KR102200536B1 - Miro2 발현 촉진제 또는 활성화제를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Miro2 발현 촉진제 또는 활성화제를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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이희란
박수정
우하나
김해린
김승후
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울산대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 Miro2 발현 촉진제 또는 활성화제를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에서는 Miro2 발현 감소에 의해 해마 신경전구세포의 세포사멸이 유도되고, 미토콘드리아의 기능이 저해되는 것을 확인한 바, Miro2는 알츠하이머병 바이오마커 조성물 또는 알츠하이머병 진단용 키트에 활용될 수 있고, Miro2 단백질, 상기 단백질의 발현 촉진제 또는 활성화제는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 약학 조성물 등으로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

Miro2 발현 촉진제 또는 활성화제를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating alzheimer's disease comprising inducer or activator of Miro2}
본 발명은 Miro2를 포함하는 알츠하이머병 진단용 바이오마커 조성물, 또는 Miro2 단백질, 상기 단백질의 발현 촉진제 또는 활성화제를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
사람의 수명이 늘어나고, 고령화 사회로 진행되면서, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 루게릭병과 같은 퇴행성 신경질환이 증가하고 있다. 퇴행성 신경질환은 여러 원인에 의해 뇌세포가 과도하게 사멸하고, 이에 따른 뇌기능의 소실에 의해 발생되는 질환이며, 특히 알츠하이머병 환자에서는 내재적으로 존재하는 성체 신경줄기세포의 숫자와 증식능이 현저히 감소되어 있는 것으로 밝혀져 소실된 뇌세포의 보충이 제대로 이루어지지 않는 것 또한 주요한 병인으로 여겨지고 있다.
알츠하이머병 (Alzheimer's disease; AD)은 기억력, 행동, 언어 및 시공간능력이 점진적으로 감퇴하는 질환이다. 알츠하이머병 환자의 뇌에는 아밀로이드 베타에 의한 플라그 (plaque) 형성이 관찰되고, 과인산화 (hyperphosphorylated) 형태의 타우 (tau)를 함유한 PHFs (paired helical filaments)로 이루어진 세포 내 신경 섬유성 엉김 (neurofibrillary tangles)이 축적되는 특징이 있다. 이로 인하여 뇌조직 전반에 퇴행성 위축이 일어나고 상기와 같은 각종 증상들이 유발된다.
아밀로이드 베타의 존재는 상당한 생화학적인 과정을 변화시켜 다른 단백질의 침착화를 초래하고, 소교세포의 식작용을 활성화시켜 결과적으로 신경세포의 소멸과 지각 손상을 가져온다. 아밀로이드 베타의 진단을 위한 '최소한의 미시적인 판단기준'은 뇌에서 발견되는 아밀로이드 베타 침착의 양에 의존한다. 이러한 신경염 침착의 아밀로이드는 주로 β-시트 구조로 배열되어있는, 39 ~ 43개의 아미노산으로 이루어진 아밀로이드 베타라고 알려진 펩티드로 이루어져 있다.
현재 아밀로이드 베타 펩티드의 생성과 아밀로이드 베타 펩티드로 유도된 산화 스트레스를 저해 또는 억제시키기 위한 연구가 계속되고 있으나 개발된 신소재나 약은 없는 실정이다. 또한, 현재까지 알츠하이머병 약물 개발의 주 표적은 병에서 나타나는 신경전달물질 이상으로 콜린성 신경 세포를 표적으로 한 콜린에스테라제 억제제들 (Aricept, Exelon, Reminyl 등)과 글루타메이트 길항제인 메만틴 (Memantine)이 FDA 승인을 얻어 현재 시판 중에 있는 것이 전부이다. 하지만 상기 언급한 바와 같이 이들 약물은 일시적으로 증상만 완화시킬 뿐이므로 병을 근원적으로 치료하거나 병의 진행 자체를 억제하는 약물 개발 기술이 절실히 요구되고 있다.
한편, Miro2는 두 개의 GTPase domain과 EF hand를 가지며, 미토콘드리아의 바깥쪽 막에 위치하여 미토콘드리아가 미세소관 (microtubule)을 따라 이동하는 것을 조절하는 단백질이다. Miro 패밀리에는 Miro1과 Miro2가 포함되어 있으며 이들은 약 60%의 아미노산 서열의 유사성을 가진다. Miro는 미토콘드리아의 이동 방향에 따라 다이네인 (dynein) 또는 카이네신 (kinesin)과의 상호작용을 통해 작동하며, 그 외에도 TRAK1/2나 syntabulin 등의 단백질들과 상호작용하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 알츠하이머병의 진단, 예방 및 치료에 있어서 Miro2의 역할은 현재까지 보고된 바가 없다.
