JP6310919B2 - Usp30インヒビター及び使用方法 - Google Patents
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Description
USP30インヒビター及びUSP30インヒビターの使用方法が提供される。いくつかの実施態様では、ミトコンドリア障害が関与する症状を処置する方法が提供される。
マイトファジーは、リソソームによる分解を介してミトコンドリアを排除する特殊なオートファジー経路である。このように、それは、オルガネラの正常な細胞ターンオーバー中に、赤血球の成熟中に、及び受精後にミトコンドリアを除去して、精子由来のミトコンドリアを排除する。マイトファジーはまた、損傷ミトコンドリアのクリアランス(これは、ミトコンドリア品質コントロールの重要な一面である)を媒介する。障害のある又は過剰なミトコンドリアは、クリアランスされずに放置されると異常な酸化ストレス源になり、ミトコンドリア融合を介して健全なミトコンドリアを損ない得る。酵母では、マイトファジーの選択的遮断は、過剰なミトコンドリア及びミトコンドリアDNA(mt−DNA)の喪失によって活性酸素種(ROS)の産生増加を引き起こす。ミトコンドリア品質コントロールの障害も、重要な生合成経路(ATP産生及びCa2+バッファリング)に影響を与え、全体的な細胞ホメオスタシスを障害し得る。
いくつかの実施態様では、細胞におけるマイトファジーを増加させる方法が提供される。いくつかの実施態様では、前記方法は、前記細胞をUSP30インヒビターと接触させることを含む。
X1X2CX3X4X5X6X7X8X9X10X11CX12(配列番号48)
(配列中、
X1は、L、M、A、S及びVから選択され;
X2は、Y、D、E、I、L、N及びSから選択され;
X3は、F、I及びYから選択され;
X4は、F、I及びYから選択され;
X5は、D及びEから選択され;
X6は、L、M、V及びPから選択され;
X7は、S、N、D、A及びTから選択され;
X8は、Y、D、F、N及びWから選択され;
X9は、G、D及びEから選択され;
X10は、Y及びFから選択され;
X11は、L、V、M、Q及びWから選択され;並びに
X12は、F、L、C、V及びYから選択される)を含む。
いくつかの実施態様では、ペプチドUSP30インヒビターのペプチドは、配列番号1〜22から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は100%同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様では、前記ペプチドは、10μM未満のIC50でUSP30を阻害する。いくつかの実施態様では、USP7、USP5、UCHL3及びUSP2から選択される少なくとも1個、少なくとも2個又は少なくとも3個のペプチダーゼに対するペプチドUSP30インヒビターのIC50は、20μM超、30μM超、40μM超又は50μM超である。
本発明者らは、USP30(これは、ミトコンドリアに局在するデユビキチナーゼ(DUB)である)をParkin媒介性マイトファジーのアンタゴニスト(atagonist)として同定した。USP30は、そのデユビキチナーゼ活性を介して、損傷ミトコンドリアのユビキチン化及び分解に対して反作用するので、USP30の阻害は、突然変異体Parkinによって引き起こされるマイトファジーの障害をレスキューする。さらに、USP30のUSP30阻害は酸化ストレスを減少させ、ミトコンドリア毒素のロテノンに対する保護を提供する。損傷ミトコンドリアはParkinを蓄積する可能性が高いので、USP30の阻害は、不健全なミトコンドリアを選択的にクリアランスするはずである。ニューロン(例えば、パーキンソン病におけるミトコンドリア機能障害に対して特に脆弱な黒質ニューロン)に加えて、心筋細胞などの長命の代謝活性細胞も、効率的なミトコンドリア品質コントロールシステムに依拠している。これに関連して、Parkinは、虚血性ストレスに応じてマイトファジーを活性化し、損傷ミトコンドリアをクリアランスすることによって、虚血/再灌流傷害から心筋細胞を保護することが示されている。従って、USP30インヒビターにより、神経学的症状、心臓症状及び全身症状を含むミトコンドリア障害が関与する症状の処置が提供される。
「インヒビター」は、ターゲットの活性の1つ以上を遮断し、中和し、阻害し、無効化し、減少させ及び/若しくは干渉することができ、並びに/又はターゲットタンパク質の発現(又は、ターゲットタンパク質をコードする核酸の発現)を減少させることができる薬剤を指す。インヒビターとしては、限定されないが、抗体、ポリペプチド、ペプチド、核酸分子、低分子干渉RNA(siRNA)及び他の阻害RNA、低分子(例えば、無機低分子)、多糖、ポリヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー及びペプチボディが挙げられる。インヒビターは、ターゲットタンパク質の活性及び/又は発現を、そのインヒビターで処理されていないターゲットタンパク質の発現及び/又は活性と比較して少なくとも10%減少(例えば、少なくとも15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%又はさらには100%減少)させ得る。
分数X/Yの100倍
(式中、Xは、A及びBのプログラムアラインメント中の、配列アラインメントプログラムALIGN-2によって同一マッチとしてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Yは、B中のアミノ酸残基の総数である)。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと同等ではない場合、Bに対するAのアミノ酸配列同一性の%は、Aに対するBのアミノ酸配列同一性の%と同等ではないと認識されよう。特に明記しない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性の%値は、直前の段落に記載されているようにALIGN-2コンピュータプログラムを使用して得られる。
様々な態様では、本発明は部分的には、USP30インヒビター、並びに疾患及び障害を処置する方法であって、USP30を阻害することを含む方法に基づくものである。
本発明は部分的には、USP30活性インヒビター及び/又はUSP30発現インヒビターが、ミトコンドリアのユビキチン化及びマイトファジーを増加及び/又は回復させるのに有効であるという発見に基づくものである。いくつかの実施態様では、USP30インヒビターは、神経変性疾患、例えばパーキンソン病、及びミトコンドリア障害が関与する症状、例えばマイトファジーの障害、ミトコンドリアDNAの突然変異、ミトコンドリアの酸化ストレス及び/又はリソソーム蓄積障害が関与するものを処置するのに有効である。
いくつかの実施態様では、USP30 mRNA及び/又はUSP30 mRNA前駆体にハイブリダイゼーションするアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。USP30をコードする非限定的で例示的なヒトmRNA配列を配列番号30に示す(表4)。いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、USP30 mRNA及び/又はUSP30 mRNA前駆体の領域にハイブリダイゼーションし、二本鎖RNA/DNAハイブリッドを切断するRNase Hによるその分解を指令する。USP30 mRNA及び/又はUSP30 mRNA前駆体の切断を媒介することによって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内のUSP30タンパク質の量を減少させ得る(すなわち、USP30発現を阻害し得る)。いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドはRNase Hによる分解を媒介せず、例えば、翻訳機構の結合若しくはプロセスビリティに干渉することによってmRNAの翻訳を「遮断」するか、又は例えば、スプライシング機構及び/若しくはスプライス部位のアクセシビリティに干渉することによってmRNA前駆体の適切なスプライシングを「遮断」する。いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、RNase H以外の機構によるmRNA及び/又はmRNA前駆体の分解を媒介し得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドの任意の阻害機構が本明細書で意図される。
いくつかの実施態様では、USP30発現は、低分子干渉RNA(siRNA)によって阻害される。本明細書で使用されるsiRNAは二本鎖RNA(dsRNA)と同義であり、各末端のヘアピン構造(小ヘアピンRNA又はshRNAとも称される)の有無にかかわらず、二本鎖RNAオリゴマーを含む。低分子干渉RNAは、小分子干渉RNA、サイレンシングRNA、低分子阻害RNA及び/又は小分子阻害RNAとしても公知であり、本明細書では、これらの用語を同等であると考える。
