KR20150056835A - Usp30 억제제 및 사용 방법 - Google Patents

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바리스 빈골
제이콥 콘
윙난 장
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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

USP30 억제제 및 USP30 억제제의 사용 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 미토콘드리아 결함을 수반하는 질환의 치료 방법을 제공한다.

Description

USP30 억제제 및 사용 방법{USP30 INHIBITORS AND METHODS OF USE}
USP30 억제제 및 USP30 억제제의 사용 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 미토콘드리아 결함을 수반하는 질환의 치료 방법을 제공한다.
미토파지(mitophagy)는 리소좀에 의한 분해를 통해 미토콘드리아를 제거하는 특수한 자가포식(autophagy) 경로이다. 그 자체로서, 미토파지는 세포소기관의 정상적인 세포 턴오버 중에, 적혈구의 성숙 중에 미토콘드리아를 제거하고, 수정에 이어서 정액-유래된 미토콘드리아를 제거한다. 미토파지는 또한 손상된 미토콘드리아의 제거를 매개하며, 이는 미토콘드리아 질의 조절에 중요한 태양이다. 결함성 또는 과잉 미토콘드리아는 제거되지 않고 남아있는 경우 산화 스트레스의 이상 원인으로 되고 미토콘드리아 융합을 통해 건강한 미토콘드리아를 손상시키게 될 수도 있다. 효모에서, 미토파지의 선택적인 봉쇄는 과잉 미토콘드리아 및 미토콘드리아 DNA(mt-DNA)의 상실에 의해 반응성 산소 종(ROS)의 증가된 생산을 유발한다. 손상된 미토콘드리아 질 조절은 또한 핵심적인 생합성 경로, ATP 생산, 및 Ca2+ 완충에 영향을 미칠 수 있으며 전체적인 세포 항상성을 방해할 수 있다.
알쯔하이머병(AD) 다음으로, 두 번째로 가장 통상적인 신경퇴행성 질환인 파킨슨병(PD)은 가장 현저하게는 흑질 중 도파민작용성 뉴런의 상실을 특징으로 한다. PD의 발병 기전은 명확하지 않지만, 여러 방면의 증거는 미토콘드리아 기능장애가 PD에 중심임을 암시한다. 미토콘드리아 독소인 MPTP는 도파민 뉴런을 손상시키고 인간에서 임상 파킨슨증을 생성시킨다. 역학적 증거는 PD를 살충제, 예를 들어 로테논(복합체 I 억제제) 및 파라콰트(산화 스트레스 유발제)에의 노출과 관련짓는다. 미토콘드리아 손상과 일치되게, 감소된 복합체 I 활성 및 높은 수준의 mt-DNA 돌연변이가 PD 환자의 흑질에서 발견되었다. 유사하게, 미토콘드리아의 기능 및 형태 변화가 PD의 유전자 모델에서 존재한다. 추정상 가장 강력하게는, 조기발병 가족성 PD는 파킨 유비퀴틴-리가제 및 PINK1 세린/쓰레오닌 단백질 키나제(이들은 모두 미토콘드리아 기능 조절 및 질 조절을 통해 건강한 미토콘드리아를 유지시키는 작용을 한다)의 돌연변이에 의해 유발될 수 있다.
파리의 유전자 연구는 PINK1이 파킨의 상류에 작용하여 적합한 미토콘드리아 형태 및 기능을 유지함을 확립시켰다. PINK1은 세포질로부터 손상된 미토콘드리아의 표면으로 파킨을 모집하여, 미토콘드리아 외막 단백질의 파킨-매개된 유비퀴틴화 및 미토파지에 의한 손상된 미토콘드리아의 제거에 이르게 한다. PINK1 또는 파킨에서의 PD-관련된 돌연변이는 파킨 모집, 미토콘드리아 유비퀴틴화 및 미토파지를 손상시킨다. 파킨은 미토콘드리아 기능의 다수의 태양들, 예를 들어 미토콘드리아 동역학 및 수송을 조절하고, 또한 미토콘드리아 생물발생에 영향을 미칠 수 있다. 손상된 미토콘드리아상의 광범위한 외부 미토콘드리아 막 단백질들의 분해는 파킨에 의해 영향을 받는 것처럼 보인다. 이들 중에서 미토콘드리아 관련된 단백질, MIRO, 미토콘드리아-키네신 운동 어댑터 복합체의 성분이 파킨 및 PINK1 모두의 공유 기질일 수 있다.
파킨 발현 및/또는 활성은 가족성 PD에서 유전자 돌연변이를 통해서 또는 산발성 PD에서 인산화에 의해 손상될 수 있다. 흑질 도파민 뉴런에서 본질적으로 높은 미토콘드리아 산화 스트레스와 관련하여, 파킨-매개된 미토콘드리아 질 조절의 상실은 신경퇴행에 대한 흑질 뉴런의 보다 큰 민감성을 설명할 수 있다. 손상된 미토콘드리아의 제거를 촉진하고 미토콘드리아 질 조절을 증대시키는 것은 PD에 이로울 수 있다.
일부 실시태양에서, 세포에서 미토파지의 증가 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 상기 세포를 USP30 억제제와 접촉시킴을 포함한다.
일부 실시태양에서, 세포에서 미토콘드리아 유비퀴틴화의 증가 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 세포에서 Tom20, MIRO, MUL1, ASNS, FKBP8, TOM70, MAT2B, PRDX3, IDE, VDAC1, VDAC2, VDAC3, IPO5, PSD13, UBP13, 및 PTH2 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상 또는 14개 단백질의 유비퀴틴화의 증가 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 상기 세포를 USP30 억제제와 접촉시킴을 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 방법은 Tom20의 K56, K61 및 K68 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 아미노산의 유비퀴틴화를 증가시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 MIRO의 K153, K187, K330, K427, K512, K535, K567, 및 K572 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상 또는 8개 아미노산의 유비퀴틴화를 증가시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 MUL1의 K273, K299 및 K52 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 아미노산의 유비퀴틴화를 증가시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 ASNS의 K147, K168, K176, K221, K244, K275, K478, K504, 및 K556 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상 또는 9개 아미노산의 유비퀴틴화를 증가시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 FKBP8의 K249, K271, K273, K284, K307, K317, K334, 및 K340 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 또는 8개 아미노산의 유비퀴틴화를 증가시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 TOM70의 K78, K120, K123, K126, K129, K148, K168, K170, K178, K185, K204, K230, K233, K245, K275, K278, K312, K326, K349, K359, K441, K463, K470, K471, K494, K501, K524, K536, K563, K570, K599, K600, 및 K604 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상 아미노산의 유비퀴틴화를 증가시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 MAT2B의 K209, K245, K316, 및 K326 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 아미노산의 유비퀴틴화를 증가시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 PRDX3의 K83, K91, K166, K241, 및 K253 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 또는 5개 아미노산의 유비퀴틴화를 증가시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 IDE의 K558, K657, K854, K884, K929, 및 K933 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 6개 아미노산의 유비퀴틴화를 증가시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 VDAC1의 K20, K53, K61, K109, K110, K266, 및 K274 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 또는 7개 아미노산의 유비퀴틴화를 증가시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 VDAC2의 K31, K64, K120, K121, K277, 및 K285 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 6개 아미노산의 유비퀴틴화를 증가시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 VDAC3의 K20, K53, K61, K109, K110, K163, K266, 및 K274 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 또는 8개 아미노산의 유비퀴틴화를 증가시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 IPO5의 K238, K353, K436, K437, K548, K556, K613, K678, K690, K705, K775, 및 K806 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상 아미노산의 유비퀴틴화를 증가시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 PSD13의 K2, K32, K99, K115, K122, K132, K161, K186, K313, K321, K347, K350, 및 K361 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상 아미노산의 유비퀴틴화를 증가시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 UBP13의 K18, K190, K259, K326, K328, K401, K405, K414, K418, K435, K586, K587, 및 K640 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상 아미노산의 유비퀴틴화를 증가시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 PTH2의 47, 76, 81, 95, 106, 119, 134, 171, 177 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상 또는 9개 아미노산의 유비퀴틴화를 증가시킴을 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 세포는 산화 스트레스 하에 있다. 일부 실시태양에서, 세포에서 산화 스트레스를 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 방법은 상기 세포를 USP30 억제제와 접촉시킴을 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 세포는 파킨에서의 병원성 돌연변이, PINK1에서의 병원성 돌연변이, 또는 파킨에서의 병원성 돌연변이 및 PINK1에서의 병원성 돌연변이를 포함한다. 파킨에서의 비제한적인 병원성 돌연변이들을 표 1에 나타낸다. 따라서, 일부 실시태양에서, 상기 파킨에서의 병원성 돌연변이는 표 1의 돌연변이들 중에서 선택된다. PINK1에서의 비제한적인 병원성 돌연변이들을 표 2에 나타낸다. 일부 실시태양에서, PINK1에서의 병원성 돌연변이는 표 2의 돌연변이들 중에서 선택된다.
다양한 실시태양에서, 상기 세포는 뉴런, 심장 세포, 및 근육 세포 중에서 선택된다. 일부 상기와 같은 실시태양에서, 상기 세포는 생체외 또는 시험관내에 있다. 한편으로, 일부 상기와 같은 실시태양에서, 상기 세포는 대상체 중에 포함된다.
일부 실시태양에서, 대상체에서 미토콘드리아 결함을 수반하는 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 상기 대상체에게 유효량의 USP30 억제제를 투여함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 미토콘드리아 결함을 수반하는 질환은 미토파지 결함을 수반하는 질환, 미토콘드리아 DNA의 돌연변이를 수반하는 질환, 미토콘드리아 산화 스트레스를 수반하는 질환, 미토콘드리아 모양 또는 형태의 결함을 수반하는 질환, 미토콘드리아 막 전위의 결함을 수반하는 질환, 및 리소좀 저장 결함을 수반하는 질환 중에서 선택된다.
일부 실시태양에서, 미토콘드리아 결함을 수반하는 질환은 신경퇴행성 질병; 미토콘드리아 근육병증, 뇌병증, 젖산혈증 및 뇌졸중-유사 에피소드(MELAS) 증후군; 레베르 유전 시신경병증(LHON); 신경병증, 운동실조, 망막색소변성증-모체 유전된 레이 증후군(NARP-MILS); 다논병; 심근경색에 이르는 허혈성 심장병; 다중 설파타제 결손증(MSD); 점액지질증 II(ML II); 점액지질증 III(ML III); 점액지질증 IV(ML IV); GM1-강글리오사이드증(GM1); 신경 세로이드-지질갈색소증(NCL1); 알퍼스병; 바쓰 증후군; 베타-산화 결함; 카르니틴-아실-카르니틴 결손; 카르니틴 결손; 크레아틴 결손 증후군; 조-효소 Q10 결손; 복합체 I 결손; 복합체 II 결손; 복합체 III 결손; 복합체 IV 결손; 복합체 V 결손; COX 결손; 만성 진행성 외안근마비 증후군(CPEO); CPT I 결손; CPT II 결손; II형 글루타르산뇨증; 컨스-세르 증후군; 젖산뇨증; 장쇄 아실-CoA 데하이드로게나제 결손(LCHAD); 레이병 또는 증후군; 치명적인 유아 심근증(LIC); 루프트병; II형 글루타르산뇨증; 중간-쇄 아실-CoA 데하이드로게나제 결손(MCAD); 간대성 근경련성 간질 및 불균일 적색 섬유(MERRF) 증후군; 미토콘드리아 열성 실조증 증후군; 미토콘드리아 세포병증; 미토콘드리아 DNA 결핍 증후군; 근육신경위장 장애 및 뇌병증; 피어슨 증후군; 피루베이트 카복실라제 결손; 피루베이트 데하이드로게나제 결손; POLG 돌연변이; 중간/단-쇄 3-하이드록시아실-CoA 데하이드로게나제(M/SCHAD) 결손; 및 극장쇄 아실-CoA 데하이드로게나제(VLCAD) 결손 중에서 선택된다.
일부 실시태양에서, 신경퇴행성 질병의 치료 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 대상체에게 유효량의 USP30 억제제를 투여함을 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 신경퇴행성 질병은 알쯔하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 헌팅톤병, 허혈증, 뇌졸중, 루이소체 치매, 및 전측두엽 치매 중에서 선택된다.
일부 실시태양에서, 파킨슨병의 치료 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 대상체에게 유효량의 USP30 억제제를 투여함을 포함한다.
일부 실시태양에서, 산화 스트레스를 겪고 있는 세포를 수반하는 질환의 치료 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 대상체에게 유효량의 USP30 억제제를 투여함을 포함한다.
대상체의 치료를 수반하는 일부 실시태양에서, 상기 대상체는 상기 대상체의 세포의 적어도 일부 중에 파킨에서의 병원성 돌연변이, PINK1에서의 병원성 돌연변이, 또는 파킨에서의 병원성 돌연변이 및 PINK1에서의 병원성 돌연변이를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 파킨에서의 병원성 돌연변이는 표 1의 돌연변이들 중에서 선택된다. 일부 실시태양에서, PINK1에서의 병원성 돌연변이는 표 2의 돌연변이들 중에서 선택된다.
일부 실시태양에서, 상기 USP30 억제제를 경구, 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하로 투여한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 하나 이상의 추가적인 치료제를 투여함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 하나 이상의 추가적인 치료제는 레보도파, 도파민 작용물질, 모노아미노 옥시게나제(MAO) B 억제제, 카테콜 O-메틸트랜스퍼라제(COMT) 억제제, 항콜린제, 아만타딘, 릴루졸, 콜린에스테라제 억제제, 메만틴, 테트라베나진, 정신병치료제, 클로나제팜, 다이아제팜, 항우울제, 및 항-경련제 중에서 선택된다.
본 발명에 개시된 방법들 중 어느 하나에서, 상기 USP30 억제제는 USP30 발현의 억제제일 수 있다. 비제한적인 예시적인 USP30 발현 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 짧은 간섭 RNA(siRNA)를 포함한다. 본 발명에 개시된 방법들 중 어느 하나에서, 상기 USP30 억제제는 USP30 활성의 억제제일 수 있다. 비제한적인 예시적인 USP30 활성 억제제는 항체, 펩티드, 펩티바디, 앱타머, 및 소분자를 포함한다.
일부 실시태양에서, USP30의 펩티드 억제제는 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
X1X2CX3X4X5X6X7X8X9X10X11CX12(서열번호 48)
상기에서:
X1은 L, M, A, S 및 V 중에서 선택되고;
X2는 Y, D, E, I, L, N 및 S 중에서 선택되고;
X3은 F, I 및 Y 중에서 선택되고;
X4는 F, I 및 Y 중에서 선택되고;
X5는 D 및 E 중에서 선택되고;
X6은 L, M, V 및 P 중에서 선택되고;
X7은 S, N, D, A 및 T 중에서 선택되고;
X8은 Y, D, F, N 및 W 중에서 선택되고;
X9는 G, D, 및 E 중에서 선택되고;
X10은 Y 및 F 중에서 선택되고;
X11은 L, V, M, Q 및 W 중에서 선택되고;
X12는 F, L, C, V 및 Y 중에서 선택된다.
일부 실시태양에서, USP30 펩티드의 펩티드 억제제는 서열번호 1 내지 22 중에서 선택된 아미노산 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 100% 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 펩티드는 USP30을 10 μM 미만의 IC50으로 억제한다. 일부 실시태양에서, USP7, USP5, UCHL3 및 USP2 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 이상의 펩티다제에 대한 USP30의 펩티드 억제제의 IC50은 20 μM 초과, 30 μM 초과, 40 μM 초과, 또는 50 μM 초과이다.
일부 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 USP30 mRNA의 영역 및/또는 USP30 pre-mRNA의 영역에 적어도 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 100% 상보성인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 USP30 mRNA의 영역 또는 USP30 pre-mRNA의 영역은 적어도 10 이상, 15 이상, 20 이상, 25 이상, 30 이상, 40 이상, 50 이상, 60 이상, 70 이상, 80 이상, 90 이상, 또는 100 이상 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시태양에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 10 내지 500 뉴클레오티드 길이, 또는 10 내지 400 뉴클레오티드 길이, 또는 10 내지 300 뉴클레오티드 길이, 또는 10 내지 200 뉴클레오티드 길이, 또는 10 내지 100 뉴클레오티드 길이, 또는 15 내지 100 뉴클레오티드 길이, 또는 10 내지 50 뉴클레오티드 길이, 또는 15 내지 50 뉴클레오티드 길이이다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 비-뉴클레오티드 성분을 포함할 수도 있다.
일부 실시태양에서, siRNA는 USP30 mRNA의 영역 및/또는 USP30 pre-mRNA의 영역에 적어도 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 100% 일치하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 USP30 mRNA의 영역 또는 USP30 pre-mRNA의 영역은 적어도 10 이상, 15 이상, 20 이상 또는 25 이상 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시태양에서, 상기 siRNA는 10 내지 200 뉴클레오티드 길이, 또는 10 내지 100 뉴클레오티드 길이, 또는 15 내지 100 뉴클레오티드 길이, 또는 10 내지 60 뉴클레오티드 길이, 또는 15 내지 60 뉴클레오티드 길이, 또는 10 내지 50 뉴클레오티드 길이, 또는 15 내지 50 뉴클레오티드 길이, 또는 10 내지 30 뉴클레오티드 길이, 또는 15 내지 30 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시태양에서, siRNA는 shRNA이다.
본 발명의 실시태양은 대상체에서 미토콘드리아 결함을 수반하는 질환의 치료를 위한 USP30 억제제이다. 특정한 실시태양에서 상기 미토콘드리아 결함을 수반하는 질환은 미토파지 결함을 수반하는 질환, 미토콘드리아 DNA의 돌연변이를 수반하는 질환, 미토콘드리아 산화 스트레스를 수반하는 질환, 미토콘드리아 모양 또는 형태의 결함을 수반하는 질환, 미토콘드리아 막 전위의 결함을 수반하는 질환, 및 리소좀 저장 결함을 수반하는 질환 중에서 선택된다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 미토콘드리아 결함을 수반하는 질환은 신경퇴행성 질병; 미토콘드리아 근육병증, 뇌병증, 젖산혈증 및 뇌졸중-유사 에피소드(MELAS) 증후군; 레베르 유전 시신경병증(LHON); 신경병증, 운동실조, 망막색소변성증-모체 유전된 레이 증후군(NARP-MILS); 다논병; 심근경색에 이르는 허혈성 심장병; 다중 설파타제 결손증(MSD); 점액지질증 II(ML II); 점액지질증 III(ML III); 점액지질증 IV(ML IV); GM1-강글리오사이드증(GM1); 신경 세로이드-지질갈색소증(NCL1); 알퍼스병; 바쓰 증후군; 베타-산화 결함; 카르니틴-아실-카르니틴 결손; 카르니틴 결손; 크레아틴 결손 증후군; 조-효소 Q10 결손; 복합체 I 결손; 복합체 II 결손; 복합체 III 결손; 복합체 IV 결손; 복합체 V 결손; COX 결손; 만성 진행성 외안근마비 증후군(CPEO); CPT I 결손; CPT II 결손; II형 글루타르산뇨증; 컨스-세르 증후군; 젖산뇨증; 장쇄 아실-CoA 데하이드로게나제 결손(LCHAD); 레이병 또는 증후군; 치명적인 유아 심근증(LIC); 루프트병; II형 글루타르산뇨증; 중간-쇄 아실-CoA 데하이드로게나제 결손(MCAD); 간대성 근경련성 간질 및 불균일 적색 섬유(MERRF) 증후군; 미토콘드리아 열성 실조증 증후군; 미토콘드리아 세포병증; 미토콘드리아 DNA 결핍 증후군; 근육신경위장 장애 및 뇌병증; 피어슨 증후군; 피루베이트 카복실라제 결손; 피루베이트 데하이드로게나제 결손; POLG 돌연변이; 중간/단-쇄 3-하이드록시아실-CoA 데하이드로게나제(M/SCHAD) 결손; 및 극장쇄 아실-CoA 데하이드로게나제(VLCAD) 결손 중에서 선택된다. 보다 특정한 실시태양에서, 상기 신경퇴행성 질병은 알쯔하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 헌팅톤병, 허혈증, 뇌졸중, 루이소체 치매, 및 전측두엽 치매 중에서 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시태양은 대상체에게 투여함을 포함하는 상기 대상체에서 신경퇴행성 질병의 치료를 위한 USP30 억제제이다. 특정한 실시태양에서, 상기 신경퇴행성 질병은 파킨슨병, 알쯔하이머병, 헌팅톤병, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 허혈증, 뇌졸중, 루이소체 치매, 및 전측두엽 치매 중에서 선택된다.
또한 본 발명의 실시태양은 대상체에서 파킨슨병의 치료를 위한 USP30 억제제이다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 상기 USP30 억제제를 경구, 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하로 투여한다.
본 발명의 특정한 실시태양에서, 본 발명에 개시된 바와 같은 치료에 사용하기 위한 USP30 억제제를 하나 이상의 추가적인 치료제와 병용한다. 추가의 특정한 실시태양에서, 상기 하나 이상의 추가적인 치료제는 레보도파, 도파민 작용물질, 모노아미노 옥시게나제(MAO) B 억제제, 카테콜 O-메틸트랜스퍼라제(COMT) 억제제, 항콜린제, 아만타딘, 릴루졸, 콜린에스테라제 억제제, 메만틴, 테트라베나진, 정신병치료제, 클로나제팜, 다이아제팜, 항우울제, 및 항-경련제 중에서 선택된다.
본 특허 또는 출원 파일은 컬러로 작성된 하나 이상의 도면을 함유한다. 컬러 도면(들)과 함께 본 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 요청 및 필요 경비의 지불시 관청에 의해 제공될 것이다.
도 1A는 GFP-파킨 및 개별적인 FLAG-표지된(tagged) DUB에 의해 동시형질감염된 HeLa 세포의 면역염색을 도시한다. 24시간의 발현에 이어서, 세포를 CCCP(20 μM, 24시간)로 처리하고 GFP, FLAG 및 내인성 Tom20을 면역염색하였다. FLAG-표지된 USP30, DUBA2, UCH-L1, USP15 및 ATXN3에 대한 전형적인 상들을 도시하며; 다른 DUB들은 도시하지 않는다(스케일 바, 10 ㎛). 도 1B는 GFP-파킨 및 지시된 대조용(β-Gal) 및 USP30 구조물로 동시형질감염된 SH-SY5Y 세포의 면역염색을 도시한다. 24시간의 발현에 이어서, 세포를 CCCP(20 μM, 24시간)로 처리하고 myc, FLAG 및 내인성 Tom20 및 HSP60을 면역염색하였다(스케일 바, 5 ㎛). 도 1C는 도 1B로부터의 Tom20 또는 HSP60 염색을 갖는 세포의 퍼센트의 정량분석을 도시한다(일원 ANOVA - 듄네트의 다중 비교 시험에 의해 ***p<0.001. N = 3 실험. 오차 막대는 SEM을 나타낸다). 도 1D는 도 1B로부터의 세포당 전체 Tom20 및 HSP60 형광 강도의 정량분석을 도시한다(일원 ANOVA - 듄네트의 다중 비교 시험에 의해 **p<0.01. n = 대조용(β-Gal), USP30-FLAG 및 USP30-C77S-FLAG 그룹들에 대해서 각각 63, 67 및 54 세포. N = 3 실험. 오차 막대는 SEM을 나타낸다). 도 1E는 도 1B로부터의 파킨 클러스터를 함유하는 세포의 퍼센트의 정량분석을 도시한다(일원 ANOVA - 듄네트의 다중 비교 시험에 의해 ***p<0.001. N = 3 실험. 오차 막대는 SEM을 나타낸다).
도 2A는 배양된 래트 해마 뉴런 중 형질감염된 USP30-FLAG(적색) 및 미토콘드리아-표지된 GFP(녹색)의 면역염색을 도시한다. 융합물은 컬러로 도시되고; 개별적인 채널은 회색-스케일로 도시된다(스케일 바, 5 ㎛). 도 2B는 대조용 또는 USP30 siRNA로 형질감염된 SH-Sy5Y 세포의 면역염색을 도시한다. 3일의 녹다운에 이어서, 세포를 고정시키고 내인성 USP30 및 HSP60을 면역염색하였다. USP30 siRNA는 주로 미토콘드리아 USP30 항체 염색을 감소시켰다(스케일 바, 5 ㎛). 상자속 영역의 보다 큰 배율의 상들을 오른쪽 패널상에 도시한다(스케일 바, 2 ㎛). 도 2C는 USP30, HSP60 및 GAPDH 항체에 의한 래트 뇌로부터의 세포질- 및 미토콘드리아-풍부 분획들의 면역블럿을 도시한다. 도 2D는 GFP-파킨 및 지시된 대조용(β-Gal) 및 USP30 구조물로 동시형질감염된 SH-SY5Y 세포의 면역염색을 도시한다. 24시간의 발현에 이어서, 세포를 CCCP(20 μM, 4시간)로 처리하고 GFP, FLAG, 및 내인성 Tom20 및 폴리유비퀴틴 쇄(FK2 항체에 의해 검출됨)를 면역염색하였다(스케일 바, 5 ㎛). 도 2E는 도 2D로부터의 미토콘드리아 면적에 의해 표준화된 미토콘드리아-관련된 폴리유비퀴틴 염색 강도의 정량분석을 도시하는 플롯이다(미토콘드리아 FK2 염색의 적분된 형광 강도/Tom20 염색의 면적)(일원 ANOVA - 듄네트의 다중 비교 시험에 의해 ***p<0.001. n = β-Gal, USP30-FLAG 및 USP30-C77S-FLAG 그룹들에 대해서 각각 61, 45 및 59 세포. 오차 막대는 SEM을 나타낸다). 도 2F는 지시된 대조용(β-Gal) 및 USP30 구조물로 형질감염된 GFP-파킨 발현 안정성 HEK-293 세포로부터의 세포 용해물의 면역블럿을 도시한다. 24시간의 발현에 이어서, 세포를 CCCP(5 μM, 2시간)로 처리하고 용해시켰다. 도 2G는 도 2F로부터의 액틴에 대해 표준화된 GFP-파킨에 대한 면역블럿 신호의 정량분석을 도시하는 플롯이다(일원 ANOVA - 듄네트의 다중 비교 시험에 의해 ***p<0.001. N = 6 실험. 오차 막대는 SEM을 나타낸다).
도 3A는 mt-케이마(Keima)가 세포질(녹색) 및 리소좀(적색) 미토콘드리아를 차별적으로 강조함을 도시한다. 배양된 해마 뉴런을 mt-케이마 및 GFP로 형질감염시켰다. 2일의 발현에 이어서, 세포를 458 ㎚(녹색으로 도시됨) 또는 543 ㎚(적색으로 도시됨) 광 여기로 영상화하였다. GFP 신호를 사용하여 세포의 윤곽을 표시하였다(백색으로 도시됨)(스케일 바, 5 ㎛). 도 3B는 파킨 shRNA 녹다운 구조물로 형질감염된 뉴런 중 mt-케이마 영상화를 도시한다(스케일 바, 5 ㎛). 도 3C는 도 3B로부터의 미토파지 지수의 정량분석을 도시하는 플롯이다(일원 ANOVA - 듄네트의 다중 비교 시험에 의해 **p<0.01 및 ***p<0.001. n = 그룹당 52 내지 109 세포. N = 3 내지 6 실험. 오차 막대는 SEM을 나타낸다). 도 3D는 PINK1 shRNA 녹다운 구조물로 형질감염된 뉴런 중 mt-케이마 영상화를 도시한다(스케일 바, 5 ㎛). 도 3E는 도 3D로부터의 미토파지 지수의 정량분석을 도시하는 플롯이다(일원 ANOVA - 듄네트의 다중 비교 시험에 의해 **p<0.01 및 ***p<0.001. n = 그룹당 52 내지 109 세포. N = 3 내지 6 실험. 오차 막대는 SEM을 나타낸다). 도 3F는 PINK1-GFP 및 파킨-shRNA#1(대조용으로서 루시페라제 shRNA 및 β-Gal)로 형질감염된 뉴런 중 mt-케이마 영상화를 도시한다(스케일 바, 5 ㎛). 도 3G는 도 3F로부터의 미토파지 지수의 정량분석을 도시하는 플롯이다(일원 ANOVA - 듄네트의 다중 비교 시험에 의해 ***p<0.001. n = 55 내지 77 세포. N = 3 실험. 오차 막대는 SEM을 나타낸다).
도 4A는 NH4Cl 처리(50 mM, 2분) 전후의 배양된 해마 뉴런에서의 mt-케이마 영상화를 도시한다. 543 ㎚ 또는 458 ㎚ 레이저 여기 공급원에 의해 수집된 mt-케이마 신호를 각각 적색 및 녹색으로 나타낸다(스케일 바, 5 ㎛). 도 4B는 해마 뉴런 중 mt-케이마 및 리소트랙커(Lysotracker)(회색 스케일로 도시됨)의 영상화를 도시한다(스케일 바, 5 ㎛). 도 4C는 mt-케이마 신호에 대해 영상화된 뉴런 중 내인성 LAMP-1에 대한 사후(post-hoc) 면역염색을 도시한다. mt-케이마 영상화에 바로 이어서, 세포를 고정시키고 항-LAMP1 항체(회색 스케일로 도시됨)로 염색하였다(스케일 바, 5 ㎛). 도 4D는 배양된 해마 뉴런에서 1, 3 및 6 내지 7일의 mt-케이마 발현에 따른 미토파지 지수의 정량분석을 도시하는 플롯이다(일원 ANOVA - 본페로니의 다중 비교 시험에 의해 *p<0.05 및 ***p<0.001. n = 56 내지 146 세포. N = 6 실험. 오차 막대는 SEM을 나타낸다). 도 4E는 FLAG-파킨 cDNA 및 파킨 shRNA 발현 구조물로 형질감염된 HEK-293 세포 용해물의 면역블럿이다. PSD-95-FLAG를 대조용으로서 동시-형질감염시켰다. 도 4F는 PINK1-GFP cDNA 및 PINK shRNA 구조물로 형질감염된 HEK-293 세포 용해물의 면역블럿이다. PSD-95-FLAG를 대조용으로서 동시-형질감염시켰다. 도 4G는 지시된 shRNA를 발현하는 아데노부속 바이러스로 감염된 배양된 해마 뉴런 중 내인성 파킨의 면역블럿을 도시한다. 도 4H는 지시된 shRNA를 발현하는 아데노부속 바이러스로 감염된 배양된 해마 뉴런 중 내인성 PINK1의 면역블럿을 도시한다. 도 4I는 GFP-파킨(또는 대조용으로서 GFP)으로 형질감염된 뉴런에서의 mt-케이마 영상화를 도시한다(스케일 바, 5 ㎛). 도 4J는 도 4I로부터의 미토파지 지수의 정량분석을 도시하는 플롯이다(스튜던츠 t-시험에 의해 p = 0.52, n = 61 내지 67 세포. N = 3 실험. 오차 막대는 SEM을 나타낸다).
도 5A는 USP30-FLAG 또는 USP30-C77S-FLAG로 형질감염된 뉴런에서의 mt-케이마 영상화를 도시한다(스케일 바, 5 ㎛). 도 5B는 지시된 cDNA 및 shRNA 구조물로 형질감염된 HEK-293 세포 용해물의 면역블럿을 도시한다. PSD-95-FLAG를 대조용으로서 동시-형질감염시켰다. 도 5C는 내인성 USP30 shRNA를 발현하는 아데노부속 바이러스 입자로 감염된 배양된 해마 뉴런에서의 상기 USP30의 면역블럿을 도시한다. 도 5D는 래트 USP30 shRNA 및 인간 USP30 cDNA 발현 구조물(대조용으로서 루시페라제 shRNA 및 β-Gal)로 형질감염된 뉴런에서 mt-케이마 영상화를 도시한다(스케일 바, 5 ㎛). 도 5E는 도 5A로부터의 미토파지 지수의 정량분석을 도시하는 플롯이다(일원 ANOVA - 본페로니의 다중 비교 시험에 의해 ***p<0.001. 43 내지 122 세포. N = 6 실험. 오차 막대는 SEM을 나타낸다). 도 5F는 도 5B로부터의 미토파지 지수의 정량분석을 도시하는 플롯이다(일원 ANOVA - 듄네트의 다중 비교 시험에 의해 **p<0.01 및 ***p<0.001. n = 96 내지 101 세포. N = 4 실험. 오차 막대는 SEM을 나타낸다).
도 6A는 HA-유비퀴틴 및 지시된 구조물로 형질감염된 모 HEK-293 세포주(GFP-파킨이 결여됨)에서의 내인성 MIRO 및 Tom20에 대한 항-HA-면역침전물의 면역블럿을 도시한다. 24시간의 발현에 이어서, 세포를 CCCP(5 μM, 2시간)로 처리하고 유비퀴틴화된 단백질을 항-HA 비드로 면역침전시켰다. 면역침전물 및 투입물을 지시된 항체로 블럿팅하였다. 도 6B는 USP30 녹다운에 의한 내인성 MIRO 및 Tom20에 대한 항-HA-면역침전물의 면역블럿을 도시한다. GFP-파킨 발현 안정성 HEK-293 세포를 HA-유비퀴틴 및 지시된 shRNA 및 cDNA 발현 구조물로 형질감염시켰다. 6일의 발현에 이어서, 세포를 도 6A에서와 같이 처리하였다. 도 6C 및 E는 지시된 HA-표지된 유비퀴틴 돌연변이체로 형질감염되고 CCCP(20 μM, 2시간)로 처리된 세포로부터의 내인성 Miro 및 Tom20에 대한 항-HA-면역침전물의 면역블럿을 도시한다. 도 6D 및 F는 (C) 및 (E)로부터의 면역블럿 신호의 정량분석을 도시한다. 상기 유비퀴틴 돌연변이체에 의해 제공된 유비퀴틴화의 양을 야생형 유비퀴틴과 비교하여 보고한다(듄네트의 다중 복합 시험과 함께 일원 ANOVA를 사용하여, '야생형 HA-유비퀴틴 + CCCP' 그룹과 비교된 **p<0.01 및 ***p<0.001. δ는 ***p<0.001을 나타낸다). 도 6G는 지시된 FLAG-표지된 USP30 구조물로 형질감염되고 CCCP(5 μM, 1 내지 6시간)로 처리된 GFP-파킨 HEK-293 안정성 세포 용해물의 면역블럿을 도시한다. 도 6H는 도 6G에 도시된 액틴에 대해 표준화된 면역블럿 신호의 정량분석을 도시하는 플롯이다(본페로니의 다중 비교 시험과 함께 이원 ANOVA를 사용하여, β-Gal 대조용과 비교된 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. 모든 다른 단백질들(VDAC, Mfn-1, Tom70, Hsp60)에 대한 면역블럿 신호는 유의수준에 도달하지 못했다. N = 3 내지 5 실험).
