CN114685674B - 一种抗体融合蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种PD‑L1/VEGFRI抗体融合蛋白及其应用。本发明通过柔性接头将PD‑L1抗体与VEGFRI受体外段Doman2(VEGFRI‑D2)进行融合，以构建具有靶向、免疫调节等功能的融合蛋白。本发明所述的融合蛋白亲和力高，半衰期长，可协同从免疫正常化和肿瘤血管生成两方面抑制肿瘤的生长及功能，为肿瘤的治疗提供了新的思路。

Description

一种抗体融合蛋白及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白及其应用。
背景技术
肿瘤是指机体在各种致瘤因子的作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物。根据新生物的细胞特性及对机体的危害性程度，可将肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类。其中，恶性肿瘤是威胁人类健康的重要疾病之一，同时也是造成全球范围内疾病负担的重要原因。虽然近年来针对恶性肿瘤的治疗和预防取得了重大进展，但是由于人口数量増长和人口老齡化，加之吸烟、肥胖和饮食结构改变等危险因素，恶性肿瘤疾病负担仍然会不断増加。预计到2030年，全球恶性肿瘤新发病例数将増长到2400万例。在过去的几十年中，中国在经济快速増长的同时也伴随着疾病谱的改变，恶性肿瘤已经成为我国最主要的公共卫生问题。
机体在对抗肿瘤疾病时，主要通过激发活化T淋巴细胞为效应T细胞发挥细胞免疫应答作用。T细胞抗原受体与抗原肽-MHC复合物作用产生T细胞活化的第一信号，同时活化还需要共刺激分子与T细胞表面协同刺激分子受体结合作用产生的第二信号。其中程序性死亡因子配体1(programmed death-1 ligand，PD-L1，又命名为B7-H1或CD274)是主要的共刺激分子，其与受体PD-1特异性结合，产生负性第二信号，参与免疫的负性调节，降低T细胞功能，从而促进肿瘤免疫耐受。PD-L1属于I型跨膜配体，包含IgV和IgC样结构，大部分位于胞外，小部分位于细胞质。PD-L1的受体PD-1存在于T细胞表面，两者结合会抑制T细胞的增殖和细胞因子的产生，这种机制作为自然选择的一种方式使肿瘤在免疫反应的环境中得到了进化。PD-L1与B7-1也有结合，B7-1是另一种T细胞激活的负性调节者，PD-L1异常表达于多种肿瘤细胞，而且在多种癌症中PD-L1表达的增加和不良的预后有关系。随着免疫的活化和促炎因子的产生，在肿瘤微环境的免疫细胞和其他细胞中，PD-L1也会上调，进一步促进了肿瘤微环境T细胞的抑制。阻断PD-L1可以促进与肿瘤反应的T细胞重新激活，恢复其发现和杀死肿瘤细胞的功能。
肿瘤细胞及其微环境通过上调PD-L1表达并与肿瘤特异的CD8+T细胞表面的PD-1结合，来限制宿主的免疫反应，从而产生免疫逃逸。因此利用PD-1或PD-L1的单抗针对性阻断PD-1/PD-L1信号通路可恢复T细胞对肿瘤的免疫杀伤功能，能够发挥良好的治疗效果。目前已有很多PD-1或PD-L1的单抗进入临床研究或上市，默沙东的Keytruda、百时美施贵宝的Opdivo、信达的信迪利单抗以及君实的特瑞普利单抗都是已在国内上市的针对PD-1的单抗药物，它们在多种肿瘤临床实验中都具有良好治疗的效果；罗氏的Tecentriq、辉瑞的Bavencio和阿斯利康的Imfinzi为都已通过FDA审批针对PD-L1的单抗药物，在非小细胞肺癌、膀胱癌等肿瘤治疗方面取得一定的疗效。虽然以PD-1与PD-L1单抗为核心的肿瘤免疫疗法在临床应用中取得不错的效果，但是仍具有一定的局限性：(1)PD-1/PD-L1单抗不能无差别治疗肿瘤病人，使用PD-1/PD-L1单抗治疗的肿瘤病人需先进行生物标记物；(2)通过PD-1/PD-L1信号通路治疗肿瘤的机理研究还不完全明了；(3)严重的致命并发症，如免疫性肝炎、免疫性肺炎、免疫性肠癌、免疫性心脏炎症甚至免疫性神经系统炎症。
肿瘤细胞的生长和转移扩散需要血管不断的生成而维持，这个动态的过程主要由血管内皮生长因子(VEGF)介导，而阻抑肿瘤血管生成无疑对控制肿瘤生长及扩散有重要意义。许多因子如表皮生长因子(EGF)和VEGF与其特定的酪氨酸激酶受体相结合，引起下游作用，导致肿瘤特异性行为或者增殖、侵袭和血管形成。VEGF信号通路主要包括6种配体(VEGF-A，-B，-C，-D，-E和PGF)和3种受体(VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3)，其中，VEGF-A及其主要受体VEGFR1、VEGFR2是肿瘤血管新生过程中最重要的调控因素。VEGF作为促血管生成因子，能够增大血管的通透性，刺激内皮细胞的增殖与迁移，促进肿瘤血管新生，参与肿瘤的生长、侵袭和转移。阻断VEGF信号通路，在临床前及临床研究中显示出良好的抗肿瘤效果。目前，VEGF单抗也已经被批准用于治疗多种肿瘤，如贝伐珠单抗及其生物类似药，包括信达生物制药IB1305、东耀药业TAB008、齐鲁制药QL1101、恒瑞医药BP102、天广实生物技术有限公司MIL60、百奥泰生物BAT1706、博安LY01008等。
近期研究表明，同时抑制PD-1信号和VEGF信号，抗肿瘤效果更好(Clin ExpImmunol,2013,172(3):500-6.Sznol et al,ASCO,GU2015)。PD-1单抗和VEGFR2单抗联用，PD-L1单抗和VEGF单抗联用，都显示出良好的协同效果。专利WO2019/206281即公开了一种稳定的抗人PD-1抗体的药物制剂和联合用药物，所述的联合用药物包括针对VEGF等靶点的抑制剂；专利CN110812485A公开了一种抗PD-1抗体及化疗药物、抗VEGF抗体等的联合化疗法在治疗非小细胞肺癌、乳腺癌、黑素瘤、肝癌、结直肠癌或肾癌中的应用。另外，专利CN109942712A提供了一种抗PD-L1/VEGF双特异性的抗体及抗肿瘤用途；专利WO2019/062642A1公开了一种靶向PD-1或PD-L1且靶向VEGF家族的双靶向融合蛋白及其抗肿瘤用途；专利WO2019/154349A1则公开了一种抗PD-1/抗VEGF天然抗体结构样异源二聚体形式的双特异抗体。
联合给药需要依次注射两种或多种抗体，或可将抗体做成同一剂型。但一方面，依次注射抗体会增加患者的疼痛，降低患者的治疗依从性，另一方面，不同抗体之间的物化性质不同，做成同一剂型存在较大的困难。同时，现阶段可同时阻断PD-1和VEGF信号通路的抗体或新型治疗药物种类较少，融合蛋白虽然是药物研发的方向，但其通常存在表达量低、稳定性差、工艺复杂等问题。
因此，亟需开发能够同时阻断PD-1和VEGF信号通路的抗体或新型治疗药物，为肿瘤的治疗提供新的思路。
发明内容
针对上述不足，本发明提供了一种PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白。本发明通过柔性接头将PD-L1抗体与VEGFRI受体外段Doman2(VEGFRI-D2)进行融合，以构建具有靶向、免疫调节等功能的融合蛋白。本发明所述的融合蛋白亲和力高，半衰期长，可协同从免疫正常化和肿瘤血管生成两方面抑制肿瘤的生长及功能，为肿瘤的治疗提供了新的思路。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白。
具体地，所述的PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白包含抗PD-L1抗原结合蛋白和抗VEGFRI抗原结合蛋白。
进一步具体地，所述的抗PD-L1抗原结合蛋白包含：
(1)含有序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的重链HCDR1、HCDR2和HCDR3中的任意一个或多个的重链互补决定区，或者与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的重链HCDR1、HCDR2或HCDR3分别具有3、2或1个氨基酸差异的HCDR变体；
