CN115068603A - 含有抗pd-1-抗vegfa双特异性抗体的药物组合及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于肿瘤治疗和免疫学生物学领域，涉及一种含有抗PD‑1‑抗VEGFA双特异性抗体的药物组合及其用途。具体地，所述的药物组合包括至少一种双特异性抗体，以及至少一种PARP抑制剂，其中，所述双特异性抗体包括：靶向PD‑1的第一蛋白功能区，和靶向VEGFA的第二蛋白功能区，其中，按照EU编号系统，所述双特异性抗体中包含的免疫球蛋白的重链恒定区在234和235位点的2个位点发生突变，并且突变后，双特异性抗体与FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa和/或C1q的亲和力常数相比突变前降低。PARPi和本发明双特异性抗体联合给药对肿瘤的治疗效果显著优于单用PARPi或双特异性抗体，具有良好的应用前景。

Description

含有抗PD-1-抗VEGFA双特异性抗体的药物组合及其用途
技术领域
本发明属于肿瘤治疗和免疫学生物学领域，涉及一种含有抗PD-1-抗VEGFA双特异性抗体的药物组合及其用途。具体地，本发明涉及一种含有抗人PD-1-抗人VEGFA双特异性抗体的药物组合及其用途。
背景技术
肿瘤尤其是恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病。肿瘤的生长有两个明显不同的阶段，即从无血管的缓慢生长期转为有血管的快速增殖期，血管的生成使肿瘤能获得足够的营养而完成血管切换期，如果没有血管的生成，原发肿瘤的生长不超过1－2mm，转移则无法实现。
血管内皮生长因子(VEGF)是一类能促进内皮细胞分裂增殖、促进新生血管的形成、提高血管通透性的生长因子，它与细胞表面的血管内皮生长因子受体结合，通过激活酪氨酸激酶信号转导途径发挥功能。在肿瘤组织中，肿瘤细胞、肿瘤侵入的巨噬细胞和肥大细胞能分泌高水平的VEGF，以旁分泌的形式刺激肿瘤血管内皮细胞，促进内皮细胞增殖、迁移，诱导血管形成，促进肿瘤持续生长，并提高血管通透性，引起周围组织纤维蛋白沉着，促进单核细胞、成纤维细胞内皮细胞侵润，有利于肿瘤基质形成和肿瘤细胞进入新生血管，促进肿瘤转移，因而抑制肿瘤血管生成被认为是当前最具有前途的肿瘤治疗方法之一。VEGF家族包括：VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD和PIGF。血管内皮生长因子受体(VEGFR)包括VEGFR1(又称Flt1)、VEGFR2(又称KDR或Flk1)、VEGFR3(又称Flt4)和Neuropilin-1(NRP-1)。其中，前三种受体在结构上类似，都属于酪氨酸激酶超家族，均由膜外区、跨膜片段及膜内区三部分构成，其中膜外区由免疫球蛋白样结构域组成，膜内区属酪氨酸激酶区。VEGFR1和VEGFR2主要位于血管内皮细胞表面，VEGFR3主要位于淋巴管内皮细胞表面。
VEGF家族分子对于几种受体有不同的亲和力。VEGFA主要与VEGFR1、VEGFR2和NRP-1结合发挥作用。VEGFR1是最早发现的受体，在正常生理情况下VEGFR1与VEGFA的亲和力比VEGFR2与VEGFA的亲和力高，但是其胞内段酪氨酸酶活性比VEGFR2低(马莉，中国优生与遗传杂志，24(5)(2016)：146-148)。
VEGFR2是血管发生和构建的主要调节者，与VEGFR1相比VEGFR2具有很高的酪氨酸激酶活性。VEGFR2与配体VEGFA结合后介导血管内皮细胞的增殖、分化等行为，以及血管的形成过程和血管的通透性(Roskoski R Jr.等人，Crit Rev Oncol Hematol，62(3)(2007)：179-213.)，VEGFA与VEGFR2结合后通过下游PLC-γ-PKC-Raf-MEK-MAPK信号传导通路介导胞内相关蛋白基因转录表达，促进血管内皮细胞增殖(Takahashi T等人，Oncogene，18(13)(1999)：2221-2230.)。
VEGFR3属于酪氨酸激酶家族成员之一，主要表达在胚胎时期的血管内皮细胞和成年期的淋巴管内皮细胞，VEGFC和VEGFD与VEGFR3结合以刺激淋巴管内皮细胞的增殖与迁移，促进淋巴管的新生；NRP-1是一种非酪氨酸激酶跨膜蛋白，不能独立转导生物信号，而与VEGF酪氨酸激酶受体形成复合物后才能介导信号传导。(马莉，中国优生与遗传杂志，24(5)(2016)：146-148)。
VEGFA与VEGFR2主要参与调控血管生成，VEGFA与VEGFR2结合前后会引发上下游通路中众多中间信号形成级联反应，最终以内皮细胞增殖、存活、迁移、通透性增加及浸润到周围组织等不同形式改变其生理功能(董宏超等人，《现代肿瘤医学》，第22卷，第9期2014年9月，第2231-3页)。
细胞程序性死亡受体-1(Programmed cell death protein，PD-1)，又被称为CD279，是I型跨膜糖蛋白膜表面受体，属于CD28免疫球蛋白超家族，普遍表达于T细胞，B细胞以及髓样细胞。PD-1有两个天然配体，PD-L1和PD-L2。PD-L1和PD-L2均属于B7超家族，组成性地或诱导性地表达于多种细胞膜表面，包括非造血系统细胞以及多种肿瘤细胞。PD-L1主要表达于T细胞、B细胞、DC以及微血管内皮细胞和多种肿瘤细胞。PD-L2则仅表达于抗原呈递细胞如树突状细胞和巨噬细胞。PD-1与其配体的相互作用可抑制淋巴的活化，抑制T细胞的增殖以及IL-2、IFN-γ等细胞因子的分泌。
有大量研究表明肿瘤微环境可保护肿瘤细胞免受免疫细胞的破坏，而肿瘤微环境中浸润的淋巴细胞PD-1表达上调，且多种原发肿瘤组织在免疫组化分析中均表现为PD-L1阳性，如肺癌、肝癌、卵巢癌、皮肤癌、结肠癌、胶质瘤等。同时，PD-L1在肿瘤的表达与癌症患者的不良预后显著相关。阻断PD-1与其配体的相互作用可促进肿瘤特异性的T细胞免疫，提高肿瘤细胞的免疫清除效率。大量临床试验表明，靶向PD-1或PD-L1的抗体可促进CD8+T细胞浸润到肿瘤组织，上调抗肿瘤的免疫效应因子，如IL-2、IFN-γ，颗粒酶B以及穿孔素，从而有效抑制肿瘤的生长。
由于PD-1抗体的广谱抗肿瘤前景和惊人的药效，业界普遍认为针对PD-1通路的抗体将带来治疗多种肿瘤治疗的突破性的进展：用于治疗非小细胞性肺癌，肾细胞癌，卵巢癌，黑色素瘤(Homet M.B.,Parisi G.,et al.,Anti-PD-1Therapy in Melanoma.SeminOncol.Jun；42(3)(2015):466-473)，淋巴瘤以及贫血(Held SA,Heine A,et al.,Advancesin immunotherapy of chronic myeloid leukemia CML.Curr Cancer DrugTargets.Sep；13(7)(2013):768-74)、微卫星高度不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)肿瘤(多款抗PD-1抗体药物已受FDA等批注用于治疗具有MSI-H/dMMR特征的肿瘤)。
目前抗血管生成疗法和免疫检查点抑制剂的联用在很多肿瘤中展现出了良好的疗效。抗VEGF抗体，如Bevacizumab，和抗PD-1/PD-L1抗体的联用，如Nivolumab、Pembrolizumab、Atezolizumab等，在卵巢癌(Joyce F.Liu et al.,JAMA Oncol.2019；5(12):1731-1738.)、非小细胞肺癌(包括EGFR和/或ALK敏感突变的非小细胞肺癌)(Manegold C,et al.,J Thorac Oncol.2017Feb；12(2):194-207.)、肾细胞癌(Dudek AZet al.,J Clin Oncol.2018；36(suppl；abstr 4558).)、肝细胞癌(Stein S et al.,JClin Oncol,2018,36(15_suppl):4074.；FDA于2020年批注Bevacizumab联合Atezolizumab治疗肝细胞癌)、直结肠癌(包括MSI-H/dMMR和非MSI-H/dMMR类型)(Bendell JC etal.American Society of Clinical Oncology；May 29–June 2,2015；Chicago,IL.2015；abstract 704；Hochster HS et al.American Society of Clinical OncologyGastrointestinal Cancers Symposium；January 19–21,2017；San Francisco,CA.2017；abstract 673.)、乳腺癌(Yukinori Ozaki et al.,AACR；Cancer Res 2020；80(4Suppl):Abstract nr PD1-03.)；VEGFR2抗体和PD-1抗体药物联用在胃及胃食管结合部腺癌亦展现了良好的抗肿瘤效果(Herbst RS et al.,Lancet Oncol.2019；20(8):1109-1123.)；PD-1抗体(Pembrolizumab)和血管生成抑制剂(Lenvatinib)联用方案在治疗子宫内膜癌中展现出了良好的疗效，于2019年被FDA批准用于治疗子宫内膜癌。对于黑色素瘤(PD-1抗体Nivolumab和Pembrolizumab已被FDA批准用于治疗黑色素瘤)、宫颈癌(Krishnansu S.etal.,N Engl J Med 2014；370:734-743.)、胶质瘤、前列腺癌(Antonarakis ES.et al.,JClin Oncol.2020 Feb 10；38(5):395-405.)、尿路上皮癌(Joaquim Bellmunt.et al.,NEngl J Med 2017；376:1015-1026；FDA于2017年批注Nivolumab用于治疗膀胱癌)、食管癌(Kato K et al.,Lancet Oncol.2019；20(11):1506–17.)、间皮瘤(Scherpereel A etal.,Lancet Oncol.2019；20(2):239-253.)等肿瘤，PD-1/PDL-1抗体展现出了良好的疗效，考虑到PD-1通路与VEGF通路的在肿瘤发生中的协同作用，可以预期同时阻断PD-1及VEGF通路的药物将会有更好的抗肿瘤效果。
多聚ADP核糖聚合酶(Poly ADP-ribose Polymerase，PARP)属于PARP酶家族，包括PARP-1、PARP-2、PARP-3和Vault-PARP。PARP在DNA修复通路中起关键作用。DNA损伤断裂时会激活PARP，它作为DNA损伤的一种分子感受器，具有识别、结合到DNA断裂位置的功能，进而激活、催化受体蛋白的聚ADP核糖基化作用，参与DNA的修复过程。
PARP抑制剂可通过介导合成致死来发挥抗肿瘤效应。除了PARP介导的DNA修复，还存在其他DNA修复机制。同源重组(Homologous Recombination)，是指发生在非姐妹染色单体之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。DNA同源重组修复(Homologous Recombination Repair，HRR)是DNA双链损伤的重要修复方式，BRCA1和BRCA2是该过程的关键蛋白，如果BRCA基因出现突变导致BRCA1和BRCA2蛋白失去功能，就会引起HRR功能异常，即HRD(Homologous Recombination Deficiency)。其它HRR相关基因如PALB2,ATM,BRCA1/2,CHEK2,BARD1,BRIP1,Mre11,CDK12，RAD50,NBS1,RAD51C,RAD51D及PALB2等异常、或BRCA1基因启动子发生甲基化、以及其它暂未明确的原因，上述都会引起HRD，导致基因组不稳定(Lord CJ,Ashworth A.Science.2017；355(6330):1152-1158.)。癌症和肿瘤基因图谱(TCGA)研究发现超过50％高级别浆液性卵巢癌存在HRD(同源重组修复缺陷)。其中包括BRCA1/2胚系突变(15％)，BRCA1/2体细胞突变(6％)，表观遗传改变的BRCA1启动子甲基化(11％)，EMSY扩增(8％)，PTEN突变(7％)，RAD51C甲基化(3％)，ATM或ATR突变(2％)及其他HRD基因突变(5％)(Turner NC.N Engl J Med.2017；377(25):2490-2492)。
合成致死(Synthetic lethality)是指两个非致死基因同时失活导致细胞死亡的现象。PARP抑制剂可以与PARP1或PARP2催化位点的结合，导致PARP蛋白无法从DNA损伤位点上脱落，进而导致DNA复制叉停滞和DNA复制无法顺利进行，如果当PARP被抑制而HRR相关蛋白又有缺陷时，就导致了合成致死。
对于携带特定DNA修复缺陷(如BRCA1或BRCA2种系基因突变)的肿瘤细胞，抑制PARP可阻碍肿瘤细胞的DNA修复，利用合成致死促进肿瘤细胞的死亡。
PARP抑制剂(PARPi)在卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌等癌症的临床研究表现出良好的疗效，已获批用于携带有同源修复缺陷的卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌和乳腺癌等癌症的治疗(J.Mateo et al.Ann Oncol.2019Sep 1；30(9):1437-1447.)，PARPi在胰腺癌、前列腺癌中也已展示出良好的药效。对于未携带DNA修复缺陷(如BRCA1或BRCA2种系基因突变)的肿瘤，PARPi依然表现出抗肿瘤效果。尼拉帕利在NOVA临床研究中，与安慰剂对比，无论患者是否携带有同源重组修复缺陷基因突变，其PFS均得到显著延长(Mirza MR et al.NEngl J Med 2016；375(22):2154–2164.)，其它PARPi，如奥拉帕利、芦卡帕利等，亦在不携带有同源重组修复缺陷基因突变的肿瘤患者中展现出了良好的药效(J.Mateo et al.AnnOncol.2019 Sep 1；30(9):1437-1447.)。
目前已经获批上市的PARP抑制剂共有四款，分别是阿斯利康的奥拉帕利(Olaparib)、美国克洛维斯肿瘤公司的芦卡帕利(Rucaparib)、Tesaro公司的尼拉帕利(Niraparib)以及辉瑞的他拉唑帕利(Talazoparib)。中国恒瑞医药的氟唑帕利(Fluzoparib)在中国获批用于既往经过二线及以上化疗的伴有胚系BRCA突变的铂敏感复发性卵巢癌、输卵管癌或原发性腹膜癌患者的治疗。此外，尚有veliparib ER、ABT-472、ABT-767、Stenoparib、AST-6828、AG-PD、ANG-2864、ANG-3038、ANG-3186、AZD-5305、AZ-0108、AZD-2461、AMXI-5001、AMXI-2001、AMXI-3001、AMXI-7001、AMXI-9001、pamiparib、ZYTP-1、CK-102、XZ-120312、YHP-743、iobenguane I 131、rucaparib camsylate、CVL-218、CPH-101、CPH-102、CBX-11、CBX-15、minocycline、DB-207、DPS-102、E-7016、iobenguane I131、MK-2512、HCX-014、HWH-340、IDX-1197、IDX-1197、senaparib、IMP-04100、IMP-04111、IMP-04149、IMP-04249、IMP-04307、IMP-04356、JPI-289、JPI-547、JPI-283、fluzoparib、GT-1620、iobenguane I 131、DR-2313、MP-124、H-10、NT-125、BGP-15、NMSP-293、NMSP-293、NMSP-118、NMSP-648、NMSP-914、DB-207、NUV-1156、NUV-1176、JPI-289、Stenoparib、OX-401、NU-1025、NU-1085、PLX-376、R-554、RBN-2397、RBN-012759、PJ-34、INO-1001、WW-46、BSI-401、iniparib、SOMCL-9112、SC-10914、HTMC-0435、SRX-3128、TSL-1502、PJ-34、CEP-8983、CK-102、THG-009、talazoparib SR、L-2286、mitoparib、WB-1340等在研发中。
双功能抗体亦称为双特异性抗体(Bispecific Antibody)，是同时靶向两种不同抗原的特异性药物，其可通过免疫分选纯化生产。另外，也可通过基因工程获得，基因工程在结合位点优化，合成形式的考量以及产量等方面都具有相应的灵活性，所以具有一定的优势。目前，其存在形式已被证明有超过45种(Müller D,Kontermann RE.Bispecificantibodies for cancer immunotherapy:Current perspectives.BioDrugs 2010；24:89-98)。目前已开发的多种双特异性抗体为IgG-ScFv形式即Morrison模式(Coloma M.J.,Morrison S.L.Design and production of novel tetravalent bispecificantibodies.Nat Biotechnol.,1997；15:159-163)，由于这种类似于天然存在的IgG形式，其在抗体工程、表达和纯化上所具有的优势，已被证明是双功能抗体的一种理想存在形式(Miller B.R.,Demarest S.J.,et al.,Protein Eng Des Sel 2010；23:549-57；Fitzgerald J,Lugovskoy A.MAbs 2011；3:299-309)。
临床前研究发现，PARPi可以触发免疫系统对基于新抗原和非新抗原的肿瘤细胞识别，提示其与免疫检查点抑制剂联用可能获得更好的疗效(Mateo J et al.AnnOncol.2019；30(9):1437-1447.)。抑制PARP诱导肿瘤细胞提高PD-L1的表达，形成免疫抑制从而削弱PARPi的疗效，因此，抑制PARP的同时阻断PD-(L)1可避免形成免疫抑制，从而使得PARPi和PD-(L)1抑制剂发挥更强的抗肿瘤活性(Jiao S et al.Clin Cancer Res.2017；23(14):3711-3720.)。另一方面，对于肿瘤细胞来说，相关基因突变导致其特定DNA修复缺陷，DNA损伤的积累使得肿瘤细胞与正常细胞差别增大，更容易被免疫系统识别，且肿瘤变异越多，其生存就越依赖对免疫系统的抑制。因此PARPi与PD-1药物联合用药具有一定理论基础。除PD-1外，如抗PD-1/VEGFA双特异性抗体，同时还阻断在肿瘤微环境中和PD-1的表达具有很强的相关性的VEGF-A，通过抑制血管生成等机制遏制肿瘤进展。
开发更有效的治疗手段或者联合给药治疗方案具有巨大的临床意义。
发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，开展了抗PD-1-抗VEGFA抗体和PARP抑制剂联合应用在肿瘤治疗中的研究，发现二者的联用具有良好的治疗和/或预防肿瘤特别是恶性肿瘤的效果。由此提供了下述发明：
本发明的一个方面涉及一种药物组合，其包括至少一种双特异性抗体，以及至少一种PARP抑制剂；
其中，所述双特异性抗体包括：
靶向PD-1的第一蛋白功能区，和
靶向VEGFA的第二蛋白功能区；
其中，所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白，所述第二蛋白功能区为单链抗体；或者，所述第一蛋白功能区为单链抗体，所述第二蛋白功能区为免疫球蛋白；
其中，
所述的免疫球蛋白，其重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:28－30所示的HCDR1－HCDR3，其轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:31－33所示的LCDR1－LCDR3；和所述的单链抗体，其重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:34－36所示的HCDR1－HCDR3并且其轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:37－39所示的LCDR1－LCDR3；
或者，
所述的免疫球蛋白，其重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:34－36所示的HCDR1－HCDR3并且其轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:37－39所示的LCDR1－LCDR3；和所述的单链抗体，其重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:28－30所示的HCDR1－HCDR3，其轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:31－33所示的LCDR1－LCDR3；
所述免疫球蛋白为人IgG1亚型；
其中，按照EU编号系统，所述免疫球蛋白的重链恒定区在第234位点、235位点和237位点中的任意2个位点或3个位点发生突变，并且突变后，双特异性抗体与FcγRIIIa和/或C1q的亲和力常数相比突变前降低；优选地，所述亲和力常数通过Fortebio Octet分子相互作用仪测得。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述的药物组合，其中，按照EU编号系统，所述免疫球蛋白的重链恒定区具有如下突变：
L234A和L235A；或者
L234A和G237A；或者
L235A和G237A；
或者
L234A、L235A、G237A。
本发明中，如果没有特别说明，位点之前的字母表示突变前的氨基酸，位点之后的字母表示突变后的氨基酸。
本发明还涉及一种药物组合，其包括至少一种双特异性抗体，以及至少一种PARP抑制剂；
其中，所述双特异性抗体包括：
靶向PD-1的第一蛋白功能区，和
靶向VEGFA的第二蛋白功能区；
其中，所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白，所述第二蛋白功能区为单链抗体；或者，所述第一蛋白功能区为单链抗体，所述第二蛋白功能区为免疫球蛋白；
其中，
所述的免疫球蛋白，其重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:28－30所示的HCDR1－HCDR3，其轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:31－33所示的LCDR1－LCDR3；和所述的单链抗体，其重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:34－36所示的HCDR1－HCDR3并且其轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:37－39所示的LCDR1－LCDR3；
或者，
所述的免疫球蛋白，其重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:34－36所示的HCDR1－HCDR3并且其轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:37－39所示的LCDR1－LCDR3；和所述的单链抗体，其重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:28－30所示的HCDR1－HCDR3，其轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:31－33所示的LCDR1－LCDR3；
所述免疫球蛋白为人IgG1亚型。
本发明还涉及一种药物组合，其包括至少一种双特异性抗体，以及至少一种PARP抑制剂；
其中，所述双特异性抗体包括：
靶向PD-1的第一蛋白功能区，和
靶向VEGFA的第二蛋白功能区；
其中，所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白，所述第二蛋白功能区为单链抗体；或者，所述第一蛋白功能区为单链抗体，所述第二蛋白功能区为免疫球蛋白；
其中，
