KR20190054909A - HIF-2α 활성 억제제를 포함하는 연골육종 치료, 전이 또는 재발 억제용 조성물 - Google Patents

Abstract

본원은 HIF-2α 조절을 통한 연골육종 치료, 재발 또는 전이 억제와 관련된 조성물 및 방법을 개시한다. 본원에 따른 조성물 및 방법은 연골육종의 발달 및 전이 과정에서 HIF-2α 억제를 통해 연골육종, 특히 탈분화 연골육종의 치료, 재발 및 전이를 효과적으로 억제할 수 있다.

Description

HIF-2α 활성 억제제를 포함하는 연골육종 치료, 전이 또는 재발 억제용 조성물 {Pharmaceutical composition comprising agent inhibiting the activity of HIF-2α for treating chondrosarcoma, or preventing recurrence and metastasis thereof}

본원은 연골육종의 치료, 재발 또는 전이 억제와 관련된 기술이다.

연골육종(Chondrosarcoma)은 공통적으로 암세포에서 연골 기질을 만들어내는 종양을 의미한다. 연골육종은 골연부에서 발생하는 종양 중 세 번째로 흔하게 발생하는 종양이며 성인에게서 발생하는 골연부에 가장 흔하게 발생하는 종양이다. 골연부암의 100,000명 당 발병율은 0.9명이며, 5년간 생존율은 약 67.7%이다. 악성 연골육종의 10년간 생존율은 29%이고, 재발률은 13%에 달한다. 일반적인 연골육종의 치료법은 수술적 제거가 가장 일반적이고, 수술 후 화학 요법 및 방사능요법으로 치료를 진행한다. 하지만 화학요법과 방사능요법에 대해서는 세포외기질층이 두꺼워 방사능요법에 대해 저항성이 존재하고, 일반적으로 흔하게 사용되는 독소루비신, 시스플라틴과 같은 항암 치료제에 대해서도 항암제가 전달이 효과적이지 못하여, 항암제를 통한 완전한 항암효과를 기대하기 어려운 것을 물론 연골육종 이외의 다른 부작용이 일어날 수 있고, 연골육종 자체에 큰 효과를 가져다주지 못한다.

또한 연골육종 특이적인 치료법도 없다. 현재 3기 연골암 환자 중 70%에서 전이가 발생하고 연골육종 환자 중 13%에서 재발이 일어나기 때문에 연골암의 재발 및 전이를 억제하는 것은 해당 분야에서 큰 과제로 남아있다.

한국 공개특허 2011-0127943호는 HIF-2α(hypoxia-inducible factor-2α) 유전자의 발현을 억제에 관한 것으로, HIF-2α 단백질의 활성을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 개시한다.

따라서 전달효율이 우수하며 연골육종에 특이적인 항암치료, 재발 및 전이를 효과적으로 억제하기 위한 항암제 개발이 시급하다.

본원은 HIF-2α 조절을 통한 연골육종 치료, 재발 또는 전이 억제용 조성물 및 방법을 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 HIF-2α 억제제를 포함하는 연골육종의 치료, 전이 또는 재발 억제용 약학 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서 상기 HIF-2α 억제제는 HIF-2α단백질의 전사 활성을 억제하는 물질로서, 예를 들면, 상기 HIF-2α 억제제는 TC-S7009 [N-(3-Chloro-5-fluorophenyl)-4-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-5-amine], 또는 그 유사체인 PT2385 [((S)-3-((2,2-difluoro-1-hydroxy-7-(methylsulfonyl)-2,3-dihydro-1H-inden-4-yl)oxy)-5-fluorobenzonitrile)], 또는 그 유사체인 PT2385 [((S)-3-((2,2-difluoro-1-hydroxy-7-(methylsulfonyl)-2,3-dihydro-1H-inden-4-yl)oxy)-5-fluorobenzonitrile)] 또는 PT2399 [((S)-3-((7-((difluoromethyl)sulfonyl)-2,2-difluoro-1-hydroxy-2,3-dihydro-1H-inden-4-yl)oxy)-5-fluorobenzonitrile)를 포함한다.

다른 구현예서 본원에 따른 조성물은 항암 화학요법제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면 상기 HIF-2α 억제제는 TC-S7009, 또는 그 유사체인 PT2385 또는 PT2399와 항암 화학요법제 예를 들면 시스플라틴 또는 독소루비신은 병용으로 사용될 수 있다.

다른 구현예에서 HIF-2α 억제제는 상기 HIF-2α유전자의 단백질로의 발현, HIF-2α유전자가 전사된 mRNA를 분해하여, 이로부터 단백질 합성을 억제할 수 있는 siRNA로, 예를 들면 상기 siRNA는 서열번호 1로 표시되는 RNA와 서열번호 2로 표시되는 RNA를 포함하는 ds(double strand) RNA이다

다른 양태에서 본원은 HIF-2α를 과발현하는 세포를 제공하는 단계; 상기 세포에 HIF-2α의 발현 또는 활성을 억제할 것으로 기대되는 시험물질을 처리하는 단계; 및 상기 처리결과, 시험물질을 처리하지 않은 세포와 비교하여, 상기 세포에서 상기 HIF-2α의 발현 또는 활성이 감소한 경우, 상기 시험물질을 연골육종 치료제 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, 연골육종 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

일 구현예에서 상기 세포는 연골육종 세포이다.

다른 구현예에서 상기 연골육종은 탈분화(dedifferentiated) 연골육종이다.

다른 구현예에서 상기 검출하는 단계는 MMP(matrix metalloproteinases)1, MMP2 및 MMP9 발현을 검출하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 검출결과 상기 MMP1, MMP2 및 MMP9 발현이 시험물질을 처리하지 않은 세포와 비교하여 감소한 경우, 상기 시험물질을 연골육종 치료제 후보물질로 선별하는 단계를 추가로 포함한다.

다른 양태에서 본원은 HIF-2α 검출용 물질을 포함하는 연골육종 진단용 조성물을 제공한다.

일 구현예에서 상기 연골육종은 탈분화된 연골육종이다.

또 다른 양태에서 본원은 대상체의 연골육종 진단에 대한 정보를 제공하기 위하여, 상기 대상체로부터 유래된 생물학적 시료를 제공하는 단계: 상기 생물학적 시료에서 HIF-2α의 발현량 또는 활성을 검출하는 단계; 상기 검출결과, 대조군과 비교하여 상기 생물학적 시료에서 상기 HIF-2α의 발현량이 증가 또는 활성이 증가된 경우, 상기 대상체 유래의 생물학적 시료를 연골육종으로 진단하는 단계를 포함하는, HIF-2α 마커의 검출방법을 제공한다.

일 구현예에서, 상기 연골육종은 탈분화된 연골육종이다.

본원은 HIF-2α 조절을 통한 연골육종 치료, 재발 또는 전이 억제와 관련된 기술로, 본원에 따른 조성물 및 방법은 연골육종의 발달 및 전이 과정에서 HIF-2α 억제제를 이용해 HIF-2α의 활성을 조절하여 연골육종의 재발 및 전이를 효과적으로 감소시키는 것으로 HIF-2α 억제제를 연골육종의 치료제로 사용 할 수 있다. 본원에서는 HIF-2α 억제제로서 일 구현예에서 예로서 TC-S7009(CAS number 1422955-31-4)를 사용하여 인비보 및 인비트로 실험에서 HIF-2α 억제에 의한 연골육종 성장 및 전이 억제효과를 확인하였다.