いくつかの実施態様では、USP30インヒビターは抗体である。「抗体」という用語は本明細書では最も広い意味で使用され、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)及び抗体フラグメントを含む様々な抗体構造を包含する。本明細書で使用される「抗体」という用語は、少なくとも重鎖の相補性決定領域(CDR)1、CDR2及びCDR3と、少なくとも軽鎖のCDR1、CDR2及びCDR3とを含む分子であって、抗原に結合することができる分子を指す。抗体という用語は、限定されないが、抗原に結合することができるフラグメント、例えばFv、一本鎖Fv(scFv)、Fab、Fab’及び(Fab’)2を含む。抗体という用語はまた、限定されないが、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びマウス、ヒト、カニクイザルなどの様々な種の抗体を含む。
いくつかの実施態様では、USP30インヒビターはペプチドである。ペプチドは、一本鎖のD−若しくはL−アミノ酸、又はD−及びL−アミノ酸がペプチド結合によって連結された混合物から構成されるアミノ酸配列である。ペプチドのアミノ酸サブユニットは天然に存在するアミノ酸でもよいし、又は天然に存在しないアミノ酸でもよい。多くの天然に存在しないアミノ酸が当技術分野で公知であり、市販されている。さらに、アミノ酸サブユニットを連結するペプチド結合を改変し得る。例えば、Sigma-Aldrich; Gentilucci et al., Curr. Pharm. Des. 16: 3185-3203 (2010);US2008/0318838を参照のこと。一般に、ペプチドは少なくとも2個のアミノ酸残基を含有し、約50アミノ酸長未満である。様々な実施態様では、ペプチドインヒビターは、3〜50個、5〜50個、10〜50個、10〜40個、10〜35個、10〜30個又は10〜25個のアミノ酸を含み得るか、又はこれらからなり得る。様々な実施態様では、ペプチドインヒビターは、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個又は25個のアミノ酸を含み得る。様々な実施態様では、ペプチドインヒビターは、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個又は25個のアミノ酸からなり得る。
X1X2CX3X4X5X6X7X8X9X10X11CX12(配列番号48)
(配列中、
X1は、L、M、A、S及びVから選択され;
X2は、Y、D、E、I、L、N及びSから選択され;
X3は、F、I及びYから選択され;
X4は、F、I及びYから選択され;
X5は、D及びEから選択され;
X6は、L、M、V及びPから選択され;
X7は、S、N、D、A及びTから選択され;
X8は、Y、D、F、N及びWから選択され;
X9は、G、D及びEから選択され;
X10は、Y及びFから選択され;
X11は、L、V、M、Q及びWから選択され;並びに
X12は、F、L、C、V及びYから選択される)を含む。いくつかの実施態様では、ペプチドは、10μM未満のIC50でUSP30を阻害する。いくつかの実施態様では、X1は、L及びMから選択される。いくつかの実施態様では、X3は、Y及びDから選択される。いくつかの実施態様では、X3は、Fである。いくつかの実施態様では、X4は、Y及びFから選択される。いくつかの実施態様では、X4は、Yである。いくつかの実施態様では、X5は、Dである。いくつかの実施態様では、X6は、L及びMから選択される。いくつかの実施態様では、X7は、S、N及びDから選択される。いくつかの実施態様では、X8は、Yである。いくつかの実施態様では、X9は、Gである。いくつかの実施態様では、X10は、Yである。いくつかの実施態様では、X11は、Lである。いくつかの実施態様では、X12は、F及びLから選択される。いくつかの実施態様では、X12は、Fである。
XAX1X2CX3X4X5X6X7X8X9X10X11CX12XB(配列番号49)
(配列中、X1〜X12は、上に定義されているとおりであり、XA及びXBはそれぞれ独立して、任意のアミノ酸である)を含む。いくつかの実施態様では、XAは、S、A、T、E、Q、D及びRから選択される。いくつかの実施態様では、XBは、D、Y、E、H、S及びIから選択される。
いくつかの実施態様では、USP30インヒビターはペプチボディである。ペプチボディは、ビヒクルに連結されたペプチド配列である。いくつかの実施態様では、ペプチボディのビヒクル部分は分解を減少させ、及び/又は半減期を増加させ、毒性を減少させ、免疫原性を減少させ、及び/又はペプチドの生物学的活性を増加させる。いくつかの実施態様では、ペプチボディのビヒクル部分は、抗体Fcドメインである。他のビヒクルとしては、直鎖状ポリマー(例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリリシン、デキストランなど);分岐鎖状ポリマー(例えば、米国特許第4,289,872号及び米国特許第5,229,490号;WO1993/0021259を参照のこと);脂質;コレステロール基(例えば、ステロイド);炭水化物又はオリゴ糖;又は任意の天然若しくは合成タンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドビヒクルが挙げられる。ペプチボディのペプチド部分は、典型的には、ターゲット、例えばUSP30に結合する。いくつかの実施態様(emodiments)では、ペプチボディのペプチド部分は、本明細書に記載されるペプチドである。
いくつかの実施態様では、USP30インヒビターはアプタマーである。本明細書で使用される「アプタマー」という用語は、USP30などのターゲット分子に特異的に結合する核酸分子を指す。高特異的であり、サイズが比較的小さく、及び/又は非免疫原性であるように、アプタマーを選択し得る。例えば、Ni, et al., Curr. Med. Chem. 18: 4206 (2011)を参照のこと。いくつかの実施態様では、アプタマーは、USP30に特異的に結合して阻害することができる二次及び/又は三次構造を形成する小さなRNA、DNA又は混合RNA/DNA分子である。
いくつかの実施態様では、低分子USP30インヒビターが提供される。いくつかの実施態様では、低分子USP30インヒビターは、酵素活性又はターゲット結合の効率が減少するように、USP30に結合してUSP30酵素活性(例えば、ペプチダーゼ活性)を阻害し、及び/又はUSP30のターゲット結合に干渉し、及び/又はUSP30のコンフォメーションを変化させる。
様々なアッセイを使用して、USP30インヒビターを同定及び試験し得る。USP30タンパク質発現を減少させるインヒビターの場合、タンパク質レベルを検出する任意のアッセイが、阻害を測定するのに適切であり得る。一例として、タンパク質レベルは、USP30に結合する抗体を使用する様々なイムノアッセイ、例えばELISA、ウエスタンブロッティング、免疫組織化学などによって検出され得る。インヒビターがUSP30の細胞内局在性に影響を与える場合、例えば、免疫組織化学によって、又は細胞成分を分画し、1つ以上の抗体を使用して様々な画分中のUSP30レベルを検出することによって、細胞内局在性の変化を検出し得る。USP30 mRNAレベルを減少させるインヒビターの場合、逆転写酵素PCR(RT−PCR)などの増幅系アッセイを使用して、mRNAレベルの変化を検出し得る。
本明細書に記載されるUSP30インヒビターの医薬製剤は、所望の程度の純度を有するこのようなインヒビターを、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態の1つ以上の任意の薬学的に許容しうる担体(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))と混合することによって調製される。薬学的に許容しうる担体は、一般に、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、限定されないが:緩衝剤、例えばリン酸、クエン酸及び他の有機酸;アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤;保存剤(例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチル又はベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;及びm−クレゾール);低分子量(約10残基未満)のポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン;グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖、二糖及び他の炭水化物;キレート化剤、例えばEDTA;糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール;塩形成対イオン、例えばナトリウム;金属錯体(例えば、Zn−タンパク質複合体);及び/又は非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコール(PEG)が挙げられる。本明細書における例示的な薬学的に許容しうる担体としてはさらに、間質性薬物分散剤、例えば可溶性中性−活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)、例えばヒト可溶性PH−20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばrHuPH20(HYLENEX(登録商標), Baxter International, Inc.)が挙げられる。rHuPH20を含む特定の例示的なsHASEGP及びその使用方法は、米国特許公開第2005/0260186号及び米国特許公開第2006/0104968号に記載されている。一態様では、sHASEGPをコンドロイチナーゼなどの1つ以上のさらなるグリコサミノグリカナーゼと組み合わせる。
