KR101773120B1 - 항―ｈｅｒ3 항체 및 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 HER3 (ErbB3)에 대해 유도된 신규한 치료용 재조합 항체뿐 아니라, 상기 재조합 항-HER3 항체들 중 적어도 2개의 혼합물을 포함하는 조성물, 및 암의 치료를 위한 항체 및 항체 조성물의 용도에 관한 것이다.

Description

항―ＨＥＲ3 항체 및 조성물{ANTI-HER3 ANTIBODIES AND COMPOSITIONS}
본 발명은 HER3 수용체를 표적으로 하는 신규한 재조합 항체 및 이러한 항체들 중 두 개 이상을 포함하는 인간암 치료에 사용되는 조성물에 관한 것이다.
EGFR 수용체 패밀리
표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 패밀리 (ErbB 패밀리로도 알려짐)는 수용체 티로신 키나제 (RTK)의 서브그룹이고 하기 4개의 멤버로 구성된다: HER1/EGFR/ErbB, HER2/ErbB2, HER3/ErbB3 및 HER4/ErbB4. EGFR 패밀리의 멤버는 세포외 리간드 결합 영역, 단일 막통과(transmembrane) 도메인 및 세포내 티로신 키나제를 갖는 밀접하게 관련된 단일-쇄 모듈의 당단백질이다 (Ferguson (2008) Annu Rev Biophys. 37: 353-373에서 개관됨). 정상적인 생리적 환경에서 ErbB 패밀리는 세포 성장, 분화 및 이동의 조정에 있어서 중요한 사건을 조절한다 (Citri et al. (2006) Nat Rev Mol Cell Biol. 7: 505-516). EGFR, HER2 및 HER3은 정상 세포의 악성 전환 및 암세포의 지속 성장 (전-생존 경로)에서 중대한 역할을 담당하는 것으로 여겨진다. EGFR 및 HER2는 다수의 상피암에 의해 과발현되는 것이 발견되었다 (Slamon et al. (1987) Science, 235: 177-182; Arteaga (2002) Oncologist 7 Suppl 4: 31-39; Bodey et al. (1997) Anticancer Res. 17: 1319-1330; Rajkumar et al. (1996) J Pathol. 179: 381-385). EGFR 및 HER2의 과발현은 게다가 여러 인간 상피암에서 질환 진행, 생존 감소, 반응 부족 및 화학요법 내성과 관련되었다 (Slamon et al. (1987) supra; Baselga et al. (2002) Oncologist 7 Suppl 4: 2-8).
HER3 구조
인간 표피 성장 인자 수용체 3 (HER3, ErbB3)으로 알려진 ErbB 패밀리의 세 번째 멤버는 1989년에 Kraus 등에 의해 확인되었다 (Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86: 9193-9197). HER3 유전자는 EGFR 및 HER2와 현저한 구조적 유사성을 지니는 1342개 아미노산의 단백질을 엔코딩한다. 전체 크기, 2개의 시스테인 클러스터(도메인 II 및 IV)를 갖는 4개의 세포외 서브도메인(I-IV), 및 티로신 키나제 도메인과 같은 특징은 EGFR 및 HER2와 구조적 유사성을 나타낸다 (Cho and Leahy (2002) Science, 297: 1330-1333). HER3의 티로신 키나제 도메인은 EGFR의 티로신 키나제 도메인과 59%의 서열 상동성을 나타낸다 (Brennan et al. (2000) Oncogene, 19: 6093-6101).
HER3 활성화의 조절
Neu 분화 인자 (NDF), 헤레귤린 (HRG) 및 뉴레귤린 1 (NRG1)은 HER3에 대한 리간드인 당단백질의 유의어이다 (Peles et al. (1992) Cell, 69: 205-216; Wen et al. (1992) Cell, 69: 559-572). NRG1 단백질의 15개 이상의 아이소형이 동정되었다. 아이소형은 대안적인 스플라이싱 및 다수의 프로모터를 통해 단일 NRG1 유전자로부터 생산된다 (Falls et al. (2003) Exp Cell Res, 284: 14-30). 3가지의 구조적 특징이 아이소형의 기능적 차이를 설명한다. 이러한 구조적 특징은 EGF-유사 도메인 (α 또는 β)의 유형, N-말단 서열 (유형 I, II 또는 III) 및 아이소형이 처음에 막통과 단백질 또는 비멤브레인 단백질로서 합성되었는지 여부이다 (Falls et al. (2003) supra). NRG1 아이소형의 유형 I 서브그룹은 독특한 N-말단 서열 다음에 면역글로불린-유사 도메인 그리고 이어서 EGF-유사 도메인을 지닌다. 유형 II 변이체는 N-말단 크링글(kringle)-유사 서열, 면역글로불린 도메인 및 EGF-유사 도메인을 함유한다. 유형 III 변이체는 시스테인-풍부 영역 내에 N-말단 소수성 도메인을 함유하고, 면역글로불린 도메인을 생략한 다음 EGF-유사 도메인 및 다양한 다운스트림 대체 엑손(downstream alternative exon)으로 이어진다. NRG1 아이소형은 EGF-유사 도메인 아래에 링커 서열, 막통과 도메인 및 세포질 테일을 함유할 수 있다 (Falls et al. (2003) supra). NRG1 아이소형 중 일부는 면역글로불린-유사 도메인과 EGF-유사 도메인 사이의 스페이서 영역에서 글리코실화된다 (Hayes et al. (2008) J Mammary Gland Biol Neoplasia, 13: 205-214).
EGFR의 경우와 같이, HER3는 계류(tethered) 형태 및 연장된 형태로 존재한다. 계류 형태에서 이합체화 아암(arm)은 도메인 I과 III을 능률적인 리간드 결합부와 매우 멀리 떨어지게 두면서, 도메인 IV와의 상호작용에 의해 숨겨진다 (Cho and Leahy et al. (2002) supra). 세포외 도메인 I 및 III에 대한 리간드 결합은 HER3의 연장된 형태에서 일어나서 HER2와 우선적으로 헤테로이합체화되는 연장되고 리간드-결합된 HER3 분자인 ErbB 패밀리의 다른 멤버 (또는 그 밖의 RTK 멤버, 예컨대 MET)와의 헤테로이합체화를 야기한다 (Pinkas-Kramarski et al. (1996) EMBO J, 15: 2452-2467). 리간드 결합시에 어떠한 HER3 호모이합체도 형성되지 않는다 (Ferguson et al. (2000) EMBO J, 19: 4632-4643).
EGFR 및 HER2와 대조적으로, HER3의 티로신 키나제는 어떠한 검출가능한 생물학적 반응에 충분치 않은 손상된 촉매 활성을 지닌다 (Pinkas-Kramarski et al. (1996) supra; Guy et al. (1994) Proc Natl Acad Sci USA, 91: 8132-8136). 단백질 키나제의 촉매 도메인에서 고도로 보존된 2개의 아미노산 잔기 (Hanks et al. (1988) Science, 241: 42-52)가 HER3의 촉매 도메인에서 변경된다. 이것은 잔기 815에서 아스파르트산 대신 아스파라긴의 치환 및 잔기 740에서 글루타메이트 대신 히스타민의 치환이다. 2개의 아미노산 치환은 HER3에서 이의 티로신 키나제 도메인의 촉매 활성이 결여된 이유일 수 있다 (Plowman et al. (1990) Proc Natl Acad Sci USA, 87: 4905-4909). HER3의 손상된 본질적인 키나제 활성으로 인해, 수용체는 그 고유의 리간드 결합에 반응하기 위해 또 다른 ErbB 패밀리 멤버와 헤테로이합체화될 필요가 있다 (Berger et al. (2004) FEBS Lett, 569: 332-336).
HER3 신호전달의 종료
HER3의 세포내이입에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 더욱이, 여러 연구들은 HER3이 HER2와 동일한 정도로 세포내이입 손상된다고 제안하였다 (Baulida et al. (1996) J Biol Chem, 271: 5251-5257). 이와 일치하여 HER3-NRG1 복합체는 EGFR-EGF 복합체보다 덜 효율적으로 느리게 내재화되는 것이 발견되었는데, 이는 HER3이 EGFR만큼 효율적으로 세포내이입되지 않음을 시사한다 (Baulida et al. (1997) Exp Cell Res, 232: 167-172; Waterman et al. (1999) EMBO J, 18: 3348-3358). 그러나, EGFR의 C-말단 테일이 HER3의 C-말단 테일로 대체되었을 때, EGFR은 세포내이입 손상되었는데, 이는 HER3의 C-말단에 있는 영역이 내재화에 대해 수용체를 보호함을 시사하는 것이다 (Waterman et al. (1999) supra). 또한 NRG1은, EGF가 TGFα에 의해 활성화되었을 때 관찰된 바와 같이, 엔도솜에서 리간드-수용체 복합체의 분리로 인해 분해되도록 HER3을 효율적으로 표적화하지 않음이 제안되었다 (Waterman et al. (1999) supra).
HER3 의 발현 및 생리적 역할
HER3은 EGFR 및 HER2와 같이 유선 발달에 중요한 것으로 나타났다 (Schroeder et al. (1998) Cell Growth Differ, 9: 451-464). EGFR 및 HER2가 사춘기 마우스 유선에서 고도로 발현되고 공동-국소화되는 한편, HER3은 처녀 마우스로부터의 사춘기후 유선에서 단지 낮은 수준으로 발현되나, 임신 및 수유 동안 보다 높은 수준으로 발현된다 (Schroeder et al. (1998) supra). 임신 및 수유 동안 보다 높은 수준의 HER3 발현은 유선 발달 및 분화의 후기 단계에서 HER3의 중요성을 내포한다 (Jackson-Fisher et al. (2008) Breast Cancer Res, 10: R96). HER3-결핍 마우스를 이용한 연구는 PI3K/AKT 신호전달 경로를 통한 유선 상피의 형태발생에 있어서 HER3의 조절 임무를 추가로 지적하였다 (Jackson-Fisher et al. (2008) supra). 그 밖의 연구는 임신 14-16일까지의 랫트에서 도관 상피 세포에 의한 높은 수준의 HER3 발현을 나타내었는데, 이는 또한 유선 상피의 형태발생에 있어서 HER3의 조절 임무를 입증하는 것이다 (Darcy et al. (2000) J Histochem Cytochem, 48: 63-80).
마우스에서 HER3 유전자의 표적화된 녹아웃은 혈액 환류로 인해 적절한 심장 기능을 지탱할 수 없게 된 발육부전의 심장 판막 때문에 13.5일에 배아 치사를 초래하였다 (Erickson et al. (1997) Development, 124: 4999-5011). 그 밖의 결함은 뇌 발달, 특히 소뇌를 포함하는 중간뇌 영역에서의 비정상, 및 감각 및 운동 신경의 말초 엑손의 슈반(Schwann) 세포에서의 심각한 결함을 포함한다 (Erickson et al. (1997) supra; Riethmacher et al. (1997) Nature, 389: 725-730).
시험관내 연구는 각질세포 (Marikovsky et al. (1995) Oncogene, 10: 1403-1411), 슈반 세포 전구체 (Syroid et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA, 93: 9229-9234), 올리고덴드로사이트 (Vartanian et al. (1997) J Cell Biol, 137: 211-220) 및 신경근 시냅스 (Zhu et al. (1995) EMBO J, 14: 5842-5848)의 발달에 있어서 HER2와 함께 HER3도 관련시켰다.
HER3의 조직 분포는 EGFR과 크게 다르지 않다 (www.proteinatlas.org). HER3의 손상된 키나제 활성에도 불구하고, 수용체는 PI3K/AKT 신호전달을 통해 ErbB 네트워크에서 필수적인 역할을 담당한다 (Citri et al. (2003) Exp Cell Res, 284: 54-65). 신호전달의 개시를 위한 헤테로이합체화의 요건 때문에, HER3의 생리적 역할은 전반적으로 EGFR 및 HER2에 대해 확인된 것과 유사할 수 있다. 그러나 HER3 녹아웃 마우스의 배아 치사 및 HER3 억제에 대한 빈약한 데이터로 인해, 성인에서 HER3의 정확한 역할은 알려져 있지 않다.
HER3 과 암
HER3은 ErbB 신호전달을 PI3K/AKT 신호전달 경로로 채널링하는 이의 능력에 있어서 독특한데, 이러한 능력은 종양 성장 및 진행을 촉진한다 (Prigent et al. (1994) EMBO J, 13: 2831-2841). 종양 성장의 조절에서 HER3의 중대한 역할은 또한 인간 유방암에서 HER2 과발현이 높은 수준의 HER3 발현과 종종 연관된다는 관찰에 의해 지지된다 (Naidu et al. (1998) Br J Cancer, 78: 1385-1390). 더욱이, HRG의 과발현은 형질전환 및 종양발생성을 증가시키는 반면 (Atlas et al. (2003) Mol Cancer Res, 1: 165-175), NRG의 봉쇄는 종양발생성 및 전이를 억제하는데 (Tsai et al. (2003) Oncogene, 22: 761-768), 이는 암 발달에서의 HER3 리간드의 존재의 중요성을 나타낸다.
세포 표면 상에 HER2 호모이합체의 존재 그리고 이에 의한 HER2 신호전달의 강조는 상피 세포의 형질전환을 일으킨다 (Yarden and Sliwkowski (2001) Nat Rev Mol Cell Biol, 2: 127-137에서 개관됨). 그러나 HER2-HER3 이합체는 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK) 및 AKT 경로 둘 모두를 통해 신호 형질도입을 유도하는 능력을 지닌다. MAPK 경로 및 AKT 경로 둘 모두의 활성화는 HER2 호모이합체에 비해 HER2-HER3 헤테로이합체의 추가적인 종양발생 가능성을 내포한다 (Citri et al. (2003)(supra)에서 개관됨).
HER3의 높은 발현은 유방암 외에 방광암 및 직장결장암을 포함하는, HER2를 과발현시키는 동일한 종양 유형들 중의 다수에서 발견된다 (Bodey et al. (1997) Anticancer Res, 17: 1319-1330; Rajkumar et al. (1996) J Pathol, 179: 381-385; Lemoine et al. (1992) Br J Cancer, 66: 1116-1121; Maurer et al. (1998) Hum Pathol, 29: 771-777). HER3 과발현과 임상적 성과 간의 연관성을 확립하려면 더 많은 연구가 필요하지만, 임상 정보는 HER2도 HER3도 암과 관련된 독립형 수용체로서 고려될 수 없다는 시험관내 연구로부터의 결과를 지지한다.
항- HER3 항체
다수의 항-HER3 항체가 문헌에 기재되어 있다. 참조: 예를 들어 WO 2011/060206, WO 2011/044311, WO 2011/022727, WO 2010/127181, WO 2008/100624, WO 2007/077028, WO 03/013602 및 WO 97/35885.
AMG 888 (Amgen/Daiichi Sankyo)은 인간 HER3 종양발생 신호전달을 억제한다고 전해지는 완전한 인간 모노클로날 항체이다. AMG 888은 암 치료를 위해 현재 임상 시험으로 조사중이다.
MM-121 (Merrimack Pharmaceuticals)은 HER3에 대한 헤레귤린 결합을 차단하여 HER3의 활성화를 차단한다고 전해지는 항-HER3 항체이다; 참조: WO 2010/019952 및 Schoeberl et al., Cancer Res. 70(6):2485-94, March 2010. MM-121 역시 암 치료를 위해 현재 임상 시험으로 조사중이다.
퍼투주맙은 HER3 및 그 밖의 EGFR 수용체에 대한 HER2의 이합체화를 억제하는 HER 이합체화 억제제로서 기능하는 항-HER2 항체이다. Franklin 등 (Cancer Cell 2004, 5(4):317-28)은 퍼투주맙이 도메인 II의 중심에 가까운 HER2에 결합하여, HER2-HER3 헤테로이합체화 및 신호전달에 필요한 결합 포켓을 입체적으로 차단한다고 기재하고 있다. 퍼투주맙의 아미노산 서열은 WO 2006/033700 및 US 2006/0121044 A1에 기재되어 있다.
특정 항-HER3 항체가 알려져 있고, 일부 경우 임상 시험으로 조사되고 있다는 사실에도 불구하고, 어떠한 항-HER3 항체도 현재 치료용으로 승인된 바 없다. 그로 말미암아, 상기 개요된 대로 종양 성장의 조절에 있어서 HER3의 중대한 역할에 비추어, HER3 수용체를 표적으로 하는 신규한 항체뿐 아니라 그러한 항-HER3 항체의 혼합물이 요구된다.
발명의 개요
본 발명은 HER3 수용체를 표적으로 하는 신규한 재조합 항체뿐 아니라 이러한 항체들 중 2개 이상을 포함하는 조성물 및 인간 암 치료, 예컨대 유방암, 난소암, 위암, 및 HER3을 발현 또는 과발현시키거나 HER3 경로 활성화의 조짐을 지니는 그 밖의 암(예컨대, NSCLC, 교모세포종)의 치료를 위한 항체 및 조성물의 용도에 관한 것이다. EGFR 패밀리의 다른 수용체에 대해 유도된 이용가능한 모노클로날 항체를 포함하는, 그러한 암에 대해 현재 이용가능한 치료에 비해, 본 발명의 항체는 단독으로 또는, 바람직하게는 2개 이상의 그러한 항체를 포함하는 조성물로, 그리고 임의로 화학요법과 같은 그 밖의 치료와 병용하여 양호한 임상 반응을 제공할 수 있을 것으로 고려된다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에서 항체 4785, 4889, 4935, 5038, 5082, 5101, 5106, 5143, 5144 및 5259로서 지칭된 항체에 기반한 신규한 재조합 항-HER3 항체 및 이의 인간화 및/또는 친화성-성숙된 변이체에 관한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 이러한 양태는 본원에서 항체 4785, 4889, 4935, 5038, 5082, 5101, 5106, 5143, 5144 및 5259로서 지칭된 항체들 중 어느 하나의 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 재조합 항-HER3 항체 분자에 관한 것이다.
본 발명의 이러한 양태의 추가의 구체예는 하기를 포함한다: 항체 4785, 4889, 4935, 5038, 5082, 5101, 5106, 5143, 5144 및 5259 중 어느 하나의 중쇄 CDR3 서열 및 경쇄 CDR3 서열을 포함하고, 상기 항체와 결합에 대해 경쟁하는 재조합 항-HER3 항체 분자; 이러한 항체들 중 어느 하나의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 재조합 항-HER3 항체 분자; 및 이러한 항체들 중 어느 하나의 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하거나, 이러한 항체들 중 어느 하나의 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열 각각에 90% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성, 예컨대 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성을 각각 지니는 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하고 상기 항체와 결합에 대해 경쟁하는 재조합 항-HER3 항체.
본 발명의 또 다른 양태는 적어도 제 1 및 제 2 재조합 항-HER3 항체를 포함하는 재조합 항체 조성물에 관한 것이고, 여기서 제 1 및 제 2 항체는 HER3의 별개의 에피토프에 결합하고, 제 1 및 제 2 항체 중 하나 또는 둘 모두는 상기 개요된 항체의 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 추가의 양태는 항암제에 컨쥬게이션된 본 발명의 재조합 항-HER3 항체를 포함하는 면역컨쥬게이트에 관한 것이다. 관련 양태는 적어도 본 발명의 제 1 및 제 2 재조합 항-HER3 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이고, 여기서 상기 조성물 중 하나 이상의 항-HER3 항체는 면역컨쥬게이트이다.
본 발명의 추가의 양태는 본 발명의 항-HER3 항체를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 지니는 핵산 분자뿐 아니라 그러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터로 트랜스펙션된 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 본 발명의 항체 및 폴리클로날 항체 조성물을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 본 발명의 항-HER3 항체 또는 조성물을 인간 또는 동물 피검체에게 투여함에 의해, 상기 피검체에서 질환을 치료하고, 특히 인간에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 관련 양태는 인간 또는 동물에서 질환을 치료하고, 특히 인간에서 암을 치료하는데 사용되는 약제를 제조하기 위한 본 발명의 하나 이상의 항-HER3 항체의 용도이다.
본 발명의 추가의 양태는 HER3을 발현시키거나 과발현시키는 세포를 본 발명의 재조합 항-HER3 항체 또는 면역컨쥬게이트 또는 재조합 항-HER3 항체 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 세포의 표면 상에서 HER3의 내재화를 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 양태 및 특정 구체예는 하기 상세한 설명 및 실시예로부터 자명할 것이다.
도 1-10은 상이한 농도의 지시된 항-HER3 항체로 96시간 동안 처리된 MDA-MB-175 세포의 대사 활성을 도시한다.
도 11은 지시된 항체로 전처리한 지 1시간 후에 10 nM 헤레귤린 베타로 자극시킨 세포주 MDA-MB-175 및 MCF7에서의 포스포-HER3 수준의 웨스턴 블롯 분석 결과를 도시한다.
도 12-15는 4개의 암 세포주에서의 선택된 2개의 항-HER3 항체의 혼합물의 대사 활성을 도시한다.
도 16-19는 4개의 암 세포주에서의 선택된 3개의 항-HER3 항체의 혼합물의 대사 활성을 도시한다.
도 20 및 21은 암 세포주 MDA-MB-175에서 2개의 혼합물들 중 개별적인 항체에 비해 2개의 항-HER3 항체의 두 상이한 혼합물들의 성장 억제 활성을 도시한다.
도 22 및 23은 2개의 암 세포주 MDA-MB-175 및 MCF7에서 참조 항체 MM-121 (항-HER3) 및 퍼투주맙 (항-HER2)에 비해 본 발명의 2개의 항-HER3 항체의 혼합물의 성장 억제 활성을 도시한다.