도 1a 내지 도 1h는 HIF-2α가 연골육종 악성 종양을 관장하는 유전자 모듈의 상류 조절 인자임을 나타내는 결과이다.
도 1a는 연골육종 환자의 전사체 데이터(GSE12475)를 이용하여 WGCNA에 의해 M1(cyan), M2(purple), M3(green)의 3가지 유전자 모듈이 동정되었다. IPA를 사용하여 각 모듈과 관련이있는 암 촉진(CP) 주석을 분석했다. 각 모듈에 대해 상위 10개의 CP 주석은 P 값의 순서로 정렬되고 해당 활성화 Z- 점수와 함께 플롯된다. -log₁₀ (P 값)> 2를 컷오프로 사용했다.
도 1b는 연골육종에서 M1 모듈의 예측된 상류 조절 인자. 왼쪽 패널: M1 모듈과 관련된 CP 주석의 업스트림 조절기가 IPA에 의해 분석되었다. 예측 된 업스트림 조절인자는 링크 된 노드의 활성화 z- 점수의 합에 따라 녹색에서 빨간색으로 색으로 구분된다. 오른쪽 패널: HIF-2α에 의해 조절되는 대표적인 CP 주석이 활성화 Z 점수의 순서로 정렬되었다.
도 1c는 Ad-Epas1에 감염된 일차 배양 된 마우스 연골 세포에서 얻은 전사체 데이터를 Ad-Ctrl(GSE73659)에 감염된 비교군 비교하여 M1 모듈 유전자 세트로 GSEA를 수행했다.
도 1d는 Visant로 시각화 된 M1 모듈 유전자의 네트워크 연결. 허브 유전자는 네트워크의 중심쪽에 위치한다. HIF-2α의 표적 유전자는 연골 세포에서 HIF-2α를 과발현한 전사체 데이터 세트(GSE73659)에 기초하여 결정되었다.
도 1e 내지 g는 연골육종 환자에서 유래한 정상 연골 조직 및 연골육종 조직의 조직학 및 IHC 분석 결과로, 도 1e는 정상 관절 연골, 잘 분화 된 연골육종 및 탈분화성 연골육종 표본에서 HIF-2α에 대한 H&E, Safranin-O 염색 및 IHC의 대표적인 이미지. 스케일 바 = 50μm 이고, 도 1f는 적응 Hirsch index (H- index)에 의해 채점된 분화된 연골육종(n = 45) 및 탈분화 연골육종(n = 20)에서의 HIF-2α 발현의 정량화를 나타내는 점선(P <.001) (Pirker R, Pereira JR, von Pawel J, et al. EGFR expression as a predictor of survival for first-line chemotherapy plus cetuximab in patients with advanced non-small-cell lung cancer: analysis of data from the phase 3 FLEX study. Lancet Oncol. 2012;13(1):33-42., Al-Akhrass H, Naves T, Vincent F, et al. Sortilin limits EGFR signaling by promoting its internalization in lung cancer. Nat Commun. 2017;8.)이고; 도 1g는 HIF-2α에 대한 염색 강도는 3가지 카테고리로 등급이 매겨졌다. 분화가 잘되고 탈분화 된 연골육종 중 각 카테고리의 표본 비율은 파이 그래프로 표시된다. Fisher 's exact test는 두 연골육종 군간의 유의 한 통계적 차이를 측정하기 위해 시행되었다 (P <.001).
도 1h는 환자는 HIF-2α 활성화 상태를 나타내는 주성분 축의 값을 기반으로 k- 평균 클러스터링을 수행하여 그룹화되었다. 환자 제 1군과 제 2군은 각각 HIF-2α 활성이 높은 연골육종 환자를 나타낸다. 환자 임상 정보는 표 1에 요약되어있다. Error bars are ± SEM, and the two-sided Student's t test was used to generate P values; M = module; WGCNA = weighted gene co-expression network analysis; CP = cancer-promoting; IPA = ingenuity pathway analysis; GSEA = geneset enrichment analysis; NES = normalized enrichment score; P = P value; Ad = adenovirus; Ctrl = control; H&E = hematoxylin and eosin; IHC = immunohistochemistry; yr = year; OS = overall survival.
도 2a 내지 도 2f는 HIF-2α가 정형 마우스 모델에서 연골육종의 전이성을 촉진하는 것을 나타내는 결과이다.
도 2a는 상단 패널: 연골육종 동성체 마우스 모델의 도식적 표현. 하부 패널: SW1353 이종 이식에 따른 경골 골수 강내에서 형성된 일차 연골육종 종양을 사프라닌 -O / 헤마톡실린으로 염색 하였다. 스케일 바 = 100μm.
도 2b는 이종 조직 SW1353 세포에서 유래한 원발성 및 폐 전이성 연골육종에 대한 조직학 및 IHC 분석. 노란색 화살촉은 HIF-2α 양성 세포를 나타낸다. 눈금 막대 = 25μm.
도 2c는 왼쪽 패널: 원발 종양 및 폐 전이성 조직에서 Lamin B, 인간 미토콘드리아 및 HIF-2α의 다색 면역 형광. 스케일 바 = 20μm. 우측 패널: 원발성 및 전이성 SW1353 종양 중 HIF-2α 및 인간 미토콘드리아에 대한 이중 양성 세포의 비율 (P <.001, n = 6).
도 2d는 HIF-2α knockdown 연구에 사용 된 연골육종 이종 이식 모델의 개략도이다.
도 2e는 왼쪽 패널: SW1353 - shCtrl 또는 SW1353 - shEPAS1 세포와 xenografted 경골의 대표적인 매크로 이미지. 조직 학적 이미지는 Safranin-O / hematoxylin을 사용하여 얻었다. 스케일 바 = 50mm (상단), 50μm (하단). 오른쪽 패널: 관골 뼈의 골수 내강(intramedullary region)에서 기원하고 주변 근육 조직(n = 6)으로 침범 된 extraosseous outgrowth를 갖는 마우스의 비율.
도 2f는 좌측 패널: 폐에서 연골육종 세포의 전이 성장을 H&E 염색으로 검사 하였다. 스케일 바 = 50μm. 중간 패널: 폐 전이가 있는 쥐의 수를 세고 백분율(n = 6)으로 그렸다. 우측 패널: 동물 당 폐의 전이 병소의 수를 세었고 도트 플롯(P = 0.03, n = 6)을 사용하여 플로트했다. Error bars는 ± SEM 이고, two-sided Student's t test를 사용하여 P 값을 계산하였다; *P < .05, ***P < .001. P = P value; EP = epiphyseal plate; H&E = hematoxylin and eosin; IHC = immunohistochemistry; IF = immunofluorescence; T = tumor; B = bone; L = lung; shCtrl = control shRNA; shEPAS1 = EPAS1 shRNA.
도 3a 내지 도 3d는 HIF-2α가 연골육종 세포에서 암과 관련된 전형적인 진셋(geneset)을 조절한다는 결과를 나타낸다. 도 3은 세포 수준에서 siRNA로 HIF-2α의 발현을 감소시킨 뒤, 세포 내의 전체 mRNA의 발현 패턴을 분석한 결과이다. HIF-2α 억제로 발현양이 유의미하게 감소한 유전자들은 특히 일반적으로 암의 전이나 발생과 관련있다고 알려진 EMT(상피간엽이행), apoptosis(세포 사멸), p53 pathway(p53 신호전달체계)와 관련된 것으로 밝혀졌다. 특히 상피간엽이행은 전이와 관련이 있고, 상피간엽이행이 일이난 세포들은 더 쉽게 전이를 일으킬수 있다고 알려져있기 때문에 HIF-2α를 억제함으로써 암의 전이를 억제시킬 수 있음을 나타낸다. 또한 HIF-2α의 억제로 인해 세포사멸과 p53 신호전달체계와 관련된 유전자들의 발현이 증가한 것으로 나타났다. 이는 HIF-2α가 세포 수준에서 간접적으로 세포사멸과 p53 신호전달체계에 관련된 유전자들을 감소시킨다는 것을 의미한다. 구체적으로, HIF-2α의 억제를 통해 세포사멸을 유도하거나 p53 신호전달체계와 관련된 유전자들의 발현이 증가됨으로써 암세포의 성장 능력(proliferation)을 감소시키고, 암세포의 성장이나 전이 과정 중에 생존(survival)을 감소시킬 수 있음을 나타낸다. p53 신호전달체계는 일반적으로 세포의 성장을 억제하는 신호전달체계로 알려져 있고, p53 자체가 종양억제제로 매우 잘 알려져 있다. 따라서, siRNA를 이용한 HIF-2α의 억제로 연골육종의 성장 및 전이, 생존을 억제할 수 있음을 나타낸다.
도 3a는 SW1353 세포에서 HIF-1α 또는 HIF-2α knockdown 후 특이적으로 하향 조절 된 유전자의 Venn diagram이다.
도 3b는 GSEA 결과로, 이는 HIF-1α(상단) 또는 HIF-2α(하단) 낙다운을 수행한 SW1353 전사체를 사용하여 M1 모듈 유전자 세트(도 1A)로 수행했다.
도 3c는 MSigDB 'hallmark'genesets을 사용하여 HIF-2α 낙다운에 대한 전 사체 변화의 경로 농축 분석을 수행한 결과이다 (Liberzon A, Birger C, Thorvaldsdottir H, Ghandi M, Mesirov JP, Tamayo P. The Molecular Signatures Database (MSigDB) hallmark gene set collection. Cell Syst. 2015;1(6):417-425.). 각 상자는 개별적인 유전자 기호를 나타내며 NES 값에 대해 색으로 구분 된다. 파란색과 노란색 색상은 각각 음의 농도와 양의 농도를 나타낸다.
도 3d는 HIF-2α 낙다운 후 SW1353 세포의 상피 간엽 전이 (EMT) geneset 중에서 50개까지의 발현이 감소된 유전자의 히트맵과 세포사멸과 p53 경로 genesets 에서 발현이 증가된 50개의 유전자이다. GSEA = geneset enrichment analysis; M = module; Ctrl = control; NES = normalized enrichment score; P = P value; MsigDB = the molecular signatures database; FC = fold change.
도 4a 내지 도 4l은 HIF-2α가 연골육종 세포의 침윤성 및 종양 개시능을 부여한다는 결과를 나타낸다.
도 4a는 좌측 패널: ctrl 또는 EPAS1 shRNA를 보유하는 렌티 바이러스로 형질 도입 된 SW1353 세포를 사용한 트랜스웰 침투 분석으로부터의 크리스탈 바이올렛 염색의 대표적인 이미지. 스케일 바 = 200μm. 우측 패널: 침투 분석은 ctrl 또는 EPAS1 shRNA를 발현하는 SW1353 (P = .05, n = 3) 및 OUMS-27 (P = .005, n = 4) 세포를 사용하여 수행 하였다. 침입 된 세포의 수를 무작위 이미지 필드에서 계수하고 ctrl shRNA를 발현하는 세포의 수에 비례하여 표준화 하였다.
도 4b는 세포 이동 분석은 표시된 shRNA를 발현하는 SW1353 (n = 3) 및 OUMS-27 세포 (n = 4)를 사용하여 수행 하였다. SW1353 세포로 수행된 이동 분석의 대표적인 이미지가 왼쪽 패널에 표시되어있다 (P = N.S.). 스케일 바 = 200μm.
도 4c는 EPAS1, MMP1, MMP2 및 MMP9 유전자의 상대적 mRNA 수준은 표시된 안정한 세포주에서 qRT-PCR을 이용해 측정되었다 (P = .02 (EPAS1), P = .009 (MMP1), P = .02 (MMP2), P = .01 (MMP9), n = 7).
도 4d는 상대적인 총 MMP 활성은 eGFP 또는 HIF-2α를 과발현하는 SW1353 세포에서 MMP 활성 분석으로 측정 하였다 (P <.001, n = 6).
도 4e는 좌측 패널: 젤라틴 분해 분석은 ctrl 또는 EPAS1 shRNA를 발현하는 SW1353 세포로 수행 하였다. 핵은 DAPI로 염색되었다. 스케일 바 = 100μm. 오른쪽 패널: 상대적인 젤라틴 분해 영역을 ImageJ를 사용하여 측정하고 대조군 영역으로 표준화 하였다 (P <.001, n = 4).
도 4f는 대조군 또는 EPAS1 siRNA로 전달이입된 SW1353 세포의 전사체 데이터를 이용한 암 줄기 세포 유전자세트로 수행된 GSEA 결과이다.
도 4g는 왼쪽 패널: 단층 또는 구로 성장한 연골육종 세포주 SW1353 (P <.001, n = 9) 및 OUMS-27 (P = .04, n = 9)에서 EPAS1 전사량의 qRT-PCR을 이용한 분석. 우측 패널: 단일 층 또는 구 (GSE47823) (n = 2)로 성장한 1차 연골육종 세포에서의 EPAS1의 상대적 발현 수준.
도 4h 및 도 4i는 ctrl 또는 EPAS1 shRNA를 발현하는 렌티 바이러스로 형질 도입 된 SW1353 및 OUMS-27 세포의 구체 형성 분석으로 h는 표시된 shRNAs를 발현하는 SW1353의 구형 형성 분석의 대표 이미지, 그리고 구의 개수와 직경 (P = .03, n = 6)에 대한 그래프. 스케일 바 = 200μm; i는 구의 수와 직경은 표시된 shRNA를 발현하는 OUMS-27 세포에서 측정 결과이다 (P = .02, n = 5).
도 4j는 eGFP 또는 HIF-2α 를 과발현하는 SW1353 세포에서 다능성 마커의 상대적인 mRNA 수치 (P = .02 (NANOG), P = .02 (SOX2), P = .02 (OCT4), P = .02 (CD44) n = 7)이다.
도 4k는 에서 왼쪽 패널: ctrl 또는 EPAS1 shRNA (왼쪽, P = 0.03, n = 4)를 발현하는 SW1353 세포에 의한 콜로니 형성 분석의 대표 이미지 및 정량화 결괴이고, 오른쪽 패널은 콜로니의 수는 표시된 shRNA를 발현하는 OUMS-27 세포에서 측정된 결과이다(오른쪽, P = .01, n = 6).
도 4l은 연골육종 전이를 강화시키는 HIF-2α의 역할을 도식적으로 나타낸 것이다.
Error bars는 ± SEM이고, two-sided Student's t test 또는 ANOVA 를 사용하여 P 값을 구하였다; N.S. = non-significant, *P < .05, **P < .01, ***P < .001. Ctrl = control; GSEA = geneset enrichment analysis; NES = normalized enrichment score; P = P value; IPA = ingenuity pathway analysis; shCtrl = control shRNA; shEPAS1 = EPAS1 shRNA.
도 5a 내지 도 5l은 HIF-2α의 약리학적 억제가 연골육종에서 시스플라틴의 항 종양 억제 효과를 강화시킨다는 결과를 나타낸다.
도 5a는 DMSO 또는 10μM TC-S7009로 처리한 SW1353 세포를 사용한 Transwell 침투 분석 결과이다. 대표 이미지를 표시하고, 침입 세포의 숫자는 임의의 이미지 필드에서 계산하고 DMSO (P = 0.02, n = 3)를 처리한 세포의 수로 상대적인 표준화를 진행했다. 스케일 바 = 200μm.
도 5b는 SW1353 세포에서 DMSO 또는 10μM TC-S7009 처리 후 젤라틴 분해 분석 (P <.001, n = 3)에서 얻은 대표적인 이미지와 상대적인 분해 영역이다. 스케일 바 = 50μm.
도 5c는 DMSO 또는 10μM TC-S7009로 처리한 SW1353 세포를 사용한 구형 형성 분석 결과이다. 대표적인 이미지를 표시하고 구 직경을 측정했다. Box-whisker 플롯이 데이터를 나타내기 위해 사용되었다. 스케일 바 = 200μm.
도 5d는 DMSO 또는 10μm의 TC-S7009 (P <0.001, n = 5)로 치료 SW1353 세포의 콜로니 형성 분석의 대표 이미지와 정량 결과이다.
도 5e는 비히클, TC-S7009, 시스플라틴 또는 TC-S7009 및 시스플라틴을 병용 투여한 후 Annexin-V 및 propidium iodide로 염색한 SW1353 세포의 유동 세포 계측법으로 측정한 결과로 세포 사멸 세포의 백분율을 나타내었다.
도 5f에서 CI는 3가지 다른 병용 요법으로 계산되었다. 세포 생존률은 Nutlin-3a, ABT-888 또는 TC-S7009의 시스플라틴과의 조합 처리 후 MTT 분석에 의해 측정되었다. CI 값은 부가 효과(CI = 1), 상승 작용(CI <1) 및 길항 작용(CI> 1)에 대해 정량적으로 정의되었다.
도 5g는 HIF-2α 억제제, TC-S7009와의 병용 화학 요법의 개략도이다. 쥐에게 DMSO(n = 5), 시스플라틴(n = 5), TC-S7009(n = 5) 또는 시스플라틴 + TC-S7009(n = 5)를 8회 복강 내 주사하였다. 연골육종 세포의 동종 이종이식 후 2주가 지난 뒤 주 2회 주사하였다.
도 5h는 경골의 대표적인 육안 및 조직학적 이미지이다. 절편은 Safranin-O와 hematoxylin으로 염색되었다. 스케일 바 = 50mm (상측), 100μm (왼쪽 아래), 500μm (오른쪽 아래).
도 5i는 관상 뼈의 골수 내 위치에서 기원 한 골외 성장(outgrowth)을 나타낸 쥐의 백분률이다.
도 5j는 폐의 연골육종 세포의 전이성 성장을 H&E 염색으로 확인하였다. 황색 화살촉은 폐의 전이 영역을 나타낸다. 스케일 바 = 100μm.
도 5k는 폐 전이가 있는 생쥐의 수를 세고 백분율(n = 5)로 그렸다.
도 5l은 동물 당 폐의 전이 병소의 수를 계수하고 도트 플롯(n = 5)으로 플로팅 하였다.
Error bars는 ± SEM이고, two-sided Student's t test 또는 ANOVA를 사용하여 P 값을 계산하였다; *P < .05, ***P < .001. P = P value; CI = combination index; H&E = hematoxylin and eosin.
도 6a 내지 도 6e는 HIF-2α 경로의 분자들의 카피 수 변경은 연골육종 환자의 예후와 관련이 있다는 결과를 나타낸다.
도 6a는 GLAD에 의해 추론 된 각 1차 연골육종의 분절 된 카피 수 이다. 연골육종이 있는 67명의 환자 샘플에 대한 smoothed copy number 데이터가 표시되었다. 연골육종 환자는 유전적 불안정성 지표인 genomic instability indicator의 염색체간 변이 정도에 따라 불안정한 정도가 낮은(n = 22), 중간인(n = 23), 높은(n = 22) 그룹으로 나누었다. 화살촉과 열린 화살촉은 각각 HIF1A와 EPAS1 유전자 위치를 나타낸다. CNA: 증폭(적색), 중성(흰색) 및 결실(파란색).
도 6b 및 도 6c는 67명의 환자의 전체 및 무 재발 생존의 Kaplan-Meier 플롯 결과로, 6b 는 HIF1A 및 6c는 EPAS1 유전자 위치의 카피 수 상태에 의해 층화 되었다. 통계적 유의성은 log-rank test를 사용하여 계산 하였다. 결실(HIF1A, n = 9, EPAS1, n = 16), 안정(HIF1A, n = 18, EPAS1, n = 27) 및 증폭(HIF1A, n = 24). 통계적 유의성은 log-rank test를 사용하여 계산 하였다.
도 6d는 EPAS1 및 VHL 유전자좌의 CNA 상태에 기초한 67명의 환자 분류 기준의 개략도이다. 제 1군은 제 2군에 비해 HIF-2α 경로 과잉 작용을 일으킬 것으로 예상되는 환자군에 해당한다.
도 6e는 Kaplan-Meier 플롯은 그룹별로 층화된 67명의 환자의 전체 및 무 재발 생존율을 나타낸다. 통계적 유의성은 log-rank test를 사용하여 계산 하였다.
SV = smoothing value; GLAD = gain and loss analysis of DNA; CNA = copy number alteration; pVHL = von Hippel-Lindau tumor suppressor; PHD = prolyl hydroxylase domain-containing protein; P = P value.
도 7은 본원의 한 구현예에 따른 뼈 및 연골 종양에서의 HIF-2α 발현 프로파일링에 대한 결과를 나타낸다. A) osteochondroma, 연골 육종 및 연골 육종 표본에서 HIF-2α에 대한 Safranin-O, H&E 및 IHC. 스케일 바 = 25μm. B) 연골 육종 transcriptome 데이터(GSE12475)를 사용하여 연골 육종 환자를 HIF-2α 활성화 상태를 나타내는 주성분 축의 값에 따라 k-means clustering을 수행하여 G1과 G2 두 그룹으로 나누었다. HIF-2α 활성화 상태는 M1 모듈에 포함 된 HIF-2α 표적 유전자의 발현 수준에 따라 결정되었다. H&E = hematoxylin and eosin; IHC = immunohistochemistry; G = group; M = module; IPA = ingenuity pathway analysis; PCA = principal component analysis; Dim = dimension.
도 8은 본원의 한 구현예에 따른 연골 육종 세포의 이동에 영향을 주지 않으면서 기질 분해 효소의 발현을 조절하는 HIF-2α의 기능에 대한 결과이다. A) 표시된 shRNA가 있는 렌티 바이러스(n = 6)로 형질 도입 된 SW1353 세포의 이동 분석. 세포 이동의 대표적인 이미지가 표시됩니다. Image-Pro Premier 소프트웨어를 사용하여 세포가 이동한 영역을 정량화하기 위해 이미지를 분석했다. 스케일 바 = 200μm. B) 검정색 상자는 TRANSFAC® (GeneXplain GmbH) 데이터베이스에 의해 HIF 결합 사이트로 예측되는 HRE 시퀀스를 나타냅니다. 회색 상자는 프로모터에 HRE 시퀀스가 있는 사이트를 나타낸다. C) 연골 육종 환자에서 HIF family와 MMP1, MMP2 및 MMP9 유전자의 전사 수준 사이의 상관 관계를 보여주는 그래프 (GSE12475). R 및 P 값은 피어슨 상관 관계에 기초하여 계산되었다. P = P value; Ctrl = control; MMP = matrix metalloproteinase; HRE = hypoxia response element; TRANSFAC = TRANScription FACtor database; HIF = hypoxia inducible factor; TSS = transcription start site.
도 9는 본원의 한 구현예에 따른 HIF-2α의 잠재적 HIF 결합 부위를 갖는 다능성 인자의 발현을 증가시킴으로써 연골 육종 세포의 줄기를 부여한다는 결과를 나타낸다. A) 구체 형성 분석은 ctrl 또는 EPAS1 shRNA를 포함하는 렌티 바이러스로 형질 도입 된 SW1353 세포로 수행 하였다. 세포는 B-27 (2%), EGF (20 ng/ml) 또는 bFGF (20 ng/ml)의 존재 또는 부재하에 처리 하였다. 이미지는 세 가지 독립적인 실험을 대표한다. 스케일 바 = 200μm. B) 검정색 상자는 TRANSFAC® (GeneXplain GmbH) 데이터베이스에 의해 HIF 결합 사이트로 예측되는 HRE 시퀀스를 나타냅니다. 회색 상자는 프로모터에 HRE 시퀀스가 있는 사이트를 나타냅니다. EGF = epidermal growth factor; bFGF = basic fibroblast growth factor; shCtrl = control shRNA; shEPAS1 = EPAS1 shRNA; HRE = hypoxia response element; TRANSFAC = TRANScription FACtor database; HIF = hypoxia inducible factor; TSS = transcription start site.
도 10은 본원의 한 구현예에 따른 HIF-2α 과발현이 세포 배양 및 이종 이식 모델에서 연골 육종 세포의 전이성 행동을 촉진한다는 결과를 나타낸다. A) 상부 패널: eGFP 또는 HIF-2α를 과발현하는 SW1353 안정 세포주의 대표적인 위상 - 대조 이미지. 스케일 바 = 150μm. 하부 패널: 안정한 세포주에서의 EPAS1의 상대적 발현 수준. B) eGFP 또는 HIF-2α를 과발현하는 SW1353 세포(왼쪽 패널)를 사용하여 트랜스 웰 침투 분석의 크리스탈 바이올렛 염색의 대표 이미지. 스케일 바 = 200μm. 침범 된 세포를 무작위 이미지 필드에서 계수하고 대조군과 비교하여 평준화 시켰다 (우측 패널, P = .04, n = 5). C) 이동 분석은 eGFP 또는 HIF-2α를 갖는 지시 된 렌티 바이러스로 형질 도입 된 SW1353 세포를 사용하여 수행 하였다. 스케일 바 = 100μm. 상처 형성 후 0시간과 24시간 후에 영상을 촬영하였고 (왼쪽 패널), 상처 형성 후 12시간 후에 이동 된 영역을 측정 하였다 (오른쪽 패널, P = N.S., n = 6). D) eGFP 또는 HIF-2α를 과발현하는 SW1353 세포의 구형 형성 분석. 대표 이미지가 표시되고, 구의 수와 직경이 측정되었다. 스케일 바 = 200μm. 세포는 무 혈청 배지에서 성장시켰다 (P = .05, n = 6). Box-whisker 플롯이 데이터를 나타내기 위해 사용되었다. E) 표시된 렌티 바이러스로 형질 도입 된 SW1353 세포의 콜로니 형성 분석 정량. 콜로니는 크리스탈 바이올렛 염색(오른쪽 패널) 후 계산되었고, 대표 이미지(왼쪽 패널) (P = .04, n = 9) 제시됩니다. F) HIF-2α 과발현 연구에 사용 된 연골 육종 이종 이식 모델의 개략도. eGFP 또는 HIF-2α를 과발현하는 SW1353 세포(마우스 1 마리당 1 Х 10⁵개)를 누드 마우스에 정위적으로 주입하고 7주 후에 분석 하였다. G) 폐의 연골 육종 세포의 전이성 성장은 H&E 염색으로 검사하였다. 스케일 바 = 200μm. H) 폐 전이가 있는 쥐의 수를 세었고 백분율 (n = 6, eGFP # 1, 5, eGFP # 2, 6, EPAS1 # 1, 4, EPAS1 # 2)에 의해 나타내었다. I) 동물 당 폐의 전이 병소의 수를 세고 도트 플롯을 사용하여 플로트 하였다 (n = 6, eGFP#1; 5, eGFP#2; 6, EPAS1#1; 4, EPAS1#2). Error bars are ± SEM, and the two-sided Student's t test or ANOVA was used to generate P values; N.S. = non-significant, *P < .05. P = P value; HIF = hypoxia inducible factor; H&E = hematoxylin and eosin.
도 11은 본원의 한 구현예에 따른 HIF-2α 억제제 TC-S7009는 세포 생존력 및 이동 능력에 영향을 주지 않고, HIF-2α의 전사 활성 및 종양 유발 잠재 성을 효과적으로 차단한다는 결과를 나타낸다. A) SW1353 세포를 pcDNA3 또는 pcDNA3-EPAS1 및 HRE를 함유하고 있는 리포터 플라스미드를 트렌스펙션 시켰다. TC-S7009를 농도별로 투여했고, HRE 리포터 활동은 Renilla 루시퍼 라제 활성으로 정상화되었다 (P <.001, n = 5). B) SW1353 세포 (P = N.S., n = 3)의 세포 생존 능력에 대한 TC-S7009의 효과를 시험하기 위한 Trypan blue 배제 분석. C) TC-S7009의 다양한 농도 혹은 부재 하에서 SW1353 세포의 콜로니 형성 분석. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 계산 된 콜로니 수 (P <.001, n = 5). D) DMSO 또는 10μM TC-S7009로 처리 한 SW1353 세포를 사용하여 수행 된 이동 분석. 대표 이미지가 표시되고(왼쪽) Image-Pro Premier 소프트웨어 (P = N.S., n = 6)를 사용한 상대적인 마이그레이션 영역을(오른쪽)이 결정했다. Scale bar = 200μm. Error bars are ± SEM, and the two-sided Student's t test or ANOVA was used to generate P values; N.S. = non-significant, ***P < .001. HRE = hypoxia response element; P = P value.
도 12는 본원의 한 구현예에 따른 2번 염색체상의 EPAS1 유전자좌의 카피넘버 변화(CNA)에 대한 프로파일링 결과를 나타낸다. 연골 육종 환자 67명을 대상으로 CNA 프로파일을 조사한 결과, EPAS1의 카피 수 상태: 결실(녹색, n = 16), 안정(황색, n = 27), 증가(빨간색, n = 24)에 따라 3 그룹으로 분류하여 순서대로 나열되었다. Inlets는 EPAS1 유전자좌에서 결실, 안정, 또는 복제 수의 증가를 포함하는 환자의 2번 염색체에 대한 대표적인 게놈 프로필이다. 화살촉은 2번 염색체의 EPAS1 위치를 나타낸다. Inlet 이미지의 수직의 점선 빨간색 선은 GLAD로 감지 된 중단점을 나타냅니다. 할당 된 상태는 컬러 코드로 표시됩니다. Chr2 = chromosome2; GLAD = gain and loss analysis of DNA.