도 7A는 USP30 과발현에 의한 내인성 MIRO 및 Tom20에 대한 항-HA-면역침전물의 면역블럿을 도시한다. GFP-파킨을 안정하게 발현하는 HEK-293 세포를 HA-유비퀴틴 및 지시된 구조물로 형질감염시켰다. 24시간의 발현에 이어서, 세포를 CCCP(5 μM, 2시간)로 처리하고 유비퀴틴화된 단백질을 항-HA 비드로 면역침전시켰다. 면역침전물 및 투입물을 지시된 항체로 블럿팅하였다. 도 7B는 도 7A로부터의 동시-면역침전된 MIRO에 대한 면역블럿 신호의 정량분석을 도시하는 플롯이다. 도 7C는 도 7A로부터의 동시-면역침전된 Tom20에 대한 면역블럿 신호의 정량분석을 도시하는 플롯이다. 항-HA 비드로 동시-침전시킨 단백질 수준을 'β-Gal + CCCP' 그룹에 대해 표준화한다(β-Gal + CCCP과 비교된, 일원 ANOVA - 듄네트의 다중 비교 시험에 의해 *p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001. N = 3 내지 5 실험. 오차 막대는 SEM을 나타낸다). 도 7D는 USP30 녹다운에 의한 내인성 MIRO 및 Tom20에 대한 항-HA 면역침전물의 면역블럿을 도시한다. GFP-파킨 발현 안정성 HEK-293 세포를 HA-유비퀴틴 및 지시된 shRNA 플라스미드로 형질감염시켰다. 6일의 발현에 이어서, 세포를 도 7A에서와 같이 처리하였다. 도 7E는 도 7D로부터의 동시-면역침전된 MIRO에 대한 면역블럿 신호의 정량분석을 도시하는 플롯이다. 도 7F는 도 7D로부터의 동시-면역침전된 Tom20에 대한 면역블럿 신호의 정량분석을 도시하는 플롯이다. 항-HA 비드로 동시-침전시킨 단백질 수준을 '루시페라제 shRNA + CCCP' 그룹에 대해 표준화한다('루시페라제 shRNA + CCCP'와 비교된, 일원 ANOVA - 듄네트의 다중 비교 시험에 의해 *p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001. N = 4 내지 6 실험. 오차 막대는 SEM을 나타낸다).
도 8A는 지시된 구조물로 형질감염된 GFP-파킨 HEK-293 세포로부터의 HA-유비퀴틴 침전물의 면역블럿을 도시한다. 형질감염 및 CCCP(5 μM, 2시간)에 의한 처리에 이어서, 유비퀴틴화된 단백질을 항-HA 비드로 면역침전시키고, 침전물 및 투입물을 나타낸 항체로 면역블럿팅하였다. 도 8B는 Tom20-myc 및 USP30 구조물(대조용으로서 β-Gal)로 형질감염시킨 뉴런에서의 mt-케이마 영상화를 도시한다(스케일 바, 5 ㎛). 도 8C는 USP30 shRNA 및 MIRO cDNA 구조물(대조용으로서 루시페라제 RNAi 및 β-Gal)로 형질감염된 뉴런에서 mt-케이마 영상화를 도시한다(스케일 바, 5 ㎛). 도 8D는 도 8B로부터의 미토파지 지수의 정량분석을 도시하는 플롯이다(일원 ANOVA - 듄네트의 다중 비교 시험에 의해 ***p<0.001. 모든 그룹에 대해서 n = 67 내지 80 세포. N = 3 실험. 오차 막대는 SEM을 나타낸다). 도 8E는 도 8C로부터의 미토파지 지수의 정량분석을 도시하는 플롯이다(일원 ANOVA - 본페로니의 다중 비교 시험에 의해 *p<0.05 및 ***p<0.001. 모든 그룹에 대해서 n = 72 내지 75 세포. N = 3 실험. 오차 막대는 SEM을 나타낸다).
도 9A는 USP30 녹다운 실험에서 Tom20으로부터 동정된 K-GG 펩티드에 상응하는 추출된 이온 크로마토그램을 도시한다. 각각의 유비퀴틴화된 펩티드의 상대적인 풍부성을 가장 풍부한 분석과 비교하여 y-축상에 도시한다(전구체 이온 m/z를 각 피크 위에 나타내었다). 각각의 K-GG 펩티드의 서열을 하부에 녹색으로 나타낸다. 별표는 변형된 리신 잔기를 나타낸다. 도 9B는 파킨 과발현 실험에서 USP30으로부터 동정된 K-GG 펩티드에 상응하는 추출된 이온 크로마토그램을 도시한다. 데이터를 (A)에서와 유사한 방식으로 나타낸다. 도 9C는 야생형, K161N 및 G430D GFP-파킨 구조물로 형질감염된 세포로부터의 내인성 USP30에 대한 항-HA-면역침전물의 면역블럿을 도시한다. 24시간의 발현 후에, 세포를 CCCP(20 μM, 2시간)로 처리하고 유비퀴틴화된 단백질을 항-HA 비드로 면역침전시켰다. 면역침전물 및 투입물을 지시된 항체로 블럿팅하였다. 도 9D는 (C)로부터의 동시-면역침전된 USP30에 대한 면역블럿 신호의 정량분석을 도시한다. 항-HA 비드와 함께 침전하는 단백질 수준을 '야생형 GFP-파킨 + CCCP' 그룹에 대해서 표준화한다(야생형 GFP-파킨 + CCCP'와 비교하여, 일원 ANOVA - 듄네트의 다중 비교 시험에 의해 ***p<0.001. N = 4 실험. 오차 막대는 SEM을 나타낸다). 도 9E는 지시된 GFP 및 GFP-파킨 구조물로 형질감염되고 CCCP(20 μM)로 처리된 HEK-293 세포로부터 제조된 용해물의 면역블럿을 도시한다. 도 9F는 (E)로부터의 액틴에 대해 표준화된 USP30에 대한 면역블럿 신호의 정량분석을 도시한다(본페로니의 다중 비교 시험과 함께 이원 ANOVA를 사용하여, 야생형 GFP-파킨과 비교된 **p<0.01, ***p<0.001. N = 4 실험. 오차 막대는 SEM을 나타낸다).
도 10A는 지시된 siRNA 및 cDNA 발현 구조물로 형질감염된 GFP-파킨-G43D 발현 안정성 SH-SY5Y 세포에서의 면역염색을 도시한다. 3일의 발현에 이어서, 세포를 CCCP(20 μM, 24시간)로 처리하고, 고정시키고 GFP, FLAG 및 내인성 Tom20을 염색하였다(스케일 바, 5 ㎛). 도 10B는 도 10A로부터의 Tom20 형광 강도의 정량분석을 도시하는 플롯이다(일원 ANOVA - 듄네트의 다중 비교 시험에 의해 ***p<0.001. 오차 막대는 SEM을 나타낸다). 도 10C는 도 10A로부터의 GFP-파킨-G430D 반점 면적의 정량분석을 도시하는 플롯이다(일원 ANOVA - 듄네트의 다중 비교 시험에 의해 ***p<0.001. 오차 막대는 SEM을 나타낸다). 도 10D는 파킨 shRNA 및 USP30-C77A-FLAG로 형질감염된 뉴런에서 mt-케이마 영상화를 도시한다(스케일 바, 5 ㎛). 도 10E는 도 10D로부터의 미토파지 지수의 정량분석을 도시하는 플롯이다(일원 ANOVA - 듄네트의 다중 비교 시험에 의해 ***p<0.001. N = 71 내지 77 세포. N = 3 실험. 오차 막대는 SEM을 나타낸다).
도 11A는 3일 동안 USP30 siRNA로 형질감염된 SH-SY5Y 세포에서의 내인성 USP30에 대한 면역블럿을 도시한다. 도 11B 및 11C는 지시된 siRNA로 형질감염된 GFP-파킨-G430D 발현 안정성 SH-SY5Y 세포의 면역염색을 도시한다. 3일의 녹다운에 이어서, 세포를 CCCP(20 μM, 24시간)로 처리하고, 고정시키고 GFP 및 내인성 Tom20을 염색하였다(스케일 바, 5 ㎛). 도 11D는 대조용 siRNA에 대해 표준화된 도 11B 및 11C로부터의 Tom20 염색 강도의 변화 배수의 정량분석을 도시하는 플롯이다(일원 ANOVA - 듄네트의 다중 비교 시험에 의해 ***p<0.001. 오차 막대는 SEM을 나타낸다). 도 11E 및 11F는 USP30 siRNA로 형질감염된 GFP-파킨-G430D(E) 및 GFP-파킨-K161N(F) 발현 SH-SY5Y 세포에서의 면역염색을 도시한다. 3일의 녹다운에 이어서, 세포를 CCCP(20 μM, 24시간)로 처리하고, 고정시키고 GFP 및 내인성 Tom20 및 HSP60을 염색하였다(스케일 바, 5 ㎛). 도 11G 및 11H는 대조용 siRNA에 대해 표준화된 도 11E 및 11F로부터의 Tom20(G) 및 HSP60(H) 염색 강도의 변화 배수의 정량분석을 도시하는 플롯이다(스튜던츠 t-시험에 의해 *p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001. N = 2 내지 3 실험. 오차 막대는 SEM을 나타낸다).
도 12A는 야생형, 파킨 돌연변이체(park 25 ) 및 "파킨 돌연변이체: dUSP30 녹다운"(park 25 ; 액틴 - GAL4 > UAS - dUSP30 RNAi ) 파리로부터의 간접 비상근(IFM)의 횡단면을 도시한다. 전자-밀집 미토콘드리아를 화살표 머리로 표시한다. 감소되고 해체된 크리스타(따라서 외관상 색상이 옅음)를 갖는 미토콘드리아를 대시선으로 윤곽을 나타낸다(상부 패널 - 스케일 바, 1 ㎛). 보다 큰 배율의 상들을 하부 패널에 나타낸다(스케일 바, 0.2 ㎛). 도 12B 및 C는 (A)로부터의 미토콘드리아 완전체의 정량분석을 도시한다. 전체 미토콘드리아 면적에 대한 해체된 크리스타를 함유하는 미토콘드리아의 면적 퍼센트(B), 및 해체된 미토콘드리아를 함유하는 근육 면적의 퍼센트(C)를 맹검으로 정량분석한다. (이원 ANOVA - 본페로니의 다중 비교 시험에 의해, 야생형에 비교된 *p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001. park 25 대 park 25 의 경우 ***p<0.001; 액틴-GAL4>UAS - dUSP30 RNAi . 파리당 34 내지 55 영상화 시야, N = 3 내지 4 파리. 오차 막대는 S.E.M.을 나타낸다). 도 12D 및 E는 드로소필라에서 기어오르기(climbing) 분석에 대한 dUSP30 녹다운 및 파라콰트의 영향을 도시한다. 지시된 유전자형들에 대해서, 비히클(5% 슈크로스) 또는 파라콰트(10 mM, 48시간)로 처리된, 30 초 동안 >15 ㎝를 기어오르는 파리의 퍼센트. (본페로니의 다중 비교 시험과 함께 일원 ANOVA에 의해 **p<0.01 및 ***p<0.001. N = 4 내지 10 실험. 오차 막대는 SEM을 나타낸다). 도 12F는 ELISA에 의해 측정된 바와 같은, 지시된 유전자형에 대해 드로소필라 머리당 도파민 신경전달물질 수준을 도시한다. (본페로니의 다중 비교 시험과 함께 일원 ANOVA에 의해 *p<0.05 및 ***p<0.001. n = 유전자형당 28개 머리. N = 4 실험. 오차 막대는 SEM을 나타낸다). 도 12G 및 H는 드로소필라에서 생존에 대한 dUSP30 녹다운 및 파라콰트의 영향을 도시한다. 지시된 유전자형들에 대해서, 비히클 또는 파라콰트(10 mM, 96시간 이하)로 처리된, 여전히 살아있는 파리의 퍼센트. (본페로니의 다중 비교 시험과 함께 이원 ANOVA를 사용하여, **p<0.01 및 ***p<0.001. N = 3(G) 및 4(H) 실험. 오차 막대는 SEM을 나타낸다).
도 13은 USP30 녹다운(왼쪽) 및 GFP-파킨 과발현(오른쪽) 실험 모두에서 "콤보" 처리 대 CCCP-단독 처리에 대해 유비퀴틴화가 현저하게 증가된(p<0.05) 41개 단백질들의 부분집합을 나타내는 비대칭적인 "화산형 플롯"을 도시한다. "콤보"는 각각 2개의 실험으로, CCCP로 처리되고 USP30-shRNA를 발현하는 세포, 또는 CCCP로 처리되고 GFP-파킨을 발현하는 세포를 지칭한다. 이러한 단백질들의 부분집합에 대해서, 유비퀴틴화의 증가배수(x-축) 및 p-값(y-축)을 보고한다. 미토콘드리아 단백질(인간 미토카르타(MitoCarta) 데이터베이스를 근거로 확인됨)을 적색으로 도시한다.
도 14는 실시예 10에 개시된 바와 같이, 억제성 펩티드 USP30_3("pep3"; 서열번호 1) 및 USP30_8("pep8"; 서열번호 2)에 의한 다양한 펩티다제(USP30 포함)의 억제를 도시한다.
도 15는 실시예 10에 개시된 바와 같이, 신호 대 소음비("S/N"), ELISA 신호("신호"), 각 서열에 대한 클론들의 수("n"), 전체 클론수("전체"), 및 독특한 서열들의 수("Uniq")와 함께, USP30_3 및 몇몇 친화성-성숙한 펩티드에 대한 펩티드 위치에 의한 잔기 확률의 그래프를 도시한다.
도 16은 실시예 10에 개시된 바와 같이, USP30_3 및 3개의 친화성 성숙한 펩티드에 대한 신호 대 소음비의 그래프를 도시한다. 각각의 펩티드에 대해서, 시험된 표적은 왼쪽에서부터 오른쪽으로, USP2, USP7, USP14, USP30, UCHL1, UCHL3, 및 UCHL5이었다. 각 펩티드에 대한 서열들을 하부에 나타낸다.
도 17A는 USP30 shRNA로 형질감염된 해마 뉴런에서의 비율측정(ratiometric) mito-roGFP 영상화를 도시한다. "상대 산화 지수"는 0(DTT 처리 후 mito-roGFP 비, 1 mM, 흑색으로 도시됨)에서부터 1(알드리티올 처리 후 mito-roGFP 비, 100 μM, 적색으로 도시됨)까지의 '컬러 등급'으로 도시되었다. 도 17B는 도 17A로부터의 상대 산화의 정량분석을 도시하는 플롯이다(스튜던츠 t-시험에 의해 ***p<0.001, n = 루시페라제 shRNA의 경우 24 세포 및 USP30 shRNA의 경우 36 세포. N = 3 실험. 오차 막대는 SEM을 나타낸다). 도 17C는 dUSP30 mRNA의 정량적인 RT-PCR을 도시한다. 액틴 - GAL4에 대해 상대적으로 나타낸, 액틴 - GAL4 , UAS -dUSP30 RNAi , 및 액틴 - GAL4 > UAS - dUSP30 RNAi 파리에서의 qRT-PCR. dUSP30 mRNA 수준을 각 그룹에서 드로소필라 RpII140 mRNA 수준에 대해 표준화하였다. N = 7 실험. 본페로니의 다중 비교 시험과 함께 일원 ANOVA에 의해 ***p<0.001. 도 17D는 대조용 파리(액틴 - GAL4)에서의 기어오르기 분석을 도시한다. 파리를 비히클 대조용(5% 슈크로스) 또는 파라콰트(10 mM, 48시간)로 처리하였다. L-DOPA(1 mM, 48시간)를 지시된 바와 같이 파라콰트와 동시에 투여하였다. (일원 ANOVA - 듄네트의 다중 비교 시험에 의해 ***p<0.001. N = 6 실험. 오차 막대는 SEM을 나타낸다). 도 17E는 ELISA에 의해 평가된 바와 같은, 파리 머리당 세로토닌 수준을 도시한다. 파리를 파라콰트(10 mM, 48시간) 또는 비히클 대조용(5% 슈크로스)으로 처리하였다. (일원 ANOVA - 본페로니의 다중 비교 시험에 의해 계산된 p-값. n = 8 머리, N = 2 실험. 오차 막대는 SEM을 나타낸다). 도 17F 및 G는 액틴 - GAL4 유전자형에 대해 상대적으로 나타낸, 지시된 유전자형의 파리에서 (F) dUSP47 및 (G) dYOD1 mRNA 수준의 정량적인 RT-PCR 측정을 도시한다. 태크맨(TaqMan) 분석 Dm01795269_g1(드로소필라 CG5486(USP47)) 및 Dm01840115_s1(드로소필라 CG4603 (YOD1))를 사용하였다. Dm02134593_g1(RpII140)이 표준화에 사용되었다. (일원 ANOVA - 듄네트의 다중 비교 시험을 사용하여 p**<0.01 및 ***p<0.001. N = 3 실험. 오차 막대는 SEM을 나타낸다). 도 17H 및 I는 비히클 또는 파라콰트(10 mM)로 처리된, 지시된 유전자형의 파리의 생존 곡선을 도시한다. 그래프는 파라콰트를 먹인 후 지시된시간에서 살아있는 파리의 퍼센트를 도시한다. (이원 ANOVA - 본페로니의 다중 비교 시험을 사용하여 *p<0.05, p**<0.01 및 ***p<0.001. N = 5(H) 및 4(I) 실험. 오차 막대는 SEM을 나타낸다).
본 발명자들은 파킨-매개된 미토파지의 길항물질로서 미토콘드리아-국소화된 데유비퀴티나제(DUB), USP30을 동정하였다. USP30은 그의 데유비퀴티나제 활성을 통해, 손상된 미토콘드리아의 유비퀴틴화 및 분해를 방해하며, USP30의 억제는 돌연변이 파킨에 의해 유발된 미토파지 결함을 구제한다. 더욱이, USP30의 USP30 억제는 산화 스트레스를 감소시키고 미토콘드리아 독소, 로테논에 대한 보호를 제공한다. 손상된 미토콘드리아는 더 쉽게 파킨을 축적하는 듯하므로, USP30 억제는 건강하지 못한 미토콘드리아를 우선적으로 제거할 것이다. 뉴런(예를 들어 파킨슨병에서 미토콘드리아 기능장애에 특히 취약한 흑질 뉴런) 외에, 오래-사는, 대사적으로 활성인 세포, 예를 들어 심근세포가 또한 효율적인 미토콘드리아 질 조절 시스템에 의존한다. 이와 관련하여, 파킨은 심근세포를, 허혈 스트레스에 반응하여 형태의 활성화 및 손상된 미토콘드리아의 제거를 통해 허혈증/재관류 손상에 대해 보호하는 것으로 나타났다. 따라서, USP30 억제제는 우리에게 신경학적 질환, 심장 질환 및 전신 질환을 포함하여, 미토콘드리아 결함을 수반하는 질환의 치료를 제공한다.
I. 정의
"억제제"는 표적의 활성들 중 하나 이상을 차단, 중화, 억제, 폐지, 감소 및/또는 방해하고/하거나 상기 표적 단백질의 발현(또는 상기 표적 단백질을 암호화하는 핵산의 발현)을 감소시킬 수 있는 작용제를 지칭한다. 억제제는 비제한적으로 항체, 폴리펩티드, 펩티드, 핵산 분자, 짧은 간섭 RNA(siRNA) 및 다른 억제성 RNA, 소분자(예를 들어 작은 무기 분자), 폴리사카라이드, 폴리뉴클레오티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 앱타머, 및 펩티바디를 포함한다. 억제제는 표적 단백질의 활성 및/또는 발현을, 상기 억제제로 처리되지 않은 상기 표적 단백질의 발현 및/또는 활성에 비해 적어도 10%까지(예를 들어 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 심지어 100%)까지 감소시킬 수 있다.
"USP30 억제제"는 USP30의 활성들 중 하나 이상을 차단, 중화, 억제, 폐지, 감소 및/또는 방해하고/하거나 USP30의 발현(또는 USP30을 암호화하는 핵산의 발현)을 감소시킬 수 있는 작용제를 지칭한다. 일부 실시태양에서, USP30 억제제는 USP30의 데유비퀴티나제 활성을 감소시킨다. 일부 실시태양에서, USP30 억제제는 데유비퀴티나제 활성을 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 100%까지 감소시킨다. 데유비퀴티나제 활성을 임의의 기전, 예를 들어 비제한적으로 USP30의 활성 부위의 방해, 표적 인식 방해, USP30의 형태 변경, USP30의 적합한 세포내 국소화 방해 등을 포함하는 기전에 의해 억제제에 의해 감소시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, USP30 억제제는 USP30 발현을 억제하며, 상기 발현은 mRNA로서(예를 들어 상기 억제제는 상기 USP30 mRNA를 생산하는 USP30 유전자의 전사를 억제한다) 및/또는 단백질 수준으로서(예를 들어 상기 억제제는 USP30 단백질을 생산하는 USP30 mRNA의 번역을 억제한다)의 발현일 수 있다. 일부 실시태양에서, USP30 발현의 억제제는 USP30 단백질의 수준을 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 100%까지 감소시킨다.
"미토파지" 및 "미토콘드리아 분해"란 용어는 세포의 리소좀 기구를 통한 미토콘드리아의 조절된 분해를 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다.
"미토콘드리아 결함을 수반하는 질환"은 세포 집단에서 미토콘드리아 기능, 미토콘드리아 모양/형태, 미토콘드리아 막 전위, 및/또는 미토파지의 결함 또는 결함들을 수반하는 질환을 지칭한다. 미토콘드리아 결함을 수반하는 질환은 비제한적으로, 미토파지가 세포 집단에서 정상적인 세포 집단에서보다 더 느린 속도로 또는 더 적은 정도로 발생하게 하는 미토파지 결함을 수반하는 질환을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 미토파지의 결함은 감소된 미토파지가 증가된 결함성 미토콘드리아의 존재를 생성시키도록 하는 다른 미토콘드리아 결함을 동반한다. 미토콘드리아 결함을 수반하는 질환은 또한 비제한적으로 변경된 미토콘드리아 기능을 생성시키는 미토콘드리아 DNA의 돌연변이를 수반하는 질환을 포함한다. 미토콘드리아 결함을 수반하는 질환은 또한 미토콘드리아 산화 스트레스를 수반하는 질환을 포함하며, 상기 질환에서 세포 중 증가된 수준의 반응성 산소종(ROS) 및/또는 반응성 질소종(RNS)은 단백질 응집 및/또는 미토콘드리아 기능장애와 관련된다. 미토콘드리아 산화 스트레스는 미토콘드리아 기능장애를 생성시키거나, 또는 미토콘드리아 기능장애는 산화 스트레스를 생성시킬 수 있다. 미토콘드리아 결함을 수반하는 질환은 또한 비제한적으로 미토콘드리아 모양/형태의 결함을 수반하는 질환, 및 미토콘드리아 막 전위의 결함을 수반하는 질환을 포함한다. 미토콘드리아 결함을 수반하는 질환은 비제한적으로 신경퇴행성 질병(예를 들어 파킨슨병, 헌팅톤병, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 알쯔하이머병, 허혈, 뇌졸중, 루이소체 치매, 및 전측두엽 치매); 미토콘드리아 근육병증, 뇌병증, 젖산혈증 및 뇌졸중-유사 에피소드(MELAS) 증후군; 레베르 유전 시신경병증(LHON); 신경병증, 운동실조, 망막색소변성증-모체 유전된 레이 증후군(NARP-MILS); 다논병; 심근경색에 이르는 허혈성 심장병; 다중 설파타제 결손증(MSD); 점액지질증 II(ML II); 점액지질증 III(ML III); 점액지질증 IV(ML IV); GM1-강글리오사이드증(GM1); 신경 세로이드-지질갈색소증(NCL1); 알퍼스병; 바쓰 증후군; 베타-산화 결함; 카르니틴-아실-카르니틴 결손; 카르니틴 결손; 크레아틴 결손 증후군; 조-효소 Q10 결손; 복합체 I 결손; 복합체 II 결손; 복합체 III 결손; 복합체 IV 결손; 복합체 V 결손; COX 결손; 만성 진행성 외안근마비 증후군(CPEO); CPT I 결손; CPT II 결손; II형 글루타르산뇨증; 컨스-세르 증후군; 젖산뇨증; 장쇄 아실-CoA 데하이드로게나제 결손(LCHAD); 레이병 또는 증후군; 치명적인 유아 심근증(LIC); 루프트병; II형 글루타르산뇨증; 중간-쇄 아실-CoA 데하이드로게나제 결손(MCAD); 간대성 근경련성 간질 및 불균일 적색 섬유(MERRF) 증후군; 미토콘드리아 열성 실조증 증후군; 미토콘드리아 세포병증; 미토콘드리아 DNA 결핍 증후군; 근육신경위장 장애 및 뇌병증; 피어슨 증후군; 피루베이트 카복실라제 결손; 피루베이트 데하이드로게나제 결손; POLG 돌연변이; 중간/단-쇄 3-하이드록시아실-CoA 데하이드로게나제(M/SCHAD) 결손; 및 극장쇄 아실-CoA 데하이드로게나제(VLCAD) 결손을 포함한다.
파킨 또는 PINK1에서 "병원성 돌연변이"는 세포에서 감소된 활성을 생성시키고 기능 상실 및/또는 기능 획득(예를 들어 우성 음성 돌연변이, 예를 들어 파킨 Q311stop)을 수반할 수 있는 각각의 단백질 또는 유전자에서의 돌연변이 또는 돌연변이들을 지칭한다. 세포에서 상기와 같은 감소된 활성은 비제한적으로 감소된 효소 활성(예를 들어 감소된 유비퀴틴화 또는 키나제 활성), 우성 음성 돌연변이 단백질의 존재에 기인한 감소된 활성, 또 다른 세포 인자에의 감소된 결합, 세포하 국소화 변화에 기인한 감소된 활성, 및/또는 세포내 또는 세포 구획내 단백질의 감소된 수준에 기인한 감소된 활성을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 파킨 및/또는 PINK1에서의 병원성 돌연변이는 미토콘드리아의 유비퀴틴화를 감소시키며, 이는 감소된 미토파지를 생성시킬 수도 있다. 병원성 돌연변이는 또한 단백질의 암호화 영역 밖에서, 예를 들어 인트론(예를 들어 연접에 영향을 미친다), 프로모터, 5' 번역되지 않은 영역, 3' 번역되지 않은 영역 등에서 발생할 수도 있다.
더욱이, 파킨 돌연변이는 치환, 결실, 삽입, 중복 등, 또는 이들 중 임의의 조합을 수반할 수 있다. 파킨의 비제한적인 예시적인 병원성 돌연변이를 표 1에 나타낸다. PINK1 단백질의 비제한적인 예시적인 병원성 돌연변이를 표 2에 나타낸다. 파킨슨병 돌연변이의 데이터베이스는, 예를 들어 파킨슨병 돌연변이 데이터베이스(http://www.molgen.ua.ac.be/PDmutDB/)로 공개적으로 입수가능하다.
[표 1]
Figure pct00001
[표 2]
Figure pct00002
"산화 스트레스"란 용어는 세포에서 반응성 산소종(ROS) 및/또는 반응성 질소종(RNS)의 증가를 지칭한다. 일부 실시태양에서, 산화 스트레스는 단백질 응집 및/또는 미토콘드리아 기능장애를 도출한다. 일부 실시태양에서, 미토콘드리아 기능장애는 산화 스트레스를 도출한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "USP30"이란 용어는 달리 나타내지 않는 한 임의의 척추동물 출처, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 영장류(예를 들어 인간) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)로부터의 임의의 고유 USP30("유비퀴틴 특이적 펩티다제 30" 또는 "유비퀴틴 특이적 프로테아제 30")을 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 가공되지 않은 USP30뿐만 아니라 세포 중 가공으로부터 생성되는 USP30의 임의의 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 USP30의 천연 변체, 예를 들어 연접 변체 또는 대립유전자 변체를 포함한다. 예시적인 인간 USP30의 아미노산 서열을 서열번호 26(표 4)에 나타낸다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "파킨"이란 용어는 달리 나타내지 않는 한 임의의 척추동물 출처, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 영장류(예를 들어 인간) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)로부터의 임의의 고유 파킨을 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 가공되지 않은 파킨뿐만 아니라 세포 중 가공으로부터 생성되는 파킨의 임의의 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 파킨의 천연 변체, 예를 들어 연접 변체 또는 대립유전자 변체를 포함한다. 예시적인 인간 파킨의 아미노산 서열을 서열번호 29(표 4)에 나타낸다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "PINK1"이란 용어는 달리 나타내지 않는 한 임의의 척추동물 출처, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 영장류(예를 들어 인간) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)로부터의 임의의 고유 PINK1(PTEN-유도된 추정적인 키나제 단백질 1)을 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 가공되지 않은 PINK1뿐만 아니라 세포 중 가공으로부터 생성되는 PINK1의 임의의 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 PINK1의 천연 변체, 예를 들어 연접 변체 또는 대립유전자 변체를 포함한다. 예시적인 인간 PINK1의 아미노산 서열을 서열번호 30(표 4)에 나타낸다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "Tom20"이란 용어는 달리 나타내지 않는 한 임의의 척추동물 출처, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 영장류(예를 들어 인간) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)로부터의 임의의 고유 Tom20을 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 가공되지 않은 Tom20뿐만 아니라 세포 중 가공으로부터 생성되는 Tom20의 임의의 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 Tom20의 천연 변체, 예를 들어 연접 변체 또는 대립유전자 변체를 포함한다. 예시적인 인간 Tom20의 아미노산 서열을 서열번호 27(표 4)에 나타낸다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "MIRO1" 및 "MIRO"란 용어는 달리 나타내지 않는 한 임의의 척추동물 출처, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 영장류(예를 들어 인간) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)로부터의 임의의 고유 MIRO1(미토콘드리아 Rho GTPase 1)을 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 가공되지 않은 MIRO1뿐만 아니라 세포 중 가공으로부터 생성되는 MIRO1의 임의의 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 MIRO1의 천연 변체, 예를 들어 연접 변체 또는 대립유전자 변체를 포함한다. 예시적인 인간 MIRO1의 아미노산 서열을 서열번호 28(표 4)에 나타낸다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "MUL1"이란 용어는 달리 나타내지 않는 한 임의의 척추동물 출처, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 영장류(예를 들어 인간) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)로부터의 임의의 고유 MUL1(NFκB의 미토콘드리아 유비퀴틴 리가제 활성제)을 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 가공되지 않은 MUL1뿐만 아니라 세포 중 가공으로부터 생성되는 MUL1의 임의의 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 MUL1의 천연 변체, 예를 들어 연접 변체 또는 대립유전자 변체를 포함한다. 예시적인 인간 MUL1의 아미노산 서열을 서열번호 32(표 4)에 나타낸다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "ASNS"란 용어는 달리 나타내지 않는 한 임의의 척추동물 출처, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 영장류(예를 들어 인간) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)로부터의 임의의 고유 ASNS(아스파라진 신시타제[글루타민 가수분해성])를 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 가공되지 않은 ASNS뿐만 아니라 세포 중 가공으로부터 생성되는 ASNS의 임의의 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 ASNS의 천연 변체, 예를 들어 연접 변체 또는 대립유전자 변체를 포함한다. 예시적인 인간 ASNS의 아미노산 서열을 서열번호 33(표 4)에 나타낸다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "FKBP8"이란 용어는 달리 나타내지 않는 한 임의의 척추동물 출처, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 영장류(예를 들어 인간) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)로부터의 임의의 고유 FKBP8(FK506 결합 단백질 8)을 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 가공되지 않은 ASNS뿐만 아니라 세포 중 가공으로부터 생성되는 FKBP8의 임의의 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 FKBP8의 천연 변체, 예를 들어 연접 변체 또는 대립유전자 변체를 포함한다. 예시적인 인간 FKBP8의 아미노산 서열을 서열번호 34(표 4)에 나타낸다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "TOM70"이란 용어는 달리 나타내지 않는 한 임의의 척추동물 출처, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 영장류(예를 들어 인간) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)로부터의 임의의 고유 TOM70(외막 70 kDa 서브유닛의 트랜스로카제)을 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 가공되지 않은 TOM70뿐만 아니라 세포 중 가공으로부터 생성되는 TOM70의 임의의 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 TOM70의 천연 변체, 예를 들어 연접 변체 또는 대립유전자 변체를 포함한다. 예시적인 인간 TOM70의 아미노산 서열을 서열번호 35(표 4)에 나타낸다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "MAT2B"란 용어는 달리 나타내지 않는 한 임의의 척추동물 출처, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 영장류(예를 들어 인간) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)로부터의 임의의 고유 MAT2B(메티오닌 아데노실트랜스퍼라제 2 서브유닛 베타)를 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 가공되지 않은 MAT2B뿐만 아니라 세포 중 가공으로부터 생성되는 MAT2B의 임의의 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 MAT2B의 천연 변체, 예를 들어 연접 변체 또는 대립유전자 변체를 포함한다. 예시적인 인간 MAT2B의 아미노산 서열을 서열번호 36(표 4)에 나타낸다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "PRDX3"이란 용어는 달리 나타내지 않는 한 임의의 척추동물 출처, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 영장류(예를 들어 인간) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)로부터의 임의의 고유 PRDX3(페록시리독신 III)을 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 가공되지 않은 PRDX3뿐만 아니라 세포 중 가공으로부터 생성되는 PRDX3의 임의의 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 PRDX3의 천연 변체, 예를 들어 연접 변체 또는 대립유전자 변체를 포함한다. 예시적인 인간 PRDX3의 아미노산 서열을 서열번호 37(표 4)에 나타낸다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "IDE"란 용어는 달리 나타내지 않는 한 임의의 척추동물 출처, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 영장류(예를 들어 인간) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)로부터의 임의의 고유 IDE(인슐린 분해 효소)를 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 가공되지 않은 IDE뿐만 아니라 세포 중 가공으로부터 생성되는 IDE의 임의의 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 IDE의 천연 변체, 예를 들어 연접 변체 또는 대립유전자 변체를 포함한다. 예시적인 인간 IDE의 아미노산 서열을 서열번호 38(표 4)에 나타낸다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "VDAC1"이란 용어는 달리 나타내지 않는 한 임의의 척추동물 출처, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 영장류(예를 들어 인간) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)로부터의 임의의 고유 VDAC1(전압-의존성 음이온 선택성 채널 단백질 1)을 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 가공되지 않은 VDAC1뿐만 아니라 세포 중 가공으로부터 생성되는 VDAC1의 임의의 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 VDAC1의 천연 변체, 예를 들어 연접 변체 또는 대립유전자 변체를 포함한다. 예시적인 인간 VDAC1의 아미노산 서열을 서열번호 39(표 4)에 나타낸다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "VDAC2"란 용어는 달리 나타내지 않는 한 임의의 척추동물 출처, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 영장류(예를 들어 인간) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)로부터의 임의의 고유 VDAC2(전압-의존성 음이온 선택성 채널 단백질 2)를 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 가공되지 않은 VDAC2뿐만 아니라 세포 중 가공으로부터 생성되는 VDAC2의 임의의 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 VDAC2의 천연 변체, 예를 들어 연접 변체 또는 대립유전자 변체를 포함한다. 예시적인 인간 VDAC2의 아미노산 서열을 서열번호 44(표 4)에 나타낸다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "VDAC3"이란 용어는 달리 나타내지 않는 한 임의의 척추동물 출처, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 영장류(예를 들어 인간) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)로부터의 임의의 고유 VDAC3(전압-의존성 음이온 선택성 채널 단백질 3)을 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 가공되지 않은 VDAC3뿐만 아니라 세포 중 가공으로부터 생성되는 VDAC3의 임의의 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 VDAC3의 천연 변체, 예를 들어 연접 변체 또는 대립유전자 변체를 포함한다. 예시적인 인간 VDAC3의 아미노산 서열을 서열번호 45(표 4)에 나타낸다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "IPO5"란 용어는 달리 나타내지 않는 한 임의의 척추동물 출처, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 영장류(예를 들어 인간) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)로부터의 임의의 고유 IPO5(임포틴 5)을 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 가공되지 않은 IPO5뿐만 아니라 세포 중 가공으로부터 생성되는 IPO5의 임의의 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 IPO5의 천연 변체, 예를 들어 연접 변체 또는 대립유전자 변체를 포함한다. 예시적인 인간 IPO5의 아미노산 서열을 서열번호 40(표 4)에 나타낸다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "PTH2"란 용어는 달리 나타내지 않는 한 임의의 척추동물 출처, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 영장류(예를 들어 인간) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)로부터의 임의의 고유 PTH2(펩티딜-tRNA 하이드롤라제 2, 미토콘드리아성)를 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 가공되지 않은 PTH2뿐만 아니라 세포 중 가공으로부터 생성되는 PTH2의 임의의 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 PTH2의 천연 변체, 예를 들어 연접 변체 또는 대립유전자 변체를 포함한다. 예시적인 인간 PTH2의 아미노산 서열을 서열번호 41(표 4)에 나타낸다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "PSD13"이란 용어는 달리 나타내지 않는 한 임의의 척추동물 출처, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 영장류(예를 들어 인간) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)로부터의 임의의 고유 PSD13(26S 프로테아솜 비-ATPase 조절 서브유닛 13)을 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 가공되지 않은 PSD13뿐만 아니라 세포 중 가공으로부터 생성되는 PSD13의 임의의 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 PSD13의 천연 변체, 예를 들어 연접 변체 또는 대립유전자 변체를 포함한다. 예시적인 인간 PSD13의 아미노산 서열을 서열번호 42(표 4)에 나타낸다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "UBP13"이란 용어는 달리 나타내지 않는 한 임의의 척추동물 출처, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 영장류(예를 들어 인간) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)로부터의 임의의 고유 UBP13(유비퀴틴 카복실-말단 하이드롤라제 13)을 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 가공되지 않은 UBP13뿐만 아니라 세포 중 가공으로부터 생성되는 UBP13의 임의의 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 UBP13의 천연 변체, 예를 들어 연접 변체 또는 대립유전자 변체를 포함한다. 예시적인 인간 UBP13의 아미노산 서열을 서열번호 43(표 4)에 나타낸다.
