CN104220457A - 涉及her3抑制剂的诊断和治疗 - Google Patents

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Abstract

本申请描述了NRG1超表达作为用于使用HER3抑制剂(如，双特异性HER3/EGFR抑制剂)治疗癌症患者的选择标准的用途，以及治疗那些患者的方法。

Description

涉及HER3抑制剂的诊断和治疗
相关申请的交叉参考
本申请要求于2012年3月27日提交的U.S.专利申请61/616241的优先权权益，在此将其完整内容全部按引用并入本文中。
技术领域
本申请涉及癌症治疗和选择癌症患者用于使用HER3抑制剂治疗的方法的领域。
背景技术
受体酪氨酸激酶的HER家族是细胞生长、分化和存活的重要介质。该受体家族包括四个截然不同的成员，包括表皮生长因子受体(EFGR、ErbB1或HER1)、HER2(ErbB2或p185neu)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4或tyro2)。
靶向HER通路的治疗目前用于治疗如乳癌、非小细胞肺癌、结肠直肠癌、头颈癌和胰腺癌这样的疾病。
EGFR被六个不同的配体结合：表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGF-α)、双调蛋白(amphiregulin)、肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)、betacellulin和表皮调节蛋白(epiregulin)(Groenen等，Growth Factors，11:235-257(1994))。
神经调节蛋白(Neuregulin)是Her3和Her4受体酪氨酸激酶的配体。存在四个已知的神经调节蛋白家族的成员，NRG1、NRG2、NRG3和NRG4(Falls，D.L.，Ex Cell Res，284:14-30(2003)；Hirsch和Wu(2007)，ExpertReviews，Vol.7,147-157)。NRG1转录产物经历大范围的交替剪接，形成至少15种不同的异构体。所有活性异构体共享对于活性必需的且足够的EGF-样结构域(Holmes，W.E.等，Science，256:1205-1210(1992)；Yarden，Y.，和Peles，E.，Biochemistry 30:3543-3550(1991))。
去年在美国诊断出大约52140个头颈癌的鳞状上皮细胞癌(HNSCC)的新病例，并且估计11460人死于该疾病(1)。用于HNSCC的医疗干预包括外科手术、放疗和组合的放疗-化疗。对于原发性HNSCC的总体5-年相对存活率大约为60％。然而，对于诊断为转移性疾病的患者，5-年相对存活率仅有35％(2)。患有晚期HNSCC患者中差的结果清楚地表明这一人群需要更有效的治疗(3)。
通过表皮生长因子受体(EGFR)通路的信号传导是HNSCC的主要驱动者(4)。在高达90％的全部HNSCC中，EGFR是超表达的(5，6)。已经证明了使用西妥昔单抗(cetuximab)的EGFR抑制是成功的治疗策略，虽然由于先天性的或获得性的抗药性，其具有有限的长期临床益处(7)。已经在HNSCC的临床研究中研究了靶向EGFR和或HER2酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)，如厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)和拉帕替尼(lapatinib)，但尚未在随机化试验中证明存活优势(8-10)。
NRG1自分泌信号传输已经显示出调节肺上皮细胞增殖(Jinbo等，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.27:306-313(2002))并且在人的肺发育中起着作用(Patel等，Am.J.Resp Cell Mol Bio，22:432-440(2000))，并且已经涉及NSCLC对EGFR抑制剂的不敏感性(Zhou等，Cancer cell 10:39-50(2006))。临床前研究表明了特定的癌细胞系受自分泌-信号传输环路驱动，其中NRG1通过啮合HER2激酶促进恶化(Wilson等，Cancer Cell，20:158-173(2011))。
发明内容
本发明的一个方面提供一种治疗患者一种类型的癌症的方法，包括将治疗有效量的HER3抑制剂给药至患者，其中在给药HER3抑制剂之前，所述患者被诊断为患有超表达NRG1的癌症。NRG1超表达表示患者对HER3抑制剂的治疗应答性。在一个实施方案中，所述患者被诊断为患有以高于癌症类型中NRG1表达中值水平的水平表达NRG1的癌症。在特定的实施方案中，所述患者被诊断为患有以癌症类型中NRG1表达的60个百分比(60thpercentile)或更高、75个百分比或更高，或80个百分比或更高的水平表达NRG1的癌症。在一个实施方案中，癌症的类型是其呈现出由超表达模式和缺乏超表达模式组成的双峰表达谱的一种类型。在一个实施方案中，所述双峰表达谱的拐点是1.5，如依据线性标度测量的。在一个实施方案中，癌症的类型是其呈现出自分泌神经调节蛋白-诱导的信号传输的一种类型，如HNSCC。
在一个实施方案中，所述HER3抑制剂抑制NRG1结合HER3。在一个实施方案中，所述HER3抑制剂是抗体。在一个实施方案中，所述HER3抑制剂是双特异性HER3/EGFR抑制剂。在一个实施方案中，所述双特异性HER3/EGFR抑制剂是双特异性抗体，其包含特异性结合HER3和EGFR的抗原结合结构域。在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含SEQ ID NO:1的重链可变结构域的HVR序列和SEQ ID NO:2的轻链可变结构域序列的HVR序列。在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含SEQ ID NO:1的重链可变结构域和SEQ ID NO:2的轻链可变结构域序列。
在一个实施方案中，诊断包括测定来自患者癌症的样品中的NRG1的表达水平，并且将样品中的NRG1的表达水平相对于样品中的AL-137727和VPS33B中的一种或两种的表达水平进行量化。
本发明的另一个方面提供一种治疗患者头颈鳞状上皮细胞癌(HNSCC)的方法，包括将治疗有效量的双特异性HER3/EGFR抑制剂给药至患者，其中在给药双特异性HER3/EGFR抑制剂之前，所述患者被诊断为患有超表达NRG1的HNSCC。NRG1超表达表示患者对双特异性HER3/EGFR抑制剂的治疗应答性。在一个实施方案中，所述双特异性HER3/EGFR抑制剂是双特异性抗体，其包含特异性结合HER3和EGFR的抗原结合结构域。在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含SEQ ID NO:1的重链可变结构域的HVR序列和SEQ ID NO:2的轻链可变结构域序列的HVR序列。在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含SEQ ID NO:1的重链可变结构域和SEQ ID NO:2的轻链可变结构域序列。
本发明的另一个方面提供了一种用于选择治疗的方法，所述治疗用于患有一种类型的呈现出自分泌神经调节蛋白诱发的信号传输的癌症的患者，所述方法包括确定来自患者的癌症样品中的神经调节蛋白1(NRG1)表达并且如果癌症样品超表达NRG1，选择HER3抑制剂用于治疗。在一个实施方案中，癌症样品以高于癌症类型中的NRG1表达的中值水平的水平表达NRG1。在特定的实施方案中，所述癌症样品以癌症类型中的NRG1表达的60个百分比或更高、75个百分比或更高，或80个百分比或更高的水平表达NRG1。在一个实施方案中，癌症的类型是其呈现出由超表达模式和缺乏超表达模式组成的双峰表达谱的一种类型。在一个实施方案中，所述双峰表达谱的拐点是1.5，如依据线性标度测量的。在一个实施方案中，癌症的类型是其呈现出自分泌神经调节蛋白-诱导的信号传输的一种类型，如HNSCC。在一个实施方案中，该方法进一步包括将治疗有效量的HER3抑制剂给药至患者。在一个实施方案中，癌症的类型是HNSCC。在一个实施方案中，所述HER3抑制剂抑制NRG结合HER3。在一个实施方案中，所述HER3抑制剂是抗体。在一个实施方案中，所述HER3抑制剂是双特异性HER3/EGFR抑制剂。在一个实施方案中，所述双特异性HER3/EGFR抑制剂是双特异性抗体，其包含特异性结合HER3和EGFR的抗原结合结构域。在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含SEQ ID NO:1的重链可变结构域的HVR序列和SEQID NO:2的轻链可变结构域序列的HVR序列。在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含SEQ ID NO:1的重链可变结构域和SEQ ID NO:2的轻链可变结构域序列。
在一个实施方案中，NRG1表达的确定包括测定来自患者癌症的样品中的NRG1的表达水平并且将样品中的NRG1的表达水平相对于样品中的AL-137727和VPS33B中的一种或两种的表达水平进行量化。
本发明的另一个方面提供了一种用于选择治疗的方法，所述治疗用于患有头颈鳞状上皮细胞癌(HNSCC)的患者，所述方法包括测定来自患者的HNSCC样品中的神经调节蛋白(NRG1)表达，并且如果HNSCC样品超表达NRG1，选择双特异性HER3/EGFR抑制剂作为治疗。在一个实施方案中，该方法进一步包括将治疗有效量的双特异性HER3/EGFR抑制剂抑制剂给药至患者。在一个实施方案中，所述双特异性HER3/EGFR抑制剂是双特异性抗体，其包含特异性结合HER3和EGFR的抗原结合结构域。在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含SEQ ID NO:1的重链可变结构域的HVR序列和SEQ ID NO:2的轻链可变结构域序列的HVR序列。在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含SEQ ID NO:1的重链可变结构域和SEQ ID NO:2的轻链可变结构域序列。在一个实施方案中，NRG1表达的确定包括测定来自患者癌症的样品中的NRG1的表达水平并且将样品中的NRG1的表达水平相对于样品中的AL-137727和VPS33B中的一种或两种的表达水平进行量化。
本发明的另一个方面提供了一种用于宣传HER3抑制剂或其药物学上可接受的组合物的方法，包括将HER3抑制剂或其药物组合物用于治疗患有一种类型的癌症的患者群的用途促销给目标听众，其中患者的癌症超表达NRG1。在一个实施方案中，所述HER3抑制剂抑制NRG结合HER3。在一个实施方案中，所述HER3抑制剂是抗体。在一个实施方案中，所述HER3抑制剂是双特异性HER3/EGFR抑制剂。在一个实施方案中，所述双特异性HER3/EGFR抑制剂是双特异性抗体，其包含特异性结合HER3和EGFR的抗原结合结构域。在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含SEQ ID NO:1的重链可变结构域的HVR序列和SEQ ID NO:2的轻链可变结构域序列的HVR序列。在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含SEQ ID NO:1的重链可变结构域和SEQ ID NO:2的轻链可变结构域序列。
本发明的另一个方面提供了一种用于宣传双特异性HER3/EGFR抑制剂或其药物学上可接受的组合物的方法，包括将双特异性HER3/EGFR抑制剂或其药物组合物用于治疗患有HNSCC的患者群体的用途促销给目标听众，其中患者的HNSCC超表达NRG1。在一个实施方案中，所述双特异性HER3/EGFR抑制剂是双特异性抗体，其包含特异性结合HER3和EGFR的抗原结合结构域。在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含SEQ ID NO:1的重链可变结构域的HVR序列和SEQ ID NO:2的轻链可变结构域序列的HVR序列。在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含SEQ ID NO:1的重链可变结构域和SEQ ID NO:2的轻链可变结构域序列。
本发明的另一个方面提供了一种定量癌症样品中的NRG1表达水平的方法，包括测定样品中的NRG1的表达水平，并且将样品中的NRG1的表达水平相对于样品中的一种或多种内部参照基因的表达水平进行量化。在一个实施方案中，一种或多种参照基因是AL-137727和VPS33B中的一种或两种。在一个实施方案中，样品来自呈现出自分泌神经调节蛋白诱发的信号传输的癌症，如头颈鳞状上皮细胞癌(HNSCC)。在这种方法的一个特定实施方案中，使用聚合酶链式反应(PCR)来测定NRG1的表达水平以及AL-137727和VPS33B中的一种或两种的表达水平。在一个实施方案中，该方法中使用的PCR是定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)。在另一个实施方案中，使用免疫组织化学(IHC)或ELISA测定NRG1的表达水平。在另一个实施方案中，通过直接RNA测序测定了NRG1的表达水平。在另一个实施方案中，使用RNA原位杂交测定NRG1的表达水平。
附图简述
图1是证明了MEHD7945A抗体结合HER3-ECD和EGFR-ECD两者的图。
图2A和B是证明了MEHD7945A抑制EGFR和HER2/HER3依赖性信号传输的图。
图3是显示了FaDu癌症模型中肿瘤生长受到MEHD7945A抑制的图。
图4是在许多小鼠异种移植模型中，与西妥昔单抗或抗-HER3相比，MEHD7945A的肿瘤生长抑制作用的概述。
图5显示了通过qRT-PCR测定的癌症类型中的NRG1(A)和HER3(B)表达水平。
图6显示了与其他癌症类型相比，HNSCC中的NRG1表达的双峰分布。
图7显示了以log10标度作图时，HNSCC中的NRG1表达的双峰分布。虚线表示HNSCC中NRG1表达的超表达和缺乏超表达模式之间的拐点，将其在对数标度上设定在0.3689，对应于线性标度上的大约1.50。
图8显示了来自未治疗SCHNN患者的新鲜冷冻肿瘤样本中的pHER3和pTyr的IP-western印迹分析的结果。MCF7是阴性对照；MCF7+NRG和PCI6A是阳性对照。用于pTyr印迹的对照分开运行，而用于pHER3的对照同时运行。
图9显示了qRT-PCR试验的结果，表明高NRG1表达与23个SCHNN肿瘤中的HER3信号传输的pHER3不同的激活相关(18/19与IP-western重叠)。x-轴下的黑线表示具有通过IP-western可检测的pHER3的肿瘤。
图10是概括了分析中使用的患者及其肿瘤的病理和人口统计变量的表。
图11显示了比较未匹配的原发性和复发性HNSCC样本中的NRG1表达水平的qRT-PCR分析。
图12显示了比较匹配的原发性和复发性HNSCC中的NRG1表达水平的qRT-PCR分析。
图13是显示了匹配的未治疗和治疗后的HNSCC之间的比较。
图14是显示了匹配的未治疗和化疗后HNSCC样品之间的NRG1或HER3表达和自分泌生物学变化的表。使用定义软件来检测复染核内的NRG1或NER3或两种转录产物的表达。
图15显示了原发性和复发性SCHNN中NRG1(A)和HER3(B)的RNA-ISH和qRT-PCR的成对分析。
图16显示了HNSCC和CRC患者的NRG1表达水平。
图17显示了与1期研究中的HNSCC患者的NRG1表达水平相比，原发性&复发性HNSCC中的NRG1表达水平。
图18显示了抗体MEHD7945A的氨基酸序列(SEQ ID NO:1和2)。
优选实施方案的详述
I.定义
除非另外限定，本文中使用的所有技术术语、符号和其他科学技术确定具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。在一些情况中，为了清楚和/或为了现成的参考，本文中限定了具有通常理解含义的术语，并且本文中中包含这样的定义不必然解释为表示与本领域通常理解的实质性差异。本文中描述或参考的技术和程序通常是本领域技术人员充分了解的并且通常是使用常规方法来使用的，例如，Sambrook等，Molecular Cloning:A LaboratoryManual(分子克隆：实验室手册)第2版(1989)Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.中描述的广泛使用的分子克隆方法。如果适用，通常根据制造商限定的实验方案和/或参数进行涉及使用商业购得的试剂盒和试剂的程序。
因此在描述本发明的方法、试剂盒和用途之前，应了解本发明不限于所描述的特定方法、实验方案、细胞系、动物种或属、构建体和试剂，因为这些当然可以改变。还应了解本文中使用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的，并且不是用来限制本发明的范围，其将只通过所附权利要求来限制。
必须注意到，除非文中另外清楚地指出，否则本文和所附权利要求中使用的，单数形式“一个(a)”、“和”和“该”包括复数指示物。
在整个说明书和权利要求中，词语“包含”或“包括”，将理解为表示包含所述整体或整体的组，但不排除任何其他整体或整体的组。
在本文中术语“抗体”以最宽的含义来使用并且尤其涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体和抗体片段，只要它们呈现出所需的生物活性。术语“多特异性抗体”以最宽的含义来使用并且特意涵盖包含具有多表位特异性(即，能够特异性结合两个，或多个不同生物分子上的表位)的抗原结合结构域的抗体。抗原结合结构域的一个特定实例是由重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)组成的VHVL单位。这样的多特异性抗体包括，但不限于，全长抗体，具有两个或多个VL和VH结构域的抗体，抗体片段，如Fab，Fv，dsFv，scFv，双抗，双特异性双抗和三抗，已经共价或非共价连接的抗体片段。“双特异性抗体”是包含能够特异性结合一个生物分子上的两个不同表位的或能够特异性结合两个不同生物分子上的表位的抗原结合结构域的多特异性抗体。双特异性抗体在本文中还称为具有“双重特异性”或“双重特异性的”。
在特定的实施方案中，本发明的抗体对其靶标HER或HERs具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-8M或更低，例如，10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。
基础的4-链抗体单体是由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成的杂四聚糖蛋白(IgM抗体由5个基础杂四聚单体连同另外的称为J链的多肽组成，并且因此含有10个抗原结合位点，而分泌的IgA抗体可以聚合形成包含2-5个基础4-链单体连同J链的多价聚集物)。在IgG的情况中，4-链单体通常约150,000道尔顿。每个L链通过一个共价二硫化物键连接H链，而两个H链根据H链的同种型，通过一个或多个二硫化物键彼此连接。每个H和L链还规则地间隔了链内二硫化物桥。每个H链在N-端具有可变结构域(VH)，其对于每个α和γ链，连有三个恒定结构域(CH)，而对于μ和ε同种型，连有四个CH结构域。每个L链在N-端具有可变结构域(VL)，其在另一端连有恒定结构域(CL)。VL与VH排列成行，而CL与重链的第一个恒定结构域(CH1)排列成行。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域中间形成了界面。VH和VL一起的配对形成了单个抗原结合位点。对于不同类别的抗体的结构和特性，参见，例如，Basic and Clinical Immunology，第8版，DanielP.Stites，Abba I.Terr和Tristram G.Parslow(编辑)，Appleton&Lange，Norwalk，CT，1994，第71页和第6章。
基于恒定结构域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的L链可以分配给两种明显不同类型中的一种，这两种类型称为κ和λ。根据重链(CH)的恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分配给不同的类型或同种型。存在五种类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，具有分别指定为α、δ、γ、ε和μ的重链。基于CH序列和功能相对次要的差异，将γ和α类别进一步分成亚类，例如，人表达以下亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
术语“可变的”是指可变结构域的特定片段在抗体的序列中大范围地不同。V结构域介导抗原结合并且限定了特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性不是均匀分布于可变结构域的110个氨基酸跨度范围中。相反，V区域由相对不变的链组成，所述链称为框架区(FR)，其是由极高可变性的称为“超变区”或HVR的较短区域隔开的15-30个氨基酸。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR，大部分采用β-折叠构造，通过三个超变区连接，其形成环连接，并且在一些情况中，形成β-折叠结构的一部分。每个链中的超变区通过FR在近端连在一起，并且与来自其他链的超变区连接，有助于抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等，Sequences of Proteins of Immuological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD.(1991))。恒定结构域不直接涉及抗体与抗原结合，但呈现出各种效应物功能，如抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)中的抗体沉淀。
术语“超变区”、“HVR”或“HV”在用于本文中时，是指抗体可变域中序列超变和/或形成结构上限定的环的区域。通常，抗体包含六个HVR；三个在VH中(HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3)，三个在VL中(HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3)。在天然抗体中，H3和L3呈现出六个HVR的最大多样性，特别是认为H3在给予抗体精细的特异性中起到了独特的作用。参见，例如，Xu等，Immunity 13:37-45(2000)；Johnson和Wu，在Methods inMolecular Biology 248:1-25中(Lo编辑，Human Press，Totowa，NJ，2003)。实际上，只有重链组成的天然产生的羊驼(camelid)抗体在不存在轻链的情况下是功能性的并且是稳定的。参见，例如，Hamers-Casterman等，Nature 363:446-448(1993)；Sheriff等，Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。
HVR通常包含来自超变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者是最高序列可变性的和/或涉及抗原识别。各种HVR描绘在使用中并且包括在本文中。Kabat互补性决定区(CDR)是基于序列可变性并且是最常使用的(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。Chothia而是提到了结构环的位置(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM HVR表示Kabat HVR和Chothia结构环之间的折衷，并且通过Oxford Molecular’s AbM抗体建模软件来使用。“接触”HVR是基于可用的复合晶体结构的分析。以下记录了来自这些HVR中的每一个的残基。
HVR可以包含如下的“延长HVR”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)以及VH中的26-35(H1)、50-65或47-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，根据上文的Kabat等，将可变结构域的残基编号。
“框架”或“FR”残基是除了本文中限定的HVR残基以外的那些可变结构域残基。
术语“如Kabat中那样的可变结构域残基编号”或“如Kabat中那样的氨基酸位置编号”，是指用于上文的Kabat等中的抗体编制的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用这种编号系统，实际的线性氨基酸序列可以含有较少或另外的氨基酸，这对应于缩短或插入可变结构域的FR或HVR。例如，重链可变结构域可以在H2的残基52后包括单个氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)以及在重链FR残基82后插入残基(例如，残基82a、82b和82c等，根据Kabat)。可以通过在抗体序列的同源性区域与“标准”Kabat编号的序列比对为给定的抗体确定残基的Kabat编号。
当涉及可变结构域中的残基时(大致为轻链的残基1-107和重链的残基1-113)，通常使用Kabat编号系统(例如，Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD.(1991))。当涉及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号系统”或“EU指数”(例如，上文Kabat等中记载的EU指数)。“Kabat中的EU指数”是指人IgG1EU抗体的残基编号。除非本文中另外指出，提及抗体可变结构域中的残基编号指的是通过Kabat编号系统的残基编号。除非本文中另外指出，提及抗体的恒定结构域中的残基编号意思是通过EU编号系统的残基编号(例如，参见WO2006/073941)。
“亲和性”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点及其结合伴侣(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和强度。除非另外指出，如本文中使用的，“结合亲和性”是指内在的结合亲和性，其反映出结合对(例如，抗体和抗原)成员之间的1:1的相互作用。通常可以通过解离常数(Kd)来表示分子X对其伴侣Y的亲和性。可以通过本领域已知的常规方法，包括本文中描述的那些，来测量亲和性。
“亲和性成熟的”抗体是在其一个或多个HVR或框架区中具有一个或多个改变的抗体，所述改变导致与不具有那些改变的亲本抗体相比，抗体对抗原的亲和性提高。在一个实施方案中，亲和性成熟的抗体对靶标抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔亲和性。可以使用本领域已知的特定程序来产生亲和性成熟的抗体。例如，Marks等，Bio/Technology 10:779-783(1992)描述了通过VH和VL结构域改组的亲和性成熟。例如，Barbas等，Proc Nat.Acad.Sci.USA 91:3809-3813(1994)；Schier等，Gene 169:147-155(1995)；Yelton等，J.Immunol.155:1994-2004(1995)；Jackson等，J.Immunol.154(7):3310-9(1995)和Hawkins等，J.Mol.Biol.226:889-896(1992)描述了HVR和/或框架残基的随机诱变。
抗体的“类别”是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五个主要类别的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几个可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
