CN112300280B - 一种抗pd-1抗体及其医药用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于肿瘤治疗和分子免疫学领域，涉及一种抗PD‑1抗体及其医药用途。具体地，本发明涉及一种单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体的重链可变区包含：氨基酸序列为SEQ ID NOs:19－21的CDR；和/或所述单克隆抗体的轻链可变区包含：氨基酸序列为SEQ ID NOs:22－24的CDR，其中，按照EU编号系统，所述抗体的重链恒定区在第234位点、235位点和237位点中的任意2个位点或3个位点发生突变，并且突变后的抗体与FcγRIIIa和/或C1q的亲和力常数相比突变前降低。本发明的单克隆抗体能够很好地特异性与PD‑1结合，特异地解除PD‑1对机体免疫抑制，激活T淋巴细胞。

Description

一种抗PD-1抗体及其医药用途
技术领域
本发明属于肿瘤治疗和分子免疫学领域，涉及一种抗PD-1抗体及其医药用途。具体地，本发明涉及一种突变的抗PD-1的抗体。
背景技术
跨膜受体PD-1(programmed cell death 1，程序性细胞死亡因子1，亦简称为PD-1)是CD28基因家族成员之一，在活化的T细胞，B细胞以及骨髓系细胞都有表达。PD-1的配体PDL1(Programmed cell death 1ligand 1，亦简称为PDL-1)和PDL2(Programmed celldeath1ligand 2，亦简称为PDL-2)均属于B7超家族，其中PDL1在多种细胞都有表达，包括T细胞，B细胞以及内皮细胞和上皮细胞，PDL2则仅表达于抗原呈递细胞如树突状细胞和巨噬细胞。
PD-1/PDL1信号通路在调节免疫耐受、微生物感染及肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。PD-1的表达主要在T细胞等免疫细胞，而PD-1的配体PDL1主要在许多人类肿瘤组织呈高表达。阻断PD-1/PDL1信号通路可使被抑制的T细胞激活，进而攻击癌细胞。阻断PD-1/PDL1信号可以促进肿瘤抗原特异性T细胞的增殖，发挥杀伤肿瘤细胞的作用，进而抑制局部肿瘤生长(Julie R et al.,2012，N Engl J Med.366:2455–2465)。
PD-1/PD-L1是一个重要的特异性免疫检查点，PD-1/PD-L1复合物的形成传输抑制信号并负调节T细胞免疫应答；它抑制TCR介导的T细胞活化、细胞因子产生和T细胞增殖(Fife等(2011)Nature Immunology 10：1185-1193)；诱导同源抗原特异性T细胞之中的衰竭或无反应性(Hofmeyer等(2011)Journal of Biomedicine and Biotechnology 2011：1-9)；促进Th1细胞分化成Foxp3+调节性T细胞(Armanath等(2011)Science TransMed 3：1-13；Francisco等(2009)J.Exp.Med.206：3015-3029)；并诱导效应T细胞的凋亡。PD-L1基因的破坏导致上调的T细胞应答和自身反应性T细胞的产生(Latchman等(2004)PNAS 101：10691-10696)。PD-1或PD-L1的抗体阻断导致增加的抗肿瘤免疫性(Iwai等(2002)PNAS 99：12293-12297)。
在过去的近20年中，研究者努力开发特异性免疫检查点抑制剂并期望提供用于治疗癌症的新免疫治疗方案，其中T淋巴细胞的天然免疫系统具有强大的抗癌能力，其具有广泛且精确的特异性，从而可对各种肿瘤抗原做出响应。这种新兴的癌症免疫疗法通过激活的效应细胞的过继转移、针对相关抗原的免疫接种或提供非特异性免疫刺激剂来增强抗肿瘤免疫应答。因此，PD-1/PD-L1特异性免疫检查点抑制剂具有治疗相关癌症的潜力。
抗PD-1抗体药物发挥疗效的机制为阻断免疫细胞表面的PD-1蛋白与其配体PDL1或PDL2的结合，激活免疫细胞进而杀伤肿瘤。目前，尚需要开发新的抗PD-1抗体，以减少或消除抗体介导的ADCC、ADCP和/或CDC活性对抗PD-1抗体所结合的免疫细胞造成的损伤，提高抗体药物药效。ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)是抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用，是指抗体的Fab段结合病毒感染的细胞或肿瘤细胞的抗原表位，其Fc段与杀伤细胞(NK细胞、巨噬细胞等)表面的Fc受体(Fc Receptor,FcR)结合，介导杀伤细胞直接杀伤靶细胞。
CDC(complement dependent cytotoxicity)指补体依赖的细胞毒性。CDC作用是由抗体与细胞膜表面相应抗原结合后，进一步与补体C1q的首先结合引起的，接着C2-C9就被激活形成攻膜复合物对靶细胞发挥裂解效应。
Fc受体是表达在特定免疫细胞表面，用于识别抗体Fc区域介导免疫应答的免疫球蛋白家族蛋白。抗体Fab区域识别抗原后，其抗体Fc区域与免疫细胞(如杀伤细胞)上的Fc受体结合，启动免疫细胞的应答功能，如吞噬作用及ADCC。
根据Fc受体识别抗体类型及表达细胞的不同，Fc受体主要分为FcγR、FcαR和FcεR三种类型，FcγR又可分为FcγRI(亦称为CD64)、FcγRII(亦称为CD32)、FcγRIII(亦称为CD16)和FcRn(亦称为Neonatal Fc receptor)四种亚型。其中FcγRI、FcγRII、FcγRIII与ADCC效应密切相关。FcγRIII是介导ADCC的最主要分子，在不同细胞类型中具有高度同源的FcγRIIIa和FcγRIIIb两种亚型，在FcγRIIIa人群中存在单核干多态性(SNP)位点引起的高亲和力FcγRIIIa亚型，分别称为FcγRIIIa_V158和低亲和力FcγRIIIa_F158两个亚型。FcγRI对IgG的Fc区域具有较高的亲和力，参与ADCC过程；FcγRII有FcγRIIa，FcγRIIb和FcγRIIc(亦分别称为CD32a，CD32b，CD32c)三个亚型，其中FcγRIIa具有ADCC活性；FcγRIIa在人群中存在由于单核苷酸突变导致的两种亚型，分别称为FcγRIIa_H131和FcγRIIa_R131；FcγRIIb为抑制性受体，FcγRIIb是典型的抑制性FcγR，可抑制附近的ITAM通路。例如，免疫复合物与BCR结合后，Fc段会结合同一细胞上的FcγRIIb，负性调节B细胞激活，减少抗体、细胞因子的分泌(Hogarth PM,Pietersz GA.2012,NATURE REVIEWS DRUGDISCOVERY,11(4):311-331)。
IgG家族包含四个成员，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，它们重链恒定区的可结晶片段(fragment crystallizable，Fc)区域存在氨基酸的差异，导致它们与FcγRs的亲和力各不相同。IgG1是人体内最多的亚型，也是单抗药物中用的最多的亚型，IgG1能够结合各种FcγRs，能够引发ADCC以及CDC效应。IgG2与FcγRs的亲和力最弱，但是IgG2仍能够通过与FcγRIIa的结合引发单核细胞介导的ADCC。IgG3与FcγRs的结合能力最强，能引发ADCC，且CDC效应比IgG1更强。IgG4分子与FcγRI之外的FcγRs结合较弱，IgG4分子引起CDC和NK细胞介导的ADCC的可能性较低；然而，IgG4亚型抗体可通过与FcγRI的结合介导ADCP效应，靶向于免疫细胞的抗体药物存在ADCP效应可能会导致免疫细胞损伤，具有影响药物药理学负面效应。
Zhang等人(Zhang T等人.Cancer ImmunolImmunother.2018；67(7):1079–1090.)及Dahan等人(Dahan R等人。Cancer Cell.2015；28(3):285-95.)的研究表明，靶向PD-1、CTLA-4等免疫检查点的抗体的Fc段与Fc受体结合会对抗抗体介导的抗癌活性产生负面影响，这可能是由于Fc依赖性效应子功能诱导的免疫细胞受损，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)是导致免疫细胞损伤的重要机制。
非鳞状非小细胞肺癌(non-squamous non-small cell lung cancer，NSCLC)、鳞状非小细胞肺癌(Squamous non-small cell lung cancer，sNSCLC)均为肺组织恶性肿瘤，当前治疗策略包括早期的手术，然而大多数肺癌患者确诊时已处于晚期，手术与放疗效果不佳，化疗成为其重要的治疗手段。目前，铂类与其它化疗药物的联合化疗仍是晚期sNSCLC和NSCLC在内的肺癌的一线化疗方案(Pfister DG等.J Clin Oncol.2003；22：330；DeRuysscher等(2006)Annals of Oncology17：543-552.)。
化疗药物目前主要分为下述九类(赫捷等。临床肿瘤学。北京：人民卫生出版社，2016：230-237)第一类为直接与DNA结合，阻止DNA复制的药物，包括各种炕化剂、丝裂霉素和博来霉素、达卡巴嗪、铂类药物如顺铂和卡铂、喜树碱类药物及其衍生物；第二类为阻止核酸生物合成的药物，这类药物主要影响瘤细胞的酶系，使DNA和RNA的前体物合成受阻，从而抑制DNA或RNA形成，主要包括甲氨蝶岭、氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、羟基脲和阿糖胞苷等，主要作用于S期细胞，属抗代谢类化疗药，为周期特异性抗癌药；第三类为影响转录的化疗药物，主要药理作用是插入DNA双螺旋与其形成非共价结合，从而干扰DNA上的遗传信息转录到依赖DNA的mRNA上，导致模报功能受到损害、转录受阻，主要包括。第四类为影晌微管蛋白和有丝分裂的药物主要包括长春碱类、鬼臼毒素类和紫杉醇类等植物药；第五类为影晌核糖体功能，阻止蛋白质合成的药物以二尖杉醋碱类植物药为代表，它能抑制蛋白质合成的起始阶段，使核糖体分解并释出新生肽链，但不能阻止mRNA和tRNA与核糖体的结合这类药可使核DNA和胞质RNA减少、多聚核糖体解聚，并拥制有丝分裂；第六类为影晌细胞膜的药物植物凝集素如刀豆素(Con-A)和植物凝集素(PHA)等可以和细胞膜上的糖蛋白受体结舍，从而影响瘤细胞的DNA合成，阻止瘤细胞分裂；第七类为诱导细胞凋亡(apoptosis)的药物，如三氧化二砷等；第八类为激素类主要通过调节内分泌米治疗肿瘤，包括雌激素类、抗雌激素类、孕激素类、雄激素类、抗雄激素类、肾上腺皮质激素类、抗肾上腺皮质激素类(包括氯苯二氯乙烷和氨鲁米特)；第九类为抗肿瘤靶点治疗，包括单克隆抗体、表皮生长因子信号传导抑制剂(如针对受体型酪氨酸激酶通路的靶向药物)、泛素蛋白酶体抑制剂、血管生成抑制剂等。然而，化疗药物除能杀死肿瘤细胞外，对人体正常细胞也有损害，因此对癌症患者常见的化疗方案往往导致严重的毒副作用；更重要的是，化疗药物除了明显的毒性之外，很多种肿瘤患者在接受化疗药物治疗后疾病仍无法得到长期控制，5年生存率仍然很低。因此，开发更低毒性、更有效的治疗手段或者联合给药治疗方案具有巨大的临床意义。
安罗替尼(Anlotinib)是一种喹啉衍生物类酪氨酸激酶抑制剂，其作为多靶点酪氨酸激酶抑制剂(TKI)在影响肿瘤血管生成和增殖信号传导方面发挥作用，主要靶点包括：受体酪氨酸激酶血管内皮生长因子受体(VEGFR)1至3，表皮生长因子受体(EGFR)，成纤维细胞生长因子受体(FGFR)1至4，血小板衍生生长因子受体(PDGFR)α和β，以及干细胞因子受体(SCFR)7、8和9。一项2期试验显示，安罗替尼可改善无进展生存期，并具有总体生存的潜在益处(Han B,et al.Br J Cancer.2018；118(5)：654-661)。一项多中心、双盲、3期随机临床试验显示，在中国患者中，安罗替尼导致延长的总生存期和无进展生存期，这一发现表明，安罗替尼耐受性良好，是晚期NSCLC患者潜在的三线或进一步治疗(Han B,et al.JAMAOncol.2018Nov；4(11)：1569-1575)。
文献WO2008112407在实施例24中公开了一种喹啉衍生物类的酪氨酸激酶抑制剂1-[[[4-(4-氟-2-甲基-1H-吲哚-5-基)氧基-6-甲氧基喹啉-7-基]氧基]甲基]环丙胺及其制备方法，它的结构式如下面的式I所示。盐酸安罗替尼是式I化合物的盐酸盐。
Figure BDA0002613250550000061
仑伐替尼(又称乐伐替尼，lenvatinib)是由日本卫材公司开发的一种口服多酪氨酸激酶抑制剂，可抑制VEGFR1(FLT1)、VEGFR2(KDR)和VEGFR3(FLT4)的激酶活性的多靶点受体酪氨酸激酶抑制剂。除正常细胞功能外，仑伐替尼还抑制与病原性血管发生、肿瘤生长和癌症进展有关的其他受体酪氨酸激酶，包括成纤维细胞生长因子(FGF)受体FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4；转染重排受体(RET)、KIT、和血小板衍生性生长因子受体α(PDGFRα)。仑伐替尼还在肝细胞癌细胞系中展示出抗增殖活性，该抗增殖活性取决于活化的FGFR信号传导以及对抑制FGF受体底物2α(FRS2α)磷酸化的同时抑制。
文献美国专利7,612,208的实例368中披露了仑伐替尼化合物结构，为4-(3-氯-4(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-喹啉甲酰胺。文献美国专利号7,253,286的披露了仑伐替尼的甲烷磺酸盐形式(即，甲磺酸盐)，仑伐替尼甲磺酸盐的化学名为4-[3-氯-4-(环丙基脲基)苯氧基]-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺甲烷磺酸盐，下面提供了其化学结构(式II)：
Figure BDA0002613250550000071
然而，很多种肿瘤患者在接受化疗药物治疗后疾病仍无法得到长期控制，5年生存率仍然很低。因此，开发更低毒性、更有效的治疗手段或者联合给药治疗方案具有巨大的临床意义。
发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，对抗PD-1抗体结构的Fc端进行相应的改造，降低Fc区域与Fc受体的结合，从而降低对T细胞的ADCC、ADCP和/或CDC毒副作用，增加抗PD-1抗体药物的药物效能。由此提供了下述发明：
本发明的一个方面涉及一种抗体，其中，
所述抗体的重链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NOs:19－21所示的HCDR1－HCDR3；并且所述抗体的轻链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NOs:22－24所示的LCDR1－LCDR3；
所述抗体为人IgG1亚型；
其中，按照EU编号系统(EU numbering system)，所述抗体的重链恒定区在第234位点、235位点和237位点中的任意2个位点或3个位点发生突变，并且突变后的抗体与FcγRIIIa和/或C1q的亲和力常数相比突变前降低；优选地，所述亲和力常数通过FortebioOctet分子相互作用仪测得。
在本发明的一个实施方案中，所述抗体为单克隆抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述抗体为抗PD-1抗体，优选为抗PD-1单克隆抗体。
在本发明的一些实施方案中，所述的抗体，其中，按照EU编号系统，所述抗体的重链恒定区在第234位点、235位点和/或237位点具有如下突变：
L234A和L235A；
L234A和G237A；
L235A和G237A；
或者
L234A、L235A和G237A。
本发明中，如果没有特别说明，位点之前的字母表示突变前的氨基酸，位点之后的字母表示突变后的氨基酸。
本发明还涉及一种抗体，其中，
所述抗体的重链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NOs:19－21所示的HCDR1－HCDR3；并且所述抗体的轻链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NOs:22－24所示的LCDR1－LCDR3；
所述抗体为人IgG1亚型；
其中，按照EU编号系统，所述抗体的重链恒定区在第234位点、235位点和/或237位点具有如下突变：
L234A和L235A；
L234A和G237A；
L235A和G237A；
或者
L234A、L235A和G237A。
在本发明的一些实施方案中，按照EU编号系统，所述抗体的重链恒定区还具有选自如下的一个或多个突变：
N297A、D265A、D270A、P238D、L328E、E233D、H268D、P271G、A330R、C226S、C229S、E233P、P331S、S267E、L328F、A330L、M252Y、S254T、T256E、N297Q、P238S、P238A、A327Q、A327G、P329A、K322A、T394D、G236R、G236A、L328R、A330S、P331S、H268A、E318A和K320A。
在本发明的一些实施方案中，所述的抗体，其中，
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:6；并且
所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:8。
在本发明的一些实施方案中，所述的抗体，其中，
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
在本发明的一个实施方案中，所述的抗体：
其重链如SEQ ID NO:16所示，并且其轻链如SEQ ID NO:12所示；
或者
其重链如SEQ ID NO:18所示，并且其轻链如SEQ ID NO:12所示。
轻链和重链的可变区决定抗原的结合；每条链的可变区均含有三个高变区，称互补决定区(CDR)(重链(H)的CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，轻链(L)的CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；其由Kabat等人命名，见Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition(1991),第1-3卷,NIH Publication 91-3242,Bethesda Md)。
