFc por 10 minutos (ver Tabela 10 para as concentrações de diluição). Após incubação a 37°C durante 30 minutos, a microplaca foi lavada e seca. Em seguida, o anticorpo secundário marcado com enzima foi adicionado e a microplaca foi incubada a 37°C por 30 minutos. Depois que a microplaca foi lavada e seca, TMB foi adicionado para o desenvolvimento da cor por 5 minutos e,
em seguida, a solução de parada foi adicionada para encerrar o desenvolvimento da cor. Em seguida, a microplaca foi colocada em um leitor de microplaca imediatamente e o valor de OD de cada poço na microplaca foi lido a 450 nm (ver Tabela 10). SoftMax Pro 6.2.1 foi usado para analisar e processar os dados.
[0200] Os resultados de detecção são mostrados na FIG 16. As intensidades de absorvância em cada dose são mostradas na Tabela 9. Por análise quantitativa do anticorpo VP101 ligado, a simulação da curva foi realizada para dar a EC50 de eficiência de ligação do anticorpo (Tabela 9). Tabela 9: Detecção de anticorpo bifuncional competindo com PD-L1 pela ligação a PD-1 por ELISA competitivo Gradiente de diluição de Revestimento antígeno: PD-1-hFc 0.5 μg/mL anticorpo VP101 Nivolumab 14C12H1L1 5μg/ml 0,096 0,063 0,058 0,058 0,062 0,063 1:3 0,064 0,077 0,059 0,059 0,061 0,064 1:9 0,166 0,160 0,061 0,062 0,066 0,071 1:27 0,867 0,848 0,284 0,335 0,262 0,193 1:81 1,217 1,149 0,973 1,007 0,968 0,882 1:243 1,196 1,949 1,139 1,144 1,122 1,051 1:729 1,183 1,250 1,127 1,185 1,052 1,059 0 1,153 1,276 0,960 1,071 1,027 1,024 Receptor PD-L1-mFc 0.3μg/ml Anticorpo IgG anti-camundongo de cabra (H + L), secundário conjugado com HRP (1: 5000) EC50(nM) 1,216 0,842 0,745
[0201] Os resultados mostram que o anticorpo VP101 pode se ligar efetivamente ao antígeno PD-1 e inibir a ligação do ligante PD-L1 a PD-1, e sua eficiência na inibição da ligação de PD-L1 a PD-1 é dependente da dose. Exemplo 4: Ligação do anticorpo VP101 ao antígeno de superfície da membrana celular
Em primeiro lugar, as células 293T que expressam o antígeno PD-1 foram construídas e, em seguida, a capacidade de ligação específica do anticorpo ao antígeno de superfície da membrana celular foi analisada e verificada por citometria de fluxo.
1. Construção de células 293T que expressam o antígeno PD-1
[0202] O vetor pLenti6.3-PD-1 de PD-1 (o vetor pLenti6.3 foi adquirido da Invitrogen) foi transfectado em células 293T e as células do grupo de clones 293T-PD-1 que expressam PD-1 de forma estável foram obtidas por triagem.
2. Detecção de ligação de anticorpo ao antígeno de superfície celular
[0203] O antígeno que expressa 293T-PD-1 obtido na etapa anterior foi digerido com pancreatina por um método de digestão de pancreatina convencional e o número de células em cada tubo de coleta foi feito para ser 2 × 105. As soluções de diluição de anticorpos com concentração gradativamente diluída com PBSA (1% BSA) foram incubadas com células 293T- PD-1 em gelo por 2 horas e, em seguida, cada tubo foi adicionado com 100 μL de IgG anti-humano de cabra FITC (1:500) e incubado em gelo por 1 hora. Em seguida, o PBS foi usado para a lavagem e 300 μL de PBSA foram usados para ressuspender as células, e os sinais de fluorescência (MFI) foram detectados com o canal FITC em um citômetro de fluxo.
[0204] Os resultados são mostrados na figura. 17, e os valores de MFI em cada concentração são mostrados na Tabela
10. Por análise de quantificação de fluorescência e ajuste de curva do anticorpo 14C12H1L1 ligado, o EC50 de ligação do anticorpo VP101 foi calculado como sendo 3,5 nM.
