WO2017111166A1 - Ｔｄｐ－４３細胞内存在量関連疾患治療剤 - Google Patents

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桂一 泉川
信弘 高橋
石川　英明
俊明 礒邉
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国立大学法人東京農工大学
公立大学法人首都大学東京
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a preventive and / or therapeutic agent for TDP-43 intracellular abundance-related diseases including ALS, and a pharmaceutical composition comprising the same as an active ingredient.
  • ALS Amyotrophic Lateral Sclerosis
  • ALS familial amyotrophic lateral sclerosis
  • ALS1 Cu / Zn superoxide dismutase 1 gene
  • Non-patent Document 2 genes that cause ALS include angiogenin (Non-patent Document 2), vesicle-associated protein (VAMP) / synaptobrevin-associated protein-B (Non-Patent Document 3), TAR-DNA-binding protein 43 (TAR-DNA-binding protein-43: hereinafter referred to as "TDP-43" in this specification) (Non-patent Document 4), and fused in sarcoma / translated Genes such as in liposarcoma (FUS / TLS) (Non-patent Document 5) have been reported. However, the specific mechanism of how ALS develops and the pathology progresses due to these genetic abnormalities has not been clarified.
  • Non-Patent Document 6 discloses that in 3 out of 6 patients with familial ALS, there is a mutation in the gene for optineurin that suppresses NF ⁇ B involved in intracellular signal transduction. . Mutant optineurin has lost the inhibitory activity of NF ⁇ B, suggesting that NF ⁇ B inhibitors may have a therapeutic effect on ALS. However, 90-95% of ALS are sporadic and many ALS patients have found mutations in the TDP-43 gene rather than the optineurin gene. Therefore, even if the NF ⁇ B inhibitor has an effect on ALS treatment, the therapeutic effect can be expected only in a small part of ALS patients.
  • Non-Patent Document 7 shows that the concentration of glutamic acid (hereinafter often abbreviated as “Glu”) in the cerebrospinal fluid of an ALS patient having a mutant SOD1 gene is 3 compared to a healthy subject having a wild-type SOD1 gene.
  • Glu poison associated with increased Glu is important in the pathogenesis of ALS, as it is nearly doubled, and collective studies have confirmed that Glu increases in cerebrospinal fluid in approximately 40% of sporadic ALS patients This suggests that he plays a role. This increase in Glu in ALS patients is thought to be due to a loss of Glu uptake in astrocytes.
  • Glu toxins especially Glu toxins due to Glu increase through ⁇ -amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) receptor, a subtype of glutamate receptor
  • AMPA ⁇ -amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid
  • Non-patent Document 13 disclose the results of clinical trials in which Riluzole can significantly extend the survival of patients with ALS, albeit slightly.
  • Riluzole is an antagonist of glutamate developed based on the above hypothesis. At present, only this riluzole is approved in Europe, the United States and Japan as a treatment for ALS (trade name: Riltech). However, riluzole does not suppress the increase in Glu, which is the cause of ALS, but is only a coping therapy that reduces the effect of Glu poisoning due to an increase in Glu. There is no sex.
  • Patent Document 1 discloses that a large amount of methylcobalamin (Methylcobalamin) gives a certain improvement effect on the clinical symptoms of ALS.
  • methylcobalamin a large amount of methylcobalamin (Methylcobalamin) gives a certain improvement effect on the clinical symptoms of ALS.
  • this drug is also mainly based on the inhibitory effect on cell death caused by glutamic acid (Non-Patent Document 14), and it cannot be expected to greatly improve the effect of riluzole.
  • a high concentration of methylcobalamin competitively inhibits DNA methylation by S-adenosylmethionine, so that high gene transcription can be maintained (Non-patent Document 15). Therefore, it has been speculated that this may promote the synthesis of various proteins necessary for nerve regeneration, resulting in the protection of motor neurons in the spinal cord and cerebrum. There is no evidence to show any relevance, and it is merely general reasoning.
  • Non-patent Documents 16 to 23 the TDP-43 gene with high mutation frequency has been suggested in both familial ALS and sporadic ALS. It is also known that deposits containing TDP-43 accumulate in the cytoplasm in cells at the lesion site (Non-patent Document 17). However, the mechanism of TDP-43 in cells and how the TDP-43 gene mutation is related to the development of ALS has never been known.
  • the present inventors conducted a study of TDP-43, which has the highest mutation frequency among ALS patients, in order to find an effective treatment for ALS.
  • TDP-43 an increase in the expression level of TDP-43, or the expression of mutant TDP-43 found in ALS patients, induced cell death, which was induced by TDP-43 and specific mitochondrial tRNA (hereinafter referred to as this
  • mt-tRNA specific mitochondrial tRNA
  • the present inventors identified each binding site in the binding between TDP-43 and a specific mt-tRNA, and based on the identification result, TDP-43 and a specific mt-tRNA We have developed a binding inhibitor that can selectively inhibit the binding. In addition, a prophylactic / therapeutic agent for TDP-43 intracellular abundance-related diseases was developed using this binding inhibitor as an active ingredient.
  • the present invention is based on the development result and provides the following.
  • a binding inhibitor between TDP-43 and mt-tRNA (a) a molecule that binds to a region consisting of all or part of the variable region in mt-tRNA, (b) the variable region in mt-tRNA A molecule that shields a region consisting of all or part of (c) selected from the group consisting of lysine at position 136, lysine at position 145, phenylalanine at position 147 and phenylalanine at position 149 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: A molecule that binds to a region consisting of a part of TDP-43 containing at least one amino acid, or (d) lysine at position 136, lysine at position 145, phenylalanine at position 147, and position 149 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 It consists of a molecule that shields a region consisting of a part of TDP-43 containing at least one amino acid selected from the
  • the nucleic acid comprises a nucleotide comprising any one of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 2 (guguuugugg), SEQ ID NO: 3 (cagggau), SEQ ID NO: 4 (auggugg), and SEQ ID NO: 5 (uuggucg), and TDP-43
  • SEQ ID NO: 2 guguuugugg
  • SEQ ID NO: 3 cagggau
  • SEQ ID NO: 4 auggugg
  • SEQ ID NO: 5 uuggucg
  • the nucleic acid comprises a nucleotide containing a base sequence complementary to a region consisting of all or part of the variable region in the mt-tRNA, and binds to any one of the mt-tRNAs. Binding inhibitors.