通过本领域技术人员所熟知的技术手段，例如通过VBASE2数据库分析上面的(1)-(3)项中的单克隆抗体序列的CDR区的氨基酸序列：
本发明的涉及的抗体14C12、14C12H1L1(hG1WT)、14C12H1L1(hG1DM)、14C12H1L1(hG1TM)具有相同的CDR：
其重链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下：
HCDR1:GFAFSSYD(SEQ ID NO:19)，
HCDR2:ISGGGRYT(SEQ ID NO:20)，
HCDR3:ANRYGEAWFAY(SEQ ID NO:21)；
其轻链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下：
LCDR1:QDINTY(SEQ ID NO:22)，
LCDR2:RAN(SEQ ID NO:23)，
LCDR3:LQYDEFPLT(SEQ ID NO:24)。
在本发明的一些实施方案中，所述抗体以大于大约10-7M，例如大于大约10-6M、10- 5M、10-4M或10-3M或更大的亲和力常数结合FcγRIIIa_F158、FcγRI、FcγRIIa_H131、FcγRIIIa_V158和/或FcγRIIb；优选地，所述亲和力常数通过Fortebio Octet分子相互作用仪测得；
优选地，所述抗体与FcγRIIIa_F158、FcγRI、FcγRIIa_H131、FcγRIIIa_V158和/或FcγRIIb没有结合信号或者结合信号小于0.1nm；优选地，所述结合信号是指通过Fortebio Octet分子相互作用仪测得的响应值。
在本发明的一些实施方案中，所述抗体以大于大约10-9M，例如大于大约10-8M、10- 7M、10-6M或10-5M或更大的亲和力常数结合C1q；优选地，所述亲和力常数通过FortebioOctet分子相互作用仪测得；
优选地，所述抗体与C1q没有结合信号或者结合信号小于0.1nm；优选地，所述结合信号是指通过Fortebio Octet分子相互作用仪测得的响应值。
在本发明的一些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体。
在本发明的一些实施方案中，所述抗体为人源化抗体。
本发明的另一方面涉及一种分离的核酸分子，其编码本发明任一项所述的抗体。
本发明的再一方面涉及一种载体，其包含本发明的分离的核酸分子。
本发明的再一方面涉及一种宿主细胞，其包含本发明的分离的核酸分子，或者本发明的载体。
本发明的再一方面涉及一种偶联物，其包括抗体以及偶联部分，其中，所述抗体为本发明任一项所述的抗体，所述偶联部分为可检测的标记；优选地，所述偶联部分为放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。
本发明的再一方面涉及一种试剂盒，其包括本发明任一项所述的抗体，或者包括本发明的偶联物；
优选地，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别所述抗体；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。
本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的抗体或者本发明的偶联物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测PD-1在样品中的存在或其水平。
本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含本发明任一项所述的抗体或者本发明的偶联物；可选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述的药物，其中，其还包含一种或多种肿瘤化疗药物；
优选地，所述肿瘤化疗药物为酪氨酸激酶抑制剂；更优选地，所述肿瘤化疗药物为安罗替尼或其可药用盐(例如盐酸盐)，或者仑伐替尼或其可药用盐(例如甲烷磺酸盐)。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述的药物组合物，其中，所述药物组合物的单位剂量，按照其中的所述抗体的质量计算，为100mg-1000mg、200mg-800mg、200mg-500mg、300mg-600mg、400mg-500mg或者450mg。
本发明的再一方面涉及一种药物组合，其包含本发明中任一项所述的抗体，以及至少一种(例如1种、2种或3种)肿瘤化疗药物。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述的药物组合，其中，所述肿瘤化疗药物为酪氨酸激酶抑制剂；更优选地，所述肿瘤化疗药物为安罗替尼或其可药用盐(例如盐酸盐)，或者仑伐替尼或其可药用盐(例如甲烷磺酸盐)。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述的药物组合，其中，所述抗体的单位剂量为100mg-1000mg、200mg-800mg、200mg-500mg、300mg-600mg、400mg-500mg或者450mg。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的药物组合，其中，所述肿瘤化疗药物的单位剂量为0.1mg-100mg、0.5mg-50mg、0.5mg-10mg、1mg-10mg、2mg-8mg或者1mg-5mg。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的药物组合，其中，所述肿瘤化疗药物的单位剂量为1mg-20mg、2mg-15mg、4mg-12mg或者8mg-12mg。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述的药物组合，其中，
所述药物组合为固定组合，例如呈固体药物组合物形式或液体药物组合物形式；或者
所述药物组合是非固定组合，例如所述非固定组合中的抗PD-1抗体、肿瘤化疗药物各自呈药物组合物形式。
本发明的再一方面涉及一种药盒产品，其包含本发明中任一项所述的药物组合物或者本发明中任一项所述的药物组合，以及产品说明书。
本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的抗体、本发明的偶联物、本发明中任一项所述的药物组合物或者本发明中任一项所述的药物组合在制备治疗和/或预防肿瘤或者贫血病的药物中的用途，或者在制备用于诊断肿瘤或者贫血病的药物中的用途；优选地，所述肿瘤选自黑色素瘤、肾肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、白血病、鼻咽癌和子宫内膜癌中的一种或多种；
优选地，所述肺癌选自非小细胞性肺癌、小细胞性肺癌和肺鳞癌中的一种或多种；
优选地，所述胃癌为胃腺癌或食管结合部腺癌；
优选地，所述肿瘤为具有MSI-H/dMMR表型的实体瘤；优选地，所述肿瘤选自具有MSI-H/dMMR表型的下述肿瘤中的一种或多种：
结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、胃癌、间皮瘤、肉瘤、肾上腺皮质癌、恶性黑色素瘤或卵巢生殖细胞肿瘤。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述的用途，其中，所述肿瘤为复发性、转移性(例如淋巴转移、脑转移和/或骨转移的)或难治性肿瘤。
MSI(microsatellite instability)是微卫星不稳定性。微卫星(Microsatellite)是遍布于人类基因组中的短串联重复序列,有单核苷酸、双核苷酸或高位核苷酸的重复，重复次数10-50次。与正常细胞相比，某些异常组织细胞，如肿瘤，内的微卫星由于重复单位的插入或缺失而导致微卫星长度的改变，就叫做MSI。根据MSI不稳定性和程度，可分为微卫星高度不稳定型(MSI-H)、微卫星低度不稳定型(MSI-L)和微卫星稳定型(MSS)。造成MSI的主要原因是DNA错配修复(mismatch repair，MMR)功能缺陷。人类错配修复基因(MMR基因)经转录翻译后可表达相应的错配修复蛋白，如果任一MMR蛋白表达缺失可造成细胞的错配修复功能缺陷，则对DNA复制过程中的碱基错配丧失修复功能而造成累积，导致微卫星不稳定(MSI)的发生，约15％的结直肠癌是经由MSI途径引发的。最早发现于结直肠癌，也可发生于胃癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质肿瘤等(Baretti M等人.PharmacolTher.2018；189:45-62.)，后续研究在间皮瘤、肉瘤、肾上腺皮质癌、恶性黑色素瘤和卵巢生殖细胞肿瘤中亦发现MSI-H/dMMR特征。
MSI-H和dMMR代表两种不同检测方法所产生的结果，dMMR与MSI-H在生物学上具有一致性，称为MSI-H/dMMR或者MSI-high/dMMR，MSI-L和MSS则是MMR正常(proficientmismatch repair，pMMR)的表型。dMMR检测方法为基于肿瘤标本(包括手术标本、穿刺标本)进行MSH2、MLH1、MSH6以及PMS2四个错配基因的免疫组化蛋白检测，若四个蛋白里面任何一个蛋白表达缺失则为dMMR；如四个蛋白均为阳性表达则肿瘤为pMMR，即错配修复功能完整。MSI的检测为肿瘤细胞和体细胞重复DNA序列(微卫星序列)的长度进行一一配对检测，并比较长度。当使用PCR方法并基于美国NCI标准检测5个标准位点时，如果其中有两个或两个以上位点不一致则为不稳定，定义为MSI-H，如果一个位点不一致则称为MSI-L(微卫星低度不稳定)，如5个位点均一致则为MSS。高通量测序(High-throughput sequencing)(或称下一代测序，Next-generation sequencing technology，NGS)亦可作为检测微卫星不稳定性的方法。当选用更多的微卫星位点，如多于5个或者其他一些微卫星位点，进行PCR检测时，通常≥30％的位点不一致就叫MSI-H，所有位点都一致就定义为MSS，在0到30％之间是MSI-L。
本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的抗体、本发明的偶联物、本发明中任一项所述的药物组合物或者本发明中任一项所述的药物组合在制备如下药物中的用途：
阻断PD-1与PDL1结合的药物，
下调PD-1活性或水平的药物，
解除PD-1对机体的免疫抑制的药物，或者
提高T淋巴细胞中IFN-γ和/或IL-2表达的药物。
干扰素γ(IFNγ)，主要由自然杀伤细胞(NK)，自然杀伤T细胞(NKT)先天产生，和由CD4 Th1细胞和CD8细胞毒性T淋巴细胞这些效应T细胞经由特定抗原刺激后产生。IFNγ作为一种重要的先天性和获得性免疫细胞因子在对抗或抑制病毒，某些细菌和原虫性疾病感染起着重要作用。同时，IFNγ能激活巨噬细胞，诱导Ⅱ类主要组织相容性复合体的表达，激活免疫反应控制肿瘤的发展(Schoenborn JR,Wilson CB.Regulation of Interferon-γDuring Innate and Adaptive Immune Responses.Advances in Immunology2007；96:41-101)。本发明的体外实验中，本发明的抗体能诱导IFNγ的分泌激活免疫反应。
白细胞介素2(IL-2)由T细胞产生，是调节T细胞亚群的生长因子，也是调控免疫应答的重要因子，并可促进活化B细胞增殖，参与抗体反应、造血和肿瘤监视。重组的人IL-2已经被美国FDA批准用于治疗恶性肿瘤(包括黑色素瘤、肾肿瘤等)(Chavez,A.R.,et al.,Pharmacologic administration of interleukin-2.Ann N Y Acad Sci,2009.1182:p.14-27)。体外实验中，本发明的抗体可特异地解除PD-1对机体免疫抑制，激活T细胞，诱导IL-2产生，在抗肿瘤及寄生虫等疾病的治疗中有广泛应用前景。
本发明的再一方面涉及一种在体内或体外方法，包括给予细胞或者有需求的受试者以有效量的本发明任一项所述的抗体、本发明的偶联物、本发明中任一项所述的药物组合物或者本发明中任一项所述的药物组合的步骤，所述方法选自如下：
阻断PD-1与PDL1结合的方法，
下调PD-1活性或水平的方法，
解除PD-1对机体的免疫抑制的方法，或者
提高T淋巴细胞中IFN-γ和/或IL-2表达的方法。
根据本发明任一项所述的抗体、本发明的偶联物、本发明中任一项所述的药物组合物或者本发明中任一项所述的药物组合，其用于治疗和/或预防肿瘤或者贫血病，或者用于诊断肿瘤或者贫血病；优选地，所述肿瘤选自黑色素瘤、肾肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、白血病、鼻咽癌和子宫内膜癌中的一种或多种；
优选地，所述肺癌选自非小细胞性肺癌、小细胞性肺癌和肺鳞癌中的一种或多种；
优选地，所述胃癌为胃腺癌或食管结合部腺癌；
优选地，所述肿瘤为具有MSI-H/dMMR表型的实体瘤；优选地，所述肿瘤选自具有MSI-H/dMMR表型的下述肿瘤中的一种或多种：
结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、胃癌、间皮瘤、肉瘤、肾上腺皮质癌、恶性黑色素瘤或卵巢生殖细胞肿瘤。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述的抗体或者本发明的偶联物，其中，所述肿瘤为复发性、转移性(例如淋巴转移、脑转移和/或骨转移的)或难治性肿瘤。
根据本发明任一项所述的抗体、本发明的偶联物、本发明中任一项所述的药物组合物或者本发明中任一项所述的药物组合，其用于：
阻断PD-1与PDL1结合，
下调PD-1活性或水平，
解除PD-1对机体的免疫抑制，或者
提高T淋巴细胞中IFN-γ和/或IL-2表达。
本发明的再一方面涉及一种治疗和/或预防肿瘤或者贫血病的方法，或者一种诊断肿瘤或者贫血病的方法，包括给予有需求的受试者以有效量的本发明任一项所述的抗体、本发明的偶联物、本发明中任一项所述的药物组合物或者本发明中任一项所述的药物组合的步骤；优选地，所述肿瘤选自黑色素瘤、肾肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、白血病、鼻咽癌和子宫内膜癌中的一种或多种；
优选地，所述肺癌选自非小细胞性肺癌、小细胞性肺癌和肺鳞癌中的一种或多种；
优选地，所述胃癌为胃腺癌或食管结合部腺癌；
优选地，所述肿瘤为具有MSI-H/dMMR表型的实体瘤；优选地，所述肿瘤选自具有MSI-H/dMMR表型的下述肿瘤中的一种或多种：
结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、胃癌、间皮瘤、肉瘤、肾上腺皮质癌、恶性黑色素瘤或卵巢生殖细胞肿瘤。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述的方法，其中，所述肿瘤为复发性、转移性(例如淋巴转移、脑转移和/或骨转移的)或难治性肿瘤。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述的方法，其中，所述给予有需求的受试者以有效量的抗PD-1抗体的步骤为在手术治疗之前或之后，和/或在放射治疗之前或之后。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述的方法，其中，
抗PD-1抗体的单次给药剂量为每千克体重0.1-100mg，优选1-10mg(例如1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg或10mg)；或者，抗PD-1抗体的单次给药剂量为每位受试者10-1000mg(例如大约100mg、大约150mg、大约200mg、大约250mg、大约300mg、大约350mg、大约400mg、大约450mg、大约500mg、大约600mg、大约700mg、大约800mg、大约900mg或大约1000mg)，优选50-500mg、100-400mg、150-300mg、150-250mg或200mg；
优选地，每3天、4天、5天、6天、10天、1周、2周或3周给药一次；
优选地，给药方式为静脉滴注或静脉注射。
在一些方案中，抗PD-1抗体的施用治疗以2周(14天)或3周(21天)为一个周期，优选在每个周期第一天(D1)静脉给予抗PD-1抗体。例如，所述抗PD-1抗体以每两周一次(q2w)或者每三周一次(q3w)的频率施用。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，当提及PD-1蛋白(Programmed cell death protein 1,NCBIGenBank:NP_005009.2)的氨基酸序列时，其包括PD-1蛋白的全长，或者PD-1的胞外片段PD-1ECD或者包含PD-1ECD的片段；还包括PD-1ECD的融合蛋白，例如与小鼠或人IgG的Fc蛋白片段(mFc或hFc)进行融合的片段。然而，本领域技术人员理解，在PD-1蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“PD-1蛋白”应包括所有此类序列，及其天然或人工的变体。并且，当描述PD-1蛋白的序列片段时，其不仅包括序列片段，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。
如本文中所使用的，当提及PDL1蛋白(NCBI Genebank ID:NP_054862.1)的氨基酸序列时，其包括PDL1蛋白的全长，或者PDL1的胞外片段PDL1ECD或者包含PDL1ECD的片段；还包括PDL1ECD的融合蛋白，例如与小鼠或人IgG的Fc蛋白片段(mFc或hFc)进行融合的片段。然而，本领域技术人员理解，在PDL1蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“PDL1蛋白”应包括所有此类序列以及其天然或人工的变体。并且，当描述PDL1蛋白的序列片段时，包括PDL1序列片段，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。