도 24는 개별적인 항-HER3 항체 5082 또는 5038 혹은 2개 항체의 혼합물로 처리된 OVCAR-8 세포의 전 세포(whole cell) 용해물내의 다양한 시점에서의 HER3 수준을 도시하는 웨스턴 블롯이다.
도 25는 개별적인 항-HER3 항체 5082 또는 5038 혹은 2개 항체의 혼합물에 의한 다양한 시점에서의 HER3 및 AKT의 인산화 억제를 도시하는, MDA-MB-175 세포의 전 세포 용해물 상에서 수행된 웨스턴 블롯이다.
도 26은 A549 폐암 이종이식 모델에서 개별적인 항-HER3 항체 5038 및 5082 그리고 5038+5082의 혼합물의 생체내 효능을 도시한다.
도 27-32는 코팅된 HER3 항원에 대한 음성 대조군 및 항체의 적정에 의한 항-HER3 항체의 도메인 맵핑(mapping)의 결과를 도시한다.
도 33은 항체 교차-경쟁 분석에 의한 항-HER3 항체의 에피토프 비닝(binning) 결과를 나타내는 표를 도시한다.
도 34는 항-HER3 항체에 대해 지정된 에피토프 저장소(bin)들 간의 관련성에 대한 그래픽 삽화이며, 여기서 겹쳐진 원은 중첩 에피토프를 갖는 항체를 나타낸다.
도 35는 종양 부피로서 표현된, BxPC3 췌장암 이종이식 모델에서 항-HER3 모노클로날 항체 5038 및 5082 그리고 5038+5082의 혼합물의 생체내 효능을 도시한다.
도 36은 생존 퍼센트로서 표현된, BxPC3 췌장암 이종이식 모델에서 항-HER3 모노클로날 항체 5038 및 5082 그리고 5038+5082의 혼합물의 생체내 효능을 도시한다.
정의
용어 "항체"는 "항체 분자"는 혈청의 기능성 성분을 기재하며, 이는 종종 분자의 집합물(항체 또는 면역글로불린) 또는 하나의 분자(항체 분자 또는 면역글로불린 분자)를 언급한다. 항체는 특정 항원성 결정인자(항원 또는 항원성 에피토프)에 결합하거나 이와 반응할 수 있고, 차례로 면역학적 효과기 메커니즘을 유도할 수 있다. 개별적 항체는 보통 단일특이성으로 간주되고, 항체들의 조성물은 모노클로날(즉, 동일한 항체 분자로 구성) 또는 폴리클로날(즉, 동일한 항원, 또는 심지어 별개의 상이한 항원 상의 동일하거나 상이한 에피토프와 반응하는 2개 이상의 상이한 항체들로 구성)일 수 있다. 각각의 항체는 이의 해당 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 독특한 구조를 갖고, 모든 천연 항체는 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄의 동일한 전체적인 기본 구조를 갖는다. 항체는 또한 집합적으로 면역글로불린으로 공지되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항체" 또는 "항체들"은 또한 키메라 및 단일 사슬 항체, 뿐만 아니라 항체의 결합 단편, 예를 들어, Fab, Fv 단편 또는 단일 쇄 Fv(scFv) 단편, 뿐만 아니라 다합체 형태, 예를 들어, 이합체 IgA 분자 또는 5가 IgM을 포함한다. 항체는 인간 또는 비-인간 기원의 것, 예를 들어 뮤린 또는 그 밖의 설치류-유래 항체, 또는, 예를 들어 뮤린 항체에 기반한 키메라, 인간화 또는 재형성된(reshaped) 항체일 수 있다.
항체의 각각의 중쇄는 전형적으로 중쇄 가변 영역 (VH) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 전형적으로 CH1, CH2 및 CH3으로 지칭되는 3개의 도메인을 포함한다. 각각의 항체 경쇄는 통상적으로 경쇄 가변 영역 (VL) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 통상적으로 CL로서 지칭되는 단일 도메인을 포함한다. VH 및 VL 영역은 과변이(서열 및/또는 구조적으로 정의된 루프에서 과변이될 수 있는 "과가변 영역")의 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 이들은 또한 프레임워크 영역 (FR)으로 명명된, 더욱 보존된 영역이 산재된 상보성 결정 영역 (CDR)으로도 지칭된다. 각각의 VH 및 VL은 전형적으로 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 하기 순서대로 정렬되는 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 가변 영역의 아미노산 잔기는 종종 케이뱃(Kabat) 넘버링 양식으로서 알려진 표준화된 넘버링 방법을 이용하여 넘버링된다 (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).
첨부된 서열 목록에서, 경쇄 (LC) DNA 및 아미노산 서열은 경쇄 가변 영역 (VL) 서열과 인간 카파 불변 영역 서열 둘 모두를 포함한다. 하기 실시예 1에 언급된 대로, 인간 카파 불변 영역은 아미노산 -TVAAP- (Thr Val Ala Ala Pro)로 시작하여 아미노산 -NRGEC (Asn Arg Gly Glu Cys)을 갖는 C-말단에서 끝난다. 따라서, 본원에서 사용되는 대로, 용어 "경쇄 가변 영역 서열" 또는 "VL"은 서열 목록에서 인간 카파 불변 영역의 시작부 앞에 있는 (즉, 아미노산 TVAAP 앞) 경쇄 서열의 N-말단부를 지칭하는 것으로 이해된다.
"항체 5082"와 같은 전 항체와 관련해서 본원에서 사용되는 항체 번호는 실시예에 기재되고 첨부된 서열 목록에 정의된 특수한 항체를 지칭한다. 예를 들어, 항체 5082는 SEQ ID NO:18에 개시된 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:44에 개시된 IGHG1 중쇄 불변 영역 서열을 포함하는 중쇄, 및 SEQ ID NO:20에 개시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 지니는 항체이고, 여기서 상기 설명된 대로 경쇄 서열은 경쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:20에서의 잔기 1-108) 및 인간 카파 불변 영역 서열 (SEQ ID NO:20에서의 잔기 109-214) 둘 모두를 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 명시된 항체로부터 "유래"되거나 항체에 "기반"한 항체를 포함하도록 의도되며, 여기서 그러한 항체는 특정 상황에 따라 하기 중 하나를 포함한다: 상기 명시된 항체의 중쇄 CDR3 서열; 상기 명시된 항체의 중쇄 CDR3 서열 및 경쇄 CDR3 서열; 상기 명시된 항체의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 그리고 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열; 또는 상기 명시된 항체의 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열, 또는 상기 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열의 인간화 및/또는 친화성 성숙된 변이체, 또는 개개의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 서열과 90% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성, 예컨대 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성을 지니는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 서열. 본원에 기재된 명시된 항체로부터 유래되거나 이에 기반한 항체는 일반적으로 상기 명시된 항체와 동일한 HER3 에피토프에 결합할 것이고 바람직하게는 상기 명시된 항체와 실질적으로 동일한 활성을 나타낼 것이다. 항체가 결합에 대해 상기 명시된 항체와 경쟁하는 경우 이러한 항체는 명시된 항체와 동일한 HER3 에피토프에 결합하는 것으로 간주된다.
주로 아미노산 잔기에 있는 표적 항원 잔기와 항체의 상호작용의 특이성은 중쇄 및 경쇄의 6개 CDR에 있다. 따라서 CDR내 아미노산 서열은 CDR의 밖에 있는 서열보다 개별적인 항체들 간에 훨씬 많이 가변적이다. CDR 서열이 대부분의 항체-항원 상호작용을 책임지므로, 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열로 그래프트된 특수한 항체로부터의 CDR 서열을 발현시키는 발현 벡터를 작제함에 의해 특수한 천연 발생 항체의 특징을 모방하는 재조합 항체, 또는 더욱 일반적으로 주어진 아미노산 서열을 지니는 임의의 특수한 항체를 발현시킬 수 있다. 결과적으로, 비-인간 항체를 "인간화"시킬 수 있고 더욱 실질적으로 원래 항체의 결합 특이성 및 친화성을 유지시킬 수 있다. 인간화에 대한 보다 상세한 논의가 하기에 제공된다.
"키메라 항체"는 이의 가장 넓은 의미에서 하나의 항체로부터의 하나 이상의 영역 및 하나 이상의 다른 항체로부터의 하나 이상의 영역을 함유하는 항체를 지칭한다. 본원에서 사용되는 "키메라 항체"는 일반적으로, 부분적으로는 인간 기원의 것이고 부분적으로는 비-인간 기원의 것인, 즉 비-인간 동물, 예를 들어 마우스 또는 그 밖의 설치류, 또는 닭과 같은 조류에서 일부 유래된 항체이다. 키메라 항체는 인간 항-항체 반응, 예컨대 뮤린 항체의 경우, 인간 항-마우스 항체 반응의 위험성을 감소시키는데 있어서 비-인간 항체보다 바람직하다. 전형적인 키메라 항체의 예는 가변 영역 서열이 마우스의 면역화로부터 유래된 뮤린 서열인 반면 불변 영역 서열이 인간인 것이다. 키메라 항체의 경우, 비-인간 부분, 즉 전형적으로 가변 영역 서열의 프레임워크 영역은 항체를 인간화하기 위해 추가로 변경될 수 있다.
용어 "인간화"는 항체가 전체적으로 또는 부분적으로 비-인간 기원의 것, 예를 들어 관심있는 항원으로 마우스를 면역화시켜 수득된 뮤린 항체 또는 그러한 뮤린 항체에 기반한 키메라 항체인 경우, 특히 중쇄 및 경쇄의 프레임워크 영역 및 불변 도메인에 있는 특정 아미노산을 대체시켜 인간에서 면역 반응을 회피하거나 최소화할 수 있다는 사실을 지칭한다. 모든 항체는 논의되고 있는 항체의 "인간화(humanness)" 정도와 어느 정도 관련되는 인간 항-항체 반응을 유도할 가능성을 지니는 것으로 알려져 있다. 비록 면역원성, 그리고 이에 의해 특정 항체의 인간 항-항체 반응을 정밀하게 예측할 수는 없지만, 비-인간 항체는 인간 항체보다 더욱 면역원성인 경향이 있다. 외래 (일반적으로 설치류) 불변 영역이 인간 기원의 서열로 대체된 키메라 항체는 완전한 외래 기원의 항체보다 일반적으로 덜 면역원성인 것으로 나타났고, 치료용 항체에서의 추세는 인간화 또는 완전한 인간 항체를 향하고 있다. 키메라 항체 또는 비-인간 기원의 그 밖의 항체의 경우, 그 결과로서, 이들을 인간화시켜 인간 항-항체 반응의 위험성을 감소시키는 것이 바람직하다.
키메라 항체의 경우, 인간화는 전형적으로 가변 영역 서열의 프레임워크 영역의 변형을 포함한다. 상보성 결정 영역 (CDR)의 일부인 아미노산 잔기는 통상적으로 인간화와 관련하여 변경되지 않을 것이나, 특정 경우에, 예를 들어 글리코실화 부위, 탈아미드화 부위 또는 요망되지 않는 시스테인 잔기를 제거하기 위해 개별적인 CDR 아미노산 잔기를 변경시키는 것이 바람직할 수 있다. N-결합된 글리코실화는 올리고사카라이드 사슬이 트리펩티드 서열 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr에서 아스파라긴 잔기에 부착함에 의해 일어나며, 여기서 X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있다. N-글리코실화 부위의 제거는 Asn 또는 Ser/Thr 잔기를, 바람직하게는 보존적 치환에 의해 상이한 잔기로 돌연변이시킴에 의해 달성될 수 있다. 아스파라긴 및 글루타민 잔기의 탈아미드화는 pH 및 표면 노출과 같은 요인에 의해 일어날 수 있다. 아스파라긴 잔기는 주로 서열 Asn-Gly에 존재할 때 특히 탈아미드화되기 쉽고, Asn-Ala과 같은 다른 디펩티드 서열에서는 적은 정도로 탈아미드화된다. 따라서, 그러한 탈아미드화 부위, 특히 Asn-Gly이 CDR 서열에 존재할 때, 전형적으로 관여된 잔기들 중 하나를 제거하기 위한 보존적 치환에 의해 그 부위를 제거하는 것이 바람직할 수 있다.
항체 서열을 인간화하는 많은 방법이 당 분야에 공지되어 있다; 참조: 예컨대, Almagro & Fransson (2008) Front Biosci. 13: 1619-1633에 의해 개관됨. 한 가지 일반적으로 사용되는 방법은, 예컨대 뮤린-유래된 키메라 항체의 경우 뮤린 가변 영역 유전자에 대한 인간 생식계열 유전자 대응부를 동정하고 뮤린 CDR 서열을 이러한 프레임워크로 그래프트하는 것을 포함하는 CDR 그래프팅이다. CDR 그래프팅은 케이뱃 CDR 정의에 기반할 수 있으나, 최근 간행물 (Magdelaine-Beuzelin et al. (2007) Crit Rev . Oncol Hematol. 64: 210-225)은 IMGT 정의 (www.imgt.org)가 인간화의 결과를 향상시킬 수 있음을 제안하였다. CDR 그래프팅이 CDR 그래프트된 비-인간 항체의 결합 특이성 및 친화성, 및 이에 따라 생물학적 활성을 감소시킬 수 있으므로, 복귀 돌연변이를 CDR 그래프트된 항체의 선택된 위치에 도입시켜 부모 항체의 결합 특이성 및 친화성을 유지시킬 수 있다. 가능한 복귀 돌연변이를 위한 위치의 확인은 문헌 및 항체 데이터베이스에서 이용가능한 정보를 이용하여 수행될 수 있다. 복귀 돌연변이의 후보인 아미노산 잔기는 전형적으로 항체 분자의 표면에 위치한 것들인 반면, 숨겨지거나 낮은 정도의 표면 노출을 지니는 잔기는 일반적으로 변경되지 않을 것이다. CDR 그래프팅 및 복귀 돌연변이에 대안적인 인간화 기법은 비-인간 기원의 표면 노출되지 않은 잔기를 유지하는 한편 표면 잔기를 인간 잔기로 변경시키는 리서피싱(resurfacing)이다.
특정 경우에, 표적 에피토프에 대한 결합 친화성을 향상시키기 위해 하나 이상의 CDR 아미노산 잔기를 변경시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 이것은 "친화성 성숙화"로 알려져 있고, 예를 들어 항체의 인간화가 감소된 결합 특이성 또는 친화성을 초래하고 복귀 돌연변이 단독에 의해 결합 특이성 또는 친화성을 충분히 향상시킬 수 없는 상황에서, 임의로 인간화와 함께 수행될 수 있다. 다양한 친화성 성숙화 방법, 예를 들어 문헌[Burks et al. (1997) PNAS USA, vol. 94, pp. 412-417]에 기재된 시험관내 스캐닝 포화 돌연변이발생 방법 및 문헌[Wu et al. (1998) PNAS USA, vol. 95, pp. 6037-6042]의 단계식 시험관내 친화성 성숙화 방법이 당 분야에 공지되어 있다.
상기 지시된 대로, 본 발명은 인간화 항체, 즉 달리 기재된 인간화된 항체를 포함한다. 이들은 또한 본 발명의 항체의 "인간화 변이체"로서 지칭될 수 있다. 특히, 임의의 특수한 아미노산 서열에 관해 본원에서 사용되는 용어 "중쇄 가변 영역 서열" 및 "경쇄 가변 영역 서열"은 특수한 서열뿐 아니라 이의 임의의 인간화 변이체도 포함하도록 의도된다. 본원에 기재된 항-HER3 항체의 친화성 성숙된 변이체도 본 발명에 포함시키고자 한다.
본원에서 이용되는 대로, 명시된 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역 서열에 비해 특정한 최소 수준의 서열 동일성, 예컨대, 참조 서열과 90% 이상 또는 95% 이상의 서열 동일성, 예컨대 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 서열 또는 경쇄 가변 영역 서열에 대한 언급은 그러한 참조 서열의 인간화 및/또는 친화성 성숙된 변이체를 포함하도록 의도되나, 이에 제한되지 않는다
용어 "재조합 항체"는 항체의 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터 (또는 가능하게는 1개를 초과하는 발현 벡터, 전형적으로 2개의 발현 벡터)로 트랜스펙션된 세포 또는 세포주로부터 발현되는 항체를 지칭하며, 여기서 상기 코딩 서열은 자연적으로는 세포와 관련이 없다.
용어 "벡터"는 상이한 유전적 환경들 간의 수송 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 핵산 서열이 삽입될 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 핵산 서열의 전사를 위한 조절 엘리먼트(적어도 적합한 프로모터)를 지니는 벡터를 "발현 벡터"로서 지칭한다. 용어 "플라스미드" 및" 벡터"는 상호교환적으로 이용될 수 있다. 본 발명에 관해 사용된 발현 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같이 당 분야에 공지된 임의의 적합한 유형의 것일 수 있다.
용어 "폴리클로날 항체" 또는 "[모노클로날] 항체들의 혼합물"은 동일하거나 상이한 항원 상에 있는 상이한 특이적 항원성 결정인자와 결합하거나 반응할 수 있는 2개 이상의 상이한 항체 분자들의 조성물을 지칭한다. 본 발명과 관련하여, 폴리클로날 항체의 개별적인 항체는 HER3의 상이한 항원성 결정인자에 결합한다. 바람직하게는 본 발명의 폴리클로날 항체의 개별적인 항체가 HER3의 상이한 에피토프, 더욱 바람직하게는 별개의 그리고 실질적으로 중첩되지 않은 에피토프에 결합한다. 폴리클로날 항체의 가변성은 일반적으로 항체 분자의 가변 영역에 있는 것으로 여겨진다. "재조합 폴리클로날 항-HER3 항체 조성물"은 HER3에 결합하는 2개 이상의 재조합 모노클로날 항체의 혼합물을 포함하는 조성물이다.
항체는 인간 아이소형 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2, 또는 뮤린 아이소형 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 및 IgA와 같은 상이한 아이소형으로서 존재하는 것이 당 분야에 널리 공지되어 있다. 본 발명의 항체는 어떠한 아이소형도 지닐 수 있다. 본 발명의 폴리클로날 항체 조성물의 개별적인 항체는 하나를 초과하는 아이소형의 항체를 포함할 수 있으나, 바람직하게는 이들은 모두 동일한 아이소형을 갖는다.
"적어도 제 1 및 제 2 재조합 항-HER3 항체"를 포함하는 재조합 항체 조성물은 명시된 항체들 중 적어도 2개를 포함할 것이나, 본원에 기재된 항-HER3 항체들 중 2개를 초과하는 항체를 포함할 수 있다. 특정 경우에, 그러한 재조합 항체 조성물은 비교적 많은 수의 개별적인 항-HER3 항체, 예컨대 10보다 큰 수 이하, 예컨대 15개 또는 20개 이하를 포함할 수 있으나, 일반적으로 10개 미만의 상이한 항-HER3 항체, 즉 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 항체를 포함할 것이다. 본 발명의 재조합 항체 조성물은 더욱 전형적으로 약 6개 이하의 상이한 항-HER3 항체를 포함할 것이고, 많은 경우에, 이들은 4개 이하의 상이한 항-HER3 항체를 포함할 것이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 재조합 항체 조성물은, 이에 따라, 2, 3 또는 4개의 상이한 항-HER3 항체, 전형적으로 2 또는 3개의 상이한 항-HER3 항체를 포함할 것이다.
용어 "CDR" 또는 "상보성 결정 영역"은 항체의 결합 특이성을 결정하는데 주로 책임이 있는 항체의 가변 도메인에서 발견되는 "과가변" 영역을 지칭한다. 참조: 문헌[Lefranc et al (2003), IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains, Dev . Comp Immunol. 27, 55-77]에서의 정의. 항체의 각각의 중쇄 및 경쇄는 CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 지칭되는 3개의 CDR 영역을 함유하는데, 그 중 CDR3이 가장 큰 가변성을 나타낸다.
용어 "에피토프"는 동물에서 항원성 또는 면역원성 활성을 갖는 큰 분자 (예컨대, 항원 또는 항원성 부위)의 일부를 기재하기 위해 사용된다. 면역원성 활성을 지니는 에피토프는 동물에서 항체 반응을 유도하는 큰 분자의 일부이다. 항원성 활성을 지니는 에피토프는 당 분야에 공지된 어떠한 방법에 의해 측정시 항체가 면역특이적으로 결합하는 큰 분자의 일부이다. 항원성 에피토프가 반드시 면역원성일 필요는 없다. 항원은, 독소, 바이러스, 박테리아, 단백질 또는 DNA와 같이, 항체 또는 항체 단편이 면역특이적으로 결합하는 물질이다. 항원 또는 항원성 부위는, 이것이 매우 작지 않은 한, 종종 하나를 초과하는 에피토프를 지니며, 자주 면역 반응을 자극시킬 수 있다. 에피토프는 선형이거나 입체형태일 수 있다. 선형 에피토프는 일반적으로 항체에 의해 인지되는 단백질 분자 상에 약 6 내지 10개의 인접 아미노산들로 구성된다. 대조적으로, 입체형태적 에피토프는 순차적으로 정렬되지 않지만, 항체가 특정 3차원 구조를 인지하는 경우의 아미노산들로 구성된다. 단백질 분자가 3차원 구조로 폴딩될 때, 에피토프를 형성하는 아미노산은 항체가 입체형태적 에피토프를 인지할 수 있도록 병렬연결된다. 변성된 단백질에서 선형 에피토프만이 인지된다. 입체형태적 에피토프는, 당연히, 폴딩된 단백질의 바깥에 있어야 한다.
