ES2724549T3 - ARN pequeños derivados de RNY como biomarcadores para trastornos relacionados con la aterosclerosis - Google Patents

Abstract

Procedimiento in vitro de diagnóstico o pronóstico de un trastorno relacionado con la aterosclerosis en un individuo, que comprende las etapas de: a) determinar el nivel de expresión de al menos un biomarcador que consiste en un ARN Y pequeño (s-RNY) en una muestra biológica de dicho individuo, b) comparar el nivel de expresión de dicho al menos un biomarcador con un valor de referencia, c) deducir de dicha comparación si el individuo ha desarrollado o está en riesgo de desarrollar un trastorno relacionado con la aterosclerosis.

Description

DESCRIPCIÓN

ARN pequeños derivados de RNY como biomarcadores para trastornos relacionados con la aterosclerosis

La presente invención se refiere a un procedimiento in vitro de diagnóstico o pronóstico de un trastorno relacionado con la aterosclerosis mediante la detección de un ARN Y pequeño (s-RNY), así como al uso de un inhibidor de S-RNY como medicamento contra los trastornos relacionados con la aterosclerosis. La invención también se refiere a un procedimiento para el cribado de un compuesto adecuado para el tratamiento de un trastorno relacionado con la aterosclerosis.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El descubrimiento de ARN pequeños reguladores es uno de los avances biomédicos más importantes en la historia reciente. Hasta la fecha, se han identificado tres clases principales de ARN pequeños, a saber, el microARN (miRNA), el ARN interferente pequeño (siRNA), y el ARN de interacción con piwi (piRNA). Estas clases difieren en su biogénesis, su longitud, y su distribución en los tejidos (Ghildiyal, M., y Zamore, PD (2009) Nat Rev Genet 10, 94­ 108; Kim, VN et al (2009) Nature Reviews 10, 126-139). Los miRNA tienen ~ 22 nucleótidos (nt) de longitud y se generan a partir de transcritos primarios en forma de horquilla mediante dos etapas de procesamiento secuencial mediadas por una endonucleasa ARNasa III nuclear (Drosha) y citoplasmática (Dicer). Los miRNA están cargados en RISC (complejo de silenciamiento inducido por ARN), cuyo componente principal es Argonaute 2 (Ago2), para mediar el bloque de degradación y/o traducción de ARN mensajero de dianas específicas (ARNm) a través de la complementariedad de secuencias parciales por emparejamiento de bases de Watson-Crick (Fabian, MR, et al. (2010). Annual review of biochemistry 79, 351-379). Los miRNAs se expresan ubicuamente y controlan una amplia gama de actividades celulares, incluyendo el desarrollo, la función inmunitaria y la muerte celular (Fabian, MR, et al. (2010). Annual review of biochemistry 79, 351-379). Los siRNAs derivan de ARN de doble cadena que son procesados por Dicer en ARN pequeños de 19 nt. Los siRNAs también se incorporan en RISC para silenciar la posttranscripcionalmente los ARNm diana específicos en células madre (Ghildiyal, M., y Zamore, PD (2009). Nat Rev Genet 10, 94-108). Los piRNAs derivan de ARN de una cadena que son procesados por un mecanismo poco entendido en ARn pequeños de 24-30 nt. Los piRNAs median el silenciamineto génico epigenético y posttranscripcional de retrotransposones y otros elementos genéticos en las células germinales (Ghildiyal, M., y Zamore, PD (2009). Nat Rev Genet 10, 94-108). Es importante destacar que, los recientes análisis de los datos procedentes de tecnologías de secuenciación de nueva generación, también conocidas como secuenciación profunda o de alto rendimiento, a partir de cultivos de células y tejidos han revelado la existencia de otras clases de ARN pequeños, incluidos los sno-ARN y tRNAs o de repeticiones Alu. En general, estos hallazgos sugieren que las células pueden generar una amplia gama de ARN pequeños reguladores con una amplia variedad de mecanismos y funciones de procesamiento.

Los inventores han explorado si los estímulos aterogénicos regulan la expresión de nuevos ARN pequeños reguladores, que a su vez pueden modular la apoptosis y la inflamación en macrófagos. La aterosclerosis es causada por un engrosamiento de la pared de la arteria, también conocido como lesión, como resultado de la acumulación de lípidos, células, y la matriz extracelular en la zona entre el endotelio y las células musculares lisas subyacentes (Moore, KJ, y Tabas, I. (2011). Cell 145, 341-355). Una etapa de inicio clave de la aterosclerosis es la acumulación subendotelial de ApoB-LPS (lipoproteínas que contienen apolipoproteína B) compuesto de ésteres de acilo graso de colesterilo y triglicéridos, que son transportados en la sangre como LDL (lipoproteína de baja densidad) (Moore, KJ, y Tabas, I. (2011). Cell 145, 341-355). La activación de las células endoteliales por ApoB-LP conduce al reclutamiento de macrófagos, que desempeñan un papel importante a lo largo de la aterosclerosis desde las fases tempranas de formación de la lesión a las avanzadas. De hecho, en fases tempranas, los macrófagos fagocitan las lipoproteínas y lípidos, y se convierten en las así llamadas células espumosas, que secretan citoquinas inflamatorias y se someten a apoptosis. El aclaramiento eferocítico rápido de las células espumosas apoptóticas conduce a la supresión de la respuesta inflamatoria en última instancia, retardando la progresión de la lesión. Sin embargo, en lesiones avanzadas, la apoptosis de los macrófagos no se acopla correctamente con el aclaramiento de fagocitosis, lo que conduce a la formación de placa necrótica. La acumulación de restos necróticos en última instancia promueve la inflamación, rotura de la placa, y, finalmente, la trombosis. Tanto la tasa de mortalidad de los macrófagos como la eficiencia de aclaramiento celular por apoptosis son procesos que controlan la progresión de la lesión (Moore, KJ, y Tabas, I. (2011). Cell 145, 341-355). La inducción de la apoptosis de los macrófagos en las lesiones ateroscleróticas implica el efecto crónico y acumulativo de varias características, incluyendo el estrés oxidante, citoquinas, LDL oxidada (LDL ox), la activación de la vía de Fas death, ácidos grasos saturados, y factores de estrés del retículo endoplásmico (Moore, KJ, y Tabas, I. (2011). Cell 145, 341-355). Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a la apoptosis en los macrófagos tras estímulos relevantes para el ateroma es un objetivo clave en el desciframiento de la progresión de la lesión.

Los inventores han demostrado que, en macrófagos estimulados con lípidos aterogénicos, los RNYs (también llamados "ARN Y") se procesan en ARN pequeños que tienen alrededor de 24-34 nucleótidos (nt) de longitud y son referidos como RNYY pequeños (s-RNY). Estos s-RNY causan la degradación de un subconjunto de ARNm cruciales para la aterogénesis y en última instancia modulan la apoptosis y la respuesta inflamatoria en macrófagos cargados de lípidos.

Los RNYs son ARN no codificantes que tienen ~110 nt de longitud citoplasmática que se caracterizan por un amplio apareamiento de bases de las regiones 5' y 3' y por la asociación con las proteínas Ro60 y La/SSB para formar el complejo de ribonucleoproteína Ro. En los macrófagos incubados con estímulos aterogénicos, tales como ácido palmítico (PA), la generación de s-RNY requiere Ago2 y la proteína de unión a ARN de cadena simple hnRNP A1 que es la proteína del núcleo más abundante del complejo de ribonucleoproteínas. hnRNP A1 se desplaza al citoplasma para unirse directamente a RNY y modular el posicionamiento/reclutamiento de Ago2 que a su vez participa en la catálisis y la maduración de RNY en s-RNY.

s-RNY regulan vías pro-inflamatorias y pro-apoptóticas en macrófagos cargados de lípidos mediante el control de los niveles de expresión de un subconjunto de las transcripciones o transcritos que son críticos en la regulación de la patogénesis de la aterosclerosis, tales como Fos, KLF2, y NR4A1. Es importante destacar que s-RNY son responsables, al menos en parte, para la activación de p38 y vías de señalización de NF-^kB en los macrófagos tratados con PA, induciendo en última instancia la muerte celular y la respuesta inflamatoria.

Según el hallazgo anterior de que los s-RNY son los principales ARN pequeños que regulan la respuesta inmunitaria en la patogénesis de la aterosclerosis, se demostró un aumento significativo de la expresión de s-RNY en modelos de ratón para la aterosclerosis y en el suero de una cohorte de pacientes con enfermedad estable de las arterias coronarias (CAD). Además, los niveles de expresión de sRNy en pacientes con CAD se correlacionaron positivamente con lípidos pro-aterogénicas y afección inflamatoria, mientras que se encontró una asociación negativa con HDL ateroprotector.

En conjunto, los resultados de los inventores indican que la expresión s-RNY se puede utilizar como un marcador diagnóstico y una diana terapéutica para la aterosclerosis.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Procedimiento de diagnóstico o pronóstico de un trastorno relacionado con la aterosclerosis

La presente invención se refiere a un procedimiento in vitro de diagnóstico o pronóstico de un trastorno relacionado con la aterosclerosis en un individuo, que comprende las etapas de:

a) determinar el nivel de expresión de al menos un biomarcador que consiste en un Y ARN pequeño (s-RNY) en una muestra biológica de dicho individuo,

b) comparar el nivel de expresión de dicho al menos un biomarcador con un valor de referencia,

c) deducir de dicha comparación si el individuo ha desarrollado o está en riesgo de desarrollar un trastorno relacionado con la aterosclerosis.

La descripción también se refiere al uso de al menos un ARN Y pequeño (s-RNY) como biomarcador de trastornos relacionados con la aterosclerosis.

Tal como se usa en este documento, un "trastorno relacionado con la aterosclerosis" es una enfermedad que resulta del desarrollo de la aterosclerosis en cualquier arteria del cuerpo, incluyendo arterias en el corazón, el cerebro, los brazos, las piernas, la pelvis y los riñones. Un trastorno relacionado con la aterosclerosis puede ser, por ejemplo, enfermedad renal crónica, enfermedad cerebrovascular, enfermedad vascular periférica, enfermedad isquémica del corazón, enfermedad de la arteria carótida, o enfermedad de la arteria coronaria (también llamada enfermedad cardíaca coronaria (CHD)).

Un trastorno relacionado con la aterosclerosis se diagnostica generalmente mediante angiografía cuando un estrechamiento severo (estenosis) de la arteria ya está presente, y en menor medida por las pruebas de estrés cardíaco. La detección temprana de un trastorno relacionado con la aterosclerosis actualmente se basa en la detección anatómica, tal como la evaluación de calcio coronario mediante tomografía computarizada, medición del grosor promedio de la íntima carótida (IMT) por ultrasonidos, y formación de imágenes por ultrasonido intravascular (IVUS), y/o medición fisiológica, tal como el análisis de subclases de lipoproteínas o medición de HbA1c, hs-CRP, y/o homocisteína.

El término "diagnosticar" o "diagnóstico" se utiliza en el presente documento para referirse a la identificación de un estado, enfermedad o afección molecular o patológica, tal como la identificación de un trastorno relacionado con la aterosclerosis o para referirse a la identificación de un paciente que ha desarrollado o está en riesgo de desarrollar un trastorno relacionado con la aterosclerosis.

El término "pronosticar" o "pronóstico" se utiliza en el presente documento para referirse a la predicción de la probabilidad de desarrollar un trastorno relacionado con la aterosclerosis.

Según la invención, el término "biomarcador" significa un indicador biológico o indicador derivado biológicamente de un proceso, un evento o condición. El término biomarcador, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un s-RNY que se expresa diferencialmente en un individuo que ha desarrollado o está en riesgo de desarrollar un trastorno relacionado con la aterosclerosis en comparación con un individuo o población de control.

El término "ARN Y pequeño” o "s-RNY" se refieren a un ARN pequeño de aproximadamente 24-34 nucleótidos que derivan del procesamiento de un ARN Y (también llamado RNY).

Los RNY son altamente conservados en eucariotas. El genoma humano contiene cuatro genes que codifican RNY respectivamente llamados ARN hY1 (hRNY1) de la secuencia de SEQ ID NO: 1 (gi|161087011|ref|NR_004391.1), ARN hY3 (hRNY3) de la secuencia de SEQ ID NO: 2 (gi|161087012|ref|NR_004392.1), ARN hY4 (hRNY4) de la secuencia de SEQ ID NO: 3 (gi|161087013|ref|NR_004393.1) y ARN hY5 (hRNY5) de la secuencia de SEQ ID NO: 4 (gi|197209873|ref|NR_001571,2 |) (hY2 es un producto de degradación de hY1). En el genoma de Mus musculus, los genes que codifican RNY se llaman ARN Y1 de Mus musculus (mRNY1) de la secuencia de SEQ ID NO: 5 (gi|161333869|ref|NR_004419.1 |); ARN Y3 de Mus musculus (mRNY3) de la secuencia de SEQ ID NO: 6.

Los s-RNY humanos incluyen s-RNY1-5p (SEQ ID NO: 7) y s-RNY1-3p (SEQ ID NO: 8) ambos derivados de hRNY1 mediante el procesamiento en su lado 3' o 5', respectivamente; s-RNY3-5p (SEQ ID NO: 9) y s-RNY3-3p (SEQ ID NO: 10) ambos derivados de hRNY3 mediante el procesamiento en su lado 5' o 3', respectivamente; s-RNY4-5p (SEQ iD NO: 11) y s-RNY4-3p (SEQ ID NO: 12) ambos derivados de hRNY4 mediante el procesamiento en su lado 5' o 3', respectivamente; y s-RNY5-3p (SEQ ID NO: 13) que deriva de hRNY5 mediante el procesamiento en su lado 3'.

Los RNY pequeños s-RNY3-5p y s-RNY4-5p han sido recientemente identificados por los inventores. Por lo tanto, la invención también se refiere a un ácido nucleico aislado que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 9 (s-RNY3-5p) o SEQ ID NO: 11 (s-RNY4-5p).

s-RNY de Mus Musculus incluyen s-RNY1-5p de Mus Musculus (SEQ ID NO: 14) y s-RNY1-3p de Mus Musculus (SEQ ID NO: 15) ambos derivados de mRNY1 mediante el procesamiento en su lado 5' o 3', respectivamente, y s-RNY3-5p de Mus Musculus (SEQ ID NO: 16) y s-RNY3-3p de Mus Musculus (SEQ ID NO: 17) ambos derivados de mRNY3 mediante el procesamiento en su lado 5' o 3', respectivamente.

En una realización, dicho al menos un biomarcador se selecciona del grupo que consiste en s-RNY1-5p (SEQ ID NO: 7), s-RNY1-3p (SEQ ID NO: 8), s-RNY3-5p (SEQ ID NO: 9), s-RNY3-3p (SEQ ID NO: 10), s-RNY4-5p (SEQ ID NO: 11), s-RNY4-3p (SEQ ID NO: 12), y s-RNY5-3p (SEQ ID NO: 13) o variantes de los mismos.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "variante" de un s-RNY indica secuencias de ácidos nucleicos que tienen al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de ácido nucleico con una secuencia de ácido nucleico descrita en este documento. Preferiblemente, una secuencia de ácido nucleico variante tendrá al menos aproximadamente 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92% , 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia de ácido nucleico sobre la longitud completa de una secuencia de ácido nucleico tal como se describe en el presente documento. La identidad de secuencia de ácido nucleico se puede calcular mediante procedimientos bien conocidos para un experto en la técnica. El porcentaje de identidad se puede calcular mediante la realización de una alineación global por parejas basada en el algoritmo de alineación de Needleman-Wunsch para encontrar la alineación óptima (incluidos los huecos) de dos secuencias a lo largo de toda su longitud, por ejemplo, utilizando Needle, y el uso de la matriz DNAFULL con una penalización de apertura de hueco de 10 y una penalización de extensión de hueco de 0,5. Con ese fin, las secuencias de ARN serían escritas en bases de ADN.

En el marco de la invención, se puede determinar el nivel de expresión de dos, tres o más biomarcadores de acuerdo con la invención.

En una realización, el nivel de expresión de al menos un biomarcador se compara con un valor de referencia.

