JP6155533B2

JP6155533B2 - Ｔｄｐ−４３細胞内存在量関連疾患の認定方法

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Publication number: JP6155533B2
Application number: JP2014502381A
Authority: JP
Inventors: 信弘高橋; 桂一泉川; 石川　英明; 英明石川; 治孝吉川; 俊明礒邉; 万悟田岡; 中山　洋; 洋中山
Original assignee: NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION TOKYO UNIVERSITY OF AGRICULUTURE & TECHNOLOGY; Tokyo Metropolitan University
Current assignee: NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION TOKYO UNIVERSITY OF AGRICULUTURE & TECHNOLOGY; Tokyo Metropolitan University
Priority date: 2012-02-28
Filing date: 2013-02-28
Publication date: 2017-07-05
Anticipated expiration: 2033-02-28
Also published as: EP2821504A4; CN104520439A; WO2013129603A1; US20150045248A1; EP2821504A1; JPWO2013129603A1

Description

本発明は、TDP-43細胞内存在量関連疾患の認定方法、及び細胞内における特定のmt-tRNAの存在量を低減させる薬剤の製造方法又はTDP-43と核酸若しくはポリペプチドとの結合を阻害する結合阻害剤の製造方法に関する。

筋萎縮性側索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis：以下、しばしば「ALS」と略称する）は、脳幹・脊髄・運動ニューロンの病変によって上位運動ニューロン障害、下位運動ニューロン障害が進行し、それに伴う筋萎縮と筋力低下の原因によって上肢の機能障害、歩行障害、構音障害、嚥下障害、呼吸障害等の症状が現われる難治性の疾患である。人工呼吸器により比較的長期間生存する例も知られてはいるが、病勢の進展は通常比較的速く、発症後平均3.5年で主として呼吸筋の麻痺によって死亡することが多い。

ALSのうち5〜10％は、家族歴を伴うことから家族性筋萎縮性側索硬化症（家族性ALS）と呼ばれている。家族性ALSの約2割では、フリーラジカルを除去する酵素であるCu/Zn スーパーオキシドジスムターゼ（SOD1：superoxide dismutase 1）遺伝子の変異（ALS1）が報告されており（非特許文献１）、SOD1遺伝子がALSの原因遺伝子の1つと考えられている。また、その他のALSの原因遺伝子としては、アンジオゲニンangiogenin（非特許文献２）、小胞膜結合タンパク質（VAMP:vesicle-associated membrane protein）/シナプス小胞結合タンパク質B(VAPB：synaptobrevin-associated membrane protein B)（非特許文献３）、TAR DNA結合タンパク質43（TDP-43：TAR DNA-binding protein）（非特許文献４）、及びfused in sarcoma/translated in liposarcoma(FUS/TLS)（非特許文献５）等の遺伝子が報告されている。しかし、これらの遺伝子異常により、ALSがどのように発症し、病態が進行するのか、その具体的な機序については明らかにされていない。

Maruyamaら（非特許文献６）は、家族性ALS患者の6例中3例で、細胞内シグナル伝達に関与するNFκBを抑制するオプチニューリン（optineurin）の遺伝子に変異があることを開示している。変異型オプチニューリンは、NFκBの抑制活性を喪失していることから、NFκB阻害剤がALSの治療効果を持つ可能性が示唆されている。しかしながら、ALSの90〜95％は、孤発性であり、多くのALS患者ではオプチニューリン遺伝子よりも、むしろTDP-43遺伝子において変異が見い出されている。それ故、仮にNFκB阻害剤がALS治療における効果を有していたとしても、その治療効果は、ごく一部のALS患者にしか期待できない。

Rothsteinら（非特許文献７）は、変異型SOD1遺伝子を有するALS患者の髄液で、野生型SOD1遺伝子を有する健常体と比較してグルタミン酸(以下しばしば「Glu」と略称する)の濃度が3倍近く増加すること、及び集団的研究でも孤発性ALS患者の約40%の髄液でGluの増加が確認されていることから、Gluの増加に伴うGlu毒がALSの発症機序において重要な役割を担っていることを示唆している。ALS患者におけるこのようなGluの増加は、アストロサイトでのGluの取り込みの喪失によるものであると考えられており、それ故、孤発性ALSは、Glu毒、特にグルタミン酸受容体のサブタイプであるα-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソオキサゾールプロピオン酸（AMPA）受容体を介したGlu増加によるGlu毒により神経障害をきたす結果として発症するという仮説が有力である。ヒトALS運動ニューロンでは、AMPA受容体のサブユニットであるGluR2 Q/R部位のRNA編集率が低く、孤発性ALSの病態に重要な役割を果たすとの報告もあり（非特許文献８〜１２）、この仮説を支持している。

Lacomblezら（非特許文献１３）は、リルゾール（Riluzole）がALS患者の生存期間を僅かではあるが有意に延長できるという臨床試験結果を開示している。リルゾールは、前記仮説に基づいて開発されたグルタミン酸の拮抗剤である。現在のところ、このリルゾールのみがALSの治療薬として欧米及び日本において認可されている（商品名：リルテック）。しかし、リルゾールは、ALSの原因であるGlu増加を抑制するものではなく、Glu増加によるGlu毒効果を軽減する対処療法に過ぎないため、ALSの主症状である筋力低下や他の臨床症状に対する有効性はない。

特許文献１には、メチルコバラミン（Methylcobalamin）の大量投与によりALSの臨床症状に一定の改善効果が認められることが開示されており、現在、メチルコバラミンの二重盲検比較試験が進められている。しかし、本薬剤も主にグルタミン酸による細胞死に対する抑制的効果（非特許文献１４）に基づいており、リルゾールの効果を大きく改善することは期待できない。ところで、メチルコバラミンのALSに対する効果については、Gluの毒性効果抑制の他にも、高濃度のメチルコバラミンがS‐アデノシルメチオニンによるDNAのメチル化を競争的に阻害することから、遺伝子転写を高く維持し(非特許文献１５)、それによって神経再生に必要な各種タンパク質の合成が促進される結果として、脊髄や大脳の運動神経細胞の保護に及ぶのではないか、と推測されている。しかし、実際にALSの病態、発症機構との関連性を示す証拠はなく、単なる一般論的推論に留まっている。

また、ALSの診断には現在までのところ確定診断できる特異的臨床検査方法がなく、従来は、病歴や神経所見によって総合的に判定されており、発症前の予想、発症早期の診断や発症後の正確な診断は、困難であった。

以上のように、ALSは、これまで精度の高い診断方法、根治療法、及び進行抑制又は進行遅延療法が確立しておらず、その開発が切望されていた。

特願平9−41604

Rosen D.R., et al. 1993, Nature, 362(6415):59-62. Greenway M.J., et al. 2004, Neurology, 63(10):1936-8. Ratnaparkhi A., et al. 2008, PLoS One, 3(6):e2334. Arai T., et al. 2006, Biochem. Biophys. Res. Commun., 351(3):602-11. Kwiatkowski T.J. Jr, 2009, Science, 323(5918):1205-8 Maruyama H., et al., 2010, Nature, 465: 223-226 Rothstein J.D., et al., 1990, Ann, Neurol.,28:18 -25. Trotti D., et al., 1999, Nat. Neurosci., 1999, 2:427-433. Rothstein J.D., 1996, Neuron, 16:675- 686. Bruijn L.I., et al. 1997, Neuron, 18:327-338. Howland D.S., et al. 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, ;99:1604 -1609. Rothstein, J.D., 2009, Ann. Neurol., 65 (suppl):S3-S9. Lacomblez L., 1996, Lancet, 347: 1425-1431. Akaike A., et al., 1993, Eur. J. Pharmacol., 241:1-6. Pfohl-Leszkowicz A, et al., 1991, Biochemistry, 30:8045-8051.

本発明の目的は、ALSや前頭側頭葉変性症（frontotemporal lobar degeneration：以下しばしば「FTLD」とする。ピック球を有するピック病を含むものとする。）をはじめとするTAR DNA結合タンパク質-43（TAR DNA-binding Protein 43kDa：本明細書においては、以下、しばしば「TDP-43」と略称する）細胞内存在量関連疾患の認定方法、及びTDP-43結合阻害剤製造法を開発し、提供することである。

上記課題を解決するために、本発明者らは、ALS患者の中で変異頻度の高いTDP-43遺伝子について研究を行った。TDP-43遺伝子は、家族性ALS及び孤発性ALSのいずれにおいても変異が見い出されており、ALSの主要な原因遺伝子であることが示唆されている(Lagier-Tourenne, C., and Cleveland, D. W., 2009, Cell, 136;1001-1004；Arai, et al., 2006, Biochem. Biophys. Res. Commun., 351:602-611; Neumann, et al., 2006, Science, 314, 130-133；Chen-Plotkin, et al., 2010, Nat. Rev. Neurol., 6: 211-220；Lagier-Tourenne, et al., 2010, Hum. Mol. Genet. 19: R46-R64; Kabashi, et al., 2008, Nat. Genet. 40:572-574; Sreedharan, et al., 2008, Science, 319:1668-1672; Pesiridis, G.S., et al., 2009, Hum. Mol. Genet., 18:R156-R162)。また、ALS患者の病巣部の細胞では細胞質にTDP-43を含む沈着物が蓄積することが知られている（Arai T, et al., Biochem Biophys Res Commun., 2006, 351:602-611）。しかしながら、TDP-43の細胞内における機能やTDP-43遺伝子の変異がALS発症とどのように関連するのか、その機序については、これまで全く不明であった。TDP-43に変異を持つ孤発性ALSの多数症例を用いてゲノムワイドにTDP-43作用遺伝子を探索する研究も進行中であるが、新規の治療法及びそのスクリーニング法の開発に結びつく結果は、現在までのところ得られていない(Sephton C.F., et al., 2011, J. Biol. Chem. 286:1204-1215.；Polymenidou M, et al., 2011, Nat. Neurosci.,14(4):459-68.；T
ollervey J.R., et al., 2011, Nat. Neurosci., 14(4):452-8)。

本発明者らは、TDP-43のアミノ酸配列中に、RNA結合配列であるRRM(RNA Recognition Motif)ドメインが存在することに着目し、鋭意研究を進めた結果、TDP-43は4種のミトコンドリアtRNA(以下「mt-tRNA」とする)、すなわち、mt-tRNA^Asn、mt-tRNA^Gln、mt-tRNA^Glu及びmt-tRNA^Proの生合成又は代謝と、グルタミン酸／グルタミン及びアスパラギン酸／アスパラギンのアミノ酸代謝に関与し、当該mt-tRNAやアミノ酸の生合成又は代謝における足場となるスキャホールドタンパク質であること、かつ当該mt-tRNAやアミノ酸の細胞内存在量を制御していることが明らかになった。また、TDP-43はエネルギー代謝の制御にも関与し、TDP-43の細胞内での存在量とATP又は活性酸素の細胞内量に相関関係があることも明らかになった。さらに、細胞内におけるTDP-43の発現量の増加によって誘導される細胞死がTDP-43と一部のmt-tRNAとの結合量の増加と相関すること、及びその結合を正常値まで低減させることで細胞死が生じなくなることを見いだした。本発明は、当該知見に基づいて完成されたものであって、具体的には、以下を提供する。

（１）TDP-43の細胞内存在量に関連する疾患の認定方法であって、
被検体由来の細胞内における、
（ａ）mt-tRNA^Asn、mt-tRNA^Gln、mt-tRNA^Glu及びmt-tRNA^Proからなる群から選択される少なくとも一のmt-tRNAの存在量、
（ｂ）グルタミン酸及び／又はアスパラギン酸の存在量、
（ｃ）ATP又は活性酸素の存在量、
（ｄ）Aralar 1、Aralar 2、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ及びMusashi 2からなる群から選択される少なくとも一のポリペプチドとTDP-43との結合量、又は
（ｅ）mt-tRNA^Asn、mt-tRNA^Gln、mt-tRNA^Glu及びmt-tRNA^Proからなる群から選択される少なくとも一のmt-tRNAとTDP-43との結合量
の少なくとも一つを測定する測定工程、及び
前記測定工程で得られた測定値を健常体由来の細胞内における対応する測定値と比較して、両者の値に統計学的に有意な差がある場合には、その被検体が前記疾患に罹患していると認定する認定工程
を含む、前記方法。

（２）前記疾患は、被検体由来の細胞内におけるTDP-43の存在量が健常体由来の細胞内におけるその存在量と比較して統計学的に有意に増加する疾患である、（１）に記載の認定方法。

（３）前記TDP-43が配列番号１で示されるアミノ酸配列において開始メチオニンを1位としたときに、90位のアラニンがバリン（以下、しばしば「A90V」と略称する）に、169位のアスパラギン酸がグリシン（以下、しばしば「D169G」と略称する）に、267位のアスパラギンがセリン（以下、しばしば「N267S」と略称する）に、287位のグリシンがセリン（以下、しばしば「G287S」と略称する）に、290位のグリシンがアラニン（以下、しばしば「G290A」と略称する）に、292位のセリンがアスパラギン（以下、しばしば「S292N」と略称する）に、294位のグリシンがアラニン（以下、しばしば「G294A」と略称する）に、294位のグリシンがバリン（以下、しばしば「G294V」と略称する）、295位のグリシンがアルギニン（以下、しばしば「G295R」と略称する）に、295位のグリシンがセリン（以下、しばしば「G295S」と略称する）に、298位のグリシンがセリン（以下、しばしば「G298S」と略称する）に、311位のメチオニンがバリン（以下、しばしば「M311V」と略称する）に、315位のアラニンがトレオニン（以下、しばしば「A315T」と略称する）に、315位のアラニンがグルタミン酸（以下、しばしば「A315E」と略称する）に、331位のグルタミンがリジン（以下、しばしば「Q331K」と略称する）に、332位のセリンがアスパラギン（以下、しばしば「S332N」と略称する）に、335位のグリシンがアスパラギン酸（以下、しばしば「G335D」と略称する）に、337位のメチオニンがバリン（以下、しばしば「M337V」と略称する）に、343位のグルタミンがアルギニン（以下、しばしば「Q343R」と略称する）に、345位のアスパラギンがリシン（以下、しばしば「N345K」と略称する）に、348位のグリシンがシステイン（以下、しばしば「G348C」と略称する）に、352位のアスパラギンがセリン（以下、しばしば「N352S」と略称する）に、352位のアスパラギンがトレオニン（以下、しばしば「N352T」と略称する）に、357位のグリシンがセリン（以下、しばしば「G357S」と略称する）に、361位のアルギニンがセリン（以下、しばしば「R361S」と略称する）に、363位のプロリンがアラニン（以下、しばしば「P363A」と略称する）に、378位のアスパラギンがアスパラギン酸（以下、しばしば「N378D」と略称する）に、379位のセリンがシステイン（以下、しばしば「S379C」と略称する）に、379位のセリンがプロリン（以下、しばしば「S379P」と略称する）に、382位のアラニンがプロリン（以下、しばしば「A382P」と略称する）に、382位のアラニンがトレオニン（以下、しばしば「A382T」と略称する）に、383位のイソロイシンがバリン（以下、しばしば「I383V」と略称する）に、384位のグリシンがアルギニン（以下、しばしば「G384R」と略称する）に、390位のアスパラギンがアスパラギン酸（以下、しばしば「N390D」と略称する）に、390位のアスパラギンがセリン（以下、しばしば「N390S」と略称する）に、若しくは393位のセリンがロイシン（以下、しばしば「S393L」と略称する）に置換した変異、又は374位のチロシン以降が欠失した変異を有する、（１）又は（２）に記載の認定方法。

（４）前記変異がD169G、G298S又はR361Sである、（３）に記載の認定方法。

（５）前記疾患が神経系疾患である、（１）〜（４）のいずれかに記載の認定方法。

（６）前記神経系疾患が筋萎縮側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病及び前頭側頭葉変性症からなる群から選択される、（５）に記載の認定方法。

（７）細胞内におけるアスパラギン酸、グルタミン酸、ATP又は活性酸素の存在量を低減させる薬剤を製造する方法であって、薬剤候補物質を細胞内に導入する導入工程、前記薬剤候補物質を含む及び含まない細胞におけるそれぞれの前記存在量を測定する測定工程、前記測定工程で得られた2つの細胞の測定値を比較して、前記薬剤候補物質を含む細胞における測定値が統計学的に有意に低い場合に、その薬剤候補物質を目的の薬剤として選択する選択工程を含む、前記方法。

（８）TDP-43結合阻害剤を製造する方法であって、
（ａ）mt-tRNA^Asn、mt-tRNA^Gln、mt-tRNA^Glu及びmt-tRNA^Proからなる群から選択される少なくとも一のmt-tRNA、及び／又は
（ｂ）Aralar1、Aralar2、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（Glutamate DeHydrogenase：以下「GDH」とする）、及びMusashi 2からなる群から選択される少なくとも一のタンパク質
とTDP-43を薬剤候補物質と共に混合する混合工程、前記mt-tRNA及び／又は前記タンパク質と前記TDP-43との結合量を検出する検出工程、前記結合が検出されない場合、又は検出された結合量と前記薬剤候補物質の非存在下における対応するmt-tRNA及び／又はタンパク質とTDP-43との結合量とを比較して両者の値に統計学的に有意な差がある場合に、その薬剤候補物質をTDP-43結合阻害剤として選択する選択工程を含む、前記方法。

（９）前記薬剤候補物質は、前記（ａ）に示すmt-tRNA又は前記（ｂ）に示すタンパク質との間でTDP-43との結合を競合し合う物質である、（８）に記載の製造方法。

（１０）前記薬剤候補物質は、細胞内における活性状態の、前記（ａ）に示すmt-tRNA又は前記（ｂ）に示すタンパク質の存在量を低減させる物質である、（８）に記載の製造方法。