용어 "별개의 에피토프"는 본 발명의 2개의 상이한 항체가 별개의 에피토프에 결합할 때, 항원 결합에 대해 100% 미만의 경쟁, 바람직하게는 항원 결합에 대해 80% 미만의 경쟁, 보다 바람직하게는 항원 결합에 대해 50% 미만의 경쟁, 가장 바람직하게는 가능한 한 적은 경쟁, 예컨대 항원 결합에 대해 약 25% 미만의 경쟁이 존재한다는 사실을 지칭한다. 동일한 항원과의 결합에 대해 서로 경쟁할 수 있는 항체는 동일한 에피토프 또는 중첩 에피토프에 결합할 수 있거나, 서로의 가까운 근접부에 결합 부위를 지닐 수 있어서, 경쟁이 주로 입체 장해에 의해 야기되게 한다. 항체 쌍의 "별개의 에피토프"에 대한 분석은, 예를 들어 HER3 및 개별적인 형광 표지된 항체를 발현시키는 세포 상에서 FACS (형광 활성화 세포 분류) 또는 그 밖의 유세포 분석을 이용하여 포화 항체 조건하에 결합 실험을 이용함으로써, 또는 흐름 세포 표면에 포획되거나 컨쥬게이션된 HER3 항원을 이용한 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해, 당 분야에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. SPR을 이용하여 항체들 간의 경쟁을 측정하는 방법은 하기 실시예 12에 기재되어 있다.
별개의 에피토프는, 본 발명의 조성물 중 2개의 상이한 항-HER3 항체가 항원 결합에 대해 충분히 낮게 경쟁하여 2개의 항체가 이들의 개개의 에피토프에 동시에 결합할 수 있다는 의미에서 "중첩되지 않는(non-overlapping)" 것이 바람직하다. 상이한 정도의 중첩이 존재할 수 있고, 어느 정도의 중첩이 존재함에도 불구하고 개별적인 항체가 이들의 에피토프에 실질적으로 결합할 수 있는 한 별개의 에피토프는 "중첩되지 않은" 것으로 고려될 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다. 이것은 항원 결합에 대한 2개의 항체들 간의 경쟁이 약 50% 미만일 때의 경우로서 일반적으로 고려된다.
유사하게, 본 발명의 항-HER3 항체와 "결합에 대해 경쟁하는" 항체는 항원 결합에 대해 약 50% 이상의 경쟁을 나타내는 것으로서 정의될 수 있다.
동일한 항원 상의 상이한 에피토프에 결합하는 항체는 에피토프의 위치에 따라 이들이 결합하는 항원의 활성에 다양한 영향을 미칠 수 있다. 항원의 활성 분위에서 에피토프에 결합하는 항체는 항원의 기능을 완전히 차단할 수 있는 반면, 상이한 에피토프에 결합하는 또 다른 항체는 항원 단독의 활성에 거의 또는 전혀 영향을 주지 않을 수 있다. 그러나, 이러한 항체는 여전히 보체를 활성화시킴으로써 항원을 제거시킬 수 있고, 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에서의 하나 이상의 항체 결합과 조합될 때 상승 효과를 발생시킬 수 있다. 본 발명에 관해, 에피토프는 HER3의 세포외 도메인의 부분인 것이 바람직하다. 본 발명의 항원은 바람직하게는 항체나 항체 단편이 면역특이적으로 결합하는 세포외 도메인 HER3 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 단편이다. HER3 관련 항원은 또한 항체나 항체 단편이 면역특이적으로 결합하는 HER3 폴리펩티드 또는 이의 단편의 세포외 도메인의 유사체 또는 유도체일 수 있다.
용어 "면역글로불린"은 혈액 또는 혈청에서 발견되는 항체의 혼합물의 집합적인 명칭으로서 일반적으로 사용되나, 그 밖의 공급원으로부터 유래되는 항체의 혼합물을 표기하는 데에도 이용될 수 있다.
용어 "동족체(cognate) VH 및 VL 코딩 쌍"은 동일한 항체 생산 세포 내에 함유되거나 이로부터 유래된 VH 및 VL 코딩 서열의 본래의 쌍을 기재한다. 따라서, 동족체 VH 및 VL 쌍은 상기 세포가 유래되는 공여체에 본래 존재하는 VH 및 VL 쌍이다. 용어 "VH 및 VL 코딩쌍으로부터 발현된 항체"는 항체 또는 항체 단편이 벡터, 플라스미드 또는 VH 및 VL 코딩 서열을 함유하는 그 밖의 폴리뉴클레오티드로부터 생성된 것을 나타낸다. 완전한 항체 또는 이의 안정적인 단편으로 동족체 VH 및 VL 코딩 쌍이 발현되는 경우, 이들은 이들이 유래되는 세포로부터 본래 발현되는 항체의 결합 친화성 및 특이성을 보존한다. 동족체 쌍의 라이브러리는 또한 동족체 쌍의 레퍼토리 또는 집합물을 언급하는 것이며, 이는 개별적으로 유지되거나 풀링될 수 있다.
"단백질" 또는 "폴리펩티드"는 길이 또는 번역후 변형에 관계 없는 임의의 아미노산 사슬을 의미한다. 단백질은 단량체 또는 다합체로 존재할 수 있고, 이는 2개 이상의 어셈블링된 폴리펩티드 사슬, 단백질, 폴리펩티드, 올리고펩티드, 또는 펩티드의 단편을 포함한다.
용어 "헤드-투-헤드(head-to-head) 프로모터" ("양-지향성(bi-directional) 프로모터"로도 알려짐)는 근접하게 위치하여 프로모터에 의해 구동되는 2개의 유전자 단편의 전사가 반대 방향으로 발생하는 프로모터 쌍을 지칭한다.
용어 "트랜스펙션"은 외래 DNA를 세포로 도입시키는 광범위한 용어로 본원에서 사용된다. 상기 용어는 또한 외래 DNA를 세포로 도입시키기 위한 다른 기능적으로 동등한 방법, 예를 들어, 형질전환, 감염, 형질도입, 또는 공여체 세포 및 수용체 세포의 융합을 포함하고자 한다.
용어 "HER3" (ErbB-3으로도 알려짐)은 "발명의 배경" 단락에서 상기 기재된 "인간 표피 성장 인자 수용체 3"을 뜻한다. 본원에서 사용되는 대로, 이것은 HER3의 변이체, 아이소형 및 종 상동체를 포함하고자 한다. 바람직하게는, HER3에 대한 본 발명의 항체의 결합은 HER3과 그 밖의 ErbB 패밀리 멤버 간의 헤테로머 복합체의 형성, 예컨대 HER2와의 헤테로이합체화를 억제시킴에 의해 HER3을 발현시키는 세포 (즉, 전형적으로 종양 세포)의 성장을 억제한다.
본원에서 사용되는 용어 "성장을 억제한다" (예컨대, 세포에 대해 언급됨)는 것은 항-HER3 항체의 부재시의 동일한 세포의 성장에 비해, 항-HER3 항체와 접촉시에 세포의 증식 (세포의 수에서의 증가) 또는 대사에서의 어떠한 측정가능한 감소, 예컨대 세포 배양 성장의 적어도 약 10%, 더욱 바람직하게는, 예컨대 적어도 약 20% 또는 30%, 보다 바람직하게는 적어도 약 40% 또는 50%, 예컨대 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 99% 또는 심지어 100%의 억제를 포함한다. 성장 억제는, 예컨대 하기 실시예에 기재된 관련 암 세포주에서 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "이합체화를 억제한다" 또는 "이합체 형성을 억제한다"는 것은 항-HER3 항체의 부재시의 이합체 형성에 비해 항-HER3 항체의 결합의 결과로서, 다른 수용체, 특히 HER2, 그러나 또한 EGFR 또는 HER4와 이합체를 형성하는 HER3의 능력에서의 어떠한 측정가능한 감소를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "치료"는 징후 또는 질병 상태를 완화, 감소, 개선 또는 근절(치유)하기에 충분한 양으로 본 발명의 항-HER3 항체 또는 항체 조성물을 투여하는 것을 의미한다. 일반적으로 본 발명의 2개 이상의 항-HER3 항체의 투여는, 바람직하게는 치료에 이용되는 모든 항-HER3 항체를 함유하는 조성물의 형태로, 항체를 동시 투여함에 의해서일 수 있다. 그러나, 본 발명의 2개 이상의 항-HER3 항체를 별도로 투여하는 것도 가능하다. 따라서, 본원에서 예컨대 2개 이상의 항-HER3 항체를 포함하는 재조합 항체 조성물을 투여하는 것에 대한 언급은 2개 이상의 항체를 이와 같이 포함하는 조성물의 투여뿐 아니라, 항체들의 분리된 투여도 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명의 2개 이상의 항-HER3 항체의 조합물은 동시에, 순차적으로 또는 별도로 투여될 수 있다.
2개의 서열들, 예컨대 가변 영역 서열들 간의 동일성 퍼센트는 2개 서열의 최적 정렬을 위해 도입되어야 하는 갭을 고려하여, 서열에 의해 공유된 동일한 위치의 수를 지칭한다 (동일한 위치의 # / 위치의 총 # × 100으로서 계산됨). 서열 비교 및 2개의 서열 간의 동일성 퍼센트의 결정은 용이하게 이용가능한 소프트웨어를 이용하여 수행될 수 있다. 적합한 소프트웨어 프로그램은 단백질과 뉴클레오티드 서열 둘 모두를 정렬하기 위해 온라인용과 다운로드용 둘 모두에 해당하는 다양한 공급원으로부터 이용가능하다. 하나의 적합한 프로그램은 www.clustal.org로부터 이용가능하거나, 대안적으로 다양한 다른 단백질 및 뉴클레오티드 인포메틱스 툴도 제공하는, 예컨대 European Bioinformatics Institute (www.ebi.ac.uk)로부터의 ClustalW (Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res. 11;22(22):4673-80)이다.
특정 구체예
본 발명의 일 양태는 다양한 새로운 항-HER3 항체에 관한 것이다. 따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 본원에서 항체 4785, 4889, 4935, 5038, 5082, 5101, 5106, 5143, 5144 및 5259로서 지칭되는 항체들 중 어느 하나의 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 재조합 항-HER3 항체에 관한 것이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체 4785, 4889, 4935, 5038, 5082, 5101, 5106, 5143, 5144 및 5259 중 어느 하나의 중쇄 CDR3 서열 및 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 재조합 항-HER3 항체에 관한 것이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체 4785, 4889, 4935, 5038, 5082, 5101, 5106, 5143, 5144 및 5259 중 어느 하나의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 그리고 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 재조합 항-HER3 항체에 관한 것이다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 항체 4785, 4889, 4935, 5038, 5082, 5101, 5106, 5143, 5144 및 5259 중 어느 하나의 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하거나, 상기 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 서열의 인간화 및/또는 친화성 성숙된 변이체를 포함하거나, 상기 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95%의 서열 동일성, 상기 서열과 예컨대 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 각각 지니고, 결합에 대해 상기 항체와 경쟁하는 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 재조합 항-HER3 항체에 관한 것이다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 상기 정의된 항체들 어느 것과 동일한 에피토프에 결합하고 결합에 대해 경쟁하는 재조합 항-HER3 항체뿐 아니라 그러한 항체들 중 하나 이상, 바람직하게는 2개 이상의 그러한 항체, 예컨대 2개 또는 3개의 본원의 다른 곳에 기재된 그러한 항체를 포함하는 항체 조성물에 관한 것이다.
하기 표 1은 항체 4785, 4889, 4935, 5038, 5082, 5101, 5106, 5143, 5144 및 5259의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 (LC)의 DNA 및 아미노산 서열에 대한, 첨부된 서열 목록에 개시된 서열 ID 번호를 나타낸다 (여기서, 상기 설명된 대로, 경쇄 서열은 경쇄 가변 영역 (VL) 서열 및 인간 카파 불변 영역 서열 둘 모두를 포함한다).
표 1: 선택된 항- HER3 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄의 DNA 및 아미노산 서열에 대한 서열 ID 번호
Figure 112013046896517-pct00001
또 다른 양태에서, 본 발명은 적어도 제 1 및 제 2 재조합 항-HER3 항체를 포함하는 재조합 항체 조성물에 관한 것이고, 여기서 제 1 및 제 2 항체는 HER3의 별개의 에피토프에 결합하고, 제 1 및 제 2 항체들 중 적어도 하나는 상기 개요된 항체의 군으로부터 선택되며, 예를 들어 조성물 중 항-HER3 항체들 둘 모두 또는 전부는 상기 개요된 항체의 군으로부터 선택된다.
따라서 본 발명의 이러한 양태의 한 구체예는 적어도 제 1 및 제 2 재조합 항-HER3 항체를 포함하는 재조합 항체 조성물에 관한 것이고, 여기서 제 1 및 제 2 항체는 HER3의 별개의 에피토프에 결합하고, 제 1 및 제 2 항체 각각은 항체 4785, 4889, 4935, 5038, 5082, 5101, 5106, 5143, 5144 및 5259로 구성된 군으로부터 선택되는 항체의 중쇄 CDR3 서열을 포함한다.
본 발명의 이러한 양태의 또 다른 구체예는 적어도 제 1 및 제 2 재조합 항-HER3 항체를 포함하는 재조합 항체 조성물에 관한 것이고, 여기서 제 1 및 제 2 항체는 HER3의 별개의 에피토프에 결합하고, 제 1 및 제 2 항체 각각은 항체 4785, 4889, 4935, 5038, 5082, 5101, 5106, 5143, 5144 및 5259로 구성된 군으로부터 선택되는 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR3 서열을 포함한다.
본 발명의 이러한 양태의 추가의 구체예는 적어도 제 1 및 제 2 재조합 항-HER3 항체를 포함하는 재조합 항체 조성물에 관한 것이고, 여기서 제 1 및 제 2 항체는 HER3의 별개의 에피토프에 결합하고, 제 1 및 제 2 항체 각각은 항체 4785, 4889, 4935, 5038, 5082, 5101, 5106, 5143, 5144 및 5259로 구성된 군으로부터 선택되는 항체의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 그리고 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다.
본 발명의 이러한 양태의 추가의 구체예는 적어도 제 1 및 제 2 재조합 항-HER3 항체를 포함하는 재조합 항체 조성물에 관한 것이고, 여기서 제 1 및 제 2 항체는 HER3의 별개의 에피토프에 결합하고, 제 1 및 제 2 항체 각각은 항체 4785, 4889, 4935, 5038, 5082, 5101, 5106, 5143, 5144 및 5259로 구성되는 군으로부터 선택된 항체의 중쇄 가변 영역 서열 또는 이의 인간화 및/또는 친화성 성숙된 변이체 및 경쇄 가변 영역 서열 또는 이의 인간화 및/또는 친화성 성숙된 변이체를 포함하거나; 제 1 및 제 2 항체 각각은 항체 4785, 4889, 4935, 5038, 5082, 5101, 5106, 5143, 5144 및 5259로 구성되는 군으로부터 선택된 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 서열 각각과 적어도 90% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성, 예컨대 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 각각 지니는 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하고, 제 1 및 제 2 항체는 이들이 유래되는 개개의 항체와 결합에 대해 경쟁한다.
특정 구체예는 HER3의 별개의 에피토프에 결합하는 적어도 제 1 및 제 2 재조합 항-HER3 항체를 포함하는 항체 조성물이고; 여기서,
a) 제 1 재조합 항체는 항체 4785, 4889, 4935, 5038, 5082, 5101, 5106, 5143, 5144 및 5259로부터 선택되는 어느 하나의 참조 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 서열과 적어도 90% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성, 예컨대 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 각각 지니는 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하고, 제 1 재조합 항체는 상기 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하고 결합에 대해 이와 경쟁하며;
b) 제 2 재조합 항체는 항체 4785, 4889, 4935, 5038, 5082, 5101, 5106, 5143, 5144 및 5259로부터 선택되는 어느 하나의 참조 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 서열과 적어도 90% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성, 예컨대 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 각각 지니는 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하고, 상기 참조 항체는 a)의 참조 항체와 다르며, 제 2 재조합 항체는 상기 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하고 결합에 대해 이와 경쟁한다.
또한 본 발명의 이러한 양태의 추가의 구체예는 적어도 제 1 및 제 2 재조합 항-HER3 항체를 포함하는 재조합 항체 조성물이고, 여기서 제 1 및 제 2 항체는 HER3의 별개의 에피토프에 결합하고, 제 1 및 제 2 항체는 항체 4785, 4889, 4935, 5038, 5082, 5101, 5106, 5143, 5144 및 5259, 또는 이의 인간화 및/또는 친화성 성숙된 변이체로 구성되는 군으로부터 선택된다.
또한 본 발명의 이러한 양태의 추가의 구체예는 적어도 제 1 및 제 2 재조합 항-HER3 항체를 포함하는 재조합 항체 조성물이고, 여기서 제 1 및 제 2 항체는 HER3의 별개의 에피토프에 결합하고, 제 1 및 제 2 항체는 항체 4785, 4889, 4935, 5038, 5082, 5101, 5106, 5143, 5144 및 5259와 동일한 에피토프에 결합하며 결합에 대해 이들과 경쟁하는 항체들로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 이러한 양태의 추가의 구체예는 HER3의 별개의 에피토프에 결합하는 적어도 제 1 및 제 2 재조합 항-HER3 항체를 포함하는 항체 조성물이고, 여기서 상기 항체들 중 하나 이상은,
(a) 항체 4785의 중쇄 CDR3 서열 및 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체;
(b) 항체 4889의 중쇄 CDR3 서열 및 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체;
(c) 항체 4935의 중쇄 CDR3 서열 및 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체;
(d) 항체 5038의 중쇄 CDR3 서열 및 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체;
(e) 항체 5082의 중쇄 CDR3 서열 및 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체;
(f) 항체 5101의 중쇄 CDR3 서열 및 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체;
(g) 항체 5106의 중쇄 CDR3 서열 및 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체;
(h) 항체 5143의 중쇄 CDR3 서열 및 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체;
(i) 항체 5144의 중쇄 CDR3 서열 및 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체; 및
(j) 항체 5259의 중쇄 CDR3 서열 및 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체로 구성되는 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 상기 제 1 및 제 2 재조합 항-HER3 항체 둘 모두는 상기 개시된 항체 (a)-(j)로부터 선택된다. 조성물은 또한 적어도 제 3 재조합 항-HER3 항체, 바람직하게는 상기 항체 (a)-(j)로부터 선택되는 항체를 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 항체 조성물은 HER3의 별개의 에피토프에 결합하는 적어도 제 1 및 제 2 재조합 항-HER3 항체를 포함할 수 있고, 상기 제 1 및 제 2 항체 각각은 상기 개시된 항체 (a)-(j) 중 어느 하나와 동일한 에피토프에 결합하고 결합에 대해 이와 경쟁한다.
또한 본 발명의 이러한 양태의 추가의 구체예는 HER3의 별개의 에피토프에 결합하는 적어도 제 1 및 제 2 재조합 항-HER3 항체를 포함하는 항체 조성물이고, 여기서 상기 항체들 중 적어도 하나는,
(A) 항체 4785의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 그리고 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체;
(B) 항체 4889의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 그리고 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체;
(C) 항체 4935의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 그리고 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체;
(D) 항체 5038의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 그리고 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체;
(E) 항체 5082의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 그리고 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체;
(F) 항체 5101의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 그리고 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체;
(G) 항체 5106의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 그리고 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체;
(H) 항체 5143의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 그리고 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체;
(I) 항체 5144의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 그리고 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체; 및
(J) 항체 5259의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 그리고 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체로 구성되는 군으로부터 선택된다.
이러한 구체예에서, 상기 제 1 및 제 2 재조합 항-HER3 항체 둘 모두는 바람직하게는 상기 개시된 항체 (A)-(J)로부터 선택된다. 조성물은 또한 적어도 제 3 재조합 항-HER3 항체, 바람직하게는 상기 항체 (A)-(J)로부터 선택되는 항체를 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 항체 조성물은 HER3의 별개의 에피토프에 결합하는 적어도 제 1 및 제 2 재조합 항-HER3 항체를 포함할 수 있고, 상기 제 1 및 제 2 항체 각각은 상기 개시된 항체 (A)-(J) 중 어느 하나와 동일한 에피토프에 결합하고 결합에 대해 이와 경쟁한다.
본 발명의 이러한 양태의 한 특정 구체예는 적어도 제 1 및 제 2 재조합 항-HER3 항체를 포함하는 재조합 항체 조성물에 관한 것이고, 여기서 제 1 및 제 2 항체는 결합에 대해 항체 5082 및 5106과 각각 경쟁하며, 제 1 및 제 2 항체는 다음과 같다:
· 항체 5082 및 5106, 또는 이의 인간화 및/또는 친화성 성숙된 변이체;
· 항체 5082의 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체, 및 항체 5106의 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체;
· 항체 5082의 중쇄 및 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체, 및 항체 5106의 중쇄 및 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체;
· 항체 5082의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체, 및 항체 5106의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체;
· 항체 5082의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체, 및 항체 5106의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체; 또는
· 항체 5082의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열 각각과 적어도 90%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 각각 지니는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체, 및 항체 5106의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열 각각과 적어도 90%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 각각 지니는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체.