본원은 연골육종, 특히 탈분화 연골육종의 발달, 전이 및 재발에 있어서 HIF-2α가 핵심 인자임을 규명한 발견을 기초로 한 것이다. 구체적으로 HIF-2α는 악성 탈분화 연골육종을 일으키는 유전자 모듈의 전사 인자로서 연골육종 세포에 침윤성 및 종양-개시능을 부여하는 것임을 규명하였다. 마우스 모델에서, HIF-2α의 억제는 연골육종의 골외 성장(extraosseous outgrowth) 및 폐 전이를 억제하는 것으로 나타났다. 또한 기존 화학요법 제제와 함께 사용시, 본원에 따른 HIF-2α의 활성 억제는 마우스에서 연골육종 세포의 세포사멸에 대한 상승효과를 가져오며, 악성 연골육종을 제거하는 것으로 나타났다. 또한 HIF-2α 경로의 EPAS1 유전자의 CNA(Copy Number Alteration)가 질병 불량한 예후와 밀접한 관련이 있음을 발견하였다.

이에 한 양태에서 본원은 HIF-2α 억제제를 포함하는 연골육종 치료, 전이억제 또는 재발 억제용 조성물이다.

HIF (Hypoxia Induced Factor)-1α 및 HIF-2α는 저산소 상태에서 발현이 증가해 저산소에 대한 세포의 반응을 주도하는 인자이다. HIF-1α는 GLUT1 발현을 통한 glucose 유입 증가와 VEGF 발현을 통한 혈관 유도로 glucose 공급을 늘려 암세포의 증식 유도한다. 암세포의 특이적인 물질대사 과정인 Warburg effect는 HIF-1α의 조절을 받으며, 무산소 호흡을 통한 빠른 에너지원 공급, 아미노산, 지방, 핵산 등의 생합성을 촉진해 세포 증식에 필수적인 물질을 생산한다. HIF-2α는 HIF-2α 경로의 하위 유전자의 프로모터에 결합하여 이들 유전자의 전사체로의 전사(transcription)를 조절하는, 관절염 상황에서 MMP 등의 효소 발현을 촉진해 연골기질 분해하는데 관여하는 것으로 알려져있으나, 연골육종, 특히 탈분화 연골육종의 발생, 전이, 재발과 관련성은 알려져 있지 않다.

연골육종은 연골을 형성하는 악성종양으로, 골육종 다음으로 흔한 골종양이며 원발성 악성 골종양의 10-20%를 차지한다. 발생 위치는 골반골에 가장 호발하고 대퇴골, 상완골, 늑골 등에 발생한다. 종류는 선행병변이 없이 발생하는 원발성과 내연골종이나 골연골종 등의 악성변화에 의한 속발성 연골육종으로 구분된다. 또한편 발생 부위에 따라 골 내부에서 발생한 중심성 연골육종과 표면에서 발생하는 말초성 연골육종으로 분류될 수 있다. 조직학적 분류로는 관례성(conventional), 간엽성(mesenchymal), 점액성(myxoid), 미분화성(dedifferentiated) 및 투명세포성(clear celll)으로 분류할 수 있다.

연골육종은 전이성 잠재력이 거의없는 저등급 종양에서부터 전이성 전이 및 재발을 특징으로 하는 고등급의 탈분화된 공격성 종양에 이르기까지 다양하며 치료가 불가능하여 예후가 나빠질 수 있다. 연골육종은 조직학적 방법에 따라 분류될 수 있으며, 임상적 양태 및 예후에 있어서 중요하다 악성 연골육종은 핵 크기, 염색 패턴(hyperchromasia), 세포분열 활성 및 세포질 정도를 기준으로 1 내지 3등급으로 등급이 매겨질 수 있다 (Chondrosarcoma of the pelvis. A review of sixty-four cases. AUPring ME, Weber KL, Unni KK, Sim FH SOJ Bone Joint Surg Am. 2001;83-A(11):1630).

특히 고등급 연골육종은 탈분화 연골육종을 포함한다. 탈분화 연골육종은 저등급의 악성 히알린 연골종양과 저등급 연골육종 및 고등급의 탈분화 연골육종이 혼합되어 있다. 고등급의 탈분화 연골육종은 미분화 육종, 골육종, 혈관 육종, 섬유 육종, 횡문근 육종, 평활근 육종 및 거대 세포 종양의 특징을 포함하여 다양한 특징을 가지고 있다. 탈분화 연골육종은 매우 나쁜 예후를 보이는 심각한 악성 종양이다. 평균 생존 기간은 6개월 정도로 짧고, 5년간 환자 생존율은 10%에서 13%로 낮다. 수술로부터 2년 이후까지 살아남는 환자들은 매우 적다 (The molecular pathogenesis of dedifferentiated chondrosarcoma. Akio Sakamoto Indian J Orthop. 2014 May-Jun; 48(3): 262-265).

본원에 따른 억제제는 연골육종 조직에서 발현하고 있는 HIF-2α 단백질의 활성을 억제할 수 있는 다양한 물질이 포함될 수 있다. HIF-2α 단백질은 여러 암에서 발현이 증가하고, 이합체 형태로 작용하는 전사인자이며, HIF-2α 경로의 하위 단계의 유전자의 전사를 조절한다. HIF-2α 억제재는 HIF-2α의 구조 중 PAS-B 부위에 붙음으로써, HIF-2α의 이합체화를 방해하고 DNA에 붙는 것을 억제할 수 있는 물질이다. 이러한 HIF-2α의 전사 활성 억제는 하위 유전자의 발현을 감소시켜 및 HIF-2α의 하위 유전자가 단백질로 발현되는 것을 억제하여 표적 유전자의 세포내 단백질 농도를 낮출 수 있는 물질이다.

따라서 이러한 효과를 나타내는 다양한 물질이 본원의 억제제로 작용할 수 있다. 전사 및/또는 번역 수준에서의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 물질은 예를 들면 저분자화합물, 항체 및 폴리펩타이드를 포함하는 단백질 또는 RNA와 DNA를 포함하는 핵산분자 예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 또는 miRNA 또는 이들 임의의 조합을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에서 사용된 용어 발현이란 인비트로 또는 세포내에서 유전자가 단백질로 만들어지는 과정의 모든 단계를 포함하는 것으로, 예를 들면 유전자에서 mRNA로의 전사, mRNA에서 단백질로의 번역을 포함하는 것이다.

본원에서 "활성"이란 발현된 단백질이 세포내에서 본래의 기능할 수 있도록 하는 생물학적 작용을 의미한다.

본원에 따른 일 구현 예에서 본원의 조성물에 포함될 수 있는 억제제는 기존에 HIF-2α 특이적 억제제로 알려진 물질이 사용될 수 있다. 예를 들면 TC-S7009 (N-(3-Chloro-5-fluorophenyl)-4-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-5-amine CAS No. 1422955-31-4)와 이의 유사체인 PT2385 ((S)-3-((2,2-difluoro-1-hydroxy-7-(methylsulfonyl)-2,3-dihydro-1H-inden-4-yl)oxy)-5-fluorobenzonitrile; CAS No: 1672665-49-4), PT2399 ((S)-3-((7-((difluoromethyl)sulfonyl)-2,2-difluoro-1-hydroxy-2,3-dihydro-1H-inden-4-yl)oxy)-5-fluorobenzonitrile; CAS No: 1672662-14-4)을 들 수 있다. 이들은 HIF-2α에 특이적으로 작용하여 이의 이량체화 및 DNA 결합을 억제하여, 궁극적으로 이의 전사 활성을 방해한다. 본원에서는 처음으로 이들 물질이 악성 연골육종 특히 탈분화 연골육종의 성장 및 전이를 억제한다는 규명하였다.

본원의 다른 구현 예에서, 억제제는 HIF-2α를 특이적으로 인식하여, 이의 활성 및/또는 작용기전을 방해, 억제, 간섭, 억제할 수 있는 항체이다. 본원에서 사용된 용어 항체는 완전한 항체, 항체분자의 항원결합 단편 및 이들과 기능적으로 동등한 항체 또는 단편을 포함하는 것이다. 또한 본 발명의 항체는 IgG, IgM, IgD, IgE, IgA 또는 IgY 타입일 수 있으며, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 또는 IgA2 클래스 또는 그 하부클래스일 수 있다. 본 발명의 항체는 모노클로날, 폴리클로날, 키메라, 단쇄, 이특이성, 유인원화 및 인간화된 항체 및 이의 활성 단편 및 항체 모방체를 포함하는 것이다.