所述的免疫球蛋白，其重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:28－30所示的HCDR1－HCDR3，其轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:31－33所示的LCDR1－LCDR3；和所述的单链抗体，其重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:34－36所示的HCDR1－HCDR3并且其轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:37－39所示的LCDR1－LCDR3；
或者，
所述的免疫球蛋白，其重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:34－36所示的HCDR1－HCDR3并且其轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:37－39所示的LCDR1－LCDR3；和所述的单链抗体，其重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:28－30所示的HCDR1－HCDR3，其轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:31－33所示的LCDR1－LCDR3；
所述免疫球蛋白为人IgG1亚型；
其中，按照EU编号系统，所述免疫球蛋白的重链恒定区具有如下突变组合之一：
L234A和L235A；或者
L234A和G237A；或者
L235A和G237A；或者
L234A、L235A、G237A。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述的药物组合，其中，按照EU编号系统，所述免疫球蛋白的重链恒定区具有或还具有选自如下的一个或多个突变：
N297A、D265A、D270A、P238D、L328E、E233D、H268D、P271G、A330R、C226S、C229S、E233P、P331S、S267E、L328F、A330L、M252Y、S254T、T256E、N297Q、P238S、P238A、A327Q、A327G、P329A、K322A、T394D、G236R、G236A、L328R、A330S、P331S、H268A、E318A和K320A。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述的药物组合，其中，
所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:9；并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:17；
或者，
所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:9；并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11和SEQ IDNO:17；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述的药物组合，其选自如下的(1)－(12)中的任一项：
(1)
所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:7所示；
(2)
所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:11所示；
(3)
所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:17所示；
(4)
所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:7所示；
(5)
所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:11所示；
(6)
所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:17所示；
(7)
所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示；
(8)
所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:3所示；
(9)
所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:3所示；
(10)
所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示；
(11)
所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:3所示；以及
(12)
所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:3所示。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述的药物组合：
所述免疫球蛋白的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，并且其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述的药物组合，其中，所述双特异性抗体为IgG-scFv形式即Morrison模式。
在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合，其中，
所述免疫球蛋白的重链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区，并且所述免疫球蛋白的轻链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的轻链恒定区。
在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合，其中，
所述的免疫球蛋白，其重链恒定区为人Ig gamma-1chain C region或人Iggamma-4chain C region，并且其轻链恒定区为人Ig kappa chain C region。
在本发明的一些实施方案中，所述免疫球蛋白的恒定区是人源化的，例如，重链恒定区采用Ig gamma-1chain C region，ACCESSION:P01857；轻链恒定区采用Ig kappachain C region，ACCESSION:P01834；或者
所述免疫球蛋白的重链恒定区采用Ig gamma-4chain C region，ACCESSION:P01861.1；轻链恒定区采用Ig kappa chain C region，ACCESSION:P01834。
在本发明的一个实施方式中，重链恒定区Ig gamma-1 chain C region(ACCESSION:P01857)的氨基酸序列如下：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:40)
在本发明的一个实施方式中，重链恒定区Ig gamma-4chain C region(ACCESSION:P01861.1)的氨基酸序列如下：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:41)
在本发明的一个实施方式中，轻链恒定区Ig kappa chain C region(ACCESSION:P01834)的氨基酸序列如下：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:42)
在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合，其中，所述单链抗体连接在免疫球蛋白的重链的C末端。由于免疫球蛋白由两条重链，因此，一个免疫球蛋白分子连接有两个单链抗体分子。优选地，两个单链抗体分子相同。
在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合，其中，所述单链抗体为两条，每条单链抗体的一端分别连接在免疫球蛋白的两条重链的C末端或N末端。
在本发明的一些实施方式中，所述单链抗体的VH与VL之间存在二硫键。在抗体的VH和VL之间引入二硫键的方法是本领域熟知的，例如可参见美国专利US5,747,654；Rajagopal et.al，Prot.Engin.10(1997)1453-1459；Reiter et.al，Nat.Biotechnol.14(1996)1239-1245；Reiter et.al，Protein Engineering 8(1995)1323-1331；Webberet.al，Molecular Immunology 32(1995)249-258；Reiter et.al，Immunity 2(1995)281-287；Reiter et.al，JBC 269(1994)18327-18331；Reiter et.al，Inter.J.of Cancer 58(1994)142-149；或者Reiter et.al，Cancer Res.54(1994)2714-2718；其通过引用并入本文。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述的药物组合，其中，所述第一蛋白功能区与所述第二蛋白功能区直接连接或者通过连接片段连接；和/或所述单链抗体的重链可变区与所述单链抗体的轻链可变区直接连接或者通过连接片段连接。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述的药物组合，其中，所述连接片段为(GGGGS)n，n为正整数；优选地，n为1、2、3、4、5或6。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述的药物组合，其中，所述第一蛋白功能区和第二蛋白功能区独立地为1个、2个或者2个以上。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述的药物组合，其中，所述单链抗体连接在免疫球蛋白的重链的C末端。
本发明还涉及一种药物组合，其包括至少一种双特异性抗体，以及至少一种PARP抑制剂；
其中，所述双特异性抗体包括：
靶向PD-1的第一蛋白功能区，和
靶向VEGFA的第二蛋白功能区；
所述第一蛋白功能区为1个，所述第二蛋白功能区为2个；
其中，所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白，所述第二蛋白功能区为单链抗体；
所述免疫球蛋白的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，并且其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示；
所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；
所述单链抗体连接在免疫球蛋白的重链的C末端；
所述第一蛋白功能区与所述第二蛋白功能区通过第一连接片段连接；并且所述单链抗体的重链可变区与所述单链抗体的轻链可变区通过第二连接片段连接；所述第一连接片段和所述第二连接片段相同或不同；
优选地，所述第一连接片段和所述第二连接片段的氨基酸序列独立地选自SEQ IDNO:18和SEQ ID NO:19；
优选地，所述第一连接片段和所述第二连接片段的氨基酸序列均如SEQ ID NO:18所示。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述的药物组合，其中，所述双特异性抗体或其抗原结合片段以小于大约10-6M，例如小于大约10-7M、10-8M或10-9M或更小的亲和力常数结合FcγRI；优选地，所述亲和力常数通过Fortebio Octet分子相互作用仪测得。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述的药物组合，其中，所述双特异性抗体或其抗原结合片段以小于大约10-9M，例如小于大约10-7M、10-8M或10-9M或更小的亲和力常数结合C1q；优选地，所述亲和力常数通过Fortebio Octet分子相互作用仪测得。
在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合，其中，所述的双特异性抗体或其抗原结合片段以小于10-5M，例如小于10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的KD结合VEGFA蛋白和/或PD-1蛋白；优选地，所述KD通过Fortebio分子相互作用仪测得。
在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合，其中，
所述的双特异性抗体或其抗原结合片段以小于1nM、小于0.5nM、小于0.2nM、小于0.15nM或小于0.14nM的EC50结合VEGFA蛋白；优选地，所述EC50通过间接ELISA方法测得；
和/或，
所述的双特异性抗体或其抗原结合片段以小于1nM、小于0.5nM、小于0.2nM、小于0.17nM、小于0.16nM或小于0.15nM的EC50结合PD-1蛋白；优选地，所述EC50通过间接ELISA方法测得。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述双特异性抗体为单克隆抗体。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述双特异性抗体为人源化抗体。
在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合，其中，所述PARP抑制剂选自奥拉帕利、芦卡帕利、尼拉帕利、他拉唑帕利、氟唑帕利、veliparib ER、ABT-472、ABT-767、Stenoparib、AST-6828、AG-PD、ANG-2864、ANG-3038、ANG-3186、AZD-5305、AZ-0108、AZD-2461、AMXI-5001、AMXI-2001、AMXI-3001、AMXI-7001、AMXI-9001、pamiparib、ZYTP-1、CK-102、XZ-120312、YHP-743、iobenguane I 131、rucaparib camsylate、CVL-218、CPH-101、CPH-102、CBX-11、CBX-15、minocycline、DB-207、DPS-102、E-7016、iobenguane I 131、MK-2512、HCX-014、HWH-340、IDX-1197、IDX-1197、senaparib、IMP-04100、IMP-04111、IMP-04149、IMP-04249、IMP-04307、IMP-04356、JPI-289、JPI-547、JPI-283、fluzoparib、GT-1620、iobenguane I 131、DR-2313、MP-124、H-10、NT-125、BGP-15、NMSP-293、NMSP-293、NMSP-118、NMSP-648、NMSP-914、DB-207、NUV-1156、NUV-1176、JPI-289、Stenoparib、OX-401、NU-1025、NU-1085、PLX-376、R-554、RBN-2397、RBN-012759、PJ-34、INO-1001、WW-46、BSI-401、iniparib、SOMCL-9112、SC-10914、HTMC-0435、SRX-3128、TSL-1502、PJ-34、CEP-8983、CK-102、THG-009、talazoparib SR、L-2286、mitoparib和WB-1340中的一种或多种。
在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合，其还包含一种或多种肿瘤化疗药物；
优选地，所述肿瘤化疗药物选自拓扑异构酶II(TOP2)抑制剂，优选地，所述拓扑异构酶II(TOP2)抑制剂是依托泊苷；
优选地，所述肿瘤化疗药物选自紫杉醇类药物，优选地，所述紫杉醇类药物选自紫杉醇、白蛋白紫杉醇、脂质体紫杉醇和多烯紫杉醇(多西他赛)；
优选地，所述肿瘤化疗药物选自铂类药物，优选地，所述铂类药物选自顺铂、卡铂和奥沙利铂；
优选地，所述肿瘤化疗药物选自吉西他滨、培美曲塞和卡培他滨中的一种或多种。
在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合，其中，所述药物组合为固定组合，例如呈固体药物组合物形式或液体药物组合物形式；或者
所述药物组合是非固定组合，例如所述双特异性抗体、PARP抑制剂和肿瘤化疗药物各自呈药物组合物形式。
在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合，其中，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
本发明的药物组合物可以配制成药学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。本发明的药物组合物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如，可通过下述方法来制备无菌注射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的本发明的双特异性抗体，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如无菌无热原水。
此外，本发明的双特异性抗体或者PARP抑制剂可以以单位剂量形式存在于药物组合物中，以便于施用。在某些实施方案中，所述单位剂量为至少1mg，至少5mg，至少10mg，至少15mg，至少20mg，至少25mg，至少30mg，至少45mg，至少50mg，至少75mg，或至少100mg。在所述药物组合物为液体(例如，注射剂)剂型的情况下，其可以包含浓度至少为0.1mg/ml，如至少0.25mg/ml，至少0.5mg/ml，至少1mg/ml，至少2.5mg/ml，至少5mg/ml，至少8mg/ml，至少10mg/ml，至少15mg/ml，至少25mg/ml，至少50mg/ml，至少75mg/ml，或至少100mg/ml的本发明的双特异性抗体。
本发明的双特异性抗体或药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在一个优选的实施方案中，本发明的双特异性抗体或药物组合物通过静脉输注或注射给予。
本发明所提供的双特异性抗体或药物组合物可以单独使用或联合使用，也可以与另外的药学活性剂(例如肿瘤化疗药物)联合使用。这种另外的药学活性剂可以在施用本发明的双特异性抗体或本发明的药物组合物之前、同时或之后施用。
在本发明中，可调整给药方案以获得最佳目的反应(例如治疗或预防反应)。例如，可以单次给药，可以在一段时间内多次给药，或者可以随治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。
本发明的双特异性抗体是本发明中任一项所述的双特异性抗体，是抗PD-1-抗VEGFA双特异性抗体。
本发明的另一方面涉及一种药盒产品，其包含本发明中任一项所述的药物组合，以及产品说明书。
本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的药物组合或者本发明的药盒产品在制备治疗和/或预防恶性肿瘤的药物中的用途；
优选地，所述恶性肿瘤选自卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、宫颈癌、输卵管癌、腹膜癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、肝癌、皮肤癌、胶质瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、肾肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、胃肠道癌、脑癌、食管癌例如食管鳞癌、微卫星高度不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)癌、尿路上皮癌、间皮瘤、胃腺癌、胃食管结合部腺癌、白血病、骨髓瘤、甲状腺癌、头颈癌、骨癌、胆道癌和睾丸癌；
优选地，所述肿瘤为存在同源重组介导的修复功能缺陷(例如BRCA1突变和/或BRCA2突变)的肿瘤；
优选地，所述肿瘤为不存在同源重组介导的修复功能缺陷的肿瘤；
优选地，所述肺癌为非小细胞性肺癌、小细胞肺癌；
优选地，所述非小细胞性肺癌为EGFR和/或ALK敏感突变的非小细胞肺癌；
优选地，所述非小细胞性肺癌为不携带EGFR和/或ALK敏感突变的非小细胞肺癌；
优选地，所述肝癌为肝细胞癌；
优选地，所述肾肿瘤为肾细胞癌；
优选地，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌；
优选地，所述尿路上皮癌为膀胱癌；
优选地，所述腹膜癌为原发性腹膜癌；
优选地，所述卵巢癌为存在同源重组介导的修复功能缺陷(例如BRCA1突变和/或BRCA2突变)的卵巢癌；
优选地，所述输卵管癌为存在同源重组介导的修复功能缺陷(例如BRCA1突变和/或BRCA2突变)的输卵管癌；
优选地，所述腹膜癌为存在同源重组介导的修复功能缺陷(例如BRCA1突变和/或BRCA2突变)的腹膜癌；
优选地，所述乳腺癌为存在同源重组介导的修复功能缺陷(例如BRCA1突变和/或BRCA2突变)的乳腺癌。
本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的药物组合或者本发明的药盒产品在制备如下药物中的用途：
(1)
检测样品中的VEGFA水平的药物或试剂，
阻断VEGFA与VEGFR2结合的药物或试剂，
下调VEGFA的活性或其水平的药物或试剂，
解除VEGFA对血管内皮细胞增殖的刺激作用的药物或试剂，
抑制血管内皮细胞增殖的药物或试剂，或者
阻断肿瘤血管生成的药物或试剂；
和/或
(2)
阻断PD-1与PD-L1结合的药物或试剂，
下调PD-1的活性或其水平的药物或试剂，
解除PD-1对机体免疫抑制的药物或试剂，
促进T淋巴细胞中IFN-γ分泌的药物或试剂，或者
促进T淋巴细胞中IL-2分泌的药物或试剂。
本发明的体外实验中，抗VEGFA抗体及抗VEGFA-抗PD-1双特异性抗体均能抑制HUVEC细胞增殖，抗PD-1抗体及抗VEGFA-抗PD-1双特异性抗体均能促进IFNγ和/或IL-2的分泌激活免疫反应。
本发明的再一方面涉及一种治疗和/或预防恶性肿瘤的方法，包括给予有需求的受试者以有效量的本发明中任一项所述的药物组合或者本发明的药盒产品的步骤；
优选地，所述恶性肿瘤选自卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、宫颈癌、输卵管癌、腹膜癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、肝癌、皮肤癌、胶质瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、肾肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、胃肠道癌、脑癌、食管癌如食管鳞癌、微卫星高度不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)癌、尿路上皮癌、间皮瘤、胃腺癌、胃食管结合部腺癌、白血病、骨髓瘤、甲状腺癌、头颈癌、骨癌、胆道癌和睾丸癌；
优选地，所述肿瘤为存在同源重组介导的修复功能缺陷(例如BRCA1突变和/或BRCA2突变)的肿瘤；
优选地，所述肿瘤为不存在同源重组介导的修复功能缺陷的肿瘤；
优选地，所述肺癌为非小细胞性肺癌、小细胞肺癌；
优选地，所述非小细胞性肺癌为EGFR和/或ALK敏感突变的非小细胞肺癌；
优选地，所述非小细胞性肺癌为不携带EGFR和/或ALK敏感突变的非小细胞肺癌；
优选地，所述肝癌为肝细胞癌；
优选地，所述肾肿瘤为肾细胞癌；
优选地，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌；
优选地，所述尿路上皮癌为膀胱癌；
优选地，所述腹膜癌为原发性腹膜癌；
优选地，所述卵巢癌为存在同源重组介导的修复功能缺陷(例如BRCA1突变和/或BRCA2突变)的卵巢癌；
优选地，所述输卵管癌为存在同源重组介导的修复功能缺陷(例如BRCA1突变和/或BRCA2突变)的输卵管癌；
优选地，所述腹膜癌为存在同源重组介导的修复功能缺陷(例如BRCA1突变和/或BRCA2突变)的腹膜癌；
优选地，所述乳腺癌为存在同源重组介导的修复功能缺陷(例如BRCA1突变和/或BRCA2突变)的乳腺癌。
在本发明的一些实施方式中，所述的治疗和/或预防恶性肿瘤的方法，其中，在手术之前或之后给药，和/或在放疗之前或之后给药。