또 다른 그러한 구체예는 적어도 제 1 및 제 2 재조합 항체를 포함하는 재조합 항체 조성물에 관한 것이고, 여기서 제 1 및 제 2 항체는 결합에 대해 항체 5082 및 4785와 각각 경쟁하며, 제 1 및 제 2 항체는 다음과 같다:
· 항체 5082 및 4785, 또는 이의 인간화 및/또는 친화성 성숙된 변이체;
· 항체 5082의 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체, 및 항체 4785의 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체;
· 항체 5082의 중쇄 및 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체, 및 항체 4785의 중쇄 및 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체;
· 항체 5082의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체, 및 항체 4785의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체;
· 항체 5082의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체, 및 항체 4785의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체; 또는
· 항체 5082의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열 각각과 적어도 90%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 각각 지니는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체, 및 항체 4785의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열 각각과 적어도 90%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 각각 지니는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체.
또 다른 그러한 구체예는 적어도 제 1 및 제 2 재조합 항체를 포함하는 재조합 항체 조성물에 관한 것이고, 여기서 제 1 및 제 2 항체는 결합에 대해 항체 5082 및 5038과 각각 경쟁하며, 제 1 및 제 2 항체는 다음과 같다:
· 항체 5082 및 5038, 또는 이의 인간화 및/또는 친화성 성숙된 변이체;
· 항체 5082의 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체, 및 항체 5038의 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체;
· 항체 5082의 중쇄 및 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체, 및 항체 5038의 중쇄 및 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체;
· 항체 5082의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체, 및 항체 5038의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체;
· 항체 5082의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체, 및 항체 5038의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체; 또는
· 항체 5082의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열 각각과 적어도 90%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 각각 지니는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체, 및 항체 5038의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열 각각과 적어도 90%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 각각 지니는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체.
또 다른 그러한 구체예는 적어도 제 1 및 제 2 재조합 항체를 포함하는 재조합 항체 조성물에 관한 것이고, 여기서 제 1 및 제 2 항체는 결합에 대해 항체 5082 및 5144와 각각 경쟁하며, 제 1 및 제 2 항체는 다음과 같다:
· 항체 5082 및 5144, 또는 이의 인간화 및/또는 친화성 성숙된 변이체;
· 항체 5082의 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체, 및 항체 5144의 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체;
· 항체 5082의 중쇄 및 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체, 및 항체 5144의 중쇄 및 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체;
· 항체 5082의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체, 및 항체 5144의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체;
· 항체 5082의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체, 및 항체 5144의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체; 또는
· 항체 5082의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열 각각과 적어도 90%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 각각 지니는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체, 및 항체 5144의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열 각각과 적어도 90%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 각각 지니는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체.
또 다른 그러한 구체예는 적어도 제 1 및 제 2 재조합 항체를 포함하는 재조합 항체 조성물에 관한 것이고, 여기서 제 1 및 제 2 항체는 결합에 대해 항체 4889 및 5143과 각각 경쟁하며, 제 1 및 제 2 항체는 다음과 같다:
· 항체 4889 및 5143, 또는 이의 인간화 및/또는 친화성 성숙된 변이체;
· 항체 4889의 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체, 및 항체 5143의 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체;
· 항체 4889의 중쇄 및 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체, 및 항체 5143의 중쇄 및 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체;
· 항체 4889의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체, 및 항체 5143의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체;
· 항체 4889의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체, 및 항체 5143의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체; 또는
· 항체 4889의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열 각각과 적어도 90%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 각각 지니는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체, 및 항체 5143의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열 각각과 적어도 90%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 각각 지니는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체.
또 다른 그러한 구체예는 적어도 제 1 및 제 2 재조합 항체를 포함하는 재조합 항체 조성물에 관한 것이고, 여기서 제 1 및 제 2 항체는 결합에 대해 항체 4785 및 5038과 각각 경쟁하며, 제 1 및 제 2 항체는 다음과 같다:
· 항체 4785 및 5038, 또는 이의 인간화 및/또는 친화성 성숙된 변이체;
· 항체 4785의 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체, 및 항체 5038의 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체;
· 항체 4785의 중쇄 및 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체, 및 항체 5038의 중쇄 및 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체;
· 항체 4785의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체, 및 항체 5038의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체;
· 항체 4785의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체, 및 항체 5038의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체; 또는
· 항체 4785의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열 각각과 적어도 90%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 각각 지니는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체, 및 항체 5038의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열 각각과 적어도 90%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 각각 지니는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체.
또 다른 그러한 구체예는 적어도 제 1 및 제 2 재조합 항체를 포함하는 재조합 항체 조성물에 관한 것이고, 여기서 제 1 및 제 2 항체는 결합에 대해 항체 4785 및 5259와 각각 경쟁하며, 제 1 및 제 2 항체는 다음과 같다:
· 항체 4785 및 5259, 또는 이의 인간화 및/또는 친화성 성숙된 변이체;
· 항체 4785의 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체, 및 항체 5259의 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체;
· 항체 4785의 중쇄 및 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체, 및 항체 5259의 중쇄 및 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체;
· 항체 4785의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체, 및 항체 5259의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체;
· 항체 4785의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체, 및 항체 5259의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체; 또는
· 항체 4785의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열 각각과 적어도 90%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 각각 지니는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체, 및 항체 5259의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열 각각과 적어도 90%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 각각 지니는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체.
또 다른 그러한 구체예는 적어도 제 1 및 제 2 재조합 항체를 포함하는 재조합 항체 조성물에 관한 것이고, 여기서 제 1 및 제 2 항체는 결합에 대해 항체 5106 및 4889와 각각 경쟁하며, 제 1 및 제 2 항체는 다음과 같다:
· 항체 5106 및 4889, 또는 이의 인간화 및/또는 친화성 성숙된 변이체;
· 항체 5106의 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체, 및 항체 4889의 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체;
· 항체 5106의 중쇄 및 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체, 및 항체 4889의 중쇄 및 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체;
· 항체 5106의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체, 및 항체 4889의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체;
· 항체 5106의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체, 및 항체 4889의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체; 또는
· 항체 5106의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열 각각과 적어도 90%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 각각 지니는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체, 및 항체 4889의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열 각각과 적어도 90%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 각각 지니는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체.
하기 표 2 및 3은 본 발명에 따른 다양한 항-HER3 항체의 중쇄 (표 2) 및 경쇄 (표 3)의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열을 나타낸다. 이러한 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄의 아미노산 서열뿐 아니라 엔코딩 DNA 서열 (CHO 세포에서 발현에 최적화됨)이 첨부된 서열 목록에서 제공된다. 이러한 서열에 대한 SEQ ID 번호의 개관에 대해서는 상기 표 1을 참조하라.
표 2: 선택된 항- HER3 항체의 중쇄 CDR1 , CDR2 및 CDR3 서열
Figure 112013046896517-pct00002
표 3: 선택된 항- HER3 항체의 경쇄 CDR1 , CDR2 및 CDR3 서열
Figure 112013046896517-pct00003
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 항체, 즉 항체 4785, 4889, 4935, 5038, 5082, 5101, 5106, 5143, 5144 및 5259로 구성되는 군으로부터 선택된 항체, 또는 이의 인간화 및/또는 친화성 성숙된 변이체를 엔코딩하거나; 그러한 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 서열, 또는 그러한 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 서열과 적어도 90% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성, 예컨대 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 지니는 중쇄 및/또는 경쇄 서열을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명의 이러한 양태의 한 구체예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37 또는 39로 구성되는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나와 동일한 아미노산 서열을 엔코딩하는 서열을 포함한다.
본 발명의 추가의 양태는 상기 정의된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다. 상기 지시된 대로, 본 발명과 관련하여 사용되는 발현 벡터는 당 분야에 공지된 임의의 적합한 유형의 벡터, 예컨대 플라스미드 또는 바이러스 벡터일 수 있다.
또한 본 발명의 추가의 양태는 상기 정의된 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이고, 여기서 상기 숙주 세포는 상기 핵산 분자에 의해 엔코딩되는 항-HER3 항체를 발현시킬 수 있다.
추가의 양태에서, 본원에 기재된 어떠한 2개의 개별적인 항체들의 결합 특이성은 하나의 이중특이적 결합 분자에서 조합될 수 있다. 그러한 이중특이적 결합 분자는 바람직하게는 2개의 선택된 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다. 이중특이적 결합 분자는 2중 가변 도메인 항체일 수 있고, 즉, 항체의 2개의 아암은 2개의 상이한 가변 도메인을 포함하거나, 이중특이적 Fab 단편 또는 이중특이적 scFv와 같은 항체 단편의 형태일 수 있다.
항- HER3 항체 및 항체 조성물의 생산
본 발명의 추가의 양태는 본 발명의 항-HER3 항체 또는 항-HER3 항체의 혼합물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 양태의 한 구체예는 항-HER3 항체를 발현시킬 수 있는 상기 정의된 숙주 세포를 제공하는 단계, 상기 숙주 세포를 항체를 발현시키기에 적합한 조건하에 배양시키는 단계, 및 생성된 항체를 분리시키는 단계를 포함하는, 본원에 정의된 항-HER3 항체를 생산하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 각각 재조합 항-HER3 항체를 발현시킬 수 있는 적어도 제 1 숙주 세포 및 제 2 숙주 세포를 제공하는 단계, 제 1 및 제 2 숙주 세포를 제 1 및 제 2 항체를 발현시키기에 적합한 조건하에 배양시키는 단계, 및 생성된 제 1 및 제 2 항체를 분리시키는 단계를 포함하는, 본원에 기재된 적어도 제 1 및 제 2 재조합 항-HER3 항체를 포함하는 재조합 항-HER3 항체의 혼합물을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 항체 또는 항체 조성물은 재조합 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 생산하기 위해 당 분야에 일반적으로 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 따라서, 본 발명의 단일 항체를 생산하는 경우에, 재조합 모노클로날 항체를 생산하기 위해 당 분야에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 본 발명의 2개 이상의 항-HER3 항체를 포함하는 항체 조성물을 생산하기 위해서, 개별적인 항체들은 별도로 생산될 수 있고, 즉 각각의 항체는 분리된 바이오반응기에서 생산되거나, 개별적인 항체들은 단일 바이오반응기에서 함께 생산될 수 있다. 조성물에 있는 상이한 항체들의 수가, 예컨대 2개 또는 3개를 초과하는 경우, 이것은 일반적으로 바람직하게는 단일 바이오반응기에서 항체들을 함께 생산하기 위한 비용 효율성의 이유 때문일 것이다. 또 한편으로는, 조성물이 단지 소수의 상이한 항체, 예컨대 2개, 3개 또는 가능하게는 4개의 상이한 항체를 함유하는 경우, 이들을 상이한 바이오반응기에서 별도로 또는 단일 바이오반응기에서 함께 생산할지에 대한 판단은 개개의 환경에 기반하여 이루어져야 할 것이다. 항체 조성물이 하나를 초과하는 바이오반응기에서 생산되는 경우, 정제된 항-HER3 항체 조성물은 각각의 바이오반응기로부터 개별적으로 정제된 상층액에서 수득된 항체들을 풀링시킴에 의해 얻어질 수 있다. 세포주 또는 항체 제조물이 이후 시점에 업스트림에서 또는 다운스트림 프로세싱 이전이나 그 동안에 조합되는 경우, 다수의 바이오반응기에서 폴리클로날 항체 조성물을 생산하기 위한 다양한 접근법이 WO 2009/129814호 (참조로서 포함됨)에 기재되어 있다.
2개 이상의 개별적인 항체를 단일 바이오반응기에서 생산하는 경우, 이것은, 예컨대 WO 2004/061104호 또는 WO 2008/145133호 (둘 모두는 본원에 참조로서 포함된다)에 기재된 대로 수행될 수 있다. WO 2004/061104호에 기재된 방법은 항체 코딩 서열의 개별적 숙주 세포의 유전체로의 부위-특이적인 통합에 기초하며, VH 및 VL 단백질 사슬이 생산 동안 이들의 원래 페어링으로 유지되는 것을 보장한다. 또한, 부위-특이적인 통합은 위치 효과를 최소화하므로 폴리클로날 세포주에서 개별적 세포의 성장 및 발현 특성은 거의 유사할 것으로 예상된다. 일반적으로, 상기 방법은 하기를 포함한다: ⅰ) 하나 이상의 리콤비나제(recombinase) 인지 부위를 갖는 숙주 세포; ⅱ) 숙주 세포와 양립하는 하나 이상의 리콤비나제 인지 부위를 갖는 발현 벡터; ⅲ) 선택된 VH 및 VL 코딩 쌍을 스크리닝 벡터에서 발현 벡터로 이동시켜 발현 벡터의 집합물을 생성함으로써 전장 항체 또는 항체 단편이 벡터로부터 발현될 수 있도록 함(이러한 이동은 스크리닝 벡터가 발현 벡터와 동일한 경우에는 필요하지 않을 수 있다); ⅳ) 숙주 세포를 발현 벡터의 집합물, 및 숙주 세포의 유전체에 있는 리콤비나제 인지 부위를 벡터에 있는 것과 조합시킬 수 있는 리콤비나제를 코딩하는 벡터로 트랜스펙션; ⅴ) 트랜스펙션된 숙주 세포로부터 폴리클로날 세포주 수득/생성; 및 ⅵ) 폴리클로날 세포주로부터 항체 조성물의 발현 및 수집.
WO 2008/145133호는 단일 바이오반응기에서 2개 이상의 상이한 항체를 생산하기 위한 대안적인 접근법을 기재한다. 이러한 방법은 a) 발현 벡터의 세트로서, 상기 벡터들 각각이 폴리클로날 단백질의 별개의 멤버를 엔코딩하는 별개의 핵산의 하나 이상의 복사체(copy)를 포함하는 발현 벡터의 세트를 제공하고, 세포의 유전체로의 발현 벡터의 부위-특이적인 통합을 회피하는 조건하에 숙주 세포를 각각의 발현 벡터로 별도로 트랜스펙션시킴으로써, 세포의 2개 이상의 조성물로서, 각각의 조성물이 폴리클로날 단백질의 한 별개의 멤버를 발현시키는 세포의 2개 이상의 조성물을 수득하고, c) 세포의 적어도 2개의 조성물을 혼합시켜 폴리클로날 세포주를 수득함에 의해, 2개 이상의 별개의 멤버를 포함하는 폴리클로날 항체 또는 그 밖의 폴리클로날 단백질을 발현시킬 수 있는 폴리클로날 세포주를 생성하는 것을 포함한다. WO 2004/061104호 및 WO 2008/145133호의 두 방법 모두는 재조합 폴리클로날 항체를 구성하는 모든 멤버가 단일 바이오반응기에서 생산되고 단일 공정으로 정제될 수 있게 함으로써, 각각의 항체에 대해 분리된 생산 및 정제 공정이 필요하지 않으면서 놀랍게도 동시에 상이한 항체를 균일하게 생산할 수 있다는 이점을 가진다. WO 2008/145133호의 방법은 증가된 수율을 제공하는 이점을 추가로 지니는데, 그 이유는 각각의 생산 세포가 특정 항체를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드의 다수의 복사체를 지닐 수 있기 때문이다.
본 발명의 항체는 포유동물 세포뿐 아니라 비-포유동물 진핵생물 또는 원핵생물 세포, 예컨대 식물 세포, 곤충 세포, 효모 세포, 균류, 대장균(E. coli) 등을 포함하는 다양한 유형의 세포에서 생산될 수 있다. 그러나, 항체는 CHO 세포, COS 세포, BHK 세포, 골수종 세포(예를 들어, Sp2/0 또는 NS0 세포)와 같은 포유동물 세포, NIH 3T3와 같은 섬유모세포, 또는 HeLa 세포, HEK 293 세포 또는 PER.C6 세포와 같은 무한증식(immortalized) 인간 세포에서 생산되는 것이 바람직하다.
핵산 서열을 숙주 세포에 트랜스펙션시키는 방법은 당 분야에 널리 알려져 있다 (참조: 예컨대, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd Edition, 2001). 예컨대 WO 2004/061104호에 기재된 대로, 부위-특이적인 통합을 위해, 적합한 숙주 세포는 하나 이상의 리콤비나제 인지 부위를 그 유전체에 포함할 것이다. 이러한 경우에, 적합한 발현 벡터는 숙주 세포의 리콤비나제 인지 부위(들)에 어울리는 재조합 인지 부위를 포함한다. 예컨대 부위-특이적인 통합 접근법을 이용하여 스크리닝 벡터로부터 선택된 VH 및 VL 코딩 쌍을 이동시키는 것에 관한 추가의 상세설명은 WO 2004/061104호에서 찾아볼 수 있다.
2개 이상의 항-HER3 항체를 포함하는 본 발명의 항체 조성물이 단일 바이오반응기에서 생산되어야 할 때, 폴리클로날 세포주를 생성하기 위해 유사한 증식율 및 바람직하게는 유사한 항체 발현 수준을 갖는 세포주를 선택할 수 있다. 그 후 개별적인 세포주를 소정의 비율로 혼합시킴에 의해 폴리클로날 세포주가 생성된다. 폴리클로날 항체를 발현시키는 폴리클로날 세포주를 생성하는 것뿐 아니라 그러한 세포주를 이용하여 폴리클로날 항체를 생산하는 것에 관한 추가의 정보 및 실시예에 대해서는 WO 2009/129814, WO 2004/061104 및 WO 2008/145133호 (본원에 참조로서 포함됨)를 참조하라.
따라서, 본 발명의 한 구체예는 본 발명의 2개 이상의 항-HER3 항체를 발현시킬 수 있는 폴리클로날 세포주이다. 추가의 구체예는 각각의 개별적인 세포가 단일 VH 및 VL 쌍을 발현시킬 수 있는 폴리클로날 세포주, 및 총괄하여 VH 및 VL 쌍의 집합물을 발현시킬 수 있는 폴리클로날 세포주이며, 여기서 각각의 VH 및 VL 쌍은 항-HER3 항체를 엔코딩한다.
본 발명의 재조합 항체 조성물은, 폴리클로날 세포주에 의해 발현되는 개별적인 항체의 상대 발현 수준에 있어서 실질적인 균일성을 유지하면서, 폴리클로날 워킹 세포 뱅크(pWCB)로부터의 하나의 앰풀을 적합한 배지에서 항체 발현의 충분한 수준을 허용하는 기간 동안 배양시킴에 의해 단일 바이오반응기에서 제조될 수 있다. 대략 15일 내지 50일의 생산 기간이 일반적으로 적합할 것이다. 유가식(fed) 회분 또는 관류 배양과 같이 당 분야에 공지된 배양 방법이 이용될 수 있다. 배양 배지는 바람직하게는 무혈청 배지이고, 보다 바람직하게는 무혈청 무단백질 배지, 예컨대 화학적으로 규정된 배지이다. 그러한 배양 배지는 전형적으로 생산에 이용된 특정 세포 유형의 성장을 위해 설계되고, 다수의 적합한 배지 제형이 시판된다.
재조합 항체 조성물은 배양 배지로부터 수득되고 통상적인 정제 기법에 의해 정제된다. 이들은 이온-교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 겔 여과와 같은 후속 정제 단계와 조합된, 예를 들어 친화성 크로마토그래피를 포함할 수 있는데, 이러한 정제 기법이 재조합 항체의 정제를 위해 빈번하게 사용되어 왔기 때문이다. 2개 이상의 항체가 폴리클로날 세포주에 의해 단일 바이오반응기에서 생산될 때, 폴리클로날 항체 조성물 내에 모든 개별적인 멤버들의 존재는 전형적으로 정제, 예를 들어 이온-교환 크로마토그래피 이후에 평가된다. 폴리클로날 항체 조성물의 특성규명은, 예컨대 WO 2006/007853, WO 2009/065414, WO 2011/042024 및 WO 2011/042027호 (본원에 참조로서 포함됨)에 기재된 대로 수행될 수 있다.
치료 조성물
본 발명의 또 다른 양태는 활성 성분으로서 적어도 하나의 본 발명의 항-HER3 항체를 포함하는 약제 조성물, 또는 항-HER3 재조합 Fab 또는 또 다른 항-HER3 재조합 항체 단편 조성물이다. 바람직하게는, 그러한 약제 조성물의 활성 성분은 2개 이상의 항-HER3 항체를 포함하는 상기 기재된 항-HER3 재조합 항체 조성물이다. 그러한 조성물은 암의 완화, 예방 및/또는 치료를 위한 것이다. 약제 조성물은 인간 또는 가축이나 애완동물에 투여될 수 있으나, 전형적으로 인간에게 투여될 것이다.
본 발명의 치료 조성물에서 개별적인 항체들 간의 비, 또는 본 발명의 개별적인 항체가 동시에, 순차적으로 또는 별도로 투여되는 경우에, 투여되는 항체들 간의 비는 종종 항체가 동등한 양으로 투여되도록 하는 비일 것이나, 반드시 그럴 필요가 있는 것은 아니다. 따라서, 2개의 항-HER3 항체를 포함하는 본 발명의 조성물은 종종 이들을 1:1의 비로 함유할 것이고, 3개의 항-HER3 항체를 포함하는 조성물은 종종 이들을 1:1:1의 비로 함유할 것이다. 그러나, 개별적인 항체의 특성에 따라서, 동등하지 않은 양의 상이한 항체를 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 조성물 중 상이한 항-HER3 항체들의 적합한 비는 WO 2010/040356호 (본원에 참조로서 포함됨)에 기재된 대로 측정될 수 있는데, 상기 특허에는 최적의 효력 및 효능을 갖는 조합 약물을 얻기 위해 폴리클로날 항체 조성물과 같은 조합 약물 생성물에서 화학적 개체(entity)들 간의 최적의 화학량론적 비를 확인하고 선택하는 방법이 기재되어 있다.