本明細書で提供されるUSP30インヒビターのいずれかは、方法、例えば治療方法で使用され得る。いくつかの実施態様では、細胞におけるマイトファジーを増加させる方法であって、前記細胞におけるUSP30阻害を可能にする条件下で、前記細胞をUSP30インヒビターと接触させることを含む方法が提供される。いくつかの実施態様では、細胞におけるミトコンドリアのユビキチン化を増加させる方法であって、前記細胞におけるUSP30阻害を可能にする条件下で、前記細胞をUSP30インヒビターと接触させることを含む方法が提供される。実施例6に記載されているように、例えば、免疫蛍光を使用して、マイトファジーの増加を決定し得る。実施例5に記載されているように、例えば、トリプシン消化後のユビキチン化ペプチドを免疫親和性濃縮し、続いて質量分析によって、ユビキチン化の増加を決定し得る。いくつかの実施態様では、USP30インヒビターと接触させた細胞又は細胞集団におけるミトコンドリアタンパク質のユビキチン化を、前記インヒビターと接触させていないマッチ細胞又は細胞集団におけるミトコンドリアタンパク質のユビキチン化と比較することによって、ミトコンドリアのユビキチン化の増加を決定し得る。
本発明の他の態様では、本明細書に記載される疾患の処置、予防及び/又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。該製造品は、容器と該容器上又は該容器に付随するラベル又は添付文書を含む。適切な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、IV液バッグなどが含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成され得る。容器は、組成物単独又は障害を処置、予防及び/又は診断するために有効な他の組成物と組み合わせる組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有し得る(例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有する静脈内投与溶液バッグ又はバイアルであり得る)。組成物中の少なくとも1つの活性剤は、本発明のインヒビターである。ラベル又は添付文書は、組成物が選択された症状の処置に使用されることを示す。さらに、製造品は、(a)本発明のインヒビターを含む組成物を中に収容する第1の容器と、(b)さらなる細胞傷害剤又はそれ以外の治療剤を含む組成物を中に収容する第2の容器とを含み得る。本発明のこの実施態様における製造品は、組成物が特定の症状の処置に使用され得ることを示している添付文書をさらに含み得る。あるいは又は加えて、製造品は、薬学的に許容し得る緩衝液、例えば注射用の静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液又はデキストロース溶液を含む第2の(又は第3の)容器をさらに含み得る。さらに、それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含み得る。
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上記一般的な説明を考慮して、様々な他の実施態様を実施し得ると理解される。
DUB cDNAの過剰発現スクリーニング:
マイトファジーのレギュレーターを同定するために、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)(DUB−FLAG:GFP−Parkin cDNAの比1:3)を使用して、FLAGタグ付DUBライブラリ由来の個々のcDNAをGFP−Parkinと共にHeLa細胞にコトランスフェクションした。発現の24時間後、10μM CCCPで細胞を24時間処理し、固定し、抗Tom20(Santa Cruz Biotechnology)、抗GFP(Aves Labs)及び抗FLAG(Sigma)一次抗体を使用して染色した。二次抗体で染色した後、40×/1.25オイル対物レンズ(0.34μm/ピクセル解像度、1μm共焦点zステップサイズ)を使用してLeica SP5 Laser Scanning Confocal Microscopeを用いて、ランダムフィールドの画像を取得した。Tom20染色を含有するGFP−Parkin及びFLAG−DUBコトランスフェクション細胞の割合を盲検的にスコア化した。
記載されているように(Seeburg et al., Neuron 58: 571-583 (2008))、解離海馬ニューロン培養物を調製し、DIV8〜10でLipofectamine LTX PLUSを使用してトランスフェクションした。過剰発現実験の場合は1〜3日間及びノックダウン実験の場合は3〜4日間にわたって、構築物を発現させた。40×/1.25オイル対物レンズ(0.07μm/ピクセル解像度、1μm共焦点zステップサイズ)を備えるLeica TCS SP5 Laser Scanning Confocal microscopeを用いて、mt−Keimaトランスフェクションニューロンをイメージングした。イメージング中、37℃/5%CO2に維持した加湿チャンバー中で細胞を維持した。458nm(中性pHシグナル)及び543nm(酸性pHシグナル)レーザー励起を用いてシーケンシャルモードのハイブリッド検出器を使用し、630〜710nmで発光蛍光を収集して、2つの画像を取得した。ImageJにおいて特注のマクロによって、全ての画像の定量を実施した。mt−Keimaの定量のために、細胞体の輪郭を手動で示し、高比率(543nm/458nm)リソソームシグナルの総面積を、体細胞ミトコンドリアシグナルの総面積で割った(マイトファジー指数)。
Parkin基質を決定するために、ドキシサイクリンでHEK−293 GFP−Parkin誘導細胞を24時間処理し、次いで、5μM CCCP又はDMSOビヒクルコントロールで2時間処理した。USP30基質を決定するために、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を使用して、ヒトUSP30 shRNAでHEK−293T細胞を6日間トランスフェクションし、次いで、先のように処理した。両方の実験において、細胞を溶解し(20mM HEPES(pH8.0)、8M尿素、1mMオルトバナジン酸ナトリウム、2.5mMピロリン酸ナトリウム、1mMβ−グリセロホスフェート)、超音波処理し、遠心分離によって清澄化してから、ユビキチン残遺物を有するペプチドをタンパク質分解消化及び免疫親和性濃縮し、質量分析を行った。
全ての溶解物実験について、トランスフェクションの24時間後において、サンプル還元剤(Invitrogen)を含有するSDSサンプル緩衝液(Invitrogen)に、トランスフェクションHEK−293細胞を溶解した。免疫沈降実験については、トランスフェクションの24時間後(過剰発現実験)又は6日後(ノックダウン実験)において、0.5%SDSを含有するTBS緩衝液に細胞を溶解し、1%Triton−X−100及びプロテアーゼ及びホスファターゼインヒビターを含有する緩衝液で溶解物を希釈した。抗HAアフィニティマトリックスビーズ(Roche Applied Science)を用いて、HA−ユビキチントランスフェクション細胞の溶解物からユビキチン化タンパク質を免疫沈降した。SDS−PAGEによってインプット及び沈降物を分離し、免疫ブロッティングによって分析した。
エラーバーは、平均の標準誤差(S.E.M.)を示す。p値を計算するために、図の凡例に示されているように、対応のないStudent t検定、Dunnett多重比較検定(単一条件との比較の場合)又はBonferroni多重比較検定(複数条件間の比較の場合)による一元ANOVA、及び二元ANOVAを使用した。全ての統計分析をGraphPad Prism v.5ソフトウェアで実施した。