Tabela 10: Análise da intensidade de fluorescência da ligação de VP101 ao antígeno de superfície 293T-PD-1 detectado por
FACS Anticorpo (nM) 0,14 0,41 1,23 3.70 11.11 33.33 100 EC50 Bevacizumab 3,2 2,2 2,0 2,3 2,7 3,8 5,7 - Nivolumab 33,3 74,9 171,9 357,9 481,9 498,3 478,4 2,1 14C12H1L1 48,1 99,7 201,5 409,0 600,2 655,4 670,8 2,9 VP101 30,8 61,8 135,7 286,9 487,7 534,0 528,6 3,5
[0205] Os resultados mostram que o anticorpo VP101 pode se ligar efetivamente ao antígeno PD-1 na superfície da célula hospedeira 293T-PD-1 e sua eficiência de ligação é dependente da dose, e bevacizumab não tem atividade de ligação a 293T- PD-1, que indica que a ligação de VP101 a 293T-PD-1 é específica.
3. A ligação dos anticorpos VP101, BsAbB7 e BsAbB8 ao antígeno de superfície celular foi detectada por referência ao procedimento experimental descrito na etapa 2 deste exemplo
[0206] Os resultados são mostrados na figura 18, e os valores de MFI em cada concentração são mostrados na Tabela
11. Por análise de quantificação de fluorescência e ajuste de curva do anticorpo ligado, os valores de EC50 de ligação de nivolumab, 14C12H1L1, VP101, BsAbB7 e BsAbB8 foram calculados em 7,853 nM, 3,607 nM , 7,896 nM, 9,943 nM e 10,610 nM, respectivamente.
Tabela 11: Análise das intensidades de fluorescência da ligação de VP101, BsAbB7 e BsAbB8 ao antígeno de superfície 293T-PD-1 detectado por FACS Anticorpo 0,014 0,14 0,41 1,23 3,7 11 30 100 EC50(nM) (nM) Bevacizumab 1,89 1,90 2,20 1,92 2,04 2,48 2,80 2,43 - Nivolumab 3,91 15,30 34,69 94,04 234,34 533,63 640,15 804,69 7,853 14C12H1L1 7,40 29,55 69,16 175,54 422,53 868,45 831,27 813,58 3,607 VP101 3,47 16,16 38,75 93,08 216,76 509,23 810,37 783,58 7,896 BsAbB7 3,85 14,86 37,45 83,78 202,40 465,10 837,61 846,80 9,943 BsAbB8 4,41 16,77 36,86 89,89 210,40 457,91 804,43 863,35 10,610
[0207] Os resultados mostram que o anticorpo VP101 pode se ligar à superfície da membrana PD-1 de 293T-PD1 de uma maneira dependente da dose. O bevacizumab não tem atividade de ligação a 293T-PD-1, o que indica que a ligação de VP101 a 293T-PD-1 é específica. Exemplo 5: Ligação competitiva do anticorpo VP101 ao antígeno de superfície da membrana celular
1. Um método de citometria de fluxo competitivo foi adotado para detectar o EC50 do VP101 na competição com PD-L1 pela ligação ao antígeno de superfície da membrana celular PD-1, e o método é especificado da seguinte forma:
[0208] As células 293T-PD-1 foram digeridas de forma convencional e divididas em várias amostras com 300.000 células cada, as quais foram então submetidas a centrifugação e lavagem. Em seguida, cada tubo foi adicionado com 100 μL do anticorpo diluído gradativamente correspondente e incubado em gelo por 30 minutos; 100 μL de PD-L1-mFc foram então adicionados a cada tubo e a mistura foi bem misturada para atingir uma concentração final de 20 nM e, em seguida, incubada em gelo por 1 hora. Em seguida, 500 μL de PBSA a 1% foram adicionados e a mistura foi centrifugada a 5600 rpm por
5 minutos para remover o sobrenadante. 100 μL de anticorpo anti-camundongo de revestimento FITC diluído na proporção de 1: 500 foram então adicionados a cada tubo, e a mistura foi incubada em gelo por 40 minutos na ausência de luz após ter sido bem misturada. Em seguida, a mistura foi centrifugada, lavada e ressuspensa e, em seguida, transferida para um tubo de carga para teste.