如本文中使用的术语“单克隆抗体”是指来自基本上同质的抗体群的抗体，即，构成群的单独抗体基本上是相似的并且结合相同的表位，除了在单克隆抗体产生过程中可能出现的变体，这样的变体通常少量存在。这样的单克隆抗体通常包括包含结合靶标的可变区的抗体，其中通过包括从抗体群选择抗体的方法来获得抗体。例如，选择方法可以是从多个克隆(如杂交瘤克隆池、噬菌体克隆或重组DNA克隆)中选择单个克隆。应当理解选定的抗体可以进一步改变，例如，以提高对靶标的亲和性、将抗体人源化、提高其在细胞培养物中的生产、降低其在体内的免疫原性、形成多特异性抗体等，并且包含改变的可变区序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。除了它们的特异性，单克隆抗体的制剂是有利的，因为它们通常未受到其他免疫球蛋白的污染。修饰词“单克隆”表示从基本上同质的抗体群获得的抗体的特征，并不是解释为需要通过任何特定的方法来生产抗体。例如，根据本发明可以使用的单克隆抗体可通过各种技术制得，包括杂交瘤方法(例如，Kohler等，Nature,256:495(1975)；Harlow等，Antibodies:A Laboratory Manual(抗体：实验室手册)，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988)；Hammerling等，见：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681,(Elsevier,N.Y.,1981))、重组DNA技术(参见，例如，U.S.专利No.4,816,567)、噬菌体展示技术(参见，例如，Clackson等，Nature,352:624-628(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)；Sidhu等，J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等，J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Nat.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472(2004)；和Lee等J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004))和用于从具有编码人免疫球蛋白序列的部分或全部人免疫球蛋白基因座或基因的动物生产人或人样抗体的技术(参见，例如，WO98/24893、WO/9634096、WO/9633735和WO/9110741，Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993)；Jakobovits等，Nature,362:255-258(1993)；Bruggemann等，Year in Immuno.,7:33(1993)；U.S.专利Nos.5,545,806、5,569,825、5,591,669(全部都是GenPharm)；5,545,807；WO 97/17852、U.S.专利Nos.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425和5,661,016以及Marks等，Bio/Technology,10:779-783(1992)；Lonberg等，Nature,368:856-859(1994)；Morrison,Nature,368:812-813(1994)；Fishwild等，NatureBiotechnology,14:845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology,14:826(1996)；以及Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.,13:65-93(1995))。
“完整的”抗体是包含抗原结合位点以及CL和至少重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。优选，完整的抗体具有一种或多种效应物功能。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fab’-SH；双抗；线性抗体(参见，U.S.专利No.5,641,870，实施例2；Zapata等，Protein Eng.8(10):1057-1062(1995))；单链抗体分子(例如，scFv)。尽管在本发明的描述中和整个说明书中，提及了抗体和抗体的各种特性，相同的公开内容也适用于功能性抗体片段，例如，双重作用Fab片段。
表述“线性抗体”通常是指Zapata等，Protein Eng.8(10):1057-1062(1995)中描述的抗体。这些抗体包含一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-VH1)，其与互补轻链多肽一起，形成一对抗原结合区。在优选的实施方案中，片段是“功能性的”，即，定性地保持了相应的完整抗体结合靶标HER受体的能力，并且如果完整抗体还抑制HER激活或功能，也定性地保留这样的抑制特性。定性的保留意思是保留了这种类型的活性，但结合亲和性和/或活性的程度可能不同。
抗体的木瓜蛋白酶产生了两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，以及残余的“Fc”片段，反映出易于结晶能力的名称。Fab片段由完整的L链连同H链的可变区(VH)和一个重链的第一个恒定结构域(CH1)组成。抗体的胃蛋白酶处理产生了单个大的F(ab’)2片段，其大致对应于具有二价抗原结合活性的两个二硫化物连接的Fab片段并且仍然能够交联抗原。Fab’片段在CH1结构域的羧基端具有另外的几个残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸，由此不同于Fab片段。Fab’-SH是本文中用于其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有三个硫醇基团的Fab’的名称。F(ab’)2抗体片段最初作为Fab’片段对来产生，所述对在片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学耦合也是已知的。
Fc片段包含通过二硫化物结合在一起的两条H链的羧基端部分。通过Fc区域中的序列来确定抗体的效应物功能；这一区域也是Fc受体(FcR)在特定类型的细胞上发现的识别的部分。
“Fv”由紧密非共价结合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠散发出六个超变环(各自从H和L链发出3个环)，其提供用于抗原结合的氨基酸残基并且给予抗体抗原结合特异性。尽管单个可变结构域的亲和性常常低于完整的结合位点，然而，即使是单个可变结构域(或只包含三个抗原特异性的HVR的Fv的一半)也具有识别并结合抗原的能力。
“单链Fv”也缩写为“sFv”或“scFv”，其是包含连接成单个多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，sFv多肽进一步包含VH和VL结构域之间的多肽连接物，其能够使sFv形成所需的用于抗原结合的结构。对于sFv的综述，参见Pluchthun，在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies中，vol.113，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994)；Borrebaeck 1995。
术语“双抗”是指通过在VH和VL结构域之间使用短的连接物(约5-10个残基)构建sFv片段(参见前一段)制得的小抗体片段，使得获得V结构域的链间而不是链内配对，形成二价片段，即，具有两个抗原结合位点的片段。双抗更全面地描述于例如EP 404,097；WO 93/11161和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:6444-6448(1993)中。
作为参照抗体的“结合相同表位的抗体”是指在竞争试验中阻断50％或更多的参照抗体与其抗原结合的抗体，并且相反地，参照抗体在竞争试验中阻断50％或更多的抗体与其抗原结合。
术语“嵌合”抗体是指其中重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分源自不同来源或物种的抗体。
“人抗体”是具有对应于人或人细胞产生的或利用人抗体库或其他人抗体编码序列源自非人来源的抗体的氨基酸序列的抗体。这种人抗体的定义特意排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有框架”是表示在人免疫球蛋白VL和VH框架序列选择中最常出现的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列的亚组。通常，序列的亚组是如Kabat等，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第五版，NIH Publication 91-3242,BethesdaMD(1991),vols.1-3种的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如上文Kabat等中的亚组κ。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如上文Kabat等中的亚组III。
非人(例如，啮齿动物)抗体的“人源化”形式是含有最小的源自非人抗体的序列的嵌合抗体。对于绝大部分，人源化抗体是其中来自受体的超变区的残基被来自非人物种(供体抗体)(如，小鼠、大鼠、兔子或非人灵长类动物)具有所需抗体特异性、亲和性和能力的超变区的残基替代的人免疫球蛋白(受体抗体)。在一些情况中，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些改变，以进一步限定抗体性能。通常，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个并且通常两个可变结构域，其中全部或基本上全部的超变环对应于非人免疫球蛋白的那些，并且全部或基本上全部的FR是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体任选还将包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的。对于更多详细内容，参见Jones等，Nature321:522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
“结合”目标抗原的本发明的抗体是以足够的亲和性结合抗原的抗体，使得抗体在靶向蛋白质或表达抗原的细胞或组织中用作诊断和/或治疗剂。关于抗体与靶标分子的结合，术语“特异性结合”特定多肽或特定多肽靶标上的表位或“对特定多肽或特定多肽靶标上的表位特异性的”意思是可测量不同于非特异性相互作用的结合。例如，可以通过测定相比于对照分子的分子结合来测量特异性结合。例如，可以通过与靶标相似的对照分子(例如，过量的非标记靶标)的竞争来测定特异性结合。在这种情况中，如果标记的靶标与探针的结合被过量的非标记靶标竞争性地抑制，则认为是特异性结合。在一个特定的实施方案中，“特异性地结合”是指抗体与其特定的靶标HER受体的结合，而不是其他特定的非靶标HER受体。例如，抗体特异性地结合EGFR和HER3，但没有特异性地结合HER2或HER4，或抗体特异性地结合EGFR和HER2，但没有特异性地结合HER3或HER4，或抗体特异性地结合EGFR和HER4，但没有特异性地结合HER2或HER3。
“HER受体”是属于HER受体家族的受体蛋白酪氨酸激酶并且包括EGFR(ErbB1、HER1)、HER2(ErbB2)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4)受体。HER受体通常将包含胞外结构域，其可以结合HER配体和/或与另一个HER受体分子二聚化；亲脂性跨膜结构域；保守性胞内酪氨酸激酶结构域；和带有几个可以磷酸化的酪氨酸残基的羧基端信号传输结构域。HER受体可以是“天然序列”HER受体或其“氨基酸序列变体”。优选，HER受体是天然序列人HER受体。
“HER通路”是指由HER受体家族介导的信号传输网络。
术语“ErbB1”、“HER1”、“表皮生长因子受体”和“EGFR”在本文中可以互换使用，并且是指例如在Carpenter等，Ann.Rev.Biochem.56:881-914(1987)中公开的EGFR，包括其天然产生的突变形式(例如，如Ullrich等，Nature(1984)309:418425和Humphrey等，PNAS(USA)87:4207-4211(1990)中的删除突变EGFR)，及其变体，如EGFRvIII。EGFR的变体还包括删除、置换和插入变体，例如，Lynch等(New England Journal of Medicine 2004，350:2129)，Paez等(Science 2004，,304:1497)和Pao等(PNAS 2004,101:13306)中所述的那些。
在本文中，“EGFR胞外结构域”或“EGFR ECD”是指在细胞外的EGFR的结构域，锚定在细胞膜上，或在循环中，包括其片段。在一个实施方案中，EGFR的胞外结构域可以包含四个结构域：“结构域I”(来自约1-158的氨基酸残基)、“结构域II”(氨基酸残基159-336)、“结构域III”(氨基酸残基337-470)和“结构域IV”(氨基酸残基471-645)，其中边界是大概的，并且可以有约1-3个氨基酸的变化。
表述“ErbB2”和“HER2”在本文中可以互换使用并且是指例如Semba等，PNAS(USA)82:6497-6501(1985)和Yamamoto等，Nature 319:230-234(1986)(GenBank登录号X03363)中所述的人HER2蛋白。术语“erbB2”是指编码人HER2的基因，而“neu”是指编码大鼠p185neu的基因。优选的HER2是天然序列人HER2。
在本文中，“HER2胞外结构域”或“HER2ECD”是指细胞外的HER2的结构域，锚定在细胞膜上，或在循环中，包括其片段。在一个实施方案中，HER2的胞外结构域可以包含四个结构域：“结构域I”(来自约1-195的氨基酸残基)、“结构域II”(来自约196-319的氨基酸残基)、“结构域III”(来自约320-488的氨基酸残基)和“结构域IV”(来自约489-630的氨基酸残基)(残基编号不含信号肽)。参见Garrett等，Mol.Cell..11:495-505(2003)，Cho等，Nature 421:756-760(2003)，Franklin等，Cancer Cell 5:317-328(2004)和Plowman等，Proc.Natl.Acad.Sci.90:1746-1750(1993)。
“ErbB3”和“HER3”是指例如美国专利No.5,183,884和5,480,968以及Kraus等，PNAS(USA)86:9193-9197(1989)中公开的受体多肽。
在本文中，“HER3胞外结构域”或“HER3ECD”是指细胞外的HER3的结构域，锚定在细胞膜上，或在循环中，包括其片段。在一个实施方案中，所述HER3的胞外结构域可以包含四个结构域：结构域I、结构域II、结构域III和结构域IV。在一个实施方案中，所述HER3ECD包含氨基酸1-636(编号包括信号肽)。在一个实施方案中，所述HER3结构域III包含氨基酸328-532(编号包括信号肽)。
在本文中术语“ErbB4”和“HER4”是指例如EP专利申请No 599,274；Plowman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:1746-1750(1993)；和Plowman等，Nature，366:473-475(1993)中公开的受体多肽，包括其异型体，例如，如1999年4月22日公开的WO99/19488中所公开的。
“HER配体”意思是结合和/或激活HER受体的多肽。本文中特别感兴趣的HER配体是天然序列人HER配体，如表皮生长因子(EGF)(Savage等，J.Biol.Chem.247:7612-7621(1972))；转化生长因子α(TGF-α)(Marquardt等，Science 223:1079-1082(1984))；双调蛋白，也称为施旺氏细胞瘤或角化细胞自分泌生长因子(Shoyab等，Science 243:1074-1076(1989)；Kimura等，Nature348:257-260(1990)；和Cook等，Mol.Cell.Biol.11:2547-2557(1991))；betacellulin(Shing等，Science 259:1604-1607(1993)；和Sasada等，Biochem.Biophys.Res.Commun.190:1173(1993))；肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)(Higashiyama等，Science 251:936-939(1991))；表皮调节蛋白(Toyoda等，J.Biol.Chem.270:7495-7500(1995)；和Komurasaki等，Oncogene15:2841-2848(1997))；神经调节蛋白，包括神经调节蛋白1(NRG1)、神经调节蛋白-2(NRG2)(Carraway等，Nature 387:512-516(1997))、神经调节蛋白-3(NRG3)(Zhang等，Proc.Natl.Acad.Sci.94:9562-9567(1997))和神经调节蛋白-4(NRG4)(Harari等，Oncogene 18:2681-89(1999))；和cripto(CR-1)(Kannan等，J.Biol.Chem.272(6):3330-3335(1997))。结合EGFR的HER配体包括EGF、TGF-α、双调蛋白、betacellulin、HB-EGF和表皮调节蛋白。结合HER3的HER配体包括NRG1和NRG2。能够结合HER4的HER配体包括betacellulin、表皮调节蛋白、HB-EGF、NRG1、NRG2、NRG3和NRG4。
除非另外指出，如本文中所用的术语“NRG”，是指来自任何脊椎动物的任何天然的神经调节蛋白(也称为heregulin(HRG))，所述脊椎动物包括哺乳动物，如灵长类动物(例如，人)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。术语包括“全长”、未加工的NRG以及从天然加工获得的任何形式的NRG。术语还包括天然产生的NRG的变体，例如，剪接变体或等位基因变体。存在四种已知形式的NRG：NRG1(Holmes,W.E.等，Science 256:1205-1210(1992))；NRG2(Caraway,K.L.等，Nature 387:512-516(1997))；NRG3(Zhang,E.等，ProcNatl Acad Sci USA 94:9562-9567)；和NRG4(Harari,D.等，Oncogene18:2681-2689)。由于交替剪接，存在两种受体结合需要的NRG1EGF-样结构域的活性异形体，称为NRG1α(NRG1α)和NRG1β(NRGβ)。示例性人NRG1的序列显示于Genbank登录号No.BK000383(Falls,D.L.,Ex Cell Res,284:14-30(2003))和美国专利NO.5,367,060中。在一个实施方案中，NRG1包含Swiss Prot登录号Q7RTV8(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列。
本文中的“HER二聚体”是包含至少两个HER受体的非共价结合的二聚体。当将表达两种或更多HER受体的细胞暴露于HER配体时，形成了这样的复合物，并且可以通过免疫沉淀分离，并通过SDS-PAGE分析，例如，如Sliwkowski等，J.Biol.Chem.,269(20):14661-14665(1994)中所述的。其他蛋白质，如细胞因子受体亚基(例如，gp130)，可以与二聚体结合。
本文中的“HER杂二聚体”是包含至少两个不同HER受体的非共价结合的杂二聚体，如EGFR-HER2、EGFR-HER3、EGFR-HER4、HER2-HER3或HER2-HER4杂二聚体。
“HER抑制剂”是干扰HER激活或功能的试剂。HER抑制剂的实例包括HER抗体(例如，EGFR、HER2、HER3或HER4抗体)；EGFR靶向的药物；小分子HER拮抗剂；HER酪氨酸激酶抑制剂；HER2和EGFR双重酪氨酸激酶抑制剂，如lapatinib/GW572016；反义分子(参见，例如，WO2004/87207)；和/或结合或干扰下游信号传输分子功能的试剂，如MAPK或Akt。在一个实施方案中，所述HER抑制剂是结合HER受体的抗体。在一个实施方案中，所述HER抑制剂是HER3抑制剂。在实施方案中，所述抑制剂是双特异性HER抑制剂，如同时抑制HER3和EGFR、HER3和HER2，或HER3和HER4的抑制剂。在一个实施方案中，所述HER抑制剂是同时对HER3和EGFR特异性的双特异性抗体。这样的抑制剂的一个实例是双特异性抗体DL11f，也称为MEHD7945A。
“HER二聚化抑制剂”或“HDI”是抑制HER同型二聚体或HER杂二聚体形成的试剂。优选，所述HER二聚化抑制剂是抗体。然而，HER二聚化抑制剂还包括肽和非肽小分子，以及其他抑制HER同型二聚体或杂二聚体形成的化学物质。
“抑制HER二聚化”的抗体是抑制或干扰HER二聚体形成的抗体，与基础的机理无关。在一个实施方案中，这样的抗体在其杂二聚结合位点结合HER2。二聚化抑制抗体的一个特定实例是帕妥珠单抗(pertuzumab)(Pmab)，或MAb 2C4。HER二聚化抑制剂的其他实例包括结合EGFR并抑制其与一种或多种其他HER受体二聚化的抗体(例如，EGFR单克隆抗体806，MAb806，其结合激活的或“未栓系的”EGFR；参见Johns等，J.Biol.Chem.279(29):30375-30384(2004))；结合HER3并抑制其与一种或多种其他HER受体二聚化的抗体；结合HER4并抑制其与一种或多种其他HER受体二聚化的抗体；肽二聚化抑制剂(美国专利No.6,417,168)；反义二聚化抑制剂；等。
如本文中使用的，“EGFR拮抗剂”或“EGFR抑制剂”是指特异性结合EGFR并阻止或降低其信号传输活性，并且没有特异性结合HER2、HER3或HER4的那些化合物。这样的试剂的实例包括结合EGFR的抗体和小分子。结合EGFR的抗体的实例包括MAb 579(ATCC CRL HB 8506)、MAb455(ATCC CRL HB 8507)、MAb 225(ATCC CRL 8508)、MAb 528(ATCC CRL8509)(参见，美国专利No.4,943,533，Mendelsohn等)及其变体，如嵌合225(C225或西妥昔单抗；)和整形的人225(H225)(参见，WO96/40210，Imclone Systems Inc.)；IMC-11F8，完全人的、靶向EGFR的抗体(Imclone)；结合II型突变EGFR的抗体(美国专利No.5,212,290)；结合EGFR的人源化和嵌合抗体，如US专利No.5,891,996中所述的；和结合EGFR的人抗体，如ABX-EGF或帕尼单抗(Panitumumab)(参见WO98/50433，Abgenix/Amgen)；EMD 55900(Stragliotto等，Eur.J.Cancer 32A:636-640(1996))；EMD7200(matuzumab)针对EGFR与EGF和TGF-α两者竞争EGFR结合的人源化EGFR抗体(EMD/Merck)；人EGFR抗体，HuMax-EGFR(GenMab)；称为E1.1、E2.4、E2.5、E6.2、E6.4、E2.11、E6.3和E7.6.3并且描述于US 6,235,883中的完全人抗体；MDX-447(Medarex Inc)和mAb 806或人源化mAb 806(Johns等，J.Biol.Chem.279(29):30375-30384(2004))。抗EGFR抗体可以与细胞毒性剂偶联，因此产生免疫偶联物(参见，例如，EP659,439A2，Merck Patent GmbH)。EGFR拮抗剂包括小分子，如US专利No:5,616,582、5,457,105、5,475,001、5,654,307、5,679,683、6,084,095、6,265,410、6,455,534、6,521,620、6,596,726、6,713,484、5,770,599、6,140,332、5,866,572、6,399,602、6,344,459、6,602,863、6,391,874、6,344,455、5,760,041、6,002,008和5,747,498，以及以下的PCT公开：WO98/14451、WO98/50038、WO99/09016和WO99/24037中描述的化合物。特定的小分子EGFR拮抗剂包括OSI-774(CP-358774、厄洛替尼、Genentech/OSIPharmaceuticals)；PD183805(CI 1033、2-丙烯酰胺、N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-6-喹唑啉基]-，二氢氯化物，Pfizer Inc.)；ZD1839，吉非替你4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉，AstraZeneca)；ZM 105180((6-氨基-4-(3-甲基苯基-氨基)-喹唑啉，Zeneca)；BIBX-1382(N8-(3-氯-4-氟-苯基)-N2-(1-甲基-哌啶-4-基)-嘧啶并[5,4-d]嘧啶-2,8-二胺，Boehringer Ingelheim)；PKI-166((R)-4-[4-[(1-苯乙基)氨基]-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-苯酚)；(R)-6-(4-羟苯基)-4-[(1-苯乙基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶)；CL-387785(N-[4-[(3-溴苯基)氨基]-6-喹唑啉基]-2-丁炔酰胺)；EKB-569(N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁炔酰胺)(Wyeth)；AG1478(Sugen)；和AG1571(SU 5271；Sugen)。
“HER抗体”是结合HER受体的抗体。任选地，HER抗体进一步干扰HER激活或功能。特定的HER2抗体包括帕妥珠单抗和曲妥珠单抗(trastuzumab)。特定的EGFR抗体的实例包括西妥昔单抗和帕尼单抗。示例性抗HER3抗体描述于WO2011076683中(Mab205.10.1、Mab205.10.2、Mab205.10.3)、US7846440；US7705130和US5968511中。
涉及HER抗体的专利公开包括：US 5,677,171,US 5,720,937,US5,720,954,US 5,725,856,US 5,770,195,US 5,772,997,US 6,165,464,US6,387,371,US 6,399,063,US2002/0192211A1,US 6,015,567,US 6,333,169,US4,968,603,US 5,821,337,US 6,054,297,US 6,407,213,US 6,719,971,US6,800,738,US2004/0236078A1,US 5,648,237,US 6,267,958,US 6,685,940,US6,821,515,WO98/17797,US 6,333,398,US 6,797,814,US 6,339,142,US6,417,335,US 6,489,447,WO99/31140,US2003/0147884A1,US2003/0170234A1,US2005/0002928A1,US 6,573,043,US2003/0152987A1,WO99/48527,US2002/0141993A1,WO01/00245,US2003/0086924,US2004/0013667A1,WO00/69460,WO01/00238,WO01/15730,US6,627,196B1,US 6,632,979B1,WO01/00244,US2002/0090662A1,WO01/89566,US2002/0064785,US2003/0134344,WO 04/24866,US2004/0082047,US2003/0175845A1,WO03/087131,US2003/0228663,WO2004/008099A2,US2004/0106161,WO2004/048525,US2004/0258685A1,US 5,985,553,US 5,747,261,US 4,935,341,US 5,401,638,US 5,604,107,WO87/07646,WO 89/10412,WO 91/05264,EP 412,116B1,EP 494,135B1,US5,824,311,EP 444,181B1,EP 1,006,194A2,US 2002/0155527A1,WO91/02062,US 5,571,894,US 5,939,531,EP 502,812B1,WO 93/03741,EP554,441B1,EP 656,367A1,US 5,288,477,US 5,514,554,US 5,587,458,WO93/12220,WO 93/16185,US 5,877,305,WO 93/21319,WO 93/21232,US5,856,089,WO 94/22478,US 5,910,486,US 6,028,059,WO 96/07321,US5,804,396,US 5,846,749,EP 711,565,WO 96/16673,US 5,783,404,US5,977,322,US 6,512,097,WO 97/00271,US 6,270,765,US 6,395,272,US5,837,243,WO 96/40789,US 5,783,186,US 6,458,356,WO 97/20858,WO97/38731,US 6,214,388,US 5,925,519,WO 98/02463,US 5,922,845,WO98/18489,WO 98/33914,US 5,994,071,WO 98/45479,US 6,358,682B1,US2003/0059790,WO 99/55367,WO 01/20033,US 2002/0076695A1,WO00/78347,WO 01/09187,WO 01/21192,WO 01/32155,WO 01/53354,WO01/56604,WO 01/76630,WO02/05791,WO 02/11677,US 6,582,919,US2002/0192652A1,US 2003/0211530A1,WO 02/44413,US 2002/0142328,US 6,602,670B2,WO 02/45653,WO 02/055106,US 2003/0152572,US2003/0165840,WO 02/087619,WO 03/006509,WO03/012072,WO 03/028638,US 2003/0068318,WO 03/041736,EP 1,357,132,US 2003/0202973,US2004/0138160,US 5,705,157,US 6,123,939,EP 616,812B1,US2003/0103973,US 2003/0108545,US 6,403,630B1,WO 00/61145,WO00/61185,US 6,333,348B1,WO 01/05425,WO 01/64246,US 2003/0022918,US 2002/0051785A1,US 6,767,541,WO 01/76586,US 2003/0144252,WO01/87336,US 2002/0031515A1,WO 01/87334,WO 02/05791,WO 02/09754,US 2003/0157097,US 2002/0076408,WO 02/055106,WO 02/070008,WO02/089842,WO 03/86467,WO 2010/108127,和WO 2011/076683。