"패키지 삽입물"이란 용어는 치료 제품의 상업적인 패키지 중에 통상적으로 포함되는 설명서를 지칭하며, 상기와 같은 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 용도, 투여량, 투여, 복합 요법, 금기 및/또는 경고에 대한 정보를 함유한다.
"개인" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 비제한적으로 가축(예를 들어 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들어 인간 및 비-인간 영장류, 예를 들어 원숭이), 토끼 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 개인 또는 대상체는 인간이다.
기준 폴리펩티드 서열에 관하여 "아미노산 서열 일치성 퍼센트(%)"는 최대의 서열 일치성 퍼센트를 성취하기 위해서 서열들을 정렬시키고, 필요한 경우, 틈을 도입시킨 후에, 서열 일치성의 부분으로서 어떠한 보존적인 치환도 고려하지 않고, 상기 기준 폴리펩티드 서열 중의 아미노산 잔기와 일치하는 후보 서열 중 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 일치성 퍼센트를 측정하기 위한 정렬을 당해 분야의 기술내에 있는 다양한 방식으로, 예를 들어 공개적으로 입수할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 성취할 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 서열들을 정렬시키기에 적합한 매개변수들, 예를 들어 비교하는 서열들의 전체길이에 대해 최대의 정렬을 성취하기 위해 필요한 임의의 연산을 결정할 수 있다. 그러나, 본 발명의 목적을 위해서, 아미노산 서열 일치성 퍼센트를 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성시킨다. 상기 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에 의해 저술되었으며, 소스 암호는 미국 저작권 관청(미국 워싱톤 D.C. 20559 소재)에 사용자 문서와 함께 제출되었다(이때 상기 코드는 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되어 있다). 상기 ALIGN-2 프로그램은 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재의 제넨테크 인코포레이티드로부터 공개적으로 입수할 수 있거나, 또는 상기 소스 암호로부터 편집될 수 있다. 상기 ALIGN-2 프로그램을, 디지털 UNIX V4.0D를 포함하여, UNIX 실행 시스템상에서 사용하기 위해 편집해야 한다. 모든 서열 비교 매개변수들은 상기 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변하지 않는다.
ALIGN-2를 아미노산 서열 비교를 위해 사용하는 경우에, 주어진 아미노산 서열 A의 주어진 아미노산 서열 B에의, 상기 B와의, 또는 상기 B에 대한 아미노산 서열 일치성 퍼센트(이는 한편으로 주어진 아미노산 서열 B에, 상기 B와, 또는 상기 B에 대해 일정한 아미노산 서열 일치성 퍼센트를 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있다)를 하기와 같이 계산한다:
100 x X/Y 분수
상기에서, X는 A 및 B의 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2의 정렬에서 상기 프로그램에 의해 일치성 합치로서 채점되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B 중 아미노산 잔기의 총수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, A 대 B의 아미노산 서열 일치성 퍼센트는 B 대 A의 아미노산 서열 일치성 퍼센트와 동일하지 않음을 알 것이다. 달리 구체적으로 서술되지 않는 한, 본 발명에 사용된 모든 아미노산 서열 일치성 퍼센트 값들은 상기 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞의 단락에 개시된 바와 같이 획득된다.
"약학 제형"이란 용어는 제형 중에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 하는 형태로 존재하고 상기 제형이 투여되는 대상체에게 허용 가능하지 않게 독성인 추가적인 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"약학적으로 허용 가능한 담체"는 대상체에게 무독성인, 활성 성분 이외의 약학 제형 중의 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 비제한적으로 완충제, 부형제, 안정제, 또는 보존제를 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "치료"(및 "치료하다" 및 "치료하는"과 같은 그의 문법상 어미변화)는 치료 중인 개인의 자연적인 과정을 변경시키고자 하는 임상적 중재를 지칭하며, 예방을 위해서 또는 임상적 병리 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 비제한적으로 질병의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 상기 질병의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질병 진행속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 진정 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 항체를 사용하여 질병의 발생을 지연시키거나 또는 질병의 진행을 늦춘다.
하나 이상의 추가적인 치료제"와 함께" 투여함은 동시적인(동반), 및 임의의 순서로 연속적인 투여를 지칭한다.
작용제, 예를 들어 약학 제형의 "유효량"은 목적하는 치료학적 또는 예방학적 결과를 성취하기 위한 투여량 및 상기에 필요한시간 동안 유효한 양을 지칭한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "벡터"란 용어는 결합된 또 다른 핵산을 전파할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기-복제 핵산 구조물로서 벡터뿐만 아니라 상기 벡터가 도입된 숙주 세포의 게놈내에 통합된 벡터를 포함한다. 몇몇 벡터는 상기 벡터가 작동적으로 연결되는 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 상기와 같은 벡터를 본 발명에서 "발현 벡터"라 칭한다.
"숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"이란 용어는 호환적으로 사용되며 상기와 같은 세포의 자손을 포함하여, 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 1차 형질전환된 세포 및 계대배양 수에 관계없이 상기 세포로부터 유래된 자손을 포함하는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함한다. 자손은 핵산 함량이 모 세포와 완전히 동일하지는 않을 수도 있지만, 돌연변이를 함유할 수도 있다. 원래 형질전환된 세포에서 선별되거나 선택된 동일한 기능 또는 생물 활성을 갖는 돌연변이 자손은 본 발명에 포함된다.
II. 조성물 및 방법
다양한 태양에서, 본 발명은 부분적으로, USP30 억제제 및 USP30을 억제함을 포함하는 질병 및 질환의 치료 방법을 기본으로 한다.
A. USP30의 예시적인 억제제
본 발명은 부분적으로 USP30 활성 및/또는 발현의 억제제가 미토콘드리아 유비퀴틴화 및 미토파지의 증가 및/또는 복원에 유효하다는 발견에 근거한다. 일부 실시태양에서, USP30 억제제는 신경퇴행성 질병, 예를 들어 파킨슨병뿐만 아니라 미토콘드리아 결함을 수반하는 질환, 예를 들어 미토파지 결함, 미토콘드리아 DNA의 돌연변이, 미토콘드리아 산화 스트레스, 및/또는 리소좀 저장 결함을 수반하는 질환들을 치료하기에 유효하다.
USP30 억제제는 USP30 활성의 억제제 및 USP30 발현의 억제제를 포함한다. 비제한적인 예시적인 상기와 같은 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 항체, 펩티드, 펩티바디, 앱타머, 및 소분자를 포함한다. 일부 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 짧은 간섭 RNA(siRNA)를 사용하여 USP30 발현을 억제할 수 있다. 일부 실시태양에서, 항체, 펩티드, 펩티바디, 앱타머, 및 소분자를 사용하여 USP30 활성을 억제할 수 있다. USP30 억제제의 일부 비제한적인 예를 본 발명에 개시한다. 추가의 억제제를 본 발명에 논의된 방법들을 포함하여 당해 분야의 표준 방법을 사용하여 확인할 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드
일부 실시태양에서, USP30 mRNA 및/또는 USP30 pre-mRNA에 하이브리드화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다. USP30을 암호화하는 비제한적인 예시적인 인간 mRNA 서열을 서열번호 30(표 4)에 나타낸다. 일부 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 USP30 mRNA 및/또는 USP30 pre-mRNA의 영역에 하이브리드화하며, 이중-가닥 RNA/DNA 하이브리드를 절단하는 RNase H를 통해 그의 분해를 지시한다. USP30 mRNA 및/또는 USP30 pre-mRNA의 절단을 매개함으로써, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 세포 중 USP30 단백질의 양을 감소시킬 수 있다(즉 USP30의 발현을 억제할 수 있다). 일부 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 RNase H를 통해 분해를 매개하는 것이 아니라, 오히려 상기 mRNA의 번역을, 예를 들어 번역 기구 결합 또는 진행도의 간섭을 통해 "차단"하거나, 또는 상기 pre-mRNA의 적합한 연접을, 예를 들어 연접 기구 및/또는 연접 부위의 접근성의 방해를 통해 "차단"한다. 일부 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 RNase H 이외의 기전을 통해 mRNA 및/또는 pre-mRNA의 분해를 매개할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 임의의 억제 기전이 본 발명에서 고려된다.
일부 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 10 내지 500 뉴클레오티드 길이, 또는 10 내지 400 뉴클레오티드 길이, 또는 10 내지 300 뉴클레오티드 길이, 또는 10 내지 200 뉴클레오티드 길이, 또는 10 내지 100 뉴클레오티드 길이, 또는 15 내지 100 뉴클레오티드 길이, 또는 10 내지 50 뉴클레오티드 길이, 또는 15 내지 50 뉴클레오티드 길이이다. 다양한 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상, 80개 이상, 90개 이상, 또는 100개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 USP30 mRNA 및/또는 pre-mRNA의 영역에 하이브리드화한다. 더욱이, 다양한 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 USP30 mRNA 및/또는 pre-mRNA의 영역에 100% 상보성일 필요는 없으나, 1개 이상의 불합치를 가질 수도 있다. 따라서, 일부 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 USP30 mRNA 및/또는 pre-mRNA의 영역에 대해 80% 이상 상보성, 85% 이상 상보성, 90% 이상 상보성, 95% 이상 상보성, 또는 100% 상보성이다. 일부 실시태양에서, USP30 mRNA의 영역 또는 USP pre-mRNA의 영역은 적어도 10 이상, 15 이상, 20 이상, 25 이상, 30 이상, 40 이상, 50 이상, 60 이상, 70 이상, 80 이상, 90 이상, 또는 100 이상 뉴클레오티드 길이이다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오사이드간 결합, 당 부분, 및/또는 핵염기 중 하나 이상에 대한 변형을 포함할 수도 있다. 더욱이, 상기 뉴클레오티드의 서열을 비-뉴클레오티드 성분에 의해 중단시키고/시키거나, 비-뉴클레오티드 성분을 상기 올리고뉴클레오티드의 한쪽 또는 양쪽 단부에 부착시킬 수도 있다.
비제한적인 예시적인 뉴클레오티드 변형은 당 변형을 포함하며, 여기에서 상기 당 중에 통상적으로 존재하는 하이드록실기 중 어느 하나가, 예를 들어 포스포네이트기, 포스페이트기에 의해 치환되거나, 표준 보호기에 의해 보호되거나, 또는 추가적인 뉴클레오티드에 대한 추가적인 결합을 마련하도록 활성화되거나, 또는 고체 지지체에 접합될 수도 있다. 5' 및 3' 말단 OH를 인산화하거나 또는 1 내지 20개 탄소 원자의 아민 또는 유기 캡핑기로 치환시킬 수 있다. 다른 하이드록실을 또한 표준 보호기로 유도체화할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한 당해 분야에 일반적으로 공지된 리보스 또는 데옥시리보스의 유사한 형태들, 예를 들어 2'-O-메틸-2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카보사이클릭 당 유사체, α-아노머 당, 에피머 당, 예를 들어 아라비노스, 자일로스 또는 릭소스, 피라노스 당, 퓨라노스 당, 세도헵툴로스, 비환족 유사체 및 비염기성 뉴클레오사이드 유사체, 예를 들어 메틸 리보사이드를 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포다이에스터 결합을 변형된 뉴클레오사이드간 결합으로 치환시킬 수도 있다. 이들 변형된 뉴클레오사이드간 결합은 비제한적으로, 포스페이트가 P(O)S("티오에이트"), P(S)S("다이티오에이트"), (O)NR2("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2("폼아세탈")(여기에서 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H 또는 에테르(-O-) 결합, 아릴, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 또는 아르알딜을 임의로 함유하는 치환되거나 비치환된 알킬(1-20 C)이다)로 치환되는 실시태양들을 포함한다. 폴리뉴클레오티드 중의 모든 결합이 동일할 필요는 없다. 선행의 설명은 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 siRNA를 포함하여, 본 발명에서 언급된 모든 올리고뉴클레오티드들에 적용된다.
일부 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 중의 하나 이상의 뉴클레오사이드간 결합은 포스포로티오에이트이다. 일부 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 중의 하나 이상의 당 부분은 2' 변형, 예를 들어 2'-O-알킬(예를 들어 2'-OMe) 및 2'-플루오로를 포함하거나; 또는 바이사이클릭 당 부분(예를 들어 LNA)이다. 비제한적인 예시적인 핵염기 변형은 5-메틸시토신을 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 단일의 올리고뉴클레오티드 내에 하나보다 많은 유형의 변형을 포함할 수도 있다. 즉, 비제한적인 예로서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 2'-O 알킬 변형, 바이사이클릭 뉴클레오티드, 및 동일한 올리고뉴클레오티드 중의 포스포로티오에이트 결합을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 "갭머(gapmer)"이다. 갭머는 RNase H 절단을 매개하기 위한 데옥시리보뉴클레오티드의 중심 부분, 및 상기 듀플렉스의 안정성을 증가시키는 변형된 당 부분을 포함하는 5' 및 3' "날개부"를 포함한다.
안티센스 올리고뉴클레오티드 설계 및 기전은 예를 들어 문헌[van Roon-Mom et al., Methods Mol . Biol ., 867: 79-96 (20120)]; 문헌[Prakash, Chem . Biodivers ., 8: 1616-1641 (2011)]; 문헌[Yamamoto et al., Future Med . Chem ., 3: 339-365 (2011)]; 문헌[Chan et al., Clin . Exper . Pharmacol. Physiol ., 33: 533-540 (2006)]; 문헌[Kurreck et al., Nucl . Acids Res ., 30: 1911-1918 (2002)]; 문헌[Kurreck, Eur . J. Biochem ., 270: 1628-1644 (2003)]; 문헌[Geary, Expert Opin. Drug Metab . Toxicol ., 5: 381-391 (2009)]; 문헌["Designing Antisense Oligonucleotides," available online from Integrated DNA Technologies (2011)]에 개시되어 있다.
짧은 간섭 RNA ( siRNA )
일부 실시태양에서, USP30의 발현은 짧은 간섭 RNA(siRNA)에 의해 억제된다. 본 발명에 사용된 바와 같이, siRNA는 이중-가닥 RNA(dsRNA)와 동의어이며 각각의 단부에 헤어핀 구조가 있거나 없는 이중-가닥 RNA 올리고머(또한 작은 헤어핀 RNA, 또는 shRNA라 지칭된다)를 포함한다. 짧은 간섭 RNA는 또한 작은 간섭 RNA, 침묵 RNA, 짧은 억제성 RNA 및/또는 작은 억제성 RNA로서 공지되어 있으며, 이들 용어는 본 발명에서 동등한 것으로 간주된다.
"짧은-간섭 RNA(siRNA)"란 용어는 유전자 발현을 방해하는 작은 이중-가닥 RNA를 지칭한다. siRNA는, 이중-가닥 RNA가 동종 유전자를 침묵시키는 과정인 RNA 간섭의 매개인자이다. 일부 실시태양에서, siRNA는 단일-가닥 돌출부(들)를 포함할 수도 있는 듀플렉스를 형성하는, 약 15 내지 25 뉴클레오티드 길이의 2개의 단일-가닥 RNA로 구성된다. 일부 실시태양에서, siRNA는 15 내지 25 뉴클레오티드 길이일 수 있고 단일-가닥 돌출부를 포함할 수도 있는 이중-가닥 부분을 포함하는 헤어핀 구조를 형성하는 단일 RNA로 구성된다. 상기와 같은 헤어핀 siRNA를 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)라 칭할 수 있다. 효소 복합체, 예를 들어 폴리머라제에 의한 상기 이중-가닥 RNA의 가공은 상기 이중-가닥 RNA를 절단시켜 siRNA를 생성시킬 수 있다. 상기 siRNA의 안티센스 가닥은 mRNA 절단을 안내하는 RNA 간섭(RNAi) 침묵화 복합체에 의해 사용되어, mRNA 분해를 촉진한다. 예를 들어 포유동물 세포에서 siRNA를 사용하여 특정한 유전자를 침묵시키기 위해서, 염기쌍 영역을 관련없는 mRNA에 대한 우연한 상보성을 피하도록 선택한다. RNAi 침묵화 복합체는 당해 분야에서, 예를 들어 문헌[Fire et al., Nature 391:806-811, 1998], 및 문헌[McManus et al., Nat. Rev . Genet. 3(10):737-747, 2002]에 의해 동정되었다.
일부 실시태양에서, 작은 간섭 RNA는 적어도 약 10 내지 약 200 뉴클레오티드, 예를 들어 약 16 뉴클레오티드 이상, 약 17 뉴클레오티드 이상, 약 18 뉴클레오티드 이상, 약 19 뉴클레오티드 이상, 약 20 뉴클레오티드 이상, 약 21 뉴클레오티드 이상, 약 22 뉴클레오티드 이상, 약 23 뉴클레오티드 이상, 약 24 뉴클레오티드 이상, 약 25 뉴클레오티드 이상, 약 26 뉴클레오티드 이상, 약 27 뉴클레오티드 이상, 약 28 뉴클레오티드 이상, 약 29 뉴클레오티드 이상, 약 30 뉴클레오티드 이상, 약 35 뉴클레오티드 이상, 약 40 뉴클레오티드 이상, 약 45 뉴클레오티드 이상, 약 50 뉴클레오티드 이상, 약 55 뉴클레오티드 이상, 약 60 뉴클레오티드 이상, 약 65 뉴클레오티드 이상, 약 70 뉴클레오티드 이상, 약 75 뉴클레오티드 이상, 약 80 뉴클레오티드 이상, 약 85 뉴클레오티드 이상, 약 90 뉴클레오티드 이상, 약 95 뉴클레오티드 이상, 약 100 뉴클레오티드 이상, 약 110 뉴클레오티드 이상, 약 120 뉴클레오티드 이상, 약 130 뉴클레오티드 이상, 약 140 뉴클레오티드 이상, 약 150 뉴클레오티드 이상, 또는 150 뉴클레오티드 초과를 포함한다. 일부 실시태양에서, siRNA는 10 내지 200 뉴클레오티드 길이, 또는 10 내지 100 뉴클레오티드 길이, 또는 15 내지 100 뉴클레오티드 길이, 또는 10 내지 60 뉴클레오티드 길이, 또는 15 내지 60 뉴클레오티드 길이, 또는 10 내지 50 뉴클레오티드 길이, 또는 15 내지 50 뉴클레오티드 길이, 또는 10 내지 30 뉴클레오티드 길이, 또는 15 내지 30 뉴클레오티드 길이이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 siRNA는 약 21 내지 약 25 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 siRNA 분자는 RNA 및 DNA의 헤테로듀플렉스이다.
안티센스 올리고뉴클레오티드의 경우와 같이, siRNA는 당, 뉴클레오사이드간 결합, 및/또는 핵염기에 대한 변형을 포함할 수 있다. siRNA에 사용하기에 적합한 비제한적인 예시적인 변형들이 본 발명 및 또한 문헌[Peacock et al., J. Org. Chem ., 76: 7295-7300 (2011)]; 문헌[Bramsen et al., Methods Mol . Biol ., 721: 77-103 (2011)]; 문헌[Pasternak et al., Org . Biomol . Chem ., 9: 3591-3597 (2011)]; 문헌[Gaglione et al., Mini Rev . Med . Chem ., 10: 578-595 (2010)]; 문헌[Chernolovskaya et al., Curr . Opin . Mol . Ther ., 12: 158-167 (2010)]에 개시되어 있다.
세포에서 USP30의 발현을 억제하는 방법은 상기 세포에 부분적인 또는 완전한 이중-가닥 특성을 갖는 siRNA를 도입시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, siRNA는 상기 USP30 유전자 암호화 영역 또는 pre-mRNA에서 발견되는 뉴클레오티드 서열에 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 100% 일치하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 USP30 유전자에 특이적인 siRNA를 합성하고 이를 대상체에게 직접 도입시킨다. 다른 실시태양에서, 상기 siRNA를 표적화된 전달 시스템, 예를 들어 적합한 조직 또는 세포 유형을 특이적으로 인식하고 상기 조직 또는 유형에 siRNA를 전달하는 표적 특이성 리포솜의 부분으로서 제형화할 수 있다. 상기 표적화된 siRNA의 대상체에의 투여시, 상기 siRNA는 상기 적합한 세포 유형으로 전달되고, 이에 의해 상기 세포 유형내 siRNA 농도가 증가한다. 상기 전달된 siRNA의 용량에 따라, 상기 과정은 USP30 단백질 발현의 부분적인 또는 완전한 상실을 제공할 수 있다.
다른 실시태양에서, 적합한 세포 또는 조직에 상기 USP30 유전자에 특이적인 siRNA의 하나 또는 2개의 가닥 모두를 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 구조물을 제공한다. 상기 실시태양에서, 상기 siRNA의 하나 또는 2개의 가닥 모두를 암호화하는 핵산을 구성 또는 조절 프로모터의 조절 하에 둘 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 핵산은 헤어핀 구조를 형성하는 siRNA, 예를 들어 shRNA를 암호화한다.
siRNA에 대한 다양한 담체 및 약물-전달 시스템들은 예를 들어 문헌[Seth et al., Ther . Deliv ., 3: 245-261 (2012)]; 문헌[Kanasty et al., Mol . Ther ., 20: 513-524 (2012)]; 문헌[Methods Enzymol ., 502: 91-122 (2012)]; 문헌[Vader et al., Curr . Top . Med . Chem ., 12: 108-119 (2012)]; 문헌[Naeye et al., Curr . Top. Med . Chem ., 12: 89-96 (2012)]; 문헌[Foged, Curr . Top . Med . Chem ., 12: 97-107 (2012)]; 문헌[Chaturvedi et al., Expert Opin . Drug Deliv ., 8: 1455-1468 (2011)]; 문헌[Gao et al., Int . J. Nanomed ., 6: 1017-1025 (2011)]; 문헌[Shegokar et al., Pharmazie ., 66: 313-318 (2011)]; 문헌[Kumari et al., Expert Opin. Drug Deliv., 11: 1327-1339 (2011)]에 개시되어 있다.
항체
일부 실시태양에서, USP30 억제제는 항체이다. "항체"란 용어는 본 발명에서 가장 넓은 의미로 사용되며 다양한 항체 구조물, 예를 들어 비제한적으로 단클론 항체, 다클론 항체, 다중특이성 항체(예를 들어 이중특이성 항체), 및 목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함한다. 본 발명에 사용된 바와 같은 "항체"란 용어는 적어도 중쇄의 상보성-결정 영역(CDR) 1, CDR2, 및 CDR3 및 적어도 경쇄의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 분자를 지칭하며, 여기에서 상기 분자는 항원에 결합할 수 있다. 상기 항체란 용어는 비제한적으로 항원과 결합할 수 있는 단편, 예를 들어 Fv, 단일-쇄 Fv(scFv), Fab, Fab' 및 (Fab')2를 포함한다. 항체란 용어는 또한 비제한적으로 키메릭 항체, 인간화된 항체, 및 다양한 종, 예를 들어 마우스, 인간, 키노몰구스 원숭이 등의 항체를 포함한다.
일부 실시태양에서, 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 이들 중 하나 또는 둘 모두는 각각의 불변 영역을 포함할 수도, 포함하지 않을 수도 있다. 중쇄 가변 영역은 중쇄 CDR1, 프레임워크(RF)2, CDR2, FR3 및 CDR3을 포함한다. 일부 실시태양에서, 중쇄 가변 영역은 또한 CDR1에 대해 N-말단인 FR1의 적어도 일부, 및/또는 CDR3에 대해 C-말단인 FR4의 적어도 일부를 포함한다. 유사하게, 경쇄 가변 영역은 경쇄 CDR1, 프레임워크(FR)2, CDR2, FR3 및 CDR3을 포함한다. 일부 실시태양에서, 경쇄 가변 영역은 또한 FR1 및/또는 FR4를 포함한다.
비제한적인 예시적인 중쇄 불변 영역은 γ, δ, 및 α를 포함한다. 비제한적인 예시적인 중쇄 불변 영역은 또한 ε 및 μ를 포함한다. 각각의 중쇄 불변 영역은 항체 아이소타입에 상응한다. 예를 들어, γ 불변 영역을 포함하는 항체는 IgG 항체이며, δ 불변 영역을 포함하는 항체는 IgD 항체이고, α 불변 영역을 포함하는 항체는 IgA 항체이다. 몇몇 아이소타입들을 하위부류로 추가로 세분할 수 있다. 예를 들어, IgG 항체는 비제한적으로 IgG1(γ1 불변 영역을 포함한다), IgG2(γ2 불변 영역을 포함한다), IgG3(γ3 불변 영역을 포함한다), 및 IgG4(γ4 불변 영역을 포함한다) 항체를 포함한다. 비제한적인 예시적인 경쇄 불변 영역은 λ 및 κ를 포함한다.
일부 실시태양에서, 항체는 키메릭 항체이며, 상기 항체는 첫 번째 종(예를 들어 마우스, 래트, 키노몰구스 원숭이 등)으로부터의 하나 이상의 가변 영역 및 두 번째 종(예를 들어 인간, 키노몰구스 원숭이, 닭 등)으로부터의 하나 이상의 불변 영역을 포함한다. 키메릭 항체의 인간 불변 영역은 비-인간 불변 영역(존재하는 경우, 치환된다)과 동일한 아이소타입일 필요는 없다. 키메릭 항체는 예를 들어 미국특허 제 4,816,567 호; 및 문헌[Morrison et al. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 81: 6851-55 (1984)]에 논의되어 있다.
일부 실시태양에서, 항체는 인간화된 항체이며, 상기 항체에서 비-인간 가변 영역(예를 들어 마우스, 래트, 키노몰구스 원숭이, 닭 등)의 프레임워크 영역 중 하나 이상의 아미노산이 인간 가변 영역으로부터의 상응하는 아미노산으로 치환되었다. 일부 실시태양에서, 인간화된 항체는 하나 이상의 인간 불변 영역 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 실시태양에서, 인간화된 항체는 Fab, scFv, (Fab')2 등이다. 예시적인 인간화된 항체는 CDR-그래프트화된 항체를 포함하며, 상기 항체에서 첫 번째(비-인간) 종의 상보성 결정 영역(CDR)이 두 번째(인간) 종의 프레임워크 영역(FR)상에 그래프트화되었다. 인간화된 항체는 비-인간 항체에 대한 인간 면역 반응(예를 들어 인간 항-마우스 항체(HAMA) 반응)(상기 반응은 항체 치료제에 대한 면역 반응을 생성시키고 상기 치료제의 유효성을 감소시킬 수 있다)을 감소시키거나 제거하기 때문에 치료 분자로서 유용하다. 항체를 임의의 방법에 의해 인간화시킬 수 있다. 인간화의 비제한적인 예시적인 방법은 예를 들어 미국특허 제 5,530,101 호; 미국특허 제 5,585,089 호; 미국특허 제 5,693,761 호; 미국특허 제 5,693,762 호; 미국특허 제 6,180,370 호; 문헌[Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986)]; 문헌[Riechmann et al., Nature 332: 323-27 (1988)]; 문헌[Verhoeyen et al., Science 239: 1534-36 (1988)]; 및 미국 공보 제 US 2009/0136500 호에 개시된 방법들을 포함한다.
일부 실시태양에서, 항체는 인간 항체, 예를 들어 인간 면역글로불린 유전자를 포함하는 비-인간 동물에서 생산된 항체, 예를 들어 제노마우스(XenoMouse)(등록상표), 및 시험관내 방법, 예를 들어 파지 디스플레이(여기에서 상기 항체 레퍼토리는 인간 면역글로불린 서열을 기본으로 한다)를 사용하여 선택된 항체이다. 인간 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 트랜스제닉 마우스 및 인간 항체의 제조에서 그의 용도가 예를 들어 문헌[Jakobovits et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 2551-55 (1993)]; 문헌[Jakobovits et al., Nature 362: 255-8 (1993)]; 문헌[Lonberg et al., Nature 368: 856-9 (1994)]; 및 미국특허 제 5,545,807 호; 미국특허 제 6,713,610 호; 미국특허 제 6,673,986 호; 미국특허 제 6,162,963 호; 미국특허 제 5,545,807 호; 미국특허 제 6,300,129 호; 미국특허 제 6,255,458 호; 미국특허 제 5,877,397 호; 미국특허 제 5,874,299 호; 및 미국특허 제 5,545,806 호에 개시되어 있다. 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하는 인간 항체의 제조 방법은 예를 들어 문헌[Hoogenboom et al., J. Mol . Biol . 227: 381-8 (1992)]; 문헌[Marks et al., J. Mol . Biol . 222: 581-97 (1991)]; 및 PCT 공보 제 WO 99/10494 호에 개시되어 있다.
중쇄 불변 영역의 선택은 항체가 생체내에서 효과기 작용을 가질 것인지의 여부를 결정할 수 있다. 상기와 같은 효과기 작용은, 일부 실시태양에서, 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC) 및/또는 보체-의존성 세포독성(CDC)을 포함하며, 상기 항체가 결합되는 세포를 살해할 수 있다. 전형적으로, 인간 IgG1 또는 IgG3 중쇄를 포함하는 항체는 효과기 작용을 갖는다. 일부 실시태양에서, 효과기 작용은 바람직하지 못하다. 일부 상기와 같은 실시태양에서, 인간 IgG4 또는 IgG2 중쇄 불변 영역을 선택하거나 가공할 수 있다.
