WO2021153798A1 - 移植腎慢性拒絶反応及び慢性腎臓病の発症又は進行の可能性を評価する方法、検査キット及び医薬組成物 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention is a method and a test kit for evaluating the possibility of developing or progressing chronic kidney disease or chronic kidney disease, and for prevention and / or treatment of chronic kidney disease or chronic kidney disease. With respect to the pharmaceutical composition of.
  • Chronic kidney disease is a condition in which either or both of renal disorders typified by proteinuria and renal dysfunction using glomerular filtration rate as an index persist for 3 months or longer. , 1 in 8 adults in Japan is affected.
  • CKD chronic kidney disease
  • the effects of drug treatment cannot be expected, and many patients are forced to undergo dialysis.
  • dialysis is a symptomatic treatment, patients with end-stage renal disease must continue to receive dialysis for the rest of their lives, which imposes a heavy physical and financial burden on the patients.
  • the increase in dialysis medical costs has become a concern in the medical economy.
  • biomarkers such as urinary protein, urinary albumin, serum creatinine (Cre), urea nitrogen (BUN) and estimated glomerular filtration rate (eGFR).
  • these biomarkers have the advantage of being easily measurable or calculable, they are not suitable for early and sensitive detection of the progression of renal dysfunction.
  • Non-Patent Document 1 Data from the 2013 US Kidney Data System (Non-Patent Document 1) show that those who have undergone kidney transplantation have better survival rates than dialysis patients.
  • a major issue that affects the success rate of kidney transplantation is immune rejection of allogeneic grafts.
  • immunosuppressive agents and medical technology the risk of acute immune rejection has been significantly reduced.
  • relatively slowly progressing chronic rejection represented by chronic active antibody-mediated rejection (CAAMR) is still difficult to overcome.
  • CAAMR chronic active antibody-mediated rejection
  • Chronic rejection is rejection that occurs 3 months after kidney transplantation. Chronic rejection often progresses gradually without clear clinical symptoms being observed, and failure to take appropriate measures is likely to lead to loss of renal transplant function. Diagnosis of chronic rejection is generally made by biopsy (biopsy) of the graft. However, biopsy is a heavy burden on the subject and is not a simple method. In addition, biopsy may underestimate the grade of rejection or miss lesions. Therefore, a simple and accurate method for determining the possibility of the onset or progression of chronic rejection is to diagnose chronic rejection, determine the appropriate timing of biopsy, and appropriate prophylactic or therapeutic treatment for chronic kidney disease. It is beneficial for implementation at the right time and has important significance in renal transplantation treatment.
  • synaptotagmin is a membrane protein present on synaptic vesicles identified as a calcium-phospholipid-binding molecule, and functions as a calcium sensor in exocytosis from synaptic vesicles due to its ability to bind to calcium ions. Is believed to be.
  • Synaptotagmin-17 has two C-terminal C2-like domains that are structurally homologous to the C-terminal C2-region common to the human synaptotagmin family, but has an N-terminal transmembrane region. Does not have.
  • the SYT17 protein is expressed in the brain and kidney, and is increased in the hippocampus, especially in the kainic acid-induced rat seizure model, and in the proximal tubule in the kidney after ischemia-reperfusion injury, and the expression level is increased according to the medical condition. It has been reported to change (Non-Patent Document 2 and Non-Patent Document 3). However, there have been no reports so far on changes in the functional role and expression level of the SYT17 protein in chronic kidney disease and chronic rejection.
  • An object of the present invention is to evaluate the possibility of developing or progressing chronic renal rejection of transplanted kidney or chronic kidney disease, and to provide a clinical index that can provide appropriate information for performing a transplanted renal biopsy or necessary treatment. do.
  • the present inventors have found that a large amount of SYT17 protein is present in the urine sample of a patient who has developed chronic renal rejection or chronic kidney disease as compared with a healthy subject, and completed the following invention.
  • the method according to (1) which comprises a step of evaluating.
  • the method according to (1) which comprises a step of evaluating.
  • the step of comparing the amount of SYT17 protein in the second urine-derived sample collected from the same subject; and the amount of SYT17 protein in the first urine-derived sample is higher than the amount of SYT17 protein in the second urine-derived sample.
  • the subject includes a step of evaluating that the transplanted renal chronic rejection reaction or chronic kidney disease is more likely to be advanced at the time of collecting the first urine-derived sample than at the time of collecting the second urine-derived sample (1). ).
  • kidney transplantation a Renal diseases that cause chronic kidney disease are membranous nephropathy, nephrosis syndrome, lupus nephritis, diabetic nephropathy, IgA nephropathy, focal segmental glomerulosclerosis, and autosomal dominant multiple cystic kidney.
  • Renal diseases that cause chronic kidney disease are membranous nephropathy, nephrosis syndrome, lupus nephritis, diabetic nephropathy, IgA nephropathy, focal segmental glomerulosclerosis, and autosomal dominant multiple cystic kidney.
  • a pharmaceutical composition for the prevention and / or treatment of renal transplant renal rejection or chronic kidney disease which comprises at least one substance selected from the group consisting of a specific antibody against SYT17 and a derivative thereof and an inhibitory nucleic acid against SYT17. thing.
  • the pharmaceutical composition according to (8) which is the pharmaceutical composition according to (8), for administration to a subject having a urinary SYT17 protein amount greater than or exceeding the urinary SYT17 protein amount of a control.
  • the value is the amount of SYT17 protein in urine-derived samples collected from multiple patients and controls who have chronic renal rejection or chronic kidney disease, and ROC analysis is performed on these measured values.
  • the pharmaceutical composition which is determined by doing so.
  • Renal diseases that cause chronic kidney disease are membranous nephropathy, nephrosis syndrome, lupus nephritis, diabetic nephropathy, IgA nephropathy, focal segmental glomerulosclerosis, and autosomal dominant multiple cystic kidney.
  • the pharmaceutical composition according to (8) or (9) which is chronic transplant nephropathy.
  • (11) A test kit containing a specific antibody against SYT17 or a derivative thereof for use in evaluating the possibility of developing or progressing chronic renal rejection of transplanted kidney or chronic kidney disease.
  • a non-invasive and easily collectable sample called a urine-derived sample, and prevent and / or prevent it.
  • treatment can be performed.
  • FIG. 1A is from renal transplant patients classified into normal histopathology group (NED), fibrosis group (IF / TA), calcineurin toxicity group (CNI-T) and chronic active antibody-related rejection group (CAAMR). It is a typical fluorescence micrograph showing the result of immune tissue staining for SYT17 protein of the transplanted kidney sample of.
  • the vertical axis of the graph represents the relative expression level of each gene in unstimulated cells.
  • HRGEC human renal glomerular endothelial cells
  • RPTEC human renal proximal tubule epithelial cells
  • C is a control cell into which a negative control siRNA has been introduced
  • P is a control cell into which a positive control siRNA has been introduced.
  • FIG. 6A is a photograph showing the results of immunoblotting for SYT17 protein using whole urine samples of healthy volunteers (Healthy), NED and CAAMR.
  • PC is a cytolysin of cells that overexpresses the SYT17 protein.
  • FIG. 6B is a photograph showing the results of immunoblotting for the SYT17 protein using the urinary exosome fractions of healthy volunteers, NED and CAAMR.
  • FIG. 6C is a graph showing the results of quantifying the bands of SYT17 and CD9 detected in the immunoblotting of the urinary exosome fraction for each lane using ImageJ software as SYT17 / CD9.
  • SYT17 / CD9 Fig. 7A
  • existing clinical markers N-acetyl- ⁇ -D-glucosaminidase (NAG)
  • NAG N-acetyl- ⁇ -D-glucosaminidase
  • the present inventors detected almost or very little SYT17 protein in the urinary exosome fractions of healthy subjects and NED, while those who developed chronic rejection after renal transplantation. It was confirmed that about 10 times as much SYT17 protein as that of healthy subjects or NED was detected.
  • SYT17 protein is an inflammatory circuit (Inflammation amplifier) (Ogura et al.,) In which the expression and production of inflammatory mediators such as IL-6 are synergistically increased by the simultaneous activation of the NF- ⁇ B pathway and the STAT3 pathway.
  • the inflammatory circuit is a molecular mechanism that induces the pathophysiology of chronic inflammation reported by the present inventors.
  • Cytokines such as IL-6 and IL-17 produced from the non-immune cells themselves and the induced T cells when inflammatory stimulation is applied to type I collagen-positive non-immune cells such as fibroblasts, keratinocytes, and vascular endothelial cells.
  • the NF- ⁇ B pathway and the STAT3 pathway are simultaneously activated in non-immune cells, and the production of cytokines such as IL-6, chemokines, growth factors, etc. is synergistically increased.
  • the produced IL-6 acts on the non-immune cells themselves to enhance the inflammatory circuit, and chemokines and growth factors cause cell infiltration to disrupt homeostasis. It has been experimentally proven that the continuous enhancement of this inflammatory circuit induces the pathophysiology of chronic inflammation.
  • the phosphorylation (activation) of NF- ⁇ B p65 and STAT3 was enhanced in the tubules of CAAMR, and human tubule epithelial cells were observed.
  • Co-stimulation with IL-6 and NF ⁇ increases the expression levels of IL-6 and CCL20 as well as the expression level of SYT17, while knocking down SYT17 in human tubule epithelial cells causes IL-6 and CCL2. It was confirmed that the expression was suppressed, and that forcible expression of SYT17 enhanced the NF- ⁇ B promoter activity and the IL-6 promoter activity.
  • SYT17 whose expression is induced in tubular epithelial cells by the inflammatory circuit, promotes inflammation through positive feedback. Therefore, the amount of SYT17 protein in urine-derived samples means that it is an effective non-invasive diagnostic marker for the onset and progression of chronic rejection and chronic kidney disease associated with chronic inflammation.
  • substances that suppress the expression of SYT17 and substances that inhibit the activity of SYT17 can suppress the enhancement of the inflammatory circuit in chronic rejection and chronic kidney disease, and prevent chronic rejection or chronic kidney disease and / or. It is considered to be useful for treatment.
  • the first aspect of the present invention evaluates the possibility of the subject's chronic rejection of transplanted kidney or the onset or progression of chronic kidney disease using the amount of SYT17 protein in a urine-derived sample collected from the subject as an index. Regarding the method.
  • this embodiment will be described by exemplifying a preferred embodiment.
  • One preferred embodiment of this embodiment is the step of measuring the amount of SYT17 protein in a urine-derived sample collected from a subject; the step of comparing the amount of SYT17 protein in a subject urine-derived sample with a cutoff value; and subject urine. If the amount of SYT17 protein in the derived sample exceeds the cutoff value, the subject includes a step of evaluating that the subject has developed or is likely to develop chronic renal transplantation rejection or chronic kidney disease.
  • the urine-derived sample in the present invention may be urine itself or a processed product such as a concentrated urine or a partially purified product, and can be appropriately selected depending on the method for measuring the SYT17 protein.
  • the urine-derived sample may be urine itself.
  • the urine-derived sample is preferably a processed urine from the viewpoint of concentrating the SYT17 protein.
  • the processed urine product is preferably a processed product in which urinary exosomes are concentrated, and a typical example thereof is an exosome fraction recovered from urine.
  • the exosome fraction can be recovered from urine by a known method using an ultracentrifugation method such as a pellet down method, a sucrose cushioning method or a density gradient centrifugation method. It can also be recovered using, for example, MagCapture Exosome Isolation Kit PS (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), DiagExo (registered trademark) Urinary Exosome Isolation Kit (101Bio, LLC), or other commercially available urinary exosome separation kits.
  • MagCapture Exosome Isolation Kit PS Fluji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • DiagExo registered trademark Urinary Exosome Isolation Kit
  • the amount of SYT17 protein in a urine-derived sample is a general method capable of measuring the target protein in a biological sample, for example, an immunoassay for the SYT17 protein, a high-sensitivity mass spectrometry method such as TOF-MS. It can be measured by such means.
  • the immunoassay uses a specific antibody against the SYT17 protein or a derivative thereof, and a method known or well known to those skilled in the art, for example, The Immunoassay Handbook: Theory and Applications of Ligand Binding, ELISA and Related Techniques (4TH), Elsevier is referred to. Can be done.
  • the specific antibody against the SYT17 protein that is, the antibody that specifically binds to the SYT17 protein is an antibody that preferentially binds to the SYT17 protein over the non-target protein.
  • Specific antibodies to the SYT17 protein can also be described as antibodies that have a high binding affinity for the SYT17 protein and are at least 2-fold stronger, preferably at least 10-fold stronger, more preferably at least 20-fold stronger than the affinity with the non-target protein. Most preferably, it has at least 100-fold stronger affinity and can bind to the SYT17 protein. If an antibody can detect the presence of the SYT17 protein without unwanted results, typically false positives, false negatives, etc., then the antibody is considered to be a specific antibody against the SYT17 protein.
  • Specific antibodies to the SYT17 protein can originate from any species, including, for example, mice, rats, sharks, rabbits, pigs, hamsters, camels, llamas, goats or humans.
  • the specific antibody can be of any class (eg IgG, IgE, IgM, IgD or IgA) and subclass of immunoglobulin molecule, but is preferably IgG.
  • the specific antibody used for measuring the amount of SYT17 protein may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and the specific antibody used in the pharmaceutical composition described later is preferably a monoclonal antibody.
  • the specific antibody can be a chimeric antibody, a humanized antibody or a human antibody.
  • a derivative of a specific antibody against the SYT17 protein is an antigen-binding fragment derived from the above antibody, which is defined as a partial fragment of an antibody having the ability to specifically bind to an antigen, for example, Fab (fragment of antibody binding), Fab'. , F (ab') 2, single chain antibody (single chain Fv), disulfide stabilized antibody (disulfide stabilized Fv), peptide containing CDR, etc., but is not limited thereto.