在本发明的一些实施方式中，所述的治疗和/或预防恶性肿瘤的方法，其中，所述双特异性抗体的单次给药剂量为每千克体重0.1-100mg，优选每千克体重5-50mg或5-15mg；
每3天、4天、5天、6天、10天、1周、2周或3周给药一次；
和/或
给药方式为静脉滴注或静脉注射。
在本发明的一些实施方式中，所述的治疗和/或预防恶性肿瘤的方法，其中，PARP抑制剂的单次给药剂量为每千克体重0.1-100mg，优选每千克体重5-50mg或5-15mg；
每3天、4天、5天、6天、10天、1周、2周或3周给药一次；
和/或
给药方式为静脉滴注或静脉注射。
在本发明的一些实施方式中，所述的治疗和/或预防恶性肿瘤的方法，其中，所述双特异性抗体与PARP抑制剂同时给药或者不同时给药。
本发明的双特异性抗体和/或PARP抑制剂的治疗或预防有效量的典型非极限范围是0.02－100mg/kg，例如0.1－50mg/kg，0.1－25mg/kg，或1－10mg/kg。应注意的是，剂量可随需要治疗的症状的类型和严重性不同而发生变化。此外，本领域技术人员理解，对于任一特定患者，特定的给药方案应根据患者需要和医生的专业评价而随时间调整；此处给出的剂量范围只用于举例说明目的，而不限定本发明药物组合物的使用或范围。
在本发明中，所述受试者可以为哺乳动物，例如人。
本发明的再一方面涉及一种在体内或在体外的方法，其选自：
(1)
检测样品中的VEGFA水平的方法，
阻断VEGFA与VEGFR2结合的方法，
下调VEGFA的活性或其水平的方法，
解除VEGFA对血管内皮细胞增殖的刺激作用的方法，
抑制血管内皮细胞增殖的药物或试剂的方法，或者
阻断肿瘤血管生成的方法；
和/或
(2)
阻断PD-1与PD-L1结合的方法，
下调PD-1的活性或其水平的方法，
解除PD-1对机体免疫抑制的方法，
促进T淋巴细胞中IFN-γ分泌的方法，或者
促进T淋巴细胞中IL-2分泌的方法。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述的药物组合或者药盒产品，其用于治疗和/或预防恶性肿瘤；
优选地，所述恶性肿瘤选自卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、宫颈癌、输卵管癌、腹膜癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、肝癌、皮肤癌、胶质瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、肾肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、胃肠道癌、脑癌、食管癌例如食管鳞癌、微卫星高度不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)癌、尿路上皮癌、间皮瘤、胃腺癌、胃食管结合部腺癌、白血病、骨髓瘤、甲状腺癌、头颈癌、骨癌、胆道癌和睾丸癌；
优选地，所述肿瘤为存在同源重组介导的修复功能缺陷(例如BRCA1突变和/或BRCA2突变)的肿瘤；
优选地，所述肿瘤为不存在同源重组介导的修复功能缺陷的肿瘤；
优选地，所述肺癌为非小细胞性肺癌、小细胞肺癌；
优选地，所述非小细胞性肺癌为EGFR和/或ALK敏感突变的非小细胞肺癌；
优选地，所述非小细胞性肺癌为不携带EGFR和/或ALK敏感突变的非小细胞肺癌；
优选地，所述肝癌为肝细胞癌；
优选地，所述肾肿瘤为肾细胞癌；
优选地，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌；
优选地，所述尿路上皮癌为膀胱癌；
优选地，所述腹膜癌为原发性腹膜癌；
优选地，所述卵巢癌为存在同源重组介导的修复功能缺陷(例如BRCA1突变和/或BRCA2突变)的卵巢癌；
优选地，所述输卵管癌为存在同源重组介导的修复功能缺陷(例如BRCA1突变和/或BRCA2突变)的输卵管癌；
优选地，所述腹膜癌为存在同源重组介导的修复功能缺陷(例如BRCA1突变和/或BRCA2突变)的腹膜癌；
优选地，所述乳腺癌为存在同源重组介导的修复功能缺陷(例如BRCA1突变和/或BRCA2突变)的乳腺癌。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述的药物组合或者药盒产品，其用于：
(1)
检测样品中的VEGFA水平，
阻断VEGFA与VEGFR2结合，
下调VEGFA的活性或其水平，
解除VEGFA对血管内皮细胞增殖的刺激作用，
抑制血管内皮细胞增殖，或者
阻断肿瘤血管生成；
和/或
(2)
阻断PD-1与PD-L1结合，
下调PD-1的活性或其水平，
解除PD-1对机体免疫抑制，
促进T淋巴细胞中IFN-γ分泌，或者
促进T淋巴细胞中IL-2分泌。
本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的药物组合中的双特异性抗体在制备治疗和/或预防恶性肿瘤的药物中的用途，其中，所述恶性肿瘤选自卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌和乳腺癌；
优选地，所述卵巢癌为存在同源重组介导的修复功能缺陷(例如BRCA1突变和/或BRCA2突变)的卵巢癌；
优选地，所述输卵管癌为存在同源重组介导的修复功能缺陷(例如BRCA1突变和/或BRCA2突变)的输卵管癌；
优选地，所述腹膜癌为存在同源重组介导的修复功能缺陷(例如BRCA1突变和/或BRCA2突变)的腹膜癌；
优选地，所述乳腺癌为存在同源重组介导的修复功能缺陷(例如BRCA1突变和/或BRCA2突变)的乳腺癌。
本发明的再一方面涉及一种治疗和/或预防恶性肿瘤的方法，包括给予有需求的受试者以有效量的本发明中任一项所述的药物组合中的双特异性抗体的步骤，其中，所述恶性肿瘤选自卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌和乳腺癌；
优选地，所述卵巢癌为存在同源重组介导的修复功能缺陷(例如BRCA1突变和/或BRCA2突变)的卵巢癌；
优选地，所述输卵管癌为存在同源重组介导的修复功能缺陷(例如BRCA1突变和/或BRCA2突变)的输卵管癌；
优选地，所述腹膜癌为存在同源重组介导的修复功能缺陷(例如BRCA1突变和/或BRCA2突变)的腹膜癌；
优选地，所述乳腺癌为存在同源重组介导的修复功能缺陷(例如BRCA1突变和/或BRCA2突变)的乳腺癌。
本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的药物组合中的双特异性抗体，其用于治疗和/或预防恶性肿瘤，其中，所述恶性肿瘤选自卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌和乳腺癌；
优选地，所述卵巢癌为存在同源重组介导的修复功能缺陷(例如BRCA1突变和/或BRCA2突变)的卵巢癌；
优选地，所述输卵管癌为存在同源重组介导的修复功能缺陷(例如BRCA1突变和/或BRCA2突变)的输卵管癌；
优选地，所述腹膜癌为存在同源重组介导的修复功能缺陷(例如BRCA1突变和/或BRCA2突变)的腹膜癌；
优选地，所述乳腺癌为存在同源重组介导的修复功能缺陷(例如BRCA1突变和/或BRCA2突变)的乳腺癌。
抗体治疗药物，特别是单克隆抗体已在多种疾病的治疗中取得了良好的疗效。获取这些治疗性抗体的传统实验方法是采用抗原免疫动物，在免疫动物体内获取靶向抗原的抗体，或通过亲和力成熟的方法来改进那些与抗原的亲和力较低的抗体。
轻链和重链的可变区决定抗原的结合；每条链的可变区均含有三个高变区，称互补决定区(CDR)(重链(H Chain)的CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，轻链(L Chain)的CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；其由Kabat等人命名，见Bethesda M.d.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition,NIH Publication(1-3)1991:91-3242.
优选地，CDR也可以由IMGT编号系统定义，请参见Ehrenmann,Francois,QuentinKaas,and Marie-Paule Lefranc.“IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign:adatabase and a tool for immunoglobulins or antibodies,T cell receptors,MHC,IgSF and MhcSF.”Nucleic acids research 38.suppl_1(2009):D301-D307。
通过本领域技术人员所熟知的技术手段，例如通过VBASE2数据库特别是根据IMGT定义分析下面的(1)-(13)项中的单克隆抗体序列的CDR区的氨基酸序列，结果如下：
(1)Bevacizumab
重链可变区的氨基酸序如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示。
其重链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下：
HCDR1:GYTFTNYG(SEQ ID NO:28)
HCDR2:INTYTGEP(SEQ ID NO:29)
HCDR3:AKYPHYYGSSHWYFDV(SEQ ID NO:30)
其轻链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下：
LCDR1:QDISNY(SEQ ID NO:31)
LCDR2:FTS(SEQ ID NO:32)
LCDR3:QQYSTVPWT(SEQ ID NO:33)
(2)14C12、14C12H1L1或14C12H1L1(M)
其重链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下：
HCDR1:GFAFSSYD(SEQ ID NO:34)
HCDR2:ISGGGRYT(SEQ ID NO:35)
HCDR3:ANRYGEAWFAY(SEQ ID NO:36)
其轻链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下：
LCDR1:QDINTY(SEQ ID NO:37)
LCDR2:RAN(SEQ ID NO:38)
LCDR3:LQYDEFPLT(SEQ ID NO:39)
(3)VP101(hG1WT)或VP101(hG1DM)
其重链的9个CDR区的氨基酸序列如下：
HCDR1:GYTFTNYG(SEQ ID NO:28)
HCDR2:INTYTGEP(SEQ ID NO:29)
HCDR3:AKYPHYYGSSHWYFDV(SEQ ID NO:30)
HCDR4:GFAFSSYD(SEQ ID NO:34)
HCDR5:ISGGGRYT(SEQ ID NO:35)
HCDR6:ANRYGEAWFAY(SEQ ID NO:36)
HCDR7:QDINTY(SEQ ID NO:37)
HCDR8:RAN(SEQ ID NO:38)
HCDR9:LQYDEFPLT(SEQ ID NO:39)
其轻链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下：
LCDR1:QDISNY(SEQ ID NO:31)
LCDR2:FTS(SEQ ID NO:32)
LCDR3:QQYSTVPWT(SEQ ID NO:33)。
本发明的抗体VP101(hG1DM)在VP101(hG1WT)非可变区引入氨基酸突变。按照EU编号系统在234、235位点引入氨基酸突变：
通过在其重链铰链区域第234号位点引进了亮氨酸到丙氨酸的点突变(L234A)，第235号位点引进了亮氨酸到丙氨酸的点突变(L235A)，获得VP101(hG1DM)。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，当提及VEGFA蛋白的氨基酸序列时，其包括但不限于VEGFA蛋白(GenBank ID：NP_001165097.1)的全长，还包括VEGFA的融合蛋白，例如与小鼠或人IgG的Fc蛋白片段(mFc或hFc)进行融合的片段。然而，本领域技术人员理解，在VEGFA蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“VEGFA蛋白”应包括所有此类序列，包括其天然或人工的变体。并且，当描述VEGFA蛋白的序列片段时，其还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。在本发明的一个实施方案中，VEGFA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:33的下划线部分所示(不含末尾的6个His，共302个氨基酸)。
如本文中所使用的，当提及VEGFR2蛋白(亦称为KDR)的氨基酸序列时，其包括但不限于VEGFR2蛋白(GenBank ID：NP_002244)的全长，或者VEGFR2的胞外片段VEGFR2-ECD或者包含VEGFR2-ECD的片段；还包括VEGFR2-ECD的融合蛋白，例如与小鼠或人IgG的Fc蛋白片段(mFc或hFc)进行融合的片段。然而，本领域技术人员理解，在VEGFR2蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于置换、缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“VEGFR2蛋白”应包括所有此类序列，包括其天然或人工的变体。并且，当描述VEGFR2蛋白的序列片段时，其还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。在本发明的一个实施方案中，VEGFR2的胞外片段VEGFR2-ECD的氨基酸序列如SEQ IDNO:34所示(766个氨基酸)。
如本文中所使用的，如果没有特别说明，所述VEGFR为VEGFR1和/或VEGFR2；其具体蛋白序列为现有技术中已知序列，可以参考现有文献或者GenBank中公开的序列。例如，VEGFR1(VEGFR1,NCBI Gene ID:2321)；VEGFR2(VEGFR2,NCBI Gene ID:3791)。
如本文中所使用的，当提及PD-1蛋白(Programmed cell death protein 1)的氨基酸序列时，其包括但不限于PD-1蛋白(NCBI GenBank:NP_005009.2)的全长，或者PD-1的胞外片段PD-1ECD或者包含PD-1ECD的片段；还包括PD-1ECD的融合蛋白，例如与小鼠或人IgG的Fc蛋白片段(mFc或hFc)进行融合的片段。然而，本领域技术人员理解，在PD-1蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“PD-1蛋白”应包括所有此类序列，包括其天然或人工的变体。并且，当描述PD-1蛋白的序列片段时，其还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。
如本文中所使用的，术语EC50是指半最大效应浓度(concentration for 50％ofmaximal effect)，是指能引起50％最大效应的浓度。
如本文中所使用的，术语“抗体”是指，是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。从一般意义上，重链可以理解为抗体中分子量较大的多肽链，轻链是指抗体中分子量较小的多肽链。轻链可分类为κ和λ轻链。重链通常可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配可以遵循Kabat Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991))，或者Chothia&Lesk J.Mol.Biol.196(1987):901-917；Chothia et al.Nature 342(1989):878-883或者IMGT编号系统定义，见Ehrenmann,Francois,Quentin Kaas,and Marie-PauleLefranc."IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign:a database and a toolfor immunoglobulins or antibodies,T cell receptors,MHC,IgSF and MhcSF."Nucleic acids research 38.suppl_1(2009):D301-D307.的定义。特别地，重链还可以包含3个以上CDR，例如6、9、或12个。例如在本发明的双特异性抗体中，重链可以是IgG抗体的重链的C端连接另一个抗体的ScFv，这种情况下重链含有9个CDR。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂方法产生抗体的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和具有足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分的多肽。
如本文中所使用的，术语“Fd片段”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段；术语“Fv片段”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等人，Nature 341(1989):544-546)；术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab')2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。
在一些情况下，抗体的抗原结合片段是单链抗体(例如,scFv)，其中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见，例如，Bird等人，Science 242(1988):423-426和Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988):5879-5883)。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993):6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan et al.，Protein Eng.8(1995):725-731，Choi et al.，Eur.J.Immunol.31(2001):94-106，Hu et al.，Cancer Res.56(1996):3055-3061，Kipriyanov et al.，J.Mol.Biol.293(1999):41-56和Roovers et al.，CancerImmunol.(2001)描述。
在一些情况下，抗体的抗原结合片段是双抗体，即，双价抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如,Holliger P.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993):6444-6448，和Poljak R.J.etal.,Structure 2(1994):1121-1123)。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。
在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。
如本文中所使用的，术语“单抗”和“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片断，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(Nature,256:495,1975)，但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.Patent 4,816,567)。
如本文中所使用的，术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类)，而轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类)，但无论如何，其仍保留对目标抗原的结合活性(U.S.Patent 4,816,567Cabillyet al.；Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81(1984):6851-6855)。
如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，人源免疫球蛋白(受体抗体)的全部或部分CDR区被一非人源抗体(供体抗体)的CDR区替换后得到的抗体或抗体片段，其中的供体抗体可以是具有预期特异性、亲和性或反应性的非人源(例如，小鼠、大鼠或兔)抗体。此外，受体抗体的构架区(FR)的一些氨基酸残基也可被相应的非人源抗体的氨基酸残基替换，或被其他抗体的氨基酸残基替换，以进一步完善或优化抗体的性能。关于人源化抗体的更多详细内容，可参见例如，Jones et al.,Nature,321(1986):522-525；Reichmann etal.,Nature,(1988)332:323 329；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2(1992):593-596；和Clark,Immunol.Today 21(2000):397-402。
如本文中所使用的，术语“表位”是指，抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。“表位”在本领域内也称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性的”或“构象的”。参见，例如，EpitopeMapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。
如本文中所使用的，术语“分离的”或“被分离的”指的是，从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”或“被分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。在本发明的一些实施方案中，术语“靶向”是指特异性结合。
如本文中所使用的，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10- 9M或10-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合抗原，例如，如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定或Fortebio分子相互作用仪中测定的。
如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的辅料”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:MackPublishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
如本文中所使用的，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起或预先递送入机体时，其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物试验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂则在临床实验中使用较多。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如PD-1与PD-L1结合或者VEGF表达过高相关的疾病如肿瘤)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如PD-1与PD-L1结合或者VEGF表达过高相关的疾病如肿瘤)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
发明的有益效果
