CN110317811A - Usp30抑制剂及其使用方法 - Google Patents

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雅各布·科恩
张映楠
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Abstract

本发明提供USP30的抑制剂以及使用USP30的抑制剂的方法。在一些实施方案中，提供治疗涉及线粒体缺陷的病症的方法。

Description

USP30抑制剂及其使用方法
本申请是国际专利申请PCT/EP2013/068983，国际申请日2013年9 月13日，中国国家申请日2015年3月17日，中国国家申请号 201380048259.7，发明名称为“USP30抑制剂及其使用方法”的分案申请。
领域
本发明提供USP30的抑制剂以及使用USP30的抑制剂的方法。在一些实施方案中，提供治疗涉及线粒体缺陷的病症的方法。
背景
线粒体自噬(Mitophagy)是通过溶酶体降解消除线粒体的专门的自体吞噬途径。由此，其在细胞器的正常细胞更新过程中、在红细胞成熟过程中以及在受精之后去除线粒体，以去除精子来源的线粒体。线粒体自噬还调节损坏的线粒体的清除，这是线粒体质量控制的重要方面。缺陷的或过量的线粒体，如果不将其清除，可能变成异常的氧化压力来源，并且通过线粒体融合破坏健康的线粒体。在酵母中，线粒体自噬的选择性阻断由过量的线粒体引起活性氧(ROS)的增加的产生和线粒体DNA(mt-DNA)的丢失。受损的线粒体质量控制还可能影响关键的生物合成途径，ATP产生和Ca2+缓冲，并且扰乱整体细胞内稳态。
帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是次于阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease，AD)的第二最常见的神经变性病症，其特征最主要在于黑质中多巴胺能神经元的丧失。尽管PD的发病机制还不清楚，但是，一些证据链表明线粒体功能障碍对PD是重要的。一种线粒体毒素，即MPTP，损坏多巴胺神经元，并且在人中产生临床帕金森症。流行病学证据将PD与暴露于杀虫剂联系起来，所述杀虫剂如鱼藤酮(复合物I抑制剂)和百草枯(氧化应激物)。与线粒体损坏一致，在来自PD患者的黑质中发现减少的复合物I活性和高水平的mt-DNA突变。类似地，在PD的遗传模型中存在线粒体的功能和形态变化。可能最引人注意的是，早期发作的家族性PD可能是由于Parkin泛素-连接酶和PINK1丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的突变引起，这两种酶都起作用通过调节线粒体动力学和质量控制来维持健康的线粒体。
本领域的遗传性研究确定PINK1在Parkin的上游起作用，以维持正确的线粒体形态和功能。PINK1从细胞质中招募Parkin到损坏的线粒体的表面，导致Parkin-介导的线粒体外膜蛋白的遍在蛋白化并且通过线粒体自噬去除损坏的线粒体。PINK1或Parkin中的PD-相关的突变消弱 Parkin募集、线粒体遍在蛋白化和线粒体自噬。Parkin调节线粒体功能的多个方面，如线粒体动力学和运输，并且还可以影响线粒体生物进化 (biogenesis)。损坏的线粒体上宽范围的线粒体外膜蛋白的降解似乎受 Parkin影响。在这些线粒体相关的蛋白中，MIRO，即线粒体-驱动蛋白运动元连接物复合物(mitochondria-kinesin motoradaptor complex)的成分，可能是Parkin与PINK-1共有的底物。
在家族性PD中，Parkin的表达和/或活性可能经由遗传突变而被消弱，或者在偶发性PD中，经由磷酸化而被消弱。在黑质多巴胺神经元中遗传性高线粒体氧化应激的情形中，失去Parkin-介导的线粒体质量控制可能解释黑质神经元对神经变性的更大的易感性。在PD中，促进损坏的线粒体的清除和增强线粒体质量控制可能是有益的。
概述
在一些实施方案中，提供增加细胞中的线粒体自噬的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使细胞与USP30的抑制剂接触。
在一些实施方案中，提供增加细胞中的线粒体遍在蛋白化的方法。在一些实施方案中，提供增加细胞中选自下述的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种或十四种蛋白的遍在蛋白化：Tom20，MIRO，MUL1，ASNS，FKBP8，TOM70，MAT2B，PRDX3，IDE，VDAC1，VDAC2，VDAC3，IPO5，PSD13，UBP13和PTH2。在一些实施方案中，所述方法包括使细胞与USP30的抑制剂接触。
在一些实施方案中，所述方法包括增加选自Tom 20的K56、K61和 K68的至少一个、至少两个或三个氨基酸的遍在蛋白化。在一些实施方案中，所述方法包括增加选自MIRO的K153、K187、K330、K427、K512、 K535、K567和K572的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或八个氨基酸的遍在蛋白化。在一些实施方案中，所述方法包括增加选自MUL1的K273、K299和K52的至少一个、至少两个或三个氨基酸的遍在蛋白化。在一些实施方案中，所述方法包括增加选自ASNS的K147、K168、K176、K221、K244、K275、K478、 K504和K556的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个或九个氨基酸的遍在蛋白化。在一些实施方案中，所述方法包括增加选自FKBP8的K249、K271、K273、K284、 K307、K317、K334和K340的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或八个氨基酸的遍在蛋白化。在一些实施方案中，所述方法包括增加选自TOM70的K78、K120、K123、K126、 K129、K148、K168、K170、K178、K185、K204、K230、K233、K245、 K275、K278、K312、K326、K349、K359、K441、K463、K470、K471、 K494、K501、K524、K536、K563、K570、K599、K600和K604的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个氨基酸的遍在蛋白化。在一些实施方案中，所述方法包括增加选自MAT2B的K209、K245、K316和K326的至少一个、至少两个、至少三个或四个氨基酸的遍在蛋白化。在一些实施方案中，所述方法包括增加选自PRDX3的K83、K91、K166、K241和K253的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或五个氨基酸的遍在蛋白化。在一些实施方案中，所述方法包括增加选自IDE的K558、K657、K854、K884、K929和K933的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或六个氨基酸的遍在蛋白化。在一些实施方案中，所述方法包括增加选自VDAC1的K20、K53、K61、K109、K110、K266和K274的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或七个氨基酸的遍在蛋白化。在一些实施方案中，所述方法包括增加选自VDAC2的 K31、K64、K120、K121、K277和K285的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或六个氨基酸的遍在蛋白化。在一些实施方案中，所述方法包括增加选自VDAC3的K20、K53、K61、K109、K110、 K163、K266和K274的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、或八个氨基酸的遍在蛋白化。在一些实施方案中，所述方法包括增加选自IPO5的K238、K353、K436、K437、K548、 K556、K613、K678、K690、K705、K775和K806的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个氨基酸的遍在蛋白化。在一些实施方案中，所述方法包括增加选自PSD13的K2、K32、K99、K115、K122、K132、K161、 K186、K313、K321、K347、K350和K361的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个氨基酸的遍在蛋白化。在一些实施方案中，所述方法包括增加选自UBP13的K18、K190、K259、K326、K328、K401、K405、K414、 K418、K435、K586、K587和K640的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个氨基酸的遍在蛋白化。在一些实施方案中，所述方法包括增加选自 PTH2的47、76、81、95、106、119、134、171、177的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个或九个氨基酸的遍在蛋白化。
在一些实施方案中，所述细胞处于氧化应激中。在一些实施方案中，提供减少细胞中的氧化应激的方法。在一些实施方案中，方法包括使细胞与USP30的抑制剂接触。
在一些实施方案中，所述细胞包含Parkin中的致病性突变、PINK1 中的致病性突变或包含Parkin中的致病性突变与PINK1中的致病性突变。 Parkin中的非限制性的示例性的致病性突变显示在表1中。因此，在一些实施方案中，Parkin中的致病性突变选自表1中的突变。PINK1中的非限制性的示例性的致病性突变显示在表2中。在一些实施方案中，PINK1中的致病性突变选自表2中的突变。
在不同的实施方案中，所述细胞选自神经元、心脏的细胞(cardiac cell)和肌细胞。在一些这样的实施方案中，所述细胞是离体的或体外的。备选地，在一些这样的实施方案中，所述细胞包含在受试者中。
在一些实施方案中，提供治疗受试者中涉及线粒体缺陷的病症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括给所述受试者施用有效量的USP30 的抑制剂。在一些实施方案中，涉及线粒体缺陷的病症选自涉及线粒体自噬缺陷的病症、涉及线粒体DNA突变的病症、涉及线粒体氧化应激的病症、涉及线粒体形状或形态缺陷的病症、涉及线粒体膜电位缺陷的病症和涉及溶酶体贮积缺陷的病症。
在一些实施方案中，涉及线粒体缺陷的病症选自神经变性病；线粒体肌病、脑病、乳酸性酸中毒和卒中样发作(MELAS)综合征(mitochondrial myopathy，encephalopathy，lactic acidosis，and stroke-like episodes(MELAS) syndrome)；莱伯遗传性视神经病(Leber’s hereditary optic neuropathy， LHON)；神经病、共济失调、色素性视网膜炎-母系遗传的利氏综合征 (neuropathy，ataxia，retinitis pigmentosa-maternallyinherited Leigh syndrome，NARP-MILS)；Danon病(Danon disease)；引起心肌梗死的缺血性心脏病；多发性硫酸脂酶缺乏症(multiple sulfatase deficiency， MSD)；粘脂质累积II(mucolipidosis II，ML II)；粘脂质累积III (mucolipidosis III，ML III)；粘脂质累积IV(mucolipidosis IV，ML IV)； GM1-神经节苷脂贮积病(GM1-gangliosidosis，GM1)；神经元蜡样脂-脂褐质沉积症(neuronal ceroid-lipofuscinoses，NCL 1)；阿尔珀斯病(Alpers disease)；巴尔特综合征(Barth syndrome)；β-氧化缺陷(Beta-oxidationdefects)；肉碱-酰基-肉碱缺乏症(carnitine-acyl-carnitine deficiency)；肉碱缺乏症(carnitine deficiency)；肌酸缺乏综合征(creatine deficiency syndromes)；辅酶Q10缺乏症(co-enzyme Q10 deficiency)；复合物I缺乏症(complex I deficiency)；复合物II缺乏症(complex II deficiency)；复合物III缺乏症(complex III deficiency)；复合物IV缺乏症(complex IV deficiency)；复合物V缺乏症(complex V deficiency)；COX缺乏症(COX deficiency)；慢性进行性外侧眼肌麻痹(chronic progressive externalophthalmoplegia syndrome，CPEO)；CPT I缺乏症(CPT I deficiency)； CPT II缺乏症(CPT II deficiency)；II型戊二酸尿症(glutaric aciduria type II)；卡恩斯-塞尔综合征(Kearns-Sayre syndrome)；乳酸性酸中毒(lactic acidosis)；长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(long-chain acyl-CoA dehydrongenase deficiency，LCHAD)；利氏病或综合征(Leigh disease or syndrome)；致死性幼儿心肌病(lethal infantile cardiomyopathy，LIC)；勒夫特病(Luft disease)；II型戊二酸尿症(glutaric aciduria type II)；中等链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(medium-chain acyl-CoA dehydrongenase deficiency，MCAD)；肌阵挛型癫痫与破碎红纤维(MERRF)综合征 (myoclonic epilepsy and ragged-redfiber(MERRF)syndrome)；线粒体隐性遗传的共济失调综合征(mitochondrial recessiveataxia syndrome)；线粒体细胞病(mitochondrial cytopathy)；线粒体DNA耗竭综合征(mitochondrial DNA depletion syndrome)；肌神经胃肠紊乱与脑病(myoneurogastointestinal disorder and encephalopathy)；皮尔逊综合征 (Pearsonsyndrome)；丙酮酸羧化酶缺乏症(pyruvate carboxylase deficiency)；丙酮酸脱氢酶缺乏症(pyruvate dehydrogenase deficiency)； POLG突变(POLG mutations)；中等链/短链3-羟基酰基-辅酶A脱氢酶 (M/SCHAD)缺乏症(medium/short-chain 3-hydroxyacyl-CoAdehydrogenase (M/SCHAD)deficiency)；和非常长的长链酰基-辅酶A脱氢酶(VLCAD) 缺乏症(very long-chain acyl-CoA dehydrongenase(VLCAD)deficiency)。
在一些实施方案中，提供治疗神经变性疾病的方法。在一些实施方案中，所述方法包括给受试者施用有效量的USP30的抑制剂。
在一些实施方案中，所述神经变性疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、亨廷顿病 (Huntington’s disease)、局部缺血(ischemia)、中风(stroke)、具有雷维小体的痴呆症(dementia with Lewy bodies)和额颞性痴呆症 (frontotemporal dementia)。
在一些实施方案中，提供治疗帕金森病的方法。在一些实施方案中，所述方法包括给受试者施用有效量的USP30的抑制剂。
在一些实施方案中，提供治疗涉及经历氧化应激的细胞的病症。在一些实施方案中，所述方法包括给受试者施用有效量的USP30的抑制剂。
在一些涉及受试者治疗的实施方案中，所述受试者在所述受试者的至少一部分细胞中包含在Parkin中的致病性突变、在PINK1中的致病性突变或包含在Parkin中的致病性突变和在PINK1中的致病性突变。在一些实施方案中，在Parkin中的致病性突变选自表1中的突变。在一些实施方案中，在PINK1中的致病性突变选自表2中的突变。
在一些实施方案中，USP30的抑制剂口服、肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。在一些实施方案中，所述方法包括施用至少一种另外的治疗剂。在一些实施方案中，所述至少一种另外的治疗剂选自左旋多巴 (levodopa)，多巴胺激动剂，单氨基加氧酶(MAO)B抑制剂，儿茶酚 O-甲基转移酶(COMT)抑制剂，抗胆碱能药(anticholinergic)，金刚烷胺(amantadine)，利芦噻唑(riluzole)，胆碱酯酶抑制剂(cholinesterase inhibitor)，美金刚(memantine)，丁苯那嗪(tetrabenazine)，抗精神病药 (antipsychotic)，氯硝西泮(clonazepam)，地西泮(diazepam)，抗抑郁药(antidepressant)和抗惊厥药(anti-convulsant)。
在本文所述的任一种方法中，所述USP30的抑制剂可以是USP30表达的抑制剂。非限制性的示例性的USP30表达的抑制剂包括反义寡核苷酸和短干扰RNAs(siRNAs)。在本文所述的任一种方法中，所述USP30 的抑制剂可以是USP30活性的抑制剂。非限制性的示例性的USP30活性的抑制剂包括抗体、肽、肽体(peptibodies)、适体和小分子。
在一些实施方案中，USP30的肽抑制剂包含氨基酸序列：
X1X2CX3X4X5X6X7X8X9X10X11CX12(SEQ ID NO：48)
其中：
X1选自L，M，A，S和V；
X2选自Y，D，E，I，L，N和S；
X3选自F，I和Y；
X4选自F，I和Y；
X5选自D和E；
X6选自L，M，V和P；
X7选自S，N，D，A和T；
X8选自Y，D，F，N和W；
X9选自G，D和E；
X10选自Y和F；
X11选自L，V，M，Q和W；以及
X12选自F，L，C，V和Y。
在一些实施方案中，USP30肽的肽抑制剂包含与选自SEQ ID NOs： 1-22的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述肽以小于10μM的IC50抑制USP30。在一些实施方案中，USP30的肽抑制剂对选自USP7，USP5， UCHL3和USP2的至少一种、至少两种或至少三种肽酶的IC50大于20 μM，大于30μM，大于40μM或大于50μM。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸包含与USP30 mRNA的区域和/ 或USP30前mRNA的区域至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％互补的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述USP30mRNA的区域或USP30前mRNA的区域至少是至少10个、至少15个、至少20 个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少 70个、至少80个、至少90个或至少100个核苷酸长。在一些实施方案中，所述反义核苷酸是10-500个核苷酸长，或10-400个核苷酸长，或 10-300个核苷酸长，或10-200个核苷酸长，或10-100个核苷酸长，或 15-100个核苷酸长，或10-50个核苷酸长，或15-50个核苷酸长。反义寡核苷酸可以包含一个或多个非核苷酸成分。
在一些实施方案中，siRNA包含与USP30mRNA的区域和/或USP30 前mRNA的区域至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述USP30mRNA的区域或USP30 前mRNA的区域至少是至少10个、至少15个、至少20个或至少25个核苷酸长。在一些实施方案中，所述siRNA是10-200个核苷酸长，或 10-100个核苷酸长，或15-100个核苷酸长，或10-60个核苷酸长，或15-60 个核苷酸长，或10-50个核苷酸长，或15-50个核苷酸长，或10-30个核苷酸长，或15-30个核苷酸长。在一些实施方案中，siRNA是shRNA。
本发明的一个实施方案是用于治疗受试者中涉及线粒体缺陷的病症的USP30的抑制剂。在一个具体的实施方案中，所述涉及线粒体缺陷的病症选自涉及线粒体自噬缺陷的病症，涉及线粒体DNA突变的病症，涉及线粒体氧化应激的病症，涉及线粒体形状或形态缺陷的病症，涉及线粒体膜电位缺陷的病症和涉及溶酶体贮积缺陷的病症。在另一个具体的实施方案中，涉及线粒体缺陷的病症选自神经变性病；线粒体肌病、脑病、乳酸性酸中毒和卒中样发作(MELAS)综合征；莱伯遗传性视神经病(LHON)；神经病、共济失调、色素性视网膜炎-母系遗传的利氏综合征(NARP-MILS)；Danon病；引起心肌梗死的缺血性心脏病；多发性硫酸脂酶缺乏症(MSD)；粘脂质累积II(ML II)；粘脂质累积III(ML III)；粘脂质累积IV(MLIV)；GM1-神经节苷脂贮积病(GM1)；神经元蜡样脂-脂褐质沉积症(NCL1)；阿尔珀斯病；巴尔特综合征；β-氧化缺陷；肉碱-酰基- 肉碱缺乏症；肉碱缺乏症；肌酸缺乏综合征；辅酶Q10缺乏症；复合物I 缺乏症；复合物II缺乏症；复合物III缺乏症；复合物IV缺乏症；复合物V缺乏症；COX缺乏症；慢性进行性外侧眼肌麻痹(CPEO)；CPT I缺乏症；CPT II缺乏症；II型戊二酸尿症；卡恩斯-塞尔综合征；乳酸性酸中毒；长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(LCHAD)；利氏病或综合征；致死性幼儿心肌病(LIC)；勒夫特病；II型戊二酸尿症；中等链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(MCAD)；肌阵挛型癫痫与破碎红纤维(MERRF)综合征；线粒体隐性遗传的共济失调综合征；线粒体细胞病；线粒体DNA耗竭综合征；肌神经胃肠紊乱与脑病；皮尔逊综合征；丙酮酸羧化酶缺乏症；丙酮酸脱氢酶缺乏症；POLG突变；中等链/短链3-羟基酰基-辅酶A脱氢酶(M/SCHAD)缺乏症；和非常长的长链酰基-辅酶A脱氢酶(VLCAD)缺乏症。在更具体的实施方案中，所述神经变性病选自阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、亨廷顿病、局部缺血、中风、具有雷维小体的痴呆症和额颞性痴呆症。
本发明的另一个实施方案是用于治疗受试者中的神经变性病的 USP30的抑制剂，包括施用给所述受试者。在一个具体的实施方案中，所述神经变性病选自帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、局部缺血、中风、具有雷维小体的痴呆症和额颞性痴呆症。
本发明的另一个实施方案是用于治疗受试者中的帕金森病的USP30 的抑制剂。
在本发明的另一个实施方案中，所述USP30的抑制剂口服、肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。
在本发明的一个具体的实施方案中，用于本文所述的治疗中的USP30 的抑制剂与至少一种另外的治疗剂组合。在更具体的实施方案中，所述至少一种另外的治疗剂选自左旋多巴，多巴胺激动剂，单氨基加氧酶(MAO) B抑制剂，儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)抑制剂，抗胆碱能药，金刚烷胺，利芦噻唑，胆碱酯酶抑制剂，美金刚，丁苯那嗪，抗精神病药，氯硝西泮，地西泮，抗抑郁药和抗惊厥药。
附图简述
专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。专利局在接到请求和支付必要的费用后将提供本专利或专利申请公布带有彩色附图的副本。
图1A显示共转染GFP-Parkin和单独的FLAG-标记的DUBs的HeLa 细胞的免疫染色。表达24小时后，细胞用CCP(20μM，24h)处理并且针对GFP、FLAG和内源性Tom20免疫染色。显示关于FLAG-标记的USP30、 DUBA2、UCH-L1、USP15和ATXN3的代表性的图片；其他的DUBs未显示。刻度条是10μm。图1B显示共转染GFP-Parkin与所示的对照(β-Gal) 和USP30构建体的SH-SY5Y细胞的免疫染色。表达24小时后，细胞用 CCCP(20μM，24h)处理，并且针对myc、FLAG和内源性Tom20和HSP60 免疫染色(刻度条，5μm)。图1C显示图1B中具有Tom20或HSP60染色的细胞百分数的量化(通过单向ANOVA-Dunnett’s多重比较检验， ***p＜0.001。N＝3次实验。误差条表示SEM)。图1D显示来自图1B的每个细胞的总Tom20和HSP60荧光强度的量化(通过单向ANOVA- Dunnett’s多重比较检验，**p＜0.01。对于对照(β-Gal)、USP30-FLAG和USP30-C77S-FLAG组，n分别为63、67和54。N＝3次实验。误差条表示SEM)。图1E显示来自图1B含有Parkin簇的细胞百分数的量化(通过单向ANOVA-Dunnett’s多重比较检验，***p＜0.001。N＝3次实验。误差条表示SEM)。
图2A显示在培养的大鼠海马神经元中转染的USP30-FLAG(红色)和线粒体-标记的GFP(绿色)的免疫染色。合并用颜色显示；单个通道是灰度的。刻度条是5μm。图2B显示转染对照或USP30 siRNA的SH-Sy5Y 细胞的免疫染色。在3天的敲倒(knockdown)后，固定细胞并且针对内源性USP30和HSP60免疫染色。USP30 siRNA主要减少线粒体USP30 抗体染色(刻度条，5μm)。在右图中显示框出的区域的较高放大倍数的图片(刻度条，2μm)。图2C显示使用USP30、HSP60和GAPDH抗体对来自大鼠脑的细胞质-和线粒体-富集级分的免疫印迹。图2D显示共转染GFP-Parkin和所示的对照(β-Gal)和USP30构建体的SH-SY5Y细胞的免疫染色。24小时表达后，细胞用CCCP(20μM，4h)处理并且针对GFP、 FLAG和内源性Tom20以及聚泛素链(用FK2抗体检测)免疫染色(刻度条，5μm)。图2E是显示由图2D的线粒体面积标准化的线粒体-相关的聚泛素染色强度的量化的图(积分的线粒体FK2染色的荧光强度 /Tom20染色面积)。(通过单向ANOVA-Dunnett’s多重比较检验， ***p＜0.001。对于β-Gal、USP30-FLAG和USP30-C77S-FLAG组，n分别为61、45和59个细胞。误差条表示SEM)。图2F显示来自转染了所示的对照(β-Gal)与USP30构建体的表达GFP-Parkin的稳定的HEK-293细胞的细胞裂解物的免疫印迹。表达24小时后，细胞用CCCP(5μM，2小时) 处理并裂解。图2G是显示来自图2F针对肌动蛋白标准化的关于 GFP-Parkin的免疫印迹信号的量化的图(通过单向ANOVA-Dunnett’s 多重比较检验，***p＜0.001。N＝6次实验。误差条表示SEM)。