[0209] Os resultados são mostrados na figura. 19, e os valores de MFI em cada concentração são mostrados na Tabela
12. Por análise de quantificação de fluorescência e ajuste de curva, os valores de EC50 de ligação dos anticorpos VP101 e 14C12H1L1 foram calculados em 8,33 nM e 4,37 nM, respectivamente. Tabela 12: Análise das intensidades de fluorescência de 14C12H1L1 e VP101 na competição pela ligação ao antígeno de superfície 293T-PD-1 detectado por FACS Anticorpo 0,05 0,14 0,41 1,23 3,70 11,11 33,33 100,00 EC50 R2 (nM) 14C12H1L1 288,17 287,29 277,09 237,22 177,80 12,04 10,32 9,87 4,37 0,988 VP101 272,66 264,39 279,11 272,26 239,18 99,29 17,05 14.91 8,33 0,999
[0210] Os resultados mostram que o anticorpo VP101 pode bloquear efetivamente a ligação de PDL-1 a PD-1 na superfície das células hospedeiras 293T-PD-1 de uma maneira dependente da dose.
2. Os valores de EC50 de VP101, BsAbB7, BsAbB8, 14C12H1L1 e nivolumab na competição com PD-L1 pela ligação ao antígeno de superfície da membrana celular PD-1 foram detectados usando citometria de fluxo competitiva e referindo-se ao procedimento experimental descrito na etapa 1 deste exemplo
[0211] Os resultados são mostrados na figura 20, e os valores de MFI em cada concentração são mostrados na Tabela
13. Por análise de quantificação de fluorescência e ajuste de curva, os valores de EC50 de ligação competitiva dos anticorpos VP101, BsAbB7, BsAbB8, 14C12H1L1 e nivolumab foram calculados em 15,04 nM, 22,25 nM, 19,25 nM, 9,21 nM e 9,72 nM, respectivamente. Tabela 13: Análise das intensidades de fluorescência de VP101, BsAbB7, BsAbB8, 14C12H1L1 e nivolumab na competição pela ligação ao antígeno de superfície 293T-PD-1 detectado por FACS Anticorpo 0,14 0,41 1,23 3,7 11,11 33,33 100 300 EC50 R2 (nM) VP101 1441,94 1380,62 1368,15 1288,34 982,69 112,90 8,49 8,21 15,04 0,9971 BsAbB7 1412,62 1377,27 1339,60 1341,27 1094,35 417,70 9,23 9,18 22,25 0,9985 BsAbB8 1578,36 1521,50 1427,20 1429,85 1137,74 359,69 9,73 9,68 19,25 0,9962 14C12H1L1 1384,08 1551,05 1462,85 1296,64 580,45 12,93 13,37 14,99 9,21 0,9950 Nivolumab 1539,58 1552,37 1483,84 1300,81 713,56 70,92 60,77 56,92 9,72 0,9969
[0212] Os resultados mostram que a atividade do anticorpo 14C12H1L1 é equivalente à do anticorpo comercializado nivolumab direcionado a PD-1 e é superior à do anticorpo bifuncional VP101. A atividade do anticorpo VP101 é superior à de BsAbB7 e BsAbB8. Exemplo 6: Detecção de bioatividade de neutralização de anticorpos VP101, BsAbB7 e BsAbB8 no bloqueio de VEGF para ativar a via de sinalização de NFAT
1. Construção de células 293T-NFAT- (opv) KDR (C7) O vetor KDR (VEGFR2) pCDH-KDRFL (OPV) -GFP-Puro (o vetor pCDH-GFP-Puro é adquirido na Youbio) e o vetor NFAT pNFAT- luc-higro (o vetor pGL4-luc2P-higro é adquirido na Promega) foram transfectados em Células 293T e um grupo de clones 293T-NFAT- (opv) KDR (C7) que expressam de forma estável os genes repórter da luciferase KDR e NFAT foram obtidas por triagem.
2. Células 293T-NFAT- (opv) KDR (C7) foram coletadas e centrifugadas por 5 minutos para remover o sobrenadante; O meio DMEM + 10% FBS foi usado para ressuspender as células, e o número de células foi contado e a viabilidade celular foi detectada; em seguida, a concentração de células foi ajustada para estar em uma faixa adequada e 50000 células/suspensão de células de 50 μL foram adicionadas a cada poço de uma placa preta de 96 poços
[0213] Anticorpos correspondentes (concentrações finais sendo 300, 100, 10, 2, 0,2, 0,02, 0,002 nM) e VEGF (concentração final sendo 30 ng/mL) foram diluídos de acordo com o projeto experimental, e os anticorpos direcionados a VEGF foram pré-incubados com VEGF para 1 hora à temperatura ambiente antes de ser adicionado às células. Os controles em branco e isotípico (volume final de cada poço sendo 100 μL) foram projetados e incubados em uma incubadora de dióxido de carbono a 37°C, 5% de CO2 por 4 horas; 50 μL de sistema de ensaio de luciferase foram adicionados a cada poço, e as unidades de fluorescência relativa (RLUs) foram detectadas por um testador de microplaca multi-rótulo em 5 minutos.