  • variable region in the mt-tRNA consists of any one of the base sequences represented by SEQ ID NO: 6 (cuaaguguuuguggg), SEQ ID NO: 7 (uucucagggauggg), SEQ ID NO: 8 (gcuaaugguggagu), and SEQ ID NO: 9 (aucauuggucgugg)
  • SEQ ID NO: 6 cuaaguguuuguggg
  • SEQ ID NO: 7 uucucagggauggg
  • SEQ ID NO: 8 gcuaaugguggagu
  • SEQ ID NO: 9 aucauuggucgugg
  • the peptide comprises an amino acid sequence at positions 136 to 149 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and consists of a peptide having a total length of 100 amino acids or less, and binds to any one of the mt-tRNAs described in (2) The binding inhibitor described.
  • a pharmaceutical composition for treating a TDP-43 intracellular abundance-related disease comprising as an active ingredient the binding inhibitor of TDP-43 and mt-tRNA according to any one of (1) to (7).
  • TDP-43 intracellular abundance-related disease is selected from the group consisting of amyotrophic lateral sclerosis, frontotemporal lobar degeneration, Alzheimer's disease, and Parkinson's disease. Composition.
  • the binding inhibitor between TDP-43 of the present invention and a specific mt-tRNA can be used as an active ingredient of a pharmaceutical composition for treating a disease associated with TDP-43 intracellular abundance.
  • the pharmaceutical composition for treating TDP-43 intracellular abundance-related diseases of the present invention is a treatment of TDP-43 intracellular abundance-related diseases such as ALS and frontotemporal lobar degeneration, for which conventional effective treatment methods are not known. Can be law.
  • FIG. IP is a result showing each RNA co-immunoprecipitated from the cell extract by DAP-TDP-43 pull-down.
  • Input is the result showing each RNA in the cell extract.
  • Mt-tRNA Asn and mt-tRNA Gln in the upper two figures are the results of Northern blotting, and the third 5S rRNA in the upper stage is the result of PAGE.
  • Biotin at the bottom is the detection result of DAP-TDP-43 by Western blot.
  • Dox indicates doxycycline. The base sequences of various chimeric mt-tRNAs of mt-tRNA Asn and mt-tRNA Leu prepared in Example 3 are shown.
  • 1 is the base sequence of the parental wild-type mt-tRNA Asn
  • 2 is the base sequence of the chimeric mt-tRNA whose acceptor stem region is derived from mt-tRNA Leu
  • 3 is the chimeric mt whose D-loop region is derived from mt-tRNA Leu -tRNA base sequence
  • 4 is a base sequence in a chimeric mt-tRNA whose anticodon loop region is derived from mt-tRNA Leu
  • 5 is a base sequence in a chimeric mt-tRNA whose variable region is derived from mt-tRNA Leu
  • 6 is a U-loop
  • the region is the base sequence of the chimeric mt-tRNA derived from mt-tRNA Leu
  • 7 is the base sequence of wild-type mt-tRNA Leu .
  • the underlined portion indicates a region substituted with a sequence derived from mt-tRNA Leu .
  • the illustrated base U uracil
  • T thymine
  • the result of the gel shift assay of Example 3 is shown.
  • the figure shows the results for positive control wild type mt-tRNA Asn and negative control wild type mt-tRNA Lue .
  • the lower band in lanes 1 to 3 indicates free mt-tRNA Asn
  • the lower band in lanes 4 to 6 indicates free mt-tRNA Leu .
  • the upper band in lane 3 shows the TDP-43-mt-tRNA complex.
  • NT indicates inhibitor candidate nucleic acid treatment (Nucleic acid Treatment)
  • TF indicates Trigger factor.
  • the result of the gel shift assay of Example 3 is shown.
  • This figure shows the results for each chimeric mt-tRNA.
  • the lower band in all lanes represents each free chimeric mt-tRNA Asn .
  • the upper bands in lanes 3, 6, 9, and 12 indicate TDP-43-mt-tRNA complexes composed of each chimeric mt-tRNA and TDP-43.
  • the result of the gel shift assay of Example 3 is shown. This figure shows the results for each chimeric mt-tRNA.
  • the lower band in all lanes represents each free chimeric mt-tRNA Asn .
  • the upper bands in lanes 3, 6 and 9 show the TDP-43-mt-tRNA complex consisting of each chimeric mt-tRNA and TDP-43. It can be seen that the amount of the complex of chimeric mt-tRNA and TDP-43 in lane 6 is significantly reduced. It is the figure which inhibited the coupling
  • A shows the base sequence of each mt-tRNA Asn inhibitor candidate used. The bold letters indicate the base sequences constituting the loop part of the variable region.
  • NT indicates untreated inhibitor candidate nucleic acid
  • IP indicates co-immunoprecipitation
  • NB indicates Northern blot
  • WB indicates Western blot.
  • a first aspect of the present invention is a binding inhibitor between TDP-43 and a specific mt-tRNA (herein referred to as “TDP-43 / mt-tRNA binding inhibitor” or simply “binding inhibitor”). ).
  • the TDP-43 / mt-tRNA binding inhibitor of the present invention is composed of a substance that binds to any of the binding sites in TDP-43 and a specific mt-tRNA and inhibits the binding of both. According to the TDP-43 / mt-tRNA binding inhibitor of the present invention, it can be used as an active ingredient of a therapeutic pharmaceutical composition in TDP-43 intracellular abundance-related diseases.