“HER激活”是指任一种或多种HER受体的激活或磷酸化。通常，HER激活导致信号传导(例如，由HER受体或底物多肽中的HER受体磷酸化酪氨酸残基的胞内激酶结构域引起)。可以通过HER配体结合包含目标HER受体的HER二聚体来介导HER激活。HER配体结合HER二聚体可以激活二聚体中的一个或多个HER受体的激酶结构域并且由此导致一个或多个HER受体中的酪氨酸残基的磷酸化和/或其他底物多肽中的酪氨酸残基的磷酸化，所述其他底物多肽如Akt或MAPK胞内激酶。
“磷酸化”是指将一个或多个磷酸基团添加至蛋白质，如HER受体，或其底物。
HER2上的“杂二聚结合位点”是指接触或连接与其形成二聚体时EGFR、HER3或HER4的胞外结构域中的区域的HER2的胞外结构域中的区域。在HER2的结构域II中发现了该区域。Franklin等，Cancer Cell 5:317-328(2004)。
“结合HER2的杂二聚结合位点”的HER2抗体，结合结构域II中的残基(并且任选还结合HER2胞外结构域的其他结构域中的残基，如结构域I和III)，并且可以在至少一定程度上在空间上阻碍HER2-EGFR、HER2-HER3或HER2-HER4杂二聚体的形成。Franklin等，Cancer Cell 5:317-328(2004)表征了HER2-帕妥珠单抗晶体结构，保藏于RCSB Protein Data Bank(ID编码IS78)，说明了结合HER2的杂二聚结合位点的示例性抗体。
“结合HER2的结构域II”的抗体结合结构域II中的残基和任选的HER2的其他结构域中的残基，如结构域I和III。
当用于描述本文中公开的各种抗体时，“分离的”表示抗体已经从表达其的细胞或细胞培养物中得到鉴定和分离和/或收集。天然环境的污染成分是通常干扰多肽的诊断或治疗作用的材料，并且可以包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。在优选的实施方案中，抗体将纯化(1)至足以获得至少15个N-端或内部氨基酸序列的残基的程度，使用旋杯测序仪，或(2)至同质，在非还原或还原条件下，使用考马斯蓝或优选银染，通过SDS-PAGE。分离的抗体包括重组细胞内原位的抗体，因为多肽天然环境的至少一种成分将不存在。然而，通常，将通过至少一步的纯化步骤制备分离的多肽。在一些实施方案中，多特异性抗HER抗体是分离的抗体。
术语“对照序列”是指需要在特定的宿主生物体中表达可操作连接的编码序列的DNA序列。例如，对原核生物合适的对照序列包括启动子，任选操作子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。
将核酸置于与另一个核酸序列的功能性关系中时，核酸是“可操作连接的”。例如，如果DNA作为参与多肽分泌的前蛋白表达时，则该用于前序列或分泌前导序列的DNA与用于多肽的DNA可操作地连接；如果其影响了序列的转录，则启动子或增强子与编码序列可操作地连接；或如果其放置使得促进了翻译，则核糖体结合位点可操作地连接编码序列。通常，“可操作地连接”意思是连接的DNA序列是邻接的，并且在分泌前导序列的情况中，是邻接的并且在阅读相位中。然而，增强子不必须是邻接的。可以通过在方便的限制性位点的结合来完成连接。如果不存在这样的位点，根据常规实践，使用合成的寡核苷酸适体或连接物。
将关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”限定为比对序列并且引入缺口(如果需要)来获得最大百分比同一性并且没有考虑任何保守性置换作为序列同一性的一部分后，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸相同的氨基酸残基的百分比。为了确定百分比氨基酸序列同一性的目的，可以本领域技术人员能力范围内的各种方式来实现比对，例如，使用公众可获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括在待比较序列的整个长度上获得最大比对需要的任何算法。为了本文中的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2来产生％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.授权，并且已经在U.S.Copyright Office，Washington D.C.，20559，使用用于文档写入了源代码，其中依据U.S.Copyright Registration No.TXU510087登记。ALIGN-2程序公众可以从Genentech，Inc.，South San Francisco，加利福尼亚获得，或可以从源代码编译。ALIGN-2程序应当编译，以在UNIX操作系统上使用，包括数字UNIXV4.0D。所有比较参数由ALIGN-2程序设定，并且没有改变。
在其中将ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情况中，如下计算给定的氨基酸序列A与、和，或相对给定的氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(其可以替换地用短语表达为与、和或相对给定的氨基酸B具有或包含特定％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)：
100×X/Y分数
其中X是在A和B的程序比对中通过比对程序ALIGN-2评分为相同匹配的氨基酸残基数，并且其中Y是B中的氨基酸残基总数。将认识到在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A与B的％氨基酸序列同一性将不等于B与A的％氨基酸序列同一性。除非另外特意指出，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性使用ALIGN-2计算机程序按照前面一段中所述的来获得。
杂交反应的“严格性”是本领域普通技术人员容易确定的，并且通常是取决于探针长度、洗涤温度和盐浓度的经验计算。通常，较长的探针需要较高的温度用于合适的退火，而较短的探针需要较低的温度。当互补链存在于低于其熔化温度的环境中时，杂交通常依赖于变性DNA重新退火的能力。探针和可杂交序列之间所需同源性程度越高，可以使用的相对温度越高。因此，断定较高的相对温度将易于使得反应条件更严格，而较低的温度使得反应条件严格性较低。对于杂交反应严格性的其他详细内容和解释，参见Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology,Wiley IntersciencePublishers,(1995)。
如本文中限定的，“严格性条件”或“高严格性条件”可以通过以下那些来鉴定：(1)对于洗涤，使用低离子强度和高温度，例如，在50℃，0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；(2)在杂交过程中，使用变性剂，如甲酰胺，例如，在42℃，50％(v/v)甲酰胺和0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficol/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/pH6.5的50mM磷酸钠缓冲液和750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠；或(3)在42℃，在使用50％甲酰胺，5×SSC(0.75M NaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×Denhardt’s溶液、超声波鲑鱼精子DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖的溶液中杂交过夜，在42℃，在0.2×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中洗涤10分钟，接着在55℃，由含有EDTA的0.1×SSC组成的10分钟高严格性洗涤。
“中等严格条件”可以按照Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，New York:Cold Spring Harbor Press，1989中所述的来鉴定，并且包括使用比上述那些严格性较低的洗涤溶液和杂交条件(例如，温度、离子强度和％SDS)。中等严格条件的实例是在包含：20％甲酰胺、5×SSC(150mMNaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/ml变性剪切的鲑鱼精子DNA的溶液中，在37℃，孵育过夜，接着在约37-50℃，在1×SSC中，洗涤滤器。本领域技术人员将知道怎样按照调节因素(如，探针长度等)的需要，来调节温度、离子强度等。
抗体“效应物功能”是指可归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物活性，并且随着抗体同种型而改变。抗体效应物功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；和B细胞激活。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指其中结合在存在于特定细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上的Fc受体(FcR)上的分泌Ig能够使这些细胞毒性效应物细胞特异性结合带有抗原的靶标细胞并且随后使用细胞毒素杀灭靶标细胞的细胞毒性形式。抗体“装备”细胞毒性细胞并且对于这样的杀灭是绝对需要的。用于介导ADCC的初级细胞、NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达概述于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)的第464页的表3中。为了评价目标分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC试验，如描述于美国专利No.5,00,362或5,821,337中的。用于所述试验的有用效应物细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。替换地，或另外地，可以在体内评价目标分子的ADCC活性，例如，在动物模型中，如Clynes等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)95:652-656中公开的。
“Fc受体”或“FcR”描述了结合抗体Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类，包括等位基因变体，以及可替换地，这些受体的剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，其具有相似的氨基酸序列，主要在其细胞质结构域中有不同。激活受体FcγRIIA在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见综述M.in Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR综述于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)；Capel等，Immunomethods 4:25-34(1994)；和de Haas等，J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。其他FcR，包括将来鉴定的那些，包括在本文中的术语“FcR”中。术语还包括新生儿受体，FcRn，其负责将母体的IgG转移至胎儿(Guyer等，J.Immunol.117:587(1976)和Kim等，J.Immunol.24:249(1994))。
“人效应物细胞”是表达一种或多种FcR并且执行效应物功能的白细胞。优选，细胞至少表达FcγRIII并且执行ADCC效应物功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；优选PBMC和NK细胞。效应物细胞可以从天然来源分离，例如，从血液分离。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指靶标细胞在补体的存在下裂解。典型的补体通路的激活是通过补体系统的第一成分(C1q)与(合适亚类的)结合其同源抗原的抗体的结合来启动的。为了评价补体激活，可以进行CDC试验，例如，如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所述的。
“药物学上可接受的载体”是指药物制剂中除了活性成分以外的成分，其对患者是无毒的。药物学上可接受的载体包括，但不限于，缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
术语“抗癌治疗”是指用于治疗癌症的治疗。抗癌治疗剂的实例包括，但不限于，例如化疗剂、生长抑制剂、细胞毒性剂、放疗中使用的药剂、抗血管生成剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂和其他治疗癌症的药剂、抗-CD20抗体、血小板衍生的生长因子抑制剂(例如，GleevecTM(甲磺酸伊马替尼(ImatinibMesylate))、COX-2抑制剂(例如，塞来昔布(celecoxib))、干扰素、细胞因子、结合以下靶标EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA或VEGF受体、TRAIL/Apo2中的一种多种的拮抗剂(例如，中和抗体)，以及其他生物活性和有机化学剂等。其组合也包括在本发明中。
“化疗剂”是用于癌症治疗中的化合物。化疗剂的实例包括烷化剂，如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclosphosphamide)；烷基磺酸酯，如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和派泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，如苄替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和尿烷亚胺(uredopa)；乙烯亚胺(ethylenimine)和methylamelamine，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基蜜胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酸胺(triethylenethiophosphoramide)和三轻甲蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(acetogenins)(尤其是bullatacin和bullatacinone)；δ-9-四氢大麻醇(屈大麻酚(dronabinol)，)；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙碱；桦木酸；喜树喊(camptothecin)(包括合成类似物拓扑替康(topotecan)CPT-11(伊立替康(irinotecan，))、乙酰基喜树碱、scopolectin和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素；足叶草酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；cryptophycins(特别是cryptophycin I和cryptophycin 8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CBI-TMl)；eleutherobin；pancratistatin；sarcodictyin；spongistatin；氮芥类，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥(novembichin)、胆留醇苯乙酸氮芥(phenesterine)、松龙苯芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲(nitrosureas)，如亚硝基脲氮芥(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(Iomustine)、尼莫司汀(nimustine)，和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，如enediyne抗生素(例如calicheamicin，尤其是calicheamicin gamma 1I和calicheamicin omega I1(参见，例如，Agnew，Chem Intl.Ed.Engl.，33:183-186(1994))；CDP323，口服α-4整联蛋白抑制剂；dynemicin，包括dynemicin A；埃斯佩拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)生色团和相关色素蛋白enediyne抗生素生色团)，aclacinomysins、放射菌素(actinomycin)、authramycin、氮丝氨酸(azaserine)、博莱霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、去甲柔红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、chromomycinis、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸、阿霉素(包括吗啉代-阿霉素、氰基吗啉代-阿霉素、2-吡咯啉阿霉素、阿霉素HCl脂质体注射液脂质体阿霉素TLC D-99PEG化脂质体阿霉素和去氧多柔比星)，表阿霉素(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、发波霉素(marcelIomycin)、丝裂霉素，如丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、紫菜霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢药，如氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸(denopterin)、氨甲蝶呤，丁蝶翼素(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷，双脱氧尿苷、去氟氧尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷；雄激素类，如卡普睾酮(calusterone)、丙酸甲雄烷酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄氨(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，如frolinic acid；醋葡内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(biasntrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone)；伊洛尼塞(elfornithine)；醋酸羟吡咔唑(elliptinium acetate)；epothilone；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登素类(maytansinoids)；如美登素(maytansine)和柄型菌素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰胼；甲基苄胼(procarbazine)；多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；单端抱霉烯(trichothecene)(尤其是T-2毒素，verracurin A，杆抱菌素(roridin)A和anguidine)；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesin)达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；溴丙哌嗪(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara_C”)；噻替派；紫杉烷(taxoid)，例如，紫杉醇紫杉醇的白蛋白工程化纳米颗粒配制剂(albumin-engineered nanoparticle formulationofpaclitaxel)(ABRAXANETM)和多西紫杉醇chloranbucil；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂剂，如顺钼、奥沙利铂(oxaliplatin)(例如，)和卡铂(carboplatin)；长春花碱(vincas)，其防止微管蛋白聚合形成微管，包括长春花碱长春新碱长春地辛和长春瑞滨足叶乙苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；甲酰四氢乙酸(leucovorin)；诺消灵(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊班膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲类(retinoids)，如维甲酸，包括贝沙罗汀(bexarotene)二膦酸盐类，如氯屈瞵酸盐(clodronate)(例如，或)、依替膦酸盐(etidronate)NE-58095、唑来膦酸(zoledronic acid)/唑来膦酸盐(zoledronate)阿仑膦酸盐(alendronate)帕米磷酸盐(pamidronate)替鲁膦酸盐(tiludronate)或利塞膦酸盐(risedronate)曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制异常细胞增殖中涉及的信号传输通路中的基因表达的那些，如，例如，PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，疫苗和基因治疗疫苗，例如，疫苗、疫苗和疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如，)；rmRHBAY439006(索拉非尼(sorafenib)；Bayer)；SU-11248(sunitinib，Pfizer)；哌立福辛(perifosine)、COX-2抑制剂(例如，塞来昔布(celecoxib)或依托考昔(etoricoxib))、蛋白体抑制剂(例如，PS341)；硼替佐米(bortezomib)CCI-779；替吡法尼(tipifarnib)(R11577)；orafenib，ABT510；Bcl-2抑制剂，如哈眠那(oblimersen sodium)匹杉琼(pixantrone)；EGFR抑制剂(参见下文定义)；酪氨酸激酶抑制剂(参见下文定义)；丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂，如雷帕霉素(西罗莫司(sirolimus)，)；法尼基转移酶抑制剂，如lonafarnib(SCH6636，SARASARTM)；和以上任一种物质的药物学上可接受的盐、酸或衍生物；以及两种或更多上述物质的组合，例如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写)；和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)联合5-FU和甲酰四氢乙酸的治疗方案的缩写)。
如本文中所限定的，化疗剂包括“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”，其作用是调节、降低、阻断或抑制能够促进癌症生长的激素。它们可以本身就是激素，包括但不限于：具有混合的激动剂/拮抗剂谱的抗雌激素类，包括他莫昔芬(tamoxifen)4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬(toremifene)艾多昔芬(idoxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、雷洛昔芬(raloxifene)曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，如SERM3；没有激动剂特性的纯抗雌激素，如氟维司群(fulvestrant)和EM800(此类药剂可阻断雌激素受体(ER)二聚化、抑制DNA结合、提高ER周转和/或遏制ER水平)；芳香酶抑制剂，包括类固醇芳香酶抑制剂，福美坦(formestane)和依西美坦(exemestane)以及非类固醇芳香酶抑制剂，如阿那曲唑(anastrozole)来曲唑(letrozole)和氨鲁米特(aminoglutethimide)及其它芳香酶抑制剂，包括伏罗唑(vorozole)醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)法倔唑(fadrozole)和4(5)-咪唑；黄体生成素释放激素激动剂，包括亮丙瑞林(leuprolide)(和)、戈舍瑞林(goserelin)、布舍瑞林(buserelin)和曲普瑞林(triptorelin)；性类固醇类，包括孕激素，如醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮，雌激素，如乙烯雌酚(diethylstilbestrol)和倍美力(premarin)，及雄激素/维甲类，如氟甲睾酮(fluoxymesterone)、全反式维A酸和芬维A胺(fenretinide)；奥那司酮(onapristone)；抗孕酮类；雌激素受体下调剂(ERD)；抗雄激素类，如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及以上任一种物质的药物学上可接受的盐、酸或衍生物；以及两种或更多种上述物质的组合。