대한민국 공개특허 제10-2019-0012747호 (2019.02.11. 공개)
본 발명의 목적은 알츠하이머병 진단용 바이오마커 조성물, 또는 알츠하이머병 진단용 키트를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 알츠하이머병 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 알츠하이머병 진단에 필요한 정보 제공 방법, 또는 알츠하이머병 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Miro2 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 알츠하이머병 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 Miro2 단백질의 발현 수준 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 알츠하이머병 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 Miro2 단백질, 상기 단백질의 발현 촉진제 또는 활성화제, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 대상체와 정상 대조군으로부터 분리된 시료로부터 Miro2 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 알츠하이머병이 의심되는 대상체로부터 분리된 시료에 후보 약물을 처리하는 제 1단계; 상기 후보 약물의 투여 전과 후의 Miro2 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제 2단계; 및 정상 대조군 시료와 비교하여 상기 Miro2 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 증가시키는 후보 약물을 선별하는 제 3단계;를 포함하는 알츠하이머병 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서는 Miro2 발현 감소에 의해 해마 신경전구세포의 세포사멸이 유도되고, 미토콘드리아의 기능이 저해되는 것을 확인한 바, Miro2는 알츠하이머병 바이오마커 조성물 또는 알츠하이머병 진단용 키트에 활용될 수 있고, Miro2 단백질, 상기 단백질의 발현 촉진제 또는 활성화제는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 약학 조성물 등으로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 알츠하이머병이 유도된 마우스의 해마와 피질에서 Miro의 발현을 확인한 결과이다.
도 2는 Miro2 발현 감소에 의한 해마 신경전구세포의 세포사멸을 확인한 결과이다.
도 3은 Miro2 발현 감소에 의한 해마 신경전구세포의 오토파지 및 미토파지를 확인한 결과이다.
도 4는 Miro2 발현 감소에 의한 신경전구세포 내 미토콘드리아의 기능 저해를 확인한 결과이다.
본 발명의 발명자들은 알츠하이머병 마우스 모델에서 Miro의 발현이 감소되어 있고, Miro2가 해마 신경전구세포의 세포사멸 및 미토콘드리아 기능 저해를 억제하는 것을 확인한 바, 알츠하이머병 치료제로 활용이 가능함을 확인하며 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서 사용된 용어 "바이오마커"는 알츠하이머병이 발생한 대상체의 조직 또는 세포를 정상 대조군의 조직 또는 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 대조군에 비하여 질환이 발생한 대상체의 조직 또는 세포에서 증가 또는 감소 양상을 보이는 단백질 또는 핵산, 지질, 당지질, 당단백질 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.
본 발명에서 사용된 용어 "시료"는 Miro2 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준에 있어서 정상 대조군과 차이가 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
본 발명에서 사용된 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트 (template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 또한, 프라이머는 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산으로서, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "프로브"는 mRNA 외 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현량을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA (single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA (double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "항체"는 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미하며, 본 발명에서의 항체는 Miro2에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 제조된 것 또는 시판되어 구입한 것이 모두 사용 가능하다. 또한, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 에피토프 (epitope)와 결합할 수 있는 단편 등을 포함한다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미하며, 또한, 인간화 항체 등 특수 항체도 포함한다.
또한, 본 발명의 키트는 마커 성분에 특이적으로 결합하는 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체 (conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소반응 정지용액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "펩티드"는 표적 물질에 대한 결합력 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한, 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물전달 물질로 이용될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "앱타머 (aptamer)"는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산 (DNA, RNA 또는 변형핵산)이다. 앱타머는 고유의 높은 친화성 (보통 pM 수준)과 특이성으로 표적분자에 결합할 수 있다는 특성 때문에 단일 항체와 비교가 되고, 특히 "화학 항체"라고 할 만큼 대체 항체로서의 높은 가능성이 있다.
이에, 본 발명은 Miro2 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 알츠하이머병 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 Miro2 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 알츠하이머병 진단용 키트를 제공한다.
상기 제제는 프라이머, 프로브, 항체, 펩티드 및 앱타머로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
또한, 본 발명은 Miro2 단백질, 상기 단백질의 발현 촉진제 또는 활성화제, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 단백질의 발현 촉진제 또는 활성화제는 Miro2 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 및 천연물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
상기 조성물은 신경전구세포의 세포사멸 및 미토콘드리아의 기능 저해를 억제하여 알츠하이머병을 예방 내지 치료할 수 있다.