  • TAR DNA binding protein-43 (TDP-43: TAR DNA-binding protein 43 kDa) is a kind of heteronuclear ribonucleoprotein (hnRNP). It has two RRM (RNA Recognition Motif) domains that are RNA binding sequences in the molecule, and functions as a scaffold protein that serves as a scaffold in biosynthesis or metabolism of four types of mt-tRNA and amino acids. In addition, the intracellular abundance of the four types of mt-tRNAs and amino acids is controlled by moving back and forth between the nucleoplasm and the cytoplasm (WO2013 / 129603).
  • TDP-43 is a region other than the mt-tRNA binding region described later in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, in addition to human wild-type TDP-43 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, A human mutant TDP-43 consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids have been added, deleted and / or substituted, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, preferably two amino acid sequences other than RRM and 85 %, 90%, 95%, 97%, 98% or more of an amino acid sequence having an amino acid identity and having a function equivalent to that of human wild-type TDP-43 Includes orthologs.
  • plurality means an integer of 2 to 10, for example, an integer of 2 to 7, 2 to 5, 2 to 4, or 2 to 3.
  • identity means that when two amino acid sequences are aligned so that the number of amino acid matches is maximized while introducing gaps in one or both as necessary, The ratio (%) of the number of matched amino acids in the other amino acid sequence to the total number of amino acids in the alignment target region in the amino acid sequence.
  • alanine at position 90 is valine (A90V) (hereinafter, the amino acid position in SEQ ID NO: 1 is indicated by a numerical value, The wild-type amino acid at that position is indicated before the numerical value, the amino acid after the mutation is indicated by a single letter, respectively), aspartic acid at position 169 is glycine (D169G), and asparagine at position 267 is serine (N267S) Glycine at position 287 is serine (G287S), glycine at position 290 is alanine (G290A), serine at position 292 is asparagine (S292N), and glycine at position 294 is alanine (
  • mt-tRNA refers to the four types of mt-tRNA that can bind to TDP-43. The four are in mt-tRNA Asn SEQ ID NO: 10, in mt-tRNA Gln SEQ ID NO: 11, mt-tRNA Pro is in SEQ ID NO: 12, and mt-tRNA Glu is shown in SEQ ID NO: 13.
  • TDP-43-mt-tRNA complex refers to an RNA protein complex formed by the binding of TDP-43 and a specific mt-tRNA.
  • the TDP-43-mt-tRNA complex is composed of a mt-tRNA binding region on TDP-43 and a TDP-43 binding region on a specific mt-tRNA.
  • mt-tRNA binding region refers to a partial region on the amino acid sequence of TDP-43 that is directly involved in binding to a specific mt-tRNA.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is used as the reference amino acid sequence of TDP-43, the mt-tRNA binding region has four amino acids shown in FIG. 1, namely, lysine at position 136 (K136) and lysine at position 145 (K145 ), Phenylalanine (F147) at position 147, and phenylalanine (F149) at position 149.
  • TDP-43 is the above-mentioned human mutant TDP-43 or TDP-43 ortholog of another species, when the amino acid sequence is aligned with the amino acid sequence of human TDP-43 represented by SEQ ID NO: 1, K136, Amino acid regions containing amino acids at four positions corresponding to K145, F147, and F149 correspond.
  • TDP-43 binding region refers to a region on the base sequence of a specific mt-tRNA that is directly involved in binding to TDP-43.
  • the TDP-43 binding region is composed of all or part of a variable region of a specific mt-tRNA.
  • the variable region of each mt-tRNA is the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 (CUAAGUGUUUGUGGG) in mt-tRNA Asn , the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 (UUCUCAGGGAUGGG) in mt-tRNA Gln , and the sequence number 8 in mt-tRNA Pro.
  • the TDP-43 binding region is at least SEQ ID NO: 2 (GUGUUUGUGG) if it is mt-tRNA Asn , at least SEQ ID NO: 3 (CAGGGAU) if it is mt-tRNA Gln , and if it is mt-tRNA Pro.
  • SEQ ID NO: 4 (AUGGUGG) contains at least the base sequence shown by SEQ ID NO: 5 (UUGGUCG).
  • TDP-43 / mt-tRNA binding inhibitor refers to a molecule that inhibits the formation of a TDP-43-mt-tRNA complex.
  • a binding inhibitor is a blocking molecule (blocker) that binds to a target substance, shields the binding region, and physically blocks the partner molecule to which the target substance should originally bind to the binding region.
  • antagonist molecules that have a structure similar to the partner molecule that can bind to the binding region of the partner molecule and compete with the partner molecule over the binding region are known.
  • the 43 / mt-tRNA binding inhibitor may be either.
  • TDP-43 / mt-tRNA binding inhibitors of the present invention can be broadly classified into TDP-43 inhibitors and mt-tRNA inhibitors based on the target target.
  • the composition of each inhibitor is as follows.
  • TDP-43 inhibitor refers to a molecule that targets TDP-43, binds to a part or all of the mt-tRNA binding region of TDP-43, Alternatively, part or all of the mt-tRNA binding region of TDP-43 is shielded to inhibit TDP-43 from binding to a specific mt-tRNA.
  • part of the mt-tRNA binding region means a group consisting of K136, K145, F147, and F149 in the mt-tRNA binding region, preferably K136, K145, F147, and F149 (in this specification, A region comprising at least one of the amino acids selected from the group consisting of (often expressed as “F147 / F149”).
  • the TDP-43 inhibitor includes a nucleic acid TDP-43 inhibitor, a peptide TDP-43 inhibitor, a low molecular compound TDP-43 inhibitor, and a combined TDP-43 inhibitor.
  • a nucleic acid TDP-43 inhibitor and the peptide TDP-43 inhibitor will be described.
  • Nucleic acid TDP-43 inhibitor is a TDP-43 inhibitor composed of nucleic acids.
  • the nucleic acid constituting the nucleic acid TDP-43 inhibitor includes non-natural nucleic acids in addition to natural nucleic acids such as DNA and / or RNA.
  • non-natural nucleic acid refers to an artificially constructed nucleic acid analog having a structure and / or property similar to that of a natural nucleic acid.