图3A显示mt-Keima区分性突出显示细胞质(绿色)和溶酶体(红色)线粒体。用mt-Keima和GFP转染培养的海马神经元。表达2天后，细胞用458nm(显示为绿色)或543nm(显示为红色)光激发成像。GFP 信号用来描述细胞(显示为白色)。刻度条，5μm。图3B显示转染了Parkin shRNA敲倒构建体的神经元中的mt-Keima成像。刻度条为5μm。图3C是显示来自图3B的线粒体自噬指数的量化的图(通过单向ANOVA- Dunnett’s多重比较检验，**p＜0.01和***p＜0.001。n＝52-109个细胞/组。 N＝3-6次实验。误差条表示SEM)。图3D显示在转染了PINK1 shRNA敲倒构建体的神经元中的mt-Keima成像。刻度条为5μm。图3E是显示来自图3D的线粒体自噬指数的量化的图(通过单向ANOVA-Dunnett’s多重比较检验，**p＜0.01和***p＜0.001。n＝52-109个细胞/组。N＝3-6次实验。误差条表示SEM)。图3F显示转染了PINK1-GFP和Parkin-shRNA#1 的神经元中的mt-Keima成像(萤光素酶shRNA和β-Gal作为对照)。刻度条为5μm。图3G是显示来自图3F的线粒体自噬指数的量化的图(通过单向ANOVA-Dunnett’s多重比较检验，***p＜0.001。n＝55-77个细胞。 N＝3次实验。误差条表示SEM)。
图4A显示在NH4Cl处理(50mM，2分钟)之前和之后在培养的海马神经元中的mt-Keima成像。用543nm或458nm激光发射源收集的 mt-Keima信号分别以红色和绿色显示。刻度条为5μm。图4B显示海马神经元中mt-Keima和Lysotracker的成像(以灰度显示)。刻度条为5μm。图4C显示在关于mt-Keima信号成像的神经元中针对内源性LAMP-1的 post-hoc免疫染色。在mt-Keima成像后立即固定细胞并且用抗-LAMP1 抗体染色(以灰度显示)。刻度条为5μm。图4D是显示在培养的海马神经元中mt-Keima表达1、3和6-7天后线粒体自噬指数的量化的图(使用单向ANOVA-Bonferroni’s多重比较检验，*p＜0.05和***p＜0.001。 n＝56-146个细胞。N＝6次实验。误差条表示SEM)。图4E是转染了 FLAG-Parkin cDNA和ParkinshRNA表达构建体的HEK-293细胞裂解物的免疫印迹。共转染PSD-95-FLAG作为对照。图4F是转染了PINK1-GFP cDNA和PINK shRNA构建体的HEK-293细胞裂解物的免疫印迹。共转染PSD-95-FLAG作为对照。图4G显示在转染了表达所示的shRNAs的腺伴随病毒的培养的海马神经元中内源性Parkin的免疫印迹。图4H显示在转染了表达所示的shRNAs的腺伴随病毒的培养的海马神经元中的内源性PINK1的免疫印迹。图4I显示在转染了GFP-Parkin(或GFP作为对照)的神经元中的mt-Keima成像。刻度条为5μm。图4J是显示来自图4I的线粒体自噬指数的量化的图(通过斯氏t检验，p＝0.52。n＝61-67 个细胞。N＝3次实验。误差条表示SEM)。
图5A显示在转染了USP30-FLAG或USP30-C77S-FLAG的神经元中的mt-Keima成像。刻度条为5μm。图5B显示转染了所示的cDNA和 shRNA构建体的HEK-293细胞裂解物的免疫印迹。共转染PSD-95-FLAG 作为对照。图5C显示在转染了表达USP30 shRNA的腺伴随病毒颗粒的培养的海马神经元中的内源性USP30的免疫印迹。图5D显示在转染了大鼠USP30 shRNA和人USP30 cDNA表达构建体的神经元中的 mt-Keima成像(萤光素酶shRNA和β-Gal作为对照)。刻度条为5μm。图5E是显示来自图5A的线粒体自噬指数的量化的图(通过单向ANOVA -Bonferroni’s多重比较检验，***p＜0.001。43-122个细胞。N＝6次实验。误差条表示SEM)。图5F是显示来自图5B的线粒体自噬指数的量化的图(通过单向ANOVA-Dunnett’s多重比较检验，**p＜0.01和***p＜0.001。n＝96-101个细胞。N＝4次实验。误差条表示SEM)。
图6A显示在转染了HA-遍在蛋白和所示的构建体的母代HEK-293 细胞系(其缺乏GFP-Parkin)中关于内源性MIRO和Tom20的抗-HA-免疫沉淀的免疫印迹。表达24小时后，细胞用CCCP(5μM，2小时)处理，并且用抗-HA珠子免疫沉淀遍在蛋白化的蛋白。用所示的抗体显示免疫沉淀和输入物的印迹。图6B显示用USP30敲倒对内源性MIRO和Tom20 的抗-HA-免疫沉淀的免疫印迹。将表达GFP-Parkin的稳定的HEK-293细胞转染HA-遍在蛋白和所示的shRNA和cDNA表达构建体。表达6天后，如图6A处理细胞。图6C和E显示来自转染了所示的HA-标记的遍在蛋白突变体并用CCCP(20μM，2小时)处理的细胞的内源性Miro和Tom20 的抗-HA-免疫沉淀的免疫印迹。图6D和F显示来自(C)和(E)的免疫印迹信号的量化。相对于野生型遍在蛋白报告由遍在蛋白突变体提供的遍在蛋白化的量(与‘野生型HA-遍在蛋白+CCCP’组相比，**p＜0.01和 ***p＜0.001，使用单向ANOVA与Dunnett’s多重比较检验进行。δ表示***p＜0.001)。图6G显示转染了所示的FLAG-标记的USP30构建体并用 CCCP(5μM，1-6小时)处理的GFP-Parkin HEK-293稳定细胞裂解物的免疫印迹。图6H是显示针对图6G中所示的肌动蛋白标准化的免疫印迹信号的量化的图(与β-Gal对照相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，使用两向ANOVA与Bonferroni’s多重比较检验。关于所有其他蛋白(VDAC， Mfn-1，Tom70，Hsp60)的免疫印迹信号没有达到显著性。N＝3-5次实验)。
图7A显示用USP30过量表达对内源性MIRO和Tom20的抗-HA-免疫沉淀的免疫印迹。将稳定表达GFP-Parkin的HEK-293细胞转染HA- 遍在蛋白和所示的构建体。在表达24小时后，细胞用CCCP(5μM，2小时)处理，并且用抗-HA珠子免疫沉淀遍在蛋白化的蛋白。用所示的抗体显示免疫沉淀和输入物的印迹。图7B是显示来自图7A的共-IP化的MIRO 的免疫印迹信号的量化的图。图7C是显示来自图7A的共-IP化的Tom20 的免疫印迹信号的量化的图。将用抗-HA珠子共沉淀的蛋白水平针对‘β-Gal+CCCP’组标准化(与β-Gal+CCCP相比，通过单向ANOVA- Dunnett’s多重比较检验，*p＜0.05，**p＜0.01和***p＜0.001。N＝3-5次实验。误差条表示SEM)。图7D显示用USP30敲倒对内源性MIRO和T0m20 的抗-HA免疫沉淀的免疫印迹。将表达GFP-Parkin的稳定的HEK-293细胞转染HA-遍在蛋白和所示的shRNA质粒。表达6天后，如图7A处理细胞。图7E是显示来自图7D的关于共-IP化的MIRO的免疫印迹信号的量化的图。图7F是显示来自图7D的关于共-IP化的Tom20的免疫印迹信号的量化的图。用抗-HA珠子共沉淀的蛋白水平针对‘萤光素酶shRNA +CCCP’组标准化(与‘萤光素酶shRNA+CCCP’相比，通过单向ANOVA -Dunnett’s多重比较检验，*p＜0.05，**p＜0.01和***p＜0.001。N＝4-6次实验。误差条表示SEM)。
图8A显示来自转染了所示的构建体的GFP-Parkin HEK-293细胞的 HA-遍在蛋白沉淀的免疫印迹。转染并用CCCP(5μM，2小时)处理后，用抗-HA珠子免疫沉淀遍在蛋白化的蛋白，并且用所示的抗体免疫印迹沉淀和输入物。图8B显示在转染了Tom20-myc和USP30构建体(β-Gal 作为对照)的神经元中的mt-Keima成像。刻度条为5μm。图8C显示在转染了USP30 shRNA和MIRO cDNA构建体(萤光素酶RNAi和β-Gal 作为对照)的神经元中的mt-Keima成像。刻度条为5μm。图8D是显示来自图8B的线粒体自噬指数的量化的图(通过单向ANOVA-Dunnett’s 多重比较检验，***p＜0.001。对于所有组，n＝67-80个细胞。N＝3次实验。误差条表示SEM)。图8E是显示来自图8C的线粒体自噬指数的量化的图(通过单向ANOVA-Bonferroni’s多重比较检验，*p＜0.05和***p＜0.001。对于所有组，n＝72-75个细胞。N＝3次实验。误差条表示SEM)。
图9A显示在USP30敲倒实验中与由Tom20鉴定的K-GG肽相对应的萃取离子色谱(extracted ion chromatograms)。相对于最丰富的分析，其前体离子m/z表示高于每个峰，在y轴上显示每种遍在蛋白化肽的相对丰度。每种K-GG肽的序列在下方显示为绿色。星号表示修饰的赖氨酸残基。图9B显示在Parkin过表达实验中与由USP30鉴定的K-GG肽相对应的萃取离子色谱。数据以与(A)相似的方式表示。图9C显示来自转染了野生型、K161N和G430DGFP-Parkin构建体的细胞的内源性USP30 的抗-HA-免疫沉淀的免疫印迹。表达24小时后，细胞用CCCP(20μM，2 小时)处理，并且用抗-HA珠子免疫沉淀遍在蛋白化的蛋白。用所示的抗体显示免疫沉淀和输入物的印迹。图9D显示来自(C)的共IP化的USP30 的免疫印迹信号的量化。将用抗-HA珠子共沉淀的蛋白水平针对‘野生型GFP-Parkin+CCCP’组标准化。(与‘野生型GFP-Parkin+CCCP’相比，通过单向ANOVA-Dunnett’s多重比较检验，***p＜0.001。N＝4次实验。误差条表示S.E.M.)。图9E显示由转染了所示的GFP和GFP-Parkin 构建体并用CCCP(20μM)处理的HEK-293细胞制备的裂解物的免疫印迹。图9F显示来自(E)的针对肌动蛋白标准化的关于USP30的免疫印迹信号的量化。(与野生型GFP-Parkin比较，使用两向ANOVA与 Bonferroni’s多重比较检验，**p＜0.01，***p＜0.001。N＝4次实验。误差条表示S.E.M.)。
图10A显示在转染了所示的siRNAs和cDNA表达构建体的表达 GFP-Parkin-G430D的稳定SH-SY5Y细胞中的免疫染色。在表达3天后，细胞用CCCP(20μM，24小时)处理，固定，并针对GFP、FLAG和内源性Tom20染色。刻度条为5μm。图10B是显示来自图10A的Tom20荧光强度的量化的图(通过单向ANOVA-Dunnett’s多重比较检验， ***p＜0.001，误差条表示SEM)。图10C是显示来自图10A的 GFP-Parkin-G430D点纹面积的量化的图(通过单向ANOVA-Dunnett’s 多重比较检验，***p＜0.001，误差条表示SEM)。图10D显示在转染了 ParkinshRNA和USP30-C77A-FLAG的神经元中的mt-Keima成像。刻度条为5μm。图10E是显示来自图10D的线粒体自噬指数的量化的图(通过单向ANOVA-Dunnett’s多重比较检验，***p＜0.001。N＝71-77个细胞。 N＝3次实验。误差条表示SEM)。
图11A显示在转染USP30 siRNA 3天的SH-SY5Y细胞中内源性 USP30的免疫印迹。图11B和11C显示在转染了所示的siRNAs的表达 GFP-Parkin-G430D的稳定的SH-SY5Y细胞中的免疫染色。敲倒3天后，细胞用CCCP(20μM，24小时)处理，固定，并针对GFP和内源性Tom20 染色。刻度条为5μm。图11D是显示来自图11B和11C针对对照siRNA 标准化的Tom20染色强度的倍数变化的量化的图(通过单向ANOVA- DunneU’s多重比较检验，***p＜0.001。误差条表示SEM)。图11E和11F显示转染了USP30 siRNA的表达GFP-Parkin-G430D(E)和表达GFP-Parkin-K161N(F)的SH-SY5Y细胞的免疫染色。敲倒3天后，细胞用CCCP(20μM，24小时)处理，固定，并针对GFP和内源性Tom20与 HSP60染色。刻度条为5μm。图11G和11H是显示来自图11E和11F针对对照siRNA标准化的Tom20(G)和HSP60(H)染色强度的倍数变化的量化的图。(通过斯氏t检验，*p＜0.05，**p＜0.01和***＜0.001。N＝2-3次实验。误差条表示S.E.M.)。
图12A显示来自野生型、parkin突变体(park25)和“parkin突变体； dUSP30敲倒”(park25；Actin-GAL4＞UAS-dUSP30RNAi)果蝇(flies)的间接飞行肌(IFMs)的横截面。电子致密的线粒体用箭头标记。具有减少的和无组织的嵴(cristae)的线粒体(由此在外观上是苍白的)用虚线表示 (上图-刻度条为1μm)。下图中显示更高放大倍数的图像(刻度条为 0.2μm)。图12B和C显示来自(A)的线粒体完整性的量化。相对于总线粒体面积的含有无组织的嵴的线粒体的面积百分数(B)和含有无组织的线粒体的肌肉面积的百分数(C)进行不知情的定量。(与野生型比较，通过两向ANOVA-Bonferroni’s多重比较检验，*p＜0.05，**p＜0.01和***p＜0.001。对于park25相对于park25，***p＜0.001；肌动蛋白-GAL4＞UAS-dUSP30RNAi。每只果蝇34-35个成像视野，N＝3-4只苍蝇。误差条表示S.E.M.)。图12D和E显示dUSP30敲倒和百草枯对果蝇(Drosophila)的爬行测定的影响。对于所示的基因型，用赋形剂(5％蔗糖)或百草枯(10mM，48小时)处理，在30秒内爬行＞15cm的果蝇的百分数。(通过单向ANOVA与Bonferroni’s多重比较检验，**p＜0.01和***p＜0.001。N＝4-10次实验。误差条表示S.E.M.)。图12F显示对于所示的基因型通过ELISA确定的每只果蝇头的多巴胺神经递质水平。(通过单向ANOVA-Bonferroni’s多重比较检验，*p＜0.05和***p＜0.001。n＝28个头/基因型。N＝4次实验。误差条表示S.E.M.)。图12G和H显示dUSP30敲倒和百草枯对果蝇存活的影响。对于所示的基因型，用赋形剂或百草枯(10mM，多至96小时)处理，仍然存活的果蝇的百分数。(利用两向ANOVA与Bonferroni’s多重比较检验，**p＜0.01和***p＜0.001。N＝3次(G)和4次(H)实验。误差条表示S.E.M.)。
图13显示不对称的“火山图”，显示在USP30敲倒(左边)和 GFP-Parkin过表达(右边)两个实验中，相对于单独的CCCP-处理，对于“组合”处理，其遍在蛋白化显著增加的41种蛋白的子集(p＜0.05)。在所述两个实验中，“组合”分别是指用CCCP处理并且表达 USP30-shRNA的细胞或用CCCP处理并且表达GFP-Parkin的细胞。对于该蛋白子集，报道了遍在蛋白化的倍数增加(x轴)和p-值(y-轴)。线粒体蛋白(基于人MitoCarta数据库鉴定)用红色显示。
图14显示抑制性肽USP30_3(“pep3”；SEQ ID NO：1)和USP30_8 (“pep8”；SEQ IDNO：2)对各种肽酶的抑制，所述肽酶包括USP30，如实施例10中所述。
图15显示关于USP30_3以及某些亲和力成熟的肽的肽位置的残基概率、以及信号与噪声比率(“S/N”)、ELISA信号(“信号”)、每种序列的克隆数(“n”)、克隆总数(“总数”)和特有序列的数目(“Uniq”)的图表，如实施例10中所述。
图16显示关于USP30_3和三种亲和力成熟的肽的信号与噪声比率的图表，如实施例10中所述。对于每种肽，测试的靶标从左至右为USP2， USP7，USP14，USP30，UCHL1，UCHL3和UCHL5。每种肽的序列显示在下方。
图17A显示在转染了USP30 shRNA的海马神经元中的参比 mito-roGFP成像。“相对氧化指数”以‘颜色刻度’从0(1mM DTT处理后的mito-roGFP比率，以黑色显示)至1(在100μMaldrithiol处理后的 mito-roGFP比率，以红色显示)显示。图17B是显示来自图17A的相对氧化性的量化的图(通过斯氏t检验，***p＜0.001。n＝24个细胞(关于萤光素酶shRNA)和36个细胞(关于USP30 shRNA)。N＝3次实验。误差条表示SEM)。图17C显示dUSP30mRNA的定量性RT-PCR。在肌动蛋白-GAL4、UAS-dUSP30RN4i和肌动蛋白-GAL4＞UAS-dUSP30RNAi果蝇中的qRT-PCR相对于肌动蛋白-GAL4进行表示。每组中dUSP30mRNA水平针对果蝇RpII140mRNA水平标准化。N＝7次实验。通过单向ANOVA 与Bonferroni’s多重比较检验，***p＜0.001。图17D显示在对照果蝇(肌动蛋白-GAL4)中的爬行测定。果蝇用赋形剂对照(5％蔗糖)或百草枯(10mM，48小时)处理。如所示，L-DOPA(1mM，48小时)与百草枯同时施用。 (通过单向ANOVA-Dunnett’s多重比较检验，***p＜0.001。N＝6次实验。误差条表示S.E.M.)。图17E显示每只果蝇头通过ELISA测定的5-羟色胺(serotonin)水平。果蝇用百草枯(10mM，48小时)或赋形剂对照(5％蔗糖)处理。(通过单向ANOVA-Bonferroni’s多重比较检验计算p-值。 n＝8个头，N＝2次实验。误差条表示S.E.M.)。图17F和G显示在所示基因型的果蝇中的(F)dUSP47和(G)dYOD1 mRNA水平的定量RT-PCR测量，相对于肌动蛋白-GAL4基因型进行表示。使用TaqMan测定 Dm01795269_g1(果蝇CG5486(USP47))和Dm01840115_s1(果蝇CG4603(YOD1))。使用Dm02134593_g1(RpII140)进行标准化。(使用单向 ANOVA-Dunnett’s多重比较检验，p**＜0.01和p***＜0.001。N＝3次重复。误差条表示S.E.M.)。图17H和I显示用赋形剂或百草枯(10mM)处理的所示基因型的果蝇的存活曲线。图表显示在喂饲百草枯后在所示的时间存活的果蝇的百分数。(使用两向ANOVA与Bonferroni’s多重比较检验， *p＜0.05，p**＜0.01和p***＜0.001。N＝5次(H)和4次(I)实验。误差条表示 S.E.M.)。
详述
本发明人已经鉴定了USP30，即定位线粒体的去遍在蛋白酶 (deubiquitinase，DUB)，作为Parkin-介导的线粒体自噬的拮抗剂 (atagonist)。USP30通过其去遍在蛋白酶活性抵消受损的线粒体的遍在蛋白化和降解，并且抑制USP30挽救由突变体Parkin引起的线粒体自噬缺陷。此外，USP30的USP30抑制减少氧化应激，并且提供针对线粒体毒素鱼藤酮的保护作用。由于受损的线粒体更可能积聚Parkin，因此， USP30抑制应该优先清除不健康的线粒体。除了神经元(如黑质神经元，其在帕金森病中特别易受线粒体功能障碍的影响)之外，长期代谢活性的细胞，如心肌细胞，也依赖于有效的线粒体质量控制系统。在这一情形中，已经表明Parkin通过响应缺血性应激而激活线粒体自噬并且清楚受损的线粒体来保护心肌细胞抵抗缺血/再灌注损伤。因此，为我们提供USP30 的抑制剂，用于治疗涉及线粒体缺陷的疾病，包括神经学病症、心脏病症和系统病症。
I.定义
“抑制剂”是指能够阻断、中和、抑制、取消、减少和/或干扰靶标的一种或多种活性和/或减少靶蛋白的表达(或编码所述靶蛋白的核酸的表达)的试剂。抑制剂包括，但不限于，抗体、多肽、肽、核酸分子、短干扰RNAs(siRNAs)和其他抑制性RNAs、小分子(例如，小的无机分子)、多糖、多核苷酸、反义寡核苷酸、适体和肽体。与没有用所述抑制剂处理的靶蛋白的表达和/或活性相比，抑制剂可以使靶蛋白的活性和/或表达减少至少10％(例如，减少至少15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％， 55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％或甚至100％)。
“USP30的抑制剂”指能够阻断、、中和、抑制、取消、减少和/或干扰USP30的一种或多种活性和/或减少USP30的表达(或编码USP30的核酸的表达)的试剂。在一些实施方案中，USP30的抑制剂减少USP30 的去遍在蛋白酶活性。在一些实施方案中，USP30的抑制剂使去遍在蛋白酶活性减少至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少 35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％或100％。去遍在蛋白酶活性可以通过抑制剂经由任意机制减少，所述机制包括，但不限于，干扰USP30的活性位点，干扰靶标识别，改变USP30的构象，干扰USP30的正确的亚细胞定位等等。在一些实施方案中，USP30的抑制剂抑制 USP30表达，其可以是mRNA(例如，其抑制USP30基因转录产生USP30 mRNA)和/或蛋白水平(例如，其抑制USP30mRNA翻译产生USP30 蛋白)的表达。在一些实施方案中，USP30表达的抑制剂使USP30蛋白水平减少至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％或100％。
术语“线粒体自噬”和“线粒体降解”可互换使用，指通过细胞的溶酶体机制的线粒体的调节的降解。
“涉及线粒体缺陷的病症”指涉及细胞群体中线粒体功能、线粒体形状/形态、线粒体膜电位和/或线粒体自噬中的一种缺陷或多种缺陷的病症。涉及线粒体缺陷的病症包括，但不限于，涉及线粒体自噬缺陷的病症，以致线粒体自噬在细胞群体中以比正常其他群体缓慢的速率发生或比正常细胞群体小的程度发生。在一些实施方案中，线粒体自噬的缺陷伴有其他线粒体缺陷，以使减少的线粒体自噬导致增加的缺陷性线粒体的存在。涉及线粒体缺陷的病症还包括，但不限于，涉及线粒体DNA突变的病症，所述突变导致改变的线粒体功能。涉及线粒体缺陷的病症还包括涉及线粒体氧化应激的病症，其中细胞中增加的活性氧(ROS)和/或活性氮(RNS)水平与蛋白聚集和/或线粒体功能障碍相关。线粒体氧化应激可能导致线粒体功能障碍，或者线粒体功能障碍可能导致氧化应激。涉及线粒体缺陷的病症还包括，但不限于，涉及线粒体形状/形态缺陷的病症和涉及线粒体膜电位缺陷的病症。示例性的涉及线粒体缺陷的病症包括，但不限于，神经变性疾病(如帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病、局部缺血、中风、具有雷维小体的痴呆症和额颞性痴呆症)；线粒体肌病、脑病、乳酸性酸中毒和卒中样发作(MELAS)综合征；莱伯遗传性视神经病(LHON)；神经病、共济失调、色素性视网膜炎-母系遗传的利氏综合征(NARP-MILS)；Danon病；肌阵挛型癫痫与破碎红纤维(MERFF) 综合征；引起心肌梗死的缺血性心脏病；多发性硫酸脂酶缺乏症(MSD)；粘脂质累积II(ML II)；粘脂质累积III(ML III)；粘脂质累积IV(MLIV)； GM1-神经节苷脂贮积病(GM1)；神经元蜡样脂-脂褐质沉积症(NCL1)；阿尔珀斯病；巴尔特综合征；β-氧化缺陷；肉碱-酰基-肉碱缺乏症；肉碱缺乏症；肌酸缺乏综合征；辅酶Q10缺乏症；复合物I缺乏症；复合物 II缺乏症；复合物III缺乏症；复合物IV缺乏症；复合物V缺乏症；COX 缺乏症；慢性进行性外侧眼肌麻痹(CPEO)；CPT I缺乏症；CPT II缺乏症； II型戊二酸尿症；卡恩斯-塞尔综合征；乳酸性酸中毒；长链酰基辅酶A 脱氢酶缺乏症(LCHAD)；利氏病或综合征；致死性幼儿心肌病(LIC)；勒夫特病；II型戊二酸尿症；中等链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(MCAD)；肌阵挛型癫痫与破碎红纤维(MERRF)综合征；线粒体隐性遗传的共济失调综合征；线粒体细胞病；线粒体DNA耗竭综合征；肌神经胃肠紊乱与脑病；皮尔逊综合征；丙酮酸羧化酶缺乏症；丙酮酸脱氢酶缺乏症；POLG 突变；中等链/短链3-羟基酰基-辅酶A脱氢酶(M/SCHAD)缺乏症；和非常长的长链酰基-辅酶A脱氢酶(VLCAD)缺乏症。
Parkin或PINK1中的“致病性突变”指各个蛋白或基因中的一种突变或多种突变，所述突变导致细胞中减少的活性，并且可能涉及功能丧失和/或功能获得(如显性的负突变，例如，Parkin Q311stop)。细胞中此类减少的活性可包括，但不限于，减少的酶活性(如减少的遍在蛋白化或激酶活性)，由于显性负突变体蛋白的存在而减少的活性，减少与另一只细胞因子的结合，由于亚细胞定位改变而减少的活性，和/或由于细胞中或细胞区室中减少的蛋白水平而减少的活性。在一些实施方案中，Parkin和 /或PINK1中的致病性突变导致减少的线粒体遍在蛋白化，这可能导致减少的线粒体自噬。致病性突变也可能在蛋白的编码区外发生，例如，发生在内含子(例如，影响剪接)、启动子、5’不翻译区、3’不翻译区等。此外，Parkin突变可以包括置换、缺失、插入、重复等，或这些的任意组合。 Parkin中的非限制性的示例性的致病性突变显示在表1中。PINK1蛋白中的非限制性的示例性的致病性突变显示在表2中。帕金森病突变的数据库是公众可获得的，如帕金森病突变数据库(ParkinsonDisease Mutation Database)，http：//www.molgen.ua.ac.be/PDmutDB/。
表1：Parkin(PARK2)中的示例性的致病性的突变
del＝缺失；dup＝重复；fs＝移码；ex＝外显子；IVS＝插入序列；prom＝启动子
表2：PINK1中的示例性的致病性的突变
Tyr258Stop IVS7+1G＞A ex6-8del Asp297fs
Trp437Stop Gly440Glu ex4-8del Arg492Stop
Thr313Met Glu239Stop ex3-8del Arg464His
Stop582Leu Gln456Stop delPINK1 Arg246Stop
Pro196fs Gln129Stop Cys92Phe Ala168Pro
Lys520fs Gln129fs Cvs549fs 23bp del ex7
Lys24fs ex7del Asp525fs
del＝缺失；fs＝移码；ex＝外显子
术语“氧化应激”指细胞中活性氧(ROS)和/或活性氮(RNS)增加。在一些实施方案中，氧化应激导致蛋白聚集和/或线粒体功能障碍。在一些实施方案中，线粒体功能障碍导致氧化应激。