如本文中所使用的，术语EC50是指半数最大效应浓度(concentration for 50％ofmaximal effect)，是指能引起50％最大效应的浓度。
如本文中所使用的，术语“抗体”是指，是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
如本文中所使用的，术语“单抗”和“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片断，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(Nature,256:495,1975)，但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.Patent 4,816,567)。
如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，人源免疫球蛋白(受体抗体)的全部或部分CDR区被一非人源抗体(供体抗体)的CDR区替换后得到的抗体或抗体片段，其中的供体抗体可以是具有预期特异性、亲和性或反应性的非人源(例如，小鼠、大鼠或兔)抗体。此外，受体抗体的构架区(FR)的一些氨基酸残基也可被相应的非人源抗体的氨基酸残基替换，或被其他抗体的氨基酸残基替换，以进一步完善或优化抗体的性能。关于人源化抗体的更多详细内容，可参见例如，Jones et al.,Nature,321:522 525(1986)；Reichmann etal.,Nature,332:323 329(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593 596(1992)；和Clark,Immunol.Today 21:397 402(2000)。
如本文中所使用的，术语“分离的”或“被分离的”指的是，从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”或“被分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。
如本文中所使用的，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10- 9M或10-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合抗原(例如，PD-1蛋白)。可以使用本领域技术人员知悉的方法测定KD，例如使用Fortebio分子相互作用仪测定。
如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
如本文中所使用的，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起或预先递送入机体时，其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物试验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂则在临床实验中使用较多。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如肿瘤)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如肿瘤)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
如本文中所使用的，术语“完全消除”是指通过现有的仪器设备(例如FortebioOctet分子相互作用仪)检测显示没有结合信号或结合信号极低。在本发明的一个实施方案中，没有结合信号或结合信号极低是指结合信号(即响应值或Response)低于0.1nm。
“复发性”癌症是在对初始治疗(例如手术)产生应答后，在初始部位或远处部位再生的癌症。“局部复发性”癌症是在治疗后，在与先前治疗的癌症相同的位置出现的癌症。
“转移性”癌症是指从身体的一部分(例如肺部)扩散到身体的另一部分的癌症。
发明的有益效果
本发明实现了如下的(1)至(9)项中所述技术效果中的一项或多项：
(1)本发明的抗体特别是14C12H1L1(hG1TM)和14C12H1L1(hG1WT)均能有效地阻断PD-1/PDL1结合所诱导的免疫细胞的免疫抑制，诱导人外周血单核细胞分泌IFN-γ和IL-2。
(2)本发明的抗体特别是14C12H1L1(hG1TM)，完全消除了其与Fc受体FcγRI、FcγRIIa_H131、FcγRIIIa_V158和/或FcγRIIIa_F158的结合活性，进而消除了其ADCC活性或ADCP活性。
(3)本发明的抗体特别是14C12H1L1(hG1TM)完全消除了其与补体C1q的结合活性，进而完全消除了其CDC活性。
(4)本发明的抗体例如14C12H1L1(hG1DM)显著地减弱了其与Fc受体FcγRI、FcγRIIa_H131、FcγRIIa_R131和/或FcγRIIIa_V158的结合，并完全消除了其与FcγRIIIa_F158和/或FcγRIIb的结合，因此显著地降低其ADCC活性。
(5)本发明的抗体特别是14C12H1L1(hG1DM)完全消除了其与补体C1q的结合活性，进而完全消除了其CDC活性。
(6)本发明的单克隆抗体特别是14C12H1L1(hG1TM)、14C12H1L1(hG1DM)和14C12H1L1(hG1WT)均能够很好地特异性与PD-1结合，并且能够十分有效地阻断PD-1与PDL1的结合，特异地解除PD-1对机体免疫抑制，激活T淋巴细胞。其中，PD-1抗体14C12H1L1(hG1TM)对IFN-γ和IL-2分泌的诱导效果明显强于对照抗PD-1抗体Nivolumab，以及对照抗PDL1抗体5C10H2L2-IgG1mt。具有用于制备预防和治疗肿瘤的药物的潜力。
(7)能够有效地防治前述肿瘤；
(8)毒副作用较低；
(9)本发明的抗PD-1抗体或者本发明的药物组合中的抗PD-1抗体与化疗药物之间具有协同作用。
附图说明
图1：14C12H1L1(hG1DM)与FcγRI的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.12nM。
图2：14C12H1L1(hG4)与FcγRI的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.12nM。
图3：14C12H1L1(hG1WT)与FcγRI的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.12nM。
图4：14C12H1L1(hG1TM)与FcγRI的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.12nM。
图5：5C10H2L2-IgG1mt与FcγRI的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.12nM。
图6：14C12H1L1(hG1DM)与FcγRIIIa_V158的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM。
图7：14C12H1L1(hG4)与FcγRIIIa_V158的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM。
图8：14C12H1L1(hG1WT)与FcγRIIIa_V158的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM。
图9：14C12H1L1(hG1TM)与FcγRIIIa_V158的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM。
图10：5C10H2L2-IgG1mt与FcγRIIIa_V158的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM。
图11：14C12H1L1(hG1DM)与FcγRIIIa_F158的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗原的浓度分别为500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM。
图12：14C12H1L1(hG4)与FcγRIIIa_F158的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM。
图13：14C12H1L1(hG1WT)与FcγRIIIa_F158的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM。
图14：14C12H1L1(hG1TM)与FcγRIIIa_F158的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM。
图15：5C10H2L2-IgG1mt与FcγRIIa_F158的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM。
图16：14C12H1L1(hG1DM)与FcγRIIa_H131的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM。
图17：14C12H1L1(hG4)与FcγRIIa_H131的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM。
图18：14C12H1L1(hG1WT)与FcγRIIa_H131的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM。
图19：14C12H1L1(hG1TM)与FcγRIIa_H131的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM。
图20：5C10H2L2-IgG1mt与FcγRIIa_H131的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM。
图21：14C12H1L1(hG1DM)与FcγRIIa_R131的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM。
图22：14C12H1L1(hG4)与FcγRIIa_R131的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM。
图23：14C12H1L1(hG1WT)与FcγRIIa_R131的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM。
图24：14C12H1L1(hG1TM)与FcγRIIa_R131的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM。
图25：5C10H2L2-IgG1mt与FcγRIIa_R131的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM。
图26：14C12H1L1(hG1DM)与FcγRIIb的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM。
图27：14C12H1L1(hG4)与FcγRIIb的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM。
图28：14C12H1L1(hG1WT)与FcγRIIb的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM。
图29：14C12H1L1(hG1TM)与FcγRIIb的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM。
图30：5C10H2L2-IgG1mt与FcγRIIb的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM。
图31：14C12H1L1(hG1DM)与C1q的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为20nM、10nM、5nM、2.5nM、1.25nM。
图32：14C12H1L1(hG4)与C1q的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为20nM、10nM、5nM、2.5nM、1.25nM。
图33：14C12H1L1(hG1WT)与C1q的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为20nM、10nM、5nM、2.5nM、1.25nM。
图34：14C12H1L1(hG1TM)与C1q的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为20nM、10nM、5nM、2.5nM、1.25nM。
图35：5C10H2L2-IgG1mt与C1q的亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗原的浓度分别为20nM、10nM、5nM、2.5nM、1.25nM。
图36：混合淋巴反应加入14C12H1L1(hG1WT)和14C12H1L1(hG1TM)的IFN-γ分泌量检测结果。
图37：混合淋巴反应加入14C12H1L1(hG1WT)和14C12H1L1(hG1TM)的IL-2分泌量检测结果。
图38：14C12H1L1(hG1WT)、Nivolumab和14C12H1L1(hG1TM)的ADCP效应结果图。
图39：14C12H1L1(hG1TM)+安罗替尼针对人非小细胞肺癌肿瘤细胞的杀伤效果图。
图40：14C12H1L1(hG1TM)抑制小鼠直结肠癌MC38细胞增殖。
图41：14C12H1L1(hG1TM)有效增强免疫细胞对人胃癌细胞KATO III细胞的免疫反应。
图42：14C12H1L1(hG1TM)有效增强免疫细胞对鼻咽癌肿瘤细胞CNE-2Z的免疫反应。
图43：14C12H1L1(hG1TM)有效增强免疫细胞对间皮瘤肿瘤细胞NCI-H2452的免疫反应。
图44：14C12H1L1(hG1TM)有效增强免疫细胞对人小细胞肺癌细胞NCI-H446细胞的免疫反应。
图45：14C12H1L1(hG1TM)联合盐酸安罗替尼有效增强免疫细胞对鼻咽癌肿瘤细胞CNE-2Z细胞的免疫反应。
图46：14C12H1L1(hG1TM)联合安罗替尼显著增强免疫细胞对MSI-h/dMMR肿瘤系细胞系SW48细胞的免疫反应。
图47：14C12H1L1(hG1TM)显著增强免疫细胞对非MSI-h/dMMR(即MSS)表型的人直结肠癌细胞SW837细胞的免疫反应。
图48：14：14C12H1L1(hG1TM)联合安罗替尼显著增强免疫细胞对非MSI-h/dMMR(即MSS)表型的人直结肠癌细胞SW837细胞的免疫反应。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，为可以通过市场购买获得的常规产品。
在本发明下面的实验中：
BALB/c小鼠购自广东省医学实验动物中心。
抗PDL1抗体5C10H2L2-IgG1mt的制备方法参照PCT公开WO2017148424A1。
抗PD-1抗体Nivolumab(商品名Opdivo)购自百时美施贵宝公司。
人外周血单核细胞均为在中山康方生物医药有限公司分离制备，且经提供者知情同意。
Raji-PDL1为中山康方生物医药有限公司基于人B细胞系细胞Raji细胞通过转染构建的表达有人PD-L1的细胞。
Ficoll-PaqueTM PLUS(或Ficoll-Paque PLUS)购自GE Healthcare。
Human IL-2 ELISA Kit购自达科为生物技术股份有限公司。
RPMI 1640培养基、DMEM培养基、Trypsin-EDTA(0.25％)phenol red、Blasticidin均来源于Gibco。
金黄色葡萄球菌肠毒素抗原(SEB)来源于德诺泰克。
FBS来源于Excell bio。
丝裂霉素C(MMC)来源于Stressmarq。
同型对照抗体为人抗鸡蛋溶酶体抗体(human anti-Hen Egg Lysozyme IgG，即anti-HEL抗体，或者human IgG，简称hIgG)的序列来自于Acierno等人发表的Affinitymaturation increases the stability and plasticity of the Fv domain of anti-protein antibodies中Fab F10.6.6序列的可变区序列(Acierno等人.J Mol Biol.2007；374(1):130-146.)。
实施例中所使用的安罗替尼为安罗替尼(Anlotinib)的盐酸盐，商品名称
Figure BDA0002613250550000291
通用名称盐酸安罗替尼，来源于正大天晴药业集团股份有限公司。
制备例1：抗PD-1的抗体14C12及其人源化抗体14C12H1L1(hG1WT)的序列设计
抗PD-1的抗体14C12及其人源化抗体14C12H1L1(hG1WT)的重链和轻链的氨基酸序列、以及编码核酸序列分别与中国专利公开CN 106967172A(或者CN 106977602A)中的14C12、14C12H1L1完全相同。
(1)14C12的重链可变区序列和轻链可变区序列
14C12重链可变区的核酸序列：(354bp)
GAGGTCAAACTGGTGGAGAGCGGCGGCGGGCTGGTGAAGCCCGGCGGGTCACTGAAACTGAGCTGCGCCGCTTCCGGCTTCGCCTTTAGCTCCTACGACATGTCATGGGTGAGGCAGACCCCTGAGAAGCGCCTGGAATGGGTCGCTACTATCAGCGGAGGCGGGCGATACACCTACTATCCTGACTCTGTCAAAGGGAGATTCACAATTAGTCGGGATAACGCCAGAAATACTCTGTATCTGCAGATGTCTAGTCTGCGGTCCGAGGATACAGCTCTGTACTATTGTGCAAACCGGTACGGCGAAGCATGGTTTGCCTATTGGGGACAGGGCACCCTGGTGACAGTCTCTGCC(SEQ ID NO:1)