본원의 다른 구현 예에서, 억제제는 HIF-2α 발현, 활성 및/또는 작용/기전을 간섭, 방해 및 또는 억제할 수 있는 폴리펩타이드이다. 본원에서 사용된 용어 폴리펩타이드는 천연 또는 합성의 아미노산의 중합체를 일컫는 것으로 이러한 작용을 갖는 한 특정 길이를 지칭하는 것은 아니며, 펩타이드, 올리고펩타이드를 포함한다. 이러한 폴리펩타이드는 자연적 또는 인위적으로 변형된 것 예를 들면 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등으로 변형된 것도 포함한다.

본원에 따른 다른 구현예에서, 본원에 따른 조성물에 포함될 수 억제제는 뉴클레오타이드 예를 들면 siRNA (small interfereing RNA) 또는 shRNA (small hairpin RNA) 또는 miRNA (microRNA) 이다. siRNA, shRNA 및 miRNA는 RNA 간섭 (interference) 작용을 통해, 예를 들면 짧은 길이의 간섭 RNA (siRNA)가 서열 특이적으로 전사체에 결합하여, RISC(RNA Induced Silencing Complex)를 형성하여, 전사된 RNA가 세포내에 단백질로 발현될 수 없도록(silencing) 한다. siRNA, shRNA 또는 miRNA는 그 표적 서열에 상당히 상보적인 서열을 갖는다. 상당히 상보적 서열이란, 표적 유전자의 적어도 연속적인 15 베이스 길이의 서열과 적어도 약 70% 상보성, 적어도 약 80% 상보성, 적어도 약 90% 상보성, 또는 약 100% 상보성을 의미한다. 표적 핵산에 결합하여 사일런싱의 기능을 하는 한 다양한 유래의, 본원에 따른 HIF-2α 유전자를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및/또는 miRNA가 사용될 수 있으며, 이들의 생물학적 동등체, 유도체 및 유사체도 포함하는 것이다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 당업계에 공지된 바와 같으며, 예를 들면 표적 단백질의 임의의 코딩 서열에 결합하여, 표적 단백질의 발현을 억제/감소시키는 짧은 합성 핵산이다. 안티센스 RNA는 표적 유전자 및 전달 방법에 따라 적절한 길이를 가질 수 있으며, 예를 들면 약 6, 8 또는 10 내지 40, 60 또는 100 뉴클레오타이드이다. 일구현예에서는 siRNA가 HIF-2α 유전자 발현 억제에 사용된다. 이러한 siRNA는 목적하는 유전자의 발현을 감소시켜 목적하는 효과를 달성하는 한 다양한 서열이 포함될 수 있으며 일 구현예에서는 HIF2α siRNA sense 서열: ACUACGUCCUGAGUGAGAU (서열번호 1); HIF2α siRNA antisense 서열: AUCUCACUCAGGACGUAGU (서열번호 2)이다. 상기 RNA는 상보성 쌍으로 사용된다. 상기 서열은 3'에 dTdT 오버행을 포함할 수 있다. 도 3에 기재된 바와 같이 이러한 siRNA는 세포 수준에서 siRNA로 HIF-2α의 발현을 감소시켜, 세포 전이, 세포사멸과 p53 신호전달체계와 관련된 유전자들의 발현에 영향을 미치는 것으로 나타나, siRNA를 이용한 HIF-2α의 억제로 연골육종의 성장 및 전이, 생존을 억제할 수 있음을 나타낸다.

본원에서 사용된 용어 "치료"란 본원에 따른 조성물의 투여로 연골육종 또는 이로 인한 질환의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 질환의 정확한 기준을 파악하고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.

본원의 조성물은 항암 화학요법제를 추가로 포함할 수 있다. 연골육종의 병리학적 및 세포적 특징, 예컨대 그들의 낮은 증식률은 종래의 항암 요법의 효능을 제한하였다. 본원에서는 기존의 화학 요법제와 함께 HIF-2α 억제가 연골육종 세포의 세포 사멸을 유발하는 시너지 효과를 통해 연골육종의 악성 종양을 효과적으로 완화시킨다는 것을 증명하였다. 따라서 본원에 따른 조성물은 연골육종에 사용될 수 있는 다양한 항암 화학요법제와 병용으로 사용될 수 있다. 일 구현예에서는 시스플라틴이 사용된다. 시스플라틴은 DNA에 결합하여 이의 복제를 방해하는 방식으로 작용한다. 따라서 다른 구현예에서는 항암세포의 DNA 복제를 방해하는 다른 다양한 항암 화학요법제가 함께 사용될 수 있다. 예를 들면 독소루비신(doxorubicin)이 있다. 독소루비신 같은 경우 실제 연골육종 환자에서 치료용으로 흔히 사용되는 항암 화학요법제이지만, 연골육종 세포들에서 항암 저항성이 있다고 알려져 있기 때문이다. 본원에서는 항암 화학요법에 사용되는 항암제에 대한 저항성을 개선할 수 있었다. 일 구현예에서는 본원에 따른 HIF-2α의 억제제를 처리하여 시스플라틴에 대한 저항성을 개선할 수 있다. 다른 구현예에서는 HIF-2α의 억제제를 처리하여 시스플라틴에 대한 만감도를 증가시킬 수 있다. 독소루비신 또는 시스플라틴은 연골육종의 치료에 일반적으로 사용되는 항암제이고, 연골육종은 상기 항암제 모두에 대해 저항성이 발견된다. 이에 다른 구현예에서는 본원에 따른 HIF-2α의 억제제를 처리하여 독소루비신에 대한 저항성을 개선할 수 있다. 본원에 따른 HIF-2α의 억제제를 처리하여 독소루비신에 대한 민감도를 증가시킬 수 있다.

본원의 조성물은 상기 언급한 유효성분 이외에 추가로 약학적 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다.

본원에서 사용된 "담체"란 사용되는 투여량 및 농도에 노출되는 세포 또는 포유동물에 무독성인 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제를 의미하는 것이다. 이러한 담체의 예로는 식염수, 링거액, 완충 식염수, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충액, 아스코르브산을 비롯한 산화방지제, 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩타이드, 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어폴리비닐피롤리돈, 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신, 단당류, 이당류 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물, 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA, 당 알콜, 예를 들어 만니톨또는 소르비톨, 염 형성 카운터 이온, 예를 들어 나트륨, 및(또는) 비이온계 계면활성제, 예를 들어 트윈, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 플루로닉스(PLURONICS)를 들 수 있다.

필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제형화할 수 있다.

본원의 조성물의 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니며, 공지된 억제제의 투여방법을 적용할 수 있으며, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우 피부에 붙이는 패치형, 코/호흡기를 통해 투여할 수 있으며, 신속한 치료효과를 얻기 위해서는 정맥내 주사에 의한 투여가 바람직하다.

투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 매우 다양하며, 공지된 억제제의 투여량을 적용할 수 있다. siRNA, miRNA, 안테센스 올리고뉴클레오타이드, shRNA 제제 및 폴리펩타이드를 포함한 단백질 제제의 경우 비경구 투여가 선호될 수 있으나 다른 경로 및 수단을 배제하는 것은 아니다. 전형적인 약물의 경우 투약단위체는, 예를 들어 약 0.01mg 내지 100mg를 포함하나 상기 범위의 이하 및 이상의 범위를 배제하는 것은 아니다. 일일 투여량은 약 1μg 내지 10g 일 수 있으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.

본원은 HIF-2α가 악성 연골육종의 발달 및 개시에 중요하다는 것을 규명한 것에 근거한 것으로, HIF-2α의 활성을 저해하는 물질을 스크리닝하여 연골육종, 특히 악성 연골육종, 더욱 특히 탈분화 연골육종 치료제로 개발할 수 있다.

이러한 관점에서 본원은 다음의 단계를 포함하는 연골육종 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 방법은 HIF-2α를 과발현하는 세포를 제공하는 단계; 세포에 상기 세포에 HIF-2α의 발현 또는 활성을 억제할 것으로 기대되는 시험물질을 처리하는 단계; 및 상기 처리결과, 시험물질을 처리하지 않은 세포와 비교하여, 상기 세포에서 상기 HIF-2α의 발현 또는 활성이 감소한 경우, 상기 시험물질을 연골육종 치료제 후보물질로 선별하는 단계를 포함한다.

본원에 사용되는 HIF-2α은 스크리닝을 하는 구체적 방법에 따라 다양한 유래의 것이 본 방법에 사용될 수 있으며, 예를 들면 포유류, 특히 인간유래 또는 마우스 유래의 것이 사용될 수 있다. 또한 동일한 숙주, 예를 들면 인간에서 유래된 것이라도 특정 개인, 지역, 환경 등에 따라 서열변이가 있을 수 있으며, 이러한 것은 물론 일부 서열이 변형(결실, 치환, 부가)되었으나, 기능적으로 동등한 변이체가 모두 본 발명에 사 용될 수 있다.

본원의 방법에 사용될 수 있는 HIF-2α은 분리된 형태 또는 이를 발현하는 세포의 형태로 제공될 수 있다. 세포의 경우 본원의 방법에 채용되는 단백질을 내인적으로 발현하거나, 또는 이를 발현하는 플라스미드의 도입(transient 또는 stable 전달이입)에 의해 이를 발현 또는 과발현하는 세포주일 수 있다.

일 구현예에서 본원에 따른 방법에 사용될 수 있는 세포주는 연골육종 세포주이며, 이는 예를 들면 SW1353 (예를 들면 ATCC® HTB-94™) 또는 OUMS-27 (www.expasy.org, Accession NO: CVCL_3090)를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 또 다른 사용 가능한 연골육종 세포주로 JJ012 (Interstitial collagenase gene expression correlates with in vitro invasion in human chondrosarcoma. Scully SP et al., Clin Orthop Relat Res. 2000;376:291-303.), Hs819.t (ATCC® CRL-7891™), CH2879 (Establishment and characterization of a continuous human chondrosarcoma cell line, ch-2879: comparative histologic and genetic studies with its tumor of origin. Gil-Benso R et al., Lab Invest. 2003 Jun;83(6):877-87.), L835 (Three new chondrosarcoma cell lines: one grade III conventional central chondrosarcoma and two dedifferentiated chondrosarcomas of bone. van Oosterwijk JG et al., BMC Cancer. 2012a;12:375.), L2975 (Three new chondrosarcoma cell lines: one grade III conventional central chondrosarcoma and two dedifferentiated chondrosarcomas of bone. van Oosterwijk JG et al., BMC Cancer. 2012a;12:375.), NDCS1 (Establishment of novel human dedifferentiated chondrosarcoma cell line with osteoblastic differentiation. Kudo et al., Virchows Arch. 2007;451 (3:691-699.), L3252 (Three new chondrosarcoma cell lines: one grade III conventional central chondrosarcoma and two dedifferentiated chondrosarcomas of bone. van Oosterwijk JG et al., BMC Cancer. 2012a;12:375.) 등을 들 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본 방법에서 사용되는 단백질의 양, 세포의 종류 및 시험물질의 양 및 종류 등은 사용하는 구체적인 실험방법 및 시험물질의 종류에 따라 달라지며, 당업자라면 적절한 양을 선택할 수 있을 것이다. 실험결과 시험물질과 접촉되지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 존재하에서 HIF-2α의 발현 또는 활성을 억제 또는 감소를 가져오는 물질을 후보물질로 선별한다. 감소의 경우 대조군과 비교 약 99% 이하 감소, 약 95% 이하 감소, 약 90% 감소, 약 85% 감소, 약 80% 감소, 약 75% 감소, 약 70% 감소, 약 65% 이하 감소, 약 60% 이하 감소, 약 55% 감소, 약 50% 이하 감소, 약 45% 이하 감소, 약 40% 이하 감소, 약 30% 이하 감소, 약 20% 이하 감소를 의미하나, 이를 벗어나는 범위를 제외하는 것은 아니다.

본원의 "시험물질"은 HIF-2α의 발현 또는 활성을 억제할 것으로 기대되는 물질을 의미하여, 저분자량 화합물, 고분자량 화합물, 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물또는 세포 또는 조직 배양물), 또는 바이오의약품(예컨대, 단백질, 항체, 펩타이드, DNA, RNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, RNAi, 앱타머, RNAzyme 및 DNAzyme), 또는 당 및 지질 등을 포함하나 이로 한정하는 것은 아니다. 상기 시험물질은 2개 이상의 아미노산 잔기, 예컨대 6개, 10개, 12개, 20개 이하 또는 20개초과 예컨대 50개 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 시험 물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있으며 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 구입 가능하다. 시험 물질은 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, "1-비드 1-화합물" 라이브러리방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다.

예를 들면 HIF-2α의 발현 또는 활성을 억제하는 약물의 스크리닝 목적을 위해서는 화합물은 저분자량의 치료효과를 갖는 것이 사용될 수 있다. 예를 들면 중량이 400 Da, 600 Da 또는 800 Da과 같은 약 1000 Da 내외의 화합물이 사용될 수 있다. 목적에 따라 이러한 화합물은 화합물 라이브러리의 일부를 구성할 수 있으며, 라이브러리를 구성하는 화합물의 숫자도 수십개부터 수백만개까지 다양하다. 이러한 화합물 라이브러리는 펩타이드, 펩토이드 및 기타 환형 또는 선형의 올리고 머성 화합물, 및 주형을 기본으로 하는 저분자 화합물, 예컨대 벤조디아제핀, 하이단토인, 바이아릴, 카보사이클 및 폴리사이클 화합물(예컨대 나프탈렌, 페노티아진, 아크리딘, 스테로이드 등), 카보하이드레이트 및 아미노산 유도체, 디하이드로피리딘, 벤즈하이드릴 및 헤테로사이클(예컨대 트리아진, 인돌, 티아졸리딘 등)을 포함하는 것일 수 있으나, 이는 단지 예시적인 것으로 이로 한정되는 것은 아니다.

또한 예를 들면 바이올로직스가 스크리닝에 사용될 수 있다. 바이올로직스는 세포 또는 바이오분자를 일컫는 것으로, 바이오분자란, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질 또는 생체내 및 생체외에서 세포 시스템 등을 이용하여 생산된 물질을 일컫는 것이다. 바이오분자를 단독으로 또는 다른 바이오분자 또는 세포와 조합으로 제공될 수 있다. 바이오분자는 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 항체, 또는 기타 혈장에서 발견되는 단백질 또는 생물학적 유기물질을 포함하는 것이다.

본원에서는 HIF-2α가 연골육종의 발달, 전이 등에 있어서 MMP1, MMP2 및 MMP9의 전사를 조절하는 것을 규명하였다. 연골육종 전이를 일으키는 중요한 사건은 MMP(matrix metalloproteinases)와 같은 이화 작용 효소에 의한 뼈 특이적 세포외매트릭스(ECM)의 주변 층의 파괴이다. 실제로, HIF-2α는 MMP1, MMP2 및 MMP9 (도 4C)의 실질적인 상향 조절을 유발하였으며, HIF-2α 과발현은 연골육종 세포의 총 MMP 활성을 약 3배 증가 시켰으며 HIF-2α의 낙다운은 하부 기질의 분해를 실질적으로 감소시키는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 HIF-2α가 주변 뼈 기질의 분해를 촉진하고 원발 종양에서 연골육종 세포의 초기 탈출을 가능하게하는 서브세트의 MMP 계열 단백질을 직접적으로 상향조절함을 나타낸다.