펩티드
일부 실시태양에서, USP30 억제제는 펩티드이다. 펩티드는 D- 또는 L-아미노산의 단일쇄 또는 펩티드 결합에 의해 결합되는 D- 및 L-아미노산의 혼합물로 구성된 아미노산들의 서열이다. 상기 펩티드의 아미노산 서브유닛은 천연 아미노산이거나 또는 비-천연 아미노산일 수 있다. 다수의 비-천연 아미노산은 당해 분야에 공지되어 있으며 상업적으로 입수할 수 있다. 더욱이, 상기 아미노산 서브유닛들을 결합시키는 펩티드 결합을 변형시킬 수도 있다. 예를 들어 문헌[Sigma-Aldrich; Gentilucci et al., Curr . Pharm . Des . 16: 3185-3203 (2010)]; US 2008/0318838을 참조하시오. 일반적으로, 펩티드는 2개 이상의 아미노산 잔기를 함유하며 길이가 약 50 아미노산 미만이다. 다양한 실시태양에서, 펩티드 억제제는 3 내지 50, 5 내지 50, 10 내지 50, 10 내지 40, 10 내지 35, 10 내지 30, 또는 10 내지 25 아미노산을 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다. 다양한 실시태양에서, 펩티드 억제제는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 아미노산을 포함할 수 있다. 다양한 실시태양에서, 펩티드 억제제는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 아미노산으로 이루어질 수 있다.
표적 분자에 특이적으로 결합하는 펩티드의 개발 방법은 파지 디스플레이 방법을 포함하여, 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어 미국특허 제 5,010,175 호; WO 1996/023899; WO 1998/015833; 문헌[Bratkovic, Cell . Mol . Life Sci ., 67: 749-767 (2010)]; 문헌[Pande et al., Biotech . Adv . 28: 849-858 (2010)]을 참조하시오. 일부 실시태양에서, 펩티드의 선택에 이어서, 상기 펩티드를, 예를 들어 비-천연 아미노산 및/또는 펩티드 결합을 통합시킴으로써 변형시킬 수도 있다. USP30의 펩티드 억제제를 선택하는 비제한적인 예시적인 방법은 본 발명에 개시되어 있다.
펩티드 억제에 중요한 아미노산은 일부 실시태양에서 알라닌 주사 돌연변이 생성에 의해 결정될 수 있다. 차례로 각각의 잔기를 단일 아미노산, 전형적으로는 알라닌으로 치환시키고, USP30 억제에 대한 효과를 평가한다. 예를 들어 미국특허 제 5,580,723 호 및 미국특허 제 5,834,250 호를 참조하시오. 절두(truncation) 분석을 또한 억제 활성에 대한 펩티드 단부의 아미노산의 중요성뿐만 아니라 상기 펩티드의 길이의 중요성을 측정하는데 사용할 수 있다. 일부 예에서, 절두 분석은 모 펩티드보다 더 단단히 결합하는 보다 짧은 펩티드를 밝혀낼 수 있다. 다양한 돌연변이 분석, 예를 들어 알라닌 주사 돌연변이 및 절두 분석의 결과를 사용하여 억제제 펩티드의 추가적인 변형에 대한 정보를 제공할 수 있다.
비제한적인 예시적인 펩티드 억제제들이 본 발명에, 예를 들어 실시예 10 및 도 15에 개시되어 있다. 당해 분야의 숙련가는 일부 실시태양에서 본 발명에 개시된 펩티드 서열을, 바람직한 성질들, 예를 들어 USP30에 대한 개선된 특이성, USP30에 대한 보다 강한 결합, 개선된 용해도, 및/또는 개선된 세포막 투과성을 갖는 추가의 펩티드 억제제들을 생성시키기 위해서 변형시킬 수 있음을 알 것이다. 일부 실시태양에서, USP30의 펩티드 억제제는 서열번호 1 내지 22 중에서 선택된 서열에 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 100% 일치하는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 펩티드 억제제는 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
X1X2CX3X4X5X6X7X8X9X10X11CX12(서열번호 48)
상기에서:
X1은 L, M, A, S 및 V 중에서 선택되고;
X2는 Y, D, E, I, L, N 및 S 중에서 선택되고;
X3은 F, I 및 Y 중에서 선택되고;
X4는 F, I 및 Y 중에서 선택되고;
X5는 D 및 E 중에서 선택되고;
X6은 L, M, V 및 P 중에서 선택되고;
X7은 S, N, D, A 및 T 중에서 선택되고;
X8은 Y, D, F, N 및 W 중에서 선택되고;
X9는 G, D, 및 E 중에서 선택되고;
X10은 Y 및 F 중에서 선택되고;
X11은 L, V, M, Q 및 W 중에서 선택되고;
X12는 F, L, C, V 및 Y 중에서 선택된다.
일부 실시태양에서, 상기 펩티드는 USP30을 10 μM 미만의 IC50으로 억제한다. 일부 실시태양에서, X1은 L 및 M 중에서 선택된다. 일부 실시태양에서, X3은 Y 및 D 중에서 선택된다. 일부 실시태양에서, X3은 F이다. 일부 실시태양에서, X4는 Y 및 F 중에서 선택된다. 일부 실시태양에서, X4는 Y이다. 일부 실시태양에서, X5는 D이다. 일부 실시태양에서, X6은 L 및 M 중에서 선택된다. 일부 실시태양에서, X7은 S, N 및 D 중에서 선택된다. 일부 실시태양에서, X8은 Y이다. 일부 실시태양에서, X9는 G이다. 일부 실시태양에서, X10은 Y이다. 일부 실시태양에서, X11은 L이다. 일부 실시태양에서, X12는 F 및 L 중에서 선택된다. 일부 실시태양에서 X12는 F이다.
일부 실시태양에서, 펩티드 억제제는 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
XAX1X2CX3X4X5X6X7X8X9X10X11CX12XB(서열번호 49)
상기에서, X1 내지 X12는 상기 정의된 바와 같고, XA 및 XB는 각각 독립적으로 임의의 아미노산이다. 일부 실시태양에서, XA는 S, A, T, E, Q, D 및 R 중에서 선택된다. 일부 실시태양에서, XB는 D, Y, E, H, S 및 I 중에서 선택된다.
펩티바디
일부 실시태양에서, USP30 억제제는 펩티바디이다. 펩티바디는 비히클에 결합된 펩티드 서열이다. 일부 실시태양에서, 상기 펩티바디의 비히클 부분은 상기 펩티드의 분해를 감소시키고/시키거나 반감기를 증가시키고, 독성을 감소시키고, 면역원성을 감소시키고/시키거나, 생물 활성을 증가시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 펩티바디의 비히클 부분은 항체 Fc 도메인이다. 다른 비히클은 선형 중합체(예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리리신, 덱스트란 등); 분지쇄 중합체(예를 들어 미국특허 제 4,289,872 호 및 미국특허 제 5,229,490 호; WO 1993/0021259를 참조하시오); 지질; 콜레스테롤 그룹(예를 들어 스테로이드); 탄수화물 또는 올리고사카라이드; 또는 임의의 천연 또는 합성 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드 비히클을 포함한다. 상기 펩티바디의 펩티드 부분은 전형적으로 표적, 예를 들어 USP30에 결합한다. 일부 실시태양에서, 상기 펩티바디의 펩티드 부분은 본 발명에 개시된 펩티드이다.
일부 실시태양에서, 펩티바디는 항체의 몇몇 바람직한 특성들, 예를 들어 혈장에서 긴 수명 및 결합 상대에 대한 증가된 친화성(예를 들어, Fc 도메인의 이량체화에 기인하여)을 유지한다. 상기 펩티바디의 생산은 예를 들어 WO 2000/0024782 및 미국특허 제 6,660,843 호에 일반적으로 개시되어 있다.
앱타머
일부 실시태양에서, USP30 억제제는 앱타머이다. 본 발명에 사용된 바와 같은 "앱타머"란 용어는 표적 분자, 예를 들어 USP30에 특이적으로 결합하는 핵산 분자를 지칭한다. 앱타머는 고도로 특이성이며, 크기가 비교적 작고/작거나, 비-면역원성이도록 선택될 수 있다. 예를 들어 문헌[Ni, et al., Curr . Med . Chem. 18: 4206 (2011)]을 참조하시오. 일부 실시태양에서, 앱타머는 USP30에 특이적으로 결합하고 USP30을 억제할 수 있는 2차 및/또는 3차 구조를 형성하는 작은 RNA, DNA, 또는 혼합된 RNA/DNA 분자이다.
일부 실시태양에서, 앱타머는, 예를 들어 생체내 안정성을 증가시키거나, 표적 친화성을 증가시키거나, 용해도를 증가시키거나, 혈청 반감기를 증가시키거나, 분해에 대한 내성을 증가시키거나/시키고 막 투과성을 증가시키는 등의 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드(예를 들어 변형된 당, 변형된 핵염기, 및/또는 변형된 뉴클레오사이드간 결합을 갖는 뉴클레오사이드)를 포함한다. 일부 실시태양에서, 앱타머는 예를 들어 엑소뉴클레아제에 의한 말단 분해를 방지하도록 말단에 하나 이상의 변형된 또는 전화된 뉴클레오티드를 포함한다.
앱타머의 생성 및 치료학적 용도는 당해 분야에 널리 확립되어 있다. 예를 들어 미국특허 제 5,475,096 호를 참조하시오. 일부 실시태양에서, 앱타머는, 예를 들어 문헌[Ellington et al., Nature 346: 818 (1990)]; 및 문헌[Tuerk et al., Science 249: 505 (1990)]에 개시된 바와 같이, 기하급수적인 농축에 의한 리간드의 계통적 진화(SELEX)에 의해 생성된다. 일부 실시태양에서, 앱타머는 예를 들어 문헌[Berezovski et al., J. Am . Chem . Soc. 130: 913 (2008)]에 개시된 바와 같이, AptaBid 방법에 의해 생성된다. 느린 오프율(off-rate) 앱타머 및 상기와 같은 앱타머의 선택 방법은 예를 들어 문헌[Brody et al., Expert Rev . Mol . Diagn ., 10: 1013-22 (2010)]; 및 미국특허 제 7,964,356 호에 개시되어 있다.
소분자
일부 실시태양에서, USP30의 소분자 억제제를 제공한다. 일부 실시태양에서, USP30의 소분자 억제제는 USP30에 결합하며 USP30 효소 활성(예를 들어 펩티다제 활성)을 억제하고/하거나 USP30 표적 결합을 방해하고/하거나 효소 활성 또는 표적 결합의 효율이 감소되도록 USP30 형태를 변경시킨다.
"소분자"는 본 발명에서 약 1000 달톤 이하, 예를 들어 약 900 달톤 이하, 약 800 달톤 이하, 약 700 달톤 이하, 약 600 달톤 이하, 또는 약 500 달톤 이하의 분자량을 갖는 것으로 정의된다. 소분자는 유기 또는 무기일 수 있으며, 예를 들어 화합물 라이브러리 또는 천연 공급원으로부터 단리되거나, 또는 공지된 화합물의 유도체화에 의해 수득될 수 있다.
일부 실시태양에서, USP30의 소분자 억제제는 소분자의 라이브러리를 선별함으로써 동정된다. 소분자 라이브러리의 발생 및 선별은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어 문헌[Thompson et al., Chem . Rev . 96: 555-600 (1996)]; 및 국립 건강 분자 라이브러리 연구소 프로그램을 참조하시오. 예를 들어 조합적인 화학 라이브러리를, 일련의 화학적 구성요소들을 다양한 조합으로 혼합함으로써 형성시킬 수 있으며, 수 백만개의 화학적 화합물들을 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 100개의 상호교환 가능한 화학적 구성요소들의 체계적이고 조합적인 혼합은 이론적으로 1억개의 사량체성 화합물 또는 100억개의 오량체성 화합물의 합성을 생성시킨다. 예를 들어 문헌[Gallop et al. 1994, J. Med . Chem . 37: 1233-1250]을 참조하시오. 다양한 다른 유형의 소분자 라이브러리를 또한 설계할 수 있으며 예를 들어 천연 생성물 라이브러리를 사용할 수 있다. 소분자 라이브러리를 다양한 상업적 판매자로부터 획득할 수 있다. 예를 들어 켐브리지(ChemBridge), 엔조 라이프 사이언시즈(Enzo Life Sciences), 시그마 알드리치(Sigma-Aldrich), AMRI 글로벌(Global) 등을 참조하시오.
USP30의 소분자 억제제를 동정하기 위해서, 일부 실시태양에서, 소분자 라이브러리를 본 발명에 개시된 분석을 사용하여 선별할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 소분자 억제제에 공통적인 특징을 확인하기 위해서 USP30을 억제하는 각 소분자의 특성을 고려하며, 이는 상기 소분자의 추가적인 변형에 대한 정보를 제공하는데 사용될 수 있다.
일부 실시태양에서, 예를 들어 초기 라이브러리 선별에서 동정된 USP30의 하나 이상의 소분자 억제제를 사용하여 상기 초기 소분자 억제제의 변형을 포함하는 후속 라이브러리를 생성시킬 수 있다. 상기 방법을 사용하여, USP30에 대한 보다 큰 특이성(다른 DUB에 비해), 및/또는 USP30에 대한 보다 큰 결합 친화성, 및/또는 다른 바람직한 성질들, 예를 들어 낮은 독성, 보다 큰 용해도, 보다 큰 세포 투과성 등을 갖는 후보 화합물들의 후속 반복물을 개발할 수 있다.
탈유비퀴틴화 효소의 다양한 소분자 억제제들이 당해 분야에 공지되어 있으며, 이중 일부를 표 3에 나타낸다.
[표 3]
유비퀴틴 특이적 프로테아제의 억제제
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
표 3 및 상기 중에 인용된 참고문헌들에 나타낸 억제제들뿐만 아니라 당해 분야에 공지된 추가적인 억제제들은 USP30의 특정한 억제제들을 포함하여, 추가적인 탈유비퀴틴화 효소 억제제의 개발을 위한 토대를 형성할 수 있다. 또한 WO 2007/009715를 참조하시오. 당해 분야의 숙련가는 예를 들어 상기 구조들 중 어느 하나에 대한 변형을 수행하여 추정적인 탈유비퀴틴화 효소 억제제의 라이브러리를 형성시키고 본 발명에 개시된 분석을 사용하여 USP30에 대한 특이성을 갖는 변형된 화합물을 선별할 수 있다.
B. 분석
다양한 분석들을 사용하여 USP30 억제제를 동정하고 시험할 수 있다. USP30 단백질의 발현을 감소시키는 억제제들에 대해서, 단백질 수준을 검출하는 임의의 분석이 억제의 측정에 적합할 수 있다. 일례로서, 단백질 수준을 USP30에 결합하는 항체를 사용하는 다양한 면역분석들, 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블럿팅, 면역조직화학 등에 의해 검출할 수 있다. 억제제가 USP30의 세포내 국소화에 영향을 미치는 경우, 세포내 국소화의 변화를, 예를 들어 면역조직화학에 의해서 또는 세포 성분을 분별하고 하나 이상의 항체를 사용하여 다양한 분획 중 USP30의 수준을 검출함으로써 검출할 수 있다. USP30 mRNA의 수준을 감소시키는 억제제들의 경우, 증폭-기재 분석, 예를 들어 역전사효소 PCR(RT-PCR)을 사용하여 mRNA 수준의 변화를 검출할 수 있다.
USP30 효소 활성에 영향을 미치는 억제제들의 경우, 비제한적인 예시적인 분석은 하기와 같다: USP30을 USP30 기질의 존재 하에서 상기 억제제 또는 후보 억제제와 접촉시킨다. 비제한적인 예시적인 USP30 기질은 Ub-β-갈락토시다제 융합 단백질(예를 들어 문헌[Quesada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun 314:54-62 (2004)]을 참조하시오), Ub4 쇄(예를 들어 Lys-48- 및 Lys-63-결합된 Ub), UBIQ 유전자 번역의 선형 산물; 단일- 또는 다중-유비퀴틴화 접합체 중 번역-후 형성된 분지된 펩티드 결합; 프로테오솜-매개된 분해로부터 생성되는 유비퀴틴화된 잔류물, 및 다른 작은 아미드 또는 에스터 부가물을 포함한다. USP30 활성(예를 들어 Ub 기질의 가공)을 USP30 및 상기 억제제 또는 후보 억제제의 존재하에서 측정한다. 상기 활성을 상기 억제제 또는 후보 억제제 없이 USP30의 존재하에서 Ub 기질의 가공과 비교한다. 상기 억제제 또는 후보 억제제가 USP30의 활성을 억제하는 경우, UB 기질 가공의 양은 상기 억제제 또는 후보 억제제 없이 USP30 존재하의 UB 기질 가공의 양에 비해 감소할 것이다.
억제 및/또는 특이성을 측정하기 위한 추가의 비제한적인 예시적인 분석을 실시예 10에 개시한다. 간단히, 일련의 농도의 억제제를 유비퀴틴-AMC 및 USP30과 혼합한다(상기 억제제를 상기 기질과 혼합하고 이어서 UPS30을 가하여 상기 반응을 출발시킬 수도 있다). 특이성을 측정하고자 하는 경우, 유사한 반응을 USP30 대신에 하나 이상의 추가적인 DUB 또는 유비퀴틴 C-말단 하이드롤라제(UCH)를 사용하여 준비할 수도 있다. 상기 효소의 첨가 직후에, 형광을 모니터한다(340 ㎚에서의 여기 및 465 ㎚에서의 방출 사용). 효소 활성의 초기 비율을 실시예 10에 개시된 바와 같이 계산할 수 있다.
C. 약학 제형
본 발명에 개시된 바와 같은 USP30 억제제의 약학 제형을, 목적하는 순도를 갖는 상기와 같은 억제제를 하나 이상의 임의의 약학적으로 허용 가능한 담체(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 함께 혼합하여 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 일반적으로 무독성이며, 비제한적으로 완충제, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 산화방지제; 보존제(예를 들어 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드); 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-형성 대이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착체(예를 들어 Zn-단백질 착체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 본 발명에서 예시적인 약학적으로 허용 가능한 담체는 간질성 약물 분산제, 예를 들어 용해성 중성-활성 하이알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들어 인간 용해성 PH-20 하이알루로니다제 당단백질, 예를 들어 rHuPH20(하일레넥스(HYLENEX)(등록상표), 박스터 인터내셔널 인코포레이티드(Baxter International, Inc.))을 추가로 포함한다. rHuPH20을 포함하여, 몇몇 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 미국특허 공보 제 2005/0260186 호 및 제 2006/0104968 호에 개시되어 있다. 하나의 태양에서, sHASEGP를 하나 이상의 추가적인 글리코스아미노글리카나제, 예를 들어 콘드로이티나제와 병용한다.
본 발명의 제형은 또한 치료되는 특정한 적응증에 필요한 바와 같은 하나보다 많은 활성 성분, 바람직하게는 서로 불리한 영향을 미치지 않는 상보적인 활성을 갖는 것들을 함유할 수도 있다.
활성 성분을, 예를 들어 코아세르베이션 기법에 의해서 또는 계면 중합에 의해서 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어 리포솜, 알부민 미소구, 미세유화액, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로유화액 중의 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메트아크릴레이트) 마이크로캡슐 중에 포집할 수 있다. 상기와 같은 기법들은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
서방성 제제를 제조할 수도 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 상기 억제제를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 기질을 포함하며, 상기 기질은 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 무균성이다. 멸균을 예를 들어 무균성 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 수행할 수 있다.
D. 치료 방법 및 조성물
본 발명에서 제공된 USP30 억제제들 중 어느 하나를 방법, 예를 들어 치료 방법에 사용할 수 있다. 일부 실시태양에서, 세포에서 미토파지를 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 세포를 상기 세포 중에서 USP30의 억제를 허용하는 조건하에 USP30 억제제와 접촉시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 세포에서 미토콘드리아 유비퀴틴화를 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 세포를 상기 세포 중에서 USP30의 억제를 허용하는 조건하에 USP30 억제제와 접촉시킴을 포함한다. 증가된 미토파지를, 예를 들어 실시예 6에 개시된 바와 같은 면역형광을 사용하여 측정할 수 있다. 증가된 유비퀴틴화를 예를 들어 실시예 5에 개시된 바와 같이 트립신 절단 후 유비퀴틴화된 펩티드를 면역친화성 농축시킨 다음 질량 분석에 의해 측정할 수 있다. 일부 실시태양에서, 미토콘드리아 유비퀴틴화의 증가를, USP30 억제제와 접촉된 세포 또는 세포들의 집단 중 미토콘드리아 단백질의 유비퀴틴화를 상기 억제제와 접촉되지 않은 합치되는 세포 또는 세포들의 집단 중의 미토콘드리아 단백질의 유비퀴틴화와 비교함으로써 측정할 수 있다.
일부 실시태양에서, 증가된 미토파지는 USP30 억제제와 접촉된 세포의 집단에서, 상기 억제제와 접촉되지 않은 합치되는 세포의 집단에 비해 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 또는 75% 이상의, 세포당 미토콘드리아 평균수의 감소를 의미한다. 일부 실시태양에서, 증가된 미토콘드리아 유비퀴틴화는 USP30 억제제와 접촉된 세포 또는 세포들의 집단에서, 상기 억제제와 접촉되지 않은 합치되는 세포 또는 세포들의 집단에 비해 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 100%(즉 2배) 이상, 150% 이상 또는 200%(즉 3배) 이상의, 미토콘드리아 단백질의 전체적인 유비퀴틴화의 증가를 의미한다.
일부 실시태양에서, 세포에서 Tom20, MIRO, MUL1, ASNS, FKBP8, TOM70, MAT2B, PRDX3, IDE, VDAC1, VDAC2, VDAC3, IPO5, PSD13, UBP13, 및 PTH2 중에서 선택된 하나 이상의 단백질의 유비퀴틴화의 증가 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 세포를 상기 세포 중에서 USP30의 억제를 허용하는 조건하에 USP30 억제제와 접촉시킴을 포함한다. 일부 상기와 같은 실시태양에서, 유비퀴틴화는 Tom20의 K56, K61 및 K68 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개의 아미노산을 증가시키고/시키거나; 유비퀴틴화는 MIRO의 K153, K187, K330, K427, K512, K535, K567, 및 K572 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상 또는 8개의 아미노산을 증가시킨다. 일부 상기와 같은 실시태양에서, 유비퀴틴화는 Tom20의 K56, K61 및 K68 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개의 아미노산을 증가시키고/시키거나; 유비퀴틴화는 MIRO의 K153, K187, K330, K427, K512, K535, K567, 및 K572 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상 또는 8개의 아미노산을 증가시키고/시키거나; 유비퀴틴화는 MUL1의 K273, K299 및 K52 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개의 아미노산을 증가시키고/시키거나; 유비퀴틴화는 FKBP8의 K249, K271, K273, K284, K307, K317, K334, 및 K340 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 또는 8개의 아미노산을 증가시키고/시키거나; 유비퀴틴화는 ASNS의 K147, K168, K176, K221, K244, K275, K478, K504, 및 K556 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상 또는 9개의 아미노산을 증가시키고/시키거나; 유비퀴틴화는 TOM70의 K78, K120, K123, K126, K129, K148, K168, K170, K178, K185, K204, K230, K233, K245, K275, K278, K312, K326, K349, K359, K441, K463, K470, K471, K494, K501, K524, K536, K563, K570, K599, K600, 및 K604 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 아미노산을 증가시키고/시키거나; 유비퀴틴화는 MAT2B의 K209, K245, K316, 및 K326 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상 또는 4개의 아미노산을 증가시키고/시키거나; 유비퀴틴화는 PRDX3의 K83, K91, K166, K241, 및 K253 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 또는 5개의 아미노산을 증가시키고/시키거나; 유비퀴틴화는 IDE의 K558, K657, K854, K884, K929, 및 K933 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 6개의 아미노산을 증가시키고/시키거나; 유비퀴틴화는 VDAC1의 K20, K53, K61, K109, K110, K266, 및 K274 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 또는 7개의 아미노산을 증가시키고/시키거나; 유비퀴틴화는 VDAC2의 K31, K64, K120, K121, K277, 및 K285 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 6개의 아미노산을 증가시키고/시키거나; 유비퀴틴화는 VDAC3의 K20, K53, K61, K109, K110, K163, K266, 및 K274 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 또는 8개의 아미노산을 증가시키고/시키거나; 유비퀴틴화는 IPO5의 K238, K353, K436, K437, K548, K556, K613, K678, K690, K705, K775, 및 K806 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상의 아미노산을 증가시키고/시키거나; 유비퀴틴화는 PSD13의 K2, K32, K99, K115, K122, K132, K161, K186, K313, K321, K347, K350, 및 K361 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상의 아미노산을 증가시키고/시키거나; 유비퀴틴화는 UBP13의 K18, K190, K259, K326, K328, K401, K405, K414, K418, K435, K586, K587, 및 K640 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상의 아미노산을 증가시키고/시키거나; 유비퀴틴화는 PTH2의 K47, K76, K81, K95, K106, K119, K134, K171, K177 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상 또는 9개의 아미노산을 증가시킨다. 일부 실시태양에서, 하나 이상의 추가적인 단백질의 유비퀴틴화는 세포를 USP30 억제제와 접촉시킬 때 증가한다. 유비퀴틴화가 USP30 억제제의 존재하에서 증가시킬 수도 있는 비제한적인 예시적인 단백질을 부록 A에 나열하며, 상기 부록은 본 발명에 참고로 인용된다. 표적 단백질의 증가된 유비퀴틴화를, 예를 들어 실시예 5에 개시된 바와 같이, 트립신 절단 후 유비퀴틴화된 펩티드의 면역친화성 농축에 이은 질량 분석에 의해 측정할 수 있다. 일부 실시태양에서, 유비퀴틴화의 증가를, USP30 억제제와 접촉된 세포 또는 세포들의 집단 중 표적 단백질의 유비퀴틴화를 상기 억제제와 접촉되지 않은 합치되는 세포 또는 세포들의 집단 중의 동일한 표적 단백질의 유비퀴틴화와 비교함으로써 측정할 수 있다.
일부 실시태양에서, 단백질의 증가된 유비퀴틴화는 USP30 억제제와 접촉된 세포 또는 세포들의 집단에서, 상기 억제제와 접촉되지 않은 합치되는 세포 또는 세포들의 집단에 비해 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 100%(즉 2배) 이상, 150% 이상, 또는 200%(즉 3배) 이상의, 상기 단백질의 유비퀴틴화의 증가를 의미한다.
일부 실시태양에서, 상기 세포는 산화 스트레스 하에 있다. 추가로, 일부 실시태양에서, 세포에서 산화 스트레스를 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 세포를 상기 세포 중에서 USP30의 억제를 허용하는 조건하에 USP30 억제제와 접촉시킴을 포함한다.
상기 방법들 중 어느 하나에서, 상기 세포는 파킨에서의 병원성 돌연변이, PINK1에서의 병원성 돌연변이, 또는 파킨에서의 병원성 돌연변이 및 PINK1에서의 병원성 돌연변이를 포함할 수 있다. 파킨 및 PINK1에서의 비제한적인 예시적인 병원성 돌연변이를, 예를 들어 본 발명의 표 1 및 2에 나타낸다.
일부 실시태양에서, 상기 세포는 뉴런이다. 일부 실시태양에서, 상기 세포는 흑질 뉴런이다. 일부 실시태양에서, 상기 세포는 심장 세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 세포는 심근세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 세포는 근육 세포이다.
상기 방법들 중 어느 하나의 일부 실시태양에서, 상기 세포는 대상체 중에 포함된다. 상기 방법들 중 어느 하나의 일부 실시태양에서, 상기 세포는 시험관내 또는 생체외에 있을 수 있다.
또 다른 태양에서, 약제로서 사용하기 위한 USP30 억제제를 제공한다. 추가의 태양에서, 치료 방법에 사용하기 위한 USP30 억제제를 제공한다. 일부 실시태양에서, 대상체에서 미토콘드리아 결함을 수반하는 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 대상체에게 유효량의 USP30 억제제를 투여함을 포함한다. 미토콘드리아 결함을 수반하는 질환은 미토파지 결함, 미토콘드리아 DNA의 하나 이상의 돌연변이, 미토콘드리아 산화 스트레스, 미토콘드리아 모양 또는 형태의 결함, 미토콘드리아 막 전위의 결함, 및/또는 리소좀 저장 결함을 수반할 수 있다. 미토콘드리아 결함을 수반하는 비제한적인 예시적인 질환은 신경퇴행성 질병; 미토콘드리아 근육병증, 뇌병증, 젖산혈증 및 뇌졸중-유사 에피소드(MELAS) 증후군; 레베르 유전 시신경병증(LHON); 신경병증, 운동실조, 망막색소변성증-모체 유전된 레이 증후군(NARP-MILS); 다논병; 심근경색에 이르는 허혈성 심장병; 다중 설파타제 결손증(MSD); 점액지질증 II(ML II); 점액지질증 III(ML III); 점액지질증 IV(ML IV); GM1-강글리오사이드증(GM1); 신경 세로이드-지질갈색소증(NCL1); 알퍼스병; 바쓰 증후군; 베타-산화 결함; 카르니틴-아실-카르니틴 결손; 카르니틴 결손; 크레아틴 결손 증후군; 조-효소 Q10 결손; 복합체 I 결손; 복합체 II 결손; 복합체 III 결손; 복합체 IV 결손; 복합체 V 결손; COX 결손; 만성 진행성 외안근마비 증후군(CPEO); CPT I 결손; CPT II 결손; II형 글루타르산뇨증; 컨스-세르 증후군; 젖산뇨증; 장쇄 아실-CoA 데하이드로게나제 결손(LCHAD); 레이병 또는 증후군; 치명적인 유아 심근증(LIC); 루프트병; II형 글루타르산뇨증; 중간-쇄 아실-CoA 데하이드로게나제 결손(MCAD); 간대성 근경련성 간질 및 불균일 적색 섬유(MERRF) 증후군; 미토콘드리아 열성 실조증 증후군; 미토콘드리아 세포병증; 미토콘드리아 DNA 결핍 증후군; 근육신경위장 장애 및 뇌병증; 피어슨 증후군; 피루베이트 카복실라제 결손; 피루베이트 데하이드로게나제 결손; POLG 돌연변이; 중간/단-쇄 3-하이드록시아실-CoA 데하이드로게나제(M/SCHAD) 결손; 및 극장쇄 아실-CoA 데하이드로게나제(VLCAD) 결손을 포함한다. 미토콘드리아 결함을 수반하는 비제한적인 예시적인 신경퇴행성 질병은 파킨슨병, 알쯔하이머병, 헌팅톤병, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 허혈증, 뇌졸중, 루이소체 치매, 및 전측두엽 치매를 포함한다. 미토콘드리아 결함을 수반할 수 있는 추가의 예시적인 신경퇴행성 질병은 비제한적으로 두개내 출혈, 뇌출혈, 삼차 신경병증, 설인신경통, 벨마비, 중증근무력증, 근이영양증, 진행성 근위축증, 원발성 측삭 경화증(PLS), 가성 구마비, 진행성 구마비, 척수 근위축증, 유전성 근위축증, 무척추 디스크 증후군, 경추증, 신경총 질환, 흉곽출구 파괴 증후군, 말초 신경병증, 프로피리아, 다발성 전신 위축증, 진행성 핵상마비, 피질기저핵 변성, 탈수초병, 길랑-바레 증후군, 다발성 경화증, 샤르코-마리-투스병, 프리온병, 크로이펠츠-야콥병, 게르스트만-스트라우슬러-샤잉커 증후군(GSS), 및 치명적 가족성 불면증을 포함한다. 일부 상기와 같은 실시태양에서, 상기 방법은 개인에게 예를 들어 하기에 개시하는 바와 같은, 유효량의 하나 이상의 추가적인 치료제를 투여함을 또한 포함한다.
일부 실시태양에서, USP30 억제제를 약제의 제작 또는 제조에 사용하기 위해 제공한다. 일부 상기와 같은 실시태양에서, 상기 약제는 미토콘드리아 결함을 수반하는 질환, 예를 들어 미토파지 결함을 수반하는 질환, 미토콘드리아 DNA의 돌연변이를 수반하는 질환, 미토콘드리아 산화 스트레스를 수반하는 질환, 미토콘드리아 모양/형태의 결함을 수반하는 질환, 미토콘드리아 막 전위의 결함을 수반하는 질환, 및 리소좀 저장 결함을 수반하는 질환의 치료를 위한 것이다. 추가의 실시태양에서, 상기 약제는 미토콘드리아 결함을 수반하는 질환의 치료 방법에 사용하기 위한 것이며, 상기 방법은 미토콘드리아 결함을 수반하는 질환을 갖는 개인에게 유효량의 상기 약제를 투여함을 포함한다. 하나의 상기와 같은 실시태양에서, 상기 방법은 상기 개인에게 유효량의 하나 이상의 추가적인 치료제, 예를 들어 하기에 개시하는 바와 같은 치료제를 투여함을 또한 포함한다.
본 발명의 실시태양들 중 어느 하나에 따른 "개인"은 인간일 수 있다.
추가의 태양에서, 본 발명에 제공된 USP30 억제제 중 어느 하나를 포함하는 약학 제형을 예를 들어 상기 치료 방법들 중 어느 하나에 사용하기 위해 제공한다. 하나의 실시태양에서, 약학 제형은 본 발명에 제공된 USP30 억제제들 중 어느 하나 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 약학 제형은 본 발명에 제공된 USP30 억제제들 중 어느 하나 및 예를 들어 하기에 개시하는 바와 같은 하나 이상의 추가적인 치료제를 포함한다.
USP30 억제제를 단독으로 또는 요법 중 다른 작용제들과 함께 사용할 수 있다. 예를 들어 USP30 억제제를 하나 이상의 추가적인 치료제와 함께 투여할 수 있다.