[0214] Os resultados experimentais são mostrados na FIG. 21, e os valores de EC50 para cada anticorpo são mostrados na Tabela 14. Tabela 14: Detecção da bioatividade de neutralização dos anticorpos VP101, BsAbB7 e BsAbB8 no bloqueio de VEGF para ativar a via de sinalização de NFAT por ensaio repórter Amostra VP101 BsAbB7 BsAbB8 Bevacizumab EC50(nM) 1,2400 1,2170 1,7280 0,7730
[0215] Os resultados mostram que o EC50 de VP101 é 1,240 nM, o EC50 de BsAbB7 é 1,217 nM, o EC50 de BsAbB8 é 1,728 nM e o EC50 de bevacizumab é 0,773 nM, e os resultados experimentais mostram que a atividade de VP101 e BsAbB7 em bloquear VEGF para ativar a via de sinalização NFAT é melhor do que o de BsAbB8. Exemplo 7: Experiência de Proliferação de Células HUVEC Induzida por VEGFA de Inibição de Anticorpo VP101
[0216] As células HUVEC (adquiridas da Allcell) em bom estado de crescimento, após a concentração celular ser ajustada para 1,5 × 104/mL foram inoculadas em uma placa de 96 poços a 200 μL/poço e, em seguida, incubadas em uma incubadora a 37°C, 5% de CO2 por 24 horas. Em seguida, observou-se que as células aderiram bem e, a seguir, o meio de cultura foi descartado. VEGFA 20 nM preparado usando 1640 contendo 2% de FBS foi então adicionado à placa de 96 poços a 200 μL/poço e anticorpos em diferentes concentrações foram adicionados, seguido por incubação por 72 horas. 72 horas depois, o meio de cultura foi descartado e MTT foi adicionado. 4 horas depois, o MTT foi descartado e DMSO foi adicionado, e então um leitor de microplaca foi usado para medir o valor de OD em 490 nm.
[0217] Os resultados são mostrados na figura. 22. Os resultados mostram que os anticorpos humanizados VP101 e bevacizumab podem inibir eficazmente a proliferação de células HUVEC induzida por VEGFA de uma maneira dependente da dose, e a atividade farmacológica de VP101 na inibição da proliferação de células HUVEC induzida por VEGFA é maior do que a de bevacizumab em a mesma dose. Exemplo 8: Promoção da secreção de citocinas IFN-γ e IL-2 na reação de linfócitos mistos
1. Promoção da secreção de IFN-γ por VP101, 14C12H1L1 e nivolumab em sistema de cultura misto de células DC e PBMC
[0218] PBMCs foram isolados por Ficoll-Paque Plus (GE
Healthcare) e adicionados a IL-4 (Peprotech 200-04, 1000 U/mL) e GM-CSF (Peprotech 300-03, 1000 U/mL) por 6 dias de indução, e então TNF-α (Peprotech 300-01A, 200 U/mL) foi adicionado adicionalmente durante 3 dias de indução para obter células DC maduras.
[0219] No dia da co-cultura, PBMCs frescos foram isolados do sangue periférico de outro doador, e as células DC maduras obtidas foram misturadas com PBMCs recém-isolados de outro doador em uma proporção de 1:10 e, entretanto, anticorpos em diferentes concentrações (hIgG como um controle) foram adicionados. Após co-cultura por 5-6 dias, o sobrenadante celular foi coletado e testado quanto ao conteúdo de IFN-γ usando um kit ELISA (adquirido em Dakewe).
[0220] O efeito de VP101 na secreção de IFN-γ em sistema de cultura misto de células DC e PBMC são mostrados na FIG. 23. Como pode ser visto na FIG. 23, VP101 pode efetivamente promover a secreção de IFN-γ de uma maneira dependente da dose. Além disso, em doses de 30 nM e 300 nM, VP101 tem maior atividade na promoção da secreção de IFN-γ do que 14C12H1L1 equivalente, e no nível de dose de 30 nM, tem maior atividade na promoção da secreção de IFN-γ do que o nivolumab equivalente.