和/或(2)含有序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的轻链LCDR1、LCDR2和LCDR3中的任意一个或多个的轻链互补决定区，或者与SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6所示的轻链LCDR1、LCDR2或LCDR3分别具有3、2或1个氨基酸差异的LCDR变体。
进一步具体地，所述的抗PD-L1抗原结合蛋白包含：
(1)含有如SEQ ID NO:7所示的重链可变区，或者与SEQ ID NO:7所示的重链可变区具有3、2或1个氨基酸差异的重链可变区变体；
和/或(2)含有如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区，或者与SEQ ID NO:8所示的轻链可变区具有3、2或1个氨基酸差异的轻链可变区变体。
进一步具体地，所述的抗PD-L1抗原结合蛋白包含：
序列如SEQ ID NO:9所示的重链和序列如SEQ ID NO:10所示的轻链。
进一步具体地，所述的抗VEGFRI抗原结合蛋白具有序列如SEQ ID NO:12所示的VEGFRI-D2。
进一步具体地，所述的抗PD-L1抗原结合蛋白和抗VEGFRI抗原结合蛋白通过柔性接头串联连接，所述的柔性接头的序列如SEQ ID NO:11所示。
进一步具体地，所述的抗VEGFRI抗原结合蛋白与所述的抗PD-L1抗原结合蛋白的重链串联；或所述的抗VEGFRI抗原结合蛋白与所述的抗PD-L1抗原结合蛋白的轻链串联。
优选地，所述的抗VEGFRI抗原结合蛋白与所述的抗PD-L1抗原结合蛋白的重链串联。
在一个实施例中，所述PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白的重链序列如SEQ ID NO:13所示，轻链序列如SEQ ID NO:10所示。
在另一个实施例中，所述PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白的重链序列如SEQ ID NO:9所示，轻链序列如SEQ ID NO:14所示。
另一方面，本发明提供了一系列编码所述PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白的核酸分子。
具体地，所述的核酸分子包含一种或多种经密码子优化的核酸分子。
又一方面，本发明提供了一系列载体，所述的载体包含本申请所述的一个或多个核酸分子。
具体地，所述的载体包括但不限于质粒、病毒、噬菌体。
进一步具体地，所述的载体为pcDNA3.1、pcDNA3.4或ptt5。
又一方面，本发明提供了一系列包含上述核酸分子或上述载体的宿主细胞。
具体地，所述的宿主细胞包括但不限于微生物、植物或动物细胞。
进一步具体地，所述的宿主细胞为293F或Expi CHO-S。
具体地，可通过本领域技术人员已知的方法将本发明所述的载体引入所述宿主细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等方法。
又一方面，本发明提供了生产上述PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白的方法，所述的方法包括在使得所述抗体融合蛋白表达的情况下，培养上述宿主细胞的步骤。
又一方面，本发明提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包含本发明所述的PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白、核酸分子、载体和/或宿主细胞。
具体地，所述的药物组合物还包含任选的药学上可接受的载体。
进一步具体地，所述的药学上可接受的载体包括但不限于：稀释剂、赋形剂、填充剂、润湿剂、崩解剂、矫味剂和粘合剂。
具体地，所述的药物组合物还包含组合治疗剂，所述的组合治疗剂包括但不限于化学治疗剂、放射治疗剂、免疫抑制剂、细胞毒性药物。
又一方面，本发明提供了所述的PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白、核酸分子、载体和/或宿主细胞在制备用于检测PD-L1/VEGFRI的工具中的应用。
又一方面，本发明提供了所述的PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白、核酸分子、载体和/或宿主细胞在制备用于预防和/或治疗与PD-L1/VEGFRI活性相关的疾病的药物、试剂盒和/或装置中的应用。
具体地，所述的疾病包括但不限于白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、非小细胞肺癌、胃癌、胰腺癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌、卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、黑色素瘤。
与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
(1)本发明提供了一种PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白，所述的融合蛋白可特异性靶向抗原，利用PD-L1在肿瘤细胞上的高表达，将VEGF的阻断效应聚焦到肿瘤微环境，减轻阻断VEGF对多种组织器官的副作用，为为肿瘤的治疗提供了新的思路。
(2)本发明所述的PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白特异性高，亲和力好，具有有效的抗肿瘤活性。
(3)本发明所述的PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白中，PD-L1抗体可解除免疫抑制，VEGFRI-D2通过“trap”结构结合VEGF，从而阻断VEGF信号通路，抑制肿瘤组织血管增生，二者可协同从免疫正常化和肿瘤营养输送两方面抑制肿瘤的生长。
(4)本发明所述的PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白引入PD-L1抗体后，检测发现其半衰期延长，PK也得到改善。
附图说明
图1为本发明所述PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白的结构，其中，1A为46-24抗体融合蛋白的结构，1B为23-47抗体融合蛋白的结构。
图2为本发明所述PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白SDS-PAGE 4-12％梯度胶电泳图。
图3为本发明所述PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白的SEC-HPLC色谱图，其中，3A为46-24抗体融合蛋白的色谱图，3B为23-47抗体融合蛋白的色谱图。
图4为本发明所述PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白与PD-L1/VEGFRI的结合图。
图5为本发明所述PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白阻断PD1/PD-L1的结合图。
图6为本发明所述PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白抑制HUVEC细胞增殖图。
图7为体内抗肿瘤检测小鼠的体重变化图。
图8为体内抗肿瘤检测小鼠肿瘤体积统计结果图。
图9为体内抗肿瘤检测抑瘤率统计结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
术语