Según la invención, un nivel de expresión de al menos un biomarcador de la invención superior al valor de referencia es indicativo de que el individuo ha desarrollado o se encuentra en riesgo de desarrollar un trastorno relacionado con la aterosclerosis.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "determinar" incluye la detección cualitativa y/o cuantitativa (es decir, detectar y/o medir el nivel de expresión) con o sin referencia a un control o un valor predeterminado. Como se usa en este documento, "detectar" significa la determinación de si s-RNY está presente o no en una muestra biológica y "medir" significa la determinación de la cantidad de un s-RNY en una muestra biológica. Habitualmente, el nivel de expresión de un s-RNY puede determinarse por ejemplo mediante RT-PCR realizada en una muestra biológica y más particularmente un procedimiento de RT-PCR de stem-loop, tal como se describe en Chen et al., (2005) Nucleic Acids Res. 2005 Nov 27; 33 (20): e179.

Por ejemplo, de acuerdo con el procedimiento de la invención, la determinación de un nivel de expresión de al menos s-RNY1-5p (SEQ ID NO: 7), s-RNY1-3p (SEQ ID NO: 8), s-RNY3- 5p (SEQ ID NO: 9) o s-RNY4-5p (SEQ ID NO: 11) superior a sus respectivos valores de referencia es indicativo de que el individuo ha desarrollado o está en riesgo de desarrollar un trastorno relacionado con la aterosclerosis.

El término "el nivel de expresión de un biomarcador es superior al valor de referencia" como se usa en el presente documento, significa que hay un aumento estadísticamente significativo entre el nivel de expresión de dicho biomarcador, tal como se determina en la muestra biológica, y el valor de referencia. En una realización, el nivel de biomarcador puede ser comparado con el valor de referencia usando la relación del nivel de dicho biomarcador en comparación con el valor de referencia o usando el valor de p.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "valor de referencia" se refiere a la cantidad de un s-RNY en muestras biológicas obtenida a partir de la población general o de una población seleccionada de individuos. El valor de referencia predeterminado puede ser un valor umbral o un intervalo. Por ejemplo, la población seleccionada puede estar compuesta de sujetos aparentemente sanos, tales como personas que no han tenido previamente cualquier signo o síntoma que indique la presencia de un trastorno relacionado con la aterosclerosis.

El valor de referencia puede ser cualquier número de medidas estadísticas para distinguir entre un nivel indicativo de que un individuo ha desarrollado o está en riesgo de desarrollar un trastorno relacionado con la aterosclerosis y un nivel indicativo de que un individuo no ha desarrollado o no está en riesgo de desarrollar un trastorno relacionado con la aterosclerosis, incluyendo los niveles de expresión promedio y mediana, y/o expresión de s-RNY corte o umbral o valores del número de cambio, tal como se determina en un individuo o un grupo de individuos.

El nivel de expresión de ARN Y pequeños se puede medir mediante el uso de técnicas similares como se puede usar para cuantificar la transcripción de genes, en particular, ensayos basados en la hibridación directa y ensayos basados en la amplificación, con una cierta adaptación experimental, bien conocidos en la técnica, debido a las secuencias cortas de los ARN Y pequeños. Por ejemplo, la transcripción inversa del ARN Y pequeño a ADNc se realizó utilizando cebadores hairloop, tal como se ha desarrollado por la compañía Applied Biosystems (Perkin Elmer).

Por ejemplo, los ácidos nucleicos que tienen al menos 10 nucleótidos y que presentan complementariedad u homología de secuencia al s-RNY de interés en el presente documento encuentran utilidad como cebadores de amplificación. Se entiende que tales ácidos nucleicos no tienen que ser idénticos, pero son habitualmente al menos aproximadamente 80% idénticos con la región homóloga de tamaño comparable, más preferiblemente 85% idénticos y aún más preferiblemente 90-95% idénticos.

En ciertas realizaciones, será ventajoso emplear ácidos nucleicos en combinación con medios apropiados, tales como un marcador detectable, para detectar la hibridación. Una amplia variedad de indicadores apropiados son conocidos en la técnica incluyendo, ligandos fluorescentes, radiactivos, enzimáticos u otros ligandos (por ejemplo, avidina/biotina).

Los cebadores son habitualmente ácidos nucleicos de cadena sencilla más cortos, de entre 10 a 25 nucleótidos de longitud, diseñados para adaptarse perfectamente a o casi a la perfección con un ácido nucleico de interés, a amplificar. Los cebadores son "específicos" a los ácidos nucleicos a los que se hibridan, es decir, preferiblemente se hibridan en condiciones de hibridación de alta rigurosidad (correspondiente a la temperatura de fusión más alta, Tf, por ejemplo, formamida al 50%, 5x o 6x SCC. SCC es un NaCl 0,15 M, citrato de Na 0,015 M).

En una realización particular, los procedimientos de la invención comprenden las etapas de proporcionar el total de los ARN extraídos de una muestra biológica, tal como una muestra de sangre y someter los ARN a amplificación con cebadores específicos, más particularmente mediante una RT-PCR cuantitativa o semi-cuantitativa, tal como se describe a continuación.

Según una realización, dicho al menos un biomarcador se selecciona del grupo que consiste en s-RNY1-5p (SEQ ID NO: 7), s-RNY1-3p (SEQ ID NO: 8), s-RNY3-5p (SEC ID NO: 9), y s-RNY4-5p (SEQ ID NO: 11).

De hecho, s-RNY1-3p, s-RNY1-5p, s-RNY3-5p, y s-RNY4-5p se han identificado como inducidos por estímulos aterorelevantes en los macrófagos derivados de médula ósea (BMDM) o macrófagos primarios humanos. Por otra parte, se ha encontrado que s-RNY1-3p tiene un único sitio de unión en el ARNm de factor 2 de tipo Kruppel (KLF2) y s-RNY1-3p regula por disminución el gen de KLF2 en el nivel post-transcripcional en macrófagos cargados de lípidos. KLF2 tiene un papel anti-apoptótico y un papel anti-inflamatorio en los macrófagos y es conocido como un gen crítico en la regulación de la patogénesis de la aterosclerosis. Adicionalmente, s-RNY1-5p y s-RNY4-5p se detectaron en el suero humano y se encontraron como no regulados en pacientes con CAD en suero en comparación con los individuos de control. Los inventores encontraron además que s-RNY1-5p y s-RNY4-5p se correlacionaron positivamente con los lípidos proaterogénicos y se correlacionaron negativamente con marcadores de HDL. Los marcadores de HDL se asocian con un menor riesgo de trastorno relacionado con la aterosclerosis. En una realización preferida, el procedimiento de diagnóstico o pronóstico de un trastorno relacionado con la aterosclerosis comprende la etapa de determinar el nivel de expresión de un ácido nucleico de secuencia de s-RNY1-5p (SEQ ID NO: 7) y/o s-RNY4 -5p (SEQ ID NO: 11). Preferiblemente, la muestra biológica es una muestra de fluido, en particular, sangre entera, plasma o suero.

Según otra realización, el procedimiento de diagnóstico o pronóstico de un trastorno relacionado con la aterosclerosis comprende la etapa de determinar el nivel de expresión de al menos un biomarcador seleccionado del grupo que consiste en s-RNY1-5p (SEQ ID NO: 7), s-RNY1-3p (SEQ ID NO: 8), s-RNY3-5p (SEQ ID NO: 9), y s-RNY4-5p (SEQ ID NO: 11).

El término "muestra biológica" se refiere a una muestra biológica obtenida con el propósito de la evaluación in vitro. Las muestras biológicas que pueden ser utilizadas para realizar los procedimientos de acuerdo con la invención abarcan cualquier muestra biológica derivada de un paciente que contiene ARN y más particularmente s-RNY, incluyendo cualquier fluido, tejido, muestras celulares, órganos, biopsias, etc. Las muestras habituales que se utilizan en los procedimientos de acuerdo con la invención son muestras de sangre (por ejemplo, muestra de sangre entera), plasma o suero. En una realización preferida, dicha muestra de sangre es una muestra de sangre entera obtenida de un paciente a analizar.

El término "paciente" o "individuo" puede ser, por ejemplo un mamífero humano o no humano (tal como un roedor (ratón, rata), un felino, un canino o un primate) afectados por o que puede verse afectado por un trastorno relacionado con la aterosclerosis. Preferiblemente, el paciente o el individuo es un ser humano. El paciente puede presentar factores de riesgo para el desarrollo de un trastorno relacionado con la aterosclerosis, tales como la obesidad, la diabetes y la hipertensión. Preferiblemente, el procedimiento de la invención comprende además la etapa de determinar el nivel de expresión de al menos un lípido proaterogénico, preferiblemente triglicéridos, lipoproteína que contiene ApoB o ApoE y/o marcadores de HDL, preferiblemente HDL-C y apoA-I.

Procedimientos de tratamiento

Los inventores mostraron que la expresión de s-RNY es inducida en macrófagos expuestos a diversos tipos de estímulos apoptóticos, incluyendo aquellos que son relevantes para el desarrollo de la aterosclerosis (ejemplo 2). También se ha demostrado que la expresión s-RNY afecta a la modulación de la expresión génica en macrófagos cargados de lípidos mediante la regulación de forma directa, a nivel post-transcripcional, un subconjunto crítico de ARNm de la patogénesis de desarrollo de la aterosclerosis (ejemplo 4). Adicionalmente, los s-RNY inducidos por estímulos aterogénicos son un componente intrínseco de la maquinaria que regule la apoptosis en los macrófagos cargados de lípidos, a través de la activación de los mecanismos de p38 y de NF-KB para promover en última instancia la muerte celular y la respuesta proinflamatoria en macrófagos (ejemplo 5). En conjunto, estos resultados identifican los s-RNY como responsables de regular las vías proinflamatorias y proapoptóticas en los macrófagos cargados de lípidos.

Así, la descripción también se refiere a un inhibidor de un ARN Y pequeño (s-RNY) para su uso como un medicamento. La invención además se refiere a un inhibidor de un s-RNY para su uso en el tratamiento de un trastorno relacionado con la aterosclerosis.

El inhibidor de un s-RNY puede ser dirigido contra cualquier s-RNY como se define anteriormente, es decir, cualquier s-RNY humano o variante del mismo.

Según una realización, dicho inhibidor de s-RNY es un inhibidor de un s-RNY seleccionado del grupo que consiste en s-RNY1-5p (SEQ ID NO: 7), s-RNY1-3p (SEQ ID NO: 8), s-RNY3-5p (SEQ ID NO: 9) o s-RNY4-5p (SEQ ID NO: 11).

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "inhibidor de s-RNY" se refiere a un compuesto que inhibe o reduce la actividad biológica de s-RNY. La actividad biológica de s-RNY depende de la cantidad del ácido nucleico de s-RNY (es decir, su nivel de expresión), así como de la cantidad de r Ny a partir de la cual se procesa y se madura s-RNY, o de la interacción de s-RNY con sus secuencias diana.

Por lo tanto, el inhibidor de s-RNY puede reducir o inhibir la expresión de s-RNY (es decir, inhibir el procesamiento de RNY, por ejemplo, mediante la inhibición de la interacción de RNY con su pareja de unión) o reducir o inhibir la capacidad de interacción de s-RNY con sus secuencias diana.

"Expresión de s-RNY" se refiere a los acontecimientos de modificación de RNY post-transcripcional, mediante escisión y maduración, para proporcionar un s-RNY funcional, en particular cualquier reacción que da lugar a la inhibición del procesamiento de RNY.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "secuencia diana" de s-RNY de acuerdo con la invención es una secuencia a la que s-RNY se hibrida específicamente los. Una secuencia diana interacciona con un s-RNY mediante un emparejamiento de bases Watson-Crick, e incluye, por ejemplo, ARNm del factor 2 de tipo Krüppel (KLF2), tal como se describe en la sección de Ejemplos a continuación.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "pareja de unión" se refiere a una molécula (peptídica o no peptídica) que interactúa directamente con el biomarcador de la invención. Preferiblemente, dicha pareja de unión es una pareja de proteína o una pareja de proteína de fusión o su dominio de unión o un anticuerpo, variantes de anticuerpos, moléculas derivadas de anticuerpos. Preferiblemente, dicha pareja de unión es una proteína implicada en la maduración de hRNY1, hRNY3, hRNY4 o hRNY5.

En particular, se ha identificado por los inventores que, en los macrófagos incubados con estímulos aterogénicos, la generación de s-RNY requiere Ago2 y la proteína de unión a ARN de cadena simple hnRNP A1 que forma parte del complejo de ribonucleoproteínas. Por otra parte, los RNY, los precursores de s-RNY, se asocian con las proteínas Ro60 y La/SSB para formar el complejo de ribonucleoproteínas Ro. Por consiguiente, un inhibidor de s-RNY puede ser una molécula que inhibe o reduce la interacción de RNY con Ago2, complejo de ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas (hnRNPs), Ro60 o La/SSB, o una molécula que inhibe o reduce el procesamiento de Ago2 de RNY.

"Complejo de ribonucleoproteínas (RNP) Ro" o partículas de ribonucleoproteínas RO (RNPs) contienen al menos tres proteínas: la proteína La, que está implicada en la terminación correcta de la transcripción de ARN polimerasa III y las proteínas Ro específicas de RNP de 52 kDa (Ro52) y 60 kDa (Ro60). Las RNP Ro pueden contener componentes adicionales, tales como componentes de ARN. Los componentes de ARN de RNP Ro en células humanas consisten en uno de cada cuatro RNY pequeños diferentes. Ro60 (también conocido como Ro/SSA) es una proteína de la secuencia SEQ ID NO: 20 (P10155.2 GI: 52788235). La (también conocida como SSB o La/SSB) es una proteína de la secuencia SEQ ID NO: 21 (La/SSB: gi|10835067|ref|NP_003133.1).

Proteína Argonauta-2 (Ago2) es una enzima de la secuencia de SEQ ID NO: 18 (Acc No gi|29171734|ref|NP_036286.2). Ago2 tiene una actividad endorribonucleasa para ARN de doble cadena y es el componente catalítico del complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). Ago2 está implicada en jugar un papel en el silenciamiento de genes mediada por ARN de interferencia cortos.

Las ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas A1 (hnRNP A1) es una proteína de desplazamiento núcleocitoplasma de la secuencia de SEQ ID NO: 19 (Acc No gi|4504445|ref|NP_002127.1) con funciones en muchos aspectos del metabolismo de ARN. Las hnRNP están asociadas con pre-ARNm en el núcleo y parecen influir en el procesamiento de pre-ARNm y otros aspectos del metabolismo y transporte de ARNm. hnRNP A1 está involucrado en el empaquetamiento de pre-ARNm en partículas hnRNP, transporte de poli (A) ARNm desde el núcleo hasta el citoplasma y puede modular la selección del sitio de empalme.

De acuerdo con una realización, el inhibidor de s-RNY es un inhibidor de la expresión génica de al menos una proteína seleccionada del grupo que consiste en Ago2 (SEQ ID NO: 18), complejo de ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas (hnRNP, tales como hnRNP A1 de la secuencia SEC ID NO: 19), Ro60 (SEQ ID NO: 20) y La/SSB (SEQ ID NO: 21). Preferiblemente, dicho inhibidor de s-RNY previene o reduce el procesamiento de RNY en s-RNY.

Un "inhibidor de la expresión génica" se refiere a cualquier compuesto natural o sintético que tiene un efecto biológico para inhibir la expresión de un gen.

Por lo tanto, un "inhibidor de la expresión génica de Ago2" indica un compuesto natural o sintético que tiene un efecto biológico para inhibir la expresión de la expresión génica de Ago2.

Por lo tanto, un "inhibidor de la expresión génica de hnRNP A1" indica un compuesto natural o sintético que tiene un efecto biológico para inhibir la expresión de la expresión génica de hnRNP A1.

Por lo tanto, un "inhibidor de la expresión génica de Ro60" indica un compuesto natural o sintético que tiene un efecto biológico para inhibir la expresión de la expresión génica de Ago2.