14C12重链可变区的氨基酸序列：(118aa)
EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVATISGGGRYTYYPDSVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLRSEDTALYYCANRYGEAWFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:2)
14C12轻链可变区的核酸序列：(321bp)
GACATTAAGATGACACAGTCCCCTTCCTCAATGTACGCTAGCCTGGGCGAGCGAGTGACCTTCACATGCAAAGCATCCCAGGACATCAACACATACCTGTCTTGGTTTCAGCAGAAGCCAGGCAAAAGCCCCAAGACCCTGATCTACCGGGCCAATAGACTGGTGGACGGGGTCCCCAGCAGATTCTCCGGATCTGGCAGTGGGCAGGATTACTCCCTGACCATCAGCTCCCTGGAGTATGAAGACATGGGCATCTACTATTGCCTGCAGTATGATGAGTTCCCTCTGACCTTTGGAGCAGGCACAAAACTGGAACTGAAG(SEQ ID NO:3)
14C12轻链可变区的氨基酸序列：(107aa)
DIKMTQSPSSMYASLGERVTFTCKASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:4)
(2)人源化单克隆抗体14C12H1L1(hG1WT)的重链可变区序列和轻链可变区序列、重链序列和轻链序列
14C12H1L1(hG1WT)重链可变区的核酸序列：(354bp)
GAAGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGGGGAGGGCTGGTGCAGCCCGGCGGGTCACTGCGACTGAGCTGCGCAGCTTCCGGATTCGCCTTTAGCTCCTACGACATGTCCTGGGTGCGACAGGCACCAGGAAAGGGACTGGATTGGGTCGCTACTATCTCAGGAGGCGGGAGATACACCTACTATCCTGACAGCGTCAAGGGCCGGTTCACAATCTCTAGAGATAACAGTAAGAACAATCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCTGAGGACACCGCACTGTACTATTGTGCCAACCGCTACGGGGAAGCATGGTTTGCCTATTGGGGGCAGGGAACCCTGGTGACAGTCTCTAGT(SEQ ID NO:5)
14C12H1L1(hG1WT)重链可变区的氨基酸序列：(118aa)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKGLDWVATISGGGRYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNNLYLQMNSLRAEDTALYYCANRYGEAWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:6)
14C12H1L1(hG1WT)轻链可变区的核酸序列：(321bp)
GACATTCAGATGACTCAGAGCCCCTCCTCCATGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGGGTCACCTTCACATGCCGCGCTAGTCAGGATATCAACACCTACCTGAGCTGGTTTCAGCAGAAGCCAGGGAAAAGCCCCAAGACACTGATCTACCGGGCTAATAGACTGGTGTCTGGAGTCCCAAGTCGGTTCAGTGGCTCAGGGAGCGGACAGGACTACACTCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCTGAGGACATGGCAACCTACTATTGCCTGCAGTATGATGAGTTCCCACTGACCTTTGGCGCCGGGACAAAACTGGAGCTGAAG(SEQ ID NO:7)
14C12H1L1(hG1WT)轻链可变区的氨基酸序列：(107aa)
DIQMTQSPSSMSASVGDRVTFTCRASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDMATYYCLQYDEFPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:8)
14C12H1L1(hG1WT)重链的核酸序列：(1344bp)
GAAGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGGGGAGGGCTGGTGCAGCCCGGCGGGTCACTGCGACTGAGCTGCGCAGCTTCCGGATTCGCCTTTAGCTCCTACGACATGTCCTGGGTGCGACAGGCACCAGGAAAGGGACTGGATTGGGTCGCTACTATCTCAGGAGGCGGGAGATACACCTACTATCCTGACAGCGTCAAGGGCCGGTTCACAATCTCTAGAGATAACAGTAAGAACAATCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCTGAGGACACCGCACTGTACTATTGTGCCAACCGCTACGGGGAAGCATGGTTTGCCTATTGGGGGCAGGGAACCCTGGTGACAGTCTCTAGTGCCAGCACCAAAGGACCTAGCGTGTTTCCTCTCGCCCCCTCCTCCAAAAGCACCAGCGGAGGAACCGCTGCTCTCGGATGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAACCCGTCACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTCTGACAAGCGGAGTCCATACATTCCCTGCTGTGCTGCAAAGCAGCGGACTCTATTCCCTGTCCAGCGTCGTCACAGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTCAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTGGAGCCCAAATCCTGCGACAAGACACACACCTGTCCCCCCTGTCCTGCTCCCGAACTCCTCGGAGGCCCTAGCGTCTTCCTCTTTCCTCCCAAACCCAAGGACACCCTCATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTCACCTGTGTCGTCGTGGATGTCAGCCATGAGGACCCCGAGGTGAAATTCAACTGGTATGTCGATGGCGTCGAGGTGCACAACGCCAAAACCAAGCCCAGGGAGGAACAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACAGTCCTCCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCTCTCCCTGCCCCCATTGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAAGGCCAACCCAGGGAGCCCCAGGTCTATACACTGCCTCCCTCCAGGGACGAACTCACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAGGGCTTTTATCCCAGCGACATCGCCGTCGAGTGGGAGTCCAACGGACAGCCCGAGAATAACTACAAGACCACCCCTCCTGTCCTCGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAAAGCAGGTGGCAGCAGGGAAACGTGTTCTCCTGCAGCGTGATGCACGAAGCCCTCCACAACCACTACACCCAGAAAAGCCTGTCCCTGAGCCCCGGCAAA(SEQ ID NO:9)
14C12H1L1(hG1WT)重链的氨基酸序列：(448aa)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKGLDWVATISGGGRYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNNLYLQMNSLRAEDTALYYCANRYGEAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:10)
14C12H1L1(hG1WT)轻链的核酸序列：(642bp)
GACATTCAGATGACTCAGAGCCCCTCCTCCATGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGGGTCACCTTCACATGCCGCGCTAGTCAGGATATCAACACCTACCTGAGCTGGTTTCAGCAGAAGCCAGGGAAAAGCCCCAAGACACTGATCTACCGGGCTAATAGACTGGTGTCTGGAGTCCCAAGTCGGTTCAGTGGCTCAGGGAGCGGACAGGACTACACTCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCTGAGGACATGGCAACCTACTATTGCCTGCAGTATGATGAGTTCCCACTGACCTTTGGCGCCGGGACAAAACTGGAGCTGAAGCGAACTGTGGCCGCTCCCTCCGTCTTCATTTTTCCCCCTTCTGACGAACAGCTGAAATCAGGCACAGCCAGCGTGGTCTGTCTGCTGAACAATTTCTACCCTAGAGAGGCAAAAGTGCAGTGGAAGGTCGATAACGCCCTGCAGTCCGGCAACAGCCAGGAGAGTGTGACTGAACAGGACTCAAAAGATAGCACCTATTCCCTGTCTAGTACACTGACTCTGTCCAAGGCTGATTACGAGAAGCACAAAGTGTATGCATGCGAAGTGACACATCAGGGACTGTCAAGCCCCGTGACTAAGTCTTTTAACCGGGGCGAATGT(SEQ ID NO:11)
14C12H1L1(hG1WT)轻链的氨基酸序列：(214aa)
DIQMTQSPSSMSASVGDRVTFTCRASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDMATYYCLQYDEFPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:12)
制备例2：人源化抗体14C12H1L1(hG4)的序列设计
重链可变区和轻链可变区与14C12H1L1(hG1WT)相同，另外采用Ig gamma-4chainC region，ACCESSION:P01861.1作为重链恒定区，Ig kappa chain C region，ACCESSION:P01834为轻链恒定区，进而得到了抗体14C12H1L1(hG4)。14C12H1L1(hG4)的序列如下：
14C12H1L1(hG4)重链的核酸序列：(1335bp)
GAAGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGGGGAGGGCTGGTGCAGCCCGGCGGGTCACTGCGACTGAGCTGCGCAGCTTCCGGATTCGCCTTTAGCTCCTACGACATGTCCTGGGTGCGACAGGCACCAGGAAAGGGACTGGATTGGGTCGCTACTATCTCAGGAGGCGGGAGATACACCTACTATCCTGACAGCGTCAAGGGCCGGTTCACAATCTCTAGAGATAACAGTAAGAACAATCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCTGAGGACACCGCACTGTACTATTGTGCCAACCGCTACGGGGAAGCATGGTTTGCCTATTGGGGGCAGGGAACCCTGGTGACAGTCTCTAGTGCCAGCACCAAAGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA(SEQ ID NO:13)
14C12H1L1(hG4)重链的氨基酸序列：(445aa)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKGLDWVATISGGGRYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNNLYLQMNSLRAEDTALYYCANRYGEAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQID NO:14)
14C12H1L1(hG4)轻链的核酸序列同SEQ ID NO:11。
14C12H1L1(hG4)轻链的氨基酸序列同SEQ ID NO:12。
制备例3：人源化抗体14C12H1L1(hG1TM)的序列设计
本发明人在制备例1所获得的14C12H1L1(hG1WT)的基础上，按照EU编号系统(EUnumbering system)，通过在其重链铰链区域第234号位点引进了亮氨酸到丙氨酸的点突变(L234A)，第235号位点引进了亮氨酸到丙氨酸的点突变(L235A)，第237号位点引进了甘氨酸到丙氨酸的点突变(G237A)，获得了突变的人源化14C12H1L1(hG1TM)。
14C12H1L1(hG1TM)重链的核酸序列：(1344bp)
GAAGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGGGGAGGGCTGGTGCAGCCCGGCGGGTCACTGCGACTGAGCTGCGCAGCTTCCGGATTCGCCTTTAGCTCCTACGACATGTCCTGGGTGCGACAGGCACCAGGAAAGGGACTGGATTGGGTCGCTACTATCTCAGGAGGCGGGAGATACACCTACTATCCTGACAGCGTCAAGGGCCGGTTCACAATCTCTAGAGATAACAGTAAGAACAATCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCTGAGGACACCGCACTGTACTATTGTGCCAACCGCTACGGGGAAGCATGGTTTGCCTATTGGGGGCAGGGAACCCTGGTGACAGTCTCTAGTGCCAGCACCAAAGGGCCCAGCGTGTTTCCTCTCGCCCCCTCCTCCAAAAGCACCAGCGGAGGAACCGCTGCTCTCGGATGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAACCCGTCACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTCTGACAAGCGGAGTCCATACATTCCCTGCTGTGCTGCAAAGCAGCGGACTCTATTCCCTGTCCAGCGTCGTCACAGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTCAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTGGAGCCCAAATCCTGCGACAAGACACACACCTGTCCCCCCTGTCCTGCTCCCGAAGCTGCTGGAGCCCCTAGCGTCTTCCTCTTTCCTCCCAAACCCAAGGACACCCTCATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTCACCTGTGTCGTCGTGGATGTCAGCCATGAGGACCCCGAGGTGAAATTCAACTGGTATGTCGATGGCGTCGAGGTGCACAACGCCAAAACCAAGCCCAGGGAGGAACAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACAGTCCTCCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCTCTCCCTGCCCCCATTGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAAGGCCAACCCAGGGAGCCCCAGGTCTATACACTGCCTCCCTCCAGGGACGAACTCACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAGGGCTTTTATCCCAGCGACATCGCCGTCGAGTGGGAGTCCAACGGACAGCCCGAGAATAACTACAAGACCACCCCTCCTGTCCTCGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAAAGCAGGTGGCAGCAGGGAAACGTGTTCTCCTGCAGCGTGATGCACGAAGCCCTCCACAACCACTACACCCAGAAAAGCCTGTCCCTGAGCCCCGGCAAA(SEQ ID NO:15)