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学用语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有的其他技术和科学术语都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968,IUPAC-IUB委员会)中所述。
本发明所述的“抗原结合蛋白”通常是指包含结合抗原部分的蛋白质，以及任选地允许结合抗原的部分采用促进抗原结合蛋白与抗原结合的构象的支架或骨架部分。可典型地包含抗体轻链可变区(VL)、抗体重链可变区(VH)或上述两者。VH和VL区可进一步被区分为称为互补决定区(CDR)的高变区，它们散布在称为框架区(FR或FWR)的更保守的区域中。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗原结合蛋白的实例包括但不限于抗体、抗原结合片段(Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb)、免疫缀合物、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段、抗体衍生物、抗体类似物、嵌合抗原受体或融合蛋白等，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。
本发明所述的“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键链接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA、IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可以分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(Fv区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补决定区(CDR)。每条轻链可变区(VL或LCVR)和重链可变区(VH或HCVR)由3个CDR区和4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。
术语“互补决定区”(CDR)指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。通常每个重链可变区中存在三个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，每个轻链可变区中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。本发明中使用“Kabat编号规则”(参见Kabat等(1991))确定CDR的氨基酸序列边界。
术语“单克隆抗体”是指从基本上均质抗体的群里获得的抗体，即除可能的变体抗体外，构成所述群体的个别抗体相同和/或结合相同的表位。与通常包含针对不同决定簇的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体是针对抗原上的单一决定簇的。因此。“单克隆”是指从基本上均质抗体群体获得的抗体的特性，且不应解释为需要通过任何特定方法来制造抗体。本发明所述的单克隆抗体可通过各种本领域技术人员已知的技术制备，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法及转基因方法等。
本发明所述的人LIFR抗体包括下表1所述的重链及轻链的组合。
表1 PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白的序列特征
在某些实施例中，RB0005为抗PD-L1抗体，序列可见专利CN105968200B；136为VEGFRI融合蛋白，序列如SEQ ID NO:19所示。
术语“特异性结合”、“选择性结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10-8M，例如大约小于10-9M、10-10M、10-11M或更小的亲和力(KD)结合。其中，“KD”指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。
在某些实施例中，本发明所述的PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白还可通过培养包含所述的核酸分子或载体的宿主细胞或包含编码所述PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白的核苷酸序列的基因修饰细胞得到。
在某些实施例中，本发明所述的PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白(如经生物素化、辣根过氧化酶或任何其它可检测部分修饰的抗体)可用于非疾病诊断或治疗目的的检测PD-L1/VEGFRI。具体来说，PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白可用于例如(但不限于)纯化或检测PD-L1/VEGFRI，包括体内和体外两者的诊断。例如，所述抗体可用于定性和定量测量生物样品中PD-L1/VEGFRI的含量的免疫分析中。
本发明进一步涵盖接合于诊断试剂的抗体或其片段。所述抗体可用于诊断例如检测相关目标于特定细胞、组织或血清中的表达；或作为临床测试程序的一部分监测免疫反应的发展或进展以便例如判断指定治疗方案的功效；可通过将抗体偶合至可检测物质来促进检测；可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性物质、使用各种正电子发射断层摄影术的正电子发射金属，和非放射性顺磁性金属离子；可使用所属领域中已知的技术将可检测物质直接偶合或接合于抗体(或其片段)，或通过中间物(例如所属领域中已知的连接子)间接偶合或接合于抗体(或其片段)。
本发明提供对PD-L1/VEGFRI表达的检测，其包含使用一种或一种以上本发明的PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白(任选接合于可检测部分)接触生物样品(个体细胞、组织或体液)，和检测样品关于LIFR表达是否呈阳性，或检测样品相较于对照样品是否具有改变(例如减少或增加)的表达。可使用本发明方法诊断的疾病包括(但不限于)本文所述的疾病。在某些实施例中，组织或体液为周边血液、周边血液白血球、活组织检查组织(例如肺或皮肤活组织检查)以及组织。
本发明的PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白适用于治疗各种与PD-L1/VEGFRI活性相关疾病的病症或症状。具体地，所述的疾病包括但不限于白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、非小细胞肺癌、胃癌、胰腺癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌、卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、黑色素瘤。
在某些实施例中，本发明提供包含本发明PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白的药物组合物。组合物通常包括医药学上可接受的载体，包括但不限于：稀释剂、赋形剂、填充剂、润湿剂、崩解剂、矫味剂和粘合剂。此药物组合物可呈任何适合形式(视将其投予患者的所需方法而定)，可通过多种途径(例如经口、经皮、皮下、鼻内、静脉内、肌肉内、眼内、局部、鞘内和脑室内)向患者投予本发明的PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白。在任何指定情况下最适于投药的途径将视特定抗体、个体和疾病的性质和严重度以及个体的身体状况而定。