Por lo tanto, un "inhibidor de la expresión génica de La/SSB" indica un compuesto natural o sintético que tiene un efecto biológico para inhibir la expresión de la expresión génica de hnRNP A1.

En una realización de la invención, dicho inhibidor de la expresión génica es un siRNA.

Los ARN inhibidores pequeños (siRNAs) pueden funcionar como inhibidores de la expresión de genes para uso en la invención. La expresión génica se puede reducir con un ARN pequeño de doble cadena (dsRNA), o un vector o constructo que causa la producción de un ARN pequeño de doble cadena, de manera que la expresión del gen se inhibe específicamente (es decir, interferencia de a Rn o ARNi). Los procedimientos para la selección de un dsRNA apropiado o vector de codificación de dsARN son bien conocidos en la técnica para genes cuya secuencia se conoce (por ejemplo, ver Tuschi, T. et al (1999); Elbashir, SM et al (2001); Hannon, GJ. (2002); McManus, MT et al (2002); Brummelkamp, TR et al (2002); Patentes de Estados Unidos n° 6.573.099 y 6.506.559; Patentes Internacionales n° WO 01/36646, WO 99/32619, y WO 01/68836).

En una realización particular, la secuencia del siRNA que reconoce Ago2 está representada por SEQ ID NO: 22.

En una realización particular, la secuencia del siRNA que reconoce hnRNP está representada por SEQ ID NO: 23.

En una realización particular, la secuencia del siRNA que reconoce Ro60 está representada por SEQ ID NO: 24.

En una realización particular, la secuencia del RNAsi que reconoce La/SSB está representada por SEQ ID NO: 25.

Según otra realización, el inhibidor de s-RNY interactúa específicamente con al menos un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en hRNY1 (SEQ ID NO: 1), hRNY3 (SEQ ID NO: 2), hRNY4 (SEQ ID NO: 3) y hRNY5 (SEQ ID NO: 4), preferentemente que consiste en SEQ ID NO: 1 (hRNY1) y SEQ ID NO: 2 (hRNY3).

Habitualmente, dicho inhibidor de s-RNY puede ser un inhibidor de la interacción entre la proteína Ago2 o complejo de ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas (hnRNPs) y al menos un RNY, en particular un RNY seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 (hRNY1) y SEQ ID NO: 2 (hRNY3).

Tal como se usa en el presente documento, los términos "inhibidor de la interacción" significa la prevención o reducción de la asociación directa o indirecta de una o más moléculas, ácidos nucleicos, péptidos, proteínas. Como se usa en este documento, el término "inhibidor de la interacción entre Ago2 o el complejo de ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas (hnRNPs) y al menos un RNY" es una molécula que puede prevenir la interacción entre Ago2 o hnRNPs con al menos un RNY por la competición o mediante la fijación a una de las moléculas.

Los s-RNY proporcionan una nueva herramienta identificada para controlar la expresión de genes diana. Más particularmente, los s-RNY permiten la inhibición de la expresión de dichos genes diana mediante la explotación de una maquinaria asociada a Ago2 para provocar la degradación de ARNm que contienen secuencias complementarias a s-RNY. Una posible forma de interferir con la actividad de s-RNY, es utilizar oligonucleótidos (ODN) que comprende secuencias de ácido nucleico complementarias de estos s-RNY como competidores de la secuencia endógena dentro de los ARNm de los genes diana, para la unión a s-RNY. Al igual que los elementos naturales, los señuelos son capaces de unirse a s-RNY. Por lo tanto, cuando estos elementos están en excedencia atraerán los s-RNY lejos de elementos transcripcionales naturales. Cuando se evita que los factores de regulación, s-RNY, en particular, se unan a sus secuencias diana, sus efectos reguladores sobre la expresión de genes están generalmente impedidos. La estrategia de señuelo tiene como objetivo proporcionar un excedente intracelular de ODN que se unen a s-RNY, secuestrándolos así de su sitio o sitios naturales. De esta manera, se evita la degradación de ARNm inducida por s-RNY.

Los inhibidores de dichos s-RNY para su uso en la invención pueden estar basados en constructos de oligonucleótidos antisentido (ODN). Los oligonucleótidos antisentido, incluyendo moléculas de ARN anti-sentido y moléculas de ADN anti-sentido, actuarían para bloquear directamente la actividad de s-RNY mediante la unión al mismo y por lo tanto evitando la unión que conduce a la degradación del ARNm.

Por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido de al menos aproximadamente 15 bases y complementarios a regiones únicas de la secuencia de transcripción de s-RNY se pueden sintetizar, por ejemplo, mediante técnicas de fosfodiéster convencionales y administrarse mediante, por ejemplo, inyección intravenosa o infusión. Los procedimientos para utilizar técnicas antisentido para inhibir específicamente la expresión génica de genes cuya secuencia se conoce son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, véanse las patentes de Estados Unidos N° 6.566.135; 6,566,131; 6,365,354; 6,410,323; 6,107,091; 6,046,321; y 5,981,732). Debe observarse además que los oligonucleótidos antisentido pueden ser modificados con fosforotioato para evitar su hidrólisis in vivo por nucleasas. Tales modificaciones son bien conocidas en la técnica. Los oligonucleótidos antisentido útiles como inhibidores de inhibidores de s-RNY se pueden preparar mediante procedimientos conocidos. Estos incluyen técnicas para la síntesis química, tal como, por ejemplo, mediante síntesis química de fosforamidita en fase sólida. Alternativamente, se pueden generar moléculas de ARN anti-sentido mediante transcripción in vitro o in vivo de secuencias de ADN que codifican la molécula de ARN. Tales secuencias de ADN se pueden incorporar en una amplia variedad de vectores que incorporan promotores de ARN polimerasa adecuados tales como promotores de polimerasa T7 o SP6.

Diversas modificaciones a los oligonucleótidos de la invención se pueden introducir como medio de aumentar la estabilidad intracelular y la vida media. Las modificaciones posibles incluyen, pero no se limitan a, la adición de secuencias flanqueantes de ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos a los extremos 5' y/o 3' de la molécula, o el uso de fosforotioato o 2'-O-metilo en lugar de enlaces fosfodiesterasa dentro del esqueleto de oligonucleótidos.

Por consiguiente, en una realización preferida, el inhibidor de dicho s-RNY es un ácido nucleico que hibrida específicamente con al menos una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en s-RNY1-5p (SEQ ID NO: 7), s-RNY1- 3p (SEQ ID NO: 8), s-RNY3-5p (SEQ ID NO: 9), s-RNY3-3p (SEQ ID NO: 10), s-RNY4-5p (SEQ ID NO: 11), s- RNY4-3p (SEQ ID NO: 12), y s-RNY5-3p (SEQ ID NO: 13) o variantes de los mismos.

Habitualmente, dicho inhibidor es un ácido nucleico de secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 22 (siRNA que reconoce Ago2), SEQ ID NO: 23 (siRNA que reconoce hnRNP), SeQ ID NO: 24 (siRNA que reconoce Ro60), SEQ ID NO: 26 (2 '-OMe-ARN antisentido a s-RNY1-5p humano o de ratón), y SEQ ID NO: 54 (2'OMe-ARN antisentido a s-RNY4-5p humano: 5'-AGUUCUGAUAACCCACUACCAUCGGACCAGCC-3').

La descripción se refiere además a un procedimiento de tratamiento de un trastorno relacionado con la aterosclerosis, que comprende administrar a un paciente en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de un s-RNY.

De acuerdo con una realización, dicho s-RNY se selecciona del grupo que consiste en s-RNY1-5p (SEQ ID NO: 7), s-RNY1-3p (SEQ ID NO: 8), s-RNY3-5p (SEQ ID NO: 9) y s-RNY4-5p (SEQ ID NO: 11).

El inhibidor de un s-RNY se formula ventajosamente en una composición farmacéutica junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

"Farmacéuticamente" o "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica u otra cuando se administra a un mamífero, especialmente un ser humano, según sea apropiado. Un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable se refiere a una carga sólida, semisólida o líquida no tóxico, diluyente, material de encapsulación o auxiliar de formulación de cualquier tipo.

La forma de las composiciones farmacéuticas, la vía de administración, la dosis y el régimen naturalmente dependerán de la afección a tratar, la gravedad de la enfermedad, la edad, el peso y el sexo del paciente, etc.

Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden formular para una administración tópica, oral, intraocular, intravenosa, intramuscular o subcutánea y similares.

Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas contienen vehículos que son farmacéuticamente aceptables para una formulación capaz de ser inyectada. Estas pueden ser, en particular, soluciones isotónicas, estériles, salinas (fosfato monosódico o fosfato de disodio, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio y similares, o mezclas de tales sales), o composiciones secas, especialmente liofilizadas, que tras la adición, dependiendo del caso, de agua esterilizada o de suero fisiológico, permiten la constitución de soluciones inyectables.

Las dosis utilizadas para la administración pueden adaptarse en función de varios parámetros, y en particular en función del modo de administración utilizado, de la patología pertinente, o alternativamente de la duración deseada del tratamiento. Por ejemplo, está dentro de la experiencia de la técnica comenzar con dosis del compuesto a niveles inferiores a los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosificación hasta que se consiga el efecto deseado. Sin embargo, la dosis diaria de los productos puede variar en un amplio intervalo de 0,01 a 1000 mg por adulto por día. Preferiblemente, las composiciones contienen 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100, 250 y 500 mg del ingrediente activo para el ajuste sintomático de la dosificación al sujeto a tratar. Un medicamento habitualmente contiene de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 500 mg del ingrediente activo, preferiblemente de 1 mg a aproximadamente 100 mg del ingrediente activo. Una cantidad eficaz del fármaco se suministra normalmente a un nivel de dosificación de 0,0002 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal por día, especialmente de aproximadamente 0,001 mg/kg a 7 mg/kg de peso corporal por día.

Según la invención, “tratamiento” incluye tanto el tratamiento terapéutico como el tratamiento profiláctico o preventivo, en el que el objetivo es prevenir o ralentizar la afección o trastorno patológico objetivo. Los que están en necesidad de tratamiento incluyen aquellos que ya tienen el trastorno, así como los propensos a tener el trastorno o aquellos en los que el trastorno debe prevenirse. El término "tratar" incluye reducir, aliviar o inhibir o eliminar los síntomas o el progreso de un trastorno.

El tratamiento de acuerdo con la invención incluye un procedimiento de tratamiento de un trastorno relacionado con la aterosclerosis, que comprende administrar a un paciente en necesidad de tratamiento, un inhibidor del s-RNY o la composición farmacéutica que contiene dicho inhibidor. Preferentemente, el tratamiento comprende además administrar a dicho paciente un fármaco anti-aterosclerosis, tal como secuestrante de ácidos biliares, niacina (ácido nicotínico), las estatinas (inhibidores de la HMG-CoA reductasa), fibratos o probucol, o combinaciones de los mismos.

Preferiblemente, se administra una cantidad eficaz, preferiblemente una cantidad terapéuticamente eficaz del inhibidor del s-RNY de la invención. Una "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico o profiláctico deseado. La cantidad eficaz puede variar de acuerdo con el fármaco con el que se coadministra el inhibidor del s-RNY.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un inhibidor del s-RNY de la invención puede variar según factores, tales como el estado de enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad del inhibidor de s-RNY para provocar un resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz abarca una cantidad en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del inhibidor de s-RNY es superada por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una cantidad terapéuticamente eficaz también abarca una cantidad suficiente para conferir beneficios, por ejemplo, un beneficio clínico.

La descripción proporciona un procedimiento de tratamiento de un trastorno relacionado con la aterosclerosis, que comprende las etapas de:

a) diagnosticar o pronosticar un trastorno relacionado con la aterosclerosis en un individuo mediante la determinación del nivel de expresión de al menos un biomarcador que consiste en un ARN Y pequeño (s-RNY) en una muestra biológica de dicho individuo, como se describe anteriormente, y

b) administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de fármaco anti-aterosclerosis a dicho individuo diagnosticado o pronosticado con un trastorno relacionado con la aterosclerosis.

De acuerdo con dicho aspecto, la invención se refiere también a un medicamento anti-aterosclerosis para su uso en el tratamiento de un trastorno relacionado con la aterosclerosis en un individuo, en el que el individuo se ha diagnosticado o pronosticado con un trastorno relacionado con la aterosclerosis mediante la determinación del nivel de expresión de al menos un biomarcador que consiste en un ARN Y pequeño (s-RNY) en una muestra biológica de dicho individuo. En particular, dicho uso puede comprender el diagnóstico o pronóstico de la persona con un trastorno de trastorno relacionado con la aterosclerosis mediante la medición del nivel de expresión de al menos un biomarcador que consiste en un ARN Y pequeño (s-RNY) en una muestra biológica de dicho individuo.

De acuerdo con dicho aspecto de la invención, el fármaco anti-aterosclerosis puede ser, sin limitación, un secuestrante de ácidos biliares, niacina (ácido nicotínico), estatinas (inhibidores de la HMG-CoA reductasa), fibratos o probucol, un inhibidor de s-RNY como se describe anteriormente, o combinaciones de los mismos.

Un procedimiento para el cribado de un compuesto adecuado para el tratamiento y/o prevención de un trastorno relacionado con la aterosclerosis

La invención además se refiere a un procedimiento de cribado de un compuesto adecuado para el tratamiento de un trastorno relacionado con la aterosclerosis, que comprende las etapas de:

a) poner en contacto un compuesto candidato con un s-RNY o un RNY,

b) identificar como un compuesto adecuado para el tratamiento de un trastorno relacionado con la aterosclerosis, que inhibe la maduración de dicho RNY en s-RNY o que inhibe la actividad de dicho s-RNY.

Dicho s-RNY puede ser s-RNY1-5p (SEQ ID NO: 7), s-RNY1-3p (SEQ ID NO: 8), s-RNY3-5p (SEQ ID NO: 9), s-RNY3-3p (SEQ ID NO: 10), s-RNY4-5p (SEQ ID NO: 11), s-RNY4-3p (SEQ ID NO: 10), s-RNY5-3p (SEQ ID NO: 13) o variantes de los mismos. Preferiblemente, dicho s-RNY se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7 (s-RNY1-5p), SEQ ID NO: 9 (s-RNY3-5p), SEQ ID NO: 8 (s-RNY1-3p) y SEQ ID NO: 11 (s-RNY4-5p) o una variante de los mismos.

Dicho RNY puede ser RNY1, RNY3, RNY4 o RNY5, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 (hRNY1), SEQ ID NO: 2 (hRNY3) y SEQ ID NO: 3 (hRNY4), aún más preferentemente SEQ ID NO: 1 (hRNY1), SEQ ID NO: 2 (hRNY3).

Según la invención, un compuesto adecuado para el tratamiento de un trastorno relacionado con la aterosclerosis puede inhibir la interacción de un RNY con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 18 (Ago2), SEQ ID NO: 20 (Ro60), SEQ ID NO: 19 (hnRNP A1) y SEQ ID NO: 21 (La/SSB).

Habitualmente, la determinación de la capacidad de un compuesto candidato para inhibir la actividad de un s-RNY puede comprender la etapa de determinar el nivel de expresión de un polipéptido de secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 29 (c-Fos; gi\4885241\ref\NP_005243.1), SEQ ID NO: 30 (factor 2 del tipo Kruppel (KLF2) gi|7706469|ref|NP_057354.1), SEQ ID NO: 31 (Zfyve28 gi\187953521\gb\AAI37311.1), SEQ ID NO: 32 (familia-1 romboidal (Rhbdf1) gi|190341097|ref|NP_071895.3), SEQ ID NO: 33 (Fgfr1, gi\105990522\ref\NP_075598.2), SEQ ID NO : 34 (lisil oxidasa (LOX) gi|20149540|ref|NP_002308.2) y SEQ ID NO: 35 (Nr4A1 (también conocido como Nur77) gi|27894344|ref|NP_775180.1). Estos polipéptidos son conocidos por ser importantes en la regulación de la patogénesis de la aterosclerosis y se han identificado como potenciales s-RNY que dirigen ARNm diana por los inventores.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "proteína" o "polipéptido" se refiere a cualquier cadena de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, independientemente de la longitud o modificación post-traduccional.