除非另外指明，术语“USP30”用在本文中指来自任意脊椎动物来源的任意的天然的USP30(“遍在蛋白特异性肽酶30”或“遍在蛋白特异性蛋白酶30”)，所述脊椎动物来源包括哺乳动物，如灵长类(例如，人) 和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。该术语包括“全长的”未加工的USP30 以及由在细胞中加工产生的任意形式的USP30。该术语还包括天然存在的USP30变体，例如，剪接变体或等位基因变体。示例性的人USP30的氨基酸序列显示在SEQ IDNO：26(表4)中。
除非另外指明，术语“Parkin”用在本文中指来自任意脊椎动物来源的任意的天然的Parkin，所述脊椎动物来源包括哺乳动物，如灵长类(例如，人)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。该术语包括“全长的”未加工的Parkin以及由在细胞中加工产生的任意形式的Parkin。该术语还包括天然存在的Parkin变体，例如，剪接变体或等位基因变体。示例性的人Parkin的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：29(表4)中。
除非另外指明，术语“PINK1”用在本文中指来自任意脊椎动物来源的任意的天然的PINK1(PTEN-诱导的推定的激酶蛋白1)，所述脊椎动物来源包括哺乳动物，如灵长类(例如，人)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。该术语包括“全长的”未加工的PINK1以及由在细胞中加工产生的任意形式的PINK1。该术语还包括天然存在的PINK1变体，例如，剪接变体或等位基因变体。示例性的人PINK1的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：30(表4)中。
除非另外指明，术语“Tom20”用在本文中指来自任意脊椎动物来源的任意的天然的Tom20，所述脊椎动物来源包括哺乳动物，如灵长类(例如，人)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。该术语包括“全长的”未加工的Tom20以及由在细胞中加工产生的任意形式的Tom20。该术语还包括天然存在的Tom20变体，例如，剪接变体或等位基因变体。示例性的人Tom20的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：27(表4)中。
除非另外指明，术语“MIRO1”和“MIRO”用在本文中指来自任意脊椎动物来源的任意的天然的MIRO1(线粒体Rho GTP酶1)，所述脊椎动物来源包括哺乳动物，如灵长类(例如，人)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。该术语包括“全长的”未加工的MIRO1以及由在细胞中加工产生的任意形式的MIRO1。该术语还包括天然存在的MIRO1变体，例如，剪接变体或等位基因变体。示例性的人MIRO1的氨基酸序列显示在 SEQ ID NO：28(表4)中。
除非另外指明，术语“MUL1”用在本文中指来自任意脊椎动物来源的任意的天然的MUL1(NFκB的线粒体遍在蛋白连接酶激动剂)，所述脊椎动物来源包括哺乳动物，如灵长类(例如，人)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。该术语包括“全长的”未加工的MUL1以及由在细胞中加工产生的任意形式的MUL1。该术语还包括天然存在的MUL1变体，例如，剪接变体或等位基因变体。示例性的人MUL1的氨基酸序列显示在 SEQ ID NO：32(表4)中。
除非另外指明，术语“ASNS”用在本文中指来自任意脊椎动物来源的任意的天然的ASNS(天冬酰胺合成酶[谷氨酰胺水解])，所述脊椎动物来源包括哺乳动物，如灵长类(例如，人)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。该术语包括“全长的”未加工的ASNS以及由在细胞中加工产生的任意形式的ASNS。该术语还包括天然存在的ASNS变体，例如，剪接变体或等位基因变体。示例性的人ASNS的氨基酸序列显示在SEQ ID NO： 33(表4)中。
除非另外指明，术语“FKBP8”用在本文中指来自任意脊椎动物来源的任意的天然的FKBP8(FK506结合蛋白8)，所述脊椎动物来源包括哺乳动物，如灵长类(例如，人)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。该术语包括“全长的”未加工的FKBP8以及由在细胞中加工产生的任意形式的FKBP8。该术语还包括天然存在的FKBP8变体，例如，剪接变体或等位基因变体。示例性的人FKBP8的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：34 (表4)中。
除非另外指明，术语“TOM70”用在本文中指来自任意脊椎动物来源的任意的天然的TOM70(外膜70kDa亚基的易位酶)，所述脊椎动物来源包括哺乳动物，如灵长类(例如，人)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。该术语包括“全长的”未加工的TOM70以及由在细胞中加工产生的任意形式的TOM70。该术语还包括天然存在的TOM70变体，例如，剪接变体或等位基因变体。示例性的人TOM70的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：35(表4)中。
除非另外指明，术语“MAT2B”用在本文中指来自任意脊椎动物来源的任意的天然的MAT2B(甲硫氨酸腺苷转移酶2亚基β)，所述脊椎动物来源包括哺乳动物，如灵长类(例如，人)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。该术语包括“全长的”未加工的MAT2B以及由在细胞中加工产生的任意形式的MAT2B。该术语还包括天然存在的MAT2B变体，例如，剪接变体或等位基因变体。示例性的人MAT2B的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：36(表4)中。
除非另外指明，术语“PRDX3”用在本文中指来自任意脊椎动物来源的任意的天然的PRDX3(过氧化物氧还蛋白III)，所述脊椎动物来源包括哺乳动物，如灵长类(例如，人)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。该术语包括“全长的”未加工的PRDX3以及由在细胞中加工产生的任意形式的PRDX3。该术语还包括天然存在的PRDX3变体，例如，剪接变体或等位基因变体。示例性的人PRDX3的氨基酸序列显示在SEQ ID NO： 37(表4)中。
除非另外指明，术语“IDE”用在本文中指来自任意脊椎动物来源的任意的天然的IDE(胰岛素降解酶)，所述脊椎动物来源包括哺乳动物，如灵长类(例如，人)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。该术语包括“全长的”未加工的IDE以及由在细胞中加工产生的任意形式的IDE。该术语还包括天然存在的IDE变体，例如，剪接变体或等位基因变体。示例性的人IDE的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：38(表4)中。
除非另外指明，术语“VDAC1”用在本文中指来自任意脊椎动物来源的任意的天然的VDAC1(电压依赖性阴离子选择性通道蛋白1)，所述脊椎动物来源包括哺乳动物，如灵长类(例如，人)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。该术语包括“全长的”未加工的VDAC1以及由在细胞中加工产生的任意形式的VDAC1。该术语还包括天然存在的VDAC1变体，例如，剪接变体或等位基因变体。示例性的人VDAC1的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：39(表4)中。
除非另外指明，术语“VDAC2”用在本文中指来自任意脊椎动物来源的任意的天然的VDAC2(电压依赖性阴离子选择性通道蛋白2)，所述脊椎动物来源包括哺乳动物，如灵长类(例如，人)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。该术语包括“全长的”未加工的VDAC2以及由在细胞中加工产生的任意形式的VDAC2。该术语还包括天然存在的VDAC2变体，例如，剪接变体或等位基因变体。示例性的人VDAC2的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：44(表4)中。
除非另外指明，术语“VDAC3”用在本文中指来自任意脊椎动物来源的任意的天然的VDAC3(电压依赖性阴离子选择性通道蛋白3)，所述脊椎动物来源包括哺乳动物，如灵长类(例如，人)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。该术语包括“全长的”未加工的VDAC3以及由在细胞中加工产生的任意形式的VDAC3。该术语还包括天然存在的VDAC3变体，例如，剪接变体或等位基因变体。示例性的人VDAC3的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：45(表4)中。
除非另外指明，术语“IPO5”用在本文中指来自任意脊椎动物来源的任意的天然的IPO5(输入蛋白5)，所述脊椎动物来源包括哺乳动物，如灵长类(例如，人)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。该术语包括“全长的”未加工的IPO5以及由在细胞中加工产生的任意形式的IPO5。该术语还包括天然存在的IPO5变体，例如，剪接变体或等位基因变体。示例性的人IPO5的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：40(表4)中。
除非另外指明，术语“PTH2”用在本文中指来自任意脊椎动物来源的任意的天然的PTH2(肽酰-tRNA水解酶2，线粒体的)，所述脊椎动物来源包括哺乳动物，如灵长类(例如，人)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。该术语包括“全长的”未加工的PTH2以及由在细胞中加工产生的任意形式的PTH2。该术语还包括天然存在的PTH2变体，例如，剪接变体或等位基因变体。示例性的人PTH2的氨基酸序列显示在SEQ ID NO： 41(表4)中。
除非另外指明，术语“PSD13”用在本文中指来自任意脊椎动物来源的任意的天然的PSD13(26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基13)，所述脊椎动物来源包括哺乳动物，如灵长类(例如，人)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。该术语包括“全长的”未加工的PSD13以及由在细胞中加工产生的任意形式的PSD13。该术语还包括天然存在的PSD13变体，例如，剪接变体或等位基因变体。示例性的人PSD13的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：42(表4)中。
除非另外指明，术语“UBP13”用在本文中指来自任意脊椎动物来源的任意的天然的UBP13(遍在蛋白羧基末端水解酶13)，所述脊椎动物来源包括哺乳动物，如灵长类(例如，人)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。该术语包括“全长的”未加工的UBP13以及由在细胞中加工产生的任意形式的UBP13。该术语还包括天然存在的UBP13变体，例如，剪接变体或等位基因变体。示例性的人UBP13的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：43(表4)中。
术语“包装说明书”用于指通常包括在治疗产品的商品包装中的使用说明，其包含关于适应证、用法、剂量、给药、组合疗法、禁忌症的信息和/或关于使用这样的治疗产品的警告。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物，如猴)，兔以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
关于参比多肽序列的“氨基酸序列同一性百分数(％)”定义为在比对序列并在必要时引入缺口以获得最大的序列同一性百分数后，并且不认为任何保守性置换是序列同一性的一部分，候选序列中与参比多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。为了确定氨基酸序列同一性百分数的目的而进行的比对可以以本领域技术内的多种方式实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，如BLAST，BLAST-2，ALIGN或Megalign (DNASTAR)软件实现。本领域技术人员能够确定用于比对序列的适当的参数，包括实现在比较的序列的全长上的最大比对所需要的任何算法。然而，为了本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.编写，并且源代码已经提交美国版权局，Washington D.C.，20559进行使用者登记，登记为美国版权注册号TXU510087。ALIGN-2程序是公众可从加利福尼亚州南旧金山的Genentech，Inc.获得的，或可以由源代码进行汇编。 ALIGN-2程序应该汇编用于UNIX操作系统，包括数字UNIX V4.0D。所有的序列比较参数均由ALIGN-2程序设定并且不能改变。
在使用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情形中，给定的氨基酸序列 A针对、与或相对于给定的氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(其可以备选地表示为给定的氨基酸序列A具有或包含针对、与或相对于给定的氨基酸序列B的某种％氨基酸序列同一性)计算如下：
100×分数X/Y
其中X是在A和B的所述程序比对中由序列比对程序ALIGN-2评分为相同的匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。应该理解，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A针对B的％氨基酸序列同一性不等于B针对A的％氨基酸序列同一性。除非另外特别指明，本文所用的所有的％氨基酸序列同一性值如上一段落所述用ALIGN-2计算机程序获得。
术语“药物制剂”指这样的制剂，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
“药用载体”是指药物制剂中不同于活性成分的成分，其对受试者是无毒的。药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
用于本文时，“治疗(treatment)”(及其语法变化，如“治疗(treat)”或“正在治疗(treating)”)指在尝试改变被治疗的个体的天然进程中的临床干预，并且可以为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的理想效果包括但不限于防止疾病发生或复发，缓和症状，消除疾病的任何直接或间接病理学后果，防止转移，减少疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和症状缓解或改善的预后。在一些实施方案中，将本发明的抗体用于延缓疾病的发展或减缓疾病的进展。
与一种或多种其他的治疗剂“组合”给药包括同时(同时发生的)和以任意顺序的连续给药。
“有效量的”试剂，例如，药物制剂，是指在需要的剂量和时间阶段有效获得所需的治疗或预防结果的量。
术语“载体”当在本文中使用时是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为″表达载体”。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换地使用，并且是指其中引入外源核酸的细胞，包括所述细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的次数。后代在核酸含量上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括与在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变体后代。
II.组合物和方法
在各个方面中，本发明部分基于USP30的抑制剂和包括抑制USP30的治疗疾病和病症的方法。
A.示例性的USP30的抑制剂
本发明部分基于这样的发现：USP30活性和/或表达的抑制剂有效增加和/或恢复线粒体遍在蛋白化和线粒体自噬。在一些实施方案中，USP30 的抑制剂有效治疗神经变性疾病，如帕金森病，以及涉及线粒体缺陷的病症，如涉及线粒体自噬缺陷、线粒体DNA突变、线粒体氧化应激和/或溶酶体贮积缺陷的病症。
USP30的抑制剂包括USP30活性抑制剂和USP30表达抑制剂。非限制性的示例性的此类抑制剂包括反义寡核苷酸、短干扰RNAs(siRNAs)、抗体、肽、肽体、适体和小分子。在一些实施方案中，反义寡核苷酸或短的干扰RNAs(siRNAs)可以用来抑制USP30表达。在一些实施方案中，抗体、肽、肽体、适体和小分子可以用来抑制USP30活性。本文记载了USP30的抑制剂的一些非限制性的实例。其他的抑制剂可以使用本领域的标准方法进行鉴定，包括本文讨论的那些方法。
反义寡核苷酸
在一些实施方案中，提供与USP30mRNA和/或USP30前mRNA杂交的反义寡核苷酸。非限制性的示例性的编码USP30的人mRNA序列显示在 SEQ ID NO：30(表4)中。在一些实施方案中，反义寡核苷酸与USP30 mRNA和/或USP30前mRNA的区域杂交，并且引导其通过RNA酶H降解，所述RNA酶H分解双链的RNA/DNA杂化物。通过调控USP30mRNA和/或 USP30前mRNA的分解，反义寡核苷酸可以减少细胞中USP30蛋白的量 (即，可以抑制USP30的表达)。在一些实施方案中，反义寡核苷酸不通过RNA酶H调控降解，而是“阻断”mRNA的翻译，例如，通过干扰翻译机制结合或持续合成能力(processivity)，或“阻断”前mRNA的正确的剪接，例如，通过干扰剪接机制和/或剪接位点的可及性。在一些实施方案中，反义寡核苷酸可以通过不同于RNA酶H的机制调控mRNA和/或前 mRNA的降解。本文考虑反义寡核苷酸的任意抑制性机制。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸是10-500个核苷酸长，或10-400 个核苷酸长，或10-300个核苷酸长，或10-200个核苷酸长，或10-100个核苷酸长，或15-100个核苷酸长，或10-50个核苷酸长，或15-50个核苷酸长。在不同的实施方案中，反义寡核苷酸与USP30mRNA和/或前mRNA 包含至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个核苷酸的区域杂交。此外，在不同的实施方案中，反义寡核苷酸不需要与USP30 mRNA的区域和/或USP30前mRNA的区域100％互补，而是可以具有1个或多个错配。因此，在一些实施方案中，反义寡核苷酸与USP30mRNA的区域和/或USP30前mRNA的区域至少80％互补，至少85％互补，至少90％互补，至少95％互补或100％互补。在一些实施方案中，所述USP30mRNA 的区域或USP30前mRNA的区域至少是至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少 80个、至少90个或至少100个核苷酸长。
反义寡核苷酸可以包含对核苷间连接、糖结构部分和/或核碱基中的一个或多个的修饰。此外，核苷酸的序列可以被非核苷酸成分中断，和/ 或非核苷酸成分可以连接在所述寡核苷酸的一个末端或两个末端。
非限制性的示例性的核苷酸修饰包括糖修饰，其中在糖中普通存在的任意羟基可以被替代，例如，被膦酸酯基团(phosphonate groups)、磷酸基团替代，被标准的保护基团保护，或被活化以产生针对另外的核苷酸的另外的连接，或者可以缀合到固体支持物上。5′和3′末端OH可以被磷酸化或被1-20个碳原子的胺或有机封端基团结构部分置换。其他的羟基也可以被衍生为标准的保护基团。寡核苷酸还可以包含本领域通常已知的类似形式的核糖或脱氧核糖，包括，例如，2′-O-甲基-2′-O-烯丙基，2′-氟-或2′-叠氮基-核糖，碳环糖类似物，α-异头糖，差向异构糖，如阿拉伯糖，木糖或来苏糖，吡喃糖，呋喃糖，景天庚酮糖，无环类似物和无碱基核苷类似物，如甲基核苷。一个或多个磷酸二酯键可以被修饰的核苷间键替代。这些修饰的核苷间键包括，但不限于，这样的实施方案，其中磷酸被P(O)S (“硫代物”)、P(S)S(“二硫代物”)、(O)NR2(“酰胺化物”)、P(O)R、 P(O)OR’、CO或CH2(“formacetal”)替代，其中每个R或R’独立地为H或是取代的或未取代的任选含有醚(-O-)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或 araldyl的烷基(1-20C)。并非聚核苷酸中的所有键都需要是相同的。前述描述适用于本文引用的所有寡核苷酸，包括反义寡核苷酸和siRNA。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸中的一个或多个核苷间连接是硫代磷酸酯。在一些实施方案中，反义寡核苷酸中的一个或多个糖结构部分包含2’修饰，如2’-O-烷基(如2’-OMe)和2’-氟；或是二环糖结构部分(如 LNA)。非限制性的示例性的核碱基修饰包括5-甲基胞嘧啶。反义寡核苷酸可以在单个寡核苷酸内包含多于一种类型的修饰。即，作为非限制性的实例，反义寡核苷酸可以在同一寡核苷酸内包含2’-O烷基修饰，二环核苷酸，和硫代磷酸酯连接。在一些实施方案中，反义寡核苷酸是“gapmer”。 Gapmers包含用于调节RNA酶H分解的脱氧核糖核苷酸的中间区域，以及包含增加双链体的稳定性的修饰的糖结构部分的5’和3’“翼”。
反义寡核苷酸的设计和机制记述在，例如，van Roon-Mom等，Methods Mol.Biol.(分子生物学方法)，867：79-96(20120)；Prakash，Chem. Biodivers.，8：1616-1641(2011)；Yamamoto等，Future Med.Chem.(未来医药化学)，3：339-365(2011)；Chan等，Clin.Exper.Pharmacol.Physiol.(临床药理学生理学实验)，33：533-540(2006)；Kurreck等，Nucl.Acids Res.(核酸研究)，30：1911-1918(2002)；Kurreck，Eur.J.Biochem.(欧洲生物化学杂志)， 270：1628-1644(2003)；Geary，Expert Opin.Drug Metab.Toxicol.(药物代谢和毒物学专家观点)，5：381-391(2009)；“Designing Antisense Oligonucleotides(设计反义寡核苷酸)，”可由Integrated DNA Technologies 在线获得(2011)中。
短的干扰RNAs(siRNAs)
在一些实施方案中，用短的干扰RNA(siRNA)抑制USP30的表达。当用在本文中时，siRNAs与双链RNA(dsRNA)是同义的，并且包括在每个末端具有或不具有发夹结构的双链RNA寡聚物(还称为小发夹RNA，或 shRNA)。短的干扰RNA也称为小干扰RNAs，沉默RNAs，短的抑制性RNA 和/或小的抑制性RNAs，并且这些术语在本文中认为是等价的。
术语“短干扰RNA(siRNA)”是指干扰基因表达的小的双链RNAs。 siRNAs是RNA干扰的调节剂，所述RNA干扰是双链RNA沉默同源基因的过程。在一些实施方案中，siRNAs由两个形成双链体的长度约为15-25个核苷酸的单链RNAs组成，其可以包含单链突出端。在一些实施方案中， siRNAs由形成发夹结构的单个RNA组成，所述发夹结构包含长度可以为 15-25个核苷酸的双链部分，并且可以包含单链突出端。所述发夹siRNAs 可以称为短发夹RNA(shRNA)。酶复合物，例如，聚合酶对双链RNA的加工可以导致所述双链RNA分解而产生siRNAs。所述siRNAs的反义链被 RNA干扰(RNAi)沉默复合物用来引导mRNA分解，由此促进mRNA降解。为了用siRNAs沉默特定的基因，例如，在哺乳动物细胞中，选择碱基配对区域，以避免与不相关mRNA的可能的互补性。本领域中已经鉴定了 RNAi沉默复合物，诸如例如，Fire等，Nature(自然)391：806-811，1998和 McManus等，Nat.Rev.Genet.(自然遗传性综述)3(10)：737-747，2002。
在一些实施方案中，小干扰RNAs包含至少约10个-约200个核苷酸，包括至少约16个核苷酸，至少约17个核苷酸，至少约18个核苷酸，至少约 19个核苷酸，至少约20个核苷酸，至少约21个核苷酸，至少约22个核苷酸，至少约23个核苷酸，至少约24个核苷酸，至少约25个核苷酸，至少约26个核苷酸，至少约27个核苷酸，至少约28个核苷酸，至少约29个核苷酸，至少约30个核苷酸，至少约35个核苷酸，至少约40个核苷酸，至少约45个核苷酸，至少约50个核苷酸，至少约55个核苷酸，至少约60个核苷酸，至少约65个核苷酸，至少约70个核苷酸，至少约75个核苷酸，至少约80个核苷酸，至少约85个核苷酸，至少约90个核苷酸，至少约95个核苷酸，至少约 100个核苷酸，至少约110个核苷酸，至少约120个核苷酸，至少约130个核苷酸，至少约140个核苷酸，至少约150个核苷酸或多于150个核苷酸。在一些实施方案中，siRNA为10-200个核苷酸长，或10-100个核苷酸长，或 15-100个核苷酸长，或10-60个核苷酸长，或15-60个核苷酸长，或10-50个核苷酸长，或15-50个核苷酸长，或10-30个核苷酸长，或15-30个核苷酸长。在某些实施方案中，所述siRNA包含长度为约21个-约25个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方案中，所述siRNA分子是RNA与DNA的异双链体。
如同反义寡核苷酸，siRNAs可以包含对糖、核苷间连接和/或核碱基的修饰。本文中记载了适用于siRNAs的非限制性的示例性的修饰，并且其也记载在，例如，Peacock等，J.Org.Chem.(有机化学杂志)，76： 7295-7300(2011)；Bramsen等，Methods Mol.Biol.(分子生物学方法)，721：77-103(2011)；Pasternak等，Org.Biomol.Chem.(有机生物分子化学)，9： 3591-3597(2011)；Gaglione等，Mini Rev.Med.Chem.，10：578-595(2010)；Chernolovskaya等，Curr.Opin.Mol.7her.(现代分子治疗观点)，12：158-167 (2010)中。