“受试者”是脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括，但不限于，人、非人高等灵长类动物、灵长类动物、农场动物(如，奶牛)、运动动物、宠物(如，猫、狗和马)和实验室动物(如，小鼠和大鼠)。
蛋白质“表达”是指基因编码的信息转化成信使RNA(mRNA)，然后转化成蛋白质。
在本文中，“表达”目标蛋白(如，神经调节蛋白(如，神经调节蛋白1(NRG1))和/或HER3)的样品或细胞是确定样品或细胞中存在编码蛋白质的mRNA或蛋白质(包括其片段)的样品或细胞。
在癌症类型中“在高于NRG1表达中值水平的水平表达NRG1”的样品、细胞、肿瘤或癌症是其中本领域技术人员认为NRG1表达水平对于该癌症类型是“高NGR1水平”的样品、细胞、肿瘤或癌症。通常，相对于相同癌症类型的样品、细胞、肿瘤或癌症群中的NRG1水平，这样的水平将在约50％至约100％的范围内。例如，用于达到中值表达水平的群通常可以是HNSCC样品，或其小组，如化疗抗性HNSCC癌、EGFR抑制剂抗性HNSCC，以及晚期、难治或复发HNSCC癌症。本文中的实施例，证明了怎样测定中值表达水平。这可能构成表达的绝对值。在一个实施方案中，认为高NRG1水平的NRG1表达水平为60个百分比或更高、第70百分位或更高、75个百分比或更高、80个百分比或更高、第85百分位或更高、第90百分位或更高、第95百分位或更高、第97百分位或更高、第98百分位或更高，或，第99百分位或更高。将在特定试验条件下的试验中，如本文中公开的qRT-PCR，并且最优选如实施例5中的qRT-PCR试验，来定量这样的值。在一个实施方案中，使用作为参照基因的AL-137727(SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11)和VPS33B(SEQ ID NO:12)的平均表达水平，使用δCt方法来计算NRG1表达水平。
在特定的癌症类型中，NRG1表达在患有该癌症类型的患者群中是双峰的。双峰表达谱由一组呈现出高水平的NRG1表达的患者-超表达模式-和一组呈现出较低NRG1表达水平的患者-缺乏超表达模式组成。在一个实施方案中，将两个模式之间的拐点用作将癌症类型表征为“超表达NRG1”的癌症(该癌症具有高于拐点的NRG1表达水平)或“缺乏NRG1超表达”的癌症(该癌症具有低于拐点的NRG1表达水平)的值。在一个实施方案中，将二元高斯分布用于估算NRG1的超表达和缺乏NRG1的超表达之间的拐点。在一个实施方案中，使用AL-137727(SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11)和VPS33B(SEQ ID NO:12)作为参照基因来计算NRG1表达水平。
本文中使用的“聚合酶链式反应”或“PCR”的技术通常是指其中按照1987年7月28日授权的美国专利No.4,683,195中所述的来扩增少量的特定片段的核酸的程序。通常，需要获得来自目标区域末端或超出范围的序列信息，使得可以设计寡核苷酸引物；这些引物的序列与待扩增模板的相对链相同或相似。两条引物的5’端核苷酸与扩增的材料的末端一致。PCR可以用于扩增特定的RNA序列、来自总基因组DNA的特定DNA序列以及从总细胞RNA转录的cDNA、噬菌体或质粒序列等。通常参见Mullis等，Cold SpringHarbor Symp.Quant.Biol.，51:263(1987)；Erlich等，PCR Technology(PCR技术)，(Stockton Press，NY，1989)。如本文中所用的，认为PCR是用于扩增核酸测试样品的核酸聚合酶反应的一个实例，但不是唯一的实例，其包含使用已知的核酸(DNA或RNA)作为引物，并且利用核酸聚合酶来扩增或产生特定的核酸片段或扩增或产生与特定核酸互补的特定片段的核酸。
“定量实时聚合酶链式反应”或“qRT-PCR”是指其中在PCR反应的每个步骤测量PCR产物含量的PCR形式。这种技术已经描述于各种出版物中，包括Cronin等，Am.J.Pathol.164(1):35-42(2004)；和Ma等，Cancer Cell5:607-616(2004)。
术语“微阵列”是指可杂交阵列要素(优选多核苷酸探针)在基质上的有序排列。
术语“多核苷酸”，以单数或复数使用时，通常是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。因此，例如，如本文中限定的多核苷酸包括，但不限于，单链和双链DNA、包括单链和双链区的DNA、单链和双链RNA以及包括单链和双链区的RNA、包含可以是单链或更常见双链的或包括单链和双链区的DNA和RNA的杂交分子。此外，如本文中使用的术语“多核苷酸”是指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。这样区域中的链可以来自相同分子或来自不同分子。该区域可以包括一个或多个分子的全部，但更常见是仅涉及该分子的一些区域中的一个。三螺旋区的分子之一常常是寡核苷酸。术语“多核苷酸”特异性地包括cDNA。术语包括含有一个或多个修饰碱基的DNA(包括cDNA)和RNA。因此，具有为了稳定性或为了其他原因修饰的主链的DNA或RNA是“多核苷酸”，与本文中术语一样。此外，包含不常见碱基(如，肌苷)或修饰的碱基(如，氚化碱基)的DNA或RNA也包括在如本文中限定的术语“多核苷酸”中。通常，术语“多核苷酸”包括未修饰多核苷酸的所有化学、酶和/或代谢修饰形式，以及病毒和细胞(包括单一和复合细胞)特征性DNA和RNA的化学形式。
术语“寡核苷酸”是指相对短的多核苷酸，包括，但不限于，单链脱氧核糖核苷酸、单链或双链核糖核苷酸、RNA:DNA杂交体和双链DNA。常常通过化学方法，例如，使用商业购得的自动化寡核苷酸合成仪，来合成寡核苷酸，如单链DNA探针寡核苷酸。然而，可以通过各种其他方法，包括体外重组DNA介导的技术，和通过在细胞和生物体中的DNA表达，来制得寡核苷酸。
短语“基因扩增”是指通过其在特定细胞或细胞系中形成多个基因或基因片段拷贝的过程。复制的区域(一段扩增的DNA)常常被称为“扩增子”。通常，所产生的信使RNA(mRNA)的含量也按照由表达的特定基因形成的拷贝数的比例增加。
“天然序列”多肽是具有与源自自然界的多肽(例如，HER受体或HER配体)具有相同氨基酸序列的多肽，包括天然产生的变体或等位基因变体。这样的天然序列多肽可以从自然界分离，或可以通过重组或合成方式来产生。因此，天然序列多肽可以具有天然产生的人多肽、鼠多肽或来自任何其他哺乳动物物种的多肽的氨基酸序列。
在本文中，“患者”是人患者。患者可以是“癌症患者”，即，患有或处于患有一种或多种癌症症状风险的患者。
本文中的“肿瘤样品”是源自患者肿瘤的样品或包含来自患者肿瘤的肿瘤细胞的样品。本文中的肿瘤样品的实例包括，但不限于，肿瘤活检样品、循环肿瘤细胞、循环血浆蛋白、腹水、初级细胞培养物或源自肿瘤或呈现出肿瘤样特性的细胞系，以及保存的肿瘤样品，如福尔马林固定的、石蜡包埋的肿瘤样品或冷冻肿瘤样品。
“固定的”肿瘤样品是已经使用固定剂在组织学上保存的样品。
“福尔马林固定的”肿瘤样品是已经使用甲醛作为固定剂保存的样品。
“包埋的”肿瘤样品是由坚固并且通常硬的介质(如，石蜡、蜡、火棉或树脂)包围的样品。包埋使得可以切割薄的切片，用于显微镜检查或用于产生组织微阵列(TMA)。
“石蜡包埋的”肿瘤样品是由源自石油的固体烃的纯化混合物围绕的样品。
在本文中，“冷冻”肿瘤样品是指是冷冻的或已经冷冻的肿瘤样品。
“呈现出HER表达、扩增或激活”的癌症或生物样品是在诊断测试中表达(包括超表达)HER受体、具有扩增的HER基因和/或另外证明HER受体激活或磷酸化的样品。
具有“HER受体超表达或扩增”的癌症细胞是与相同组织类型的非癌细胞相比具有明显较高水平的HER受体蛋白或基因的细胞。这样的超表达可以由基因扩增或由提高的转录或翻译引起。可以在诊断或预后试验中，通过评价细胞表面上存在的HER蛋白提高的水平(例如，经由免疫组织化学；IHC)来确定HER受体超表达或扩增。可替换地，或另外地，可以测量细胞中HER编码核酸的水平，例如，经由原位杂交的荧光(FISH；参见1998年10月公布的WO98/45479)、southern印迹或聚合酶链式反应(PCR)技术，如定量实时PCR(qRT-PCR)。还可以通过测量生物流体(如，血清)中的脱落抗原(shedantigen)(例如，HER胞外结构域)来研究HER受体超表达(参见，例如，1990年6月12日授权的美国专利No.4,933,294；1991年4月18日公开的WO91/05264；1995年3月28日授权的美国专利5,401,638；和Sias等，J.Immunol.Methods 132:73-80(1990))。除了以上试验，各种体内试验也是本领域技术人员可利用的。例如，可以将患者体内的细胞暴露于可操作地连接可检测标记(例如，放射性同位素)的抗体，并且可以评价患者体内抗体与细胞的结合，例如，通过针对放射性的外部扫描或通过分析从之前暴露于抗体的患者获取的活检样品。
相反，“没有超表达或扩增HER受体”的癌症是与相同组织类型的非癌细胞相比不具有高于正常水平的HER受体蛋白或基因的癌症。抑制HER二聚化的抗体，如，帕妥珠单抗，可以用于治疗没有超表达或扩增HER2受体的癌症。
在本文中，“抗肿瘤剂”是指用于治疗癌症的药物。抗肿瘤剂的非限制性实例包括化疗剂、HER抑制剂、HER二聚化抑制剂、HER抗体、与抗原相关的针对肿瘤的抗体、抗激素化合物、细胞因子、EGFR靶向药物、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂、生长抑制剂和抗体、细胞毒性剂、诱导凋亡的抗体、COX抑制剂、法呢基转移酶抑制剂、结合致癌胎儿蛋白CA125的抗体、HER2疫苗、Raf或ras抑制剂、脂质体阿霉素、拓扑替康(topotecan)、紫杉烷(taxane)、双重酪氨酸激酶抑制剂、TLK286、EMD-7200、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗、厄洛替尼和贝伐单抗(bevacizumab)。
“批准的抗肿瘤剂”是用于治疗癌症的已经由监管部门(如，食品和药品管理局(FDA)或其国外的同等单位)批准销售的药物。
在HER3抑制剂作为“单一抗肿瘤剂”给药时，其是唯一给药来治疗癌症的抗肿瘤剂，即，没有结合另一种抗肿瘤剂(如，化疗)来给药。
“护理标准”，本文中意指常规用于治疗特定形式的癌症的一种或多种抗肿瘤剂。
“生长抑制剂”，用于本文中时，是指在体外或体内抑制细胞(尤其是HER表达癌细胞)生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是明显降低S期的HER表达细胞百分比的制剂。生长抑制剂的实例包括阻断细胞周期进展(在S期以外的时期)的制剂，如诱导G1停止和M-期停止的制剂。典型的M-期阻断剂包括长春碱类(vincas)(长春新碱和长春花碱)、紫杉烷和拓扑II抑制剂，如阿霉素、表柔比星、柔红霉素、足叶乙苷和博来霉素。停止G1的那些制剂也溢出至S-期停止，例如，DNA烷化剂，如他莫昔芬、强的松、氨烯咪胺(decarbazine)、氮芥、顺铂、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶和ara-C。更多的信息可见于The Molecular Basis of Cancer，Mendelsohn和Israel编辑，第1章，标题为“Cell cycle regulation,oncogenes,and antineoplastic drugs”，Murakami等，(WB Saunders:Philadelphia，1995)，尤其是p.13。
“生长抑制”抗体的实例是结合HER并且抑制表达HER的癌细胞生长的那些。
“诱导凋亡”的抗体是诱导程序化细胞死亡的抗体，如通过膜联蛋白V的结合、DNA的片段化、细胞收缩、内质网的扩张、细胞片段化和/或膜囊(称为凋亡体)形成来确定细胞死亡。各种方法可用于评价与凋亡相关的细胞事件。例如，可以通过膜联蛋白V结合来测量磷脂酰丝氨酸(PS)移位；可以通过DNA梯来评价DNA片段化；以及可以通过亚二倍体细胞的任何增加来评价核/染色质凝聚连同DNA片段化。优选，诱导凋亡的抗体是在使用BT474细胞的膜联蛋白结合试验中，相对于未处理细胞，导致约2至50倍，优选约5至50倍，并且最优选约10至50倍的膜联蛋白结合诱导的抗体。
“处理”是指治疗性处理和预防性或防止性手段。需要处理的那些包括已经患有癌症的那些或其中待防止癌症的那些。因此，本文中待处理的患者已经诊断为患有癌症或倾向于或易患有癌症。
术语“治疗有效量”或“有效量”是指治疗患者癌症有效的药物量。药物的有效量可以减少癌细胞的数量；减小肿瘤大小；抑制(即，减缓至一定程度并且优选停止)癌细胞浸润至周围器官中；抑制(即，减缓至一定程度并且优选停止)肿瘤转移；抑制一定程度的肿瘤生长；和/或减轻一定程度的一种或多种与癌症相关的症状。为了到达药物可以防止生长和/或杀灭现有的癌细胞的程度，药物可以是抑制细胞生长的和/或细胞毒性的。有效量可以延长无进展存活(例如，通过Response Evaluation Criteria for Solid Tumors，RECIST，或CA-125变化来测量)、导致客观应答(包括部分应答，PR，或完全应答，CR)、提高存活(包括总体存活和无进展存活)和/或改善一种或多种癌症的症状(例如，通过FOSI评价的)。最优选，药物的治疗有效量能有效提高无进展存活(PFS)和/或总体存活(OS)。
“存活”是指患者保持有生命的，并且包括总体存活以及无进展存活。
“总体存活”是指患者从诊断或治疗时开始保持有生命的，并持续限定的时间段，如1年、5年等。
“无进展存活”是指患者保持有生命的，没有癌症进展或恶化。
“延长存活”意思是相对于未治疗的患者(即，相对于没有使用HER抑制剂(如，双特异性HER3/EGFR抑制剂MEHD7945A)治疗的患者)，或相对于没有表达指定水平的NRG1的患者，和/或相对于用批准的抗癌剂治疗的患者，提高治疗患者的总体或无进展存活。
“客观应答”是指可测量的应答，包括完全应答(CR)或部分应答(PR)。
“完全应答”或“CR”意指癌症的所有体征因应答治疗而消失。这不总是表示癌症已经治愈。
“部分应答”“PR”是指应答治疗，一个或多个肿瘤或损伤的大小降低，或身体内癌症的程度降低。
如本文中使用的术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语旨在包括放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)、化疗剂和毒素，如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体。
“化疗抗性”癌症意思是尽管接受了化疗方案，但癌症患者仍然进展了(即，患者是“化疗难治的”)，或在完成化疗方案的12个月内(例如，6个月内)，患者进展了。
“铂-抗性”癌症意思是尽管接受了基于铂的化疗，但癌症患者仍然进展了(即，患者是“铂难治的”)，或在完成基于铂的化疗方案的12个月内(例如，6个月内)，患者进展了。
“抗血管生成剂”是指一定程度上阻断，或干扰血管发展的化合物。例如，抗血管生成剂可以是结合涉及促进血管生成的生长因子或生长因子受体的小分子或抗体。本文中优选的抗血管生成剂是结合血管内皮生长因子(VEGF)的抗体，如贝伐单抗
术语“细胞因子”指的是由一个细胞群释放的蛋白质的通用术语，该细胞群作为胞间介质作用于另一种细胞。这样的细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。其中包括的细胞因子是生长激素，如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如卵泡刺激因子(FSH)、甲状腺刺激因子(TSH)和促黄体激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳质；肿瘤坏死因子-α和-β；缪勒抑制物质；鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，如干扰素-α、-β和γ，集落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞间介素，如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；肿瘤坏死因子，如TNF-α或TNF-β；和其他多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。如本文中所用的，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质以及天然序列细胞因子的生物活性等价物。
“酪氨酸激酶抑制剂”是抑制酪氨酸激酶的酪氨酸激酶活性的分子，如HER受体。这样的抑制剂实例包括之前段落中所述的EGFR靶向药物；小分子HER2酪氨酸激酶抑制剂，如可从Takeda获得的TAK165；CP-724,714，一种口服的EerbB2受体酪氨酸激酶的选择性抑制剂(Pfizer和OSI)；双重HER抑制剂，如EKB-569(可从Wyeth获得)，其优选地结合EGFR，但同时抑制超表达HER2和EGFR的细胞；GW572016(可从Glaxo获得)，口服HER2和EGFR酪氨酸激酶抑制剂；PKI-166(可从Navartis获得)；pan-HER抑制剂，如卡纽替尼(CI-1033；Pharmacia)；Raf-1抑制剂，如反义剂ISIS-5132，可从ISIS Pharmaceuticals获得，其抑制Raf-1信号传输；非HER靶向的TK抑制剂，如甲磺酸伊马替尼(Imatinib mesylate)(GleevacTM)，可从Glaxo获得；MAPK胞外调控的激酶I抑制剂CI-1040(可从Pharmacia获得)；喹唑啉，如PD 153035，4-(3-氯苯胺基)喹唑啉；吡啶并嘧啶；嘧啶并嘧啶；吡咯并嘧啶，如CGP 59326、CGP 60261和CGP 62706；吡唑并嘧啶，4-(苯基氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶；姜黄素(二阿魏酰甲烷，4,5-二(4-氟苯胺基)邻苯二甲胺)；含有硝基噻吩部分的tyrphostine；PD-0183805(Warner-Lamber)；反义分子(例如，结合HER编码核酸的那些)；喹喔啉(美国专利No.5,804,396)；tryphostin(美国专利No.5,804,396)；ZD6474(Astra Zeneca)；PTK-787(Novartis/Schering AG)；pan-HER抑制剂，如CI-1033(Pfizer)；Affinitac(ISIS 3521；Isis/Lilly)；甲磺酸伊马替尼(Gleevac；Novartis)；PKI166(Novartis)；GW2016(Glaxo SmithKline)；CI-1033(Pfizer)；EKB-569(Wyeth)；Semaxinib(Sugen)；ZD6474(AstraZeneca)；PTK-787(Novartis/Schering AG)；INC-1C11(Imclone)；或如以下任一篇专利公开中所述的：美国专利No.5,804,396；WO99/09016(American Cyanimid)；WO98/43960(AmericanCyanamid)；WO97/38983(Warner Lambert)；WO99/06378(Warner Lambert)；WO99/06396(Warner Lambert)；WO96/30347(Pfizer，Inc)；WO96/33978(Zeneca)；WO96/3397(Zeneca)；和WO96/33980(Zenaca)。
本文中的治疗剂的“固定的”或“无变化的”剂量是指与患者的体重(WT)或体表面积(BSA)无关地给药至人患者的剂量。因此固定的或无变化的剂量不是作为mg/kg剂量或mg/m2剂量来提供，而是作为治疗剂的绝对量来提供。
本文中的“负荷”剂量通常包括给药至患者的治疗剂的初始剂量，并且之后给予其一个或多个维持剂量。通常，给药单个负荷剂量，但本文中也考虑了多个负荷剂量。通常，给药的负荷剂量的含量超过给药的维持剂量的含量和/或给药负荷剂量比维持剂量更频繁，使得比使用维持剂量更早地获得所需的治疗剂的稳态浓度。
本文中的“维持”剂量是指在治疗时间段内给药至患者的一个或多个治疗剂剂量。通常，以间隔的时间间隔来给药维持剂量，如大约每个星期、大约每2个星期、大约每3个星期，或大约每4个星期。
“药物”是治疗癌症的活性药物，如HER3抑制剂，如双特异性HER3/EGFR抑制剂(如，MEHD7945A)。
“目标受众”是正在向其推销或打算向其推销特定药物的一群人或公共机构，如通过销售或广告来促销，尤其是针对特定的用途、治疗或适应症来推销，如，单独的患者、患者群、报纸的读者、医学文献和杂志、电视或互联网浏览者、电台或互联网听众、医师、制药公司等。
使用的“包装说明书”是指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其含有关于适应症、使用方法、剂量、给药、禁忌症、与包装的产品结合的其他治疗产品的信息和/或关于使用这样的治疗产品的警告等。
II.组合物和方法
A.示例性HER3抑制剂
在一个方面中，本发明部分涉及选择用于患有一种类型癌症的患者的治疗，所述癌症类型基于患者癌症中的NRG1的表达水平。在一个实施方案中，如果患者的癌症超表达NRG1，则选择HER3抑制剂作为治疗。在一个实施方案中，如果患者癌症中的NRG1水平高于该癌症类型中一般的NRG1水平，则选择HER3抑制剂作为治疗。在特定的实施方案中，如果选择了这样的治疗，则使用HER3抑制剂治疗患者。
HER3抑制剂可以是抗体或其他抗原结合蛋白、小分子、核酸(如，siRNA)，或任何其他这样的分子。在本发明的特定实施方案中，所述HER3抑制剂抑制NRG1结合HER3。
在一个实施方案中，所述HER3抑制剂是抗体。示例性抗-HER3抗体描述于WO2011076683中(Mab205.10.1、Mab205.10.2、Mab205.10.3、US7846440、US7705130和US5968511。
在一个实施方案中，所述HER3抑制剂是双特异性HER3/EGFR抑制剂。在一个实施方案中，所述双特异性HER3/EGFR抑制剂是双特异性抗体。在一个实施方案中，所述双特异性HER3/EGFR抑制剂是包含特异性结合HER3和EGFR的抗原结合结构域的双特异性抗体。在一个实施方案中，所述双特异性HER3/EGFR抑制剂是包含两个相同的抗原结合结构域的双特异性抗体，每个结构域特异性地结合HER3和EGFR。这样的抗体描述于WO2010108127、US20100255010和Schaefer等，Cancer Cell,20:472-486(2011)中。一种这样的包含特异性结合HER3和EGFR的抗原结合结构域的特定双特异性HER3/EGFR抑制剂是MEHD7945A。
在一个实施方案中，所述双特异性HER3/EGFR抗体包含特异性结合HER3和EGFR的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH，所述VH包含SEQID NO:1的氨基酸序列的一个、两个和/或三个HVR。在一个实施方案中，所述双特异性HER3/EGFR抗体包含特异性结合HER3和EGFR的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，所述VH包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的一个、两个和/或三个HVR，所述VL包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的一个、两个和/或三个HVR。在一个实施方案中，所述双特异性HER3/EGFR抗体包含特异性结合HER3和EGFR的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，所述VH包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的全部三个HVR，所述VL包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的全部三个HVR。在一些实施方案中，所述HVR是延长的HVR。在一个特定的实施方案中，所述HVR-H1包含氨基酸序列LSGDWIH(SEQ ID NO:3)，HVR-H2包含氨基酸序列VGEISAAGGYTD(SEQ ID NO:4)、HVR-H3包含氨基酸序列ARESRVSFEAAMDY(SEQ ID NO:5)、HVR-L1包含氨基酸序列NIATDVA(SEQ ID NO:6)、HVR-L2包含氨基酸序列SASF(SEQ ID NO:7)和HVR-L3包含氨基酸序列SEPEPYT(SEQ ID NO:8)。
在一个实施方案中，所述双特异性HER3/EGFR抗体包含特异性结合HER3和EGFR的抗原结合结构域，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的VH。在一个特定的实施方案中，包含与SEQID NO:1的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的VH的双特异性HER3/EGFR包含含有氨基酸序列LSGDWIH(SEQ ID NO:3)的HVR-H1、含有氨基酸序列VGEISAAGGYTD(SEQ ID NO:4)的HVR-H2和含有氨基酸序列ARESRVSFEAAMDY(SEQ ID NO:5)的HVR-H3。
在一个实施方案中，所述双特异性HER3/EGFR抗体包含特异性结合HER3和EGFR的抗原结合结构域，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的VL。在一个特定的实施方案中，包含与SEQID NO:2的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的VL的双特异性HER3/EGFR包含含有氨基酸序列NIATDVA(SEQ ID NO:6)的HVR-L1、含有氨基酸序列SASF(SEQ ID NO:7)的HVR-L2和含有氨基酸序列SEPEPYT(SEQ ID NO:8)的HVR-L3。
在一个实施方案中，所述双特异性HER3/EGFR抗体包含特异性结合HER3和EGFR的抗原结合结构域，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的VH和与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的VL。在一个实施方案中，包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的VH和与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的VL的双特异性HER3/EGFR抗体包含含有氨基酸序列LSGDWIH(SEQ ID NO:3)的HVR-H1、含有氨基酸序列VGEISAAGGYTD(SEQ ID NO:4)的HVR-H2、含有氨基酸序列ARESRVSFEAAMDY(SEQ ID NO:5)的HVR-H3、含有氨基酸序列NIATDVA(SEQ ID NO:6)的HVR-L1、含有氨基酸序列SASF(SEQ ID NO:7)的HVR-L2和含有氨基酸序列SEPEPYT(SEQ ID NO:8)的HVR-L3。
在一个实施方案中，所述双特异性HER3/EGFR抗体包含特异性结合HER3和EGFR的抗原结合结构域，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH。在一个实施方案中，所述双特异性HER3/EGFR抗体包含特异性结合HER3和EGFR的抗原结合结构域，其中所述抗体包含含有SEQID NO:2的氨基酸序列的VL。在一个实施方案中，所述双特异性HER3/EGFR抗体包含特异性结合HER3和EGFR的抗原结合结构域，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VL。
1.抗体亲和性
在特定的实施方案中，本文中提供的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-8M或更低，例如，10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。