（１１）前記薬剤候補物質が核酸分子、ペプチド、又は低分子化合物である、（９）又は（１０）に記載の製造方法。

（１２）前記薬剤候補物質が
（ａ）配列番号２、４又は５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む100アミノ酸以下のポリペプチド、
（ｂ）配列番号２、４又は５で示されるアミノ酸配列において1〜3アミノ酸の付加、欠失又は置換を含むポリペプチドを含む130アミノ酸以下のポリペプチド、
（ｃ）配列番号２、４又は５で示されるアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は
（ｄ）配列番号２、４又は５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの一部
である、（１１）に記載の製造方法。

（１３）前記薬剤候補物質がTGG若しくはUGG及び／又はGTT若しくはGUUからなる塩基配列を含む5〜50塩基の核酸分子に結合する
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるペプチドの一部、
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において1〜3アミノ酸の付加、欠失又は置換を含むペプチドの一部、又は
（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドの一部、
で構成される9〜20アミノ酸からなるペプチドである、（１１）に記載の製造方法。

（１４）前記TDP-43が配列番号１で示されるアミノ酸配列において開始メチオニンを1位としたときに、A90V、D169G、N267S、G287S、G290A、S292N、G294A、G294V、G295R、G295S、G298S、M311V、A315T、A315E、Q331K、S332N、G335D、M337V、Q343R、N345K、G348C、N352S、N352T、G357S、R361S、P363A、N378D、S379C、S379P、A382P、A382T、I383V、G384R、N390D、N390S、若しくはS393Lの変異、又は374位のチロシン以降が欠失した変異を有する、（７）〜（１１）のいずれかに記載の製造方法。

（１５）前記変異がD169G、G298S又はR361Sである、（１４）に記載の製造方法。

（１６）（７）に記載のアミノ酸、ATP又は活性酸素の細胞内存在量を低減させる薬剤又は（８）〜（１５）のいずれかに記載のTDP-43結合阻害剤がTDP-43の細胞内存在量に関連する疾患治療剤の有効成分である、（７）〜（１５）のいずれかに記載の製造方法。

（１７）前記TDP-43の細胞内存在量に関連する疾患は、被検体由来の細胞内におけるTDP-43の存在量が健常体由来の細胞内におけるその存在量と比較して統計学的に有意に増加する疾患である、（１６）に記載の製造方法。

（１８）前記疾患が神経系疾患である、（１６）又は（１７）に記載の製造方法。

（１９）前記疾患が筋萎縮側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病及び前頭側頭葉変性症からなる群から選択される、（１８）に記載の製造方法。

（２０）TG若しくはUG及び／又はGT若しくはGUからなる塩基配列を2以上含み、mt-tRNA^Asn、mt-tRNA^Gln、mt-tRNA^Glu又はmt-tRNA^ProとTDP-43との結合を阻害する5〜50塩基の核酸分子からなるTDP-43結合阻害剤。

（２１）TGG若しくはUGG及び／又はGTT若しくはGUUからなる塩基配列を2以上含み、6〜50塩基の核酸分子からなる、（２０）に記載のTDP-43結合阻害剤。

（２２）前記塩基配列が連続する繰り返し配列を含む、（２０）又は（２１）に記載のTDP-43結合阻害剤。

（２３）前記繰り返し回数が3〜15回である、（２２）に記載のTDP-43結合阻害剤。

（２４）配列番号４３、４５又は４６で示される塩基配列を含む、（２３）に記載のTDP-43結合阻害剤。

本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2012-042256号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。

本発明の認定方法によれば、被検体がALS及びFTLDをはじめとするTDP-43細胞内存在量に関連する疾患に罹患しているか否かを高い精度で認定することが可能となる。

本発明の製造法によれば、ALS及びFTLDをはじめとするTDP-43細胞内存在量に関連する疾患の治療において有効成分となり得る物質を効率的に選択することが可能となる。

本発明のTDP-43結合阻害剤によれば、TDP-43細胞内存在量に関連する疾患の治療の有効成分として提供し得る。

DAP-TDP-43のプルダウンによって共免疫沈降したRNAを示すウレア変性PAGEの結果である。枠内のバンド1〜3は、DAP-TDP-43と特異的に結合するRNAを示す。右図は、左図の右側2レーンを過剰感光させた図である。ナノLS-MS/MSの結果である。 A：DAP-TDP-43のプルダウンによって共免疫沈降したRNAをウレア変性PAGE後にSYBR Gold染色した結果を示す。B：DAP-TDP-43で共免疫沈降したmt-tRNA^Asn、mt-tRNA^Gln、mt-tRNA^Pro及びmt-tRNA^Gluのノザンブロットの結果を示す。 A：TDP-43-siRNA又はCont（非特異的siRNA）をトランスフェクトしたHeLa細胞におけるTDP-43タンパク質のウエスタンブロットの検出結果である。B：TDP-43-siRNA又はContをトランスフェクトしたHeLa細胞における細胞増殖率である。 TDP-43-siRNA処理による様々なRNAのHeLa細胞内存在量の変動を示す。5.8Sは5.8S rRNAを、U1はU1 snRNAを、Asnはmt-tRNA^Asnを、Glnはmt-tRNA^Glnを、Leuはmt-tRNA^Leu(UUR)を示す。この結果は、少なくとも３回の独立した実験結果に基づく。 A：DAP-TDP-43を過剰発現したときのDAP-TDP-43と内在TDP-43に対するウエスタンブロット解析の結果を示す。B： DAP-TDP-43を過剰発現したときのmt-tRNA^Asn及びmt-tRNA^Gln、及び5.8S rRNAに対するノザンブロット解析の結果を示す。 A：mt-tRNA^Asn又はmt-tRNA^Glnの経時的分解を示す図である。B：DAP-TDP-43との経時的共免疫沈降の結果である。 A：野生型TDP-43及び各ドメイン欠失型TDP-43の構造を示す概念図である。黒棒及び白棒は、TPD-43におけるドメインを表す。棒下の数値は、TDP-43のアミノ酸配列において、開始メチオニンを1位としたときの位置を示す。B：野生型TDP-43及び各ドメイン欠失型TDP-43発現株におけるドキシサイクリン誘導により発現した細胞内の各タンパク質を示すウエスタンブロットの結果である。C：野生型TDP-43及び各ドメイン欠失型TDP-43に結合したmt-tRNA^Asn及びmt-tRNA^Glnを示すノザンブロットの結果である。ドメイン欠失型TDP-43によって誘導される細胞毒性を示す図である。この結果は、すくなくとも３回の独立した実験結果に基づく。 A：実験に使用した野生型TDP-43及び各変異型TDP-43を示した概念図である。図中、アスタリスクは、各変異型TDP-43における変異（点突然変異）の位置を示している。D169Gは、TDP-43のアミノ酸配列169位のDがGに置換した変異、G298Sは、TDP-43のアミノ酸配列298位のGがSに置換した変異、そしてR361Sは、TDP-43のアミノ酸配列361位のRがSに置換した変異である。B：野生型及び各変異型TDP-43発現株における生存率を示す図である。野生型及び各変異型TDP-43をドキシサイクリン誘導により発現した場合の各mt-tRNAの細胞内存在量を示す図である。各値は、ドキシサイクリン無添加時（-dox）を1としたときの発現誘導時(+dox)の相対値で示している。 DAP-TDP-43のプルダウンによって共免疫沈降した新規TDP-43結合タンパク質を示すウエスタンブロットの結果である。 A：aralar 1及びaralar 2の相互交換免疫沈降の結果を示す。B：aralar 1又はaralar 2と共免疫沈降するmt-tRNA^Asnの結果を示す。 Musashi2のプルダウンによって共免疫沈降したmt-tRNA間を示すノザンブロットの結果である。 aralar 1又はaralar 2とドメイン欠失型TDP-43の結合を示す図である。 A:TDP-43をTDP-43-siRNAにより発現抑制したときの、細胞あたりのATP存在量を示す図である。B:DAP-TDP-43をドキシサイクリン誘導により過剰発現したときの、細胞あたりのATP存在量を示す図である。各ドメイン欠失型TDP-43発現時におけるmt-tRNA^Asn、mt-tRNA^Gln及びtRNA^Leuの細胞内存在量を示した図である。各値は、ドキシサイクリン無添加時（-dox）を1としたときの発現誘導時(+dox)の相対値で示している。各ドメイン欠失型TDP-43発現時におけるATPの測定結果である。 ALS様変異型TDP-43（D169G、G298S、R361S）を有する発現誘導型細胞系における、前記変異型TDP-43誘導後のATPの細胞内存在量を示す図である。 TDP-43に結合する4種のmt-tRNAの配列をアラインメントした図である。図中の星印は、4種のmt-tRNAの全てで保存された塩基を示す。また、各mt-tRNAが高次構造を形成したときのDループ、アンチコドンループ、可変領域、Tループ及び受容アームに相当する塩基を配列下部に示す。 TDP-43に結合するmt-tRNA^Asnの二次構造を示す。図中の星印が付された塩基は図１９で示したTDP-43に結合する4種のmt-tRNAの全てで保存された塩基である。図中の矢印は、実施例１３（２）の競合アッセイで用いたTDP-43結合阻害剤候補オリゴヌクレオチド（D-loop、Anticodon、T-loop）に対応するmt-tRNAの分断部位を示す。なお、この図は、mt-tRNAをDNAで表していることから、UをTに置換している。 TDP-43結合阻害剤候補オリゴヌクレオチドによる、TDP-43とmt-tRNAとの結合阻害を示す図である。A：Flag-IPによってDAP-TDP-43と共免疫沈降した核酸を示すウレア変性PAGEの結果である。図中に示すmt-tRNAは、TDP-43に結合する4種のmt-tRNAを示す。B：競合反応においてDAP-TDP-43と共免疫沈降したmt-tRNA^Asnのノザンブロットの結果を示す。繰り返し配列を有する様々なTDP-43結合阻害剤候補オリゴヌクレオチドによる、TDP-43とmt-tRNAの結合阻害を示す図である。A：Flag-IPによってDAP-TDP-43と共免疫沈降したオリゴヌクレオチドを示すウレア変性PAGEの結果である。図中のmt-tRNAは、TDP-43に結合する4種のmt-tRNAに示す。B：競合反応においてDAP-TDP-43と共免疫沈降したmt-tRNA^Asnのノザンブロットの結果を示す。 (TG)₁₂を各濃度で加えたときのTDP-43とmt-tRNAの結合阻害を示す図である。A：Flag-IPによってDAP-TDP-43と共免疫沈降したmt-tRNAを示すウレア変性PAGEの結果である。B：競合反応においてDAP-TDP-43と共免疫沈降したmt-tRNA^Asnのノザンブロットの結果を示す。C：Bの結果をグラフ化した図である。細胞内のTDP-43と活性酸素量との経時的関係を示す図である。

１．TDP-43細胞内存在量関連疾患の認定方法
１−１．概要
本発明の第１の態様は、TDP-43細胞内存在量関連疾患の認定方法である。本態様の方法は、被検体より採取された細胞における、測定物質の存在量、又は測定物質とTDP-43との結合量等を測定することによって、該被検体がTDP-43細胞内存在量関連疾患に罹患しているか否かを認定することを特徴とする。

１−２．対象疾患
本発明の対象疾患は、「TDP-43細胞内存在量関連疾患」である。ここで、「TAR DNA結合タンパク質-43 (TDP-43:TAR DNA-binding Protein 43kDa)」とは、ヘテロ核内リボ核酸タンパク（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein：hnRNP）の一種である。TDP-43は分子内に2つのRNA結合ドメインを有し、細胞内で核質と細胞質の間を行き来できるタンパク質である。本明細書において、TDP-43は、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるヒト野生型TDP-43の他、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、1個又は数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を含むアミノ酸配列からなるヒト変異型TDP-43、及び配列番号１で示されるアミノ酸配列と85％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつヒト野生型TDP-43と同等の機能を有するヒト変異型TDP-43若しくは他生物種のTDP-43オルソログを包含する。なお、本明細書において「数個」とは、2〜10の整数、例えば、2〜7、2〜5、2〜4、2〜3の整数をいう。また、本明細書において「同一性」とは、2つのアミノ酸配列間において、アミノ酸の一致数が最大となるように必要に応じて一方又は双方にギャップを導入してアラインメントさせたときの一方のアミノ酸配列（ここでは配列番号１で示されるアミノ酸配列）の全アミノ酸数に対する他方のアミノ酸配列の前記一致したアミノ酸数の割合（％）をいう。

前記配列番号１で示されるアミノ酸配列において、1個又は数個のアミノ酸の置換、又は欠失を含むアミノ酸配列からなるヒト変異型TDP-43の具体例としては、例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列において開始メチオニンを1位としたとき（以下、本明細書において同様とする）に、90位のアラニンがバリン（A90V）に、169位のアスパラギン酸がグリシン（D169G）に、267位のアスパラギンがセリン（N267S）に、287位のグリシンがセリン（G287S）に、290位のグリシンがアラニン（G290A）に、292位のセリンがアスパラギン（S292N）に、294位のグリシンがアラニン（G294A）に、294位のグリシンがバリン（G294V）に、295位のグリシンがアルギニン（G295R）に、295位のグリシンがセリン（G295S）に、298位のグリシンがセリン（G298S）に、311位のメチオニンがバリン（M311V）に、315位のアラニンがトレオニン（A315T）に、315位のアラニンがグルタミン酸（A315E）に、331位のグルタミンがリジン（Q331K）に、332位のセリンがアスパラギン（S332N）に、335位のグリシンがアスパラギン酸（G335D）に、337位のメチオニンがバリン（M337V）に、343位のグルタミンがアルギニン（Q343R）に、345位のアスパラグンがリシン（N345K）に、348位のグリシンがシステイン（G348C）に、352位のアスパラギンがセリン（N352S）に、352位のアスパラギンがトレオニン（N352T）に、357位のグリシンがセリン（G357S）に、361位のアルギニンがセリン（R361S）に、363位のプロリンがアラニン（P363A）に、378位のアスパラギンがアスパラギン酸（N378D）に、379位のセリンがシステイン（S379C）に、379位のセリンがプロリン（S379P）に、382位のアラニンがプロリン（A382P）に、382位のアラニンがトレオニン（A382T）に、383位のイソロイシンがバリン（I383V）に、384位のグリシンがアルギニン（G384R）に、390位のアスパラギンがアスパラギン酸（N390D）に、390位のアスパラギンがセリン（N390S）に、若しくは393位のセリンがロイシン（S393L）に、それぞれ置換した変異、又は374位のチロシン以降が欠失した変異を有するヒト変異型TDP-43が挙げられる。好ましくはD169G、G298S、又はR361Sの変異を有するヒト変異型TDP-43である。

本明細書において「TDP-43細胞内存在量関連疾患」とは、細胞あたりのTDP-43の存在量が健常体のそれと比較して統計学的に有意に増加又は減少することが知られている疾患をいう。TDP-43は、健常体の細胞内においては、1細胞あたりの存在量が極めて厳格に制御されている（Ayala, Y.M., et al., 2011, EMBO J. 30(2):277-288.）。したがって、その細胞内存在量が通常範囲を逸脱して変動した場合、その個体は、身体に何らかの変調をきたすこととなる。TDP-43細胞内存在量関連疾患は、TDP-43の細胞内存在量が通常範囲を逸脱した疾患であれば、疾患の種類を問わない。また、TDP-43の細胞内存在量の変動と疾患との関連性が未解明である疾患であってもよい。好ましくは細胞あたりの前記TDP-43の存在量が健常体のそれと比較して、統計学的に有意に増加することが知られている疾患である。

本明細書において「健常体」とは、少なくともTDP-43細胞内存在量関連疾患に罹患していない動物個体、好ましくはいずれの疾患にも罹患していない健康な動物個体をいう。健常体は、原則として、後述する被検体と同種であり、好ましくは被検体との生体的条件が近い個体、例えば、亜種（人種、品種を含む）、性別、年齢（月齢、週齢を含む）、体重、体質（アレルギー等）、既往歴が同じか、又は近い条件の個体をいう。

本明細書において「統計学的に有意」とは、被検体由来の細胞、及びそれと同等数の健常体由来の細胞中に存在するTDP-43の量的差異を統計学的に処理したときに、両者間に有意差があることをいう。具体的には、例えば、危険率（有意水準）が5％、1％又は0.1％より小さい場合が挙げられる。統計学的処理の検定方法は、有意性の有無を判断可能な公知の検定方法を適宜使用すればよく、特に限定しない。例えば、スチューデントｔ検定法、多重比較検定法を用いることができる。

TDP-43細胞内存在量関連疾患の具体例として、TDP-43の存在量が健常体のそれと比較して統計学的に有意に増加することが知られている疾患の多くは、神経系疾患である。それ故、神経系疾患は、本発明の対象疾患として好適である。そのような神経疾患としては、例えば、ALS、FTLD、アルツハイマー病（AD：Alzheimer disease）、又はパーキンソン病（PD：Parkinson disease）が挙げられる。ALS又はFTLDは、本発明の対象疾患として好ましい。

１−３．認定方法
本発明のTDP-43細胞内存在量関連疾患の認定方法は、測定工程及び認定工程を含む。以下、各工程について具体的に説明をする。

（１）測定工程
本態様において「測定工程」とは、被検体由来の細胞内における測定物質の細胞内存在量又はTDP-43との結合量を測定する工程である。

本明細書において「被検体」とは、検査に供される個体、すなわち、後述する細胞を提供する動物個体を指す。ここでいう動物とは、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。

本明細書において「被検体由来の細胞」とは、被検体から採取された細胞をいう。いずれの器官又は組織由来の細胞であるかは特に限定はしない。脳神経系細胞、脳脊髄液細胞、又は血液細胞等は、本発明において好適に用いることができる。又は、被検体から採取した皮膚等の細胞を基に作製した人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell; iPS細胞）から分化誘導させた神経細胞（運動ニューロン）等も、本発明において好適に用いることができる。これらの細胞は、公知の採取方法で採取されたものであればよい。あるいは、被検体由来の細胞を培養によって増殖させたものでもよい。例えば、血液細胞を採取する場合、末梢部の静脈等に注射をして末梢血を採取することによって得ることができる。また、脳脊髄液細胞であれば、公知の腰椎穿刺によって脳髄液を採取することによって得ることができる。前記細胞は、被検体から採取した後に直ちに使用してもよいし、冷凍又は冷蔵により一定期間保存した後、必要に応じて解凍等の処理を行ない使用してもよい。本工程において使用する細胞の量は、少なくとも2×10⁶個、好ましくは少なくとも1×10⁶個、より好ましくは少なくとも5×10⁵個あれば、後述する測定物質を十分に検出にすることができる。