用于抑制细胞中的USP30表达的方法包括将具有部分或完全双链特征的siRNA引入到所述细胞中。在一些实施方案中，siRNA包含与USP30 基因编码区或前mRNA中存在的核苷酸序列至少75％、至少80％、至少 85％、至少90％、至少95％或100％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，合成对USP30基因特异性的siRNA，并将其直接引入到受试者中。在其他实施方案中，所述siRNA可以配制为靶向递送系统的一部分，如靶标特异性脂质体，其特异性识别并且将siRNA递送至适当的组织或细胞类型。当将靶向的siRNA施用至受试者时，所述siRNA被递送至适当的细胞类型，由此增加所述细胞类型中siRNA的浓度。取决于所递送的siRNA的剂量，该方法可以提供部分或完全的USP30蛋白表达丧失。
在其他实施方案中，对适当的细胞或组织提供表达构建体，所述表达构建体包含编码对USP30基因特异性的siRNA的一条链或两条链的核酸。在这些实施方案中，编码所述siRNA的一条链或两条链的核酸可以处于组成型或调节型启动子的控制下。在一些实施方案中，所述核酸编码形成发夹结构的siRNA，例如，shRNA。
例如，在Seth等，Ther.Deliv.(治疗递送)，3：245-261(2012)；Kanasty 等，Mol.Ther.(分子治疗)，20：513-524(2012)；Methods Enzymol.(酶学方法)，502：91-122(2012)；Vader等，Curr.Top.Med.Chem.(现代高级医药化学)，12：108-119(2012)；Naeye等，Curr.Top.Med.Chem.(现代高级医药化学)，12：89-96(2012)；Foged，Curr.Top.Med.Chem.(现代高级医药化学)， 12：97-107(2012)；Chaturvedi等，Expert Opin.Drug Deliv.(药物递送专家观点)，8：1455-1468(2011)；Gao等，Int.J.Nanomed.(国际纳米医学杂志)，6：1017-1025(2011)；Shegokar等，Pharmazie.，66：313-318(2011)；Kumari等， ExpertOpin.Drug Deliv.(药物递送专家观点)，11：1327-1339(2011)中记载了用于siRNAs的多种载体和药物递送系统。
抗体
在一些实施方案中，USP30的抑制剂是抗体。术语“抗体”在本文中以最广泛的意义应用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于，单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要其展现出需要的抗原结合活性即可。术语“抗体”用在本文中是指包含至少重链的互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3和至少轻链的CDR1、 CDR2和CDR3，其中所述分子能够结合抗原。术语抗体包括但不限于，能够结合抗原的片段，如Fv、单链Fv(scFv)、Fab、Fab’和(Fab’)2。术语抗体还包括但不限于，嵌合抗体，人源化抗体和各种物种如小鼠、人、食蟹猴等的抗体。
在一些实施方案中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，它们中的一个或两个包含或不包含各自的恒定区。重链可变区包含重链CDR1，构架 (FR)2，CDR2，FR3和CDR3。在一些实施方案中，重链可变区还包含至少FR1的一部分，其在CDR1的N端，和/或至少FR4的一部分，其在CDR3 的C端。类似地，轻链可变区包含轻链CDR1，构架(FR)2，CDR2，FR3 和CDR3。在一些实施方案中，轻链可变区还包含FR1和/或FR4。
非限制性示例性的重链恒定区包括γ，δ和α。非限制性示例性的重链恒定区还包括ε和μ。每个重链恒定区对应一种抗体同种型。例如，包含γ恒定区的抗体是IgG抗体，包含δ恒定区的抗体是IgD抗体，包含α恒定区的抗体是IgA抗体。某些同种型可以进一步细分成亚类。例如，IgG抗体包括但不限于，IgG1(包含γ1恒定区)，IgG2(包含γ2恒定区)，IgG3(包含γ3恒定区)和IgG4(包含γ4恒定区)抗体。非限制性示例性的轻链恒定区包括λ和κ。
在一些实施方案中，抗体是嵌合抗体，其包含至少一个来自第一物种 (如小鼠、大鼠、食蟹猴等)的可变区和至少一个来自第二物种(如人、食蟹猴、鸡等)的恒定区。如果存在的话，嵌合抗体的人恒定区不需要与其替代的非人恒定区是相同同种型的。例如，美国专利号4,816,567；和 Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)81：6851-55 (1984)中讨论了嵌合抗体。
在一些实施方案中，抗体是人源化抗体，其中在非人可变区(如小鼠、大鼠、食蟹猴、鸡等)的构架区中的至少一个氨基酸已被来自人可变区的相应的氨基酸替代。在一些实施方案中，人源化抗体包含至少一个人恒定区或其片段。在一些实施方案中，人源化抗体是Fab，scFv，(Fab’)2等。示例性的人源化抗体包括CDR-移接的抗体，其中第一(非人)物种的互补决定区(CDRs)已经移接到第二(人)物种的构架区(FRs)上。由于人源化抗体减少或消除针对非人抗体的人免疫应答(如人抗-小鼠抗体(HAMA) 应答)，这种免疫应答可能导致针对抗体治疗剂的免疫应答，并且减少所述治疗剂的效力，因此，人源化抗体可用作治疗分子。抗体可以通过任何方法而被人源化。非限制性的示例性的人源化方法包括，例如，记述在美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762；6,180,370；Jones等， Nature(自然)321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature(自然)332：323-27 (1988)；Verhoeyen等，Science(科学)239：1534-36(1988)；和美国公布号 US 2009/0136500中的方法。
在一些实施方案中，抗体是人抗体，如在包含人免疫球蛋白基因的非人动物中产生的抗体，如和使用体外方法选择的抗体，如噬菌体展示法，其中抗体所有成员是基于人免疫球蛋白序列的。例如，在 Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)90：2551-55 (1993)；Jakobovits等，Nature(自然)362：255-8(1993)；Lonberg等，Nature (自然)368：856-9(1994)；和美国专利号5,545,807；6,713,610；6,673,986； 6,162,963；5,545,807；6,300,129；6,255,458；5,877,397；5,874,299；和 5,545,806中记载了包含人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠及其在制备人抗体中的应用。使用噬菌体展示文库制备人抗体的方法记述在，例如， Hoogenboom等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)227：381-8(1992)；Marks 等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)222：581-97(1991)；和PCT公布号WO 99/10494中。
重链恒定区的选择能够决定抗体是否在体内具有效应子功能。在一些实施方案中，所述效应子功能包括抗体-依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC)和/或补体-依赖性细胞毒性(CDC)，并且能够导致对所述抗体所结合的细胞的杀伤。典型地，包含人IgG1或IgG3重链的抗体具有效应子功能。在一些实施方案中，效应子功能不是合乎需要的。在一些此类实施方案中，可以选择或改造人IgG4或IgG2重链恒定区。
肽
在一些实施方案中，USP30的抑制剂是肽。肽是由通过肽键连接的D- 或L-氨基酸或D-与L-氨基酸的混合物的单链组成的氨基酸序列。肽的氨基酸亚基可以是天然存在的氨基酸或可以是非天然存在的氨基酸。本领域中已知多种非天然存在的氨基酸，并且其是可商业获得的。此外，连接氨基酸亚基的肽键可以进行修饰。参见，例如，Sigma-Aldrich；Gentilucci等， Curr.Pharm.Des.16：3185-3203(2010)；US 2008/0318838。通常，肽包含至少两个氨基酸残基，并且长度少于约50个氨基酸。在不同的实施方案中，肽抑制剂可以包含或由3-50个、5-50个、10-50个、10-40个、10-35个、10-30 个或10-25个氨基酸组成。在不同的实施方案中，肽抑制剂可以包含10，11， 12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24或25个氨基酸。在不同的实施方案中，肽抑制剂可以由10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23， 24或25个氨基酸组成。
开发特异性结合靶分子的肽的方法在本领域中是已知的，包括噬菌体展示法。例如，参见美国专利号No.5,010,175；WO 1996/023899；WO 1998/015833；Bratkovic，Cell.Mol.Life Sci.(细胞分子生命科学)，67： 749-767(2010)；Pande等，Biotech.Adv.(生物技术进展)28：849-858(2010)。在一些实施方案中，在选择肽之后，可以对所述肽进行修饰，例如，通过结合非天然氨基酸和/或肽键。本文记述了非限制性示例性的选择USP30的肽抑制剂的方法。
在一些实施方案中，可以通过丙氨酸扫描诱变来确定对肽抑制重要的氨基酸。每个残基依次用单个氨基酸替换，典型地用丙氨酸替换，并且评估对USP30抑制的作用，例如，参见美国专利号5,580,723和5,834,250。也可以利用截短分析，不仅确定在肽末端的氨基酸对抑制性活性的重要性，还确定肽长度对抑制性活性的重要性。在一些情形中，截短分析可以揭示比亲本肽更紧密结合的较短的肽。不同突变分析的结果，如丙氨酸扫描诱变和截短分析的结果，可以用来获知对抑制剂肽的进一步的修饰。
本文中记述了非限制性的示例性的肽抑制剂，例如，在实施例10和图 15中。在一些实施方案中，本领域技术人员应该理解，本文所述的肽序列可以进行修饰，以产生具有需要的特性的其他肽抑制剂，所述需要的特性如改善的针对USP30的特异性，对USP30的更强的结合，改善的溶解性和 /或改善的细胞膜渗透性。在一些实施方案中，USP30的肽抑制剂包含与选自SEQ ID NOs：1-22的序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或 100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，肽抑制剂包含下述氨基酸序列：
X1X2CX3X4X5X6X7X8X9X10X11CX12(SEQ ID NO：48)
其中：
X1选自L，M，A，S和V；
X2选自Y，D，E，I，L，N和S；
X3选自F，I和Y；
X4选自F，I和Y；
X5选自D和E；
X6选自L，M，V和P；
X7选自S，N，D，A和T；
X8选自Y，D，F，N和W；
X9选自G，D和E；
X10选自Y和F；
X11选自L，V，M，Q和W；和
X12选自F，L，C，V和Y；
在一些实施方案中，所述肽以小于10μM的IC50抑制USP30。在一些实施方案中，X1选自L和M。在一些实施方案中，X3选自Y和D。在一些实施方案中，X3是F。在一些实施方案中，X4选自Y和F。在一些实施方案中，X4是Y。在一些实施方案中，X5是D。在一些实施方案中，X6选自 L和M。在一些实施方案中，X7选自S，N和D。在一些实施方案中，X8是 Y。在一些实施方案中，X9是G。在一些实施方案中，X10是Y。在一些实施方案中，X11是L。在一些实施方案中，X12选自F和L。在一些实施方案中，X12是F。
在一些实施方案中，肽抑制剂包含下述氨基酸序列：
XAX1X2CX3X4X5X6X7X8X9X10X11CX12XB(SEQ ID NO：49)
其中X1-X12如上文定义，并且XA和XB分别独立地是任意氨基酸。在一些实施方案中，XA选自S，A，T，E Q，D和R。在一些实施方案中，XB选自D， Y，E，H，S和I。
肽体
在一些实施方案中，USP30的抑制剂是肽体。肽体是连接到载体 (vehicle)上的肽序列。在一些实施方案中，所述肽体的载体部分减少所述肽的降解和/或增加半衰期，减少毒性，减少免疫原性，和/或增加生物活性。在一些实施方案中，所述肽体的载体部分是抗体Fc结构域。其他载体包括直链聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、聚赖氨酸、葡聚糖等)；支链聚合物(参见，例如，美国专利号4,289,872和美国专利号5,229,490；WO 1993/0021259)；脂质；胆固醇基团(如类固醇)；碳水化合物或寡糖；或任何天然的或合成的蛋白、多肽或肽载体。所述肽体的肽部分典型地结合在靶标上，例如，结合在USP30上。在一些实施方案中，所述肽体的肽部分是本文所述的肽。
在一些实施方案中，肽体保留抗体的某些需要的特征，如在血浆中的长的半衰期和对于结合配偶体的增加的亲和性(例如，由于Fc结构域的二聚体化导致)。例如，肽体的产生通常记述在WO 2000/0024782和美国专利号6,660,843中。
适体
在一些实施方案中，USP30的抑制剂是适体。术语“适体”用在本文中是指特异性结合靶分子，如USP30的核酸分子。可以选择适体为高度特异性的、尺寸相对较小的和/或无免疫原性。例如，参见Ni，等，Curr.Med. Chem.(现代医药化学)18：4206(2011)。在一些实施方案中，适体是小 RNA、DNA或混合的RNA/DNA分子，其形成能够特异性结合并抑制 USP30的二级和/或三级结构。
在一些实施方案中，适体包含一个或多个修饰的核苷(例如，具有修饰的糖、修饰的核碱基和/或修饰的核苷间连接的核苷)，例如，所述修饰的核苷增加体内稳定性，增加靶标亲和性，增加溶解性，增加血清半衰期，增加对降解的耐受性，和/或增加膜渗透性等。在一些实施方案中，适体在其末端包含一个或多个修饰的或反向核苷酸，以防止末端降解，例如，防止外切核酸酶对末端的降解。
在本领域中充分确定了适体的产生和治疗性应用。例如，参见，美国专利号5,475,096。在一些实施方案中，适体通过利用指数富集(SELEX)系统性进化配体而产生，例如，如在Ellington等，Nature(自然)346：818 (1990)；和Tuerk等，Science(科学)249：505(1990)中所述。在一些实施方案中，适体通过AptaBid法产生，例如，如在Berezovski等，J.Am.Chem. Soc.(美国化学学会杂志)130：913(2008)中所述。缓慢解离速率的适体和选择此类适体的方法记述在，例如，Brody等，Expert Rev.Mol.Diagn.(分子诊断专家综述)，10：1013-22(2010)；和美国专利号7,964,356中。
小分子
在一些实施方案中，提供USP30的小分子抑制剂。在一些实施方案中，USP30的小分子抑制剂与USP30结合并且抑制USP30的酶活性(例如肽酶活性)和/或干扰USP30靶向结合和/或改变USP30构象，从而减少酶活性或靶向结合的功效。
“小分子”在本文中定义为具有低于约1000道尔顿的分子量，例如，低于约900道尔顿，低于约800道尔顿，低于约700道尔顿，低于约600道尔顿，或低于约500道尔顿。小分子可以是有机的或无机的，并且，例如，可以由化合物文库或天然来源分离，或者可以通过已知化合物的衍生而获得。
在一些实施方案中，通过筛选小分子文库而鉴定USP30的小分子抑制剂。小分子文库的产生和筛选在本领域中是公知的。例如，参见 Thompson等，Chem.Rev.(化学综述)96：555-600(1996)；和国立健康分子文库计划研究所(National Institutes of HealthMolecular Libraries Program)。例如，可以通过以多种组合混合一组化学结构单元而形成组合的化学文库，并且可以产生数百万中化学化合物。例如，100种可互换的化学结构单元的系统性、组合性混合理论上产生一亿种四聚体化合物或一百亿种五聚体化合物的合成。例如，参见Gallop等，1994，J.Med Chem. (医药化学杂志)37：1233-1250)。也可以设计并使用多种其他类型的小分子文库，例如，天然产物文库。小分子文库可以从多个商业出售商处获得。例如，参见ChemBridge，Enzo Life Sciences，Sigma-Aldrich，AMRI Global，等等。
在一些实施方案中，为了鉴定USP30的小分子抑制剂，可以使用本文所述的测定筛选小分子文库。在一些实施方案中，考虑抑制USP30的每种小分子的特征，以鉴定对所述小分子抑制剂共有的特征，其可以用来获知小分子的进一步的修饰。
在一些实施方案中，鉴定的一种或多种USP30的小分子抑制剂，例如，在初始文库筛选中鉴定的，可以用来产生包含所述初始小分子抑制剂的修饰的后续文库。利用这一方法，可以开发具有更大的USP30特异性(相对于其他DUBs)和/或更大的USP30结合亲和性和/或其他需要的特性，如低毒性、更大的溶解性、更大的细胞渗透性等的候选化合物的后续重复 (iterations)。
去遍在蛋白化酶的多种小分子抑制剂在本领域中是已知的，它们中的一些显示在表3中。
表3：遍在蛋白特异性蛋白酶的抑制剂
表3中所示的抑制剂和其中引用的参考文献以及本领域中已知的另外的抑制剂可以形成研发另外的去遍在蛋白化酶抑制剂的基础，包括USP30 的特异性抑制剂。还参见WO2007/009715。例如，本领域技术人员可以对上述结构中的任一种进行修饰，以形成推定的去遍在蛋白化酶抑制剂的文库，并且利用本文所述的测定筛选对USP30具有特异性的修饰的化合物。
B.测定
多种测定可以用于鉴定并且检测USP30的抑制剂。对于减少USP30蛋白表达的抑制剂，任何检测蛋白水平的测定都可以适于测量抑制。例如，蛋白水平可以通过使用结合USP30的抗体的多种免疫测定，如ELISA，蛋白质印迹，免疫组织化学等，进行检测。如果抑制剂影响USP30的亚细胞定位，例如，通过免疫组织化学，或通过细胞成分分级并用一种或多种抗体检测不同级分中的USP30水平，可以检测到亚细胞定位的变化。对于减少USP30mRNA水平的抑制剂，可以使用基于扩增的测定，如反转录PCR (RT-PCR)，来检测mRNA水平中的变化。
对于影响USP30酶活性的抑制剂，一种非限制性的示例性的测定如下：在USP30底物的存在下，使USP30与抑制剂或候选抑制剂接触。非限制性的示例性的USP30底物包括Ub-β-半乳糖苷酶融合蛋白(例如，参见， Quesada等，Biochem.Biophys.Res.Commun(生物化学生物物理研究通讯) 314：54-62(2004))，Ub4链(例如，Lys-48-和Lys-63-连接的Ub)，UBIQ基因翻译的线性产物；在单-或多-遍在蛋白化缀合物中的翻译后形成的支链肽键；由蛋白酶体介导的降解产生的遍在蛋白化的残余物，和其他小的酰胺或酯加合物。在USP30和抑制剂或候选抑制剂的存在下，测量USP30活性(例如，Ub底物的加工)。将该活性与存在USP30而无抑制剂或候选抑制剂时的Ub底物的加工进行比较。如果所述抑制剂或候选抑制剂抑制USP30的活性，则与存在USP30而无所述抑制剂或候选抑制剂时的UB底物加工相比较，UB底物加工的量将减少。
实施例10中记述了另一个非限制性的示例性的确定抑制和/或特异性的测定。简言之，将一定浓度范围的抑制剂与遍在蛋白-AMC和USP30混合(所述抑制剂可以与底物混合，然后加入USP30以起始反应)。如果确定特异性，可以用一种或多种另外的DUBs或遍在蛋白C端水解酶(UCHs) 替代USP30设立相似的反应。加入酶后立即监测荧光(340nm激发和465nm发射)。如实施例10所述计算初始酶活性速率。
C.药物制剂
本文所述的USP30的抑制剂的药物制剂通过将具有需要的纯度的所述抑制剂与一种或多种任选的药用载体混合而制备(Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药典)，第16版，Osol，A.Ed.(1980))，以冻干的制剂或水溶液的形式存在。药用载体通常在所用的剂量和浓度对接受者是无毒的，并且包括但不限于，缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如氯化十八烷基二甲基苄基铵)；氯化六甲双胺(hexamethonium chloride)；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚，丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间-甲酚)；低分子量 (小于约10个残基)多肽；蛋白，如血清白蛋白，明胶，或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖，和其他碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；成盐平衡离子，如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。本文中示例性的药用载体还包括药物间质分散剂，如可溶性中性-活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20( Baxter International，Inc.)。美国专利公布号2005/0260186和2006/0104968 中记载了某些示例性的sHASEGPs和使用方法，包括rHuPH20。在一个方面中，sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶(glycosaminoglycanases) 如软骨素酶组合。
本发明的制剂还可以包含多于一种所治疗的具体适应证所需要的活性成分，优选具有彼此没有不利影响的互补活性的那些成分。
活性成分可以截留在例如通过凝聚技术或通过界面聚合法制备的微胶囊中，例如，分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，截留在胶体药物递送系统中(例如，脂质体，白蛋白微胶囊，微乳液，纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗滴乳液中。此类技术公开在 Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药典)，第16版，Osol，A.Ed. (1980)中。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的适当的实例包括包含所述抑制剂的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质以定型制品的形式存在，例如，薄膜或微胶囊的形式。
要用于体内给药的制剂通常是无菌的。无菌性可以是容易地获得的，例如，通过无菌滤膜过滤而获得。
D.治疗方法和组合物
本文提供的任一种USP30的抑制剂都可以用于例如治疗方法的方法中。在一些实施方案中，提供增加细胞中的线粒体自噬的方法，所述方法包括在允许抑制所述细胞中的USP30的条件下使所述细胞与USP30的抑制剂接触。在一些实施方案中，提供增加细胞中的线粒体遍在蛋白化的方法，所述方法包括在允许抑制所述细胞中的USP30的条件下使所述细胞与 USP30的抑制剂接触。例如，增加的线粒体自噬可以使用实施例6所述的免疫荧光来确定。例如，增加的遍在蛋白化可以如实施例5所述通过胰蛋白酶消化后免疫亲和富集遍在蛋白化的肽然而质谱法来确定。在一些实施方案中，线粒体遍在蛋白化的增加可以通过将与USP30的抑制剂接触的细胞或细胞群体中的线粒体蛋白的遍在蛋白化与没有与USP30的抑制剂接触的匹配的细胞或细胞群体中的线粒体蛋白的遍在蛋白化进行比较而确定。
在一些实施方案中，增加的线粒体自噬意指与没有与抑制剂接触的匹配的细胞群体相比，在与USP30的抑制剂接触的细胞群体中，每个细胞的线粒体平均数量减少至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少 30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％或至少75％。在一些实施方案中，增加的线粒体遍在蛋白化意指，与没有与抑制剂接触的匹配的细胞或细胞群体相比，在与 USP30的抑制剂接触的细胞或细胞群体中的线粒体蛋白的整体遍在蛋白化增加至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少100％(即，2倍)，至少150％或至少200％ (即，3倍)。