USP30 억제제와 병용할 수 있는 예시적인 치료제는, 예를 들어 파킨슨병의 치료를 위해서, 레보도파, 도파민 작용물질(예를 들어 프라미펙솔, 로피니롤, 및 아포몰핀), 모노아민 옥시게나제(MAO) B 억제제(예를 들어 셀레질린 및 라사질린), 카테콜 O-메틸트랜스퍼라제(COMT) 억제제(예를 들어 엔타카폰 및 톨카폰), 항콜린제(예를 들어 벤조트로핀 및 트라이헥실페니딜), 및 아만타딘을 포함한다. USP30 억제제와 병용할 수 있는 추가의 예시적인 치료제는, 예를 들어 근위축성 측삭 경화증의 치료를 위해서, 릴루졸이다. USP30 억제제와 병용할 수 있는 예시적인 치료제는, 예를 들어 알쯔하이머병의 치료를 위해서, 콜린에스테라제 억제제(예를 들어 도네페질, 리바스티그민, 갈란타민, 및 타크린), 및 메만틴을 포함한다. USP30 억제제와 병용할 수 있는 예시적인 치료제는, 예를 들어 헌팅톤병의 치료를 위해서, 테트라베나진, 정신병치료제(예를 들어 할로페리돌 및 클로자핀), 클로나제팜, 다이아제팜, 항우울제(예를 들어 에시탈로프람, 플루옥세틴 및 세트랄린), 및 기분안정제(예를 들어 리튬), 및 항경련제(예를 들어 발프로산, 다이발프로엑스, 및 라모트리진)를 포함한다.
"함께" 투여는 병행 투여(2개 이상의 치료제가 동일한 또는 별도의 제형 중에 포함되는 경우), 및 분리 투여(이 경우에 본 발명의 억제제의 투여는 추가적인 치료제 및/또는 보조제 전에, 이와 동시에, 및/또는 이어서 발생할 수 있다)를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 USP30 억제제의 투여 및 추가적인 치료제의 투여는 서로 약 1개월 이내에, 또는 약 1, 2, 또는 3주 이내에, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일 이내에 발생한다. 본 발명의 억제제들을 또한 다른 유형의 요법과 함께 사용할 수도 있다.
본 발명의 억제제(및 임의의 추가적인 치료제)를 임의의 적합한 수단, 예를 들어 경구, 비경구, 폐내, 비내, 및 병변내 투여에 의해 투여할 수 있다. 비경구 투여는 비제한적으로 근육내, 정맥내, 동맥내, 뇌내, 뇌혈관내, 척추강내, 안내, 복강내, 및 피하 투여를 포함한다. 본 발명의 억제제(및 임의의 추가적인 치료제)를 또한 이식된 전달 기구, 예를 들어 뇌내 임플란트를 사용하여 투여할 수도 있다. 비제한적인 예시적인 뇌신경계 운반 방법은 예를 들어 문헌[Pathan et al., Recent Patents on Drug Delivery & Formulation, 2009, 3: 71-89]에서 검토된다. 투여는 임의의 적합한 경로에 의해서, 예를 들어 주사에 의해서, 예를 들어 상기 투여가 짧은지 혹은 만성적인지에 따라서 정맥내 또는 피하 주사에 의해서 수행될 수 있다. 비제한적으로 단일 또는 다양한 시점들에 걸친 수회 투여, 일시 투여, 및 펄스 주입을 포함한 다양한 투여 스케줄들이 본 발명에서 고려된다.
본 발명의 억제제를 양호한 의료 관행과 일관된 방식으로 제형화하고, 투약하고, 투여할 것이다. 이와 관련하여 고려되는 인자들은 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유동물, 개인 환자의 임상적 상태, 질환의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의료 종사자들에게 공지된 다른 인자들을 포함한다. 상기 억제제는 문제의 질환을 예방하거나 치료하기 위해 통상적으로 사용되는 하나 이상의 작용제가 필요하지 않지만, 상기 작용제와 함께 임의로 제형화된다. 상기와 같은 다른 작용제의 유효량은 상기 제형 중에 존재하는 억제제의 양, 질환 또는 치료의 유형, 및 상기에 논의된 다른 인자들에 따라 변한다. 이들은 일반적으로 본 발명에 개시된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본 발명에 개시된 투여량의 약 1 내지 99%로, 또는 적합한 것으로 경험상/임상적으로 측정된 임의의 투여량 및 임의의 경로에 의해 사용된다.
질병의 예방 또는 치료를 위해서, USP30 억제제의 적합한 투여량(단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가적인 치료제와 함께 사용될 때)은 치료되는 질병의 유형, 억제제의 유형, 질병의 중증도 및 과정, 상기 억제제가 예방 또는 치료 목적으로 사용되는 지의 여부, 선행 요법, 환자의 병력, 및 상기 억제제에 대한 반응, 및 주치의의 판단에 따라 변할 것이다. 상기 억제제를 상기 환자에게 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 적합하게 투여한다. 상기 질병의 유형 및 중증도에 따라, 억제제의 약 1 ㎍/㎏ 내지 15 ㎎/㎏(예를 들어 0.1 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏)이, 예를 들어 하나 이상의 별도의 투여에 의해, 또는 연속 주입에 의해 상기 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 하나의 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 인자들에 따라 약 1 ㎍/㎏ 내지 100 ㎎/㎏ 이상의 범위일 수 있다. 수일 또는 그 이상에 걸쳐 반복된 투여를 위해서, 상태에 따라, 상기 치료를 일반적으로는 질병 증상의 목적하는 억제가 발생할 때까지 지속할 것이다. 상기 억제제의 하나의 예시적인 투여량은 약 0.05 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏의 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 ㎎/㎏, 2.0 ㎎/㎏, 4.0 ㎎/㎏ 또는 10 ㎎/㎏(또는 이들의 임의의 조합)의 하나 이상의 용량을 상기 환자에게 투여할 수 있다. 상기와 같은 용량을 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 매 3주 마다(예를 들어 상기 환자가 약 2 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 상기 억제제를 제공받도록) 투여할 수 있다. 초기의 보다 높은 부하 용량에 이어서 하나 이상의 보다 낮은 용량을 투여할 수도 있다. 그러나, 다른 투여량 섭생들도 유용할 수 있다. 상기 요법의 진행을 통상적인 기법 및 분석에 의해 쉽게 모니터한다.
상기 제형 또는 치료 방법 중 어느 하나를 하나보다 많은 USP30 억제제를 사용하여 수행할 수도 있는 것으로 이해한다.
E. 제조 물품
본 발명의 또 다른 태양에서, 본 발명에 개시된 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질들을 함유하는 제조 물품을 제공한다. 상기 제조 물품은 용기 및 상기 용기상에 또는 상기 용기와 결합된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니 등을 포함한다. 상기 용기를 다양한 물질들, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로부터 형성시킬 수 있다. 상기 용기는 조성물을 단독으로 또는 상기 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유효한 또 다른 조성물과 병용하여 유지하며 멸균 입구를 가질 수도 있다(예를 들어 상기 용기는 피하주사바늘에 의해 뚫릴 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 주머니 또는 바이알일 수 있다). 상기 조성물 중의 하나 이상의 활성제는 본 발명의 억제제이다. 상기 표지 또는 패키지 삽입물은 상기 조성물이 선택된 질환의 치료에 사용됨을 가리킨다. 더욱이, 상기 제조 물품은 (a) 본 발명의 억제제를 포함하는 조성물을 함유하는 제 1 용기; 및 (b) 추가의 세포독성제 또는 달리 치료제를 포함하는 조성물을 함유하는 제 2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 실시태양에서 제조 물품은 상기 조성물이 특정 질환의 치료에 사용될 수 있음을 가리키는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 한편으로, 또는 추가로, 상기 제조 물품은 약학적으로 허용 가능한 완충제, 예를 들어 주사를 위한 세균발육저지용수(BWFI), 포스페이트-완충된 염수, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 포함하는 제 2(또는 제 3) 용기를 추가로 포함할 수도 있다. 상기 제조 물품은 또한 상업적으로 및 사용자의 입장에서 바람직한 다른 물질들, 예를 들어 다른 완충제, 희석제, 충전제, 바늘 및 주사기를 포함할 수도 있다.
III. 실시예
하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예들이다. 상기에 제공된 일반적인 설명이 주어진, 다양한 다른 실시태양들을 실시할 수도 있음을 안다.
실시예 1: 물질 및 방법
DUB cDNA 과발현 선별:
미토파지의 조절인자를 확인하기 위해서, FLAG-표지된 DUB 라이브러리로부터의 개별적인 cDNA를 리포펙타민 2000(인비트로젠(Invitrogen))을 사용하여 GFP-파킨과 함께 HeLa 세포에 동시형질감염시켰다(1:3 DUB-FLAG:GFP-파킨 cDNA 비). 24시간의 발현 후에, 세포를 24시간 동안 10 μM CCCP로 처리하고, 고정시키고 항-Tom20(산타크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology)), 항-GFP(아베스 랩스(Aves Labs)) 및 항-FLAG(시그마(Sigma)) 1차 항체를 사용하여 염색하였다. 2차 항체로 염색한 다음, 무작위 시야의 상들을 40X/1.25 오일-대물렌즈를 사용하는 레이카(Leica) SP5 레이저 주사 공초점 현미경(0.34 ㎛/픽셀 해상도, 1 ㎛ 공초점 z-단계 크기)으로 획득하였다. Tom20 염색을 함유하는 GFP-파킨 및 FLAG-DUB 동시형질감염된 세포의 퍼센트를 맹검으로 기록하였다.
해마 배양물, 형질감염 및 mt - 케이마 영상화:
용해된 해마 뉴런 배양물을 개시된 바와 같이(문헌[Seeburg et al., Neuron 58: 571-583 (2008)]) 제조하고 리포펙타민 LTX PLUS를 사용하여 DIV 8-10에서 형질감염시켰다. 구조물을 1 내지 3일 동안 과발현 실험을 위해서 발현시키고 3 내지 4일 동안 녹다운 실험을 위해서 발현시켰다. mt-케이마-형질감염된 뉴런을 40X/1.25 오일-대물렌즈를 사용하는 레이카 SP5 레이저 주사 공초점 현미경(0.07 ㎛/픽셀 해상도, 1 ㎛ 공초점 z-단계 크기)으로 영상화하였다. 세포를 영상화 동안 37 ℃/5% CO2에서 유지된 가습 챔버에서 유지시켰다. 2개의 상을 458 ㎚(중성 pH 신호) 및 543 ㎚(산성 pH 신호) 레이저 여기로 연속적인 방식으로 하이브리드 검출기를 사용하여 획득하고, 630 내지 710 ㎚에서 방출 형광을 수집하였다. 모든 상 정량분석을 이미지J(ImageJ)에서 맞춤-작성된 매크로에 의해 수행하였다. mt-케이마 정량분석을 위해서, 세포체를 손으로 윤곽을 잡고 높은 비(543 ㎚/458 ㎚)의 리소좀 신호의 전체 면적을 체세포 미토콘드리아 신호의 전체 면적으로 나누었다(미토파지 지수).
질량 분석
파킨 기질을 측정하기 위해서, HEK-293 GFP-파킨 유도성 세포를 24시간 동안 독시사이클린으로 처리하고, 이어서 2시간 동안 5 μM CCCP 또는 DMSO 비히클 대조용으로 처리하였다. USP30 기질을 측정하기 위해서, HEK-293 세포를 6일 동안 리포펙타민 2000(인비트로젠)을 사용하여 인간 USP30 shRNA로 형질감염시키고, 이어서 이전과 같이 처리하였다. 상기 두 실험 모두에서, 세포를 용해시키고(20 mM HEPES(pH 8.0), 8 M 유레아, 1 mM 나트륨 오쏘바나데이트, 2.5 mM 나트륨 피로포스페이트, 1 mM β-글리세로포스페이트), 초음파 처리하고, 원심분리에 의해 제거한 후에 단백질분해 절단하고 유비퀴틴 잔류물을 갖는 펩티드를 면역친화성 농축시키고 질량 분석을 수행하였다.
세포 용해물의 제조 및 면역침전
전체 용해물 실험을 위해서, 형질감염된 HEK-293 세포를 샘플 환원제(인비트로젠)를 함유하는 SDS 샘플 완충제(인비트로젠) 중에 형질감염-후 24시간째에 용해시켰다. 면역침전 실험을 위해서, 세포를 0.5% SDS를 함유하는 TBS 완충제 중에 형질감염-후 24시간째에(과발현 실험) 또는 6일째에(녹다운 실험) 용해시키고, 용해물을 1% 트리톤-X-100 및 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 함유하는 완충제로 희석하였다. 유비퀴틴화된 단백질을, 항-HA 친화성 기질 비드(로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science)로 HA-유비퀴틴 형질감염된 세포의 용해물로부터 면역침전시켰다. 투입물 및 침전물을 SDS-PAGE에 의해 분석하고 면역블럿팅에 의해 분석하였다.
통계학적 분석
오차 막대는 평균의 표준 오차(S.E.M.)를 가리킨다. p 값을 계산하기 위해서, 비-쌍 스튜던츠 t-시험, 듄네트의 다중 비교 시험(단일 조건에 대한 비교를 위해서) 또는 본페로니의 다중 비교 시험(다중 조건들간의 비교를 위해서)과 병행되는 일원 ANOVA 및 이원 ANOVA를 도면 범례에 나타낸 바와 같이 사용하였다. 모든 통계학적 분석을 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) v.5 소프트웨어에서 수행하였다.
DNA 제작
DUB 과발현 선별을 위해서, 100 cDNA로 이루어지는 FLAG-표지된 DUB 라이브러리를 사용하였다. 형질감염을 위해서, 하기의 구조물들을 β-액틴 프로모터-기재 pCAGGS 플라스미드내로 서브클로닝하였다: USP30-FLAG(래트), USP30-FLAG(인간), GFP-파킨(인간), FLAG-파킨(인간), PINK1-GFP(인간), myc-파킨(인간), RHOT1 (MIRO)-myc-FLAG(인간), TOM20-myc(인간), HA-유비퀴틴, PSD-95-FLAG, 및 mt-m케이마(문헌[Katayama et al., Chemistry & Biology 18: 1042-1094 (2011)]). 점 돌연변이를 하기의 구조물들에 대해서 퀵체인지(QuikChange) II XL(에이질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies))를 사용하여 생성시켰다: USP30-C77S-FLAG(래트), USP30-C77A-FLAG(래트), USP30-C77S-FLAG(인간), GFP-파킨 K161N(인간), 및 GFP-파킨 G430D(인간). Mito-tagGFP2(에브로젠(Evrogen)), Tom20-3KR-myc, 및 HA-유비퀴틴 돌연변이체(블루 헤론(Blue Heron))를 구입하였다. β-Gal(문헌[Seeburg and Sheng, J. Neurosci . 28: 6583-6591 (2008)]) 및 mito-ro-GFP(문헌[Dooley et al., J. Biol . Chem. 279: 22284-22293 (2004)]) 발현 플라스미드는 앞서 개시되었다. 하기의 영역들을 표적화하는 짧은-헤어핀 서열들을 pSuper 또는 pSuper-GFP-neo 플라스미드내로 클로닝하였다: 래트 PINK1 #1(TCAGGAGATCCAGGCAATT), 래트 PINK1 #2(CCAGTACCTTGAAGAGCAA), 래트 파킨 #1(GGAAGTGGTTGCTAAGCGA), 래트 파킨 #2(GAGGAAAAGTCACGAAACA), 래트 USP30(CCAGAGCCCTGTTCGGTTT), 인간 USP30(CCAGAGTCCTGTTCGATTT), 및 개똥벌레 루시페라제(CGTACGCGGAATACTTCGA).
항체 및 시약:
하기의 항체들을 면역세포화학을 위해 사용하였다: 토끼 항-TOM20, 마우스 항-TOM20, 염소 항-HSP60(산타 크루즈 바이오테크놀로지); 마우스 항-FLAG, 토끼 항-FLAG, 마우스 항-myc(시그마 알드리치); 및 닭 항-GFP(아베스 랩스).
하기의 항체들을 면역블럿팅을 위해 사용하였다: 토끼 항-TOM20, 염소 항-HSP60(산타 크루즈 바이오테크놀로지); 마우스 항-MFN1, HRP-접합된 항-FLAG, 마우스 항-myc, 토끼 항-USP30, 토끼 항-RHOT1(MIRO), 토끼 항-TIMM8A(시그마 알드리치); 토끼 항-GFP, 닭 항-GFP(인비트로젠); HRP-접합된 항-GAPDH, HRP-접합된 항-α-액틴, HRP-접합된 항-β-튜불린, 토끼 항-VDAC(셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology)); 토끼 항-TOM70(프로테인테크 그룹(Proteintech Group)); 항-유비퀴틴(FK2)(엔조 라이프 사이언시즈(Enzo Life Sciences)); 마우스 항-LAMP1(스트레스젠(StressGen)); HRP-접합된 항-HA(로슈); 및 항-USP30 토끼(토끼를 정제된 인간 USP30 아미노산 65-517로 면역시켜 생성됨).
면역침전 실험을 위해서, 항-FLAG M2 친화성 젤 비드(시그마) 및 항-HA 친화성 기질 비드(로슈 어플라이드 사이언스)를 사용하였다.
파킨, PINK1 및 USP30 shRNA를 발현하는 아데노부속 바이러스 유형 2(AAV2) 입자는 pSuper 벡터의 H1 프로모터 및 shRNA 발현 카세트를 함유하는 pAAV-BASIC-CAGeGFP-WPRE 벡터로부터 벡터 바이오랩스 인코포레이티드(Vector Biolabs, Inc.)에 의해 생산되었다.
하기의 시약들을 나타낸 바와 같이 구입하였다: 블라스티시딘 S, 제오신, 리포펙타민 2000, 리포펙타민 LTX PLUS, 라이소트랙커 그린(LysoTracker Green) DND-626(인비트로젠); PhosSTOP 포스파타제 억제제 정제, 완전 EDTA-부재 프로테아제 억제제 정제, DNase I(로슈 어플라이드 사이언스); 카보닐 시아나이드 3-클로로페닐하이드라존(CCCP), 독시사이클린, 다이메틸 설폭사이드, 암모늄 클로라이드, 로테논, DTT, 알드리티올, 파라콰트 다이클로라이드(시그마 알드리치); N-에틸말레이미드(써모 사이언티픽(Thermo Scientific); 및 하이그로마이신(클론테크 레보라토리즈(Clontech Laboratories)).
형질감염 및 면역세포화학:
모든 이종 세포를 cDNA 발현을 위해서 리포펙타민 2000으로, 및 siRNA 녹다운 실험을 위해서 리포펙타민 RNAiMAX로, 제조사의 설명(인비트로젠)에 따라 형질감염시켰다. siRNA를 siGenome 풀(비-침묵화 풀 #2을 대조용 siRNA 형질감염에 사용하였다)로서 다마콘(Dharmacon)으로부터 구입하였다. 해마 배양물을 앞서 개시된 바와 같이 제조하고(문헌[Seeburg et al., Neuron 58: 571-583 (2008)]), 1.8 ㎍ DNA, 1.8 ㎕ PLUS 시약 및 6.3 ㎕ LTX 시약과 함께 리포펙타민 LTX PLUS(인비트로젠)로 형질감염시켰다. 약물 처리에 이어서, 세포를 포스페이트-완충 염수(PBS, pH 7.4)(일렉트론 마이크로스코피 사이언시즈(Electron Microscopy Sciences)) 중의 4% 파라폼알데하이드/4% 슈크로스로 고정시켰다. 침투(PBS 중의 0.1% 트리톤-X), 차단(PBS 중의 2% BSA) 및 1차 항체 배양에 이어서, 항체를 알렉사(Alexa) 염료-접합된 2차 항체(인비트로젠)을 사용하여 가시화하였다. 모든 면역세포화학 상을 40X/1.25 오일 대물렌즈(0.34 ㎛/픽셀 해상도, 1 ㎛ 공초점 z-단계 크기)를 갖는 레이카 SP5 레이저 주사 현미경으로 획득하였다.
HEK293 및 SH - SY5Y 안정성 세포주 생성
GFP-파킨(인간) 야생형, K161N 및 G430D를 발현하는 안정하게 형질감염된 HEK 세포주를, FLP-In 293 세포를 pOG44 Flp-리콤비나제 발현 벡터(인비트로젠) 및 CMV 프로모터하에서 상응하는 구조물을 발현하는 pcDNA5-FRT 벡터(인비트로젠)로 동시형질감염시킴으로써 생성시켰다. 세포주를 50 ㎍/㎖ 하이그로마이신 선택을 사용하여 선택하고 유지시켰다. GFP-파킨(인간)을 발현하는 유도성 HEK 안정성 세포주를, FLP-In T-Rex 293 세포를 pOG44 및 GFP-파킨(인간)을 발현하는 pcDNA5-FRT-TO 벡터(인비트로젠)로 동시형질감염시킴으로써 생성시켰다. 상기 세포주를 50 ㎍/㎖ 하이그로마이신 및 15 ㎍/㎖ 블라스티시딘을 사용하여 선택하고 유지시켰다. SH-SY5Y 안정성 세포를 pcDNA5-FRT-TO를 사용하여 Flp-In 유도성 모 세포주로 유사하게 생성시키고 75 ㎍/㎖ 하이그로마이신 및 3 ㎍/㎖ 블라스티시딘하에서 유지시켰다.
질량 분석에 의한 유비퀴틴 변형의 단리 및 확인
파킨 기질을 동정하기 위해서, 유도성 GFP-파킨(인간)을 안정하게 발현하는 HEK 293T 세포를 24시간 동안 독시사이클린(1 ㎍/㎖)을 사용하여 유도하고, 이어서 2시간 동안 5 μM CCCP 또는 DMSO 비히클 대조용으로 처리하였다. USP30 기질을 측정하기 위해서, HEK293T 세포를 6일 동안 리포펙타민 2000(인비트로젠)을 사용하여 인간 USP30 shRNA로 형질감염시키고, 이어서 상기와 같이 처리하였다.
면역친화성 단리 및 질량 분석 방법을 사용하여 앞서 개시된 바와 같이 절단된 단백질 용해물로부터 K-GG 펩티드를 농축시키고 동정하였다(문헌[Xu et al., Nat. Biotech., 28: 868-873 (2010)]; 문헌[Kim et al., Mol. Cell, 44: 325-340 (2011)]). 세포 용해물을 얼음상에서 간단한 초음파 처리에 의해 용해 완충제(1 mM 나트륨 오쏘바나데이트, 2.5 mM 나트륨 피로포스페이트, 1 mM β-글리세로포스페이트와 함께 8 M 유레아 20 mM HEPES pH 8.0) 중에서 제조하였다. 단백질 샘플(60 ㎎)을 60 ℃에서 20분 동안 4.1 mM DTT 중에서 환원시키고, 얼음상에서 10분 냉각시키고, 암실에서 실온에서 15분 동안 9.1 mM 요오도아세트아미드로 알킬화시켰다. 샘플을 20 mM HEPES pH 8.0을 사용하여 4X 희석하고 실온에서 밤새 10 ㎍/㎖ 트립신 중에서 절단하였다. 절단에 이어서, TFA를 1%의 최종 농도로 가하여 상기 펩티드를 산성화시킨 후에 Sep-Pak C18 카트리지(워터스(Waters))상에서 탈염시켰다. 펩티드를 40% ACN/0.1% TFA 중에서 상기 카트리지로부터 용리시키고, 플래시 동결시키고 48시간 동안 동결건조시켰다. 무수 펩티드를 1.4 ㎖ 1X IAP 완충제(셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology)) 중에 서서히 재현탁시키고 1800 x g에서 5분 동안 원심분리에 의해 제거하였다. 예비결합된 항-KGG 비드(셀 시그널링 테크놀로지)를 1X IAP 완충제 중에서 세척한 후에 상기 절단된 펩티드를 접촉시켰다.
면역친화성 농축을 4 ℃에서 2시간 동안 수행하였다. 비드를 IAP 완충제로 2회 및 물로 4회 세척한 후에 0.15% TFA 중에서 펩티드를 각각 실온에서 10분 동안 2회 용리시켰다. 면역친화성 농축된 펩티드를 앞서 개시된 바와 같이 STAGE-Tips를 사용하여 탈염시켰다(문헌[Rappsilber et al., Anal . Chem ., 75: 663-670 (2003)]).
액체 크로마토그래피-질량 분석(LC-MS)을 데이터 의존적인 상부 15 방식으로 작동하는 LTQ-오비트랩 벨로스(LTQ-Orbitrap Velos) 질량 분광계상에서 수행하였다. 펩티드를 나노액퀴티(NanoAcquity) UPLC를 사용하여 0.1 x 100-㎜ 워터스 1.7 ㎛ BEH-130 C18 컬럼상에 주입하고 2단계 선형 구배(이때 용매 B는 처음에 85분에 걸쳐 2%에서부터 25%까지 상승하고 이어서 5분에 걸쳐 25%에서부터 40%까지 상승하였다)를 사용하여 1 ㎕/분으로 분리시켰다. 상기 컬럼으로부터 용리되는 펩티드들을 이온화하고 어드밴스(ADVANCE) 소스(마이크롬-브룩커(Michrom-Bruker))를 사용하여 질량 분광계에 도입시켰다. 각각의 사용률에서, 하나의 전체 MS 스캔이 상기 오비트랩에서 60,000 해상도로 수집된 다음, 단일동위원소, 충전 상태 한정된 전구체(z > 1)상의 이온 트랩에서 15 MS/MS 스캔까지 수집되었다. MS/MS(±20 ppm)에 대해 선택된 이온에 대해 30초 동안 동적인 배제를 수행하였다.
질량 스펙트럼 데이터를 관계형 데이터베이스에 로딩하기 위해서 mzxml로 전환시켰다. MS/MS 스펙트럼을, 인간 단백질(Uniprot) 및 통상적인 오염물질로부터의 트립신 분해 펩티드의 연결된 표적-유인 데이터베이스에 대해 마스코트(Mascot)를 사용하여 검색하였다. 전구체 이온 질량 허용오차는 ±50 ppm으로 설정되었다. 카브아미도메틸 시스테인(+57.0214)의 고정된 변형 및 산화된 메티오닌(+15.9949) 및 K-GG(+114.0429)의 가변적인 변형이 고려되었다. 선형 판별 분석(LDA)을 사용하여 펩티드 수준에서 각각의 실행으로부터 펩티드 스펙트럼 합치(PSM)를 5% 오류 발견률(FDR)로 여과하고 후속으로 모든 실행의 합계로서 2% 단백질 수준 FDR로 여과하였다(<0.5% 펩티드 수준 FDR). 국소화 점수를 AScore 연산의 변형된 버전 및 상기 AScore 서열로서 상응하게 국소화된 변형의 위치를 사용하여 각각의 K-GG PSM에 대해 생성시켰다(문헌[Beausoleil et al., Nat . Biotech . 24(10): 1285-1292 (2006)]). 트립신이 유비퀴틴 변형된 리신 PSM에 인접하여 절단할 수 없음을 보이는 연구에 의해, 상기 AScore 서열은 C-말단 리신상의 GG 변형이 모호함을 보고한다(문헌[Bustos et al., Mol . Cell . Proteomics, published online June 23, 2012, doi: 10.1074/mcp.R112.019117]; 문헌[Seyfried et al., Anal. Chem., 80: 4161-4169 (2008)]). 이에 대한 가능한 예외는 단백질(또는 생체내 절두 산물)의 C-말단의 리신일 것이며, PSM은 진짜 K-GG 펩티드의 소스 단편화로부터 기원한다. 하류 분석에 가장 신뢰할만한 데이터세트를 확립시키기 위해서, 상기 AScore 서열이 C-말단 리신을 보고하는 PSM을 2개의 그룹, 즉 상기 -GG가 달리 국소화될 수 있는 이용 가능한 내부 리신을 갖는 것, 및 이용 가능한 리신이 결여된 것으로 나눌 수 있다. C-말단 K-GG를 갖지만 이용 가능한 리신이 결여된 PSM을 하류 분석의 고려로부터 제거하였다. 나머지 PSM에 대해서, -GG 변형을 상기 C-말단에 가장 가까운 이용 가능한 리신에 재국소화하였다.
단지 단일의 내부 리신 잔기만을 갖는 모호하게 국소화된(AScore < 13) 확실하게 확인된 펩티드가 상기 내부 리신에 국소화된 변형을 갖는 것으로 보고되었다. 상기 변형이 AScore > 13을 갖는 C-말단 리신에 할당된 펩티드는, 트립신이 유비퀴틴 변형된 리신 잔기에서 절단할 수 없음을 암시하는 증거를 근거로 폐기되었다.
비스타그란데(VistaGrande) 연산의 변형된 버전(XQuant라 칭함)을 사용하여, 직접적인 PSM 또는 정확한 전구체 이온 및 체류시간 합치(교차 정량분석)에 의해 안내된, 개별적인 K-GG 펩티드에 대한 표지되지 않은 피크 면적에 대한 정보를 얻었다. 직접적인 PSM에 대해서, 상기 표지되지 않은 피크 면적의 정량분석을, 고정된 질량 및 체류 허용오차를 사용하여 앞서 개시된 바와 같이 수행하였다(문헌[Bakalarski et al., J. Proteome Res ., 7: 4756-4765 (2008)]). XQuant 내에서 교차 정량분석이 가능하도록, 짝을 이룬 도구 분석과 교차하는 체류시간 상관성을, 실험내 모든 분석들에 대해 하나 내지 4개의 PSM에 의해 확인된 고득점 펩티드 서열을 근거로 측정하였다. 합치된 체류시간 쌍을 선형 최소 제곱 회귀 모델을 사용하여 설계하여 체류시간 상관성 방정식을 제공하였다. 펩티드가 별도의 MS/MS에 의해 동정되지 않은 도구 분석에서, 상기 XQuant 연산에 상기 계산된 전구체 이온의 질량 및 상기 회귀 모델로부터 유도된 그의 예견된 체류시간을 시딩하여 교차 정량분석을 수행하였다. 상기 m/z 허용오차가 고정된 반면, 상기 체류시간 허용오차는 각각의 짝을 이룬 도구 실행에 대해서 동적으로 조정된다. 펩티드가 주어진 도구 실행내에서 확실하게 동정되지 않고 다수의 다른 실행들에서 동정된 경우에, 다수의 교차 정량분석 사건들을 수행하여 데이터 질을 확실히 하였다. XQuant 결과를 앞서 개시된 바와 같이(문헌[Bakalarski et al., J. Proteome Res ., 7: 4756-4765 (2008)]) 83 이상의 발견적인 신뢰도 점수로 여과하였다. 단일 실행 내에서 동일한 m/z의 다수의 정량분석 사건들로부터 발생한 전체 스캔 피크 측정치들을 그들의 체류시간내 피크 경계들이 중복되는 경우 함께 모았다. 상기와 같은 그룹으로부터, 가장 큰 전체 피크 면적을 갖는 피크를 그의 단일 대표값으로서 선택하였다.
파킨 및 USP30의 후보 기질들을 동정하기 위해서, 그래프 분석 및 혼합-효과 모델링을 상기 XQuant 데이터에 적용하였다. 혼합 효과 모델을 각 단백질에 대한 AUC 데이터에 맞추었다. "처리"(예를 들어 대조용, 파킨 과발현/USP30 녹다운, CCCP, 콤보)는 명확한 고정 효과이고 "펩티드"는 무작위 효과로서 맞추어졌다. 오류 발견률(FDR)을 각각의 처리 대 대조용의 P-값에 근거하여 계산하였다. 콤보 대 대조용 및 콤보 대 CCCP로부터의 평균 AUC의 변화 배수 및 P-값을 플롯의 작성에 사용하였다. 혼합 효과 모델을 'nlme'(문헌[Pinheiro et al., nlme: Linear and Nonlinear Mixed Effects Models. R package version 3, 1-101 (2011)])에 의해 R에 맞추었다.
세포 용해물의 제조, 및 면역침전
전체 용해물 실험을 위해서, 세포를 24시간 후에 샘플 환원제(인비트로젠)를 함유하는 SDS 샘플 완충제(인비트로젠) 중에 용해시키고 95 ℃에서 10분 동안 비등시켰다. 전체 용해물을 SDS-PAGE에 의해 분리하고 면역블럿팅에 의해 분석하였다. 면역침전 실험을 위해서, 세포를 트리스-완충된 염수(10 mM 트리스, 150 mM NaCl, pH 8.0) 중의 0.5% SDS 중에서 24시간(과발현 실험) 또는 6일(녹다운 실험)째에 5 μM MG132 및 지시된 농도 및 지속기간의 CCCP로 처리하고 70 ℃에서 10분 동안 비등시켰다. 용해물을 면역침전 완충제(50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 10% 글리세롤, 1% 트리톤-X, 프로테아제 억제제(로슈 어플라이드 사이언스), 포스파타제 억제제(로슈 어플라이드 사이언스), DNAse I(로슈 어플라이드 사이언스), 2 mM N-에틸말레이미드(써모 사이언티픽), pH 7.4) 중에서 희석하고, 31,000 g에서 10분 동안 원심분리에 의해 제거하고, 항-HA 친화성 기질 비드(로슈 어플라이드 사이언스)와 함께 밤새 배양하였다. 투입물 및 항-HA 면역침전물을 SDS-PAGE에 의해 분해하고 면역블럿팅에 의해 분석하였다.
미토콘드리아 단편화
세포내 단편화를 약 P60 다자란 수컷 래트 전뇌로부터 포커스 서브셀(FOCUS SubCell) 키트(G 바이오사이언시즈)를 사용하여 수행하였다.
드로소필라 스톡
하기 계통의 드로소필라를 분석을 위해 수득하였다: y, w; 액틴5C - GAL4 / CyO , y+(블루밍톤 드로소필라 스톡 센터(Bloomington Drosophila Stock Center), 4414), UAS-CG3016 RNAi (본 발명에서 UAS - dUSP30 RNAi 로서 지칭된다; NIG-플라이(Fly) 스톡 센터, 3016R-2). USP30 녹다운 실험을 위해서, 액틴5C - GAL4 및 UAS - dUSP30 RNAi 를 표준 유전자 기법을 사용하여 동일한 염색체상에서 재조합하였다.