本发明实现了如下的(1)至(6)项中所述技术效果中的任意一项或者任意多项：
(1)本发明对抗体Fc端的改造完全消除了VP101(hG1WT)与FC受体FcγRI、FcγRIIIa_F158的结合活性，进而完全的消除了ADCC活性。
(2)本发明对抗体Fc端的改造完全消除了VP101(hG1WT)与补体C1q的结合活性，进而完全地消除了CDC活性。
(3)本发明的双特异性抗体能够很好地特异性与VEGFA结合，并且能够十分有效地阻断VEGFA与VEGFR2的结合，特异地解除VEGFA对机体免疫抑制以及对血管形成的促进作用。
(4)本发明的双特异性抗体能够很好地与PD-1特异性结合，并且能够十分有效地阻断PD-1与PD-L1的结合，特异地解除PD-1对机体免疫抑制，激活免疫反应。
(5)PARPi和本发明双特异性抗体联合给药对肿瘤特别是乳腺癌或卵巢癌的治疗效果显著优于单用PARPi或双特异性抗体。
(6)PARPi和本发明双特异性抗体之间具有协同作用，取得了治疗或预防肿瘤协同效果。
附图说明
图1：VP101(hG1DM)与FcγRI的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.12nM。
图2：Bevacizumab与FcγRI的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.12nM。
图3：Nivolumab与FcγRI的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.12nM。
图4：VP101(hG1WT)与FcγRI的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.12nM。
图5：VP101(hG4WT)与FcγRI的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.12nM。
图6：VP101(hG1DM)与FcγRIIa_H131的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM。
图7：Bevacizumab与FcγRIIa_H131的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM。
图8：Nivolumab与FcγRIIa_H131的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM。
图9：VP101(hG1WT)与FcγRIIa_H131的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM。
图10：VP101(hG4WT)与FcγRIIa_H131的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM。
图11：VP101(hG1DM)与FcγRIIa_R131的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM。
图12：Bevacizumab与FcγRIIa_R131的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM。
图13：Nivolumab与FcγRIIa_R131的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM。
图14：VP101(hG1WT)与FcγRIIa_R131的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM。
图15：VP101(hG4WT)与FcγRIIa_R131的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM。
图16：VP101(hG1DM)与FcγRIIIa_V158的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM。
图17：Bevacizumab与FcγRIIIa_V158的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM。
图18：Nivolumab与FcγRIIIa_V158的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM。
图19：VP101(hG1WT)与FcγRIIIa_V158的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM。
图20：VP101(hG4WT)与FcγRIIIa_V158的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM。
图21：VP101(hG1DM)与FcγRIIIa_F158的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗原的浓度分别为500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM。
图22：Bevacizumab与FcγRIIIa_F158的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM。
图23：Nivolumab与FcγRIIIa_F158的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM。
图24：VP101(hG1WT)与FcγRIIIa_F158的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM。
图25：VP101(hG4WT)与FcγRIIa_F158的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM。
图26：VP101(hG1DM)与C1q的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为10nM、5nM、2.5nM、1.25nM、0.625nM。
图27：Bevacizumab与C1q的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为10nM、5nM、2.5nM、1.25nM、0.625nM。
图28：Nivolumab与C1q的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为10nM、5nM、2.5nM、1.25nM、0.625nM。
图29：VP101(hG1WT)与C1q的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为10nM、5nM、2.5nM、1.25nM、0.625nM。
图30：VP101(hG4WT)与C1q的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗原的浓度分别为10nM、5nM、2.5nM、1.25nM、0.625nM。
图31：VP101(hG1WT)和VP101(hG1DM)在表达PD-1抗原的CHO-K1-PD1靶细胞体系的ADCC活性检测结果。
图32：VP101(hG1WT)和VP101(hG1DM)在表达PD-1抗原的CHO-K1-PD1靶细胞体系的CDC活性检测结果。
图33：ELISA法检测抗体VP101(hG1DM)对PBMC、Raji-PDL1细胞混合培养所诱导的细胞因子IFN-γ的分泌的影响。
图34：ELISA法检测抗体VP101(hG1DM)对PBMC、Raji-PDL1细胞混合培养所诱导的细胞因子IL-2的分泌的影响。
图35：VP101(hG1DM)在表达PD-1抗原的CHO-K1-PD1靶细胞体系的ADCP活性检测结果。
图36：VP101(hG1DM)在乳垫肿瘤移植模型中抑制乳腺癌肿瘤细胞增殖活性的结果。
图37：PARPi和VP101(hG1DM)联用抑制卵巢癌细胞迁移的结果。
图38：PARPi和VP101(hG1DM)联用对乳腺癌皮下移植肿瘤模型中小鼠皮下移植瘤体积的效果。
图39：PARPi和VP101(hG1DM)联用对乳腺癌皮下移植肿瘤模型中小鼠体重的效果。
图40：PARPi和VP101(hG1DM)联用对卵巢癌皮下移植肿瘤模型中小鼠皮下移植瘤体积的效果。
图41：PARPi和VP101(hG1DM)联用对卵巢癌皮下移植肿瘤模型中小鼠体重的效果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
在本发明的下述实施例中，所用的同靶点已上市药物抗体Bevacizumab(商品名
Figure BDA0003541209030000441
)作为对照抗体，购自豪夫迈·罗氏有限公司Roche，或者也可以参照制备例1进行制备。
在本发明的下述实施例中，所用的同靶点已上市药物抗体Nivolumab(商品名
Figure BDA0003541209030000451
)作为对照抗体，购自百时美施贵宝公司BMS。
在本发明的下述实施例中，所用的PARP抑制剂奥拉帕利Olaparib，购自selleckchem公司。
在本发明的下述实施例中，所用到同型对照抗体为人抗鸡蛋溶酶体(human anti-Hen Egg Lysozyme IgG，anti-HEL，即human IgG，简称hIgG)，其可变区序列来自于Acierno等人发表的Affinity maturation increases the stability and plasticity of theFv domain of anti-protein antibodies(Acierno等人.J Mol Biol.2007；374(1):130-46.。实施例中所用到的hIgG1DM和hIgG4WT即是anti-HEL带有hG1DM和hG4WT恒定区序列的同型对照抗体，在中山康方生物医药有限公司实验室制备而成。
在本发明的下述实施例中，所用的乳腺癌细胞MDA-MB-231、SNU-251卵巢癌细胞和SK-OV-3细胞均存在BRCA1突变和BRCA2突变。
制备例1：抗VEGFA的抗体Bevacizumab的制备
上市的抗VEGFA单抗Avastin(Bevacizumab)的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列参照中国专利公开CN1259962A。编码重链可变区和轻链可变区的核酸序列委托金斯瑞公司合成。
Bevacizumab重链可变区(Bevacizumab-Hv)的氨基酸序列：(123aa)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1)
编码Bevacizumab重链可变区的核酸序列：(369bp)
GAGGTGCAGCTGGTCGAGTCCGGGGGGGGGCTGGTGCAGCCAGGCGGGTCTCTGAGGCTGAGTTGCGCCGCTTCAGGGTACACCTTCACAAACTATGGAATGAATTGGGTGCGCCAGGCACCAGGAAAGGGACTGGAGTGGGTCGGCTGGATCAACACTTACACCGGGGAACCTACCTATGCAGCCGACTTTAAGCGGCGGTTCACCTTCAGCCTGGATACAAGCAAATCCACTGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGAGCTGAGGACACCGCAGTCTACTATTGTGCTAAATATCCCCACTACTATGGGAGCAGCCATTGGTATTTTGACGTGTGGGGGCAGGGGACTCTGGTGACAGTGAGCAGC(SEQID NO:2)
Bevacizumab轻链可变区(Bevacizumab-Lv)的氨基酸序列：(107aa)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:3)
编码Bevacizumab轻链可变区的核酸序列：(321bp)
GATATTCAGATGACTCAGAGCCCCTCCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGGGTCACCATCACATGCAGTGCTTCACAGGATATTTCCAACTACCTGAATTGGTATCAGCAGAAGCCAGGAAAAGCACCCAAGGTGCTGATCTACTTCACTAGCTCCCTGCACTCAGGAGTGCCAAGCCGGTTCAGCGGATCCGGATCTGGAACCGACTTTACTCTGACCATTTCTAGTCTGCAGCCTGAGGATTTCGCTACATACTATTGCCAGCAGTATTCTACCGTGCCATGGACATTTGGCCAGGGGACTAAAGTCGAGATCAAG(SEQ ID NO:4)
重链恒定区均采用Ig gamma-1chain C region，ACCESSION:P01857；轻链恒定区均采用Ig kappa chain C region，ACCESSION:P01834。
将Bevacizumab的重链cDNA和轻链的cDNA分别克隆到pcDNA3.1载体中，获得抗体Bevacizumab的重组表达质粒。将重组质粒转染293F细胞。将293F细胞培养液纯化后进行检测。
制得了抗VEGFA单抗Avastin(Bevacizumab)。
制备例2：抗PD-1的抗体14C12、其人源化抗体14C12H1L1以及突变体14C12H1L1(M) 的序列设计
抗PD-1的抗体14C12及其人源化抗体14C12H1L1的重链和轻链的氨基酸序列、以及编码核酸序列分别与中国专利公开CN 106967172A中的14C12、14C12H1L1相同。
(1)14C12的重链可变区序列和轻链可变区序列
14C12的重链可变区的氨基酸序列：(118aa)
EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVATISGGGRYTYYPDSVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLRSEDTALYYCANRYGEAWFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:5)
编码14C12的重链可变区的核酸序列：(354bp)
GAGGTCAAACTGGTGGAGAGCGGCGGCGGGCTGGTGAAGCCCGGCGGGTCACTGAAACTGAGCTGCGCCGCTTCCGGCTTCGCCTTTAGCTCCTACGACATGTCATGGGTGAGGCAGACCCCTGAGAAGCGCCTGGAATGGGTCGCTACTATCAGCGGAGGCGGGCGATACACCTACTATCCTGACTCTGTCAAAGGGAGATTCACAATTAGTCGGGATAACGCCAGAAATACTCTGTATCTGCAGATGTCTAGTCTGCGGTCCGAGGATACAGCTCTGTACTATTGTGCAAACCGGTACGGCGAAGCATGGTTTGCCTATTGGGGACAGGGCACCCTGGTGACAGTCTCTGCC(SEQ ID NO:6)
14C12的轻链可变区的氨基酸序列：(107aa)
DIKMTQSPSSMYASLGERVTFTCKASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:7)
编码14C12的轻链可变区的核酸序列：(321bp)
GACATTAAGATGACACAGTCCCCTTCCTCAATGTACGCTAGCCTGGGCGAGCGAGTGACCTTCACATGCAAAGCATCCCAGGACATCAACACATACCTGTCTTGGTTTCAGCAGAAGCCAGGCAAAAGCCCCAAGACCCTGATCTACCGGGCCAATAGACTGGTGGACGGGGTCCCCAGCAGATTCTCCGGATCTGGCAGTGGGCAGGATTACTCCCTGACCATCAGCTCCCTGGAGTATGAAGACATGGGCATCTACTATTGCCTGCAGTATGATGAGTTCCCTCTGACCTTTGGAGCAGGCACAAAACTGGAACTGAAG(SEQ ID NO:8)
(2)人源化单克隆抗体14C12H1L1的重链可变区序列和轻链可变区序列、重链序列和轻链序列
14C12H1L1重链可变区的氨基酸序列：(118aa)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKGLDWVATISGGGRYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNNLYLQMNSLRAEDTALYYCANRYGEAWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:9)
编码14C12H1L1重链可变区的核酸序列：(354bp)
GAAGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGGGGAGGGCTGGTGCAGCCCGGCGGGTCACTGCGACTGAGCTGCGCAGCTTCCGGATTCGCCTTTAGCTCCTACGACATGTCCTGGGTGCGACAGGCACCAGGAAAGGGACTGGATTGGGTCGCTACTATCTCAGGAGGCGGGAGATACACCTACTATCCTGACAGCGTCAAGGGCCGGTTCACAATCTCTAGAGATAACAGTAAGAACAATCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCTGAGGACACCGCACTGTACTATTGTGCCAACCGCTACGGGGAAGCATGGTTTGCCTATTGGGGGCAGGGAACCCTGGTGACAGTCTCTAGT(SEQ ID NO:10)
14C12H1L1轻链可变区的氨基酸序列：(107aa)
DIQMTQSPSSMSASVGDRVTFTCRASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDMATYYCLQYDEFPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:11)
编码14C12H1L1轻链可变区的核酸序列：(321bp)
GACATTCAGATGACTCAGAGCCCCTCCTCCATGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGGGTCACCTTCACATGCCGCGCTAGTCAGGATATCAACACCTACCTGAGCTGGTTTCAGCAGAAGCCAGGGAAAAGCCCCAAGACACTGATCTACCGGGCTAATAGACTGGTGTCTGGAGTCCCAAGTCGGTTCAGTGGCTCAGGGAGCGGACAGGACTACACTCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCTGAGGACATGGCAACCTACTATTGCCTGCAGTATGATGAGTTCCCACTGACCTTTGGCGCCGGGACAAAACTGGAGCTGAAG(SEQ ID NO:12)
14C12H1L1重链(14C12H1)的氨基酸序列：(448aa)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKGLDWVATISGGGRYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNNLYLQMNSLRAEDTALYYCANRYGEAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:13)
编码14C12H1L1重链(14C12H1)的核酸序列：(1344bp)
GAAGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGGGGAGGGCTGGTGCAGCCCGGCGGGTCACTGCGACTGAGCTGCGCAGCTTCCGGATTCGCCTTTAGCTCCTACGACATGTCCTGGGTGCGACAGGCACCAGGAAAGGGACTGGATTGGGTCGCTACTATCTCAGGAGGCGGGAGATACACCTACTATCCTGACAGCGTCAAGGGCCGGTTCACAATCTCTAGAGATAACAGTAAGAACAATCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCTGAGGACACCGCACTGTACTATTGTGCCAACCGCTACGGGGAAGCATGGTTTGCCTATTGGGGGCAGGGAACCCTGGTGACAGTCTCTAGTGCCAGCACCAAAGGACCTAGCGTGTTTCCTCTCGCCCCCTCCTCCAAAAGCACCAGCGGAGGAACCGCTGCTCTCGGATGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAACCCGTCACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTCTGACAAGCGGAGTCCATACATTCCCTGCTGTGCTGCAAAGCAGCGGACTCTATTCCCTGTCCAGCGTCGTCACAGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTCAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTGGAGCCCAAATCCTGCGACAAGACACACACCTGTCCCCCCTGTCCTGCTCCCGAACTCCTCGGAGGCCCTAGCGTCTTCCTCTTTCCTCCCAAACCCAAGGACACCCTCATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTCACCTGTGTCGTCGTGGATGTCAGCCATGAGGACCCCGAGGTGAAATTCAACTGGTATGTCGATGGCGTCGAGGTGCACAACGCCAAAACCAAGCCCAGGGAGGAACAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACAGTCCTCCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCTCTCCCTGCCCCCATTGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAAGGCCAACCCAGGGAGCCCCAGGTCTATACACTGCCTCCCTCCAGGGACGAACTCACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAGGGCTTTTATCCCAGCGACATCGCCGTCGAGTGGGAGTCCAACGGACAGCCCGAGAATAACTACAAGACCACCCCTCCTGTCCTCGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAAAGCAGGTGGCAGCAGGGAAACGTGTTCTCCTGCAGCGTGATGCACGAAGCCCTCCACAACCACTACACCCAGAAAAGCCTGTCCCTGAGCCCCGGCAAA(SEQ ID NO:14)
14C12H1L1轻链(14C12L1)的氨基酸序列：(214aa)
DIQMTQSPSSMSASVGDRVTFTCRASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDMATYYCLQYDEFPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:15)
编码14C12H1L1轻链(14C12L1)的核酸序列：(642bp)