在一些实施方案中，提供增加细胞中选自Tom20，MIRO，MUL1， ASNS，FKBP8，TOM70，MAT2B，PRDX3，IDE，VDAC，IPO5，PSD13， UBP13和PTH2的至少一种蛋白的遍在蛋白化的方法，所述方法包括在允许抑制所述细胞中的USP30的条件下使所述细胞与USP30的抑制剂接触。在一些此类实施方案中，在选自Tom 20的K56、K61和K68中的至少一个、至少两个或三个氨基酸的遍在蛋白化增加；和/或在选自MIRO的K153、 K187、K330、K427、K512、K535、K567和K572中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或八个氨基酸的遍在蛋白化增加。在一些此类实施方案中，在选自Tom 20的K56、K61 和K68中的至少一个、至少两个或三个氨基酸的遍在蛋白化增加；和/或在选自MIRO的K153、K187、K330、K427、K512、K535、K567和K572中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或八个氨基酸的遍在蛋白化增加；和/或在选自MUL1的K273、 K299和K52中的至少一个、至少两个或三个氨基酸的遍在蛋白化增加；和 /或在选自FKBP8的K249、K271、K273、K284、K307、K317、K334和K340 中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或八个氨基酸的遍在蛋白化增加；和/或在选自ASNS的K147、K168、K176、K221、K244、K275、K478、K504和K556中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个或九个氨基酸的遍在蛋白化增加；和/或选自TOM70的K78、 K120、K123、K126、K129、K148、K168、K170、K178、K185、K204、 K230、K233、K245、K275、K278、K312、K326、K349、K359、K441、 K463、K470、K471、K494、K501、K524、K536、K563、K570、K599、 K600和K604中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个氨基酸的遍在蛋白化增加；和/或在选自MAT2B的K209、K245、K316和K326中的至少一个、至少两个、至少三个或四个氨基酸的遍在蛋白化增加；和/或在选自PRDX3的K83、K91、K166、K241和K253中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或五个氨基酸的遍在蛋白化增加；和/或在选自IDE的 K558、K657、K854、K884、K929和K933中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或六个氨基酸的遍在蛋白化增加；和/或在选自VDAC1的K20、K53、K61、K109、K110、K266和K274的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或七个氨基酸的遍在蛋白化增加；和/或在选自VDAC2的K31、K64、K120、K121、K277 和K285中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或六个氨基酸的遍在蛋白化增加；和/或在选自VDAC3的K20、K53、K61、K109、 K110、K163、K266和K274中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或八个氨基酸的遍在蛋白化增加；和 /或在选自IPO5的K238、K353、K436、K437、K548、K556、K613、K678、 K690、K705、K775和K806中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个氨基酸的遍在蛋白化增加；和/或在选自PSD13的K2、K32、K99、K115、 K122、K132、K161、K186、K313、K321、K347、K350和K361中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个氨基酸的遍在蛋白化增加；和/或在选自UBP13的K18、K190、K259、K326、K328、K401、K405、K414、 K418、K435、K586、K587和K640中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个氨基酸的遍在蛋白化增加；和/或在选自PTH2的K47、K76、K81、 K95、K106、K119、K134、K171、K177中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个或九个氨基酸的遍在蛋白化增加。在一些实施方案中，当细胞与USP30的抑制剂接触时，一种或多种另外的蛋白的遍在蛋白化增加。在存在USP30的抑制剂时遍在蛋白化可能增加的非限制性的示例性的蛋白在附件A中列出，该附件通过引用结合在本文中。例如，靶蛋白的增加的遍在蛋白化可以如实施例5中所述，通过在胰蛋白酶消化后免疫亲和富集遍在蛋白化的肽，然后质谱检测进行确定。在一些实施方案中，遍在蛋白化的增加可以通过将与 USP30的抑制剂接触的细胞或细胞群体中靶蛋白的遍在蛋白化与没有与所述抑制剂接触的匹配的细胞或细胞群体中相同靶蛋白的遍在蛋白化进行比较而确定。
在一些实施方案中，增加的蛋白遍在蛋白化意指，与没有与抑制剂接触的匹配的细胞或细胞群体相比，在与USP30的抑制剂接触的细胞或细胞群体中蛋白的遍在蛋白化增加至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少100％(即，2 倍)，至少150％，或至少200％(即，3倍)。
在一些实施方案中，细胞处在氧化应激下。此外，在一些实施方案中，提供减少细胞中的氧化应激的方法，所述方法包括在允许抑制细胞中的USP30的条件下使所述细胞与USP30的抑制剂接触。
在前述任一种方法中，所述细胞可以包含Parkin中的致病性突变、 PINK1中的致病性突变或包含Parkin中的致病性突变与PINK1中的致病性突变。例如，Parkin和PINK1中的非限制性的示例性的致病性突变显示在本文的表1和表2中。
在一些实施方案中，所述细胞是神经元。在一些实施方案中，所述细胞是黑质神经元。在一些实施方案中，所述细胞是心脏的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是心肌细胞。在一些实施方案中，所述细胞是肌细胞。
在前述任一种方法的一些实施方案中，所述细胞包含在受试者中。在前述任一种方法的一些实施方案中，所述细胞可以是体外的或离体的。
在另一方面中，提供用作药物的USP30的抑制剂。在其他方面中，提供用于治疗方法中的USP30的抑制剂。在一些实施方案中，提供治疗受试者中涉及线粒体缺陷的病症的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的USP30的抑制剂。涉及线粒体缺陷的病症可以包括线粒体自噬缺陷，线粒体DNA中的一种或多种突变，线粒体氧化应激，线粒体形状/形态缺陷，线粒体膜电位缺陷和/或溶酶体贮积缺陷。非限制性的示例性的涉及线粒体缺陷的病症包括神经变性病；线粒体肌病、脑病、乳酸性酸中毒和卒中样发作(MELAS)综合征；莱伯遗传性视神经病(LHON)；神经病、共济失调、色素性视网膜炎-母系遗传的利氏综合征(NARP-MILS)；Danon 病；引起心肌梗死的缺血性心脏病；多发性硫酸脂酶缺乏症(MSD)；粘脂质累积II(ML II)；粘脂质累积III(ML III)；粘脂质累积IV(ML IV)；GM1- 神经节苷脂贮积病(GM1)；神经元蜡样脂-脂褐质沉积症(NCL1)；阿尔珀斯病；巴尔特综合征；β-氧化缺陷；肉碱-酰基-肉碱缺乏症；肉碱缺乏症；肌酸缺乏综合征；辅酶Q10缺乏症；复合物I缺乏症；复合物II缺乏症；复合物III缺乏症；复合物IV缺乏症；复合物V缺乏症；COX缺乏症；慢性进行性外侧眼肌麻痹(CPEO)；CPT I缺乏症；CPT II缺乏症；II型戊二酸尿症；卡恩斯-塞尔综合征；乳酸性酸中毒；长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症 (LCHAD)；利氏病或综合征；致死性幼儿心肌病(LIC)；勒夫特病；II型戊二酸尿症；中等链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(MCAD)；肌阵挛型癫痫与破碎红纤维(MERRF)综合征；线粒体隐性遗传的共济失调综合征；线粒体细胞病；线粒体DNA耗竭综合征；肌神经胃肠紊乱与脑病；皮尔逊综合征；丙酮酸羧化酶缺乏症；丙酮酸脱氢酶缺乏症；POLG突变；中等链/ 短链3-羟基酰基-辅酶A脱氢酶(M/SCHAD)缺乏症；和非常长的长链酰基- 辅酶A脱氢酶(VLCAD)缺乏症。非限制性的示例性的涉及线粒体缺陷的神经变性病包括帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化 (ALS)、局部缺血、中风、具有雷维小体的痴呆症和额颞性痴呆症。其他示例性的可能涉及线粒体缺陷的神经变性病包括，但不限于，颅内出血 (intracranial hemorrhage)，脑出血(cerebral hemorrhage)，三叉神经痛 (trigeminal neuralgia)，舌咽神经痛(glossopharyngeal neuralgia)，贝尔麻痹(Bell′s Palsy)，重症肌无力(myasthenia gravis)，肌营养不良症(musculardystrophy)，进行性肌萎缩(progressive muscular atrophy)，原发性侧索硬化(primarylateral sclerosis，PLS)，假性延髓麻痹(pseudobulbar palsy)，进行性延髓麻痹(progressive bulbar palsy)，脊髓性肌萎缩(spinal muscular atrophy)，遗传性肌萎缩(inherited muscular atrophy)，无脊椎动物盘综合征(invertebrate disk syndromes)，颈椎病(cervical spondylosis)，神经丛病症(plexus disorders)，胸廓出口破坏综合征(thoracic outlet destruction syndromes)，周围神经病(peripheral neuropathies)，prophyria，多系统萎缩(multiple system atrophy)，进行性核上麻痹(progressivesupranuclear palsy)，皮质基底节变性(corticobasal degeneration)，脱髓鞘病(demyelinating diseases)，吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barre syndrome)，多发性硬化病(multiple sclerosis)，进行性神经性腓骨肌萎缩病 (Charcot-Marie-Toothdisease)，朊病毒病(prion disease)，克-雅病(Creutzfeldt-Jakob disease)，格-施-沙综合征 (Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome，GSS)和家族致命性失眠症 (fatalfamilial insomnia)。在一些此类实施方案中，所述方法进一步包括给个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，如下文所述。
在一些实施方案中，提供USP30的抑制剂，用于制造或制备药物。在一些此类实施方案中，所述药物用于治疗涉及线粒体缺陷的病症，诸如例如，涉及线粒体自噬缺陷的病症，涉及线粒体DNA突变的病症，涉及线粒体氧化应激的病症，涉及线粒体形状/形态缺陷的病症，涉及线粒体膜电位缺陷的病症，和涉及溶酶体贮积缺陷的病症。在另一些实施方案中，所述药物用于治疗涉及线粒体缺陷的病症的方法中，所述方法包括给患有涉及线粒体缺陷的病症的个体施用有效量的所述药物。在一个此类实施方案中，所述方法还包括给个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，如下文所述。
本文任一实施方案所述的“个体”可以是人。
在另一方面中，提供包含本发明提供的任一种USP30的抑制剂的药物制剂，例如，用于上述任一种治疗方法中。在一个实施方案中，药物制剂包含本发明提供的任一种USP30的抑制剂和药用载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含本发明提供的任一种USP30的抑制剂和至少一种另外的治疗剂，例如，如下文所述。
USP30的抑制剂可以单独或与其他药剂组合用于治疗。例如，USP30 的抑制剂可以与至少一种另外的治疗剂共同给药。
可以与USP30的抑制剂组合的示例性的治疗剂，例如，用于治疗帕金森病，包括左旋多巴，多巴胺激动剂(如普拉克索(pramipexole)，罗匹尼罗(ropinirole)和阿扑吗啡(apomorphine))，单氨基加氧酶(MAO)B抑制剂(如司立吉林(selegiline)和雷沙吉兰(rasagiline))，儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)抑制剂(如恩他卡朋(entacapone)和托卡朋(tolcapone))，抗胆碱能药(如苯托品(benzotropine)和苯海索(trihexylphenidyl))和金刚烷胺。可以与USP30的抑制剂组合的其他示例性的治疗剂，例如，用于治疗肌萎缩侧索硬化，是利芦噻唑。可以与USP30的抑制剂组合的示例性的治疗剂，例如，用于治疗阿尔茨海默病，包括胆碱酯酶抑制剂(如多奈哌齐(donepezil)，利斯的明(rivastigmine)，加兰他敏(galantamine)和他克林(tacrine))和美金刚。可以与USP30的抑制剂组合的示例性的治疗剂，例如，用于治疗亨廷顿病，包括丁苯那嗪，抗精神病药(如氟哌啶醇 (haloperidol)和氯氮平(clozapine))，氯硝西泮，地西泮，抗抑郁药(如依他普仑(escitalopram)，氟西汀(fluoxetine)和舍曲林(sertraline))，和情绪稳定药(如锂)和抗惊厥药(如丙戊酸(valproic acid)，双丙戊酸钠(divalproex)和拉莫三嗪(lamotrigine))。
“组合”施用包括联合施用(其中两种以上的治疗剂包含在同一或分开的制剂中)和分开的制剂，在所述情形中，本发明的抑制剂的施用可以在另外的治疗剂和/或辅药的施用之前、同时和/或之后发生。在一些实施方案中，USP30的抑制剂的施用和另外的治疗剂的施用彼此在约一个月内，或在约一周、两周或三周内，或在约一天、两天、三天、四天、五天或六天内发生。本发明的抑制剂还可以与其他类型的疗法组合使用。
本发明的抑制剂(和任一种另外的治疗剂)可以通过任意适当的方式给药，包括口服、肠胃外、肺内、鼻内和病变内给药。肠胃外给药包括，但不限于，肌内、静脉内、动脉内、大脑内、脑室内、鞘内、眼内、腹膜内和皮下给药。本发明的抑制剂(和任一种另外的治疗剂)还可以使用植入的递送装置诸如例如，大脑内植入物给药。例如，在Pathan等， RecentPatents on Drug Delivery&Formulation，2009，3：71-89中总结了非限制性的示例性的中枢神经系统递送方法。部分根据用药是短期还是长期性而定，可通过任何适合途径，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射用药。本文中涵盖各种用药时程，包括，但不限于，单次给药或在多个时间点多次给药、推注给药及脉冲输注。
本发明的抑制剂将以与良好医疗实践相一致的方式配制、给药和施用。在该背景下考虑的因素包括待治疗的具体病症、待治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状态、病症的原因、递送药剂的位点、给药方法、给药时间安排和医疗从业者已知的其他因素。所述抑制剂不需要，但任选地，与目前用于预防或治疗待讨论病症的一种或多种药剂一起配制。所述其他药剂的有效量取决于制剂中存在的抑制剂的量、病症或治疗的类型和以上讨论的其他因素。这些一般以相同剂量，并使用如本文中所述的给药途径，或以本文中所述的剂量的约1-99％，或以通过经验/临床确定合适的任意剂量和任何途径来使用。
为了预防或治疗疾病，USP30的抑制剂的合适剂量(当单独或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、抑制剂的类型、疾病的严重性和进程、所述抑制剂是以预防目的施用还是以治疗目的施用、以前的治疗、患者的临床病史和对所述抑制剂的应答，和主治医师的判断力。所述抑制剂以一次治疗或经过一系列治疗合适地施用于患者。根据疾病的类型和严重性，约1μg/kg-15mg/kg(例如 0.1mg/kg-10mg/kg)的抑制剂可以是用于向患者施用的最初候选剂量，无论，例如，通过一次或多次分别施药，或通过连续输注。一个典型的每日剂量可以在约1μg/kg-100mg/kg或更多的范围内，其取决于上文提及的因素。为了重复施用数日或更长，根据病症，通常将持续治疗直至出现疾病症状的理想抑制。所述抑制剂的一个示范性剂量应该在约0.05mg/kg-约10 mg/kg范围内。因此，约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)的一个或多个剂量可以施用于患者。这样的剂量可以间隔地，例如每周或每三周施用(例如以使得患者接受约2-约20个或例如约6个剂量的所述抑制剂)。可以施用最初较高的负荷剂量，随后是一个或多个较低的剂量。然而，其他剂量方案也可以是有用的。这种治疗的进展容易通过常规技术和测定进行监测。
应该理解，上述制剂或治疗方法中的任一种可以使用多于一种USP30 的抑制剂进行。
E.制品
在本发明的另一方面中，提供一种制品，所述制品包含可用于治疗、预防和/或诊断本文所述的病症的材料。该制品包括容器和在容器上或与容器一起的标签或包装说明书(package insert)。适合的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。所述容器可以由各种材料诸如玻璃或塑料制成。容器装有组合物，所述组合物是单独地或与可有效用于治疗、预防和/或诊断所述病症的另一种组合物组合，并且可以具有无菌的存取口(例如，所述容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中至少一种活性试剂是本发明的抑制剂。标签或包装说明书标明该组合物是用于治疗选择的病症。此外，所述制品可以包含(a)其中包含组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抑制剂；和(b)其中包含组合物的第二容器，其中所述组合物包含另一种细胞毒性剂或其他的治疗剂。本发明的该实施方案中的制品还可以包括包装说明书，所述包装说明书指明所述组合物可以用于治疗特定病症。备选地，或另外地，所述制品还可以包括第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包含药用缓冲剂，如抑菌注射用水(BWFI)，磷酸盐缓冲盐水，Ringer氏溶液或葡萄糖溶液。从商业和用户立场，它还可以包括所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。
实施例
以下是本发明的方法和组合物的实施例。要理解，根据以上提供的一般性描述，可以实施多种其他实施方案。
实施例1：材料和方法
DUB cDNA过表达筛选：
为了鉴定线粒体自噬的调节剂，将来自FLAG-标记的DUB文库的各个cDNAs与GFP-Parkin用Lipofectamine 2000(Invitrogen)共转染到HeLa细胞中(DUB-FLAG：GFP-ParkincDNA比率为1∶3)。表达24小时后，细胞用 10μM CCCP处理24小时，固定并用抗-Tom20(SantaCruz Biotechnology)、抗-GFP(Aves Labs)和抗-FLAG(Sigma)一级抗体染色。在用二级抗体染色后，用Leica SP5激光扫描共聚焦显微镜利用40X/1.25 油镜-物镜获得随机视野的图像(0.34μm/像素分辨率，1μm共聚焦z-步尺寸)。对含有Tom20的GFP-Parkin和FLAG-DUB共转染细胞的百分数进行盲目评分。
海马培养物、转染和mt-Keima成像：
如所述制备解离的海马神经元培养物(Seeburg等，Neuron(神经元)58： 571-583(2008))，并且使用Lipofectamine LTX PLUS在DIV 8-10进行转染。对于过表达实验，构建体表达1-3天，对于敲倒实验，表达3-4天。 mt-Keima-转染的神经元用Leica TCS SP5激光扫描共聚焦显微镜用 40X/1.25油镜物镜成像(0.07μm/像素分辨率，1μm共聚焦z-步尺寸)。成像过程中，细胞保持在湿润的室中，该室保持在37℃/5％CO2中。使用混合检测器(hybriddetector)以458nm(中性pH信号)和543nm(酸性pH 信号)激光激发的顺序模式获得两个图像，并且收集630-710nm的发射荧光。所有图像定量通过ImageJ的custom-written macros进行。对于 mt-Keima定量，手工绘出细胞体，并且将高比率(543nm/458nm)的溶酶体信号的总面积除以体细胞线粒体信号的总面积(线粒体自噬指数)。
质谱法
为了确定Parkin底物，将HEK-293 GFP-Parkin可诱导的细胞用多西环素(doxycycline)处理24小时，然后用5μM CCCP或DMSO载体对照处理 2小时。为了确定USP30底物，将HEK-293T细胞用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)转染人USP30 shRNA6天，然后按前述处理。在两个实验中，将细胞裂解(20mM HEPES pH8.0，8M尿素，1mM原钒酸钠，2.5mM焦磷酸钠，1mMβ-甘油磷酸酯)，超声处理，并且通过离心进行澄清处理，然后蛋白水解消化并且免疫亲和富集携带遍在蛋白残留物的肽，以及进行质谱法分析。
制备细胞裂解物和免疫沉淀
对于整个裂解物实验，转染的HEK-293细胞在转染后24小时在含有样品还原剂(Invitrogen)的SDS样品缓冲液(Invitrogen)中裂解。对于免疫沉淀实验，细胞在转染后24小时(过表达实验)或6天(敲倒实验)在含有0.5％ SDS的TBS缓冲液中裂解，并且将裂解物用含有1％Triton-X-100和蛋白酶与磷酸酶抑制剂的缓冲液稀释。遍在蛋白化的蛋白用抗-HA亲和基质珠子(Roche Applied Science)从HA-遍在蛋白转染的细胞的裂解物中免疫沉淀出来。输入物和沉淀通过SDS-PAGE解析并且通过免疫印迹法分析。
统计学分析
误差条表示平均值的标准误差(S.E.M.)。为了计算p值，如附图图例所示，使用非配对斯氏t检验、单向ANOVA与Dunnett’s多重比较检验(用于比较单一条件)或Bonferroni’s多重比较检验(用于比较多个条件)以及两向ANOVA。所有的统计学分析以GraphPad Prismv.5软件进行。
DNA构建
对于DUB过表达筛选，使用由100种cDNAs组成的FLAG-标记的 DUB文库。对于转染，将下述构建体亚克隆到基于β-肌动蛋白启动子的 pCAGGS质粒中：USP30-FLAG(大鼠)，USP30-FLAG(人)，GFP-Parkin (人)，FLAG-Parkin(人)，PINK1-GFP(人)，myc-Parkin(人)，RHOT1 (MIRO)-myc-FLAG(人)，TOM20-myc(人)，HA-遍在蛋白，PSD-95-FLAG，和mt-mKeima(Katayama等，Chemistry&Biology(化学和生物学)18： 1042-1094(2011))。对于下述构建体：USP30-C77S-FLAG(rat)， USP30-C77A-FLAG(大鼠)，USP30-C77S-FLAG(人)，GFP-ParkinK161N (人)和GFP-Parkin G430D(人)，使用QuikChange II XL(Agilent Technologies)产生点突变。购买Mito-tagGFP2(Evrogen)，Tom20-3KR-myc 和HA-遍在蛋白突变体(BlueHeron)。β-Gal(Seeburg and Sheng，J. Neurosci.(神经科学杂志)28：6583-6591(2008))和mito-ro-GFP(Dooley等， J.Biol.Chem.(生物化学杂志)279：22284-22293(2004))表达质粒如之前所述。将靶向下述区域的短发夹序列克隆到pSuper或pSuper-GFP-neo质粒中：
大鼠PINK1#1(TCAGGAGATCCAGGCAATT)，
大鼠PINK1#2(CCAGTACCTTGAAGAGCAA)，
大鼠Parkin#1(GGAAGTGGTTGCTAAGCGA)，
大鼠Parkin#2(GAGGAAAAGTCACGAAACA)，
大鼠USP30(CCAGAGCCCTGTTCGGTTT)，
人USP30(CCAGAGTCCTGTTCGATTT)，和
萤火虫萤光素酶(CGTACGCGGAATACTTCGA)。
抗体和试剂
将下述抗体用于免疫细胞化学：兔抗-TOM20，小鼠抗-TOM20，山羊抗-HSP60(SantaCruz Biotechnology)；小鼠抗-FLAG，兔抗-FLAG，小鼠抗 -myc(Sigma-Aldrich)；和鸡抗-GFP(Aves Labs)。
将下述抗体用于免疫印迹：兔抗-TOM20，山羊抗-HSP60(Santa CruzBiotechnology)；小鼠抗-MFN1，HRP-缀合的抗-FLAG，小鼠抗-myc，兔抗 -USP30，兔抗-RHOT1(MIRO)，兔抗-TIMM8A(Sigma-Aldrich)；兔抗 -GFP，鸡抗-GFP(Invitrogen)；HRP--缀合的抗-GAPDH，HRP--缀合的抗-α-肌动蛋白，HRP-缀合的抗-β-微管蛋白，兔抗-VDAC(CellSignaling Technology)；兔抗-TOM70(Proteintech Group)；抗-遍在蛋白(FK2)(EnzoLife Sciences)；小鼠抗-LAMP1(StressGen)；HRP-缀合的抗-HA(Roche)；和抗-USP30兔(通过用纯化的人USP30氨基酸65-517免疫兔产生)。
对于免疫沉淀实验，使用抗-FLAG M2亲和凝胶珠子(Sigma)和抗-HA 亲和基质珠子(Roche Applied Science)。
表达Parkin、PINK1和USP30 shRNAs的腺伴随病毒2型(AAV2)颗粒由VectorBiolabs，Inc.从包含H1启动子和pSuper载体的shRNA表达盒的 pAAV-BASIC-CAGeGFP-WPRE载体制备。
按所示购买下述试剂：杀稻瘟素S(blasticidin S)，zeocin，Lipofectamine2000，Lipofectamine LTX PLUS，LysoTracker Green DND-626(Invitrogen)； PhosSTOP磷酸酶抑制剂片剂，cOmplete不含EDTA的蛋白酶抑制剂片剂， DNA酶I(Roche AppliedScience)；羰基氰化3-氯苯腙(carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone，CCCP)，多西环素，二甲基亚砜，氯化铵，鱼藤酮，DTT，aldrithiol，二氯百草枯(Sigma-Aldrich)；N-乙基马来酰亚胺 (Thermo Scientific)；和潮霉素(Clontech Laboratories)。
转染和免疫细胞化学：
按照供应商的使用说明(Invitrogen)，所有的异源细胞用 Lipofectamine 2000转染用于cDNA表达，和用Lipofectamine RNAiMAX转染用于siRNA敲倒实验。siRNAs购自Dharmacon作为siGenome池(非沉默池#2用作对照siRNA转染)。按之前所述(Seeburg等，Neuron 58：571-583 (2008))制备海马培养物，并用Lipofectamine LTX PLUS(Invitrogen)转染1.8μg DNA，1.8μl PLUS试剂和6.3μl LTX试剂。药物治疗后，细胞用在磷酸盐缓冲的盐水(PBS，pH 7.4)中的4％低聚甲醛/4％蔗糖固定(Electron MicroscopySciences)。透明化处理(在PBS中的0.1％Triton-X)、封闭(在 PBS中的2％BSA)和一级抗体温育后，用Alexa染料-缀合的二级抗体 (Invitrogen)显现抗体。所有的免疫细胞化学图像用Leica SP5激光扫描显微镜用40X/1.25油镜物镜获得(0.34μm/像素分辨率，1μm共聚焦z-步尺寸)。
HEK293和SH-SY5Y稳定细胞系产生