약제 조성물은 본 발명의 하나 이상의 항체 또는 이의 단편 외에 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 추가로 포함할 것이다. 이들은, 예를 들어 보존제, 안정화제, 계면활성제/습윤제, 에멀젼화제, 용해제, 삼투압을 조절하기 위한 염 및/또는 완충제를 포함할 수 있다. 용액 또는 현탁액은 점도-증가 물질, 예컨대 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈 또는 젤라틴을 추가로 포함할 수 있다. 약제 조성물에 적합한 pH 값은, 적절한 경우, 완충제를 사용하여 유지된, 일반적으로 약 5.5 내지 8.5의 범위, 예컨대 약 6 내지 8, 예컨대 약 7일 것이다.
예컨대, 암 환자에게 투여되는 적합한 제형 또는 조성물을 제공하기 위해 통상적인 조제 실무가 이용될 수 있다. 투여는 전형적으로 치료용일 것이며, 이것은 암 질환이 진단된 이후에 투여됨을 의미한다. 임의의 적합한 투여 경로가 이용될 수 있고, 예를 들어, 투여는 비경구, 정맥내, 동맥내, 피하, 근내, 복막내, 비내, 에어로솔, 좌제, 또는 경구 투여일 수 있다. 본 발명의 약제 조성물은 전형적으로 액체 용액 또는 현탁액의 형태로 투여될 것이고, 보다 전형적으로 수용액 또는 현탁액, 특히 등장성 수용액 또는 현탁액의 형태로 투여될 것이다.
본 발명의 약제 조성물은 그 자체로(per se) 공지된 방식으로 제조되며, 예를 들어, 통상적인 용해, 동결건조, 혼합, 과립화 또는 당제(confectioning) 공정에 의해 제조된다. 약제 조성물은 통상적인 조제 실무에 따라 제형화될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy (21st edition), ed. A.R. Gennaro, 2005, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, USA; and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, ed. J. Swarbrick, 3rd edition, 2006, Informa Healthcare, New York, NY, USA] 참조).
액제 제형의 대안으로서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 항체만을 포함하거나 만니톨과 같은 담체와 함께 포함하는 동결건조된 형태로 제조될 수 있는데, 이러한 경우 조성물은 사용 전에 살균수와 같은 액체로 재구성된다.
약제 조성물은 약 1% 내지 약 95%, 바람직하게는 약 20% 내지 약 90%의 활성 성분을 포함한다. 본 발명에 따른 약제 조성물은, 예를 들어 앰풀, 바이알, 좌제, 정제 또는 캡슐의 형태와 같은 단위 용량 형태로 생산될 수 있다. 제형은 치료적 또는 예방적 유효량 (예컨대, 병리 상태를 예방, 제거, 또는 감소시키는 양)으로 개인에 투여되어 암성 질환 또는 그 밖의 병상에 대한 치료를 제공할 수 있다. 투여되는 치료제의 바람직한 투여량은 암의 중증도, 특정 환자의 전반적인 건강 상태, 화합물 부형제의 제형, 및 이의 투여 경로와 같은 변수에 의존적일 듯하다.
본 발명에 따른 항체 및 조성물의 치료 용도
본 발명에 따른 항-HER3 항체 및 약제 조성물은 포유동물에서 질병의 치료 또는 개선, 특히 인간에서 암의 치료에 이용될 수 있다. 본 발명의 한 구체예는 치료적 유효량의 본 발명의 항-HER3 재조합 항체 조성물을 인간 또는 그 밖의 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 암과 관련된 하나의 이상의 징후를 예방, 치료 또는 개선시키는 방법이다.
특정 구체예는 본원에 정의된 재조합 항-HER3 항체 또는 바람직하게는, 상기 정의된 2개 이상의 항-HER3 항체를 포함하는 재조합 항체 조성물을 HER3의 발현을 특징으로 하는 질병, 특히 암에 걸린 인간 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.
추가의 구체예는 HER3을 발현시키는 세포를 본원에 정의된 재조합 항-HER3 항체 또는 바람직하게는, 상기 정의된 2개 이상의 항-HER3 항체를 포함하는 재조합 항체 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 세포에서 HER3 및 그 밖의 ErbB 패밀리 수용체 간의 헤테로이합체 형성을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 구체예는 인간 또는 그 밖의 포유동물에서 암과 관련된 하나 이상의 징후를 치료, 개선 또는 예방하기 위한 조성물, 예컨대 HER3의 발현을 특징으로 하는 질병에 걸린 인간 환자를 치료하기 위한 조성물의 제조에서 본 발명의 항-HER3 재조합 항체 또는 항체 조성물의 용도이다.
HER3 발현 수준을 포함하는 다수의 요인에 기반하여, 특히 하기 종양 유형에 본 발명의 항체 조성물을 이용한 치료가 필요할 수 있다: 유방암, 난소암, 위암, 결장암, 직장암, 전립선암, 방광암, 췌장암, 두경부암, 및 비소세포폐암. 본 발명의 항체 조성물은 HER3을 발현시키는 암, 예를 들어 많은 유방암, 난소암 및 위암과 같은 특정 상피암의 치료에 특히 적용될 수 있는 것으로 고려된다.
이러한 적응증 각각과 관련하여, 2가지의 주요 임상 경로, 즉 1) 한 가지 이상의 추가의 치료적 처치에 관한 보조 요법 또는 2) 단일요법이 고려된다. 이러한 2가지 옵션을 하기에서 간단하게 검토한다.
1) 보조 요법: 조합 요법으로도 알려진 보조 요법에서, 환자는 한 가지 이상의 추가의 치료적 처치, 전형적으로 화학요법제 또는 항신생물제 및/또는 방사선 요법과 함께 본 발명의 항체로 치료될 것이다. 대안적으로 또는 추가로, 본 발명의 항-HER3 항체 및 조성물은 또한 EGFR 또는 VEGF를 표적화하는 항체와 같은 상이한 항암 항체와 함께 이용될 수 있다. 따라서 상기 나열된 일차 암 표적은 표준 1차 라인 및 2차 라인 요법 외에 본 발명의 항체 또는 조성물을 투여함에 의해 치료될 수 있다. 프로토콜 설계는, 예컨대 종양 부피의 감소 뿐만 아니라 표준 화학요법제의 통상적인 양을 감소시키는 능력에 의해 평가되는 유효성을 다룰 것이다. 이러한 투여량 감소는 화학요법제의 용량-관련 독성을 감소시킴으로써 추가적이고/이거나 지속된 요법을 가능케 할 것이다.
본 발명의 항체 조성물을 암 세포의 최종 분화를 유도하는 것으로 알려진 작용제와 조합시킴에 의해, 효과가 추가로 향상될 수 있다. 그러한 화합물은, 예를 들어 레티노산, 트랜스-레티노산, 시스-레티노산, 페닐부티레이트, 신경 성장 인자, 디메틸 설폭시드, 활성 형태 비타민 D3, 과산화소체 증식-활성화 수용체 감마, 12-O-테트라데카노일포르볼 13-아세테이트, 헥사메틸렌-비스-아세트아미드, 형질전환 성장 인자-베타, 부티르산, 시클릭 AMP, 및 베스나리논(vesnarinone)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 화합물은 레티노산, 페닐부티레이트, 모든-트랜스-레티노산, 활성 형태 비타민 D로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 항체 조성물 및 하나 이상의 화합요법제 또는 항신생물성 화합물을 포함하는 약제 물품은 암 요법에서 동시, 별개 또는 연속 투여를 위한 조합 치료제로서 이용될 수 있다. 화합요법 화합물은 대상이 되는 특정 암의 치료에 적합한 임의의 화합요법제, 예를 들어 알킬화제, 예를 들어 시스플라틴, 카르보플라틴 또는 옥살리플라틴과 같은 백금 유도체; 식물 알코이드, 예를 들어 파클리탁셀, 도세탁셀 또는 이리노테칸; 항종양 항생제, 예를 들어 독소루비신 (아드리아마이신); 토포테칸과 같은 토포아이소머라제 억제제; 및 항대사산물, 예를 들어 플루오로우라실 또는 그 밖의 플루오로피리미딘으로 구성된 군으로부터 선택된 작용제일 수 있다.
또한 본 발명의 항체는 티로신 키나제 억제제 (TKI)에 관한 보조 요법으로서 이용될 수 있는 것으로 고려된다. 이들은 수용체의 세포내 티로신 키나제 도메인과 상호작용하고, 세포내 Mg-ATP 결합 부위에 대해 경쟁함으로써 리간드 유도 수용체 인산화를 억제하는 주로 퀴나졸린 유도된 합성 저분자량 분자이다. EGFR 패밀리 수용체를 차단하는 여러 티로신 키나제 억제제가 현재 임상 개발중에 있다. 이러한 TKI의 검토에 관해서는 문헌[Spector et al. (2007) Breast Cancer Res. 9(2): 205]을 참조하라. 이렇게 본 발명의 항체 조성물 및 HER3을 표적화하는 하나 이상의 TKI를 포함하는 약제 물품을 또한 암 요법에서 동시, 별개 또는 연속 투여를 위한 조합 치료제로서 이용할 수 있다.
그 밖의 구체예에서, 본 발명의 항체 조성물은 그 밖의 항체 치료제와 함께 이용될 수 있다. 이러한 예는, 예컨대 EGFR (에르비툭스(Erbitux)® 또는 벡티빅스(Vectibix)®) 또는 VEGF (아바스틴(Avastin)®)에 대한 항체뿐 아니라, 그 밖의 항-RTK 항체, 예를 들어 HER2 또는 MET와 같은 하나 이상의 그 밖의 RTK 표적에 대한 하나 이상의 항체를 포함한다. 또한 그 밖의 구체예에서, 본 발명의 항체 조성물은 면역계의 세포를 자극하는 것으로 알려진 작용제와 함께 이용될 수 있고, 그러한 조합 치료는 본 발명의 항체 조성물의 효능에 있어서 강화된 면역-매개된 개선을 초래한다. 그러한 면역-자극제의 예는 재조합 인터루킨 (예컨대, IL-21 및 IL-2)을 포함한다.
2) 단일요법: 종양의 단일요법에 있어서 본 발명에 따른 항체의 이용과 관련하여, 항체는 화학요법제 또는 항신생물제를 함께 사용하지 않으며, 즉 독립형 요법으로서 환자에게 투여될 수 있다.
면역컨쥬게이트
본 발명의 항체 및 조성물의 치료 용도를 위한 또 다른 옵션은 면역컨쥬게이트, 즉 하나 이상의 항암제에 컨쥬게이션된 항체의 형태이다. 특히 별개의 HER3 에피토프에 결합하는 본 발명의 2개 이상의 개별적인 항체를 포함하는 조성물의 경우, 이것은 세포 표면 상에 가교된 항체-수용체 격자를 생성함으로써 단일 모노클로날 항체를 이용한 것에 비해 수용체 내재화의 수준을 잠재적으로 증가시킬 수 있는 것으로 고려된다. 따라서 하나 이상의 항암제에 그러한 조성물의 개별적인 항체들 중 하나 이상을 컨쥬게이션하는 것은 종양 세포의 내부에 컨쥬게이션된 항암제를 특이적으로 그리고 효과적으로 전달할 가능성을 지니므로, 본 발명의 항-HER3 항체의 효과를 증대시켜 향상된 종양 세포-사멸 활성을 제공한다.
세포독성제 (통상적인 화학요법제 및 그 밖의 소분자 항암 약물 포함), 사이토카인 (컨쥬게이트가 "면역사이토카인"으로 명명될 수 있는 경우), 독소 (컨쥬게이트가 "면역독소"로 명명될 수 있는 경우) 및 방사성핵종을 포함하는 다양한 유형의 항암제가 본 발명의 항체에 컨쥬게이션될 수 있고, 소수의 면역컨쥬게이트는 이미 임상용으로 승인된 바 있다. 여기에는 제발린(Zevalin)® (90Y에 컨쥬게이션된 뮤린 항-CD20 항체), 벡사르(Bexxar)® (131I에 컨쥬게이션된 뮤린 항-CD20 항체) 및 밀로타르그(Mylotarg)® (칼리케아미신에 컨쥬게이션된 인간화 항-CD33 항체)가 포함된다. 임상 시험 테스트를 받은 그 밖의 면역컨쥬게이트는, 예컨대 독소루비신 또는 메이탄시노이드 화합물에 컨쥬게이션된 항체를 포함한다. 임상 시험 테스트를 받은 면역독소는 트렁케이션된 슈도모나스 외독소 A에 컨쥬게이션된 여러 개의 항체를 포함한다. IL-2에 컨쥬게이션된 인간화 EpCAM 항체를 포함하는 면역사이토카인도 테스트를 받았다.
세포독성제에 컨쥬게이션된 본 발명의 항체의 경우, 이들은 알킬화제 (예컨대, 카르보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴), 항대사산물 (예컨대, 메토트렉세이트, 카페시타빈, 겜시타빈), 아트라사이클린 (예컨대, 블레오마이신, 독소루비신, 미토마이신-C) 및 식물 알칼로이드 (예컨대, 도세탁셀 및 파클리탁셀과 같은 탁산, 및 빈블라스틴, 빈크리스틴 및 비노렐빈과 같은 빈카 알칼로이드)를 포함하는 화학요법 약물의 주요 부류들 중 어느 것에 속할 수 있다. 면역컨쥬게이트의 이용은 항암제를 종양에, 특히 내재화 이후 종양 세포의 내부에 명확하게 겨냥하기 때문에, 본 발명의 항-HER3 항체에 기반한 면역컨쥬게이트는 유리하게는 칼리케아미신 또는 메이탄신 유도체와 같은 고도의 세포독성제, 또는 박테리아 독소 (예컨대, 슈도모나스 외독소 A, 디프테리아 독소) 또는 식물 독소 (예컨대, 리신)와 같은 독소에 기반할 수 있다.
면역컨쥬게이트에서 컨쥬게이션된 항암제는 혈청에서 비교적 안정하지만 면역컨쥬게이트가 표적 세포내로 내재화될 때 작용제의 방출을 허용하는 불안정한 링커에 의해 일반적으로 항체에 연결된다. 적합한 링커는, 예를 들어 혈청의 중성 pH에서는 안정하지만 내재화 이후 리소좀 내의 약산성 조건에서는 산 가수분해되는 화학적 링커, 세포내 티올에 의해 절단되는 디설파이드 링커, 및 혈청에서는 안정하지만 세포내 구획에서 효소 절단되는 펩티드 링커를 포함한다.
다양한 컨쥬게이션 정렬이 본 발명의 2개 이상의 항체를 함유하는 조성물에서 구상될 수 있다. 예를 들어, 2개의 항체를 이용하여 항체들을 2개 이상의 상이한 항암 약물에 컨쥬게이션하거나 하나의 항체를 다른 항체에 컨쥬게이션된 효소와 같은 작용제에 의해 활성화되는 프로드럭에 컨쥬게이션시킬 수 있을 것이다. 항체-지향성 효소 프로드럭 요법 (ADEPT)의 일반적 개념이 모노클로날 항체에 대해 기재되었는데, 여기서 프로드럭은 mAB-효소 컨쥬게이트에 의해 종양에 표적화된 효소에 의해 활성화되지만, 본 발명은 이러한 접근법을 특정 상황에 맞출 기회를 제공할 수 있다. 따라서, 정상 조직에 대한 손상을 회피하거나 감소시키면서 종양 세포 사멸을 특이적으로 증가시킬 수 있다.
항암 면역컨쥬게이트에 대한 추가의 정보에 관해서는, 문헌[Wu et al. (2005) Nature Biotechnology 23(9):1137-1146; Schrama et al. (2006) Nature Reviews/Drug Discovery 5:147-159; and Rohrer (2009) chimica oggi / Chemistry Today 27(5):56-60]을 참조하라.
투여 용량 및 경로
본 발명의 항체 및 조성물은 대상이 되는 질환의 치료에 효과적인 양, 즉 요망되는 결과를 달성하는데 필요한 투여량으로 그러한 기간 동안 투여될 것이다. 치료적 유효량은 치료되는 특정 질환, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 항-HER3 항체가 독립형 치료로서 투여되는지 또는 하나 이상의 추가의 항암 치료와 함께 투여되는지 여부와 같은 요인들에 따라 달라질 수 있다.
종양 요법을 위한 유효량은 환자에서 질환 진행을 안정화시키고/거나 징후를 개선시키고, 바람직하게는, 예컨대 종양 크기를 감소시킴에 의해 질환 진행을 역전시키는 이의 능력에 의해 측정될 수 있다. 암을 억제하는 본 발명의 항체 또는 조성물의 능력은, 예컨대 실시예에 기재된 시험관내 검정에 의해서, 뿐만 아니라 인간 종양에서의 효능을 예측하게 하는 적합한 동물 모델에서 평가될 수 있다. 적합한 투여 섭생은, 예를 들어 단일 볼루스(bolus) 또는 연속 주입으로서 투여되고, 각 경우의 긴급성에 따라 투여량의 조정이 가능한, 각각의 특정 상황에서의 최적 치료 반응을 제공하도록 선택될 것이다.
본 발명에 따른 항체에 대한 구체적인 용량은 아직 결정되지 않았으나, 치료 용도로 승인된 유사한 제품 (예컨대, HER2 또는 EGFR에 대해 유도된 모노클로날 항체)과의 비교를 통해 정확한 용량 항목이 결정될 수 있다. 따라서 본 발명의 항체 조성물의 적절한 투여량은 항-HER2 모노클로날 항체 트라스투주맙 (헤르셉틴®) 또는 항-EGFR 모노클로날 항체 파니투무맙 (벡티빅스®)에 대해 권고된 투여량과 유사할 것으로 고려된다. 특정 질환에 따라, 헤르셉틴®은 4 mg/kg의 초기 용량 및 후속하는 2 mg/kg의 주 1회 용량, 또는 8 mg/kg의 초기 용량 및 후속하는 3주마다의 6 mg/kg의 용량으로 유방암의 치료를 위해 (주입에 의해) 투여되는 한편, 벡티빅스®는 14일마다 6 mg/kg의 용량으로 투여된다.
본 발명의 항체 조성물의 적합한 용량은 0.1-100 mg/kg의 범위, 예컨대 약 0.5-50 mg/kg, 예컨대 약 1-20 mg/kg의 범위일 것으로 고려된다. 항체 조성물은, 예를 들어 적어도 0.25 mg/kg, 예컨대 적어도 0.5 mg/kg, 예컨대 적어도 1 mg/kg, 예컨대 적어도 1.5 mg/kg, 예컨대 적어도 2 mg/kg, 예컨대 적어도 3 mg/kg, 예컨대 적어도 4 mg/kg, 예컨대 적어도 5 mg/kg; 및 예컨대 많아야 50 mg/kg 이하, 예컨대 많아야 30 mg/kg 이하, 예컨대 많아야 20 mg/kg 이하, 예컨대 많아야 15 mg/kg 이하의 투여량으로 투여될 수 있다. 투여는, 보통, 예컨대 매주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 또는 4주마다 1회, 및 필요한 경우 투여량을 임의로 증가시키거나 감소시킬 수 있는 주치의가 적절하다고 판단하는 동안의 적합한 간격으로 반복될 것이다.
3개의 별개의 전달 접근법이 본 발명에 따른 항체의 전달을 위해 고려된다. 통상적인 정맥내 전달은 아마 대부분의 종양에 대한 표준 전달 기법일 것이다. 그러나, 복막강 내의 종양, 예를 들어, 난소, 담도, 다른 관 등의 종양과 관련하여, 복막내 투여가 종양에서 고 용량의 항체를 수득하고 항체 제거율을 최소화하는데 유리함이 증명될 수 있다. 유사하게, 특정 고형 종양은 국부 관류에 적합한 맥관 구조를 가진다. 국부 관류는 종양 부위에서 고용량의 항체의 획득을 가능케 하고, 항체의 단기 제거를 최소화할 것이다.
임의의 단백질 또는 항체 융합 기반 치료제를 이용함에 따른, 안정성 우려는 주로, (ⅰ) 사이토카인 방출 증후군, 즉 저혈압, 열, 진전, 오한, (ⅱ) 단백질에 대한 면역원성 반응의 발생 (즉, 재조합 항체 생성물에 대한 환자에 의한 인간 항체의 발생), 및 (ⅲ) HER3 수용체를 발현하는 정상 세포에 대한 독성과 관련된다. 상기 임의의 안전성 우려를 모니터하기 위해 표준 시험 및 후속 절차가 이용된다.
본 출원에 인용된 모든 특허 및 비특허 참조문헌은 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다.
하기 비제한적인 실시예에서 본 발명을 추가로 설명할 것이다.
실시예
실시예 1: 항- HER3 항체의 클로닝
면역화
한 마리의 BALB/cJ 마우스, 한 마리의 C57BL/6 마우스 및 한 마리의 C3H 마우스 (8-10주령)로 이루어진 3마리의 암컷 마우스를 면역화에 이용하였다. 마우스를 시판되는 HER3 단백질 (R&D Systems cat.#348-RB)로 면역시켰다. 처음 4회의 면역화 동안, HER3 단백질을 PBS에 희석시키고 프로인트 애쥬번트(Freund's Adjuvant)와 1:1(v/v)로 혼합하였다. 다섯 번째 및 최종 면역화에는 애쥬번트 없이 PBS 중 HER3 단백질을 제공하였다.
면역 반응을 향상시키고 조절하기 위해 애쥬번트를 사용하였다. 첫 번째 면역화에서, 완전 프로인트 애쥬번트(CFA)를 사용한 반면, 두 번째, 세 번째 및 네 번째 면역화를 위해서는 불완전 프로인트 애쥬번트(IFA)를 사용하였다. IFA는 광유로 구성된 수중유 에멀젼이고, CFA는 가열 사멸되고, 건조된 미코박테리움 종이 첨가된 IFA이다. 둘 모두의 애쥬번트는 저장소 효과(depot effect)를 갖는다. CFA의 미코박테리움은 면역계의 강력한 활성화를 생성하고, 이는 면역 반응의 장기간 지속성을 발생시킨다. 안정적인 에멀젼만을 마우스에 투여하였다.