El nivel de expresión de una proteína o un polipéptido puede determinarse mediante cualquier procedimiento conocido para un experto en la técnica. Tales procedimientos incluyen habitualmente procedimientos basados en la determinación de la expresión de ARNm correspondiente y procedimientos basados en la determinación del nivel de expresión de una proteína.

El nivel de expresión de una proteína o un polipéptido puede ser evaluada mediante la determinación de la expresión del ARNm correspondiente (productos de transcripción). Esta medición puede realizarse mediante diversos procedimientos que son bien conocidos por la persona experta en la técnica, incluyendo los procedimientos cuantitativos que implican PCR transcriptasa inversa (RT-PCR), tales como RT-PCR (qRT-PCR), y procedimientos que implican el uso de arrays (macroarrays o microarrays) de ADN e hibridación in situ.

El nivel de expresión de una proteína o un polipéptido puede ser evaluado mediante el uso de procedimientos inmunológicos. Los procedimientos inmunológicos adecuados incluyen inmunoensayos ligados a enzimas (ELISA), sándwich, ensayos de ELISA directos, indirectos, o competitivos, ensayos immunospot ligados a enzimas (ELIspot), radioinmunoensayos (RIA), ensayos de citometría de flujo (FACS), inmunohistoquímica, transferencia Western, ensayos de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), ensayos de chip de proteínas utilizando, por ejemplo, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, ligandos de receptores u otros agentes de unión a las proteínas codificadas por la secuencia. El nivel de expresión de tales proteínas se cuantifica utilizando tecnologías bien conocidas por el sector.

Cebadores y kits que contienen los mismos para usar en el diagnóstico o pronóstico de trastornos relacionados con la aterosclerosis

La invención se refiere al uso de una pareja de cebadores adecuados para la amplificación de un s-RNY en el diagnóstico o pronóstico de un trastorno relacionado con la aterosclerosis.

La presenta invención también se refiere al uso de una sonda que se hibrida específicamente a un s-RNY para diagnosticar o pronosticar un trastorno relacionado con la aterosclerosis. Por consiguiente, el uso de un ácido nucleico que se hibrida específicamente a una secuencia de ácido nucleico que consiste en SEQ ID NO: 9 (s-RNY3-5p) o SEQ ID NO: 11 (s-RNY4-5p) se proporciona como una sonda para el diagnóstico o pronóstico de un trastorno relacionado con aterosclerosis.

Dicho s-RNY puede ser s-RNY1-5p (SEQ ID NO: 7), s-RNY1-3p (SEQ ID NO: 8), s-RNY3-5p (SEQ ID NO: 9), s-RNY3-3p (SEQ ID NO: 10), s-RNY4-5p (SEQ ID NO: 11), s-RNY4-3p (SEQ ID NO: 12), s-RNY5-3p (SEQ ID NO: 13) o variantes de los mismos. Preferiblemente, dicho s-RNY se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7 (s-RNY1-5p), SEQ ID NO: 9 (s-RNY3-5p), SEQ ID NO: 8 (s-RNY1-3p) y SEQ ID NO: 11 (s-RNY4-5p) o variantes de los mismos.

El término "sonda" se refiere a un ácido nucleico aislado capaz de hibridarse a un ácido nucleico diana. Un marcador o molécula informadora detectable puede unirse a una sonda. Los marcadores típicos incluyen isótopos radiactivos, sustratos enzimáticos, cofactores, ligandos, agentes quimioluminiscentes o fluorescentes, haptenos y enzimas. Se discuten procedimientos para el marcaje y guía en la elección de las marcadores apropiadas para diversos fines, por ejemplo, en Sambrook et al. ((1989) Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor). Las sondas son preferiblemente de al menos 12, 15, 20, 25, o 30 nucleótidos de largo. Las sondas pueden ser de menos de 60, 50, 40 o preferiblemente 35 nucleótidos de longitud.

Las sondas se pueden utilizar para el diagnóstico o pronóstico de un trastorno relacionado con la aterosclerosis mediante la identificación de que al menos un s-RNY como se describe anteriormente, en particular un s-RNY seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7 (s-RNY1-5p), SEQ ID NO: 9 (s-RNY3-5p), SEQ ID NO: 8 (s-RNY1-3p) y SEQ ID NO: 11 (s-RNY4-5p) o variantes de los mismos está sobreexpresado en una muestra biológica en comparación con una muestra de control o un valor de referencia. El contacto de una muestra de ARN total (transcriptoma) de una muestra biológica con la sonda en condiciones que permiten la hibridación de la sonda con su correspondiente fragmento en el ácido nucleico, da como resultado la formación de un híbrido de ácido nucleico/sonda. La formación de este híbrido puede detectarse (por ejemplo, mediante el marcaje del ácido nucleico o la sonda), con lo cual la formación de este híbrido indica la expresión de la secuencia correspondiente. Tales procedimientos de identificación basados en hibridación con una sonda específica (sea sobre un soporte de fase sólida o en solución) han sido descritos en la técnica. La sonda específica es preferiblemente una secuencia que, en condiciones optimizadas, se hibrida específicamente con al menos un s-RNY seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7 (s-RNY1-5p), SEQ ID NO: 9 (s-RNY3 -5p), SEQ ID NO: 8 (s-RNY1-3p) y SEQ ID NO: 11 (s-RNY4-5p).

Preferiblemente, la sonda comprende una secuencia que es al menos 80%, preferiblemente entre 80 y 85%, más preferiblemente entre 85 y 90%, especialmente preferiblemente entre 90 y 95%, lo más preferiblemente entre 95% y 100% idéntica (o complementaria) a la secuencia de nucleótidos de una región específica. Preferiblemente, la sonda comprenderá una secuencia de aproximadamente 15 a aproximadamente 40, o 20 a aproximadamente 40 y, en particular, 15, 20, 25, 30, 35, 38, o todos los nucleótidos contiguos idénticos (o complementarios) a un s-RNY, en ^{particular a un s-RNY seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7 (s-RNY1-5p), SEQ} iD NO: 9 (s-RNY3-5p), SEQ ID NO: 8 (s-RNY1-3p ), SEQ ID NO: 11 (s-RNY4-5p), SEQ ID NO: 10 (s-RNY3-3p), SEQ ID NO: 12 (s-RNY4-3p) y SEQ ID NO: 13 (s-RNY5 -3P) o variantes de los mismos, preferiblemente, un s-RNY seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7 (s-RNY1-5p), SEQ ID NO: 9 (s-RNY3-5p), SEQ ID NO: 8 (s-RNY1-3p) y SEQ ID NO: 11 (s-RNY4-5p) o variantes de los mismos.

Una sonda de acuerdo con la invención pueden comprender, consistir o consistir esencialmente en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SeQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52. Preferiblemente, dicha sonda de acuerdo con la invención pueden comprender, consistir o consistir esencialmente en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 52.

El término "cebador" se entiende como moléculas cortas de ácido nucleico, tales como un oligonucleótido de ADN, que pueden hibridarse a una molécula de ácido nucleico diana complementaria mediante hibridación de ácido nucleico para formar un híbrido entre el cebador y la cadena de ácido nucleico diana. Un cebador se puede extender a lo largo de la molécula de ácido nucleico diana mediante una enzima polimerasa. Por lo tanto, los cebadores pueden usarse para amplificar una molécula de ácido nucleico diana. Se pueden usar pares de cebadores para la amplificación de una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, mediante PCR, PCR en tiempo real, u otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos conocidos en la técnica. Los procedimientos para preparar y utilizar cebadores se describen, por ejemplo, en Sambrook et al. ((1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York). Dicho cebador puede ser un cebador de sentido y/o un cebador antisentido, comprendiendo o consistiendo dicho cebador de sentido en 15 a 40 nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos que es idéntica o sustancialmente idéntica (es decir al menos 75%, 80%, 90%, 95% o 98% idéntica) a la secuencia de nucleótidos de un s-RNY, en particular a un s-RNY seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7 (s-RNY1-5p), SEQ ID NO: 9 (s -RNY3-5p), SEQ ID NO: 8 (s-RNY1-3p) y SEQ ID NO: 11 (s-RNY4-5p), o una variante de los mismos, y comprendiendo o consistiendo dicho cebador antisentido en 15 a 40 nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos que es idéntica o sustancialmente idéntica (es decir, al menos 75%, 80%, 90%, 95% o 98% idéntica) a la secuencia de nucleótidos de un s-RNY, en particular a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7 (s-RNY1-5p), SEQ ID NO: 9 (s-RNY3-5p), SEQ ID NO: 8 (s-RNY1-3p) y SEQ ID NO: 11 (s-RNY4-5p), o una variante de los mismos. Preferiblemente, los cebadores pueden ser de menos de 100, 50, 40, 25 o preferiblemente 20 nucleótidos de largo.

Un cebador de acuerdo con la invención pueden comprender, consistir o consistir esencialmente en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 40 , SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEC ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52. Preferiblemente, dicho cebador de acuerdo con la invención pueden comprender, consistir o consistir esencialmente en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 52.

La invención también se refiere a una pareja de cebadores adecuados para la amplificación de una secuencia de ácido nucleico que consiste en SEQ ID NO: 9 (s-RNY3-5p) o SEQ ID N^o : 11 (s-RNY4-5p), siendo ambos s-RNY recientemente identificados por los inventores.

La descripción también se refiere a una sonda que se hibrida específicamente a una secuencia de ácido nucleico que consiste en SEQ ID NO: 9 (s-RNY3-5p) o SEQ ID NO: 11 (s-RNY4-5p).

La descripción también proporciona una sonda o cebadores que se hibridan específicamente a un s-RNY, tal como se describe anteriormente, en particular a un s-RNY seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7 (s-RNY1-5p), SEQ ID NO: 9 (s-RNY3-5p), SEQ ID NO: 8 (s-RNY1-3p) y SEQ ID NO: 11 (s-RNY4-5p) o variantes de los mismos, para su uso para el diagnóstico o pronóstico de un trastorno relacionado con la aterosclerosis.

La descripción también se refiere a un kit que comprende medios para determinar el nivel de expresión de al menos un s-RNY, en particular de un s-RNY seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7 (s-RNY1-5p), SEQ ID NO: 9 (s-RNY3-5p), SEQ ID NO: 8 (s-RNY1-3p) y SEQ ID NO: 11 (s-RNY4-5p) o una variante de los mismos, tal como la pareja de cebadores y/o sondas de acuerdo con la invención.

Los kits pueden utilizarse para su uso en el diagnóstico o pronóstico de un trastorno relacionado con la aterosclerosis determinando el nivel de expresión de al menos un biomarcador de la invención. El kit puede comprender así una combinación de reactivos que permiten determinar el nivel de expresión de al menos un s-RNY, en particular de un s-RNY de la secuencia de SEQ ID NO: 7 (s-RNY1-5p), SEQ ID NO: 8 (s-RNY3-5p), SEQ ID NO: 9 (s-RNY1-3p) o SEQ ID NO: 11 (s-RNY4-5p) o una variante de los mismos y opcionalmente las instrucciones del fabricante para su uso en el diagnóstico o pronóstico de un trastorno relacionado con la aterosclerosis. Por consiguiente, comprende, para cada uno de los biomarcadores a ensayar, al menos una sonda o una pareja de cebadores que se hibridan selectivamente con dichos biomarcadores.

El kit puede comprender además al menos un valor de referencia.

La invención se describirá adicionalmente en vista de las siguientes figuras y ejemplos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: (A) Análisis bioinformático de la secuenciación de alto rendimiento de ARN pequeños que muestra la distribución de las diferentes clases de ARN pequeños identificados y la regulación por incremento de los ARN pequeños derivados de RNY. (B) (s-RNYs) en macrófagos primarios humanos estimulados con 1 pM de estaurosporina (STS) en los puntos de tiempo indicados.

Figura 2: (A) Análisis bioinformático de conjuntos de datos pequeños de secuencias de ARN pequeños que identifican una secuencia de consenso de ARN pequeños (los s-RNY) derivados de los RNYs en macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM) después del tratamiento de extracción de M-CSF durante 36 h . El gráfico de barras en la parte superior muestra la localización de los s-RNYs en RNYs. (B) Modelos de estructura secundaria de RNY de ratón utilizando servidor web RNAfold (http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi). Las puntas de flecha indican los s-RNY maduros, las flechas indican los sitios de escisión potenciales de Ago2 recombinante en un ensayo de procesamiento in vitro. Se destacan los supuestos sitios de unión de hnRNP A1.

Figura 3: (A) Análisis con RT-PCR cuantitativa de los s-RNY indicados en BMDM incubados durante 18 h con 10 mg/ml de LTA (ácido lipoteicoico) solo o en combinación con 0,25 pM de tapsigargina (Tg). Los datos se normalizaron por U2 snRNA. (B) Análisis con RT-PCR cuantitativa de los s-RNY indicados en BMDM incubados durante 28 h con 0,25 pM de tapsigargina (Tg) sola o tapsigargina en combinación con las concentraciones indicadas de LDL oxidada (LDL ox). Los datos se normalizaron por U2 snRNA y presentan como media y SD (n = 8). (C) Análisis con RT-PCR cuantitativa de los s-RNY indicados en BMDM incubados durante 28 h con 0,25 pM Tg en combinación con la concentración indicada de LDL acetilada (acLDL). Los datos se normalizaron por U2 snRNA.

Figura 4: (A) Análisis con RT-PCR cuantitativa de los s-RNY indicados en BMDM incubados durante 18 h con 0,25 pM de tapsigargina (Tg) con BSA, 0,25 mM de los ácidos grasos indicados en complejo con BSA, o tapsigargina más los ácidos grasos. Los datos se normalizaron por U2 snRNA y se presentan como media y SD (n = 8). Los ácidos grasos insaturados son el ácido linoleico (LA) y ácido oleico (OA), y los ácidos grasos saturados fueron ácido esteárico (SA) y ácido palmítico (PA). Análisis con RT-PCR cuantitativa de los s-RNY indicados en control o arcos aórticos con ApoE ~A (B) o LDLR ~A (C). Los ratones fueron alimentados con dieta de pienso o dieta alta en colesterol (HCD). Los datos se normalizaron por U2 snRNA y se presentan como media y SD (n = 8 para "B" y n = 5 para "C"). Prueba t de Student: * p <0,05; ** P <0,01.

Figura 5: La eficacia de la eliminación mediada por siRNAs SMARTPool comprados de Thermo Scientific se evaluó en BMDM. Después de 48 horas a partir de la transfección, el ARN total fue aislado y analizado por análisis de RT-PCR cuantitativa. Los datos se normalizaron por U2 snRNA y se presentan como media y SD (n = 4). Prueba t de Student: ** P <0,01.

Figura 6 : El agotamiento de los reguladores conocidos de las vías de biogénesis de ARN pequeños y el metabolismo del ARN muestra que la pérdida de La/SSB, Ro60, p53, Ago2, y hnRNP A1 (todo en gris claro) conduce a una reducción estadísticamente significativa (prueba t de Student: P <0,05) de los s-RNY indicados, mientras que el agotamiento de Dicer conduce a una inducción significativa (prueba t de Student: p <0,05). Los BMDM se dejaron sin estimular o se estimularon con 0,25 mM de PA durante 18 h, y se aisló el ARN total y se analizó mediante RT-PCR cuantitativa. Los datos se normalizaron por U2 snRNA. Los datos se presentan como media y SD (n = 4).

Figura 7: Análisis de inmunoprecipitación de ARN usando los anticuerpos indicados y los ARN indicados en BMDM. Los BMDM se dejaron sin estimular o se estimularon con 0,25 mM de PA durante 18 horas y se aisló el ARN total y se analizó mediante RT-PCR cuantitativa. Los datos se presentan como media y SD (n = 6) y se normalizó con la IgG y la entrada.