  • Specific antibodies against SYT17 protein and derivatives thereof can be prepared by a method known to those skilled in the art.
  • the amino acid sequence of the human SYT17 protein (registered in NCBI as accession numbers NP_057608.2, NP_001317438.1, NP_001295086.1) or the base sequence of the DNA encoding this (accession number NM_016524.4 in NCBI, SYT17 protein is prepared by a genetic recombination method based on (registered as NM_001308157.2, NM_001330509.1), and by immunizing an appropriate animal with this as an antigen, the B cells of the animal are further fused with myeloma cells.
  • hybridoma It can be produced by obtaining a hybridoma.
  • hybridoma method for example, Meyaard et al. (1997) Immunity 7: 283-290; Wright et al. (2000) Immunity 13: 233-242; Kaithamana et al. (1999) J.Immunol. 163: 5157-5164 Please refer to.
  • commercially available anti-SYT17 antibodies such as Anti-SYT17 HPA040811 (Atlas antibodies), anti-SYT17 antibody (Proteintech), SYT17 antibody (invitrogen), etc., and the same or sequence identity as the CDR sequence of these antibodies is 90%.
  • Antibodies containing the above amino acid sequences as CDR sequences, and amino acid sequences having the same or sequence identity of 90% or more as the amino acid sequences of the heavy chain variable region and light chain variable region of these antibodies are used in the heavy chain variable region and light chain.
  • Antibodies included as chain variable regions are also available.
  • labeled compounds include fluorescent substances (eg FITC, rhodamine, etc.), metal particles such as gold colloid, fluorescent microbeads such as Luminex (registered trademark, Luminex), chromoproteins (eg phycoerythrin, phycocyanin, etc.), radioisotopes.
  • fluorescent substances eg FITC, rhodamine, etc.
  • metal particles such as gold colloid
  • fluorescent microbeads such as Luminex (registered trademark, Luminex), chromoproteins (eg phycoerythrin, phycocyanin, etc.), radioisotopes.
  • Luminex registered trademark, Luminex
  • chromoproteins eg phycoerythrin, phycocyanin, etc.
  • radioisotopes eg.g 3 H, 14 C, 32 P, 35 S, 125 I, 131 I, etc.
  • enzymes eg, peroxid
  • the amount of SYT17 protein may be expressed by the mass of SYT17 protein per unit volume of urine, that is, the concentration of SYT17 protein, and a method capable of detecting the presence of the target protein as an output signal, for example, fluorescence intensity in a fluorescence immunoassay.
  • the integrated value of the output signal representing the SYT17 protein may be used as the protein amount.
  • the amount of SYT17 protein can be expressed as an absolute value or a relative value with respect to the internal standard, depending on the measurement method.
  • the amount of SYT17 protein is relative to the amount of proteins recognized by those skilled in the art as exosome markers, such as proteins such as CD9, CD63, CD81, ALIX. Can be represented.
  • the amount of SYT17 protein in the urine-derived sample collected from the subject is compared with the cutoff value.
  • the cutoff value the amount of SYT17 protein in urine-derived samples collected from multiple patients with chronic renal rejection or chronic kidney disease and controls was measured in advance, and ROC was measured using these measured values. It can be determined by performing an analysis.
  • the value of the amount of SYT17 protein in the urine-derived sample is used as an explanatory variable
  • the patient is a patient who has developed chronic rejection or chronic kidney disease, that is, transplanted renal chronic rejection or chronic kidney disease.
  • ROC analysis is performed with whether or not the control is the objective variable, and an ROC curve is created with 1-specificity (false positive rate) on the horizontal axis and sensitivity (positive rate) on the vertical axis.
  • the method usually used to obtain the cutoff value from the ROC curve for example, the method of setting the cutoff value at the point where the Youden's index (sensitivity + specificity -1) is maximized, or from the upper left corner of the ROC curve.
  • the cutoff value can be determined by a method of setting the cutoff value at the point where the distance is minimized.
  • a control person is a person who is clinically determined to have neither chronic rejection nor chronic kidney disease. Controls are not limited to those who do not have any disease or symptom other than chronic rejection and chronic kidney disease, such as healthy individuals with no special findings, including kidney. , Those who have undergone kidney transplantation and have no special findings in the transplanted kidney (No Evidence of Diseases, NED) can be mentioned.
  • subject refers to humans, and for example, rodents including mice, rats, hamsters and guinea pigs. Includes mammals such as humans, chimpanzees, primates including rhesus monkeys, domestic animals including pigs, cows, goats, horses and sheep, and pets including dogs and cats.
  • the terms "subject”, “control” and “patient” can be replaced with “subject”, “control” and "affected”, respectively.
  • the subject, control, patient and subject are preferably humans. Also, the subject, control and patient are preferably animals of the same species.
  • the control urine-derived sample is preferably treated in the same manner as the subject urine-derived sample. Specifically, when the subject urine-derived sample is urine itself, the urine itself is used as the control urine-derived sample, and when the subject urine-derived sample is a processed urine, the corresponding urine is used as the control urine-derived sample. It is preferable to use a processed product.
  • the amount of SYT17 protein in the control urine-derived sample is preferably measured by the same method as the measurement of SYT17 protein in the subject urine-derived sample.
  • the cutoff value when the amount of SYT17 protein is expressed as a relative value to the amount of CD9 protein, the cutoff value can be 0.42 or more.
  • the cutoff value when the cutoff value is set to 0.42, as shown in Examples described later, the subject has or is likely to develop a chronic rejection of transplanted kidney, with a sensitivity of 77% and a specificity of 87%. Can be evaluated at.
  • the subject is predicted to have or are likely to develop chronic renal transplant rejection or chronic kidney disease, and the doctor is based on this information.
  • prophylactic or therapeutic measures can be taken for the onset or progression of transplanted renal chronic rejection or chronic kidney disease.
  • the subject of the present invention is a person who may have a chronic rejection of transplanted kidney or a chronic kidney disease.
  • the subjects to be evaluated for the possibility of developing chronic renal transplant rejection are those who have undergone renal transplant surgery, that is, renal transplant recipients.
  • the subjects to be evaluated for the possibility of developing chronic kidney disease are not particularly limited and may be subjects for which evaluation is desired, but those suffering from renal disease causing chronic kidney disease are preferable. Or a person who may be affected.
  • the renal disease that causes chronic kidney disease in the present invention may be a primary kidney disease, a secondary kidney disease, or a hereditary / congenital kidney disease. It may also be a glomerular disease, a vascular disease, or a tubular interstitial disease.
  • renal diseases that cause chronic kidney disease include membranous nephropathy (including idiopathic membranous nephropathy), nephrosis syndrome (including primary nephrosis syndrome and microvariant nephrosis syndrome), lupus nephritis, and chronic Transplant nephropathy, diabetic nephropathy, IgA nephropathy, focal segmental glomerulosclerosis, nephrosclerosis, Good Pasture syndrome, multiple cystic kidney (including autosomal dominant multiple cystic kidney), urinary acid kidney Diseases, obesity-related nephropathy, etc. can be mentioned.
  • Another preferred embodiment of the evaluation method of the first aspect is the step of measuring the amount of SYT17 protein in a urine-derived sample collected from a subject; the amount of SYT17 protein in a subject urine-derived sample and urine collected from a control.
  • the amount of SYT17 protein in the urine-derived sample collected from the subject is compared with the amount of SYT17 protein in the urine-derived sample collected from the control.
  • the amount of SYT17 protein in the control urine-derived sample is preferably measured by the same method as the measurement of SYT17 protein in the subject urine-derived sample using the control urine-derived sample that has been subjected to the same treatment as the subject urine-derived sample.
  • the amount of SYT17 protein in a urine-derived sample collected from a plurality of controls is measured in advance, and the average value, median value, and other reference values are determined from those measured values, and this is used as the SYT17 in the subject urine-derived sample. It may be used for comparison with the amount of protein.
  • the subject's urine-derived sample is higher than the amount of SYT17 protein in the control's urine-derived sample, the subject is predicted to have or are likely to develop chronic renal transplant rejection or chronic kidney disease.
  • the doctor can make a diagnosis based on this information, and can take prophylactic or therapeutic measures for the onset or progression of transplanted renal chronic rejection or chronic kidney disease.
  • the amount of SYT17 protein in a subject urine-derived sample is at least 4 times or more, preferably at least 6 times or more, more preferably at least 8 times or more, and even more preferably 10 times or more that of a control urine-derived sample.
  • the subject can be assessed as having or likely to develop chronic rejection of the transplanted kidney.
  • the amount of SYT17 protein in the subject urine-derived sample is higher than that in the control urine-derived sample, for example, at least 1.2 times or more, preferably at least 1.5 times or more, more preferably at least 1.8 times or more, still more preferably at least.
  • the subject can be evaluated as having or likely to develop chronic kidney disease.
  • Yet another preferred embodiment of the evaluation method of the first aspect is the step of measuring the amount of SYT17 protein in the first urine-derived sample collected from the subject; the amount of SYT17 protein in the first urine-derived sample, and The step of comparing the amount of SYT17 protein in the second urine-derived sample collected from the same subject before the first urine-derived sample collection; and the amount of SYT17 protein in the first urine-derived sample is the first. If the amount of SYT17 protein in the second urine-derived sample is higher than the amount of SYT17 protein, the transplanted renal chronic rejection reaction or chronic kidney disease in the subject is more advanced at the time of collecting the first urine-derived sample than at the time of collecting the second urine-derived sample. Includes steps to evaluate as likely. Descriptions of each step and definitions of terms are as described above unless otherwise stated below.
  • the amount of SYT17 protein in the first urine-derived sample collected from the subject is compared with the amount of SYT17 protein in the second urine-derived sample.
  • the second urine-derived sample is a urine-derived sample collected from the same subject at a time point before the first urine-derived sample collection, that is, a time point before the urine collection for obtaining the first urine-derived sample. It is a sample derived from urine collected from the same subject.
  • the first and second urine-derived samples are preferably urine-derived samples that have been subjected to the same treatment, and the amount of SYT17 protein is preferably measured by the same measuring method.
  • first and second urine-derived samples do not refer to the time series of urine-derived sample collection, but are used to distinguish between the urine-derived sample to be evaluated and the urine-derived sample to be compared.
  • the transplanted renal chronic rejection reaction or chronic kidney disease in the subject is the first at the time of collecting the first urine-derived sample. It is predicted that it is more likely to be more advanced than when the second urine-derived sample was collected, and the doctor will make a diagnosis based on this information, and preventive measures against the onset or progression of renal transplant renal rejection or chronic kidney disease. Treatment or therapeutic treatment can be performed.
  • the evaluation method of the first aspect examines or determines the possibility of the onset or progression of transplanted renal chronic rejection reaction or chronic kidney disease in a subject using the amount of SYT17 protein in a urine-derived sample collected from the subject as an index. It can also be expressed as a method, or it can be expressed as a method of assisting in diagnosing the onset or progression of transplanted renal chronic rejection or chronic kidney disease in a subject, or a method of obtaining data for diagnosis.
  • the present invention also provides, as another embodiment, a method for determining the effectiveness of prophylactic or therapeutic treatment for the development of transplanted renal chronic rejection or chronic kidney disease.
  • compositions comprising at least one substance selected from the group consisting of a specific antibody against SYT17 and a derivative thereof and an inhibitory nucleic acid against SYT17 for the prevention and / or treatment of chronic renal transplantation or chronic kidney disease.
  • the pharmaceutical composition for this is provided as another embodiment.
  • prevention and “preventive treatment” include all types of medically permissible preventive interventions aimed at preventing or suppressing the onset or onset of disease.
  • treatment and “therapeutic treatment” also include all types of medically acceptable therapeutic interventions aimed at curing, transient remission, etc. of the disease. That is, treatment or prevention of chronic kidney disease, and therapeutic or prophylactic treatment include various purposes including delay or stop of progression of chronic kidney disease, regression or disappearance of lesions, prevention of onset or prevention of recurrence, and the like. Includes medically acceptable interventions.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment contains at least one substance selected from the group consisting of a specific antibody against SYT17 and a derivative thereof and an inhibitory nucleic acid against SYT17 as an active ingredient.
  • containing as an active ingredient means that an effective amount of such a substance is contained.
  • the effective amount means an amount effective for the prevention and / or treatment of the disease, and is appropriately determined according to the usage, the age of the subject, the condition of the disease and other conditions.
  • Nucleic acids that inhibit SYT17 are nucleic acids that can suppress the transcription of mRNA encoding the SYT17 protein from the SYT17 gene (also called SYT17 mRNA), nucleic acid that can degrade the mRNA, and protein translation from the mRNA.
  • Antisense which can be designed and prepared by those skilled in the art based on the base sequence of the SYT17 gene or the base sequence of the mRNA encoding the SYT17 protein, can be a nucleic acid capable of suppressing Nucleic acids, or nucleic acids that cause RNA interference, such as siRNA, shRNA, miRNA, etc. can be mentioned. Examples of commercially available inhibitory nucleic acids include human si-SYT17 s28627, s28628 and s28629 (all Thermo Fisher).
  • a DNA capable of inducing transcription of the antisense nucleic acid or a nucleic acid causing RNA interference by being placed under the control of an appropriate expression promoter, and a part of the base sequence of the nucleic acid causing the antisense nucleic acid or RNA interference.
  • Nucleic acids that have been modified to increase stability against degradation by nucleases are also included in the inhibitory nucleic acids that suppress expression as referred to in the present invention as nucleic acids that are functionally equivalent to the above-mentioned antisense nucleic acids or nucleic acids that cause RNA interference.
  • Modifications for improving stability against degradation by nucleases include 2'O-methylation, 2'-F conversion, 4'-thiolation and the like.