14C12H1L1(hG1TM)重链的氨基酸序列：(448aa)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKGLDWVATISGGGRYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNNLYLQMNSLRAEDTALYYCANRYGEAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:16)
14C12H1L1(hG1TM)轻链的核酸序列同SEQ ID NO:11。
14C12H1L1(hG1TM)轻链的氨基酸序列同SEQ ID NO:12。
制备例4：人源化抗体14C12H1L1(hG1DM)的序列设计
本发明人在14C12H1L1(hG1WT)的基础上，通过在其重链铰链区域第234号位点引进了亮氨酸到丙氨酸的点突变(L234A)，第235号位点引进了亮氨酸到丙氨酸的点突变(L235A)，获得了突变的人源化抗体14C12H1L1(hG1DM)。
14C12H1L1(hG1DM)重链的核酸序列：(1344bp)
GAAGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGGGGAGGGCTGGTGCAGCCCGGCGGGTCACTGCGACTGAGCTGCGCAGCTTCCGGATTCGCCTTTAGCTCCTACGACATGTCCTGGGTGCGACAGGCACCAGGAAAGGGACTGGATTGGGTCGCTACTATCTCAGGAGGCGGGAGATACACCTACTATCCTGACAGCGTCAAGGGCCGGTTCACAATCTCTAGAGATAACAGTAAGAACAATCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCTGAGGACACCGCACTGTACTATTGTGCCAACCGCTACGGGGAAGCATGGTTTGCCTATTGGGGGCAGGGAACCCTGGTGACAGTCTCTAGTGCTAGCACCAAAGGGCCCAGCGTGTTTCCTCTCGCCCCCTCCTCCAAAAGCACCAGCGGAGGAACCGCTGCTCTCGGATGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAACCCGTCACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTCTGACAAGCGGAGTCCATACATTCCCTGCTGTGCTGCAAAGCAGCGGACTCTATTCCCTGTCCAGCGTCGTCACAGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTCAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTGGAGCCCAAATCCTGCGACAAGACACACACCTGTCCCCCCTGTCCTGCTCCCGAAGCTGCTGGAGGCCCTAGCGTCTTCCTCTTTCCTCCCAAACCCAAGGACACCCTCATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTCACCTGTGTCGTCGTGGATGTCAGCCATGAGGACCCCGAGGTGAAATTCAACTGGTATGTCGATGGCGTCGAGGTGCACAACGCCAAAACCAAGCCCAGGGAGGAACAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACAGTCCTCCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCTCTCCCTGCCCCCATTGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAAGGCCAACCCAGGGAGCCCCAGGTCTATACACTGCCTCCCTCCAGGGACGAACTCACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAGGGCTTTTATCCCAGCGACATCGCCGTCGAGTGGGAGTCCAACGGACAGCCCGAGAATAACTACAAGACCACCCCTCCTGTCCTCGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAAAGCAGGTGGCAGCAGGGAAACGTGTTCTCCTGCAGCGTGATGCACGAAGCCCTCCACAACCACTACACCCAGAAAAGCCTGTCCCTGAGCCCCGGCAAA(SEQ ID NO:17)
14C12H1L1(hG1DM)重链的氨基酸序列：(448aa)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKGLDWVATISGGGRYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNNLYLQMNSLRAEDTALYYCANRYGEAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:18)
14C12H1L1(hG1DM)轻链的核酸序列同SEQ ID NO:11。
14C12H1L1(hG1DM)轻链的氨基酸序列同SEQ ID NO:12。
实验例1：14C12H1L1(hG1DM)、14C12H1L1(hG4)、14C12H1L1(hG1WT)和14C12H1L1 (hG1TM)的Fc受体FcγRI亲和力检测
Fc受体FcγRI(又名CD64)可与IgG抗体的Fc端结合，参与抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。治疗性单克隆抗体与Fc受体结合的能力影响到该抗体的安全性和有效性。本实验使用Fortebio Octet分子相互作用仪检测14C12H1L1(hG1DM)、14C12H1L1(hG4)、14C12H1L1(hG1WT)和14C12H1L1(hG1TM)与FcγRI的亲和力常数，以评价各抗体的ADCC活性。
Fortebio Octet分子相互作用仪检测相应抗体与FcγRI的亲和力常数实验方法简述如下：样品稀释缓冲液为PBS，0.02％Tween-20，0.1％BSA，pH7.4的溶液。HIS1K传感器上加入浓度为1μg/mL的FcγRI(购自Sinobio)溶液，固定时间50s，以使得FcγRI固定于传感器表面。抗体与FcγRI的结合和解离参数的测定均在缓冲液中进行，抗体浓度为3.12-50nM(两倍梯度稀释)。固定有抗原的传感器在缓冲液中平衡60s后测定固定在传感器上的FcγRI与各抗体的结合，时间120s；FcγRI与抗体的解离测定时间为120s。检测温度为30℃，频率为0.3Hz。数据以1:1模型拟合分析，以得到各抗体和FcγRI的亲和力常数。
FcγRI与14C12H1L1(hG1DM)、14C12H1L1(hG4)、14C12H1L1(hG1WT)和14C12H1L1(hG1TM)以及对照抗体5C10H2L2-IgG1mt的亲和力常数测定结果如表1和图1－图5所示。
表1：14C12H1L1(hG1DM)、14C12H1L1(hG4)、14C12H1L1(hG1WT)和14C12H1L1(hG1TM)以及对照抗体5C10H2L2-IgG1mt与FcγRI结合的动力学参数
抗体 K<sub>D</sub>(M) kon(1/Ms) SE(kon) kdis(1/s) SE(kdis) Rmax(nm)
14C12H1L1(hG1DM) N/A N/A N/A N/A N/A N/A
14C12H1L1(hG4) 5.80E-09 6.37E+05 2.21E+04 3.69E-03 1.05E-04 0.45-0.54
14C12H1L1(hG1WT) 2.52E-09 6.94E+05 2.19E+04 1.75E-03 9.14E-05 0.50-0.55
14C12H1L1(hG1TM) N/A N/A N/A N/A N/A N/A
5C10H2L2-IgG1mt N/A N/A N/A N/A N/A N/A
N/A表示抗体与抗原没有结合或结合信号极低，没有对结果进行分析，故未能获得相应数据。
结果显示，14C12H1L1(hG4)和14C12H1L1(hG1WT)均可以与FcγRI结合，亲和力常数分别为5.80E-09M和2.52E-09M。14C12H1L1(hG1TM)及5C10H2L2-IgG1mt由于与FcγRI没有结合或结合信号极低，没有对结果进行分析，故而未能获得相应数据。
结果表明，相对于14C12H1L1(hG4)和14C12H1L1(hG1WT)，14C12H1L1(hG1DM)、14C12H1L1(hG1TM)与FcγRI的结合活性被有效地消除。
实验例2：14C12H1L1(hG1DM)、14C12H1L1(hG4)、14C12H1L1(hG1WT)和14C12H1L1 (hG1TM)与Fc受体FcγRIIIa及其亚型的亲和力测定
(1)FcγRIIIa_V158与14C12H1L1(hG1DM)、14C12H1L1(hG4)、14C12H1L1(hG1WT)和 14C12H1L1(hG1TM)的亲和力常数测定
Fc受体FcγRIIIa_V158(又名CD16a_V158)，可与IgG抗体的Fc端结合，介导ADCC效应。实验中使用Fortebio Octet分子相互作用仪检测14C12H1L1(hG1DM)、14C12H1L1(hG4)、14C12H1L1(hG1WT)和14C12H1L1(hG1TM)与FcγRIIIa_V158的亲和力常数，以评价各抗体的ADCC活性。
Fortebio Octet分子相互作用仪检测相应抗体以及对照抗体5C10H2L2-IgG1mt与FcγRIIIa_V158的亲和力常数实验方法简述如下：样品稀释缓冲液为PBS，0.02％Tween-20，0.1％BSA，pH7.4。5μg/mL的FcγRIIIa_V158固定在HIS1K传感器上，时间120s，传感器在缓冲液中平衡60s，固定在传感器上的FcγRIIIa_V158与各抗体结合，抗体浓度为31.25-500nM(两倍稀释)，时间60s，抗体在缓冲液中解离，时间60s。传感器使用10mM甘氨酸，pH1.5再生，时间5s，重复4次。检测温度为30℃，频率为0.3Hz。数据以1:1模型拟合分析，得到亲和力常数。
FcγRIIIa_V158与14C12H1L1(hG1DM)、14C12H1L1(hG4)、14C12H1L1(hG1WT)和14C12H1L1(hG1TM)以及对照抗体5C10H2L2-IgG1mt的亲和力常数测定结果如表2和图6－图10所示。
表2：14C12H1L1(hG1DM)、14C12H1L1(hG4)、14C12H1L1(hG1WT)和14C12H1L1(hG1TM)以及对照抗体5C10H2L2-IgG1mt与FcγRIIIa_V158结合的动力学参数
Figure BDA0002613250550000421
Figure BDA0002613250550000431
N/A表示抗体与抗原没有结合或结合信号极低，没有对结果进行分析，故未能获得相应数据。
结果显示，14C12H1L1(hG1DM)和14C12H1L1(hG1WT)均可以与FcγRIIIa_V158结合，亲和力常数分别为6.21E-07M和6.54E-08M；而14C12H1L1(hG4)、14C12H1L1(hG1TM)及5C10H2L2-IgG1mt由于与FcγRIIIa_V158没有结合或结合信号极低，没有对结果进行分析。
结果表明，相对于14C12H1L1(hG1DM)和14C12H1L1(hG1WT)，14C12H1L1(hG4)、14C12H1L1(hG1TM)以及对照抗体5C10H2L2-IgG1mt与FcγR IIIa_V158的结合活性被有效地消除。
(2)FcγRIIIa_F158与14C12H1L1(hG1DM)、14C12H1L1(hG4)、14C12H1L1(hG1WT)和 14C12H1L1(hG1TM)的亲和力常数测定
Fc受体FcγRIIIa_F158(又名CD16a_F158)可与IgG抗体的Fc端结合，介导ADCC。本实验使用Fortebio Octet分子相互作用仪检测14C12H1L1(hG1DM)、14C12H1L1(hG4)、14C12H1L1(hG1WT)和14C12H1L1(hG1TM)和对照抗体与FcγRIIIa_F158的亲和力常数，以评价各抗体的ADCC活性。
Fortebio Octet分子相互作用仪检测14C12H1L1(hG1DM)、14C12H1L1(hG4)、14C12H1L1(hG1WT)和14C12H1L1(hG1TM)与FcγRIIIa_F158的亲和力常数实验方法简述如下：样品稀释缓冲液为PBS，0.02％Tween-20，0.1％BSA，pH7.4。5μg/mL的FcγRIIIa_F158固定在HIS1K传感器上，时间120s，传感器在缓冲液中平衡60s，固定在传感器上的FcγRIIIa_F158与各抗体结合，抗体浓度为31.25-500nM(两倍稀释)，时间60s，抗体在缓冲液中解离，时间60s。传感器使用10mM甘氨酸，pH1.5再生，时间5s，重复4次。检测温度为30℃，频率为0.3Hz。数据以1:1模型拟合分析，得到亲和力常数。
FcγRIIIa_F158与14C12H1L1(hG1DM)、14C12H1L1(hG4)、14C12H1L1(hG1WT)和14C12H1L1(hG1TM)以及对照抗体5C10H2L2-IgG1mt的亲和力常数测定结果如表3和图11－图15所示。
表3：14C12H1L1抗体及其亚型与FcγRIIIa_F158结合的动力学参数
抗体 K<sub>D</sub>(M) kon(1/Ms) SE(kon) kdis(1/s) SE(kdis) Rmax(nm)
14C12H1L1(hG1DM) N/A N/A N/A N/A N/A N/A
14C12H1L1(hG4) N/A N/A N/A N/A N/A N/A
14C12H1L1(hG1WT) 1.02E-07 2.52E+05 2.93E+04 2.56E-02 1.12E-03 0.34-0.57
14C12H1L1(hG1TM) N/A N/A N/A N/A N/A N/A
5C10H2L2-IgG1mt N/A N/A N/A N/A N/A N/A
N/A表示抗体与抗原没有结合或结合信号极低，没有对结果进行分析，故未能获得相应数据。
结果显示，14C12H1L1(hG1WT)可以与FcγRIIIa_F158结合，亲和力常数为1.02E-07M；而14C12H1L1(hG1DM)、14C12H1L1(hG4)和14C12H1L1(hG1TM)及5C10H2L2-IgG1mt由于与FcγRIIIa_F158没有结合或结合信号极低，没有对结果进行分析，故而未能获得相应数据。
结果表明，相对于14C12H1L1(hG1WT)，14C12H1L1(hG1DM)、14C12H1L1(hG4)、14C12H1L1(hG1TM)与FcγRIIIa_F1581的结合活性被有效地消除。
实验例3：14C12H1L1(hG1DM)、14C12H1L1(hG4)、14C12H1L1(hG1WT)和14C12H1L1 (hG1TM)与Fc受体FcγRIIa及其亚型的亲和力测定
(1)FcγRIIa_H131与14C12H1L1(hG1DM)、14C12H1L1(hG4)、14C12H1L1(hG1WT)和 14C12H1L1(hG1TM)的亲和力常数测定
Fc受体FcγRIIa_H131(又名CD32a_H131)可与IgG抗体的Fc端结合，参与抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。治疗性单克隆抗体与Fc受体结合的能力影响到该抗体的安全性和有效性。本实验使用Fortebio Octet分子相互作用仪检测14C12H1L1(hG1DM)、14C12H1L1(hG4)、14C12H1L1(hG1WT)和14C12H1L1(hG1TM)与FcγRIIa_H131的亲和力常数，以评价各待测抗体与Fc受体的结合能力。
Fortebio Octet分子相互作用仪检测14C12H1L1(hG1DM)、14C12H1L1(hG4)、14C12H1L1(hG1WT)和14C12H1L1(hG1TM)与FcγRIIa_H131的亲和力常数实验方法简述如下：固化物稀释液为PBS，0.02％Tween-20，0.1％BSA，pH7.4，分析物稀释缓冲液为PBS，0.02％Tween-20，0.02％casein，0.1％BSA，pH7.4。5μg/mL的FcγRIIa_H131固定在NTA传感器上，固定高度约为1.0nm，传感器在PBS，0.02％Tween-20，0.02％casein，0.1％BSA，pH7.4缓冲液中平衡300s以封闭传感器，固定在传感器上的FcγRIIa_H131与抗体结合，抗体浓度为12.5nM-200nM(两倍梯度稀释)，时间60s，抗体在缓冲液中解离，时间60s。传感器使用10mM Glycine，pH1.7和10mM硫酸镍再生。检测温度为30℃，频率为0.6Hz。数据以1:1模型拟合分析，得到亲和力常数。
FcγRIIa_H131与14C12H1L1(hG1DM)、14C12H1L1(hG4)、14C12H1L1(hG1WT)和14C12H1L1(hG1TM)以及对照抗体5C10H2L2-IgG1mt的亲和力常数测定结果如表4和图16－图20所示。
表4：14C12H1L1抗体及其亚型与FcγRIIa_H131结合的动力学参数
Figure BDA0002613250550000451
Figure BDA0002613250550000461
N/A表示抗体与抗原没有结合或结合信号极低，没有对结果进行分析，故未能获得相应数据。
结果显示，14C12H1L1(hG4)和14C12H1L1(hG1WT)均可以与FcγRIIa_H131结合，亲和力常数分别为5.07E-08M和5.74E-08M；而14C12H1L1(hG1DM)、14C12H1L1(hG1TM)及5C10H2L2-IgG1mt由于与FcγRIIa_H131没有结合或结合信号极低，没有对结果进行分析，故而未能获得相应数据。