本態様において「測定物質」とは、本工程において測定すべき物質であって、具体的には、
（i）4種のmt-tRNA、すなわちmt-tRNA^Asn、mt-tRNA^Gln、mt-tRNA^Glu及びmt-tRNA^Pro、
（ii）グルタミン酸（Glu）及びアスパラギン酸（Asp）、
（iii）ATP又は活性酸素、又は
（iv）Aralar 1、Aralar 2、GDH及びMusashi 2
が該当する。

本測定工程において、測定すべき値は、
（ａ）前記（i）に示すmt-tRNA群から選択される少なくとも一のmt-tRNAの細胞内存在量、
（ｂ）前記（ii）に示すいずれか一方又は両方のアミノ酸の細胞内存在量、好ましくはアミノ酸濃度、
（ｃ）前記（iii）に示すATP又は活性酸素の細胞内存在量、好ましくはATP濃度又は活性酸素濃度、
（ｄ）前記（iv）に示すポリペプチド群から選択される少なくとも一のポリペプチドとTDP-43との結合量、又は
（ｅ）前記（i）に示すmt-tRNA群から選択される少なくとも一のmt-tRNAとTDP-43との結合量である。

本明細書において「（細胞内）存在量」とは、細胞中に含まれる測定物質の分量をいう。存在量は、濃度、蛍光強度、イオン強度又は放射線強度のような相対量であってもよいし、容量のような所定細胞数あたりの測定物質の絶対量であってもよい。

本明細書において「TDP-43との結合量」とは、所定量のTDP-43と直接的又は間接的に結合する測定物質の相対量又は絶対量をいう。したがって、「測定物質の、細胞内存在量又はTDP-43との結合量を測定する」とは、測定物質の、細胞内存在量又はTDP-43との結合量を定量することである。

前記（ｄ）に示す測定物質の結合量において、Aralar 1及びAralar 2については、より具体的にはTDP-43におけるGRドメイン及び／又は315ドメインとの結合量である。また、前記（ｅ）に示す測定物質の結合量は、より具体的には前記（i）に示すmt-tRNA群から選択される少なくとも一のmt-tRNAとTDP-43におけるRRM1（RNA Recognition Motif-1）ドメインとの結合量である。前記（ａ）〜（ｅ）は、いずれか1つを測定すれば足りるが、二以上を測定してもよい。二以上を測定することにより、測定誤差等による誤認定をなくし、より高い認定の精度を確保することが可能となる。

なお、健常体においては、1細胞あたりの前記（ａ）〜（ｅ）に示す測定物質の存在量又は結合量が所定量の10％の範囲を超えないように極めて厳格に制御されている。本発明者らは、上記（ａ）〜（ｅ）に示す測定物質の存在量又は結合量の変動がTDP-43細胞内存在量関連疾患と密接な関連性を有することを解明した。したがって、（ａ）〜（ｅ）に示す存在量又は結合量を測定することによって、TDP-43細胞内存在量関連疾患の罹患の有無を認定することができる。

本工程における具体的な測定方法は、前記（ａ）〜（ｅ）に示す測定物質のいずれを測定するかによって異なる。

（ａ）に示すmt-tRNAの細胞内存在量を測定する方法は、RNAを検出する当該分野で公知の方法であれば特に制限はしない。例えば、標的mt-tRNAの全部又は一部の塩基配列に相補的な塩基配列を有し、標的mt-tRNAを特異的に検出可能な核酸プローブを用いた検出方法、又は定量RT-PCR法等が利用できる。核酸プローブを用いた検出方法には、例えば、ノザンブロット法、表面プラズモン共鳴（SPR:Surface Plasmon Resonance）法又は水晶振動子マイクロバランス（QCM：Quarts Crystal Microbalance）法が挙げられる。上記方法は、いずれも当該分野で公知の技術であり、本発明においても公知の方法に準じて行えばよい。具体的には、例えば、Sambrook， J．et． al．， (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Third Ed．，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New Yorkや、森泉豊榮，中本高道，(1997) センサ工学，昭晃堂；稲田利文,塩見春彦,2008,羊土社, RNA実験ノートに記載の方法を参照すればよい。より正確な測定結果を得るために上記二以上の方法を組み合わせて使用してもよい。

また、（ｂ）に示すアミノ酸の存在量、及び（ｃ）に示すATP又は活性酸素の存在量を測定する方法は、例えば、質量分析法、NMR法、又はルシフェラーゼ発色法、を利用することができる。質量分析法は、高速液体クロマトグラフ質量分析法（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry法；以下「LC-MS」と略記する）、高速液体クロマトグラフタンデム質量分析法（以下「LC-MS/MS」と略記する）、ガスクロマトグラフ質量分析法（Gas Chromatography-Mass Spectrometry）、ガスクロマトグラフタンデム質量分析法（GC-MS/MS）、キャピラリー電気泳動質量分析法（CE-MS）及びICP質量分析法（IPC-MS）を含む。これらの分析方法は、いずれも当該分野で公知の技術であって、それらの方法に準じて行えばよい。例えば、Iijima et al., The Plant Journal (2008)54,949-962、Hirai et al. Proc Natl Acad Sci USA (2004) 101(27) 10205-10210、Sato et al., The Plant Journal (2004) 40(1)151-163、又はShimizu et al., Proteomics (2005) 5,3919-3931を参照にすればよい。好ましい測定方法は、LC-MS又はLC-MS/MSである。

さらに、（ｄ）に示すポリペプチドとTDP-43との結合量を測定する方法は、タンパク質間相互作用を検出する当該分野で公知の方法であれば特に制限はしない。例えば、各ポリペプチドを特異的に認識する抗体、すなわち、抗Aralar 1抗体、抗Aralar 2抗体、抗GDH抗体又は抗Musashi 2抗体、及び抗TDP-43抗体を用いた免疫学的検出法が挙げられる。本明細書で各ポリペプチドを特異的に認識する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体のいずれであってもよい。組換え抗体は、キメラ抗体及び合成抗体を含む。また、ここでいう「合成抗体」とは、化学的方法又は組換えDNA法を用いることによって合成した抗体をいう。例えば、一本鎖Fv（scFv ：single chain Fragment oｆ variable region）、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）又はテトラボディ(tetrabody)等が挙げられる。免疫学的検出法には、例えば、共免疫沈降法、ファーウェスタンブロッティング法、ELISA（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）法、酵素抗体法、放射免疫測定法が含まれる。これらの方法は、いずれも当該分野で公知の方法であり、本発明においても、原則として公知の方法に準じて行えばよい。具体的には、例えば、Sambrook， J．et． al．， (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Third Ed．，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New Yorkに記載の方法を参照すればよい。

そして、（ｅ）に示すmt-tRNAとTDP-43との結合量を測定する方法は、RNAとタンパク質間の相互作用を検出する当該分野で公知の方法であれば特に制限はしない。例えば、各標的mt-tRNAの全部又は一部の塩基配列に相補的な塩基配列を有し、各標的mt-tRNAを特異的に検出可能な核酸プローブ及び抗TDP-43抗体を用いた免疫学的核酸検出法が挙げられる。具体的には、例えば、共免疫沈降法、ファーウェスタンブロッティング法、ノーザンブロッティング法、ELISA法、RT-PCR法が含まれる。

（２）認定工程
本態様において「認定工程」とは、前記測定工程で得られた測定値を健常体由来の細胞内における対応する測定値と比較して、両者の値に統計学的に有意な差がある場合には、その被検体が前記疾患に罹患していると認定する認定工程である。

「健常体由来の細胞内における対応する測定値」とは、前記測定工程で得られた被検体由来の細胞内における前記（ａ）〜（ｅ）の測定値に対応する健常体由来の細胞内における前記（ａ）〜（ｅ）の測定値をいう。例えば、前記測定工程で被検体由来の細胞内における所定のmt-tRNAの存在量を測定した場合には、健常体由来の細胞内における当該所定のmt-tRNAの存在量の測定値が健常体由来の細胞内における対応する測定値となる。

前記健常体由来の細胞内における対応する測定値は、被検体由来の細胞内における測定物質の測定と同一方法及び同一条件で測定した値である。したがって、前記測定工程において、被検体由来の細胞内における測定物質の測定と共に、健常体由来の細胞内における対応する測定物質の測定を同方法及び同条件で行ってもよい。また、様々な生体的条件の健常体で（ａ）〜（ｅ）の測定値を予め測定した上でデータベース化しておき、被検体由来の細胞内における測定物質を測定する際に、当該データベース上で被検体と生体的条件の最も近い健常体のデータを呼び出し、そのデータ上の測定物質の測定方法及び測定条件で、被検体由来の細胞内における測定物質を測定することもできる。この場合、比較対象となる健常体由来の試料がなくてもTDP-43細胞内存在量関連疾患の罹患の有無を認定できるので便利である。

前記統計学的に有意な差は、細胞内における被検体由来の測定物質の存在量又は結合量が健常体由来の対応するそれよりも多くてもよいし、少なくてもよい。前記測定物質は、通常、所定の範囲内となるように調節されていることから、その範囲から逸脱した場合には、その多少にかかわらずTDP-43細胞内存在量関連疾患と関連し得るからである。

したがって、例えば、（ａ）に示すmt-tRNAの存在量が健常体由来の細胞よりも被検体由来の細胞において有意に多い又は少ない場合には、その被検体はTDP-43細胞内存在量関連疾患に罹患している可能性が高いと認定する。同様に、（ｂ）に示すアミノ酸の存在量、又は（ｃ）に示すATP若しくは活性酸素の存在量が健常体由来の細胞よりも被検体由来の細胞において有意に多い又は少ない場合には、その被検体はTDP-43細胞内存在量関連疾患に罹患している可能性があると認定する。さらに、（ｄ）に示すポリペプチドとTDP-43との結合量、又は（ｅ）に示すmt-tRNAとTDP-43との結合量が健常体由来の細胞よりも被検体由来の細胞において有意に多い又は少ない場合には、その被検体はTDP-43細胞内存在量関連疾患に罹患している可能性が高いと認定する。より具体的には、例えば、ALSに類似の症状又は徴候の見られる被検体由来の細胞において、（ａ）に示すmt-tRNAの存在量が健常体由来の細胞よりも有意に多い場合、（ｂ）に示すアミノ酸の存在量、若しくは（ｃ）に示すATP又は活性酸素の存在量が健常体由来の細胞よりも有意に多い場合、又は（ｄ）に示すポリペプチドとTDP-43との結合量若しくは（ｅ）に示すmt-tRNAとTDP-43との結合量が健常体由来の細胞よりも有意に多い場合、その被検体はALSに罹患している可能性が高いと認定する。被検体と健常体において二種以上の測定物質の測定値を比較することで、単一の測定物質を測定したときよりも擬陽性率及び偽陰性率が低い、より精度の高い認定を行うことができる。

被検体と健常体のそれぞれの対応する測定値を比較する場合には、測定に供した両者の細胞量を比較補正するために、細胞内における量的差異がないことが期待される公知のタンパク質や核酸を内部コントロールとして用いてもよい。このような内部コントロール用のタンパク質としては、例えばグリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素（GAPDH：glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase）、β-アクチン、アルブミンが、また内部コントロール用の核酸としては、5S rRNA、5.8S rRNA、U1 snRNA等が挙げられる。このような内部コントロールを用いることで、被検体と健常体の定量結果の補正が可能となることから、より正確な測定値を得ることができる。

１−４．効果
本発明のTDP-43細胞内存在量関連疾患の認定方法によれば、従来困難であったALSをはじめとするTDP-43細胞内存在量関連疾患を、発症前又は発症早期に正確に認定することができる。

また、本発明のTDP-43細胞内存在量関連疾患の認定方法を同一のTDP-43細胞内存在量関連疾患患者に対して経時的に行うことにより、その患者における当該疾患の改善若しくは悪化の推移をモニターすることができる。

２．薬剤製造方法
２−１．概要
本発明の第２の態様は、細胞内における測定物質の存在量を低減させる薬剤の製造方法である。本製造方法によって、TDP-43細胞内存在量関連疾患の治療剤における有効成分となり得る薬剤を得ることができる。

２−２．製造方法
本態様の製造方法は、導入工程、測定工程、選択工程を含む。以下、各工程について具体的に説明する。

（１）導入工程
本態様において「導入工程」とは、薬剤候補物質を細胞内に導入する工程である。

本態様において「薬剤候補物質」とは、本発明の製造方法において細胞内における後述する測定物質の存在量を低減させる薬剤となり得る候補物質をいう。当該物質の種類は、前記低減効果を有する薬剤の候補となり得る物質であれば特に制限はしない。例えば、ペプチド、オリゴヌクレオチド又は低分子化合物等が、薬剤候補物質として挙げられる。ペプチドの具体例としては、RNAアーゼ、ATPアーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、GDH等の酵素が挙げられる。

本態様における「測定物質」は、前記第１態様における測定物質の一部、すなわち
（i）2種のアミノ酸、すなわち、グルタミン酸（Glu）及びアスパラギン酸（Asp）、
（ii）ATP又は活性酸素
又は、
（iii）4種のmt-tRNA、すなわち、mt-tRNA^Asn、mt-tRNA^Gln、mt-tRNA^Glu及びmt-tRNA^Pro
が該当する。

本態様において使用する「細胞」は、動物由来の細胞、好ましくは脊椎動物由来、より好ましくは哺乳動物由来、一層好ましくはヒト由来の細胞、特に、治療対象となるTDP-43細胞内存在量関連疾患患者由来の細胞である。いずれの器官又は組織由来の細胞であるかは問わない。本発明の製造方法で製造する薬剤は、前述のようにTDP-43細胞内存在量関連疾患の治療剤の有効成分となり得ることから、本態様で使用する細胞は、標的とするTDP-43細胞内存在量関連疾患の発症部位の器官又は組織由来の細胞（iPS細胞も含む）、又はTDP-43を過剰に発現させた培養細胞であれば好ましい。細胞は、培養細胞であることが望ましい。初代培養細胞、継代培養細胞、又は株化細胞のいずれであってもよい。

細胞に導入する薬剤候補物質の分量は、使用する薬剤候補物質の種類に応じて適宜定めればよい。なお、本態様における薬剤候補物質の効果は、測定物質の細胞内存在量を低減させるだけで足り、完全に除去する必要はない。これは、後述するように、本態様の測定物質がいずれも個体生存において必須の物質であることから、細胞内からの完全除去は、細胞、ひいては個体に対して重篤な副作用を及ぼし得るからである。

薬剤候補物質を細胞内に導入する方法は、当該分野で公知の方法を用いればよい。例えば、核酸分子やペプチドを細胞内に導入する場合、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション、ウイルス感染法、リポフェクション法、細胞膜透過性ペプチドを用いる方法等の周知の方法を用いることができる。また、Lipofectamin2000（Invitrogen社）のような市販の核酸導入剤を使用してもよい。低分子化合物を細胞内に導入する場合、通常は、培地に添加すれば足りる。

（２）測定工程
本態様における「測定工程」は、前記第１態様における測定工程とは異なり、前記薬剤候補物質を含む及び含まない細胞内におけるそれぞれの測定物質の存在量を測定する工程をいう。測定方法については、前記第１態様に記載の方法と同様に行えばよい。

「薬剤候補物質を含む及び含まない細胞」は、薬剤候補物質の含有条件以外は、同一条件、すなわち、由来個体、由来組織、培養条件（培地組成（薬剤候補物質の有無を除く）、培養時間、培養温度等を含む）が同一であることが望ましい。

（３）選択工程
本態様において「選択工程」とは、薬剤候補物質を含む及び含まない細胞における前記測定工程で得られた測定値、すなわち、測定物質の存在量を比較して、前記薬剤候補物質を含む細胞における測定値が薬剤候補物質を含まない細胞における測定値よりも統計学的に有意に低い場合には、その薬剤候補物質を目的の薬剤として選択する工程である。測定値の差異は、有意性があれば特に問わない。得られた薬剤の薬効の差異は、製剤時に1投与剤あたりに含有させる当該薬剤の量を適宜増減させればよいからである。

２−３．効果
本発明の細胞内における測定物質の存在量を低減させる薬剤の製造方法によれば、これまで知られていなかったTDP-43細胞内存在量関連疾患の治療剤における有効成分となり得る薬剤を得ることができる。

３．TAR DNA結合タンパク質-43結合阻害剤製造方法
３−１．概要
本発明の第３の態様は、TDP-43結合阻害剤を製造する方法である。本態様の製造方法は、薬剤候補物質の添加によって、測定物質とTDP-43との結合を有意に低減することのできる薬剤を製造することを特徴とする。

３−２．製造方法
本態様の製造方法は、混合工程、検出工程、選択工程を含む。以下、各工程について具体的に説明する。

（１）混合工程
本態様において「混合工程」とは、測定物質とTDP-43を薬剤候補物質と共に混合する工程をいう。

本態様における「測定物質」とは、前記第１態様における測定物質とは異なり、以下の少なくとも一の物質が該当する。
（i）4種のmt-tRNA、すなわちmt-tRNA^Asn、mt-tRNA^Gln、mt-tRNA^Glu及びmt-tRNA^Pro
（ii）4種のタンパク質、すなわちAralar1、Aralar2、GDH、及びMusashi 2

（Ａ）薬剤候補物質
本態様において「薬剤候補物質」とは、前記測定物質とTDP-43との結合を有意に低減することのできる薬剤、すなわち、TDP-43結合阻害剤の候補物質をいう。