본 발명의 조성물이 약학 조성물인 경우, 투여를 위하여, 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형 제제는 상기 유효성분 외에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 과제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로솔, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 시간에 따라 다르지만, 당 업자에 의해 적절하게 선택될 수 있는 바, 상기 조성물의 일일 투여량은 바람직하게는 0.001 mg/kg 내지 50 mg/kg이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 대상체와 정상 대조군으로부터 분리된 시료로부터 Miro2 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 알츠하이머병이 의심되는 대상체로부터 분리된 시료에 후보 약물을 처리하는 제 1단계; 상기 후보 약물의 투여 전과 후의 Miro2 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제 2단계; 및 정상 대조군 시료와 비교하여 상기 Miro2 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 증가시키는 후보 약물을 선별하는 제 3단계;를 포함하는 알츠하이머병 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 제 2단계의 Miro2 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준은 역전사 중합효소 연쇄반응 (reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR), 효소면역분석법 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사능면역분석 (radioimmunoassay), 면역조직화학 (immunohistochemistry), 마이크로어레이 (microarray), 웨스턴 블랏 (western blotting) 및 유세포 분석법 (FACS)으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 알츠하이머병 마우스 모델에서 Miro의 발현 감소
알츠하이머병이 유도된 10개월 된 5xFAD 마우스 [APP KM670/671NL (Swedish), APP I716V (Florida), APP V717I (London), PSEN1 M146L (A>C), PSEN1 L286V, B6SJL strain]의 뇌로부터 해마 (hippocampus)와 피질 (cortex) 조직을 적출하였다. 적출한 조직을 -20℃의 금속동결판 위에 올려 놓고, OCT compound로 조직을 덮은 후 동결시켰다. 이후 동결절편기를 이용하여 조직을 박절하고 슬라이드 글라스에 부착시켰다. 슬라이드 글라스를 건조시킨 다음 -20℃ 아세톤을 이용하여 OCT compound를 제거하고, 4% 파라포름알데하이드로 15분간 조직을 고정시킨 후 PBS로 3회 세척하였다. 이후 blocking buffer (5% Bovine serum albumin)로 1시간 동안 blocking을 수행하고, 1차 항체 (anti-Miro Ab; Thermofisher #PA5-72835, anti-B-4G8 Ab; Biolegend #SIG-39240)와 4℃에서 밤새 반응시켰다. 이후 슬라이드 글라스를 PBS로 3회 세척하고, FITC가 접목된 2차 항체 (Jackson Immuno Research, #111-095-045, #115-095-003)와 차광 상태에서 1시간 동안 반응시켰다. 슬라이드 글라스를 PBS로 3회 세척하고, 수용성 봉입제를 처리하여 마운팅한 후 현미경으로 조직을 관찰하였다.
도 1A는 알츠하이머병이 유도된 마우스의 해마와 피질에서의 Miro 발현을 현미경으로 관찰한 결과이며, 도 1B는 형광 강도를 정량화하여 그래프로 나타낸 것이다.
붉은색 형광을 나타내는 B-4G8 항체는 아밀로이드 베타 (Amyloid beta)를 염색하는데 사용하였는데, 알츠하이머병이 유도된 마우스에서 아밀로이드 베타가 축적되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
더불어, 대조군에 비해 알츠하이머병이 유도된 마우스의 해마와 피질에서 Miro의 발현이 감소되어 있는 것을 확인하였다. 이때 사용된 anti-Miro Ab는 아이소폼 (isoform)인 Miro1과 Miro2를 구분하지 못하는 항체이므로, 도 1에서 확인된 Miro의 발현 수준은 Miro1/2에 해당된다고 볼 수 있다.
특히, 해마는 신경전구세포 (neural progenitor cell)가 많이 존재하는 부위인 바, 상기 세포를 이용하여 다음 실험을 수행하였다.
실시예 2: Miro2 발현 감소에 의한 해마 신경전구세포의 세포사멸 유도
해마 신경전구세포는 6 웰 플레이트에 2 X 105 세포/웰 농도로 접종하고, 하루 동안 배양하였다. 이후 리포펙타민 2000을 이용하여 siCon, siMiro1 또는 siMiro2를 200 nM 농도로 형질주입 (transfection)하고 24시간 동안 배양하였다. 이후 프로피디움 요오드화물 (propidium iodide; PI)을 1 μg/mL 농도로 5분간 처리하고, 염색된 세포들을 계수하여 정량화 하였다.
siRNA 서열 (5'->3')
siCon AUU CUA UCA CUA GCG UGA C
siMiro1 CA GUC UAG AAA CUU GUG UA
siMiro2 GAC UAC GUG GAC CAU CCU A
siRNA를 이용하여 해마 신경전구세포의 Miro1 또는 Miro2의 발현을 감소시킨 결과, 도 2A에 나타낸 바와 같이, siMiro2에 의해 신경전구세포의 세포사멸이 현저하게 유도되는 반면, siMiro1에 의해서는 신경전구세포의 세포사멸이 유도되지 않는 것을 확인할 수 있었다.