DUB過剰発現スクリーニングのために、100個のcDNAからなるFLAGタグ付DUBライブラリを使用した。トランスフェクションのために、以下の構築物をβ−アクチンプロモーターベースのpCAGGSプラスミドにサブクローニングした:USP30−FLAG(ラット)、USP30−FLAG(ヒト)、GFP−Parkin(ヒト)、FLAG−Parkin(ヒト)、PINK1−GFP(ヒト)、myc−Parkin(ヒト)、RHOT1(MIRO)−myc−FLAG(ヒト)、TOM20−myc(ヒト)、HA−ユビキチン、PSD−95−FLAG及びmt−mKeima(Katayama et al., Chemistry & Biology 18: 1042-1094 (2011))。以下の構築物については、QuikChange II XL (Agilent Technologies)を使用して、点突然変異を生成した:USP30−C77S−FLAG(ラット)、USP30−C77A−FLAG(ラット)、USP30−C77S−FLAG(ヒト)、GFP−Parkin K161N(ヒト)及びGFP−Parkin G430D(ヒト)。Mito−tagGFP2(Evrogen)、Tom20−3KR−myc及びHA−ユビキチン突然変異体(Blue Heron)は購入した。β−Gal(Seeburg and Sheng, J. Neurosci. 28: 6583-6591 (2008))及びmito−ro−GFP(Dooley et al., J. Biol. Chem. 279: 22284-22293 (2004))発現プラスミドは、以前に記載されているものであった。以下の領域をターゲティングするショートヘアピン配列をpSuper又はpSuper−GFP−neoプラスミドにクローニングした:ラットPINK1#1(TCAGGAGATCCAGGCAATT)、ラットPINK1#2(CCAGTACCTTGAAGAGCAA)、ラットParkin#1(GGAAGTGGTTGCTAAGCGA)、ラットParkin#2(GAGGAAAAGTCACGAAACA)、ラットUSP30(CCAGAGCCCTGTTCGGTTT)、ヒトUSP30(CCAGAGTCCTGTTCGATTT)及びホタルルシフェラーゼ(CGTACGCGGAATACTTCGA)。
以下の抗体を免疫細胞化学に使用した:ウサギ抗TOM20、マウス抗TOM20、ヤギ抗HSP60(Santa Cruz Biotechnology);マウス抗FLAG、ウサギ抗FLAG、マウス抗myc(Sigma-Aldrich);及びニワトリ抗GFP(Aves Labs)。
製造業者の説明書(Invitrogen)に従って、cDNA発現の場合にはLipofectamine 2000で、及びsiRNAノックダウン実験の場合にはLipofectamine RNAiMAXで全ての異種細胞をトランスフェクションした。siRNAは、DharmaconからsiGenomeプール(非サイレンシングプール#2をコントロールsiRNAトランスフェクションとして使用した)として購入した。以前に記載されているように(Seeburg et al., Neuron 58: 571-583 (2008))、海馬培養物を調製し、1.8μgのDNA、1.8μlのPLUS試薬及び6.3μlのLTX試薬と共にLipofectamine LTX PLUS (Invitrogen)でトランスフェクションした。薬物処理後、4%パラホルムアルデヒド/4%スクロースのリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH7.4)(Electron Microscopy Sciences)で細胞を固定した。透過処理し(0.1%Triton−XのPBS溶液)、ブロッキングし(2%BSAのPBS溶液)、一次抗体とインキュベーションした後、Alexa色素コンジュゲート二次抗体(Invitrogen)を使用して、抗体を可視化した。40×/1.25オイル対物レンズ(0.34μm/ピクセル解像度、1μm共焦点zステップサイズ)を備えるLeica SP5 laser scanning microscopeを用いて、全ての免疫細胞化学画像を取得した。
pOG44Flp−リコンビナーゼ発現ベクター(Invitrogen)、及びCMVプロモーターの下で対応する構築物を発現するpcDNA5−FRTベクター(Invitrogen)でFLP−In 293細胞をコトランスフェクションすることによって、GFP−Parkin(ヒト)野生型、K161N及びG430Dを発現する安定トランスフェクションHEK細胞株を作製した。50μg/mLハイグロマイシン選択を使用して、細胞株を選択及び維持した。pOG44、及びGFP−Parkin(ヒト)を発現するpcDNA5−FRT−TOベクター(Invitrogen)でFLP−In T−Rex 293細胞をコトランスフェクションすることによって、GFP−Parkin(ヒト)を発現する誘導HEK安定細胞株を作製した。50μg/mLハイグロマイシン及び15μg/mLブラストサイジンを使用して、株を選択及び維持した。pcDNA5−FRT−TOを使用してFlp−In誘導親細胞株と同様にSH−SY5Y安定細胞を作製し、75μg/mlハイグロマイシン及び3μg/mlブラストサイジンの下で維持した。
Parkin基質を同定するために、ドキシサイクリン(1μg/mL)を使用して、誘導GFP−Parkin(ヒト)を安定的に発現するHEK293T細胞を24時間誘導し、次いで、5μM CCCP又はDMSOビヒクルコントロールで2時間処理した。USP30基質を決定するために、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を使用して、ヒトUSP30 shRNAでHEK 293T細胞を6日間トランスフェクションし、次いで、上記のように処理した。
全ての溶解物実験について、24時間後において、サンプル還元剤(Invitrogen)を含有するSDSサンプル緩衝液(invitrogen)に細胞を溶解し、95℃で10分間煮沸した。SDS−PAGEによって全溶解物を分離し、免疫ブロッティングによって分析した。免疫沈降実験については、24時間(過剰発現実験)又は6日間(ノックダウン実験)の時点において、0.5%SDSのトリス緩衝生理食塩水(10mM TRIS、150mM NaCl、pH8.0)中で、5μM MG132並びに示されている濃度及び期間のCCCPで細胞を処理し、70℃で10分間煮沸した。免疫沈降緩衝液(50mM HEPES、150mM NaCl、10%グリセロール、1%Triton−X、プロテアーゼインヒビター(Roche Applied Science)、ホスファターゼインヒビター(Roche Applied Science)、DNAse I(Roche Applied Science)、2mM N−エチルマレイミド(Thermo Scientific)、pH7.4)で溶解物を希釈し、31,000gで10分間遠心分離することによって清澄化し、抗HAアフィニティマトリックスビーズ(Roche Applied Science)と共に一晩インキュベーションした。SDS−PAGEによってインプット及び抗HA免疫沈降物を分離し、免疫ブロッティングによって分析した。
FOCUS SubCell Kit (G Biosciences)を使用して、約P60の成体雄性ラットの前脳から細胞内分画を実施した。
以下のDrosophila系統を分析のために入手した:y、w;アクチン5C−GAL4/CyO、y+(Bloomington Drosophila Stock Center, 4414)、UAS−CG3016RNAi(本明細書ではUAS−dUSP30RNAiと称される;NIG-Fly Stock Center, 3016R-2)。USP30ノックダウン実験のために、標準的な遺伝子技術を使用して、アクチン5C−GAL4及びUAS−dUSP30RNAiを同じ染色体上に組換え導入した。
製造業者の説明書(Qiagen RNeasy Plus kit, Applied Biosystems High Capacity cDNA Reverse Transcription kit)に従って、単一のハエからRNA及び続いてcDNAを得た。TaqManアッセイDm01796115_g1及びDm01796116_g1(Drosophila CG3016(USP30))、Dm01795269_g1(Drosophila CG5486(USP47))及びDm01840115_s1(Drosophila CG4603(YOD1))を使用するApplied Biosystems ViiA7 Real-Time PCRシステムを使用して、定量RT−PCRを実施した。Dm02134593_g1(RpII140)をコントロールとして使用した。
5%スクロースのみ(水中)又は5%スクロース+10mMパラコート(水中)を含有する溶液をワットマン紙に染み込ませて、1日齢の成体雄に与えた。処理の48時間後、1条件当たり15匹のハエを回収し、100μLの水中でホモジナイズした。適切な量のパラコートを未処理ハエ由来のホモジネートにスパイクすることによって、標準曲線サンプルを作製した。次いで、サンプルをボルテックスで混合し、内部標準(プロプラノロール)を含有する200μLのアセトニトリルを追加した。サンプルを再度ボルテックスし、10,000×gで10分間遠心分離した。200μLの水を含有する新たなプレートに上清を移し、LC−MS/MSによって分析してパラコート濃度を定量した。LC−MS/MSは、Applied Biosystems (Foster City, CA)製の4000 Q TRAP(登録商標)MS及びTurboIonSpray(登録商標)イオン源が接続されたAgilent 1100シリーズHPLCシステム(Santa Clara, CA)及びCTC Analytics (Carrboro, NC)製のHTS PALオートサンプラーから構成されていた。Phenomenex製のKrud Katcherガードカラムを備えるWaters Atlantis dC18カラム(3μm 100×2.1mm)で、HPLC分離を実施した。トランジション185.1→165.1(パラコート)及び260.2→183.1(プロプラノロール)の多重反応モニタリング(MRM)を使用して、定量を行った。アッセイの下限及び上限は、それぞれ10μM及び1000μMである。アッセイの定量(quatitation)では、重み付け1/x2線形回帰を用いて、分析物/ISピーク面積比対名目パラコート濃度をプロットすることによって作図した検量線を用いた。