  • nucleic acid constituting the nucleic acid TDP-43 inhibitor may be any of the aforementioned nucleic acids.
  • it is a natural nucleic acid, that is, a nucleic acid consisting only of DNA, RNA, or a combination thereof, or a nucleic acid containing one or several non-natural nucleic acids.
  • Nucleic acids constituting nucleic acid TDP-43 inhibitors include fluorescent dyes (eg, fluorescamine and derivatives thereof, rhodamine and derivatives thereof, FITC, cy3, cy5, FAM, HEX, VIC), quencher substances (TAMRA, DABCYL , BHQ-1, BHQ-2, or BHQ-3), modified with biotin or (strept) avidin, or a modifying substance such as magnetic beads, or isotopes (eg, 32 P, 33 P, 35 S) or the like It can also be labeled.
  • the modification / labeling position of these modifying substances and the like may be determined as appropriate according to the properties of the modifying substances and the purpose of use. Generally, it is often modified at the 5 ′ or 3 ′ end of a nucleic acid TDP-43 inhibitor.
  • One nucleic acid TDP-43 inhibitor may be modified with one or more modifying substances.
  • nucleic acid TDP-43 inhibitors include antagonist nucleic acids or nucleic acid aptamers that bind to the mt-tRNA binding region of TDP-43.
  • each nucleic acid TDP-43 inhibitor will be specifically described.
  • the “antagonist nucleic acid” is a nucleotide that binds to a nucleic acid binding region of a target substance and functions as an antagonist.
  • the antagonist nucleic acid goes around the nucleic acid binding region of the target substance and competes with a counterpart nucleic acid molecule that should originally bind to the nucleic acid binding region.
  • the antagonist nucleic acid includes, for example, an inactive form of the partner nucleic acid molecule that maintains the binding property to the target substance, a nucleotide that is structurally similar to the partner nucleic acid molecule, and a partner nucleic acid molecule that includes a binding region for the target substance. Examples include nucleotides composed of a part.
  • the nucleic acid constituting the antagonist nucleic acid may be a natural nucleic acid or a non-natural nucleic acid, DNA or RNA as described above, but is preferably RNA.
  • nucleic acid TDP-43 inhibitor examples include inactive mt-tRNA retaining the TDP-43 binding region (for example, a specific mt-tRNA having a mutation in the anticodon loop), TDP- 43 nucleotides comprising all or part of the variable region including the binding region.
  • nucleotides comprising a part of the variable region include nucleotides containing at least the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 (GUGUUUGUGG) in the case of mt-tRNA Asn , and at least SEQ ID NO: 3 (CAGGGAU) in the case of mt-tRNA Gln.
  • a nucleotide containing the nucleotide sequence shown in FIG. 4 a nucleotide containing at least the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 (AUGGUGG) in the case of mt-tRNA Pro , and a nucleotide sequence shown in at least SEQ ID NO: 5 (UUGGUCG) in the case of mt-tRNA Glu Including nucleotides.
  • mt-tRNA Asn for example, a nucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 14 (GUGUUUGUGGG) or SEQ ID NO: 15 (AAGUGUUUGUGGG), in the case of mt-tRNA Gln , for example, SEQ ID NO: 28 (CAGGGAUGGG) or nucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 29 (CUCAGGGAUGGG), for mt-tRNA Pro , for example, nucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 30 (AUGGUGGAGU) or SEQ ID NO: 31 (UAAUGGUGGAGU), and If it is mt-tRNA Glu , the nucleotide which consists of a base sequence shown by sequence number 32 (UUGGUCGUGG) or sequence number 33 (CAUUGGUCGUGG) will be mentioned, for example.
  • the antagonist nucleic acid in the nucleic acid TDP-43 inhibitor has one or more other bases at the 5 ′ end and / or 3 ′ end in addition to the whole or a part of the variable region which is the TDP-43 binding region.
  • a plurality may be included.
  • it may be a nucleotide consisting of SEQ ID NO: 16 (AAGUGUUUGUGGGUUU) in which a part of the base sequence constituting the U loop is linked to the 3 'end of the nucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 (AAGUGUUUGUGGG).
  • aptamer is a ligand molecule that has the ability to specifically bind to a target substance.
  • the aptamer can be firmly and specifically bound to the target substance by its three-dimensional structure, and can specifically inhibit the function of the target substance.
  • nucleic acid aptamer is an aptamer composed of nucleic acids, and is based on a secondary structure of a single-stranded nucleic acid molecule through a hydrogen bond or the like, and a three-dimensional structure formed based on a tertiary structure.
  • a ligand molecule that binds strongly and specifically to a target substance and has the ability to specifically inhibit or suppress functions such as physiological activity of the target substance.
  • nucleic acid aptamer an RNA aptamer composed only of RNA and a DNA aptamer composed only of DNA are known, but the nucleic acid constituting the nucleic acid aptamer in the present specification is not particularly limited.
  • DNA aptamer, RNA aptamer, aptamer composed of a combination of DNA and RNA, and the like are included.
  • the target substance of the nucleic acid aptamer in this embodiment is TDP-43.
  • Nucleic acid aptamers bind to the mt-tRNA binding region of TDP-43, or bind to other regions of TDP-43, blocking all or part of the binding region, and certain mt-tRNAs Functions as a blocking molecule that prevents binding to the -43 mt-tRNA binding region.
  • RNA aptamer When a nucleic acid aptamer is produced, if it is an RNA aptamer, it can be produced by, for example, in-vitro sorting using a SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) method.
  • the SELEX method selects and collects RNA molecules bound to the mt-tRNA binding region of the target substance TDP-43 from an RNA pool composed of random sequence regions and RNA molecules that have primer binding regions at both ends. Later, after amplification by RT-PCR reaction, transcription is performed using the obtained cDNA molecule as a template, and the next round of RNA pool is repeated several to several tens of rounds to bind more to the target substance. This is a method for selecting strong RNA.
  • the base sequence lengths of the random sequence region and the primer binding region are not particularly limited. Usually, the random sequence region ranges from 20 to 80 bases, and the primer binding region ranges from 15 to 40 bases.