다음으로, Miro2의 과발현이 세포사멸을 억제하는지 여부를 확인하기 위해, 리포펙타민 2000을 이용하여 miRCon (Bioneer AccuTarget miRNA negative control #1) 또는 miR-351-5p를 50 nM 농도로 형질주입함과 동시에 rAD-sc-GFP (자체 제작) 또는 rAD-Miro2 (#ADV-221197, Vector biolabs)를 MOI (multiflicity of infection) 10으로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 이후 프로피디움 요오드화물을 1 μg/mL 농도로 5분간 처리하고, 염색된 세포들을 계수하여 정량화 하였다.
miRNA 서열 (5'->3')
miR-351-5p UCC CUG AGG AGC CCU UUG AGC CUG A
그 결과, 도 2B에 나타낸 바와 같이, miR-351-5p에 의해 유도된 세포사멸이 Miro2의 과발현에 의해 현저하게 억제되는 것을 확인하였다. 이는 Miro2가 해마 신경전구세포의 세포사멸에 있어서 억제 효능을 가지고 있음을 보여주는 결과이다.
실시예 3: Miro2 발현 감소에 의한 해마 신경전구세포의 오토파지/미토파지 (autophagy/mitophagy) 유도
해마 신경전구세포는 6 웰 플레이트에 2 X 105 세포/웰 농도로 접종하고, 하루 동안 배양하였다. 이후 리포펙타민 2000을 이용하여 siMiro2를 200 nM 농도로 형질주입 (transfection)하고 24시간 동안 배양하였다. 이후 세포를 고정액 [0.15 M cacodylate buffer (Ted Pella Inc., Redding, CA) pH 7.4 containing 2.5% glutaraldehyde (Electron Microscopy Sciences, Hartfield, PA), 2% paraformaldehyde (fresh from paraformaldehyde (EMS)) with 2 mM calcium chloride]으로 2-3시간 정도 ice에서 고정시켰다. 이후 세포를 cold cacodylate buffer (containing 2 mM calcium chloride)로 3분씩 5회 세척하고, 4 mM calcium chloride와 3% potassium ferrocyanide를 포함하는 0.3 M cacodylate buffer와 동량의 4% aqueous osmium tetroxide를 미리 준비하여, 세포를 넣고 ice에서 1시간 후고정을 수행하였다. 이후 세포를 증류수로 3분씩 5회 세척하고, 1% uranyl acetate (aqueous)에 넣어 4℃에서 밤새 반응시켰다. 이후 세포를 증류수로 3분씩 5회 세척하고, 알코올 시리즈 (30%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 100%)로 각각 30분씩 탈수시켰다.
다음으로 세포에 레진 (resin)을 침투 (infiltration) 시켰다. 간략하게, 에탄올 및 레진을 각각 3:1, 1:1, 1:3 부피비로 제조하고, 세포를 각 단계별로 1시간씩 반응시켰다. 이후 세포를 100% 레진에 넣어 밤새 반응시키고, 다음날 다시 새로운 레진에 넣어 3시간 반응시킨 후, 몰드 (mold)에 넣어 65℃ 오븐에 24시간 이상 굳혔다. 준초박절편 (semi-thin section)을 통해 세포 절편 슬라이드를 제작하고, 톨루이딘 블루 (toluidine blue)로 염색한 후 광학 현미경을 통해 세포를 관찰하였다. 또한, 초박절편 (ultra thin section)을 통해 세포 절편 슬라이드를 제작하고, 그리드 (grid)에 올린 후 2% uranyl acetate와 lead nitrate를 이용하여 이중염색한 후, 전자현미경을 이용하여 세포를 관찰하였다.
도 3A는 siMiro2를 이용하여 해마 신경전구세포의 Miro2의 발현을 감소시킨 후, 오토파지 및 미토파지를 현미경으로 관찰한 결과이이며, 도 3B 및 도 3C는 오토파지 및 미토파지를 정량하여 그래프로 나타낸 것이다.