在某些实施例中，本发明涉及向患者投予至少两种药剂，其中第一药剂为本发明的PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白，而其它药剂为组合治疗剂。PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白和组合治疗剂可同时、相继或分开投予。本发明的组合治疗方法可产生大于相加作用的效果，从而提供抗PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白和组合治疗剂两者皆不以单独使用时治疗有效的量投予的治疗效益。所述的组合治疗剂包括但不限于化学治疗剂、放射治疗剂、免疫抑制剂、细胞毒性药物。
实施例1融合蛋白制备
1.融合蛋白表达
本发明所述46-24PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白重链的DNA核苷酸序列如SEQ IDNO:15所示，轻链的DNA核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示；23-47PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白重链的DNA核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，轻链的DNA核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。
将上述基因序列分别构建到哺乳动物表达载体pcDNA3.1 GN中。用控内毒质粒大抽试剂盒大抽质粒，OPM-293CD05 medium(奥浦迈，货号81075-001)培养293F细胞准备转染。转染前一天细胞计数，密度2.59*106/mL，活率98.1％，用新鲜培养基稀释细胞至1.5*106/mL。转染当天细胞计数，密度3.01*106/mL，活率98.8％，用新鲜培养基稀释细胞至2.78*106/mL。取1/10转染体积的OPM-293 CD05 medium，先1:1加入重链和轻链，至1.5μg/mL转染体积，再加入3倍质粒量的PEI，室温孵育15min。向上述处理好的细胞中加入孵育混合物，边加边混匀。放入摇床培养，培养条件37℃，90rpm，8％CO2。转染后第一天和第四天加入补料OPM-CHO PFF05补料(奥浦迈，货号FB1279-001)。转染后第6天收上清。
2.融合蛋白纯化
2.1亲和层析
用0.5M NaOH冲洗系统，0.1M NaOH冲洗填料Mabselect Sure，各处理1小时控内毒素，用20mM PB，150mM NaCl，pH7.2平衡填料。将46-24、23-47瞬转表达上清过滤后上样，控制流速1mL/min，上样结束后先用20mM PB，150mM NaCl洗至UV280峰变水平，再用20mM PB，1M NaCl，pH6.5洗至峰变水平，最后用20mM Cit-Na3Cit，pH3.5洗脱，用1M Tris pH9.0中和。
2.2阳离子层析
用0.5M NaOH冲洗系统，0.1M NaOH冲洗填料SP-HP，各处理2小时控内毒素，用20mMPB，pH6.0平衡填料。将亲和层析得的46-24、23-47样品调节pH至6.0并稀释调整电导＜3μS/cm进行上样，控制流速1mL/min，上样结束后先用20mM PB，pH6.0缓冲液冲洗至UV280基线，再用20mM PB，1M NaCl，pH.6.0进行线性梯度洗脱(0-30％B，20CV)，按峰收集洗脱样品。
2.3阴离子层析
用0.5M NaOH冲洗系统，0.1M NaOH冲洗填料Q-HP，各处理2小时控内毒素，用20mMTris，pH9.0平衡填料。将亲和层析得的46-24、23-47样品调节pH至9.0并稀释调整电导＜3μS/cm进行上样，控制流速1mL/min，上样结束后先用20mM Tris，pH9.0洗至UV280基线，再用20mM Tris，1M NaCl，pH9.0进行线性梯度洗脱(0-30％B，20CV)，按峰收集洗脱样品。
3.融合蛋白检测分析
SDS-PAGE 4-12％梯度胶分析蛋白的纯度，SEC-HPLC分析蛋白纯度，qPCR(orangeprotein gel stain)分析蛋白TM值。
表2检测结果
图2为46-24/23-47PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白SDS-PAGE 4-12％梯度胶电泳图，图3为46-24/23-47PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白SEC-HPLC色谱图，其中3A为46-24，3B为23-47。由图2和图3可知，本申请所述的融合蛋白表达量较高，且杂质少。
实施例2融合蛋白与PD-L1亲和力测定
采用实施例1中所制备的融合蛋白及RB0005蛋白，用GE 8K进行Biacore亲和力测定，HBS-EP+为实验缓冲液进行，在25℃条件下进行，将实施例2所得融合蛋白稀释到5μg/mL，以流速10μL/min固定20s至Protein A芯片上。将分析物PD-L1梯度稀释至0、1、3、9、27、81nM以流速30μL/min，结合300s，解离900s，用pH 1.5的10mM Glycine-HCl再生，流速为100μL/min，时间30s，重复一次。抗体亲和力检测结果如下表3所示。
表3亲和力测定数据
样品 靶标 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
46-24 PD-L1 5.19E+05 1.71E-04 3.29E-10
47-23 PD-L1 5.25E+05 1.92E-04 3.65E-10
RB0005 DP-L1 3.34E+05 2.81E-04 8.40E-10
由表3可知，本申请所述的PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白对PD-L1/VEGFRI的亲和力较高。
实施例3融合蛋白与VEGF165的结合
向96孔板中包被细胞因子hVEGF/mVEGF，4℃过夜，去除上清，用含0.1％吐温20的PBS洗板，用3％BSA in PBS溶液封闭96孔板，37℃封闭1.5h，洗板后加入用1％BSA in PBS溶液梯度稀释的待测样品，37℃孵育1h，洗板后加入用1％BSA in PBS稀释的羊抗人IgG-HRP，37℃孵育50min，洗板后加入TMB单组份显色液避光反应2-4min，加入2M H2SO4终止反应，酶标仪读数OD450-OD620。最后通过GraphPad Prism 6软件拟合回归模型绘制曲线，获得待测样品EC50值，表征待测样品的结合活性。
表4结合活性检测结果
由表4及图4可知，本申请所述的PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白能够特异性地结合PD-L1/VEGFRI。
实施例4融合蛋白体外活性测定
1.PD1/PD-L1结合阻断活性
将培养在F12K+10％FBS培养基中的GS-C2/PD-L1细胞100μL，密度为5*105铺板于96孔白板，37℃，5％CO2培养过夜，弃上清加入50μL/孔预先梯度稀释好的融合蛋白(46-24/23-47)及RB0005，再加入50μL密度为1*106/mL的GS-J2/PD-1细胞，37℃，5％CO2培养6h，后每孔加入80μL ONE-GloTM Luciferase，室温反应5min后，读取荧光信号。
表5PD1/PD-L1结合阻断检测结果
融合蛋白 EC50(nM)
46-24 14.37
23-47 12.23
RB0005 14.83
由表5及图5可知，本申请所述的PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白能够阻断PD1/PD-L1的结合。
2.HUVEC细胞增殖抑制活性
HUVEC细胞(ATCC，PCS-100-013)来自人脐静脉内皮细胞，具有生物活性的细胞因子VEGF165，VEGF165与HUVEC细胞表面的VEGF受体结合后，能促进HUVEC细胞增殖。在体系中加入VEGF受体融合蛋白样品，该受体蛋白结合体系中的VEGF165后，能阻碍VEGF165与HUVEC细胞表面的受体结合，进而抑制VEGF165对HUVEC细胞的促增殖作用。