  • a molecule similar to the target substance and an RNA pool may be mixed and a pool of RNA molecules that have not bound to the molecule may be used.
  • the RNA molecule finally obtained by such a method is used as an RNA aptamer.
  • the SELEX method is a known method, and a specific method may be performed according to, for example, Pan et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., (1995) 92: 11509-11513).
  • Peptide TDP-43 inhibitor is a TDP-43 inhibitor composed of peptides. Like the nucleic acid aptamer, the peptide TDP-43 inhibitor binds to the mt-tRNA binding region of TDP-43, which is the target substance, or binds to another region of TDP-43 and binds to the binding region. And functions as a shielding molecule that blocks specific mt-tRNA from binding to the mt-tRNA binding region of TDP-43.
  • peptidic inhibitors include an antibody (anti-TDP-43 antibody) to TDP-43, which is a target substance, or a fragment thereof.
  • anti-TDP-43 antibody an antibody to TDP-43
  • the anti-TDP-43 antibody and fragments thereof will be specifically described.
  • Anti-TDP-43 antibody is an antibody that shows immunoreactivity to TDP-43.
  • the anti-TDP-43 antibody of the present specification recognizes part of the amino acid sequence constituting TDP-43 as an epitope, specifically binds to TDP-43, and can block the mt-tRNA binding region of TDP-43. Any antibody may be used.
  • an anti-TDP-43 antibody having a part of the mt-tRNA binding region as an epitope can be mentioned.
  • a specific epitope for example, in the amino acid sequence of human TDP-43 represented by SEQ ID NO: 1, it contains at least one amino acid of K136, K145, F147, or F149, and 5-20, 7-18, or Examples thereof include peptides consisting of 8 to 15 consecutive amino acid sequences. As an example, a peptide consisting of 14 amino acids at positions 136 to 149 in the amino acid sequence of human TDP-43 represented by SEQ ID NO: 1 is applicable.
  • the species of the antibody used in the present invention is not particularly limited. Birds and mammals may be used. Examples include chickens, ostriches, mice, rats, guinea pigs, rabbits, goats, donkeys, sheep, camels, horses, humans, and the like.
  • the antibody used in the present invention is an antibody that recognizes an epitope on the amino acid sequence of TDP-43, shows immunoresponsiveness to TDP-43, and can block the mt-tRNA binding region, it may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. Any of antibodies may be used. Moreover, the serum containing a polyclonal antibody may be sufficient.
  • polyclonal antibody refers to a group of different types of immunoglobulins that can specifically bind to and recognize the aforementioned antigen peptide.
  • the “monoclonal antibody” refers to a single type of immunoglobulin that specifically binds to and recognizes an antigen, or at least one set of light chain variable regions contained in an immunoglobulin ( V L region) and a synthetic or recombinant antibody including a heavy chain variable region (V H region).
  • the immunoglobulin can be of any class (eg, IgG, IgE, IgM, IgA, IgD and IgY), or any subclass (eg, IgG1, IgG2, IgG3). , IgG4, IgA1, IgA2).
  • “Synthetic antibody” refers to an antibody synthesized chemically or by using recombinant DNA methods. For example, an antibody newly synthesized using a recombinant DNA method can be mentioned. Specific examples include scFv (single chain fragment of variable region), diabody, triabody, and tetrabody. In the immunoglobulin molecule, a set of variable region to form a functional antigen binding site (the light chain variable region, V L and heavy chain variable regions V H) is located on separate polypeptide chains called light chain and heavy chain To do.
  • scFv in the immunoglobulin molecule, the V L and V H joined by a flexible linker long enough, a molecular weight of about 35kDa following synthetic antibodies with a structure included in a single polypeptide chain.
  • a set of variable regions can self-assemble with each other to form a functional antigen binding site.
  • scFv can be obtained by incorporating recombinant DNA encoding it into a vector using known techniques and expressing it.
  • Diabodies are molecules having a structure based on the dimeric structure of scFv (Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448).
  • the linker is shorter than about 12 amino acid residues, the two variable regions in the scFv cannot self-assemble, but by interacting the two scFvs to form a diabody, one scFv the V L becomes possible set the V H of the other scFv, it can form two functional antigen binding sites. Furthermore, by adding a cysteine residue to the C-terminal of scFv, a disulfide bond between two scFvs becomes possible and a stable diabody can be formed. Thus, a diabody is a bivalent antibody fragment.
  • Triabodies and tetrabodies are trivalent and tetravalent antibodies, respectively, having their trimer and tetramer structures based on the scFv structure as in diabodies.
  • Diabodies, triabodies, and tetrabodies may be multispecific antibodies.
  • Multispecific antibody refers to a multivalent antibody, that is, an antibody having a plurality of antigen-binding sites in one molecule, and each antigen-binding site binds to a different epitope.
  • bispecific antibodies Bispecific antibodies in which each antigen-binding site binds to a different epitope can be mentioned.
  • “Recombinant antibody” refers to a chimeric antibody or a humanized antibody.
  • a “chimeric antibody” is an antibody prepared by combining amino acid sequences of antibodies from different animals, and is an antibody in which the constant region (C region) of one antibody is replaced with the C region of another antibody. For example, an antibody in which the C region of a mouse monoclonal antibody is replaced with the C region of a human antibody is applicable.
  • a “humanized antibody” is a mosaic antibody in which the CDR of a human antibody is replaced with the CDR of an antibody derived from a mammal other than a human.
  • the antibody used in the present invention can be modified as necessary.
  • the modifications herein include functional modifications necessary for antigen-specific binding activity such as glycosylation and modifications on the label necessary for antibody detection.
  • Glycosylation modifications on the antibody are made to adjust the affinity of the antibody for the target target, TDP-43.
  • modification in which the glycosylated amino acid residue is removed by substitution in the framework region of the antibody variable region can be mentioned.