파리들을 제조사의 설명에 따라 제조된 뉴트리-플라이(Nutri-Fly) "저먼 푸드(German Food)" 제형(Genesee, 66-115) 상에서 키웠다. 모든 파리를 25 ℃에서 키우고 표준 유전자 기법을 사용하여 교배시켰다. 모든 실험을 나이-합치된 수컷 파리를 사용하여 수행하였다.
정량적인 RT- PCR
RNA 및 후속 cDNA를 하기의 제조사의 설명에 따라 단일 파리로부터 수득하였다(퀴아겐 RNeasy 플러스 키트(Qiagen RNeasy Plus kit), 어플라이드 바이오시스템스 고 용량 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems High Capacity cDNA Reverse Transcription kit)). 정량적인 RT-PCR을 태크맨 분석 Dm01796115_g1 및 Dm01796116_g1(드로소필라 CG3016(USP30)), Dm01795269_g1(드로소필라 CG5486(USP47)), 및 Dm01840115_s1(드로소필라 CG4603(YOD1))을 사용하는 어플라이드 바이오시스템스 ViiA7 실시간 PCR 시스템을 사용하여 수행하였다. Dm02134593_g1(RpII140)을 대조용으로서 사용하였다.
섭취된 파라콰트 농도의 측정
1일 된 다자란 수컷에게 포화된 와트만 페이퍼 상에서 단지 5% 슈크로스(수중)만 또는 5% 슈크로스 + 10 mM 파라콰트(수중)를 함유하는 용액을 먹였다. 48시간의 처리 후에, 조건당 15 마리의 파리를 수거하고 100 ㎕의 물에서 균질화시켰다. 표준 곡선 샘플을, 적합한 양의 파라콰트를 처리되지 않은 파리로부터의 균질물에 첨가(spiking)함으로써 생성시켰다. 이어서 상기 샘플을 와동 혼합하고, 내부 표준(프로프라놀올)을 함유하는 200 ㎕의 아세토나이트릴을 가하였다. 상기 샘플을 다시 와동시키고 10,000 x g에서 10분 동안 원심분리시켰다. 상등액을 200 ㎕의 물을 함유하는 새로운 플레이트로 옮기고 LC-MS/MS에 의해 분석하여 파라콰트의 농도를 정량분석하였다. 상기 LC-MS/MS는 에이질런트 1100 시리즈 HPLC 시스템(산타 클라라(Santa Clara), 미국 캘리포니아주 소재) 및 4000 Q TRAP(등록상표) MS 및 터보이온스프레이(TurboIonSpray)(등록상표) 이온 소스(어플라이드 바이오시스템스(미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)로부터)와 결합된 HTS PAL 자동샘플러(CTC 어낼리틱스(Analytics)(미국 노쓰캐롤라이나주 카보로 소재))로 이루어졌다. HPLC 분리를 페노메넥스(Phenomenex)로부터의 크루드 캣쳐(Krud Katcher) 가드 컬럼과 함께 워터스 아틀란티스(Waters Atlantis) dC18 컬럼(3 ㎛ 100 x 2.1 ㎜)상에서 수행하였다. 정량분석을 파라콰트의 경우 185.1 → 165.1 및 프로프라놀올의 경우 260.2 → 183.1의 추이의 다중 반응 모니터링(MRM)을 사용하여 수행하였다. 상기 분석의 하한 및 상한은 각각 10 μM 및 1000 μM이다. 상기 분석의 정량분석은 분석물/IS 피크 면적 정량 대 공칭 농도의 파라콰트를 계량된 1/x2 선형 회귀로 플롯팅하여 작성된 보정 곡선을 사용하였다.
드로소필라 간접 비상근의 투과형 전자 현미경검사
다자란 수컷 흉부를 몸통의 나머지로부터 단리하고, 이어서 종 방향으로 이등분하고 바로 고정시키고 앞서 개시한 바와 같이 처리하였다(문헌[Greene et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 4078-4083 (2003)]).
기어오르기 분석
기어오르기 분석을 하기 계통의 드로소필라를 사용하여 수행하였다: y, w; 액틴5C- GAL4 / CyO , y+ (액틴 만); y, w; UAS - CG3016 - RNAi / CyO , y+ (RNAi 만); y, w; UAS-CG3016 RNAi , 액틴5 C- GAL4 / CyO , y+ (USP30 녹다운).
1일 된 다자란 수컷에게 포화된 와트만 페이퍼 상에서 단지 5% 슈크로스(수중) 만 또는 5% 슈크로스 + 10 mM 파라콰트(수중)를 함유하는 용액을 먹였다. 48시간의 처리 후에, 파리를 이산화 탄소로 마취시키고 10개의 그룹으로, 상기 이산화 탄소의 효과로부터의 1-시간 회복 기간 동안 단지 1% 아가로스만을 함유하는 바이알로 옮겼다. 이어서 상기 파리를 새로운 유리 튜브로 옮기고, 바닥을 가볍게 두드리고 기어오르는 상기 파리의 능력을 기록하였다. 30초 동안 >15 ㎝를 수직으로 기어오르는 파리의 수를 기록하였다.
생존 분석
바이알당 10 마리의 다자란 1-일된 수컷에게 포화된 와트만 페이퍼 상에서 단지 5% 슈크로스(수중) 만 또는 5% 슈크로스 + 10 mM 파라콰트(수중)를 함유하는 용액을 먹였다. 살아있는 파리의 수를 개시된 구간에서 카운트하였다.
멀티톡스 ( MultiTox ) 세포사 분석
대조용 또는 USP30 siRNA로 형질감염된 SH-SY5Y 세포를 1% 소 태아 혈청을 함유하는 통상적인 생육 배지(DMEM/F12 및 1X 글루타맥스(GlutaMax))에서 로테논으로 처리한다. 24시간의 배양에 이어서, 멀티-톡스 플루오르(Multi-Tox Fluor) 분석(프로메가)을 사용하여 제조사의 설명에 따라 세포 생육력을 측정한다. GF-AFC 형광을 각각의 조건에 대해서 비스-AAF-R110 형광에 대해 표준화하고 대조용(대조용 RNAi + DMSO)의 분획으로서 제공한다.
실시예 2: USP30은 손상된 미토콘드리아의 파킨-매개된 제거를 길항한다
미토콘드리아 제거를 조절하는 DUB를 동정하기 위해서, FLAG-표지된 인간 DUB cDNA 라이브러리(97 DUB)를 확립된 미토콘드리아 분해 분석에서 선별하였다(문헌[Narendra et al., J. Cell Biol ., 183: 795-803 (2008)]). 상기 분석에서, 프로토노포어 카보닐 시아나이드 3-클로로페닐하이드라존(CCCP, 20 μM, 24시간)에 의해 유도된 미토콘드리아 탈분극은 파킨을 과발현하는 배양된 세포에서 미토콘드리아의 현저한 상실을 생성시킨다(미토콘드리아 외막 단백질 마커 Tom20을 염색함으로써 측정된 바와 같이). CCCP 처리는 GFP-파킨으로 형질감염된 세포의 대다수에서 Tom20 염색의 확고한 소멸을 도출하였다(파킨-형질감염된 세포의 >80%이 CCCP 후 Tom20 염색이 결여되었다 - 도 1A). 개별적인 FLAG-표지된 DUB cDNA를 GFP-파킨으로 동시형질감염시키고, CCCP-유도된 미토콘드리아(Tom20)에 대한 이의 효과를 측정하였다. 약 100개의 상이한 DUB의 라이브러리 중에서, 2개의 DUB, USP30 및 DUBA2가 CCCP-처리된 GFP-파킨-형질감염된 세포에서 Tom20 염색의 상실을 확고히 차단한 반면, 다른 것들은 거의 영향이 없었다(도 1A - Tom20 염색을 갖는 세포의 %: 대조용(β-Gal): 15.3%, USP30: 97.4%, DUBA2: 94.7%, UCH-L1: 36%, USP15: 23.3%, ATXN3: 8.3%; 다른 음성 DUB는 도시 안 됨). USP30은 추정상 세포질에 면하는 효소 도메인을 갖는 미토콘드리아 외막 중에 국소화되는 것으로 보고되었기 때문에, DUBA2보다는 USP30을 추가의 연구를 위해 선택하였으며(문헌[Nakamura and Hirose, Mol . Biol. Cell, 19: 1903-1914 (2008)]); 따라서 상기 USP30은 미토콘드리아에 대한 파킨의 작용을 방해하기 위해서 정확히 세포내 구획 중에 있을 것이다. USP30의 특이적인 미토콘드리아 관련을 뉴런 중의 미토콘드리아 마커들과 형질감염된 USP30-FLAG 및 내인성 USP30의 면역-공동국소화(도 2A 및 B)뿐만 아니라 래트 뇌로부터 정제된 미토콘드리아와 USP30과의 공동단편화(도 2C)에 의해 확인하였다.
CCCP-유도된 미토파지를 방지하는 USP30 과발현의 능력이 또한 myc-파킨으로 형질감염된 상이한 세포주(도파민작용성 SY-SY5Y 세포)에서 입증되었다(도 1B). 상기 USP30의 효과가 Tom20에 특이적이 아님을 확인하기 위해서, USP30 과발현이 또한 미토콘드리아 기질 단백질 HSP60의 CCCP-유도된 상실을 방지하는지의 여부를 시험하였다. 실제로, USP30 과발현은 HSP60의 CCCP-유도된 상실을 또한 방지하였으며, 이는 USP30이 세포소기관의 집단적인 분해를 차단함을 암시한다(도 1B 내지 D). 대조적으로, 촉매적으로-불활성인 USP30 C77S 돌연변이체의 발현(문헌[Nakamura and Hirose, Mol . Biol . Cell, 19: 1903-1914 (2008)])은 파킨-매개된 미토콘드리아 분해의 방지에 효과가 없었으며, 이는 USP30이 미토콘드리아 기질의 탈유비퀴틴화를 통해 미토파지를 방해한다는 생각을 지지한다(도 1B 내지 D).
USP30 효소 활성은 미토파지의 차단에 필요하기 때문에, USP30 및 파킨이 미토콘드리아 유비퀴틴화에 상반되는 효과를 갖는지의 여부를 검사하였다. 앞서 보고된 바와 같이, 단기간 CCCP 처리(20 μM, 4시간)는 미토콘드리아로의 파킨 재분배를 유발시켰으며(Tom20에 의해 표시됨) 미토콘드리아상의 유비퀴틴화 신호의 축적을 유도하였다(폴리유비퀴틴 항체 FK2에 의한 염색에 의해 측정됨, 도 2D; 문헌[Lee et al., J. Cell Biol ., 189: 671-680 (2010)]). USP30이 파킨과 동시 발현되었을 때, 미토콘드리아상에 축적된 유비퀴틴 신호의 양은 약 75%까지 감소하였으며, 이는 또한 USP30 효소 활성을 요하는 효과이다(도 2D 및 E). 이들 데이터는 USP30이 미토콘드리아 단백질에 대한 파킨의 유비퀴틴 리가제 작용을 반대하고, 이에 의해 미토파지를 억제하는 DUB로서 작용한다는 생각을 지지한다.
선행의 연구들은 리가제 활성에 결함이 있는 파킨 병원성 돌연변이체가 CCCP에 반응하여 미토콘드리아 분해를 지지할 수 없고, 이는 전위된 파킨과 함께 핵주위 영역 중에 불분명한 미토콘드리아의 집락화를 유도함을 지적하였다(문헌[Geisler et al., Nat. Cell Biol ., 12: 119-131 (2010)]; 문헌[Lee et al., J. Cell Biol ., 189: 671-680 (2010)]). 현저하게, USP30 + 파킨으로 동시형질감염되고 CCCP로 처리된 세포에서 야생형 myc-파킨은 분해되지 않은 미토콘드리아의 핵주위 클러스터와 결합된 채로 있다는 점에서 돌연변이 파킨과 유사하게 행동하였다(도 1B(백색 화살표) 및 E). USP30의 동시발현은 파킨 발현 수준을 변경시키지 않았다(도 2F 및 G). 이들 데이터는 USP30이 파킨의 미토콘드리아로의 전위를 억제함에 의해서라기 보다는, 손상된 미토콘드리아상의 유비퀴틴 신호의 효소적 제거에 의해 미토파지를 차단함을 가리킨다.
실시예 3: 뉴런에서 미토파지에 필요한 파킨, Pink1
뉴런에서 미토파지를 측정하기 위해서, 미토콘드리아 기질내로 표적화되는 비율측정 pH-민감성 형광 단백질, mt-케이마를 모니터하였다. 낮은 비율의 mt-케이마-유도된 형광(543 ㎚/458 ㎚)은 중성 환경을 보고하는 반면 높은 비율의 형광은 산성 pH를 보고한다(문헌[Katayama et al., Chemistry & Biology 18: 1042-1094 (2011)]). 따라서 mt-케이마는 세포질 중 미토콘드리아 및 산성 리소좀 중 미토콘드리아의 차별적인 영상화를 가능하게 한다. mt-케이마는 리소좀 프로테아제에 내성이므로, 시간에 따른 미토콘드리아의 축적되는 리소좀 전달을 측정할 수 있게 한다.
래트 분리된 해마 배양물에서의 형질감염에 이어서, mt-케이마 신호는 초기에 미토콘드리아의 특징인 신장된 구조 중에 낮은 543/458 비의 값으로 축적되었다(녹색으로 도시됨 - 도 3A). 2 내지 3일의 발현 후에, 높은 비(산성)의 신호를 갖는 다수의 둥근 mt-케이마 구조가 또한 세포체 전체를 통해 존재하였다(적색으로 도시됨 - 도 3A). 이들 둥근 mt-케이마-양성 구조는 (1) NH4Cl에 의한 세포의 중화가 높은 비(543/458)의 픽셀을 관상-망상 미토콘드리아 신호에 영향을 미치지 않으면서 특이적으로 상기 둥근 구조에서 낮은 비의 신호로 완전하게 역전시키고(도 4A); (2) mt-케이마와 관련되지 않은 다수의 라이소트랙커-양성 구조가 또한 존재하지만, 독립적인 리소좀 마커 염료(라이소트랙커 그린 DND-26)가 높은 비의 mt-케이마 구조를 염색하고(도 4B); (3) 사후 면역염색 실험에서, 높은 비의 픽셀이 내인성 리소좀 단백질 LAMP-1과 함께 국소화되었기 때문에(도 4C) 가장 그럴듯하게는 리소좀을 나타내는 듯하다. 상기 "산성" mt-케이마 신호의 거의 전부가 신경 세포체(세포체는 전체 높은 비(543/458) 신호의 95.6±2.2%를 함유하였다)에서 발견되었기 때문에, 상기 세포체내의 리소좀(적색) 신호/미토콘드리아(녹색) 신호의 비를 뉴런 중 미토콘드리아의 리소좀 전달의 척도("미토파지 지수")로서 사용하였다(문헌[Katayama et al., Chemistry & Biology 18: 1042-1094 (2011)]). 상기 미토파지 지수에 의해 정량분석된 바와 같이, 리소좀 중의 mt-케이마의 풍부성은 수일의시간에 걸쳐 증가하였고(도 4D), 이는 기본 조건하에서 배양된 뉴런 중의 활성 미토파지를 암시한다.
이종 세포에서, 파킨 과발현은 미토콘드리아 탈분극시 미토콘드리아 분해를 구동할 수 있지만; 내인성 파킨 및 PINK1이 비-신경 또는 신경 세포에서 미토파지에 필요한지의 여부는 아직 확립되지 않았다(문헌[Youle and Narendra, Nat . Rev . Mol . Cell Biol . 12: 9-14 (2011)]). 뉴런 미토파지에서 상기 PINK1/파킨 경로의 역할을 검사하기 위해서, 파킨 또는 PINK1을 pSuper-기재 벡터로부터 발현된 작은 헤어핀 RNA(shRNA)를 사용하여 녹다운시켰다. 상기 파킨 및 PINK1 shRNA는 이종 세포에서 그들의 각 표적의 cDNA-구동된 발현을 효율적으로 녹다운시켰으며(도 4E 및 F), 뉴런 배양물 중의 내인성 파킨 또는 PINK1의 단백질 수준을 각각 약 80% 및 약 90%까지 억제시켰다(도 4G 및 H). 대조용 루시페라제 shRNA에 비해, 파킨 shRNA들(2개의 독립적인 서열들)로 형질감염된 뉴런은 미토파지 지수의 약 50% 감소를 나타내었으며, 이는 리소좀으로의 감소된 미토콘드리아 전달을 가리킨다(도 3B 및 C). PINK1 shRNA는 상기 산성 mt-케이마 신호의 감소에 훨씬 더 유효하였다(미토파지 지수의 약 80 내지 90% 감소(도 3D 및 E)). 선행의 유전자 연구들은 건강한 미토콘드리아의 유지에 있어서 PINK1을 파킨의 상류에 놓았다(문헌[Clark et al., Nature, 441: 1162-1166 (2006); Park et al. Nature, 441: 1157-1161 (2006)]). 유전자 상위성과 일관되게, 본원의 mt-케이마 실험은 PINK1 과발현이 신경에서 미토파지를 강하게 증대시켰으며, 이는 파킨 녹다운에 의해 완전하게 제거된 효과이다(도 3F 및 G). 다른 한편으로, 파킨 과발현은 상기 mt-케이마 분석에 의해 측정된 바와 같이, 단독으로는 기본 미토파지에 명백한 효과를 갖지 못하였다(도 4I 및 J). 따라서, 신경 미토파지는 PINK1과 파킨을 모두 필요로 하며, 이때 PINK1은 파킨의 상류에서, 분명히 제한으로 작용한다.
실시예 4: USP30은 뉴런에서 미토파지를 길항한다
이어서, USP30이 이종 세포에서와 같이 뉴런에서 미토파지를 억제하는지의 여부를 조사하였다. β-Gal 및 mt-케이마로 형질감염된 대조용 뉴런에 비해, 야생형 USP30의 동시발현은 3일째에 미토파지 지수의 약 60% 감소를 야기하였으며, 이는 USP30이 뉴런에서 미토콘드리아의 리소좀 전달을 억제함을 가리킨다(도 5A 및 E). 대조적으로, 효소-불활성 USP30(C77S 또는 C77A)의 과발현은 미토파지 신호의 확고한 증가를 유도하였다(도 5A 및 E). 미토콘드리아의 리소좀으로의 증대된 전달은, 추정상 기질 또는 프로-미토파지 유비퀴틴쇄와의 상호작용 및 내인성 USP30으로부터의 이들의 격리에 의해, 촉매-불활성 USP30의 우성-음성 작용을 반영하는 듯하다(문헌[Berlin et al., J. Biol . Chem ., 285: 34909-34921 (2010)]; 문헌[Bomberger et al., J. Biol . Chem., 284: 18778-18789 (2009)]; 문헌[Ogawa et al., J. Biol . Chem ., 286: 41455-41465 (2011)]).
내인성 USP30의 기능을 시험하기 위해서, USP30을 shRNA를 사용하여 녹다운시켰다. 이종 세포에서, 래트 USP30 shRNA 플라스미드는 형질감염된 래트 USP30 cDNA의 발현을 특이적으로 제거하였다(도 5B). 동일한 래트 USP30 shRNA는 뉴런 배양물에서 내인성 USP30의 약 85% 감소를 유도하였다(도 5C). 뉴런에서, USP30 녹다운은 음성 대조용 루시페라제 shRNA에 비해, mt-케이마의 리소좀 전달을 증가시켰다(미토파지 지수의 약 60% 증가)(도 5D 및 F). shRNA-내성 인간 USP30 cDNA의 동시형질감염은 상기 효과를 "구제하였다", 즉 미토콘드리아 분해에 대한 제동을 복원시켰으며, 이는 USP30 shRNA가 비-특이적 효과를 발휘하지 않았음을 가리킨다(도 5B, D 및 F). 실제로, 인간 USP30 cDNA + 래트 USP30 shRNA로 동시형질감염된 뉴런은 야생형 USP30을 단독으로 과발현하는 뉴런과 유사하게, 대조용보다 더 낮은 수준의 mt-케이마의 리소좀 축적을 나타내었다(도 5D 및 F). 더욱이, 효소-불활성 인간 USP30(C77S)은 USP30 shRNA에 의해 유도된 증대된 미토파지를 역전시키지 못하였으며, 실제로 USP30 shRNA보다 훨씬 더 미토파지 활성을 증대시켰고, 이의 결과는 USP30 녹다운이 불완전함을 암시한다. 이러한 결과는 내인성 USP30이 그의 DUB 활성을 통해 뉴런에서 미토파지를 억제한다는 강한 증거를 제공한다.
실시예 5: USP30은 다수의 미토콘드리아 단백질들을 탈유비퀴틴화한다
파킨 및 USP30은 미토콘드리아 분해를 길항 조절하기 때문에, 상기 E3 리가제 및 DUB는 일부 공통의 기질상에서 작용하는 것으로 가정되었다. 파킨 및 USP30 기질을 동정하기 위해서, 세포에서 전체적인 유비퀴틴화를, 유비퀴틴 분지-특이성 (K-GG) 항체를 사용하여 트립신-절단된 추출물로부터 유비퀴틴화된 펩티드의 면역친화성 농축에 이어서 질량 분석(MS)에 의해 분석하였다. 전체적인 유비퀴틴화를 분석하고 하기 2개의 상이한 세트의 조건으로 HEK-293 세포에서 MS에 의해 정량분석하였다: 1) 유도성 파킨 과발현, 또는 2) USP30 녹다운(USP30 녹다운 효율은 85±5%이었다(도 7C를 참조하시오)). 각각의 세트에서, 세포를 CCCP(5 μM, 2시간) 또는 비히클 대조용(DMSO)으로 처리하였다. 전체적으로, MS 분석은 약 3200개의 단백질상에서 >15,000의 독특한 유비퀴틴화 부위를 밝혀내었으며, 이들의 부분집합은 CCCP 단독(내인성 파킨 및 USP30 수준) 또는 파킨 과발현/USP30 녹다운에 반응하였다(약 3200개 단백질의 목록에 대해서 부록 A를 참조하시오). MS는 각각 파킨 과발현 또는 USP30 녹다운에 의해 유비퀴틴화가 증가된(즉 CCCP-단독에 대해 '파킨 과발현 + CCCP' 또는 'USP30 녹다운 + CCCP'에서 현저하게 더 많은 유비퀴틴화를 나타낸) 233개 및 335개 단백질을 동정하였다. 이들 단백질 중 41개는 파킨 과발현 및 USP30 녹다운 모두에 의해 조절되었다(도 13). 이들 41개 단백질 중 12개는 미토콘드리아성이거나 또는 미토콘드리아와 관련된다(Tom20, MIRO1, FKBP8, PTH2, MUL1, MAT2B, TOM70, PRDX3, IDE, 및 3개의 VDAC 동형 모두 - 인간 미토카트타(MitoCarta) 데이터베이스에 근거한다). 다른 것들은 핵 수입 단백질(예를 들어 IPO5), 데메틸라제(예를 들어 KDM3B), 및 유비퀴틴/프로테아솜 시스템의 성분들(예를 들어 PSD13, UBP13)을 포함하였다(도 13).
본 발명자들은 USP30 녹다운에 의한 유비퀴틴화의 큰 증가를 나타낸 2개의 미토콘드리아 단백질인 Tom20 및 MIRO에 대한 추가적인 연구에 집중하였다(Tom20에 대한 USP30 shRNA + CCCP/CCCP 유비퀴틴화 비 = 3.52, p = 0.005; MIRO의 경우 = 2.95, p = 0.019; 도 13, 왼쪽을 참조하시오). Tom20 및 MIRO는 또한 파킨 과발현에 의한 유비퀴틴화의 큰 크기 및 매우 현저한 증가를 나타내었다(도 13, 우측). USP30이 이들 단백질을 탈유비퀴틴화할 수 있음을 확인하기 위해서, GFP-파킨을 안정하게 과발현하는 세포주를 HA-유비퀴틴으로 형질감염시키고 항-HA 항체를 사용하여 유비퀴틴화된 단백질을 면역침전시켰다(IP). 미토콘드리아 탈분극(CCCP, 5 μM, 2시간)에 이어서, GFP-파킨 안정성 세포는 항-HA-면역침전물에서 MIRO를 면역블럿팅함으로써 측정된 바와 같이, 내인성 MIRO의 유비퀴틴화를 확고히 증대시키는 것으로 나타났다(도 7A). HA-유비퀴틴 부재하의 대조용 형질감염에서, 항-HA-비드는 MIRO를 면역침전시키지 않았으며, 이는 MIRO 유비퀴틴화 신호에 대한 특이성을 가리킨다(도 7A, 좌측 레인). β-Gal 대조군에 비해, 야생형 USP30(그러나 DUB-죽은 USP30-C77S는 아닌)의 동시형질감염은 유비퀴틴화된 MIRO의 양을 약 85%까지 감소시켰다(도 7A 및 B). 유사하게, 야생형 USP30 과발현은 Tom20의 유비퀴틴화를 감소시킨 반면(도 7A); USP30-C77S는 실제로 기본적인 Tom20 유비퀴틴화를 약 2배(CCCP 부재), 및 CCCP-유도된 유비퀴틴화를 약 8배 증가시켰으며, 이는 우성-음성 기전과 일치한다(도 7A 및 C). CCCP는 모 HEK-293 세포주(GFP-파킨이 없음)에서 검출 가능한 Tom20 또는 MIRO 유비퀴틴화를 유도하지 않았다(도 6A). 그러나, 상기 세포주에서, USP30-C77S의 과발현은 여전히 기본적인 Tom20 유비퀴틴화를 증대시킬 수 있었고 USP30은 이를 억제할 수 있었다(도 6A). 합해서, 본 발명의 데이터는 MIRO 및 Tom20이 USP30의 기질이며 USP30은 미토콘드리아 손상에 따른 MIRO 및 Tom20 모두의 파킨-매개된 유비퀴틴화를 대항할 수 있음을 가리킨다.
공유된 기질의 부분집합이 기본적인 조건(Tom20에 의해 예시됨, 상기에 논의됨)하에서조차 USP30에 의해 조절되는 것으로 밝혀졌다. MUL1, ASNS 및 FKBP8(그러나 MIRO는 아님)은 Tom20과 유사하게 작용하는 기질이었다, 즉 이들도 또한 CCCP의 부재에서 USP30 녹다운에 의한 유비퀴틴화의 기본적인 증가를 나타내었다. 따라서, USP30은 기본적으로 상기 세트의 단백질들을 탈유비퀴틴화하며, 가능하게는 CCCP의 부재 하에서 활성이고 Tom20(MIRO는 아닌) 상에서 작용하는 미토콘드리아 E3 리가제를 견제한다. 다른 한편으로, TOM70, MAT2B 및 PTH2와 같은 단백질들은 오직 CCCP에 이어서 USP30 녹다운에 의한 증대된 유비퀴틴화를 나타낸다는 점에서 MIRO와 유사하게 작용하였으며, 이는 USP30이 오직 파킨이 미토콘드리아에 보충된 후에만 상기 단백질들의 탈유비퀴틴화에 투입됨을 암시한다. 파킨은 손상된 미토콘드리아에 보충된 다음에 USP30 기질의 Tom20 및 MIRO 유형 모두를 표적화할 수 있으며, 이는 상기 균형을 다중유비퀴틴화쪽으로 이동시킨다.
동일한 실험 시스템(GFP-파킨 및 HA-유비퀴틴을 과발현하는 세포)을 사용하여, 내인성 USP30의 기능을 shRNA 억제에 의해 시험하였다. USP30 녹다운은 MIRO의 기본적인 유비퀴틴화에 영향을 미치지 않았다(CCCP-유도된 미토콘드리아 손상의 부재하에서). 미토콘드리아 탈분극(CCCP 5 μM, 2시간) 후에, 그러나 상기 MS 실험과 일관되게, USP30 녹다운은 HA-유비퀴틴 면역침전물에서 측정된 바와 같이, 유비퀴틴화된 MIRO의 수준을 약 2.5배 증가시켰다(도 7D 및 E). 현저하게, USP30 녹다운은 효소-불활성 USP30과 유사하게, 기본 및 CCCP-유도된 Tom20 유비퀴틴화를 모두 증가시켰다(도 7D 및 F). USP30 shRNA에 의해 유발된 MIRO 및 Tom20 유비퀴틴화의 증가는 인간 USP30 shRNA에 둔감한 래트 USP30 cDNA의 발현에 의해 방지되었으며, 이는 상기 RNAi 효과의 특이성을 가리킨다(도 6B). 따라서, 이들 생화학적 데이터는 내인성 USP30이 Tom20 및 MIRO 모두의 유비퀴틴화에 대한 제동으로서 작용한다는 상기 MS 발견을 확증한다.
파킨은 앞서 다양한 미토콘드리아 기질상에서 K27-, K48- 및 K63-유형 폴리유비퀴틴쇄를 조립하는 것으로 나타났다(문헌[Geisler et al., Nat. Cell Biol., 12: 119-131 (2010)]). Tom20 및 Miro상의 상기 폴리유비퀴틴쇄 위상을 검사하기 위해서, HA-유비퀴틴 돌연변이체(여기에서 모두 7개의 리신 잔기가 아르기닌으로 개별적으로 치환되었다(단일의 K에서 R로의 돌연변이체)), 또는 단일 리신이 완전하게 남아있고 다른 6개의 리신은 모두 아르기닌으로 치환된 돌연변이체로 상기 유비퀴틴화 분석을 반복하였다. 야생형 유비퀴틴에 대해, 상기 유비퀴틴 돌연변이체들에 의해 제공된 CCCP-유도된 Tom20 및 Miro 유비퀴틴화의 양을 비교하였다. 모든 "단일의 K에서 R로의 돌연변이체" 중에서, 오직 K27R 돌연변이만이 Tom20의 CCCP-유도된 유비퀴틴화를 차단한 반면, 다른 K에서 R로의 돌연변이체(K6R, K11R, K29R, K33R, K48R, K63R)는 정상적인 Tom20 유비퀴틴화를 지지하였다(도 6C 및 D). 반대로, 정상적인 Tom20 유비퀴틴화는 오직 K27 완전한(모든 다른 리신은 돌연변이됨) 유비퀴틴에 의해 지지된 반면, 모든 다른 단일 리신 돌연변이체(K6, K11, K29, K33, K48, K63)는 손상된 Tom20 유비퀴틴화를 가졌다(도 6E 및 F). 따라서, 유비퀴틴상의 K27은 Tom20상의 폴리유비퀴틴쇄의 형성에 필요하고 충분하며, 이는 Tom20상의 1차 폴리유비퀴틴 위상이 K27-유형 쇄임을 암시한다. Tom20과 유사하게, Miro도 또한 그의 정상적인 유비퀴틴화를 위해서 K27(및 유비퀴틴상의 다른 리신은 아니다)을 필요로 하였다. 오직 K27만을 함유하는 유비퀴틴 돌연변이체는 Miro 유비퀴틴화를 가장 잘 지지하였지만, 야생형 유비퀴틴에 비해 Miro상에는 현저하게 적은 유비퀴틴이 부착되었으며(야생형 유비퀴틴의 약 65%), 이는 Miro가 K27외에 다른 쇄-유형을 축적함을 암시한다(도 6E 및 F). 본원의 데이터는 다른 기질상에서 K27-결합된 쇄를 조립하는 파킨의 능력과 일치한다(문헌[Geisler et al., Nat . Cell Biol ., 12: 119-131 (2010)]).
유비퀴틴화 외에, USP30은 단백질 턴오버를 조절한다. 공개된 증거는 파킨이 다수의 미토콘드리아 외막 단백질의 분해를 매개함을 암시한다(문헌[Chan et al., Human Mol . Genet ., 20: 1726-1737 (2011)]). 이와 일관되게, 상기 검사된 다수의 외막 단백질들(MIRO, MFN-1, TOM70, VDAC, Tom20)은 모두 GFP-파킨 안정성 세포주의 6시간의 CCCP 처리(5 μM) 동안 단백질 수준의 현저한 강하를 보였다(도 6G 및 H). Tom20 수준도 또한 감소되었지만 MIRO 및 다른 외막 단백질들보다 더 적은 정도로 감소되었다(t = 6h에서 CCCP에 의해 10 +/- 1% 감소, p<0.01)(도 6G 및 H). 상기 외막 단백질들과 대조적으로, 미토콘드리아 기질 단백질 HSP60 및 내막 단백질 TIMM8A는 상기 시간틀내에서 CCCP에 의해 변하지 않았다. GFP-파킨 안정성 세포에서 USP30의 과발현은 MIRO 및 Tom20의 CCCP-유도된 고갈을 크게 약화시키거나 없앴다(도 6G 및 H). USP30 과발현에 의한 안정화는 MIRO 및 Tom20에 비교적 특이적인 것으로 나타났는데, 그 이유는 다른 미토콘드리아 막 단백질들(MFN-1, TOM70, VDAC)의 CCCP-유도된 분해가 영향을 받지 않았기 때문이다(도 6G 및 H). 야생형 USP30과 달리, 상기 불활성 C77A- 또는 C77S-USP30 돌연변이체는 CCCP에 의해 유도된 MIRO 또는 Tom20의 분해를 억제하지 않았으며, 이는 DUB 활성에 대한 요구를 암시한다(도 6G 및 H). 이들 데이터는 USP30이 다른 미토콘드리아 단백질의 턴오버에 영향을 미치지 않으면서 MIRO 및 Tom20의 분해를 특이적으로 억제할 수 있음을 가리킨다.