따라서 본원에 따른 방법은 상기 검출하는 단계는 MMP1, MMP2 및 MMP9 발현을 검출하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 검출결과 상기 MMP1, MMP2 및 MMP9 발현이 시험물질을 처리하지 않은 세포와 비교하여 감소한 경우, 상기 시험물질을 연골육종 치료제 후보물질로 선별하는 단계를 포함한다. MMP1, MMP2 및 MMP9는 기존에 공지된 단백질로 이들의 NCBI DB 번호는 다음과 같다: MMP1: NP_001139410.1, NP_002412.1; MMP2: NP_001121363.1, NP_001289437.1, NP_001289438.1, NP_001289439.1; 및 MMP9: NP_004985.2

본원에서는 EPAS1 유전자좌의 CNA를 GLAD(Gain and Loss Analysis of DNA) 세분화 방법을 사용하여 분석한 결과 EPAS1(Endothelial PAS domain containing protein 1, UniProtKB - Q99814) 유전자좌의 카피 수 증가를 갖는 환자는 EPAS1 카피수의 손실 또는 변화가 없는 환자와 비교하여 예후가 불량 한 것을 규명하였다. EPAS1 유전자의 카피수 증가는 환자는 전반적 및 무재발 생존율 모두에서 예후가 좋지 않은 것으로 나타났으며, 이는 HIF-2α 경로 성분의 게놈 변화를 기초로 연골육종 환자에서 고위험 환자의 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.

이에, 또다른 양태에서 본원은 대상체의 연골육종의 예후에 대한 정보를 제공하기 위해, 상기 대상체로부터 유래된 생물학적 시료를 제공하는 단계; 상기 생물학적 시료에서 HIF-2α 경로의 EPAS1 유전자좌의 CNA(Copy Number Alteration)를 검출하는 단계; 및 상기 검출결과, 대조군과 비교하여 상기 생물학적 시료에서 상기 CNA가 증가한 경우, 상기 대상체의 연골육종의 예후가 불량한 것으로 판단하는 단계를 포함하는, EPAS1(Endothelial PAS domain containing protein 1) CNA 검출방법을 제공한다. CNA 검출방법은 공지된 것으로 예를 들면 본원 실시예에 기재된 것을 참조할 수 있다.

본원에서는 연골육종, 특히 악성의 탈분화 연골육종에서 HIF-2α이 과발현/활성이 증가한 것을 규명하였다.

따라서 본원은 HIF-2α 검출용 물질을 포함하는 탈분화된 연골육종 진단용 조성물을 제공한다.

또한 이와 관련되어 본원은 대상체의 연골육종 진단에 대한 정보를 제공하기 위하여, 상기 대상체로부터 유래된 생물학적 시료를 제공하는 단계: 상기 생물학적 시료에서 HIF-2α의 발현량 또는 활성을 검출하는 단계; 상기 검출결과, 대조군과 비교하여 상기 생물학적 시료에서 상기 HIF-2α의 발현량이 증가 또는 활성이 증가된 경우, 상기 대상체 유래의 생물학적 시료를 연골육종으로 진단하는 단계를 포함하는, HIF-2α 마커의 검출방법을 제공한다.

일 구현예에서 본원에 따른 검출은 HIF-2α의 발현량으로 mRNA 또는 단백질 수준에서 검출할 수 있으며, 이러한 방법은 기존에 공지된 것으로 예를 들면 핵산은 PCR과 같은 핵산 증폭 방법, 노던블랏을 포함하며, 단백질은 HIF-2α를 특이적으로 인식할 수 있는 항체를 이용한 면역분석 방법을 포함하나 이로 제한되는 것은 아니며, 또한 본원에 기재된 것을 참조할 수 있다.

일 구현예에서 본원에 따른 검출은 HIF-2α의 활성으로, 이는 전사인자로서 하위 유전자의 전사 조절여부를 검출하여 달성 될 수 있다. 이러한 방법은 공지된 것으로서 당업자라면 본원에 개시된 것을 참조로 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다.

전술한 본원에 따른 방법에 사용될 수 있는 생물학적 시료는 특히 원발암 조직, 여기에서 전이된 전이 조직 또는 그 주변 조직에서 주변 조직에서 HIF-2α의 단백질 및 CNA 분석이 가능하다. 또한 그외 환자의 혈액, 신체조직과 같이 DNA를 추출할 수 있는 시료에서 CNA 검출을 이용한 분석이 가능하다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

인간 샘플 . 인간 샘플은 국립 암 연구소 협동 조직 조직망(CHTN)에서 획득하였다. 모든 인체유래물 제공자에게서 서면의 동의서를 얻었다. 실험에 사용된 다양한 임상병기에 있는 뼈와 연골, 연골육종 조직어레이(tissue array) T261a, OS805는 US Biomax Inc.에서 얻었다. Nikon Eclipse Ni-U 정립 현미경에 연결된 DS-Ri2 카메라(Nikon)를 사용하여 조직학적 또는 면역 화학적 염색 이미지를 수집하고 분석하였다. 모든 조직학적 및 면역 조직 화학적 샘플은 인간 육종의 특정 전문 지식을 가진 2명의 병리학자에 의해 독립적으로 평가되었다. 평가자들은 샘플의 위와 같이 분류된 특징에 대하여 전혀 알지 못한다.

마우스 및 실험 시스템 . BALB/c nu/nu, 5주령의 암컷 흉선 누드 마우스를 대한 바이오 링크 (주)에서 구입하여 개별 환기 케이지에 수납하였다. 음식과 물은 살균 후에 제공되었다. 생체 내 실험을 위해, 실험 조건 당 5 내지 7마리의 마우스가 사용되었다. 정위 주입 모델에서, SW1353 세포는 트립신 처리되고 원심 분리 후 PBS에 재 현탁되었다. 세포의 수는 25μl 당 1Х10⁶개로 조절되었다. eGFP 혹은 HIF-2α을 과발현한 SW1353 세포를 이용한 실험에서는 세포 수를 25μl 당 1Х10⁵개로 조절하였다. 세포들은 25μl의 Geltrex와 섞어졌다 (Thermo Fisher Scientific, Geltrex™ LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix). 주사 전에 마우스를 마취시켰다. 피부를 메스를 사용하여 절개하고 직경 0.35mm의 단일 구멍을 무균 H- 파일(MANI, 28mm / # 70)의 도움으로 오른쪽 상단 경골의 연골을 통해 뚫었다. SW1353 세포를 구멍을 통해 30 게이지 마이크로 주사 바늘로 천천히 주사하였다. 수술용 왁스를 사용하여 구멍을 밀봉하고 피부 상처를 봉합하였다. 선택된 실험 기간 후, 마우스를 희생시키고 전체 뒷다리를 해부하였다. 폐 샘플의 경우, 기관을 통해 PBS를 주입하고 모든 샘플을 조직 형태 및 면역 조직 화학 분석을 위해 처리하였다. 보조 항암치료제 연구를 위해 누드마우스에 연골육종 세포를 주사하고 2주 뒤, Kolliphor EL (castor oil, 10% v/v, Sigma Aldrich, C5135)과 함께 2mg/kg/의 cisplatin, 20mg/kg의 TC-S7009 (Tocsris)를 넣거나 넣지 않은 채로 마우스에 주사했음. Vehicle 용액은 DMSO, PBS, 그리고 Kolliphor EL (10% v/v)으로 구성함. 항암치료 혼합제는 마우스에 4주간 1주일에 2회씩 투여됨.

세포 배양 . 연골육종 세포주 SW1353 및 OUMS-27은 각각 ATCC 및 JCRB Cell Bank로부터 구입하여 10% FBS (Invitrogen) 및 1% 항생제가 첨가된 DMEM (Welgene Inc.)에서 배양하였다. 안정한 세포주의 선택을 위해, 1Х10³ 세포를 100mm 접시에 뿌리고 식민지가 보일 때까지 약 2주간 배양하고 매 3일마다 신선한 배지를 공급하였다. 보이는 콜로니는 복제 링을 사용하여 개별적으로 분리되었다. 단일 콜로니 형성 세포를 트립신 처리하고, 24- 웰 플레이트에 시딩하고, 점차적으로 100mm 접시로 팽창시켰다. 트랜스펙션은 METAFECTENE PRO (Biontex)를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 수행하였다. RNA interference 실험에 사용된 small interfering RNAs (siRNAs)는 보충 표 2-1에 나타냈다. 모든 siRNA는 Bioneer에서 구입하였다. 모든 세포주는 한국 세포주 은행의 STR (short-tandem repeat) 프로파일을 사용하여 검사 및 인증되었으며 마이코플라스마 오염이 없었다. 이 연구에서 사용된 세포주는 ICLAC에 등재된 일반적으로 잘못 식별된 세포주의 데이터베이스에서 발견되지 않았다.

조직학 및 면역 조직 화학 . 생쥐의 뼈 조직 샘플을 PBS 중 4% 파라 포름알데히드에 고정시키고 0.5 M EDTA (pH 7.4)에서 탈회시켰다. 폐 조직을 4% 파라 포름 알데히드 용액에 고정시켰다. 모든 샘플을 단계적 에탄올로 탈수시키고 파라핀에 끼우고 두께 5μm로 절단하고 밤새 건조시켰다. 조직 학적 또는 면역 조직 화학 염색을 위해, 절편을 크실렌으로 탈 파라핀화하고 재 수화하였다. 절편 샘플을 H&E 또는 Safranin O로 염색하였다. 면역 염색을 위해, 시트르산 완충액(pH 6.0)에서 60℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여 항원을 회수하였다. 면역 형광 실험을 위해서 샘플들은 2차 안티바디를 처리한 뒤 실온에서 1시간 동안 방치된 뒤, 1μg/ml의 DAPI로 10분간 방치되었다. 샘플을 PBS 중의 1% BSA로 블로킹하고 1차 및 2차 항체와 순차적으로 배양하였다. 원발 종양 부위의 정량화를 위해 Image-Pro Premier 소프트웨어(Media Cybernetics, Inc.)를 사용하여 영상을 분석하였다. 면역 형광을 탐지하기 위해 면역 염색된 조직들은 레이저 스캐닝 공초점 현미경(Carl Zeiss, LSM700)을 이용해 이미지화 됨.

마이크로 어래이 . SW1353 세포들(3Х10⁵)은 컨트롤, HIF1A 혹은 EPAS1 siRNA로 형질주입 되었음. 각 그룹마다 생물학적 반복실험이 3회 반복됨. cDNA는 GeneChip WT(Whole Transcript) Amplfication 키트를 이용해 제조사의 설명에 따라 합성됨. 마이크로 어래이 서비스들은 Macrogen Inc.에서 제공되었고 GeneChip® Human Gene 2.0 ST Array (Affymetrix)을 이용해 수행됨. 어래이 데이터 추출 및 분석은 Affymetrix® GeneChip Command Console® Software (AGCC)를 이용해 수행됨. 비교군 간의 유의 발현 유전자를 정하기 위해 |log₂(fold change)| > 0.263와 P-value (paired t-test) < 0.05가 컷오프로 사용됨.

항체 및 시약 . HIF-2α 억제제 TC-S7009 (카탈로그 번호 5243)는 Tocris로부터 입수하였다. Kolliphor EL (카탈로그 번호 C5135), Nutlin-3a (카탈로그 번호 SML0580) 및 cisplatin (카탈로그 번호 C2210000)은 Sigma Aldrich에서 구입하였다. ABT-888 (카탈로그 번호 115505)는 Cayman에서 구매하였다. 항-HIF-2α 항체 (sc-13596), 정상 마우스 IgG (sc-2025) 및 염소 항 마우스 IgG-B (sc-2039)를 Santa Cruz Biotechnology로부터 구입하였다. 항-인간 마이토콘드리아 항제 (카탈로그 번호 MAB1273)은 Millipore에서 구매하였다. 항- HIF-2α 항체 (카탈로그 번호 NB100-122)는 Novus Biologicals에서 구매하였다. Biotin-SP-conjugated goat 항-토끼 IgG는 Jackson ImmunoResearch Labs에서 구매하였다. 항-토끼 IgG Alexa Flluor 647 (카탈로그 번호 A-31573), 항-마우스 IgG Alexa Fluor 594 (카탈로그 번호 A-21203), 항-염소 IgG Alexa Fluor 488 (카탈로그 번호 A-11055)는 Thermo Fisher Scientific에서 구매하였다.

가중치 유전자 동시 발현 네트워크 분석(WGCNA) . 가중 네트워크 구성은 Langfelder P, Horvath S. Eigengene networks for studying the relationships between co-expression modules. Bmc Syst Biol 1, 54 (2007)에서 설명한 대로 Bioconductor의 WGCNA R 패키지를 사용하여 수행되었다. WGCNA는 마이크로 어레이 샘플에서 유전자에 대한 공동 발현 네트워크를 구축한다. 이 연구에서 분석된 발현 프로파일링은 17개의 신선한 냉동 연육 육종 조직 검사(GSE12475)에서 나왔다. 네트워크의 유전자에 해당하는 노드, 및 한 쌍의 노드는 상호 표현식 관계가 있는 경우 가장자리를 통해 연결되었다. Langfelder P, Zhang B, Horvath S. Defining clusters from a hierarchical cluster tree: the Dynamic Tree Cut package for R. Bioinformatics 24, 719-720 (2008)에서 기술된대로 동적인 cut-tree 방법을 기반으로 한 유전자 연결성의 차이와 dendrogram 절단에 기초한 평균 계층적 클러스터링을 사용하여 공동 발현 클러스터를 제조하였다.

환자 전사체 데이터의 Ingenuity pathway analysis (IPA) . IPA (Qiagen, https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/)는 질병 및 기능 분석을 수행하고 업스트림 조절인자를 확인하는 데 사용되었다. IPA에서 사용하기 위해 개발 된 알고리즘은 Kramer A, Green J, Pollard J, Jr., Tugendreich S. Causal analysis approaches in Ingenuity Pathway Analysis. Bioinformatics. 2014;30(4):523-530에 설명되어 있다. 암 관련 유전자 세트의 농축 P- 값 및 활성화 z- 점수를 분석하기 위해 M1 (263개 유전자), M2 (265개 유전자) 및 M3 (418개 유전자) 모듈 데이터 세트에 대해 IPA의 질병 및 기능 분석을 수행했다. 레귤레이터-이펙터 분석은 M1 모듈의 업스트림 레귤레이터를 식별하기 위해 수행되었다. 활성화 z- 점수 계산을 위해 WGCNA 결과의 모듈 멤버쉽 값을 입력값으로 사용했다.

유전자 세트 농축 분석 (GSEA) . GSEA는 Subramanian A, et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 15545-15550 (2005)에 기술 된대로 수행되었다. Hallmark genesets은 MSigDB 데이터베이스 (http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb)에서 얻었다. 종양 및 암 줄기 세포의 침투에 대한 유전자 세트는 IPA로부터 획득되었다.