上記薬剤候補物質の例として、核酸分子、ペプチド、又は低分子化合物が挙げられる。

（Ａ−１）核酸分子
薬剤候補物質としての核酸分子には、変異型mt-tRNA、結合領域核酸断片、RNAi機能核酸、核酸アプタマー、リボザイム、アンチセンス核酸、U1アダプターが該当する。

本態様において「変異型mt-tRNA」とは、mt-tRNA^Asn、mt-tRNA^Gln、mt-tRNA^Glu及びmt-tRNA^Proからなる群より選択される野生型mt-tRNAの変異型であって、TDP-43との結合活性は保持しながらも、変異により本来の機能を喪失したmt-tRNA（loss of function mt-tRNA）をいう。前記変異は、前記野生型mt-tRNAからの1又は数個のヌクレオチドの欠失、置換及び／又は付加を含む。

本態様において「結合領域核酸断片」とは、前記測定物質のmt-tRNAにおける塩基配列の一部であって、TDP-43と直接結合する活性領域を含むmt-tRNAの部分断片をいう。前記変異型mt-tRNAの部分断片も包含する。前記TDP-43と直接結合するmt-tRNAの部分断片としては、例えば、TDP-43のRRM1と結合する4種のmt-tRNA（mt-tRNA^Asn、mt-tRNA^Gln、mt-tRNA^Glu及びmt-tRNA^Pro）の共通領域が挙げられる。具体的には、Dステム＆ループ内のGUU、及びTステム＆ループ内のUGGのコンセンサス配列である。したがって、GTT若しくはGUU及び／又はTGG若しくはUGGからなる塩基配列を含むmt-tRNAの部分断片又はそのDNA断片は、TDP-43のRRM1との結合を巡って前記4種のmt-tRNAと競合し得ることから、薬剤候補物質となり得る。このようなmt-tRNAの部分断片の塩基長は5〜50塩基、好ましくは5〜30塩基あればよい。

本態様において「RNAi機能核酸」とは、生体内においてRNA干渉（RNAi：RNA inteference）を誘導し、標的とする遺伝子の転写産物の分解を介してその遺伝子の発現を抑制（サイレンシング）することができる物質をいう。例えば、siRNA（small interfering RNA）、shRNA（short hairpin RNA）又はmiRNA（micro RNA）が挙げられる。なお、RNAiについては、例えば、Bass B.L., 2000, Cell, 101, 235-238；Sharp P.A., 2001, Genes Dev., 15 ,485-490；Zamore P.D., 2002, Science, 296, 1265-1269；Dernburg ,A.F. & Karpen, G.H., 2002, Cell, 111,159-162）を参照されたい。本態様において、RNAi機能核酸の標的となり得る転写産物をコードする遺伝子には、例えば、mt-tRNA^Asn、mt-tRNA^Gln、mt-tRNA^Glu、mt-tRNA^Pro、Aralar1、Aralar2、GDH、及びMusashi 2の各遺伝子が挙げられる。これらの標的に対するRNAi機能核酸の設計は、当該分野で公知の技術を用いて行えばよい。一具体例を挙げると、siRNAを設計する場合であれば、例えば、まず、Aralar1遺伝子の塩基配列から、当該Aralar1遺伝子に特異的な塩基配列であって、15塩基以上35塩基以下、好ましくは15塩基以上30塩基以下、より好ましくは18塩基以上25塩基以下の連続した塩基配列領域をsiRNAのセンス鎖の塩基配列として選択する。続いて、アンチセンス鎖の塩基配列は、選択した前記RNAセンス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列とする。また、siRNAの調製に際しては、センス鎖、アンチセンス鎖共に選択領域内のT（チミン）塩基をU（ウラシル）塩基に変換する。さらに、選択したRNAセンス鎖領域内のGC（グアニン‐シトシン）含有量は、好ましくは20〜80％、より好ましくは30〜70％、一層好ましくは40〜60％である。なお、選択した領域のRNAセンス鎖及びRNAアンチセンス鎖の3’末端側にTT（チミン‐チミン）又はUU（ウラシル‐ウラシル）、好ましくはTTを付加することが好ましい。

本態様において「核酸アプタマー」とは、自身の立体構造によって標的物質（ここでは測定物質又はTDP-43）と特異的に結合する能力を有するリガンド核酸をいう。核酸アプタマーは、その種類により、DNAアプタマー、RNAアプタマー、及びそれらの混合アプタマーが知られているが、本態様では、いずれのアプタマーであってもよい。アプタマーに関しては、例えば、Janasena, Clin. Chem., 1999, 45:1628-1650、を参照されたい。

本態様において「リボザイム」とは、リボ酵素とも呼ばれる触媒活性を有するRNA分子である。基質であり、標的物質（測定物質）でもある本態様の前記（ｉ）に示す4種のmt-tRNA分子のいずれかに特異的に結合し、その標的RNA分子を切断又は連結したり、酸化や還元等の化学反応を触媒したりする機能を有する。

本態様において「アンチセンス核酸」とは、測定物質がタンパク質である場合、そのタンパク質遺伝子の転写産物を標的とするアンチセンス核酸である。ここで言う核酸は、DNA又はRNAのみならず、例えば、PNAやLNAのような核酸類似体も含む。

本態様において「U1アダプター」とは、約25塩基からなる二機能性のオリゴヌクレオチドであって、標的遺伝子のｍRNA前駆体における3'末エクソンに相補的な5'側の「標的ドメイン」とU1 snRNAの5’領域に相補的な配列を有する3'側の「U1ドメイン」を含む（Goraczniak R., et al., 2009, Nat Biotechnol., Vol 27, p257-263,）。U1アダプターを導入するとU1 snRNAを含むU1核内低分子リボ核蛋白質(U1 snRNP)が標的遺伝子のｍRNA前駆体のポリAシグナル周辺に結合し、該mRNAのポリアデニル化を特異的に阻害する。その結果、標的遺伝子のｍRNA前駆体は不安定化し、その後、核内で分解されることによって、遺伝子のサイレンシングが生じる。したがって、Aralar1、Aralar2、GDH及びMusashi 2からなる群から選択される少なくとも一以上の当該タンパク質の遺伝子を標的としたU1アダプターを設計すればよい。

（Ａ−２）ペプチド
薬剤候補物質としてのペプチドには、変異型タンパク質、結合領域ペプチド断片、抗体、ペプチドアプタマー、酵素等が該当する。ペプチドは、オリゴペプチド又はポリペプチドのいずれであってもよい。ペプチドのサイズは、TDP-43結合阻害剤として機能し得る限りにおいて、特に限定はしない。通常は、20アミノ酸以下、好ましくは15アミノ酸以下、より好ましくは10アミノ酸以下である。また、ペプチドは、修飾されていてもよい。ペプチドの修飾には、機能上の修飾又は標識上の修飾を含む。機能上の修飾には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ホルミル化、アミド化、リン酸化、メチル化、環状化又はPEG化が挙げられる。標識上の修飾には、蛍光色素（フルオレセイン、FITC、ローダミン、テキサスレッド、Cy3、Cy5、）、蛍光タンパク質（例えば、PE、APC、GFP、）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ）、放射性同位元素（例えば、³H、¹⁴C、³⁵S）又はビオチン若しくは（ストレプト）アビジンによる標識が挙げられる。

本態様において「変異型タンパク質」とは、Aralar1、Aralar2、GDH、Musashi 2及びTDP-43からなる群より選択される野生型タンパク質の変異型であって、Aralar1、Aralar2、GDH又はMusashi 2についてはTDP-43との結合活性を、また、TDP-43についてはAralar1、Aralar2、GDH、Musashi 2からなる群より選択される一のタンパク質、又はmt-tRNA^Asn、mt-tRNA^Gln、mt-tRNA^Glu若しくはmt-tRNA^Proからなる群より選択されるmt-tRNAとの結合活性を保持しながらも、変異により本来の機能を喪失したタンパク質（loss of function型タンパク質）、あるいは変異により本来の機能を昂進又は新たな機能を付与されたタンパク質（gain of function型タンパク質）をいう。前記変異は、前記野生型タンパク質からの1又は数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を含む。

本態様において「結合領域ペプチド断片」とはTDP-43又は本態様の前記（ii）で示す測定物質のタンパク質におけるアミノ酸配列の一部であって、TDP-43又は本態様の前記（ii）で示す測定物質のタンパク質と直接結合する活性領域を含む当該タンパク質の部分断片をいう。前記変異型タンパク質の部分断片も包含する。例えば、結合領域ペプチド断片がTDP-43の結合領域ペプチド断片の場合、以下の（ａ）〜（ｄ）に記載のペプチドが該当する。

（ａ）配列番号２、４又は５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む100アミノ酸以下、好ましくは80アミノ酸以下のポリペプチド、
（ｂ）配列番号２、４又は５で示されるアミノ酸配列において1〜3アミノ酸、好ましくは1又は2アミノ酸の付加、欠失又は置換を含むポリペプチドを含む130アミノ酸以下、好ましくは100アミノ酸以下、より好ましくは80アミノ酸以下のポリペプチド、
（ｃ）配列番号２、４又は５で示されるアミノ酸配列と90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは97％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２、４又は５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの一部
ここで、配列番号２は、配列番号１で示されるヒトTDP-43において、105位〜169位に位置するRRM1ドメインに相当する。また、配列番号４は、配列番号１で示されるヒトTDP-43において、274位〜314位に位置するGRドメインに相当する。そして、配列番号５は、配列番号１で示されるヒトTDP-43において、315位〜414位に位置する315ドメインに相当する。なお、配列番号３は、配列番号１で示されるヒトTDP-43において、193位〜257位に位置するRRM2（RNA Recognition Motif-2）ドメインに相当する。

本発明者らの研究結果から、TDP-43のRRM1は、前記測定物質であるmt-tRNA^Asn、mt-tRNA^Gln、mt-tRNA^Glu及びmt-tRNA^Proと結合する領域であり、GRドメインと315ドメインは、Aralar1及びAralar2と結合する領域であることが判明している。したがって、TDP-43のRRM1ドメインを含むペプチド断片又はその断片のアミノ酸配列と90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上の同一性を有するペプチドは前記4種のmt-tRNAとの結合を巡ってTDP-43と競合し得ることから、薬剤候補物質となり得る。このようなペプチド断片は5〜60アミノ酸、好ましくは9〜20アミノ酸あればよい。

本態様において「抗体」は、中和抗体として機能するものであって、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、抗体フラグメントを含む。

抗体がポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の場合、免疫グロブリン分子は、任意のクラス（例えば、IgG、IgE、IgM、IgA、IgD及びIgY）、又は任意のサブクラス（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2）であってもよい。

「組換え抗体」とは、キメラ抗体、ヒト化抗体、合成抗体又は多重特異性抗体をいう。

「キメラ抗体」とは、異なる動物由来の抗体のアミノ酸配列を組み合わせて作製される抗体で、ある抗体の定常領域（C領域）を他の抗体のC領域で置換した抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体のC領域をヒト抗体のC領域と置き換えた抗体が該当する。これによりヒト体内における当該抗体に対する免疫反応を軽減し得る。

「ヒト化抗体」とは、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体のV領域における相補性決定領域（CDR）とヒト抗体のCDRとを置換したモザイク抗体である。

「合成抗体」とは、化学的に又は組換えDNA法を用いることによって合成した抗体をいう。例えば、組換えDNA法を用いて新たに合成された抗体が挙げられる。具体的には、例えば、単鎖抗体（scFv：single chain Fragment of variable region）、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）又はテトラボディ（tetrabody）等が挙げられる。

「多重特異性抗体」とは、多価抗体、すなわち抗原結合部位を一分子内に複数有する抗体において、それぞれの抗原結合部位が異なるエピトープと結合する抗体をいう。例えば、IgGのように2つの抗原結合部位を有する抗体で、それぞれの抗原結合部位が異なるエピトープと結合する二重特異性抗体（Bispecific抗体）が挙げられる。

「抗体フラグメント」とは、例えば、Fab、F(ab’）₂、Fv等が該当する。

前記抗体は、いずれも当該分野で公知の方法を用いて製造すればよい。

本態様において「ペプチドアプタマー」とは、前記核酸アプタマーと同様に、自身の立体構造によって標的物質（ここでは測定物質又はTDP-43）と特異的に結合する能力を有するペプチドをいう。

本態様における「酵素」は、RNAアーゼ、好ましくはmt-tRNA^Asn、mt-tRNA^Gln、mt-tRNA^Glu及びmt-tRNA^Proをそれぞれ特異的に認識して分解することのできるRNAアーゼ、及び、プロテアーゼ、好ましくはAralar1、Aralar2、GDH及びMusashi 2をそれぞれ特異的に認識して分解することのできるプロテアーゼをいう。

（Ａ−３）低分子化合物
本明細書において「低分子化合物」とは、分子量5000以下、好ましくは2000以下、より好ましくは1000以下の化合物であって、前記核酸及びペプチド以外の物質が該当する。例えば、ホルモン（例えば、ステロイドホルモン）、神経伝達物質（例えば、アドレナリン、エピネフリン、ノルアドレナリン、ドーパミン）、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、及び免疫抑制剤等の様々な医薬化合物が挙げられる。また、特定の低分子化合物と同等の薬理活性を有する低分子化合物の誘導体、又はその塩も含む。

（Ｂ）薬剤候補物質の具体例
薬剤候補物質には、例えば、競合物質又は間接的結合阻害物質が挙げられる。

（Ｂ−1）競合物質
本態様において「競合物質」とは、TDP-43との結合を測定物質と競合することによって、又は測定物質との結合をTDP-43と競合することによって、測定物質とTDP-43との結合を阻害する物質をいう。本態様においては、当該競合物質として、例えば、TDP-43がmt-tRNA等の測定物質を取り込み、凝集化することで、細胞内において本来機能すべき場所から隔離された場合に沈着している場合等において、その凝集を解離し得る物質も含むものとする。

測定物質と競合する競合物質としては、変異型mt-tRNA、結合領域核酸断片、核酸アプタマー、変異型タンパク質、結合領域ペプチド断片、又は低分子化合物が薬剤候補物質として好ましく利用できる。また、TDP-43と競合する競合物質としては、変異型タンパク質、結合領域ペプチド断片、又は低分子化合物が好ましく利用できる。また、前述のように、TDP-43のRRM1と結合する4種のmt-tRNAの共通領域、具体的にはDステム＆ループ内のGUU、及びTステム＆ループ内のUGGのコンセンサス配列又はその一部を含む核酸分子、あるいは4種のmt-tRNAが結合するTDP-43上のRRM1を含むペプチド、又はAralar1及びAralar2が結合するGRドメインと315ドメインを含むペプチドも好ましく利用できる。

（Ｂ−２）間接的結合阻害物質
本態様において「間接的結合阻害物質」とは、細胞内における測定物質の絶対存在量又は活性化測定物質の存在量を低減させることによって測定物質とTDP-43との結合を二次的に阻害する物質をいう。

細胞内における測定物質の絶対存在量を低減させる間接的結合阻害物質としては、RNAi機能核酸、リボザイム、アンチセンス核酸、U1アダプター、酵素、又は低分子化合物が好ましく利用できる。また、細胞内における活性化測定物質の存在量を低減させる間接的結合阻害物質としては、変異型mt-tRNA、結合領域核酸断片、核酸アプタマー、変異型タンパク質、結合領域ペプチド断片、抗体、又はペプチドアプタマーが好ましく利用できる。

（Ｃ）方法
混合工程は、培養細胞等を用いたインビボ、又はインビトロのいずれで行ってもよい。

本工程をインビボで行う場合、本態様において使用する「細胞」は、動物由来の細胞、好ましくは脊椎動物由来、より好ましくは哺乳動物由来、一層好ましくはヒト由来の細胞、特に、治療対象となるTDP-43細胞内存在量関連疾患患者由来の細胞である。細胞は、培養細胞であることが望ましい。より好ましくはTDP-43が過剰発現した培養細胞（iPS細胞も含む）である。初代培養細胞、継代培養細胞、又は株化細胞のいずれであってもよい。

細胞に導入する薬剤候補物質の分量及び薬剤候補物質を細胞内に導入する方法は、前記第２態様に準じて行えばよい。

TDP-43や測定物質は、内在性のものを用いてもよいが、外来のTDP-43や測定物質を細胞内に薬剤候補物質と共に又は別個に導入してもよい。TDP-43及び測定物質は、当該物質そのものを細胞に導入してもよいし、それらをコードする核酸を細胞に導入し、形質転換した細胞内で発現させてもよい。導入後の細胞は、適当な時間、適当な温度及びCO₂濃度条件下で数日培養する。細胞の培養方法は、当該分野で公知の方法で行えばよい。

なお、インビボで本工程を行った場合には、検出工程前に薬剤候補物質等を導入した細胞を溶解し、前記TDP-43と前記mt-tRNA及び／又はタンパク質との結合によって形成された複合体を含む細胞抽出液を調製しておく必要がある。細胞抽出液の方法は、溶解バッファ等を用いた公知の細胞抽出液の調製方法を用いればよい。

本工程をインビトロで行う場合、TDP-43、測定物質、薬剤候補物質のそれぞれを、タンパク質−タンパク質相互作用又はタンパク質−核酸相互作用が可能な当該分野で公知の方法に基づいて混合すればよい。例えば、Sambrook， J．et． al．， (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Third Ed．，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New Yorkに記載の方法を参照すればよい。また、TDP-43、測定物質、薬剤候補物質のいずれかを固相担体に固定しておいてもよい。それによって、次の検出工程での複合体の検出が容易になるので便利である。固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ラテックス、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるビーズ、マイクロプレート、試験管、スティック又は試験片等の形状の不溶性担体を用いることができる。固定化は、固相担体にTDP-43、測定物質、薬剤候補物質のいずれかを物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法に従って直接結合させる、あるいは、抗TDP-43抗体等の抗体を固相担体に固定化しておき、抗原であるTDP-43を抗原抗体反応によって固相担体に間接的に結合させる方法もある。