MIRO 및 Tom20 분해는 미토파지를 수반하고(도 6G 및 H, 및 문헌[Chan et al., Human Mol . Genet ., 20: 1726-1737 (2011)]) USP30 녹다운은 미토파지(도 5C 및 E) 및 MIRO 및 Tom20의 유비퀴틴화(도 7)를 증대시키기 때문에, 이들 단백질의 고갈이 미토파지를 촉발할 수도 있는 것으로 추측되었다. 상기 모델에서, 이들 단백질의 과발현은 USP30-녹다운에 의해 유도된 미토파지를 차단할 것이다. 대신에, 뉴런에서 MIRO 또는 Tom20의 과발현은, 심지어 단독으로, mt-케이마 분석에서 미토파지의 확고한 증가를 도출하였으며(도 8B 내지 E), 이는 USP30 녹다운과 유사한 효과이다. 따라서 MIRO 및 Tom20의 유비퀴틴화는 미토파지(유비퀴틴화에 부차적으로 발생하는 그들의 분해라기보다는)에 대한 신호로서 작용하고, MIRO 및 Tom20의 과발현은 유비퀴틴화에 이용가능한 기질들의 풀을 증가시킴으로써 미토파지를 촉진하는 것으로 가정되었다.
Tom20으로부터 유도된 유비퀴틴화된 펩티드의 MS 분석은 CCCP 또는 USP30 녹다운시 유비퀴틴화가 증가되고 CCCP 처리 + USP30 녹다운의 조합에 반응하여 훨씬 더 증가하는 3개의 리신 잔기(K56, K61 및 K68)를 동정하였다(도 9). 이들 특정 부위상의 유비퀴틴화를 확인하기 위해서, Tom20 중의 3개의 리신 잔기를 아르기닌으로 돌연변이시켰다("3KR-Tom20"(K56R, K61R, K68R 돌연변이체)). GFP-파킨 과발현 세포에서, myc-표지된 야생형 Tom20은 내인성 Tom20과 유사하게(도 7A 및 C), 효소-불활성 USP30-C77S의 동시발현에 의해 유비퀴틴화의 증가를 나타내었다(도 8A). 대조적으로, 3KR-Tom20은 야생형 Tom20보다 적은 기본적인 유비퀴틴화를 나타내었으며 추가로 우성-음성 USP30-C77S에 의해 영향을 받지 않았고(도 8A), 이는 이들 3개의 리신 잔기가 Tom20상의 주요 USP30 표적 잔기임을 가리킨다.
뉴런에서의 mt-케이마 분석에서, 야생형 Tom20의 과발현은 미토파지를 증대시킨 반면, 3KR-Tom20 돌연변이체는 그렇게 하지 못했다(도 8B 및 D); 따라서 Tom20은 미토파지를 구동하기에 충분하지만, 이 능력은 그의 유비퀴틴화에 따라 변한다. 더욱이, 3KR-Tom20은 USP30-C77S에 의해 유도된 미토파지의 증가를 차단하였으며(도 8B 및 D), 이는 우성-음성 USP30에 의해 유발된 증가된 미토파지 유출이 Tom20 유비퀴틴화를 필요로 함을 암시한다. 한편으로, 과발현된 3KR-Tom20은 비-촉매적인 방식으로 USP30과 물리적으로 결합함으로써 USP30-C77S-유도된 미토파지를 방해할 수 있다.
질량 분석은 USP30 및 파킨에 의해 조절되는 MIRO 상의 9개의 리신-유비퀴틴화 부위를 확인하였으며, 이들 중 일부는 정상적인 MIRO 기능에 필요한 것으로 공지되어 있다(예를 들어 K427이 GTPase 활성에 필요하다(문헌[Fransson et al., Bioch . Biophys. Res . Comm ., 344: 500-510 (2006)])). 따라서, 조합적 돌연변이를 추구하는 대신에, 미토파지를 유도하는 MIRO의 능력에 대한 USP30의 효과를 연구하였는데, 그 이유는 USP30 녹다운이 MIRO 유비퀴틴화를 증가시키기 때문이다(도 7D 및 E). MIRO 유비퀴틴화가 미토파지를 구동한다는 생각과 일관되게, USP30 녹다운은 MIRO 과발현 단독에 따라 관찰된 것 이상으로 미토파지를 추가로 증대시켰다(도 8C 및 E). 종합하면, 이들 데이터는 MIRO 또는 Tom20의 유비퀴틴화가 뉴런에서 미토파지를 구동할 수 있고, USP30에 의한 미토파지의 억제가 적어도 부분적으로 이들 단백질의 탈유비퀴틴화에 의해 설명될 수 있음을 가리킨다.
실시예 6: USP30 녹다운은 PD 돌연변이와 관련된 미토파지 결함을 구제한다
파킨의 PD-관련된 돌연변이와 관련된 미토콘드리아 분해 결함이 손상된 미토콘드리아의 손상된 유비퀴틴화에 기인하고 USP30이 실제로 파킨의 생화학적 및 기능상 길항물질로서 작용하는 경우, USP30의 억제는 미토콘드리아 유비퀴틴화 및 분해를 복원할 것이다. 이러한 가설을 시험하기 위해서, 본 발명자들은 미토파지의 동반되는 결함(문헌[Geisler et al., Nat. Cell Biol ., 12: 119-131 (2010)]; 문헌[Lee et al., J. Cell Biol ., 189: 671-680 (2010)])과 함께 약화된 리가제 활성을 나타내는(문헌[Sriram et al., Human Mol . Genet ., 14: 2571-2586 (2005)]) PD-관련된 파킨 병원성 돌연변이체, 예를 들어 G430D 및 K161N에 집중하였으며 연구하였다(예를 들어 G430D 및 K161N).
병원성 돌연변이체 GFP-파킨-G430D로 형질감염되고 CCCP로 처리된 SH-SY5Y 세포에서, 미토콘드리아는 제거되지 못하고 결함성 파킨 단백질과 함께 핵주위 클러스터를 형성한다(도 10A, 첫 번째 컬럼). 동일한 세포를 파킨-G430D 및 USP30 siRNA로 이중으로 형질감염시켰으며, 이는 USP30 단백질의 녹다운을 약 60%까지 도출하였고(도 11A), 파킨-G430 및 대조용 siRNA에 의해 형질감염된 세포에 비해(도 10A 및 B에서 정량분석됨), 미토콘드리아의 60% 감소(전체 Tom20 형광에 의해 측정된 바와 같이)를 나타내었다. 이러한 결과는 USP30 단백질 수준의 siRNA 녹다운이 결함성 파킨에도 불구하고 미토파지를 충분히 구제할 수 있음을 보인다. 미토콘드리아 분해는 다른 DUB(USP6, USP14)의 녹다운에 의해 구제되지 않았다(도 11B 내지 D). RNAi-내성 야생형 USP30(래트 USP30 cDNA)(그러나 불활성 래트 USP30-C77S 돌연변이체는 아님)의 재도입은 USP30 siRNA에 의한 미토콘드리아 분해의 구제를 방지하였다(도 10A 및 B). 미토콘드리아 분해의 구제는 돌연변이 G430D 파킨(대개는 미토콘드리아와 결합된)의 핵주위 클러스터의 상실 및 세포질 전체를 통한 보다 작은 분산된 파킨-함유 반점의 출현과 서로 관련되었다(도 10A 및 C; 또한 도 11B 및 C 참조). CCCP-처리된 GFP-파킨-G430D 발현 세포에서, USP30 녹다운은 Tom20 면역반응성의 상실을 도출할 뿐만 아니라 기질 단백질 HSP60의 염색을 감소시켰으며, 이는 USP30 억제가 전체 미토콘드리아의 분해를 복원했음을 암시한다(도 11E 및 G). 또 다른 PD-관련된 파킨 돌연변이체(K161N)와 관련된 미토콘드리아 분해 결함은 유사하게 USP30 siRNA 녹다운에 의해 구제되었다(도 11F 및 H). 뉴런에서, 파킨 녹다운과 관련된 감소된 미토파지(mt-케이마 분석에서 측정된 바와 같이)가 또한 우성-음성 USP30-C77A에 의해 구제되었다(도 10D 및 E). 따라서, USP30의 발현 또는 활성의 억제는 세포가 결함성 파킨 또는 파킨 녹다운을 극복하고 손상된 미토콘드리아의 제거를 복원할 수 있게 한다.
임의의 특정한 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 파킨 리가제 활성은 유비퀴틴화를 통해 미토콘드리아를 방어하므로, 파킨 돌연변이체 중에 존재하는 일부 잔류 리가제 활성이, USP30 녹다운이 미토파지를 구제하기 위해서 필요할 수도 있다. 현재 USP30 녹다운이 파킨 활성의 완전한 상실에 유효한지의 여부는 알려져 있지 않다. 그러나, 중복되는 기질을 갖거나 또는 파킨의 결여를 보상할 수 있는 다른 E3이 존재하는 것은 가능하다.
실시예 7: USP30은 파킨 기질이다.
파킨은 외부 미토콘드리아 막 단백질에 대해 광범위한 활성을 가지므로, 본 발명자들은 파킨이 USP30(이 또한 상기 미토콘드리아 구획에 존재한다)을 유비퀴틴화하는 지가 궁금하였다. 이러한 가능성을 지지하기 위해서, CCCP로 처리된 GFP-파킨 발현 세포에서 프로테오믹스 실험으로 USP30-유도된 유비퀴틴화된 펩티드를 동정하였다('DMSO'에 대한 'GFP-파킨 + CCCP' 중 USP30의 유비퀴틴화의 변화 배수 = 27.23, p < 0.001). 파킨에 의한 USP30 유비퀴틴화를 확인하기 위해서, GFP-파킨 및 HA-유비퀴틴을 과발현하는 세포에서 유비퀴틴화 분석을 반복하였으며, GFP-파킨이 CCCP 처리(20 μM, 2시간, 도 9C 및 D)에 이어서 내인성 USP30의 유비퀴틴화를 유도함을 발견하였다. 질량 분석에 의해 확인된 USP30의 유비퀴틴화 부위(K235 및 K289)는 그의 유비퀴틴화에 필요하지 않았으며, 이는 USP30 중 다른 리신 잔기들이 유비퀴틴을 수용할 수 있음을 암시한다(데이터 도시 안 됨). CCCP 처리(20 μM)는 또한 GFP-파킨 발현 세포에서 USP30 수준의 현저한 강하를 유도하였다(도 9E 및 F). 중요하게, 병원성 돌연변이 G430D 또는 K161N을 갖는 파킨은 유비퀴틴화할 수 없거나(도 9C 및 D) 또는 USP30을 분해시킬 수 없었다(도 9E 내지 F). 이들 데이터는 파킨이 유비퀴틴화하고 USP30을 분해하며, 따라서 미토파지에 대한 제동을 제거함을 가리킨다.
실시예 8: USP30 녹다운은 산화 스트레스를 감소시키고 생체내에서 보호를 제공한다
이어서 USP30 녹다운이 미토콘드리아 및 세포에 기능상 이점을 제공하는지의 여부를 검사하였다. ROS(주로 미토콘드리아로부터 유래한다)는 신경퇴행성 질환과 관련되며 미토콘드리아 기능장애는 PD에서 증가된 산화 스트레스에 기여할 수 있다(문헌[Lee et al., Biochem . J., 441: 523-540 (2012)]). 미토콘드리아에서 산화 스트레스를 측정하기 위해서, 미토콘드리아 기질-표적화된 ro-GFP(미토-roGFP)(미토콘드리아 산화환원 전위의 정량적인 비율측정 영상화를 허용하는 산화환원-민감성 형광 단백질)를 사용하였다(문헌[Dooley et al., J. Biol. Chem. 279: 22284-22293 (2004)]). 개별적인 세포에서 비율측정 미토-roGFP 신호의 측정에 이어서, 상기 탐침의 동적인 범위를, 상기 탐침을 완전히 환원시키기 위해서 DTT(1 mM)로, 및 상기 탐침을 완전히 산화시키기 위해서 알드리티올(100 μM)로 연속적으로 배양물을 처리함으로써 눈금화하였다(문헌[Guzman et al., Nature, 468: 696-700 (2010)]). DTT 및 알드리티올 후에 측정된 미토-roGFP의 비를 각각 0 및 1로 설정하여 상대적인 산화 지수를 눈금화하였다. 대조용 루시페라제 shRNA로 형질감염된 대조용 세포에서, 뉴런은 약 0.6의 평균 상대 산화 지수를 가졌다(도 17A 및 B). USP30 녹다운은 상기 상대 산화 지수를 약 0.4로 떨어뜨렸으며, 이는 USP30의 억제가 미토콘드리아 산화 스트레스의 감소를 도출하였음을 암시한다.
USP30 녹다운이 생체내 스트레스 조건하에서 보호를 제공하는지의 여부를 시험하기 위해서, 드로소필라(PD 분자 발병학을 연구하기에 유효한 모델 시스템으로서 대두되었다(문헌[Guo, Cold Spring Harb . Perspect . Med . 2(11) pii: a009944 (2012)])를 사용하였다. 파리 USP30(CG3016, 이후부터 dUSP30이라 칭한다)을 녹다운시키기 위해서, GAL4/UAS 시스템을 사용하였다(문헌[Brand et al., Development, 118: 401-415 (1993)]). 액틴 - GAL4 드라이버 계통을 UAS - dUSP30 RNAi 트랜스제닉 계통(상기 계통은 액틴 프로모터의 조절하에서 dUSP30 RNAi의 발현을 허용한다)와 교배시켰다(상기 액틴 - GAL4 > dUSP30 RNAi 계통을 'dUSP30 녹다운' 계통이라 칭한다). 액틴- GAL4에 의한 UAS - dUSP30 RNAi 의 활성화는 오직 액틴 - GAL4 또는 오직 UAS -dUSP30 RNAi 만을 함유하는 대조용 모 계통에 비해, 정량적인 RT-PCR에 따르면 dUSP30 mRNA의 약 90% 감소를 도출하였다(도 17C). 상기 dUSP30 녹다운의 보호 효과를 시험하기 위해서, 상기 'dUSP30 녹다운' 계통을 파킨 돌연변이체 파리(park 25 )와 교배시켰다(문헌[Greene et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 100: 4078-4083 (2003)]). 파킨이 없는 파리는 그의 간접 비상근(IFM)에서 미토콘드리아 형태의 심한 결함을 보이며, 상기 미토콘드리아는 감소되고 해체된 크리스타를 갖는 기형이고, EM 하에서 "옅은" 외관의 미토콘드리아를 생성시킨다(도 12A 및 문헌[Greene et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 100: 4078-4083 (2003)]). 대조적으로, 야생형 파리는 크리스타로 고르게 충전된 다수의 짙게 염색된 미토콘드리아를 갖는다(도 12A). 파킨-결함 미토콘드리아에 대한 USP30 억제의 효과를 측정하기 위해서, 파킨 돌연변이체를 dUSP30 녹다운 파리에 교배하였다. "파킨 돌연변이체; dUSP30 녹다운" 파리에서, 때때로 단편화된 크리스타를 갖는 "옅은" 미토콘드리아가 또한 발견되었지만, 상기 IFM 미토콘드리아의 대부분은 전자-밀집되며 다수의 크리스타를 함유하였다(도 12A). 전체 미토콘드리아 면적에 걸쳐 해체된 크리스타를 함유하는 미토콘드리아의 면적 퍼센트의 정량분석은 dUSP30 녹다운에 의한 미토콘드리아 완전성의 강한 개선을 밝혀내었다(도 12B - 파킨 돌연변이체에서 약 90% 대 "파킨 돌연변이체; dUSP30 녹다운"에서 약 25%). "파킨 돌연변이체; dUSP30 녹다운" 파리는 또한 근육면적당 더 적은 손상된 미토콘드리아를 가졌다(도 12C). 따라서, dUSP30 발현의 억제는 파킨-결함 드로소필라에서 생체내 형태학적 미토콘드리아 완전성을 크게 복원시킬 수 있다.
PD와 관련된 뉴런에서의 USP30 억제 효과를 검사하기 위해서, 특이적으로 파리 신경계의 아민성 뉴런에서 dUSP30RNAi를 구동하는 도파민 데카복실라제(Ddc)-GAL439를 사용하였다. 미토콘드리아 손상 및 PD의 모델로서, 파리를 파라콰트(PD와 관련된 미토콘드리아 독소)로 처리하였다(문헌[Castello et al., J. Biol . Chem ., 282: 14186-14193 (2007)]; 문헌[Cocheme et al., J. Biol . Chem ., 283: 1786-1798 (2008)]; 문헌[Tanner et al., Environmental Health Perspect., 119: 866-872 (2011)]). 파라콰트(10 mM, 48시간)로 처리한 다음, 상기 Ddc - GAL4 및 UAS - dUSP30 RNAi 대조용 파리 계통은 모두 15 ㎝ 이상 기어오르는 능력이 감소됨을 보였다(도 12D). 상기 기어오르기 결함은 L-DOPA에 의한 추가적인 치료에 의해 충분히 구제되었으며(도 17D), 이는 상기 행동 결함이 도파민의 결핍으로 인한 듯함을 보인다. 일관되게, 대조용 파리 계통(Ddc - GAL4 또는 UAS -dUSP30 RNAi 트랜스제닉 단독)에서, 파라콰트 처리(10 mM, 48시간)는 세로토닌 신경전달물질 수준의 변경 없이 파리 머리에서 도파민 수준의 30 내지 60% 감소를 유발하였다(이는 상기 모델에서 도파민작용성 시스템에 대한 파라콰트의 특이적인 독성을 가리킨다 - 도 12F 및 도 17E). L-DOPA와 유사하게, Ddc - GAL4 > UAS - dUSP30 RNAi 파리에서 dUSP30 녹다운은 또한 상기 파라콰트-유도된 기어오르기 손상을 완전히 구제하였으며(도 12D), 이는 상기 행동 시험에서 파라콰트 독성에 대한 완전한 보호가 특이적으로 아민성 뉴런에서 USP30의 억제에 의해 제공될 수 있음을 가리킨다. 유사한 완전한 보호가 또한 액틴 - GAL4 > UAS -dUSP30 RNAi 파리에서 USP30의 전신 녹다운에 의해 관찰되었다(도 12E). 현저하게, Ddc 뉴런(Ddc - GAL4 > UAS - dUSP30 RNAi 파리)에서 USP30 녹다운은 또한 파라콰트-유도된 도파민 결핍을 방지하였다(도 12F). USP30 녹다운은 도파민의 고갈 및 운동 장애를 모두 구제하였으므로, 이들 결과는 USP30의 억제가 신경화학 및 기능면 모두에서 도파민작용성 뉴런 및 유기체에 이로울 수 있음을 보인다.
USP30 녹다운이 유기체 생존에 영향을 미치는지의 여부를 시험하기 위해서, 파라콰트(10 mM, 96시간)에 의한 연장된 치료에 걸쳐 살아있는 파리의 백분율을 모니터하였다. dUSP30 RNAi를 발현하는 파리는 대조용보다 현저하게 더 오래 생존하였다(도 12G). 파라콰트로 처리된 파리의 오직 <15%만이 96시간째에 액틴-GAL4 및 UAS - dUSP30 RNAi 대조군에서 살아있었던 반면, 파리의 약 45%는 액틴- GAL4 > UAS-dUSP30 RNAi ('전신 dUSP30 녹다운') 그룹에서 살아있었다(도 12G). 본 발명자들은 USP30 녹다운의 이점이, 3개의 파리 계통이 모두 LC-MS/MS에 의해 측정된 바와 같이 대략 동량의 파라콰트를 섭취하였기 때문에(파리당 평균 파라콰트 질량: UAS -dUSP30 RNAi : 3.2 ㎍, 액틴- GAL4: 2.7 ㎍, 액틴 - GAL4 > UAS - dUSP30 RNAi : 2.7 ㎍), 파라콰트에의 노출에 있어서의 차이에 기인하지 않음을 확인하였다. 파리에서 다른 DUB(dUSP47(CG5486) 또는 dYOD1(CG4603))의 녹다운은 상기 생존 분석에서 이점을 제공하지 않았으며; 오히려, 파라콰트에 반응하여 사망률을 악화시켰다(도 17F 내지 H). 더욱 또한, 인간 USP30 cDNA의 dUSP30 RNAi 를 발현하는 파리에의 도입은 dUSP30 RNAi 에 의해 제공된 생존 이점을 역전시켰으며(도 17I), 이는 상기 RNAi 효과의 특이성을 입증한다. 현저하게, USP30 녹다운은 특이적으로 Ddc 뉴런에서, 전신 USP30 녹다운 미만임에도 불구하고 중대한 생존 이점을 제공하기에 충분하였다(도 12H). 상기 결과는 USP30 억제의 유기체 이점의 상당 부분이 도파민작용성 뉴런에서 매개됨을 암시하며, USP30이 도파민작용성 뉴런 기능장애에 중요한 역할을 한다는 생각을 더욱 강화시킨다.
실시예 9: 논의
PD에서 발병 기전의 보다 양호한 이해는 상기 신경퇴행성 질병에 대한 질병-개질 요법의 합리적인 설계에 도움이 될 것이다. 산화성 인산화 효소의 손상된 활성(문헌[(Schapira et al., Lancet, 1: 1269 (1989)]), 산화 스트레스 마커의 상승된 수준(문헌[Lee et al., Biochem . J., 441: 523-540 (2012)]) 및 PD에서 mtDNA 돌연변이(문헌[Bender et al., Nature Genet ., 38: 515-517 (2006)]; 문헌[Kraytsberg et al., Nature Genet ., 38: 518-520 (2006)])는 결함성 미토콘드리아의 축적을 암시한다(문헌[Zheng et al., Science Transl. Med., 2: 52ra73 (2010)]). PINK1/파킨 유전학은 이상 미토콘드리아 생물학 및 PD의 병인학에서 원인 인자로서 손상된 미토콘드리아 질 조절에 대한 논점에 추가로 영향을 미친다(문헌[Youle et al., J. Biol . Chem ., 12: 9-23 (2011)]). 불명확한 손상된 미토콘드리아는 독성의 출처일 수 있으며 건강한 미토콘드리아와의 융합을 통해 미토콘드리아 망을 "오염"시킬 수 있다(문헌[Tanaka et al., J. Cell . Biol ., 191: 1367-1380 (2010)].
본 발명자들은 미토파지의 음의 조절인자로서 미토콘드리아에 국소화된 DUB인 USP30을 동정하였다. USP30은 그의 탈유비퀴티나제 활성을 통해서 파킨-매개된 유비퀴틴화 및 미토콘드리아 단백질의 분해를 저지하고 미토파지에 대한 손상된 미토콘드리아의 방어를 역전시킨다. USP30의 녹다운 억제는 미토파지를 촉진하였으며, 파킨의 PD-관련된 돌연변이체를 발현하는 세포에서 CCCP-유도된 미토콘드리아 분해를 복원시켰다. USP30 녹다운은 파킨 돌연변이 파리에서 미토콘드리아 완전성을 개선시키며, 이는 파킨 및 USP30이 생체내에서 미토콘드리아 질에 대해 저지하는 작용을 가짐을 입증한다. USP30 녹다운은 또한 파라콰트로 처리된 야생형 파리에서 운동 양상 및 생존 이점을 부여하였으며, 이는 USP30 억제가 미토콘드리아 손상의 영향을 개선시킬 수도 있다는 생각을 더욱 지지한다.
파킨 , USP30 및 미토콘드리아 질 조절
파킨 및 PINK1이 미토파지에서 핵심 요소로서 확인되지만, 상기 미토파지 경로의 상세한 역학적 이해는, 특히 포유동물 세포에서, 부족하다. 뉴런에서 기본적인 미토파지가 파킨 및 PINK1에 의존한다는 사실(도 3)은 이들 단백질이 통상적으로 발생하는 미토콘드리아 손상을 능동적으로 모니터함을 암시한다. 미토콘드리아 분열(이는 파킨-매개된 미토파지에 필요한 것으로 보인다(문헌[Tanaka et al., J. Cell. Biol ., 191: 1367-1380 (2010)])은 2개의 딸 미토콘드리아 중 하나에서 막 전위의 일시적인 강하를 이끌어냄으로써 기본적인 미토콘드리아 턴오버에 기여할 수 있다(문헌[Twig et al., EMBO J., 27: 433-446 (2008)]). 이러한 일시적인 막 전위의 강하는 PINK1 축적 및 파킨 모집의 기회를 생성시켜, 막 전위가 신속히 재확립되지 않는다면 결국 미토파지에 이르게 한다. 따라서 기본 조건하에서, USP30 녹다운은 상기 미토콘드리아 막 전위의 분열-관련된 강하 동안 파킨-매개된 유비퀴틴화를 촉진시킴으로써 미토파지를 가속화할 수 있다. 손상된 미토콘드리아가 파킨을 축적하기가 더욱 쉽기 때문에, USP30 기능의 억제는 건강하지 않은 미토콘드리아를 우선적으로 제거할 것으로 예상된다.
파킨 리가제 활성은 유비퀴틴화를 통해 미토콘드리아를 방어하기 때문에, 파킨 돌연변이체 중에 존재하는 일부 잔류 리가제 활성이 추정상, USP30 녹다운이 미토파지를 구제하는데 필요하다. 파킨 활성의 완전한 상실과 함께, USP30 녹다운은, 다른 E3 리가제가 중복되는 기질을 갖지 않고 파킨의 결여를 보상할 수 있지 않는 한, 제거 구제에 효과가 없을 것으로 예상할 수 있다. 파킨 돌연변이 파리에서 USP30 녹다운에 의한 미토콘드리아 완전성의 구제는, 파킨 유전자의 큰 부분이 누락되지만, 후자의 가능성을 지지한다.
정상적인 턴오버의 부분으로서, 상기 제거된 미토콘드리아는 추정상 미토콘드리아 생물발생을 통해 대체될 필요가 있다. 배양 세포주에서, 미토콘드리아 손상은 전체 미토콘드리아 질량을 증가시킨다(문헌[Narendra et al., PLoS Biology, 8: e1000298 (2010)]). 이와 관련하여 흥미롭게도, 파킨이 또한 음의 전사 조절인자를 저하시킴으로써 미토콘드리아 생물발생을 높일 수 있음이 주목된다(문헌[Shin et al., Cell 144: 689-702 (2011)]). USP30이 또한 상기 생물발생 경로를 조절하는지의 여부 및 USP30 억제에 의해 유도된 미토파지가 새로운 미토콘드리아 생산에 동반되는지의 여부를 측정하기 위해서 추가의 연구가 필요하다.
공통 기질상에서 USP30 대 파킨
전체 유비퀴틴화 부위 지도화 실험은 유비퀴틴화가 파킨 과발현 및 USP30 녹다운 모두에 의해 영향을 받는 다수의 기질들을 동정하였다. 이러한 공유된 추정상의 기질들 중에서, Miro 및 Tom20이 파킨 및 USP30에 의해 길항적으로 조절되는 유비퀴틴화 수준을 가짐, 즉 GFP-파킨 과발현 또는 USP30 녹다운이 CCCP 처리에 의해 유도된 유비퀴틴화를 증가시킴을 확인하였다. 흥미롭게도, Tom20에 의해 예시되는 이러한 공유된 기질의 부분집합은 기본 조건하에서조차 USP30에 의해 조절되었다. Mul1, Asns 및 Fkbp8(그러나 Miro는 아님)이 Tom20과 유사하게 반응하는(CCCP의 부재하에서 USP30 녹다운에 의해 기본적인 유비퀴틴화 증가를 나타낸다) 미토콘드리아 기질이었다. 따라서, USP30은 기본적으로, 추정상 CCCP의 부재하에서 활성이고 Miro가 아닌 Tom20상에서 작용하는 미토콘드리아 E3 리가제를 견제함으로써 상기 단백질 세트를 탈유비퀴틴화한다. CCCP에 이어서, USP30은 또한 상기 기질 세트의 파킨 의존성 유비퀴틴화를 방해한다. 다른 한편으로, Tom70, Mat2b 및 Pth2와 같은 단백질들은 오직 CCCP에 이어서만 USP30 녹다운에 의해 증대된 유비퀴틴화를 나타낸다는 점에서 Miro와 유사하게 반응하였다. 이러한 관찰은 상기 단백질 세트가, 모집된 파킨의 부재하에서 낮은 수준의 기본적인 유비퀴틴화를 겪거나(즉 파킨은 그의 주요 E3 리가제이다), 또는 USP30이 기본적인 조건하에서 상기 단백질들에 대해 불활성임을 암시한다. 미토콘드리아 탈분극은 가능하게는 PINK1-매개된 인산화(문헌[Kondapalli et al., Open Biology, 2: 120080 (2012)]; 문헌[Vives-Bauza et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 107: 378-383 (2010)]을 참조하시오)를 통해 파킨의 E3 리가제 활성을 조절하며(문헌[Matsuda et al., J. Cell Biol ., 189: 211-221 (2010)]); USP30(미토콘드리아상에 구성적으로 국소화되어 있다)의 활성이 또한 미토콘드리아 손상에 의해 조절되는지의 여부는 연구 중인채로 있다.
전체 유비퀴틴화 분석은 또한 유비퀴틴화가 파킨 및 USP30에 의해 역으로 조절되는 일련의 비-미토콘드리아 단백질을 밝혀내었다(핵 단백질, 대사 효소 및 유비퀴틴-프로테아솜 시스템(UPS)의 성분들을 포함함). 이는 파킨과 USP30간의 길항 작용성 관계가 미토콘드리아 이상으로 연장될 수 있음을 암시한다. 이들 비-미토콘드리아 "기질"은 파킨 및 USP30에 의해 간접적으로 조절되거나, 또는 미토콘드리아상에 아집단들을 가질 수도 있지만, 공식적으로는 계산 도구에 의해 사용되는 엄격한 여과 기준으로 인해 미토콘드리아 국소화를 갖는 것으로서 지정되지는 않았다(문헌[Pagliarini et al., Cell, 134: 112-123 (2008)]). MS는 또한 파킨 과발현 또는 USP30 녹다운(예를 들어 Ssbp, ZO1, Rab10, Vamp1)시 유비퀴틴화의 추가적인 증가 없이 CCCP에 의해 증대된 유비퀴틴화(내인성 파킨 및 USP30 수준하에서)를 보이는 일부 단백질들을 동정하였으며, 이는 미토콘드리아 탈분극에 이어서 또 다른 UPS 경로의 참여를 암시한다. 일부의 경우에, 상승된 수준의 유비퀴틴화된 종은 전체 단백질 기질 자체의 수준의 증가로부터 유래할 수 있음에 주목하는 것이 적합하다.
흥미롭게도, 파킨은 또한 유비퀴틴화하고 USP30을 분해하며, 병원성 파킨 돌연변이는 USP30을 하향조절하는 상기 파킨의 능력을 차단한다. 미토파지의 음의 조절인자를 제거하지 못하는 것은 상기 파킨 돌연변이와 관련된 비효율적인 유비퀴틴화를 악화시킬 수 있으며, 또한 이는 USP30 녹다운에 의한 미토파지의 구제를 부분적으로 설명할 수 있다.
파킨 , USP30 및 신경퇴행
파킨에서 PD-관련된 돌연변이는 감소된 촉매 활성, 증대된 응집 및/또는 감소된 발현에 이르게 할 수 있다(문헌[Hampe et al., Human Mol . Genet ., 15: 2059-2075 (2006)]; 문헌[Matsuda et al., J. Biol . Chem ., 281: 3204-3209 (2006)]; 문헌[Wang et al., J. Neurochem ., 93: 422-431 (2005)]; 문헌[Winklhofer et al., J. Biol . Chem . 278: 47199-47208 (2003)]). 산발성 PD에서, 파킨 활성은 또한 세포 스트레스로 인해 억제될 수 있다(문헌[Corti et al., Physiol. Rev., 91: 1161-1218 (2011)]). PD-관련된 PINK1 돌연변이는 손상된 미토콘드리아로의 파킨의 전좌를 손상시킨다(문헌[Matsuda et al., J. Cell Biol ., 189: 211-221 (2010)]; 문헌[Narendra et al., PLoS Biology, 8: e1000298 (2010)]; 문헌[Vives-Bauza et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 107: 378-383 (2010)]). 따라서, 미토콘드리아 질 조절에서 파킨의 감소된 기능은 드문 파킨 돌연변이에 의해 나타나는 것보다 PD에서 더 우세한 듯하며, 이는 특발성 PD에서 USP30 억제의 가능한 유용성에 대한 추가적인 지지를 제공한다. USP30 억제의 이점과 일관되게, USP30의 녹다운은 PD-관련된 돌연변이 파킨을 발현하는 세포에서 미토파지를 복원시키며 뉴런에서 산화 스트레스를 감소시킨다. 드로소필라 파킨 돌연변이에서, USP30의 녹다운은 미토콘드리아 완전성을 개선시킨다. 더욱 또한, USP30 녹다운은, 미토콘드리아에 관련된 산화 스트레스 인자인 파라콰트에 대한 행동 및 생존 분석에서 이점을 제공한다(문헌[Castello et al., J. Biol . Chem ., 282: 14186-14193 (2007)]; 문헌[Cocheme et al., J. Biol . Chem ., 283: 1786-1798 (2008)]). 파라콰트는 PD에 역학적으로 관련된 미토콘드리아 독이기 때문에(문헌[Tanner et al., Environmental Health Perspect., 119: 866-872 (2011)]), 본원의 발견은 USP30의 억제가 미토콘드리아 손상 및 기능장애에 의해 유발된 질병에 도움이 될 수도 있다는 증거를 제공한다.