结果表明，相对于14C12H1L1(hG4)和14C12H1L1(hG1WT)，14C12H1L1(hG1DM)、14C12H1L1(hG1TM)与FcγRIIa_H131的结合活性被有效地消除。
(2)FcγRIIa_R131与14C12H1L1(hG1DM)、14C12H1L1(hG4)、14C12H1L1(hG1WT)和 14C12H1L1(hG1TM)的亲和力常数测定
Fc受体FcγRIIa_R131(又名CD32a_R131)可与IgG抗体的Fc端结合，参与抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。治疗性单克隆抗体与Fc受体结合的能力影响到该抗体的安全性和有效性。本实验使用Fortebio Octet分子相互作用仪检测14C12H1L1(hG1DM)，14C12H1L1(hG4)，14C12H1L1(hG1WT)，和14C12H1L1(hG1TM)与FcγRIIa_R131的亲和力常数，以评价各待测抗体与Fc受体的结合能力。
Fortebio Octet分子相互作用仪检测14C12H1L1(hG1DM)，14C12H1L1(hG4)，14C12H1L1(hG1WT)，和14C12H1L1(hG1TM)与FcγRIIa_R131的亲和力常数实验方法简述如下：固化物稀释液为PBS，0.02％Tween-20，0.1％BSA，pH7.4，分析物稀释缓冲液为PBS，0.02％Tween-20，0.02％casein，0.1％BSA，pH7.4。5μg/mL的FcγRIIa_R131固定在NTA传感器上，固定高度约为1.0nm，传感器在PBS，0.02％Tween-20，0.02％casein，0.1％BSA，pH7.4缓冲液中平衡300s以封闭传感器，固定在传感器上的FcγRIIa_R131与抗体结合，抗体浓度为12.5-200nM(两倍梯度稀释)，时间60s，抗体在缓冲液中解离，时间60s。传感器使用10mMGlycine，pH1.7和10mM硫酸镍再生。检测温度为30℃，频率为0.6Hz。数据以1:1模型拟合分析，得到亲和力常数。
FcγRIIa_R131与14C12H1L1(hG1DM)、14C12H1L1(hG4)、14C12H1L1(hG1WT)和14C12H1L1(hG1TM)以及对照抗体5C10H2L2-IgG1mt的亲和力常数测定结果如表5和图21－图25所示。
表5:14C12H1L1抗体及其亚型与FcγRIIa_R131结合的动力学参数
抗体 K<sub>D</sub>(M) kon(1/Ms) SE(kon) kdis(1/s) SE(kdis) Rmax(nm)
14C12H1L1(hG1DM) N/A N/A N/A N/A N/A N/A
14C12H1L1(hG4) 3.13E-08 3.50E+05 3.05E+04 1.10E-02 6.43E-04 0.21-0.46
14C12H1L1(hG1WT) 3.46E-08 6.60E+05 9.46E+04 2.28E-02 1.33E-03 0.39-0.83
14C12H1L1(hG1TM) 2.32E-07 4.04E+05 9.45E+04 9.38E-02 4.89E-03 0.19-0.35
5C10H2L2-IgG1mt N/A N/A N/A N/A N/A N/A
N/A表示抗体与抗原没有结合或结合信号极低，没有对结果进行分析，故未能获得相应数据。
结果显示，14C12H1L1(hG4)、14C12H1L1(hG1WT)和14C12H1L1(hG1TM)均可以与FcγRIIa_R131结合，亲和力常数分别为3.13E-08M，3.46E-08M和2.32E-07M；14C12H1L1(hG1DM)、5C10H2L2-IgG1mt由于与FcγRIIa_R131没有结合或结合信号极低，没有对结果进行分析，故而未能获得相应数据。
结果表明，相对于14C12H1L1(hG4)和14C12H1L1(hG1WT)，在有结合活性的抗体中14C12H1L1(hG1TM)结合力最弱，与FcγRIIa_R131的结合活性最小。
实验例4：FcγRIIb与14C12H1L1(hG1DM)，14C12H1L1(hG4)，14C12H1L1(hG1WT)，和 14C12H1L1(hG1TM)的亲和力常数测定
Fc受体FcγRIIb(又名CD32b)可与IgG抗体的Fc端结合，负性调控免疫细胞的功能，抑制免疫细胞的激活、增殖，抑制细胞因子的分泌等。本实验使用Fortebio Octet分子相互作用仪检测各待测抗体与FcγRIIb的亲和力常数，以评价14C12H1L1(hG1DM)、14C12H1L1(hG4)、14C12H1L1(hG1WT)和14C12H1L1(hG1TM)与Fc受体的结合能力。
Fortebio Octet分子相互作用仪检测14C12H1L1(hG1DM)、14C12H1L1(hG4)、14C12H1L1(hG1WT)和14C12H1L1(hG1TM)与FcγRIIb的亲和力常数实验方法简述如下：固化物稀释液为PBS，0.02％Tween-20，0.1％BSA，pH7.4，分析物稀释缓冲液为PBS，0.02％Tween-20，0.02％casein，0.1％BSA，pH7.4。5μg/mL的hFcγRIIb-his固定在NTA传感器上，固定高度约为1.0nm，传感器在PBS，0.02％Tween-20，0.02％casein，0.1％BSA，pH7.4缓冲液中平衡300s以封闭传感器，固定在传感器上的hFcγRIIb-his与抗体结合，抗体浓度为12.5nM-200nM(两倍梯度稀释)，时间60s，抗体在缓冲液中解离，时间60s。传感器使用10mMGlycine，pH1.7和10mM硫酸镍再生。检测温度为30℃，频率为0.6Hz。数据以1:1模型拟合分析，得到亲和力常数。
FcγRIIb与14C12H1L1(hG1DM)、14C12H1L1(hG4)、14C12H1L1(hG1WT)和14C12H1L1(hG1TM)以及对照抗体5C10H2L2-IgG1mt的亲和力常数测定结果如表6和图26－图30所示。
表6：14C12H1L1抗体及其亚型与FcγRIIb结合的动力学参数
Figure BDA0002613250550000481
Figure BDA0002613250550000491
N/A表示抗体与抗原没有结合或结合信号极低，没有对结果进行分析，故未能获得相应数据。
结果显示，14C12H1L1(hG4)和14C12H1L1(hG1WT)均可以与FcγRIIb结合，亲和力常数分别为5.62E-08M和6.13E-08M；而14C12H1L1(hG1DM)、14C12H1L1(hG1TM)及5C10H2L2-IgG1mt由于与FcγRIIb没有结合或结合信号极低，没有对结果进行分析，故而未能获得相应数据。
结果表明，相对于14C12H1L1(hG4)和14C12H1L1(hG1WT)，14C12H1L1(hG1DM)和14C12H1L1(hG1TM)与FcγRIIb的结合活性被有效地消除。
实验例5：C1q与14C12H1L1(hG1DM)，14C12H1L1(hG4)，14C12H1L1(hG1WT)，和 14C12H1L1(hG1TM)的亲和力测定
血清补体C1q可与IgG抗体的Fc端结合，介导CDC效应，治疗性单克隆抗体与C1q结合的能力影响到该抗体的安全性和有效性。本实验使用Fortebio Octet分子相互作用仪检测14C12H1L1(hG1DM)、14C12H1L1(hG4)、14C12H1L1(hG1WT)和14C12H1L1(hG1TM)与C1q的亲和力常数，以评价这些抗体的CDC活性。
Fortebio Octet分子相互作用仪检测相应抗体与C1q的亲和力常数实验方法简述如下：样品稀释缓冲液为PBS，0.02％Tween-20，0.1％BSA，pH7.4。50μg/mL的抗体固定在FAB2G传感器上，固定高度约为2.0nm，传感器在缓冲液中平衡60s，固定在传感器上的抗体与抗原C1q结合，抗原浓度为1.25nM-20nM(两倍梯度稀释)，时间60s，抗原抗体在缓冲液中解离，时间60s。传感器使用10mM甘氨酸，pH1.7再生，时间5s，重复4次。样品板震动速率为1000rpm，检测温度为30℃，检测频率为0.6Hz。数据以1:1模型拟合分析，得到亲和力常数。数据采集软件为Fortebio Data Acquisition 7.0，数据分析软件为Fortebio DataAnalysis 7.0。
C1q与14C12H1L1(hG1DM)、14C12H1L1(hG4)、14C12H1L1(hG1WT)和14C12H1L1(hG1TM)以及对照5C10H2L2-IgG1mt的亲和力常数测定结果如表7和图31－图35所示。
表7：14C12H1L1抗体及其亚型与C1q结合的动力学参数
Figure BDA0002613250550000501
N/A表示抗体与抗原没有结合或结合信号极低，没有对结果进行分析，故未能获得相应数据。
结果显示，14C12H1L1(hG1WT)可以与C1q结合，亲和力常数为1.35E-09M；而14C12H1L1(hG1DM)、14C12H1L1(hG4)、14C12H1L1(hG1TM)由于与C1q没有结合或结合信号极低，没有对结果进行分析，故而未能获得相应数据。
结果还显示，5C10H2L2-IgG1mt可以与C1q结合，亲和力常数为4.43E-09，表明其具有与C1q的结合活性，可引起CDC效应。
实验例6：外周血单核细胞与Raji-PDL1细胞混合培养体系中检测14C12H1L1 (hG1WT)和14C12H1L1(hG1TM)的药效学活性
本实验中通过外周血单核细胞与Raji-PDL1细胞共培养体系检测抗PD-1抗体14C12H1L1(hG1WT)和14C12H1L1(hG1TM)，以及对照抗体抗PD-L1抗体5C10H2L2-IgG1mt和Nivolumab解除PD-1/PD-L1所介导的免疫抑制的药效学活性。
在混合淋巴反应中，分离的外周血单核细胞(含有表达免疫活性PD-1的免疫细胞)与表达PD-L1的Raji-PDL1细胞共同培养时，PD-1与PD-L1相互作用可介导免疫细胞的功能抑制，表现为细胞因子IFN-γ和IL-2的分泌降低；而抗PD-1或PD-L1抗体可解除免疫细胞的免疫抑制，引起细胞因子分泌的增加。Raji细胞为B细胞系细胞，如前述，B细胞可作为抗原提呈细胞，介导免疫细胞对肿瘤细胞的免疫反应；在本发明中，Raji-PDL1、PBMCs共培养体系用于评价抗PD-1抗体的药理学活性，并在Raji-PDL1、PBMCs及肿瘤细胞共培养体系中评价PD-1抗体在不同类别肿瘤中的药理学活性。
采用Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare Cat No.:171440-02)方法分离外周血单核细胞，将分离得到的外周血单核细胞用SEB(0.5μg/mL)刺激两天后，在96孔板中加入刺激成熟的外周血单核细胞(1*105cells/孔)和使用MMC(Mito-mycin C处理浓度2μg/mL)处理1小时的Raji-PDL1细胞(1*105cells/孔),加入14C12H1L1(hG1WT)或14C12H1L1(hG1TM)或对照抗体Nivolumab或对照抗体抗PD-L1抗体5C10H2L2-IgG1mt混合均匀共培养。3天后，收集细胞上清，采用ELISA试剂盒(购自达科为公司)检测IFN-γ的分泌量和IL-2的分泌量。
混合淋巴反应中IFN-γ分泌结果如图36所示。结果显示，在PBMC与Raji-PDL1混合培养体系中，在同等剂量水平下，14C12H1L1(hG1TM)所诱导的IFN-γ分泌量显著高于14C12H1L1(hG1WT)、Nivolumab或者5C10H2L2-IgG1mt。
混合淋巴反应中IL-2分泌结果如图37所示。结果显示，在PBMC与Raji-PDL1混合培养体系中，在同等剂量水平下，14C12H1L1(hG1TM)所诱导的IL-2分泌量显著高于14C12H1L1(hG1WT)、Nivolumab或者5C10H2L2-IgG1mt。
结果表明，14C12H1L1(hG1TM)解除PD-1/PD-L1所介导的免疫抑制的药效学活性显著优于Nivolumab、14C12H1L1(hG1WT)或者5C10H2L2-IgG1mt。
实验例7：Nivolumab、14C12H1L1(hG1WT)及14C12H1L1(hG1TM)对CHO-K1-PD1的抗 体介导的细胞吞噬的活性
为检测抗体介导的细胞吞噬(antibody dependent cellular phagoxytosis,ADCP)活性，以鼠源巨噬细胞为效应细胞，过表达PD1的细胞系为靶细胞，检测其介导ADCP效应。首先在无菌条件下取Blab/c小鼠(购自广东省医学实验动物中心)股骨骨髓，并经红细胞裂解液冰上裂解5min，用DMEM完全培养基(含10％FBS)终止裂解，1000rpm离心洗涤2次。将细胞团用10mL DMEM完全培养基重悬，并添加M-CSF至工作浓度为100ng/mL，于37℃、5％CO2的细胞培养箱诱导培养7天，其中于第3和第5天半量换液并补充M-CSF。细胞于第7天诱导完成，经0.05％胰酶消化，收集巨噬细胞，750xg离心5min，弃上清用DMEM完全培养基(含10％FBS)悬浮并计数，调整细胞密度并分装至灭菌EP管中，备用；
CHO-K1-PD1细胞(基于CHO-K1细胞过表达PD1的细胞系)，170*g离心5min，用PBS洗涤1次并重悬计数及活率。羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(carboxyfluoresceindiacetate succinimidyl ester，CFSE)用PBS稀释至2.5μM，取适量稀释后的CFSE重悬细胞(染色密度：1000万细胞/mL)，细胞培养箱内孵育20min；加入6mL的DMEM完全培养基终止染色，170*g离心5min，弃上清；加入1mL DMEM完全培养基，放置培养箱孵育10min；并调整至实验密度，细胞命名为CHO-K-PD1-CFSE。
待测抗体用DMEM完全培养基稀释至20、2、0.2μg/mL(工作浓度10、1、0.1μg/mL)，同时设anti HEL IgG1和培养基分别作为同型对照组(anti-HEL抗体)和空白对照组；按实验设计将稀释后的抗体和CHO-K1-PD1-CFSE细胞加至相应已含巨噬细胞的1.5mL的EP管中，(终体积100μL，效应细胞与靶细胞比例为5万比15万)，重悬混匀，放置37℃培养箱孵育2h；每管加800μL室温含1％牛血清白蛋白(Bull Serum Albumin，BSA)的PBS溶液，500xg离心5min，弃上清；用800μL的1％PBSA洗涤一次；APC anti-mouse/human CD11b antibody(Biolegend，货号：101212)用PBSA 400倍稀释并按100μL/样本加至相应样本中，混匀，冰上孵育40min，每个样本用800μL 1％PBSA，1200xg离心5min离心洗涤2次，弃上清。每管加200μL 1％PBSA重悬细胞，转移至流式上样管并用BD FACS Calibur流式仪检测分析。上机体系中巨噬细胞为APC+阳性，发生吞噬作用的巨噬细胞则为APC和CFSE双阳性。以双阳性细胞数与APC阳性细胞数比例作为吞噬率，并以此评价抗体介导的ADCP活性。按如下公式计算各组ADCP活性，以P％表示：
Figure BDA0002613250550000531
结果如图38所示。
结果显示，同浓度时14C12H1L1(hG1WT)和Nivolumab的吞噬率分别是同型对照抗体组anti-HEL抗体的3.94和4.26倍，说明14C12H1L1(hG1WT)和Nivolumab具有ADCP效应；同浓度时14C12H1L1(hG1TM)的吞噬率与同型对照抗体组相当，说明14C12H1L1(hG1TM)不具有ADCP效应。
结果表明，14C12H1L1(hG1TM)所引入的氨基酸突变能够有效地消除其ADCP效应，获得了意料不到的技术效果。
实验例8:14C12H1L1(hG1TM)+盐酸安罗替尼在Scid/beige免疫缺陷小鼠人非小细 胞肺癌HCC827细胞皮下移植模型中的药效学评价Scid/beige免疫缺陷小鼠(购自北京维通利华)，每组8只，雌性。0.2μg/ml金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)加入到100万/ml的PBMC悬液中培养3天进行PBMC活化，以提高PBMC细胞上PD1的表达。小鼠在第0天皮下接种经过SEB活化的PBMC细胞80万与600万HCC827人非小细胞肺癌细胞(购自广州吉尼欧生物)混合物，分为2个组同型对照抗体组(即anti-HEL抗体，由中山康方生物医药有限公司制备，制备方法见前述)和14C12H1L1(hG1TM)+盐酸安罗替尼组，给药方式是14C12H1L1(hG1TM)尾静脉给药，一周一次(首次给药与细胞混合皮下给药)，安罗替尼是灌胃，每天一次，连续30天，具体实验方案见表8。实验中持续测量肿瘤，并按照a(肿瘤长)*b(肿瘤宽)*b(肿瘤宽)/2的公式计算体积。
表8：实验计划和分组
Figure BDA0002613250550000541
实验结果如图39所示。
结果显示，14C12H1L1(hG1TM)+盐酸安罗替尼针对人非小细胞肺癌肿瘤细胞能够显著地抑制肿瘤体积的增长，具有良好的肿瘤杀伤效果。
实验例9：14C12H1L1(hG1TM)在C57BL/6-hPD1/hPDL1/hCD73小鼠结肠癌MC38- hPDL1/hCD73皮下移植模型中的药效学评价
小鼠MC38细胞系为小鼠直结肠癌细胞系，已被证实是MC38细胞系是研究人类MSI-high/dMMR肿瘤的有效模型(Efremova M等人.Nat Commun.2018；9(1):32.)。
雌性C57BL/6-hPD1/hPDL1/hCD73小鼠(购自南京集萃药康生物科技有限公司)，每组8只，每只小鼠右前肢皮下接种结肠癌MC38-hPDL1/hCD73细胞(购自南京集萃药康生物科技有限公司)(2*106cells/100μL/只)。接种当天定义为D0天。按体重调整给药体积:10μL/g*小鼠体重(g)。anti-HEL抗体作为对照抗体(制备方法和来源同实验例8)或者14C12H1L1(hG1TM)均为腹腔给药；每周给药2次，给药3周，共计6次。具体实验方案见表9。实验中持续测量肿瘤，并按照：肿瘤体积(mm3)＝(肿瘤长*(肿瘤宽)2)/2的公式计算体积。
表9：实验方案及分组
Figure BDA0002613250550000551
实验结果如图40所示.