  • a chimeric RNA in which a part of the ribonucleotide of the above RNA is replaced with the corresponding deoxyribonucleotide or nucleotide analog is also included in the inhibitory nucleic acid that suppresses the expression referred to in the present invention.
  • Nucleotide analogs include, for example, 5-modified uridine or cytidine, such as 5- (2-amino) propyluridine, 5-bromouridine, etc .; 8-position modified adenosine or guanosine, such as 8-bromoguanosine; deazanucleotides, etc.
  • the type or number of bases modified or substituted in the inhibitory nucleic acid is not particularly limited as long as the ability to suppress the expression of the target molecule is not lost.
  • the above-mentioned inhibitory nucleic acid can be artificially synthesized by using gene recombination technology or chemical synthesis technology.
  • a gene recombination method a method for chemically synthesizing a nucleic acid, a method for synthesizing an unnatural base, or a method for synthesizing a nucleic acid containing the same, a method well known to those skilled in the art can be adopted.
  • nucleic acids may be synthesized by using a device such as a so-called DNA synthesizer.
  • the specific antibody against SYT17 and its derivative used in the pharmaceutical composition are an antibody and an antibody derivative capable of specifically binding to the SYT17 protein and neutralizing its activity.
  • the definition of the specific antibody against the SYT17 protein and its derivative and the description of the preferred embodiment and the like are as described above in the item of evaluation method.
  • Neutralization of SYT17 protein activity by a specific antibody against SYT17 or a derivative thereof is performed by administering the specific antibody or a derivative thereof to a model animal for chronic renal rejection of transplantation or chronic kidney disease, and evaluating the improvement of the symptoms or the delay in progression. It can be confirmed by.
  • a specific antibody or its derivative is added to renal cells such as tubular cells and glomerular endothelial cells whose inflammatory circuit is enhanced by stimulation with an inflammatory amplification factor such as IL-6 or TNF ⁇ . , It can also be confirmed by evaluating the suppression of its hyperinflammatory.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment is administered to a subject who has developed or is at risk of developing chronic renal rejection or chronic kidney disease.
  • the subject to whom the pharmaceutical composition for the prevention and / or treatment of transplanted renal chronic rejection is administered is a subject who has undergone renal transplant surgery, that is, a renal transplant recipient.
  • the pharmaceutical composition is administered to a subject having a urinary SYT17 protein amount greater than or greater than the cutoff value in the control's urinary SYT17 protein amount. It is confirmed by using the method described above in the item of evaluation method that the subject to which the pharmaceutical composition is administered has a urinary SYT17 protein amount higher than or higher than the cutoff value of the control. be able to.
  • the renal disease causing chronic kidney disease that can be prevented and / or treated by the pharmaceutical composition is not limited as long as the expression of SYT17 is upregulated, and even if it is a primary renal disease, it is secondary. It may be a renal disease or a hereditary / congenital renal disease. It may also be a glomerular disease, a vascular disease, or a tubular interstitial disease.
  • renal diseases that cause chronic kidney disease include membranous nephropathy (including idiopathic membranous nephropathy), nephrosis syndrome (including primary nephrosis syndrome and microvariant nephrosis syndrome), lupus nephritis, and chronic Transplant nephropathy, diabetic nephropathy, IgA nephropathy, focal segmental glomerulosclerosis, nephrosclerosis, Good Pasture syndrome, multiple cystic kidney (including autosomal dominant multiple cystic kidney), urinary acid kidney Diseases, obesity-related nephropathy, etc. can be mentioned.
  • the pharmaceutical composition can be administered by any route as long as its effective amount is delivered to the inflamed site of the kidney, such as intravenous administration, intraarterial administration, intraperitoneal administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, local administration, etc. , Preferably administered parenterally.
  • the preparation of such a pharmaceutical composition may be any preparation suitable for the route of administration, for example, an injection or an infusion.
  • the pharmaceutical composition alleviates the symptoms of transplanted renal chronic rejection or chronic kidney disease by being administered to a subject who requires or is at risk of developing a transplanted renal chronic rejection or chronic kidney disease. It is possible to remit or prevent its onset. That is, yet another aspect of the present invention is a group consisting of a specific antibody against SYT17 and a derivative thereof, and an inhibitory nucleic acid against SYT17 in a subject requiring or at risk of developing chronic renal rejection or chronic kidney disease. It can also be expressed as a method for preventing and / or treating chronic renal rejection of renal transplantation or chronic kidney disease, which comprises administering an effective amount of at least one substance selected from the above.
  • the effective amount of the pharmaceutical composition in the preventive and / or therapeutic method, the preparation containing the pharmaceutical composition, the embodiment, the administration method and the like are as described above.
  • a method for preventing or treating the onset or progression of transplanted renal chronic rejection or chronic kidney disease is used for those who have developed or are likely to develop chronic kidney disease or chronic kidney disease by the evaluation method of the first aspect, or chronic kidney disease or chronic kidney disease. Onset of transplanted renal chronic rejection or chronic kidney disease in those who were evaluated to be more likely to have kidney disease at the time of collecting the first urine-derived sample than at the time of collecting the second urine-derived sample. Alternatively, it comprises the step of taking prophylactic or therapeutic treatment for progression.
  • An exemplary embodiment of this method is the step of measuring the amount of SYT17 protein in a urine-derived sample collected from a subject; the step of comparing the amount of SYT17 protein in a subject urine-derived sample with a cutoff value.
  • the cutoff value is the amount of SYT17 protein in urine-derived samples collected from multiple patients and controls with chronic renal rejection or chronic kidney disease, and these measurements are used to measure ROC. If the amount of SYT17 protein in the subject's urine-derived sample exceeds the cut-off value, the above-mentioned steps, which are determined by performing analysis; Includes the step of taking prophylactic or therapeutic treatment for progression.
  • Another exemplary embodiment of this method is the step of measuring the amount of SYT17 protein in a urine-derived sample collected from a subject; the amount of SYT17 protein in a subject urine-derived sample and in a urine-derived sample collected from a control. Steps to compare with SYT17 protein level; and if the amount of SYT17 protein in the subject urine-derived sample is greater than the amount of SYT17 protein in the control urine-derived sample, the subject has a chronic renal rejection or chronic kidney disease. Includes the step of taking prophylactic or therapeutic treatment for the onset or progression.
  • Yet another exemplary embodiment of this method is the step of measuring the amount of SYT17 protein in a first urine-derived sample taken from a subject; the amount of SYT17 protein in a first urine-derived sample and the first urine.
  • the step of comparing the amount of SYT17 protein in the second urine-derived sample collected from the same subject prior to the collection of the derived sample; and the amount of SYT17 protein in the first urine-derived sample is the second urine. If the amount of SYT17 protein is higher than the amount of SYT17 protein in the derived sample, it includes a step of taking prophylactic or therapeutic treatment for the onset or progression of transplanted renal chronic rejection or chronic renal disease in the subject.
  • the prophylactic or therapeutic treatment is preferably dialysis, renal transplantation or administration of the pharmaceutical composition described above.
  • Test Kit The present invention provides, as another embodiment, a test kit containing a specific antibody against SYT17 or a derivative thereof for use in assessing the possibility of developing or progressing chronic renal rejection of transplanted kidney or chronic kidney disease.
  • the test kit includes a specific antibody against SYT17 or a derivative thereof, as well as a specific antibody against a protein recognized as an exosome marker, such as a protein such as CD9, CD63, CD81, ALIX, or a derivative thereof, particularly preferably a specific antibody against CD9. Alternatively, a derivative thereof may be included.
  • the test kit may also further include instruments and reagents required for immunoassays, such as carriers such as plates, and reagents such as blocking solutions, wash solutions and chromogenic substrates.
  • the test kit of this embodiment can be used for measuring the amount of SYT protein in a urine-derived sample collected from a subject in the above-mentioned evaluation method.
  • the test kit of this embodiment specifically has a urinary SYT17 protein amount that is greater than or exceeds the urinary SYT17 protein amount of the control. It is also useful as a companion diagnostic because it can be used to select subjects with urine.
  • phosphorylated STAT3 and phosphorylated NF- ⁇ B were added to rabbit anti-STAT3 pY705 (1: 200, Cell Signaling Technology), rabbit anti-phosphorylated NF- ⁇ B p65 Ser276 (1/400, Sigma Aldrich) or control antibody (1/400, Sigma Aldrich).
  • Cell Signaling Technology was used, and rabbit IgG Elite ABC Kit and ImmPACT DAB (Vector Laboratories, Burlingame) were used for further signal enhancement and visualization of immunostaining. Section analysis was performed using a BZ-9000 microscope (KEYENCE).
  • Immunoblotting Dissolve whole urine specimens and urinary exosome fractions in SDS buffer (10% SDS, 10% glycerol, 0.04% bromophenol blue, 0.5M Tris-HCl pH 6.8, and 10% 2-mercaptoethanol). And boiled at 60 ° C for 10 minutes. After separation by SDS-PAGE, the protein in the gel was transferred to a PVDF membrane (Millipore). Immunoblotting was performed using the Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution (Toyobo) according to the manufacturer's protocol.
  • Anti-SYT17 (1/2500, HPA040811, Atlas Antibodies) and anti-CD9 antibody (1/1000, System Biosciences) as the primary antibody, and goat anti-rabbit lgG (H + L) HRP antibody (1/10,000, 1 / 10,000, as the secondary antibody. Thermo Fisher Scientific) and goat anti-rabbit HRP antibody (1/20000, System Biosciences) were used.
  • a signal enhancer Western Blot Signal Enhancer (Thermo Fisher Scientific) was used to detect SYT17. Protein visualization was performed using Pierce TM ECL + Western Blotting Substrate (Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's protocol. The film was developed using an automatic X-ray film developing device (FPM 100, Fuji Medical Film). Immunoblotting results were quantified using ImageJ software.
  • siRNA human si-SYT17 (S1: s28627, S2: s28628, S3: s28629, all of them are Thermo Fisher) as siRNA that knocks down the expression of SYT17, and human si-nontarget (Ambion Silencer select) as a negative control. 4390843) was used as a positive control in the following experiments using p65 siRNA (Ambion Silencer select 4427038), which knocks down the expression of the NF- ⁇ B p65 subunit.
  • the base sequence of human si-SYT17 is as follows.
  • S1 s28627 Sense strand sequence 5'-GCCUAGUGUUUACAGUUUUtt-3'(SEQ ID NO: 1) Antisense strand 5'-AAAACUGUAAACACUAGGCtg-3' (SEQ ID NO: 2)
  • S2 s28628 Sense strand 5'-GCUGGUGCAUGGACUCAAAtt-3' (SEQ ID NO: 3)
  • Antisense strand 5'-UUUGAGUCCAUGCACCAGCtg-3' SEQ ID NO: 4)
  • RPTEC human renal proximal tubule epithelial cells
  • HRGEC human renal glomerular endothelial cells
  • DMEM Fluji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • FBS Thermo Fisher Scientific
  • human IL-6 100 ng / mL + human soluble IL-6R ⁇ (R & D Systems) 100 ng / mL
  • human IL-17 50 ng / STAT3 and NF- ⁇ B were activated by stimulation with mL or human TNF ⁇ (PeproTech) 50 ng / mL for 3 hours.
  • RNA Extraction Kit (Toyobo)
  • reverse transcription reaction was performed, and the mRNA expression levels of IL-6 and CCL2 for the housekeeping gene GAPDH were measured by quantitative PCR.
  • the primers used are as follows.
  • IL-6 Forward primer 5'-GGTACATCCTCGACGGCATCT-3' (SEQ ID NO: 7) Reverse primer 5'-GTGCCTCTTTGCTGCTTTCAC-3' (SEQ ID NO: 8)
  • CCL2 Forward primer 5'-CAGCCAGATGCAATCAATGCC-3' (SEQ ID NO: 9) Reverse primer 5'-TGGAATCCTGAACCCACTTCT-3'(SEQ ID NO: 10)
  • GAPDH Reverse primer 5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3' (SEQ ID NO: 11) Reverse primer 5'-CGCTCCTGGAAGATGGTG-3'(SEQ ID NO: 12)
  • Example 1 Analysis of expression of SYT17 protein in renal tissue According to immunohistochemical staining of transplanted renal specimens, SYT17 was mainly found in tubular epithelial cells in the CAAMR group as compared with the NED group, IF / TA group and CNI-T group. It was confirmed that the protein was strongly expressed (Fig. 1). It was also confirmed that the SYT17 protein is mainly localized in the cytoplasm (not shown).
  • phosphorylation (activation) of NF- ⁇ B p65 and STAT3 was enhanced in the renal tubular region of the CAAMR group as compared with other KTx groups (Fig. 2).
  • transcriptome analysis confirmed that co-stimulation of human tubular epithelial cells with IL-6 and TNF ⁇ increased the expression levels of IL-6 and CCL20 as well as the expression levels of SYT17 (Fig.). 3).
  • NF- ⁇ B and STAT3 are activated by inflammatory amplification factors such as IL-6 and CCL20, and this activation further induces the expression of SYT17 protein through positive feedback. It is shown that it promotes inflammation in the transplanted kidney.
  • SYT17 protein is not detected in whole urine specimens but can be detected in urinary exosome fractions by immunobrotting of whole urine specimens and urinary exosome fractions.
  • the relative level of the SYT17 protein (SYT17 / CD9) to the exosome marker CD9 was increased as compared with the healthy volunteers and the NED group (Fig. 6).
  • Figure 7 shows the SYT17 / CD9 quantification results of the urinary exosome fraction with a further increased number of samples, along with the results of other clinical parameters.
  • SYT17 / CD9 was 0.12 ⁇ 0.09 in the healthy volunteer group, 0.13 ⁇ 0.17 in the NED group, 0.22 ⁇ 0.35 in the IF / TA group, 0.40 ⁇ 0.35 in the CNI-T group, 1.34 ⁇ 1.05 in the CAAMR group, and 1.34 ⁇ 1.05 in the CAAMR group.