在一个实施方案中，按照以下试验所述的，通过放射性标记的抗原结合试验(RIA)来测量Kd，使用目标抗体的Fab形式及其抗原来进行。在滴定系列的未标记抗原的存在下，通过用最小浓度的(125I)-标记的抗原平衡Fab，然后用抗-Fab抗体覆盖的平板捕获结合的抗原，从而测量Fab对抗原的溶液结合亲和性(参见，例如，Chen等，J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为了建立用于试验的条件，用50mM碳酸钠(pH9.6)中的5μg/ml捕获抗-Fab抗体(CappelLabs)，将多孔平板(Thermo Scientific)覆盖过夜，并且随后用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室温下(大约23℃)阻断两小时至五小时。在非吸附剂平板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与连续稀释的目标Fab混合(例如，与Presta等，Cancer Res.57:4593-4599(1997)中的抗VEGF-抗体，Fab-12的评价一致)。然后将目标Fab孵育过夜；然而，孵育可以持续较长的时间段(例如，约65小时)，以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕获平板，用于在室温下孵育(例如，约一小时)。然后除去溶液，并且用PBS中的0.1％聚山梨酸酯20将平板洗涤八次。平板已经干燥时，加入150μl/孔的闪烁剂(MICROSCINT-20TM；Packard)，并且将平板在TOPCOUNTTMγ计数器(Packard)上计数十分钟。选择产生低于或等于20％最大结合的每种Fab的浓度用于竞争性结合试验。
根据另一个实施方案，使用或 (BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)，在25℃，使用约10应答单位(RU)的固定化抗原CM5芯片，使用表面等离子体共振试验来测量Kd。简而言之，根据供应商的说明，用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺氢氯化物(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE，Inc.)。用10mM醋酸钠，pH4.8，将抗原稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注射，以获得大约10应答单位(RU)的偶联蛋白。注射抗原后，注入1M乙醇胺，以阻断未反应的基团。为了动力学测量，在25℃，以大约25μl/min的流速，注入在含有0.05％聚山梨酸酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。通过同时拟合缔合和解离传感图，使用单纯一对一Langmuir结合模型(Evaluation Software，版本3.2)来计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。按照koff/kon的比例来计算平衡解离常数(Kd)。参见，Chen等，J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过以上的表面等离子体共振试验的on-rate超过106M-1s-1，则可以通过荧光淬灭技术来测定on-rate，所述荧光淬灭技术在递增浓度的抗原的存在下，在25℃，测量PBS，pH7.2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度的提高或降低(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)，如在分光光度计中测量的，如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000-系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)，使用搅拌比色杯。
2.抗体片段
在特定的实施方案中，本文中提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括，但不限于，Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和scFv片段，以及以下描述的其他片段。对于特定抗体片段的综述，参见Hudson等，Nat.Med.9:129-134(2003)。对于scFv片段的综述，参见，例如，Pluckthün，在ThePharmacology of Monoclonal Antibodies中，vol.113，Rosenburg和Moore编辑(Springer-Verlag，New York)，第269-315页(1994)；还参见WO 93/16185；和美国专利No.5,571,894和5,587,458。对于包含补救受体结合表位残基并具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利No.5,869,046。
双抗是具有两个抗原结合位点的可以为二价或双特异性的抗体。参见，例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等，Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三抗和四抗也描述于Hudson等，Nat.Med.9:129-134(2003)中。
单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在特定的实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见例如美国专利No.6,248,516B1)。
可以通过各种技术来制得抗体片段，所述技术包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如，大肠杆菌或噬菌体)的产生，如本文中所述的。
3.嵌合和人源化抗体。
在特定的实施方案中，本文中提供的抗体是嵌合抗体。特定的嵌合抗体描述于，例如，美国专利No.4,816,567；和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)中。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔子或非人灵长类动物，如猴子的可变区)和人恒定区。在进一步的实例中，嵌合抗体是“类别转换”抗体，其中来自亲本抗体的类别或亚类已经改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在特定的实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化，以降低对人的致免疫性，同时保持亲本非人抗体的特异性和亲和性。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR，例如，CDR(或其部分)源自非人抗体，并且FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选还将包含至少一部分的人恒定区。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，从其产生HVR残基的抗体)的相应残基置换，例如，以恢复或提高抗体特异性或亲和性。
人源化抗体及其制备方法综述于，例如，Almagro和Fransson，Front.Biosci.13:1619-1633(2008)，并且进一步描述于，例如，Riechmann等，Nature332:323-329(1988)；Queen等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA86:10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等，Methods 36:25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan，Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重修(resurfacing)”；Dall’Acqua等，Methods 36:43-60(2005)(描述“FR改组”)和Osbourn等，Methods 36:61-68(2005)和Klimka等，Br.J.Cancer，83:252-260(2000)(描述FR改组的“定向选择”方法)。
可以用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳(best-fit)”方法选择的框架区(参见，例如，Sims等，J.Immunol.151:2296(1993))；源自轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见，例如，Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；和Presta等，J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(参见，例如，Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和源自筛选FR文库的框架区(参见，例如，Baca等，J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等，J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
4.人抗体
在特定的实施方案中，本文中提供的抗体是人抗体。可以使用本领域已知的各种技术来产生人抗体。人抗体总地描述于van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)和Lonberg，Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。
人抗体可以通过将免疫原给药至转基因动物来制备，该动物已经改变，其通过应答抗原挑战来产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。这样的动物通常含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座，其替代内源性的免疫球蛋白基因座，或存在于染色体外或随机整合至动物的染色体中。在这样的转基因小鼠中，所述内源性免疫球蛋白基因座通常已经失活。对于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg，Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还可以参见，例如，描述XENOMOOUSETM技术的美国专利No.6,075,181和6,150,584；描述技术的美国专利5,770,429；描述K-M技术的美国专利7,041,870和描述技术的美国专利申请公开No.US2007/0061900。例如，通过结合不同的人恒定区，可以进一步修饰通过这样的动物产生的完整抗体的人可变区。
还可以通过基于杂交瘤的方法来制得人抗体。已经描述了用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤。(参见，例如，Kozbor J.Immunol.，133:3001(1984)；Brodeur等，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，第51-63页(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)；和Boerner等，J.Immunol.，147:86(1991))。经由人B-细胞杂交瘤技术产生的人抗体也描述于Li等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。其他方法包括例如美国专利No.7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系生产单克隆人IgM抗体)和Ni，Xiandai Mianyixue，26(4):265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)中描述的那些。人杂交瘤技术(Trioma技术)还描述于Vollmers和Brandlein，Histology and Histopathology，20(3):927-937(2005)以及Vollmers和Brandlein，Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology，27(3):185-91(2005)中。
还可以通过分离从人衍生的噬菌体展示文库分泌的Fv克隆可变结构域序列来产生人抗体。然后可以将这样的可变结构域序列与所需的人恒定结构域组合。以下描述了用于从抗体文库选择人抗体的技术。
5.文库衍生的抗体
本发明的抗体可以通过筛选组合文库得到具有所需的一种或多种活性的抗体进行分离。例如，本领域各种产生噬菌体展示文库以及筛选具有所需结合特征的抗体的文库的方法是已知的。这样的方法综述于，例如，Hoogenboom等，Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等编辑，Human Press，Totowa，NJ，2001)，并且进一步描述于例如McCafferty等，Nature 348:552-554；Clackson等，Nature 352:624-628(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury，Methods in Molecular Biology248:161-175(Lo编辑，Human Press，Totowa，NJ，2003)；Sidhu等，J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等，J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等，J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)。
在特定的噬菌体展示方法中，通过聚合酶链式反应(PCR)分开克隆VH和VL基因库，并且在噬菌体文库中随机重新组合，然后针对抗原结合噬菌体进行筛选，如Winter等，Ann.Rev.Immunol.，12:433-455(1994)中所述的。噬菌体通常展示抗体片段，作为单链Fv(scFv)片段或作为Fab片段。来自免疫来源的文库提供了免疫原的高亲和性抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以(从例如人)克隆天然库，以提供多种非自体以及自体抗原的单一抗体源，而没有任何免疫，如Griffiths等，EMBO J，12:725-734(1993)中所述的。最后，还可以通过从干细胞克隆未重排的V-基因区段，并且使用含有PCR引物的随机序列来编码高可变性的CDR3区并且在体外完成重排，从而合成制得天然文库，如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)中所述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开包括，例如，美国专利No.5,750,373和美国专利公开No.2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
从人抗体文库分离的抗体或抗体片段在本文中认为是人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在特定的实施方案中，本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如，包含两个抗原结合结构域的传统双特异性抗体，每个结构域对不同的靶标是特异性的。多特异性抗体是对至少两个不同的位点具有结合特异性的单克隆抗体。在特定的实施方案中，结合特异性中的一个是针对HER3的，而另一个针对任何其他抗原。在特定的实施方案中，所述双特异性抗体可以结合HER3的两个不同表位。双特异性抗体还可以用于将细胞毒性剂定位于表达HER3的细胞。双特异性抗体可以作为全长抗体或抗体片段来制备。
用于制备多特异性抗体的技术包括，但不限于，具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见，Milstein和Cuello，Nature 305:537(1983))、WO 93/08829和Traunecker等，EMBO J.10:3655(1991))和“钮孔(knob-in-hole)”工程化(参见，例如，美国专利No.5,731,168)。多特异性抗体还可以通过工程化静电牵引作用来制得，所述作用用于制备抗体Fc-杂二聚分子(WO 2009/089004A1)；交联两个或多个抗体或片段(参见，例如，美国专利No.4,676,980，和Brennan等，Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来生产双特异性抗体(参见，例如，Kostelny等，J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用用于制备双特异性抗体片段的“双抗”技术(参见，例如，Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见，例如，Gruber等，J.Immunol.,152:5368(1994))；和制备三特异性抗体，按照例如Tutt等，J.Immunol.147:60(1991)中所述的。
本文中还包括具有三个或多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“Octopus抗体”(参见，例如，US 2006/0025576A1)。
本文中的抗体或片段还包括“双重作用FAb”或“DAF”，其包含结合HER3以及另一个不同抗原的抗原结合位点(参见，例如，US 2008/0069820)。本文中描述了这样的双特异性HER1/EGFR抑制剂的实例并且包括示例性MEHD7945A抗体。
7.抗体变体
在特定的实施方案中，考虑了本文中提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，希望提高抗体的结合亲和性和/或其他生物特性。可以通过将合适的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或通过肽合成，来制备抗体的氨基酸序列变体。这样的修饰包括，例如，删除，和/或插入和/或置换抗体氨基酸序列中的残基。可以进行删除、插入和置换的任意组合，以获得最终的构建体，只要最终的构建体具有所需的特征，例如，抗原结合。
a)置换、插入和删除变体
在特定的实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。用于置换诱变的目标位点包括HVR和FR。保守性置换显示于表1的标题“保守性置换”下。更多实质性变化提供于表1的标题“示例性置换”下，并且如以下参照氨基酸侧链类别进一步描述的。氨基酸置换可以引入目标抗体中，并且针对所需活性来筛选产物，所需活性例如为保留的/提高的抗原结合、降低的致免疫性，或提高的ADCC或CDC。
表1
氨基酸可以根据常见的侧链特性进行分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链方向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。
非保守性置换需要将这些类别中的一个的成员替换为另一个类别的。
一种类型的置换变体涉及置换亲本抗体(例如，人源化或人抗体)的一个或多个超变区残基。通常，为进一步研究所选择的所得变体相对于亲本抗体将在特定的生物特性(例如，提高的亲和性、降低的致免疫性)中具有变化(例如，提高)和/或将具有基本上保留的亲本抗体的特定生物特性。示例性置换变体是亲和性突变抗体，其可以是方便地产生，例如，使用基于噬菌体展示的亲和性突变技术，如本文中描述的那些。简而言之，一个或多个HVR残基突变，变体抗体展示在噬菌体上，并且针对特定的生物活性(例如，结合亲和性)进行筛选。
可以在HVR中进行改变(例如，置换)，例如，以提高抗体亲和性。这样的改变可以在HVR“热点”中进行，热点即体细胞突变过程中经历高频突变的密码子编码的残基(参见，例如，Chowdhury，Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))，和/或在SDR(a-CDR)中进行，并针对结合亲和性测试所得到的变体VH或VL。通过构建并且从第二个文库重新选择的亲和性突变已经描述于例如(Hoogenboom等，Methods in Molecular Biology178:1-37(O’Brien等编辑，Human Press，Totowa，NJ，(2001))。在亲和性突变的一些实施方案中，将多样性引入选择用于通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)中的任一种进行突变的可变基因中。然后形成第二个文库。然后筛选文库，以鉴定具有所需亲和性的抗体变体。另一种引入多样性的方法涉及HVR定向方法，其中将几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)随机化。涉及抗原结合的HVR残基可以特异性地鉴定，例如，使用丙氨酸扫描诱变或建模。特别地，常常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在特定的实施方案中，置换、插入或删除可以发生在一个或多个HVR中，只要这样的改变没有实质性地降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR中进行基本上没有降低结合亲和性的保守性改变(例如，如本文中提供的保守性置换)。这样的改变可以在HVR“热点”或SDR外。在以上提供的变体VH和VL序列的特定实施方案中，各HVR是未改变的，或含有不超过一个、两个或三个氨基酸置换。
一种用于鉴定可以靶向诱变的抗体的残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085中所述的。在这种方法中，鉴定靶标残基的一个残基或组(例如，待电荷的残基，如arg、asp、his、lys和glu)并且由中性或负电荷氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替代，以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。在氨基酸位置引入了更多置换，证明对初始置换的功能敏感性。替换地，或另外地，抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体和抗原之间的接触点。可以作为置换的候选物，靶向或消除这样的接触残基和邻接的残基。可以筛选变体，以确定它们是否含有所需的特性。
氨基酸序列插入包括长度范围从一个残基至含有上百或更多个残基的多肽的氨基-和/或羧基-端融合子，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N-或C-端与酶的融合子(例如，ADEPT)或提高抗体血清半衰期的多肽。
b)糖基化变体
在特定的实施方案中，改变本文中提供的抗体，以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列，使得形成或去除一个或多个糖基化位点，因而方便地完成添加或删除抗体的糖基化位点。
在抗体包含Fc区抗体的情况中，可以改变与其连接的碳水化合物。哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分支的、二天线型寡糖，其通常通过N-连接连接Fc区的CH2结构域的Asn297。参见，例如，Wright等，TIBTECH15:26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及连接二天线型寡糖结构的“茎干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以为了形成具有特定的提高的特性的抗体变体，形成本发明的抗体中的寡糖的改变。
在一个实施方案中，提供了具有缺乏(直接或间接)连接Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构的抗体变体。例如，这样的抗体中的岩藻糖含量可以为1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。可以例如，如WO 2008/077546中所述的，通过MALDI-TOF质谱测量相对于连接Asn297的全部糖结构的总和(例如，复合物、杂合体和高甘露糖结构)，计算Asn297处的糖链内的岩藻糖平均含量，来确定岩藻糖的含量。Asn297是指位于Fc区中的大约位置297的天冬酰胺残基(Fc区残基的Eu编号)；然而，由于抗体中较小的序列改变，Asn297也可以位于位置297的上游或下游的大约±3个氨基酸，即，位置294至300。这样的岩藻糖化变体具有提高的ADCC功能。参见，例如，美国专利公开No.US 2003/0157108(Presta，L.)；US 2004/0093621(KyowaHakko Kogyo Co.，Ltd)。涉及“脱岩藻糖化”或“岩藻糖缺乏”抗体变体的公开实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等，J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等，Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生脱岩藻糖化抗体的细胞系实例包括蛋白岩藻糖化缺陷的Lec 13CHO细胞(Ripka等，Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请No US 2003/0157108A1，Presta，L；和WO 2004/056312A1，Adams等，尤其是实施例11)，和敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因，FUT8，敲除CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki等，Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda，Y.等，Biotechnol.Bioeng.，94(4):680-688(2006)和WO2003/085107)。
进一步提供了具有二等分寡糖的抗体变体，例如，其中通过GlcNAc将连接抗体Fc区的二天线型寡糖二等分。这样的抗体变体具有降低的岩藻糖化和/或提高的ADCC功能。这样的抗体变体的实例描述于，例如，WO2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利No.6,602,684(Umana等)和US2005/0123546(Umana等)。还提供了在连接Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这样的抗体变体可以具有提高的CDC功能。这样的抗体变体描述于，例如，WO 1997/30087(Patel等)；WO 1998/58964(Raju，S.)；和WO 1999/22764(Raju，S.)。
c)Fc区变体
在特定的实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fc区中，由此产生Fc区变体。Fc区变体可以在一个或多个氨基酸位置包含含氨基酸修饰(例如，置换)的人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。