结果显示，相对于同型对照抗体，14C12H1L1(hG1TM)显著地抑制了MC38细胞的增殖，表现为肿瘤体积的增长受到抑制，能够有效地治疗MSI-H/dMMR表型的实体瘤，如结肠癌和/或直肠癌。
实验例10：14C12H1L1(hG1TM)有效增强免疫细胞对人胃癌细胞KATO III细胞的免 疫反应
按照分离液Ficoll-PaqueTM Plus试剂说明书分离健康人外周血PBMC，分离后的PBMC计数，冻存。Raji-PDL1细胞用RPMI1640+10％FBS完全培养基常规培养，KATO III细胞(购自中国科学院上海细胞库)用DMEM+10％FBS完全培养基常规培养。复苏PBMC，0.5μg/mLSEB活化两天。实验当天，Raji-PDL1细胞用2μg/mL MMC处理1小时。收集SEB活化两天的PBMC和MMC处理后的Raji-PDL1细胞，PBS洗涤两次，RPMI 1640+10％FBS完全培养基重悬计数，Raji-PDL1和PBMC均是1*105个细胞/孔接种于96孔板；收集对数生长期KATO III细胞，KATOIII细胞是5*104个细胞/孔接种于96孔板；按实验设计加入稀释好抗体，混匀置于37℃，5％CO2培养箱共培养3天。3天后，收集细胞培养上清，按ELISA KIT说明书进行IL-2检测。实验培养基均是10％FBS+RPMI 1640。
实验结果如图41所示。
结果显示，当14C12H1L1(hG1TM)与人胃癌细胞KATO III细胞混合培养时，与14C12H1L1(hG1WT)或Nivolumab相比，展示出更高的药理学活性，即等浓度水平下可以刺激PBMCs分泌更多的IL-2，表明14C12H1L1(hG1TM)具有治疗胃癌的潜力。
实验例11：14C12H1L1(hG1TM)有效增强免疫细胞对鼻咽癌肿瘤细胞CNE-2Z的免疫 反应
复苏Raji-PDL1，CNE-2Z细胞(来源于广州吉妮欧生物科技有限公司)以及PBMC，PBMC复苏2小时后用SEB(0.5ug/ml)刺激两天。实验当天Raji-PDL1细胞用MMC(Mito-mycinC处理浓度2μg/mL，细胞处理密度200*104/mL)处理1小时。收集PBMC以及处理后的Raji-PDL1细胞用PBS洗两次，PBMC、Raji-PDL1各10*104/孔，在PBMC、Raji-PDL1各10*104/孔基础上再加上CNE-2Z细胞3*104/孔。按实验设计加入抗体(抗体终浓度300nM，终体积200μL)，共培养3天；收集细胞上清，进行IL-2检测。实验培养基均是10％FBS+RPMI 1640。
结果如图42所示。
结果显示，当14C12H1L1(hG1TM)与人鼻咽癌细胞CNE-2Z混合培养时，与14C12H1L1(hG1WT)相比，展示出更高的药理学活性，即等浓度水平下可以刺激PBMCs分泌更多的IL-2，表明14C12H1L1(hG1TM)具有治疗鼻咽癌的潜力。
实验例12：：14C12H1L1(hG1TM)有效增强免疫细胞对间皮瘤肿瘤细胞NCI-H2452的 免疫反应
复苏Raji-PDL1，NCI-H2452细胞(来源于中国科学院上海生命科学研究院)以及PBMC，PBMC复苏2小时后用SEB(0.5ug/ml)刺激两天。实验当天Raji-PDL1细胞用MMC(Mito-mycin C处理浓度2μg/mL，细胞处理密度200*104/mL)处理1小时。收集PBMC以及处理后的Raji-PDL1细胞用PBS洗两次，PBMC、Raji-PDL1各10*104/孔，在PBMC、Raji-PDL1各10*104/孔基础上再加上NCI-H2452细胞3*104/孔。按实验设计加入抗体(抗体终浓度300nM，终体积200μL)，共培养3天；收集细胞上清，进行IL-2检测。实验培养基均是10％FBS+RPMI 1640。
结果如图43所示。
结果显示，当14C12H1L1(hG1TM)与人间皮瘤细胞NCI-H2452混合培养时，与14C12H1L1(hG1WT)相比，展示出更高的药理学活性，即等浓度水平下可以刺激PBMC分泌更多的IL-2，表明14C12H1L1(hG1TM)具有治疗间皮瘤的潜力。
实验例12：14C12H1L1(hG1TM)有效增强免疫细胞对人小细胞肺癌细胞NCI-H446细 胞的免疫反应
按照分离液Ficoll-PaqueTM Plus试剂说明书分离健康人外周血PBMC，分离后的PBMC计数，冻存。Raji-PDL1，NCI-H446细胞(来源于中国科学院上海生命科学研究院)用RPMI 1640+10％FBS完全培养基常规培养。复苏PBMC，0.5μg/mL SEB活化两天。实验当天，Raji-PDL1细胞用2μg/mL MMC处理1小时。收集SEB活化两天的PBMC和MMC处理后的Raji-PDL1细胞，PBS洗涤两次，RPMI 1640+10％FBS完全培养基重悬计数，Raji-PDL1和PBMC均是1*105个细胞/孔接种于96孔板；收集对数生长期NCI-H446细胞，NCI-H446细胞是8*104个细胞/孔接种于96孔板；按实验设计加入稀释好抗体，混匀置于37℃，5％CO2培养箱共培养3天。3天后，收集细胞培养上清，按ELISA KIT说明书进行IL-2检测。实验培养基均是10％FBS+RPMI 1640。
结果如图44所示。
结果显示，当14C12H1L1(hG1TM)与人小细胞肺癌细胞NCI-H446细胞混合培养时，与14C12H1L1(hG1WT)和nivolumab相比，14C12H1L1(hG1TM)在有效的消除了ADCC、CDC及ADCP活性的基础上，展示出相等或者更高的药理学活性，即等浓度水平下可以刺激PBMC分泌相等或更多的IL-2，表明14C12H1L1(hG1TM)具有治疗人小细胞肺癌的潜力。
实验例13：14C12H1L1(hG1TM)联合盐酸安罗替尼有效增强免疫细胞对人鼻咽癌肿 瘤细胞CNE-2Z细胞的免疫反应
按照分离液Ficoll-PaqueTM Plus试剂说明书分离健康人外周血PBMC，分离后的PBMC计数，冻存。Raji-PDL1，CNE-2Z细胞(来源于广州吉妮欧生物科技有限公司)用RPMI1640+10％FBS完全培养基常规培养。复苏PBMC，0.5μg/mL SEB活化两天。实验当天，Raji-PDL1细胞用2μg/mL MMC处理1小时。收集SEB活化两天的PBMC和MMC处理后的Raji-PDL1细胞，PBS洗涤两次，RPMI1640+10％FBS完全培养基重悬计数，Raji-PDL1和PBMC均是1*105个细胞/孔接种于96孔板。收集对数生长期CNE-2Z细胞，CNE-2Z细胞是3*104个细胞/孔接种于96孔板。按实验设计加入稀释好抗体和安罗替尼，混匀置于37℃，5％CO2培养箱共培养3天。3天后，收集细胞培养上清，按ELISA KIT说明书进行IL-2检测。实验培养基均是10％FBS+RPMI 1640。
结果如图45所示。相较于anti-HEL抗体和安罗替尼单药，14C12H1L1(hG1TM)、14C12H1L1(hG1WT)和nivolumab均显著地增强了免疫细胞对人鼻咽癌肿瘤细胞CNE-2Z细胞的免疫反应，表现为IL-2的分泌水平显著增加，14C12H1L1(hG1TM)的药理学活性优于14C12H1L1(hG1WT)和nivolumab。
并且，14C12H1L1(hG1TM)联合安罗替尼的刺激免疫细胞激活的药理学活性优于14C12H1L1(hG1TM)单药、14C12H1L1(hG1WT)单药和nivolumab单药；还优于14C12H1L1(hG1WT)联合安罗替尼和nivolumab联合安罗替尼。
以上结果显示，14C12H1L1(hG1TM)联合安罗替尼具有治疗人鼻咽癌的潜力。
实验例14：14C12H1L1(hG1TM)联合安罗替尼显著增强免疫细胞对MSI-h/dMMR肿瘤 系细胞系SW48细胞的免疫反应
SW48细胞为人直结肠癌细胞系，被鉴定具有为MSI-h/dMMR表性的细胞(Branch P等人(1995).Cancer Res 55(11):2304–2309.)，被用于检测14C12H1L1(hG1TM)增强免疫细胞对MSI-h/dMMR表型的肿瘤的免疫反应。
按照分离液Ficoll-PaqueTM Plus试剂说明书分离健康人外周血PBMC，分离后的PBMC计数，冻存。Raji-PDL1细胞用RPMI 164010％FBS完全培养基常规培养，SW48细胞(来源于广州吉妮欧生物科技有限公司)用DMEM+10％FBS完全培养基常规培养。复苏PBMC，0.5μg/mL SEB活化两天。实验当天，Raji-PDL1细胞用2μg/mL MMC处理1小时。收集SEB活化两天的PBMC和MMC处理后的Raji-PDL1细胞，PBS洗涤两次，RPMI 1640+10％FBS完全培养基重悬计数，Raji-PDL1和PBMC均是1*105个细胞/孔接种于96孔板；收集对数生长期SW48细胞，SW48细胞是2*105个细胞/孔接种于96孔板；按实验设计加入稀释好抗体和安罗替尼，混匀置于37℃，5％CO2培养箱共培养3天。3天后，收集细胞培养上清，按ELISA KIT说明书进行IL-2检测。实验培养基均是10％FBS+RPMI 1640。
结果如图46所示。
结果显示，相较于anti-HEL抗体，14C12H1L1(hG1TM)、14C12H1L1(hG1WT)和nivolumab均显著地增强了免疫细胞对MSI-h/dMMR表型的人直结肠癌细胞SW48细胞的免疫反应，，表现为IL-2的分泌水平显著增加，14C12H1L1(hG1TM)的药理学活性优于14C12H1L1(hG1WT)。
并且，14C12H1L1(hG1TM)联合安罗替尼的刺激免疫细胞激活的药理学活性优于14C12H1L1(hG1WT)单药、14C12H1L1(hG1TM)单药和nivolumab单药；还优于14C12H1L1(hG1WT)联合安罗替尼和nivolumab联合安罗替尼。
以上结果显示，14C12H1L1(hG1TM)联合安罗替尼具有治疗MSI-h/dMMR表型的实体瘤特别是MSI-h/dMMR表型的结肠癌和/或直肠癌的潜力。
实验例15：14C12H1L1(hG1TM)显著增强免疫细胞对非MSI-h/dMMR表型的人直结肠 癌细胞SW837细胞的免疫反应
SW 837细胞为非MSI-h/dMMR(即MSS)表型的人直结肠癌细胞(Guo J等人.CancerRes.2011；71(8):2978-2987.)，在本实施例中被用于检测14C12H1L1(hG1TM)增强免疫细胞对非MSI-h/dMMR表型(即MSS)的肿瘤的免疫反应。
按照分离液Ficoll-PaqueTM Plus试剂说明书分离健康人外周血PBMC，分离后的PBMC计数，冻存。Raji-PDL1细胞用RPMI1640+10％FBS完全培养基常规培养，SW837细胞(来源于上海弘顺生物科技有限公司)用10％FBS+Leibovitz's L-15完全培养基(来源于Gibco)常规培养。复苏PBMC，0.5μg/mL SEB活化两天。实验当天，Raji-PDL1细胞用2μg/mLMMC处理1小时。收集SEB活化两天的PBMC和MMC处理后的Raji-PDL1细胞，PBS洗涤两次，1640+10％FBS完全培养基重悬计数，Raji-PDL1和PBMC均是1*105个细胞/孔接种于96孔板；收集对数生长期SW837细胞，SW837细胞是5*104个细胞/孔接种于96孔板；按实验设计加入稀释好抗体，混匀置于37℃，5％CO2培养箱共培养3天。3天后，收集细胞培养上清，按ELISA KIT说明书进行IL-2检测。
结果如图47所示。
结果显示，相较于anti-HEL抗体，14C12H1L1(hG1TM)、14C12H1L1(hG1WT)和nivolumab均显著地增强了免疫细胞对非MSI-h/dMMR表型的人直结肠癌细胞SW837细胞的免疫反应。其中，在中、高剂量组14C12H1L1(hG1TM)的药理学活性优于14C12H1L1(hG1WT)，表现为IL-2的分泌水平显著增加。
以上结果显示，14C12H1L1(hG1TM)在有效地去除了ADCC、CDC或ADCP效应的基础上，与14C12H1L1(hG1WT)和nivolumab相比，还具有更好或相当的药理学活性，表明其具有治疗非MSI-h/dMMR(即MSS)表型的实体瘤特别是非MSI-h/dMMR表型的结肠癌和/或直肠癌的潜力。
实验例16：14C12H1L1(hG1TM)联合安罗替尼显著增强免疫细胞对非MSI-h/dMMR表 型的人直结肠癌细胞SW 837细胞的免疫反应
按照分离液Ficoll-PaqueTM Plus试剂说明书分离健康人外周血PBMC，分离后的PBMC计数，冻存。Raji-PDL1细胞用RPMI1640+10％FBS完全培养基常规培养，SW837细胞用Leibovitz's L-15+10％FBS完全培养基常规培养。复苏PBMC，0.5μg/mL SEB活化两天。实验当天，Raji-PDL1细胞用2μg/mL MMC处理1小时。收集SEB活化两天的PBMC和MMC处理后的Raji-PDL1细胞，PBS洗涤两次，1640+10％FBS完全培养基重悬计数，Raji-PDL1和PBMC均是1*105个细胞/孔接种于96孔板；收集对数生长期SW837细胞，SW837细胞是5*104个细胞/孔接种于96孔板；按实验设计加入稀释好抗体，混匀置于37℃，5％CO2培养箱共培养3天。3天后，收集细胞培养上清，按ELISA KIT说明书进行IL-2检测。
结果如图48所示。
结果显示，相较于14C12H1L1(hG1WT)联合安罗替尼以及nivolumab联合安罗替尼，14C12H1L1(hG1TM)联合安罗替尼显著地增强了免疫细胞对非MSI-h/dMMR表型的人直结肠癌细胞SW837细胞的免疫反应，表现为IL-2分泌水平的增加，具有更好的治疗非MSI-h/dMMR表型的实体瘤特别是非MSI-h/dMMR表型的结肠癌和/或直肠癌的效果。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解,根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
SEQUENCE LISTING
<110> 正大天晴康方（上海）生物医药科技有限公司
<120> 一种抗PD-1抗体及其医药用途
<130> IDC200237
<150> CN201910711138.5
<151> 2019-08-02
<150> CN201911133858.4
<151> 2019-11-19
<150> CN201911105715.2
<151> 2019-11-13
<150> CN201911105711.4
<151> 2019-11-13
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 354
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 14C12重链可变区的核酸序列
<400> 1
gaggtcaaac tggtggagag cggcggcggg ctggtgaagc ccggcgggtc actgaaactg 60
agctgcgccg cttccggctt cgcctttagc tcctacgaca tgtcatgggt gaggcagacc 120
cctgagaagc gcctggaatg ggtcgctact atcagcggag gcgggcgata cacctactat 180
cctgactctg tcaaagggag attcacaatt agtcgggata acgccagaaa tactctgtat 240
ctgcagatgt ctagtctgcg gtccgaggat acagctctgt actattgtgc aaaccggtac 300
ggcgaagcat ggtttgccta ttggggacag ggcaccctgg tgacagtctc tgcc 354
<210> 2
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 14C12重链可变区的氨基酸序列
<400> 2
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asn Arg Tyr Gly Glu Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 3
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 14C12轻链可变区的核酸序列
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ttcacatgca aagcatccca ggacatcaac acatacctgt cttggtttca gcagaagcca 120
ggcaaaagcc ccaagaccct gatctaccgg gccaatagac tggtggacgg ggtccccagc 180
agattctccg gatctggcag tgggcaggat tactccctga ccatcagctc cctggagtat 240
gaagacatgg gcatctacta ttgcctgcag tatgatgagt tccctctgac ctttggagca 300
ggcacaaaac tggaactgaa g 321
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 14C12轻链可变区的氨基酸序列
<400> 4
Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Phe Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Thr Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