  • Relative SYT17 protein levels in urinary exosomes were significantly higher than in the other groups (Fig. 7A).
  • N-acetyl- ⁇ -D-glucosaminidase (NAG) / Cre, urinary protein (U-TP) / Cre and eGFR differentiate the CAAMR group from other groups.
  • NAG N-acetyl- ⁇ -D-glucosaminidase
  • U-TP urinary protein
  • eGFR eGFR
  • SYT17 / CD9 is used as an explanatory variable, and the presence or absence of chronic rejection, that is, whether it is a CAAMR group or another group (healthy volunteers, NED group, IF / TA group, CNI-T group) is used as an objective variable.
  • the optimum cutoff value for SYT17 / CD9 by ROC analysis was 0.42, with a sensitivity of 77% and a specificity of 87%.
  • SYT17 protein contained in the urinary exosome fraction of CKD patients was detected by immunoblotting (an example is shown in FIG. 11), and the intensity of the detected SYT17 and CD9 bands was quantified for each lane. SYT17 / CD9 was calculated (FIGS. 12 and 13). Numbers 1 to 10 in FIGS. 11 and 12 correspond to the following data of urinary exosome fractions of CKD patients, respectively.
  • SYT17 / CD9 in the urinary exosome fraction was higher than the average value of healthy volunteers in all CKD patients, and in proteinuria-negative membranous nephropathy, it was more than 1 times the average value of healthy volunteers, and autosomal dominant multiple cysts.
  • CKD proteinuria-positive membranous nephropathy, microvariant nephrosis syndrome, diabetic nephropathy, IgA nephropathy, nephrotic syndrome, focal segmental glomerulosclerosis, lupus nephritis
  • the value was more than tripled.
  • SEQ ID NO: 1 Nucleotide sequence of the sense strand of human si-SYT17 s28627, which is a siRNA against SYT17
  • SEQ ID NO: 2 Nucleotide sequence of the antisense strand of human si-SYT17 s28627, which is a siRNA against SYT17
  • SEQ ID NO: 4 SiRNA against SYT17 Human si-SYT17 s28628
  • Nucleotide sequence of the antisense strand of the antisense strand SEQ ID NO: 5: Sense strand of human si-SYT17 s28629 which is the siRNA against SYT17
  • SEQ ID NO: 6 Nucleotide sequence of the antisense strand of human si-SYT17 s28629, which is a siRNA against SYT17. : CCL2 forward primer base sequence
  • SEQ ID NO: 5 Sense strand of human si-SYT17 s28629 which is

Abstract

本発明は、被験者から採取された尿由来検体中のSYT17タンパク質量を指標とする、被験者の移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病の発症又は進行の可能性を評価する方法を提供する。また本発明は、SYT17に対する特異抗体及びその誘導体並びにSYT17に対する阻害性核酸よりなる群から選択される少なくとも１つの物質を含む移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病の予防及び／又は治療のための医薬組成物、並びにSYT17に対する特異抗体又はその誘導体を含む移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病の発症又は進行の可能性の評価のための検査キットを提供する。

Description

移植腎慢性拒絶反応及び慢性腎臓病の発症又は進行の可能性を評価する方法、検査キット及び医薬組成物
　本発明は、移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病の発症又は進行の可能性を評価する方法及び評価のための検査キット、並びに移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病の予防及び／又は治療のための医薬組成物に関する。
　慢性腎臓病（Chronic Kidney Diseases、CKD）は、蛋白尿に代表される腎障害、及び糸球体濾過量を指標とした腎機能低下のいずれか又は両方が３か月以上持続している状態をいい、日本において成人の８人に１人が罹患している。慢性腎臓病の症状が進行して末期腎不全に至ると、薬剤治療の効果は見込めず、多くの患者は人工透析を余儀なくされる。人工透析は対症療法であることから、末期腎不全に陥った患者は生涯にわたって人工透析を受け続ける必要があり、患者に与える身体的及び経済的な負担は大きい。さらに透析医療費の増大は、医療経済上、懸念すべき問題となっている。
　慢性腎臓病の診断において、腎機能の評価は尿蛋白、尿アルブミン、血清クレアチニン（Cre）、尿素窒素（BUN）及び推定糸球体濾過量（eGFR）といったバイオマーカーによって行われている。これらのバイオマーカーは簡便に測定又は算出可能であるという利点を有するものの、腎機能障害の進行を早期に感度よく検出することには適していない。
　また、末期腎不全に対する唯一の根治療法は腎移植である。2013年の米国腎臓データシステム（非特許文献１）におけるデータでは、腎移植を受けた者の生存率は透析患者よりも良好であることが示されている。
　腎移植の成功率を左右する大きな問題は、同種移植片に対する免疫拒絶である。近年の免疫抑制剤や医療技術の発達により、急性免疫拒絶のリスクは顕著に低下している。しかし、慢性活動性抗体関連型拒絶反応（Chronic active antibody-mediated rejection、CAAMR）に代表される比較的緩慢に進行する慢性拒絶反応は、依然として克服が困難である。
　慢性拒絶反応は腎移植後３ヶ月以降に生じる拒絶反応である。慢性拒絶反応は明確な臨床症状が観察されないままに徐々に進行することが多く、適切な処置が採られないことで移植腎機能喪失に至る可能性が高い。慢性拒絶反応の診断は、一般に移植片の生体組織診断（生検）により行われている。しかし生検は被験者の負担が大きく、また簡便な方法ではない。さらに生検は、拒絶反応のグレードを過小評価したり、病変部を見逃すこともある。そのため、慢性拒絶反応の発症又は進行の可能性を簡便かつ正確に判定する方法は、慢性拒絶反応の診断、生検の適切な実施タイミングの決定、慢性腎臓病に対する予防的又は治療的処置の適切なタイミングでの実施に有益であり、腎移植治療において重要な意義を有する。
　一方、シナプトタグミン（synaptotagmins）と称されるタンパク質ファミリーが知られている。シナプトタグミンは、カルシウム・リン脂質結合分子として同定されたシナプス小胞上に存在する膜タンパク質であり、カルシウムイオンとの結合能により、シナプス小胞からのエクソサイトーシス（exocytosis）におけるカルシウムセンサーとして機能していると考えられている。
　シナプトタグミンファミリーはヒトでは17種類のアイソフォームの存在が報告されており、その多くは、N末端側に膜貫通領域を、C末端側の細胞質領域に二つのC2領域を有する。シナプトタグミン-17（Synaptotagmin-17、SYT17）と称されるタンパク質は、ヒトシナプトタグミンファミリーに共通するC末端側のC2領域と構造的に相同な2つのC2様ドメインを有するが、N末端の膜貫通領域を持たない。
　SYT17タンパク質は脳及び腎臓で発現しており、特にカイニン酸誘発ラットてんかん発作モデルでは海馬で、また虚血再潅流障害後の腎臓では近位尿細管でそれぞれ増加し、病状に応じて発現量が変化することが報告されている（非特許文献２及び非特許文献３）。しかし、慢性腎臓病及び慢性拒絶反応におけるSYT17タンパク質の機能的役割及び発現量の変動に関する報告は、これまでのところ見当たらない。
UNITED STATES RENAL DATA SYSTEM、［online］、［令和２年１月２８日検索］、インターネット <URL：https://www.usrds.org/> Jang, Y. S., et al., 2004, Brain Res. 999: 203 Han, K. H., et al., 2007, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 292: F100
　本発明は、移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病の発症又は進行の可能性を評価し、移植腎生検や必要な処置の実施に適切な情報を与え得る臨床指標を提供することを目的とする。
　本発明者らは、健常者と比較して、移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病を発症した患者の尿検体中にSYT17タンパク質が多く存在することを見出し、以下の発明を完成させた。
（１）　被験者から採取された尿由来検体中のSYT17タンパク質量を指標とする、被験者の移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病の発症又は進行の可能性を評価する方法。
（２）　被験者から採取された尿由来検体中のSYT17タンパク質量を測定する工程；被験者尿由来検体中のSYT17タンパク質量とカットオフ値とを比較する工程であって、前記カットオフ値が、移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病を発症している複数の患者及び対照者から採取された尿由来検体中のSYT17タンパク質量を予め測定し、これらの測定値を用いてROC解析を行うことで決定されるものである、前記工程；並びに被験者尿由来検体中のSYT17タンパク質量がカットオフ値を上回る場合、被験者は移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病を発症している又は発症する可能性が高いと評価する工程を含む、（１）に記載の方法。
（３）　被験者から採取された尿由来検体中のSYT17タンパク質量を測定する工程；被験者尿由来検体中のSYT17タンパク質量と対照者から採取された尿由来検体中のSYT17タンパク質量とを比較する工程；及び被験者尿由来検体中のSYT17タンパク質量が対照者尿由来検体中のSYT17タンパク質量よりも多い場合、被験者は移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病を発症している又は発症する可能性が高いと評価する工程を含む、（１）に記載の方法。
（４）　被験者から採取された第一の尿由来検体中のSYT17タンパク質量を測定する工程；第一の尿由来検体中のSYT17タンパク質量と、第一の尿由来検体採取よりも前の時点で同一被験者から採取された第二の尿由来検体中のSYT17タンパク質量とを比較する工程；及び第一の尿由来検体中のSYT17タンパク質量が第二の尿由来検体中のSYT17タンパク質量よりも多い場合、被験者における移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病は第一の尿由来検体採取時において第二の尿由来検体採取時よりも進行している可能性が高いと評価する工程を含む、（１）に記載の方法。
（５）　尿由来検体が、尿中エクソソームが濃縮された検体である、（１）～（４）のいずれか一項に記載の方法。
（６）　被験者が、腎移植のレシピエントである、（１）～（５）のいずれか一項に記載の方法。
（７）　慢性腎臓病の原因となる腎疾患が、膜性腎症、ネフローゼ症候群、ループス腎炎、糖尿病性腎症、IgA腎症、巣状分節性糸球体硬化症、常染色体優性多発性嚢胞腎又は慢性移植腎腎症である、（１）～（６）のいずれか一項に記載の方法。
（８）　SYT17に対する特異抗体及びその誘導体並びにSYT17に対する阻害性核酸よりなる群から選択される少なくとも１つの物質を含む、移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病の予防及び／又は治療のための医薬組成物。
（９）　対照者の尿中SYT17タンパク質量よりも多い又はカットオフ値を上回る尿中SYT17タンパク質量を有する対象に投与するための、（８）に記載の医薬組成物であって、前記カットオフ値が、移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病を発症している複数の患者及び対照者から採取された尿由来検体中のSYT17タンパク質量を予め測定し、これらの測定値に対してROC解析を行うことで決定されるものである、前記医薬組成物。
（１０）　慢性腎臓病の原因となる腎疾患が、膜性腎症、ネフローゼ症候群、ループス腎炎、糖尿病性腎症、IgA腎症、巣状分節性糸球体硬化症、常染色体優性多発性嚢胞腎又は慢性移植腎腎症である、（８）又は（９）に記載の医薬組成物。
（１１）　SYT17に対する特異抗体又はその誘導体を含む、移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病の発症又は進行の可能性の評価において使用するための検査キット。
（１２）　さらにCD9に対する特異抗体又はその誘導体を含む、（１１）に記載の検査キット。
（１３）　（８）～（１０）のいずれか一項に規定される医薬組成物のコンパニオン診断において使用するための、（１１）又は（１２）に記載の検査キット。
　本発明によると、尿由来検体という非侵襲的にかつ簡便に採取可能な検体を用いて移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病の発症又は進行の可能性を知ることができ、またその予防及び／又は治療を行うことができる。