（２）検出工程
本態様において「検出工程」とは、前記TDP-43と前記mt-tRNA及び／又はタンパク質との結合を検出する工程である。本工程では、前記結合が検出された場合、その結合量を定量しておくことが望ましい。

検出工程は、基本的には、前記第１態様に記載の測定工程と同様の技術を用いて達成することができる。TDP-43と前記mt-tRNAの結合を検出する場合には、タンパク質−核酸複合体を検出する当該分野で公知の方法を用いればよい。例えば、抗TDP-43抗体を用いた免疫沈降法によって、複合体を含むTDP-43を回収後、複合体からTDP-43を、フェノール等の変性剤又はプロテアーゼによって除去し、残った核酸分子を標的mt-tRNA特異的に検出可能な核酸プローブを用いて、ノザンブロット法により検出するか、定量RT-PCR法で検出すればよい。また、TDP-43と前記タンパク質との結合を検出する場合も、標的タンパク質−タンパク質複合体を検出する当該分野で公知の方法を用いればよい。例えば、抗TDP-43抗体を用いた共免疫沈降法によって、複合体を含むTDP-43を回収後、標的タンパク質特異的な抗体を用いて、ウエスタンブロット法により検出すればよい。具体例を挙げて説明すると、例えば、細胞由来の総RNA、mt-tRNA^Asn又はmt-tRNA^Glnを調製し、これに大腸菌等で合成し精製したタグ融合TDP-43をin vitroで混合し、タグ（例えば、DAPタグ、FLAGタグ、ヒスチジンタグ、HAタグ、GFPタグ、以下同じ）に対する抗体又は結合物質を固相担体で回収後、タグ融合TDP-43に結合したmt-tRNA^Asn及びmt-tRNA^Glnをウレア変性アクリルアミドゲルによる分離し、SYBR GOLD等による染色で検出、定量する。より高感度な検出法を必要とする場合は、ノザンブロット法で検出、定量する。また、精製したmt-tRNA^Asn又はmt-tRNA^Glnを用いる場合には、これらを蛍光試薬若しくはその他の発色試薬、酵素又はビオチン等で標識し、固定化タグ融合TDP-43に結合するこれらの分子を蛍光又は発色強度等によって定量することができる。逆に、精製したmt-tRNA^Asn又はmt-tRNA^Glnを固定化し、これに蛍光試薬若しくはその他の発色試薬又は酵素を融合したTDP-43の結合を、蛍光又は発色強度を測定することで定量することができる。この場合、mt-tRNA^Asn、mt-tRNA^Gln又はTDP-43の全長の分子を用いる代わりに、それぞれの分子の結合配列を含むRNA断片又はペプチド断片を用いてもよい。より具体的な相互作用検出の一例として、trigger factor (TG)-GST融合TDP-43を大腸菌で合成し、グルタチオン固定化担体を用いた親和性クロマトグラフィー法で精製した後、これを細胞から抽出した総RNAと混合し、ノザンブロット法で検出する方法が挙げられる。

さらに、タグ融合TDP-43を発現する細胞株を調製し、発現したタグ融合TDP-43をタグに対する抗体（例えば抗FLAG抗体等）又は結合物質（例えば、ストレプトアビジン、アビジン等）を固定化した固相担体で回収し、タグ融合TDP-43に結合するmt-tRNA^Asn及び／又はmt-tRNA^Glnを抽出した後に、ウレア変性アクリルアミドゲルによる分離後のSYBR GOLD染色、又はノザンブロット法により検出、定量することができる。タグ融合TDP-43を回収する際に、ペプチド、核酸、化合物を共存させることで、細胞中のタグ融合TDP-43と結合するmt-tRNA^Asn及び／又はmt-tRNA^Glnの量的変化を検出し、定量することができる。

あるいは、TDP-43を予め固相担体に固定して、測定物質を流通し、TDP-43と測定物質との複合体を形成させておき、そこに薬剤候補物質を含む溶液を流通させて、測定物質と薬剤候補物質との間で競合させ、表面プラズモン共鳴法やELISA法により解離した複合体量を算出することで結合量を定量することもできる。

（３）選択工程
本態様において「選択工程」とは、第２態様の「選択工程」とは異なり、検出工程においてTDP-43と測定物質であるmt-tRNA及び／又はタンパク質との結合が検出されない場合、又は検出された結合量と薬剤候補物質の非存在下におけるTAR DNA結合タンパク質-43とmt-tRNA及び／又はタンパク質の結合量とを比較して、両者の値に統計学的に有意な差がある場合に、その薬剤候補物質をTAR DNA結合タンパク質-43結合阻害剤として選択する工程である。

前記検出工程において、「TDP-43と測定物質であるmt-tRNA及び／又はタンパク質との結合が検出されない場合」とは、薬剤候補物質がTDP-43と測定物質であるmt-tRNA及び／又はタンパク質との結合を完全に阻害したことを意味する。この場合、その薬剤候補物質は、強力なTDP-43結合阻害剤となり得ることから目的のTDP-43結合阻害剤として選択する。ただし、このようなTDP-43結合阻害剤は、個体生存において必須のTDP-43と測定物質の相互作用をもブロックしてしまう可能性があるため、細胞、ひいては個体に対して重篤な副作用を及ぼし得る。それ故、使用に当たっては、一過性の効果の薬剤であること、かつ有効な薬効のみを享受し得る分量を予め最適化しておくことが必要である。ただし、機能獲得型変異TDP-43と測定物質との結合を特異的に完全に阻害する薬剤候補物質はTDP-43結合阻害剤として最も好ましい。

また、前記検出工程において、「検出された結合量と薬剤候補物質の非存在下における対応するmt-tRNA及び／又はタンパク質とTDP-43との結合量とを比較して、両者の値に統計学的に有意な差がある場合」とは、TDP-43と測定物質が同一で薬剤候補物質の添加の有無のみが異なる条件下で、それぞれTDP-43と測定物質との結合量とを比較したときに両者の値に統計学的に有意な差があることであり、これは、すなわち、薬剤候補物質がTDP-43と測定物質との結合を部分的に阻害したことを意味する。このような部分阻害をする薬剤候補物質は、TDP-43結合阻害剤として好ましいことから目的のTDP-43結合阻害剤として選択する。

なお、薬剤候補物質の非存在下におけるmt-tRNA及び／又はタンパク質とTDP-43との結合は、薬剤候補物質の存在下におけるmt-tRNA及び／又はタンパク質とTDP-43との結合検出と薬剤候補物質の有無以外は、全て同一方法及び同一条件で行う。したがって、前記検出工程において、薬剤候補物質の存在下におけるmt-tRNA及び／又はタンパク質とTDP-43との結合検出と共に行ってもよい。また、薬剤候補物質の非存在下におけるmt-tRNA及び／又はタンパク質とTDP-43との結合量を予め定量した上でデータベース化しておき、それと同一方法及び同一条件で、薬剤候補物質のみを新たに添加したときの結合量を定了するようにしてもよい。

本態様の製造方法によって得られるTDP-43結合阻害剤は、TDP-43細胞内存在量関連疾患治療剤の有効成分となり得る。

なお、前記第２態様の測定物質の存在量を低減させる薬剤又は本態様のTDP-43結合阻害剤によるTDP-43の過剰発現で生じる細胞毒性の抑制効果については、これらの薬剤処理による細胞増殖率の変化を確認すればよい。薬剤未処理の細胞と比較して、細胞増殖率が統計学的に有意に増加する場合には、その薬剤は細胞毒性の抑制効果があると判断することができる。なお、細胞増殖率は、顕微鏡下で直接細胞数を計数して算出するか、ブロモウリジン量を測定する等、当該分野で公知の各種方法を用いることができる。また、細胞増殖率に代えてATP量又は活性酸素量を測定してもよい。この場合、TDP-43発現量の増加によって増加した細胞内のATP量又は活性酸素量を指標とし、薬剤処理の細胞内のATP量又は活性酸素量が統計学的に有意に減少した場合には、その薬剤は細胞毒性の抑制効果があると判断することができる。さらに、細胞内のmt-tRNA^Asn及びmt-tRNA^Gln量の増加を前記薬剤処理によって減少できた場合には、その薬剤は細胞毒性の抑制効果があると判断することができる。

４．TAR DNA結合タンパク質-43結合阻害剤
４−１．概要
本発明の第４の態様は、TDP-43結合阻害剤である。本発明のTDP-43結合阻害剤によれば、TDP-43細胞内存在量関連疾患治療剤の有効成分となり得る。

４−２．構成
本態様のTDP-43結合阻害剤は、TDP-43と4種のmt-tRNA（mt-tRNA^Asn、mt-tRNA^Gln、mt-tRNA^Glu及びmt-tRNA^Pro）との結合を阻害する核酸分子からなる競合物質である。

本明細書において「核酸分子」とは、原則として、ヌクレオチドを構成単位とし、それらがホスホジエステル結合によって連結した生体高分子をいう。したがって、通常は、アデニン、グアニン、シトシン及びチミンのいずれかの塩基を有するデオキシリボヌクレオチドが連結したDNA及び／又はアデニン、グアニン、シトシン及びウラシルのいずれかの塩基を有するリボヌクレオチドが連結したRNAのような、自然界に存在する天然型ヌクレオチドが連結してなる天然型核酸が該当する。その他にも、本発明の核酸分子は、非天然型ヌクレオチド又は非天然型核酸も含むことができる。

本明細書において、「非天然型ヌクレオチド」とは、自然界に存在しないヌクレオチドである。例えば、人工的に構築又は化学修飾され、前記天然型ヌクレオチドに類似の性質及び／又は構造を有するヌクレオシドをいう。

本明細書において、「非天然型核酸」とは、天然型核酸に類似の構造及び／又は性質を有する人工的に構築された核酸類似体をいう。例えば、ペプチド核酸（PNA：Peptide Nucleic Acid）、ホスフェート基を有するペプチド核酸（PHONA）、架橋化核酸（BNA/LNA：Bridged Nucleic Acid/Locked Nucleic Acid）、モルホリノ核酸等が挙げられる。メチルホスホネート型DNA/RNA、ホスホロチオエート型DNA/RNA、ホスホルアミデート型DNA/RNA、2'-O-メチル型DNA/RNA等の化学修飾核酸や核酸類似体が挙げられる。

TDP-43と4種のmt-tRNA（mt-tRNA^Asn、mt-tRNA^Gln、mt-tRNA^Glu及びmt-tRNA^Pro）との結合を阻害する核酸分子は、TDP-43との結合領域に相当する前記4種のコンセンサス配列の一部を含む。具体的には、TG若しくはUG及び／又はGT若しくはGUからなる塩基配列、例えば、TGG若しくはUGG及び／又はGTT若しくはGUUからなる塩基配列である。本発明の核酸分子は、このような塩基配列を2以上含む。好ましくは3以上、より好ましくは5以上、さらに好ましくは6以上、7以上、8以上、9以上、10以上である。一核酸分子内には同一の前記塩基配列(例えば、TGのみ、GTのみ)が含まれていてもよいし、前記塩基配列の組み合わせ(例えば、TGとGT)が含まれていてもよい。それぞれの塩基配列は、不連続であってもよいし連続する繰り返し配列であってもよい。繰り返し配列の場合、繰り返し回数は、例えば、3〜20回、好ましくは4〜18回、より好ましくは5〜15回である。核酸分子の塩基長は、5〜50塩基、好ましくは10〜40塩基、より好ましくは15〜30塩基である。上記核酸分子の具体例として、Tステム＆ループに含まれるコンセンサス配列UUGの一部であるUGの12回繰り返し配列に相当する配列番号４３で示されるDNAオリゴヌクレオチド(TG)₁₂、Tステム＆ループに含まれるコンセンサス配列UGGの8回繰り返し配列からなる配列番号４５で示されるDNAオリゴヌクレオチド(TGG)₈及びDステム＆ループに含まれるコンセンサス配列TTGの7回繰り返し配列からなる配列番号４６で示されるDNAオリゴヌクレオチドTT(GTT)₇Gが挙げられる。

＜実施例１：TDP-43に結合するRNAの確認＞
（目的）
TDP-43に結合するRNAを確認する。

（方法）
（１）DAPタグ付TDP-43発現ベクターの調製
DAP（doubly affinity-purification）タグは、6×Hisタグ、ビオチン化タグ及びFlagタグが、アミノ末端側からこの順番で直列に連結したタグである。DAPタグ付きTDP-43（DAP-TDP-43）発現ベクターを構築するために、まず、Flagタグ融合TDP-43の遺伝子断片を、pEGFP-TDP-43(Arai et al., Biochem Biophys Res Commun, 2006, 351:602-611）を鋳型として、KOD-Plus DNAポリメラーゼ（TOYOBO）を用いてPCRによって調製した。プライマーには、配列番号６及び７で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた。PCR産物をpcDNA5/FRT/TO（lifetechnologies）ベクター内のKpnI/XhoI部位に挿入してクローン化した。6×Hisとビオチン化配列をコードするcDNAは、Hayanoら（Interaction Analysis. J. Proteome Res., 2008, 7: 4183-4190）の方法に基づき、pcDNA3.1(+)-bioを鋳型にしてPCR増幅によって調製した。プライマーには、配列番号８及び９で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた。得られたベクターは、DAP-TDP-43 pcDNA5/FRT/TOとした。

（２）ドキシサイクリン誘導型細胞系の構築
ドキシサイクリン誘導によりDAP-TDP-43を発現する細胞系を調製するために、Flp-In-T-REx Expression System（lifetechnologies）を用いた。Flp-In-T-REx 293細胞（293 TRex細胞）を24ウェルプレートで、10％の非動化したウシ血清（Biowest LLC）、0.1mg/mLのストレプトマイシン（Wako Pure Chemicals）及び100U/mLのペニシリンG（Wako Pure Chemicals）を添加したDMEM培地（Sigma-Aldrich）を用いて、37℃、5％CO₂下で培養した。約80％コンフルエントで、細胞に0.25μgのpOG44（lifetechnologies）と0.25μgのDAP-TDP-43 pcDNA5/FRT/TOを2μLのリポフェクタミン2000でトランスフェクトした。48時間後に、細胞を200μg/mLのハイグロマイシンB（lifetechnologies）を含む培地で、TDP-43の単一クローンが共通するゲノム部位に挿入された株（DAP-TDP-43発現株）を選択した。

DAP-TDP-43の発現を誘導するために、100ng/mLのドキシサイクリンを加え、24時間培養した。

（３）細胞抽出液の調製
細胞抽出液の調製は、Izumikawaら（Biochem J., 2008, 413(3):505-516）の方法に従った。すなわち、細胞をPBSでリンスした後、2mM リボヌクレオシド-バナジル複合体、1mM PMSF、2μg/mL アプロチニン、2μg/mL ペプスタチンA及び2μg/mL リューペプチンを含む細胞塊5倍量の溶解バッファ（50mM Tris/HCl (pH7.4)、150mM NaCl、0.5％（w/v） IgepalCA-630）で30分間、氷中にて懸濁した。20000gで30分間4℃にて遠心し、上清を細胞抽出液として回収した。細胞抽出液中のタンパク質濃度は、Protein Assay(Bio-Rad)によって測定した。

（４）免疫沈降とRNA回収
Flagタグを含むDAP-TDP-43を免疫沈降するために、2×10⁷細胞の細胞抽出液から6mgのタンパク質画分を調製し、15μLのANTI-Flag-M2 アフィニティーゲル(Sigma-Aldrich)を加えて、4℃で2時間インキュベートした。DAP-TDP-43が結合した前記アフィニティーゲルを1mLの前記溶解バッファで5回洗浄し、150μLのタンパク質-RNA抽出バッファ（7M ウレア、350mM NaCl、1％ SDS、10mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM EDTA、2％ 2-メルカプトエタノール）を用いて、4℃で5分間溶出した。溶出したタンパク質と共免疫沈降したRNAを1000gで4℃にて5分間遠心することによってゲルから分離し、その後、フェノール-クロロホルム抽出を行い、タンパク質とRNAを分離した。タンパク質は、フェノール-クロロホルム抽出後の有機層に3倍量のイソプロパノールを混合し、20000gで4℃にて10分間遠心することで沈殿させ、75％エタノールで直ちに一度洗浄し、乾燥させた。RNAは、水層からイソプロパノール沈殿によって回収した。

（５）ウレア変性PAGE
細胞抽出液から回収したRNAの分離は、基本的にSambrook， J．ら (Molecular Cloning: A Laboratory Manual Third Ed．，2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)の方法に従った。抗Flag抗体固定化ビーズによるプルダウン法で得たRNAをホルムアミドに溶解し、65℃で10分間熱処理して変性させた後、氷上で急冷した。電気泳動前に最終濃度80％ホルムアミド、10mMのEDTA（pH8.0）、1/16量の10x Loading buffer (TaKaRa)となるようにRNAを調整した後、8Mウレアと0.5×TBEバッファを含む8％ポリアクリルアミドゲルでRNAを分離した。泳動後、ゲルをSYBR Gold（lifetechnologies）で5分間染色し、TDP-43に特異的に結合するバンドを切り出した。

（６）ゲル内消化
RNAのゲル内消化については、基本的にTaokaら（Anal. Chem., 2010, 82(18):7795-7803）の方法に従った。切り出したゲル断片を小片に切断し、真空下で乾燥させた。その後、15μLの2μg/μLのRNase T1又はRNaseAを用いて、37℃で1時間処理した。核酸断片は、100μLのRNアーゼフリー水に溶解した後、ポリビニリデンフルオライドフィルターを有する遠心フィルターチューブ（Ultrafree-MC, Millipore）に通して、ゲルから抽出し、5μLの2M 酢酸トリエチルアンモニウム（pH7.0）を加えた。

（７）ナノLC-MS/MS分析
LC-MS/MS分析は、基本的にはNatsumeら（2002, Anal. Chem., 74, 4725-4733）が開示するナノフローポンプからなるLCシステム（LC Assist, Japan）を使用した。カラムは、融解シリカキャピラリー(150μm i.d. × 375μm o.d.)を用いて、レーザープラー(Sutter Instruments Co., CA)により調製し、逆相スラリー(Develosil C30-UG-3, 粒径 3μm； Nomura Chemical, Japan)を50 mm長で充填した。