以前に記載されているように(Greene et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 4078-4083 (2003))、残りの胴体から成体雄の胸部を分離し、次いで、縦方向に片側切断し、直ぐに固定し、処理した。
以下のDrosophila系統を使用して、クライミングアッセイを実施した:y、w;アクチン5C−GAL4/CyO、y+(アクチンのみ);y、w;UAS−CG3016−RNAi/CyO、y+(RNAiのみ);y、w;UAS−CG3016RNAi、アクチン5C−GAL4/CyO、y+(USP30ノックダウン)。
5%スクロースのみ(水中)又は5%スクロース+10mMパラコート(水中)を含有する溶液をワットマン紙に染み込ませて、バイアル1個当たり10匹の成体1日齢雄に与えた。記載されている間隔で、生きているハエの数を計数した。
1%ウシ胎児血清を含有する通常の成長培地(DMEM/F12及び1X GlutaMax)中で、コントロール又はUSP30 siRNAでトランスフェクションしたSH−SY5Y細胞をロテノンで処理する。24時間のインキュベーション後、製造業者の説明書に従ってMulti-Tox Fluorアッセイ(Promega)を使用して、細胞生存率を測定する。各条件について、GF−AFC蛍光をビスAAF−R110蛍光に対して標準化し、コントロール(コントロールRNAi+DMSO)に対する割合として示す。
ミトコンドリアクリアランスをレギュレーションするDUBを同定するために、確立されたミトコンドリア分解アッセイ(Narendra et al., J. Cell Biol., 183: 795-803 (2008))において、FLAGタグ付ヒトDUB cDNAライブラリ(97個のDUB)をスクリーニングした。このアッセイでは、プロトノフォアカルボニルシアニド3−クロロフェニルヒドラゾン(CCCP、20μM、24時間)によって誘導されるミトコンドリアの脱分極が、Parkinを過剰発現する培養細胞における顕著なミトコンドリアの喪失をもたらす(ミトコンドリア外膜タンパク質マーカーTom20の染色による測定)。GFP−Parkinでトランスフェクションした細胞の大多数では、CCCP処理は、Tom20染色のロバストな消失をもたらした(Parkinトランスフェクション細胞の80%超では、CCCP後にTom20染色が欠如していた−図1A)。GFP−Parkinと共に個々のFLAGタグ付DUB cDNAをコトランスフェクションし、CCCP誘導性ミトコンドリア(Tom20)クリアランスに対する効果を測定した。CCCP処理GFP−Parkinトランスフェクション細胞では、約100個の異なるDUBのライブラリのうち、2個のDUB(USP30及びDUBA2)がTom20染色の喪失をロバストに阻止したのに対して、他のものはほとんど効果がなかった(図1A−Tom20染色細胞に対する%:コントロール(β−Gal):15.3%、USP30:97.4%、DUBA2:94.7%、UCH−L1:36%、USP15:23.3%、ATXN3:8.3%;他のネガティブなDUBは示さず)。USP30は、ミトコンドリア外膜に局在し、その酵素ドメインが推定では細胞質に面していると報告されており(Nakamura and Hirose, Mol. Biol. Cell, 19: 1903-1914 (2008))、従って、ミトコンドリアに対するParkinの作用への反作用はまさに細胞内コンパートメントに存在するであろうから、DUBA2ではなくUSP30をさらなる研究に選択した。ニューロンでは、トランスフェクションUSP30−FLAG及び内因性USP30がミトコンドリアマーカーと免疫共局在していることによって(図2A、B)、並びにラット脳からUSP30が精製ミトコンドリアと共分画されたことによって(図2C)、USP30の特異的ミトコンドリア結合を確認した。
ニューロンにおけるマイトファジーを測定するために、mt−Keima(これは、ミトコンドリアマトリックスにターゲティングされるレシオメトリックpH感受性蛍光タンパク質である)をモニタリングした。低比率のmt−Keima由来の蛍光(543nm/458nm)は中性環境を知らせるのに対して、高比率の蛍光は酸性pHを知らせる(Katayama et al., Chemistry & Biology 18: 1042-1094 (2011))。従って、mt−Keimaは、細胞質のミトコンドリア及び酸性リソソームのミトコンドリアのディファレンシャルなイメージングを可能にする。mt−Keimaはリソソームプロテアーゼに耐性であるので、ミトコンドリアの累積的なリソソーム送達を経時的に測定することを可能にする。
次に、USP30が、ニューロンにおけるマイトファジーを異種細胞でのように抑制するかを調査した。β−Gal及びmt−Keimaでトランスフェクションしたコントロールニューロンと比較して、野生型USP30の共発現は、3日目にマイトファジー指数の約60%の減少を引き起こしたが、これは、USP30がニューロンにおけるミトコンドリアのリソソーム送達を阻害することを示している(図5A、E)。対照的に、酵素的に不活性なUSP30(C77S又はC77A)の過剰発現は、マイトファジーシグナルのロバストな増加を誘導した(図5A、E)。リソソームへのミトコンドリア送達の増強は、おそらくは基質又はマイトファジー促進性ユビキチン鎖と相互作用し、内因性USP30からそれらを隔離することによって、触媒的に不活性なUSP30のドミナントネガティブ作用を反映する可能性がある(Berlin et al., J. Biol. Chem., 285: 34909-34921 (2010); Bomberger et al., J. Biol. Chem., 284: 18778-18789 (2009); Ogawa et al., J. Biol. Chem., 286: 41455-41465 (2011))。
Parkin及びUSP30は、ミトコンドリア分解をアンタゴニスティックにレギュレーションするので、このE3リガーゼ及びDUBはいくつかの共通基質に対して作用すると仮説した。Parkin及びUSP30基質を同定するために、トリプシン消化抽出物由来のユビキチン化ペプチドを、ユビキチン分岐鎖特異的(K−GG)抗体を使用して免疫親和性濃縮した後、質量分析(MS)することによって、細胞における全体的なユビキチン化を分析した。2つの異なる条件セットのHEK−293細胞において、MSによって全体的なユビキチン化を分析及び定量した:1)誘導性Parkin過剰発現、又は2)USP30ノックダウン(USP30ノックダウン効率は85±5%であった(図7Cを参照のこと))。各セットでは、CCCP(5μM、2時間)又はビヒクルコントロール(DMSO)で細胞を処理した。全体では、MS分析により、15,000個超のユニークなユビキチン化部位が約3200個のタンパク質上にあることが明らかになり、その一部は、CCCPのみ(内因性Parkin及びUSP30レベル)又はParkin過剰発現/USP30ノックダウンのいずれかに対して応答した(約3200個のタンパク質のリストについては、添付書類Aを参照のこと)。MSにより、parkin過剰発現又はUSP30ノックダウンによってそのユビキチン化が増加した233個及び335個のタンパク質がそれぞれ同定された(すなわち、「parkin過剰発現+CCCP」又は「USP30ノックダウン+CCCP」では、CCCPのみと対比して有意に多くのユビキチン化が示された)。これらのタンパク質のうちの41個は、Parkin過剰発現及びUSP30ノックダウンの両方によってレギュレーションされた(図13)。これら41個のタンパク質のうちの12個は、ミトコンドリア又はミトコンドリア関連のものである(Tom20、MIRO1、FKBP8、PTH2、MUL1、MAT2B、TOM70、PRDX3、IDE及び3個のVDACアイソフォーム全て−Human MitoCartaデータベースに基づく)。他には、核内輸送タンパク質(例えば、IPO5)、デメチラーゼ(例えば、KDM3B)及びユビキチン/プロテアソーム系の構成要素(例えば、PSD13、UBP13)が含まれていた(図13)。
ParkinのPD関連突然変異に関連するミトコンドリア分解障害が、損傷ミトコンドリアのユビキチン化の障害に起因するものであり、USP30が、Parkinの生化学的及び機能的なアンタゴニストとして実際に機能する場合、USP30の阻害は、ミトコンドリアのユビキチン化及び分解を回復させるはずである。この仮説を試験するために、本発明者らは、マイトファジーの障害を伴って(Geisler et al., Nat. Cell Biol., 12: 119-131 (2010); Lee et al., J. Cell Biol., 189: 671-680 (2010))減弱したリガーゼ活性を示す(Sriram et al., Human Mol. Genet., 14: 2571-2586 (2005))PD関連Parkin病因性突然変異体、例えばG430D及びK161Nに焦点を当てて研究した(例えば、G430D及びK161N)。