図１Aは、正常病理組織群（NED）、線維化群（IF/TA）、カルシニューリン毒性群（CNI-T）及び慢性活動性抗体関連型拒絶反応群（CAAMR）に分類された腎移植患者由来の移植腎検体の、SYT17タンパク質についての免疫組織染色の結果を示す代表的蛍光顕微鏡写真である。図１Bは、免疫組織染色において検出されたSYT17シグナルの蛍光強度をImageJで定量した結果を表すグラフである。***: p<0.001（Tukey検定による）、n=6。 NED、IF/TA、CNI-T及びCAAMRに分類された腎移植患者由来の移植腎検体の、リン酸化NF-κB p65（p-p65）及びリン酸化STAT3（pSTAT3）についての免疫組織染色の結果を示す代表的蛍光顕微鏡写真である。上の３段は尿細管、下の３段は糸球体を示す。図中の矢印はp-p65およびpSTAT3二重陽性細胞を表す。スケールバーは100μmである。 IL-6若しくはTNFα単独で刺激した、又はそれらで共刺激した尿細管上皮細胞におけるIL-6、CCL20及びSYT17の発現量を比較したグラフである。グラフの縦軸は、無刺激の細胞における各遺伝子の発現量に対する相対的発現量を表す。 SYT17をノックダウンするsiRNA（S1～S3）が導入されたヒト腎糸球体内皮細胞（HRGEC）及びヒト腎近位尿細管上皮細胞（RPTEC）をIL-6＋TNFα又はIL-6＋IL-17で刺激したときの、IL-6及びCCL2のmRNA発現量を示すグラフである。図中、CはネガティブコントロールのsiRNA、PはポジティブコントロールのsiRNAを導入した対照細胞である。*: p<0.05（Dunnett検定による） SYT17を強制発現させたHEK293T細胞をTNFαで刺激したときのNF-κBプロモーター活性及びIL-6プロモーター活性を示すグラフである。MockはSYT17を強制発現させない対照細胞である。*: p<0.05（Studentのt検定による） 図６Aは、健常ボランティア（Healthy）、NED及びCAAMRの全尿検体を用いたSYT17タンパク質に対するイムノブロッティングの結果を示す写真である。図中、PCはSYT17タンパク質を過剰発現する細胞の溶解物である。図６Bは、健常ボランティア、NED及びCAAMRの尿中エクソソーム画分を用いたSYT17タンパク質に対するイムノブロッティングの結果を示す写真である。図６Cは、尿中エクソソーム画分のイムノブロッティングにおいて検出されたSYT17及びCD9のバンドをレーン毎にImage Jソフトウェアを用いて定量した結果を、SYT17/CD9として表したグラフである。 腎移植患者群（NED、IF/TA、CNI-T、CAAMR）及び健常ボランティアの尿中エクソソーム画分におけるSYT17/CD9（図７A）及び既存臨床マーカー（N-アセチル-β-D-グルコサミニダーゼ（NAG）/Cre（図７B）、尿蛋白（U-TP）/Cre（図７C）、eGFR（図７D））のデータを示すグラフである。*: p<0.05、**: p <0.01、***: p <0.001（Tukey検定による）。 SYT17/CD9と既存臨床マーカー（NAG/Cre（図８A）、U-TP/Cre（図８B）、eGFR（図８C））との相関を示すグラフである。 SYT17/CD9の値を説明変数とし、慢性拒絶反応の有無を目的変数としたROC曲線を示す。 健常ボランティア及び慢性腎臓病患者群（CKD）の尿中エクソソーム画分のSYT17/CD9を示すグラフである。*: p<0.05（Studentのt検定による）。 CKD患者の尿中エクソソーム画分を用いたSYT17タンパク質に対するイムノブロッティングの結果を示す写真である。図中、PCはポジティブコントロール、NCはネガティブコントロール、1～10はCKD患者の尿中エクソソーム画分に対応する。 CKD患者尿中エクソソーム画分のSYT17/CD9を示すグラフである。図中、健常ボランティアの平均値を点線で示す。 CKD患者尿中エクソソーム画分のSYT17/CD9を示すグラフである。図中、健常ボランティアの平均値を点線で示す。
　本発明者らは、後の実施例に示されるように、健常者及びNEDの尿中エクソソーム画分からSYT17タンパク質は殆ど又はごく僅かしか検出されない一方、腎移植後に慢性拒絶反応を発症した者からは健常者又はNEDの10倍程度のSYT17タンパク質が検出されることを確認した。
　また、SYT17タンパク質の発現は、NF-κB経路とSTAT3経路の同時活性化によりIL-6などの炎症性メディエーターの発現・産生が相乗的に増加する炎症回路（Inflammation amplifier）（Ogura et al., Immunity., 2008, 29(4),628-36.; Murakami et al., J. Exp. Med., 2011, 208(1), 103-14.; Murakami et al., Cell Reports, 2013, 3(3), 946-59）と関連することも実験的に確認された。
　炎症回路とは、本発明者らにより報告された慢性炎症の病態を誘導する分子機構である。線維芽細胞、ケラチノサイト、血管内皮細胞等のI型コラーゲン陽性の非免疫細胞に炎症刺激が加わると、非免疫細胞自身及び誘導されたT細胞から産生されたIL-6及びIL-17等のサイトカインにより非免疫細胞内でNF-κB経路とSTAT3経路とが同時に活性化され、IL-6をはじめとしたサイトカイン、ケモカイン、増殖因子等の産生が相乗的に増加する。産生されたIL-6は非免疫細胞自身に作用して炎症回路を亢進し、またケモカインや増殖因子は細胞浸潤を生じさせて恒常性を破綻させる。この炎症回路の持続的な亢進が慢性炎症の病態を誘導することが実験的に証明されている。
　SYT17タンパク質について、具体的には、後の実施例に示されるように、CAAMRの尿細管においてNF-κB p65及びSTAT3のリン酸化（活性化）が亢進していること、ヒト尿細管上皮細胞をIL-6及びTNFαで共刺激するとIL-6及びCCL20の発現量が増加すると共にSYT17の発現量も増加すること、一方でヒト尿細管上皮細胞内でSYT17をノックダウンするとIL-6及びCCL2の発現が抑制されること、並びにSYT17を強制発現させるとNF-κBプロモーター活性活性及びIL-6プロモーター活性が増強されること、等が確認された。
　これらの知見は、炎症回路によって尿細管上皮細胞内で発現が誘導されたSYT17が正のフィードバックを介して炎症を促進することを示唆するものである。したがって、尿由来検体中のSYT17タンパク質量は、慢性炎症が関与する慢性拒絶反応や慢性腎臓病の発症や進行に関する有効な非侵襲性な診断マーカーとなることを意味する。また、SYT17の発現を抑制する物質やSYT17の活性を阻害する物質は、慢性拒絶反応や慢性腎臓病における炎症回路の亢進を抑制することができ、慢性拒絶反応又は慢性腎臓病の予防及び／又は治療のために有用であると考えられる。
評価方法
　本発明の第１の態様は、被験者から採取された尿由来検体中のSYT17タンパク質量を指標とする、被験者の移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病の発症又は進行の可能性を評価する方法に関する。以下、好ましい実施形態を例示して、本態様を説明する。
　本態様の１つの好ましい実施形態は、被験者から採取された尿由来検体中のSYT17タンパク質量を測定する工程；被験者尿由来検体中のSYT17タンパク質量とカットオフ値とを比較する工程；及び被験者尿由来検体中のSYT17タンパク質量がカットオフ値を上回る場合、被験者は移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病を発症している又は発症する可能性が高いと評価する工程を含む。
　本発明における尿由来検体は、尿そのものであっても尿の濃縮物又は部分精製物等の加工物であってもよく、SYT17タンパク質を測定する方法に応じて適宜選択することができる。例えば、TOF-MS等の高感度な測定方法を用いる場合、尿由来検体は尿そのものであってよい。一方、イムノアッセイ等の汎用的な測定方法を用いる場合、SYT17タンパク質を濃縮する観点で、尿由来検体は尿の加工物であることが好ましい。
　尿の加工物は、好ましくは尿中エクソソームが濃縮された加工物であり、その典型例は尿から回収されるエクソソーム画分である。尿からのエクソソーム画分の回収は、ペレットダウン法、スクロースクッション法又は密度勾配遠心法等の超遠心分離法を利用した公知の方法で行うことができる。また、例えばMagCapture Exosome Isolation Kit PS（富士フィルム和光純薬工業）、DiagExo（登録商標） Urinary Exosome Isolation kit（101Bio,LLC）その他の市販の尿中エクソソーム分離キットを用いて回収することができる。
　尿由来検体中のSYT17タンパク質量は、生物学的試料中の目的タンパク質を測定することが可能な一般的な方法、例えば、SYT17タンパク質を対象としたイムノアッセイ、TOF-MS等の高感度質量分析法等により測定することができる。
　イムノアッセイは、SYT17タンパク質に対する特異抗体又はその誘導体を用いて、当業者に公知又は周知の方法、例えばThe Immunoassay Handbook : Theory and Applications of Ligand Binding, ELISA and Related Techniques（4TH）、Elsevierの記載を参照して行うことができる。
　本発明において、SYT17タンパク質に対する特異抗体、すなわちSYT17タンパク質に特異的に結合する抗体は、非標的タンパク質よりもSYT17タンパク質に優先的に結合する抗体である。SYT17タンパク質に対する特異抗体は、SYT17タンパク質に高い結合親和性を有する抗体と表すこともでき、非標的タンパク質とのアフィニティーよりも少なくとも2倍強い、好ましくは少なくとも10倍強い、より好ましくは少なくとも20倍強い、最も好ましくは少なくとも100倍強いアフィニティーを有して、SYT17タンパク質に結合することができる。抗体がSYT17タンパク質の存在を、望まれない結果、典型的には偽陽性又は偽陰性等を生じることなく検出することができるならば、当該抗体はSYT17タンパク質に対する特異抗体であると考えられる。
　SYT17タンパク質に対する特異抗体は、例えばマウス、ラット、サメ、ウサギ、ブタ、ハムスター、ラクダ、ラマ、ヤギ又はヒトを包含する任意の種を起源とすることができる。また特異抗体は、免疫グロブリン分子の任意のクラス（例としてIgG、IgE、IgM、IgD又はIgA）及びサブクラスのものであることができるが、IgGであることが好ましい。
　本発明において、SYT17タンパク質量の測定のために用いられる特異抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよく、後述の医薬組成物に用いられる特異抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。また特異抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体であり得る。
　SYT17タンパク質に対する特異抗体の誘導体は、上記抗体に由来する、抗原と特異的に結合する能力を保持した抗体の部分断片として定義される抗原結合性断片、例えばFab（fragment of antigen binding）、Fab'、F(ab')2、一本鎖抗体（single chain Fv)、ジスルフィド安定化抗体（disulfide stabilized Fv）及びCDRを含むペプチド等であり得るが、これらには限定されない。
　SYT17タンパク質に対する特異抗体及びその誘導体は、当業者に公知の方法を用いて作製することができる。例えば、ヒトSYT17タンパク質のアミノ酸配列（NCBIにアクセッション番号NP_057608.2、NP_001317438.1、NP_001295086.1として登録されている）又はこれをコードするDNAの塩基配列（NCBIにアクセッション番号NM_016524.4、NM_001308157.2、NM_001330509.1として登録されている）に基づいて遺伝子組み換え手法によりSYT17タンパク質を作製し、これを抗原として適当な動物に免疫することで、さらに当該動物のB細胞をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを得ることで作製することができる。ハイブリドーマ法については、例えばMeyaard et al. (1997) Immunity 7:283-290; Wright et al. (2000) Immunity 13:233-242; Kaithamana et al. (1999) J.Immunol. 163:5157-5164等を参照されたい。また、市販の抗SYT17抗体、例えば、Anti-SYT17 HPA040811（Atlas antibodies）、抗SYT17抗体（Proteintech）、SYT17抗体（invitrogen）等、さらにはこれらの抗体のCDR配列と同じ又は配列同一性が90%以上であるアミノ酸配列をCDR配列として含む抗体や、これらの抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列と同じ又は配列同一性が90%以上であるアミノ酸配列を重鎖可変領域及び軽鎖可変領域として含む抗体も利用可能である。
　SYT17タンパク質に対する特異抗体及びその誘導体は、適当な標識化合物によって標識してもよい。標識化合物の例としては、蛍光物質（例えばFITC、ローダミン等）、金コロイド等の金属粒子、Luminex（登録商標、ルミネックス社）等の蛍光マイクロビーズ、色素タンパク質（例えばフィコエリトリン、フィコシアニン等）、放射性同位体（例えば3H、14C、32P、35S、125I、131I等）、酵素（例えばペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等）、ビオチン、ストレプトアビジンを挙げることができる。
　SYT17タンパク質量は、尿の単位容量あたりのSYT17タンパク質の質量すなわちSYT17タンパク質濃度で表してもよく、また例えば蛍光イムノアッセイにおける蛍光強度その他の、目的タンパク質の存在を出力信号として検出することができる方法を採用するときは、SYT17タンパク質を表す出力信号の積算値をタンパク質量として用いてもよい。
　またSYT17タンパク質量は、測定方法に応じて、絶対値で、又は内部標準に対する相対値で表すことができる。尿中エクソソームが濃縮された検体を用いる好ましい実施形態において、SYT17タンパク質量は、当業者にエクソソームマーカーとして認識されているタンパク質、例えばCD9、CD63、CD81、ALIX等のタンパク質の量に対する相対値で表すことができる。
　被験者から採取された尿由来検体中のSYT17タンパク質量は、カットオフ値と比較される。カットオフ値は、移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病を発症している複数の患者及び対照者から採取された尿由来検体中のSYT17タンパク質量を予め測定し、これらの測定値を用いてROC解析を行うことで決定することができる。
　具体的には、尿由来検体中のSYT17タンパク質量の値を説明変数とし、慢性拒絶反応又は慢性腎臓病の発症の有無、すなわち移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病を発症している患者であるか対照者であるかを目的変数としたROC解析を行い、横軸に1-特異度（偽陽性率）を、縦軸に感度（陽性率）を取ったROC曲線を作成する。次いで、ROC曲線からカットオフ値を求めるために通常用いられる方法、例えばYouden's index（感度＋特異度-1）が最大となるポイントにカットオフ値を設定する方法、又はROC曲線の左上隅からの距離が最小となるポイントにカットオフ値を設定する方法等によって、カットオフ値を決定することができる。
　対照者とは、慢性拒絶反応及び慢性腎臓病のいずれも発症していないと臨床的に判定される者をいう。対照者は、慢性拒絶反応及び慢性腎臓病以外のいかなる疾患や症状をも呈していない者に限定されるものではなく、その例としては腎臓を含め特別な所見が認められない健常者に加えて、腎移植を受けた者であって移植腎に特別な所見が認められないもの（No Evidence of Diseases、NED）を挙げることができる。
　なお、本明細書の全体を通じて、「被験者」、「対照者」、「患者」及び「対象」は、ヒトに限定されるものではなく、例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモットを含むげっ歯類、ヒト、チンパンジー、アカゲザルを含む霊長類、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジを含む家畜、イヌ、ネコを含む愛玩動物といった哺乳動物を包含する。用語「被験者」、「対照者」及び「患者」は、それぞれ「被験対象」、「対照対象」及び「罹患対象」と置き換えることができる。本発明において、被験者、対照者、患者及び対象は、好ましくはヒトである。また、被験者、対照者及び患者は、同一の種の動物であることが好ましい。