Figura 8: (A) Análisis de inmunoprecipitación de ARN de Ro60 y los s-RNY indicados en BMDM. Los BMDM se dejaron sin estimular o se estimularon con 0,25 mM de PA durante 18 h. Se aisló ARN de inmunoprecipitación y se analizó mediante RT-PCR cuantitativa. Los datos se presentan como media y SD (n = 6) y se normalizaron con la IgG y la entrada. Prueba t de Student: ** P <0,01. (B) Inmunoprecipitación de ARN de cualquiera de Ago2 o La/SSB y los s-RNY indicados en BMDM. Los BMDM se dejaron sin estimular o se estimularon con 0,25 mM de PA durante 18 h. Se aisló ARN de inmunoprecipitación y se analizó mediante RT-PCR cuantitativa. Los datos se presentan como media y SD (n = 6). Prueba t de Student: ** P <0,01.

Figura 9: (A) Inmunoprecipitación de ARN de cualquiera de Ago2 o IgG y los RNY indicados en BMDM. Los BMDM fueron transfectados con los RNAsi indicados y, o bien se dejaron sin estimular o se estimularon con 0,25 mM de PA durante 18 h. Se aisló ARN de inmunoprecipitación y se analizó mediante RT-PCR cuantitativa. Los datos se presentan como media y SD (n = 6). Prueba t de Student: ** P <0,01. (B) Análisis de inmunoprecipitaciónde de ARN de GW182 y los s-RNY indicados. Los BMDM se dejaron sin estimular o se estimularon con 0,25 mM de PA durante 18 h. Se aisló ARN de inmunoprecipitación y se analizó mediante RT-PCR cuantitativa. Los datos se presentan como media y SD (n = 6) y se normalizó con la IgG y la entrada.

Figura 10: (A) Diagrama de Venn que muestra los potenciales ARNm que reconocen s-RNY entre los ARNm regulados por disminución detectados a partir de un análisis de microarray de BMDM que sobreexpresan s-RNY y control a partir de 4 experimentos independientes. (B) Diagrama de Venn que muestra el número de posibles sitios de unión a diana para cada s-RNYs tanto en la región codificante como 3UTR de ARNm regulados por disminución de BMDM que sobreexpresan s-RNY.

Figura 11: Análisis por RT-PCR cuantitativa de los potenciales ARNm que reconocen s-RNY en BMDM transfectados con siAgo2, los oligonucleótidos antisentido de 2'-OMe-ARN (AS) a s-RNYs, o control. Los BMDM se dejaron sin estimular (columna negro) o se estimularon con 0,25 mM de PA durante 18 h, y se aisló el ARN total y se analizó. Los datos se normalizaron por U2 snRNA y se presentan como media y SD (n = 6).

Figura 12: (A) ARN de doble cadena esperado como resultado de apareamiento de bases de ARNm de KFL2 con s-RNY1-3p. Los pares de bases AU y GC están representados por líneas continuas; los pares de bases GU de oscilación están representados por líneas de puntos. (B) La secuencia del sitio diana predicho de ARNm de KFL2 de las especies indicadas. La secuencia complementaria de s-RNY1-3p está encerrada en un cuadro negro. La conservación de nucleótidos a través de las especies se indica mediante asteriscos. (C) La actividad de luciferasa relativa de construcciones indicadoras que contienen dos sitios de unión (BS) a s-RNY-1-3p wt o mutante de la secuencia de ARNm de KFL2 en las células NIH-3T3 transfectadas con oligonucleótido antisentido de 2'-OMe-ARN a s-RNY1-3p o control. Las células se dejaron sin estimular o se estimularon con 0,25 mM de PA durante 18 h. Los datos se normalizaron usando la actividad de Renilla. Los datos se presentan como media y SD (n = 4). Prueba t de Student: ** P <0,01.

Figura 13: Datos apoptóticos mediante fluorocitometría para BMDM que sobreexpresan s-RNYs, transfectados con oligonucleótidos antisentido 2'-OMe-ARN a s-RNYs o control. Los BMDM se estimularon con 0,25 mM de PA durante 18 h (A), tapsigargina pM (Tg) en combinación con 100 pM de OxLDL durante 28 h (B), o se dejaron sin estimular (C). El porcentaje de células apoptóticas y necróticas se determinó mediante tinción con DAPⁱ y la anexina V-Alexa568. Los datos se presentan como media y SD (n = 3).

Figura 14: (A) Análisis de RT-PCR cuantitiva de los s-RNY indicados en BMDM incubados con 0,25 mM de PA el tiempo indicado. Los datos se normalizaron por U2 snRNA. (B) Análisis de RT-PCR cuantitiva de los s-RNY indicados del medio de BMDM. Las células se dejaron sin estimular o se incubaron con PA 0,25 mM durante 18 h. Los datos se normalizaron utilizando el cel-miR-39no mamífero sintético, que se añadió a las muestras antes de la extracción de ARN. Los datos se presentan como media y SD (n = 8).

Figura 15: Análisis de RT-PCR cuantitiva de transcirpciones de NOS2A, IL-6, IL-12b, y IL-1b en BMDM que sobreexpresan s-RNY y transfectados con oligonucleótidos antisentido de 2'-OMe-ARN a s-RNYs o control. Los BMDM se dejaron sin estimular o se estimularon con 100 ng/ml LPS durante 12 h, y se aisló el ARN total y se analizó. Los datos se normalizaron por U2 snRNA y se presentan como media y SD (n = 4). Prueba t de Student: * p <0,05; ** P <0,01.

Figura 16: RT-PCR cuantitativa de los s-RNY indicados en el plasma sanguíneo de ratones ApoE ~A (A) o Ldlr ~A (B) o control. Los ratones fueron alimentados con la dieta de pienso o HCD, durante 12 semanas (ratones ApoE ~A ratones) o 20 semanas (ratones Ldlr -/-). Los datos se normalizaron usando cel-miR-39 y se presentan como media y SD (n = 8 para ratones ApoE ~A y n = 5 para ratones Ldlr ~A). Prueba t de Student: * P <0,05, ** P <0,01.

Figura 17: (A) Expresión diferente significativa de s-RNY1-5p circulante en el suero de pacientes con enfermedad arterial coronaria (CAD, n = 45) frente a control sano (CTR, n = 45). Datos derivados de RT-PCR cuantitativa, normalizados utilizando cel-miR-39, y presentados como la prueba t de Student con la media y la SD: *** P <0,001. (B) Curva característica operativa del receptor (ROC) para predecir la CAD. La curva ROC fue construida usando s-RNY1-5p basado en los datos de RT-PCR cuantitativa (n = 45). Se proporciona el área bajo la curva ROC se y se calcula el intervalo de confianza del 95% (0,90 a 0,99). La línea diagonal indica una prueba con un área bajo la curva ROC de 0,5.

Figura 18: Expresión diferente significativa de s-RNY4-5p circulante en el suero de pacientes con enfermedad arterial coronaria (CAD) versus control (CTR). (A) Datos derivados de RT-qPCR, normalizados mediante el uso de cel-miR-39 y se presentan como la media y la SD (CTR n = 19; CAD n = 30). (B) Área bajo la curva característica operativa del receptor (ROC) para s-RNY4-5p basado en los datos de RT-PCR cuantitativa.

Figura 19: s-RNY se expresan en la sangre periférica de pacientes con enfermedad arterial coronaria. Un modelo para generación dependiente de lípidos aterogénicos de s-RNY que actúan sobre un subconjunto de ARNm que contienen secuencias complementarias semillas y ejercen efectos de señalización de la vía.

Figura 20: Diagramas de caja de s-RNY1_5P de acuerdo con el estado de la enfermedad de la arteria coronaria (CAD).

Figura 21: Gráficos de densidad normales de s-rny1_5p en bruto y transformado.

Figura 22: Curva característica operativa del receptor (ROC) para la predicción de CAD con s-RNY1-5p.

Figura 23: Curva ROC para la predicción de CAD con hipertensión, dislipidemia, diabetes, tabaquismo, duración de la escolarización, índice tobillo-brazo, ApoA1 y CRP.

Figura 24: Curvas ROC para la predicción de CAD. Comparación de modelo de factores de riesgo cardiovascular básico con modelo completo (+ s-RNY1_5P).

Figura 25: Razón de momios para s-RNY1_5P.

EJEMPLOS

Ejemplo 1 Material y procedimientos:

Animales y Dietas

Los animales se mantuvieron en una instalación de barrera libre de patógenos y se mantuvieron de acuerdo con el Institutional Animal care and Use Protocol de la Universidad de Niza Sophia Antipolis, de acuerdo con las regulaciones nacionales pertinentes relacionadas con el bienestar animal. Los siguientes animales fueron adquiridos de Charles River Laboratories (L'Arbresle, Francia): C57BL/6J, ApoE -/-(APOE-B6.129P2/J), y Ldlr-/-(B6.129S7-Ldlrtm1Her/J). Las fórmulas # TD02028 y TD96335 con altos niveles de colesterol (HCD) (Harlan Teklad) para ApoE -/- o Ldlr -/-, respectivamente, fueron adquiridos de Ssniff Spezialdiaten GmbH (Soest, Alemania). Los ratos macho ApoE -/- y LDLR -/- a las 8 semanas de edad fueron alimentados con HCD o dieta regular (dieta de pienso) durante 12 o 20 semanas, respectivamente. Se diseccionaron arcos aórticos, corazón y plasma sanguíneo.

Población de estudio y recopilación de datos

Los sujetos fueron seleccionados al azar de un gran estudio de casos y controles sobre la enfermedad de la arteria coronaria (CAD) referenciado como estudio GENES (Genetique et Environnement en Europe de Sud) como se describe previamente (Bouisset et al., 2012). En resumen, los pacientes varones de CAD que viven en la zona de Toulouse (suroeste de Francia) y con edades comprendidas entre los 45 y los 74 años, fueron reclutados de forma prospectiva desde 2001 a 2004, admitidos en el Departamento de Cardiología de1Hospital de la Universidad de Toulouse, y sometidos a la evaluación y tratamiento de CAD estable. El CAD estable se definió por un historial de síndrome coronario agudo y de revascularización coronaria, isquemia de miocardio documentada, angina estable, o la presencia en el angiograma coronaria de una estenosis coronaria de > 50%. Durante el mismo período, los controles sanos de varones, de 45 años a 74, fueron seleccionados de la población en general utilizando las listas electorales. La estratificación por grupos de edades de 10 se utilizó para emparejar aproximadamente la distribución de edades de los controles con el de los casos. Todos los individuos fueron sometidos a un examen médico en el Departamento de Cardiología en el Hospital de la Universidad de Toulouse y completaron cuestionarios estandarizados que cubrían la edad, historial médico, variables socioeconómicas y de estilo de vida, tales como el nivel educativo, el tabaquismo y la actividad física. La actividad física se clasificó en cinco niveles, desde 1 a 4: ninguna actividad física (1), actividad física ligera durante 20 minutos una vez a la semana (2), actividad física moderada durante 20 min dos veces a la semana (3), actividad física intensa durante 20 min 3 veces a la semana o más (4). También se sometieron a un examen médico estandarizado con mediciones antropométricas y clínicas y proporcionaron muestras de sangre en ayunas. Las muestras de sangre se analizaron para determinar el colesterol sérico total, lipoproteína de alta densidad-colesterol (HDL-C), triglicéridos (TG), glucosa, g-glutamiltransferasa (y-GT) y proteína C-reactiva sensible (CRP) con reactivos enzimáticos en un analizador automático (Hitachi 912, Roche Diagnostics, Meylan, Francia). El LDL-colesterol (LDL-C) se calculó utilizando la fórmula de Friedewald, con VLDL-colesterol (VLDL-C) (g/L) = TG (g/L)/5, siempre que la concentración de TG fue inferior a 4 g/L (Genoux et al., 2011). Las lipoproteínas que contenían ApoB y ApoE (LPB:E) se ensayaron mediante un ensayo específico de inmuno-electrodifusión (Sebia, Francia). En el presente trabajo, 45 pacientes con CAD y 45 individuos de control emparejados por edad se extrajeron aleatoriamente para mediciones en suero de s-RNY.

En las tablas 3 y 4, los datos se presentan como porcentaje para las variables cualitativas o como la media con desviación estándar para las cuantitativas. Las variables cualitativas se compararon con la prueba de c2 (o prueba exacta de Fisher cuando sea necesario). Los valores medios de las variables cuantitativas se compararon con la prueba t de Student. Se utilizó Shapiro-Wilks para probar la normalidad de la distribución de los residuos y la prueba de Levene para comprobar la homogeneidad de las variables. Cuando los supuestos básicos de la prueba t de Student no eran satisfechos, los datos fueron transformados logarítmicamente o sometidos a una prueba de Wilcoxon Mann Whitney. Las asociaciones de s-RNY con características clínicas y marcadores biológicos se ensayaron usando correlaciones de rangos de Spearman. Los análisis fueron de dos colas y p <0,05 se consideró significativo. Estos análisis estadísticos se realizaron utilizando el paquete de software estadístico SAS 9.2 (SAS Institute, Cary, IL, EE.UU.) y con el software estadístico STATA (versión 11.2, Stata Corporation, College Station, TX, EE.UU.). La prueba de RoC se calculó utilizando GraphPad Prism (versión 5.01, La Jolla, CA 92037, EE.UU.).

Declaración de Ética

El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de Ética local del hospital de Toulouse (CHU Toulouse/INSERM, presente 1-99-48, febrero de 2000) y la Comisión Nacional para el procesamiento de datos y libertades (N° 900165). El consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los participantes involucrados en el estudio. La recogida biológica se constituyó de acuerdo con los principios expresados en la Declaración de Helsinki y registrados con el número CC-2008-403 en el Ministerio de Investigación y en la Agencia Regional de Salud.

Reactivos

LPS, LTA, Tg, STS, BSA, PA, ácido esteárico, ácido oleico, y ácido linoleico se adquirieron de Sigma (Saint-Quentin Fallavier, Francia). LDLox se adquirió de Clinisciences (Nanterre, Francia).

Macrófagos primarios

Se recogieron células de médula ósea de fémures y tibias de ratons macho C57BL/6J de diez semanas de edad mediante lavado con medio estéril, tal como se ha descrito anteriormente (T. Ruggiero, M. et al (2009) FASEB J 23: 2898-2908). Para diferenciar en macrófagos, las células de la médula ósea (106) se sembraron en placas de 10 cm en 7 ml de medio de BMDM (DMEM suplementado con 20% de suero bovino fetal bajo en endotoxina, 30% de medio acondicionado con células L929, 1% de I-glutamina, 1% Pen/Strep, 0,5% de piruvato Na, y 0,1% de pmercaptoetanol), y se alimentó con 2,5 ml de medio fresco cada 2 días durante 7 días. Macrófagos primarios humanos se prepararon a partir de monocitos de sangre periférica obtenidos a partir de donantes sanos (Jacquel, A., et al. (2012). Blood 119, 4.527-4.531) de acuerdo con la legislación francesa en la investigación biomédica humana. Todos los participantes proporcionaron el consentimiento por escrito en el que constaba que habían recibido toda la información que necesitaban sobre el estudio y se acordó de conformidad con las normas nacionales apropiadas informados.

Transfección Celular e inmunotransferencia

Las células BMDMs y NIH-3T3 (ATCC) se transfectaron transitoriamente durante 48 h con Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Los siRNAs se transfectaron a la concentración final de 24 nM, mientras que los oligonucleótidos de 2'-OMe-ARN antisentido para s-RNYs (Eurogentec) se transfectaron a la concentración final de 100 nM. Cuando fue necesario, los lisados celulares se incubaron a temperatura ambiente con ARNasa A (10 mg/ml, Ambion) durante 30 min. Trescientos microgramos de proteína se inmunoprecipitaron con anticuerpos acoplados a Proteina A-Dynabeads (Invitrogen) durante 16 horas a 4°C con rotación. Los inmunoprecipitados se lavaron cuatro veces con tampón de lisis y se resuspendieron en tampón cargados con proteínas y SDS. Las proteínas se sometieron a SDS-PAGE, electrotransferencia sobre membranas de PVDF, y se sondaron con anticuerpos diferentes tal como se indica.