2. Promoção da secreção de IL-2 e IFN-γ por VP101, BsAbB7 e BsAbB8b em sistema de cultura misto de células DC e PBMC
[0221] A etapa 1 neste exemplo foi referida para o método experimental, ou seja, PBMCs foram isolados por Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare) e adicionados a IL-4 (Peprotech 200-04, 1000 U/mL) e GM-CSF (Peprotech 300 -03, 1000 U/mL) durante 6 dias de indução e, em seguida, TNF-α (Peprotech 300-01A, 200 U/mL) foi adicionado adicionalmente durante 3 dias de indução para obter células DC maduras.
[0222] No dia da co-cultura, PBMCs frescos foram isolados do sangue periférico de outro doador, e as células DC maduras obtidas foram misturadas com PBMCs recém-isolados de outro doador em uma proporção de 1:10 e, entretanto, anticorpos em diferentes concentrações (hIgG como um controle) foram adicionados; após co-cultura por 5-6 dias, o sobrenadante celular foi coletado e testado quanto ao conteúdo de IL-2 e IFN-γ usando um kit de ELISA (adquirido em Dakewe).
[0223] O efeito de VP101 na secreção de IFN-γ em sistema de cultura misto de células DC e PBMC é mostrado na FIG. 24. Como pode ser visto na FIG. 24, VP101 pode efetivamente promover a secreção de IFN-γ de uma maneira dependente da dose. A atividade farmacológica de VP101 na promoção da secreção de IFN-γ é significativamente melhor do que a de BsAbB7 e BsAbB8.
[0224] O efeito de VP101 na secreção de IL-2 em sistema de cultura misto de células DC e PBMC é mostrado na FIG. 25. Como pode ser visto na FIG. 25, VP101 pode efetivamente promover a secreção de IL-2 de uma maneira dependente da dose, e a atividade farmacológica de VP101 na promoção da secreção de IL-2 é melhor do que a de BsAbB7 e BsAbB8.
3. Promoção da secreção de IL-2 e IFN-γ por VP101, 14C12H1L1 e nivolumab em sistema de cultura misto de células PBMC e Raji-PD-L1
[0225] PD-L1 foi transfectado de forma estável em células Raji através de infecção de lentivírus, e células Raji-PD-L1 expressando PD-L1 de forma estável foram obtidas após dosagem e triagem; PBMCs, após dois dias de estimulação por SEB, foram cultivadas em conjunto com Raji-PD-L1 tratado com mitomicina C.
[0226] Os resultados são mostrados nas FIGs. 26 e 27. Os resultados mostram que VP101 pode efetivamente promover a secreção de IL-2 e IFN-γ, e no nível de dose de 300 nM, a atividade de VP101 na promoção da secreção de IL-2 é significativamente melhor do que a do equivalente 14C12H1L1 e nivolumab.
[0227] O anticorpo de controle de isotipo a ser estudado era Lisozima Anti-Hen Humana (anti-HEL, isto é, IgG humana, abreviado como hIgG), e foi preparado como descrito no Exemplo de Preparação 6 acima.
4. A promoção da secreção de IL-2 e IFN-γ por VP101, BsAbB7 e BsAbB8 em sistema de cultura misto de células PBMC e Raji-PD- L1 foi estudada por referência ao método experimental descrito na etapa 3 deste exemplo
[0228] Os resultados da secreção de IFN- γ são mostrados na FIG. 28. Os resultados mostram que VP101 pode efetivamente promover a secreção de IFN- γ de uma maneira dependente da dose. Ao mesmo tempo, VP101 é significativamente melhor do que BsAbB7 na mesma dose, enquanto a atividade farmacológica de VP101 é significativamente melhor do que a de BsAbB8 em níveis de dose de 3 nM e 30 nM.