通过用pOG44 Flp-重组酶表达载体(Invitrogen)和在CMV启动子控制下表达相对应的构建体的pcDNA5-FRT载体(Invitrogen)共转染FLP-In 293 细胞产生表达GFP-Parkin(人)野生型、K161N和G430D的稳定转染的 HEK细胞系。用50μg/mL潮霉素选择来选择并维持细胞系。通过用 pOG44和表达GFP-Parkin(人)的pcDNA5-FRT-TO载体(Invitrogen)共转染FLP-In T-Rex 293细胞产生表达GFP-Parkin(人)的可诱导的HEK稳定细胞系。用50μg/mL潮霉素和15μg/mL杀稻瘟素选择并维持细胞系。类似地用pcDNA5-FRT-TO由Flp-In可诱导的亲本细胞系产生SH-SY5Y稳定的细胞，并且维持在75μg/ml潮霉素和3μg/mL杀稻瘟素条件下。
通过质谱法分离并鉴定遍在蛋白修饰
为了鉴定Parkin底物，用多西环素(1μg/mL)诱导稳定表达可诱导的 GFP-Parkin(人)的HEK 293T细胞24小时，然后用5μM CCCP或DMSO赋形剂对照处理2小时。为了确定USP30底物，将HEK 293T细胞用 Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染人USP30 shRNA 6天，然后如上述进行处理。
按之前所述(Xu等，Nat.Biotech.(自然生物技术)，28：868-873(2010)； Kim等，Mol.Cell(分子细胞)，44：325-340(2011))，利用免疫亲和分离和质谱法由消化的蛋白裂解物富集和鉴定K-GG肽。通过在冰上短暂超声处理在裂解缓冲液(8M尿素，20mM HEPES，pH8.0，具有1mM原钒酸钠， 2.5mM焦磷酸钠，1mMβ-甘油磷酸酯)中制备细胞裂解物。蛋白样品(60 mg)在60℃在4.1mM DTT中还原20分钟，在冰上冷却10分钟，并在室温在暗处用9.1mM碘乙酰胺烷基化15分钟。样品用20mM HEPES pH 8.0稀释4X，并在室温在10μg/ml胰蛋白酶中消化过夜。消化之后，加入TFA 至终浓度1％，以将所述肽酸化，然后在Sep-Pak C18柱体(Waters)上脱盐。肽由所述柱体上洗脱到40％ACN/0.1％TFA中，骤冷，并且冻干48 小时。干燥的肽轻轻重悬在1.4ml 1X IAP缓冲液(Cell Signaling Technology)中，并且通过以1800x g离心5分钟而澄清化。在与消化的肽接触之前，将重新偶联的抗-KGG珠子(CellSignaling Technology)在1X IAP 缓冲液中洗涤。
免疫亲和富集在4℃进行2小时。在室温将肽2X洗脱在0.15％TFA中 (每次10分钟)之前，将珠子用IAP缓冲液洗涤2X，用水洗涤4X。免疫亲和富集的肽用STAGE-Tips按之前所述进行脱盐(Rappsilber等，Anal.Chem.， 75：663-670(2003))。
在以数据依赖性top 15模式操作的LTQ-Orbitrap Velos质谱仪上进行液相色谱-质谱(LC-MS)分析。使用NanoAcquity UPLC将肽注射到0.1x 100-mm Waters 1.7-um BEH-130C18柱上，并且使用两阶段线性梯度以1 ul/min分离，其中溶剂B先在85分钟内从2％升至25％，然后在5分钟内从 25％升至40％。将从该柱洗脱的肽离子化，并且引入到使用ADVANCE源 (Michrom-Bruker)的质谱仪中。在每个工作期，以60,000分辨率在Orbitrap 中收集一次完全的MS扫描，然后在单同位素、电荷状态限定的先驱上在离子阱中多至15次MS/MS扫描(z＞1)。为MS/MS(±20ppm)选择的离子进行动态排除，持续30秒。
将质谱数据转化为mzxml，用于上载到相关的数据库中。使用 Mascot针对来自人蛋白(Uniprot)的胰蛋白酶肽和常见污染物的连环靶标- 诱饵数据库搜索MS/MS谱。先驱离子质量耐受性设定为±50ppm。考虑 carbamidomethyl cysteine(+57.0214)的固定修饰和氧化的甲硫氨酸 (+15.9949)和K-GG(+114.0429)的可变修饰。利用线性辨别分析(LDA) 将来自每次运行的肽光谱匹配(PSMs)滤过至5％的肽水平假发现率 (FDR)，随后以所有运行的集合至2％蛋白水平FDR(＜0.5％肽水平 FDR)。对于每个K-GG PSM，使用改进版本的AScore算法产生定位评分，并且依据AScore顺序相应地定位修饰的位置。(Beausoleil等，Nat. Biotech.(自然生物技术)24(10)：1285-1292(2006))。给出的工作表明，胰蛋白酶不能切割邻近遍在蛋白修饰的赖氨酸PSMs，其中AScore顺序报告在C-末端赖氨酸上的-GG修饰是可疑的(Bustos等，Mol.Cell.Proteomics， 2012年6月23日在线公开，doi：10.1074/mcp.R112.019117；Seyfried等，Anal. Chem.，80：4161-4169(2008))。对此可能的预测是赖氨酸位于蛋白的C端 (或体内截短产物)，PSMs来源于真正的K-GG肽的源分裂。为了建立用于下游分析的更可靠的数据组，将其中AScore顺序报告C端赖氨酸的 PSMs分成两组：具有-GG可能备选地定位的可用的内部赖氨酸残基的那些，和缺少可用的赖氨酸的那些。在下游分析中不考虑带有C-端K-GG但是缺少可用的赖氨酸的PSMs。对于其余的PSMs，-GG修饰重新定位到最接近C端的可用的赖氨酸上。
报告了可靠鉴定的具有模糊定位的肽(AScore＜13)，其仅带有单个内部赖氨酸残基，修饰定位在该内部赖氨酸上。基于表明胰蛋白酶不能切割遍在蛋白修饰的赖氨酸残基的事实，排除AScore＞13的修饰分配在C端赖氨酸上的肽。
利用称为XQuant的改进版本的VistaGrande算法来询问每个K-GG肽的未标记的峰面积，这由直接的PSMs或准确的先驱离子和保留时间匹配 (交叉定量)引导。对于直接的PSMs，未标记的峰面积的定量按之前所述使用固定的质量和保留耐受性进行(Bakalarski等，J.Proteome Res.，7： 4756-4765(2008))。为了能够在XQuant内交叉定量，基于在实验中对所有分析1-4次PSMs鉴定的高评分肽序列，确定关于配对仪器分析的保留时间相关性。使用线性最小二乘回归模型，对匹配的保留时间配对，以产生保留时间相关性方程。在通过离散MS/MS没能鉴定肽的仪器分析中，通过将计算的先驱离子的质量及其来源于回归模型的预测的保留时间引入到XQuant算法中进行交叉定量。尽管m/z耐受性是固定的，但是对于每次配对的仪器运行动态调整保留时间耐受性。如果肽没有在给定的仪器运行中可靠地鉴定出来，而是在多次其他运行中鉴定出来的，则进行多次交叉定量事件，以确保数据质量。如之前所述(Bakalarski等，J. Proteome Res.，7：4756-4765(2008))，滤过XQuant结果至启发性置信评分(heuristic confidence score)为83以上。如果其保留时间的峰边界重叠，将在单次运行内相同m/z的多次定量事件产生的完全扫描峰面积测量分组在一起。由所述组，选择具有最大总峰面积的峰作为其单一的代表值。
为了鉴定Parkin和USP30的候选底物，对XQuant数据应用图解分析和混合作用建模(mixed-effect modeling)。混合作用建模适配每种蛋白的 AUC数据。“治疗”(例如，对照，Parkin过表达/USP30敲倒，CCCP， Combo)是绝对的固定的作用，“肽”适合作为随机作用。基于每次治疗相对于对照的P-值计算假发现率(FDR)。利用来自Combo相对于对照和Combo相对于CCCP的平均AUC的倍数变化和P-值绘图。混合作用建模通过‘nlme’(Pinheiro等，nlme：Linear and Nonlinear Mixed Effects Models.R package version 3，1-101(2011))以R拟合。
制备细胞裂解物和免疫沉淀
对于总裂解物实验，将细胞在含有样品还原剂(Invitrogen)的SDS样品缓冲液(Invitrogen)中24小时后裂解，并且在95℃煮沸10分钟。总裂解物通过SDS-PAGE解析，并且通过免疫印迹分析。对于免疫沉淀实验，将细胞用在Tris-缓冲盐水(10mM TRIS，150mMNaCl，pH8.0)中的0.5％SDS 中的5μM MG132和所示浓度和持续时间的CCCP处理24小时(过表达实验)或6天(敲倒实验)，并且在70℃煮沸10分钟。将裂解物稀释在免疫沉淀缓冲液(50mM HEPES，150mM NaCl，10％甘油，1％Triton-X，蛋白酶抑制剂(Roche AppliedScience)，磷酸酶抑制剂(Roche Applied Science)， DNA酶I(Roche Applied Science)，2mM N-乙基马来酰亚胺(Thermo Scientific)，pH 7.4)中，通过以31,000g离心10分钟澄清化，并且用抗-HA 亲和基质珠子(Roche Applied Science)温育过夜。输入物和抗-HA免疫沉淀通过SDS-PAGE解析，并且通过免疫印迹分析。
线粒体分级
使用FOCUS亚细胞试剂盒(G Biosciences)由～P60成年雄性大鼠前脑进行亚细胞分级。
果蝇储备物
获得下述果蝇品系用于分析：y，w；肌动蛋白5C-GAL4/CyO，y+ (BloomingtonDrosophila Stock Center，4414)，UAS-CG3016RN4i(本文称为 UAS-dUSP30RN4i；NIG-FlyStock Center，3016R-2)。对于USP30敲倒实验，使用标准遗传技术，将肌动蛋白5C-GAL4与UAS-dUSP30RN4i重组到同一染色体上。
果蝇在按照供应商使用说明制备的Nutri-Fly“German Food”制剂 (Genesee，66-115)上喂养。所有的果蝇在25℃喂养，并且使用标准遗传技术杂交。所有的实验使用年龄-匹配的雄性果蝇进行。
定量RT-PCR
按照供应商的使用说明(Qiagen RNeasy Plus kit，Applied Biosystems HighCapacity cDNA Reverse Transcription kit)从单个果蝇获得RNA以及随后获得cDNA。使用Applied Biosystems ViiA7实时PCR系统利用TaqMan Assays Dm01796115_g1和Dm01796116_g1(果蝇CG3016(USP30))， Dm01795269_g1(果蝇CG5486(USP47))和Dm01840115_s1(果蝇CG4603 (YOD1))进行定量RT-PCR。Dm02134593_g1(RpII140)用作对照。
确定摄入的百草枯浓度
将1日龄的成年雄性果蝇在饱和Whatman纸上喂饲仅含有5％蔗糖的溶液(在水中)或含有5％蔗糖+10mM百草枯的溶液(在水中)。处理48 小时后，每种条件收集15只果蝇，并且在100μL水中匀浆。通过将适量的百草枯掺加到来自未处理的果蝇的匀浆物中产生标准曲线样品。然后，将所述样品涡旋混合，加入200μL含有内标(普萘洛尔 (Propranolol))的乙腈。将样品再次涡旋，并且以10,000×g离心10分钟。将上清转移到含有200μL水的新平板中，并且通过LC-MS/MS分析，以定量百草枯的浓度。LC-MS/MS由Agilent 1100系列HPLC系统(Santa Clara，CA)和偶联有来自Applied Biosystems(Foster City，CA)的4000 QMS和离子源的来自CTC Analytics(Carrboro，NC) 的HTS PAL自动取样仪组成。在来自Phenomenex的带有Krud Katcher保护柱的Waters Atlantis dC18柱(3μm100x 2.1mm)上进行HPLC分离。使用具有针对百草枯的跃迁(transition)185.1→165.1和针对普萘洛尔的跃迁 260.2→183.1的多反应监测(MRM)进行定量。测定的下限和上限分别为10 μM和1000μM。测定的定量使用通过相对于百草枯的额定浓度绘制分析物/IS峰面积配给量(具有权重1/x2线性回归)构建的校正曲线进行。
果蝇间接飞行肌的透射电子显微镜检查
将成年雄性果蝇的胸部与身体的其余部分分离，然后纵向对半切开，立即固定，并且按之前所述进行处理(Greene等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA (美国国家科学院学报)，100：4078-4083(2003))。
爬行测定
使用下述果蝇品系进行爬行测定：y，w；肌动蛋白5C-GAL4/CyO，y+ (仅肌动蛋白)；y，w；UAS-CG3016-RNAi/CyO，y+(仅RNAi)；y，w； UAS-CG3016RNAi，肌动蛋白5C-GAL4/CyO，y+(USP30敲倒)。
将1日龄的成年雄性果蝇在饱和Whatman纸上喂饲仅含有5％蔗糖的溶液(在水中)或含有5％蔗糖+10mM百草枯的溶液(在水中)。处理48 小时后，将果蝇用二氧化碳麻醉，并且以十只一组转移到仅含有1％琼脂糖的小瓶中进行1小时的由二氧化碳的影响的复苏时间。然后将果蝇转移至新玻璃管中，轻轻敲击至底部，并且对其爬行能力进行评分。记录在30秒内垂直爬行＞15cm的果蝇的数量。
存活测定
将每瓶十只成年1日龄的雄性果蝇在饱和Whatman纸上喂饲仅含有 5％蔗糖的溶液(在水中)或含有5％蔗糖+10mM百草枯的溶液(在水中)。以所述的时间间隔计数存活的果蝇数量。
MultiTox细胞死亡测定
将转染了对照或USP30 siRNAs的SH-SY5Y细胞用在含有1％胎牛血清的正常生长培养基(DMEM/F12和1X GlutaMax)中的鱼藤酮处理。温育24小时后，按照供应商的使用说明，利用Multi-Tox Fluor测定 (Promega)来测量细胞存活力。对于每个条件，将GF-AFC荧光针对二 -AAF-R110荧光进行标准化，并且表示为对照(对照RNAi+DMSO)的分数。
实施例2：USP30拮抗Parkin-介导的损伤的线粒体的清除
为了鉴定调节线粒体清除的DUBs，在建立的线粒体降解测定 (Narendra等，J.Cell Biol.(细胞生物学杂志)，183：795-803(2008))中筛选 FLAG-标记的人DUB cDNA文库(97 DUBs)。在这一测定中，在培养的过表达Parkin的细胞中，由质子载体(protonophore)羰基氰化3-氯苯腙 (CCCP，20μM，24小时)诱导的线粒体去极化导致显著的线粒体损失(如通过染色线粒体外膜蛋白标记Tom20所测量的)。CCCP处理导致在极大部分转染了GFP-Parkin的细胞中的Tom20染色的强有力的消失(CCCP 后，＞80％的Parkin-转染的细胞缺少Tom20染色-图1A)。将各种FLAG-标记的DUB cDNAs与GFP-Parkin共转染，并且测量其对CCCP-诱导的线粒体(Tom20)清除的影响。在～100种不同的DUBs的文库中，有两种DUBs，即USP30和DUBA2，在CCCP-处理的转染GFP-Parkin的细胞中，强有力地阻断Tom20染色的丧失，而其他的几乎没有影响(图1A-具有Tom20 染色的细胞％：对照(β-Gal)：15.3％，USP30：97.4％，DUBA2：94.7％， UCH-L1：36％，USP15：23.3％，ATXN3：8.3％；其他负的DUBs没有显示)。由于已报道USP30定位在线粒体外膜上，其酶结构域推定地朝向细胞质(Nakamura和Hirose，Mol.Biol.Cell(分子生物学和细胞)，19：1903-1914 (2008))，因此选择USP30而不选择DUBA2用于进一步的研究；由此其将在右侧亚细胞区室中，以抵消Parkin对线粒体的作用。USP30的特异性的线粒体相关性通过转染的USP30-FLAG和内源性USP30与线粒体标记在神经元中的免疫共定位(图2A，B)以及通过USP30与来自大鼠脑的纯化的线粒体的共同分级(cofractionation)(图2C)而得到证实。
还在转染了myc-Parkin的不同的细胞系(多巴胺能SH-SY5Y细胞)中显示了USP30过表达对防止CCCP-诱导的线粒体自噬的能力(图1B)。为了证实USP30的作用不是特异性针对Tom20的，检测USP30过表达是否还防止线粒体基质蛋白HSP60的CCCP-诱导的丧失。事实上，USP30过表达还防止CCCP-诱导的HSP60的丧失，这暗示USP30阻断细胞器的大量降解(图1B-D)。与此相反，无催化活性的USP30C77S突变体(Nakamura和 Hirose，Mol.Biol.Cell(分子细胞生物学与细胞)，19：1903-1914(2008))的表达对于防止Parkin-介导的线粒体降解是无效的，这支持USP30通过线粒体底物的去遍在蛋白化而抵消线粒体自噬作用的观点(图1B-D)。
由于USP30酶活性对于阻断线粒体自噬是必需的，因此检验USP30 和Parkin是否对线粒体遍在蛋白化具有相反的作用。如之前报道的，短期 CCCP处理(20μM，4小时)引起Parkin对线粒体的重新分布(由Tom20标记)，并且导致遍在蛋白化信号在线粒体上的积聚(由用聚遍在蛋白抗体 FK2染色进行测量，图2D；(Lee等，J.Cell Biol.(细胞生物学杂志)，189： 671-680(2010))。当USP30与Parkin共表达时，在线粒体上积聚的遍在蛋白信号的量减少～75％-其是一种还需要USP30酶活性的作用(图2D，E)。这些数据支持这样的观点：USP30作用为DUB，其反对Parkin对线粒体蛋白的遍在蛋白连接酶作用，由此抑制线粒体自噬。
之前的研究表明连接酶活性中的Parkin致病性突变体缺陷不能支持响应CCCP的线粒体降解，与易位的Parkin相关的核周区域中导致未清除的线粒体的簇集(Geisler等，Nat.Cell Biol.(自然细胞生物学)，12：119-131 (2010)；Lee等，J.Cell Biol.(细胞生物学杂志)，189：671-680(2010))。显著地，在共转染了USP30加Parkin并用CCCP处理的细胞中，野生型 myc-Parkin与突变Parkin作用相似，原因在于其保持与未降解的线粒体的核周簇相缔合(图1B(白色箭头)，E)。USP30的过表达不改变Parkin的表达水平(图2F，G)。这些数据表明USP30通过酶去除在受损的线粒体上的遍在蛋白信号而不是通过抑制Parkin对线粒体的易位而阻断线粒体自噬。
实施例3：神经元中的线粒体自噬所需要的Pink1，Parkin
为了测量神经元中的线粒体自噬，监测mt-Keima，其为一种靶向线粒体基质的参比pH-敏感性荧光蛋白。低比率的mt-Keima-来源的荧光 (543nm/458nm)报道中性环境，而高比率的荧光报道酸性pH(Katayama等， Chemistry&Biology(化学与生物学)18：1042-1094(2011))。因此，mt-Keima允许细胞质中的线粒体和酸性溶酶体中的线粒体的区分性成像。由于mt-Keima耐受溶酶体蛋白酶，引起其允许测量线粒体随时间的累积性溶酶体递送。
在大鼠解离的海马培养物中转染后，mt-Keima信号开始在线粒体特有的拉伸的结构中积聚，并且具有低的543/458比率值(以绿色显示-图 3A)。表达2-3天后，具有高比率(酸性)信号的多个圆形的mt-Keima结构也在整个细胞体中出现(以红色显示-图3A)。这些圆形的mt-Keima- 阳性结构最可能表示溶酶体，原因在于：(1)用NH4C1中和细胞完全特异性地将在这些圆形结构中的高比率(543/458)图像(pixel)逆转为低比率，而没有影响管状-网状的线粒体信号(图4A)；(2)独立的溶酶体标记染料 (lysotracker green DND-26)染色高比率的mt-Keima结构，但是还存在多个与mt-Keima不相关的Lysotracker-阳性结构(图4B)；(3)在由此的免疫染色实验中，高比率图像与内源性溶酶体蛋白LAMP-1共定位(图4C)。由于几乎所有的“酸性”mt-Keima信号存在于神经元细胞体(细胞体含有95.6± 2.2％的总的高比率(543/458)信号)中，因此，该细胞体内的溶酶体(红色) 信号/线粒体(绿色)信号的面积比率用作神经元中线粒体的溶酶体递送(“线粒体自噬指数”)的测量(Katayama等，Chemistry&Biology(化学与生物学)18：1042-1094(2011))。如通过线粒体自噬指数量化的，溶酶体中 mt-Keima的丰度随以天数为单位的时程增加(图4D)，这暗示在基本条件下培养的神经元中的活性线粒体自噬。
在异源细胞中，当线粒体去极化时，Parkin过表达能够驱动线粒体降解；然而，还没有确定在非神经细胞或神经细胞中对于线粒体自噬是否需要内源性Parkin和PINK1(Youle和Narendra，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.(自然分子细胞生物学综述)12：9-14(2011))。为了检验PINK1/Parkin途径在神经元线粒体自噬中的作用，使用由基于pSuper载体表达的小发夹RNAs (shRNAs)来敲倒Parkin或PINK1。在异源细胞中，这些Parkin和PINK1shRNAs有效地敲倒其各自的靶标的cDNA-驱动的表达(图4E，F)，并且分别抑制神经元培养物中的内源性Parkin或PINK1的蛋白水平～80％和～90％ (图4G，H)。与对照萤光素酶shRNA相比较，转染了Parkin shRNAs(两种独立的序列)的神经元表现出线粒体自噬指数～50％的减少，表示减少的线粒体向溶酶体的递送(图3B，C)。PINK1 shRNAs甚至更有效地减少酸性 mt-Keima信号(线粒体自噬指数减少～80-90％(图3D，E))。之前的遗传学研究在保持健康的线粒体方面将PINK1置于Parkin的上游(Clark等，Nature (自然)，441：1162-1166(2006)；Park等Nature(自然)，441：1157-1161 (2006))。与遗传学上位性相一致，我们的mt-Keima实验表明，PINK1多表达强烈增加神经元中的线粒体自噬，这是一种通过Parkin敲倒完全消除的作用(图3F，G)。另一方面，Parkin过表达本身对基底线粒体自噬没有明显的作用，如通过mt-Keima测定测量的(图4I，J)。因此，神经元线粒体自噬需要PINK1和Parkin二者，PINK1-明显是限制性的-在Parkin的上游作用。
实施例4：USP30拮抗神经元中的线粒体自噬
接下来，研究USP30是否如在异源细胞中一样抑制神经元中的线粒体自噬。与转染了β-Gal和mt-Keima的对照神经元相比，共表达野生型 USP30在3天时引起线粒体自噬指数～60％的减少，这表明USP30抑制神经元中线粒体的溶酶体递送(图5A，E)。与此相反，酶失活的USP30(C77S或 C77A)的过表达诱导强有力的线粒体自噬信号的增加(图5A，E)。增强的线粒体向溶酶体的递送可能反映催化失活的USP30的显性-阴性作用，这可能是通过与底物或原线粒体自噬的遍在蛋白链的相互作用，并且使其与内源性USP30隔离所致(Berlin等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，285： 34909-34921(2010)；Bomberger等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，284： 18778-18789(2009)；Ogawa等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，286：41455-41465(2011))。
为了检测内源性USP30的功能，用shRNAs敲倒USP30。在异源细胞中，大鼠USP30shRNA质粒特异性清除转染的大鼠USP30 cDNA的表达 (图5B)。在神经元培养物中，相同的大鼠USP30 shRNA导致内源性 USP30～85％的减少(图5C)。在神经元中，相对于阴性对照萤光素酶 shRNA，USP30敲倒增加mt-Keima的溶酶体递送(线粒体自噬指数的～60％增加)(图5D，F)。共转染shRNA-抗性人USP30 cDNA“挽救”这一作用，即，其恢复了对线粒体降解的闸门，这表明USP30 shRNA不是发挥非特异性的作用(图5B，D，F)。事实上，共转染了人USP30cDNA加大鼠 USP30 shRNA的神经元表现出比对照低的mt-Keima溶酶体积聚水平，这与过表达野生型USP30本身的神经元相类似(图5D，F)。此外，酶失活的人USP30(C77S)不能逆转由USP30 shRNA诱导的增强的线粒体自噬，并且实际上增强线粒体自噬活性甚至高于USP30shRNA(图5D，F)，后一结果表明USP30敲倒是不完全的。这些结果提供了强烈的证据表明内源性 USP30通过其DUB活性保持神经元中的线粒体自噬。
实施例5：USP30使多种线粒体蛋白去遍在蛋白化
由于Parkin和USP30拮抗性地调节线粒体降解，因此，假设该E3连接酶和DUB作用在某些共同的底物上。为了鉴定Parkin和USP30底物，在使用遍在蛋白分支特异性的(K-GG)抗体从胰蛋白酶消化的提取物中免疫亲和富集遍在蛋白化的肽之后，通过质谱法(MS)分析细胞中的整体遍在蛋白化。在HEK-293细胞中，在下述两个不同的条件组中，通过MS分析并定量整体遍在蛋白化：1)可诱导的Parkin过表达，或2)USP30敲倒 (USP30敲倒效率为85±5％(见图7C))。在每组中，细胞用CCCP(5μM，2 小时)或赋形剂对照(DMSO)处理。在聚集体中，MS分析揭示在～3200种蛋白上＞15,000个特有的遍在蛋白化位点，所述蛋白的子集响应单独的 CCCP(内源性Parkin和USP30水平)或Parkin过表达/USP30敲倒(关于所述～3200种蛋白的列表参见附件A)。MS鉴定了233和335种其遍在蛋白化分别通过parkin过表达或USP30敲倒而增加的蛋白(即，相对于单独的CCCP，在‘parkin过表达+CCCP’或‘USP30敲倒+CCCP’中表现出显著更多的遍在蛋白化)。这些蛋白中有41种由Parkin过表达和USP30敲倒二者调节(图13)。这41种蛋白中有十二种是线粒体的或与线粒体相关(Tom20，MIRO1，FKBP8，PTH2，MUL1，MAT2B，TOM70，PRDX3，IDE，以及所有三种 VDAC亚型-基于人MitoCarta数据库)。其他包括核输入蛋白(例如 IPO5)、去甲基酶(例如KDM3B)和遍在蛋白/蛋白酶体系统的成分(例如，PSD13，UBP13)(图13)。