Parkinはミトコンドリア外膜タンパク質に対して広い活性を有するので、本発明者らは、ParkinがUSP30(これもこのミトコンドリア区画に存在する)をユビキチン化するかを知ろうとした。この可能性を裏付けることにより、本発明者らは、CCCPで処理したGFP−Parkin発現細胞のプロテオミクス実験において、USP30駆動性ユビキチン化ペプチドを同定した(「DMSO」に対する「GFP−Parkin+CCCP」におけるUSP30ユビキチン化の倍率変化=27.23、p<0.001)。ParkinによるUSP30ユビキチン化を確認するために、本発明者らは、GFP−Parkin及びHA−ユビキチンを過剰発現する細胞においてユビキチン化アッセイを繰り返したところ、CCCP処理(20μM、2時間、図9C、D)後に内因性USP30のGFP−Parkin誘導性ユビキチン化を見出した。質量分析によって同定されたUSP30のユビキチン化部位(K235及びK289)はそのユビキチン化に必要ではなかったが、これは、USP30における他のリシン残基がユビキチンを受容し得ることを示唆している(データは示さず)。CCCP処理(20μM)も、GFP−Parkin発現細胞におけるUSP30レベルの有意な低下を誘導した(図9E、F)。重要なことに、病因性突然変異G430D又はK161Nを有するParkinは、USP30をユビキチン化(図9C、D)及び分解(図9E〜F)することができなかった。これらのデータは、ParkinがUSP30をユビキチン化及び分解して、マイトファジーのブレーキを除去することを示している。
次に、USP30ノックダウンが機能的利益をミトコンドリア及び細胞に提供するかを調べた。ROS(これは、大部分がミトコンドリアに由来する)は神経変性障害に関連し、ミトコンドリア機能障害は、PDにおける酸化ストレスの増加に寄与し得る(Lee et al., Biochem. J., 441: 523-540 (2012))。ミトコンドリアにおける酸化ストレスを測定するために、ミトコンドリアマトリックスターゲティングro−GFP(mito−roGFP)(これは、ミトコンドリアの酸化還元電位の定量的なレシオメトリックイメージングを可能にするレドックス感受性蛍光タンパク質である)を使用した(Dooley et al., J. Biol. Chem. 279: 22284-22293 (2004))。個々の細胞におけるレシオメトリックmito−roGFPシグナルを測定した後、培養物を逐次にDTT(1mM)で処理してプローブを完全に還元し、アルドリチオール(100μM)で処理してプローブを完全に酸化することによって、プローブのダイナミックレンジを較正した(Guzman et al., Nature, 468: 696-700 (2010)。DTT及びアルドリチオールの後に測定したmito−roGFP比をそれぞれ0及び1に設定して、相対的酸化指数を較正した。コントロールルシフェラーゼshRNAでトランスフェクションしたコントロール細胞では、ニューロンは、約0.6の平均相対的酸化指数を有していた(図17A、B)。USP30ノックダウンは相対的酸化指数を約0.4に低下させたが、これは、USP30タンパク質の抑制がミトコンドリアの酸化ストレスの減少をもたらしたことを示唆している。
PDの病原性機構をより良く理解することは、この神経変性疾患の疾患改変療法を合理的に設計するのに役立つであろう。PDにおける酸化的リン酸化酵素の活性障害(Schapira et al., Lancet, 1: 1269 (1989))、酸化ストレスマーカーレベルの上昇(Lee et al., Biochem. J., 441: 523-540 (2012))及びmtDNA突然変異(Bender et al., Nature Genet., 38: 515-517 (2006); Kraytsberg et al., Nature Genet., 38: 518-520 (2006))は、欠陥ミトコンドリアの蓄積を示唆している(Zheng et al., Science Transl. Med., 2: 52ra73 (2010))。PINK1/Parkinの遺伝学は異常ミトコンドリアの生物学にさらに関係し、ミトコンドリア品質コントロール障害をPDの病因の原因因子として指摘している(Youle et al., J. Biol. Chem., 12: 9-23 (2011))。クリアランスされない損傷ミトコンドリアは毒性源になり、健全なミトコンドリアとの融合を介してミトコンドリアネットワークを「汚染」し得る(Tanaka et al., J. Cell. Biol., 191: 1367-1380 (2010))。
Parkin及びPINK1はマイトファジーのキープレーヤーとして同定されているが、特に哺乳動物細胞におけるマイトファジー経路に関する詳細な機構的理解は不足している。ニューロンにおける基本マイトファジーがParkin及びPINK1に依存するという事実(図3)は、これらのタンパク質が、通常起こるミトコンドリア損傷を活発にモニタリングしていることを示唆している。ミトコンドリア分裂(これは、Parkin媒介性マイトファジーに必要であると思われる(Tanaka et al., J. Cell. Biol., 191: 1367-1380 (2010))は、2個の娘ミトコンドリアの一方における膜電位の一時的低下を誘発することによって、基本ミトコンドリアターンオーバーに寄与し得る(Twig et al., EMBO J., 27: 433-446 (2008))。膜電位が速やかに再確立されない場合、膜電位のこの一時的低下は、PINK1の蓄積及びParkinのリクルートに関する機会を作り出して、最終的なマイトファジーにつながる。従って、基本条件下では、USP30ノックダウンは、分裂に伴うミトコンドリア膜電位の低下中にParkin媒介性ユビキチン化を有利にすることによって、マイトファジーを加速し得る。損傷ミトコンドリアはParkinを蓄積する可能性が高いので、USP30機能の抑制は不健全なミトコンドリアを選択的にクリアランスすると予想される。
全体的ユビキチン化部位のマッピング実験により、そのユビキチン化がParkin過剰発現及びUSP30ノックダウンの両方によって影響される複数の基質が同定された。これらの共通推定基質の中で、本発明者らは、Miro及びTom20が、Parkin及びUSP30によってアンタゴニスティックにレギュレーションされるユビキチン化レベルを有することを確認した(すなわち、GFP−Parkin過剰発現又はUSP30ノックダウンは、CCCP処理によって誘導されるユビキチン化を増加させた)。興味深いことに、Tom20によって例証されたこれらの共通基質の一部は、基本条件下でさえUSP30によってレギュレーションされた。MiroではなくMul1、Asns及びFkbp8が、Tom20と類似の挙動を示したミトコンドリア基質であり、CCCPの非存在下でUSP30ノックダウンによるユビキチン化の基本的増加を示した。従って、おそらくはミトコンドリアE3リガーゼ(これは、CCCPの非存在下で活性であり、MiroではなくTom20に対して作用する)に対して拮抗作用することによって、USP30は、基本的にはこのタンパク質セットを脱ユビキチン化する。CCCP後においても、USP30は、この基質セットのParkin依存性ユビキチン化に反作用する。一方、Tom70、Mat2b及びPth2などのタンパク質は、CCCP後においてのみ、USP30ノックダウンによるユビキチン化の増強を示したという点でMiroと類似の挙動を示した。この観察結果は、リクルートされるParkinの非存在下でこれらのタンパク質セットが低レベルの基本ユビキチン化を受ける(すなわち、Parkinはそれらの主なE3リガーゼである)こと、又は基本条件下ではUSP30がこれらのタンパク質に対して不活性であることを示唆している。ミトコンドリア脱分極は、おそらくはPINK1媒介性リン酸化を介して(Kondapalli et al., Open Biology, 2: 120080 (2012); しかしVives-Bauza et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107: 378-383 (2010)を参照のこと)、ParkinのE3リガーゼ活性をレギュレーションする(Matsuda et al., J. Cell Biol., 189: 211-221 (2010));USP30(これは、ミトコンドリアに構成的に局在する)の活性もミトコンドリア損傷によってレギュレーションされるかについては、まだ研究されていない。