Secuenciación de ARN pequeño

Diez microgramos de ARN totales se sometieron al procedimiento de preparación de ARN pequeño, y las bibliotecas se secuenciaron en cualquiera de las plataformas Illumina o Solid3. Para el análisis, la secuencia del adaptador 3' se eliminó usando FASTX, y las lecturas recortadas se alinearon con la base de datos del genoma y DeepBase53 utilizando Blat y Novoalign.

Hibridación in situ con fluorescencia e inmunofluorescencia

Se realizó hibridación in situ con fluorescencia acoplada con la inmunofluorescencia como se ha descrito anteriormente (Hu, P., et al. (2012). Nature strcutural & molecular biology 19, 1168-1175). Los BMDM fueron fijados en 10% formalina neutra y se hibridaron con la sonda LNA antisentido marcada con FAM. Los portaobjetos se incubaron después con un antisuero humano anti-GW182 para teñir P-cuerpos (Eystathioy, T., et al. (2003). Journal of Molecular Medicine (Berlin, Alemania) 81, 811-818). La sonda utilizada en este estudio fue adquirida de Exiqon (Dinamarca). Para inmunofluorescencia, se fijaron los senos aórtico de ratones ApoE ~-~ en formalina al 10% neutra, se penetraron con 20% de sacarosa en PBS, y se embebieron en compuesto OCT. Se tiñeron secciones en serie de 10 mM del seno aórtico con Mac3 de rata y anticuerpos monoclonales hnRNP A1de ratón. Los portaobjetos se cubrieron en medio de montaje Vectashield con DAPI (Invitrogen). Los resultados se analizaron en un microscopio Leica DM5500B con una cámara HAMAMATSU ORGA-ER. La secuencia de la sonda de LNA se detalla en la Tabla 1.

Análisis de microarrays

Para el análisis del perfil de ARNm, se recogieron BMDM de 4 C57BL/6J machos y transfectaron con siRNAs contra el bucle terminal del RNY y control. 48 h después de la transfección, se aisló a Rn total utilizando el kit RNAeasy (Qiagen). Las muestras de ARN se marcaron con colorante Cy3 utilizando el kit QuickAmp de entrada bajo de ARN (Agilent) según lo recomendado por el proveedor. 400 ng de la sonda de ARNc marcada se hibridaron en microarrays Agilent 8x60K de alta densidad SurePrint G3 gen de ratón GE 8x60K Agilent. La normalización de datos de microarrays se realizó con el paquete Limma disponible de Bioconductor (http://www.bioconductor.org) utilizando los procedimientos de cuantiles. Se calcularon los promedios de proporciones de tratados con siRNY versus control. Se seleccionaron genes expresados diferencialmente en base a al menos una modulación de 1,2 veces el cambio entre BMDM que sobreexpresan s-RNY y control, y una prueba t de Student estadísticamente significativa (p <0,05).

Ensayo de apoptosis

La apoptosis fue ensayada en BMDM por tinción con anexina V conjugada con Alexa 488 y Dapi como se ha descrito previamente (Jacquel, A., et al, 2012. Blood 119 (19): 4527 hasta 4531). El número de células positivas de anexina V y Dapi se contó y se expresó como un porcentaje del número total de células a partir de pocillos duplicados.

Ensayo indicador de luciferasa

Las células NIH-3T3 (80% de confluencia en placas de 96 pocillos) fueron transfectadas con Lipofectamine 2000® de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ensayo de indicador de luciferasa se realizó como se ha descrito previamente (Repetto, E., et al. (2012). PLoS Genetics 8, e1002823).

ARN en Procesamiento in vitro y reticulación en UV

ARN marcados con 32P fueron sintetizados y utilizados como sustratos para cualquiera de los ensayos de procesamiento in vitro o experimentos de reticulación en UV como se ha descrito previamente (Trabucchi, M., et al (2009). Naturaleza 459, 1010-1014).

Inmunoprecipitación de ARN

La inmunoprecipitación de ARN se realizó como se ha descrito previamente (Trabucchi, M., et al (2009). Nature 459, 1010-1014) con modificaciones menores. Brevemente, los lisados celulares se inmunoprecipitaron con anticuerpos acoplados a Proteína A-Dynabeads (Invitrogen) a 4°C durante la noche. El ARN total se preparó utilizando Trizol (Invitrogen) y se analizó por RT-PCR cuantitativa. Las secuencias de cebadores se detallan en la Tabla 1.

Transferencia Northern

Se aisló el ARN total de células usando Trizol (Invitrogen), se separó en geles de poliacrilamida-urea al 10% y se sometió a electrotransferencia sobre membranas Hybond N+. Las membranas se hibridaron durante la noche con oligonucleótidos antisentido de ADN radiomarcado a s-RNYs en solución ExpressHyb (Clontech). Después de la hibridación, las membranas se lavaron tres veces con 2X SSC y SDS al 0,05%, dos veces con 0,1X SSC y SDS al 0,1%, se expusieron durante la noche a las pantallas de imagen, y se analizaron usando un Storm 860 PhosphorImager. Se hibridó la misma transferencia (tras extracció en SDS al 0,1% en ebullición) con tres sondas distintas, incluyendo U6 snRNA de control (Tabla 1).

Análisis de la expresión de ARNm y s-RNY

La expresión del ARN por RT-PCR cuantitativa se llevó a cabo mediante el uso de procedimientos estándar. Brevemente, para el ARNm, el ARN total fue aislado de las células usando Trizol y se sintetizó ADNc con un hexonucleótido aleatorio usando SuperScript III (Invitrogen). Para la detección de s-RNY por RT-PCR cuantitativa se utilizó un procedimiento cuantitativo RT-PCR tallo-bucle de acuerdo con Chen et al. (Chen, C., et al. (2005). Nucleic Acid Research 33, e179). Brevemente, el ARN total fue aislado a partir de células, tejidos, o inmunoprecipitación utilizando Trizol (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. La extracción de RNA a partir del medio extracelular, plasma sanguíneo, y el suero se realizó como se ha descrito previamente (Turchinovich, A., et al (2011). Nucleic Acid Research 39, 7.223-7.233). Brevemente, se añadieron 1,2 ml de Trizol LS a 0,4 ml de plasma sanguíneo, suero o medio. A continuación (i) 5 pg de miARN-39 sintético de Caenorhabditis elegans (cel-miR-39) se añadieron como un control de la eficiencia de purificación; (ii) se añadieron 1,2 ml de glucógeno (10 mg/ml) para mejorar la eficiencia de la unión de la columna de ARN. La purificación del ARN total extraído se realizó con columnas miRNeasy (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. El ARN se eluyó en 30 ml de agua libre de RNasa. Se sintetizó ADNc usando un oligonucleótido largo de horquilla. Este procedimiento permite la detección de los s-RNY derivados de solamente el extremo 5' del precursor mediante análisis de RT-PCR cuantitativa, a saber, la s-RNY1-5p y s-RNY3-5p de ratón y s-RNY1-5p, s-RNY3-5p, y s-RNY4-5p de humano. Las RT-PCR cuantitativas utilizando SYBR Green y TaqMan (Invitrogen) para cel-miR-39 se realizaron en un sistema StepOne (Applied Biosystem). Las secuencias de cebadores se detallan en la Tabla 1.

Proteínas recombinantes y anticuerpos para transferencia Western

Ago2 recombinante y hnRNP A1 se adquirieron de Sino Biological Inc. y Clinisciences, respectivamente, mientras que KSRP recombinante fue un regalo del Dr. R. Gherzi. Los anticuerpos monoclonales anti-hnRNP A1 de ratón (4B10), anti-c-Myc de ratón (9E10), anti-actina de cabra (I-19), y IkBa (H-4) fueron adquiridos de SantaCruz. Los anticuerpos anti-La/SSB y anti-Ro60 (TROVE2) de conejo fueron adquiridos de GmbH. El anticuerpo anti-Ago2 fue adquirido de Wako Chemicals, mientras que anticuerpos anti-NOS2A y anti-KLF2 de conejo fueron de Millipore. El anticuerpo anti-KSRP fue un regalo del Dr. R. Gherzi. Los anticuerpos monoclonales anti-p53 de ratón (1C12), de anti-caspasa-3 escindida de conejo (Asp175), anti-caspasa 3 de conejo (8G10), anti-P-p38 de conejo (9211), antip38 de conejo (9212), anti-P-JNK de ratón (9255), y anti-P-JNK de conejo (9252) fueron adquiridos de Cell Signaling. Anti-GW182 humano fue un regalo del Dr. MJ Fritzler. El anticuerpo anti-Mac3 de ratón de rata (M3/84) fue de BD Pharmingen. La inmunofluorescencia se reveló mediante el uso de anticuerpos secundarios fluorescentes: anticuerpo anti-IgG de rata (H L) conjugado con Alexa Fluor 488 (Cell Signaling) para el anti-Mac3 de ratón, anticuerpo anti-IgG de ratón (H L) conjugado con Alexa Fluor 594 (Molecular Probes) para anti-hnRNP A1, y anticuerpo anti-IgG humano (H L) conjugado con Alexa Fluor 594 (Invitrogen) para GW182.

Cribado de siRNA candidato

siRNAs SmartPool para el cribado se adquirieron de Thermo Scientific (IIIkirch, Francia). Los BMDM se sembraron en placas de 24 pocillos y cada siRNA SmartPool siRNA se transfectó singularmente en tres pocillos. 48 horas desde la transfección, las células se dejaron sin tratar o se estimularon con 0,25 mM de PA durante 18 h, y se aisló el ARN total y se analizó por RT-PCR cuantitativa. El experimento se repitió 4 veces y se analizó estadísticamente utilizando la prueba t de Student.

El cribado incluyó enzimas implicadas en biogénesis de ARN pequeños, tales como Dicer, Drosha, DDX-5, Ago1, 2, 3 y 4, Piwil1, 2 y 4, y Elac1 (también conocido como tRNasa Z 1), así como componentes de la proteína de unión a ^a Rⁿ de las maquinarias de procesamiento de ARN, tales como DGCR8, TRBP-2, hnRNP A1, IIf3 (también conocido como NF90), Xpo5, KSRP, Lin28, Zc3h12a (también conocido como MCPIP1), Ews, p53, y Fus-TLS. Además, los genes implicados en la estabilidad del ARN pequeño fueron eliminados, tales como Zcchc11 (también conocido como TUTase 4), Zcchc6 (también conocido como TUTase 7), Xrn2, Exosc2, y RNASEL.

siRNA y oligonucleótidos de ARN modificados

siRNA contra p53 y Ro60 del ratón fueron adquiridos de Ambion. siRNAs personalizados u oligonucleótidos de ARN modificados fueron sintetizados por Eurogentec:

- Ago2 de ratón 5'- GUUGUAUUGUUUAGCGAUU -3' (SEQ ID NO: 22)

- hnRNP A1 de ratón 5'- GCACUAGCCAUCUCUUGCUUC -3' (SEQ ID NO: 23)

- La/SSB de ratón 5'- UUCCUUUAAAUCUUCCACC -3' (SEQ ID NO: 25 )

- Dicer de ratón 5'UUCAGCUCGAUGGAUAUGGUG 3' (SEQ ID NO: 55)

- siRNA de ratón contra bucle terminal de RNY1 5'- CAG U CAG U UACAGAU U GAA -3' (SEQ ID NO: 56)

- si-RNA de ratón contra bucle terminal de RNY35 'CAACCAGUUACAGAUUUCU - 3' (SEQ ID NO: 57)

- 2'-OMe-ARN antisentido de ratón a s-RNY1-5p 5 'UUGAGAUAACUCACUACCUUCGGACCAGCC-3' (SEQ ID NO: 26)

- 2'-OMe-ARN antisentido de ratón a s-RNY1- 3p 5 'AAGACUAGUCAAGUGCAGUAGUGAGAAG -3' (SEQ ID NO: 27)

- 2'-OMe-ARN antisentido de ratón a s-RNY3-5p 5' UAAACACCACUACUCUCGGACCAACC -3' (SEQ ID NO: 28).

EJEMPLO 2: Estímulos pro-apoptóticos y aterogénicos inducen la expresión de ARN pequeños derivados de RNY en macrófagos

Se ha realizado una secuenciación de ARn pequeños de alto rendimiento en macrófagos primarios estimulados con cualquiera de estaurosporina (STS) o la extracción de tratamiento con factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF). Mediante el mapeo de los datos de secuenciación a bases de datos de ARN pequeños, incluyendo miRNAs, piRNAs, snoRNAs, riRNAs, y tRNAs utilizando el programa Novoalign (Figura 1A), se demostró que los macrófagos apoptóticos expresaron altamente ARn pequeños derivados de RNY (Figura 1B). ARN pequeños derivados de 3 RNY fueron encontrados en ratón y 6 en humanos variando en longitud de ~ 24 a ~34 nt que se sitúan al final y las regiones tallo de los RNY (Figuras 1B, 2A y 2B). Estos ARN pequeños se hará referencia en lo sucesivo como s-RNYs, siendo el s-RNY1-5p de ratón previamente clasificada como piRNA (piRNABank, http://pirnabank.ibab.ac.in/) y el s-RNY5-3p humano como miRNA (Meiri, E., et al (2010) Nucleic Acids Research 38, 6234 a 6246; Schotte, D. (2009) Leukemia 23, 313-322). Los genes de RNY cuentan cuatro copias en humanos (RNY1, 3, 4, y 5) y dos en el genoma de ratón (RNY 1 y 3), y su secuencia está bien conservada en vertebrados. El análisis de transferencia Northern confirmó que la expresión de s-RNYs (s-RNY1-5p, s-RNY1-3p, s-RNY3-5p y s-RNY4-5p) se indujo en los macrófagos primarios humanos tras el tratamiento con STS o extracción de M-CSF (datos no mostrados).

Utilizando el procedimiento de RT-qPCR tallo-bucle descrito previamente (Mestdagh, P. et al (2008) Nucleic Acid Research 36, E143), se ha investigado la expresión de los s-RNY derivado del extremo 5' de RNYs en macrófagos tratados con el estímulo pro-apoptótica de ácido lipoteicoico (LTA) de las bacterias Gram-positivas Staphylococcus aureus en combinación con factor de estrés un retículo endoplásmico (ER), tales como tapsigargina (Tg). El estrés de ER hace los macrófagos susceptibles a la apoptosis en la cara de otros estímulos pro-apoptóticos. El tratamiento con LTA/tapsigargina induce la expresión de s-RNYs en macrófagos derivados de médula (BMDMs) (Figura 3A), lo que sugiere un mecanismo general de la inducción s-RNY en la eliminación de macrófagos.

Un número de lípidos y lipoproteínas asociadas con enfermedades ateroscleróticas conspiran con el estrés ER para causar apoptosis de los macrófagos y la progresión de las lesiones ateroscleróticas. Para determinar si s-RNYs se inducen en macrófagos estimulados con estímulos atero-relevante, BMDMs han sido tratados con LDLox, solo o en presencia de tapsigargina. Mientras que dosis bajas de OxLDL o thapsigargin solo no tuvo ningún efecto, un mayor nivel de OxLDL o ambos reactivos juntos sinérgicamente indujeron s-RNY expresión (análisis de RT-PCR para la s-RNY1-5p y s-RNY3-5p (véase la Figura 3B) y Nothern El análisis de transferencia de s-RNY1-3p (datos no mostrados)). Se observaron resultados similares cuando BMDMs ER-tensado se incubaron con acetilada-LDL (acLDL) (Figura 3C). Los diferentes tipos de ácidos grasos se han probado a continuación, para determinar si también pueden desatar inducción s-RNYs en los macrófagos, y si es así, si este efecto se amplificó por factor de estrés ER. Como se muestra en la Figura 4A, los ácidos grasos insaturados, tales como ácido oleico y ácido linoleico no indujeron la expresión s-RNY cuando se administran solos o en combinación con tapsigargina. Sin embargo, cuando los ácidos grasos saturados, tales como ácido palmítico (PA) y esteárico, se les dio solo se indujo la expresión s-RNY, y este efecto se incrementó notablemente en el contexto de análisis thapsigargin inducida por estrés ER (RT-PCR para s -RNY1-5p y s-RNY3-5p (ver Figuras 4A) y análisis de transferencia Nothern para s-RNY1-3p y s-RNY1-5p (datos no mostrados)). Por otra parte, para probar si las s-RNYs son inducidos en modelos animales para la aterosclerosis, ApoE ■/_ , LDLR ■/_ , y los ratones de control se han comparado. Ratones ApoE ■/_ y LDLR -fueron alimentados ya sea con dieta de pienso o una dieta aterogénica que contiene 1,3% o 1,25% de colesterol, respectivamente. Como se muestra en las figuras 4B y 4C, RT-PCR cuantitativa a partir de arcos aórticos microdiseccionados reveló que el s-RNYs fueron regulados por incremento significativamente en ratones ApoE -/- y LDLR -/- en comparación con el control, y que dieta alta en colesterol (HCD) aumentó significativamente sus niveles de expresión. Por lo tanto, estos resultados indican fuertemente que se induce la expresión de s-RNY en macrófagos expuestos a diversos tipos de estímulos apoptóticos, incluyendo aquellos que son relevantes para el desarrollo de la aterosclerosis. Por otra parte, s-RNYs se expresan en aortas de los modelos de ratón para la aterosclerosis, elevando la posibilidad de que puedan desempeñar un papel en la regulación del desarrollo de la lesión.