GACATTCAGATGACTCAGAGCCCCTCCTCCATGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGGGTCACCTTCACATGCCGCGCTAGTCAGGATATCAACACCTACCTGAGCTGGTTTCAGCAGAAGCCAGGGAAAAGCCCCAAGACACTGATCTACCGGGCTAATAGACTGGTGTCTGGAGTCCCAAGTCGGTTCAGTGGCTCAGGGAGCGGACAGGACTACACTCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCTGAGGACATGGCAACCTACTATTGCCTGCAGTATGATGAGTTCCCACTGACCTTTGGCGCCGGGACAAAACTGGAGCTGAAGCGAACTGTGGCCGCTCCCTCCGTCTTCATTTTTCCCCCTTCTGACGAACAGCTGAAATCAGGCACAGCCAGCGTGGTCTGTCTGCTGAACAATTTCTACCCTAGAGAGGCAAAAGTGCAGTGGAAGGTCGATAACGCCCTGCAGTCCGGCAACAGCCAGGAGAGTGTGACTGAACAGGACTCAAAAGATAGCACCTATTCCCTGTCTAGTACACTGACTCTGTCCAAGGCTGATTACGAGAAGCACAAAGTGTATGCATGCGAAGTGACACATCAGGGACTGTCAAGCCCCGTGACTAAGTCTTTTAACCGGGGCGAATGT(SEQ ID NO:16)
(3)14C12H1L1(M)的重链可变区序列和轻链可变区序列
以14C12H1L1为基础对其骨架区(轻链)中个别氨基酸进行了突变得到14C12H1L1(M)。
14C12H1L1(M)的重链可变区14C12H1(M)：
与14C12H1L1的重链可变区14C12H1相同，即氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
14C12H1L1(M)的轻链可变区14C12L1(M)：(108aa，基于14C12H1L1所做的氨基酸序列突变位点用下划线标出)
DIQMTQSPSSMSASVGDRVTFTCRASQDINTYLSWFQQ KPGKSPKTLIYRANRLVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQP EDMATYYCLQYDEFPLTFGAGTKLELKR(SEQ ID NO:17)
制备例3：双特异性抗体的序列设计
1.序列设计
本发明中的双特异性抗体的结构模式属于Morrison模式(IgG-scFv)，即在一个IgG抗体的两条重链的C端均连接另一个抗体的scFv片段，其重链和轻链的主要组成设计如下面的表1。
在上述Bevacizumab的基础上，以上述14C12H1L1(M)的重链可变区及轻链可变区的氨基酸序列作为ScFv片段部分的VP101抗体，称为VP101(M)。相对于14C12H1L1，14C12H1L1(M)有效地优化了双特异性抗体的结构，提高了其有效性。
表1：VP101(M)和VP101(G4M)的重链和轻链的组成设计
Figure BDA0003541209030000531
上面的表1中:
(1)右下角标注“V”的，是指相应重链的可变区或者相应轻链的可变区。没有标注“V”的，相应重链或者轻链为包含恒定区的全长。这些可变区或者全长的氨基酸序列及其编码核酸序列均参照上面的制备例中记载的相应序列。
(2)Linker1的氨基酸序列为：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:18)
可选地，氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:19)可作为替换前述Linker1的Linker 2。
(3)Bevacizumab-H其采用Ig gamma-1chain C region，ACCESSION:P01857作为重链恒定区。
(4)Bevacizumab-G4H其采用Ig gamma-4 chain Cregion，ACCESSION:P01861.1作为重链恒定区。
2.抗体VP101(M)的表达和纯化
分别将VP101(M)的重链cDNA序列和轻链的cDNA序列克隆到pUC57simple(金斯瑞公司提供)载体中，分别获得pUC57simple-VP101H和pUC57simple-VP101L质粒。
分别将质粒pUC57simple-VP101H和pUC57simple-VP101L进行酶切(HindIII&EcoRI)，电泳回收得到的重链轻链分别亚克隆到pcDNA3.1载体中，提取重组质粒共转染293F细胞。细胞培养7天后，将培养液通过高速离心、上清浓缩后上样至HiTrap MabSelectSuRe柱，用Elution Buffer一步洗脱蛋白并回收目标样品抗体VP101，并换液至PBS。
3.抗体VP101(M)的检测
将纯化后的样品分别加入还原型蛋白电泳上样缓冲液和非还原型蛋白电泳上样缓冲液，煮沸后进行SDS-PAGE电泳检测。
为了与制备例4中的突变后的抗体相区分，在本发明中亦将VP101(M)称为VP101(hG1WT)。上述的VP101(M)作为“野生型”，其采用Ig gamma-1chain C region，ACCESSION:P01857作为重链恒定区，Ig kappa chain C region，ACCESSION:P01834为轻链恒定区。
VP101(hG1WT)中的免疫球蛋白部分的重链的氨基酸序列：(453aa)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:20)
编码VP101(hG1WT)中的免疫球蛋白部分的重链的核酸序列：(1359bp)
GAGGTGCAGCTGGTCGAGTCCGGGGGGGGGCTGGTGCAGCCAGGCGGGTCTCTGAGGCTGAGTTGCGCCGCTTCAGGGTACACCTTCACAAACTATGGAATGAATTGGGTGCGCCAGGCACCAGGAAAGGGACTGGAGTGGGTCGGCTGGATCAACACTTACACCGGGGAACCTACCTATGCAGCCGACTTTAAGCGGCGGTTCACCTTCAGCCTGGATACAAGCAAATCCACTGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGAGCTGAGGACACCGCAGTCTACTATTGTGCTAAATATCCCCACTACTATGGGAGCAGCCATTGGTATTTTGACGTGTGGGGGCAGGGGACTCTGGTGACAGTGAGCAGCGCAAGCACCAAAGGGCCCAGCGTGTTTCCTCTCGCCCCCTCCTCCAAAAGCACCAGCGGAGGAACCGCTGCTCTCGGATGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAACCCGTCACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTCTGACAAGCGGAGTCCATACATTCCCTGCTGTGCTGCAAAGCAGCGGACTCTATTCCCTGTCCAGCGTCGTCACAGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTCAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTGGAGCCCAAATCCTGCGACAAGACACACACCTGTCCCCCCTGTCCTGCTCCCGAACTCCTCGGAGGCCCTAGCGTCTTCCTCTTTCCTCCCAAACCCAAGGACACCCTCATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTCACCTGTGTCGTCGTGGATGTCAGCCATGAGGACCCCGAGGTGAAATTCAACTGGTATGTCGATGGCGTCGAGGTGCACAACGCCAAAACCAAGCCCAGGGAGGAACAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACAGTCCTCCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCTCTCCCTGCCCCCATTGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAAGGCCAACCCAGGGAGCCCCAGGTCTATACACTGCCTCCCTCCAGGGACGAACTCACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAGGGCTTTTATCCCAGCGACATCGCCGTCGAGTGGGAGTCCAACGGACAGCCCGAGAATAACTACAAGACCACCCCTCCTGTCCTCGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACAGCAAACTGACCGTCGATAAATCTAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCTTGTTCCGTGATGCATGAAGCACTGCACAACCATTATACCCAGAAGTCTCTGAGCCTGTCCCCCGGCAAG(SEQ ID NO:21)
为了与制备例4中的突变后的抗体相区分，在本发明中亦将VP101(G4M)称为VP101(hG4WT)。上述的VP101(G4M)作为“野生型”，其采用Ig gamma-4chain C region，ACCESSION:P01861.1作为重链恒定区，Ig kappa chain C region，ACCESSION:P01834为轻链恒定区。
VP101(hG4WT)中的免疫球蛋白部分的重链的氨基酸序列：(450aa)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:22)
编码VP101(hG4WT)中的免疫球蛋白部分的重链的核酸序列：(1350bp)
GAGGTGCAGCTGGTCGAGTCCGGGGGGGGGCTGGTGCAGCCAGGCGGGTCTCTGAGGCTGAGTTGCGCCGCTTCAGGGTACACCTTCACAAACTATGGAATGAATTGGGTGCGCCAGGCACCAGGAAAGGGACTGGAGTGGGTCGGCTGGATCAACACTTACACCGGGGAACCTACCTATGCAGCCGACTTTAAGCGGCGGTTCACCTTCAGCCTGGATACAAGCAAATCCACTGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGAGCTGAGGACACCGCAGTCTACTATTGTGCTAAATATCCCCACTACTATGGGAGCAGCCATTGGTATTTTGACGTGTGGGGGCAGGGGACTCTGGTGACAGTGAGCAGCGCAAGCACCAAAGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGTCTCTGAGCCTGTCCCTCGGCAAG(SEQ ID NO:23)
制备例4：基于人源化双特异性抗体VP101(hG1WT)的非可变区氨基酸突变设计
本发明人在制备例3所获得的VP101(hG1WT)的基础上，通过在其重链的第234号位点引进了亮氨酸到丙氨酸的点突变(L234A)，第235号位点引进了亮氨酸到丙氨酸的点突变(L235A)，获得了VP101(hG1DM)。
VP101(hG1DM)中的免疫球蛋白部分的重链的氨基酸序列：(453aa，突变位点用下划线标出)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:24)
编码VP101(hG1DM)中的免疫球蛋白部分的重链的核酸序列：(1359bp，突变位点用下划线标出)
GAGGTGCAGCTGGTCGAGTCCGGGGGGGGGCTGGTGCAGCCAGGCGGGTCTCTGAGGCTGAGTTGCGCCGCTTCAGGGTACACCTTCACAAACTATGGAATGAATTGGGTGCGCCAGGCACCAGGAAAGGGACTGGAGTGGGTCGGCTGGATCAACACTTACACCGGGGAACCTACCTATGCAGCCGACTTTAAGCGGCGGTTCACCTTCAGCCTGGATACAAGCAAATCCACTGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGAGCTGAGGACACCGCAGTCTACTATTGTGCTAAATATCCCCACTACTATGGGAGCAGCCATTGGTATTTTGACGTGTGGGGGCAGGGGACTCTGGTGACAGTGAGCAGCGCAAGCACCAAAGGGCCCAGCGTGTTTCCTCTCGCCCCCTCCTCCAAAAGCACCAGCGGAGGAACCGCTGCTCTCGGATGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAACCCGTCACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTCTGACAAGCGGAGTCCATACATTCCCTGCTGTGCTGCAAAGCAGCGGACTCTATTCCCTGTCCAGCGTCGTCACAGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTCAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTGGAGCCCAAATCCTGCGACAAGACACACACCTGTCCCCCCTGTCCTGCTCCCGAAGCTGCTGGAGGCCCTAGCGTCTTCCTCTTTCCTCCCAAACCCAAGGACACCCTCATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTCACCTGTGTCGTCGTGGATGTCAGCCATGAGGACCCCGAGGTGAAATTCAACTGGTATGTCGATGGCGTCGAGGTGCACAACGCCAAAACCAAGCCCAGGGAGGAACAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACAGTCCTCCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCTCTCCCTGCCCCCATTGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAAGGCCAACCCAGGGAGCCCCAGGTCTATACACTGCCTCCCTCCAGGGACGAACTCACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAGGGCTTTTATCCCAGCGACATCGCCGTCGAGTGGGAGTCCAACGGACAGCCCGAGAATAACTACAAGACCACCCCTCCTGTCCTCGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACAGCAAACTGACCGTCGATAAATCTAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCTTGTTCCGTGATGCATGAAGCACTGCACAACCATTATACCCAGAAGTCTCTGAGCCTGTCCCCCGGCAAG(SEQ ID NO:25)
VP101(hG1DM)、VP101(hG1WT)以及VP101(hG4WT)的免疫球蛋白部分的轻链氨基酸序列相同，其编码核酸序列也相同。
VP101(hG1DM)中的免疫球蛋白部分的轻链的氨基酸序列：(214aa)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:26)
编码VP101(hG1DM)中的免疫球蛋白部分的轻链的核酸序列：(642bp)
GATATTCAGATGACTCAGAGCCCCTCCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGGGTCACCATCACATGCAGTGCTTCACAGGATATTTCCAACTACCTGAATTGGTATCAGCAGAAGCCAGGAAAAGCACCCAAGGTGCTGATCTACTTCACTAGCTCCCTGCACTCAGGAGTGCCAAGCCGGTTCAGCGGATCCGGATCTGGAACCGACTTTACTCTGACCATTTCTAGTCTGCAGCCTGAGGATTTCGCTACATACTATTGCCAGCAGTATTCTACCGTGCCATGGACATTTGGCCAGGGGACTAAAGTCGAGATCAAGCGGACCGTGGCCGCTCCCAGTGTCTTCATTTTTCCCCCTAGCGACGAACAGCTGAAATCCGGGACAGCCTCTGTGGTCTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCTAGAGAGGCAAAAGTGCAGTGGAAGGTCGATAACGCCCTGCAGAGTGGCAATTCACAGGAGAGCGTGACAGAACAGGACTCCAAAGATTCTACTTATAGTCTGTCAAGCACACTGACTCTGAGCAAGGCTGACTACGAAAAGCATAAAGTGTATGCATGTGAGGTCACCCACCAGGGGCTGAGCAGTCCAGTCACCAAGTCATTCAACAGAGGCGAGTGC(SEQ ID NO:27)
实施例1：FcγRI与VP101(hG1WT)和VP101(hG1DM)的亲和力常数测定
Fc受体FcγRI又名(CD64)可与IgG抗体的Fc端结合，参与抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。治疗性单克隆抗体与Fc受体结合的能力影响到该抗体的安全性和有效性。
本实验使用Fortebio Octet分子相互作用仪检测VP101(hG1WT)和VP101(hG1DM)与FcγRI的亲和力常数，以评价各抗体的ADCC活性。
Fortebio Octet分子相互作用仪检测相应抗体与FcγRI的亲和力常数实验方法简述如下：样品稀释缓冲液为PBS，0.02％Tween-20，0.1％BSA，pH7.4。1μg/mL的FcγRIa固定在HIS1K传感器上，时间50s，传感器在缓冲液中平衡60s，固定在传感器上的CD64与各抗体结合，抗体浓度为3.12-50nM(两倍稀释)，时间120s，抗体在缓冲液中解离，时间120s。传感器使用10mM甘氨酸，pH1.5再生，时间5s，重复4次。检测温度为30℃，频率为0.3Hz。数据以1:1模型拟合分析，得到亲和力常数。
FcγRI与VP101(hG1WT)、VP101(hG4WT)和VP101(hG1DM)以及对照抗体Nivolumab、Bevacizumab的亲和力常数测定结果如表1和图1－图5所示。
表1：VP101(hG1WT)和VP101(hG1DM)抗体及其亚型与FcγRI结合的动力学参数
Figure BDA0003541209030000621
N/A表示抗体与抗原没有结合或结合信号极低，没有对结果进行分析，故未能获得相应数据。
结果显示，VP101(hG1WT)可以与FcγRI结合，亲和力常数为3.95E-09M；VP101(hG4WT)可以与FcγRI结合，亲和力常数为8.52E-09M；Bevacizumab可以与FcγRI结合，亲和力常数为3.68E-09M；Nivolumab可以与FcγRI结合，亲和力常数为6.20E-09M；而VP101(hG1DM)由于与FcγRI没有结合或结合信号极低，没有对结果进行分析，故而未能获得相应数据。
结果表明，除VP101(hG1DM)与FcγRI没有结合外，其他抗体与FcγRI的亲和力均相近。VP101(hG1DM)的结合活性被有效地消除。
实施例2：FcγRIIa_H131与VP101(hG1WT)和VP101(hG1DM)的亲和力常数测定
Fc受体FcγRIIa_H131又名(CD32a_H131)可与IgG抗体的Fc端结合，介导ADCC。
本实验使用Fortebio Octet分子相互作用仪检测VP101(hG1WT)和VP101(hG1DM)与FcγRIIa_H131的亲和力常数，以评价各抗体的ADCC活性。
Fortebio Octet分子相互作用仪检测VP101(hG1WT)和VP101(hG1DM)与FcγRIIa_H131的亲和力常数实验方法简述如下：固化物稀释液为PBS，0.02％Tween-20，0.1％BSA，pH7.4，分析物稀释缓冲液为PBS，0.02％Tween-20，0.02％casein，0.1％BSA，pH7.4。5μg/mL的FcγRIIa_H131固定在NTA传感器上，固定时间为60s，传感器在PBS，0.02％Tween-20，0.02％casein，0.1％BSA，pH7.4缓冲液中平衡600s以封闭传感器，固定在传感器上的FcγRIIa_H131与抗体结合，抗体浓度为12.5-200nM(两倍梯度稀释)，时间60s，抗体在缓冲液中解离，时间60s。传感器使用10mM Glycine，pH1.7和10mM硫酸镍再生。检测温度为30℃，频率为0.6Hz。数据以1:1模型拟合分析，得到亲和力常数。
FcγRIIa_H131与VP101(hG1WT)、VP101(hG4WT)和VP101(hG1DM)以及对照抗体Nivolumab、Bevacizumab的亲和力常数测定结果如表2和图6－图10所示。
表2：VP101(hG1WT)和VP101(hG1DM)抗体及其亚型与FcγRIIa_H131结合的动力学参数
Figure BDA0003541209030000641
N/A表示抗体与抗原没有结合或结合信号极低，没有对结果进行分析，故未能获得相应数据。
结果显示，VP101(hG1WT)可以与FcγRIIa_H131结合，亲和力常数为2.28E-08M；VP101(hG4WT)可以与FcγRIIa_H131结合，亲和力常数为3.68E-08M；Bevacizumab可以与FcγRIIa_H131结合，亲和力常数为6.44E-08M；VP101(hG1DM)可以与FcγRIIa_H131结合，亲和力常数为3.57E-08M；而Nivolumab由于与FcγRIIa_H131没有结合或结合信号极低，没有对结果进行分析，故而未能获得相应数据。
结果表明，除Nivolumab与FcγRIIa_H131没有结合外，其他抗体与FcγRIIa_H131均有结合，其亲和力从强到弱依次为：VP101(hG1WT)、VP101(hG1DM)、VP101(hG4WT)、Bevacizumab。
实施例3：FcγRIIa_R131与VP101(hG1WT)和VP101(hG1DM)的亲和力常数测定
Fc受体FcγRIIa_R131(又名CD32a_R131)可与IgG抗体的Fc端结合，介导ADCC。
本实验使用Fortebio Octet分子相互作用仪检测VP101(hG1WT)和VP101(hG1DM)与FcγRIIa_R131的亲和力常数，以评价各抗体的ADCC活性。
Fortebio Octet分子相互作用仪检测VP101(hG1WT)和VP101(hG1DM)的亲和力常数实验方法简述如下：固化物稀释液为PBS，0.02％Tween-20，0.1％BSA，pH7.4，分析物稀释缓冲液为PBS，0.02％Tween-20，0.02％casein，0.1％BSA，pH7.4。5μg/mL的FcγRIIa_R131固定在NTA传感器上，固定时间为60s，传感器在PBS，0.02％Tween-20，0.02％casein，0.1％BSA，pH7.4缓冲液中平衡600s以封闭传感器，固定在传感器上的FcγRIIa_R131与抗体结合，抗体浓度为12.5-200nM(两倍梯度稀释)，时间60s，抗体在缓冲液中解离，时间60s。传感器使用10mM Glycine，pH1.7和10mM硫酸镍再生。检测温度为30℃，频率为0.6Hz。数据以1:1模型拟合分析，得到亲和力常数。
FcγRIIa_R131与VP101(hG1WT)、VP101(hG4WT)和VP101(hG1DM)以及对照抗体Nivolumab、Bevacizumab的亲和力常数测定结果如表3和图11－图15所示。
表3：VP101(hG1WT)和VP101(hG1DM)抗体及其亚型与FcγRIIa_R131结合的动力学参数
Figure BDA0003541209030000651
Figure BDA0003541209030000661
N/A表示抗体与抗原没有结合或结合信号极低，没有对结果进行分析，故未能获得相应数据。