PD関連Parkin突然変異は、触媒活性の減少、凝集の増強及び/又は発現の減少につながり得る(Hampe et al., Human Mol. Genet., 15: 2059-2075 (2006); Matsuda et al., J. Biol. Chem., 281: 3204-3209 (2006); Wang et al., J. Neurochem., 93: 422-431 (2005); Winklhofer et al., J. Biol. Chem. 278: 47199-47208 (2003))。散発性PDでは、Parkin活性は、細胞ストレスによっても阻害され得る(Corti et al., Physiol. Rev., 91: 1161-1218 (2011))。PD関連PINK1突然変異は、Parkinの損傷ミトコンドリアへの移行を障害する(Matsuda et al., J. Cell Biol., 189: 211-221 (2010); Narendra et al., PLoS Biology, 8: e1000298 (2010); Vives-Bauza et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107: 378-383 (2010))。従って、ミトコンドリア品質コントロールにおけるParkinの機能低下は、珍しいParkin突然変異によって表されるよりもPDで見られやすく、特発性PDにおけるUSP30阻害が有用である可能性をさらに裏付けている。USP30阻害の利益と一致して、USP30ノックダウンは、PD関連突然変異体Parkinを発現する細胞におけるマイトファジーを回復させ、ニューロンにおける酸化ストレスを減少させる。Drosophilaのparkin突然変異体では、USP30ノックダウンは、ミトコンドリア完全性を改善する。さらに、USP30ノックダウンは、ミトコンドリアに関連する酸化ストレッサーであるパラコートに対する行動及び生存アッセイにおいて利益を提供する(Castello et al., J. Biol. Chem., 282: 14186-14193 (2007); Cocheme et al., J. Biol. Chem., 283: 1786-1798 (2008))。パラコートは、PDに疫学的に関連するミトコンドリア毒であるので(Tanner et al., Environmental Health Perspect., 119: 866-872 (2011))、本発明者らの知見は、USP30阻害が、ミトコンドリアの損傷及び機能障害によって引き起こされる疾患に有用であり得るというin vivo証拠を提供する。
以前に記載されているように(Stanger, et al., 2012, Nat. Chem. Bio., 7: 655-660)、ビオチン化USP30_cd(C77A突然変異を有するUSP30触媒ドメイン)溶液(Stanger, et al., 2012, Nat. Chem. Bio., 7: 655-660)を用いる結合選択ラウンドによって、2種類のファージディスプレイナイーブペプチドライブラリ(Linear-lib及びCyclic-lib)をサイクルした。この選択により、適度なスポットELISAシグナル(約5の信号対雑音比)を有していたペプチドUSP30_3及びUSP30_8を同定した。USP_30及びUSP_8は、配列:
USP30_3:PLYCFYDLTYGYLCFY(配列番号1);
USP30_8:VSRCYIFWNEMFCDVE(配列番号2)
を有する。
(式中、vは、最大速度の割合であり;Iは、インヒビター(USP30ペプチドリガンド)の濃度であり;v0及びvmaxは、それぞれ速度の最小割合及び最大割合である)に対してフィッティングすることによって、データを処理した。
Claims (43)
- アミノ酸配列:
X 1 X 2 CX 3 X 4 X 5 X 6 X 7 X 8 X 9 X 10 X 11 CX 12 (配列番号48)
(配列中、
X 1 は、L、M、A、S及びVから選択され;
X 2 は、Y、D、E、I、L、N及びSから選択され;
X 3 は、F、I及びYから選択され;
X 4 は、F、I及びYから選択され;
X 5 は、D及びEから選択され;
X 6 は、L、M、V及びPから選択され;
X 7 は、S、N、D、A及びTから選択され;
X 8 は、Y、D、F、N及びWから選択され;
X 9 は、G、D及びEから選択され;
X 10 は、Y及びFから選択され;
X 11 は、L、V、M、Q及びWから選択され;並びに
X 12 は、F、L、C、V及びYから選択される)を含むペプチドであって、10μM未満のIC50でUSP30を阻害する、ペプチド。 - USP7、USP5、UCHL3及びUSP2から選択される少なくとも1個、少なくとも2個又は少なくとも3個のペプチダーゼに対するペプチドのIC50が、20μM超、30μM超、40μM超又は50μM超である、請求項1に記載のペプチド。
- 配列番号1〜22から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は100%同一のアミノ酸配列を含む、請求項1又は請求項2に記載のペプチド。
- 細胞を請求項1〜3のいずれか一項に記載のペプチドと接触させることを含む、細胞におけるマイトファジーを増加させるex vivo又はin vitro方法。
- 細胞を請求項1〜3のいずれか一項に記載のペプチドと接触させることを含む、細胞におけるミトコンドリアのユビキチン化を増加させるex vivo又はin vitro方法。
- 細胞を請求項1〜3のいずれか一項に記載のペプチドと接触させることを含む、細胞におけるTom20、MIRO、MUL1、ASNS、FKBP8、TOM70、MAT2B、PRDX3、IDE、VDAC1、VDAC2、VDAC3、IPO5、PSD13、UBP13及びPTH2から選択される少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個又は14個のタンパク質のユビキチン化を増加させるex vivo又はin vitro方法。
- Tom20のK56、K61及びK68から選択される少なくとも1個、少なくとも2個又は3個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む、請求項6に記載の方法。
- MIROのK153、K187、K330、K427、K512、K535、K567及びK572から選択される少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個又は8個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む、請求項6又は請求項7に記載の方法。
- MUL1のK273、K299及びK52から選択される少なくとも1個、少なくとも2個又は3個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む、請求項6〜8のいずれか一項に記載の方法。
- ASNSのK147、K168、K176、K221、K244、K275、K478、K504及びK556から選択される少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個又は9個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む、請求項6〜9のいずれか一項に記載の方法。
- FKBP8のK249、K271、K273、K284、K307、K317、K334及びK340から選択される少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個又は8個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む、請求項6〜10のいずれか一項に記載の方法。
- TOM70のK78、K120、K123、K126、K129、K148、K168、K170、K178、K185、K204、K230、K233、K245、K275、K278、K312、K326、K349、K359、K441、K463、K470、K471、K494、K501、K524、K536、K563、K570、K599、K600及びK604から選択される少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個又は少なくとも10個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む、請求項6〜11のいずれか一項に記載の方法。
- MAT2BのK209、K245、K316及びK326から選択される少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個又は4個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む、請求項6〜12のいずれか一項に記載の方法。
- PRDX3のK83、K91、K166、K241及びK253から選択される少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個又は5個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む、請求項6〜13のいずれか一項に記載の方法。
- IDEのK558、K657、K854、K884、K929及びK933から選択される少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個又は6個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む、請求項6〜14のいずれか一項に記載の方法。