EJEMPLO 3: Procesamiento dependiente de Ago2 y hnRNP A1 de RNY en los macrófagos cargados de lípidos

En consonancia con la observación de que la inducción de la expresión s-RNY (por retirada M-CSF o adición de OxLDL en combinación con Tg, o PA en BMDM; o adición de STS en macrófagos primarios humanos cultivados) siempre va acompañada de una reducción de RNY (transferencia Nothern análisis realizados para s-RNY1-3p/RNY1, s-RNY1-5p/RNY1, s-RNY3-5p/RNY3, y s-RNY4-5p/RNY4; datos no mostrados), una regulación positiva de procesamiento de RNYs tiene ha encontrado in vitro utilizando extractos de células totales procedentes de PA tratados con BMDMs en comparación con el control no estimulado (análisis realizados para RNY1/s-RNY1-3p y s-RNY1-5p, y RNY3/s-RNY3-5p; datos no mostrados), en general lo que sugiere que la expresión de s-RNY se modula a nivel post-transcripcional. Debido RNYs forman una estructura secundaria de horquilla bastante similar a la de los genes miARN precursores (Figura 2B), una participación de las pequeñas componentes de maquinaria de procesamiento de ARN en s-RNY maduración se ha planteado la hipótesis. Para validar esta hipótesis, una pantalla de siRNA candidato ha realizado en BMDMs tratados con PA utilizando siRNAs inteligente piscina para derribar ARNasa y proteínas de unión a ARN implicados en la pequeña biogénesis de ARN, así como Ro60 y La/SSB como proteínas de unión a ARN asociados a las RNYs y formando el llamado ribonucleoprotein Ro (RNP) complejo (Figura 5). Entre los ácidos grasos saturados, PA es de lejos el más potente promotor de células espumosas de macrófagos y la apoptosis en la aterosclerosis. Como se muestra en la Figura 6, el agotamiento de La/SSB, Ro60, p53, Ago2, y hnRNP A1 disminuyó significativamente la inducción de la expresión s-RNY, en comparación con GAPDH y no dirigidos controles siRNA, evaluada por RT-PCR cuantitativa de BMDMs estimulado con PA. En todos estos casos, la expresión de s-RNY se redujo estadísticamente por más de la mitad. Sorprendentemente, se ha observado un aumento significativo de los niveles de expresión s-RNY eliminando Dicer. El análisis de transferencia Northern de BMDMs tratados con PA transfectadas con diferentes siRNAs de los utilizados en la pantalla de siRNA, confirmó que los niveles de s-RNYs se redujeron en un 70-90% a la caída de Ago2, hnRNP A1, Ro60, La/SSB, y p53, mientras que aumentó en Dicer desmontables (datos no mostrados). Es importante destacar que, se ha observado que al Ago2 o hnRNP A1 caída en BMDMs tratados con PA la disminución de la inducción nivel s-RNY fue acompañado por un aumento de los RNYs comparación con el control (análisis de transferencia Nothern realiza para s-RNY1-3p, s -RNY1-5p, y s-RNY3-5p; datos no mostrados), lo que sugiere que tanto Ago2 y hnRNP A1 pueden controlar directamente la maduración de s-RNYs en los macrófagos cargados de lípidos. Por el contrario, desmontables de Ro60 y La/SSB disminuyó ambos s-RNYs y RNYs (datos no mostrados), lo que sugiere que estas dos proteínas pueden estabilizar RNYs y/o s-RNYs, como se propuso anteriormente. En apoyo a un papel directo de Ago2 y hnRNP A1 en la regulación de procesamiento RNY, ambos RNYs pero no Gapdh (control negativo) se inmunoprecipitaron con anticuerpos contra Ago2 o hnRNP A1 en BMDMs tratados con PA mientras que los anticuerpos anti-La/SSB y anti-Ro60 hizo RNYs immunoprecipitate de ambas células estimuladas y no estimuladas (Figura 7). Sin embargo, no se inmunoprecipitan con un anticuerpo anti-p53. En conjunto, estos resultados indican claramente que tanto Ago2 y hnRNP A1 pueden controlar directamente el procesamiento RNYs en los macrófagos cargados de lípidos.

Entre las proteínas que se encuentran en la pantalla de siRNA, solamente Ago2 es una enzima. Ago2 tiene una actividad endorribonucleasa de ARN de doble cadena, es el componente catalítico de la RISC y está implicado en el procesamiento de miR-451. Ago2 se asocia con diferentes clases de pequeños ARN no codificantes, incluyendo miRNAs y siRNAs. Para establecer si Ago2 interactúa directamente con RNYs, proteína recombinante y sintético radiomarcado-RNYs (RNY1, RNY3) se han utilizado en ensayos de UV-reticulación, lo que indica una interacción directa Ago2-RNYs, mientras que el ARN TNF-ARE, utilizado como control negativo, no reticular (datos no mostrados). Estos datos demuestran la carga directa de los RNYs en Ago2 y plantearon la posibilidad de que Ago2 podría catalizar directamente la maduración de s-RNYs. Para comprobar esta hipótesis un ensayo de procesamiento in vitro se ha realizado utilizando RNYs desnudos y los Ago2 recombinante. El ensayo de Procesamiento con RNY1 y RNY3 muestra que Ago2 recombinante puede escindir ambos RNYs pero fue incapaz de generar la forma madura final, como se especula teniendo en cuenta la estructura secundaria predicha de RNYs (datos no mostrados y la Figura 2B). Sin embargo, este experimento solo no puede excluir la aparición de diferentes sitios de escisión in vivo debido a un complejo de proteínas asociado con Ago2, como era de esperar de las propiedades bioquímicas bien establecidos de Ago2. De hecho, el agotamiento de Ago2 en extractos BMDM detuvo la actividad de procesamiento de RNY mientras que la adición de la Ago2 recombinante era suficiente para rescatar el bloqueo y para generar la maduración completa de s-RNYs, como se ha demostrado para RNY3 (datos no mostrados).

Curiosamente, se ha informado recientemente de que ambas proteínas asociadas RNY, La/SSB y Ro60, son componentes integrales del complejo Ago2. En particular, los informes previos demostraron que La/SSB es ambos implicados en el procesamiento y facturación de RISC miARN mediante la promoción de la liberación de ARNm escindido. La coimmunoprecipitation experimentos en células NIH-3T3 revelaron que Ago2 interactuó con La/SSB tanto en las células untreated- y tratados con PA, mientras que con Ro60 solamente tras el tratamiento PA (datos no mostrados), indicando que Ago2 se asocia al complejo Ro RNP en lípidos Las células cargadas. Además, los anticuerpos contra Ago2, La/SSB, o Ro60 inmunoprecipitada s-RNYs de BMDMs estimuladas-PA (Figuras 8A y 8B), lo que indica la formación de un complejo de proteínas que contiene s-RNYs. En conclusión, estos datos demostraron fuertemente una maduración s-RNY que procede con una escisión Ago2 mediada.

A continuación, se ha explorado la posibilidad de que la proteína de unión a ARN de una cadena hnRNP A1 favorezca el procesamiento dependiente de Ago2 de RNY en macrófagos tratados con PA. hnRNP A1 es una proteína lanzadera de núcleo-citoplasma con funciones en muchos aspectos del metabolismo del ARN. Recientemente se ha descrito que hnRNP A1 está implicada en el procesamiento de miRNA mediante la unión específica a la estructura de bucle terminal de una sola cadena de precursores de miRNA seleccionados para modular finamente la biogénesis. En particular, se une a los precursores de miRNA para inducir un cambio en la estructura secundaria creando un sitio de escisión más favorable para Drosha. Los datos revelan que hnRNP A1 coimmunoprecipitó con Ro60 (datos no mostrados) y que el anticuerpo anti-hnRNP A1 inmunoprecipitó ambos RNY en BMDM estimulados con PA (Figura 7). Para establecer si hnRNP A1 interactúa directamente con los RNY, se han utilizado proteína recombinante y RNY transcrito in vitro en ensayos de reticulación con UV, lo que indicó una interacción directa hnRNP A1-RNY (RNY1 y RNY3; datos no mostrados) mientras que la proteína de unión a ARN KSRP, usada como control negativo, no se reticuló a RNY1 o RNY3 (datos no mostrados). El pri-let7-a, que se utilizó como control positivo, se reticuló a KSRP (datos no mostrados). Curiosamente, tanto RNY1 como RNY3 comparten algunas similitudes con la secuencia de unión de hnRNP A1 al bucle de terminal de los precursores de miR-18a (Figura 2), lo que indica que, como para los precursores de miARN, la unión de hnRNP A1 a RNY puede crear un sitio de escisión más favorable. De hecho, la presencia de hnRNP A1 promueve la escisión de Ago2 (datos no mostrados). Además, debido a que la eliminación de hnRNP A1 en BMDM tratados con PA, abolió la interacción de Ago2 con RNY1 y RNY3 (Figura 9A), se concluyó que hnRNP A1 favorece la asociación de Ago2 a RNYs en macrófagos cargados de lípidos. Por lo tanto, estos datos indican que hnRNP A1 es un regulador clave de procesamiento de RNY en macrófagos cargados de lípidos basados en su unión por afinidad a RNY. Tras la unión, hnRNP A1 podría optimizar el posicionamiento/reclutamiento de Ago2 a través de una interacción proteínaproteína. De hecho, en BMDM estimulados con PA, se ha demostrado una independencia de RNasa de la interacción entre Ago2 y hnRNP A1 (datos no mostrados). En apoyo a esta conclusión, los niveles citoplasmáticos de hnRNP A1 aumentaron drásticamente durante el tratamiento con PA de BMDM (datos no mostrados) y en los macrófagos Mac3-positivos en seno aórtico de ratones ApoE-/- (datos no presentados). La localización citoplásmica de hnRNP A1 promovería la interacción a Ago2 y, a continuación, el procesamiento de RNY. En general, estos resultados indican que en los macrófagos cargados de lípidos el procesamiento de RNY está mediado por el complejo Ago2/hnRNP A1.

EJEMPLO 4: Regulación después de la transcripción de los ARNm diana por s-RNY

Dado que el s-RNYs están asociados con Ago2 (Figura 8B), la posibilidad de que puedan ejercer un control posttranscripcional de la expresión génica comparable a la de miRNAs ha sido explorado, para apuntar mRNAs por reconocimiento de secuencias complementarias. Se ha determinado primero si s-RNYs localizar a los órganos de procesamiento (P-cuerpos), que sirven como sitios para la degradación del ARN mediada por ARN pequeños, tales como miRNAs, piRNAs, y riRNAs. Una hibridación fluorescente in situ se ha realizado seguido de inmunotinción (inmuno-FISH) usando una sonda de LNA conjugado FAM a s-RNY1-5p junto con la tinción de inmunofluorescencia de GW182, como marcador para los P-cuerpos. A pesar de que la sonda de LNA se usa aquí puede reconocer tanto RNY1 y s-RNY1-5p, un cambio en el patrón de tinción-LNA se ha notado en BMDMs al PA estímulo. En BMDMs sin tratar la señal RNY1 se difundió en todo el citoplasma, mientras que en BMDMs tratados con PA el/señal de s-RNY1-5p RNY1 era un patrón de tinción dot citoplásmica similar a la de GW182 (datos no mostrados). Notablemente, la señal de RNY1/s-RNY1-5p parcialmente colocalized con GW182 en BMDM tratado-PA (datos no mostrados). Lo más importante, el análisis de ARN de inmunoprecipitación demostraron que GW182 interactúa con s-RNYs en BMDMs tratado-PA (Figura 9B). Por lo tanto, estos datos indican que el s-RNYs localizar a los P-cuerpos en los macrófagos cargados de lípidos.

Para determinar la existencia de objetivos directos de la s-RNYs, experimentos de microarrays se realizaron de BMDMs sobreexpresan s-RNYs y control. Debido siRNA contra el bucle terminal del RNY1 o r Ny 3 genera s-RNYs asociados a Ro60 imitando la inducción de la transformación que se producen en los macrófagos cargados de lípidos y macrófagos apoptóticos (demostrado para s-RNY1-3p, S-RNY1-5p, y s -RNY3-5p; datos no mostrados), esta estrategia se ha usado en lugar de sobreexpresar ectópicos imitan s-RNYs. Este enfoque sería evitar los efectos fuera de objetivo debido a la sobreexpresión de la ectópicos s-RNYs. Se esperaba directos ARNm diana s-RNY ser enriquecido entre los ARNm que se sobreexpresa dowregulated en BMDMs s-RNYs comparación con el control.

Las 57 mRNAs estadísticamente downregulated de al menos 1,2 veces el cambio en BMDMs sobreexpresados-s-RNYs se analizaron para la presencia de posibles sitios de unión para s-RNYs utilizando Sylamer programa bioinformático (van Dongen, S., et al (2008) Nature Methods 5, 1023-1025). Debido miRNAs utilizan una secuencia de semillas de 6-8 nt en su extremo 5' para dirigirse tanto a la región 3' no traducida (3UTR) y la región codificante (CDS) de los ARNm, también se ha buscado durante al menos 7 nt de secuencia complementaria entre la secuencia de final s-RNYs 5' y ambos 3UTR y CDS de los genes regulados negativamente. Como era de esperar se observó un enriquecimiento significativo de los objetivos de s-RNYs en los mRNAs downregulated, alrededor del 56% (32 mRNAs) (Figuras 10A y 10B). En consecuencia, los genes regulados por s-RNYs serían afectados en los macrófagos tratados con PA transfectadas por los inhibidores de siAgo2 o s-RNYs. De hecho, la expresión de al menos 20/32 mRNAs (aproximadamente 62%) fueron Ago2 y s-RNYs dependiente, tal como se evaluó por RT-PCR cuantitativa en BMDMs tratados con PA transfectadas con siAgo2, 2'-OMe-ARN antisentido oligonucleótidos para s -RNYs, o de control (Figura 11, y datos no mostrados). Estos datos indican que el perfil de expresión de ARNm alterado de BMDMs expresando s-RNYs exhibe una firma que podría estar mediado por un objetivo directo de mRNA por s-RNYs.