在特定的实施方案中，本发明考虑了具有一些但非全部效应物功能的抗体变体，这使其成为其中所述抗体在体内的半衰期是重要的但特定的效应物功能(如补体和ADCC)是不需要的或可删除的应用的理想候选物。可以进行体外和/或体内细胞毒性试验，来证实CDC和/或ADCC活性的降低/耗尽。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合试验，来确保抗体缺乏FcγR结合(因此，很可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的初级细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达概括于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表3中。评价目标分子的ADCC活性的体外试验的非限制性实例描述于美国专利No,5,500,362(参见，例如，Hellstrom,I.等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)，5,821,337(参见Bruggemann,M.等，J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。或者，可以使用非放射性试验方法(参见，例如，ACTITM用于流式细胞术的非放射性细胞毒性试验(CellTechnology,Inc.Mountain View，CA；和CytoTox非放射性细胞毒性试验(Promega，Madison，WI)。用于这样的试验的有用效应物细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替换地或另外地，可以在体内评价目标分子的ADCC活性，例如，在动物模型中，如Clynes等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中公开的。还可以进行C1q结合试验来证实抗体不能结合C1q并且因此缺乏CDC活性。参见，例如，WO 2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评价补体激活，可以进行CDC试验(参见，例如，Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods202:163(1996)；Cragg,M.S.等，Blood 101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。还可以使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见，例如，Petkova,S.B.等，Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有降低的效应物功能的抗体包括Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中经一个或多个置换的那些(美国专利No.6,737,056)。这样的Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的一个或多个经置换的Fc突变体，包括残基265和297置换成丙氨酸的称为“DANA”的Fc突变体(美国专利No.7,332,581)。
公开了具有提高的或降低的与FcR结合的特定抗体变体(参见，例如，美国专利No.6,737,056；WO 2004/056312，和Shields等，J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在特定的实施方案中，抗体变体包含具有一个或多个提高ADCC的氨基酸置换的Fc区，例如，在Fc区的位置298、333和/或334的置换(残基的EU编号)。
在一些实施方案中，在Fc区形成了导致改变的(即，提高的或降低的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)的改变，例如，如美国专利No.6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等，J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述的。
具有提高的半衰期和提高的与新生儿受体(FcRn)(其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等，J.Immunol.117:587(1976)和Kim等，J.Immunol.24:249(1994)))结合的抗体，描述于US2005/0014934A1中(Hinton等)。那些抗体包含具有一个或多个置换的Fc区，其中其提高了Fc区与FcRn的结合。这样的Fc变体包括在Fc区残基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的一个或多个具有置换的那些，例如，Fc区残基434的置换(美国专利No.7,371,826)。
还可以参见Duncan&Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利No.5,648,260；美国专利No.5,624,821；和WO 94/29351，关于Fc区变体的其它实例。
d)半胱氨酸工程化抗体变体
在特定的实施方案中，希望形成半胱氨酸工程化抗体，例如，“硫代MAb”，其中所述抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基置换。在特定的实施方案中，置换的残基发生在抗体的易接近位点。通过用半胱氨酸置换那些残基，由此将反应性硫醇基团放置在抗体的易接近位点，并且可以用于将抗体与其他部分偶联，如药物部分或连接物-药物部分，以形成免疫偶联物，如本文中进一步所述的。在特定的实施方案中，以下残基的任何一个或多个可以被半胱氨酸置换：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。可以按照，例如，美国专利No.7,521,541中所述的，产生半胱氨酸工程化抗体。
e)抗体衍生物
在特定的实施方案中，进一步修饰本文中提供的抗体，以含有本领域已知的且容易获得的其他非蛋白质部分。适用于抗体衍生的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二茂烷、聚-1,3,6-三烷、乙烯/马来酐共聚物、聚氨基酸(同型聚合物或随机共聚物)，以及葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇同型聚合物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如，丙三醇)、聚乙烯醇，及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性，在制造上具有优势。聚合物可以是任何分子量的，并且可以是支链或直链的。连接抗体的聚合物数量可以改变，并且如果连接超过一个聚合物，它们可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生的聚合物的数量和/或类型可以基于以下考虑来决定，所述考虑包括，但不限于，待提高的抗体的特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于限定条件下的治疗中等。
在另一个实施方案中，提供了可以通过暴露于辐射选择性加热的抗体和非蛋白质部分的偶联物。在一个实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的，并且包括，但不限于，没有伤害正常细胞的波长，但其将非蛋白质部分加热至杀灭最接近抗体-非蛋白质部分的细胞的温度。
B.重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物生产抗体，例如，如美国专利No.4,816,567中所述。在一个实施方案中，提供了编码本文中所述的抗-HER3抗体(包括双特异性抗体)的分离核酸。这样的核酸可以编码包含VL的氨基酸序列和/或包含抗体VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在进一步的实施方案中，提供了一个或多个包含这样的核酸的载体(例如，表达载体)。在进一步的实施方案中，提供了包含这样的核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经用以下物质转染)：(1)包含编码包含抗体VL的氨基酸序列和包含抗体VH的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)包含编码包含抗体VL的氨基酸序列的核酸的第一个载体和包含编码包含抗体VH的氨基酸序列的核酸的第二个载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了制备抗HER3抗体(包括双特异性抗体)的方法，其中该方法包括在适于抗体表达的条件下，培养如上提供的包含编码抗体的核酸的宿主细胞，并且任选从宿主细胞(或宿主细胞培养基)收集抗体。
为了抗HER3抗体(包括双特异性抗体)的重组生产，分离例如如上所述的编码抗体的核酸，并且插入一个或多个载体中，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离这样的核酸并且测序。
用于抗体编码载体的克隆或表达的合适宿主细胞包括本文中所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中生产抗体，特别是不需要糖基化和Fc效应物功能时。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见，例如，美国专利No.5,648,237、5,789,199和5,840,523。(还可以参见，Charlton，Methods inMolecular Biology，Vol.248(B.K.C.Lo编辑，Humana Press，Totowa，NJ，2003)，第245-254页，描述了在大肠杆菌中表达抗体片段)。表达后，可以以可溶性片段从细菌细胞糊状物中分离出抗体，并且可以进一步纯化。
除了原核生物以外，真核微生物，如丝状真菌或酵母，也是用于抗体编码载体的合适克隆或表达宿主，包括其糖基化通路已经“人源化”的真菌和酵母菌株，导致具有部分或完全人糖基化模式的抗体的产生。参见，Gerngross，Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)；Li等，Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
用于糖基化抗体表达的合适宿主细胞也源自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株可以用于与昆虫细胞联合，特别是用于草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞的转染。
植物细胞培养物可以用作宿主。参见，例如，美国专利No.5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(如例如Graham等，J.Gen Virol.36:59(1997)中所述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利细胞(如，例如，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如例如，Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述的；MRC 5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。对于适用于抗体生产的特定哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，Vol.248(B.K.C.Lo编辑，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。
III.诊断方法
本发明的一个方面提供了一种选择用于癌症患者的治疗的方法，其包括测定来自患者的癌症样品中的神经调节蛋白1(NRG1)表达，并且如果癌症超表达NRG1，选择HER3抑制剂用于治疗。
本发明的另一个方面提供了一种选择用于癌症患者的治疗的方法，其包括测定来自患者的癌症样品中的神经调节蛋白1(NRG1)表达，并且如果样品超表达NRG1，选择双特异性HER3/EGFR抑制剂作为治疗。
在一个实施方案中，患者的癌症以高于该癌症类型中的NRG1表达的中值水平的水平表达NRG1。在一个实施方案中，在60个百分比或更高、第70百分位或更高、75个百分比或更高、80个百分比或更高、第85百分位或更高、第90百分位或更高、第95百分位或更高，或更高(第97百分位或更高)等，则认为NRG1表达水平是高NRG1水平。可以与测量NRG1表达基本上同时测定中值或百分位表达水平，或可以在之前测定。
在特定的癌症类型中，NRG1表达在患有该癌症类型的患者群中是双峰的。双峰表达谱由一组呈现出高水平的NRG1表达的患者-超表达模式和一组呈现出较低NRG1表达水平的患者-缺乏超表达模式组成。在一个实施方案中，将两个模式之间的拐点用作将癌症类型表征为超表达NRG1的癌症或缺乏NRG1超表达的癌症的值。将具有高于拐点的NRG1表达水平的癌症表征为超表达NRG1的癌症类型。将具有低于拐点的NRG1表达水平的癌症表征为缺乏NRG1超表达的癌症类型。
实施例4提供了用于测定患者群中NRG1表达分布的试验。在一个实施方案中，将二元高斯分布用于估算NRG1的超表达和缺乏NRG1的超表达之间的拐点。
本文中所示的呈现出双峰NRG1表达谱的癌症的一个实例是头颈鳞状上皮细胞癌(HNSCC)。如实施例4中所讨论的，HNSCC癌症群呈现出具有NRG1超表达的癌症和缺乏NRG1超表达的癌症的高斯双峰分布谱。分布分析提供的拐点在对数标度上大约为0.3689，对应于线性标度上的大约1.50。
在一个实施方案中，超表达NRG1的癌症还呈现出神经调节蛋白诱导的自分泌信号传输。可以通过癌细胞中NRG1和HER3共表达的存在来鉴定呈现出神经调节蛋白诱导的自分泌信号传输的癌症。例如，可以通过RNA原位杂交程序来测量NRG1和HER3的共表达。
本文中还提供了定量癌症样品中的NRG1表达水平的方法，其包括测定样品中的NRG1的表达水平，并且相对于样品中的一个或多个参照基因的表达水平，将样品中的NRG1的表达水平进行量化。合适的参照基因包括AL-137727、VPS33B、GAPDH、SDHA、SP2、GUSB等。在一个实施方案中，量化癌症样品中的NRG1表达水平的方法包括测定样品中的NRG1表达水平，并且相对于样品中的AL-137727(SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11)和VPS33B(SEQ ID NO:12)中的一种或两种的表达水平，将样品中的NRG1的表达水平进行量化。在一个实施方案中，相对于AL-137727的表达水平，将样品中的NRG1的表达水平进行量化。在一个实施方案中，相对于VPS33B的表达水平，来量化样品中的NRG1的表达水平。在一个实施方案中，相对于样品中的AL-137727和VPS33B的表达水平，将样品中的NRG1的表达水平进行量化。在一个实施方案中，使用AL-137727和VPS33B的平均表达水平，使用δCt方法来计算NRG1表达水平。对于选择用于患者的治疗或用于预测患者对治疗的应答的目的，这种量化NRG1表达的方法提供了用于比较NRG1表达的可靠标准。
在以下所述的治疗方法之前，评价了患者癌症中的NRG1表达水平。通常，从需要治疗的患者中获得生物样品，将该样品接受一种或多种诊断试验，通常至少一种体外诊断(IVD)试验。然而，本文中特意考虑了评价NRG1表达的其他形式，如体内诊断。
例如，生物样品是肿瘤样品、血液样品、痰液样品、尿样，或从患者取回的其他组织或体液。在一些实施方案中，生物样品是固定样品，例如，福尔马林固定的、石蜡包埋的(FFPE)样品，或冷冻样品。在特定的实施方案中，在原位测定NRG1的表达水平。
用于测定mRNA或蛋白质的表达各种方法包括，但不限于，基因表达谱测定、聚合酶链式反应(PCR)(包括定量实时PCR(qRT-PCR))、微阵列分析、基因表达的连续分析(SAGE)、MassARRAY、通过大规模平行签名测序(MPSS)的基因表达分析、蛋白质组学、免疫组织化学(IHC)、直接的RNA测序、质谱、ELISA等。优选对mRNA进行量化。优选使用聚合酶链式反应(PCR)的技术，或通过微阵列分析，来进行这样的mRNA分析。使用PCR时，优选的PCR形式是定量实时PCR(qRT-PCR)。优选的qRT-PCR试验如以下实施例1中所述。
各种公开的期刊论文(例如：Godfrey等，J.Molec.Diagnostics 2:84-91(2000)；Specht等，Am.J.Pathol.158:419-29(2001))中给出了对于使用固定的、石蜡包埋的作为RNA来源的组织的基因谱测定的代表性试验方案的步骤，包括mRNA分离、纯化、引物延伸和扩增。简而言之，代表性的方法从切割约10微米厚的石蜡包埋肿瘤组织样品的切片开始。然后提取RNA，并且除去蛋白质和DNA。分析RNA浓度后，如果需要，包括RNA修复和/或扩增步骤，并且使用基因特异性启动子逆转录RNA，然后进行PCR。最后，分析数据，以基于在所检查的肿瘤样品中鉴定的特征性基因表达谱来鉴定适用于患者的治疗选择。
现在将更详细地描述用于测定基因表达的各种示例性方法。
(i)基因表达谱
通常，基因表达谱测定的方法可以分成两大组：基于多核苷酸杂交分析的方法和基于多核苷酸测序的方法。最常用的本领域已知的用于样品中mRNA表达量化的方法包括northern印迹和原位杂交(Parker&Barnes，Methods in Molecular Biology 106:247-283(1999))；RNAse保护试验(Hod，Biotechniques 13:852-854(1992))；和聚合酶链式反应(PCR)(Weis等，Trends inGenetics 8:263-264(1992))。或者，可以使用识别特定双链体的抗体，所述双链体包括DNA双链体、RNA双链体和DNA-RNA杂合双链体或DNA-蛋白质双链体。用于基于测序的基因表达分析的代表性方法包括基因表达的连续分析(SAGE)，和通过大规模平行签名测序(MPSS)的基因表达分析以及直接的RNA测序。
(ii)聚合酶链式反应(PCR)
在上述的技术列表中，灵敏且灵活的定量方法是PCR，其可以用于比较不同样品群中的、正常组织和肿瘤组织中的、使用或未用药物治疗的mRNA水平，可以用于表征基因表达的模式，用于区别密切相关的mRNA和用于分析RNA结构。
第一个步骤是从目标样品中分离mRNA。起始材料通常是分别从人肿瘤或肿瘤细胞系，以及相应的正常组织或细胞系分离的总RNA。因此，可以从各种原发性肿瘤分离RNA，包括乳房、肺、结肠、前列腺、脑、肝、肾、胰腺、脾、胸腺、睾丸、卵巢、子宫等肿瘤或肿瘤细胞系，使用来自健康供体的集合DNA。如果mRNA的来源是原发性肿瘤，可以从例如冷冻或存放的石蜡包埋的和固定的(例如，福尔马林固定的)组织样品提取mRNA。用于mRNA提取的一般方法是本领域公知的，并且公开了分子生物学的标准教科书中，包括Ausubel等，Current Protocols of Molecular Biology，John Wiley和Sons(1997)。用于从石蜡包埋的组织提取RNA的方法公开于，例如，Rupp和Locker，Lab Invest.56:A67(1987)；和De Andrés等，BioTechniques18:42044(1995)。特别地，可以使用来自商业制造商(如，Qiagen)的纯化试剂盒、缓冲液组和蛋白酶，根据制造商的说明，来进行RNA提取。例如，可使用Qiagen在培养的细胞中的总RNA。其他商业上可购得的RNA分离试剂盒包括Complete DNA and RNA Purification Kit(Madison，Wis.)，和Paraffin Block RNA Isolation Kit(Ambion，Inc.)。可以使用RNA Stat-60(Tel-Test)，从组织样品中分离总RNA。例如，可以通过氯化铯密度梯度离心，分离从肿瘤制备的RNA。
因为RNA不能用作PCR的模板，通过PCR的基因表达谱测定的第一步是RNA模板逆转录至cDNA，接着在PCR反应中指数扩增。两种最常用的逆转录酶是禽成髓细胞病毒逆转录酶(AMV-RT)和莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)。通常根据环境和表达谱测定的目标，使用特定引物、随机六聚物或寡-dT引物来启动逆转录步骤。例如，提取的RNA可以是使用GENEAMPTMRNA PCR试剂盒(Perkin Elmer，Calif.，USA)，按照制造商的说明逆转录的。然后可以将衍生的cDNA用作随后的PCR反应中的模板。尽管PCR步骤可以使用各种热稳定的DNA-依赖性DNA聚合酶，但通常使用Taq DNA聚合酶，其具有5’-3’核酸酶活性，但缺乏3’-5’校对核酸内切酶活性。因此，PCR通常利用Taq或Tth聚合酶的5’-核酸酶活性来杂交结合至靶标扩增子的杂交探针，但也可以使用任何具有等价5’核酸酶活性的酶。使用两条寡核苷酸引物来产生PCR反应典型的扩增子。设计第三个寡核苷酸，或探针，来检测位于两条PCR引物之间的核苷酸序列。TaqDNA聚合酶不可延伸探针，并且所述探针用报告荧光染料和淬灭荧光染料标记。当两种染料在探针上非常接近时，淬灭染料将来自报告染料的激光诱导的发射淬灭。在扩增反应过程中，Taq DNA聚合酶以模板依赖性方式分裂探针。所得到的探针片段在溶液中分离，并且来自释放的报告染料的信号不受第二个荧光团的淬灭作用的影响。对于每个新合成的分子，释放一个报告染料的分子，并且未淬灭的报告染料的检测提供了用于定量解释数据的基础。
PCR可以使用商业购得的设备来进行，如，例如，ABIPRISMSequence Detection(Perkin-Elmer-AppliedBiosystems，Foster City，Calif.，USA)，或Lightcycler(Roche MolecularBiochemicals，Mannheim，Germany)。在优选的实施方案中，将5’核酸酶程序在实时定量PCR设备上运行，如ABI PRISMSequence DetectionSystem。该系统由热循环仪、激光、电荷耦合装置(CCD)、相机和计算机组成。该系统在热循环仪上的96-孔格式中扩增样品。在扩增过程中，通过用于全部96个孔的光导纤维电缆实时收集激光诱导的荧光信号，并且在CCD检测。该系统包括用于运行仪器和用于分析数据的软件。
5’-核酸酶试验数据最初表示为Ct，或阈值循环。如以上所讨论的，在每个循环过程中记录荧光值，并且表示扩增至扩增反应中的点的产物含量。首次将荧光信号记录为统计学显著的点是阈值循环(Ct)。
为了最小化样品与样品变化的误差和影响，通常使用内标来进行PCR。理想的内标在不同组织中以恒定水平表达，并且不受实验处理的影响。最常用于标准化基因表达模式的RNA是用于管家基因甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(GAPDH)和P-肌动蛋白的mRNA。
PCR技术的更新的变化是定量实时PCR(qRT-PCR)，其通过双重标记的荧光生成探针(即，探针)测量PCR产物累积。实时PCR与定量竞争性PCR相适，其中将针对每种靶标序列的内部竞争剂用于标准化，并且使用定量比较性PCR，使用样品所含的标准化基因或管家基因，用于PCR。对于更多详细内容，参见，例如，Held等，Genome Research 6:986-994(1996)。
各种出版的期刊论文(例如，Godfrey等，J.Molec.Diagnostics 2:84-91(2000)；Specht等，Am.J.Pathol.158:419-29(2001))中给出了对于使用固定的、石蜡包埋的组织作为RNA来源的基因表达谱测定的代表性实验方案的步骤，包括mRNA分离、纯化、引物延伸和扩增。简而言之，代表性的方法从切割约10微米厚的石蜡包埋肿瘤组织样品的切片开始。然后提取RNA，并且除去蛋白质和DNA。分析RNA浓度后，如果需要，包括RNA修复和/或扩增步骤，并且使用基因特异性启动子逆转录RNA，然后进行PCR。
根据本发明的一个方面，基于待扩增基因中存在的内含子序列设计PCR引物和探针。在这个实施方案中，引物/探针设计中的第一个步骤是标出基因内的内含子序列的范围。这可以通过公众可获得的软件，如Kent，W.，GenomeRes.12(4):656-64研发的DNA BLAT软件，或通过BLAST软件，包括其变化，来进行。随后的步骤按照非常确定的PCR引物或探针设计来进行。
设计引物和探针时，为了避免非特异性信号，重要的是遮掩内含子内的重复序列。这可以使用通过Baylor College of Medicine在线可获得的RepeatMasker程序容易地完成，该程序相对重复原件文库筛选DNA序列并且返回其中重复原件被遮掩的询问序列。然后可以将遮掩的内含子序列用于设计引物和探针序列，使用任何商业上或另外公众可获得的引物/探针设计包，如Primer Express(Applied Biosystems)；MGB assay-by-design(AppliedBiosystems)；Primer3(针对一般用户和生物学家编程者的WWW上的Rozenand Skaletsky(2000)Primer3。见：Krawetz S,Misener S(编辑)BioinformaticsMethods and Protocols:Methods in Molecular Biology(生物信息学方法和实验：分子生物学方法)，Humana Press，Totowa，N.J.，pp 365-386)。
PCR引物设计中考虑的因素包括引物长度、熔化温度(Tm)和G/C含量、特异性、补体引物序列和3’端序列。通常，最佳PCR引物通常是17-30个碱基长，并且含有约20-80％，如，例如，约50-60％G+C碱基。通常优选50至80℃，例如，约50至70℃的Tm。
对于PCR引物和探针设计的更多指导，参见，例如，Dieffenbach等，PCR Primer，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork，1995，第133-155页中的“General Concepts for PCR Primer Design；Innis和Gelfand，PCR Protocols,A Guide to Methods and Applications，CRCPress,London，1994，第5-11页中的“Optimization of PCRs”；和Plasterer,T.N.Primerselect:Primer and probe design.Methods Mol.Biol.70:520-527(1997)，将其完整内容专门按引用并入本文中。
优选的条件、引物、探针和内部参照(G6PDH)如以下实施例1中所述。
(iii)微阵列
还可以使用微阵列技术鉴定或证实不同的基因表达。因此，可以使用微阵列技术，测量新鲜或石蜡包埋的肿瘤中的乳房癌相关基因的表达谱。在这种方法中，将目标多核苷酸序列(包括cDNA和寡核苷酸)涂布或排列在微芯片基质上。然后将排列的序列与来自目标细胞或组织的特异性DNA探针杂交。就与PCR方法一样，mRNA的来源通常是从人肿瘤或肿瘤细胞系以及相应的正常组织或细胞系分离的总RNA。因此，可以从各种原发性肿瘤或肿瘤细胞系分离RNA。如果mRNA的来源是原发性肿瘤，例如，可以从冷冻或保存的石蜡包埋和固定的(例如，福尔马林固定的)组织样品中提取mRNA，该组织样品可在日常临床实践中进行常规制备并保存。
在微阵列技术的特定实施方案中，将cDNA克隆的PCR扩增片段施加于密集阵列的基质中。优选，将至少10,000个核苷酸序列施加于基质。以每个10,000个固定于微芯片上的微阵列化基因适用于在严格条件下杂交。可以通过逆转录从目标组织提取的RNA，结合荧光核苷酸，产生荧光标记的cDNA探针。施用于芯片的标记的cDNA探针特异性地与阵列上的每个DNA点杂交。严格洗涤除去非特异性结合的探针后，通过共焦激光显微镜或通过另一个检测方法，如CCD相机，来扫描芯片。每个排列元件的杂交的量化允许评价相应的mRNA丰度。使用双色荧光，从两个RNA来源产生的分开标记的cDNA探针与阵列成对杂交。因此同时测定了对应于每个指定基因的两个来源的转录产物的相对丰度。杂交的小型化规模获得了针对大量基因的方便且快速的表达模式评价。这样的方法已经显示出具有检测罕见转录产物(其以几个拷贝/细胞来表达)和重复检测表达水平中至少大约两倍差异所需的灵敏度(Schena等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(2):106-149(1996))。可以通过商业购得的设备，按照制造商的实验方案，如通过使用AffymetrixGENCHIPTM技术，或Incyte’s微阵列技术，来进行微阵列分析。
用于大规模基因表达分析的微阵列方法的研发使得可以系统地研究癌症分类的分子标记物和各种肿瘤类型中的成果预测。
(iv)基因表达的连续分析(SAGE)
基因表达的连续分析(SAGE)是允许同时和定量分析大量转录产物，而不需要提供用于每个转录产物的单独杂交探针。首先，产生短的序列标签(约10-14bp)，其含有足够的信息来唯一地鉴定转录产物，只要从每个转录产物内的独特位置获得标签。然后，将许多转录产物连接在一起，形成长的连续分子，将其测序，同时揭示了多个标签的性质。可以通过测定单独标签的丰度，并且鉴定对应于每个标签的基因，来定量地评价任一个转录产物群的表达模式。对于更多详细内容，参见，例如，Velculescu等，Science270:484-487(1995)；和Velculescu等，Cell 88:243-51(1997)。
(v)MassARRAY技术
MassARRAY(Sequenom，San Diego，Calif.)技术是自动化的、高通量的基因表达分析方法，其使用质谱(MS)来检测。根据这种方法，分离RNA、逆转录和PCR扩增后，将cDNA接受引物延伸。将cDNA衍生的引物延伸产物纯化，并且分配在预先加载了MALTI-TOF MS样品制备需要的成分的芯片阵列上。通过分析所获得的质谱中的峰面积，来定量反应中存在的各种cDNA。
(vi)通过大规模平行签名测序(MPSS)的基因表达分析