我们集中另外的研究来研究两种线粒体蛋白--Tom20和MIRO-其与 USP30敲倒一起表现出大量遍在蛋白化增加(对于Tom20，USP30 shRNA +CCCP/CCCP遍在蛋白化比率＝3.52，p＝0.005；对于MIRO＝2.95，p＝ 0.019；参见图13，左图)。Tom20和MIRO还与Parkin过表达一起表现出大幅度和高显著性的遍在蛋白化增加(图13，右图)。为了证实USP30可以使这些蛋白去遍在蛋白化，将稳定过表达GFP-Parkin的细胞系转染HA-遍在蛋白，并且用抗-HA抗体免疫沉淀(IP)遍在蛋白化的蛋白。在线粒体去极化(CCCP，5μM，2小时)后，GFP-Parkin稳定细胞表现出强有力增强的内源性MIRO的遍在蛋白化，如在抗-HA-免疫沉淀中通过针对MIRO的免疫印迹所测量的(图7A)。在没有HA-遍在蛋白的对照转染中，抗-HA-珠子不使MIRO免疫沉淀，这表明MIRO遍在蛋白化信号的特异性(图7A，左图)。与β-Gal对照相比，共转染野生型USP30，而不是DUB-死亡 USP30-C77S，使遍在蛋白化MIRO的量减少～85％(图7A，B)。类似地，野生型USP30过表达使Tom20的遍在蛋白化减少(图7A)；而USP30-C77S 实际上使基底Tom20遍在蛋白化增加～2-倍(无CCCP)，并且使CCCP-诱导的遍在蛋白化增加～8-倍，这与显性-阴性机制相一致(图7A，C)。在亲本HEK-293细胞系(缺少GFP-Parkin)中，CCCP不诱导可检测到的Tom20 或MIRO遍在蛋白化(图6A)。然而，在这一细胞系中，过表达USP30-C77S 仍然能够增加基底Tom20遍在蛋白化和USP30而抑制其(图6A)。综合考虑，我们的数据表明，MIRO和Tom20是USP30的底物，并且USP30可以抵消线粒体损伤后Parkin-介导的MIRO和Tom20二者的遍在蛋白化。
发现甚至在基本条件下，共有的底物的子集受USP30调控(以Tom20 为例，如上文所讨论的)。MUL1，ASNS和FKBP8-而不是MIRO-是与 Tom20表现相似的底物；即，在不存在CCCP时，它们还与USP30敲倒一起表现出遍在蛋白化的基本增加。因此，USP30基本使该组蛋白去遍在蛋白化，这可能抗衡线粒体E3连接酶，该酶在不存在CCCP时有活性并且作用在Tom20上而不是MIRO上。另一方面，诸如TOM70，MAT2B和 PTH2的蛋白与MIRO作用相似，原因在于它们仅在CCCP之后与USP30敲倒一起表现出增强的遍在蛋白化，这表明USP30仅在线粒体中添补了 Parkin后进行这些蛋白的去遍在蛋白化。在募集到受损的线粒体中后，Parkin可能靶向Tom20和MIRO两种类型的USP30底物，使平衡向其聚遍在蛋白化移动。
使用相同的实验系统(过表达GFP-Parkin和HA-遍在蛋白的细胞)，通过shRNA抑制检测内源性USP30的功能。USP30敲倒不影响基本的MIRO 遍在蛋白化(不存在CCCP-诱导的线粒体损伤)。然而，在线粒体去极化 (CCCP 5μM，2小时)后，并且与MS实验相一致，USP30敲倒使遍在蛋白化的MIRO水平增加～2.5-倍，如在HA-遍在蛋白免疫沉淀中测量的(图7D，E)。显著地，USP30敲倒增加基本的和CCCP-诱导的Tom20遍在蛋白化，这与酶失活的USP30相似(图7D，F)。由USP30 shRNA引起的MIRO和 Tom20遍在蛋白化的增加通过表达对人USP30shRNA不敏感的大鼠 USP30 cDNA而被阻止，这表明RNAi作用的特异性(图6B)。因此，这些生物化学数据确证了内源性USP30作用为Tom20和MIRO二者的遍在蛋白化的闸门的MS发现。
之前已表明Parkin在多种线粒体底物上组装K27-，K48-和K63-型聚遍在蛋白链(Geisler等，Nat.Cell Biol.(自然细胞生物学)，12：119-131 (2010))。为了检验Tom20和Miro上的聚遍在蛋白链拓扑性，我们使用其中所有七种赖氨酸残基分别替换为精氨酸(单个的K-突变为-R突变体)的 HA-遍在蛋白突变体或使用其中保留单个赖氨酸完整而所有其余的六个赖氨酸替换为精氨酸的突变体重复了遍在蛋白化测定。我们比较了由这些遍在蛋白突变体提供的CCCP-诱导的Tom20和Miro遍在蛋白化的量与野生型遍在蛋白提供的量。在所有的“单个K-突变为-R突变体”中，只有 K27R突变阻断Tom20的CCCP-诱导的遍在蛋白化，而其余的K-突变为-R 突变体(K6R，K11R，K29R，K33R，K48R，K63R)支持正常的Tom20遍在蛋白化(图6C，D)。相反，正常的Tom20遍在蛋白化仅受到具有完好的K27的遍在蛋白(所有其余的赖氨酸都突变了)的支持，而所有其余的单赖氨酸突变体(K6，K11，K29，K33，K48，K63)具有减弱的Tom20遍在蛋白化(图6E， F)。因此，遍在蛋白上的K27是在Tom20上构建聚遍在蛋白链所必需的也是充分的，这表明Tom20上的主要聚遍在蛋白化拓扑性是K27-型链。与Tom20相似，对其正常的遍在蛋白化，Miro也需要K27(并且不需要遍在蛋白上其余的赖氨酸)(图6C，D)。尽管仅包含K27的遍在蛋白突变体最支持Miro遍在蛋白化，但是，与野生型遍在蛋白相比较，显著更少的遍在蛋白与Miro链接(野生型遍在蛋白的～65％)，这表明除了K27之外，Miro 积聚其他的链型(图6E，F)。我们的数据与Parkin在其他底物上组装K27-连接的链的能力相一致(Geisler等，Nat.Cell Biol.(自然细胞生物学)，12： 119-131(2010))。
遍在蛋白化之外，除遍在蛋白化外USP30还调节蛋白更新吗？公开的证据表明Parkin调控多种线粒体外膜蛋白的降解(Chan等，Human Mol. Genet.(人类分子遗传学)，20：1726-1737(2011))。与此相一致的，所检验的几种外膜蛋白(MIRO，MFN-1，TOM70，VDAC，Tom20)在GFP-Parkin 稳定细胞系的6小时的CCCP处理(5μM)过程中都表现出显著的蛋白水平下降(图6G，H)。Tom20水平也减少，但是减少的程度小于MIRO和其他外膜蛋白(CCCP用在t＝6h，10+/-1％减少，p＜0.01)(图6G，H)。与外膜蛋白相反，在该时程内，线粒体基质蛋白HSP60和内膜蛋白TIMM8A不被 CCCP改变。在GFP-Parkin稳定细胞中过表达USP30极大减少或消除 CCCP-诱导的MIRO和Tom20的耗竭(图6G，H)。由于CCCP-诱导的其他线粒体膜蛋白(MFN-1，TOM70，VDAC)的降解不受影响(图6G，H)，因此，通过USP30过表达的稳定似乎是针对MIRO和Tom20相对特异性的。与野生型USP30不同，无活性的C77A-或C77S-USP30突变体不抑制CCCP诱导的MIRO或Tom20降解，这暗示需要DUB活性(图6G，H)。这些数据表明 USP30可以特异性地抵消MIRO和Tom20的降解，而不影响其他线粒体蛋白的更新。
由于MIRO和Tom20降解伴有线粒体自噬(图6G，H以及(Chan等， Human Mol.Genet.(人类分子遗传学)，20：1726-1737(2011))，并且USP30 敲倒增强线粒体自噬(图5C，E)和MIRO和Tom20的遍在蛋白化(图7)，因此，推测这些蛋白的耗竭可能引发线粒体自噬。在这一模型中，这些蛋白的过表达将阻断由USP30-敲倒诱导的线粒体自噬。相反，在mt-Keima 测定中，发现MIRO或Tom20在神经元中的过表达-甚至自身-导致线粒体自噬的强有力的增加(图8B，C，D，E)，该作用与USP30敲倒相似。因此，假设是MIRO和Tom20的遍在蛋白化作为线粒体自噬的信号(而不是其降解，其发生在遍在蛋白化之后)，并且MIRO和Tom20的过表达通过增加这些可用于遍在蛋白化的底物的集合而促进线粒体自噬。
来源于Tom20的遍在蛋白化肽的MS分析鉴定了3种赖氨酸残基(K56， K61和K68)，其遍在蛋白化在CCCP或USP30敲倒时增加，并且甚至进一步响应CCCP处理+USP30敲倒的组合而增加(图9)。为了证实在这些特点位点上的遍在蛋白化，将Tom20中的这三个赖氨酸残基突变为精氨酸 (“3KR-Tom20”(K56R，K61R，K68R突变体))。在GFP-Parkin过表达的细胞中，myc-标记的野生型Tom20随着酶失活的USP30-C77S的共表达而表现出遍在蛋白化增加(图8A)，这与内源性Tom20相似(图7A，C)。与此相反，3KR-Tom20表现出比野生型Tom20少的基本遍在蛋白化，另外，其不受显性阴性USP30-C77S的影响(图8A)，这表明这三个赖氨酸残基是 Tom20上的主要USP30靶标残基。
在神经元中的mt-Keima测定中，野生型Tom20的过表达增强线粒体自噬，而3KR-Tom20突变体不能增强线粒体自噬(图8B，D)；由此， Tom20足以驱动线粒体自噬，但是这种能力依赖于其遍在蛋白化。此外，3KR-Tom20阻断USP30-C77S诱导的线粒体自噬的增加(图8B，D)，这暗示由显性-阴性USP30引起的增加的线粒体自噬通量需要Tom20遍在蛋白化。备选地，过表达的3KR-Tom20可能能够通过以非催化方式与 USP30物理缔合而反对USP30-C77S-诱导的线粒体自噬。
质谱法鉴定了MIRO上由USP30和Parkin调节的九个赖氨酸-遍在蛋白化位点，已知这些中的一些是正常的MIRO功能所必需的(例如，K427是 GTP酶活性所必需的(Fransson等，Bioch.Biophys.Res.Comm.，344：500-510 (2006))。由此，由于USP30敲倒增加MIRO遍在蛋白化(图7D，E)，不研究组合诱变，而是研究USP30对MIRO诱导线粒体自噬的能力的影响。与 MIRO遍在蛋白化驱动线粒体自噬的观点一致，USP30敲倒进一步增强线粒体自噬，超过在单独的MIRO过表达后所观察到的线粒体自噬(图8C， E)。综合考虑，这些数据表明MIRO或Tom20的遍在蛋白化能够驱动神经元中的线粒体自噬，并且USP30对线粒体自噬的抑制至少可以部分由这些蛋白的去遍在蛋白化得以解释。
实施例6：USP30敲倒挽救与PD诱变相关的线粒体自噬
如果与Parkin的PD-连锁的突变相关的线粒体降解缺陷是由于受损的线粒体的减弱的遍在蛋白化导致的，并且USP30事实上作用为Parkin的生物化学和功能拮抗剂，那么抑制USP30应该恢复线粒体遍在蛋白化和降解。为了检验这一假说，我们集中研究PD-连锁的Parkin致病性突变体，如研究G430D和K161N，其展示出减弱的连接酶活性(Sriram等，HumanMol.Genet.(人类分子遗传学)，14：2571-2586(2005))，伴有线粒体自噬缺陷(Geisler等，Nat.Cell Biol.(自然细胞生物学)，12：119-131(2010)；Lee 等，J.Cell Biol.(细胞生物学杂志)，189：671-680(2010))(例如，G430D 和K161N)。
在转染了致病性突变体GFP-Parkin-G430D并用CCCP处理的 SH-SY5Y细胞中，线粒体不能被清除，并且形成与缺陷的Parkin蛋白相缔合的核周簇(图10A，第一列)。与转染了Parkin-G430D与对照siRNA的细胞相比，双重转染了Parkin-G430D与USP30 siRNA(其导致USP30蛋白敲倒～60％(图11A))的相同细胞表现出60％的线粒体减少(如通过总Tom20荧光所测量的)(图10A，在B中定量)。这一结果表明，当面对缺陷性Parkin 时，USP30蛋白水平的siRNA敲倒能够在很大程度上挽救线粒体自噬。敲倒其他DUBs(USP6，USP14)不能挽救线粒体降解(图11B-D)。重新引入 RNAi-耐受性野生型USP30(大鼠USP30 cDNA)，而不是无活性的大鼠 USP30-C77S突变体，防止USP30 siRNA对线粒体降解的挽救(图10A，B)。线粒体降解的挽救与突变体G430D Parkin的核周簇(通常与线粒体相关) 的丧失以及整个细胞质中较小的分散的含有puncta的点的出现相关(图 10A，C；还参见图11B，C)。CCCP-处理的表达GFP-Parkin-G430D的细胞中，USP30敲倒不仅导致Tom20免疫原性的丧失，而且减少了针对基质蛋白HSP60的染色，这表明USP30抑制恢复了整个线粒体的降解(图11E，G)。利用USP30siRNA敲倒类似地挽救了与另一种PD-相关的Parkin突变体 (K161N)的线粒体降解缺陷(图11F，H)。在神经元中，还利用显性-阴性 USP30-C77A挽救了与Parkin敲倒相关的减少的线粒体自噬(如在 mt-Keima测定中测量的)(图10D，E)。由此，抑制USP30的表达或活性允许细胞克服缺陷性Parkin或Parkin敲倒，并且恢复对受损的线粒体的清除。
尽管不希望受到任何具体的理论的束缚，但是，由于Parkin连接酶活性通过遍在蛋白化标记线粒体，因此，可能需要Parkin突变体中存在的一些残余的连接酶活性，以用于USP30敲倒，从而恢复线粒体自噬。USP30 敲倒对于完全丧失Parkin活性是否是有效的目前还是未知的。然而，可能的是，存在其他的具有重叠的底物或能够补偿Parkin的缺失的E3s。
实施例7：USP30是Parkin底物
由于Parkin具有广泛的针对线粒体外膜蛋白的活性，我们想知道 Parkin是否使也存在于该线粒体区室中的USP30遍在蛋白化。支持这种可能性，我们在用CCCP处理的表达GFP-Parkin的细胞中的蛋白质组实验中鉴定了USP30-衍生的遍在蛋白化的肽(相对于‘DMSO’，在‘GFP-Parkin+ CCCP’中的USP30的遍在蛋白化倍数变化＝27.23，p＜0.001)。为了证实 Parkin对USP30的遍在蛋白化，我们在过表达GFP-Parkin和HA-遍在蛋白的细胞中重复了遍在蛋白化测定，并且发现在CCCP处理(20μM，2小时，图 9C，D)后GFP-Parkin诱导的内源性USP30的遍在蛋白化。通过质谱法鉴定的USP30的遍在蛋白化位点(K235和K289)不是其遍在蛋白化所必需的，这表明USP30中的其他赖氨酸残基能够接纳遍在蛋白(数据未显示)。在表达GFP-Parkin的细胞中，CCCP处理(20μM)还诱导了USP30水平的显著下降(图9E，F)。重要的是，具有致病性突变G430D或K161N的Parkin不能使 USP30遍在蛋白化(图9C，D)或降解(图9E-F)。这些数据表明Parkin使USP30 遍在蛋白化并且降解，由此去除针对线粒体自噬的闸门。
实施例8：在体内，USP30敲倒减少氧化应激并且提供保护
接下来检验USP30敲倒是否对线粒体和细胞提供功能性益处。ROS- 主要来源于线粒体-与神经变性病症相关，并且线粒体功能障碍可能导致PD中增加的氧化应激(Lee等，Biochem.J.(生物化学杂志)，441：523-540 (2012))。为了测量线粒体中的氧化应激，使用线粒体基质-靶向的ro-GFP (mito-roGFP)，其为一种允许定量性参比成像线粒体氧化还原电位的氧化还原-敏感性的荧光蛋白(Dooley等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)279：22284-22293(2004))。测量了个体细胞中的参比性mito-roGFP信号后，通过顺次用DTT(1mM)处理培养物以完全还原探针，用aldrithiol(100μM) 处理以完全氧化探针，而校准探针的动态范围(Guzman等，Nature(自然)， 468：696-700(2010))。DTT与aldrithiol之后测量的mito-roGFP的比率分别设定为0和1，以校准相对氧化指数。在转染了对照萤光素酶shRNA的对照细胞中，神经元具有～0.6的平均相对氧化指数(图17A，B)。USP30敲倒使相对氧化指数下降～0.4，这表明对USP30蛋白的抑制导致线粒体氧化应激的减少。
为了检验敲倒USP30在体内是否提供应激条件下的保护，我们使用果蝇，其已经成为研究PD分子发病机制的有效的模型系统(Guo，Cold Spring Harb.Perspect.Med.2(11)pii：a009944(2012))。为了敲倒果蝇的USP30 (CG3016，本文称为dUSP30)，我们使用GAL4/UAS系统(Brand等， Development(发育)，118：401-415(1993))。我们使肌动蛋白-GAL4驱动品系与UAS-dUSP30RNAi转基因品系杂交，所述转基因品系允许dUSP30 RNAi 在肌动蛋白启动子的控制下表达(该肌动蛋白-GAL4＞dUSP30RNAi品系称为‘dUSP30敲倒’品系)。通过定量RT-PCR，与仅含有肌动蛋白-GAL4或仅含有UAS-dUSP30RNAi的对照亲本品系相比，通过肌动蛋白-GAL4激活 UAS-dUSP30RNAi导致～90％的dUSP30mRNA减少(图17C)。为了检测 dUSP30敲倒的保护性作用，我们使‘dUSP30敲倒’品系与parkin突变体果蝇 (park25)杂交(Greene等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)， 100：4078-4083(2003))。缺少parkin的果蝇在其间接飞行肌(IFMs)中表现出严重的线粒体自噬缺陷，在EM下，线粒体是畸形的，具有稀疏的、无组织的嵴，产生“苍白的”线粒体外观(图12A，以及Greene等，Proc.Natl. Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，100：4078-4083(2003))。与此相反，野生型果蝇具有多个平均堆叠成嵴的黑色染色的线粒体(图12A)。为了确定USP30抑制对Parkin-缺陷性线粒体的作用，我们使parkin突变体与dUSP30敲倒果蝇杂交。在“parkin突变体；dUSP30敲倒”果蝇中，大部分的IFM线粒体是电子致密的，并且含有多个嵴，尽管也偶然发现具有破碎的嵴的“苍白的”线粒体(图12A)。相对于总线粒体面积的含有无组织的嵴的线粒体的面积百分数的定量揭示dUSP30敲倒对线粒体完整的强烈改善(图12B-在parkin突变体中～90％，相对于在“parkin突变体；dUSP30敲倒”中的～25％)。“parkin突变体；dUSP30敲倒”果蝇还具有较少损坏的线粒体/ 肌肉面积(图12C)。由此，在parkin-缺乏的果蝇中，抑制dUSP30表达能够在体内极大地恢复线粒体的形态完整性。
为了检验在与PD相关的神经元中抑制USP30的作用，我们使用多巴胺脱羧酶(Ddc)-GAL439来在果蝇神经系统的胺能神经元中特异性驱动 dUSP30RNAi。作为线粒体损伤和PD的模型，我们用百草枯处理果蝇，百草枯是一种与PD相关的线粒体毒素(Castello等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，282：14186-14193(2007)；Cocheme等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)， 283：1786-1798(2008)；Tanner等，Environmental Health Perspect.(环境健康观点)，119：866-872(2011))。用百草枯(10mM，48小时)处理后，Ddc-GAL4 和UAS-dUSP30RNAi两个对照果蝇品系表现出减少的爬行超过15em的能力 (图12D)。该爬行缺陷被用L-DOPA的另外处理完全挽救(图17D)，这表明这种行为缺陷可能是由于多巴胺耗尽导致的。相一致地，在对照果蝇品系(Ddc-GAL4或UAS-dUSP30RNAi单独转基因的)中，百草枯处理(10mM， 48小时)引起果蝇头部多巴胺水平30-60％的减少，而没有改变5-羟色胺神经递质水平(这表明，在该模型中，百草枯对多巴胺能系统的特异性的毒性-图12F和图17E)。与L-DOPA类似，在Ddc-GAL4＞UAS-dUSP30RNAi果蝇中的dUSP30敲倒也完全挽救百草枯诱导的爬行减弱(图12D)，这表明在该行为检测中针对百草枯毒性的完全的保护性可以通过特异性在胺能神经元中抑制USP30而提供。在肌动蛋白-GAL4＞UAS-dUSP30RNAi果蝇中利用USP30的全部机体敲倒也观察到相似的完全保护作用(图12E)。令人惊讶地，Ddc神经元(Ddc-GAL4＞UAS-dUSP30RNAi果蝇)中的USP30敲倒也防止百草枯-诱导的多巴胺耗尽(图12F)。由于USP30敲倒挽救多巴胺的耗尽和运动元减弱二者，这些结果表明，在神经化学和功能方面，抑制USP30能够对多巴胺能神经元和生物体有益。
为了检测USP30敲倒是否对生物体存活有影响，我们监测随着延长的用百草枯处理(10mM，96小时)存活的果蝇的百分数。表达dUSP30 RNAi 的果蝇存活得显著比对照更久(图12G)。在肌动蛋白-GAL4和 UAS-dUSP30RNAi对照组中，在96小时，仅有＜15％用百草枯处理的果蝇存活，而在肌动蛋白-GAL4＞UAS-dUSP30RNAi(‘全机体dUSP30敲倒’)组中，～45％的果蝇存活(图12G)。我们证实了USP30敲倒的益处不是由于暴露于百草枯的差异，原因在于，通过LC-MS/MS测量，所有三种果蝇品系都摄入大致相等量的百草枯(每只果蝇平均百草枯的质量：UAS-dUSP30RNAi： 3.2μg，肌动蛋白-GAL4：2.7μg，肌动蛋白-GAL4＞UAS-dUSP30RNAi：2.7 μg)。果蝇中其他DUBs(dUSP47(CG5486)或dYOD1(CG4603))的敲倒在存活测定中没有提供益处；如果有一些的话，它们加剧响应百草枯的死亡率(图17F-H)。此外，向表达dUSP30RNAi的果蝇中引入人USP30 cDNA逆转由dUSP30RNAi提供的存活益处(图17I)，这表明RNAi作用的特异性。显著地，在Ddc神经元中特异性的USP30敲倒足以提供显著的存活益处，尽管低于全机体USP30敲倒(图12H)。这一结果暗示显著部分的USP30抑制的生物益处在多巴胺能神经元中调控，并且其进一步加强了USP30在多巴胺能神经元功能障碍中起关键作用的观点。
实施例9：讨论
更好地理解PD中的致病性机制将有助于合理设计用于这种神经变性病的减轻疾病的疗法。PD中减弱的氧化性磷酸酶的活性(Schapira 等，Lancet，1：1269(1989))、升高水平的氧化应激标记(Lee等，Biochem.J. (生物化学杂志)，441：523-540(2012))和mtDNA突变(Bender等，Nature Genet.(自然遗传学)，38：515-517(2006)；Kraytsberg等，NatureGenet.(自然遗传学)，38：518-520(2006))表明缺陷性线粒体的积聚(Zheng等，ScienceTransl.Med.，2：52ra73(2010))。PINK1/Parkin遗传学进一步涉及异常的线粒体生物学，并且意味着减弱的线粒体质量控制是PD病因学中的致病因素 (Youle等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，12：9-23(2011))。未清除的受损的线粒体可能是毒性来源，并且通过与健康的线粒体融合而“污染”线粒体网络(Tanaka等，J.Cell.Biol.(细胞生物学杂志)，191：1367-1380(2010))。
我们已经鉴定了USP30(其为一种定位在线粒体的DUB)作为线粒体自噬的负调节剂。USP30通过其去遍在蛋白酶活性反对Parkin-介导的遍在蛋白化和线粒体蛋白的降解，并且逆转用于线粒体自噬的受损的线粒体的标记。在表达Parkin的PD-相关的突变体的细胞中，USP30的敲倒抑制加速线粒体自噬，并且其恢复CCCP-诱导的线粒体降解。在parkin突变体果蝇中，USP30敲倒改善线粒体的完整性，这证实在体内，Parkin和USP30对线粒体质量具有相反的作用。在用百草枯处理的野生型果蝇中，USP30敲倒还赋予运动元行为和存活益处，这进一步支持USP30抑制可能改善线粒体损伤的影响的观点。
Parkin，USP30和线粒体质量控制
尽管Parkin和PINK1被鉴定为线粒体自噬的关键参与者，还缺少对线粒体自噬途径的详细的机制性理解，尤其是对哺乳动物细胞中的线粒体自噬途径的详细的机制性理解。神经元中基本线粒体自噬依赖于Parkin和 PINK1的事实(图3)表明这些蛋白主动监测正常存在的线粒体损伤。线粒体裂变-其似乎是Parkin-介导的线粒体自噬所必需的(Tanaka等，J.Cell. Biol.(细胞生物学杂志)，191：1367-1380(2010))-可能通过引发两个姐妹线粒体中的一个中的膜电位的瞬时下降而有助于基本的线粒体更新(Twig 等，EMBOJ.，27：433-446(2008))。如果膜电位不能迅速重建，则这种膜电位的瞬时下降产生PINK1积聚和Parkin招募的机会，导致最终的线粒体自噬。因此，在基本条件下，在裂变相关的线粒体膜电位下降过程中，USP30 敲倒可能通过有助于Parkin-介导的遍在蛋白化而加速线粒体自噬。由于受损的线粒体更可能积聚Parkin，因此，预测对USP30功能的抑制将优先清除不健康的线粒体。
由于Parkin连接酶活性通过遍在蛋白化标记线粒体，为了USP30敲倒以挽救线粒体自噬，可能需要Parkin突变体中的一些残余的连接酶活性。预测利用Parkin活性的完全丧失，USP30敲倒对于挽救清除是无效的，除非其他的E3连接酶具有重合的底物并且能够补偿Parkin的缺乏。在parkin 突变体果蝇(即使丢失大部分的parkin基因)中用USP30敲倒挽救线粒体完整性也支持后一种可能性。
按照正常的更新，清除的线粒体可能需要通过线粒体生物发生而被替代。在培养的细胞系中，线粒体损伤增加整体线粒体质量(Narendra等，PLoS Biology，8：e1000298(2010))。在这一情形中，令人感兴趣的注意到，Parkin 还能够通过降解负转录调节剂而加强线粒体的生物发生(Shin等，Cell(细胞)144：689-702(2011))。需要进一步研究来确定USP30是否也调节生物发生途径，以及由USP30抑制诱导的线粒体自噬是否伴有新线粒体产生。
在共同底物上USP30相对于Parkin
整体遍在蛋白化位点成像实验鉴定了多种其遍在蛋白化受Parkin过表达和USP30敲倒二者的影响的底物。在这些共有的假定的底物中，我们证实Miro和Tom20具有由Parkin和USP30拮抗调节的遍在蛋白化水平，即， GFP-Parkin过表达或USP30敲倒增加CCCP处理诱导的遍在蛋白化。有趣的是，这些共有的底物的子集，以Tom20为例，甚至在基本条件下，由USP30调节。Mull，Asns和Fkbp8-而不是Miro-是与Tom20表现相似的线粒体底物，在不存在CCCP时，随USP30敲倒表现出基本遍在蛋白化的增加。由此，USP30基本上使该组蛋白去遍在蛋白化，这可能通过抗衡线粒体E3连接酶进行，所述连接酶在不存在CCCP的条件下是有活性的并且作用在Tom20上而不作用在Miro上。CCCP处理后，USP30还抵消该组底物的Parkin依赖性的遍在蛋白化。另一方面，诸如Tom70，Mat2b和Pth2的蛋白与Miro表现相似，原因在于它们仅在CCCP处理后表现出随USP30敲倒增强的遍在蛋白化。这一观察表明这些子集的蛋白在不存在募集的 Parkin的条件下(即，Parkin是其主要的E3连接酶)进行低水平的基本遍在蛋白化，或者在基本条件下，USP30对那些蛋白没有活性。线粒体去极性可能通过PINK1-介导的磷酸化(Kondapalli等，Open Biology，2： 120080(2012)；而是参见Vives-Bauza等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，107：378-383(2010))调节Parkin的E3连接酶活性(Matsuda 等，J.Cell Biol.(细胞生物学杂志)，189：211-221(2010))；还需要研究组成型定位在线粒体上的USP30的活性是否也受线粒体损伤的调节。