PD에서, 미토콘드리아 기능장애는 흑질 뉴런에 특이적이지 않으며 전신적으로 존재한다(문헌[Schapira et al, Parkinson's Dis., 2011: 159160 (2011)]). USP30 발현은 광범위한 것으로 보이기 때문에(문헌[Nakamura and Hirose, Mol . Biol . Cell, 19: 1903-1914 (2008)]), USP30 억제는 손상된 미토콘드리아의 제거를 촉진함으로써 광범위한 이점을 제공할 잠재력을 갖는다. 뉴런 외에, 오래 사는 대사적으로 활성인 세포, 예를 들어 심근세포가 또한 효율적인 미토콘드리아 질 조절 시스템에 의존한다(문헌[Gottlieb et al., Am . J. Physiol . Cell Physiol ., 299: C203-210 (2010)]). 이와 관련하여, 파킨은 미토파지의 활성화 및 허혈성 스트레스에 반응하여 손상된 미토콘드리아의 제거를 통해 허혈/재관류 손상에 대해 심근세포를 보호하는 것으로 나타났다(문헌[Huang et al., PLoS One, 6: e20975 (2011)]). 유전성 미토콘드리아 질병에서, mtDNA 돌연변이는 동일한 세포내에서 야생형 mtDNA와 공존하며, 미토콘드리아 기능장애 및 질병은 오직 돌연변이된 mtDNA의 비율이 높을 때에만 발생한다(문헌[Bayona-Bafaluy et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 102: 14392-14397 (2005)]). 흥미롭게도, 파킨 과발현은 유해한 mtNDA 돌연변이를 갖는 미토콘드리아를 제거하며, 추정상 돌연변이 mtDNA를 함유하는 미토콘드리아를 분해함으로써 미토콘드리아 기능을 복원시킨다(문헌[Suen et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 107: 11835-11840 (2010)]). 따라서, USP30 억제는 미토콘드리아 질을 증대시킴으로써 PD 이외의 질병에 이로운 잠재력을 갖는다.
실시예 10: USP30의 펩티드 억제제
2가지 유형의 파지-디스플레이 고유 펩티드 라이브러리인 선형-라이브러리 및 환상-라이브러리를 앞서 개시된 바와 같이 용액 중에서 비오틴화된 USP30_cd(C77A 돌연변이를 갖는 USP30 촉매 도메인)를 갖는 수회 라운드의 결합 선택을 통해 환화시켰다(문헌[Stanger, et al., 2012, Nat . Chem . Bio., 7: 655-660]). 상기 선택은 보통의 스폿 ELISA 신호(약 5의 신호/소음비)를 갖는 펩티드 USP30_3 및 USP30_8을 동정하였다. USP_30 및 USP_8은 하기 서열을 갖는다:
USP30_3: PLYCFYDLTYGYLCFY(서열번호 1);
USP30_8: VSRCYIFWNEMFCDVE(서열번호 2).
이어서 USP30_3 및 USP30_8을 USP30의 억제 및 또한 USP7, USP5, UCHL3 및 USP2의 억제에 대해 분석하여 하기와 같이 USP30에 대한 각 펩티드의 특이성을 측정하였다. 0 내지 100 μM(USP30_3의 경우) 및 0 내지 500 μM(USP30_8의 경우)의 농도 범위의 USP30 펩티드 리간드들을 250 nM 유비퀴틴-AMC(보스톤 바이오켐(Boston Biochem.), 미국 메릴랜드주 보스톤 소재)와 혼합하였다. 30분 동안 0.05% 트윈20, 0.1% BSA 및 1mM DTT를 함유하는 PBS 완충제 중에서 각각 USP30, USP7, USP2, USP5 및 UCHL3에 대해 5.6, 2, 2, 5 및 0.05 nM의 DUB의 패널을 상기 유비퀴틴-AMC/USP30 펩티드 리간드 혼합물에 가하고 초기 속도를 스펙트라맥스(SpectraMax)(등록상표) M5e(몰레큘라 디바이스(Molecular Device), 미국 캘리포니아주 서니베일 소재)를 사용하여 형광을 모니터함으로써 바로 측정하였다(340 ㎚에서 여기 및 465 ㎚에서 방출). 상기 초기 속도를 증가하는 형광 신호의 기울기를 기준으로 계산하였다. 상기 속도를 상기 펩티드 리간드 농도가 0일때의 속도의 백분율로 표준화하고, 상기 데이터를 하기식에 대입하여 칼레이다그래프(KaleidaGraph)를 사용하여 처리하였다:
상기 식에서,
ν는 최대 속도의 백분율이고; I는 억제제(USP30 펩티드 리간드)의 농도이고; ν0 및 νmax는 각각 상기 속도의 최소 및 최대 백분율이다.
상기 실험의 결과를 도 14에 나타내었다. 펩티드 USP30_3은 8.0 μM의 IC50으로, USP30에 대해 양호한 특이성을 나타내었다. 상기 USP5에 대한 펩티드 USP30_3의 IC50은 49.4 μM에서 6배 초과이고, USP2의 경우 약 100 μM에서 10배 초과이었다. UCHL3 및 USP2에 대한 펩티드 USP30_3의 IC50은 >200 μM이었다.
펩티드 USP30_3을 친화성 성숙에 대해서 선택하였다. 상기 친화성을 개선시키기 위해서, 유연한 무작위 라이브러리를 표적화된 부모로서 상기 USP30_3 서열을 사용하여 제작하고 앞서 개시된 바와 같이 용액 중에서 USP30_cd에 대해 가려내었다(문헌[Stanger, et al., 2012, Nat . Chem . Bio., 7: 655-660]). 4 라운드의 용액 분리(panning) 후에, 모 USP30_3보다 더 강한 스폿 파지 ELISA 신호(약 3 내지 6배의 신호/소음비의 개선으로 나타남)를 갖는 USP30 촉매 도메인에 결합된 20개의 펩티드가 동정되었다.
도 15는 USP30_3에서의 위치 및 친화성 성숙된 펩티드에 의한 잔기 확률의 그래프를 도시한다. 몇몇 친화성 성숙된 펩티드에 대한 서열을 신호 대 소음비("S/N")(상기 비는 NeutrAvidin-코팅된 플레이트 단독에 대한 ELISA 신호에 대해 NeutrAvidin-코팅된 384 웰 맥시솔브(Maxisorb) 플레이트상에 포착된 비오틴화된 USP30_cd에 대해 검출된 상기 스폿 파지 ELISA 신호("신호")의 비이다)와 함께 상기 그래프 아래에 나타낸다. 도 15는 또한 상기 선택에서 각 서열의 발생 수("n"), 클론의 총수("전체"; 66), 및 독특한 서열의 수("Uniq"; 20)를 나타낸다. 상기 나타낸 친화성 성숙한 펩티드는 전부, USP30_3.27 및 USP30_3.62를 제외하고 10을 초과하는 신호 대 소음비를 가졌다.
이어서 몇몇 펩티드를 USP30 대 다른 탈유비퀴틴화 효소들에 대한 특이성에 대해서 시험하였다. 결합을 ELISA에 의해 시험하였다. 도 16은 모 USP30_3 펩티드 및 친화성 성숙한 펩티드 USP30_3.2, USP30_3.23, USP30_3.65, 및 USP30_3.88의 USP2, USP7, USP14 및 USP30의 촉매 도메인들(각각 알라닌으로 돌연변이된 시스테인 활성 부위를 갖는다), 및 UCHL1, UCHL3 및 UCHL5의 촉매 도메인들에의 결합에 대한 신호 대 소음비("s/n 비")를 나타낸다. 각각의 펩티드에 대한 막대 그래프의 세트에 대해서, 시험된 표적은 왼쪽에서 오른쪽으로, USP2, USP7, USP14, USP30, UCHL1, UCHL3, 및 UCHL5이었다.
상기 발명은 이해의 명확성을 목적으로 예시 및 실시예들에 의해 일부 상세히 개시되었지만, 상기 설명 및 실시예들을 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 해석해서는 안 된다. 본 발명에 인용된 모든 특허 및 과학문헌의 명세는 내용 전체가 참고로 명백히 인용된다.
[표 4]
서열 표
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<110> F.HOFFMANN-LA ROCHE AG <120> USP30 INHIBITORS AND METHODS OF USE <130> P4986R1-WO <140> PCT/EP2013/068983 <141> 2013-09-13 <150> US 61/809,927 <151> 2013-04-09 <150> US 61/701,963 <151> 2012-09-17 <160> 49 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Pro Leu Tyr Cys Phe Tyr Asp Leu Thr Tyr Gly Tyr Leu Cys Phe Tyr 1 5 10 15 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Val Ser Arg Cys Tyr Ile Phe Trp Asn Glu Met Phe Cys Asp Val Glu 1 5 10 15 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 Ser Leu Asp Cys Phe Phe Asp Leu Ser Tyr Gly Tyr Leu Cys Phe Asp 1 5 10 15 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 Ala Met Tyr Cys Phe Tyr Asp Met Asp Tyr Gly Tyr Gln Cys Leu Tyr 1 5 10 15 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 Thr Leu Asn Cys Tyr Tyr Asp Leu Asp Tyr Gly Tyr 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Ser Asp Ile Asp Glu Ser 645 650 655 Ser Val Met Gln Leu Ala Glu Met Gly Phe Pro Leu Glu Ala Cys Arg 660 665 670 Lys Ala Val Tyr Phe Thr Gly Asn Met Gly Ala Glu Val Ala Phe Asn 675 680 685 Trp Ile Ile Val His Met Glu Glu Pro Asp Phe Ala Glu Pro Leu Thr 690 695 700 Met Pro Gly Tyr Gly Gly Ala Ala Ser Ala Gly Ala Ser Val Phe Gly 705 710 715 720 Ala Ser Gly Leu Asp Asn Gln Pro Pro Glu Glu Ile Val Ala Ile Ile 725 730 735 Thr Ser Met Gly Phe Gln Arg Asn Gln Ala Ile Gln Ala Leu Arg Ala 740 745 750 Thr Asn Asn Asn Leu Glu Arg Ala Leu Asp Trp Ile Phe Ser His Pro 755 760 765 Glu Phe Glu Glu Asp Ser Asp Phe Val Ile Glu Met Glu Asn Asn Ala 770 775 780 Asn Ala Asn Ile Ile Ser Glu Ala Lys Pro Glu Gly Pro Arg Val Lys 785 790 795 800 Asp Gly Ser Gly Thr Tyr Glu Leu Phe Ala Phe Ile Ser His Met Gly 805 810 815 Thr Ser Thr Met Ser Gly His Tyr Ile Cys His Ile Lys Lys Glu Gly 820 825 830 Arg Trp Val Ile Tyr Asn Asp His Lys Val Cys Ala Ser Glu Arg Pro 835 840 845 Pro Lys Asp Leu Gly Tyr Met Tyr Phe Tyr Arg Arg Ile Pro Ser 850 855 860 <210> 44 <211> 294 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Met Ala Thr His Gly Gln Thr Cys Ala Arg Pro Met Cys Ile Pro Pro 1 5 10 15 Ser Tyr Ala Asp Leu Gly Lys Ala Ala Arg Asp Ile Phe Asn Lys Gly 20 25 30 Phe Gly Phe Gly Leu Val Lys Leu Asp Val Lys Thr Lys Ser Cys Ser 35 40 45 Gly Val Glu Phe Ser Thr Ser Gly Ser Ser Asn Thr Asp Thr Gly Lys 50 55 60 Val Thr Gly Thr Leu Glu Thr Lys Tyr Lys Trp Cys Glu Tyr Gly Leu 65 70 75 80 Thr Phe Thr Glu Lys Trp Asn Thr Asp Asn Thr Leu Gly Thr Glu Ile 85 90 95 Ala Ile Glu Asp Gln Ile Cys Gln Gly Leu Lys Leu Thr Phe Asp Thr 100 105 110 Thr Phe Ser Pro Asn Thr Gly Lys Lys Ser Gly Lys Ile Lys Ser Ser 115 120 125 Tyr Lys Arg Glu Cys Ile Asn Leu Gly Cys Asp Val Asp Phe Asp Phe 130 135 140 Ala Gly Pro Ala Ile His Gly Ser Ala Val Phe Gly Tyr Glu Gly Trp 145 150 155 160 Leu Ala Gly Tyr Gln Met Thr Phe Asp Ser Ala Lys Ser Lys Leu Thr 165 170 175 Arg Asn Asn Phe Ala Val Gly Tyr Arg Thr Gly Asp Phe Gln Leu His 180 185 190 Thr Asn Val Asn Asp Gly Thr Glu Phe Gly Gly Ser Ile Tyr Gln Lys 195 200 205 Val Cys Glu Asp Leu Asp Thr Ser Val Asn Leu Ala Trp Thr Ser Gly 210 215 220 Thr Asn Cys Thr Arg Phe Gly Ile Ala Ala Lys Tyr Gln Leu Asp Pro 225 230 235 240 Thr Ala Ser Ile Ser Ala Lys Val Asn Asn Ser Ser Leu Ile Gly Val 245 250 255 Gly Tyr Thr Gln Thr Leu Arg Pro Gly Val Lys Leu Thr Leu Ser Ala 260 265 270 Leu Val Asp Gly Lys Ser Ile Asn Ala Gly Gly His Lys Val Gly Leu 275 280 285 Ala Leu Glu Leu Glu Ala 290 <210> 45 <211> 283 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Met Cys Asn Thr Pro Thr Tyr Cys Asp Leu Gly Lys Ala Ala Lys Asp 1 5 10 15 Val Phe Asn Lys Gly Tyr Gly Phe Gly Met Val Lys Ile Asp Leu Lys 20 25 30 Thr Lys Ser Cys Ser Gly Val Glu Phe Ser Thr Ser Gly His Ala Tyr 35 40 45 Thr Asp Thr Gly Lys Ala Ser Gly Asn Leu Glu Thr Lys Tyr Lys Val 50 55 60 Cys Asn Tyr Gly Leu Thr Phe Thr Gln Lys Trp Asn Thr Asp Asn Thr 65 70 75 80 Leu Gly Thr Glu Ile Ser Trp Glu Asn Lys Leu Ala Glu Gly Leu Lys 85 90 95 Leu Thr Leu Asp Thr Ile Phe Val Pro Asn Thr Gly Lys Lys Ser Gly 100 105 110 Lys Leu Lys Ala Ser Tyr Lys Arg Asp Cys Phe Ser Val Gly Ser Asn 115 120 125 Val Asp Ile Asp Phe Ser Gly Pro Thr Ile Tyr Gly Trp Ala Val Leu 130 135 140 Ala Phe Glu Gly Trp Leu Ala Gly Tyr Gln Met Ser Phe Asp Thr Ala 145 150 155 160 Lys Ser Lys Leu Ser Gln Asn Asn Phe Ala Leu Gly Tyr Lys Ala Ala 165 170 175 Asp Phe Gln Leu His Thr His Val Asn Asp Gly Thr Glu Phe Gly Gly 180 185 190 Ser Ile Tyr Gln Lys Val Asn Glu Lys Ile Glu Thr Ser Ile Asn Leu 195 200 205 Ala Trp Thr Ala Gly Ser Asn Asn Thr Arg Phe Gly Ile Ala Ala Lys 210 215 220 Tyr Met Leu Asp Cys Arg Thr Ser Leu Ser Ala Lys Val Asn Asn Ala 225 230 235 240 Ser Leu Ile Gly Leu Gly Tyr Thr Gln Thr Leu Arg Pro Gly Val Lys 245 250 255 Leu Thr Leu Ser Ala Leu Ile Asp Gly Lys Asn Phe Ser Ala Gly Gly 260 265 270 His Lys Val Gly Leu Gly Phe Glu Leu Glu Ala 275 280 <210> 46 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 46 Arg Leu Thr Ser Asn Met Val Cys Lys His Cys Glu His Gln Ser Pro 1 5 10 15 Val Arg Phe <210> 47 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 47 Arg Asp Val Val Cys Asp Asn Cys Thr Lys Ile Glu Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 48 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is selected from Tyr, Asp, Glu, Ile, Leu, Asn, and Ser <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is selected from Phe, Ile, and Tyr <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is selected from Phe, Ile, and Tyr <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is selected from Asp and Glu <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is selected from Leu, Met, Val, and Pro <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is selected from Ser, Asn, Asp, Ala, and Thr <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa is selected from Tyr, Asp, Phe, Asn, and Trp <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa is selected from Gly, Asp, and Glu <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa is selected from Tyr and Phe <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa is selected from Leu, Val, Met, Gln, and Trp <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa is selected from Phe, Leu, Cys, Val, and Tyr <400> 48 Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa 1 5 10 <210> 49 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is selected from any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is selected from Leu, Met, Ala, Ser, and Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is selected from Try, Asp, Glu, Ile, Leu, Asn, and Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is selected from Phe, Ile, and Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is selected from Phe, Ile, and Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is selected from Asp and Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is selected from Leu, Met, Val, and Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is selected from Ser, Asn, Asp, Ala, and Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is selected from Tyr, Asp, Phe, Asn, and Trp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is selected from Gly, Asp, and Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is selected from Tyr and Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is selected from Leu, Val, Met, Gln, and Trp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa is selected from Phe, Leu, Cys, Val, and Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa is selected from any amino acid <400> 49 Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa 1 5 10 15

Claims (68)

  1. 세포를 USP30 억제제와 접촉시킴을 포함하는, 세포에서 미토파지의 증가 방법.
  2. 세포를 USP30 억제제와 접촉시킴을 포함하는, 세포에서 미토콘드리아 유비퀴틴화의 증가 방법.
  3. 세포를 USP30 억제제와 접촉시킴을 포함하는, 세포에서 Tom20, MIRO, MUL1, ASNS, FKBP8, TOM70, MAT2B, PRDX3, IDE, VDAC1, VDAC2, VDAC3, IPO5, PSD13, UBP13 및 PTH2 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상 또는 14개 단백질의 유비퀴틴화의 증가 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    Tom20의 K56, K61 및 K68 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 아미노산의 유비퀴틴화를 증가시킴을 포함하는 방법.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
    MIRO의 K153, K187, K330, K427, K512, K535, K567 및 K572 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상 또는 8개 아미노산의 유비퀴틴화를 증가시킴을 포함하는 방법.
  6. 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    MUL1의 K273, K299 및 K52 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 아미노산의 유비퀴틴화를 증가시킴을 포함하는 방법.
  7. 제 3 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    ASNS의 K147, K168, K176, K221, K244, K275, K478, K504 및 K556 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상 또는 9개 아미노산의 유비퀴틴화를 증가시킴을 포함하는 방법.
  8. 제 3 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    FKBP8의 K249, K271, K273, K284, K307, K317, K334 및 K340 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 또는 8개 아미노산의 유비퀴틴화를 증가시킴을 포함하는 방법.
  9. 제 3 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    TOM70의 K78, K120, K123, K126, K129, K148, K168, K170, K178, K185, K204, K230, K233, K245, K275, K278, K312, K326, K349, K359, K441, K463, K470, K471, K494, K501, K524, K536, K563, K570, K599, K600 및 K604 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상 아미노산의 유비퀴틴화를 증가시킴을 포함하는 방법.
  10. 제 3 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    MAT2B의 K209, K245, K316 및 K326 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 아미노산의 유비퀴틴화를 증가시킴을 포함하는 방법.
  11. 제 3 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    PRDX3의 K83, K91, K166, K241 및 K253 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 또는 5개 아미노산의 유비퀴틴화를 증가시킴을 포함하는 방법.
  12. 제 3 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    IDE의 K558, K657, K854, K884, K929 및 K933 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 6개 아미노산의 유비퀴틴화를 증가시킴을 포함하는 방법.
  13. 제 3 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    VDAC1의 K20, K53, K61, K109, K110, K266 및 K274 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 또는 7개 아미노산의 유비퀴틴화를 증가시킴을 포함하는 방법.
  14. 제 3 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    VDAC2의 K31, K64, K120, K121, K277 및 K285 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 6개 아미노산의 유비퀴틴화를 증가시킴을 포함하는 방법.
  15. 제 3 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    VDAC3의 K20, K53, K61, K109, K110, K163, K266 및 K274 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 또는 8개 아미노산의 유비퀴틴화를 증가시킴을 포함하는 방법.
  16. 제 3 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    IPO5의 K238, K353, K436, K437, K548, K556, K613, K678, K690, K705, K775 및 K806 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상 아미노산의 유비퀴틴화를 증가시킴을 포함하는 방법.
  17. 제 3 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    PSD13의 K2, K32, K99, K115, K122, K132, K161, K186, K313, K321, K347, K350 및 K361 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상 아미노산의 유비퀴틴화를 증가시킴을 포함하는 방법.
  18. 제 3 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    UBP13의 K18, K190, K259, K326, K328, K401, K405, K414, K418, K435, K586, K587 및 K640 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상 아미노산의 유비퀴틴화를 증가시킴을 포함하는 방법.
  19. 제 3 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    PTH2의 47, 76, 81, 95, 106, 119, 134, 171 및 177 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상 또는 9개 아미노산의 유비퀴틴화를 증가시킴을 포함하는 방법.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포가 산화 스트레스 하에 있는 방법.
  21. 세포를 USP30 억제제와 접촉시킴을 포함하는, 세포에서 산화 스트레스를 감소시키는 방법.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포가 파킨에서의 병원성 돌연변이, PINK1에서의 병원성 돌연변이, 또는 파킨에서의 병원성 돌연변이 및 PINK1에서의 병원성 돌연변이를 포함하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서,
    세포가 표 1의 돌연변이 중에서 선택된 파킨에서의 병원성 돌연변이를 포함하는 방법.
  24. 제 22 항 또는 제 23 항에 있어서,
    세포가 표 2의 돌연변이 중에서 선택된 PINK1에서의 병원성 돌연변이를 포함하는 방법.
  25. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포가 뉴런, 심장 세포 및 근육 세포 중에서 선택되는 방법.
  26. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포가 대상체 중에 포함되는 방법.
  27. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포가 생체외 또는 시험관내에 있는 방법.
  28. 대상체에게 유효량의 USP30 억제제를 투여함을 포함하는, 대상체에서 미토콘드리아 결함을 수반하는 질환을 치료하는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서,
    미토콘드리아 결함을 수반하는 질환이 미토파지 결함을 수반하는 질환, 미토콘드리아 DNA의 돌연변이를 수반하는 질환, 미토콘드리아 산화 스트레스를 수반하는 질환, 미토콘드리아 모양 또는 형태의 결함을 수반하는 질환, 미토콘드리아 막 전위의 결함을 수반하는 질환, 및 리소좀 저장 결함을 수반하는 질환 중에서 선택되는 방법.
  30. 제 28 항 또는 제 29 항에 있어서,
    미토콘드리아 결함을 수반하는 질환이 신경퇴행성 질병; 미토콘드리아 근육병증, 뇌병증, 젖산혈증 및 뇌졸중-유사 에피소드(MELAS) 증후군; 레베르 유전 시신경병증(LHON); 신경병증, 운동실조, 망막색소변성증-모체 유전된 레이 증후군(NARP-MILS); 다논병; 심근경색에 이르는 허혈성 심장병; 다중 설파타제 결손증(MSD); 점액지질증 II(ML II); 점액지질증 III(ML III); 점액지질증 IV(ML IV); GM1-강글리오사이드증(GM1); 신경 세로이드-지질갈색소증(NCL1); 알퍼스병; 바쓰 증후군; 베타-산화 결함; 카르니틴-아실-카르니틴 결손; 카르니틴 결손; 크레아틴 결손 증후군; 조-효소 Q10 결손; 복합체 I 결손; 복합체 II 결손; 복합체 III 결손; 복합체 IV 결손; 복합체 V 결손; COX 결손; 만성 진행성 외안근마비 증후군(CPEO); CPT I 결손; CPT II 결손; II형 글루타르산뇨증; 컨스-세르 증후군; 젖산뇨증; 장쇄 아실-CoA 데하이드로게나제 결손(LCHAD); 레이병 또는 증후군; 치명적인 유아 심근증(LIC); 루프트병; II형 글루타르산뇨증; 중간-쇄 아실-CoA 데하이드로게나제 결손(MCAD); 간대성 근경련성 간질 및 불균일 적색 섬유(MERRF) 증후군; 미토콘드리아 열성 실조증 증후군; 미토콘드리아 세포병증; 미토콘드리아 DNA 결핍 증후군; 근육신경위장 장애 및 뇌병증; 피어슨 증후군; 피루베이트 카복실라제 결손; 피루베이트 데하이드로게나제 결손; POLG 돌연변이; 중간/단-쇄 3-하이드록시아실-CoA 데하이드로게나제(M/SCHAD) 결손; 및 극장쇄 아실-CoA 데하이드로게나제(VLCAD) 결손 중에서 선택되는 방법.
  31. 제 30 항에 있어서,
    신경퇴행성 질병이 알쯔하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 헌팅톤병, 허혈증, 뇌졸중, 루이소체 치매, 및 전측두엽 치매 중에서 선택되는 방법.
  32. 대상체에게 유효량의 USP30 억제제를 투여함을 포함하는, 대상체에서 신경퇴행성 질병을 치료하는 방법.
  33. 제 32 항에 있어서,
    신경퇴행성 질병이 파킨슨병, 알쯔하이머병, 헌팅톤병, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 허혈증, 뇌졸중, 루이소체 치매, 및 전측두엽 치매 중에서 선택되는 방법.
  34. 대상체에게 유효량의 USP30 억제제를 투여함을 포함하는, 대상체에서 파킨슨병을 치료하는 방법.
  35. 제 28 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체가 상기 대상체의 세포의 적어도 일부 중에 파킨에서의 병원성 돌연변이, PINK1에서의 병원성 돌연변이, 또는 파킨에서의 병원성 돌연변이 및 PINK1에서의 병원성 돌연변이를 포함하는 방법.
  36. 제 35 항에 있어서,
    파킨에서의 병원성 돌연변이가 표 1의 돌연변이 중에서 선택되는 방법.
  37. 제 35 항 또는 제 36 항에 있어서,
    PINK1에서의 병원성 돌연변이가 표 2의 돌연변이 중에서 선택되는 방법.
  38. 대상체에게 유효량의 USP30 억제제를 투여함을 포함하는, 대상체에서 산화 스트레스를 겪는 세포를 수반하는 질환을 치료하는 방법.
  39. 제 28 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서,
    USP30 억제제를 경구, 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하로 투여하는 방법.
  40. 제 28 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 추가적인 치료제를 투여함을 포함하는 방법.
  41. 제 40 항에 있어서,
    하나 이상의 추가적인 치료제가 레보도파, 도파민 작용물질, 모노아미노 옥시게나제(MAO) B 억제제, 카테콜 O-메틸트랜스퍼라제(COMT) 억제제, 항콜린제, 아만타딘, 릴루졸, 콜린에스테라제 억제제, 메만틴, 테트라베나진, 정신병치료제, 클로나제팜, 다이아제팜, 항우울제, 및 항-경련제 중에서 선택되는 방법.
  42. 제 1 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서,
    USP30 억제제가 USP30 발현의 억제제인 방법.
  43. 제 42 항에 있어서,
    USP30 발현의 억제제가 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 짧은 간섭 RNA(siRNA) 중에서 선택되는 방법.
  44. 제 1 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서,
    USP30 억제제가 USP30 활성의 억제제인 방법.
  45. 제 44 항에 있어서,
    USP30 활성의 억제제가 항체, 펩티드, 펩티바디, 앱타머, 및 소분자 중에서 선택되는 방법.
  46. 대상체에서 미토콘드리아 결함을 수반하는 질환을 치료하기 위한 USP30 억제제.
  47. 제 46 항에 있어서,
    미토콘드리아 결함을 수반하는 질환이 미토파지 결함을 수반하는 질환, 미토콘드리아 DNA의 돌연변이를 수반하는 질환, 미토콘드리아 산화 스트레스를 수반하는 질환, 미토콘드리아 모양 또는 형태의 결함을 수반하는 질환, 미토콘드리아 막 전위의 결함을 수반하는 질환, 및 리소좀 저장 결함을 수반하는 질환 중에서 선택되는 USP30 억제제.
  48. 제 46 항 또는 제 47 항에 있어서,
    미토콘드리아 결함을 수반하는 질환이 신경퇴행성 질병; 미토콘드리아 근육병증, 뇌병증, 젖산혈증 및 뇌졸중-유사 에피소드(MELAS) 증후군; 레베르 유전 시신경병증(LHON); 신경병증, 운동실조, 망막색소변성증-모체 유전된 레이 증후군(NARP-MILS); 다논병; 심근경색에 이르는 허혈성 심장병; 다중 설파타제 결손증(MSD); 점액지질증 II(ML II); 점액지질증 III(ML III); 점액지질증 IV(ML IV); GM1-강글리오사이드증(GM1); 신경 세로이드-지질갈색소증(NCL1); 알퍼스병; 바쓰 증후군; 베타-산화 결함; 카르니틴-아실-카르니틴 결손; 카르니틴 결손; 크레아틴 결손 증후군; 조-효소 Q10 결손; 복합체 I 결손; 복합체 II 결손; 복합체 III 결손; 복합체 IV 결손; 복합체 V 결손; COX 결손; 만성 진행성 외안근마비 증후군(CPEO); CPT I 결손; CPT II 결손; II형 글루타르산뇨증; 컨스-세르 증후군; 젖산뇨증; 장쇄 아실-CoA 데하이드로게나제 결손(LCHAD); 레이병 또는 증후군; 치명적인 유아 심근증(LIC); 루프트병; II형 글루타르산뇨증; 중간-쇄 아실-CoA 데하이드로게나제 결손(MCAD); 간대성 근경련성 간질 및 불균일 적색 섬유(MERRF) 증후군; 미토콘드리아 열성 실조증 증후군; 미토콘드리아 세포병증; 미토콘드리아 DNA 결핍 증후군; 근육신경위장 장애 및 뇌병증; 피어슨 증후군; 피루베이트 카복실라제 결손; 피루베이트 데하이드로게나제 결손; POLG 돌연변이; 중간/단-쇄 3-하이드록시아실-CoA 데하이드로게나제(M/SCHAD) 결손; 및 극장쇄 아실-CoA 데하이드로게나제(VLCAD) 결손 중에서 선택되는 USP30 억제제.
  49. 제 48 항에 있어서,
    신경퇴행성 질병이 알쯔하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 헌팅톤병, 허혈증, 뇌졸중, 루이소체 치매, 및 전측두엽 치매 중에서 선택되는 USP30 억제제.
  50. 대상체에서 신경퇴행성 질병을 치료하기 위한 USP30 억제제.
  51. 제 50 항에 있어서,
    신경퇴행성 질병이 파킨슨병, 알쯔하이머병, 헌팅톤병, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 허혈증, 뇌졸중, 루이소체 치매, 및 전측두엽 치매 중에서 선택되는 USP30 억제제.
  52. 대상체에서 파킨슨병을 치료하기 위한 USP30 억제제.
  53. 제 46 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체가 상기 대상체의 세포의 적어도 일부 중에 파킨에서의 병원성 돌연변이, PINK1에서의 병원성 돌연변이, 또는 파킨에서의 병원성 돌연변이 및 PINK1에서의 병원성 돌연변이를 포함하는 USP30 억제제.
  54. 제 53 항에 있어서,
    파킨에서의 병원성 돌연변이가 표 1의 돌연변이 중에서 선택되는 USP30 억제제.
  55. 제 53 항 또는 제 54 항에 있어서,
    PINK1에서의 병원성 돌연변이가 표 2의 돌연변이 중에서 선택되는 USP30 억제제.
  56. 대상체에서 산화 스트레스를 겪는 세포를 수반하는 질환을 치료하기 위한 USP30 억제제.
  57. 제 46 항 내지 제 56 항 중 어느 한 항에 있어서,
    근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하로 투여되는 USP30 억제제.
  58. 제 46 항 내지 제 57 항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 추가적인 치료제와 병용되는 USP30 억제제.
  59. 제 58 항에 있어서,
    하나 이상의 추가적인 치료제가 레보도파, 도파민 작용물질, 모노아미노 옥시게나제(MAO) B 억제제, 카테콜 O-메틸트랜스퍼라제(COMT) 억제제, 항콜린제, 아만타딘, 릴루졸, 콜린에스테라제 억제제, 메만틴, 테트라베나진, 정신병치료제, 클로나제팜, 다이아제팜, 항우울제, 및 항-경련제 중에서 선택되는 USP30 억제제.
  60. 제 46 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서,
    USP30 억제제가 USP30 발현의 억제제인 USP30 억제제.
  61. 제 60 항에 있어서,
    USP30 발현의 억제제가 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 짧은 간섭 RNA(siRNA) 중에서 선택되는 USP30 억제제.
  62. 제 46 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서,
    USP30 억제제가 USP30 활성의 억제제인 USP30 억제제.
  63. 제 62 항에 있어서,
    USP30 활성의 억제제가 항체, 펩티드, 펩티바디, 앱타머, 및 소분자 중에서 선택되는 방법.
  64. USP30을 10 μM 미만의 IC50으로 억제하는, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드:
    X1X2CX3X4X5X6X7X8X9X10X11CX12(서열번호 48)
    상기에서:
    X1은 L, M, A, S 및 V 중에서 선택되고;
    X2는 Y, D, E, I, L, N 및 S 중에서 선택되고;
    X3은 F, I 및 Y 중에서 선택되고;
    X4는 F, I 및 Y 중에서 선택되고;
    X5는 D 및 E 중에서 선택되고;
    X6은 L, M, V 및 P 중에서 선택되고;
    X7은 S, N, D, A 및 T 중에서 선택되고;
    X8은 Y, D, F, N 및 W 중에서 선택되고;
    X9는 G, D 및 E 중에서 선택되고;
    X10은 Y 및 F 중에서 선택되고;
    X11은 L, V, M, Q 및 W 중에서 선택되고;
    X12는 F, L, C, V 및 Y 중에서 선택된다.
  65. 제 64 항에 있어서,
    USP7, USP5, UCHL3 및 USP2 중에서 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 이상의 펩티다제에 대한 펩티드의 IC50이 20 μM 초과, 30 μM 초과, 40 μM 초과, 또는 50 μM 초과인 펩티드.
  66. 제 64 항 또는 제 65 항에 있어서,
    서열번호 1 내지 22 중에서 선택된 아미노산 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 100% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드.
  67. USP30 mRNA의 영역 및/또는 USP30 pre-mRNA의 영역에 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 100% 상보성인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드로, 상기 영역이 적어도 10 이상, 15 이상, 20 이상, 25 이상, 30 이상, 40 이상, 50 이상, 60 이상, 70 이상, 80 이상, 90 이상, 또는 100 이상 뉴클레오티드 길이인 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  68. USP30 mRNA의 영역 및/또는 USP30 pre-mRNA의 영역에 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 100% 일치하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 siRNA로, 상기 영역이 적어도 10 이상, 15 이상, 20 이상 또는 25 이상 뉴클레오티드 길이인 siRNA.
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