Brenner等，Nature Biotechnology 18:630-634(2000)描述的这种方法是一种结合了非基于凝胶的签名测序与分开的5微克直径微珠上上百万模板的体外克隆的测序方法。首先，通过体外克隆构建了DNA模板的微珠文库。接着以高密度(通常高于3×106微珠/cm2)在流槽中装配含有模板的微珠的平面阵列。使用不需要DNA片段分离的基于荧光的签名测序方法，同时分析每个微珠上的克隆模板的游离端。该方法已经显示出能同时和准确地在单个操作中从酵母cDNA文库提供数十万的基因签名序列。
(vii)免疫组织化学
免疫组织化学方法也适用于检测本发明的预后标志物的表达水平。因此，将每个标志物特异性的抗体或抗血清，优选多克隆抗血清，并且最优选单克隆抗体，用于检测表达。可以通过抗体自身的直接标记来检测抗体，例如，使用放射性标记、荧光标记、肝素标记(如，半抗原)或酶(如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)。或者，将未标记的一抗结合标记的二抗来使用，包括一抗特异性的抗血清、多克隆抗血清或单克隆抗体。免疫组织化学实验方案和试剂盒是本领域公知的，并且是商业上可购得的。
(viii)蛋白质组学
术语“蛋白质组”定义为在特定的时间点，样品(例如，组织、生物体或细胞培养物)中存在的蛋白质的总数。其中，蛋白质组学包括样品中蛋白质表达的整体变化(也称为“表达蛋白质组学”)。蛋白质组学通常包括以下步骤：(1)通过2-D凝胶电泳(2-D PAGE)分离样品中的单独蛋白质；(2)鉴定从凝胶收集的单独蛋白质，例如，通过质谱或N-端测序；和(3)使用生物信息学分析数据。蛋白质组学方法是其他基因表达谱测定方法的有价值的补充，并且可以单独使用或结合其他方法一起使用，用于检测本发明的预后标志物的产物。
(ix)直接的RNA测序
直接的RNA测序(DSR)允许直接的RNA分子的大规模平行测序，而不需要之前的cDNA合成，也无需连接/扩增步骤。Ozsolak等，Nature461:814-818(2009)；Ozsolak F和Milos PM.，WIREs RNA，2:565-570(2011)，Ozsolak F和Milos PM.，Experimental Medicine 28:2574-2580。这一技术允许量化和表征RNA样品，包括那些福尔马林固定的和石蜡包埋的。
通常，将分离的总RNA或细胞裂解物加至tpoly(dT)-覆盖的流槽中，其能够捕获polyA RNA物质并测序。将polyA聚合酶用于产生polyA尾巴，然后将样品加载至流槽，用于不含天然polyA尾巴的RNA物质的测序。
(x)RNA原位杂交
RNA原位杂交(RISH)是用于检查组织样品中的mRNA表达的技术。Veeck J和Dahl E.，Methods Mol Biol.，664:135-50(2010)；Nuovo GJ.，Methods，44:39-46(2008)；Yamada H.，Cytometry A.，77:1032-72010。
通常，用可检测标记，如放射性标记物、酶探针、化学染料或荧光化合物，来标记目标RNA特异性的探针。在允许探针与细胞中的互补RNA序列杂交的条件下，将目标组织样品接触单链的标记探针的溶液。除去任何未杂交的探针，并且通过合适的方法检测杂交的探针。
(xi)mRNA分离、纯化和扩增的一般描述
各种公开的期刊论文(例如：Godfrey等，J.Molec.Diagnostics 2:84-91(2000)；Specht等，Am.J.Pathol.158:419-29(2001))中给出了对于使用固定的、石蜡包埋的组织作为RNA来源的基因谱测定的代表性试验方案的步骤，包括mRNA分离、纯化、引物延伸和扩增。简而言之，代表性的方法从切割约10微克的厚的石蜡包埋肿瘤组织样品的切片开始。然后提取RNA，并且除去蛋白质和DNA。分析RNA浓度后，如果需要，包括RNA修复和/或扩增步骤，并且使用基因特异性启动子逆转录RNA，然后进行PCR。最后，分析数据，以基于检查的肿瘤样品中鉴定的特征性基因表达谱来鉴定适用于患者的治疗选择。
还可以使用体内诊断试验来评价NRG1表达，例如，通过给予结合待检测分子并且用可检测标记(例如，反射性同位素)标记的分子(如，抗体)，并且针对标记的定位，在外部扫描患者。
IV.药物制剂
为了存储，通过将具有所需纯度的抗体与任选的药物学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，制得本发明使用的HER3抑制剂(如，双特异性HER3/EGFR抑制剂)的治疗制剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences 16thedition,Osol,A.编辑(1980))，通常是冻干制剂或水溶液形式的。也可以考虑抗体晶体(参见美国专利申请2002/0136719)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如，十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和m-甲酚)；低分子量(低于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。冻干抗体制剂描述于WO97/04801，在此特意按引用并入本文中。
按照待治疗的特定适应症的需求，本文中的制剂还可以含有超过一种的活性化合物，优选是具有彼此没有不利影响的互补活性的那些。可以结合HER3抑制剂的各种药物描述于以下的治疗部分中。这样的分子以对计划的目的有效的含量存在于组合中。
活性成分还可以包裹在微胶囊中，所述微胶囊例如通过凝聚技术或通过界面聚合来制得，例如，分别在胶状药物传送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗滴乳状液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。这样的技术公开于Remington’sPharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编辑(1980)。
可以制得持续释放制备物。持续释放制备物的合适实例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半渗透基质，该基质是成形物质形式的，例如，膜，或微胶囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-丙烯酸甲酯)，或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
用于体内给药的制剂必须是无菌的。这可以通过无菌过滤膜的过滤容易地完成。
因此，提供了一种用于制造HER3抑制剂(如，双特异性HER3/EGFR抑制剂)(如，MEHD7945A)或其药物组合物的方法，该方法包括在包装中将抑制剂或药物组合物与标签组合，所述标签记载了抑制剂或药物组合物适用于治疗患有能够应答该抑制剂的癌症类型的患者(例如，HNSCC)，其中患者的癌症以高于该癌症类型中的NRG1表达的中值水平的水平表达NRG1。
此外，提供了用于制造化疗剂或其药物组合物的方法，其中该方法包括在包装中将化疗剂或药物组合物与标签组合，所述标签记载了化疗剂或药物组合物适用于治疗患有特定癌症类型的患者，其中患者的癌症以高于该癌症类型中的NRG1表达的中值水平的水平表达NRG1。
V.使用HER3抑制剂的治疗
本发明在本文中提供了治疗癌症患者的方法，其包括将治疗有效量的HER3抑制剂，如双特异性HER3/EGFR抑制剂，给药至患者，其中患者在给药HER3抑制剂之前诊断为患有超表达NRG1的癌症类型。
在一个实施方案中，NRG1的超表达的诊断是基于患者的癌症以高于该癌症类型中的NRG1表达的中值水平的水平表达NRG1的确定。在特定的实施方案中，患者的癌症以或高于该癌症类型中的NRG1表达的第60、第65、第70、第75、第80、第85、第90、第95、第97百分位的水平表达NRG1。
在特定的癌症类型中，NRG1表达在患有该癌症类型的患者群中是双峰的。双峰表达谱由一组呈现出高水平的NRG1表达的患者-超表达模式-和一组呈现出较低NRG1表达水平的患者-缺乏超表达模式组成。在一个实施方案中，将两个模式之间的拐点用作将癌症类型表征为超表达NRG1的癌症或缺乏NRG1超表达的癌症的值。将具有高于拐点的NRG1表达水平的癌症表征为超表达NRG1的癌症类型。将具有低于拐点的NRG1表达水平的癌症表征为缺乏NRG1超表达的癌症类型。因此，在一个实施方案中，NRG1的超表达诊断是基于患者的癌症落入双峰NRG1表达谱的超表达模式中的患者癌症的确定。
实施例4提供了用于确定患者群中的NRG1表达分布的试验。在一个实施方案中，将二元高斯分布用于估算NRG1的超表达和缺乏NRG1的超表达之间的拐点。
在一个实施方案中，待治疗的癌症呈现出双峰NRG1表达谱。这样的癌症的一个实例是头颈鳞状上皮细胞癌(HNSCC)。如实施例4中所讨论的，HNSCC癌症群呈现出具有NRG1超表达的癌症和缺乏NRG1超表达的癌症的高斯双峰分布谱。由分布分析提供的拐点在对数标度上大约为0.3689，对应于线性标度上的大约1.50。
在一个实施方案中，待治疗的癌症呈现出神经调节蛋白诱导的自分泌信号传输。可以通过癌细胞中NRG1和HER3共表达的存在来鉴定这样的癌症。例如，可以通过RNA原位杂交程序来测量NRG1和HER3的共表达。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于治疗癌症患者的方法，其包括将治疗有效量的MEHD7945A给药至患者，其中患者在给药MEHD7945A之前诊断为患有超表达NRG1的癌症类型。在一个实施方案中，癌症呈现出神经调节蛋白诱导的自分泌信号传输。在一个实施方案中，癌症呈现出双峰NRG1表达谱。
在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗鳞状上皮细胞癌患者的方法，其包括将治疗有效量的MEHD7945A给药至患者，其中患者在给药MEHD7945A之前诊断为患有超表达NRG1的癌症类型。在一个实施方案中，鳞状上皮细胞癌呈现出出神经调节蛋白诱导的自分泌信号传输。在一个实施方案中，鳞状上皮细胞癌呈现出双峰NRG1表达谱。
在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗HNSCC患者的方法，其包括将治疗有效量的MEHD7945A给药至患者，其中患者在给药MEHD7945A之前诊断为患有超表达NRG1的HNSCC类型。
使用HER3抑制剂，如双特异性HER3/EGFR抑制剂的治疗，优选延长了存活，包括无进展存活(PFS)和/或总体存活(OS)。在一个实施方案中，使用HER3抑制剂，如双特异性HER3/EGFR抑制剂的治疗，比通过给药用于待治疗癌症的批准的抗肿瘤剂或标准护理获得的存活延长至少约20％。
患者可以具有晚期、难治的、复发的、化疗抗性的，和/或EGFR抑制剂抗性的癌症。将HER3抑制剂MEHD7945的给药至患者，可以，例如，比通过将EGFR抑制剂治疗给予这样的患者获得的存活延长至少约20％。
根据已知方法，如静脉内给药，例如，作为大丸药或通过一段时间内连续灌注，通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑液内、鞘内、口服、局部或吸入途径，将HER3抑制剂，如双特异性HER3/EGFR抑制剂给药至人患者。优选抗体的静脉内给药。
对于癌症的预防或治疗，HER3抑制剂，如双特异性HER3/EGFR抑制剂的剂量，将取决于如以上所限定的待治疗的癌症类型、癌症的严重程度和过程、给予抗体是用于预防目的或是治疗目的、之前的治疗、患者的临床史和对药物的应答，以及主治医生的判断力。
在一个实施方案中，给药固定剂量的抑制剂。可以将固定剂量一次性地或在连续治疗中合适地给药至患者。在给药固定剂量的情况中，优选在约20mg至约2000mg抑制剂的范围中。例如，固定剂量大约为420mg、大约525mg、大约840mg或大约1050mg的抑制剂。
在给药连续剂量的情况中，可以例如大约每周、大约每2周、大约每3周或大约每4周给药，但优选大约每3周。固定剂量可以例如继续给药，直至疾病进展、不利事件或医生决定的其他时间。例如，以给药约两个、三个或四个，至多达约17个或更多个固定剂量。
在一个实施方案中，可以给药一个或多个抗体的负荷剂量，接着给药一个或多个抗体的维持剂量。在另一个实施方案中，将多个相同的剂量给药至患者。
尽管HER3抑制剂，如双特异性HER3/EGFR抑制剂，可以作为单个抗肿瘤剂来给药，但患者任选可以使用抑制剂(或化疗剂)与一种或多种(另外的)化疗剂的组合来治疗。本文中的示例性化疗剂包括：伊立替康、吉西他滨、卡铂、紫杉醇、多西他赛、拓扑替康和/或脂质体阿霉素。联合给药包括共同给药或同时给药，使用分开的制剂或单个药物制剂，以及任何顺序的连续给药，其中优选存在两种(或全部)活性剂同时发挥其生物活性的时间段。因此，可以在抑制剂的给药之前或之后给药抗代谢物化疗剂。在这个实施方案中，抗代谢物化疗剂的至少一次给药和抑制剂的至少一次给药之间的时间优选大约为1个月或更短，并且最优选大约2周或更短。或者，将抗代谢物化疗剂和抑制剂在单一制剂或分开制剂中同时给药至患者。使用化疗剂和抑制剂组合的治疗可以给患者带来协同或高于叠加的治疗益处。
如果给药，抗代谢物化疗剂通常以已知的剂量来给药，或由于药物的组合作用或给药抗代谢物化疗剂引起的不利副作用，任选以降低的剂量来给药。可以根据制造商的说明或按照熟练的医生根据经验决定的，来使用这样的化疗剂的制备物和给药时间表。在抗代谢物化疗剂是吉西他滨的情况中，优选，以约600mg/m2至1250mg/m2(例如，大约1000mg/m2)的剂量来给药，例如，在3周循环的第1天和第8天给药。
除了抑制剂和抗代谢物化疗剂，其他治疗方案也可以与其组合。例如，可以给药第二种(第三种、第四种等等)化疗剂，其中第二种化疗剂是另一种不同的抗代谢物化疗剂，或不是抗代谢物的化疗剂。例如，第二种化疗剂可以是紫杉烷(如，紫杉醇或多西他赛)、卡培他滨，或基于铂的化疗剂(如，卡铂、顺铂或奥沙利铂)、蒽环类(如，阿霉素，包括，脂质体阿霉素)、拓扑替康、培美曲塞、长春花生物碱类(如，长春瑞滨)和TLK286。可以给药不同化疗剂的“混合物”。
可以与抑制剂和/或化疗剂组合的其他治疗剂包括以下的任一种或多种：第二种不同的HER抑制剂、HER二聚化抑制剂(例如，生长抑制HER2抗体，如曲妥珠单抗，或诱导HER2-超表达细胞凋亡的HER2抗体，如7C2、7F3或其人源化变体)；针对不同肿瘤相关抗原(如，EGFR、HER3、HER4)的抗体；抗激素化合物，例如，抗雌激素化合物，如他莫昔芬，或芳香酶抑制剂；保心药(用于预防或降低任何与治疗相关的心肌功能障碍)；细胞因子；EGFR靶向药物(如，或西妥昔单抗)；抗血管生成剂(尤其是由Genentech依据商标AVASTINTM销售的贝伐单抗)；酪氨酸激酶抑制剂；COX抑制剂(例如，COX-1或COX-2抑制剂)；非甾族抗炎药，塞来昔布法呢基转移酶抑制剂(例如，可从Johnson and Johnson获得的替吡法尼/R115777或可从Schering-Plough获得的Lonafarnib SCH66336)；结合癌胚蛋白CA125的抗体，如奥戈伏单抗(MoAbB43.13)；HER2疫苗(如，来自Pharmexia的HER2AutoVac疫苗，或来自Dendreon的APC8024蛋白疫苗，或来自GSK/Corixa的HER2肽疫苗)；另一种HER靶向治疗(例如，曲妥珠单抗、西妥昔单抗、ABX-EGF、EMD7200、吉非替尼、厄洛替尼、CP724714、CI1033、GW572016、IMC-11F8、TAK165等)；Raf和/或ras抑制剂(参见，例如，WO 2003/86467)；阿霉素HCl脂质体注射液拓扑异构酶I抑制剂，如拓扑替康；紫杉烷；HER2和EGFR双重酪氨酸激酶抑制剂，如拉帕替尼/GW572016；TLK286EMD-7200；治疗恶心的药物，如血清素拮抗剂、类固醇、苯二氮；预防或治疗皮疹的药物或标准痤疮治疗，包括局部或口服抗生素；治疗或预防腹泻的药物；体温降低药物，如醋氨酚、苯海拉明或哌替啶；造血生长因子等。
以上任一种共同给药的药剂的合适剂量是目前使用的那些并且可以由于药剂和抑制剂的组合作用(协同作用)，可以降低剂量。
除了以上的治疗方案，患者可以接受切除癌细胞的外科手术和/或放疗。
在抑制剂是抗体的情况中，优选，给药的抗体是裸抗体。然而，给药的抑制剂可以结合细胞毒性剂。优选，结合的抑制剂和/或与其结合的抗原被细胞内在化，在杀灭其结合的癌细胞中，导致偶联物提高的治疗功效。在优选的实施方案中，细胞毒性剂靶向或干扰癌细胞中的核酸。这样的细胞毒性剂的实例包括maytansinoid、卡奇霉素、核糖核酸酶和DNA核酸内切酶。
本申请考虑了通过基因治疗给药抑制剂。参见，例如，1996年3月14日公开的WO 96/07321，其涉及使用基因治疗来产生胞内抗体。
存在两种主要的方法来使核酸(任选包含在载体中)进入患者的细胞中；体内和体外。对于体内传送，将核酸直接注入患者中，通常在需要抗体的部位。对于体外治疗，取出患者的细胞，将核酸引入这些分离的细胞中，并且将修饰的细胞直接或例如包裹在多孔膜内给药至患者，将所述多孔膜植入患者中(参见，例如，美国专利No.4,892,538和5,283,187)。存在各种技术，可用于将核酸引入活的细胞中。这些技术根据核酸是在体外转入培养的细胞中，或在体内转入计划宿主的细胞中而改变。适用于在体外将核酸转入哺乳动物细胞中的技术包括使用脂质体、电穿孔、微注射、细胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸钙沉淀方法等。用于基因的体外传送的常用载体是逆转录病毒。
目前优选的体内核酸转移技术包括使用病毒载体(如，腺病毒、单纯疱疹病毒I或腺相关病毒)和基于脂质系统(例如，用于脂质介导的基因转移的有用脂质是DOTMA、DOPE和DC-Chol)的转染。在一些情况中，理想的是提供核酸来源以及靶向靶细胞的试剂，如细胞表面膜蛋白或靶细胞特异性的抗体、靶向上的受体的配体等。在使用脂质体的情况中，结合与内吞作用相关的细胞表面膜蛋白的蛋白质可以用于靶向和/或促进吸收，例如，向着特定细胞类型的衣壳蛋白或其片段、针对在循环中经历内在化的蛋白的抗体和靶向胞内位置并增强胞内半衰期的蛋白。受体介导的内吞作用的技术，例如，描述于Wu等，J.Biol.Chem.262:4429-4432(1987)；和Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:3410-3414(1990)。对于目前已知的基因标记和基因治疗实验方案的综述参见Anderson等，Science 256:808-813(1992)。还可以参见WO93/25683以及其中引用的参考文献。
VI.制造的商品
在本发明的另一个实施方案中，提供了含有用于治疗上述疾病或病症的材料的制造商品。制造的商品包含容器以及在容器上或与容器相连的标签或包装说明书。合适的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器等。容器可以从各种材料(如，玻璃或塑料)形成。容器容纳或含有治疗选择的疾病或病症有效的组合物并且可以具有无菌存取口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有通过皮下注射针可穿刺的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是HER3抑制剂，如双特异性HER3/EGFR抑制剂，如MEHD7945A。
制造的商品可以进一步包含第二个容器，该容器包含药物学上可接受的稀释缓冲剂，如抑菌的注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、Ringer’s溶液和葡萄糖溶液。制造的商品可以进一步包括在商业和使用者立场上所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、填充剂、针和注射器。
本发明的药盒和制造的商品还包括信息，例如，以包装说明书或标签的形式，表明该组合物根据药物以限定的水平用于治疗其中患者的癌症表达NRG1的癌症。说明书或标签可以采用任何形式，如纸或在电子介质上，如磁记录介质(例如，软盘)或CD-ROM。标签或说明书还可以包括关于药盒或制造商品中的药物组合物和剂型的其他信息。
通常，这样的信息帮助患者和医生有效且安全地使用内封的药物组合物和剂型。例如，说明书中可以提供以下关于HER3抑制剂的信息：药物动力学、药效学、临床研究、功效参数、适应症和使用、禁忌症、警告、预警、不利反应、过量、适当的剂量和给药、怎样补给、正确的存储条件、参考文献和专利信息。
在本发明的特定实施方案中，提供了制造的商品，其包含包装在一起的在药物上可接受的载体中包含HER3抑制剂(如，双特异性HER3/EGFR抑制剂)的药物组合物和标签，所述标签记载了抑制剂或药物组合物适用于治疗具有能够应答HER3抑制剂(如，双特异性HER3/EGFR抑制剂)的癌症类型的患者，其中患者的癌症以高于该癌症类型中的NRG1表达的中值水平的水平表达NRG1。
在本发明方面的任选实施方案中，本文中的制造商品进一步包含含有第二种药物的容器，其中HER3抑制剂是第一种药物，并且该商品进一步在包装说明书上包含用有效量的第二种药物治疗患者的说明。第二种药物可以是上述那些中的任何一种，示例性的第二种药物是另一种HER抑制剂或化疗剂。
包装说明书是在容器上或与容器相连。合适的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器等。容器可以从各种材料(如，玻璃或塑料)形成。容器容纳或含有治疗癌症类型有效的组合物并且可以具有无菌存取口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有通过皮下注射针可穿刺的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是HER抑制剂。标签或包装说明书表明组合物用于治疗患者的癌症，所述患者对于使用关于提供的抑制剂和任何其他药物的给药量和间隔的特定指导是合适的。制造的商品可以进一步包含含有药物学上可接受的稀释缓冲剂其他容器，所述缓冲剂如抑菌的注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、Ringer’s溶液和葡萄糖溶液。制造的商品可以进一步包括在商业和使用者立场上所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、填充剂、针和注射器。
本领域已知的许多可替换的实验方法可以成功地替代本发明实践中在本文中具体描述的那些，如，例如，在本文明相关技术领域中可以利用的许多优秀手册和教科书中描述的(例如,Using Antibodies,A LaboratoryManual(使用抗体，实验室手册)，由Harlow,E.和Lane,D.编辑，1999，ColdSpring Harbor Laboratory Press，(例如，ISBN 0-87969-544-7)；Roe B.A.等，1996，DNA Isolation and Sequencing(DNA分离和测序)(Essential TechniquesSeries)(必需技术系列)，John Wiley&Sons.(例如，ISBN 0-471-97324-0)；Methods in Enzymology:Chimeric Genes and Proteins(酶学方法：嵌合基因和蛋白质)，2000，编辑J.Abelson,M.Simon,S.Emr,J.Thomer.Academic Press；Molecular Cloning:a Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，2001，第3版，Joseph Sambrook和Peter MacCallum(之前为Maniatis克隆手册)，(例如，ISBN 0-87969-577-3)；Current Protocols in Molecular Biology(分子学通用实验)，Fred M.Ausubel等编辑，John Wiley&Sons(例如，ISBN 0-471-50338-X)；Current Protocols in Protein Science(蛋白质科学中的通用实验)，John E.Coligan编辑，John Wiley&Sons(例如，ISBN 0-471-11184-8)；和Methods inEnzymology:Guide to protein Purification(酶学方法：蛋白质纯化指导)，1990,Vol.182，Deutscher,M.P.编辑，Acedemic Press,Inc.(例如，ISBN0-12-213585-7))，或按照许多专用于描述分子生物学中的实验方法的大学和商业网站中描述的。
VII.广告方法
本文中的本发明还包括给HER3抑制剂(如，双特异性HER3/EGFR抑制剂(例如，MEHD7945A))或其药物学上可接受的组合物做广告的方法，包括将抑制剂或其药物组合物用于治疗患有一种类型的癌症的患者群的用途促销给目标听众，其中患者的癌症超表达NRG1。
广告通常是通过非人介质的付费通讯，其中鉴定主办方并控制信息。用于本文中目的的广告包括宣传、公众联系、产品放置、赞助、承销和促销。该术语还包括出现在任何设计用来吸引大量观众的印刷流通介质中出现的赞助的信息公告，以说服、告知、促进、动员或另外改变行为，以朝向购买、支持或赞成本文中的本发明的有利模式。
可以通过任何方式来实现本文中的诊断方法的广告和促销。用于传递这些信息的广告介质的实例包括电视、广播、电影、杂志、报纸、网络和公告板，包括广告片，其是出现在广播没提中的信息。广告还包括杂货店手推车的座位上、机场通道的墙壁上和公交车侧面上的那些，或在电话保持信息或店内PA系统中听到的那些，或可以放置在任何视觉或听觉流通的地方。
促销或广告方式的更多特定实例包括电视、广播、电影、网络(如，webcasts和webinars)、计划同时到达使用者的交互式计算机网络、固定的或电子公告板和其他公共标牌、海报、传统的或电子的文献，如杂志和报纸、其他介质输出、赠品或通过例如e-mail、电话、短信、邮政、快递、集会或媒介邮件、亲自访问等的个人接触。
所用的广告类型将取决于许多因素，例如，待到达的目标观众的性质，例如，医院、保险公司、诊所、医生、护士和患者，以及成本考虑和控制药物和诊断广告的相关司法法律和法规。广告可以是个性化或定制的，这基于由服务相互作用和/或其他数据限定的使用者特征，如使用者人口统计状况和地理位置。
通过以下非限制性实施例说明本发明的更多详细内容。说明书中所有引用的公开内容特意并入本文中作为参考。
实施例
实施例1
HER3和EGFR都特异性的MEHD7945A
MEHD7945A(也称为DL11f)是包含对EGFR和HER3两者都具有结合特异性的抗原结合结构域的抗体。WO 2010/108127和Schaefer等，Cancer Cell,20:472-486(2011)。通常，通过连接两个不同的抗原结合分析来构建双靶向剂，每个模块能够只能够结合一个抗原。相反，在MEHD7945A中，每个模块(Fab)可以结合两个抗原中的任何一个，因此具有从亲和力作用引发增强的结合亲和性的潜能。为了证实MEHD7945A的两个相同的Fab中的每一个都能结合EGFR或HER3，进行了竞争性结合试验。随着EGFR-ECD的含量递增，以剂量依赖性的方式降低了MEHD7945A与固定化的HER3-ECD的结合。相反，通过可溶性HER3-ECD蛋白竞争了MEHD7945A与固定化EGFR-ECD的结合。如预期的，已知它们的相对结合常数，需要较高的可溶性EGFR-ECD的浓度来竞争MEHD7945A与固定化HER3-ECD的结合(图1)。图1中的结果表示为MEHD7945A浓度vs.OD。该试验检测了在所示的可溶性竞争剂的存在下，MEHD7945A与固定化HER3-ECD或EGFR-ECD的结合，如所示的：1×＝0.02μg/ml，10×＝0.2μg/ml，100×＝2μg/ml，1000×＝20μg/ml。图1中的结果表示为MEHD7945A浓度vs.OD。
实施例2
MEHD7945A抑制EGFR和HER2/HER3-依赖性信号传输
测定了细胞信号传输试验中的MEHD7945A的双重活性。为了评价对HER3的抑制功能，使用了NRG治疗对其有效激活了HER2/HER3通路的MCF-7细胞。在NRG刺激之前，使用MEHD7945A的治疗以剂量依赖性方式有效地抑制了HER3的磷酸化，并且显著地降低了AKT和ERK1/2的磷酸化(图2A)。MEHD7945A以0.05μg/ml的IC50抑制了HER3的磷酸化，以0.19μg/ml的IC50值抑制了AKT的磷酸化，并以1.13μg/ml的IC50值抑制了ERK1/2的磷酸化。使用具有相当的HER3结合亲和性的对抗HER3的单特异性抗体抗HER3的处理获得了相似的结果。抗HER3以0.12μg/ml的IC50抑制了HER3的磷酸化，以0.74μg/ml的IC50值抑制了AKT的磷酸化，并以1.83μg/ml的IC50值抑制了ERK1/2的磷酸化。在配体刺激之前，用MEHD7945A预处理EGFR-NR6细胞，并且测定了MEHD7945A分别以0.03和0.16μg/ml的IC50值抑制了EGFR和ERK1/2的磷酸化(图2B)。单特异性EGFR抗体西妥昔单抗在抑制EGFR和下游信号传输分子的磷酸化中更有效，这可能是由于与EGFR较高的结合亲和性引起的。此外，betacellulin-和双调蛋白-诱导的EGFR磷酸化也受到MEHF7945A的抑制。MEHD7945A抑制了A431和BxPC3细胞中的ERK1/2和AKT通路，与抗HER3和西妥昔单抗的组合一样有效。