Miro2의 발현을 감소시켰을 때, 해마 신경전구세포 내 오토파지 및 미토파지가 증가하는 것을 확인한 바, Miro2가 오토파지 및 미토파지의 억제 효능을 가지는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4: Miro2 발현 감소에 의한 미토콘드리아 기능 저해
해마 신경전구세포 (2 X 105 세포/웰)에 리포펙타민 2000을 이용하여 siMiro2를 200 nM 농도로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 이후 미토콘드리아의 막 전위 변화를 분석하기 위하여 JC-1 (2 μM)으로 1시간 동안 세포를 염색한 후 유세포 분석을 수행하였다. 정상적인 미토콘드리아에서 JC-1은 aggregates 형태로 붉은 형광을 나타내나 미토콘드리아 막 전위가 떨어졌을 때는 monomer 형태로 바뀌어 녹색 형광을 나타낸다.
그 결과, 도 4A에 나타낸 바와 같이, siMiro2에 의해 미토콘드리아 막 전위가 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 해마 신경전구세포 (2 X 105 세포/웰)에 siMiro2를 200 nM 농도로 처리하고 24시간 동안 배양한 후에 세포를 회수 (1 X 104)하여 글루코즈가 포함된 배지와 갈락토즈가 포함된 배지에서 90분간 배양하였다. 이후 ATP 검출 시약 (Mitochondrial ToxGlo assay #G8000, Promega)과 반응시켜 루시퍼레이즈 활성 (luciferase activity)을 측정하고, 대조군과 비교하여 상대적인 미토콘드리아 ATP 생성량을 정량화 하였다.
그 결과, 도 4B에 나타낸 바와 같이, siMiro2에 의해 미토콘드리아 ATP 생성량이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
마지막으로, 해마 신경전구세포 (2 X 105 세포/웰)에 siMiro2를 200 nM 농도로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 이후 미토콘드리아의 반응성 산소종 (reactive oxygen species; ROS)의 생성량을 분석하기 위하여 CellRox Green (5 μM)으로 30분 동안 세포를 염색한 후 유세포 분석을 수행하였다. CellRox Green은 ROS 발생시 산화되어 녹색 형광을 나타낸다.
그 결과, 도 4C에 나타낸 바와 같이, siMiro2에 의해 ROS의 생성량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
즉, 상기 결과들로부터, siMiro2가 해마 신경전구세포 내에서 오토파지/미토파지 등의 과도한 발생으로 인해 유도되는 세포사멸을 억제하고, 이러한 기전이 주로 미토콘드리아 기능과 연관되어 있는 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation THE ASAN FOUNDATION <120> Composition for preventing or treating alzheimer's disease comprising inducer or activator of Miro2 <130> ADP-2019-0188 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siCon <400> 1 auucuaucac uagcgugac 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siMiro1 <400> 2 cagucuagaa acuugugua 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siMiro2 <400> 3 gacuacgugg accauccua 19 <210> 4 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-351-5p <400> 4 ucccugagga gcccuuugag ccuga 25

Claims (9)

  1. Miro2 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 알츠하이머병 진단용 바이오마커 조성물.
  2. Miro2 단백질의 발현, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 알츠하이머병 진단용 키트.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 제제는 프라이머, 프로브, 항체, 펩티드 및 앱타머로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 알츠하이머병 진단용 키트.
  4. Miro2 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 삭제
  6. 제 4항에 있어서, 상기 조성물은 신경전구세포의 세포사멸 및 미토콘드리아의 기능 저해를 억제하는 것을 특징으로 하는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. (a) 대상체와 정상 대조군으로부터 분리된 시료로부터 Miro2 단백질의 발현, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 측정 결과를 비교하여 대상체의 Miro2 단백질의 발현 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 보다 낮은 경우 알츠하이머병으로 판단하는 단계;
    를 포함하는, 알츠하이머병 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  8. 알츠하이머병이 의심되는 대상체로부터 분리된 시료에 후보 약물을 처리하는 제 1단계;
    상기 후보 약물의 투여 전과 후의 Miro2 단백질의 발현, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제 2단계; 및
    정상 대조군 시료와 비교하여 상기 Miro2 단백질의 발현, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 증가시키는 후보 약물을 선별하는 제 3단계;
    를 포함하는 알츠하이머병 치료제 스크리닝 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 제 2단계의 Miro2 단백질의 발현, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준은 역전사 중합효소 연쇄반응 (reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR), 효소면역분석법 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사능면역분석 (radioimmunoassay), 면역조직화학 (immunohistochemistry), 마이크로어레이 (microarray), 웨스턴 블랏 (western blotting) 및 유세포 분석법 (FACS)으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 측정되는 것을 특징으로 하는 알츠하이머병 치료제 스크리닝 방법.

KR1020190090452A 2019-07-25 2019-07-25 Miro2 발현 촉진제 또는 활성화제를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 조성물 KR102200536B1 (ko)

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