[0229] Os resultados da secreção de IL-2 são mostrados na FIG. 29. Os resultados mostram que VP101 pode efetivamente promover a secreção de IL-2 de uma maneira dependente da dose. Ao mesmo tempo, a atividade farmacológica de VP101 é significativamente melhor do que a de BsAbB7 em doses de 3 nM e 300 nM, enquanto VP101 é equivalente a BsAbB8 na mesma dose. Exemplo 9: Experiência de inibição do crescimento do tumor in vivo por VP101
[0230] Para detectar a atividade de inibição de tumor in vivo de VP101, células U87MG (células de glioma humano, adquiridas de ATCC) foram primeiro inoculados por via subcutânea em camundongos Scid Beige fêmeas de 5-7 semanas de idade (adquiridos de Vital River), e a modelagem e modo específico de administração foram mostrados na Tabela 15. Após a administração, o comprimento e a largura de cada grupo de tumores foram medidos, e o volume do tumor foi calculado. Tabela 15: Regime de dosagem de tratamento de modelo de camundongo Scid Beige com xenoenxerto de tumor U87MG com VP101 Xenoenxerto de Condição de Agrupamento n tumor administração Anticorpo de controle Controle de de isotipo, hIgG, isotipo 7 40 mg/kg, injetado por 40 mg/kg via intravenosa nos dias 0, 7 e 13 Bevacizumab 30 mg/kg, Bevacizumab U-87MG, 5 injetado por via 8 milhões de 30mg/kg intravenosa nos dias 0, células/ 7 e 13 camundongo VP101 40 mg/kg, Subcutaneamente VP101 injetado por via 7 40mg/kg intravenosa nos dias 0, 7 e 13 VP101 4 mg/kg, VP101 injetado por via 7 4mg/kg intravenosa nos dias 0, 7 e 13
[0231] Os resultados são mostrados na figura. 30. Os resultados mostram que, em comparação com um anticorpo de controle de isotipo hIgG (o método de preparação é o mesmo que o do Exemplo de Preparação 6), bevacizumab e VP101 em diferentes doses podem inibir efetivamente o crescimento de tumores de camundongo e o VP101 de alta dose é melhor do que o VP 101 de baixa dosagem na inibição de tumores.
[0232] Além disso, como mostrado na FIG. 31, VP101 não afeta o peso corporal de camundongos com tumor.
[0233] Embora o conteúdo da presente invenção tenha fornecido uma descrição completa e clara de suas concretizações descritas, não está limitado a elas. Para aqueles versados na técnica, modificações e substituições para a presente invenção são possíveis com a orientação dessas descrições, e tais modificações e substituições estão incluídas no escopo da presente invenção. O escopo completo da presente invenção é dado pelas reivindicações anexas e qualquer equivalente das mesmas.

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Anticorpo biespecífico, caracterizado pelo fato de compreender: - uma primeira região funcional de proteína dirigida ao VEGFA, e - uma segunda região funcional de proteína dirigida ao PD-1; sendo que: - a primeira região funcional da proteína é um anticorpo anti-VEGFA ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, uma região variável da cadeia pesada do anticorpo anti-VEGFA compreendendo HCDR1-HCDR3 com sequências de aminoácidos representada nas SEQ ID NOs: 15-17 respectivamente, e uma região variável da cadeia leve do anticorpo anti-VEGFA compreendendo LCDR1-LCDR3 com sequências de aminoácidos representada nas SEQ ID NOs: 18-20 respectivamente; e - a segunda região funcional de proteína é um anticorpo anti- PD-1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, uma região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-PD-1 compreendendo HCDR1-HCDR3 com sequências de aminoácidos representada nas SEQ ID NOs: 21-23 respectivamente, e uma região variável de cadeia leve do anticorpo anti-PD-1 compreendendo LCDR1-LCDR3 com sequências de aminoácidos representada nas SEQ ID NOs: 24-26 respectivamente.
    2. Anticorpo biespecífico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o anticorpo anti-VEGFA ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é selecionado a partir de Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, um fragmento de região determinante de complementaridade, um anticorpo de cadeia única, um anticorpo humanizado, um quimérico anticorpo e um diacorpo; e/ou,
    - o anticorpo anti-PD-1 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é selecionado a partir de Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, um fragmento de região determinante de complementaridade, um anticorpo de cadeia única, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico e um diacorpo.