如下进行了试验。用0.5nM NRG刺激用所示浓度的MEHD7945或抗HER3处理过的MCF-7细胞10分钟。将细胞溶解物进行免疫印迹，以检测pHER3(Tyr1289)、pAKT(Ser473)、pERK1/2(Thr202/Tyr204)和总HER3。图2A。在用5nM THF-α刺激10分钟之前，用所示浓度的MEHD7945A或西妥昔单抗处理EGFR-NR6细胞1hr。将细胞裂解物接受免疫印迹，以检测pERK1/2(Thr202/Tyr204)、总EGFR和磷酸化的EGFR。由于EGFR-NR6细胞只表达EGFR，因此使用pTyr抗体检测了EGFR的所有潜在磷酸化位点。图2B。
实施例3
MEHD7945A在各种癌症模型中是活性的
在Fadu异种移植物模型、头颈鳞状上皮细胞癌模型中的体内活性
在具有从Fadu细胞(ATCC HTB-43，Manassas，Va.)建立的肿瘤的小鼠中测试了MEHD7945A，商业购得的抗EGFR抗体，和抗HER3K抗体，所述肿瘤是通过将5×106个FaDu细胞皮下接种于CB17SCID小鼠中获得的。将具有相似大小肿瘤的动物随机分成如下的处理群(n＝9/组)：载体(MEHD7945A配制缓冲剂)、抗-EGFR抗体(25mg/kg)、抗-HER3抗体(50mg/kg)和MEHD7945A(25mg/kg)。通过腹膜内给予处理，在随机的一天，从2×负荷剂量(分别为50或100mg/kg)开始，并且每周持续，总共处理四次。如图3中所示，MEHD7945A在FaDu头颈癌模型中是活性的，并且在抑制肿瘤生长中比抗EGFR特异性的或抗HER3特异性的抗体更有效。
MEHD7945A在其他癌症类型中是活性的
图4提供了一些其他癌症的概述，其中MEHD7945A显示出对这些癌症类型的活性以及西妥昔单抗或单特异性抗HER3抗体的相对活性。用于产生这一概述的试验的相似内容提供于WO 2010/108127中。简而言之，用25mg/kg MEHD7945A、25mg/kg西妥昔单抗、50mg/kg抗HER3或25mg/kg西妥昔单抗加50mg/kg抗HER3的组合处理小鼠，一周一次，持续4个周期。用30mg/kg MEHD7945A、30mg/kg西妥昔单抗、60mg/kg抗HER3或30mg/kg西妥昔单抗加60mg/kg抗HER3的组合处理MAXF449、OVXF550和LX983，一周一次，持续4个周期。对于所有处理，初始剂量为2×负荷剂量。基于研究的最后一天，对每个研究计算肿瘤生长抑制(TGI)百分比，其中载体组的大部分小鼠存活。低于25％的TGI表示为-，25-50％之间的TGI表示为+，51-75％之间的TGI表示为++，而76％及以上的TGI表示为+++。NSCLC＝非小细胞肺癌，HNSCC＝头颈鳞状上皮细胞癌，CRC＝结肠直肠癌，n/a＝不适用。OVXF550、MAXF449和LXF983模型是人患者衍生的移植模型。
实施例4
HNSCC肿瘤呈现出NRG1的双峰表达
材料和方法
免疫沉淀和免疫印迹：对于肿瘤组织的免疫沉淀，通过需要最小50％肿瘤的H&E证实了肿瘤含量(大部分样品具有>75％肿瘤组织)。将肿瘤在干冰上切碎，然后在冷却的悬浮有磷酸酶和蛋白抑制剂(Sigma，P5726-5ML，Roche，13146100)的裂解缓冲液(BioWorld，22040045-2)中均质。每次免疫沉淀，将25ul抗HER3抗体(Santa Cruz，sc-285-G)和15ulDynabeads(Invitrogen，100.07D)加入1-2mg可溶性蛋白中。然后使样品在4℃旋转过夜。然后使用磁铁分离珠子，并且在裂解缓冲液中洗涤三次。通过在95℃煮沸5分钟，将蛋白质稀释于样品缓冲液(Invitrogen，NP0007和NP0009)中。使用标准实验方案进行了Western印迹。每个样品加载15μl洗脱的蛋白质，并且使用pHER3(Y1289；#4791)或pan p-Tyr(Clone PY20，EMD)进行了免疫检测。
组织样本：该研究中总共使用了755个肿瘤样本：127个HNSCC(所有阶段，原发性和复发的)，117个外科手术切除的HSCLC(I-IV期)，102个来自患有未治疗的转移性疾病的患者的NSCLC(III-IV期)，82个来自第一线标准护理失败但最终接受了2L治疗的患者的NSCLC(III-IV期)，29个转移的铂难治的卵巢癌，149个未治疗过的转移性结肠直肠癌，44个原发性和转移性的黑素瘤和29个来自三阴性乳房癌患者的样品(I-IV期)。将分开的20个新鲜冷冻HNSCC群用于校正磷-HER3水平，通过IP-western，使用NRG1转录产物。此外，获得了分开系列的具有复发性HNSCC的28名患者群的匹配样品(来自初次诊断和第一次复发时的活检样品)。(图5中没有包括这最后两个群)。图10和14中显示了概括了这些患者及其肿瘤的可用病理学和人口统计变量的表。依据IRB批准和知情同意获得了所有样品。
用于核酸的组织处理：对于RNA提取，将组织切片浸没于300μl RLT缓冲液(Qiagen)中，并且使用温和的MACS Octo Dissociator(Miltenyi Biotec)均质。然后将样品分成两半，按照制造商的说明，用于DNA制备(DNAeasy，Qiagen)和RNA制备(TriZol，Invitrogen)。
Fluidigm表达分析：使用BioMark 96×96基因表达平台(Fluidigm)，对细胞系和福尔马林固定的石蜡包埋的肿瘤样品进行了基因表达分析。对于肿瘤，将2μl总RNA逆转录成cDNA，并且使用Superscript III/铂Taq(Invitrogen)和预扩增反应混合物(Invitrogen)在单次反应中预扩增。在0.05×初始Taqman试验浓度的最终稀释下进行了预扩增反应(Applied Biosystems)。热循环条件如下：50℃15min，1个循环，70℃2min，1个循环，然后95℃15秒和60℃4min，14个循环。
将预扩增的cDNA稀释1.94倍，然后根据制造商的说明，在BioMarkBMK-M-96.96平台(Fluidigm)上，使用Taqman Universal PCRMasterMix(Applied Biosystems)进行了扩增。所有样品重复试验三次。在表达组中包括了之前针对其在多个细胞系、新鲜冷冻的组织样品和FFPE组织样品中的表达稳定性进行了评价的两个定制设计的参照基因，AL-1377271和VPS-33B。针对每种样品，计算了两个参照基因的Ct值的平均值，并且使用如下的δCt(dCt)方法测定了NRG1和HER3的表达水平：平均Ct(靶基因)-平均Ct(参照基因)。
用于AL137727(NM_144568(SEQ ID NO:10)；NM_001100814(SEQ IDNO:11)(每个序列表示AL137717的剪接变体)的引物/探针序列如下：
正向引物：GGCCTCAGTACCCTCAGTCT(SEQ ID NO:13)
反向引物：AGAGCAGCGGCTGACC(SEQ ID NO:14)
FAM探针：CCCCACAGGACACAAT(SEQ ID NO:15)
用于VPS-33B(NM_0186689(SEQ ID NO:12))的引物/探针序列如下：
正向引物：GGCTCGAGACCAGCTCATCTA(SEQ ID NO:16)
反向引物：GAGATCTGCCTCAATGAATAAATCC(SEQ ID NO:17)
FAM探针：TGGAGCAGCTTCCT(SEQ ID NO:18)
NRG1表达分布的分析和截留(cut-off)测定：HNSCC中的log10(NRG1)的双峰分布促成了两个正态分布的混合物的拟合，一个对应于缺乏超表达，而另一个对应于超表达。Let xi表示第i个样品的log10 NRG1表达(i＝1、……、n)。对于混合物模型的可能性是：
参数。通过EM算法获得了模型参数的最大可能性估算值(16)。简而言之，E-步骤计算第i个样品属于给出的目前参数估算值的混合物的第k种成分的条件概率。M-步骤计算目前概率给出的混合比例、平均和方差。然后重复过程来会聚。针对每种样品计算成分成分的后验概率，并且在两种成分的后验概率相等的数值处选择截留值。使用R pacakge mixtool进行了模型拟合(17)。
双色显色RNA-ISH：通过Advanced Cell Diagnostics(Fremont，CA)进行了双色RNA原位杂交。NRG1探针组具有31对寡核苷酸(总共62个)，覆盖了转录产物NM_013964的nt 1082-3001。ERBB3探针组基本上是两个探针组的集合，其一起覆盖了所有转录产物变体：20对(总共40个)覆盖了NM_001982的nt 1962-2945的寡核苷酸。14对(总共28个)覆盖了NM_001005915的nt 108-899的寡核苷酸。将针对亲环蛋白B(PPIB；正对照)和细菌基因二氢吡啶二羧酸还原酶(DapB；负对照)设计的探针用作对照。通过Hamamatsu Nanozoomer Digital Slide扫描仪扫描图像，运行Nanozoomer软件，使用40×物镜和8bit相机(15，18)。MatLab(MathWorks，Natick，MA)评分算法由以下步骤组成：通过病理学家对每个切片手动限定具有最少75％肿瘤细胞的目标区域，然后形成苏木精遮掩，以鉴定核，接着施用蓝色遮掩(NRG1)和红色遮掩(HER3)。通过苏木精遮掩来限定单独的“细胞”，以在针对每个细胞浆蓝色或红色点计数制成表时明确地分开细胞。
还使用Definiens Developer(Munichz，AG)，使用RGB(红色、绿色和蓝色)谱，分析了扫描的图像。将相同的目标区域用于分析，与在MATLAB方法中相同。将该区域细分成大约300um高和宽的平铺区域，并且在所有分辨率下进行了分析。将颜色强度(红色、绿色和蓝色强度值的平衡)和物体大小都用作区分细胞核、NRG1和HER3与背景的标准。严重重叠的核，其不可能通过光谱分离，从分析中排除，以避免偏差。
使用两种方法来得出以下细胞组中的每一组：HER3+/NRG+、HER3+/NRG-、HER3-/NRG+和HER3-/NRG-。将自分泌信号限定为(HER3+/NRG+)/((HER3+/NRG+)+(HER3+/NRG-)+(HER3-/NRG+))。
HNSCC与检查的所有其他肿瘤类型相比，表达了最高的NRG1中值水平(图5A；图6)。此外，这些HNSCC的显著子集(大约40％)表达了比任何其他肿瘤类型更高的NRG1水平(Mann-Whitnye测试p<0.0001；图6)。此外，以log10标度作图时，NRG1表达在HNSCC中呈现出双峰分布(图7，图6)。将二元高斯混合物分布用于估算NRG1的超表达和缺乏NRG1的超表达之间的拐点，发现其在对数标度上为0.3689，对应于线性标度上的大约1.50。基于这种分布的用于限定超表达vs.缺乏超表达的灵敏度和特异性分别为90.8％和93.4％。
为了确定高NRG1超表达是否与具有激活的HER3的HNSCC相关，针对来自未治疗SCHNN患者的新鲜冷冻肿瘤样本中的NRG1进行了qRT-PCR，以及总HER3的免疫沉淀，接着针对pHER3和p-酪氨酸进行了western印迹(图8；图9；图10)。通过IP-western，所有具有高NRG1表达的肿瘤(在或接近双峰分布内的低点)对于pHER3是阳性的；相反，具有最低的NRG1表达的5/7肿瘤对于pHER3是阴性的(两尾符号检验，P＝0.0386)。
为了进一步表征具有显示出高NRG1表达的肿瘤的HNSCC患者群，从具有外科手术可切除的HNSCC患者获得了肿瘤样品以及来自具有复发疾病的患者的肿瘤样品。与原发性可切除疾病相比，复发情况中的NRG1表达较高(图11)。这些发现不能通过起源位置的差异、HPV状况或任何其他可用的临床病理学信息来解释。
NRG1表达在原发性vs.复发性疾病中不同的发现可能表明了NRG1表达作为之前治疗的结果而增加，或因为高NRG1表达是与HNSCC患者提高的复发可能性相关的预后因素。为了进一步探究这个问题，获得了一系列患者匹配的原发性肿瘤和复发样本，并且通过qRT-PCR比较了两个群中的NRG1表达。如图12；图13；图14中所示；在匹配患者样本中，与原发性疾病相比，复发性情况中的NRG1表达明显较高(Wilcoxon符号秩检验；P＝0.002)。
来自最近报告的临床前数据表明了使用自分泌生物学鉴定肿瘤在预测对靶向HER家族受体的药剂的应答中是重要的(11)。为了确定HNSCC中HER3和NRG1表达的自分泌vs.旁分泌表达的程度，使用了设计来评价临床相关FFPE中的HER3和NRG1转录产物位置和丰度的双色显色RNA原位杂交试验。
良性鳞状上皮的定性检查表明了NRG1的表达限于基底层，而只在正常成层的鳞状上皮中有焦点地看到了HER3表达。相反，在刺状层中，只观察到了HER3表达。在假层状的上呼吸道上皮中看到了相似的表达模式，其中NRG1表达限于基底层，而HER3表达限于上皮的上层。在良性组织的单个细胞水平，在不存在NRG1来源的情况中，大部分细胞和组织相对表达一致水平的HER3，而在存在NRG1的情况中，存在HER3表达的梯度，从NRG1的来源到远离细胞逐渐提高。更常见地，在单独细胞水平上以及在表达这两种转录产物中的任一种的细胞的空间定向上，HER3和NRG1的表达之间存在逆相关性。
发现了在一些充分分化的头颈鳞状上皮细胞癌中的NRG1和HER3的旁分泌表达的明显证据，重现了正常组织中看到的表达模式。如本文中所用的，将自分泌定义为相同细胞中NRG1和HER3的共表达，而将旁分泌限定为邻近细胞中NRG1或HER3任一种的互斥的表达。
在其他更差分化的鳞状上皮细胞癌中，NRG1的基底细胞特异性表达和HER3的具刺细胞特异性表达之间的关联性丢失，这与更混乱的构造一致，具有用于自分泌和旁分泌表达模式的证据。最后，鉴定出其中大部分HER3/NRG1表达细胞显示出是自分泌的情况。
为了确定高NRG1表达是否与自分泌或旁分泌表达特异性地相关，并且为了确保在原发性的未治疗样品及其对应的副本治疗后切片之间观察到的NRG1表达的提高是肿瘤衍生的，针对图12中所示的相同样品中的NRG1和HER3，使用RNA-ISH比较了qRTPCR。总体上，在针对NRG1的qRTPCR和RNA-ISH之间存在强烈的、显著的正Spearman相关，而在针对HER3的qRTPCR和RNA-ISH之间存在较低的、接近显著的正相关(ρ＝0.2；p＝0.051)(图15A&B)。
将三种不同的定量成像算法用于鉴定自分泌细胞(如以上该实施例中所述的)。尽管每种方法在针对每种肿瘤的自分泌成分的相对比例中不同，但这些方法在MatLab和基于Definiens的每种方法之间，相似地将不同肿瘤进行了分级(Spearman r：对于所有配对组合，约0.75-0.96，所有情况中，p<0.0001)。这表明这些算法以相似的方式区分了自分泌和旁分泌表型，虽然具有潜在不同的灵敏度。与NRG1表达不同，未治疗和化疗后样本之间的自分泌表达的相对贡献中部存在差异(图13；图14)。此外，通过qRTPCR或RNA-ISH测定的NRG1表达水平与化疗前后肿瘤内具有NRG1和HER3自分泌表达的细胞比例之间存在很小的关联(分别地，Spearman r:0.26(p＝0.22)，0.33(p＝0.91))。
该数据表明与检查的所有其他肿瘤类型相比，相当大比例的HNSCC子集表达了显著较高的NRG1水平。NRG1表达在HNSCC中具有独特的双峰分布，具有大约40％的HNSCC肿瘤表达比所有其他肿瘤类型更高水平的NRG1。这种表达模式使人想起了乳房癌中的HER2表达，其中HER2表达水平与其他类型的乳房癌相比，在HER2阳性乳房癌中至少高一个数量级。然而，与乳房和胃癌中的HER2不同，NRG1超表达没有显示出是基因扩增的函数(20，21)。
此外，高的NRG1表达与pHER3相关，可能表明了这些特别的HNSCC肿瘤中活跃的HER3信号传输。pHER3在所有情况中是可检测的，其中NRG1以HNSCC患者中的双峰分布的低点或接近该低点表达。在一些情况中，在NRG1水平有一些低于分布低点的样品中检测到pHER3。双峰分布的低点在多个独立的数据集中相似，潜在地反映出生物上不同的HNSCC患者群，并且提供了用于鉴定可能得益于HER3定向治疗干预的HNSCC患者的截留值。
重要地，两种最低的NRG1表达肿瘤也具有可检测的pHER3。已经显示出HER3的NRG-无关性磷酸化可以通过与EGFR或其他RTK(如，c-Met)的杂二聚化来进行(1)。患有呈现出HER3的NRG无关性激活的肿瘤的患者不可能得益于HER3定向治疗，并且因此重要的是注意使用NRG1作为预测标记将有效地排除这个患者群(12)。
此外，与匹配的和未匹配的原发性肿瘤相比，复发性肿瘤样本中的NRG1表达较高。这些发现，与以上的数据一起考虑，表明NRG1表达可以是对HER3抑制剂的应答的预测和用于HNSCC复发的预后。
因此，NRG1表达水平限定了统计学和生物学上可区分的HNSCC患者子集。NRG1的高水平表达与HNSCC中的HER3的组成型激活相关，并且因此限定了针对抑制这种重要致癌基因的药物的起作用的生物标志物。
实施例5
神经调节蛋白1预测了参与MEHD7945A I期研究的患者对治疗的应答临床数据的概述
最初在开放标签、多中心、I期研究(DAF4973g)中研究了MEHD7945A，以评价在难治的或复发性上皮肿瘤患者中，通过每2周IV灌输(q2w)给药时，其安全性和耐受性、药物动力学、药效学，和/或抗肿瘤活性。研究由3+3剂-逐步升级群组成，使用28-天窗口，以评价剂量限制毒性(DLT)以及在推荐的II期剂量下多个扩充群的登记。
该研究中登记的患者呈现的癌症类型包括HNSCC、结肠直肠癌、肺癌、乳房癌、胰腺癌、卵巢癌和肝/胆癌。
评价了1至30mg/kg范围的剂量水平。药物清除以剂量依赖性方式降低，在剂量>10mg/kg接近线性并且表明MEHD7945A接受了与使用单特异性抗EGFR抗体看到的相似的靶标介导的清除。预期依据q2w时间表的1100mg剂量能提供在>95％患者中的异种移植模型中测定的每周有效暴露。
用14mg/kg q2w的MEHD7945A治疗的两名HNSCC患者具有正在进行中的部分应答，使用了10.7和3.9周的持续时间。66名患者中的十三名经历了稳定的疾病作为其最佳应答，3名患者中稳定的疾病维持了≥4个月，包括1名具有KRAS野生型mCRC的患者，之前使用FOLFIRI+西妥昔单抗难治的。
在总共15名患者中，在10至30mg/kg剂量下，观察了肿瘤相关的药物动力学作用，其中11名之前接受了EGFR靶向治疗。在来自17名具有有价值的组织样品的患者中的6名的连续活检中，观察到了降低的肿瘤S6、PRAS40和ERK的磷酸化，并且在56名在基线具有PET-avid疾病的患者中的10名中观察到了代谢应答(通过正电子发射断层扫描[PET]，氟去氧葡萄糖[FDG]吸收降低≥20％)。其中观察到这些变化的肿瘤类型包括CRC、NSCLC、HNSCC和卵巢、乳房和肛门癌。
针对NRG1表达，分析了来自患者的样品。
如上所述，该I期研究中的两名HNSCC患者呈现出对使用MEHD7945A双特异性抗体的治疗的部分应答。患者1在2007年诊断为喉HNSCC，之前的治疗包括化放疗、3×西妥昔单抗±化疗，具有SD的最佳应答。
患者1已经证实了使用MEHD7945A(14mg/kg IV)治疗后的部分应答。通过基于CT分析的肿瘤大小减小和使用Response Evaluation Criteria in SolidTumors(RECIST)指导提供的可应用标准来表示部分应答。患者1还呈现出临床改善(较少疼痛、改善的发声)。患者2在1994年诊断为舌HNSCC，最近转移至肺。之前的治疗包括多次手术和化放疗。患者2在用MEHD7945A(14mg/kg IV q2w)治疗后，具有证实的通过基于CT分析的肿瘤大小减小表示的部分应答，并且具有临床改善(重新获得了吞咽能力)。
这两名患者在研究组中具有呈现出最高NRG1水平的癌症。(图16)。此外，确定了复发性HNSCC中的NRG1表达高于原发性HNSCC中的NRG1表达水平。图17显示了该试验的结果并且比较了来自1期试验的患者1的NRG1表达水平。
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Claims (48)

1.一种治疗患者一种类型的癌症的方法，包括将治疗有效量的HER3抑制剂给药至所述患者，其中在给药HER3抑制剂之前，所述患者被诊断为患有超表达NRG1的癌症。
2.如权利要求1的方法，其中所述患者被诊断为患有以高于该癌症类型中NRG1表达的中值水平的水平表达NRG1的癌症。
3.如权利要求2的方法，其中所述患者被诊断为患有以该癌症类型中NRG1表达的第60百分位或更高的水平表达NRG1的癌症。
4.如权利要求2的方法，其中所述患者被诊断为患有以该癌症类型中NRG1表达的第75百分位或更高的水平表达NRG1的癌症。
5.如权利要求2的方法，其中所述患者被诊断为患有以该癌症类型中NRG1表达的第80百分位或更高的水平表达NRG1的癌症。
6.如权利要求1的方法，其中所述类型的癌症是呈现出由超表达模式和缺乏超表达模式组成的双峰表达谱的癌症。
7.如权利要求1-6中任一项的方法，其中所述类型的癌症呈现出自分泌神经调节蛋白诱导的信号传输。
8.如权利要求1-7中任一项的方法，其中所述类型的癌症是头颈鳞状上皮细胞癌(HNSCC)。
9.如权利要求1-8中任一项的方法，其中所述HER3抑制剂抑制NRG1结合HER3。
10.如权利要求1-9中任一项的方法，其中所述HER3抑制剂是抗体。
11.如权利要求1-10中任一项的方法，其中所述HER3抑制剂是双特异性HER3/EGFR抑制剂。
12.如权利要求11的方法，其中双特异性HER3/EGFR抑制剂是包含特异性结合HER3和EGFR的抗原结合结构域的双特异性抗体。
13.如权利要求12的方法，其中特异性结合HER3和EGFR的抗原结合结构域包含：
包含氨基酸序列LSGDWIH(SEQ ID NO:3)的HVR-H1，
包含氨基酸序列VGEISAAGGYTD(SEQ ID NO:4)的HVR-H2，
包含氨基酸序列ARESRVSFEAAMDY(SEQ ID NO:5)的HVR-H3，和
包含氨基酸序列NIATDVA(SEQ ID NO:6)的HVR-L1，
包含氨基酸序列SASF(SEQ ID NO:7)的HVR-L2，和
包含氨基酸序列SEPEPYT(SEQ ID NO:8)的HVR-L3。
14.如权利要求13的方法，其中特异性结合HER3和EGFR的抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的轻链可变结构域。
15.如权利要求12的方法，其中特异性结合HER3和EGFR的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:1的重链可变结构域和SEQ ID NO:2的轻链可变结构域。
16.如权利要求1-15中任一项的方法，其中所述诊断包括测定来自患者癌症的样品中的NRG1的表达水平并且相对于样品中的AL-137727和VPS33B中的一种或两种的表达水平，将样品中的NRG1的表达水平进行量化。
17.一种治疗患者头颈鳞状上皮细胞癌(HNSCC)的方法，包括将治疗有效量的双特异性HER3/EGFR抑制剂给药至所述患者，其中在给药双特异性HER3/EGFR抑制剂之前，所述患者被诊断为患有超表达NRG1的HNSCC。
18.如权利要求17的方法，其中所述双特异性HER3/EGFR抑制剂是包含特异性结合HER3和EGFR的抗原结合结构域的双特异性抗体。
19.如权利要求17的方法，其中特异性结合HER3和EGFR的抗原结合结构域包含：
包含氨基酸序列LSGDWIH(SEQ ID NO:3)的HVR-H1，
包含氨基酸序列VGEISAAGGYTD(SEQ ID NO:4)的HVR-H2，和
包含氨基酸序列ARESRVSFEAAMDY(SEQ ID NO:5)的HVR-H3，
和
包含氨基酸序列NIATDVA(SEQ ID NO:6)的HVR-L1，
包含氨基酸序列SASF(SEQ ID NO:7)的HVR-L2，和
包含氨基酸序列SEPEPYT(SEQ ID NO:8)的HVR-L3。
20.如权利要求19的方法，其中特异性结合HER3和EGFR的抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的轻链可变结构域。
21.如权利要求18的方法，其中特异性结合HER3和EGFR的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:1的重链可变结构域和SEQ ID NO:2的轻链可变结构域。
22.如权利要求17-21中任一项的方法，其中诊断包括测定来自患者HNSCC的样品中的NRG1的表达水平并且相对于样品中的AL-137727和VPS33B中的一种或两种的表达水平，将样品中的NRG1的表达水平进行量化。
23.一种用于选择治疗的方法，所述治疗用于患有呈现出自分泌神经调节蛋白诱发的信号传输的一种类型的癌症的患者，所述方法包括测定来自所述患者的癌症样品中的神经调节蛋白1(NRG1)表达并且如果癌症样品超表达NRG1，选择HER3抑制剂用于治疗。
24.如权利要求23的方法，其中所述癌症样品以高于该癌症类型中的NRG1表达的中值水平的水平表达NRG1。
25.如权利要求24的方法，其中所述癌症样品以该癌症类型中的NRG1表达的第60百分位或更高的水平表达NRG1。
26.如权利要求24的方法，其中所述癌症样品以该癌症类型中的NRG1表达的第75百分位或更高的水平表达NRG1。
27.如权利要求24的方法，其中所述癌症样品以该癌症类型中的NRG1表达的第80百分位或更高的水平表达NRG1。
28.如权利要求23的方法，其中所述类型的癌症是呈现出由超表达模式和缺乏超表达模式组成的双峰表达谱的癌症。
29.如权利要求23-28中任一项的方法，其中所述类型的癌症是头颈鳞状上皮细胞癌(HNSCC)。
30.如权利要求23-29中任一项的方法，其中所述HER3抑制剂抑制NRG1结合HER3。
31.如权利要求23-30中任一项的方法，其中所述HER3抑制剂是抗体。
32.如权利要求31的方法，其中所述HER3抑制剂是双特异性HER3/EGFR抑制剂。
33.如权利要求32的方法，其中双特异性HER3/EGFR抑制剂是包含特异性结合HER3和EGFR的抗原结合结构域的双特异性抗体。
34.如权利要求33的方法，其中特异性结合HER3和EGFR的抗原结合结构域包含：
包含氨基酸序列LSGDWIH(SEQ ID NO:3)的HVR-H1，
包含氨基酸序列VGEISAAGGYTD(SEQ ID NO:4)的HVR-H2，
包含氨基酸序列ARESRVSFEAAMDY(SEQ ID NO:5)的HVR-H3，和
包含氨基酸序列NIATDVA(SEQ ID NO:6)的HVR-L1，
包含氨基酸序列SASF(SEQ ID NO:7)的HVR-L2，和
包含氨基酸序列SEPEPYT(SEQ ID NO:8)的HVR-L3。
35.如权利要求34的方法，其中特异性结合HER3和EGFR的抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的轻链可变结构域。
36.如权利要求33的方法，其中特异性结合HER3和EGFR的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:1的重链可变结构域和SEQ ID NO:2的轻链可变结构域。
37.如权利要求23-36中任一项的方法，其中使用聚合酶链式反应(PCR)测定NRG1表达。
38.如权利要求37的方法，其中所述PCR是定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)。
39.如权利要求23-36中任一项的方法，其中使用IHC测定了NRG1表达。
40.如权利要求23-39中任一项的方法，其中测定HNSCC样品中的NRG1表达包括测定所述样品中的NRG1的表达水平并且相对于样品中的AL-137727和VPS33B中的一种或两种的表达水平，将所述样品中的NRG1的表达水平进行量化。
41.如权利要求23-40中任一项的方法，进一步包括将治疗有效量的HER3抑制剂给药至所述患者。
42.一种定量癌症样品中的NRG1表达水平的方法，包括：
测定所述样品中的NRG1的表达水平，和
相对于所述样品中的AL-137727和VPS33B中的一种或两种的表达水平，将所述样品中的NRG1的表达水平进行量化。
43.如权利要求42的方法，其中所述癌症呈现出自分泌神经调节蛋白诱导的信号传输。
44.如权利要求42或43的方法，其中所述癌症是头颈鳞状上皮细胞癌(HNSCC)。
45.如权利要求42-44中任一项的方法，其中使用聚合酶链式反应(PCR)测定NRG1的表达水平以及AL-137727和VPS33B中的一种或两种的表达水平。
46.如权利要求45的方法，其中所述PCR是定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)。
47.如权利要求42-44中任一项的方法，其中使用免疫组织化学(IHC)测定NRG1的表达水平以及AL-137727和VPS33B中的一种或两种的表达水平。
48.HER3抑制剂，其用于治疗超表达NRG1的癌症类型。
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