取生长状态良好的HUVEC细胞铺板于96孔板中过夜贴壁，再加入预先混合的待测样品与VEGF165混合液，继续培养72h，加入Bio-GloTM Luciferase Assay System试剂后通过多功能酶标仪测定其发光值，发光强度与孔板中活细数成正相关。最后通过GraphPadPrism 6软件拟合回归模型绘制曲线，获得待测样品EC50值，表征待测样品的细胞活性。其中avastin(贝伐单抗)为罗氏公司制备的针对VEGF的抗肿瘤药物，Conbercept(康柏西普)是一种抗血管内皮生长因子的融合蛋白。
表6HUVEC细胞增殖检测结果
融合蛋白 EC50(nM)
46-24 0.2599
avastin 0.4081
Conbercept 0.2208
由表6和图6可知，本申请所述的PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白能够有效抑制HUVEC细胞的增殖。
实施例5融合蛋白PK检测
选择12只健康状况良好的SD大鼠，6只雌性，6只雄性。按每组3只雌性，3只雄性进行分组。组1接受3mg/kg的RB0005处理；组2接受3mg/kg的PD-L1/VEGFRI融合抗体(46-24)处理。按药前，药后5±1min、30±2min，2、6、10、24、48、72h，5、7、10、14、17、21、28、35d时间点进行尾静脉采血。
血样处理：采血前将加有10μL枸橼酸钠工作液(1000U/mL)的EP管中置于2-8℃冰箱中或冰盒中；将采集的血液加入离心管中，手动颠倒至少5次至混匀；2-8℃1500g离心10min，采血后2h内完成离心。离心后的血浆转移至贴有新标签的管中，分装为3管，-80℃保存。
按下述检测方法进行检测：
(1)包被：将100μL1μg/mL VEGF165稀释液加到微孔板中，封板膜封板，4℃孵育15h。
(2)洗板：弃掉孔内液体，每孔加300μL的洗液洗板3次，每次洗板浸泡2min并轻摇板子，甩掉板内液体，吸水纸上拍3次，最后一次洗板结束，吸水纸上拍干。
(3)封闭：每孔加200μL封闭液进行封板。封板膜封板，37℃孵育1h。
(4)重复步骤(2)。封闭过的微孔板需要当天使用。
(5)加样：标准曲线溶液、质控溶液及样本(若需稀释，先用样本稀释液稀释至标准曲线范围内)用分析缓冲液进行MRD后加入封闭过的微孔板中，100μL/孔，封板膜封板，37℃孵育1h。
(6)重复步骤(2)。
(7)加biotinylated PD-L1：每孔加100μL的biotinylated PD-L1溶液(1μg/mL)。封板膜封板，37℃孵育1h。
(8)重复步骤(2)。
(9)加streptavidin-HRP：每孔加100μL的streptavidin-HRP溶液(1:5000)。封板膜封板，37℃孵育1h。
(10)显色：加入TMB底物溶液100μL/孔，室温避光孵育10min。
(11)终止：加入终止液50μL/孔，终止反应，30min内在酶标仪上测定450nm处的OD值，校正波长620nm。
检测结果如下表7所示。
表7融合蛋白PK检测结果
由表7可知，本申请所述的PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白半衰期延长，可进一步改善其PK。
实施例6融合蛋白体内活性测定
将1×107个/mL MC38细胞，以0.2mL/只接种于5-6周SPF级C57BL/6J小鼠右侧腋窝皮下。待平均肿瘤体积为100mm3左右时，挑选肿瘤生长旺盛且无溃破、健康情况良好的荷瘤动物进行分组。将小鼠分成8组(N＝6)，使得所有组的平均肿瘤尺寸相似，并且起始通过肌肉注射处理(第0天)。组1接受溶剂处理，每周两次；组2接受3mg/kg的抗PD-L1抗体(Tecentriq，RYUC-PL-00)，每周两次；组3接受3mg/kg的抗PD-L1抗体(RB0005)，每周两次；组4接受3.52mg/kg的PD-L1/VEGFRI融合抗体(46-24)，每周两次；组5接受11.72mg/kg的PD-L1/VEGFRI融合抗体(46-24)，每周两次；组6接受35.16mg/kg的PD-L1/VEGFRI融合抗体(46-24)，每周两次；组7接受3mg/kg的抗PD-L1抗体(RB0005)+1.56mg/kg的VEGFRI融合蛋白(136，序列如SEQ ID NO:19所示)联合用药，每周两次；组8接受10mg/kg的抗PD-L1抗体(RB0005)+5.19mg/kg的VEGFRI融合蛋白(136)，每周两次。每周检测体重两次以监测毒性。采用下式确定不同时间点的肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝1/2×长径×短径2。根据肿瘤生长情况来判断抗肿瘤功效。全部处理均良好耐受，小鼠体重无显著性变化(图7)。
不同处理对肿瘤生长的抑制作用如图8和图9所示，图8为小鼠的肿瘤体积统计结果，图9为抑瘤率统计结果。由图8和图9结果可知，本申请所述的PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白具有有效的抗肿瘤作用，给35.16mg/kgPD-L1/VEGFRI融合抗体组可显著抑制肿瘤生长(P<0.05)。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 瑞阳（苏州）生物科技有限公司
<120> 一种抗体融合蛋白及其应用
<130> 20201218
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr
1 5
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
Tyr Pro Gly Ser Gly Asn
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
His Gly Glu Leu Gly Gly Gly Tyr Phe Phe Asp Tyr
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<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
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Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Asn Ile His
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
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Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
1 5
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr
20 25 30
Ile Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Ile Arg Tyr Asn Glu Lys Ile
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Gly Glu Leu Gly Gly Gly Tyr Phe Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Asn Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
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<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr
20 25 30
Ile Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Ile Arg Tyr Asn Glu Lys Ile
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Gly Glu Leu Gly Gly Gly Tyr Phe Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 10
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Asn Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 11
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 11
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
<210> 12
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 12
Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met
1 5 10 15
Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn
20 25 30
Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp
35 40 45
Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn
50 55 60
Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn
65 70 75 80
Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr
85 90 95
Ile
<210> 13
<211> 564
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr
20 25 30
Ile Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Ile Arg Tyr Asn Glu Lys Ile
50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Ser Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile
465 470 475 480
Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr
485 490 495
Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu
500 505 510
Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile
515 520 525
Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala
530 535 540
Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln
545 550 555 560
Thr Asn Thr Ile
<210> 14
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 14
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Asn Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro
225 230 235 240
Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg
245 250 255
Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp
260 265 270
Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly
275 280 285
Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys
290 295 300
Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His
305 310 315 320
Arg Gln Thr Asn Thr Ile
325
<210> 15
<211> 1692
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 15
gaggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaaac ctggcgcctc cgtgaaggtg 60
agctgcaagg cctccggcta caccttcacc aagtacatca tccactgggt gcggcaagcc 120
cctggacagg gactggaatg gatgggctgg ttctaccctg gttctggcaa catccggtac 180
aacgagaaga tcaagggcag ggtgaccatg acccgggaca ccagcacctc caccgtgtac 240
atggagctgt cctccctgag gagcgaggac accgccgtgt attactgcgc taggcacgga 300
gagctgggcg gaggctactt cttcgactac tggggccagg gcacaaccgt gaccgtgtcc 360
tccgccagca ccaagggacc atccgtgttc ccactggctc caagctctaa atccactagc 420
ggaggcaccg cagccctggg atgtctggtg aaggattact tcccagagcc cgtcacagtg 480
tcatggaact ccggggctct gacctctggt gtccacacat ttccagcagt gctgcagagt 540
tcaggcctgt actccctgtc cagcgtggtc acagtgccct ctagttcact gggaactcag 600
acctatatct gcaacgtgaa tcacaagcca tccaatacta aagtcgacaa gaaagtggag 660
cccaagagct gtgataaaac acatacttgc cccccttgtc ctgcaccaga actgctggga 720
ggaccatccg tgttcctgtt tccacccaag cctaaagaca ctctgatgat ttctcgaaca 780
cccgaggtca cttgcgtggt cgtggacgtg tcccacgaag atcctgaagt caagtttaac 840
tggtacgtgg atggagtcga agtgcataat gctaagacaa aacctagaga ggaacagtac 900
gccagtacat atagagtcgt gtcagtcctg actgtgctgc atcaggactg gctgaacggg 960
aaggagtata agtgcaaagt gtccaataag gctctgcccg cacctatcga gaaaactatt 1020
agcaaggcta aaggccagcc tagggaacca caggtgtaca ccctgcctcc atctcgggag 1080