    3. Anticorpo biespecífico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a primeira região funcional de proteína ser uma imunoglobulina, uma região variável de cadeia pesada da imunoglobulina compreendendo HCDR1-HCDR3 com sequências de aminoácidos representada nas SEQ ID NOs: 15-17 respectivamente, e uma região variável de cadeia leve da imunoglobulina compreendendo LCDR1-LCDR3 com as sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NOs: 18-20 respectivamente; e a segunda região funcional de proteína é um anticorpo de cadeia única, uma região variável de cadeia pesada do anticorpo de cadeia única compreendendo HCDR1-HCDR3 com sequências de aminoácidos representada nas SEQ ID NOs: 21-23, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve do anticorpo de cadeia simples compreendendo LCDR1-LCDR3 com sequências de aminoácidos representada nas SEQ ID NOs: 24-26 respectivamente; ou, - a primeira região funcional de proteína ser um anticorpo de cadeia única, uma região variável de cadeia pesada do anticorpo de cadeia única compreendendo HCDR1-HCDR3 com sequências de aminoácidos representada nas SEQ ID NOs: 21-23, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve do único anticorpo de cadeia compreendendo LCDR1-LCDR3 com sequências de aminoácidos representada nas SEQ ID NOs: 24-26 respectivamente; e a segunda região funcional de proteína é uma imunoglobulina, uma região variável de cadeia pesada da imunoglobulina compreendendo HCDR1-HCDR3 com sequências de aminoácidos representada nas SEQ ID NOs: 15-17 respectivamente, e uma região variável de cadeia leve da imunoglobulina compreendendo LCDR1- LCDR3 com sequências de aminoácidos representada nas SEQ ID NOs: 18-20, respectivamente.
    4. Anticorpo biespecífico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina ser apresentada na SEQ ID NO: 5 e a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve da imunoglobulina é apresentada na SEQ ID NO: 7; e a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo de cadeia única ser apresentada na SEQ ID NO: 9, e a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo de cadeia simples é apresentada na SEQ ID NO: 11; ou, - a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo de cadeia simples é apresentada na SEQ ID NO: 9, e a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo de cadeia simples é apresentada na SEQ ID NO: 11 ; e a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina é apresentada na SEQ ID NO: 5, e a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve da imunoglobulina é apresentada na SEQ ID NO:
    7.
    5. Anticorpo biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 ou 4, caracterizado pelo fato de a imunoglobulina ser uma IgG, IgA, IgD, IgE ou IgM; de preferência, a imunoglobulina é uma IgG.
    6. Anticorpo biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 ou 4, caracterizado pelo fato de dois anticorpos de cadeia única estarem presentes e um terminal de cada anticorpo de cadeia única estar ligado ao terminal C ou ao terminal N de uma das duas cadeias pesadas da imunoglobulina.
    7. Anticorpo biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 ou 4, caracterizado pelo fato de a imunoglobulina compreender uma região não CDR derivada de uma espécie diferente de murino, como de um anticorpo humano.
    8. Anticorpo biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 ou 4, caracterizado pelo fato de a imunoglobulina compreender regiões constantes derivadas de um anticorpo humano; preferencialmente, as regiões constantes da imunoglobulina são selecionadas a partir de regiões constantes de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humana.
    9. Anticorpo biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 ou 4, caracterizado pelo fato de a região constante da cadeia pesada da imunoglobulina ser a região C da cadeia 1 de Ig humana ou a região C da cadeia 4 de Ig humana, e sua região constante da cadeia leve ser a região C da cadeia kappa de Ig humana.
    10. Anticorpo biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de a primeira e a segunda regiões funcionais da proteína estarem ligadas diretamente ou através de um fragmento de ligação; preferivelmente, o fragmento de ligação é (GGGGS) m, em que m é um número inteiro positivo, como 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.
    11. Anticorpo biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de os números da primeira e segunda regiões funcionais da proteína serem,
    cada um, independentemente, 1, 2 ou mais.
    12. Anticorpo biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de o anticorpo biespecífico se ligar à proteína VEGFA com uma EC50 de menos de 1 nM, menos de 0,5 nM, menos de 0,2 nM, menos de 0,15 nM ou menos de 0,14 nM; preferivelmente, o EC50 é detectado por ELISA indireto; e/ou, o anticorpo biespecífico se ligar à proteína PD-1 com um EC50 menor que 1 nM, menor que 0,5 nM, menor que 0,2 nM, menor que 0,17 nM, menor que 0,16 nM ou menor que 0,15 nM; preferivelmente, o EC50 ser detectado por ELISA indireto.
    13. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fato de codificar o anticorpo biespecífico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 12.
    14. Vetor, caracterizado pelo fato de compreender a molécula de ácido nucleico isolada, conforme definida na reivindicação
    13.
    15. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de compreender a molécula isolada de ácido nucleico, conforme definida na reivindicação 13, ou o vetor, conforme definido na reivindicação 14.