  • fluorescent dyes FITC, rhodamine, Texas Red, Cy3, Cy5
  • fluorescent proteins eg, PE, APC, GFP
  • enzymes eg, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase
  • radioisotopes eg, 3 H, 14 C, 35 S
  • biotin or (strept) avidin can be used to label the antibody.
  • the anti-TDP-43 antibody used in the present invention can be obtained by a conventional method in the art using an antigen peptide prepared based on the amino acid sequence information of the above-described epitope as an immunogen.
  • immunogen information can be presented and outsourced to each manufacturer.
  • a general method for producing immunity in the art will be briefly described.
  • an immunogen solution prepared by dissolving the TDP-43 fragment, which is an immunogen, in a buffer solution is administered to a mammal, such as a rat, mouse, rabbit, or the like, which is an immunized animal, and immunized.
  • an adjuvant may be added as necessary to effectively immunize.
  • the adjuvant commercially available complete Freund's adjuvant (FCA), incomplete Freund's adjuvant (FIA) and the like can be used alone or in combination.
  • FCA complete Freund's adjuvant
  • FIA incomplete Freund's adjuvant
  • the immunogen administration method include, but are not limited to, subcutaneous injection using FIA or FCA, intraperitoneal injection using FIA, or intravenous injection using sodium chloride.
  • the single dose of the immunogen is appropriately determined depending on the type of immunized animal, the route of administration, etc., and is about 50 to 200 ⁇ g per animal.
  • the immunization interval is not particularly limited, and after the initial immunization, booster immunization is performed 2 to 6 times, preferably 3 to 4 times at intervals of several days to several weeks, preferably at intervals of 1 to 4 weeks.
  • the antibody titer in the serum of the immunized animal is measured by ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) method. If the antibody titer rises sufficiently, the immunogen is injected intravenously or intraperitoneally And final immunization.
  • antiserum containing the polyclonal antibody can be obtained by collecting whole blood from the immunized animal after the final immunization.
  • antibody-producing cells are collected to prepare a hybridoma that produces the monoclonal antibody.
  • Antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, peripheral blood cells, etc., but spleen cells or local lymph node cells are preferred.
  • a hybridoma producing an anti-TDP-43 monoclonal antibody can be produced by cell fusion of antibody-producing cells obtained from an immunized animal and myeloma cells.
  • myeloma cells to be fused with antibody-producing cells generally available cell lines derived from mice and the like can be used.
  • the cell line to be used has drug selectivity and cannot survive in a HAT selection medium (including hypoxanthine, aminopterin, thymine) in an unfused state, and can only grow in a state fused with antibody-producing cells. Those having the following are preferred.
  • the cell line is preferably derived from an animal of the same species as the immunized animal.
  • Myeloma cells are, for example, P3X62-Ag.8 strain (ATCCTIB9), P3X63-Ag.8.U1 strain (JCRB9085), P3X63-Ag.8. / NSI / 1-Ag4-1 strain (JCRB0009), P3x63Ag8.653 strain (JCRB0028), SP2 / 0-Ag14 strain (JCRB0029) or the like can be used.
  • antibody-producing cells and myeloma cells are mixed at a ratio of about 1: 1 to 20: 1 in an animal cell culture medium such as serum-free DMEM or RPMI1640 medium in the presence of a cell fusion promoter. And merge.
  • a cell fusion promoter a 10 to 80% solution of polyethylene glycol (PEG) or the like having an average molecular weight of 1,5 kDa to 4 kDa may be used.
  • adjuvants such as a dimethylsulfoxide, can also be used together.
  • electrical stimulation for example, electroporation
  • the cell suspension is appropriately diluted with, for example, RPMI1640 medium containing fetal bovine serum, and then mixed with a 96-well microbe. seeded onto microtiter plates at about 2 ⁇ 10 6 cells / well, it may be cultured with the selective medium to each well.
  • the culture temperature is 20 to 40 ° C, preferably 37 ° C.
  • myeloma cells are HGPRT-deficient or thymidine kinase (TK) -deficient strains
  • TK thymidine kinase
  • only hybridomas of antibody-producing cells and myeloma cells can be obtained by culturing in a selection medium (HAT medium) containing hypoxanthine, aminopterin, and thymidine. It can be selectively grown and propagated. Therefore, cells that grow from about 10 days after the start of culture in a selective medium may be selected as hybridomas.
  • HAT medium selection medium
  • the antibody that produces the selected hybridoma is further selected using as an index the binding activity to TDP-43.
  • antibodies having binding activity to TDP-43 are subjected to a cross-ability test, and hybridomas that produce an acceptable antibody are selected.
  • Acceptable crossing means a negligible degree of crossing in the intended use of the antibody.
  • an ELISA method may be used.
  • the anti-TDP-43 monoclonal antibody can be obtained from the prepared hybridoma by ascites the host animal. Specifically, it is produced in the abdominal cavity of an animal (for example, mouse) of the same kind as the cell derived from the fusion partner (for example, spleen cell and myeloma cell) used in preparing the hybridoma, or immunodeficient animal (for example, nude mouse).
  • Ascites fluid containing the target anti-TDP-43 monoclonal antibody can be recovered by inoculating the hybridoma and collecting ascites as appropriate. More specifically, ascites fluid containing antibodies can be collected by inoculating hybridomas using SP2 / 0 cells as fusion partners into the peritoneal cavity of BALB / c mice 10 days after pristane inoculation.
  • the hybridoma in this invention can be used for antibody production by culturing using a suitable culture medium. Specifically, inoculate the hybridoma in a hybridoma SFM medium (Thermo Fisher Scientific) at 1 ⁇ 10 5 cells / mL and incubate in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. until the hybridoma dies. To obtain a culture supernatant containing an anti-TDP-43 monoclonal antibody.
  • a suitable culture medium Specifically, inoculate the hybridoma in a hybridoma SFM medium (Thermo Fisher Scientific) at 1 ⁇ 10 5 cells / mL and incubate in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. until the hybridoma dies.