gaaatgacta agaaccaggt cagtctgacc tgtctggtga aaggcttcta tccttccgac 1140
atcgcagtgg agtgggaaag caatggacag ccagagaaca attacaagac cacaccccct 1200
gtgctggaca gcgatgggtc tttctttctg tatagtaagc tgaccgtgga taaatcacgg 1260
tggcagcagg gtaatgtctt ttcttgtagt gtgatgcacg aagccctgca caaccattac 1320
actcagaaat ccctgtcact gtcccctgga aagggcggcg gcggcagcgg cggcggcgga 1380
agcggaggcg gaggatccgg tcgtcccttc gtggagatgt acagcgagat ccccgagatc 1440
atccacatga ccgagggcag agagctggtg atcccttgtc gtgtgacaag ccccaacatc 1500
accgtgactt taaagaagtt ccctttagac actttaatcc ccgacggcaa gaggatcatc 1560
tgggactctc gtaagggctt catcatcagc aacgccacct acaaggagat cggtttactg 1620
acttgtgagg ccaccgtgaa cggccattta tacaagacca actatttaac ccatcgtcag 1680
accaacacca tc 1692
<210> 16
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 16
gatatccagc tgacccagag cccctccttt ctgtccgcct ccgtgggcga cagggtgacc 60
atcacctgca gggccagctc cagcgtgagc aacatccact ggtatcaaca gaagcctggc 120
aaggccccca agccctggat ctacgccacc tccaacctgg ccagcggcgt gcctagcagg 180
ttcagcggtt ctggctccgg caccgagttc accctgacca tctcctccct gcagcccgag 240
gacttcgcca cctactactg ccagcagtgg tccagcaacc ccctgacctt tggccagggc 300
accaagctgg agatcaagag gactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 360
gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 420
agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 480
agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 540
agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 600
agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgt 639
<210> 17
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 17
gaggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaaac ctggcgcctc cgtgaaggtg 60
agctgcaagg cctccggcta caccttcacc aagtacatca tccactgggt gcggcaagcc 120
cctggacagg gactggaatg gatgggctgg ttctaccctg gttctggcaa catccggtac 180
aacgagaaga tcaagggcag ggtgaccatg acccgggaca ccagcacctc caccgtgtac 240
atggagctgt cctccctgag gagcgaggac accgccgtgt attactgcgc taggcacgga 300
gagctgggcg gaggctactt cttcgactac tggggccagg gcacaaccgt gaccgtgtcc 360
tccgccagca ccaagggacc atccgtgttc ccactggctc caagctctaa atccactagc 420
ggaggcaccg cagccctggg atgtctggtg aaggattact tcccagagcc cgtcacagtg 480
tcatggaact ccggggctct gacctctggt gtccacacat ttccagcagt gctgcagagt 540
tcaggcctgt actccctgtc cagcgtggtc acagtgccct ctagttcact gggaactcag 600
acctatatct gcaacgtgaa tcacaagcca tccaatacta aagtcgacaa gaaagtggag 660
cccaagagct gtgataaaac acatacttgc cccccttgtc ctgcaccaga actgctggga 720
ggaccatccg tgttcctgtt tccacccaag cctaaagaca ctctgatgat ttctcgaaca 780
cccgaggtca cttgcgtggt cgtggacgtg tcccacgagg atcctgaagt caagtttaac 840
tggtacgtgg atggagtcga agtgcataat gctaagacaa aacctagaga ggaacagtac 900
aacagtacat atagagtcgt gtcagtcctg actgtgctgc atcaggactg gctgaacggg 960
aaggagtata agtgcaaagt gtccaataag gctctgcccg cacctatcga gaaaactatt 1020
agcaaggcta aaggccagcc tagggaacca caggtgtaca ccctgcctcc atctcgggag 1080
gaaatgacta agaaccaggt cagtctgacc tgtctggtga aaggcttcta tccttccgac 1140
atcgcagtgg agtgggaaag caatggacag ccagagaaca attacaagac cacaccccct 1200
gtgctggaca gcgatgggtc tttctttctg tatagtaagc tgaccgtgga taaatcacgg 1260
tggcagcagg gtaatgtctt ttcttgtagt gtgatgcacg aagccctgca caaccattac 1320
actcagaaat ccctgtcact gtcccctgga aag 1353
<210> 18
<211> 978
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 18
gatatccagc tgacccagag cccctccttt ctgtccgcct ccgtgggcga cagggtgacc 60
atcacctgca gggccagctc cagcgtgagc aacatccact ggtatcaaca gaagcctggc 120
aaggccccca agccctggat ctacgccacc tccaacctgg ccagcggcgt gcctagcagg 180