（A）液体クロマトグラフィー（LC）条件
・使用機器： RENCON-P (エルシーアシスト)
・溶離液A： 10 mM トリエチルアミン酢酸（Glen Research）
・溶離液B: メタノール(和光純薬)
・カラム： Develosil C30-UG-3, 150 μm x 50 mmL, 粒径3μm（野村化学）
・トラップカラム Monocap for Trap, 200 μm x 45 μm （GLサイエンス）
・カラム温度：25℃
・流速：100 nL/min
・時間連続濃度勾配（タイムスケジュールグラジュエント）0 min:10%B〜40分：40％B
（B)MS条件
・使用機器：LTQ Orbitap XL（サーモサイエンティフィック）
・Mass range: 500-1950 Da
・スキャンモード：FT normal
・イオン化方法：ESI-negative
・スキャン速度：normal
・解析ソフトウェア：Excalibur Qual Browser
（C）MSMS条件
・使用機器：同上
・Mass range: normal
・スキャンモード：normal
・スキャン速度：Enhanced
・解析ソフトウェア：Excalibur Qual Browser

ゲル内消化したRNAから得られたスペクトルをクエリーとしてミトコンドリアゲノムを含むヒトゲノムデータベースを、検索エンジンAriadneを用いて解析した(Taoka, et al., 2010, Anal. Chem. 82(18): 7795-7803; Nakayama, et al., 2009, Nucleic Acids Res. 37: e47)。

（結果）
図１及び２に示す。図１は、PAGEの結果である。黒枠内の約70ヌクレオチドの3つのバンド（矢印で示すバンド１〜３）がDAP-TDP-43に特異的なRNAである。図２は、バンド1のナノLC-MS/MSクロマトグラムである。collision-induced dissociation-MS/MS analysisにおいてゲル内消化したRNA断片から生じた一連のプロダクトイオンを示している。プロダクトイオンは、多量のc/yとa/wのイオンを微量の派生物（hydrated or dehydrated ions及びそれらのヌクレオチドの塩基を失ったイオン）を含んでいた。

Ariadne解析の結果から各バンドは以下のように同定された。
バンド1: mt-tRNA^Asn遺伝子、mt-tRNA^Gln遺伝子及びmt-tRNA^Asn遺伝子と完全に同一の染色体1上の配列
バンド2: mt-tRNA^Glu及びmt-tRNA^Pro遺伝子
バンド3: mt-tRNA^Pro遺伝子

したがって、TDP-43には、4種類のmt-tRNA（mt-tRNA^Asn、 mt-tRNA^Gln、mt-tRNA^Glu及びmt-tRNA^Pro）が結合することが確認された。

＜実施例２：TDP-43に結合するmt-tRNAのノザンブロット法による確認＞
（目的）
実施例１の結果をノザンブロット法によって確認する。

（方法）
実施例１の「（４）免疫沈降と回収」で得られたRNAを8Mウレアと0.5×TBEバッファを含む8％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した後、Trans-blot SD Cell（Bio-Rad）を用いてナイロンメンブレン（Hybond-N+：Bio-Rad）に5V、60分間の条件で転写した。RNAとメンブレンをUVで架橋した後、ビオチン化プローブを用いてプレ・ハイブリダイゼーション溶液（0.6M NaCl、120mM Tris-HCl (pH8.0)、4.8mM EDTA、0.1% SDS、1×Denhardt’s Solution)中で42℃にて一晩ハイブリダイズした。メンブレンを洗浄溶液（90 mM Tris-HCl (pH8.0), 0.45 M NaCl, 3.6 mM EDTA, 0.1 % SDS)を用いて25℃で30分間の洗浄を3回行い、Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module kit (Thermo Fisher Scientific)を用いて添付の説明書に従ってRNAを検出した。検出に用いた各オリゴヌクレオチドプローブは、それぞれのmt-tRNA等に特異的な塩基配列に対して相補的な以下の配列を有する。すなわち、mt-tRNA^Asnプローブは、mt-tRNA^Asn遺伝子の塩基配列7〜34位に相補的な配列（配列番号１０）を、mt-tRNA^Glnプローブは、mt-tRNA^Gln遺伝子の塩基配列の36〜65位（配列番号１１）を、mt-tRNA^Proプローブは、mt-tRNA^Pro遺伝子の塩基配列の28〜57位（配列番号１２）を、mt-tRNA^Gluプローブは、mt-tRNA^Glu遺伝子の塩基配列の33〜62位（配列番号１３）を、以下、コントロールとしてのmt-tRNA^Leu(UUR)プローブは、mt-tRNA^Leu(UUR) 遺伝子の塩基配列の1〜30位（配列番号１４）を、tRNA^Met プローブは、tRNA^Met遺伝子の塩基配列の46〜72位（配列番号１５）を有する。各プローブは、3’末端をBiotin 3′ End DNA Labeling kit (Thermo Fisher Scientific)を用いて標識化した。各RNAバンドのシグナル強度は、LAS4000イメージアナライザーとMultiGauge software (Fujifilm)を用いて定量した。各値は、少なくとも独立した3回の実験を平均したものである(±1SD)。

（結果）
結果を図３に示す。mt-tRNA^Asn及びmt-tRNA^Glnは、実施例１の「（４）免疫沈降と回収」で得られたDAP-TDP-43と共免疫沈降したRNAから、単一バンドで検出することができた（A、B）。これに対して、コントロールとしての、他のmt-tRNAであるmt-tRNA^Leu(UUR)や細胞質-tRNAであるtRNA^Metは検出できなかった（A）。また、mt-tRNA^Pro及びmt-tRNA^Gluについても、DAP-TDP-43と共免疫沈降したRNAから検出することができた（B）。以上から、mt-tRNA^Asn、mt-tRNA^Gln、mt-tRNA^Pro及びmt-tRNA^Gluは、TDP-43と結合することが立証された。

＜実施例３：TDP-43とmt-tRNAの結合における生理学的機能＞
（目的）
TDP-43とmt-tRNAの結合における生理学的機能を明らかにする。

（a）TDP-43 siRNAによるTDP-43の細胞存在量の抑制
（方法）
TDP-43に対するsmall interference RNA (TDP-43 siRNA)を用いてTDP-43の発現を抑制した場合の前記mt-tRNAの存在量を検証した。

TDP-43 siRNAとして、配列番号１６と配列番号１７で示されるオリゴヌクレオチドからなるsiRNAを構築した。また、TDP-43 siRNAのネガティブコントロールとして、配列番号１８と配列番号１９で示されるオリゴヌクレオチドからなるsiRNA（以下、本実施例において「Cont」とする）を構築した（stealth RNA: lifetechnologies）。次にHeLa細胞を35mmペトリディッシュで培養し、約70％のコンフルエントで、細胞にTDP-43を標的とする50pmolのsiRNAを2.5μLのリポフェクタミン2000を用いて、添付の説明書に従ってトランスフェクトした。

トランスフェクトして0、24、48、72及び96時間後に培養液の一部を回収し、細胞増殖アッセイを行った。細胞増殖アッセイは、Burker-Turk chamber (Hirschmann; Laborgerate Hilgenberg)で視覚的に細胞数をカウントすることによって算出した。

また、前記24、48、72及び96時間後に、前記実施例１の「（３）細胞抽出液の調製」に記載の方法と同様の方法により細胞抽出液を調製した。siRNAによる標的遺伝子の発現抑制を確認するために、前記細胞抽出液中におけるTDP-43のタンパク質量をウエスタンブロット解析により検出した。内部コントロールには、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase：以下「GAPDH」とする）を用いた。TDP-43の発現抑制確認には抗-TDP-43抗体を用い、GAPDHの検出には抗-GAPDH抗体(ambion)を使用した。

さらに、TDP-43発現抑制時の細胞中の全RNAを得る方法として、PBSで洗浄した細胞をRNAgent Denaturing Solution (Promega)で溶解し、酸性フェノールクロロホルム抽出法によりRNAを含む水層を分離し、イソプロパノール沈殿によりRNAを回収し、75％エタノールにより洗浄した。これを細胞の全RNAとして、前記実施例１の「（５）ウレア変性PAGE」に記載の方法と同様の方法により共免疫沈降−ノザンブロット解析を行った。

検出に用いた各オリゴヌクレオチドプローブは、前記実施例２に記載のプローブの他、U1 snRNAプローブ（U1 snRNA遺伝子の塩基配列の1〜24位（配列番号２０））及び5.8S rRNAプローブ（5.8S rRNA遺伝子の塩基配列の123〜146位（配列番号２１））を使用した。

(結果)
図４及び図５に結果を示す。図４Aは、TDP-43-siRNA又はContをトランスフェクトしたHeLa細胞におけるTDP-43のタンパク質量の検出結果である。TDP-43-siRNAをトランスフェクトしたときには、Contと比較してトランスフェクト24時間後以降でTDP-43タンパク質の発現量が90％程度減少した。この結果からTDP-43-siRNAによるTDP-43の発現抑制が確認された。また、図４Bは、TDP-43-siRNA又はContをトランスフェクトしたHeLa細胞における細胞増殖率である。この図では、トランスフェクト時の細胞数を1としたときの相対値を示している。この図によればTDP-43-siRNA処理をしたHeLa細胞では、Contに対して明らかに増殖が抑制された。この結果から、TDP-43-siRNA発現の抑制は、細胞増殖を抑制することが証明された。

図５は、TDP-43-siRNA処理による様々なRNAのHeLa細胞内存在量の変動を示す図である。図中、5.8S、U1、Asn、Gln、Leuは、それぞれ5.8S rRNA、U1 snRNA、mt-tRNA^Asn、mt-tRNA^Gln、mt-tRNA^Leu(UUR)を示す。TDP-43-siRNAをトランスフェクトしたHeLa細胞は、ContをトランスフェクトしたHeLa細胞と比較して、mt-tRNA^Asn、mt-tRNA^Glnの存在量が有意（それぞれp＜0.01、p＜0.05）に減少した。一方、5.8S RNA、U1 snRNA及びmt-tRNA^Leuでは、そのような減少効果を検出できなかった。

（ｂ）ドキシサイクリンによるDAP-TDP-43の過剰発現
（方法）
実施例１の「（２）ドキシサイクリン誘導型細胞系の構築」で調製したDAP-TDP-43発現株に100ng/mLのドキシサイクリンを添加し、DAP-TDP-43を細胞内で過剰発現させた。ドキシサイクリンを添加して0、8、24、48時間後に培養液の一部を回収し、前記実施例１の「（３）細胞抽出液の調製」に記載の方法と同様の方法により細胞抽出液を調製した後、ウエスタンブロット解析を行った。また、前記実施例１の「（４）免疫沈降とRNA回収」及び「（５）ウレア変性PAGE」に記載の方法と同様の方法により全RNAを抽出し、ノザンブロット解析を行った。検出に用いたオリゴヌクレオチドプローブには、前記プローブを利用した。内部コントロールには、ウエスタンブロット解析ではGADPHを、又ノザンブロット解析では5.8S rRNAを用いた。

（結果）
図６に結果を示す。Aは、DAP-TDP-43を過剰発現したときのDAP-TDP-43と内在TDP-43に対するウエスタンブロット解析の結果を示す。また、Bは、TDP-43に結合することが明らかとなったmt-tRNA^Asn及びmt-tRNA^GlnのmRNAに対するノザンブロット解析の結果を示す。

DAP-TDP-43を過剰発現した場合には、その発現量に比例して、mt-tRNA^Asn及びmt-tRNA^Glnは、細胞内の存在量が増加した。

上記（a）及び（ｂ）の結果から、TDP-43は、少なくともmt-tRNA^Asn、及びmt-tRNA^Glnの生合成又は代謝に関わっていることが立証された。

＜実施例４：TDP-43によるmt-tRNA^Asn、及びmt-tRNA^Glnの細胞内存在量の制御＞
（目的）
mt-tRNA^Asn、及びmt-tRNA^Glnの細胞内存在量がTDP-43によって制御されていることを確認する。

（方法）
（A）DAP-TDP-43発現株を用いてDAP-TDP-43過剰発現時におけるmt-tRNA^Asn又はmt-tRNA^Glnの経時的分解を測定した。ドキシサイクリンをDAP-TDP-43発現株の培養液に添加後24時間培養して、DAP-TDP-43を過剰発現した後、エチジウムブロミド（EtBr）を添加してmt-tRNAの合成を阻害し、EtBr添加時を0時として6、12、24時間後に培養液の一部を回収し、前記実施例３に記載の方法と同様の方法により細胞全RNAを調製した後、前記実施例２に記載のノザンブロット法と同様の方法によりmt-tRNAを検出した。内部コントロールには、SYBR Goldで染色した5S rRNAを用いた。

(B) TDP-43の発現量の増加に伴うmt-tRNA^Asn、 mt-tRNA^Glnの結合量の変化を観察した。DAP-TDP-43過剰発現後のEtBr非添加時におけるDAP-TDP-43とmt-tRNA^Asn又はmt-tRNA^Glnの経時的な結合量を調べた。ドキシサイクリンをDAP-TDP-43発現株の培養液に添加し、4、8、24時間後に培養液の一部を回収し、前記実施例１の「（４）免疫沈降とRNA回収」及び「（５）ウレア変性PAGE」に記載の方法と同様の方法により共免疫沈降−ノザンブロット解析により確認した。

（結果）
図７に結果を示す。Aは、mt-tRNA^Asn又はmt-tRNA^Glnの経時的分解を、また、Bは、DAP-TDP-43との共免疫沈降の結果である。

（A）ドキシサイクリンによりTDP-43を誘導した株（+dox）では、誘導しなかった株（-dox）と比較して、mt-tRNA^Glnの分解速度が緩やかに減少し、またmt-tRNA^Asnでは分解速度が劇的に遅延することが明らかとなった。この結果は、TDP-43がmt-tRNA^Asn、及びmt-tRNA^Glnの細胞内安定性に関与していることを示している。

（B）過剰発現したTDP-43に結合するmt-tRNA^Asn及びmt-tRNA^Glnが増加し、それと相関して、これらのmt-tRNAの細胞内存在量も増加していることが判明した。ALSにおける変異型TDP-43では、野生型TDP-43と比較して、その細胞内安定性が増加することが報告されている (Ling, et al., 2010, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A. 2107:13318-13323)。それ故、TDP-43の細胞内存在量の増加は、mt-tRNA^Asn及びmt-tRNA^Glnの細胞内存在量の増加を伴うことを示唆している。

上記（A）、(B)の結果から、TDP-43は、スキャホールドタンパク質として、mt-tRNA^Asn又はmt-tRNA^Glnの細胞内安定化を、結合を介して制御していることが立証された。

＜実施例５：TDP-43におけるmt-tRNA結合部位の同定＞
（目的）
mt-tRNAがTDP-43のいずれのドメインに結合するかを同定する。

（方法）
（１）DAPタグ付ドメイン欠失型TDP-43発現ベクターの調製
RRM1ドメイン、RRM2ドメイン、GRドメイン又は315ドメインを欠失したドメイン欠失型TDP-43（それぞれdRRM1、dRRM2、dGR、及びd315とする。図８A参照）の発現ベクターを調製した。

各ドメイン欠失変異TDP-43断片は、実施例１で構築したDAP-TDP-43 pcDNA5/FRT/TOから、KOD plus DNAポリメラーゼを使用してPCRによって増幅し、調製した。使用したプライマーセットは、dRRM1用が配列番号２２と２３で示す塩基配列、dRRM2用が配列番号２４と２５で示す塩基配列、dGR用が配列番号２６と２７で示す塩基配列、及びd315用が配列番号２８と２９で示す塩基配列を有するDNAである。dRRM1、dRRM2及びdGRについては、増幅したDNA断片をClaIで切断した後、自己連結し、塩基配列決定により変異を確認した後、HindIII/XhoIで切断し、pcDNA5/FRT/TOのHindIII/XhoI部位に挿入した。d315については、増幅したDNA断片を、BamHI/XhoIで切断し、DAP-TDP-43 pcDNA5/FRT/TOからBamHI/XhoI部位でTDP-43部位を除去し作成したベクター部位に挿入した。これにより、DAP-dRRM1、DAP-dRRM2、DAP-dGR及びDAP-d315の各発現ベクターを得た。

（２）TDP-43に結合したmt-tRNA^Asn、mt-tRNA^Glnの検出のため、実施例１に記載の「（２）ドキシサイクリン誘導型細胞系の構築」に従って細胞系を構築した後、ドキシサイクリンで発現誘導後、24時間後の細胞を回収し、「（３）細胞抽出液の調製」、「（４）免疫沈降とRNA回収」、及び「（５）ウレア変性PAGEに記載の方法」に準じてmt-tRNA^Asn、mt-tRNA^Glnを検出した。

（結果）
図８に結果を示す。Aは、野生型TDP-43（WT）及び各ドメイン欠失型TDP-43の構造を示す概念図である。Bは、野生型TDP-43及び各ドメイン欠失型TDP-43発現株におけるドキシサイクリン誘導により発現した細胞内の各タンパク質を示すウエスタンブロットの結果である。また、Cは、野生型TDP-43及び各ドメイン欠失型TDP-43に結合したmt-tRNA^Asn及びmt-tRNA^Glnを示すノザンブロットの結果である。

Cより、dRRM2、dGR及びd315では、mt-tRNA^Asn及びmt-tRNA^Glnの結合は、維持されていたが、dRRM1ではmt-tRNA^Asn及びmt-tRNA^Glnとの結合は、認められなかった。この結果から、これらのmt-tRNAは、TDP-43におけるRRM1ドメインに結合していることが証明された。