Curiosamente, en la lista de los posibles ARNm que reconocen s-RNY, algunos genes han sido claramente demostrado ser importante en la regulación de la patogénesis de la aterosclerosis, la supervivencia celular y la respuesta anti-inflamatoria Fos, factor de Krüppel-como 2 (KLF2), Zfyve28, romboidal familia-1 (Rhbdf1), Fgfr1, lisil oxidasa (LOX) y NR4A1 (también conocido como Nur77). En particular, KLF2 es un factor de transcripción que tiene un anti-apoptóticos y un papel anti-inflamatorio en los macrófagos. KLF2 es downregulated en las lesiones ateroscleróticas de ratones ApoE -/- y LDLR -/- en comparación con ratones control y que llevan el doble knockout para ApoE y KLF2 desarrollan lesiones más graves y más rápido ateroscleróticas comparación con el control, lo que indica un papel protector de este gen. Los experimentos de transferencia Western confirmó que la regulación a la baja de la expresión KLF2 en BMDMs tratado-PA fue de hecho rescatado por la caída de Ago2 o de s-RNYs (datos no mostrados), indicando un papel importante jugado por s-RNYs en la regulación de la expresión de este gen. De acuerdo con las predicciones bioinformáticas, hay un único sitio de unión s-RNY1-3p en KLF2 mRNA (Figura 12A). Secuencia de conservación través de los vertebrados era más fuerte en el segmento que muestra complementaria a la región semilla de s-RNY1-3p (Figura 12B). Para evaluar si KLF2 mRNA está dirigido directamente por s-RNY1-3p, un constructo indicador se ha hecho que contiene 2 copias de la de tipo salvaje (wt) secuencia de KLF2 que tiene el sitio de unión para s-RNY1-3p, y el mutante clonado aguas abajo de un CDS de luciferasa. Es importante destacar que, el tratamiento PA de las células NIH-3T3 reprimió la actividad de luciferasa del constructo informador que contiene la secuencia en peso que fue rescatado por la caída de s-RNY1-3p (Figura 12C). En contraste, la construcción informadora de mutante no se vio afectada. En conjunto, estos datos indican que la expresión s-RNY afecta a la modulación de la expresión génica en macrófagos cargados de lípidos mediante la regulación directamente a nivel post-transcripcional un subconjunto crítico de mRNAs de la patogénesis de desarrollo de la aterosclerosis, como se ha demostrado para KLF2.

EJEMPLO 5: s-RNYs regulan la apoptosis y la respuesta inflamatoria en los macrófagos cargados de lípidos

De acuerdo con informes anteriores (Scull, CM, y Tabas, I. (2011) Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 31, 2792-2797; Seimon, TA et al (2010) Cell Metabolism 12, 467-482.), las figuras 13A y 13B muestran una activación de la apoptosis en los macrófagos tratados con estímulos pro-aterogénicas, tales como PA o Tg en combinación con Ld Lox. Por lo tanto, se han evaluado los efectos de la s-RNYs en BMDMs apoptosis mediante citometría de flujo. Como se muestra en la Figura 13A, inducción de la s-RNYs maduración mediante el uso de siRNA contra el bucle terminal del RNYs provoca una regulación al alza de la apoptosis mediada por el tratamiento PA, que es rescatado por co-transfección de los oligonucleótidos de 2'-OMe-ARN antisentido (SEC ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28) a s-RNYs. Por otra parte, se observa una regulación a la baja de la apoptosis cuando la expresión s-RNY endógeno es derribado en BMDMs tratados con PA o LDLox (Figuras 13A y 13B). En particular, mediante la promoción de s-RNY maduración se induce la apoptosis en BMDMs no tratados, que también es rescatado por co-transfección de los oligonucleótidos antisentido de 2'-OMe-ARN a s-RNYs (Figura 13C). Además, 2'-OMe-ARN oligonucleótido antisentido a s-RNYs inhibe la activación de la caspasa-3 en BMDMs tratados con PA (datos no mostrados), mientras que s-RNYs sobreexpresión es capaz de activar en BMDMs no estimuladas (datos no mostrados). Por lo tanto, estos resultados indican que los estímulos inducidos por s-RNYs aterogénicas son un componente intrínseco de la maquinaria de regulación de la apoptosis en los macrófagos cargados de lípidos.

Dado que el tratamiento PA promueve tanto la apoptosis y la respuesta inflamatoria en los macrófagos mediante la regulación de las vías de señalización receptores de tipo Toll aguas abajo de activación (TLR), incluyendo la quinasa c-Jun NH2-terminal (JNK), NF-kB y p38, se ha planteado la hipótesis de que s-RNYs puede regular el modo de PA de la acción en los macrófagos por última instancia, la modulación de estas vías de señalización. Los experimentos de tiempo revelaron que la activación de p38 reforzada con PA, que depende de la fosforilación de p38, empezó a las 9 h mientras que la activación de NF-KB, que depende de la degradación de I ^k B ^a , empezó después de 9 h de tratamiento (datos no mostrados). Como se informó anteriormente, el tratamiento ácidos grasos libres de BMDMs no mejoró significativamente la activación de JNK después de la fosforilación (datos no mostrados). Curiosamente, la expresión de s-RNY fue inducida por 9 h de tratamiento PA en BMDMs (Figura 14A), sugiriendo una correlación de temporización entre la inducción s-RNYs y activación de señalización celular, y un posible papel de la s-RNYs en la regulación de ellos. De hecho, los inventores han demostrado que NF-kappa B y la activación p-38 están ambos reducidos en s-RNYs caída en BMDMs tratados con PA (datos no mostrados), indicando que el s-RNYs promueven la activación de ambas vías de señalización. En consonancia con esta conclusión, s-RNYs sobreexpresión en BMDMs aumentó fuertemente la expresión inducida-PA de genes NF-kappa B-objetivo, como se demostró para el óxido nítrico sintasa 2 (NOS2A) (datos no mostrados). Por otra parte, el efecto de inducir s-RNY maduración en la regulación de la expresión de citoquinas de defunción y óxido nítrico activados por vía de NF- ^k B ha sido probado en BMDMs tratados con el lipopolisacárido activador de macrófagos general (LPS). Como se muestra en la Figura 15, s-RNYs mejorado una regulación positiva significativa de los ARNm que codifican para NOS2A, interleucina (IL) -6, IL-12b, y IL-1b. Por lo tanto estos datos indican que el s-RNYs activan p38 y NF-kappa B vías para promover en última instancia, la muerte celular y la respuesta pro-inflamatoria en los macrófagos.

EJEMPLO 6: s-RNYs son regulados por incremento en la sangre de modelos de ratón para la aterosclerosis y en pacientes con enfermedad de la arteria coronaria

Recientemente, se han encontrado cantidades significativas de miRNA en los fluidos corporales extracelulares, incluyendo sangre, orina, saliva y semen. Algunos miRNA circulantes en la sangre se han revelado con éxito como biomarcadores para varios trastornos humanos, tales como muchos tipos de cáncer, enfermedades cardiovasculares y lesiones cerebrales y hepáticas. Para evaluar si s-RNY puede ser considerado como nuevos biomarcadores para enfermedades derivadas de aterosclerosis, se ha determinado primero la presencia de s-RNY en el medio extracelular. Para ello, se aisló ARN del medio de BMDM tratado con PA y se midieron los niveles de expresión de s-RNY mediante RT-PCR cuantitativa (Figura 14B). El tratamiento con PA dio lugar a un enriquecimiento de ~ 100 veces de s-RNY en el medio extracelular en comparación con el control. Como los miRNA, los s-RNYs también son sorprendentemente estables en medio de cultivo celular. De hecho, la transferencia Northern de una combinación de medio y residuos de BMDM tratados con STS en diferentes puntos temporales reveló que los s-RNY fueron significativamente estables en el espacio extracelular (análisis de transferencia Northern que muestra la estabilidad de s-RNY1-5p en BMDM estimulados con 1 ^m M de estaurosporina (STS) durante 72 horas; datos no mostrados). Este resultado puede indicar que la estabilidad de S-RNY es causada probablemente por su asociación con complejo de proteínas, microvesículas, exosomas, cuerpos apoptóticos, o lipoproteínas, tal como se ha demostrado recientemente para miRNA extracelulares. De acuerdo con informes anteriores, los resultados de transferencia Northern muestran que las especies no-miARN, tales como U6 snRNA, son extremadamente inestables en el medio extracelular (datos no mostrados).

Para probar si los s-RNY están significativamente presentes en la sangre de modelos animales para la aterosclerosis, se han comparado los niveles de expresión de s-RNY en el plasma sanguíneo de ratones ApoE -/-, Idlr-/- y de control. Los animales fueron alimentados con dieta de pienso o HCD. Tal como se muestra en la Figura 16, la RT-PCR cuantitativa de plasma de sangre reveló que los s-RNY se regularon por incremento significativamente en ratones ApoE-/- y LDLR-/- en comparación con el control, y aún más cuando los ratones fueron alimentados con HCD.

Por lo tanto, debido a estos datos, se puede prever lógicamente que los s-RNY se pueden encontrar en cantidades significativas en los fluidos corporales humanos de pacientes con enfermedades relacionadas con la aterosclerosis. Para validar esta hipótesis, la expresión de los s-RNY se midió en 45 pacientes varones con enfermedad coronaria estable (CAD) y 45 sujetos varones normolipémicos sanos emparejados por la edad, en el contexto de un estudio de casos y controles (Bouisset F. et al. (2012) The American journal of cardiology 110, 197202). Las variables metabólicas y clínicas de los individuos con CAD y de control se resumen en la Tabla 2.

Tabla 2: Características clínicas y biológicas de la población de estudio

Entre los marcadores metabólicos, el colesterol total o LDL-colesterol (LDL-C) no fueron significativamente diferentes entre las dos cohortes, probablemente reflejando los efectos de los fármacos reductores de lípidos en pacientes de CAD. Sin embargo, los pacientes con CAD mostraron niveles más altos de lípidos pro-aterogénicos, tales como triglicéridos y lipoproteínas que contienen ApoB y ApoE (LPB:E), aumento de la CRP, disminución de los marcadores de lipoproteínas de alta densidad (HDL) ateroprotectoras, tales como los niveles de HDL-colesterol (HDL-C) y apoA-I. El Índice de masa corporal (IMC) y la circunferencia de la cintura no fueron significativamente diferentes entre los casos y los controles, pero la actividad física fue menor en los casos y se encontró el 84,4% de los fumadores actuales o anteriores en los casos en contra de 55,6% en los individuos de control. En conjunto, estas características clínicas y biológicas reflejan un aumento de la prevalencia de factores de riesgo cardiovasculares clásicos en pacientes con CAD. Se ha investigado una desregulación de la expresión de s-RNY en el suero de pacientes con CAD en comparación con los controles sanos. Los datos muestran una regulación por aumento significativa de la expresión de s-RNY1-5p en pacientes con CAD (p <0,001, Tabla 2 y la Figura 17A). s-RNY4-5p también se detectó en el suero humano y se encontró que estaba regulado por aumento en pacientes con CAD en suero en comparación con individuos de control (p <0,001, Tabla 3 y Figura 18A), mientras que s-RNY3-5p no se detectó en pacientes de CAD y control. Es importante destacar que se investigó la correlación entre los niveles de s-RNY1-5p y parámetros metabólicos individuales y marcadores de riesgo cardiovascular (Tabla 4).

Tabla 3: Características clínicas y biológicas de la población de estudio (s-RNY4-5p)

Tabla 4. Coeficientes de correlación de rango de Sperman entre s-RNYs y algunos parámetros metabólicos y factores de riesgo cardiovasculares en la población de estudio

s-RNY1-5p se correlacionó positivamente con los lípidos pro-aterogénicos (triglicéridos y LPB:E) y negativamente con marcadores de HDL (HDL-C y apoA-I). Los factores ambientales, tales como la actividad física y una condición inflamatoria, tal como se documenta por una PCR elevada, muestran una correlación positiva con RNY1-5p (Tabla 4). Se encontraron las mismas correlaciones para s-RNY4-5p (Tabla 4). En general, estos datos indican una fuerte correlación entre los s-RNYs y el riesgo de CAD, tal como fue atestiguado por la puntuación alta del área bajo las curvas ROC (Figura 17B y 18B), que apoya la hipótesis de que la medición de s-RNY1-5p y s-RNY4-5p podría mejorar la predicción del riesgo de CAD.

La regulación por incremento de ARN pequeños derivados de RNY (en particular, s-RNY1-5p) en pacientes con enfermedad de la arteria coronaria fue confirmada en una cohorte mayor de pacientes (n = 263) (véase la Tabla 5 y las Figuras 20-25).

Tabla 5: Características demográficas, clínicas y biológicas de los pacientes y controles

Claims (14)

R E IV IN D IC A C IO N E S

1. Procedimiento in vitro de diagnóstico o pronóstico de un trastorno relacionado con la aterosclerosis en un individuo, que comprende las etapas de:

a) determinar el nivel de expresión de al menos un biomarcador que consiste en un ARN Y pequeño (s-RNY) en una muestra biológica de dicho individuo,

b) comparar el nivel de expresión de dicho al menos un biomarcador con un valor de referencia,

c) deducir de dicha comparación si el individuo ha desarrollado o está en riesgo de desarrollar un trastorno relacionado con la aterosclerosis.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que dicho al menos un biomarcador se selecciona del grupo que consiste en s-RNY1-5p (SEQ ID NO: 7), s-RNY1-3p (SEQ ID NO: 8), s-RNY3-5p (SEQ ID NO: 9), s-RNY3-3p (SEQ ID NO: 10), s-RNY4-5p (SEQ ID NO: 11), s-RNY4-3p (SEQ ID NO: 12) y s-RNY5-3p (SEQ ID NO: 13) o variantes de los mismos.

3. Procedimiento, según la reivindicación 1 o 2, en el que dicho al menos un biomarcador es s-RNY1-5p (SEQ ID NO: 7) y/o s-RNY4-5p (SEQ ID NO: 11) y la muestra biológica es sangre entera, plasma o muestra de suero.

4. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho trastorno relacionado con la aterosclerosis es la enfermedad de la arteria coronaria.

5. Procedimiento de cribado para un compuesto adecuado para el tratamiento de un trastorno relacionado con la aterosclerosis, que comprende las etapas de:

a) poner en contacto un compuesto candidato con un s-RNY o un RNY,

b) identificar como compuesto adecuado para el tratamiento de un trastorno relacionado con la aterosclerosis, que inhibe la maduración de dicho RNY en s-RNY o que inhibe la actividad de dicho s-RNY.

6. Inhibidor de un s-RNY para su uso en el tratamiento de un trastorno relacionado con la aterosclerosis.

7. Inhibidor de un s-RNY para su uso, según la reivindicación 6, en el que dicho s-RNY se selecciona del grupo que consiste en s-RNY1-5p (SEQ ID NO: 7), s-RNY1-3p (SEQ ID NO: 8), s-RNY3-5p (SEQ ID NO: 9) y s-RNY4-5p (SEQ ID NO: 11).

8. Inhibidor de un s-RNY para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, en el que dicho inhibidor de un s-RNY inhibe al menos una proteína seleccionada del grupo que consiste en Ago2, complejo de ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas (hnRNP), Ro60 y La/SSB.

9. Inhibidor de un s-RNY para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que dicho inhibidor interactúa específicamente con al menos un ácido nucleico que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 (hRNY1), SEQ ID NO: 2 (hRNY3), SEQ ID NO: 3 (hRNY4) y SEQ ID NO: 4 (hRNY5).

10. Inhibidor de un s-RNY para su uso, según la reivindicación 9, en el que dicho inhibidor es un ácido nucleico que hibrida específicamente con al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7 (s-RNY1-5p), SEQ ID NO: 9 (s-RNY3-5p), SEQ ID NO: 8 (s-RNY1-3p) y SEQ ID NO: 11 (s-RNY4-5p).

11. Fármaco contra la aterosclerosis para su uso para tratar un trastorno relacionado con la aterosclerosis en un individuo, en el que dicho uso comprende diagnosticar o pronosticar el individuo con un trastorno relacionado con la aterosclerosis mediante la medición del nivel de expresión de al menos un biomarcador que consiste en un ARN Y pequeño (s-RNY) en una muestra biológica de dicho individuo.

12. Ácido nucleico aislado que consiste en la secuencia SEQ ID NO: 9 (s-RNY3-5p) o SEQ ID NO: 11 (s-RNY4-5p).

13. Pareja de cebadores adecuados para la amplificación de una secuencia de ácido nucleico que consiste en la SEQ ID NO: 9 (s-RNY3-5p) o la SEQ ID NO: 11 (s-RNY4-5p).

14. Uso de un ácido nucleico que se hibrida específicamente a una secuencia de ácido nucleico que consiste en SEQ ID NO: 9 (s-RNY3-5p) o SEQ ID NO: 11 (s-RNY4-5p) como sonda para el diagnóstico o pronóstico de un trastorno relacionado con la aterosclerosis.