10 ㎍의 재조합 HER3 단백질을 각각의 면역화에 이용하였다. 전체적으로, 마우스에 5회 주입하였다. 모든 마우스에 200 ㎕의 항원-애쥬번트 에멀젼을 처음 4회의 주입 동안 피하(s.c.) 주입하고 PBS 중 100 ㎕의 항원을 다섯 번째 주입 동안 복막내(i.p.) 주입하였다. 면역화, 애쥬번트, 주입 경로 등의 요약은 표 4에 있다.
마우스를 경추 탈골로 희생시키고, 비장과 서혜 림프절을 수거하였다. 70 ㎛ 세포 스트레이너(strainer)(Falcon, BD Biosciences, Cat. No.352350)를 통해 분쇄시켜 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 3마리의 마우스로부터의 세포를 풀링시키고, 10% FBS를 지니는 찬 RPMI-1640에 재현탁시키고 스핀 다운(spun down)시켰다.
표 4: 면역화 요약
Figure 112013046896517-pct00004
뮤린 형질 세포의 FACS 분류
적혈구를 제거하기 위해 풀링된 세포 현탁액을 0.17 M NH4Cl에서 용해시켰다. 용해 후에 세포를 2% FBS/PBS에서 2회 세척하였다. 세포를 1 ml의 2% FBS/PBS에 재현탁시키고, Fc-블록(block) (항-마우스 CD16/CD32, BD Biosciences, Cat. No.553141)과 인큐베이션하고, 1회 세척하였다. 2% FBS/PBS에서 재현탁시킨 후에, 세포를 항-마우스 CD43-FITC (BD Biosciences, Cat. No.553270), 항-마우스 CD138-PE (BD Biosciences, Cat. No. 553714), 항-마우스 IgM-호라이즌 (BD Biosciences, Cat. No. 560575), 항-마우스 IgG1-APC (BD Biosciences, Cat. No. 550874), 항-마우스 MHC II (I-A/I-Ed)-바이오틴 (BD Biosciences, Cat. No. 553622) 및 항-마우스 B220/CD45R-PerCP (BD Biosciences, Cat. No. 553093)로 암실에서 20분간 염색하였다. 세포를 세척하고, 스트렙타비딘-APC-Cy7 (BD Biosciences, Cat. No. 554063)과 20분간 인큐베이션하고, 세척하였다. 세포를 FACSAria™ 세포 분류기 상에서 FACS 분류하였다. B220lowMHCIIintCD43+CD138+IgM-인 세포가 PCR 반응 완충제를 함유하는 384-웰 미세역가 플레이트로 단일 세포 분류되었다. 플레이트를 원심분리하고, 냉동시키고, -80℃에서 저장하였다.
동족체 V H 및 V L 쌍의 결합
형질 세포로서 게이팅된 단일 세포 상에서 VH 및 VL 코딩 서열의 결합을 수행하여 VH 및 VL 코딩 서열의 동족체 페어링을 촉진하였다. 절차는 일-단계 다중 중첩-신장 RT-PCT에 이은 네스티드 PCR에 기반한 2단계 PCR 절차를 이용하였다. 본 실시예에서 이용된 프라이머 혼합물은 카파 경쇄만을 증폭시킨다. 그러나, 요망되는 경우 람다 경쇄를 증폭시킬 수 있는 프라이머가 다중 프라이머 혼합물 및 네스티드 PCR 프라이머 혼합물에 첨가될 수 있었다. 람다 프라이머가 첨가되면, 분류 절차가 람다 포지티브 세포를 제외시키지 않도록 조정되어야 한다. 동족체 VH 및 VL 서열의 결합 원리는 WO 2005/042774호 및 문헌[Meijer et al. (2006) J Mol Biol . 358(3):764-72]에 상세히 기재되어 있다.
96-웰 PCT 플레이트를 해동시켰고 분류된 세포는 다중 중첩-신장 RT-PCR에 대한 주형으로 제공되었다. 단일-세포 분류가 반응 완충제(OneStep RT-PCR 완충제; Qiagen), RT-PCR에 대한 프라이머 및 RNase 억제제(RNasin, Promega)를 함유하기 전에, 분류 완충제를 각 웰에 첨가하였다. 중첩 신장 RT-PCR에 사용되는 프라이머뿐 아니라 프라이머 농도는 WO 2008/104183호의 표 3에 기재된 바와 동일하였다. 여기에 원스텝(OneStep) RT-PCR5Enzyme 혼합물(25배 희석; Qiagen) 및 dNTP 혼합물(각 200 μM)를 보충하여 20 ㎕의 반응 부피에서 주어진 최종 농도를 수득하였다. 플레이트를 55℃에서 30분 동안 인큐베이션시켜 각 세포로부터 RNA의 역전사(RT)를 가능하게 하였다. RT 이후에, 플레이트를 하기 PCR 주기에 적용시켰다: 94℃에서 10분, 35x(94℃에서 40초, 60℃에서 40초, 72℃에서 5분), 72℃에서 10분.
PCR 반응을 필 실 바스킷(Peel Seal Basket)이 구비된 H20BIT 써멀 사이클러(Thermal cycler)에서 24개의 96-웰 플레이트(ABgene)에 대해 수행하여 고-처리량을 촉진하였다. PCR 플레이트를 주기 후 -20℃에서 저장하였다.
네스티드 PCR 단계를 위하여, 96-웰 PCR 플레이트를 각 웰(20 ㎕ 반응물)에서 하기 혼합물을 이용하여 제공된 최종 농도를 수득하도록 제조하였다: 1x 패스트스타트(FastStart) 완충제 (Roche), dNTP 혼합물(각각 200 μM), 네스티드 프라이머 혼합물, 퓨전(Phusion) DNA 폴리머라제(0.08U; Finnzymes) 및 패스트스타트 하이 피델리티(FastStart High Fidelity) 효소 블렌드(0.8 U; Roche). 네스티드 PCR에 사용되는 프라이머뿐 아니라 프라이머 농도는 WO 2008/104183호의 표 4에 기재된 바와 동일하였다. 네스티드 PCR에 대한 주형으로서, 1 ㎕를 다중 중첩-신장 PCR 반응물로부터 옮겼다. 네스티드 PCR 플레이트를 하기 열주기로 처리하였다: 35x(95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 90초), 72℃에서 10분.
무작위로 선택된 반응물을 1% 아가로스 겔 상에서 분석하여 약 890 염기쌍(bp)의 중첩-신장 단편의 존재를 입증하였다. PCR 단편의 추가 가공까지 플레이트를 -20℃에서 저장하였다.
네스티드 PCR로부터의 결합된 VH 및 VL 코딩 쌍의 레퍼토리를 다양한 공여체로부터의 쌍을 혼합하지 않고 풀링시키고, 분취용 1% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 정제하였다. 인간 카파 불변 경쇄 엔코딩 서열을 WO 2008/104183호에 기재된 대로 결합된 VH 및 VL 코딩 쌍의 풀링된 PCR 생성물의 VL 코딩 영역으로의 중첩 신장에 의해 스플라이싱하였다. 인간 카파 불변 경쇄 엔코딩 서열을 50 ㎕의 전체 부피 중의 퓨젼(Phusion) 효소(2U; Finnzymes), 1x 퓨전 완충제, dNTP 혼합물(각각 200 μM), hKCforw-v2 프라이머 및 Kappa3' 프라이머(사용된 프라이머 및 농도에 대해서는 WO 2008/104183호의 표 5 참조), 및 플라스미드 주형 pLL138(10 ng/㎕)을 함유하는 반응물에서 카파 경쇄를 갖는 인간 항체의 코딩 서열을 함유하는 플라스미드로부터 증폭시켰다. 반응물을 25x(95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 45초), 72℃에서 10분의 열주기에 적용시켰다. 생성된 PCR 단편을 분취용 1% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 정제하였다.
인간 카파 불변 엔코딩 영역 단편(1.4 ng/㎕), 정제된 풀링된 PCR 단편(1.4 ng/㎕), 퓨젼(Phusion) DNA 폴리머라제(0.5U; Finnzymes) 및 패스트스타트 하이 피델리티 효소 블렌드(0.2U; Roche), 1x 패스트스타트 완충제(Roche), dNTP 혼합물(각각 200 μM), mhKCrev 프라이머 및 mJH 세트 프라이머를 함유하는 중첩 신장 PCR(50 ㎕의 전체 부피)에 의한 다음 스플라이싱에 의해 각각의 레퍼토리에서 정제된 풀링된 PCR 단편을 인간 카파 불변 엔코딩 영역(SEQ ID NO: 42)의 증폭되고 정제된 PCR 단편에 스플라이싱시켰다(사용된 프라이머 및 농도에 대해서는 WO 2008/104183호의 표 5 참조). 반응을 95℃에서 2분, 25x(95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분), 72℃에서 10분의 열주기에 적용시켰다. 생성된 PCR 단편(약 4518 bp)을 분취용 1% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 정제시켰다.
동족체 V H 및 V L 코딩 쌍의 스크리닝 벡터로의 삽입
HER3에 대한 결합 특이성을 지니는 항체를 확인하기 위해, 수득된 VH 및 VL 코딩 서열을 전장 항체로서 발현시켰다. 이것은 VH 및 VL 코딩 쌍의 레퍼토리를 발현 벡터로 삽입하고 숙주 세포로 트랜스펙션시키는 것을 포함한다.
결합된 VH 및 VL 코딩 쌍을 함유하는 발현 벡터의 레퍼토리를 생성하기 위해 2-단계 클로닝 절차를 이용하였다. 통계적으로, 발현 벡터의 레퍼토리가 스크리닝 레퍼토리의 생성을 위해 사용된 페어링된 동족체 VH 및 VL PCR 생성물의 수 보다 10배 많은 재조합 플라스미드를 함유하는 경우, 모든 독특한 유전자 쌍이 제시될 가능성이 99%이다. 따라서, 400개의 중첩-신장 V-유전자 단편이 수득되는 경우, 모든 독특한 유전자 쌍을 수득할 99%의 가능성을 지니기 위해 4000개 이상의 클론의 레퍼토리가 스크리닝을 위해 생성되었을 것이다.
간단히 말해, 인간 카파 불변 코딩 영역으로 스플라이싱된 결합된 VH 및 VL 코딩 쌍의 레퍼토리의 정제된 PCR 생성물을 PCR 생성물의 말단에 도입된 제한 부위에서 Xho Ｉ 및 Not Ｉ DNA 엔도누클레아제로 절단하였다. 절단되고 정제된 단편을 표준 라이게이션(ligation) 절차에 의해 XhoI/NotI 분해된 포유동물 IgG 발현 벡터, 00-VP-002(WO 2008/104183에 기재됨)로 라이게이션하였다. 라이게이션 혼합물을 대장균(E. coli)으로 전기 천공시키고 적합한 항생제를 함유하는 2xYT 플레이트에 첨가하고 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 증폭된 벡터의 레퍼토리를 플레이트로부터 회수된 세포로부터 표준 DNA 정제 방법(Qiagen)을 이용하여 정제시켰다. 플라스미드를 AscI 및 NheI 엔도누클레아제를 이용한 절단에 의해 프로모터-리더(leader) 단편의 삽입을 위해 제조하였다. 상기 효소의 제한 부위는 VH 및 VL 코딩 유전자 쌍 사이에 위치하였다. 벡터의 정제에 이어서, AscI-NheI 분해된 양-지향성 포유동물 프로모터-리더 단편을 표준 라이게이션 절차에 의해 AscI 및 NheI 제한 부위에 삽입하였다. 라이게이션된 벡터를 대장균(E.coli)에서 증폭시키고 플라스미드를 표준 방법을 이용하여 정제하였다. 통상적인 절차에 의해 스크리닝 벡터의 생성된 레퍼토리로 대장균(E. coli)을 형질전환시켰다. 수득된 콜로니를 384-웰 마스터 플레이트에 통합시키고 저장하였다.
포유동물 발현 플라스미드의 증폭을 위해 2-단계 절차를 이용하였다. 먼저, 박테리아를 용해시키고 수산화나트륨에서 인큐베이션시킴에 의해 DNA를 변성시켰다. 후속하여, TempliPhi 증폭을 수행하였다 (GE Amersham). 이러한 방법은 롤링 서클(rolling circle) 증폭에 의해 이중-가닥 환형 DNA 주형을 지수적으로 증폭시키기 위해 박테리오파지 Φ29 DNA 폴리머라제를 이용한다. 포유동물 세포에서의 항체 발현을 위해, 제조자가 권고하는 대로 표준 트랜스펙션 조건을 이용한 293프리스타일(Freestyle)™ 발현 시스템 (Invitrogen)을 적용시켰다. 트랜스펙션에 앞서 세포에 발프로에이트를 50mM로 보충시켰고 다음 날 트립톤 N1을 1.5% (w/v)의 최종 농도의 트랜스펙션 부피로 첨가시켰다. 항체를 함유하는 상층액을 트랜스펙션한 지 6일 후에 회수하였다. 표준 항-IgG ELISA를 이용하여 발현 수준을 산정하였다.
재조합 HER3 단백질로의 결합에 대한 스크리닝 ( ELISA )
항체 특이성을 재조합 HER3-단백질을 항원으로서 이용하여 ELISA에 의해 측정하였다.
간단히 말해, 눈크 맥시소르브(Nunc maxisorb) 플레이트(cat.# 464718)를 밤새 4℃에서 PBS 중에서 희석된 1 ㎍/ml의 HER3 단백질(R&D Systems cat.#348-RB)로 코팅하였다. 50 ㎕ 2%-밀크(milk)-PBS + 0.05% Tween 20에서 차단하기 전, 플레이트를 PBS-T로 1회 세척하였다. 플레이트를 PBS-T로 1회 세척하고, 20 ㎕의 2%-밀크-PBS-T 및 프리스타일293 트랜스펙턴트로부터의 10 ㎕의 상층액을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 웰당 PBS-T 20 ㎕로 1회 세척하였다. 2% 밀크-PBS-T에서 1:25000 희석된 이차 항체(HRP-염소-항-인간 카파 경쇄, Serotec, cat.# STAR 100P)를 첨가하여 웰에 결합된 항체를 검출하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS-T에서 1회 세척한 후에, 5분 동안 인큐베이션된 25 ㎕의 기질(Kem-en-tec Diagnostics, cat.# 4518)을 첨가하였다. 인큐베이션 후에 반응을 중지시키기 위해 25 ㎕의 1M 황산을 첨가하였다. 450 nm에서 ELISA 판독기 상에서 특정 신호를 검출하였다. ELISA 데이터로부터 480개의 포지티브 항체 클론을 동정하였고 서열 분석 및 HER3으로의 결합을 확인하기 위해 선택하였다.
서열 분석 및 클론 선택
ELISA에 의해 HER3에 결합하는 것으로 확인된 클론을 본래의 마스터(master) 플레이트(384-웰 포맷)으로부터 회수하였고, 아가 플레이트 상에 스트리킹하여 단일 콜로니를 생성하였으며, 이것을 LB-배지 배양물로 골라내어 강하게 진탕시키며 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 플라스미드 DNA를 Qiaprep 96 터보 미니-프렙 키트 (Qiagen, cat.# 27193)를 이용하여 클론으로부터 분리시키고, V-유전자의 DNA 서열분석을 위해 제공하였다. 서열을 정렬시키고, 모든 독특한 클론을 선택하였다. 수득된 서열의 다중정렬은 각각의 특정 클론의 독특함을 나타내었고, 독특한 항체의 확인을 가능케 하였다. 서열분석되는 클론의 서열 분석 후, 2개 내지 40개가 넘는 멤버로 된 관련된 서열의 33개의 클러스터뿐 아니라 단 한 번만 표시되는 20개가 넘는 클론유형을 동정하였다. 각각의 관련된 서열의 클러스터는 대개 공통의 전구체 클론의 체세포 과돌연변이(somatic hypermutation)를 통해 유래되었다. 종합적으로, 각각의 클러스터로부터의 1 내지 2개의 클론을 서열 및 특이성의 확인을 위해 선택하였다. 클러스터 분석에 기반하여, 소규모 발현 및 추가의 특성규명을 위해 119개의 클론이 선택되었다. 선택된 항체 가변 영역의 서열은 첨부된 서열 목록에 제시되어 있다. 상기 설명된 대로, 서열 목록에 제시된 경쇄 서열은 모두 동일한 인간 카파 불변 영역을 포함하고, 이는 아미노산 -TVAAP-로 시작하고 C-말단에서 -NRGEC로 종료된다. 항체를 엔코딩하는 클론을 확인하기 위해, DNA 플라스미드를 제조하고 2 ml 규모의 프리스타일 CHO-S 세포 (Invitrogen)의 트랜스펙션을 발현을 위해 수행하였다. 트랜스펙션한 지 6일 후에 상층액을 회수하였다. 발현 수준을 표준 항-IgG ELISA를 이용하여 산정하였고, 특이성을 "재조합 HER3 단백질로의 결합에 대한 스크리닝"에서 상기 기재된 대로 HER3 특이적 ELISA에 의해 그리고 HER3 과발현 세포에 결합하는 항체의 고 처리량 스크리닝 공초점 현미경검사 (하기 참조)에 의해 측정하였다.
HER3 과발현 세포로의 결합에 대한 스크리닝 ( OPERA )
119개 클론을 HER3-과발현 유방암 세포주 (MCF-7)로의 결합에 대해 공초점 현미경검사를 이용하여 스크리닝하였다. 10,000개의 MCF-7 세포를 384-웰 세포 캐리어 플레이트 (Perkin Elmer, cat.# 6007439)의 각각의 웰에 시딩하고 밤새 부착되게 하였다. 배지를 다시 폐기하고, 세포를 세척하고, 2% 포름알데히드 용액 (Aldrich cat.# 533998)으로 고정시켰다. 세척 후, 40 ㎕의 항체 상층액을 각각의 웰로 옮기고, 플레이트를 2시간 동안 인큐베이션시킨 후에, 웰의 배지를 폐기하고, 2 ㎍/ml의 Alexa-488 표지된 염소 항-인간 IgG (H+L, Invitrogen cat.# A11013), 2 ㎍/ml의 CellMask Blue (Invitrogen cat.# H34558) 및 1 μM Hoechst 33342 (Invitrogen cat.# H3570)를 함유하는 30 ㎕의 새로운 배지를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 추가로 30분 동안 인큐베이션시켰다. 그 후 OPERA 고 처리량 공초점 현미경검사 (Perkin Elmer)를 이용하여 형광성 수준을 측정하였다.
ELISA 및 OPERA 확인 스크린에 의해 얻어진 결합 데이터로부터, 중간 규모 발현을 위한 64개 클론을 선택하였다.
실시예 2: 선택된 항- HER3 항체의 기능상 특성규명
생존력 분석을 이용하여 67개의 독특한 항체를 기능성 시험을 위해 선택하였다. 세포 손상은 부득이하게 대사성 세포 기능 및 성장을 위한 에너지를 유지하고 제공하는 세포의 능력을 상실시킬 것이다. 보통, 미토콘드리아 활성을 측정하는 대사 활성 검정은 이러한 전제를 기초로 한다. 세포 증식 시약 WST-1(Roche Cat. No. 11 644 807 001)은 생육할 수 있는 세포의 대사 활성을 측정하는 미리 제조된(ready-to-use) 기질이다. 이러한 실시예에서, 암세포를 2 ㎍/ml의 다양한 항-HER3 항체로 96시간 동안 처리한 후 대사적으로 활성인 세포의 수를 측정하는데 WST-1 검정을 이용하였다.
암세포주 MDA-MB-175 (ATCC cat.# HTB-25), A431NS (ATCC cat.# CRL-2592), MCF-7 (ATCC cat.# HTB-22) 및 MDA-MB-453 (ATCC cat.# HTB-130)을 96-웰 플레이트에 2 ㎍/ml의 항-HER3 항체를 함유하는 배지에서 1000개 세포/웰의 농도로 시딩하였다. 플레이트를 37℃에서 가습 인큐베이터에서 4일 동안 인큐베이션하였다. 이후, 20 μl의 WST-1 시약을 웰마다 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 플레이트를 오비탈 플레이트(orbital plate) 진탕기로 옮기고, 1시간 동안 두었다. ELISA 판독기 상에서 450 nm 및 620 nm(기준 파장)에서 흡광도를 측정하였다. 대사적으로 활성인 세포(MAC)의 수준에서의 차이를 하기와 같이 대조 상층액의 퍼센트로 계산하였다:
Figure 112013046896517-pct00005
대사 활성은 생육할 수 있는 세포의 수와 관련되며, %MAC가 낮을수록 항체에 의한 세포 성장 억제는 높은 수준에 해당하는 것으로 가정된다.
선택된 항체에 대한 이러한 분석 결과는 하기 표 5에 제시되며, 여기서 데이터는 개별적인 암 세포주에 대해 제공될 뿐 아니라 4개의 세포주에 걸친 중간 수준의 억제를 제공한다. 여러 기능적 활성을 지니는 HER3 항체들이 동정되었고 레퍼토리에 있는 항체들이 시험된 암 세포주 전부 또는 대부분에 대해 억제 효과를 나타냄이 이러한 결과로부터 명백하다.