PCA 분석 . PCA는 R 패키지를 사용하여 HIF-2α 시그니처 유전자의 발현 프로파일에 기초하여 연골육종 환자의 HIF-2α 활성화 상태를 예측하였다 (도 7의 B).

약물 상호 작용 연구 . 조합 지수(CI) 분석을 위해 SW1353 세포를 비히클, 10μM Nutlin-3a, 10μM ABT-888 또는 10μM TC-S7009로 48시간 동안 전처리하고 0.2, 0.5, 1, 2 또는 5μg/ml 시스플라틴 또는 72시간 동안 방치했다. 세포 생존도는 MTT 분석에 의해 측정되었다. CI는 Compusyn 소프트웨어 버전 1.0을 사용하여 계산되었고, 시너지 효과는 Chou-Talalay 방법 (Chou TC. Drug Combination Studies and Their Synergy Quantification Using the Chou-Talalay Method. Cancer Res. 2010;70(2):440-446.)에 의해 결정되었다. 일정하지 않은 비율의 약물 조합을 사용하여 CI를 계산하였다. 세포 사멸 분석을 위해 SW1353 세포를 비히클, 10μM Nutlin-3a, 10μM ABT-888 또는 10μM TC-S7009로 48시간 전처리하고 추가로 5μg/ml 시스플라틴으로 24시간 처리하였다. 이어서, 세포를 제조자의 프로토콜에 따라 Annexin V-FITC 아폽토시스 검출 키트(Sigma Aldrich, APOAF)로 염색 하였다. 유동 세포 계측법 분석은 FACSCanto II 유동 세포 계측기(BD Biosciences)에서 수행되었다.

Copy number alteration (CNA) 분석 . 게놈 프로파일은 Hupe P, Stransky N, Thiery JP, Radvanyi F, Barillot E. Analysis of array CGH data: from signal ratio to gain and loss of DNA regions. Bioinformatics 20, 3413-3422 (2004)에서 설명한대로 DNA 소프트웨어의 게인 및 손실 분석(Bioconductor의 GLAD 패키지)을 사용하여 분석하였다. 레이블(Gain, Stable, 또는 Loss)은 DNA 복사본의 중앙값을 기준으로 각 지역에 할당되었다. Gain 또는 Loss는 각각 양수 또는 음수 평활화 값으로 정의된다.

Lentivirus 생산 및 형질 도입 . HIF-2α를 과발현시키는 벡터의 제작을 위해, pcDNA3-EPAS1 플라스미드 (Addgene, plasmid # 18950)의 인간 HIF-2α 코딩 영역을 pLJM1-eGFP 벡터 (Addgene, plasmid # 19319)에 서브 클로닝하였다. RNA 간섭 분석법에 사용하기 위한 벡터 제작을 위해 스크램블 및 Shen C, et al. Genetic and Functional Studies Implicate HIF1 alpha as a 14q Kidney Cancer Suppressor Gene. Cancer Discovery 1, 222-235 (2011)의 EPAS1 shRNA의 서열을 pLKO.1 puro 플라스미드 (Addgene, plasmid # 8453)에 삽입하였다. 복제에 사용 된 프라이머 서열은 표 2-2에 수록되어 있다. 렌티 바이러스를 생산하기 위해, HEK293T 세포를 100mm 배양 접시 당 6.5Х10⁶ 세포에 접종하고 37℃에서 5% CO₂에서 24시간 동안 배양하였다. HIF-2α 과발현 또는 낙다운을 위한 벡터를 psPAX2 (Addgene, plasmid # 12260) 및 pMD2.G (Addgene, plasmid # 12259) 벡터와 함께 형질 감염시켰다. 3일 후, 상등액을 수확하고 0.45μm 필터를 사용하여 여과하였다. 렌티 바이러스 형질 도입을 위해, 8μg/ml Polybrene (시그마 알드리치)의 존재 하에서 세포를 렌티 바이러스로 24시간 동안 감염시켰다. 감염된 세포는 puromycin 1μg/ml를 사용하여 3일 동안 선택되었다.

트랜스 웰 침입 분석 . 침입 분석은 Transwell (BD Falcon, 기공 크기, 8μm, PET)을 사용하여 24- 웰 플레이트에서 수행하였다. 필터는 혈청이 없는 DMEM 20μl에 Geltrex 20μg (Thermo Fisher Scientific, Geltrex™ LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix)으로 코팅하고 무균 환경에서 4시간 동안 건조시켰다. 침윤 분석을 수행하기 전에, SW1353, OUMS-27 세포를 무 혈청 DMEM에서 12시간 동안 굶겼다. 세포를 파종하기 직전에, 건조된 트랜스 웰을 25μl의 무 혈청 DMEM으로 37℃에서 1시간 동안 5% CO₂에서 재 수화하였다. 굶주린 세포를 트립신 처리하고, 원심 분리하고, 무 혈청 DMEM에 재 현탁시켰다. 무 혈청 DMEM 200μl에 약 1Х10⁵ 세포를 각 트랜스 웰에 넣고 10% FBS가 보충된 DMEM 2ml를 24- 웰 플레이트에 넣었다. 플레이트를 37℃, 5% CO₂에서 48시간 동안 배양하고, 4% 파라 포름알데히드에서 2분간 고정하고, 100% MeOH에서 20분간 투과시키고, 10% EtOH 중에서 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 20분 동안 염색하였다. 트랜스 웰 윗면의 세포를 면봉으로 닦아 낸 후 각 염색 단계에서 트랜스 웰을 PBS로 세척하였다. 트랜스 웰의 밑면을 현미경으로 관찰하고 이미지를 DS-Ri2 카메라를 사용하여 촬영하였다. 이미지 필드를 무작위로 선택하고 침입 세포를 ImageJ 소프트웨어(National Institutes of Health)를 사용하여 계수하였다.

구체 형성 분석 . SW1353 및 OUMS-27 세포를 2% B27 보충제(Thermo Fisher Scientific), 20ng/ml EGF(Invitrogen) 및 20ng/ml 염기성 섬유 아세포 성장 인자(bFGF; Peprotech)가 보충된 DMEM-F12 배지 또는 DMEM-F12 배지에 현탁시켰다. eGFP 혹은 HIF-2α를 과발현하는 SW1353 세포를 이용한 실험에는 상기 보충물이 없는 DMEM-12 배지에 현탁시켰다. 그런 다음 세포를 웰 당 1Х10⁴ 세포의 밀도로 24-well Ultra-low attachment plates (Corning)에 뿌렸다. 4일 후, 각 웰에 새로운 배지를 첨가하였다. 7일 후, 구체는 50μm 보다 큰 구체의 수 또는 구체의 직경으로 분석하였다. 구체의 수에 대해, 역상 현미경(Axio Observer Z1, Zeiss) 하에서 구를 계수하였다. 구의 직경과 관련하여, 웰 당 3개의 대표 필드를 이미지화하고 AxioVision 소프트웨어(자이스)를 사용하여 직경을 측정하였다: 각 그룹의 이미지 필드 당 3개의 가장 긴 직경이 기록되었다. 구 직경의 분포는 원래 Tukey가 설명한 노치가 있는 Box-and-Whisker 플롯을 사용하여 플로팅되었다. 구형 형성 분석을 적어도 6회 반복하였다.

젤라틴 분해 분석 . 10% FBS가 공급된 DMEM 중의 SW1353 세포 (4Х10⁴)를 오레곤 그린 488- 접합 젤라틴(Life Technologies)으로 코팅된 커버 슬립 상에 시딩하였다. 간단히, coverslips은 얼음에서 15분 동안 0.5% 글루타 알데히드(Junsei chemical) 다음에 20분 동안 50μg/ml 폴리 D - 라이신(Corning)으로 치료되었다. 처리된 coverslips은 15분 동안 5mg/ml NaBH4 (Samchun 화학)로 치료, 어둠 속에서 10분 사전 예열된 200μg/ml 오레곤 그린 488 - 접합 젤라틴과 37℃에 코팅되었고, 70% EtOH 및 PBS로 광범위하게 세척하였다. 세포를 18시간 동안 배양하고, 고정시키고, DAPI로 염색하였다. 각 coverslip 마다, 형광 현미경(EVOS FL Cell Imaging System, Thermo Fisher Scientific)에서 20배로 확대에서 세 군데가 이미징되었다. 젤라틴 분해를 정량화하기 위해 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 각 필드의 분해 영역을 색상 임계화(color thresholding)로 측정하였다. 젤라틴 분해 분석은 적어도 3회 독립적으로 반복되었다.

루시퍼라아제 분석 . HIF-2α 활성은 리포터 유전자 분석에 의해 결정되었다. SW1353 세포는 저산소 반응 요소 반복을 함유하는 1μg의 리포터 벡터로 형질 감염시켰다. 티미딘 키나아제 프로모터-레닐라 루시퍼라아제 리포터 플라스미드(pRL-TK)를 트랜스펙션 효율을 위한 대조군으로 사용하였다. HIF-2α 과발현을 위해, METAFECTENE PRO (Biontex)를 사용하여 pcDNA3-HIF-2α (Addgene, plasmid # 18950) 플라스미드를 형질 감염시켰다. 트랜스펙션 24시간 후, 세포를 추가로 24시간 동안 TC-S7009로 처리하였다. 루시퍼라아제 활성을 루시페린을 사용하여 측정하고 레닐라 루시퍼라아제 활성에 의해 표준화시켰다.

마이그레이션 분석 . SW1353 및 OUMS-27 세포를 6- 웰 플레이트에서 웰 당 5Х10⁵의 밀도로 배양하였다. 세포가 90%의 합류를 달성했을 때, 멸균된 노란색 팁으로 상처가 형성되었다. 세포를 PBS로 3회 세척하고 1% FBS가 함유된 신선한 배지에서 36시간 동안 배양하였다. 무작위로 선택된 필드는 12시간마다 현미경의 디지털 카메라로 촬영하였다.

Colony 형성 분석 . SW1353 세포를 10% FBS가 공급된 DMEM에 현탁시키고 6개의 웰 플레이트에 파종하였다; 1Х10³ 및 500 세포를 각각의 웰에 파종하여 낙다운 및 과발현 실험을 수행하였다. 배지는 3일마다 14일 동안 교환하였다. OUMS-27 세포를 10% FBS가 공급 된 DMEM에 현탁시키고 6- 웰 플레이트에 파종 하였다; 5Х10³ 및 1Х10³ 세포를 각각 낙다운 및 과발현 실험을 위해 배양디쉬에 깔았다. 미디어는 21일 동안 3일마다 교체되었다. 콜로니를 4% 파라 포름알데히드 용액에서 2분간 고정시키고 100% MeOH에서 20분간 투과시켰다. 그런 다음 콜로니를 0.1% 크리스탈 바이올렛 용액에서 20분 동안 염색하였다.

MMP 활성 분석 . MMP 효소 활성의 측정은 제조사의 프로토콜에 따라 MMP 활성 분석 키트(Abcam)를 사용하여 다음 논문에서 (Kim JH, et al. Matrix cross-linking-mediated mechanotransduction promotes posttraumatic osteoarthritis. Proc Natl Acad Sci U S A 112, 9424-9429 (2015).) 기술한 바와 같이 수행하였다. SW1353 세포로부터 분비된 MMP를 함유하는 조건화 된 배지 1ml를 수집하고 100μl로 농축시켰다. MMPs에 의한 절단이 녹색 형광을 생성하는 형광 공명 에너지 전달(FRET) 펩타이드를 함유하는 미디어 용액(50μl)을 샘플의 50μl 분취량과 혼합하였다. 형광의 강도는 Spectramax Gemini 마이크로 플레이트 형광 판독기(Molecular Device)를 사용하여 488nm에서의 여기 및 530nm에서의 방출로 1시간 동안 5분마다 동역학적으로 검출되었다.

정량적 RT-PCR (qRT-PCR) . Total RNA는 TRI 시약(Molecular Research Center, Inc.)을 사용하여 추출하였다. RNA는 EasyScript Reverse Transcriptase (Transgen Biotech)를 사용하여 역전사되었다. SYR Green PCR Master Mix (Enzynomics)를 사용하여 qRT-PCR을 수행하고 StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems)에서 실행하였다. PCR 조건은 95℃에서 10분의 초기 변성 단계로 시작하였고, 95℃에서 20초, 60℃에서 1분으로 40 사이클의 PCR을 수행하였다. 용융 곡선은 95℃에서 20초, 60℃에서 1분, 95℃에서 15초를 포함하는 PCR에 의해 최종 단계의 마지막 단계에서 수집되었다. PCR 데이터는 2-ΔΔCT 방법을 사용하여 분석되었고 HPRT는 하우스키핑 유전자로 사용되었다. 프라이머 서열은 보충 표 2-3에 열거되어있다.

통계 . 대조군과 실험군 간의 차이에 대한 통계적 유의성은 양측의 unpaired Student's t test에 의해 평가되었다. ANOVA를 사용하여 3개 이상의 그룹 비교를 수행하였다. 실험은 최소 3회 독립적으로 반복되었다. 데이터는 평균±s.e.m로 나타낸다. P <0.05는 유의한 것으로 간주되었다. 통계 분석은 SPSS 버전 22 통계 소프트웨어(IBM)를 사용하여 수행되었다. Kaplan-Meier 생존 곡선은 SPSS를 사용하여 작성되고 분석되었으며, SPSS는 유의 수준을 계산하기 위해 로그 순위 테스트를 사용하였다. 이식 실험에서 동물을 무작위로 각 실험 그룹에 할당하고 치료 할당은 블라인드로 진행되었다. mRNA 발현 간의 상관 관계를 측정하기 위해 R과 P 값을 Pearson 상관 계수로 계산하였다. 데이터 포인트 수가 10개 미만인 경우 데이터가 단일 값으로 표시된다. 그룹당 더 큰 데이터 포인트 세트를 풀링하는 분석에서 Tukey 분포 막대를 사용하여 데이터 범위 분포를 강조하고 각 상자의 노치를 분석하였다. 중심선은 중앙값을 나타낸다. 상자 제한은 R 소프트웨어에 의해 결정된 25번째 및 75번째 백분위 수를 나타낸다. 수염은 25 및 75 백분위 수의 사분위수 범위의 1.5배 확장되고, 특이치는 점으로 표시되며, 극단치는 별표로 표시된다. Notch는 중간 값의 95% 신뢰 구간을 나타낸다. 박스 플롯은 XLSTAT 소프트웨어(Addinsoft)를 사용하여 플롯되었다.

연구 승인 . 표본을 얻기 전에 이 연구는 서울 대학교의 기관 검토위원회 (IRB) (IRB No. E1611 / 003-008 및 E1803 / 003-007)의 승인을 받았다. 모든 동물 연구는 서울대학교 동물 관리위원회 (IACUC, IACUC No. SNU-151216-2-2)의 승인을 받았다. 우리는 동물 실험 보고를 위한 ARRIVE 지침 (https://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines)을 준수했다.