　対照者尿由来検体は、被験者尿由来検体と同じ処理を施されたものであることが好ましい。具体的には、被験者尿由来検体が尿そのものである場合には対照者尿由来検体として尿そのものを、被験者尿由来検体が尿の加工物である場合には対照者尿由来検体として対応する尿加工物を用いることが好ましい。また、対照者尿由来検体中のSYT17タンパク質量は、被験者尿由来検体中のSYT17タンパク質の測定と同じ方法により測定することが好ましい。
　ある特定の実施形態において、SYT17タンパク質量をCD9タンパク質量に対する相対値で表す場合、カットオフ値は、0.42以上であり得る。例えばカットオフ値を0.42に設定した場合、後述の実施例に示されるように、被験者の移植腎慢性拒絶反応の発症を、又は発症の可能性が高いことを、感度77％、特異度87％で評価することができる。
　被験者尿由来検体中のSYT17タンパク質量がカットオフ値を上回る場合、被験者は移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病を発症している又は発症する可能性が高いと予測され、医師はこの情報に基づいて診断を行い、また、移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病の発症又は進行に対する予防的処置又は治療的処置を行うことができる。
　本発明において対象となる被験者は、移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病発症の可能性がある者である。特に、移植腎慢性拒絶反応の発症可能性の評価の対象となる被験者は、腎移植手術を受けた者すなわち腎移植レシピエントである。また、慢性腎臓病の発症可能性の評価対象となる被験者は、特に制限はなく、評価が望まれる被験者であればよいが、好ましくは慢性腎臓病の原因となる腎疾患に罹患している者又は罹患するおそれがある者である。
　本発明における慢性腎臓病の原因となる腎疾患は、一次性腎疾患であっても、二次性腎疾患であっても、遺伝性・先天性腎疾患であってもよい。また糸球体疾患であっても、血管性疾患であっても、尿細管間質疾患であってもよい。慢性腎臓病の原因となる腎疾患の例としては、膜性腎症（特発性膜性腎症を含む）、ネフローゼ症候群（原発性ネフローゼ症候群、微小変化型ネフローゼ症候群を含む）、ループス腎炎、慢性移植腎腎症、糖尿病性腎症、IgA腎症、巣状分節性糸球体硬化症、腎硬化症、グッドパスチャー症候群、多発性嚢胞腎（常染色体優性多発性嚢胞腎を含む）、尿酸性腎症、肥満関連腎症等を挙げることができる。
　第１の態様の評価方法の別の好ましい実施形態は、被験者から採取された尿由来検体中のSYT17タンパク質量を測定する工程；被験者尿由来検体中のSYT17タンパク質量と対照者から採取された尿由来検体中のSYT17タンパク質量とを比較する工程；及び被験者尿由来検体中のSYT17タンパク質量が対照者尿由来検体中のSYT17タンパク質量よりも多い場合、被験者は移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病を発症している又は発症する可能性が高いと評価する工程を含む。各工程の説明及び用語の定義は、特に下に述べられないかぎり、上述のとおりである。
　この実施形態において、被験者から採取された尿由来検体中のSYT17タンパク質量は、対照者から採取された尿由来検体中のSYT17タンパク質量と比較される。対照者尿由来検体中のSYT17タンパク質量は、被験者尿由来検体と同じ処理を施した対照者尿由来検体を用いて、被験者尿由来検体中のSYT17タンパク質の測定と同じ方法により測定することが好ましいが、被験者尿由来検体及び対照者尿由来検体中のSYT17タンパク質量を同時に測定する必要はなく、対照者尿由来検体中のSYT17タンパク質量は予め測定したものであってもよい。例えば、複数の対照者から採取された尿由来検体中のSYT17タンパク質量を予め測定し、それらの測定値から平均値、中央値その他の基準値を決定し、これを被験者尿由来検体中のSYT17タンパク質量との比較に用いてもよい。
　被験者尿由来検体中のSYT17タンパク質量が対照者尿由来検体中のSYT17タンパク質量よりも多い場合、被験者は移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病を発症している又は発症する可能性が高いと予測され、医師はこの情報に基づいて診断を行い、また、移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病の発症又は進行に対する予防的処置又は治療的処置を行うことができる。例えば、被験者尿由来検体中のSYT17タンパク質量が対照者尿由来検体中のそれの少なくとも4倍以上、好ましくは少なくとも6倍以上、より好ましくは少なくとも8倍以上、さらにより好ましくは10倍以上であるとき、被験者は移植腎慢性拒絶反応を発症している又は発症する可能性が高いと評価することができる。また、被験者尿由来検体中のSYT17タンパク質量が対照者尿由来検体中のそれよりも多いとき、例えば少なくとも1.2倍以上、好ましくは少なくとも1.5倍以上、より好ましくは少なくとも1.8倍以上、さらに好ましくは少なくとも2倍以上、一層さらに好ましくは少なくとも3倍以上、特に好ましくは少なくとも5倍以上であるとき、被験者は慢性腎臓病を発症している又は発症する可能性が高いと評価することができる。
　第１の態様の評価方法のさらなる別の好ましい実施形態は、被験者から採取された第一の尿由来検体中のSYT17タンパク質量を測定する工程；第一の尿由来検体中のSYT17タンパク質量と、第一の尿由来検体採取よりも前の時点で同一被験者から採取された第二の尿由来検体中のSYT17タンパク質量とを比較する工程；及び第一の尿由来検体中のSYT17タンパク質量が第二の尿由来検体中のSYT17タンパク質量よりも多い場合、被験者における移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病は第一の尿由来検体採取時において第二の尿由来検体採取時よりも進行している可能性が高いと評価する工程を含む。各工程の説明及び用語の定義は、特に下に述べられないかぎり、上述のとおりである。
　この実施形態において、被験者から採取された第一の尿由来検体中のSYT17タンパク質量は、第二の尿由来検体中のSYT17タンパク質量と比較される。ここで第二の尿由来検体は、第一の尿由来検体採取よりも前の時点で同一被験者から採取された尿由来検体、すなわち第一の尿由来検体を得るための採尿よりも前の時点で同一被験者から採取された尿に由来する検体である。第一及び第二の尿由来検体は、同じ処理を施された尿由来検体であることが好ましく、また同じ測定方法によりSYT17タンパク質量が測定されることが好ましい。ただし、第一及び第二の尿由来検体は、SYT17タンパク質量を同時に測定する必要はなく、第二の尿由来検体中のSYT17タンパク質量は予め測定したものであってもよい。なお、「第一」、「第二」という用語は、尿由来検体採取の時系列を指すものではなく、評価対象の尿由来検体と比較対象の尿由来検体とを区別するために用いられる。
　第一の尿由来検体中のSYT17タンパク質量が第二の尿由来検体中のSYT17タンパク質量よりも多い場合、被験者における移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病は第一の尿由来検体採取時において第二の尿由来検体採取時よりも進行している可能性が高いと予測され、医師はこの情報に基づいて診断を行い、また、移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病の発症又は進行に対する予防的処置又は治療的処置を行うことができる。
　第１の態様の評価方法は、被験者から採取された尿由来検体中のSYT17タンパク質量を指標とする、被験者における移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病の発症又は進行の可能性を検査又は判定する方法と表すこともでき、また被験者の移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病の発症又は進行の診断を補助する方法又は診断のためのデータを取得する方法と表すこともできる。
　加えて、投薬等の何らかの処置を受けている腎移植を受けた患者又は腎臓病の患者において尿由来検体中のSYT17タンパク質量をモニタリングすることで、上記処置が当該患者の移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病の発症に対する予防的処置として有効であるかを判定することが可能となる。また、投薬等の何らかの処置を受けている移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病を発症した患者において尿由来検体中のSYT17タンパク質量をモニタリングすることで、上記処置が当該患者の移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病に対する治療的処置として有効であるかを判定することが可能となる。したがって、本発明は、移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病の発症に対する予防的処置又は治療的処置の有効性を判定する方法も別の態様として提供する。
医薬組成物
　本発明は、SYT17に対する特異抗体及びその誘導体並びにSYT17に対する阻害性核酸よりなる群から選択される少なくとも１つの物質を含む、移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病の予防及び／又は治療のための医薬組成物を、別の態様として提供する。
　本明細書において用いられる用語「予防」及び「予防的処置」は、疾患の罹患又は発症の防止若しくは抑制などを目的とする医学的に許容される全てのタイプの予防的介入を包含する。また用語「治療」及び「治療的処置」は、疾患の治癒、一時的寛解等を目的とする医学的に許容される全てのタイプの治療的介入を包含する。すなわち、慢性腎臓病の治療又は予防、並びに治療的又は予防的処置とは、慢性腎臓病の進行の遅延又は停止、病変の退縮又は消失、発症の予防又は再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
　本態様の医薬組成物は、SYT17に対する特異抗体及びその誘導体並びにSYT17に対する阻害性核酸よりなる群から選択される少なくとも１つの物質を有効成分として含有する。ここで「有効成分として含有する」とは、有効量のかかる物質を含有することを意味する。また有効量は、疾患の予防及び／又は治療に有効な量を意味し、用法、対象の年齢、疾患の状態その他の条件に応じて適宜決定される。
　SYT17に対する阻害性核酸は、SYT17遺伝子からのSYT17タンパク質をコードするmRNA（SYT17 mRNAともいう）の転写を抑制することができる核酸、当該mRNAを分解することができる核酸、及び当該mRNAからのタンパク質翻訳を抑制することができる核酸であり得て、その典型例としては、SYT17遺伝子の塩基配列又はSYT17タンパク質をコードするmRNAの塩基配列を基にして当業者が設計、作製することができる、アンチセンス核酸、又はRNA干渉を引き起こす核酸、例えばsiRNA、shRNA、miRNA等を挙げることができる。市販されている阻害性核酸の例としては、human si-SYT17 s28627、s28628及びs28629（いずれもThermo Fisher）を挙げることができる。
　また、適当な発現プロモーターの支配下に置かれることで上記アンチセンス核酸又はRNA干渉を引き起こす核酸を転写誘導することのできるDNA、及び上記アンチセンス核酸又はRNA干渉を引き起こす核酸の塩基配列の一部が修飾されてヌクレアーゼによる分解に対する安定性が高められた核酸も、上記アンチセンス核酸又はRNA干渉を引き起こす核酸と機能的に等価な核酸として、本発明にいう発現を抑制する阻害性核酸に包含される。ヌクレアーゼによる分解に対する安定性を向上させるための修飾としては、2'O-メチル化、2'-F化、4'-チオ化等を挙げることができる。
　さらに、上記RNAのリボヌクレオチドの一部が、対応するデオキシリボヌクレオチド又はヌクレオチド類似体に置き換えられたキメラRNAもまた、本発明にいう発現を抑制する阻害性核酸に包含される。ヌクレオチド類似体としては、例えば、5位修飾ウリジン又はシチジン、例えば5-（2-アミノ）プロピルウリジン、5-ブロモウリジン等；8位修飾アデノシン又はグアノシン、例えば8-ブロモグアノシン等；デアザヌクレオチド、例えば7-デアザ-アデノシン等；O-又はN-アルキル化ヌクレオチド、例えばN6-メチルアデノシン等を挙げることができる。上記阻害性核酸において修飾される又は置換される塩基の種類又は個数は、ターゲット分子の発現を抑制する能力を失わない限り、特に制限は無い。
　上記阻害性核酸は、遺伝子組み換え技術又は化学合成技術を利用して人工的に合成することができる。遺伝子組み換え方法、核酸の化学合成方法、また非天然型の塩基の合成手法又はこれを含む核酸の合成手法としては、当業者に周知である手法を採用することができる。またいわゆるDNAシンセサイザー等の機器を用いることで、核酸を合成してもよい。
　医薬組成物において用いられるSYT17に対する特異抗体及びその誘導体は、SYT17タンパク質に特異的に結合してその活性を中和することができる抗体及び抗体誘導体である。SYT17タンパク質に対する特異抗体及びその誘導体の定義及び好ましい実施形態等の説明は、評価方法の項目において上述したとおりである。
　SYT17に対する特異抗体又はその誘導体によるSYT17タンパク質の活性の中和は、移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病のモデル動物に特異抗体又はその誘導体を投与し、その症状の改善又は進行の遅延を評価することによって確認することができる。また、SYT17タンパク質の活性の中和は、IL-6やTNFαといった炎症増幅因子での刺激により炎症回路を亢進させた尿細管細胞や糸球体内皮細胞等の腎細胞に特異抗体又はその誘導体を加え、その炎症亢進の抑制を評価することによって確認することもできる。
　本態様の医薬組成物は、移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病を発症した又は発症のおそれのある対象に投与される。特に、移植腎慢性拒絶反応の予防及び／又は治療のための医薬組成物が投与される対象は、腎移植手術を受けた対象すなわち腎移植レシピエントである。
　特定の実施形態において、医薬組成物は、対照者の尿中SYT17タンパク質量よりも多い又はカットオフ値を上回る尿中SYT17タンパク質量を有する対象に投与される。医薬組成物を投与される対象が、対照者の尿中SYT17タンパク質量よりも多い又はカットオフ値を上回る尿中SYT17タンパク質量を有することは、評価方法の項目において上述した方法を用いて確認することができる。
　医薬組成物により予防及び／又は治療することができる慢性腎臓病の原因となる腎疾患は、SYT17の発現亢進が認められるものであるかぎり制限はなく、一次性腎疾患であっても、二次性腎疾患であっても、遺伝性・先天性腎疾患であってもよい。また糸球体疾患であっても、血管性疾患であっても、尿細管間質疾患であってもよい。慢性腎臓病の原因となる腎疾患の例としては、膜性腎症（特発性膜性腎症を含む）、ネフローゼ症候群（原発性ネフローゼ症候群、微小変化型ネフローゼ症候群を含む）、ループス腎炎、慢性移植腎腎症、糖尿病性腎症、IgA腎症、巣状分節性糸球体硬化症、腎硬化症、グッドパスチャー症候群、多発性嚢胞腎（常染色体優性多発性嚢胞腎を含む）、尿酸性腎症、肥満関連腎症等を挙げることができる。
　医薬組成物は、腎臓の炎症部位にその有効量が送達されるかぎり任意の経路で投与することができ、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所投与等、非経口的に投与されることが好ましい。また、かかる医薬組成物の製剤は、投与経路に適した製剤であればよく、例えば注射剤又は点滴剤等である。