ttcagcggtt ctggctccgg caccgagttc accctgacca tctcctccct gcagcccgag 240
gacttcgcca cctactactg ccagcagtgg tccagcaacc ccctgacctt tggccagggc 300
accaagctgg agatcaagag gactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 360
gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 420
agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 480
agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 540
agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 600
agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtg gcggcggcgg cagcggcggc 660
ggcggaagcg gaggcggagg atccggtcgt cccttcgtgg agatgtacag cgagatcccc 720
gagatcatcc acatgaccga gggcagagag ctggtgatcc cttgtcgtgt gacaagcccc 780
aacatcaccg tgactttaaa gaagttccct ttagacactt taatccccga cggcaagagg 840
atcatctggg actctcgtaa gggcttcatc atcagcaacg ccacctacaa ggagatcggt 900
ttactgactt gtgaggccac cgtgaacggc catttataca agaccaacta tttaacccat 960
cgtcagacca acaccatc 978
<210> 19
<211> 339
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 19
Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met
1 5 10 15
Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn
20 25 30
Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp
35 40 45
Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn
50 55 60
Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn
65 70 75 80
Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr
85 90 95
Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
130 135 140
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
145 150 155 160
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
165 170 175
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr
180 185 190
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
195 200 205
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
210 215 220
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
225 230 235 240
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
245 250 255
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
260 265 270
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
275 280 285
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
290 295 300
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
305 310 315 320
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
325 330 335
Pro Gly Lys

Claims (6)

1.一种PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白，其特征在于，所述的PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白为抗PD-L1抗原结合蛋白和抗VEGFRI抗原结合蛋白；
所述的抗PD-L1抗原结合蛋白的重链序列为SEQ ID NO:9；所述的抗PD-L1抗原结合蛋白的轻链序列为SEQ ID NO:10；
所述的抗VEGFRI抗原结合蛋白为VEGFRI-D2，所述的VEGFRI-D2序列为SEQ ID NO:12；
所述的抗VEGFRI抗原结合蛋白与所述的抗PD-L1抗原结合蛋白的重链或轻链串联；所述的抗PD-L1抗原结合蛋白和抗VEGFRI抗原结合蛋白通过柔性接头串联连接，所述的柔性接头的序列为SEQ ID NO:11；
所述的PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白为以下两种之一：
（1）重链序列为SEQ ID NO:13和轻链序列为SEQ ID NO:10；
（2）重链序列为SEQ ID NO:9和轻链序列为SEQ ID NO:14。
2.编码权利要求1所述的PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白的核酸分子。
3.包含权利要求2所述的核酸分子的载体。
4.包含权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的载体的宿主细胞。
5.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包含权利要求1所述的PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的载体和/或权利要求4所述的宿主细胞及任选的药学上可接受的载体。
6.权利要求1所述的PD-L1/VEGFRI抗体融合蛋白、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的载体和/或权利要求4所述的宿主细胞在制备用于治疗与PD-L1/VEGFRI活性相关的疾病的药物、试剂盒和/或医疗装置中的应用；所述的疾病选自白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、非小细胞肺癌、胃癌、胰腺癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌、卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、黑色素瘤。
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