데이터 가용성 . 연구 중에 참조된 발현 프로파일링 및 게놈 변형 프로파일링 데이터는 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov) 웹 사이트의 공공 저장소에서 사용할 수 있다. 전사체 분석을 위해서는 연골육종 환자 데이터 세트 vHallor KH, et al. Genomic profiling of chondrosarcoma: chromosomal patterns in central and peripheral tumors. Clin Cancer Res 15, 2685-2694 (2009)의 (Gene Expression Omnibus : GSE12475), 쥐 연골 세포 데이터 세트 Huh YH, Lee G, Song WH, Koh JT, Ryu JH. Crosstalk between FLS and chondrocytes posttraumatic is regulated by HIF-2 alpha-mediated cytokines in arthritis. Exp Mol Med 47, (2015)의 (GSE73659), cSoderstrom M, et al. Expression of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in human chondrosarcomas. APMIS 109, 305-315 (2001)의 연골육종 세포주 데이터 세트(GSE69524), Desiderio V, et al. Molecular Profiling of Human Primary Chondrosarcoma-Derived Spheres Reveals Specific and Target Genes Involved in Multidrug Resistance and Metastasis. J Carcinogene Mutagene 5, (2013)의 일차 연골육종 세포 데이터 세트(GSE47823)가 사용되었다. 사본 번호 변경 분석을 위해, 다음 데이터 세트가 사용되었다: Hallor KH, et al. Genomic profiling of chondrosarcoma: chromosomal patterns in central and peripheral tumors. Clin Cancer Res 15, 2685-2694 (2009)의 연골육종 환자 데이터 세트 (GSE12532).

실시예 1: HIF-2α가 연골육종 환자에서 암 악성 종양의 예측 전사 인자임을 규명

연골육종의 특징적인 유전자 발현 패턴을 도출하기 위해 연골육종 환자의 전사체 데이터를 바탕으로 가중 유전자 동시 발현 네트워크 분석(WGCNA, 16)을 시행 하였다. 고도의 상관 관계가 있는 모듈 구성원 유전자로 구성된 각각 다른 3가지 유전자 모듈이 확인되었다(도 1A). 본원에서는 각 모듈을 Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (Kramer A, et al. Causal analysis approaches in Ingenuity Pathway Analysis. Bioinformatics. 2014;30(4):523-530.)에서 얻은 모든 암 관련 유전자 세트에 대한 농축 P- 값과 활성화 z- 점수를 계산하여 분석하였다. 263개의 유전자를 포함하는 M1 모듈은 '종양의 성장', '전이', '진행된 악성 종양'과 같은 암 촉진 주석에 대한 유의성있는 인리치먼트 패턴을 보여 주었으며 대부분이 고도로 활성화 된 상태에 있다. 대조적으로, M2 및 M3 모듈은 암 촉진 텀과 중복되는 정도가 상대적으로 낮았다(도 1A). 따라서 본원에서는 M1 모듈을 연골육종의 악성 특징을 결정하는 기능성 유전자 집합으로 정의했다. 이어 IPA 업스트림 조절 인자 분석을 수행하여 M1 모듈 유전자의 발현을 지배하는 전사조절자를 예측하였다. 그 결과 HIF-2α는 M1 모듈을 활성화시키는 가장 강력한 전사 인자로 예측되었다(도 1B). 실제로 본원의 유전자세트 인리치먼트 분석(GSEA)은 연골 세포에서 HIF-2α의 과발현이 전사체(transcriptome) 수준에서 M1 모듈 유전자의 전반적인 상향 조절을 유도한다는 것을 보여주었다(도 1C). WGCNA 분석에 따르면 M1 모듈 유전자 네트워크 내의 허브 유전자(즉, 높은 연결성을 갖는 허브 유전자)는 HIF-2α의 전사 표적이 되는 강한 경향이 있으며, 이는 M1 모듈 유전자가 HIF-2α에 의한 집단적으로 활성화됨을 제시한다(도 1D).

골육종, 연골육종 및 연골육종 조직의 면역 조직 화학(IHC) 분석은 연골육종 생검에서 HIF-2α 단백질의 전반적인 상향 조절을 나타냈다(도 7A). 특히, HIF-2α의 높은 발현은 잘 분화 된 연골육종보다 탈분화 것과 더 유의적으로 연관되었다(도 1, E-G). 따라서 본원에서는 HIF-2α의 활성화 상태와 환자의 임상 결과 사이에 가능한 상관 관계를 조사했다. 연골육종 환자를 HIF-2α 표적 유전자의 전사 프로파일에 따라 2군으로 분류하여 1군은 HIF-2α의 활성도가 2군에 비해 높았다(도 7의 B). 본원에서는 HIF-2α 활성과 상관 관계가 있는지 각 그룹의 환자들의 임상 데이터를 교차 점검했다. 1군의 환자는 3기 및 연골육종의 탈 분화 된 상태와 관련이 있을뿐만 아니라 예후가 좋지 않은 경향이 있었다(도 1H).

실시예 2: HIF-2α에 의한 마우스 동소 이종 이식모델에서 암전이 과정에 있어서의 선택적 이점 부여.

연골육종의 동소 마우스 모델은 인간 연골육종 세포주인 SW1353 (Clark JCM, et al. New clinically relevant, orthotopic mouse models of human chondrosarcoma with spontaneous metastasis. Cancer Cell Int. 2010;10.)에 의해 확립되었다. 경골의 골수강 내로 이식된 연골육종 세포는 6주째에 종양으로 진행되었다(도 2A). 이러한 일차 SW1353 종양 내에서, HIF-2α 발현의 상당한 이질성이 관찰되어 연골육종 세포의 일부 만이 명백한 HIF-2α 양성을 나타냈다(도 2B). 본원에서는 이식 된 연골육종 세포가 폐로 전이된 것을 확인 하였다. 흥미롭게도 폐의 이차 SW1353 종양은 빈번히 HIF-2α 양성이었다(도 2B). 일관되게, HIF-2α와 인간 미토콘드리아를 다색 면역 형광법으로 관찰되었을 때, 원발성 및 전이성 SW1353 종양 중 이중 양성의 비율은 각각 4.6% 및 70.2% 였다(도 2C). 따라서 본원에서는 HIF-2α 발현으로 인해 연골육종 세포가 그들의 원발 부위를 이탈하여 다른 장기로 전이 될 수 있음을 나타내는 것으로 가정하였다. 이 가능성을 테스트하기 위해 shEPAS1 또는 대조군 shRNA를 안정적으로 발현하는 SW1353 세포를 흉선 마우스의 경골에 이식했다(도 2D). SW1353 세포에서 HIF-2α의 낙다운은 연골을 벋어나 다른 부위로의 성장(extraosseous outgrowth) 및 폐 전이의 발생을 효과적으로 감소시켰다(도 2, E 및 F).

실시예 3: HIF-2α에 의해 유발된 전사체의 전이 및 세포 생존과 관련된 '각인(hallmark)' 유전자 세트와의 관련성

연골육종에서 HIF-2α의 역할에 대한 분자적 통찰력을 얻기 위해 HIF-1α 또는 HIF-2α 낙다운이 있거나/없는 SW1353 세포에서 전사체 분석을 수행했다. HIF-1α 및 HIF-2α 낙다운에 반응하여, 424 및 248개의 유전자가 차별적으로 하향 조절되었다(도 3A). 흥미롭게도, 오직 31개의 유전자가 2개의 HIF에 의해 공통적으로 조절되었으며, 이는 HIF-1α 및 HIF-2α가 표적 유전자 특이성에서 중복되지 않은 것을 나타낸다. M1 모듈은 HIF-2α의 낙다운에 의해 전반적으로 하향 조절되었지만 HIF-1α는 그렇지 않았고(도 3B), HIF-2α가 M1 모듈의 상류 조절자임을 뒷받침하는 것이다. Pathway enrichment analysis는 HIF-2α 낙다운 전사체에 대한 Molecular Signatures Database (MSigDB)에 특징적인 유전자 세트 (Liberzon A, et al. The Molecular Signatures Database (MSigDB) hallmark gene set collection. Cell Syst. 2015;1(6):417-425.)를 사용하여 수행되었다. 50개의 홀마크 신호 전달 유전자 세트 중 11개의 주석이 HIF-2α 낙다운 의해 유의한 영향을 받았다(도 3C). 악성 연골육종에 관련된 것들은 '상피 간엽 전이 (EMT)'(24개), '세포사멸'(25개), 'p53 결로'(26, 27개) (도 3D)이었다.

실시예 4: HIF-2α는 미세 환경 특이적 ECM 분해 효소를 상향 조절함으로써 전이 능력을 증가시킴.

전사체 분석은 HIF-2α 발현이 암세포 침입과 전이에 필수적인 과정인 EMT의 홀마크 유전자의 발현과 밀접한 상관 관계가 있음을 나타냈다. 연골육종에서 전이의 시작은 주위 기질로의 침입과 지방 혈류로의 이동을 필요로 한다 (Egeblad M, et al. New functions for the matrix metalloproteinases in cancer progression. Nat Rev Cancer. 2002;2(3):161-174., Friedl P, et al. Tube travel: The role of proteases in individual and collective a cancer cell invasion. Cancer Res. 2008;68(18):7247-7249.). 따라서 본원에서는 HIF-2α가 두 가지 연골육종 세포주인 SW1353과 OUMS-27의 침입 및 이동에 어떻게 영향을 주는지 시험했다. HIF-2α 낙다운은 그들의 침입정도를 현저하게 억제했지만(도 4A), 그들의 이동 속도는 영향을 받지 않았다(도 4B와 도 8A). 연골육종 전이를 일으키는 중요한 사건은 MMP(matrix metalloproteinases)와 같은 이화 작용 효소에 의한 뼈 특이적 세포외매트릭스(ECM)의 주변 층의 파괴이다 (Egeblad M, et al. New functions for the matrix metalloproteinases in cancer progression. Nat Rev Cancer. 2002;2(3):161-174., Soderstrom M, et al. Expression of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in human chondrosarcomas. APMIS. 2001;109(4):305-315.). 실제로, HIF-2α는 MMP1, MMP2 및 MMP9(도 4C)의 실질적인 상향 조절을 유발하였으며, 이는 뼈에 풍부한 ECM 분자를 특이적으로 분해한다 (Murphy G, et al. What are the roles of metalloproteinases in cartilage and bone damage? Ann Rheum Dis. 2005;64:44-47.). 이러한 MMPs는 TRANSFAC 분석에 의해 예측 된대로 그들의 프로모터 영역에 HIF 결합 부위를 가지고 있다(도 8B). 일관되게 HIF-2α 과발현은 연골육종 세포의 총 MMP 활성을 약 3배 증가 시켰으며 HIF-2α의 낙다운은 하부 기질의 분해를 실질적으로 감소시켰다(도 4, D 및 E). 연골육종 환자 전 사체에서 HIF-2α 및 HIF-2α 표적 MMPs는 양의 상관 관계를 보였다(도 8C). 반대로 이 MMPs는 HIF-1α와 상관 관계가 없었으며 연골 세포에서 HIF-2α의 번역 후 음성 조절인자인 HIF-3α와는 음성 상관 관계를 보였다(도 8C). 이러한 결과는 HIF-2α가 주변 뼈 기질의 분해를 촉진하고 원발 종양에서 연골육종 세포의 초기 탈출을 가능하게하는 서브세트의 MMP 계열 단백질을 직접적으로 상향조절함을 나타낸다.

실시예 5: HIF-2α 발현에 의한 연골육종의 종양 개시 능 부여

전이 과정을 완료하기 위해 일차 종양으로부터 나오는 세포는 이차 부위에 정착하기 위해 클론원성 및 자가 재생 특성이 필요하다 (Reya T, et al. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 2001;414(6859):105-111.). 이러한 종양 유발 양상은 종종 암의 줄기세포성(stemness) 획득과 관련이 있다 (Wu C, et al. Side population cells isolated from mesenchymal neoplasms have tumor initiating potential. Cancer Res. 2007;67(17):8216-8222.). 따라서, 본원에서는 HIF-2α가 연골육종 세포에서 이 재 프로그래밍을 일으키는지 여부를 조사했다. HIF-2α 낙다운에 대한 반응으로, SW1353 전사체는 HIF-2α와 암 줄기세포 연관성을 암시하는 '암 줄기 세포'유전자 세트(도 4F)에서 부정적으로 영향을 받았다. 암 줄기세포성을 측정하기 위한 구형 분석에서 HIF-2α는 이러한 구형 형성 SW1353 및 OUMS-27 세포에서 단층으로 배양된 세포와 비교하여 높게 나타났다(도 4G). 공개 데이터 세트 (Desiderio V, et al. Molecular Profiling of Human Primary Chondrosarcoma-Derived Spheres Reveals Specific and Target Genes Involved in Multidrug Resistance and Metastasis. J Carcinogene Mutagene. 2013;5(1).)와의 교차 검사는 단일 세포층 대조군(도 4G)과 비교하여 일차 배양된 연골육종 세포에서 HIF-2α 수준이 지속적으로 상승함을 보였다. 연골육종 세포주의 구형 형성 잠재력은 HIF-2α의 낙다운에 의해 유의하게 떨어졌다(도 4, H와 I, 그리고 도 9A). 사실, HIF-2α는 NANOG, SOX2, OCT4 및 CD44를 포함하여 TRANSFAC 분석(도 4J와 도 9B)에 의해 예측 된 HIF 결합 부위를 포함하는 주요 전능성(pluripotency) 유전자의 전사를 조절했다. 일관되게, HIF-2α 낙다운 연골육종 세포의 클론원성 능력을 억제했다(도 4K). 또한 HIF-2α는 연골육종 전이에 필요한 핵심 세포 과정을 조절하는 것으로 나타났다(도 4L).

실시예 6: HIF-2α 과다 발현에 의한 연골육종 세포의 전이능 증가

HIF-2α가 연골육종 전이를 유도함에 있어 역할을 테스트하기 위해 HIF-2α 또는 eGFP를 안정적으로 과발현하는 SW1353 세포를 제조하였다. 특히, SW1353-EPAS1 안정 세포주의 서브 세트는 접착성 배양 시스템에서조차도 자발적으로 사르 스코스피어(sarcospheres)를 형성하였다(도 10A). HIF-2α 과발현은 이동 속도에 영향을 주지 않으면서 SW1353 세포의 침입을 촉진시켰다(도 10 B와 C). HIF-2α 과발현은 성장 인자 보충제가 없거나 클론원성이 현저하게 증가한 경우에도 구체 형성을 가능하게 했다(도 10 D와 E). 다음으로, HIF-2α- 또는 eGFP- 과발현 세포를 무흉선 마우스 경골에 정위적으로 이식하였다(도 10F). HIF-2α가 과발현된 연골육종 세포가 주입 된 마우스는 전이가 크게 증가하였으며, 이는 HIF-2α가 연골육종의 전이를 유발함을 증명하는 것이다(도 10의 G~I).