  • amino acid sequence of the anti-TDP-43 monoclonal antibody is known (Kabat EA, et al., 1991, Sequences of proteins of immunological interest, Vol.1, eds.5, NIH publication ), May be prepared by using chemical synthesis methods or recombinant DNA techniques.
  • Antibody fragment comprises a part of the anti-TDP-43 antibody and exhibits immunoreactivity to TDP-43 in the same manner as the anti-TDP-43 antibody. It is a polypeptide that can shield the mt-tRNA binding region.
  • antibody fragments include Fab, F (ab ′) 2 , Fab ′ and the like.
  • Fab is an antibody fragment generated by cleaving IgG molecules constituting anti-TDP-43 antibody with papain.
  • H chain constant region three domains (heavy chain constant region following C H and hereinafter) constituting the (C H 1, C H 2, C H 3) adjacent to the V H of C H 1 and V H, And a full-length light chain (L chain).
  • F (ab ′) 2 is a dimer of Fab ′ produced by cleaving IgG molecules with pepsin.
  • Fab ' has a structure substantially equivalent to that of Fab, although the H chain is slightly longer than Fab so as to include the hinge part.
  • Fab ′ can be obtained by reducing F (ab ′) 2 under mild conditions and breaking the disulfide linkage in the hinge region. Since these antibody fragments all include an antigen binding site, they have the ability to specifically bind to an antigen epitope.
  • Low molecular weight compound TDP-43 inhibitor is a TDP-43 inhibitor composed of a low molecular weight compound having a molecular weight of 10,000 or less.
  • mt-tRNA inhibitor refers to a molecule that targets any one or more of a specific mt-tRNA, and a TDP-43 binding region on a specific mt-tRNA.
  • the binding of a specific mt-tRNA to TDP-43 and the resulting TDP Inhibits the formation of the -43-mt-tRNA complex.
  • a part of the TDP-43 binding region means a region containing at least the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 (GUGUUUGUGG), or mt-tRNA Gln in the TDP-43 binding region if it is mt-tRNA Asn.
  • a region containing at least the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 (CAGGGAU), at least a region containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 (AUGGUGG) in the case of mt-tRNA Pro , and at least SEQ ID NO: 5 in the case of mt-tRNA Glu
  • Examples include a region containing the base sequence represented by (UUGGUCG).
  • the mt-tRNA inhibitor includes a nucleic acid mt-tRNA inhibitor, a peptide mt-tRNA inhibitor, a low molecular weight compound mt-tRNA inhibitor, and a combination mt-tRNA inhibitor.
  • a nucleic acid mt-tRNA inhibitor and the peptide mt-tRNA inhibitor will be described.
  • Nucleic acid mt-tRNA inhibitor is an mt-tRNA inhibitor composed of a nucleic acid.
  • the basic structure of the nucleic acid mt-tRNA inhibitor is the same as that of the aforementioned nucleic acid TDP-43 inhibitor except that the target substance is different. Therefore, description of the same configuration as that of the nucleic acid TDP-43 inhibitor is omitted, and only the configuration characteristic of the nucleic acid mt-tRNA inhibitor will be described here in principle.
  • nucleic acid mt-tRNA inhibitor examples include antisense DNA and nucleic acid aptamer that bind to the TDP-43 binding region of each specific mt-tRNA.
  • each nucleic acid mt-tRNA inhibitor will be specifically described.
  • Antisense DNA is usually a DNA molecule composed of a base sequence complementary to all or part of its base sequence, using mRNA of a target gene as a target substance. Antisense DNA binds to the target substance via base pairing and inhibits the function of the target substance.
  • antisense DNA refers to a base complementary to the base sequence of a specific mt-tRNA as a target substance, all or part of its variable region, preferably all or part of the TDP-43 binding region. Consists of an array. By binding to the variable region of any one of the specific mt-tRNAs, preferably the TDP-43 binding region via base pairing, and shielding the TDP-43 binding region, TDP-43-mt -Inhibits the formation of tRNA complexes.
  • the antisense DNA of the present specification if it is an antisense DNA having mt-tRNA Asn as a target substance, a nucleotide containing at least the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 17 (ACAAACAC) and mt-tRNA Gln as a target substance
  • a nucleotide containing at least the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 20 CGACCAA
  • Antisense DNA is basically composed only of DNA, but can contain one or several nucleic acid analogs and RNAs such as PNA and LNA.
  • the base length of the antisense DNA is not particularly limited, but is usually 7 to 25 bases, preferably 10 to 20 bases.
  • the antisense DNA has other regions adjacent to the variable region of mt-tRNA at its 5 ′ end and / or 3 ′ end.
  • One or a plurality of bases complementary to a part of may be contained.
  • Antisense DNA can be prepared by using a known nucleic acid synthesis technique in this field. For example, Green, M.R. and Sambrook, J., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Alternatively, it can be consigned by each manufacturer.
  • nucleic acid aptamer of the nucleic acid mt-tRNA inhibitor is the same as the nucleic acid aptamer of the nucleic acid aptamer of the nucleic acid TDP-43 inhibitor described above.
  • the configuration to be omitted is omitted.
  • the target substance of the nucleic acid aptamer in this embodiment is a specific mt-tRNA.
  • a nucleic acid aptamer binds to any one TDP-43 binding region of a particular mt-tRNA or binds to other regions of TDP-43, shielding all or part of the binding region, It functions as a blocking molecule that prevents TDP-43 from binding to the TDP-43 binding region of certain mt-tRNAs.
  • Peptide mt-tRNA inhibitor is a specific mt-tRNA inhibitor composed of peptides. Peptide mt-tRNA inhibitors compete with TDP-43 for the TDP-43 binding region by binding to the TDP-43 binding region of any one of the specific target mt-tRNAs Examples include antagonist peptides that function as antagonists. Hereinafter, the antagonist peptide will be specifically described.
  • Antagonist peptide is a peptide that binds to the peptide binding region of a target substance and functions as an antagonist.
  • the antagonist peptide goes around the peptide binding region of the target substance and competes with the partner peptide that should originally bind to the peptide binding region.