结果显示，VP101(hG1WT)可以与FcγRIIa_R131结合，亲和力常数为2.42E-08M；VP101(hG4WT)可以与FcγRIIa_R131结合，亲和力常数为3.57E-08M；Bevacizumab可以与FcγRIIa_R131结合，亲和力常数为5.16E-08M；Nivolumab可以与FcγRIIa_R131结合，亲和力常数为6.93E-08M；VP101(hG1DM)可以与FcγRIIa_R131结合，亲和力常数为3.35E-08M。
结果表明，抗体与FcγRIIa_R131均有结合，其亲和力从强到弱依次为：VP101(hG1WT)、VP101(hG1DM)、VP101(hG4WT)、Bevacizumab、Nivolumab。
实施例4：FcγRIIb与VP101(hG1WT)和VP101(hG1DM)的亲和力常数测定
Fc受体FcγRIIb(又名CD32b)可与IgG抗体的Fc端结合，参与调控免疫细胞的功能。
本实验使用Fortebio Octet分子相互作用仪检测VP101(hG1WT)和VP101(hG1DM)与FcγRIIb的亲和力常数，以评价VP101(hG1WT)和VP101(hG1DM)与Fc受体的结合能力。
Fortebio Octet分子相互作用仪检测VP101(hG1WT)和VP101(hG1DM)与FcγRIIb的亲和力常数实验方法简述如下：固化物稀释液为PBS，0.02％Tween-20，0.1％BSA，pH7.4，分析物稀释缓冲液为PBS，0.02％Tween-20，0.02％casein，0.1％BSA，pH7.4。5μg/mL的hFCGR2B-his固定在NTA传感器上，固定时间为60s，传感器在PBS，0.02％Tween-20，0.02％casein，0.1％BSA，pH7.4缓冲液中平衡600s以封闭传感器，固定在传感器上的hFCGR2B-his与抗体结合，抗体浓度为12.5-200nM(两倍梯度稀释)，时间60s，抗体在缓冲液中解离，时间60s。传感器使用10mM Glycine，pH1.7和10mM硫酸镍再生。检测温度为30℃，频率为0.6Hz。数据以1:1模型拟合分析，得到亲和力常数。
实施例5：FcγRIIIa_V158与VP101(hG1WT)和VP101(hG1DM)的亲和力常数测定
Fc受体FcγRIIIa_V158(又名CD16a_V158)，可与IgG抗体的Fc端结合，介导ADCC效应。
实验中使用Fortebio Octet分子相互作用仪检测VP101(hG1WT)和VP101(hG1DM)与FcγRIIIa_V158的亲和力常数，以评价各抗体的ADCC活性。
Fortebio Octet分子相互作用仪检测相应抗体与FcγRIIIa_V158的亲和力常数实验方法简述如下：样品稀释缓冲液为PBS，0.02％Tween-20，0.1％BSA，pH7.4。5μg/mL的FcγRIIIa_V158固定在HIS1K传感器上，时间120s，传感器在缓冲液中平衡60s，固定在传感器上的hFcGR3A(V158)-his与各抗体结合，抗体浓度为31.25-500nM(两倍稀释)，时间60s，抗体在缓冲液中解离，时间60s。传感器使用10mM甘氨酸，pH1.5再生，时间5s，重复4次。检测温度为30℃，频率为0.3Hz。数据以1:1模型拟合分析，得到亲和力常数。
FcγRIIIa_V158与VP101(hG1WT)、VP101(hG4WT)和VP101(hG1DM)以及对照抗体Nivolumab、Bevacizumab的亲和力常数测定结果如表4和图16－图20所示。
表4：VP101(hG1WT)和VP101(hG1DM)抗体及其亚型与FcγRIIIa_V158结合的动力学参数
抗体 K<sub>D</sub>(M) kon(1/Ms) SE(kon) kdis(1/s) SE(kdis) Rmax(nm)
VP101(hG1DM) 1.34E-07 6.05E+05 2.36E+05 8.11E-02 7.42E-03 0.07-0.21
Bevacizumab 2.76E-08 5.06E+05 1.14E+05 1.39E-02 1.41E-03 0.13-0.51
Nivolumab N/A N/A N/A N/A N/A N/A
VP101(hG1WT) 4.35E-08 2.39E+05 3.14E+04 1.04E-02 8.73E-04 0.80-1.22
VP101(hG4WT) N/A N/A N/A N/A N/A N/A
N/A表示抗体与抗原没有结合或结合信号极低，没有对结果进行分析，故未能获得相应数据。
结果显示，VP101(hG1WT)可以与FcγRIIIa_V158结合，亲和力常数为4.35E-08M；VP101(hG1DM)可以与FcγRIIIa_V158结合，亲和力常数为1.34E-07M；Bevacizumab可以与FcγRIIIa_V158结合，亲和力常数为2.76E-08M；而Nivolumab、VP101(hG4WT)由于与FcγRIIIa_V158没有结合或结合信号极低，没有对结果进行分析，故而未能获得相应数据。
结果表明，除Nivolumab、VP101(hG4WT)与FcγRIIIa_V158没有结合外，其他抗体与FcγRIIIa_V158均有结合，其亲和力从强到弱依次为：Bevacizumab、VP101(hG1WT)、VP101(hG1DM)。
实施例6：FcγRIIIa_F158与VP101(hG1WT)和VP101(hG1DM)的亲和力常数测定
Fc受体FcγRIIIa_F158(又名CD16a_F158)可与IgG抗体的Fc端结合，介导ADCC。
本实验使用Fortebio Octet分子相互作用仪检测VP101(hG1WT)和VP101(hG1DM)与FcγRIIIa_F158的亲和力常数，以评价各抗体的ADCC活性。
Fortebio Octet分子相互作用仪检测VP101(hG1WT)和VP101(hG1DM)与FcγRIIIa_F158的亲和力常数实验方法简述如下：样品稀释缓冲液为PBS，0.02％Tween-20，0.1％BSA，pH7.4。5μg/mL的FcγRIIIa_F158固定在HIS1K传感器上，时间120s，传感器在缓冲液中平衡60s，固定在传感器上的hFcGR3A(F158)-his与各抗体结合，抗体浓度为31.25-500nM(两倍稀释)，时间60s，抗体在缓冲液中解离，时间60s。传感器使用10mM甘氨酸，pH1.5再生，时间5s，重复4次。检测温度为30℃，频率为0.3Hz。数据以1:1模型拟合分析，得到亲和力常数。
FcγRIIIa_F158与VP101(hG1WT)、VP101(hG4WT)和VP101(hG1DM)以及对照抗体Nivolumab、Bevacizumab的亲和力常数测定结果如表5和图21－图25所示。
表5：VP101(hG1WT)和VP101(hG1DM)抗体及其亚型与FcγRIIIa_F158结合的动力学参数
抗体 K<sub>D</sub>(M) kon(1/Ms) SE(kon) kdis(1/s) SE(kdis) Rmax(nm)
VP101(hG1DM) N/A N/A N/A N/A N/A N/A
Bevacizumab 9.32E-08 2.64E+05 7.16E+04 2.46E-02 2.09E-03 0.08-0.20
Nivolumab N/A N/A N/A N/A N/A N/A
VP101(hG1WT) 7.41E-08 2.47E+05 5.20E+04 1.83E-02 1.55E-03 0.15-0.48
VP101(hG4WT) N/A N/A N/A N/A N/A N/A
N/A表示抗体与抗原没有结合或结合信号极低，没有对结果进行分析，故未能获得相应数据。
结果显示，VP101(hG1WT)可以与FcγRIIIa_F158结合，亲和力常数为7.41E-08M；Bevacizumab可以与FcγRIIIa_F158结合，亲和力常数为9.32E-08M；而Nivolumab、VP101(hG4WT)和VP101(hG1DM)由于与FcγRIIIa_F158没有结合或结合信号极低，没有对结果进行分析，故而未能获得相应数据。
结果表明，除Nivolumab、VP101(hG4WT)和VP101(hG1DM)与FcγRIIIa_F158没有结合外，其他抗体与FcγRIIIa_F158均有结合，其亲和力从强到弱依次为：VP101(hG1WT)、Bevacizumab。
实施例7：C1q与VP101(hG1WT)和VP101(hG1DM)的亲和力常数测定
血清补体C1q可与IgG抗体的Fc端结合，介导CDC效应。治疗性单克隆抗体与C1q结合的能力影响到该抗体的安全性和有效性。
本实验使用Fortebio Octet分子相互作用仪检测了VP101(hG1WT)和VP101(hG1DM)与C1q的亲和力常数，以评价各抗体的CDC活性。
Fortebio Octet分子相互作用仪检测相应抗体与C1q的亲和力常数实验方法简述如下：样品稀释缓冲液分别为PBS，0.02％Tween-20，0.1％BSA，pH7.4。50μg/mL的抗体固定在FAB2G传感器上，固定高度约为2.0nm，传感器在缓冲液中平衡60s，固定在传感器上的抗体与C1q结合，C1q浓度为0.625nM-10nM(两倍稀释)，时间60s，抗原抗体在缓冲液中解离，时间60s。传感器使用10mM甘氨酸，pH1.7再生，时间5s，重复4次。样品板震动速率为1000rpm，检测温度为30度，检测频率为0.6Hz。数据以1:1模型拟合分析，得到亲和力常数。数据采集软件为Fortebio Data Acqμisition 7.0，数据分析软件为Fortebio Data Analysis 7.0。
C1q与VP101(hG1WT)、VP101(hG4WT)和VP101(hG1DM)以及对照抗体Nivolumab、Bevacizumab的亲和力常数测定结果如表6和图26－图30所示。
表6：VP101(hG1WT)和VP101(hG1DM)抗体及其亚型与C1q结合的动力学参数
抗体 K<sub>D</sub>(M) kon(1/Ms) SE(kon) kdis(1/s) SE(kdis) Rmax(nm)
VP101(hG1DM) N/A N/A N/A N/A N/A N/A
Bevacizumab 1.14E-09 6.52E+06 5.64E+05 7.40E-03 5.58E-04 0.51-0.63
Nivolumab N/A N/A N/A N/A N/A N/A
VP101(hG1WT) 9.76E-10 5.73E+06 5.49E+05 5.59E-03 6.12E-04 0.32-0.51
VP101(hG4WT) N/A N/A N/A N/A N/A N/A
N/A表示抗体与抗原没有结合或结合信号极低，没有对结果进行分析，故未能获得相应数据。
结果显示，VP101(hG1WT)可以与C1q结合，亲和力常数为9.76E-10M；Bevacizumab可以与C1q结合，亲和力常数为1.14E-09M；而Nivolumab、VP101(hG4WT)和VP101(hG1DM)由于与C1q没有结合或结合信号极低，没有对结果进行分析，故而未能获得相应数据。
结果表明，除Nivolumab、VP101(hG4WT)和VP101(hG1DM)与FcγRIIIa_F158没有结合外，其他抗体与C1q均有结合，VP101(hG1WT)与Bevacizumab的亲和力相近。
实施例8：VP101(hG1WT)和VP101(hG1DM)对表达PD-1抗原的CHO-K1-PD1细胞的 ADCC活性检测
为检测抗体VP101(hG1WT)和VP101(hG1DM)在细胞水平的ADCC效应，发明人构建了表达有PD-1抗原的CHO-K1-PD1细胞，并建立了正常人PBMC与靶细胞共培养的体系用于检测抗体在细胞学水平的ADCC活性。
VP101(hG1WT)和VP101(hG1DM)对表达PD-1抗原的CHO-K1-PD1细胞的ADCC活性检测，方法具体如下：
实验首先构建了人PD-1过表达载体pCDH-CMV-PD1FL-Puro(pCDH-CMV-Puro购自优宝生物)，表达载体经病毒包装后感染CHO-K1细胞，用Puromycin(2μg/mL)加药筛选后，获得抗药性稳定表达膜PD-1蛋白的CHO-K1-PD1稳定细胞系。按Ficoll外周血单个核细胞分离液操作说明书分离获得正常人PBMC，分离后的PBMC用1640完全培养基重悬，台盼蓝染色计细胞数及活率，于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中孵育过夜；次日，分别收集CHO-K1-PD1细胞和PBMC，离心去上清后，用RPMI-1640(含1％BSA)(以下称分析培养基)重悬细胞沉淀，离心洗涤2次细胞；计细胞数及活率，用分析培养基将细胞浓度调整到合适范围，根据试验设计，在96孔板中加入CHO-K1-PD1细胞悬液，30000/孔；加入50μl抗体，混匀室温预孵育1h；预孵育后，加入PBMC，90万/50μl/孔，充分混匀；37℃、5％CO2的培养箱中孵育4hrs。4hrs后，取出96孔板，250×g离心5min；小心转移100μl细胞上清(注意不要吸到板底细胞)至新的96孔平底微量板中，根据Cytotoxicity Detection Kit说明书每孔加入100μl现配的反应液，室温避光孵育30min。分别于490nm和650nm处测量OD值，各组OD值＝OD490nm-OD650nm。根据ADCC(％)＝(实验组-阴性对照组)/(靶细胞LDH最大释放-靶细胞LDH自发释放)×100％计算各组ADCC活性。
VP101(hG1WT)和VP101(hG1DM)对表达PD-1抗原的CHO-K1-PD1细胞的ADCC活性检测结果用ADCC％表示，结果如图31所示。
结果显示，在PBMC与CHO-K1-PD1混合培养体系中，阳性对照14C12H1L1(G1WT)具有显著ADCC活性，表明ADCC体系正常。与同型对照抗体hIgG1DM相比，VP101(hG1WT)显示出显著ADCC活性，且呈现剂量相关性，而VP101(G1DM)未见ADCC活性。结果表明，在VP101(hG1WT)基础上突变产生的VP101(hG1DM)在细胞学水平无ADCC活性，ADCC效应已消除。
实施例9：VP101(hG1WT)和VP101(hG1DM)对表达PD-1抗原的CHO-K1-PD1细胞的CDC 活性检测
为检测抗体VP101(hG1WT)和VP101(hG1DM)在细胞学水平的CDC效应，发明人构建了表达有PD-1抗原的CHO-K1-PD1细胞(构建方法见实施例8)，并建立了靶细胞与正常人补体血清共培养的体系以检测抗体在细胞学水平的CDC活性。
VP101(hG1WT)和VP101(hG1DM)对表达PD-1抗原的CHO-K1-PD1细胞的CDC活性检测，方法具体如下：
检测当天，胰酶消化收集CHO-K1-PD1细胞，170×g离心5min后，再用RPMI-1640(含1％BSA)(以下称分析培养基)重悬细胞沉淀，重复离心洗涤2次；计细胞数及活率，用分析培养基将细胞浓度调整到合适范围，根据试验设计，在96孔板中加入CHO-K1-PD1细胞悬液，30000/孔；加入50μl抗体，混匀，室温预孵育10min；预孵育后，加入正常人补体血清(终浓度为2％)，50μL/孔，充分混匀，置于37℃、5％CO2的培养箱中孵育4小时。4小时后，250×g离心5min；小心吸取100μl细胞上清(注意不要吸到板底细胞)并转移至新的平底96孔板中，根据Cytotoxicity Detection Kit说明书每孔加入100μl现配的反应液，室温避光孵育30min。分别于490nm和650nm处测量OD值，各组OD值＝OD490nm-OD650nm。根据CDC(％)＝(实验组-阴性对照组)/(靶细胞LDH最大释放-靶细胞LDH自发释放)×100％计算各组CDC活性。
VP101(hG1WT)和VP101(hG1DM)对表达PD-1抗原的CHO-K1-PD1细胞的CDC活性检测结果用CDC％表示，结果如图32所示。
结果显示，在正常人补体血清与CHO-K1-PD1混合培养体系中，阳性对照抗体14C12H1L1(G1WT)与同型对照抗体hIgG1DM组相比，CDC％具有显著差异，表明本CDC检测体系正常。而在同等剂量水平下，与同型对照相比，VP101(hG1WT)和VP101(hG1DM)的CDC％均无显著性差异。
实施例10：外周血单核细胞与Raji-PDL1细胞混合培养体系(MLR)中检测VP101 (hG1DM)的药效学活性
实验首先构建了人PD-L1过表达载体plenti6.3-PD-L1-BSD(plenti6.3-BSD购自invitrogen)，表达载体经病毒包装后感染Raji细胞，用BSD(10μg/mL)加药筛选后，获得稳定表达膜PD-L1蛋白的Raji-PDL1稳定细胞系。按Ficoll外周血单个核细胞分离液操作说明书分离获得正常人PBMC，分离后的PBMC用1640完全培养基重悬、计数、冻存。复苏PBMC，加入SEB(金黄色葡萄球菌肠毒素抗原)刺激培养两天。两天后收集对数期Raji-PDL1细胞，并加入丝裂霉素C(Sigma，工作浓度为25μg/mL)于培养箱处理60min，离心洗涤丝裂霉素C处理后的Raji-PDL1细胞，同时收集并洗涤SEB刺激两天后的PBMC，在有抗体或无抗体条件下，按照细胞数1:1的比例进行混合培养。3天后，离心收集上清，ELISA检测上清中IL-2和IFN-γ浓度。
IFN-γ分泌结果如图33所示。结果显示，VP101(hG1DM)可有效促进IFN-γ的分泌，活性显著优于Nivolumab。
IL-2分泌结果如图34所示。结果显示，VP101(hG1DM)可有效促进IL-2的分泌，且呈剂量依赖关系，活性显著优于Nivolumab。
实施例11：VP101(hG1DM)不具有对PD-1表达阳性细胞的抗体介导的细胞吞噬活性
抗体介导的细胞吞噬(antibody dependent cellular phagoxytosis，ADCP)是指结合于细胞表面抗原的抗体的Fc段与具有吞噬活性的细胞如巨噬细胞的Fc受体结合，进而介导吞噬细胞吞噬结合了抗体的细胞。对于免疫检查点抑制剂抗体，如PD-1抗体而言，ADCP活性的存在将会引起发挥抗肿瘤杀伤作用的表达有PD-1的免疫细胞的损伤，进而影响其抗肿瘤活性。
本实验以鼠源巨噬细胞为效应细胞，过表达PD-1的CHO-K1-PD1细胞系(构建方法见实施例8)为靶细胞，检测其介导ADCP效应。本实验采用流式细胞术检测了VP101(hG1DM)对表达有PD-1的细胞的ADCP活性，结果显示其不具备ADCP活性，而同靶点已上市的PD-1抗体Nivolumab具有明显的ADCP活性。具体方法如下：
首先在无菌条件下取C57小鼠(购自广东省医学实验动物中心)股骨骨髓，并经红细胞裂解液冰上裂解5min，用DMEM完全培养基(含10％FBS)终止裂解，1000rpm离心洗涤2次。将细胞团用10mL DMEM完全培养基重悬，并添加M-CSF至工作浓度为100ng/mL，于37℃、5％CO2的细胞培养箱诱导培养7天，其中于第3和第5天半量换液并补充M-CSF。细胞于第7天诱导完成，经0.25％胰酶消化，收集巨噬细胞，750xg离心5min，弃上清用DMEM完全培养基(含10％FBS)悬浮并计数，调整细胞密度并分装至96孔锥底板中，备用。
常规方法收集CHO-K1-PD1细胞，170xg离心5min，重悬后计数并测定活率，用PBS洗涤一次。羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(carboxyfluorescein diacetate succinimidylester，CFSE)用PBS稀释至2.5μM，取适量稀释后的CFSE重悬细胞(染色密度：1000万细胞/mL)，放置培养箱孵育20min。加入6mL的DMEM完全培养基(含10％FBS)终止染色，170xg离心5min，弃上清；加入1mL DMEM完全培养基，放置培养箱孵育10min。抗体用DMEM完全培养基稀释至20μg/mL、2μg/mL、0.2μg/mL(工作浓度10μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL)，并设计同型对照抗体hIgG1DM和hIgG4。收集新鲜诱导成熟的巨噬细胞，750xg离心5min，弃上清计数，转移至96孔锥底板中，1000xg离心5min，弃上清；调整CHO-K1-PD1-CFSE细胞密度；按实验设计将稀释后的抗体分别与靶细胞按50μL：50μL加至相应已含巨噬细胞的96孔锥底板中，重悬混匀，放置37℃培养箱孵育2h。每孔加150μL常温的1％PBSA，1000xg离心5min，弃上清；用200μL的PBSA洗涤一次；按100μL/样本将APC anti-mouse/human CD11b antibody(用PBSA 500倍稀释)加至相应样本中，混匀，冰上孵育40min。每孔加150μL 1％PBSA，1000xg离心5min，弃上清；每孔用200μLPBSA洗涤一次。每孔加200μL 1％PBSA重悬，Beckman流式仪上机。
上机体系中巨噬细胞为APC+阳性，发生吞噬作用的巨噬细胞则为APC和CFSE双阳性。以双阳性细胞数与APC阳性细胞数比例作为吞噬率，并以此评价抗体介导的ADCP活性。按如下公式计算各组ADCP活性，以P％表示：
Figure BDA0003541209030000761
结果如图35所示。
结果显示，Nivolumab在巨噬细胞+CHO-K1-PD1体系中具有明显的ADCP效应；VP101(hG1DM)的吞噬率与同型对照抗体相当，表明VP101(hG1DM)不具有ADCP效应。该结果表明，VP101(hG1DM)很可能具有更好的抗肿瘤效果。
实施例12：VP101(hG1DM)单药给药治疗乳腺癌的动物实验
本实验考察了VP101(hG1DM)移植乳腺癌细胞体内增殖的抗肿瘤活性。研究方案见下表7。
研究中使用的重度免疫缺陷NCG小鼠，雌性，5周龄，购于江苏集萃药康生物科技有限公司。使用的同型对照抗体hIgG4由中山康方生物医药有限公司构建，构建方法同前。PBMC由中山康方生物医药有限公司分离活化，方法同前。
将收集的乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞200万/50μl/只，乳房垫接种，共接种12只小鼠。当体内生长30天时，将小鼠按照肿瘤体积平均分成2组，阴性对照组，VP101(hG1DM)组。当日接受PBMC100万/50μl/只，皮下接种，PBMC接种当天记为第0天，分别在接种当日(第0天)、第7天、第14天、第21天给药。肿瘤体积通过游标卡尺测量，分组后每周两次使用游标卡尺测量肿瘤大小，并根据计算公式TV＝0.5×ab2计算肿瘤体积，其中a是肿瘤的长径，b是肿瘤的短径，TV是肿瘤的体积。
表7：VP101(hG1DM)单药给药有效抑制乳腺癌细胞增殖实验方案
Figure BDA0003541209030000771
实验结果如图36所示。结果显示，相较于同型对照抗体，VP101(hG1DM)能够有效地抑制了乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞的体积增长，表现出良好的抗肿瘤特别是抗乳腺癌的效果。
实施例13：PARPi和VP101(hG1DM)联合给药治疗抑制卵巢癌细胞的研究
取对数生长期的SNU-251卵巢癌细胞(深圳市豪地华拓生物科技有限公司，货号：HTX2700C)，经胰酶消化制备成单细胞悬液并计数，调整细胞密度，按每孔2×105个接种6孔板中，并在RPMI 1640培养基(Gibco，货号：22400-089)中于37℃培养24h。
待细胞生长至60％-70％后，将细胞分组给药，设置对照组、药物组，于37℃、5％CO2培养箱中培养24h。
将Transwell小室置于24孔板中，上室加100μL RPMI 1640培养基，置于培养箱中平衡1h；用胰酶消化上述6孔板中细胞，用无血清培养基制备单细胞悬液，进行计数，调整细胞密度至4×104个/100μL，接种于小室上室，下室加入600μL含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h；
培养结束后，取出Transwell小室，弃去培养基，PBS固定下室细胞2min，然后用4％多聚甲醛固定下室细胞20min；PBS洗涤小室两次；
500μL 0.1％结晶紫染液染色下室细胞15min，然后用PBS洗净残余染液，用棉签小心地擦拭掉上室的细胞；将小室置于玻片在显微镜下选取3个视野观察移至下室的细胞，并拍照。采用ImgeJ软件计算细胞数，按照公式计算细胞的迁移率。
实验结果如图37所示。结果显示，对比同浓度下的单用药Olaparib或单用药VP101(hG1DM)，PARP抑制剂奥拉帕利(Olaparib)与VP101(hG1DM)联用时，抑制卵巢癌细胞迁移的作用显著增强。
实施例14：PARPi和VP101(hG1DM)联合给药治疗乳腺癌的动物实验
为检测PARP抑制剂奥拉帕利(Olaparib)与抗PD-1-抗VEGFA双功能抗体VP101(hG1DM)联用的体内抑瘤活性，首先用MDA-MB-231细胞(人乳腺癌细胞，购自ATCC)，接种于5-7周龄的NCG小鼠(购自广东药康生物科技有限公司)皮下，在接种后第23天，小鼠根据肿瘤体积随机分成4组，每组6只。分组当天定义为D0天，并于分组当天D0天开始奥拉帕利给药。D2天腹腔注射400万活化的PBMC并开始VP101(hG1DM)给药。联合给药组给药方式为：药物单独配制，先后分别给药(无给药顺序和间隔时间特定要求，给完一种药物再给予另外一种药物)。造模与具体给药方式见表8。给药后测量各组肿瘤的长宽，计算肿瘤体积。