실시예 7: HIF-2α 억제제와 시스플라틴의 병용 치료에 의한 연골육종의 악성 종양의 치료 효과

화학내성은 연골육종의 치료를 위한 주요 장애물이다. EGFR (Song YD, et al. Inhibition of EGFR-induced glucose metabolism sensitizes chondrosarcoma cells to cisplatin. Tumour Biol. 2014;35(7):7017-7024.), mTOR (Zhu Z, et al. MicroRNA-100 resensitizes resistant chondrosarcoma cells to cisplatin through direct targeting of mTOR. Asian Pac J Cancer Prev. 2014;15(2):917-923.) 및 Src (Huang K, et al. Inhibition of Src by microRNA-23b increases the cisplatin sensitivity of chondrosarcoma cells. Cancer Biomark. 2017;18(3):231-239., Schrage YM, et al. Kinome Profiling of Chondrosarcoma Reveals Src-Pathway Activity and Dasatinib as Option for Treatment. Cancer Res. 2009;69(15):6216-6222.)에 의해 매개되는 발암성 신호 전달 경로를 표적으로 하는 몇 가지 분자 접근법이 성공적으로 연골육종 세포를 시스플라틴과 같은 항암제에 민감하게 하려고 시도되었다. 본원에서는 HIF-2α 활성의 약리학적 억제가 연골육종에 대한 보조 요법의 새로운 선택으로 사용될 수 있는지 여부를 시험했다. 저분자 HIF-2α 억제제인 TC-S7009 (Scheuermann TH, et al. Allosteric inhibition of hypoxia inducible factor-2 with small molecules. Nat Chem Biol. 2013;9(4):271-276.)는 명백한 세포 독성없이 연골육종 세포에서 HIF-2α의 전사 활성을 효과적으로 없애는 것으로 나타났다(도 11, A 및 B). TC-S7009 처리는 SW1353 세포에서 침습성 표현형, 기질 분해 작용, 구형 형성 및 클론원성을 효과적으로 차단했다(도 5, A-D 및 도 11, C와 D).

HIF-2α 낙다운은 세포사멸 경로와 직접적으로 관련이 있는 '세포사멸' 및 'p53 pathway' 유전자 세트(도 3D)의 양성 인리치먼트를 유발했다. 그러나 TC-S7009만으로는 세포 사멸에 현저한 영향을 미치지 않았다(도 5E). 연골육종 세포가 시스플라틴에 대한 내성이 높다는 것과 일치하게, 시스플라틴은 Annexin-V와 propidium iodide (PI) 양성 집단에서 약간의 증가만을 일으켰다(도 5E). 대조적으로, TC-S7009 및 시스플라틴과의 병용 치료는 Annexin-V 양성 세포를 현저히 증가 시켰으며, 이는 연골육종 세포의 사명을 촉발하는데 있어 두 가지 성분의 상승적 효과를 나타낸다.

HIF-2α 억제와 시스플라틴 사이의 상승 작용을 더 연구하기 위해 Chou-Talalay 방법을 사용하여 조합 지수를 계산하였으며, 이는 약물 조합의 정량적 특성 분석을 가능하게 한다 (Chou TC. Drug Combination Studies and Their Synergy Quantification Using the Chou-Talalay Method. Cancer Res. 2010;70(2):440-446.). PARP 억제제인 ABT-888과 p53 활성화제인 Nutlin-3a는 다양한 암세포 유형에서 시스플라틴 유도된 세포 사멸을 민감하게 하는 효과가 입증되어 양성 대조군으로 사용되었다 (Donawho CK, et al. ABT-888, an orallyactive poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor that potentiates DNA-damaging agents in preclinical tumor models. Clin Cancer Res. 2007;13(9):2728-2737., Deben C, et al. The MDM2-inhibitor Nutlin-3 synergizes with cisplatin to induce p53 dependent tumor cell apoptosis in non-small cell lung cancer. Oncotarget. 2015;6(26):22666-22679.). 시스플라틴 -TC-S7009 및 시스플라틴 -ABT-888 조합은 시스플라틴 -Nutlin-3a 조합(도 5F)보다 더 강한 상승 작용을 나타냈다.

화학 요법 보조제로서의 HIF-2α 억제제의 잠재적인 생체 내 치료 효과를 종양 이종이식에서 평가 하였다. 확립된 SW1353 종양을 갖는 마우스를 비히클, 시스플라틴, TC-S7009 또는 TC-S7009와 함께 시스플라틴으로 처리하였다(도 5G). 시스플라틴 또는 TC-S7009 치료만으로는 골외성 성장 및 폐 전이성 결절 형성이 경미한 정도에서 중등도 정도로 감소했다(도 5, I, K 및 L). 흥미롭게도, 시스플라틴과 TC-S7009의 병용 요법을 받은 생쥐에서 뼈 표면의 원발 종양의 침윤성 성장은 거의 사라졌으며, 폐 전이 억제에도 중대한 영향을 미치는 것으로 나타났다(도 5, H-L).

실시예 8: HIF-2α 연골육종 환자에서 HIF-2α 경로의 변화와 암 예후의 연관성

본원에서는 연골육종 환자의 예후와 HIF-2α 경로에 영향을 미치는 CNA(copy number alteration)의 연관성이 있는지를 조사하였다. 67명의 환자의 게놈 프로필은 다양한 게놈 불안정성을 나타냈다 (Hallor KH, et al. Genomic profiling of chondrosarcoma: chromosomal patterns in central and peripheral tumors. Clin Cancer Res. 2009;15(8):2685-2694.). 본원에서는 HIF1A 및 EPAS1 유전자좌의 CNA를 GLAD (Gain and Loss Analysis of DNA) 세분화 방법(도 6A 및 도 12) (Hupe P, et al. Analysis of array CGH data: from signal ratio to gain and loss of DNA regions. Bioinformatics. 2004;20(18):3413-3422)을 사용하여 분석했다. HIF1A 유전자좌의 CNA는 전반적 또는 무재발 생존에 유의한 영향을 미치지 않았다(도 6B). 대조적으로, EPAS1 유전자좌의 카피 수 증가를 갖는 환자는 EPAS1 카피수의 손실 또는 변화가 없는 환자와 비교하여 예후가 불량하였다(도 6C). 본원에서는 HIF 단백질을 분해하는 E3-ubiquitin ligase 복합체의 인식성분인 von Hippel-Lindau 종양 억제 단백질(pVHL)의 CNA 상태에 중점을 두었다. 실제로, VHL의 손실은 연골 세포에서 증가 된 HIF-2α 활성과 관련이 있다 (Weng T, et al. Loss of Vhl in cartilage accelerated the progression of age-associated and surgically induced murine osteoarthritis. Osteoarthr Cartilage. 2014;22(8):1197-1205.). 본원에서는 연골육종이 있는 67명의 환자를 EPAS1과 VHL의 CNA 상태에 따라 두 그룹으로 분류하여 그룹 1은 과잉 활동성 HIF-2α 경로를 갖고, 그룹 2는 비교적 낮은 활성을 갖는 것으로 가정했다(도 6D). 따라서 그룹 1의 환자는 전체 및 무재발 생존율 모두에서 2군에 비해 유의하게 예후가 낮았으며, 이는 HIF-2α 경로 성분의 게놈 변화를 기초로 연골육종 환자에서 "고 위험" 환자의 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있음을 나타내는 것이다(도 6e).

연골육종은 전이성 잠재력이 거의없는 저등급 종양에서부터 전이성 전이 및 재발을 특징으로하는 고등급의 탈분화된 공격성 종양에 이르기까지 다양하며 치료가 불가능하여 예후가 나빠질 수 있다.

본원에서는 연골육종 환자의 전체 전사체의 시스템 수준에서의 특성을 조사했다. 유전자 동시 발현 분석은 종종 암에 있는 교란된 전사 네트워크에 대한 유용한 글로벌 관점을 제공하며 질병의 주요 치료 표적 식별에 대한 로드맵 구성에 사용될 수 있다. 본원에서는 환자 전사체에서 WGCNA을 수행함으로써, 연골육종에 잠재적으로 책임이 있는 유전자 모듈을 도출하고 HIF-2α가 그 모듈의 마스터 조절자임을 규명하였다.

환자에서 연골육종의 조직 학적 등급과 HIF-2α 수준 사이의 양의 상관 관계는 이전에 주목되었다 (Chen C, et al. Association of elevated HIF-2alpha levels with low Beclin 1 expression and poor prognosis in patients with chondrosarcoma. Ann Surg Oncol. 2011;18(8):2364-2372.). 하지만 본 연구에서는 HIF-2α 발현이 잘 분화 된 연골육종보다 탈분화된 연골육종과 더 유의하게 연관되어 있음을 발견하였다. 본원에서는 또한 HIF-2α가 연골육종이 매우 전이성이고 치료가 어려운 상태로 전환하는데 중심적인 역할을 하는 것을 규명하였다. HIF-2α는 골 기질을 파괴하여 침윤성을 향상시키는 MMP1, MMP2 및 MMP9의 발현을 유도함으로써 연골육종 세포에 용골성 침윤을 부여하는 것을 규명하였다. 이러한 발견은 전이성 연골육종에서 이러한 단백질의 발현 증가와 일치한다 (Soderstrom M, et al. Expression of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in human chondrosarcomas. APMIS. 2001;109(4):305-315., Schoedel KE, et al. Expression of metalloproteinases and tissue inhibitor in cartilaginous neoplasms of bone. Appl Immunohistochem. 1997;5(2):111-116.). 또한 HIF-2α는 연골육종 세포의 자가 재생 및 클론원성 능력을 부여함으로써 전이 부위에서 종양 발생을 촉진한다는 것을 규명하였다.

연골육종의 몇몇 병리학적 및 세포적 특징, 예컨대 그들의 낮은 증식률은 종래의 항암 요법의 효능을 제한하였다. 본원에서는 기존의 화학 요법제와 함께 HIF-2α 억제가 연골육종 세포의 세포 사멸을 유발하는 시너지 효과를 통해 연골육종의 악성 종양을 효과적으로 완화시킨다는 것을 보여 주었다. 최근 TC-S7009의 유사체인 HIF-2α 길항제 2개가 HIF-2α 수치가 높아진 (Chen W, et al. Targeting renal cell carcinoma with a HIF-2 antagonist. Nature. 2016;539(7627):112-117., Cho H, et al. On-target efficacy of a HIF-2alpha antagonist in preclinical kidney cancer models. Nature. 2016;539(7627):107-111.) 신세포 암에서 잠재적인 임상적 사용을 입증했다. HIF-2α는 잠재적인 약물 표적이 될 수 있으며, HIF-2α 과활성 연골육종 환자의 치료 전략 개발에 사용될 수 있다.

[표 1] 그룹화된 환자의 임상 병리학 특징

[표 2-1] 본 출원에 사용된 올리고머

[표 2-2]

[표 2-3]

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Pharmaceutical composition comprising agent inhibiting the activity of HIF-2alpha for treating chondrosarcoma, or preventing recurrence and metastasis thereof <130> DP201807001p <150> KR 10-2017-0150375 <151> 2017-11-13 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HIF2alpha siRNA sense sequence <400> 1 acuacguccu gagugagau 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HIF2alpha siRNA antisense sequence <400> 2 aucucacuca ggacguagu 19

Claims (15)

1. HIF-2α 억제제를 포함하는 연골육종의 치료, 전이 또는 재발 억제용 약학 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 HIF-2α 억제제는 HIF-2α 단백질 전사 활성을 억제하는, 연골육종 치료, 전이 또는 재발 억제용 약학 조성물.
   
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 HIF-2α 억제제는 TC-S7009 [N-(3-Chloro-5-fluorophenyl)-4-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-5-amine], 또는 그 유사체인 PT2385 [((S)-3-((2,2-difluoro-1-hydroxy-7-(methylsulfonyl)-2,3-dihydro-1H-inden-4-yl)oxy)-5-fluorobenzonitrile)], 또는 그 유사체인 PT2385 [((S)-3-((2,2-difluoro-1-hydroxy-7-(methylsulfonyl)-2,3-dihydro-1H-inden-4-yl)oxy)-5-fluorobenzonitrile)] 또는 PT2399 [((S)-3-((7-((difluoromethyl)sulfonyl)-2,2-difluoro-1-hydroxy-2,3-dihydro-1H-inden-4-yl)oxy)-5-luorobenzonitrile)인, 연골육종 치료, 전이 또는 재발 억제용 약학 조성물.
   
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 조성물은 항암 화학요법제를 추가로 포함하는 연골육종 치료, 전이 또는 재발 억제용 약학 조성물.
   
5. 제 4 항에 있어서,
   상기 HIF-2α 억제제는 TC-S7009, 또는 그 유사체인 PT2385 또는 PT2399 이고,
   상기 항암 화학요법제는 시스플라틴 또는 독소루비신인, 연골육종 치료, 전이 또는 재발 억제용 약학 조성물.
   
6. 제 1 항에 있어서, 상기 억제제는 상기 HIF-2α 유전자의 단백질로의 발현을 억제하는 siRNA인, 연골육종 치료, 전이 또는 재발 억제용 약학 조성물.
   
7. 제 6 항에 있어서, 상기 siRNA는 서열번호 1로 표시되는 RNA와 서열번호 2로 표시되는 RNA를 포함하는 dsRNA인, 연골육종 치료, 전이 또는 재발 억제용 약학 조성물.
   
8. HIF-2α를 과발현하는 세포를 제공하는 단계;
   상기 세포에 HIF-2α의 발현 또는 활성을 억제할 것으로 기대되는 시험물질을 처리하는 단계; 및
   상기 처리결과, 시험물질을 처리하지 않은 세포와 비교하여, 상기 세포에서
   상기 HIF-2α의 발현 또는 활성이 감소한 경우, 상기 시험물질을 연골육종 치료제 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, 연골육종 치료제 스크리닝 방법.
   
9. 제 8 항에 있어서,
   상기 세포는 연골육종 세포인, 연골육종 치료제 스크리닝 방법.
   
10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,
    상기 연골육종은 탈분화(dedifferentiated) 연골육종인, 연골육종 치료제 스크리닝 방법.
    
11. 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 검출하는 단계는 MMP(matrix metalloproteinases)1, MMP2 및 MMP9 발현을 검출하는 단계를 추가로 포함하며,
    상기 검출결과 상기 MMP1, MMP2 및 MMP9 발현이 시험물질을 처리하지 않은 세포와 비교하여 감소한 경우, 상기 시험물질을 연골육종 치료제 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, 연골육종 치료제 스크리닝 방법.
    
12. HIF-2α 검출용 물질을 포함하는 연골육종 진단용 조성물.
    
13. 제 12 항에 있어서,
    상기 연골육종은 탈분화된 연골육종인, 연골육종 진단용 조성물.
    
14. 대상체의 연골육종 진단에 대한 정보를 제공하기 위하여,
    상기 대상체로부터 유래된 생물학적 시료를 제공하는 단계:
    상기 생물학적 시료에서 HIF-2α의 발현량 또는 활성을 검출하는 단계;
    상기 검출결과, 대조군과 비교하여 상기 생물학적 시료에서 상기 HIF-2α의 발현량이 증가 또는 활성이 증가된 경우, 상기 대상체 유래의 생물학적 시료를 연골육종으로 진단하는 단계를 포함하는, HIF-2α 마커의 검출방법.
    
15. 제 14 항에 있어서,
    상기 연골육종은 탈분화된 연골육종인, HIF-2α 마커의 검출방법.

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