표 5. 항- HER3 항체의 존재하에 대사적으로 활성인 세포 ( MAC )의 퍼센트
Figure 112013046896517-pct00006
HER3 억제에 가장 민감한 세포주 MDA-MB-175를 이용하여 표 5의 10개의 항체에 대해 용량-반응 곡선을 생성하였다; 참조: 도 1-10, 이들은 상이한 농도의 지시된 항체로 96시간 동안 처리된 MDA-MB-175 세포의 대사 활성을 나타낸다. 모든 시험된 항체가 MDA-MB-175 세포의 증식을 차단하였으나, 도 1-10에 도시된 생체내 데이터에 기반할 때, 항체 5101 및 5106이 가장 효과가 있는 것으로 보인다.
실시예 3: 항- HER3 항체에 의한 HER3 인산화의 억제
이러한 실시예는 항-HER3 항체가 HER3의 리간드 유도 인산화를 억제할 수 있음을 입증한다.
방법
항-HER3 항체로 처리된 세포주에서 HER3 인산화의 수준을 조사하기 위해, 항체로 1시간 동안 전처리된 후 10 nM의 헤레귤린 베타로 자극된 MDA-MB-175 및 MCF7 세포의 전 세포 용해물 상에서 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 세포를 T-75 배양 플라스크에서 성장시켰고 80% 컨플루언시(confluency)에서 배양 배지를 제거하고, 세포를 1xPBS로 세척하고, 0.5% FBS를 함유하는 5 ml의 배지에서 희석된 10 ㎍/ml의 항체로 처리하였다. 세포를 1시간 동안 처리한 후에, 전 세포 용해물을 표준 RIPA 완충제를 이용하여 제조하였다. 각각의 샘플에서 총 단백질 농도를 측정하였고 인산화된 HER3에 대한 일차 항체 (pHER3)를 이용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 10 ㎍의 단백질을 분석하였다.
결과
지시된 항체로 전처리한 지 1시간 후에 10 nM의 헤레귤린 베타로 자극시킨 세포주 MDA-MB-175 및 MCF7에서의 포스포-HER3 수준의 웨스턴 블롯 분석의 결과를 도 11에 도시하였다. 상이한 항-HER3 항체들은 다양한 정도로 리간드 유도 HER3 인산화를 억제하였고, 이러한 검정에서 가장 좋은 항체는 5101, 5106, 5259 및 4889였다. 항체 5038 및 5143은 이러한 세포주에서의 인산화된 HER3의 수준에 대해 단지 제한적인 효과만을 지녔다.
실시예 4: 2개의 항- HER3 항체의 혼합물의 기능상 특성규명
본 실시예는 인간 HER3과의 결합이 확인된 본 발명의 10개의 선택된 항-HER3 항체 중에서 모든 가능한 2개의 항체의 혼합물의 시험관내 시험을 기재한다. 항체 혼합물은 하기 4개의 상이한 암 세포주의 성장을 억제하는 능력에 대해 평가되었다: MDA-MB-175, MCF7 (+ 1 nM 헤레귤린 베타), H1437 (+ 1 nM 헤레귤린 베타) 및 A431NS (1 ㎍/ml의 항-EGFR 혼합물 992+1024). 항-EGFR 혼합물 992+1024는 WO 2008/104183호에 기재된 992 및 1024로서 지칭되는 2개의 항-EGFR 항체를 동등한 양으로 함유한다.
방법
인간 HER3 수용체와의 결합이 각각 확인된 항체 4785, 4889, 4935, 5038, 5082, 5101, 5106, 5143, 5144 및 5259를 모든 가능한 2개의 항체의 혼합물로 시험하여 최적 효능을 지니는 항체 혼합물을 확인하였다. 예컨대 384-웰 플레이트에서 상이한 항체 조합물을 제조하기 위해 사용된 방법은 WO 2010/040356호에 일반적으로 기재된 것들이었다. 추가의 상세설명이 하기에 제공된다.
2개의 항체의 혼합물
10개의 항체를 1xPBS에서 25 ㎍/ml의 농도로 희석시키고, 100 ㎕의 항체 용액을 시험용 2개 항체의 혼합물을 제조하는데 사용되는 384-웰 피더(feeder) 플레이트의 웰에 첨가하였다.
시험되는 4개의 세포주 각각에 대해, 세포가 웰에 첨가된 46 ㎕의 배지를 지니는 2개의 분리된 384-웰 플레이트를 이용하였다. Biomek 3000 래보러토리 오토메이션 워크스테이션 (Beckman Coulter)을 이용하여 피더 플레이트로부터의 2 ㎕의 2개의 상이한 항체들 각각을 배지 + 세포를 함유하는 384-웰 플레이트의 웰에 첨가함으로써, 2개의 상이한 항체의 모든 조합물을 제공하였다. 또한, 플레이트는 배지 대조 웰 (50 ㎕ 1xPBS 배지; 세포 없음), 미처리된 대조 웰 (50 ㎕ 1xPBS 배지 + 세포; 항체 없음), 및 추가 대조군으로서 본 발명의 10개의 항체들 중 단 하나만을 지니는 4 ㎕의 배지를 함유하는 (46 ㎕의 배지 + 세포 외에) 웰을 포함하였다.
2개의 항체의 혼합물을 함유하는 웰뿐 아니라 배지와 미처리된 대조 웰 또는 본 발명의 단일 항체를 함유하는 웰을 지니는 플레이트를 가습된 인큐베이터에서 37℃에서 4일간 인큐베이션시키고, 그 후 1xPBS에서 1:1 희석된 5 ㎕의 세포 증식 시약 WST-1을 플레이트 상의 모든 관련 웰에 첨가하였다. 이어서 플레이트를 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션시킨 후 오비탈 진탕기로 옮기고 추가로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 흡광도를 ELISA 판독기 상에서 450 nm 및 620 nm (기준 파장)에서 측정하였다. 대사적으로 활성인 세포 (MAC)의 양을 실시예 2에 기재된 대로 계산하였다.
세포주 MDA-MB-175 및 MCF-7을 이용하여 선택된 혼합물 (하기 표 6에 굵은 체로 강조됨)에 대한 용량-반응 곡선을 생성하였다. WST-1 검정을 수행하기 전에, 적절한 항체 및 항체 혼합물을 2%의 FBS 및 1%의 페니실린/스트렙토마이신 (P/S)이 보충된 적절한 배지에서 100 ㎍/ml의 최종 총 항체 농도로 희석시켜, 가장 높은 항체 농도를 함유하는 웰에서 50 ㎍/ml의 최종 총 항체 농도를 산출하였다. 그 후 항체의 2배 연속 희석을 수행하였다. 이어서 적절한 수의 세포를 384-웰 플레이트의 실험용 웰에 첨가하였다. 플레이트를 가습된 인큐베이터에서 37℃에서 4일간 인큐베이션하였다. 대사적으로 활성인 세포 (MAC)의 양을 실시예 2에 기재된 대로 미처리 대조군의 퍼센트로서 산출하였다.
결과
개별적인 항체 및 2개 항체의 혼합물을 %MAC로서 산출된, 세포 성장에 대한 이들의 중간 효과에 따라 랭크하였다. 이러한 결과를 하기 표 6에 기재한다.
상기 결과는, 다양한 혼합물에 의한 성장 억제의 수준이 상이한 세포주들 간에 현저하게 다양한 한편, 중간 %MAC에서의 차이는 덜 뚜렷함을 나타낸다. 모노클로날 항체 5082가 중간 성장 억제의 가장 높은 수준을 지니는 한편 (가장 낮은 %MAC), 여러 항체 혼합물이 세포주 MDA-MB-175를 억제함에 있어서 탁월한 것으로 나타났다. 비록 표 6의 항체 및 항체 혼합물이 4개의 세포주에 대한 중간 %MAC에 기반하여 랭크되었으나, 개별적인 항체 혼합물은 어떠한 하나 이상의 세포주에서 입증된 효과에 기반할 때 흥미로울 수 있고, 단 하나의 세포주에서의 높은 억제 수준 (낮은 %MAC)은 특정 유형의 암에 대해 생체내에서 고도로 유용한 항체 조합물로 해석될 수 있는 것으로 고려됨이 주목되어야 한다.
HER3의 비중첩 에피토프에 결합하는 2개 항체의 혼합물 및 독특한 에피토프 저장소(bin) 조합물(굵은 체로 강조됨)에 대한 용량-반응 곡선을 생성하였다. 상기 결과는 모든 혼합물이 상이한 효능이긴 하나 4개 모두의 세포주를 억제함을 나타낸다.
표 6. 4개의 암 세포주 MDA - MB -175, MCF7 , H1437 및 A431NS에서 2개의 항-HER3 항체의 혼합물에 의한 암 세포 성장 억제의 수준. 억제 수준은 대사적으로 활성인 세포 % (% MAC )로서 제시된다.
Figure 112013046896517-pct00007
Figure 112013046896517-pct00008
도 12-15는 4개의 상이한 세포주에서 항-HER3 항체의 선택된 혼합물 (상기 표에서 굵은 체로 강조된 혼합물)의 대사 활성을 나타낸다. 도 12는 MDA-MB-175 세포주에서의 대사 활성을 나타내고, 도 13은 1 ㎍/ml의 Sym004의 존재하에 A431NS 세포주에서의 활성을 나타내며, 도 14는 nM 헤레귤린 베타의 존재하에 MCF7 세포주에서의 활성을 나타내고, 도 15는 1nM 헤레귤린 베타의 존재하에 H1437 세포주에서의 활성을 나타낸다.
실시예 5: 3개의 항- HER3 항체의 혼합물의 기능상 특성규명
본 실시예는 인간 HER3과의 결합이 확인된 본 발명의 선택된 항-HER3 항체들 중에서 비중첩 에피토프를 지니는 3개의 항체의 혼합물 및 독특한 에피토프 저장소 조합물의 시험관내 시험을 기재한다. 항체 혼합물은 하기 4개의 상이한 암 세포주의 성장을 억제하는 이들의 능력에 대해 평가되었다: MDA-MB-175, MCF7 (+ 1 nM 헤레귤린 베타), H1437 (+ 1 nM 헤레귤린 베타) 및 A431NS (1 ㎍/ml의 항-EGFR 혼합물 992+1024).
방법
인간 HER3 수용체와의 결합이 각각 확인된 항체 4785, 4889, 5038, 5082, 5106, 5143 및 5259를 3개의 항체의 혼합물에서 시험하여 최적 효능을 갖는 항체 혼합물을 확인하였다. 선택된 항체 및 항체 혼합물을 암 세포주 MDA-MB-175, MCF7 (+ 1 nM 헤레귤린 베타), H1437 (+ 1 nM 헤레귤린 베타) 및 A431NS (1 ㎍/ml의 항-EGFR 혼합물 992+1024)의 성장 및 증식을 억제하는 능력에 대해 실시예 4에 기재된 WST-1 생존력 분석을 이용하여 시험하였다.
결과
시험된 3개 항체의 혼합물은 모두 상이한 효능이긴 하나 4개 모두의 세포주를 억제하는 것으로 나타났다.
도 16-19는 4개의 암 세포주에서 3개의 항-HER3 항체의 상이한 혼합물의 대사 활성을 나타낸다. 도 16은 MDA-MB-175 세포주에서의 대사 활성을 나타내고, 도 17은 1 ㎍/ml의 Sym004의 존재하에 A431NS 세포주에서의 활성을 나타내며, 도 18은 nM 헤레귤린 베타의 존재하에 MCF7 세포주에서의 활성을 나타내고, 도 19는 1nM 헤레귤린 베타의 존재하에 H1437 세포주에서의 활성을 나타낸다.
실시예 6: 항- HER3 2개의 혼합물에 의한 암 성장의 상승적 억제
본 실시예는 특정 항-HER3 항체 혼합물이 암 세포의 성장을 상승적으로 억제함을 입증한다.
방법
인간 HER3 수용체와의 결합이 각각 확인된 항체 5038, 5082 및 5144를 2개 항체의 혼합물인 5038+5082 및 5082+5144로서 시험하였고, 각 경우에 2개 항체의 혼합물을 혼합물 중 개별적인 두 항체와 비교함에 의해 세포 성장의 상승적인 억제를 조사하였다. 선택된 항체 및 항체 혼합물을 실시예 4에 기재된 WST-1 생존력 분석을 이용하여 암 세포주 MDA-MB-175의 성장 및 증식을 억제하는 이들의 능력에 대해 시험하였다.
결과
상기 결과는, 항체 5038+5082 또는 5082+5144의 혼합물이 암 세포주 MDA-MB-175의 성장을 상승적으로 억제함을 나타낸다 (도 20 및 21).
실시예 7: 항- HER3 항체 혼합물 및 참조 모노클로날 항체의 비교
본 실시예는 세포주 MDA-MB-175 및 MCF-7에서 항-HER3 항체 혼합물 (5038+5082) 및 참조 항체 퍼투주맙 및 MM-121의 유사체의 시험관내 비교를 기재한다. 퍼투주맙은 HER2의 이합체화 아암에 결합하여 HER2/HER3 헤테로이합체화를 차단하는 항-HER2 항체이다. 퍼투주맙 유사체는 WO 2006/033700 및 US 2006/0121044 A1호에 기재된 퍼투주맙의 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열을 지닌다. MM-121은 헤레귤린 결합을 차단하여 HER3의 활성화를 차단하는 항-HER3 항체이다 (참조: WO 2010/019952 and Schoeberl et al., Cancer Res.70(6):2485-94, March 2010).
방법
실시예 4에 기재된 대로 용량-반응 곡선을 생성하였다. 신호 펩티드 없이 각각의 항체의 전(whole) 람다 경쇄 (MM-121) 또는 카파 경쇄 (퍼투주맙)를 합성하고, 플랭킹 NheI 및 NotI 제한 부위를 첨가하고, HEK 293 세포에서의 일시적인 발현을 위해 발현 벡터내로 클로닝시킴에 의해 참조 항-HER3 모노클로날 항체 MM-121 (Merrimack; WO 2008/100624호에 기재된 서열) 및 참조 항-HER2 항체 퍼투주맙 (Omnitarg™, 2C4 및 R-1273로도 공지됨; US 2006/121044 A1호에 기재된 서열)의 유사체를 생성하였다. 개별적인 항체의 중쇄 VH 영역을 신호 펩티드 없이 합성한 후에, AscI 및 XhoI 부위를 첨가하고, 생성된 서열을 3개의 불변 IgG 중쇄 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 엔코딩하는 서열도 함유하는, 경쇄 발현에 이용되는 동일한 발현 벡터내로 클로닝시켰다. 벡터는 각각의 항체의 2개 사슬의 발현을 위한 헤드-투-헤드 배향으로 한 쌍의 CMV 프로모터를 포함하였다.
결과
상기 결과는, 항체 혼합물 5038+5082가 2개의 암 세포주 MDA-MB-175 및 MCF7의 성장을 억제함에 있어서 참조 항체 MM-121보다 우수함을 나타낸다. 이러한 세포주를 이용할 때 퍼투주맙에 비해 5038+5082의 명백한 우수성은 발견되지 않았다. MDA-MB-175 세포에서의 대사 활성을 도 22에 도시하며, 1 nm 헤레귤린 베타의 존재하에 MCF7 세포에서의 대사 활성을 도 23에 도시한다.
실시예 8: 항- HER3 항체 혼합물은 HER3 분해를 유도한다
본 실시예는 2개의 항-HER3 항체의 혼합물이 개별적인 항-HER3 항체에 비해 더욱 효율적인 HER3 분해를 유도할 수 있음을 입증한다. 본 연구에서 퍼투주맙 유사체도 시험하였다.
방법
항-HER3 항체로 처리된 세포주에서 HER3의 수준을 조사하기 위해, 다양한 시간 동안 항체로 처리된 OVCAR-8 세포의 전 세포 용해물에 대해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 세포를 T-75 배양 플라스크에서 성장시켰고 80% 컨플루언시에서 배양 배지를 제거하고, 세포를 1xPBS에서 세척하고 0.5% FBS를 함유하는 5 ml 배지에서 희석된 20 ㎍/ml의 항체로 처리하였다. 세포를 1, 2, 4, 16 또는 48시간 동안 처리한 후에 전 세포 용해물을 표준 RIPA 완충제를 이용하여 제조하였다. 총 단백질 농도를 각각의 샘플에서 측정하고 10 ㎍의 단백질을 HER3에 대한 일차 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다.
결과
HER3 수준의 조사 결과 (도 24)는 개별적인 항체 및 혼합물 둘 모두가 신속한 HER3 분해를 유도하였음을 입증하였다. 그러나, 항-HER3 혼합물이 개별적인 항체에 비해 더 높은 수준의 HER3 분해를 유도하였다. 퍼투주맙 유사체는 HER3 분해를 유도할 수 없었는데, 이는 이것이 HER2에 결합하나 HER3에는 결합하지 않는다는 가정하에 예상된 것이었다.
실시예 9: 항- HER3 항체 혼합물은 HER3 신호전달을 억제한다
본 실시예는 2개의 항-HER3 항체의 혼합물이 개별적인 항체보다 HER3 인산화 및 다운스트림 신호전달의 더욱 효율적인 억제를 유도할 수 있음을 입증한다.
방법
HER3 인산화 및 다운스트림 신호전달의 수준을 조사하기 위해, 세포주를 다양한 시간 동안 항-HER3 항체로 처리하고, 웨스턴 블롯 분석을 전 세포 용해물에 대해 수행하였다. MDA-MB-175 세포를 T-75 배양 플라스크에서 성장시켰고, 80% 컨플루언시에서 배양 배지를 제거한 후, 세포를 1xPBS에서 세척하고, 0.5% FBS를 함유하는 5 ml 배지에서 희석된 10 ㎍/ml의 항체로 처리하였다. 세포를 2, 4, 16 또는 48시간 동안 처리한 후에 표준 RIPA 완충제를 이용하여 전 세포 용해물을 제조하였다. 총 단백질 농도를 각각의 샘플에서 측정하였고, 10 ㎍의 단백질을 각각 pHER3, pAKT(Ser465), AKT 및 액틴에 대한 일차 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다.
결과
HER3 신호전달의 조사 결과 (도 25)는 개별적인 항체 및 혼합물 둘 모두가 HER3 및 AKT 인산화의 신속한 억제를 유도하였음을 입증하였다. 그러나, 항-HER3 혼합물이 HER3 및 AKT 인산화를 억제함에 있어서 개별적인 항체보다 우수하였다.
실시예 10: 항- HER3 혼합물의 생체내 효능
항-HER3 모노클로날 항체 5038 및 5082 그리고 5038+5082의 혼합물의 생체내 효능을 평가하기 위해, 화합물을 A549 폐암 이종이식 모델에서 시험하였다.
방법
2x106개 A549 세포를 8-10주령의 가슴샘없는 암컷 누드 마우스의 좌측 옆구리에 피하 접종시켰다. 캘리퍼스를 이용하여 매주 2회 종양을 측정하였고, 종양 부피를 하기 식에 따라 mm3으로 산출하였다: (폭)2 x 길이 x 0.5. 평균 종양 크기가 115 mm3일 때, 마우스를 랜덤화하고 치료를 개시하였다. 50 mg/kg의 5038, 5082 또는 5038+5082를 매주 2회씩 5주간 복막내 주입시켜 마우스를 치료하고 (총 10회 주입) 관찰 기간을 두었다. 실험은 항-HER3 항체와 동일한 스케쥴에 따라 각각 투약되고 투여되는 항-EGFR 모노클로날 항체 세툭시맙 (아이소형 대조군으로서) 및 비히클 대조군을 포함하였다.
결과
상기 연구 결과를 도 26에 도시하며, 여기서 5038 또는 5038+5082의 조합물로 치료된 마우스에서 종양 성장이 26일 (치료 시작)부터 37일까지 치료에 반응하여 제어된 것으로 나타났다. 이 시점 이후에, 비록 성장이 세툭시맙 또는 비히클 대조군에서의 종양에 비해 느리긴 했으나, 2개의 그룹에서의 종양이 커지기 시작했다. 이 시점 이후의 결과가 통계적으로 유의하진 않지만, 5038 및 5038+5082 처리된 그룹에서의 종양이 대조군뿐 아니라 세툭시맙 또는 5082를 투여받은 그룹에서의 종양에 비해 느리게 성장하는 경향이 명백하였다. 5082만으로 치료되거나 세툭시맙과 함께 치료된 마우스는 치료에 반응하지 않았고 비히클 대조군과 유사한 종양 성장 동력학을 나타내었다.
요약해 보면, 상기 결과는 5038 및 5038+5082의 조합물이 A549 종양 이종이식의 성장을 조절함에 있어서 5082 단독, 세툭시맙 또는 비히클 대조군으로의 치료에 비해 더 양호하였음을 시사한다.
실시예 11: 개별적인 HER3 도메인에 대한 항- HER3 항체의 맵핑
본 실시예는 기능 활성을 갖는 항-HER3 항체의 생성된 패널이 인간/마우스 키메라 수용체 작제물에 대한 결합 프로파일에 의해 도시된 대로 HER3 세포외 도메인 (ECD) 도메인 I 또는 도메인 II에 대해 유도되었음을 입증한다.