　医薬組成物は、移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病の治療を必要とする又はその発症のおそれのある対象に投与されることで、移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病の症状を緩和する、寛解する又はその発症を予防することが可能である。すなわち本発明のさらなる別の態様は、移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病の治療を必要とする又はその発症のおそれのある対象にSYT17に対する特異抗体及びその誘導体並びにSYT17に対する阻害性核酸よりなる群から選択される少なくとも１つの物質の有効量を投与することを含む、移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病の予防方法及び／又は治療方法として表すこともできる。予防及び／又は治療方法における医薬組成物の有効量、医薬組成物を含む製剤、態様、投与方法等は、上で説明したとおりである。
　また、本発明によると、移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病の発症又は進行を予防又は治療する方法がさらに提供される。この方法は、第１の態様の評価方法によって移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病を発症している又は発症する可能性が高いと評価された者に対して、あるいは移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病が第一の尿由来検体採取時において第二の尿由来検体採取時よりも進行している可能性が高いと評価された者に対して、移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病の発症又は進行に対する予防的処置又は治療的処置を行う工程を含む。
　この方法の例示的実施形態は、被験者から採取された尿由来検体中のSYT17タンパク質量を測定する工程；被験者尿由来検体中のSYT17タンパク質量とカットオフ値とを比較する工程であって、前記カットオフ値が、移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病を発症している複数の患者及び対照者から採取された尿由来検体中のSYT17タンパク質量を予め測定し、これらの測定値を用いてROC解析を行うことで決定されるものである、前記工程；並びに、被験者尿由来検体中のSYT17タンパク質量がカットオフ値を上回る場合、被験者に対して移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病の発症又は進行に対する予防的処置又は治療的処置を行う工程を含む。
　この方法の別の例示的実施形態は、被験者から採取された尿由来検体中のSYT17タンパク質量を測定する工程；被験者尿由来検体中のSYT17タンパク質量と対照者から採取された尿由来検体中のSYT17タンパク質量とを比較する工程；及び、被験者尿由来検体中のSYT17タンパク質量が対照者尿由来検体中のSYT17タンパク質量よりも多い場合、被験者に対して移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病の発症又は進行に対する予防的処置又は治療的処置を行う工程を含む。
　この方法のさらなる別の例示的実施形態は、被験者から採取された第一の尿由来検体中のSYT17タンパク質量を測定する工程；第一の尿由来検体中のSYT17タンパク質量と、第一の尿由来検体採取よりも前の時点で同一被験者から採取された第二の尿由来検体中のSYT17タンパク質量とを比較する工程；及び、第一の尿由来検体中のSYT17タンパク質量が第二の尿由来検体中のSYT17タンパク質量よりも多い場合、被験者に対して移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病の発症又は進行に対する予防的処置又は治療的処置を行う工程を含む。
　移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病の発症又は進行を予防又は治療する方法において、予防的処置又は治療的処置は、好ましくは、人工透析、腎移植又は前述の医薬組成物の投与である。
検査キット
　本発明は、SYT17に対する特異抗体又はその誘導体を含む、移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病の発症又は進行の可能性の評価において使用するための検査キットを別の態様として提供する。
　検査キットは、SYT17に対する特異抗体又はその誘導体に加えて、エクソソームマーカーとして認識されているタンパク質、例えばCD9、CD63、CD81、ALIX等のタンパク質に対する特異抗体又はその誘導体、特に好ましくはCD9に対する特異抗体又はその誘導体を含んでもよい。検査キットはまた、イムノアッセイに必要とされる器具や試薬、例えばプレート等の担体や、ブロッキング溶液、洗浄液及び発色基質等の試薬をさらに含んでもよい。
　本態様の検査キットは、上述の評価方法において、被験者から採取された尿由来検体中のSYTタンパク質量の測定のために用いることができる。また、本態様の検査キットは、前述の医薬組成物を投与する対象を選別するために、具体的には対照者の尿中SYT17タンパク質量よりも多い又はカットオフ値を上回る尿中SYT17タンパク質量を有する対象を選別するために用いることもできることから、コンパニオン診断薬としても有用である。
　以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実験手法
１）患者及び尿検体
　北海道大学病院倫理委員会の承認を受けて、2016年から2019年の間に、健常ボランティア、慢性腎臓病（CKD）患者及び腎移植（KTx）患者から全尿を得た。KTx患者からの採尿はプロトコール生検時に行い、エピソード生検時の尿は除外した。尿は1,500rpmで5分間遠心分離して上清を回収し、-80℃で保存した。
　なお、KTx患者は全員、プレドニゾン、ミコフェノール酸及びタクロリムス又はシクロスポリンによる標準的な免疫抑制治療を受けた患者である。またKTx患者は、プロトコール生検の組織学的結果から、Banff分類（2017）に基づいて、正常病理組織群（NED、n=20）、線維化群（interstitial fibrosis and tubular atrophy、IF/TA、n=19）、カルシニューリン毒性群（CNI-T、n=17）及び慢性活動性抗体関連型拒絶反応群（CAAMR、n=22）の4群に分類した。
　また、図１０に結果が示される試験において、CKD患者は、膜性腎症（n=2、いずれもタンパク尿陽性）、原発性ネフローゼ症候群（n=1）、及びループス腎炎（n=2）の患者であった。図１１及び１２に結果が示される試験において、CKD患者は、膜性腎症（タンパク尿陽性n=1、タンパク尿陰性n=2）、微小変化型ネフローゼ症候群（n=2）、ネフローゼ症候群（n=1）、糖尿病性腎症（n=1）、IgA腎症（n=2）、及び巣状分節性糸球体硬化症（n=1）であった。図１３に結果が示される試験において、CKD患者は、常染色体優性多発性嚢胞腎（n=10）であった。
２）免疫組織染色
　Kawamoto, et al., 2003. Arch. Histol. Cytol. 66: 123に記載の方法に準じて、KTx患者から得た移植腎プロトコール生検の余剰検体から凍結切片又はパラフィン切片を作製した。詳細には、まず移植腎検体を化合物に包埋して-80℃で凍結した。ミクロトームを用いて凍結切片（10μm）を作製し、エタノールで脱水した後、ホルムアルデヒドで固定した。SYT17タンパク質の検出のため、一次抗体として抗SYT17抗体（1/200、Proteintech）及びウサギIgGアイソタイプコントロール（1/5000、Cell Signaling Technology）を加えて4℃で一晩反応させ、次いで二次抗体としてロバ抗ウサギIgG (H+L), Alexa Fluor 546（1/1000、Life Technologies）又はロバ抗ウサギIgG (H+L), Hoechst 33342三塩酸塩三水和物(1/3,000、Life Technologies）を加えて常温で反応させた。反応後の切片を25%グリセロールで包埋し、ホルマリンで固定してパラフィン切片とした。
　連続切片について、リン酸化STAT3及びリン酸化NF-κBを、ウサギ抗STAT3 pY705（1:200、Cell Signaling Technology）、ウサギ抗リン酸化NF-κB p65 Ser276（1/400、Sigma Aldrich）又はコントロール抗体（Cell Signaling Technology）を用いて、さらに免疫染色のシグナル増強及び可視化のためにウサギIgG Elite ABC Kit及びImmPACT DAB（Vector Laboratories、Burlingame）を用いて検出した。切片の分析は、BZ-9000顕微鏡（KEYENCE）を用いて行った。
３）尿中エクソソームの分離
　MagCapture Exosome Isolation Kit PS（富士フィルム和光純薬工業）を製造業者のプロトコールに従って用いて、1mlの全尿検体からエクソソームを回収し、1/100量のプロテアーゼ阻害剤（Z-Leu-Leu-Leu-al（登録商標）、Sigma Aldrich）を添加後、-20℃で保存した。
４）イムノブロッティング
　全尿検体及び尿中エクソソーム画分をSDS緩衝液（10% SDS、10%グリセロール、0.04%ブロモフェノールブルー、0.5M Tris-HCl pH 6.8、及び10% 2-メルカプトエタノール）に溶解し、60℃で10分間ボイルした。SDS‐PAGEで分離後、ゲル中のタンパク質をPVDF膜（Millipore）に転写した。イムノブロッティングは、Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution（Toyobo）を製造業者のプロトコールに従って用いて行った。一次抗体としてAnti-SYT17（1/2500、HPA040811、Atlas Antibodies）及び抗CD9抗体（1/1000、System Biosciences）を、二次抗体としてヤギ抗ウサギlgG（H+L）HRP抗体（1/10,000、Thermo Fisher Scientific）及びヤギ抗ウサギHRP抗体（1/20000、System Biosciences）を使用した。SYT17の検出には、シグナル増強液であるPierce（登録商標）Western Blot Signal Enhancer（Thermo Fisher Scientific）を利用した。タンパク質の可視化は、製造業者のプロトコールに従ってPierce（商標） ECL+ Western Blotting Substrate（Thermo Fisher Scientific）を用いて行った。フィルムは自動X線フィルム展開装置（FPM 100、Fuji Medical Film）を用いて現像した。イムノブロッティングの結果は、Image Jソフトウェアを用いて定量化した。
５）発現ベクターの細胞内導入及びレポーターアッセイ
　IL-6プロモーター下にホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するpGL4.20 [luc2/Puro]（Promega）又はNF-κBプロモーター下にホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するpGL4.32 [luc2P/ NF-κB -RE/Hygro]（Promega）、及び内部コントロールであるウミシイタケルシフェラーゼの発現ベクターpGL4.74 [hRluc/TK]（Promega）でそれぞれ予め形質転換した2種のHEK293T細胞に、SYT17遺伝子を組み込んだpEF-BOSベクター（Mizushima, S. et al., 1990, Nucleic Acids Res 18: 5322）を、ポリエチレンイミンを用いてトランスフェクションした。トランスフェクションの24時間後に細胞を回収し、TNFα（50ng/ml）で6時間刺激した。細胞を回収して全細胞溶解物を調製し、TNFα刺激存在下又は非存在下におけるIL-6プロモーター及びNF-κBプロモーターのプロモーター活性の変化をdual luciferase assayにより評価した。ルシフェラーゼ活性の測定は、Dual Luciferase Reporter Assay System（Promega）を用いて、ルミノメータ（GloMax（登録商標）-Multi Detection System、Promega）で行い、ホタルルシフェラーゼ反応による発光強度をウミシイタケルシフェラーゼ反応による発光強度で補正した。
６）siRNAによるノックダウン
　SYT17の発現をノックダウンするsiRNAとしてhuman si-SYT17（S1: s28627、S2: s28628、S3: s28629、いずれもThermo Fisher）を、ネガティブコントロールとしてhuman si-nontarget（Ambion Silencer select 4390843）を、ポジティブコントロールとしてNF-κB p65サブユニットの発現をノックダウンするp65 siRNA（Ambion Silencer select 4427038）を用いて以下の実験を行った。human si-SYT17の塩基配列は以下のとおりである。
S1: s28627
センス鎖配列　5'-GCCUAGUGUUUACAGUUUUtt-3'（配列番号１）
アンチセンス鎖　5'-AAAACUGUAAACACUAGGCtg-3'（配列番号２）
S2: s28628
センス鎖　5'-GCUGGUGCAUGGACUCAAAtt-3'（配列番号３）
アンチセンス鎖　5'-UUUGAGUCCAUGCACCAGCtg-3'（配列番号４）
S3: s28629
センス鎖　5'-GCUCUCCACUCAUCGAUAUtt-3'（配列番号５）
アンチセンス鎖　5'-AUAUCGAUGAGUGGAGAGCtg-3'（配列番号６）
　Day1でヒト腎近位尿細管上皮細胞（RPTEC）又はヒト腎糸球体内皮細胞（HRGEC）を96 well plateに1.4×10３cells/wellで播種し、siRNA溶液（1ウェルあたり18μlのOpti-MEM（Thermo Fisher）及び0.5 μLの5 μM siRNA溶液）及びトランスフェクション試薬（1ウェルあたり0.28μlのLipofectamine RNAiMAX（Thermo Fisher Scientific））を各ウェルに添加して一晩培養した。Day2で180μLのDMEM（富士フィルム和光純薬工業）に10% FBS（Thermo Fisher Scientific）を混合した培地を追加してさらに一晩培養した。Day 3で、2時間の血清飢餓処理の後、ヒトIL-6（R&D Systems）100 ng/mL＋ヒト可溶性IL-6Rα（R&D Systems）100 ng/mL、及びヒトIL-17（PeproTech）50 ng/mL又はヒトTNFα（PeproTech）50 ng/mLで3時間刺激してSTAT3及びNF-κBを活性化した。RNA Extraction Kit（Toyobo）を用いてmRNAを抽出後、逆転写反応を行い、定量的PCRによってハウスキーピング遺伝子GAPDHに対するIL-6及びCCL2のmRNA発現量を測定した。使用したプライマーは以下のとおりである。
IL-6：
フォワードプライマー　5'-GGTACATCCTCGACGGCATCT-3'（配列番号７）
リバースプライマー　5'-GTGCCTCTTTGCTGCTTTCAC-3'（配列番号８）
CCL2：
フォワードプライマー　5’-CAGCCAGATGCAATCAATGCC-3'（配列番号９）
リバースプライマー　5’-TGGAATCCTGAACCCACTTCT-3'（配列番号１０）
GAPDH：
リバースプライマー　5'- GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'（配列番号１１）
リバースプライマー　5'- CGCTCCTGGAAGATGGTG-3'（配列番号１２）
７）統計解析
　統計解析は、各KTx群のサンプルサイズを20に設定して行った。効果量を約1.4、両側有意水準を0.05と仮定すると、このサンプルサイズはTukey検定を用いた場合に80%の検出力をもたらす。2群間の比較にはカイ二乗検定又はStudentのt検定を用いた。多群間の比較にはTukey検定又はDunnett検定を用いた。ROC曲線は、二項分類（拒絶反応ありvs拒絶反応なし）の性能を示す。Youden's indexを用いてROC曲線からカットオフ値を決定した。統計解析には、JMP（登録商標）14（SAS Institute Inc）を用いた。p値0.05未満を群間の有意差（*P <0.05、** P<0.01、*** P<0.001）とした。エラーバーは各群の標準偏差（SD）を表す。