整体遍在蛋白化分析还揭示一系列非线粒体蛋白，其遍在蛋白化受 Parkin和USP30相反地调节(包括核蛋白，代谢酶和遍在蛋白-蛋白酶体系统(UPS)的成分)。这表明Parkin与USP30之间的拮抗性功能关系可能超出线粒体。这些非线粒体“底物”可能受Parkin和USP30间接的调节，或者可以具有线粒体上的亚群，但是，由于计算工具所用的严格的滤过标准没有在形式上指定为具有线粒体定位(Pagliarini等，Cell(细胞)，134：112-123 (2008))。MS还鉴定了一些随CCCP(在内源性Parkin和USP30水平下)表现出增强的遍在蛋白化的蛋白，当Parkin过表达或USP30敲倒时遍在蛋白化没有进一步增加(例如，Ssbp，ZO1，Rab10，Vamp1)，这表明在线粒体去极化后启用备用的UPS途径。适当地注意到，在一些情形中，升高水平的遍在蛋白化的种类可能来源于总蛋白底物本身水平的增加。
有趣的是，Parkin还使USP30遍在蛋白化和降解，并且致病性的Parkin 突变阻断这一下调USP30的能力。不能去除线粒体自噬的负调节剂可能加重与这些Parkin突变体相关的低效的遍在蛋白化，并且还可能部分解释 USP30敲倒对线粒体自噬的挽救。
Parkin，USP30与神经变性
Parkin中PD-连锁的突变可能导致催化活性减少，增强的聚集和/或减少的表达(Hampe等，Human Mol.Genet.(人类分子遗传学)，15：2059-2075 (2006)；Matsuda等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，281：3204-3209(2006)； Wang等，J.Neurochem.(神经科学杂志)，93：422-431(2005)；Winklhofer 等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)278：47199-47208(2003))。在偶发性PD 中，Parkin活性还可能由于细胞应激性而被抑制(Corti等，Physiol.Rev.，91： 1161-1218(2011))。PD-连锁的PINK1突变减弱Parkin向受损的线粒体的易位(Matsuda等，J.Cell Biol.(细胞生物学杂志)，189：211-221(2010)； Narendra等，PLoS Biology，8：e1000298(2010)；Vives-Bauza等，Proc.Natl. Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，107：378-383(2010))。由此，Parkin 在线粒体质量控制中减少的功能在PD中可能比由稀有Parkin突变所代表的功能更普遍，这为USP30抑制在偶发性PD中的可能的应用提供进一步的支持。与USP30抑制的益处相一致，在表达PD-相关的突变体Parkin的细胞中，USP30的敲倒恢复线粒体自噬，并且减少神经元中的氧化应激。在果蝇parkin突变体中，USP30的敲倒改善线粒体的完整性。此外，USP30敲倒在针对百草枯的行外和存活测定中提供益处，百草枯是与线粒体相关的氧化性胁迫剂(Castello等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，282：14186-14193 (2007)；Cocheme等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，283：1786-1798(2008))。由于百草枯是流行病学上与PD联系的线粒体毒素(Tanner等，EnvironmentalHealth Perspect.(环境健康观点)，119：866-872(2011))，我们的发现为USP30的抑制可能有助于由线粒体损伤和功能障碍引起的疾病提供了体内证据。
在PD中，线粒体功能障碍对于黑质神经元不是特异性的，并且系统性存在(Schapira等，Parkinson’s Dis.(帕金森病)，2011：159160(2011))。由于USP30表达似乎是广泛存在的(Nakamura和Hirose，Mol.Biol.Cell(分子生物学和细胞)，19：1903-1914(2008))，USP30抑制具有通过促进受损的线粒体的清除而提供广泛的益处的潜力。除了神经元之外，长期存活的代谢活性细胞，如心肌细胞，也依赖于有效的线粒体质量控制系统(Gottlieb 等，Am.J.Physiol.Cell Physiol.，299：C203-210(2010))。在这种情形中，已经表明Parkin通过响应局部缺血应激激活线粒体自噬并且清除受损的线粒体而保护心肌细胞抵抗局部缺血/再灌注损伤(Huang等，PLoS One，6： e20975(2011))。在遗传性线粒体疾病中，在相同细胞内，mtDNA突变与野生型mtDNA共存，并且仅在突变的mtDNA以高比例存在时，跟着发生线粒体功能障碍和疾病(Bayona-Bafaluy等，Proc.Natl.AcadSci.USA(美国国家科学院学报)，102：14392-14397(2005))。有趣的是，Parkin过表达清除具有有害mtDNA突变的线粒体，并且可能通过降解含有突变mtDNA的线粒体而恢复线粒体功能(Suen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，107：11835-11840(2010))。因此，USP30抑制具有通过增强线粒体质量而有益于除PD之外的疾病的潜力。
实施例10：USP30的肽抑制剂
如之前所述(Stanger，等，2012，Nat.Chem.Bio.(自然化学生物学)，7： 655-660)，两种类型的噬菌体展示的首次用于实验的肽文库，即线性文库和环形文库，通过多轮用溶液中的生物素酰化的USP30_cd(具有C77A突变的USP30催化结构域)进行的结合选择进行循环。选择鉴定了肽 USP30_3和USP30_8，其具有中等的点状ELISA信号(信号/噪声比率为～5)。USP_30和USP_8具有下述序列：
USP30_3：PLYCFYDLTYGYLCFY(SEQ ID NO：1)；
USP30_8：VSRCYIFWNEMFCDVE(SEQ ID NO：2)。
然后，测定USP30_3和USP30_8对于USP30的抑制以及对于USP7， USP5，UCHL3和USP2的抑制，以确定每种肽对于USP30的特异性，如下所述。将浓度范围为0-100μM(对于USP30_3)和0-500μM(对于USP30_8) 的USP30肽配体与250nM遍在蛋白-AMC(BostonBiochem.，Boston，MA； Cat.No.U-550)混合。将一组在含有0.05％吐温20，0.1％BSA和1mMDTT 的PBS缓冲液中30分钟的5.6，2，2，5和0.05nM的分别针对USP30，USP7， USP2，USP5，和UCHL3的DUBs加入到遍在蛋白-AMC/USP30肽配体混合物中，并且立即通过使用M5e(Molecular Device，Sunnyvale， CA)监测荧光(340nm激发，465nm发射)来测量初始速率。基于增加的荧光信号的斜率计算初始速率。将所述速率标准化为肽配体浓度为零时的速率的百分数，并且用KaleidaGraph通过下述方程拟合处理数据：
其中v是最大速率的百分数；I是抑制剂(USP30肽配体)的浓度；v0和vmax分别是最小和最大速率百分数。
实验结果显示在图14中。肽USP30_3表现出良好的针对USP30的特异性，IC50为8.0μM。肽USP30_3针对USP5的IC50是六倍多高，为49.4μM，并且针对USP2是10倍多高，为约100μM。肽USP30_3针对UCHL3和USP2 的IC50为＞200μM。
选择肽USP30_3用于亲和力成熟。为了提高亲和力，使用USP30_3序列作为靶向的亲本，构建灵活的随机化的文库，并且针对溶液中的 USP30_cd进行淘选，如之前所述(Stanger，等，2012，Nat.Chem.Bio.(自然化学生物学)，7：655-660)。四轮溶液淘选后，鉴定了20种以比亲本USP30_3 更强的点状噬菌体ELISA信号结合到USP30催化结构域上的肽，表现为信号/噪声比率提高约3-6倍。
图15显示USP30_3中的位置的残基概率的图表和亲和力成熟的肽。某些亲和力成熟的肽的序列，以及信号/噪声比率(“S/N”)显示在图表下方，所述比率是针对捕获在NeutrAvidin-包被的384孔Maxisorb平板上的生物素化的USP30 cd的点状噬菌体ELISA信号(“信号”)相对于仅针对 NeutrAvidin-包被的平板的ELISA信号的比率。图15还显示每种序列在选择中出现的次数(“n”)，克隆的总数(“总数”；66)，以及特定序列的个数 (“Uniq”；20)。除USP30_3.27和USP30_3.62之外，所有显示的亲和力成熟的肽具有大于10的信号/噪声比率。
然后，相对于其他去遍在蛋白化的酶，检测某些肽针对USP30的特异性。结合通过ELISA进行检测。图16显示亲本USP30_3肽以及亲和力成熟的肽USP30_3.2，USP30_3.23，USP30_3.65和USP30_3.88与USP2，USP7， USP14和USP30(分别地，活性位点半胱氨酸突变为丙氨酸)的催化结构域的结合以及与UCHL1，UCHL3和UCHL5的催化结构域的信号/噪声比率(“s/n比率”)。对于关于每种肽的条线图的设置，从左至右，所检测的靶标为USP2，USP7，USP14，USP30，UCHL1，UCHL3和UCHL5。
尽管为理解清楚的目的，前述本发明已经通过举例说明和实施例的方式进行了某种详细的说明，但是本描述和实施例不应该解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容通过引用完全清楚地结合在本文中。
表4：序列的表格
附件A

Claims (68)

1.增加细胞中线粒体自噬的方法，所述方法包括使所述细胞与USP30的抑制剂接触。
2.增加细胞中的线粒体遍在蛋白化的方法，所述方法包括使所述细胞与USP30的抑制剂接触。
3.增加细胞中选自Tom20、MIRO、MUL1、ASNS、FKBP8、TOM70、MAT2B、PRDX3、IDE、VDAC1、VDAC2、VDAC3、IPO5、PSD13、UBP13和PTH2中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种或十四种蛋白的遍在蛋白化的方法，所述方法包括使所述细胞与USP30的抑制剂接触。
4.权利要求3的方法，其中所述方法包括增加选自Tom 20的K56、K61和K68的至少一个、至少两个或三个氨基酸的遍在蛋白化。
5.权利要求3或权利要求4的方法，其中所述方法包括增加选自MIRO的K153、K187、K330、K427、K512、K535、K567和K572的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或八个氨基酸的遍在蛋白化。
6.权利要求3-5中任一项的方法，其中所述方法包括增加选自MUL1的K273、K299和K52的至少一个、至少两个或三个氨基酸的遍在蛋白化。
7.权利要求3-6中任一项的方法，其中所述方法包括增加选自ASNS的K147、K168、K176、K221、K244、K275、K478、K504和K556的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个或九个氨基酸的遍在蛋白化。
8.权利要求3-7中任一项的方法，其中所述方法包括增加选自FKBP8的K249、K271、K273、K284、K307、K317、K334和K340的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或八个氨基酸的遍在蛋白化。
9.权利要求3-8中任一项的方法，其中所述方法包括增加选自TOM70的K78、K120、K123、K126、K129、K148、K168、K170、K178、K185、K204、K230、K233、K245、K275、K278、K312、K326、K349、K359、K441、K463、K470、K471、K494、K501、K524、K536、K563、K570、K599、K600和K604的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个氨基酸的遍在蛋白化。
10.权利要求3-9中任一项的方法，其中所述方法包括增加选自MAT2B的K209、K245、K316和K326的至少一个、至少两个、至少三个或四个氨基酸的遍在蛋白化。
11.权利要求3-10中任一项的方法，其中所述方法包括增加选自PRDX3的K83、K91、K166、K241和K253的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或五个氨基酸的遍在蛋白化。
12.权利要求3-11中任一项的方法，其中所述方法包括增加选自IDE的K558、K657、K854、K884、K929和K933的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或六个氨基酸的遍在蛋白化。
13.权利要求3-12中任一项的方法，其中所述方法包括增加选自VDAC1的K20、K53、K61、K109、K110、K266和K274的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或七个氨基酸的遍在蛋白化。
14.权利要求3-13中任一项的方法，其中所述方法包括增加选自VDAC2的K31、K64、K120、K121、K277和K285的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或六个氨基酸的遍在蛋白化。
15.权利要求3-14中任一项的方法，其中所述方法包括增加选自VDAC3的K20、K53、K61、K109、K110、K163、K266和K274的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、或八个氨基酸的遍在蛋白化。
16.权利要求3-15中任一项的方法，其中所述方法包括增加选自IPO5的K238、K353、K436、K437、K548、K556、K613、K678、K690、K705、K775和K806的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个氨基酸的遍在蛋白化。
17.权利要求3-16中任一项的方法，其中所述方法包括增加选自PSD13的K2、K32、K99、K115、K122、K132、K161、K186、K313、K321、K347、K350和K361的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个氨基酸的遍在蛋白化。
18.权利要求3-17中任一项的方法，其中所述方法包括增加选自UBP13的K18、K190、K259、K326、K328、K401、K405、K414、K418、K435、K586、K587和K640的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个氨基酸的遍在蛋白化。
19.权利要求3-18中任一项的方法，其中所述方法包括增加选自PTH2的47、76、81、95、106、119、134、171、177的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个或九个氨基酸的遍在蛋白化。
20.权利要求1-19中任一项的方法，其中所述细胞处于氧化应激下。
21.减少细胞中的氧化应激的方法，所述方法包括使所述细胞与USP30的抑制剂接触。
22.权利要求1-21中任一项的方法，其中所述细胞包含Parkin中的致病性突变、PINK1中的致病性突变或者包含Parkin中的致病性突变与PINK1中的致病性突变。
23.权利要求22的方法，其中所述细胞包含选自表1中的突变的Parkin中的致病性突变。
24.权利要求22或权利要求23的方法，其中所述细胞包含选自表2中的突变的PINK1中的致病性突变。
25.权利要求1-24中任一项的方法，其中所述细胞选自神经元、心脏的细胞和肌细胞。
26.权利要求1-26中任一项的方法，其中所述细胞包含在受试者中。
27.权利要求1-25中任一项的方法，其中所述细胞是离体的或体外的。
28.治疗受试者中涉及线粒体缺陷的病症的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的USP30的抑制剂。
29.权利要求28的方法，其中所述涉及线粒体缺陷的病症选自涉及线粒体自噬缺陷的病症、涉及线粒体DNA突变的病症、涉及线粒体氧化应激的病症、涉及线粒体形状或形态缺陷的病症、涉及线粒体膜电位缺陷的病症和涉及溶酶体贮积缺陷的病症。
30.权利要求28或权利要求29的方法，其中所述涉及线粒体缺陷的病症选自：神经变性病；线粒体肌病、脑病、乳酸性酸中毒和卒中样发作(MELAS)综合症；莱伯遗传性视神经病(LHON)；神经病、共济失调、色素性视网膜炎-母系遗传的利氏综合征(NARP-MILS)；Danon病；引起心肌梗死的缺血性心脏病；多发性硫酸脂酶缺乏症(MSD)；粘脂质累积II(ML II)；粘脂质累积III(ML III)；粘脂质累积IV(ML IV)；GM1-神经节苷脂贮积病(GM1)；神经元蜡样脂-脂褐质沉积症(NCL1)；阿尔珀斯病；巴尔特综合征；β-氧化缺陷；肉碱-酰基-肉碱缺乏症；肉碱缺乏症；肌酸缺乏综合征；辅酶Q10缺乏症；复合物I缺乏症；复合物II缺乏症；复合物III缺乏症；复合物IV缺乏症；复合物V缺乏症；COX缺乏症；慢性进行性外侧眼肌麻痹(CPEO)；CPT I缺乏症；CPT II缺乏症；II型戊二酸尿症；卡恩斯-塞尔综合征；乳酸性酸中毒；长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(LCHAD)；利氏病或综合征；致死性幼儿心肌病(LIC)；勒夫特病；II型戊二酸尿症；中等链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(MCAD)；肌阵挛型癫痫与破碎红纤维(MERRF)综合征；线粒体隐性遗传的共济失调综合征；线粒体细胞病；线粒体DNA耗竭综合征；肌神经胃肠紊乱与脑病；皮尔逊综合征；丙酮酸羧化酶缺乏症；丙酮酸脱氢酶缺乏症；POLG突变；中等链/短链3-羟基酰基-辅酶A脱氢酶(M/SCHAD)缺乏症；和非常长的长链酰基-辅酶A脱氢酶(VLCAD)缺乏症。
31.权利要求30的方法，其中所述神经变性病选自阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、亨廷顿病、局部缺血、中风、具有雷维小体的痴呆症和额颞性痴呆症。
32.治疗受试者中的神经变性病的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的USP30的抑制剂。
33.权利要求32的方法，其中所述神经变性病选自帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、局部缺血、中风、具有雷维小体的痴呆症和额颞性痴呆症。
34.治疗受试者中的帕金森病的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的USP30的抑制剂。
35.权利要求28-34中任一项的方法，其中所述受试者在所述受试者的至少一部分细胞中包含Parkin中的致病性突变、PINK1中的致病性突变或者包含Parkin中的致病性突变与PINK1中的致病性突变。
36.权利要求35的方法，其中所述Parkin中的致病性突变选自表1中的突变。
37.权利要求35或权利要求36的方法，其中所述PINK1中的致病性突变选自表2中的突变。
38.治疗受试者中涉及经受氧化应激的细胞的病症的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的USP30的抑制剂。
39.权利要求28-38中任一项的方法，其中所述USP30的抑制剂口服、肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。
40.权利要求28-39中任一项的方法，其中所述方法包括施用至少一种另外的治疗剂。
41.权利要求40的方法，其中所述至少一种另外的治疗剂选自左旋多巴，多巴胺激动剂，单氨基加氧酶(MAO)B抑制剂，儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)抑制剂，抗胆碱能药，金刚烷胺，利芦噻唑，胆碱酯酶抑制剂，美金刚，丁苯那嗪，抗精神病药，氯硝西泮，地西泮，抗抑郁药和抗惊厥药。
42.权利要求1-41中任一项的方法，其中所述USP30的抑制剂是USP30表达的抑制剂。
43.权利要求42的方法，其中所述USP30表达的抑制剂选自反义寡核苷酸和短干扰RNA(siRNA)。
44.权利要求1-43中任一项的方法，其中所述USP30的抑制剂是USP30活性的抑制剂。
45.权利要求44的方法，其中所述USP30活性的抑制剂选自抗体、肽、肽体、适体和小分子。
46.USP30的抑制剂，其用于治疗受试者中涉及线粒体缺陷的病症。
47.权利要求46的USP30的抑制剂，其中所述涉及线粒体缺陷的病症选自涉及线粒体自噬缺陷的病症、涉及线粒体DNA突变的病症、涉及线粒体氧化应激的病症、涉及线粒体形状或形态缺陷的病症、涉及线粒体膜电位缺陷的病症和涉及溶酶体贮积缺陷的病症。
48.权利要求46或权利要求47的USP30的抑制剂，其中所述涉及线粒体缺陷的病症选自：神经变性病；线粒体肌病、脑病、乳酸性酸中毒和卒中样发作(MELAS)综合症；莱伯遗传性视神经病(LHON)；神经病、共济失调、色素性视网膜炎-母系遗传的利氏综合征(NARP-MILS)；Danon病；引起心肌梗死的缺血性心脏病；多发性硫酸脂酶缺乏症(MSD)；粘脂质累积II(ML II)；粘脂质累积III(ML III)；粘脂质累积IV(ML IV)；GM1-神经节苷脂贮积病(GM1)；神经元蜡样脂-脂褐质沉积症(NCL1)；阿尔珀斯病；巴尔特综合征；β-氧化缺陷；肉碱-酰基-肉碱缺乏症；肉碱缺乏症；肌酸缺乏综合征；辅酶Q10缺乏症；复合物I缺乏症；复合物II缺乏症；复合物III缺乏症；复合物IV缺乏症；复合物V缺乏症；COX缺乏症；慢性进行性外侧眼肌麻痹(CPEO)；CPTI缺乏症；CPTII缺乏症；II型戊二酸尿症；卡恩斯-塞尔综合征；乳酸性酸中毒；长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(LCHAD)；利氏病或综合征；致死性幼儿心肌病(LIC)；勒夫特病；II型戊二酸尿症；中等链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(MCAD)；肌阵挛型癫痫与破碎红纤维(MERRF)综合征；线粒体隐性遗传的共济失调综合征；线粒体细胞病；线粒体DNA耗竭综合征；肌神经胃肠紊乱与脑病；皮尔逊综合征；丙酮酸羧化酶缺乏症；丙酮酸脱氢酶缺乏症；POLG突变；中等链/短链3-羟基酰基-辅酶A脱氢酶(M/SCHAD)缺乏症；和非常长的长链酰基-辅酶A脱氢酶(VLCAD)缺乏症。
49.权利要求48的USP30的抑制剂，其中所述神经变性病选自阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、亨廷顿病、局部缺血、中风、具有雷维小体的痴呆症和额颞性痴呆症。
50.USP30的抑制剂，其用于治疗受试者中的神经变性病。
51.权利要求50的USP30的抑制剂，其中所述神经变性病选自帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、局部缺血、中风、具有雷维小体的痴呆症和额颞性痴呆症。
52.USP30的抑制剂，其用于治疗受试者中的帕金森病。
53.权利要求46-52中任一项的USP30的抑制剂，其中所述受试者在所述受试者的至少一部分细胞中包含在Parkin中的致病性突变、在PINK1中的致病性突变或包含在Parkin中的致病性突变和在PINK1中的致病性突变。
54.权利要求53的USP30的抑制剂，其中所述在Parkin中的致病性突变选自表1中的突变。
55.权利要求53或权利要求54的USP30的抑制剂，其中所述在PINK1中的致病性突变选自表2中的突变。
56.USP30的抑制剂，其用于治疗受试者中涉及经受氧化应激的细胞的病症。
57.权利要求46-56中任一项的USP30的抑制剂，其中所述USP30的抑制剂口服、肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。
58.权利要求46-57中任一项的USP30的抑制剂，其与至少一种另外的治疗剂组合。
59.权利要求58的USP30的抑制剂，其中所述至少一种另外的治疗剂选自左旋多巴，多巴胺激动剂，单氨基加氧酶(MAO)B抑制剂，儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)抑制剂，抗胆碱能药，金刚烷胺，利芦噻唑，胆碱酯酶抑制剂，美金刚，丁苯那嗪，抗精神病药，氯硝西泮，地西泮，抗抑郁药和抗惊厥药。
60.权利要求46-59中任一项的USP30的抑制剂，其中所述USP30的抑制剂是USP30表达的抑制剂。
61.权利要求60的USP30的抑制剂，其中所述USP30表达的抑制剂选自反义寡核苷酸和短干扰RNA(siRNA)。
62.权利要求46-59中任一项的USP30的抑制剂，其中所述USP30的抑制剂是USP30活性的抑制剂。
63.权利要求62的方法，其中所述USP30活性的抑制剂选自抗体、肽、肽体、适体和小分子。
64.包含下述氨基酸序列的肽：
X1X2CX3X4X5X6X7X8X9X10X11CX12(SEQ ID NO：48)
其中：
X1选自L，M，A，S和V；
X2选自Y，D，E，I，L，N和S；
X3选自F，I和Y；
X4选自F，I和Y；
X5选自D和E；
X6选自L，M，V和P；
X7选自S，N，D，A和T；
X8选自Y，D，F，N和W；
X9选自G，D和E；
X10选自Y和F；
X11选自L，V，M，Q和W；以及
X12选自F，L，C，V和Y；
其中所述肽以小于10μM的IC50抑制USP30。
65.权利要求64的肽，其中所述肽针对选自USP7、USP5、UCHL3和USP2的至少一种、至少两种或至少三种肽酶的IC50大于20μM，大于30μM，大于40μM或大于50μM。
66.权利要求64或权利要求65的肽，其中所述肽包含与选自SEQ ID NOs：1-22的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列。
67.反义寡核苷酸，其包含与USP30 mRNA的区域和/或USP30前mRNA的区域至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％互补的核苷酸序列，其中所述区域至少是至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个核苷酸长。
68.siRNA，其包含与USP30 mRNA的区域和/或USP30前mRNA的区域至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的核苷酸序列，其中所述区域至少是至少10个、至少15个、至少20个或至少25个核苷酸长。
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