＜実施例６：細胞毒性＞
（目的）
ドメイン欠失型TDP-43によって誘導される細胞毒性について検証する。

（方法）
野生型及び前記実施例５で調製したドメイン欠失型TDP-43の過剰発現系を用いて、ヒト細胞における細胞毒性能について調べた。DAP-TDP43 (WT)、DAP-dRRM1、DAP-dRRM2、DAP-dGR、及びDAP-d315の各細胞培養液にドキシサイクリンを添加し、48時間後の細胞数をBurker-Turk chamber (Hirschmann; Laborgerate Hilgenberg)で視覚的に細胞数をカウントすることによって算出した。

（結果）
結果を図９に示す。この図では、細胞増殖率を、ドキシサイクリンを添加していない以外、同条件で培養した時の細胞数を１とした時の相対値で示している。図中、*はP<0.05を、また、**はP<0.01を示す。

DAP-dGR及びDAP-d315は、過剰発現（+dox）によって野生型のDAP-TDP43と同程度の細胞毒性が観察された。また、DAP-dRRM2では、野生型のDAP-TDP43以上の細胞毒性が見られた。一方、mt-tRNA^Asn及びmt-tRNA^Glnの結合ドメインであるRRM1を欠失したDAP-dRRM1の場合、過剰発現後も細胞毒性をほとんど示さなかった。この結果は、mt-tRNA^Asn及びmt-tRNA^GlnのRRM1への結合が、TDP-43の細胞毒性に関与することを示唆している。つまり、TDP-43とmt-tRNAの結合を阻害することで、細胞毒性を抑制できる。

＜実施例７：変異型TDP-43の細胞毒性とmt-tRNA^Asn、mt-tRNA^Glnの結合との相関性＞
（目的）
ALSにおけるTDP-43とmt-tRNAの相関性について検証する。

（方法）
ALSで確認されている変異を導入した変異型TDP-43（D169G、G298S、R361S;図１０A参照）の発現誘導型細胞系（DAP-D169G、DAP-G298S、DAP-R361S）を作製した。D169G、G298S及びR361Sの構築は、基本的には実施例５に記載の方法に準じた。使用したプライマーセットは、D169G用が配列番号３０と３１で示す塩基配列、G298S用が配列番号３２と３３で示す塩基配列、及びR361S用が配列番号３４と３５で示す塩基配列を有するDNAである。なお、鋳型DNAを除去するために増幅したDNA断片をDpnIで切断した後、大腸菌への形質転換により目的の配列を持つベクターを得た。塩基配列決定により変異を確認した後、HindIII/XhoIで切断し、pcDNA5/FRT/TOのHindIII/XhoI部位に挿入した。ドキシサイクリンで誘導した48時間後の変異株の生存率を測定した。

また、これらの変異型TDP-43発現株における変異型TDP-43とmt-tRNA^Asn、mt-tRNA^Glnとの結合能について確認した。検出方法は、実施例２に記載の方法に準じた。

（結果）
結果を図１０及び図１１に示す。

図１０Aは、実験に使用した野生型TDP-43及び各変異型TDP-43を示した概念図である。図１０Bは、野生型及び各変異型TDP-43発現株における生存率を示す図である。+dox及び-doxは、それぞれドキシサイクリンを培地に添加した細胞及び無添加の細胞を示す。図１０Bから、ALS様変異を有する変異型TDP-43を発現する細胞では、野生型TDP-43を発現する細胞と比較して、いずれも細胞生存率がより低く、強い細胞毒性を有することが明らかとなった。

図１１は、野生型及び各変異型TDP-43を過剰発現した時の細胞内の各mt-tRNAの存在量を示す図である。この図では、ドキシサイクリン無添加の場合を1としたときの添加時の検出バンドの相対強度で示している。この図より、変異型TDP-43においても、野生型TDP-43と同様に過剰発現することでmt-tRNA^Asn及びmt-tRNA^Glnの細胞内の存在量が増加していた。ALSで観察される変異型TDP-43は安定化によって細胞内での発現量が増加しているとの報告から、以上の結果は、ALS様変異型TDP-43では、細胞内での存在量が増加し、それによってmt-tRNA^Asn及びmt-tRNA^Glnも安定化し、これらの細胞内の存在量が増加することを示している。その結果、後述する実施例１０、１１に示す効果をも誘導することで、その細胞の細胞毒性が増加し、細胞死が誘導される。

＜実施例８：新規TDP-43結合タンパク質＞
（目的）
TDP-43結合タンパク質として、従来、FUS/TLS及びataxin2が報告されている（Kwiatkowski, et al., 2009, Science, 323:1205-1208; Vance, et al., 2009, Science 323, 1208-1211; Elden, et al., 2010, Nature. 466:1069-1075）。そこで、TDP-43に結合する他のタンパク質について解析する。

（１）TDP-43結合タンパク質の単離及び同定
（方法）
二種類の異なるタグを有するDAP-TDP-43を用い、当該異なるタグを用いてプルダウン法を二回行う二段階精製法によって、前記DAP-TDP-43に結合するタンパク質を回収し、SDS-PAGEによって分離後、プロテアーゼによるゲル内消化を行った。これらの方法は、Fujiyama−Nakamuraら（Mol Cell Proteomics, 2009, 8, 1552-1565）、Hayanoら（J. Proteome Res. 7: 4183-4190）に記載の方法に準じて行った。その後、LC-MS/MS分析とマスコット検索エンジンによるショットガン解析を行った。なお、LC-MS/MSは、以下の条件で行った。

（A）液体クロマトグラフィー（LC）条件
・使用機器：RENCON（エルシーアシスト）
・溶離液A：0.1%ギ酸含有水（ミリキュー水）
・溶離液B: 0.1%ギ酸含有アセトニトリル（和光純薬）
・カラム：：45 mm × 0.150 mm i.d. 粒径3μm（Kanto Chemical）
・カラム温度：25℃
・流速：100 nL/min
・時間連続濃度勾配（タイムスケジュールグラジュエント）0%B0分：0％〜60分：35％B
・トラップカラム Monocap for Trap 200 μm x 45 μm （GLサイエンス）
（B)MS条件
・使用機器：LTQ-Orbitrap XL（Thermo Fisher Scientific）
・Mass range: 450-1500 Da
・スキャンモード：FT normal
・イオン化方法：ESI-Positive
・スキャン速度：normal
・解析ソフトウェア：Excalibur Qual Browser
（C）MSMS条件
・使用機器：同上
・Mass range: normal
・スキャンモード：Ion-trap normal
・スキャン速度：normal
・解析ソフトウェア：Excalibur Qual Broswer
（結果）
TDP-43結合タンパク質候補として、既に報告されている（Ling et al., 2010, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2107:13318-13323）hnRNP、インターロイキン、エンハンサー結合因子、インシュリン様成長因子2 mRNA結合タンパク質、Matrin-3、及びDHX9と共に、新規TDP-43結合タンパク質であるaralar 1（SLC25A12）、aralar 2（SLC25A13；citrin）、Musashi 2及びGDHが単離された（データ示さず）。aralar 1及びaralar 2は、ミトコンドリアのアスパラギン酸−グルタミン酸輸送体タンパク質であり、ミトコンドリア内膜を介してアスパラギン酸とグルタミン酸との交換に関与する（Gellerich FN, et al., 2009, PLoS One. 9;4(12):e8181）。Musashi 2はRNA結合ドメインを持ち骨髄性白血病細胞の増殖（Jaenisch & Daley, Nat Med. 2010 16(8):903-908.）、神経系の幹細胞の維持と増殖に必要であると考えられているタンパク質である（Seigel GM, et al., Mol Vis. 2007 Jun 8;13:823-832.）。GDHは、グルタミン酸をトリカルボン酸回路の中間産物であるαケトグルタル酸（オキソグルタル酸）に変換する酵素であり、エネルギー代謝とアンモニアの解毒に関わるものとして知られている（http://www.uniprot.org/uniprot/P00367）。

（２）TDP-43の過剰発現による新規TDP-43結合タンパク質の結合効果
（方法）
DAP-TDP-43細胞株の培地にドキシサイクリンを添加してDAP-TDP-43を発現誘導した後、4、8、及び24時間で細胞を回収し、DAP-TDP-43による免疫沈降を行った。使用した方法は、前記実施例１及び２に準ずる。aralar 1、aralar 2、Musashi 2及びGDHの検出には、それぞれ抗aralar 1抗体（Santacruz）、抗aralar 2抗体（abcam）、抗Musashi 2抗体（abcam）及び抗GDH抗体（abcam）を用いた。また、内部コントロールにはβ-アクチンを用いた。β-アクチンは、抗β-アクチン抗体（Santacruz）を使用した。

（結果）
図１２に結果を示す。DAP-TDP-43の細胞内存在量は、発現誘導後に時間経過と共に増加した。これに伴って、DAP-TDP-43と共免疫沈降するaralar 1、aralar 2、Musashi 2及びGDHも量も増加した。したがって、TDP-43は、mt-tRNA^Asn等のmt-tRNAのみならず、aralar 1、aralar 2、Musashi 2及びGDHのタンパク質とも結合することが示された。

（３）aralar 1、2及びmt-tRNAとの結合性
（方法）
aralar 1及びaralar 2の結合を確認するため、免疫沈降タンパク質を相互に交換した共免疫沈降を行った。またaralar 1又はaralar 2とmt-tRNA間の結合を確認するため、前記抗体によるプルダウン後、mt-tRNA^Asnプローブを用いて検出した。共免疫沈降の方法は、基本的には、Sambrook， J．ら (Molecular Cloning: A Laboratory Manual Third Ed．，2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)の方法、及び前記実施例１及び２に記載の方法に従った。

（結果）
図１３に結果を示す。図１３Aは、aralar 1及びaralar 2の相互交換免疫沈降の結果を示す。また、図１３Bは、aralar 1又はaralar 2と共免疫沈降するmt-tRNA^Asnの結果を示す。図１３Bから、aralar 1とaralar 2は、TDP-43と結合するだけでなく、インビボで互いに結合していることも証明された。一方、mt-tRNA^Asnは、aralar 1とaralar 2共に共免疫沈降しなかったことから、TDP-43とは結合するものの、aralar 1とaralar 2には結合しないことが証明された。これらの結果は、mt-tRNAを含むTDP-43複合体と、aralar 1及びaralar 2を含むTDP-43複合体が異なる複合体であることを示している。

（４）Musashi２及びmt-tRNAとの結合性
（方法）
Musashi2とmt-tRNA間の結合を確認するため、、DAP-Musashi2(図１４ではDAP-Msi2と記載)発現誘導細胞系を構築した。基本的には実施例５に記載の方法に準じた。DAP-Musashi2によるプルダウン後、DAP-Musashi2に結合するmt-tRNA^Asn及びmt-tRNA^Glnについて、各プローブを用いて検出した。共免疫沈降の方法は、基本的には、Sambrook， J．ら (Molecular Cloning: A Laboratory Manual Third Ed．，2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)の方法、及び前記実施例１及び２に記載の方法に従った。

（結果）
図１４に結果を示す。DAP-Musashi-2(DAP-Msi2)でプルダウンするとmt-tRNA^Asn及びmt-tRNA^Glnが共免疫沈降することが確認できた。

＜実施例９：TDP-43結合タンパク質のTDP-43結合部位の同定＞
（目的）
実施例８で同定したTDP-43に結合するタンパク質、aralar 1及びaralar 2、がTDP-43のどのドメインに結合しているかを検証する。

（方法）
実施例５で作成したDAP-dRRM1、DAP-dRRM2、DAP-dGR及びDAP-d315の各発現株を使用し、共免疫沈降の方法は、基本的には、Sambrook， J．ら (Molecular Cloning: A Laboratory Manual Third Ed．，2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)の方法、及び前記実施例１及び２に記載の方法に従った。野生型及び各ドメイン欠失型TDP-43のタンパク質使用量はChemiluminescent Nucleic Acid Detection Module kit (Thermo Fisher Scientific)を用いてビオチンを検出することで確認した。

（結果）
図１５に結果を示す。この図が示すように、aralar 1及びaralar 2は、いずれもRRM 1及びRRM 2ドメイン欠失体では検出できたが、GRドメイン欠失体及び315ドメイン欠失体では、低いか又は検出されかなった。この結果から、aralar 1及びaralar 2は、TDP-43のC末端側のGR及び315ドメインに結合することが証明された。

＜実施例１０：TDP-43とATPとの関係＞
（目的）
TDP-43とATPとの関連性について検証する。

（方法）
実施例３で調製したTDP-43 siRNAを用いてTDP-43の発現を抑制した場合、及びDAP-TDP-43細胞を用いて、DAP-TDP-43を過剰発現した場合のそれぞれについて、ATPアッセイを行い、細胞内のATP量を測定した。ATP量の測定にはCelltiter-glo (Promega)を使用し、添付の説明書に添って測定した。細胞量のコントロールとして、前記実施例６に記載の方法に添って細胞数をカウントした。DAP-TDP-43の過剰発現細胞におけるATP量の測定は、ドキシサイクリン添加による発現誘導（0時）後、8、24、48時間での細胞について行った。

（結果）
図１６に結果を示す。TDP-43を抑制した場合、TDP-43細胞におけるATP存在量は、Cont細胞と比較して82％まで減少した（図１６A）。DAP-TDP-43を過剰発現した場合、細胞あたりのATP存在量は、ドキシサイクリン誘導後、48時間で1.8倍にまで増加した（図１６B）。これらの結果から、TDP-43は、酸化的リン酸化反応の制御に関与していることが示された。

＜実施例１１：ドメイン欠失型TDP-43におけるmt-tRNA及びATPの細胞存在量＞
（目的）
ドメイン欠失型TDP-43におけるmt-tRNA（mt-tRNA^Asn及びmt-tRNA^Gln）又はATPの細胞存在量を検証する。

（方法）
各ドメイン欠失型TDP-43発現株は、実施例５で調製したDAP-dRRM1、DAP-dRRM2、DAP-dGR及びDAP-d315の各発現誘導細胞株を用いた。発現誘導は、ドキシサイクリンの培地添加（+dox）で行い、添加後、48時間の細胞より全RNAを抽出し、それぞれのRNAの前記プローブを用いて、細胞内存在量を検出、定量した。発現誘導のコントロールは、ドキシサイクリン無添加（-dox）培地で、他は同一条件で培養した同系の細胞株とした。また、前記実施例１０と同様の方法により、各ドメイン欠失型TDP-43を誘導後、細胞内のATP量を測定した。

（結果）
図１７−１及び図１７−２に結果を示す。図１７−１は、各ドメイン欠失型TDP-43におけるmt-tRNA^Asn、mt-tRNA^Gln及びmt-tRNA^Leu（UUR）の細胞内存在量を、検出されたバンドの相対強度（ドキシサイクリン無添加時（-dox）を1としたときの発現誘導時(+dox)の相対値）を示したものである。図１７−１から、DAP-dRRM 2の過剰発現は、mt-tRNA^Asn及びmt-tRNA^Glnの量を顕著に増加した。

図１７−２は、各ドメイン欠失型TDP-43におけるATPの測定結果である。図１７−１の結果と同様に、DAP-dRRM 2の過剰発現は、細胞内のATP量を顕著に増加した。一方、dRRM1の過剰発現では、細胞内のATP量の増加は見られなかった。

以上の結果は、ドメイン欠失型TDP-43は、mt-tRNA^Asn、mt-tRNA^Gln、及びATPの細胞内存在量の増加能に比例して、細胞毒性を増加することを示している。

＜実施例１２：変異型TDP-43とATP細胞内存在量との相関性＞
（目的）
ALSにおけるTDP-43とATPの細胞内存在量との相関性について検証する。

（方法）
前記実施例７で作成したALSで確認されている変異を導入した変異型TDP-43（D169G、G298S、R361S;図１０A参照）の発現誘導型細胞系（DAP-D169G、DAP-G298S、DAP-R361S）を用いて、ドキシサイクリンで誘導後、48時間経過時のATPの細胞内存在量を測定した。測定方法は、実施例２に記載の方法に準じた。

（結果）
図１８に結果を示す。いずれのドメイン欠失型TDP-43も過剰発現により、細胞内のATP存在量を増大させた。これは、ALSにおける変異型TDP-43がmt-tRNA^Asnとmt-tRNA^Gln（実施例７）と同時に、ATPの細胞内存在量も増加させる能力を有しており、この増加能が細胞毒性と一致することを示している。

ALSにおけるTDP-43変異による病態の発症機序は、未だ十分に解明されてはいない。しかしながら、上記実施例１〜１２の結果から、以下のような一つの仮説を導き出すことができる。