방법
항-HER3 항체 패널이 마우스에서 생성되었기 때문에, 항체는 "자가 관용(self tolerance)"의 개념으로 인해 뮤린 HER3 상에 존재하는 에피토프를 인지하지 않을 것으로 예상된다. 결과적으로, 개별적인 도메인을 코딩하는 인간 서열이 뮤린 서열로 대체된 키메라 수용체 작제물을 에피토프 맵핑 목적으로 이용할 수 있는데, 그 이유는 항체가 인간 HER3 작제물에서 삽입된 뮤린 서열에 결합하지 않을 것으로 예상되기 때문이다. 인간 및 뮤린 HER3 mRNA 서열 (각각 수탁 번호 M29366 및 NM_010153.1)을 NCBI로부터 다운로드하였고, 세포외 도메인 I-IV를 Kani 등 (J. Biol . Chem. (2005) 280:8238-8247)이 기재한 대로 지정하였다. 4개의 인간 세포외 HER3 도메인 각각이 개별적인 뮤린 DNA 서열로 대체된 키메라 인간/뮤린 도메인 교환 변이체에 N-말단 히스티딘 태그를 제공하고, 유전자 합성시키고, Hek 293 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 완전한 인간 및 뮤린 ECD 작제물을 양성 및 음성 대조군으로서 각각 이용하였다. 일시적으로 발현된 수용체 작제물로부터의 상층액을 니켈 NTA 컬럼을 이용하여 히스티딘 태그 친화성 크로마토그래피에 의해 정제시키고, 정제된 단백질을 ELISA 플레이트에서 1 ㎍/ml의 카르보네이트 완충제로 밤새 코팅시켰다. 다음 날 웰을 1% BSA/PBS-T로 차단시키고, 차단 완충제에서 희석된 항체의 적정액을 첨가하였다. 마지막으로, 웰을 세척하고, HRP에 컨쥬게이션된 마우스 항-인간 IgG Fc를 첨가한 후 세척하고 TMB 기질을 첨가함에 의해 ELISA를 진행시켰다.
결과
항체 5101 및 5106은 면역화 동안 파괴된 관용성을 지니며 뮤린 HER3에 대해 반응하는 것으로 나타났다 (도 27-32). 그러나 5101 및 5106은 도메인 I이 인간 서열을 지니는 다른 키메라 작제물보다 뮤린 DI-인간 DII-IV HER3 작제물 (즉, 뮤린 도메인 I 및 인간 도메인 II-IV을 지니는 작제물) 상에서 보다 낮은 ELISA 광학 밀도 (OD) 값을 지니기 때문에, 이러한 2개의 항체는 인간 HER3의 도메인 I (DI) 내에 위치한 에피토프에 결합한다고 결론내릴 수 있다. 항체 5144 및 5259는 뮤린 DI를 인지하지 못했고 뮤린 DII 교환 변이체에 약하게 결합하였다. 이러한 2개의 항체는 결과적으로 인간 HER3 상의 도메인 I 및 II와 중첩되는 에피토프에 대해 유도된다. 항체의 나머지는 뮤린 DI 교환 변이체를 인지하지 못했으나 그 밖의 변이체에는 결합하였고, 따라서 인간 HER3의 도메인 I 상의 에피토프에 대해 유도된다.
항-HER3 항체의 도메인 맵핑은 도 27-32에 도시되어 있으며, 이것은 항-HER3 항체 및 코팅된 HER3 항원에 대한 음성 대조군의 적정이다. 결합된 항체를 항-인간 Fc 항체로 검출하였다. 인간 HER3 Fc에 대해 높은 백그라운드가 관찰되었는데, 이는 항-Fc 컨쥬게이트와 HER3 Fc 융합 단백질 간의 교차 반응성 때문이다. 그러나, 음성 대조군은 특이적 결합과 비특이적 결합 간의 차이를 명백하게 입증한다. 하기 표 7은 상이한 항-HER3 항체에 의해 표적화된 HER3 도메인의 개관을 제공한다.
표 7: 상이한 항- HER3 항체에 의해 표적화된 도메인
Figure 112013046896517-pct00009
실시예 12: 표면 플라즈몬 공명에 의한 항- HER3 항체의 에피토프 비닝
본 실시예는 기능 활성을 갖는 항-HER3 항체의 얼마나 많은 쌍이 HER3 ECD의 도메인 I 또는 II 상에서 5개 이상의 비중첩 에피토프 저장소를 표적화하는 지를 나타낸다.
방법
Biacore 2000 기계 (GE Healthcare, Denmark) 상에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 분석으로 항체 쌍들을 시험함에 의해 항체 교차-경쟁 분석을 수행하였다. CM5 센서 칩 (GE Healthcare, Denmark)을 제조자의 지시에 따라 10,000 공명 단위 (RU)의 항-테트라 히스티딘 항체 (Qiagen, Germany)에 컨쥬게이션시켰다. 히스티딘-태깅된(tagged) HER3-Fc 융합 단백질 (R&D Systems)을 HBS 완충제에서 희석시키고 항-히스티딘 표면 상에 5 ㎕/분의 유속으로 포획시켰다. 경쟁시키며 그리고 경쟁시키지 않으며 최대 반응 수준을 기록함에 의해 항체 조합물을 40 ㎍/ml의 포화 농도에서 경쟁적 결합 실험으로 평가하였다. 10 mM 글리신-HCl, pH 2를 주입시켜 칩 표면을 재생시켰다.
결과
시험된 10개의 항-HER3 항체가 5개의 상이한 비중첩 에피토프 저장소로 클러스터링되는 것이 발견되었다 (도 33+34). 에피토프 저장소 1은 3개의 항체 4785, 4935 및 5143을 함유하였다. 에피토프 저장소 II는 항체 5082 및 4889를 함유하였고 이 중 mAb 5082도 에피토프 저장소 1로부터의 mAb 5143과 교차-경쟁하는 것으로 나타났다. 에피토프 저장소 III은 독특하였고 mAb 5038만을 함유하였다. 에피토프 저장소 IV는 mAb 5101 및 5106을 함유하였고, 이들은 또한 마우스 HER3 단백질과 교차-반응하였다 (실시예 11). 마지막으로, 에피토프 저장소 V는 항체 5144 및 5259를 함유하였고, 이들은 DI 및 DII 둘 모두에 존재하는 유사한 에피토프에 결합하는 것으로 나타났다 (실시예 11).
도 33은 항체 교차-경쟁 분석에 의한 에피토프 비닝의 결과를 갖는 표를 나타낸다. 분석은, HER3 항원을 먼저 상단에 나열된 항체로 포화시킨 후에 좌측에 나열된 항체를 주입시킴에 의해 수행되었다. 세포에서의 숫자는 하기로서 산출된 경쟁 퍼센트를 지칭한다:
(1-(경쟁시켰을 때 최대 반응/경쟁시키지 않았을 때 최대 반응) x 100
박스로 표시된 세포는 서로 50% 이상만큼을 억제하는 항체 쌍을 나타낸다. 항체는 경쟁 프로파일에 따라 에피토프 저장소로 지정된다; 지정된 에피토프 저장소들 간의 관련성에 대한 그래픽 삽화를 제공하며, 여기서 겹쳐진 원은 중첩 에피토프를 갖는 항체를 나타내는 도 34 참조.
실시예 13: 항- HER3 혼합물의 생체내 효능
항-HER3 모노클로날 항체 5038 및 5082 그리고 5038+5082의 혼합물의 생체내 효능을 평가하기 위해, BxPC3 췌장암 이종이식 모델에서 화합물을 시험하였다.
방법
5x106개 BxPC3 세포를 8-10주령의 가슴샘없는 암컷 누드 마우스의 좌측 옆구리에 피하 접종시켰다. 캘리퍼스를 이용하여 매주 2회 종양을 측정하였고, 종양 부피를 하기 식에 따라 mm3으로 산출하였다: (폭)2 x 길이 x 0.5. 평균 종양 크기가 165 mm3일 때, 마우스를 랜덤화하고 치료를 개시하였다. 50 mg/kg의 5038, 5082 또는 5038+5082의 혼합물을 매주 2회씩 3주간 복막내 주입시켜 마우스를 치료하고 (총 6회 주입) 관찰 기간을 두었다. 실험은 상기 항-HER3 항체에 대해 기재된 바와 동일한 스케쥴에 따라 각각 투약되고 투여되는 비히클 대조군을 포함하였다.
결과
5038 또는 5038+5082의 조합물로 치료된 마우스에서, 종양 성장은 비히클 대조군에서의 마우스에 비해 현저하게 잘 억제되었다 (도 35). 5038+5082로 치료된 마우스에서, 비히클 대조군에 비해 현저한 차이는 처음 치료 후 5일 정도로 빨리 관찰되었고 연구 기간 내내 지속되었다. 5038로 치료된 마우스는 57일부터 하루(64일)를 제외하고 비히클 대조군으로 치료된 동물에 비해 종양 성장을 제어하는데 있어서 현저하게 양호하였고, 이는 연구 기간 내내 관찰되었다.
5038 및 5038+5082의 조합물에 의한 종양 성장의 효과적인 억제는 생존율에 있어서도 관찰될 수 있었다. 이러한 치료 둘 모두는 5038의 경우 0.003의 p-값 및 5038+5082의 경우 0.001의 p-값으로 로그 랭크(Log rank)(Mantel Cox)에 의해 산출된 대로 비히클 대조군에 비해 현저하게 양호하였다 (도 36).
요약해 보면, 5038 및 5038+5082의 조합물은 BxPC3 종양 이종이식을 지니는 동물의 종양 성장을 억제하고 생존율을 향상시키는데 있어서 비히클 대조군에 비해 현저하게 양호하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Symphogen A/S <120> Anti-HER3 antibodies and combinations <130> P142PC00 <160> 83 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 354 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> Ab 4785 VH DNA <400> 1 gaggtccaac tgcaacagtc tggaccagaa ctggtgatgc ctggggcttc agtgaagata 60 tcctgcaagg cttctggcta cagcttcaca agctactatg tacactgggt gaagcagagg 120 cctggacagg gacttgagtg gattggatgg atttatcctg gaagtggtca tactaagtac 180 aatgagaagt tcaaggacaa ggccacactg acggcagaca catcctccag cactgcctac 240 atgcaactca gcagcctaac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagacccccc 300 tactatagta actacgccga tgtctggggc acagggacca cggtcaccgt ctcg 354 <210> 2 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab 4785 VH <400> 2 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Met Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Val His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly His 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ctgatgatgt tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtgg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgaactg tggctgcacc atctgtcttc 360 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540 agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600 acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttaataa 660 g 661 <210> 12 <211> 218 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab 4935 LC <400> 12 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Gly Asn Thr Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys 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ttgttgagtc tgggggaggc ctagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatggca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccggaaaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attcgtgatg gtggaggtta cacctactat 180 tcagacaatg taaagggccg attcaccatc tccagggaca atgcccagaa caatctgtat 240 ttgcaaatga gccatctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgc aagaggtata 300 ttggactact ggggtcaagg aacctcagtc accgtctcg 339 <210> 22 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab 5101 VH <400> 22 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Arg Asp Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Gln Asn Asn Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser His Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ile Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val 100 105 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DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> Ab 5106 VH DNA <400> 25 gaagtgaagc tggttgagtc tgggggagac ttagtgaagc ctggagagtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctttgcca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccggaaaaga ggctggaatg ggtcgcaacc attagtgatg gtggtagtca tctttactat 180 ccggacaatg taaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa taacctgtac 240 ctgcagatga gccatctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgc aagaggtatt 300 ttggactact ggggtcaagg aacctcagtc accgtctcg 339 <210> 26 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab 5106 VH <400> 26 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser His Leu Tyr Tyr Pro Asp Asn Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser His Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr 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musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab 5106 LC <400> 28 Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Arg Ile Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu 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gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 600 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 660 taataag 667 <210> 32 <211> 220 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab 5143 LC <400> 32 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Met Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser 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aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 360 gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 420 agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 480 agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 540 agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 600 agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt aataag 646 <210> 40 <211> 213 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ab 5259 LC <400> 40 Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 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Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 43 <211> 1602 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Human IGHG1 constant domain genomic sequence <220> <221> exon <222> (1)..(298) <220> <221> exon <222> (690)..(734) <220> <221> exon <222> (853)..(1182) <220> <221> exon <222> (1280)..(1602) <400> 43 agt gcc tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc 48 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 1 5 10 15 aag agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac 96 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 20 25 30 tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc 144 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 35 40 45 agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac 192 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 50 55 60 tcc ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag 240 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 65 70 75 80 acc tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac 288 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 85 90 95 aag aga gtt g gtgagaggcc agcacaggga gggagggtgt ctgctggaag 338 Lys Arg Val ccaggctcag cgctcctgcc tggacgcatc ccggctatgc agtcccagtc cagggcagca 398 aggcaggccc cgtctgcctc ttcacccgga ggcctctgcc cgccccactc atgctcaggg 458 agagggtctt ctggcttttt ccccaggctc tgggcaggca caggctaggt gcccctaacc 518 caggccctgc acacaaaggg gcaggtgctg ggctcagacc tgccaagagc catatccggg 578 aggaccctgc ccctgaccta agcccacccc aaaggccaaa ctctccactc cctcagctcg 638 gacaccttct ctcctcccag attccagtaa ctcccaatct tctctctgca g ag ccc 694 Glu Pro 100 aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca g gtaagccagc 744 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 105 110 ccaggcctcg ccctccagct caaggcggga caggtgccct agagtagcct gcatccaggg 804 acaggcccca gccgggtgct gacacgtcca cctccatctc ttcctcag ca cct gaa 860 Ala Pro Glu 115 ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac 908 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 120 125 130 acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac 956 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 135 140 145 gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc 1004 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 150 155 160 165 gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac 1052 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 170 175 180 agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg 1100 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 185 190 195 ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca 1148 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 200 205 210 gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa g gtgggacccg 1192 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 215 220 tggggtgcga gggccacatg gacagaggcc ggctcggccc accctctgcc ctgagagtga 1252 ccgctgtacc aacctctgtc cctacag gg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac 1305 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 225 230 acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg 1353 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 235 240 245 acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg 1401 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 250 255 260 265 gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg 1449 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 270 275 280 ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tat agc aag ctc acc gtg gac 1497 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 285 290 295 aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat 1545 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 300 305 310 gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tcc ccg 1593 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 315 320 325 ggt aaa tga 1602 Gly Lys 330 <210> 44 <211> 331 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Human IGHG1 constant region <400> 44 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 1 5 10 15 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 35 40 45 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 50 55 60 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 65 70 75 80 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 85 90 95 Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 100 105 110 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 115 120 125 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 130 135 140 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 145 150 155 160 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 165 170 175 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 180 185 190 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 195 200 205 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 210 215 220 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 225 230 235 240 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 245 250 255 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 260 265 270 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 275 280 285 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 290 295 300 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 305 310 315 320 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 45 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 4785/5143 HCDR1 <400> 45 Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Tyr 1 5 <210> 46 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 4785/5143 HCDR2 <400> 46 Ile Tyr Pro Gly Ser Gly His Thr 1 5 <210> 47 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 4785/5143 HCDR3 <400> 47 Cys Ala Arg Pro Pro Tyr Tyr Ser Asn Tyr Ala Asp Val Trp 1 5 10 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 4889/5082 HCDR1 <400> 48 Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Ala Tyr Tyr 1 5 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 4889 HCDR2 <400> 49 Val Ser Tyr Asp Gly Ser Asn 1 5 <210> 50 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 4889 HCDR3 <400> 50 Cys Ala Arg Glu Gly Asp Tyr Gly Tyr Ser Asp Tyr Trp 1 5 10 <210> 51 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 4935 HCDR1 <400> 51 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr 1 5 <210> 52 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 4935 HCDR2 <400> 52 Ile Tyr Pro Gly Asn Val His Thr 1 5 <210> 53 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 4935 HCDR3 <400> 53 Cys Val Arg Arg Tyr Gly Tyr Asp Gly Asp Trp Phe Ala Tyr Trp 1 5 10 15 <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 5038 HCDR1 <400> 54 Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly Phe Tyr 1 5 <210> 55 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 5038 HCDR2 <400> 55 Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn 1 5 <210> 56 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 5038 HCDR3 <400> 56 Cys Ala Arg Gly Gly Gly Tyr Tyr Gly Asn Leu Phe Asp Tyr Trp 1 5 10 15 <210> 57 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 5082 HCDR2 <400> 57 Ile Gly Tyr Asp Gly Arg Asn 1 5 <210> 58 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 5082 HCDR3 <400> 58 Cys Ser Arg Glu Gly Asp Tyr Gly Tyr Ser Asp Tyr Trp 1 5 10 <210> 59 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 5101 HCDR1 <400> 59 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly 1 5 <210> 60 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 5101 HCDR2 <400> 60 Ile Arg Asp Gly Gly Gly Tyr Thr 1 5 <210> 61 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 5101/5106 HCDR3 <400> 61 Cys Ala Arg Gly Ile Leu Asp Tyr Trp 1 5 <210> 62 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 5106 HCDR1 <400> 62 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Ala 1 5 <210> 63 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 5106 HCDR2 <400> 63 Ile Ser Asp Gly Gly Ser His Leu 1 5 <210> 64 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 5144 HCDR1 <400> 64 Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr Ser 1 5 <210> 65 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 5144/5259 HCDR2 <400> 65 Ile Trp Gly Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 66 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 5144 HCDR3 <400> 66 Cys Val Arg Lys Gly Ile Thr Thr Thr Gly Phe Asp Tyr Trp 1 5 10 <210> 67 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 5259 HCDR1 <400> 67 Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr Thr 1 5 <210> 68 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 5259 HCDR3 <400> 68 Cys Ala Arg Lys Gly Ile Thr Thr Thr Gly Phe Asp Tyr Trp 1 5 10 <210> 69 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 4785/5143 LCDR1 <400> 69 Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr 1 5 10 <210> 70 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 4785 LCDR3 <400> 70 Cys Gln Ser Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe 1 5 10 <210> 71 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 4889/5038/5101 LCDR1 <400> 71 Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 1 5 <210> 72 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 4889 LCDR3 <400> 72 Cys Gln Gln Ser Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe 1 5 10 <210> 73 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 4935 LCDR1 <400> 73 Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Thr Phe 1 5 10 <210> 74 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 4935 LCDR3 <400> 74 Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Trp Thr Phe 1 5 10 <210> 75 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 5038 LCDR3 <400> 75 Cys Gln Gln Gly Ile Thr Leu Pro Trp Thr Phe 1 5 10 <210> 76 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 5082/5106 LCDR1 <400> 76 Gln Asp Ile Asn Asn Tyr 1 5 <210> 77 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 5082 LCDR3 <400> 77 Cys Gln Gln Ser Glu Thr Leu Pro Trp Thr Phe 1 5 10 <210> 78 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 5101 LCDR3 <400> 78 Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe 1 5 10 <210> 79 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 5106 LCDR3 <400> 79 Cys Gln Gln Tyr Ser Arg Ile Pro Tyr Thr Phe 1 5 10 <210> 80 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 5143 LCDR3 <400> 80 Cys Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe 1 5 10 <210> 81 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 5144/5259 LCDR1 <400> 81 Ser Ser Val Ser Tyr 1 5 <210> 82 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 5144 LCDR3 <400> 82 Cys Gln Gln Leu Ser Ser Tyr Pro Pro Thr Phe 1 5 10 <210> 83 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> 5259 LCDR3 <400> 83 Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Pro Thr Phe 1 5 10

Claims (33)

  1. 적어도 제1 항-인간 HER3 항체 분자 및 상기 제1 분자와 별개의 제2 항-인간 HER3 항체 분자 또는 상기의 제1 및 제2 항체 분자의 인간화 변이체를 포함하는 항체 조성물로서,
    제1 항-인간 HER3 항체 분자는 SEQ ID NO:18 내의 중쇄 CDR1-3 및 SEQ ID NO:20 내의 경쇄 CDR1-3를 포함하고,
    제2 항-인간 HER3 항체 분자는 SEQ ID NO:14 내의 중쇄 CDR1-3 및 SEQ ID NO:16 내의 경쇄 CDR1-3을 포함하는, 항체 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 항-인간 HER3 항체 분자는 SEQ ID NO:18 내의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열 및 SEQ ID NO:20 내의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열을 포함하고,
    상기 제2 항-인간 HER3 항체 분자는 SEQ ID NO:14 내의 VH 아미노산 서열 및 SEQ ID NO:16 내의 VL 아미노산 서열을 포함하는, 항체 조성물.
  3. SEQ ID NO:18 및 20의 아미노산 서열 또는 이의 인간화 변이체를 포함하는 항-인간 HER3 항체 분자 및 SEQ ID NO:14 및 16의 아미노산 서열 또는 이의 인간화 변이체를 포함하는 항-인간 HER3 항체 분자를 포함하는, 항체 조성물.
  4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 조성물 내의 하나 이상의 항-인간 HER3 항체 분자는 항암제와 컨쥬게이션된 항-인간 HER3 항체를 포함하는 면역컨쥬게이트인, 항체 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 항암제는 세포독성제, 사이토카인, 독소 및 방사성핵종으로 구성된 군으로부터 선택되는, 항체 조성물.
  6. 제1항 또는 제3항에 따른 항체 조성물을 발현하는 폴리클로날 세포주로서, 상기 폴리클로날 세포주는 상기 조성물의 항-인간 HER3 항체를 발현하는 각각의 숙주세포를 포함하는, 폴리클로날 세포주.
  7. 제1항 또는 제3항에 따른 항-인간 HER3 항체 조성물을 생산하는 방법으로서, 상기 조성물의 항-인간 HER3 항체 분자를 발현할 수 있는 각각의 숙주 세포를 제공하는 단계, 상기 항체 분자를 발현시키기에 적합한 조건하에서 상기 숙주 세포를 배양시키는 단계, 및 생성된 항체 분자를 분리시키는 단계를 포함하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 숙주 세포는 단일 바이오반응기에서 배양되는, 방법.
  9. 제1항 또는 제3항에 따른 항-인간 HER3 항체 조성물 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 암을 치료하기 위한 약제 조성물.
  10. 삭제
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