表8：PARP抑制剂奥拉帕利Olaparib与抗PD-1-抗VEGFA双功能抗体联用治疗MDA-MB-231移植瘤NCG小鼠模型的给药方案
Figure BDA0003541209030000791
结果图38所示。结果显示，相比于单用Olaparib组和单用VP101(hG1DM)组，VP101(hG1DM)与PARP抑制剂奥拉帕利Olaparib联用对小鼠乳腺癌模型展现联合抗肿瘤药效，其联用对肿瘤的抑制优于各受试药单用组。
此外，如图39所示，荷瘤鼠对受试药VP101(hG1DM)和PARP抑制剂奥拉帕利Olaparib单用和联用的耐受性均良好，各组对荷瘤小鼠体重无影响。
实施例15：PARPi和VP101(hG1DM)联合给药治疗卵巢癌的动物实验
为检测PARP抑制剂奥拉帕利(Olaparib)与抗PD-1-抗VEGFA双功能抗体VP101(hG1DM)联用的体内抑瘤活性，用SK-OV-3人卵巢癌细胞(购自ATCC)，接种于5-7周龄的NCG小鼠(购自广东药康生物科技有限公司)皮下，在接种后第39天腹腔注射300万活化的PBMC，小鼠根据肿瘤体积随机分成4组，每组6只。分组当天定义为D0天，并于分组当天D0天开始给药。联合给药组给药方式为：药物单独配制，先后分别给药(无给药顺序和间隔时间特定要求，给完一种药物再给予另外一种药物)。造模与具体给药方式见表9。给药后测量各组肿瘤的长宽，计算肿瘤体积。
表9：PARP抑制剂奥拉帕利Olaparib与抗PD-1-抗VEGFA双功能抗体联用治疗SK-OV-3移植瘤NCG小鼠模型的给药方案
Figure BDA0003541209030000801
Figure BDA0003541209030000811
结果图40所示。结果显示，相比于单用Olaparib组和单用VP101(hG1DM)组)，VP101(hG1DM)与PARP抑制剂奥拉帕利Olaparib联用对此小鼠卵巢癌模型展现联合抗肿瘤药效，其联用对肿瘤的抑制优于各受试药单用组。
此外，如图41所示，荷瘤鼠对受试药VP101(hG1DM)和PARP抑制剂奥拉帕利Olaparib单用和联用的耐受性均良好，各组对荷瘤小鼠体重无影响。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山康方生物医药有限公司
<120> 含有抗PD-1-抗VEGFA双特异性抗体的药物组合及其用途
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<151> 2021-03-12
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
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cactactatg ggagcagcca ttggtatttt gacgtgtggg ggcaggggac tctggtgaca 360
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asn Arg Tyr Gly Glu Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 14
<211> 1344
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleic acid encoding heavy chain of 14C12H1L1
<400> 14
gaagtgcagc tggtcgagtc tgggggaggg ctggtgcagc ccggcgggtc actgcgactg 60
agctgcgcag cttccggatt cgcctttagc tcctacgaca tgtcctgggt gcgacaggca 120
ccaggaaagg gactggattg ggtcgctact atctcaggag gcgggagata cacctactat 180
cctgacagcg tcaagggccg gttcacaatc tctagagata acagtaagaa caatctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag ggctgaggac accgcactgt actattgtgc caaccgctac 300
ggggaagcat ggtttgccta ttgggggcag ggaaccctgg tgacagtctc tagtgccagc 360
accaaaggac ctagcgtgtt tcctctcgcc ccctcctcca aaagcaccag cggaggaacc 420
gctgctctcg gatgtctggt gaaggactac ttccctgaac ccgtcaccgt gagctggaat 480
agcggcgctc tgacaagcgg agtccataca ttccctgctg tgctgcaaag cagcggactc 540
tattccctgt ccagcgtcgt cacagtgccc agcagcagcc tgggcaccca gacctacatc 600
tgtaacgtca accacaagcc ctccaacacc aaggtggaca agaaagtgga gcccaaatcc 660
tgcgacaaga cacacacctg tcccccctgt cctgctcccg aactcctcgg aggccctagc 720
gtcttcctct ttcctcccaa acccaaggac accctcatga tcagcagaac ccctgaagtc 780
acctgtgtcg tcgtggatgt cagccatgag gaccccgagg tgaaattcaa ctggtatgtc 840
gatggcgtcg aggtgcacaa cgccaaaacc aagcccaggg aggaacagta caactccacc 900
tacagggtgg tgtccgtgct gacagtcctc caccaggact ggctgaacgg caaggagtac 960
aagtgcaagg tgtccaacaa ggctctccct gcccccattg agaagaccat cagcaaggcc 1020
aaaggccaac ccagggagcc ccaggtctat acactgcctc cctccaggga cgaactcacc 1080
aagaaccagg tgtccctgac ctgcctggtc aagggctttt atcccagcga catcgccgtc 1140
gagtgggagt ccaacggaca gcccgagaat aactacaaga ccacccctcc tgtcctcgac 1200
tccgacggct ccttcttcct gtacagcaag ctgaccgtgg acaaaagcag gtggcagcag 1260
ggaaacgtgt tctcctgcag cgtgatgcac gaagccctcc acaaccacta cacccagaaa 1320
agcctgtccc tgagccccgg caaa 1344
<210> 15
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain of 14C12H1L1
<400> 15
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Thr Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Met Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 16
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> lnucleic acid encoding ight chain of 14C12H1L1
<400> 16
gacattcaga tgactcagag cccctcctcc atgtccgcct ctgtgggcga cagggtcacc 60
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gggaaaagcc ccaagacact gatctaccgg gctaatagac tggtgtctgg agtcccaagt 180
cggttcagtg gctcagggag cggacaggac tacactctga ccatcagctc cctgcagcct 240
gaggacatgg caacctacta ttgcctgcag tatgatgagt tcccactgac ctttggcgcc 300
gggacaaaac tggagctgaa gcgaactgtg gccgctccct ccgtcttcat ttttccccct 360
tctgacgaac agctgaaatc aggcacagcc agcgtggtct gtctgctgaa caatttctac 420
cctagagagg caaaagtgca gtggaaggtc gataacgccc tgcagtccgg caacagccag 480
gagagtgtga ctgaacagga ctcaaaagat agcacctatt ccctgtctag tacactgact 540
ctgtccaagg ctgattacga gaagcacaaa gtgtatgcat gcgaagtgac acatcaggga 600
ctgtcaagcc ccgtgactaa gtcttttaac cggggcgaat gt 642
<210> 17
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain of 14C12H1L1(M)1
<400> 17
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Thr Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Met Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100 105
<210> 18
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker 1
<400> 18
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 19
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker 2
<400> 19
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 20
<211> 453
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bevacizumab-G4H
<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 21
<211> 1359
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleic acid encoding Bevacizumab-G4H
<400> 21
gaggtgcagc tggtcgagtc cggggggggg ctggtgcagc caggcgggtc tctgaggctg 60
agttgcgccg cttcagggta caccttcaca aactatggaa tgaattgggt gcgccaggca 120
ccaggaaagg gactggagtg ggtcggctgg atcaacactt acaccgggga acctacctat 180
gcagccgact ttaagcggcg gttcaccttc agcctggata caagcaaatc cactgcctac 240
ctgcagatga acagcctgcg agctgaggac accgcagtct actattgtgc taaatatccc 300
cactactatg ggagcagcca ttggtatttt gacgtgtggg ggcaggggac tctggtgaca 360
gtgagcagcg caagcaccaa agggcccagc gtgtttcctc tcgccccctc ctccaaaagc 420
accagcggag gaaccgctgc tctcggatgt ctggtgaagg actacttccc tgaacccgtc 480
accgtgagct ggaatagcgg cgctctgaca agcggagtcc atacattccc tgctgtgctg 540
caaagcagcg gactctattc cctgtccagc gtcgtcacag tgcccagcag cagcctgggc 600
acccagacct acatctgtaa cgtcaaccac aagccctcca acaccaaggt ggacaagaaa 660
gtggagccca aatcctgcga caagacacac acctgtcccc cctgtcctgc tcccgaactc 720
ctcggaggcc ctagcgtctt cctctttcct cccaaaccca aggacaccct catgatcagc 780
agaacccctg aagtcacctg tgtcgtcgtg gatgtcagcc atgaggaccc cgaggtgaaa 840
ttcaactggt atgtcgatgg cgtcgaggtg cacaacgcca aaaccaagcc cagggaggaa 900
cagtacaact ccacctacag ggtggtgtcc gtgctgacag tcctccacca ggactggctg 960
aacggcaagg agtacaagtg caaggtgtcc aacaaggctc tccctgcccc cattgagaag 1020
accatcagca aggccaaagg ccaacccagg gagccccagg tctatacact gcctccctcc 1080
agggacgaac tcaccaagaa ccaggtgtcc ctgacctgcc tggtcaaggg cttttatccc 1140
agcgacatcg ccgtcgagtg ggagtccaac ggacagcccg agaataacta caagaccacc 1200
cctcctgtcc tcgactccga cggctccttc ttcctgtaca gcaaactgac cgtcgataaa 1260
tctaggtggc agcagggcaa cgtgttctct tgttccgtga tgcatgaagc actgcacaac 1320
cattataccc agaagtctct gagcctgtcc cccggcaag 1359
<210> 22
<211> 450
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain of VP101(hG4WT)
<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195 200 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
210 215 220
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 23
<211> 1350
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleic acid encoding heavy chain of VP101(hG4WT)
<400> 23
gaggtgcagc tggtcgagtc cggggggggg ctggtgcagc caggcgggtc tctgaggctg 60
agttgcgccg cttcagggta caccttcaca aactatggaa tgaattgggt gcgccaggca 120
ccaggaaagg gactggagtg ggtcggctgg atcaacactt acaccgggga acctacctat 180
gcagccgact ttaagcggcg gttcaccttc agcctggata caagcaaatc cactgcctac 240
ctgcagatga acagcctgcg agctgaggac accgcagtct actattgtgc taaatatccc 300
cactactatg ggagcagcca ttggtatttt gacgtgtggg ggcaggggac tctggtgaca 360
gtgagcagcg caagcaccaa agggccctcg gtcttccccc tggcgccctg ctccaggagc 420
acctccgaga gcacagccgc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 480
acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 540
cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 600
acgaagacct acacctgcaa cgtagatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga 660
gttgagtcca aatatggtcc cccatgccca ccatgcccag cacctgagtt cctgggggga 720
ccatcagtct tcctgttccc cccaaaaccc aaggacactc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc caggaagacc ccgaggtcca gttcaactgg 840
tacgtggatg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagttcaac 900
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaacggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc ctcccgtcct ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaagccaaag ggcagccccg agagccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag 1080
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
caggagggga atgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca 1320
cagaagtctc tgagcctgtc cctcggcaag 1350
<210> 24
<211> 453
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Immunoglobulin heavy chain of VP101(hG1DM)
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
225 230 235 240
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 25
<211> 1359
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleic acid encoding Immunoglobulin heavy chain of VP101(hG1DM)
<400> 25
gaggtgcagc tggtcgagtc cggggggggg ctggtgcagc caggcgggtc tctgaggctg 60
agttgcgccg cttcagggta caccttcaca aactatggaa tgaattgggt gcgccaggca 120
ccaggaaagg gactggagtg ggtcggctgg atcaacactt acaccgggga acctacctat 180
gcagccgact ttaagcggcg gttcaccttc agcctggata caagcaaatc cactgcctac 240
ctgcagatga acagcctgcg agctgaggac accgcagtct actattgtgc taaatatccc 300
cactactatg ggagcagcca ttggtatttt gacgtgtggg ggcaggggac tctggtgaca 360
gtgagcagcg caagcaccaa agggcccagc gtgtttcctc tcgccccctc ctccaaaagc 420
accagcggag gaaccgctgc tctcggatgt ctggtgaagg actacttccc tgaacccgtc 480
accgtgagct ggaatagcgg cgctctgaca agcggagtcc atacattccc tgctgtgctg 540
caaagcagcg gactctattc cctgtccagc gtcgtcacag tgcccagcag cagcctgggc 600
acccagacct acatctgtaa cgtcaaccac aagccctcca acaccaaggt ggacaagaaa 660
gtggagccca aatcctgcga caagacacac acctgtcccc cctgtcctgc tcccgaagct 720
gctggaggcc ctagcgtctt cctctttcct cccaaaccca aggacaccct catgatcagc 780
agaacccctg aagtcacctg tgtcgtcgtg gatgtcagcc atgaggaccc cgaggtgaaa 840
ttcaactggt atgtcgatgg cgtcgaggtg cacaacgcca aaaccaagcc cagggaggaa 900
cagtacaact ccacctacag ggtggtgtcc gtgctgacag tcctccacca ggactggctg 960
aacggcaagg agtacaagtg caaggtgtcc aacaaggctc tccctgcccc cattgagaag 1020
accatcagca aggccaaagg ccaacccagg gagccccagg tctatacact gcctccctcc 1080
agggacgaac tcaccaagaa ccaggtgtcc ctgacctgcc tggtcaaggg cttttatccc 1140
agcgacatcg ccgtcgagtg ggagtccaac ggacagcccg agaataacta caagaccacc 1200
cctcctgtcc tcgactccga cggctccttc ttcctgtaca gcaaactgac cgtcgataaa 1260
tctaggtggc agcagggcaa cgtgttctct tgttccgtga tgcatgaagc actgcacaac 1320
cattataccc agaagtctct gagcctgtcc cccggcaag 1359
<210> 26
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Immunoglobulin light chain of VP101(hG1DM)
<400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 27
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleic acid encoding Immunoglobulin light chain of VP101(hG1DM)
<400> 27