すなわち、変異によって細胞内でのTDP-43が安定化されるか、mt-tRNA^Asn、mt-tRNA^Gln、mt-tRNA^Glu及び／又はmt-tRNA^Pro、Aralar 1若しくはAralar 2、GDH、又はMusashi 2との結合能に変化が生じることがALS発症の引き金となると考えられる。変異によってTDP-43が安定化されると、変異型TDP-43と前記mt-tRNAと結合したTDP-43-mt-tRNA複合体、及び／又は前記タンパク質と結合したTDP-43-タンパク質複合体が増加する。変異型TDP-43と前記mt-tRNAと結合したTDP-43-mt-tRNA複合体形成によって、mt-tRNA^Asn、mt-tRNA^Glnの存在量が増加し、ミトコンドリアにおけるタンパク質合成が促進され、その結果、ミトコンドリアが活性化される。同時に前記タンパク質と結合したTDP-43-タンパク質複合体形成によって、Gluからα-ケトグルタル酸への変換が促進されトリカルボン酸サイクルの昂進が起こる。これらの効果によって、ミトコンドリアの酸化的リン酸化が異常に昂進し、ATPの合成量増加が起こると考えられる。この異常な酸化的リン酸化の昂進は、活性酸素の増加とGlu代謝に伴うアンモニアの増加による尿素代謝の異変を起こし、細胞の損傷、アポトーシスへと導くと推測される。一方で、細胞は、この現象をフィードバックするための防御システムを働かせる。細胞は、TDP-43の変異によって増加したTDP-43-mt-tRNA複合体及び／又はTDP-43-タンパク質複合体を凝集物として細胞質の特定箇所にトラップし、TDP-43の本来の機能を発揮すべき細胞内の場所からTDP-43を隔離するが、この際、TDP-43-mt-tRNA複合体に含まれるmt-tRNA^Asn、 mt-tRNA^GlnとTDP-43-タンパク質複合体も同時に凝集物として沈着させることが予測される。TDP-43の変異によってAralar 1若しくはAralar 2、GDH、又はMusashi 2との結合能に変化が生じた場合にも、TDP-43が安定化された場合と同様の現象が起こると考えられる。これによって、mt-tRNA^Asn、mt-tRNA^GlnはAspとGluのチャージが行われない状態で凝集物内にトラップされ、同時にGluからαケトグルタル酸への変換に関わるAralar1、Aralar 2、GDH及び／又はmt-tRNA^Asn、mt-tRNA^Glnと結合するMusashi 2もトラップされる。その結果、mt-tRNA^Asnとmt-tRNA^Glnへのチャージと、αケトグルタル酸への変換が起こらなくなり、細胞内でAsp及び／又はGluの蓄積が生じる。特にアストロサイトでは、AspはGluへと変換されるためにGluのより過剰な蓄積を引き起こす(Pardo et al., 2011, J. Cereb. Blood Flow Metab. 31(1):90-101; Hertz L., 2011, J. Cereb. Blood Flow Metab. 31(1):384-387)。過剰に蓄積したGlu毒によって感受性の特に高い運動ニューロンの細胞死が誘導されると推測することができる。一仮説ではあるが、以上のような発症機序によって、TDP-43のALSで観察される変異とALSの病態、特にGlu濃度の上昇がどのようにして生じるかを説明することが可能になる。したがって、この発症機序に関わる全タンパク質及び／又はRNAに対して影響を与え、Asp及び／又はGluの細胞内濃度を低減させる物質は、ALS治療剤における有効成分となり得ると考えられる。

＜実施例１３：TDP-43結合阻害剤の製造＞
TDP-43とそれに結合するmt-tRNA（mt-tRNA^Asn、mt-tRNA^Gln、mt-tRNA^Glu及びmt-tRNA^Pro）の結合を競合阻害するTDP-43結合阻害剤を本発明のTDP-43結合阻害剤製造方法を用いて製造する。

（１）4種のmt-tRNAにおけるTDP-43結合領域候補の探索
（目的）
前記4種のmt-tRNAの共通領域にTDP-43が結合すると推測し、前記4種のmt-tRNAにおけるTDP-43との結合領域を探索した。

（方法）
まず、各mt-tRNAの配列に対してlustalWによりマルチプルアラインメントを行い、WebLogoにてコンセンサス配列を、またMEMEにてモチーフをそれぞれ抽出して、コンセンサス配列を三次元構造上に重ね合わせて分析した。

（結果）
図１９に4種のmt-tRNAにおける塩基配列のアラインメントの結果を、図２０にmt-tRNA^Asnの二次構造、及び4種のmt-tRNAにおけるコンセンサス配列の位置を、それぞれ示す。

アラインメントの結果及び二次構造から、Dステム＆ループ内のGUU（mt-tRNA^GlnのみGAU）、アンチコドンループ内のUXU、Tステム＆ループ内のUGG、及び受容アーム（アミノアシル化アーム）のCCAの4領域にコンセンサス配列が存在することが明らかとなった。このうちアンチコドンループ内のコンセンサス配列UXUについては他にも多くのmt-tRNAに、また受容アームのコンセンサス配列CCAについては全てのmt-tRNAに、共通してみられる配列であって、前記4種のmt-tRNA特異的な配列ではない。したがって、これら２つのコンセンサス配列については、TDP-43結合領域候補から除外した。一方、GUUとUGGの両方のコンセンサス配列をそれぞれDステム＆ループ内とTステム＆ループ内に有するmt-tRNAは、22種のmt-tRNA中、mt-tRNA^Asn、mt-tRNA^Gln、mt-tRNA^Glu及びmt-tRNA^Proの4種のみで、これら4種のmt-tRNA特異的であることが明らかとなった。したがって、これら2つのコンセンサス配列をTDP-43結合領域候補として、さらなる検証を行った。

（２）TDP-43結合阻害剤候補オリゴヌクレオチドによるmt-tRNAとTDP-43結合の結合阻害
（目的）
前記（１）の結果からTDP-43に結合する4種のmt-tRNAにおける4つのコンセンサス領域が明らかとなった。これらのコンセンサス配列を含むオリゴヌクレオチドは、TDP-43結合との結合に関与する領域であることが推測され、それ故、4種のmt-tRNAとTDP-43結合との結合を阻害するTDP-43結合阻害剤候補となり得る。そこで、これらのオリゴヌクレオチドを用いて内在mt-tRNAとの間でTDP-43に対する競合アッセイを行った。

（方法）
mt-tRNA^Asnの5’末端の塩基を1位としたときに、Dステム＆ループを含む1〜25位に相当するDNAオリゴヌクレオチド（D-loop；5’-TAGATTGAAGCCAGTTGATTAGGGT-3’：配列番号４０）、アンチコドンループを含む26〜48位（Anticodon；5’GCTTAGCTGTTAACTAAGTGTTT-3’：配列番号４１）、Tステム＆ループを含む49〜73位のDNAオリゴヌクレオチド（T-loop；5’-GTGGGTTTAAGTCCCATTGGTCTAG-3’：配列番号４２）、Tステム＆ループに含まれるコンセンサス配列UUGの一部であるUGの12回繰り返し配列に相当するDNAオリゴヌクレオチド(TG)₁₂（5’-TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG-3’：配列番号４３）、(TG)₁₂の対照用DNAオリゴヌクレオチド(TC)₁₂（5’-TCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC-3’：配列番号４４）、Tステム＆ループに含まれるコンセンサス配列UGGの8回繰り返し配列からなるDNAオリゴヌクレオチド(TGG)₈（5’-TGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGG-3’：配列番号４５）、及びDステム＆ループに含まれるコンセンサス配列UGGの7回繰り返し配列からなるDNAオリゴヌクレオチドTT(GTT)₇G（5’-TTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTG-3’：配列番号４６）（図面では、便宜的に(TTG)₈で示している）を合成した。

競合アッセイは、実施例１の方法に準じて行った。まず、実施例１の「（３）細胞抽出液の調製」に記載の方法に従って細胞抽出液を調製した後、200nMとなるようにTDP-43結合阻害剤候補の各DNAオリゴヌクレオチドを添加した。オリゴヌクレオチドを添加しないサンプルを陰性対照用（-）とした。続いて、実施例１の「（４）免疫沈降とRNA回収」及び「（５）ウレア変性PAGE」に記載の方法に従って処理してFlagタグを含むDAP-TDP-43と結合する核酸を電気泳動により展開した。また、実施例２のノザンブロット法の方法に準じて、DAP-TD-43に結合するmt-tRNA^Asnを検出し、定量した。検出に用いたオリゴヌクレオチドプローブには、配列番号１０のオリゴヌクレオチドを利用した。mt-tRNA^AsnのRNAバンドのシグナル強度は、LAS4000イメージアナライザーとMultiGauge software (Fujifilm)を用いて定量した。

(結果)
図２１及び２２に結果を示す。

図２１Aの結果から、(TG)₁₂を添加したときにDAP-TD-43に結合する4種のmt-tRNAのバンド（図１参照）が最も薄くなり、DAP-TD-43との結合が阻害されていることが示された。D-loopとT-loopを加えたときは、陰性対照(-)と比較して若干の阻害がみられたが、Anticodonでは阻害効果がほとんど見られなかった。図２１Bの結果から、同様の結果がノザンブロット法によるmt-tRNA^Asnの検出でも確認された。

図２２Aの結果から、(TG)₁₂、(TTG)₈及びTT(GTT)₇Gを添加したときには、DAP-TD-43に結合する4種のmt-tRNAのバンド（図１参照）が陰性対照(-)と比較して明らかに薄くなり、DAP-TD-43との結合が阻害されていることが示された。一方、(TG)₁₂の対照用で、コンセンサス配列を含まない(TC)₁₂を加えたときには、DAP-TD-43とmt-tRNAとの結合は阻害されなかった。同様の結果は、図２２Bに示すノザンブロット法によるmt-tRNA^Asnの検出でも確認された。(TG)₁₂の結合阻害効果が最も強く、(TTG)₈及びTT(GTT)₈₇Gはそれに次ぐ阻害効果を有していた。したがって、前記コンセンサス配列又はその一部を含む(TG)₁₂、(TTG)₈及びTT(TT)₈₇Gは、TDP-43と4種のmt-tRNAの結合を競合阻害するTDP-43結合阻害剤となり得ることが立証された。

（３）TDP-43結合阻害剤(TG)₁₂の結合阻害効果の検証
（目的）
前記（２）で得られたTDP-43結合阻害剤の濃度と、TDP-43と4種のmt-tRNAの結合阻害効果について検証した。

（方法）
TDP-43結合阻害剤として前記（２）で得られた(TG)₁₂を用いた。基本的な方法は前記（３）に従った。ただし、添加する(TG)₁₂の濃度は、0、2、20、200 nMとした。（結果）
図２３A〜Cに結果を示す。TDP-43結合阻害剤(TG)₁₂は、濃度依存的にTDP-43と4種のmt-tRNAの結合阻害効果が高まることが明らかとなった。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

＜実施例１４：TDP-43と活性酸素量との関係＞
（目的）
実施例１０ではTDP-43とATP量との関連性につい立証した。一方、ATPが増加した場合、同時に活性酸素が産生される。活性酸素は細胞毒として知られていることから、細胞傷害の直接の原因物質と考えられる。そこで、TDP-43と活性酸素量との相関についても検証した。

（方法）
実施例１で調製したDAP-TDP-43細胞を用いた。DAP-TDP-43発現誘導は、ドキシサイクリンの培地添加（+dox）で行い、添加後、8、24、48時間後の細胞について細胞内の反応性酸素活性を測定した。発現誘導のコントロールは、ドキシサイクリン無添加（-dox）培地で、他は同一条件で培養した同系の細胞株（293TRex）とした。

細胞内のヒドロキシル、ペルオキシル又は他の反応性酸素種活性の測定は、細胞浸透性蛍光プローブ 2’, 7’-Dichlorodihydrofluorescin diacetate (DCFH-DA)を利用する。DCFH-DAは、細胞内に分散した後、細胞内エステラーゼにより脱アセチル化され、非蛍光型2’, 7’-Dichlorodihydrofluorescin (DCFH)に変化する。その後、ROSにより直ちに酸化され、強蛍光性の2’,7’-Dichlorodihydrofluorescein (DCF)に変化する。蛍光強度は、細胞質ゾルのROSレベルに比例する。具体的には、25μMのDCFH-DAを細胞に処理し、37℃、30分間インキュベートした後、回収した。回収した細胞中のDCFの蛍光強度をフローサイトメトリーにより検出した。（Miura D et al. (2004) Clinical & Experimental Metastasis 21: 445-451）
（結果）
図２４に結果を示す。TDP-43の発現を誘導した細胞では誘導時間の経過、すなわち、TDP-43の発現量の増加に伴って、細胞内の反応性酸素活性が有意に増加することが明らかとなった。一方、TDP-43の発現を誘導していない細胞（293TRex）では細胞内の反応性酸素活性に有意な変化は認められなかった。以上の結果から、TDP-43の発現量の増加に比例して、細胞内の活性酸素量は増加し、それはまた、TDP-43の発現量の増加により細胞毒性が増加することを示している。

Claims

TAR DNA結合タンパク質-43の細胞内存在量に関連する神経系疾患の認定を補助する方法であって、被検体由来の細胞内における、mt-tRNA^Asn、mt-tRNA^Gln、mt-tRNA^Glu及びmt-tRNA^Proからなる群から選択される少なくとも一のmt-tRNAの存在量、
又は
mt-tRNA^Asn、mt-tRNA^Gln、mt-tRNA^Glu及びmt-tRNA^Proからなる群から選択される少なくとも一のmt-tRNAとTAR DNA結合タンパク質-43との結合量
の少なくとも一つを測定する測定工程、及び
前記測定工程で得られた測定値を健常体由来の細胞内における対応する測定値と比較して、両者の値に統計学的に有意な差がある場合には、その被検体が前記神経系疾患に罹患しているとみなす認定補助工程
を含む、前記方法。
前記神経系疾患は、被検体由来の細胞内におけるTAR DNA結合タンパク質43の存在量が健常体由来の細胞内におけるその存在量と比較して統計学的に有意に増加する神経系疾患である、請求項１に記載の方法。
前記TAR DNA結合タンパク質-43が配列番号１で示されるアミノ酸配列において開始メチオニンを1位としたときに、
90位のアラニンがバリン（A90V）に、169位のアスパラギン酸がグリシン（D169G）に、267位のアスパラギンがセリン（N267S）に、287位のグリシンがセリン（G287S）に、290位のグリシンがアラニン（G290A）に、292位のセリンがアスパラギン（S292N）に、294位のグリシンがアラニン（G294A）に、294位のグリシンがバリン（G294V）に、295位のグリシンがアルギニン（G295R）に、295位のグリシンがセリン（G295S）に、298位のグリシンがセリン（G298S）に、311位のメチオニンがバリン（M311V）に、315位のアラニンがトレオニン（A315T）に、315位のアラニンがグルタミン酸（A315E）に、331位のグルタミンがリジン（Q331K）に、332位のセリンがアスパラギン（S332N）に、335位のグリシンがアスパラギン酸（G335D）に、337位のメチオニンがバリン（M337V）に、343位のグルタミンがアルギニン（Q343R）に、345位のアスパラギンがリシン（N345K）に、348位のグリシンがシステイン（G348C）に、352位のアスパラギンがセリン（N352S）に、352位のアスパラギンがトレオニン（N352T）に、357位のグリシンがセリン（G357S）に、361位のアルギニンがセリン（R361S）に、363位のプロリンがアラニン（P363A）に、378位のアスパラギンがアスパラギン酸（N378D）に、379位のセリンがシステイン（S379C）に、379位のセリンがプロリン（S379P）に、382位のアラニンがプロリン（A382P）に、382位のアラニンがトレオニン（A382T）に、383位のイソロイシンがバリン（I383V）に、384位のグリシンがアルギニン（G384R）に、390位のアスパラギンがアスパラギン酸（N390D）に、390位のアスパラギンがセリン（N390S）に、若しくは393位のセリンがロイシン（S393L）に置換した変異、又は
374位のチロシン以降が欠失した変異
を有する、請求項１又は２に記載の方法。
前記変異がD169G、G298S又はR361Sである、請求項３に記載の方法。
前記神経系疾患が筋萎縮側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病及び前頭側頭葉変性症からなる群から選択される、請求項１〜４に記載の方法。
TAR DNA結合タンパク質-43結合阻害剤を製造する方法であって、
mt-tRNA^Asn、mt-tRNA^Gln、mt-tRNA^Glu及びmt-tRNA^Proからなる群から選択される少なくとも一のmt-tRNA
とTAR DNA結合タンパク質-43を薬剤候補物質と共に混合する混合工程、
前記mt-tRNAと前記TAR DNA結合タンパク質-43との結合量を検出する検出工程、
前記結合が検出されない場合、又は検出された結合量と前記薬剤候補物質の非存在下における対応するmt-tRNAとTAR DNA結合タンパク質-43との結合量とを比較して両者の値に統計学的に有意な差がある場合に、その薬剤候補物質をTAR DNA結合タンパク質-43結合阻害剤として選択する選択工程
を含む、前記方法。
前記薬剤候補物質は、前記mt-tRNAとの間でTAR DNA結合タンパク質-43との結合を競合し合う物質である、請求項６に記載の製造方法。
前記薬剤候補物質は、細胞内における活性状態の、前記mt-tRNAの存在量を低減させる物質である、請求項６に記載の製造方法。
前記薬剤候補物質が核酸分子、ペプチド、又は低分子化合物である、請求項７又は８に記載の製造方法。
前記薬剤候補物質が
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む100アミノ酸以下のポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において1〜3アミノ酸の付加、欠失又は置換を含むポリペプチドを含む130アミノ酸以下のポリペプチド、
（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は
（ｄ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの一部
である、請求項９に記載の製造方法。
前記TAR DNA結合タンパク質-43が配列番号１で示されるアミノ酸配列において開始メチオニンを1位としたときに、
A90V、D169G、N267S、G287S、G290A、S292N、G294A、G294V、G295R、G295S、G298S、M311V、A315T、A315E、Q331K、S332N、G335D、M337V、Q343R、N345K、G348C、N352S、N352T、G357S、R361S、P363A、N378D、S379C、S379P、A382P、A382T、I383V、G384R、N390D、N390S、若しくはS393Lの変異、又は
374位のチロシン以降が欠失した変異を有する、請求項６〜９のいずれか一項に記載の製造方法。
前記変異がD169G、G298S又はR361Sである、請求項１１に記載の製造方法。
請求項６〜１２のいずれか一項に記載のTAR DNA結合タンパク質-43結合阻害剤がTAR DNA結合タンパク質-43の細胞内存在量に関連する神経系疾患治療剤の有効成分である、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の製造方法。
前記TAR DNA結合タンパク質-43の細胞内存在量に関連する神経系疾患は、被検体由来の細胞内におけるTAR DNA結合タンパク質43の存在量が健常体由来の細胞内におけるその存在量と比較して統計学的に有意に増加する神経系疾患である、請求項１３に記載の製造方法。
前記神経系疾患が筋萎縮側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病及び前頭側頭葉変性症からなる群から選択される、請求項１３又は１４に記載の製造方法。
TGG若しくはUGG及び／又はGTT若しくはGUUからなる2以上の連続する繰り返し配列を含み、6〜50塩基の核酸分子からなるTAR DNA結合タンパク質-43結合阻害剤。
前記繰り返し回数が3回以上である、請求項１６に記載のTAR DNA結合タンパク質-43結合阻害剤。
配列番号４５又は４６で示される塩基配列を含む、請求項１７に記載のTAR DNA結合タンパク質-43結合阻害剤。