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Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
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Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
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<213> Artificial
<220>
<223> 14C12H1L1(hG1WT)重链可变区的氨基酸序列
<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
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Ala Asn Arg Tyr Gly Glu Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
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Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 14C12H1L1(hG1WT)轻链可变区的核酸序列
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 14C12H1L1(hG1WT)轻链可变区的氨基酸序列
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Thr Tyr
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Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Met Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 14C12H1L1(hG1WT)重链的核酸序列
<400> 9
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<213> Artificial
<220>
<223> 14C12H1L1(hG1WT)重链的氨基酸序列
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
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<212> DNA
<213> Artificial
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<223> 14C12H1L1(hG1WT)轻链的氨基酸序列
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<212> DNA
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<223> 14C12H1L1(hG4)重链的核酸序列
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<223> 14C12H1L1(hG4)重链的氨基酸序列
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
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Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
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<220>
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<223> 14C12H1L1(hG1DM)重链的氨基酸序列
<400> 18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asn Arg Tyr Gly Glu Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> HCDR1
<400> 19
Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr Asp
1 5
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> HCDR2
<400> 20
Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr
1 5
<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> HCDR3
<400> 21
Ala Asn Arg Tyr Gly Glu Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 22
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> LCDR1
<400> 22
Gln Asp Ile Asn Thr Tyr
1 5
<210> 23
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> LCDR2
<400> 23
Arg Ala Asn
1
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> LCDR3
<400> 24
Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu Thr
1 5

Claims (82)

1.一种抗体，其中，
所述抗体的重链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NOs:19－21所示的HCDR1－HCDR3；并且所述抗体的轻链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NOs:22－24所示的LCDR1－LCDR3；
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；
所述抗体为人IgG1亚型；
其中，按照EU编号系统，所述抗体的重链恒定区具有如下突变：
L234A、L235A和G237A。
2.根据权利要求1所述的抗体：
其重链如SEQ ID NO:16所示，并且其轻链如SEQ ID NO:12所示。
3.根据权利要求1至2中任一权利要求所述的抗体，其中，所述抗体以大于10-7M的解离平衡常数结合FcγRIIIa_F158、FcγRI、FcγRIIa_H131、FcγRIIIa_V158和/或FcγRIIb。
4.根据权利要求3所述的抗体，其中，所述解离平衡常数通过Fortebio Octet分子相互作用仪测得。
5.根据权利要求1至2中任一权利要求所述的抗体，其中，所述抗体以大于10-6M的解离平衡常数结合FcγRIIIa_F158、FcγRI、FcγRIIa_H131、FcγRIIIa_V158和/或FcγRIIb。
6.根据权利要求5所述的抗体，其中，所述解离平衡常数通过Fortebio Octet分子相互作用仪测得。
7.根据权利要求1至2中任一权利要求所述的抗体，其中，所述抗体以大于10-5M的解离平衡常数结合FcγRIIIa_F158、FcγRI、FcγRIIa_H131、FcγRIIIa_V158和/或FcγRIIb。
8.根据权利要求7所述的抗体，其中，所述解离平衡常数通过Fortebio Octet分子相互作用仪测得。
9.根据权利要求1至2中任一权利要求所述的抗体，其中，所述抗体以大于10-4M的解离平衡常数结合FcγRIIIa_F158、FcγRI、FcγRIIa_H131、FcγRIIIa_V158和/或FcγRIIb。
10.根据权利要求9所述的抗体，其中，所述解离平衡常数通过Fortebio Octet分子相互作用仪测得。
11.根据权利要求1至2中任一权利要求所述的抗体，其中，所述抗体以大于10-3M或更大的解离平衡常数结合FcγRIIIa_F158、FcγRI、FcγRIIa_H131、FcγRIIIa_V158和/或FcγRIIb。
12.根据权利要求11所述的抗体，其中，所述解离平衡常数通过Fortebio Octet分子相互作用仪测得。
13.根据权利要求1至2中任一权利要求所述的抗体，其中，所述抗体与FcγRIIIa_F158、FcγRI、FcγRIIa_H131、FcγRIIIa_V158和/或FcγRIIb没有结合信号或者结合信号小于0.1nm。
14.根据权利要求13所述的抗体，其中，所述结合信号是指通过Fortebio Octet分子相互作用仪测得的响应值。
15.根据权利要求1至2中任一权利要求所述的抗体，其中，所述抗体以大于10-9M的解离平衡常数结合C1q。
16.根据权利要求15所述的抗体，其中，所述解离平衡常数通过Fortebio Octet分子相互作用仪测得。
17.根据权利要求1至2中任一权利要求所述的抗体，其中，所述抗体以大于10-8M的解离平衡常数结合C1q。
18.根据权利要求17所述的抗体，其中，所述解离平衡常数通过Fortebio Octet分子相互作用仪测得。
19.根据权利要求1至2中任一权利要求所述的抗体，其中，所述抗体以大于10-7M的解离平衡常数结合C1q。
20.根据权利要求19所述的抗体，其中，所述解离平衡常数通过Fortebio Octet分子相互作用仪测得。
21.根据权利要求1至2中任一权利要求所述的抗体，其中，所述抗体以大于10-6M的解离平衡常数结合C1q。
22.根据权利要求21所述的抗体，其中，所述解离平衡常数通过Fortebio Octet分子相互作用仪测得。
23.根据权利要求1至2中任一权利要求所述的抗体，其中，所述抗体以大于10-5M或更大的解离平衡常数结合C1q。
24.根据权利要求23所述的抗体，其中，所述解离平衡常数通过Fortebio Octet分子相互作用仪测得。
25.根据权利要求1至2中任一权利要求所述的抗体，其中，所述抗体与C1q没有结合信号或者结合信号小于0.1nm。
26.根据权利要求25所述的抗体，其中，所述结合信号是指通过Fortebio Octet分子相互作用仪测得的响应值。
27.分离的核酸分子，其编码权利要求1至26中任一权利要求所述的抗体。
28.一种载体，其包含权利要求27所述的分离的核酸分子。
29.一种宿主细胞，其包含权利要求27所述的分离的核酸分子，或者权利要求28所述的载体。
30.偶联物，其包括抗体以及偶联部分，其中，所述抗体为权利要求1至26中任一权利要求所述的抗体，所述偶联部分为可检测的标记。
31.根据权利要求30所述的偶联物，其中，所述偶联部分为放射性同位素、荧光物质或酶。
32.根据权利要求30所述的偶联物，其中，所述偶联部分为有色物质。
33.根据权利要求30所述的偶联物，其中，所述偶联部分为发光物质。
34.试剂盒，其包括权利要求1至26中任一权利要求所述的抗体，或者包括权利要求30至33中任一权利要求所述的偶联物。
35.根据权利要求34所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别所述抗体。
36.根据权利要求35所述的试剂盒，其中，所述第二抗体还包括可检测的标记。
37.根据权利要求36所述的试剂盒，其中，所述可检测的标记为放射性同位素、荧光物质或酶。
38.根据权利要求36所述的试剂盒，其中，所述可检测的标记为有色物质。
39.根据权利要求36所述的试剂盒，其中，所述可检测的标记为发光物质。
40.权利要求1至26中任一权利要求所述的抗体或者权利要求30至33中任一权利要求所述的偶联物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测PD-1在样品中的存在或其水平。
41.一种药物组合物，其包含权利要求1至26中任一权利要求所述的抗体或者权利要30至33中任一权利要求求所述的偶联物。
42.根据权利要求41所述的药物组合物，其还包括药学上可接受的载体。
43.根据权利要求41所述的药物组合物，其还包括药学上可接受的赋形剂。
44.根据权利要求41所述的药物组合物，其还包含一种或多种肿瘤化疗药物。
45.根据权利要求44所述的药物组合物，其中，所述肿瘤化疗药物为酪氨酸激酶抑制剂。
46.根据权利要求44所述的药物组合物，其中，所述肿瘤化疗药物为安罗替尼或其可药用盐，或者仑伐替尼或其可药用盐。
47.根据权利要求46所述的药物组合物，其中，安罗替尼的可药用盐为安罗替尼的盐酸盐。
48.根据权利要求46所述的药物组合物，其中，仑伐替尼的可药用盐为仑伐替尼的甲烷磺酸盐。
49.根据权利要求41至48中任一权利要求所述的药物组合物，其中，所述药物组合物的单位剂量，按照其中的所述抗体的质量计算，为100mg-1000mg。
50.根据权利要求41至48中任一权利要求所述的药物组合物，其中，所述药物组合物的单位剂量，按照其中的所述抗体的质量计算，为200mg-800mg。
51.根据权利要求41至48中任一权利要求所述的药物组合物，其中，所述药物组合物的单位剂量，按照其中的所述抗体的质量计算，为200mg-500mg。
52.根据权利要求41至48中任一权利要求所述的药物组合物，其中，所述药物组合物的单位剂量，按照其中的所述抗体的质量计算，为300mg-600mg。
53.根据权利要求41至48中任一权利要求所述的药物组合物，其中，所述药物组合物的单位剂量，按照其中的所述抗体的质量计算，为400mg-500mg。
54.根据权利要求41至48中任一权利要求所述的药物组合物，其中，所述药物组合物的单位剂量，按照其中的所述抗体的质量计算，为450mg。
55.一种药物组合，其包含权利要求1至26中任一权利要求所述的抗体，以及至少一种肿瘤化疗药物。
56.根据权利要求55所述的药物组合，其包含1种、2种或3种肿瘤化疗药物。
57.根据权利要求55所述的药物组合，其中，所述肿瘤化疗药物为酪氨酸激酶抑制剂。
58.根据权利要求56所述的药物组合物，其中，所述肿瘤化疗药物为安罗替尼或其可药用盐，或者仑伐替尼或其可药用盐。
59.根据权利要求58所述的药物组合物，其中，安罗替尼的可药用盐为安罗替尼的盐酸盐。
60.根据权利要求58所述的药物组合物，其中，仑伐替尼的可药用盐为仑伐替尼的甲烷磺酸盐。
61.根据权利要求55所述的药物组合，其中，所述抗体的单位剂量为100mg-1000mg。
62.根据权利要求55所述的药物组合，其中，所述抗体的单位剂量为200mg-800mg。
63.根据权利要求55所述的药物组合，其中，所述抗体的单位剂量为200mg-500mg。
64.根据权利要求55所述的药物组合，其中，所述抗体的单位剂量为300mg-600mg。
65.根据权利要求55所述的药物组合，其中，所述抗体的单位剂量为400mg-500mg。
66.根据权利要求55所述的药物组合，其中，所述抗体的单位剂量为450mg。
67.根据权利要求55所述的药物组合，其中，所述肿瘤化疗药物的单位剂量为0.1mg-100mg。
68.根据权利要求55所述的药物组合，其中，所述肿瘤化疗药物的单位剂量为0.5mg-50mg。
69.根据权利要求55所述的药物组合，其中，所述肿瘤化疗药物的单位剂量为1mg-20mg。
70.根据权利要求55所述的药物组合，其中，所述肿瘤化疗药物的单位剂量为2mg-15mg。
71.根据权利要求55所述的药物组合，其中，所述肿瘤化疗药物的单位剂量为4mg-12mg。
72.根据权利要求55所述的药物组合，其中，所述肿瘤化疗药物的单位剂量为8mg-12mg。
73.根据权利要求55至72中任一权利要求所述的药物组合，其中，
所述药物组合为固定组合；或者
所述药物组合是非固定组合。
74.根据权利要求73所述的药物组合，其中，所述药物组合呈固体药物组合物形式或液体药物组合物形式。
75.根据权利要求73所述的药物组合，其中，所述非固定组合中的抗PD-1抗体、肿瘤化疗药物各自呈药物组合物形式。
76.一种药盒产品，其包含权利要求41至54中任一权利要求所述的药物组合物或者权利要求55至75中任一权利要求所述的药物组合，以及产品说明书。
77.权利要求1至26中任一权利要求所述的抗体或者权利要求30至33中任一权利要求所述的偶联物在制备治疗和/或预防肿瘤的药物中的用途。
78.根据权利要求77所述的用途，其中，所述肿瘤选自黑色素瘤、肾肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、白血病、鼻咽癌和子宫内膜癌中的一种或多种。
79.根据权利要求78所述的用途，其中，所述肺癌选自非小细胞性肺癌、小细胞性肺癌和肺鳞癌中的一种或多种。
80.根据权利要求78所述的用途，其中，所述胃癌为胃腺癌或食管结合部腺癌。
81.根据权利要求77所述的用途，其中，所述肿瘤为具有MSI-H/dMMR表型的实体瘤。
82.根据权利要求81所述的用途，其中，所述肿瘤选自具有MSI-H/dMMR表型的下述肿瘤中的一种或多种：
结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、胃癌、间皮瘤、肉瘤、肾上腺皮质癌、恶性黑色素瘤或卵巢生殖细胞肿瘤。
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