gatattcaga tgactcagag cccctcctcc ctgtccgcct ctgtgggcga cagggtcacc 60
atcacatgca gtgcttcaca ggatatttcc aactacctga attggtatca gcagaagcca 120
ggaaaagcac ccaaggtgct gatctacttc actagctccc tgcactcagg agtgccaagc 180
cggttcagcg gatccggatc tggaaccgac tttactctga ccatttctag tctgcagcct 240
gaggatttcg ctacatacta ttgccagcag tattctaccg tgccatggac atttggccag 300
gggactaaag tcgagatcaa gcggaccgtg gccgctccca gtgtcttcat ttttccccct 360
agcgacgaac agctgaaatc cgggacagcc tctgtggtct gtctgctgaa caacttctac 420
cctagagagg caaaagtgca gtggaaggtc gataacgccc tgcagagtgg caattcacag 480
gagagcgtga cagaacagga ctccaaagat tctacttata gtctgtcaag cacactgact 540
ctgagcaagg ctgactacga aaagcataaa gtgtatgcat gtgaggtcac ccaccagggg 600
ctgagcagtc cagtcaccaa gtcattcaac agaggcgagt gc 642
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR1
<400> 28
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly
1 5
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR2
<400> 29
Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro
1 5
<210> 30
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR3
<400> 30
Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10 15
<210> 31
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LCDR1
<400> 31
Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
1 5
<210> 32
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LCDR2
<400> 32
Phe Thr Ser
1
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LCDR3
<400> 33
Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR1
<400> 34
Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr Asp
1 5
<210> 35
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR2
<400> 35
Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr
1 5
<210> 36
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR3
<400> 36
Ala Asn Arg Tyr Gly Glu Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 37
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LCDR1
<400> 37
Gln Asp Ile Asn Thr Tyr
1 5
<210> 38
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LCDR2
<400> 38
Arg Ala Asn
1
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LCDR3
<400> 39
Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 40
<211> 330
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ig gamma-1 chain C region
<400> 40
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 41
<211> 327
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ig gamma-4 chain C region
<400> 41
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ig kappa chain C region
<400> 42
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105

Claims (22)

1.一种药物组合，其包括至少一种双特异性抗体，以及至少一种PARP抑制剂；
其中，所述双特异性抗体包括：
靶向PD-1的第一蛋白功能区，和
靶向VEGFA的第二蛋白功能区；
其中：
所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白，所述第二蛋白功能区为单链抗体；其中，所述的免疫球蛋白，其重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:34－36所示的HCDR1－HCDR3并且其轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:37－39所示的LCDR1－LCDR3；和所述的单链抗体，其重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:28－30所示的HCDR1－HCDR3，其轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:31－33所示的LCDR1－LCDR3；
或者，
所述第一蛋白功能区为单链抗体，所述第二蛋白功能区为免疫球蛋白；其中，所述的免疫球蛋白，其重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:28－30所示的HCDR1－HCDR3，其轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:31－33所示的LCDR1－LCDR3；和所述的单链抗体，其重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:34－36所示的HCDR1－HCDR3并且其轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:37－39所示的LCDR1－LCDR3；
所述免疫球蛋白为人IgG1亚型；
并且按照EU编号系统，所述免疫球蛋白的重链恒定区在第234位点、235位点和237位点中的任意2个位点或3个位点发生突变，并且突变后，双特异性抗体与FcγRIIIa和/或C1q的亲和力常数相比突变前降低；优选地，所述亲和力常数通过Fortebio Octet分子相互作用仪测得。
2.根据权利要求1所述的药物组合，其中，按照EU编号系统，所述免疫球蛋白的重链恒定区具有如下突变：
L234A和L235A；或者
L234A和G237A；或者
L235A和G237A；
或者
L234A、L235A、G237A。
3.一种药物组合，其包括至少一种双特异性抗体，以及至少一种PARP抑制剂；
其中，所述双特异性抗体包括：
靶向PD-1的第一蛋白功能区，和
靶向VEGFA的第二蛋白功能区；
其中：
所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白，所述第二蛋白功能区为单链抗体；其中，所述的免疫球蛋白，其重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:34－36所示的HCDR1－HCDR3并且其轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:37－39所示的LCDR1－LCDR3；和所述的单链抗体，其重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:28－30所示的HCDR1－HCDR3，其轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:31－33所示的LCDR1－LCDR3；
或者，
所述第一蛋白功能区为单链抗体，所述第二蛋白功能区为免疫球蛋白；其中，所述的免疫球蛋白，其重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:28－30所示的HCDR1－HCDR3，其轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:31－33所示的LCDR1－LCDR3；和所述的单链抗体，其重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:34－36所示的HCDR1－HCDR3并且其轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:37－39所示的LCDR1－LCDR3；
所述免疫球蛋白为人IgG1亚型；
并且按照EU编号系统，所述免疫球蛋白的重链恒定区具有如下突变组合之一：
L234A和L235A；或者
L234A和G237A；或者
L235A和G237A；或者
L234A、L235A、G237A。
4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的药物组合，其中，按照EU编号系统，所述免疫球蛋白的重链恒定区还具有选自如下的一个或多个突变：
N297A、D265A、D270A、P238D、L328E、E233D、H268D、P271G、A330R、C226S、C229S、E233P、P331S、S267E、L328F、A330L、M252Y、S254T、T256E、N297Q、P238S、P238A、A327Q、A327G、P329A、K322A、T394D、G236R、G236A、L328R、A330S、P331S、H268A、E318A和K320A。
5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的药物组合，其中，
所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:9；并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:17；
或者，
所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:9；并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:17；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
6.根据权利要求1至5中任一权利要求所述的药物组合，其选自如下的(1)－(12)中的任一项：
(1)
所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；
(2)
所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；
(3)
所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；
(4)
所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；
(5)
所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；
(6)
所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；
(7)
所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
(8)
所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示；
(9)
所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示；
(10)
所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
(11)
所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示；以及
(12)
所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，并且所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；和，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示。
7.根据权利要求1至6中任一权利要求所述的药物组合：
所述免疫球蛋白的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，并且其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示。
8.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的药物组合，其中，所述双特异性抗体或其抗原结合片段以小于大约10-6M，例如小于大约10-7M、10-8M或10-9M或更小的亲和力常数结合FcγRI；优选地，所述亲和力常数通过Fortebio Octet分子相互作用仪测得。
9.根据权利要求1至8中任一权利要求所述的药物组合，其中，所述双特异性抗体或其抗原结合片段以小于大约10-9M，例如小于大约10-7M、10-8M或10-9M或更小的亲和力常数结合C1q；优选地，所述亲和力常数通过Fortebio Octet分子相互作用仪测得。
10.根据权利要求1至9中任一权利要求所述的药物组合，其中，所述第一蛋白功能区与所述第二蛋白功能区直接连接或者通过连接片段连接；和/或所述单链抗体的重链可变区与所述单链抗体的轻链可变区直接连接或者通过连接片段连接。
11.根据权利要求10所述的药物组合，其中，所述连接片段为(GGGGS)n，n为正整数；优选地，n为1、2、3、4、5或6。
12.根据权利要求1至11中任一权利要求所述的药物组合，其中，所述第一蛋白功能区和第二蛋白功能区独立地为1个、2个或者2个以上。
13.根据权利要求1至12中任一权利要求所述的药物组合，其中，所述单链抗体连接在免疫球蛋白的重链的C末端。
14.根据权利要求1至13中任一权利要求所述的方法，其中，所述免疫球蛋白的重链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区，并且所述免疫球蛋白的轻链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的轻链恒定区；
优选地，所述免疫球蛋白的重链恒定区为人Ig gamma-1 chain C region或人Iggamma-4 chain C region，并且所述免疫球蛋白的轻链恒定区为人Ig kappa chain Cregion；
优选地，所述免疫球蛋白的重链恒定区为人Ig gamma-1 chain C region，ACCESSION:P01857；并且所述免疫球蛋白的轻链恒定区为人Ig kappa chain C region，ACCESSION:P01834；或者
优选地，所述免疫球蛋白的重链恒定区为人Ig gamma-4 chain C region，ACCESSION:P01861.1；并且所述免疫球蛋白的轻链恒定区为人Ig kappa chain C region，ACCESSION:P01834。
15.一种药物组合，其包括至少一种双特异性抗体，以及至少一种PARP抑制剂；
其中，所述双特异性抗体包括：
靶向PD-1的第一蛋白功能区，和
靶向VEGFA的第二蛋白功能区；
所述第一蛋白功能区为1个，所述第二蛋白功能区为2个；
其中，所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白，所述第二蛋白功能区为单链抗体；
所述免疫球蛋白的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，并且其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示；
所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，并且所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；
所述单链抗体连接在免疫球蛋白的重链的C末端；
所述第一蛋白功能区与所述第二蛋白功能区通过第一连接片段连接；并且所述单链抗体的重链可变区与所述单链抗体的轻链可变区通过第二连接片段连接；所述第一连接片段和所述第二连接片段相同或不同；
优选地，所述第一连接片段和所述第二连接片段的氨基酸序列独立地选自SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19；
优选地，所述第一连接片段和所述第二连接片段的氨基酸序列均如SEQ ID NO:18所示。
16.根据权利要求1至15中任一权利要求所述的药物组合，其中，所述PARP抑制剂选自奥拉帕利、芦卡帕利、尼拉帕利、他拉唑帕利、氟唑帕利、veliparib ER、ABT-472、ABT-767、Stenoparib、AST-6828、AG-PD、ANG-2864、ANG-3038、ANG-3186、AZD-5305、AZ-0108、AZD-2461、AMXI-5001、AMXI-2001、AMXI-3001、AMXI-7001、AMXI-9001、pamiparib、ZYTP-1、CK-102、XZ-120312、YHP-743、iobenguane I 131、rucaparib camsylate、CVL-218、CPH-101、CPH-102、CBX-11、CBX-15、minocycline、DB-207、DPS-102、E-7016、iobenguane I 131、MK-2512、HCX-014、HWH-340、IDX-1197、IDX-1197、senaparib、IMP-04100、IMP-04111、IMP-04149、IMP-04249、IMP-04307、IMP-04356、JPI-289、JPI-547、JPI-283、fluzoparib、GT-1620、iobenguane I 131、DR-2313、MP-124、H-10、NT-125、BGP-15、NMSP-293、NMSP-293、NMSP-118、NMSP-648、NMSP-914、DB-207、NUV-1156、NUV-1176、JPI-289、Stenoparib、OX-401、NU-1025、NU-1085、PLX-376、R-554、RBN-2397、RBN-012759、PJ-34、INO-1001、WW-46、BSI-401、iniparib、SOMCL-9112、SC-10914、HTMC-0435、SRX-3128、TSL-1502、PJ-34、CEP-8983、CK-102、THG-009、talazoparib SR、L-2286、mitoparib和WB-1340中的一种或多种。
17.根据权利要求1至16中任一权利要求所述的药物组合，其还包含一种或多种肿瘤化疗药物；
优选地，所述肿瘤化疗药物选自拓扑异构酶II(TOP2)抑制剂，优选地，所述拓扑异构酶II(TOP2)抑制剂是依托泊苷；
优选地，所述肿瘤化疗药物选自紫杉醇类药物，优选地，所述紫杉醇类药物选自紫杉醇、白蛋白紫杉醇、脂质体紫杉醇和多烯紫杉醇；
优选地，所述肿瘤化疗药物选自铂类药物，优选地，所述铂类药物选自顺铂、卡铂和奥沙利铂；
优选地，所述肿瘤化疗药物选自吉西他滨、培美曲塞和卡培他滨中的一种或多种。
18.根据权利要求1至17中任一权利要求所述的药物组合，其中，
所述药物组合为固定组合，例如呈固体药物组合物形式或液体药物组合物形式；或者
所述药物组合是非固定组合，例如所述双特异性抗体及PARP抑制剂各自呈药物组合物形式。
19.根据权利要求18所述的药物组合，其中，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
20.一种药盒产品，其包含权利要求1至19中任一权利要求所述的药物组合，以及产品说明书。
21.权利要求1至19中任一权利要求所述的药物组合或者权利要求20所述的药盒产品在制备治疗和/或预防恶性肿瘤的药物中的用途；
优选地，所述恶性肿瘤选自卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、宫颈癌、输卵管癌、腹膜癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、肝癌、皮肤癌、胶质瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、肾肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、胃肠道癌、脑癌、食管癌例如食管鳞癌、微卫星高度不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)癌、尿路上皮癌、间皮瘤、胃腺癌、胃食管结合部腺癌、白血病、骨髓瘤、甲状腺癌、头颈癌、骨癌、胆道癌和睾丸癌；
优选地，所述肿瘤为存在同源重组介导的修复功能缺陷(例如BRCA1突变和/或BRCA2突变)的肿瘤；
优选地，所述肿瘤为不存在同源重组介导的修复功能缺陷的肿瘤；
优选地，所述肺癌为非小细胞性肺癌、小细胞肺癌；
优选地，所述非小细胞性肺癌为EGFR和/或ALK敏感突变的非小细胞肺癌；
优选地，所述非小细胞性肺癌为不携带EGFR和/或ALK敏感突变的非小细胞肺癌；
优选地，所述肝癌为肝细胞癌；
优选地，所述肾肿瘤为肾细胞癌；
优选地，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌；
优选地，所述尿路上皮癌为膀胱癌；
优选地，所述腹膜癌为原发性腹膜癌；
优选地，所述卵巢癌为存在同源重组介导的修复功能缺陷(例如BRCA1突变和/或BRCA2突变)的卵巢癌；
优选地，所述输卵管癌为存在同源重组介导的修复功能缺陷(例如BRCA1突变和/或BRCA2突变)的输卵管癌；
优选地，所述腹膜癌为存在同源重组介导的修复功能缺陷(例如BRCA1突变和/或BRCA2突变)的腹膜癌；
优选地，所述乳腺癌为存在同源重组介导的修复功能缺陷(例如BRCA1突变和/或BRCA2突变)的乳腺癌。
22.权利要求1至19中任一权利要求所述的药物组合中的双特异性抗体在制备治疗和/或预防恶性肿瘤的药物中的用途，其中，所述恶性肿瘤选自卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌和乳腺癌；
优选地，所述卵巢癌为存在同源重组介导的修复功能缺陷(例如BRCA1突变和/或BRCA2突变)的卵巢癌；
优选地，所述输卵管癌为存在同源重组介导的修复功能缺陷(例如BRCA1突变和/或BRCA2突变)的输卵管癌；
优选地，所述腹膜癌为存在同源重组介导的修复功能缺陷(例如BRCA1突变和/或BRCA2突变)的腹膜癌；
优选地，所述乳腺癌为存在同源重组介导的修复功能缺陷(例如BRCA1突变和/或BRCA2突变)的乳腺癌。
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