実施例
１）腎組織におけるSYT17タンパク質の発現解析
　移植腎検体の免疫組織染色によると、CAAMR群では、NED群、IF/TA群及びCNI-T群と比較して主に尿細管上皮細胞でSYT17タンパク質が強く発現していることが確認された（図１）。また、SYT17タンパク質は主に細胞質に局在することも確認された（図示せず）。
　また、CAAMR群の尿細管領域において、他のKTx群と比較して、NF-κB p65及びSTAT3のリン酸化（活性化）が亢進していることが確認された（図２）。さらに、トランスクリプトーム解析によると、ヒト尿細管上皮細胞をIL-6及びTNFαで共刺激するとIL-6及びCCL20の発現量が増加すると共にSYT17の発現量も増加することが確認された（図３）。
２）SYT17のノックダウン
　SYT17の発現をノックダウンすることができる3種類のsi-RNA S1～S3をトランスフェクトした糸球体内皮細胞（HRGEC）及び近位尿細管細胞（RPTEC）をIL-6＋TNFα又はIL-6＋IL-17でそれぞれ刺激したところ、IL-6及びCCL2の発現が抑制された（図４）。
３）SYT17の強制発現
　SYT17を強制発現させたHEK293T細胞をTNFαで刺激したときのNF-κBプロモーター活性及びIL-6プロモーター活性をルシフェラーゼアッセイにより評価した。SYT17の過剰発現及びTNFαの刺激によって、NF-κBプロモーター活性及びIL-6プロモーター活性が亢進することが確認された（図５）。
　以上の結果は、CAAMRの尿細管細胞において、IL-6やCCL20といった炎症増幅因子によってNF-κB及びSTAT3が活性化され、この活性化がさらにSYT17タンパク質の発現を誘導し、正のフィードバックを介して移植腎における炎症を促進することを示す。
４）KTx患者尿中エクソソーム中のSYT17タンパク質の検出
　全尿検体及び尿中エクソソーム画分のイムノブロッティングにより、SYT17タンパク質は全尿検体では検出されないものの尿中エクソソーム画分では検出可能であること、並びにCAAMR群において、エクソソームマーカーであるCD9に対するSYT17タンパク質の相対的レベル（SYT17/CD9）が健常ボランティア及びNED群と比較して上昇していることが確認された（図６）。
　さらに検体数を増やした尿中エクソソーム画分のSYT17/CD9定量結果を、他の臨床パラメータの結果と共に図７に示す。SYT17/CD9は、健常ボランティア群で0.12±0.09、NED群で0.13±0.17、IF/TA群で0.22±0.35、CNI-T群で0.40±0.35、CAAMR群で1.34±1.05であり、CAAMR群では尿中エクソソーム中の相対的SYT17タンパク質レベルが他群より有意に高かった（図７A）。これに対し、現在臨床的に使用されているマーカーであるN-アセチル-β-D-グルコサミニダーゼ（NAG）/Cre、尿蛋白（U-TP）/Cre及びeGFRは、CAAMR群を他群と鑑別することができなかった（図７B～D）。また、SYT17/CD9とこれらの臨床パラメータとの有意な相関は観察されなかった（図８A～C）。また、SYT17/CD9の値を説明変数とし、慢性拒絶反応の有無、すなわちCAAMR群であるか他群（健常ボランティア、NED群、IF/TA群、CNI-T群）であるかを目的変数としたROC解析を行ったところ、ROC曲線はAUC=0.82を示し、精度は中程度であった（図９）。ROC解析によるSYT17/CD9の最適カットオフ値は0.42で、このときの感度は77％、特異度は87％であった。
５）CKD患者尿中エクソソーム中のSYT17タンパク質の検出
　CKD患者の尿中エクソソーム画分でも、CAAMR患者と同様の結果が確認された（図１０）。
　さらに検体数を増やして、CKD患者の尿中エクソソーム画分に含まれるSYT17タンパク質をイムノブロッティングにより検出し（一例を図１１に示す）、検出されたSYT17及びCD9のバンドの強度をレーン毎に定量してSYT17/CD9を算出した（図１２、１３）。図１１及び１２中の1～10の番号は、それぞれ以下のCKD患者尿中エクソソーム画分のデータに相当する。
1：膜性腎症（タンパク尿陽性）
2：微小変化型ネフローゼ症候群
3：膜性腎症（タンパク尿陰性）
4：糖尿病性腎症
5：IgA腎症
6：微小変化型ネフローゼ症候群
7：IgA腎症
8：ネフローゼ症候群
9：巣状分節性糸球体硬化症
10：膜性腎症（タンパク尿陰性）
なお、図１２中の右側5個のバー（１１番から１５番）は、図１０に結果が示される試験において分析されたCKD患者5名の各々の定量値である。また、図１２及び１３中に、健常ボランティア（n=15）の尿中エクソソーム画分から同様にして定量されたSYT17/CD9の平均値0.9を点線で示す（なお、SYT17/CD9の標準偏差は約0.2であった）。
　尿中エクソソーム画分中SYT17/CD9は、全てのCKD患者において健常ボランティアの平均値よりも高値となり、タンパク尿陰性の膜性腎症では健常ボランティア平均値の１倍超、常染色体優性多発性嚢胞腎では約2倍以上、他のCKD（タンパク尿陽性の膜性腎症、微小変化型ネフローゼ症候群、糖尿病性腎症、IgA腎症、ネフローゼ症候群、巣状分節性糸球体硬化症、ループス腎炎）では3倍以上の値を示した。
　上記の実施例に示される結果は、尿中、特に尿中エクソソーム画分のSYT17タンパク質レベルが、慢性拒絶反応又は慢性腎臓病の診断マーカーになることを示すものである。
配列番号１：SYT17に対するsiRNAであるhuman si-SYT17 s28627のセンス鎖の塩基配列
配列番号２：SYT17に対するsiRNAであるhuman si-SYT17 s28627のアンチセンス鎖の塩基配列
配列番号３：SYT17に対するsiRNAであるhuman si-SYT17 s28628のセンス鎖の塩基配列
配列番号４：SYT17に対するsiRNAであるhuman si-SYT17 s28628のアンチセンス鎖の塩基配列
配列番号５：SYT17に対するsiRNAであるhuman si-SYT17 s28629のセンス鎖の塩基配列
配列番号６：SYT17に対するsiRNAであるhuman si-SYT17 s28629のアンチセンス鎖の塩基配列
配列番号７：IL-6フォワードプライマーの塩基配列
配列番号８：IL-6リバースプライマーの塩基配列
配列番号９：CCL2フォワードプライマーの塩基配列
配列番号１０：CCL2リバースプライマーの塩基配列
配列番号１１：GAPDHフォワードプライマーの塩基配列
配列番号１２：GAPDHリバースプライマーの塩基配列

Claims (13)

  1. 　被験者から採取された尿由来検体中のSYT17タンパク質量を指標とする、被験者の移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病の発症又は進行の可能性を評価する方法。
  2. 　被験者から採取された尿由来検体中のSYT17タンパク質量を測定する工程、
    　被験者尿由来検体中のSYT17タンパク質量とカットオフ値とを比較する工程であって、前記カットオフ値が、移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病を発症している複数の患者及び対照者から採取された尿由来検体中のSYT17タンパク質量を予め測定し、これらの測定値を用いてROC解析を行うことで決定されるものである、前記工程、並びに
    　被験者尿由来検体中のSYT17タンパク質量がカットオフ値を上回る場合、被験者は移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病を発症している又は発症する可能性が高いと評価する工程
    を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　被験者から採取された尿由来検体中のSYT17タンパク質量を測定する工程、
    　被験者尿由来検体中のSYT17タンパク質量と対照者から採取された尿由来検体中のSYT17タンパク質量とを比較する工程、及び
    　被験者尿由来検体中のSYT17タンパク質量が対照者尿由来検体中のSYT17タンパク質量よりも多い場合、被験者は移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病を発症している又は発症する可能性が高いと評価する工程
    を含む、請求項１に記載の方法。
  4. 　被験者から採取された第一の尿由来検体中のSYT17タンパク質量を測定する工程、
    　第一の尿由来検体中のSYT17タンパク質量と、第一の尿由来検体採取よりも前の時点で同一被験者から採取された第二の尿由来検体中のSYT17タンパク質量とを比較する工程、及び
    　第一の尿由来検体中のSYT17タンパク質量が第二の尿由来検体中のSYT17タンパク質量よりも多い場合、被験者における移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病は第一の尿由来検体採取時において第二の尿由来検体採取時よりも進行している可能性が高いと評価する工程
    を含む、請求項１に記載の方法。
  5. 　尿由来検体が、尿中エクソソームが濃縮された検体である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　被験者が、腎移植のレシピエントである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　慢性腎臓病の原因となる腎疾患が、膜性腎症、ネフローゼ症候群、ループス腎炎、糖尿病性腎症、IgA腎症、巣状分節性糸球体硬化症、常染色体優性多発性嚢胞腎又は慢性移植腎腎症である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　SYT17に対する特異抗体及びその誘導体並びにSYT17に対する阻害性核酸よりなる群から選択される少なくとも１つの物質を含む、移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病の予防及び／又は治療のための医薬組成物。
  9. 　対照者の尿中SYT17タンパク質量よりも多い又はカットオフ値を上回る尿中SYT17タンパク質量を有する対象に投与するための、請求項８に記載の医薬組成物であって、前記カットオフ値が、移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病を発症している複数の患者及び対照者から採取された尿由来検体中のSYT17タンパク質量を予め測定し、これらの測定値に対してROC解析を行うことで決定されるものである、前記医薬組成物。
  10. 　慢性腎臓病の原因となる腎疾患が、膜性腎症、ネフローゼ症候群、ループス腎炎、糖尿病性腎症、IgA腎症、巣状分節性糸球体硬化症、常染色体優性多発性嚢胞腎又は慢性移植腎腎症である、請求項８又は９に記載の医薬組成物。
  11. 　SYT17に対する特異抗体又はその誘導体を含む、移植腎慢性拒絶反応又は慢性腎臓病の発症又は進行の可能性の評価において使用するための検査キット。
  12. 　さらにCD9に対する特異抗体又はその誘導体を含む、請求項１１に記載の検査キット。
  13. 　請求項８～１０のいずれか一項に規定される医薬組成物のコンパニオン診断において使用するための、請求項１１又は１２に記載の検査キット。

     
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009511913A (ja) * 2005-10-13 2009-03-19 チルドレンズ・ホスピタル・メデイカル・センター Ｎｇａｌを使用する慢性腎疾患の診断および監視
JP2009532047A (ja) * 2006-04-03 2009-09-10 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト 慢性同種移植腎症についての予測バイオマーカー
US20180356402A1 (en) * 2017-06-08 2018-12-13 The Cleveland Clinic Foundation Urine biomarkers for detecting graft rejection

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009511913A (ja) * 2005-10-13 2009-03-19 チルドレンズ・ホスピタル・メデイカル・センター Ｎｇａｌを使用する慢性腎疾患の診断および監視
JP2009532047A (ja) * 2006-04-03 2009-09-10 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト 慢性同種移植腎症についての予測バイオマーカー
US20180356402A1 (en) * 2017-06-08 2018-12-13 The Cleveland Clinic Foundation Urine biomarkers for detecting graft rejection

Non-Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"NCBI", Database accession no. NM_001330509.1
HAN, K. H. ET AL., AM. J. PHYSIOL. RENAL PHYSIOL., 2007
JANG, Y. S. ET AL., BRAIN RES, vol. 999, 2004, pages 203
KAITHAMANA ET AL., J.IMMUNOL., vol. 163, 1999, pages 5157 - 5164
KAWAMOTO ET AL., ARCH. HISTOL. CYTOL., vol. 66, 2003, pages 123
MEYAARD, IMMUNITY, vol. 7, 1997, pages 283 - 290
MIZUSHIMA, S. ET AL., NUCLEIC ACIDS RES, vol. 18, 1990, pages 5322
MURAKAMI ET AL., CELL REPORTS, vol. 3, no. 3, 2013, pages 946 - 59
MURAKAMI ET AL., J. EXP. MED., vol. 208, no. 1, 2011, pages 103 - 14
OGURA ET AL., IMMUNITY., vol. 29, no. 4, 2008, pages 628 - 36
RUHL, D.A. ET AL.: "Synaptotagmin 17 controls neurite outgrowth and synaptic physiology via distinct cellular pathways", NATURE COMMUNICATIONS, vol. 3532, 6 August 2019 (2019-08-06), pages 1 - 14, XP055845661 *
TAKADA YUSUKE, KAMIMURA DAISUKE, JIANG JING-JING, HIGUCHI HARUKA, IWAMI DAIKI, HOTTA KIYOHIKO, TANAKA YUKI, OTA MITSUTOSHI, HIGUCH: "Increased urinary exosomal SYT17 levels in chronic active antibody-mediated rejection after kidney transplantation via the IL-6 amplifier", INTERNATIONAL IMMUNOLOGY, vol. 32, no. 10, 30 September 2020 (2020-09-30), pages 653 - 662, XP055911909, DOI: 10.1093/intimm/dxaa032 *
WRIGHT ET AL., IMMUNITY, vol. 13, 2000, pages 233 - 242

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