    16. Método para preparar o anticorpo biespecífico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, caracterizado pelo fato de compreender: cultivar a célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 15, em uma condição adequada, e isolar o anticorpo biespecífico das culturas de células.
    17. Conjugado, caracterizado pelo fato de compreender um anticorpo biespecífico e uma fração conjugada, sendo que o anticorpo biespecífico é o anticorpo biespecífico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, e a fração conjugada ser um marcador detectável; preferivelmente, a porção conjugada é um radioisótopo, uma substância fluorescente, uma substância luminescente, uma substância colorida ou uma enzima.
    18. Kit, caracterizado pelo fato de compreender o anticorpo biespecífico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 12 ou o conjugado, conforme definido na reivindicação 17; sendo preferivelmente que o kit compreende ainda um segundo anticorpo capaz de se ligar especificamente ao anticorpo biespecífico; opcionalmente, o segundo anticorpo compreende ainda um marcador detectável, como um radioisótopo, uma substância fluorescente, uma substância luminescente, uma substância colorida ou uma enzima.
    19. Uso do anticorpo biespecífico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, caracterizado pelo fato de ser dirigido à preparação de um kit para detectar a presença ou o nível de VEGFA e/ou PD-1 em uma amostra.
    20. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreender o anticorpo biespecífico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, ou o conjugado, conforme definido na reivindicação 17 e, opcionalmente, um excipiente farmaceuticamente aceitável.
    21. Uso do anticorpo biespecífico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, ou o conjugado, conforme definido na reivindicação 17, caracterizado pelo fato de ser dirigido à preparação de um medicamento para prevenir e/ou tratar um tumor maligno, sendo que preferivelmente, o tumor maligno é selecionado a partir de câncer de cólon retal câncer, câncer de pulmão, tal como câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de fígado, câncer de ovário, câncer de pele, glioma, melanoma, tumor renal, câncer de próstata, câncer de bexiga, câncer gastrointestinal, câncer de mama, câncer de cérebro e leucemia.
    22. Uso do anticorpo biespecífico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, ou o conjugado, conforme definido na reivindicação 17, caracterizado pelo fato de ser dirigido à preparação de: (1) um medicamento ou um agente para detectar o nível de VEGFA em uma amostra, um medicamento ou um agente para bloquear a ligação de VEGFA a VEGFR2, um medicamento ou um agente para regular negativamente a atividade ou nível de VEGFA, um medicamento ou um agente para aliviar a estimulação de VEGFA na proliferação de células endoteliais vasculares, um medicamento ou um agente para inibir a proliferação de células endoteliais vasculares, ou um medicamento ou um agente para bloquear a angiogênese tumoral; e/ou (2) um medicamento ou agente para bloquear a ligação de PD-1 a PD-L1, um medicamento ou um agente para regular negativamente a atividade ou nível de PD-1, um medicamento ou um agente para aliviar a imunossupressão de PD-1 em um organismo, um medicamento ou um agente para promover a secreção de IFN-γ em linfócitos T, ou um medicamento ou agente para promover a secreção de IL-2 em linfócitos T.
    23. Anticorpo biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12 ou o conjugado, conforme definido na reivindicação 17, caracterizado pelo fato de ser utilizado na prevenção e/ou tratamento de um tumor maligno, sendo, preferivelmente, que o tumor maligno é selecionado de câncer de cólon, câncer retal, câncer de pulmão tal como câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de fígado, câncer de ovário, câncer de pele, glioma, melanoma, tumor renal, câncer de próstata, câncer de bexiga, câncer gastrointestinal, câncer de mama, câncer de cérebro e leucemia.
    24. Anticorpo biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, ou conjugado, conforme definido na reivindicação 17, caracterizado pelo fato de ser utilizado para: (1) detectar o nível de VEGFA em uma amostra, bloquear a ligação de VEGFA a VEGFR2, diminuir a atividade ou nível de VEGFA, aliviar a estimulação de VEGFA na proliferação de células endoteliais vasculares, inibir a proliferação de células endoteliais vasculares, ou bloquear a angiogênese tumoral; e/ou (2) bloquear a ligação de PD-1 a PD-L1, regular para baixo a atividade ou nível de PD-1, aliviar a imunossupressão de PD-1 em um organismo, promover a secreção de IFN-γ em linfócitos T, ou promover a secreção de IL-2 em linfócitos T.
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