- VDAC1のK20、K53、K61、K109、K110、K266及びK274から選択される少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個又は7個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む、請求項6〜15のいずれか一項に記載の方法。
- VDAC2のK31、K64、K120、K121、K277及びK285から選択される少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個又は6個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む、請求項6〜16のいずれか一項に記載の方法。
- VDAC3のK20、K53、K61、K109、K110、K163、K266及びK274から選択される少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個又は8個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む、請求項6〜17のいずれか一項に記載の方法。
- IPO5のK238、K353、K436、K437、K548、K556、K613、K678、K690、K705、K775及びK806から選択される少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個又は少なくとも10個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む、請求項6〜18のいずれか一項に記載の方法。
- PSD13のK2、K32、K99、K115、K122、K132、K161、K186、K313、K321、K347、K350及びK361から選択される少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個又は少なくとも10個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む、請求項6〜19のいずれか一項に記載の方法。
- UBP13のK18、K190、K259、K326、K328、K401、K405、K414、K418、K435、K586、K587及びK640から選択される少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個又は少なくとも10個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む、請求項6〜20のいずれか一項に記載の方法。
- PTH2の47位、76位、81位、95位、106位、119位、134位、171位、177位から選択される少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個又は9個のアミノ酸のユビキチン化を増加させることを含む、請求項6〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞が酸化ストレス下にある、請求項4〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞を請求項1〜3のいずれか一項に記載のペプチドと接触させることを含む、細胞における酸化ストレスを減少させるex vivo又はin vitro方法。
- 細胞が、Parkinの病因性突然変異、PINK1の病因性突然変異、又はParkinの病因性突然変異及びPINK1の病因性突然変異を含む、請求項4〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞が、表1の突然変異から選択されるParkinの病因性突然変異を含む、請求項25に記載の方法。
- 細胞が、表2の突然変異から選択されるPINK1の病因性突然変異を含む、請求項25又は請求項26に記載の方法。
- 細胞が、ニューロン、心臓細胞及び筋細胞から選択される、請求項4〜27のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞が被験体内に含まれる、請求項4〜28のいずれか一項に記載の方法。
- 被験体におけるミトコンドリア障害が関与する症状を処置するための、請求項1〜3のいずれか一項に記載のペプチドを含む、医薬組成物。
- ミトコンドリア障害が関与する症状が、マイトファジーの障害が関与する症状、ミトコンドリアDNAの突然変異が関与する症状、ミトコンドリアの酸化ストレスが関与する症状、ミトコンドリアの形状又は形態の障害が関与する症状、ミトコンドリア膜電位の障害が関与する症状、及びリソソーム蓄積障害が関与する症状から選択される、請求項30に記載の組成物。
- ミトコンドリア障害が関与する症状が、神経変性疾患;ミトコンドリアミオパチー、脳症、乳酸アシドーシス及び脳卒中様発作(MELAS)症候群;レーバー遺伝性視神経症(LHON);神経障害性−運動失調症−網膜色素変性症−母性遺伝リー症候群(NARP−MILS);ダノン病;心筋梗塞につながる虚血性心疾患;多種スルファターゼ欠損症(MSD);ムコリピドーシスII(ML II);ムコリピドーシスIII(ML III);ムコリピドーシスIV(ML IV);GM1ガングリオシドーシス(GM1);神経セロイドリポフスチン症(NCL1);アルパーズ病;バース症候群;β−酸化欠損;カルニチンアシルカルニチン欠損症;カルニチン欠損症;クレアチン欠損症候群;補酵素Q10欠損症;複合体I欠損症;複合体II欠損症;複合体III欠損症;複合体IV欠損症;複合体V欠損症;COX欠損症;慢性進行性外眼筋麻痺症候群(CPEO);CPT I欠損症;CPT II欠損症;グルタル酸尿症II型;カーンズ・セイヤー症候群;乳酸アシドーシス;長鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼ欠損症(LCHAD);リー病又は症候群;致死乳児心筋症(LIC);ルフト病;グルタル酸尿症II型;中鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼ欠損症(MCAD);赤色ぼろ線維・ミオクローヌスてんかん(MERRF)症候群;ミトコンドリア劣性運動失調症候群;ミトコンドリア細胞症;ミトコンドリアDNA枯渇症候群;筋神経胃腸障害及び脳症;ピアソン症候群;ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症;ピルビン酸デヒドロゲナーゼ欠損症;POLG突然変異;中鎖/短鎖3−ヒドロキシアシル−CoAデヒドロゲナーゼ(M/SCHAD)欠損症;並びに超長鎖アシル−CoAデヒドロゲナーゼ(VLCAD)欠損症から選択される、請求項30又は請求項31に記載の組成物。
- 神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、ハンチントン病、虚血、脳卒中、レビー小体型認知症及び前頭側頭型認知症から選択される、請求項32に記載の組成物。
- 被験体における神経変性疾患を処置するための、請求項1〜3のいずれか一項に記載のペプチドを含む、医薬組成物。
- 神経変性疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、虚血、脳卒中、レビー小体型認知症及び前頭側頭型認知症から選択される、請求項34に記載の組成物。
- 被験体におけるパーキンソン病を処置するための、請求項1〜3のいずれか一項に記載のペプチドを含む、医薬組成物。
- 被験体が、前記被験体の細胞の少なくとも一部にParkinの病因性突然変異、PINK1の病因性突然変異、又はParkinの病因性突然変異及びPINK1の病因性突然変異を含む、請求項30〜36のいずれか一項に記載の組成物。
- Parkinの病因性突然変異が表1の突然変異から選択される、請求項37に記載の組成物。
- PINK1の病因性突然変異が表2の突然変異から選択される、請求項37又は請求項38に記載の組成物。
- 被験体において酸化ストレスを受けている細胞が関与する症状を処置するための、請求項1〜3のいずれか一項に記載のペプチドを含む、医薬組成物。
- 経口投与、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与又は皮下投与される、請求項30〜40のいずれか一項に記載の組成物。
- 少なくとも1つのさらなる治療剤と組み合わせた、請求項30〜41のいずれか一項に記載の組成物。
- 少なくとも1つのさらなる治療剤が、レボドパ、ドーパミンアゴニスト、モノアミノオキシゲナーゼ(MAO)Bインヒビター、カテコールO−メチルトランスフェラーゼ(COMT)インヒビター、抗コリン薬、アマンタジン、リルゾール、コリンエステラーゼインヒビター、メマンチン、テトラベナジン、抗精神病薬、クロナゼパム、ジアゼパム、抗鬱薬及び抗痙攣薬から選択される、請求項42に記載の組成物。
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