  • the antagonist peptide includes, for example, a peptide that is an inactive form of the counterpart peptide and that maintains the binding property to the target substance, a peptide that is structurally similar to the counterpart peptide, and a part of the counterpart peptide that includes a binding region for the target substance. And the like.
  • antagonist peptides in peptidic TDP-43 inhibitors include inactive TDP-43 (for example, mutant TDP-43 having a mutation in a part of RRM) in which an mt-tRNA binding region is retained, A peptide comprising a part of TDP-43 containing an mt-tRNA binding region can be mentioned.
  • Examples of the peptide consisting of a part of TDP-43 containing the mt-tRNA binding region include, for example, a peptide consisting of 14 amino acids at positions 136 to 149 including four amino acids K136, K145, F147, and F149, or this 14 A peptide consisting of 15 to 100 amino acids on TDP-43, including a peptide consisting of amino acids, preferably a peptide consisting of 18 to 50 amino acids or 20 to 40 amino acids.
  • a gene expression system containing a polynucleotide encoding the antagonist peptide can also be a TDP-43 / mt-tRNA binding inhibitor of the present invention.
  • a second embodiment of the present invention is a pharmaceutical composition for treating TDP-43 intracellular abundance-related diseases (herein, simply abbreviated as “pharmaceutical composition”).
  • This pharmaceutical composition comprises the TDP-43 / mt-tRNA binding inhibitor of the first aspect as an active ingredient and can be used for the treatment or prevention of TDP-43 intracellular abundance-related diseases.
  • the pharmaceutical composition of the present invention it is possible to provide an effective therapeutic method for TDP-43 intracellular abundance-related diseases such as ALS, which has conventionally been known only for coping therapy.
  • TDP-43 intracellular abundance-related disease refers to a disease in which the abundance per cell is statistically significantly increased or decreased with respect to TDP-43 than that of healthy subjects. Say. The amount of TDP-43 per cell is very strictly controlled in healthy cells (Ayala, YM, et al., 2011, EMBO J. 30 (2): 277-288. ). Thus, if the intracellular abundance fluctuates outside the normal range, the individual will have some modulation in the body.
  • the TDP-43 intracellular abundance-related disease is not limited as long as the TDP-43 intracellular abundance is outside the normal range. It may be a disease for which the relationship between the change in intracellular abundance of TDP-43 and the disease is unclear. Preferably, the disease is known to have a statistically significant increase in the abundance of the TDP-43 per cell as compared to that in healthy subjects.
  • TDP-43 intracellular abundance-related diseases many diseases in which the abundance of TDP-43 is known to increase statistically significantly compared to that of healthy subjects are nervous system diseases. is there. Therefore, nervous system diseases are suitable as the target diseases of the present invention.
  • neurological diseases include ALS, frontotemporal lobar degeneration (FTLD: frontotemporal lobar degeneration), Alzheimer's disease (AD: Alzheimer disease), or Parkinson's disease (PD: Parkinson disease).
  • ALS or FTLD is preferable as the target disease of the present invention.
  • the term “healthy body” refers to an animal individual not suffering from at least a TDP-43 intracellular abundance-related disease, preferably a healthy animal individual not suffering from any disease. Preferably it is a mammal individual, More preferably, it is a human.
  • “statistically significant” means that a quantitative difference in TDP-43 present in cells derived from a subject and cells derived from the same number of healthy subjects is statistically processed. This means that there is a significant difference between the two. Specifically, for example, the risk rate (significance level) is less than 5%, 1%, or 0.1%.
  • the test method for statistical processing is not particularly limited as long as a known test method capable of determining the presence or absence of significance is appropriately used. For example, Student's t test or multiple comparison test can be used.
  • (intracellular) abundance refers to the amount of a measurement substance contained in a cell.
  • the abundance may be a relative amount such as concentration, fluorescence intensity, ionic strength or radiation intensity, or may be an absolute amount of the measurement substance per predetermined number of cells such as volume.
  • the “bound amount with TDP-43” refers to a relative amount or an absolute amount of a measurement substance that binds directly or indirectly to a predetermined amount of TDP-43. Therefore, “measuring the intracellular abundance or binding amount of TDP-43 of the measurement substance” means quantifying the intracellular abundance or binding quantity of TDP-43 of the measurement substance.
  • treatment refers to alleviating or eliminating the disease involved and / or symptoms associated therewith.
  • prevention refers to prevention of the onset and onset of a disease.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises the TDP-43 / mt-tRNA binding inhibitor described in the first aspect as an active ingredient.
  • Two or more TDP-43 / mt-tRNA binding inhibitors may be included.
  • antagonist nucleic acids and antisense DNA can be included.
  • the amount (content) of the TDP-43 / mt-tRNA binding inhibitor according to the first embodiment to be blended in the pharmaceutical composition is the kind of the TDP-43 / mt-tRNA binding inhibitor to be included and / or its Since it varies depending on the effective dose (dose or intake), the type of disease, the dosage form, the type of carrier described later, and the like, it may be appropriately determined in consideration of each condition.
  • the “effective amount” is an amount necessary for the TDP-43 / mt-tRNA binding inhibitor to exert its function in a pharmaceutical composition, and is harmful to the living body to which it is administered. An amount that gives little or no significant side effects. This effective amount may vary depending on various conditions such as subject information, route of administration, and number of doses.
  • subject refers to a living body to which a pharmaceutical composition is to be administered.
  • humans pets (dogs, cats, rabbits, etc.), racehorses, laboratory animals (mouses, rats, guinea pigs, monkeys, etc.), livestock (cows, horses, sheep, goats, pigs, chickens, ostriches, etc.) Applicable.
  • livestock cows, horses, sheep, goats, pigs, chickens, ostriches, etc.
  • Subject information refers to various individual information of the subject to which the pharmaceutical composition is administered.
  • the general health status, TDP-43 intracellular abundance-related Includes disease progression and severity, age, weight, gender, drug sensitivity, presence of concomitant drugs, and resistance to treatment.
  • the content of the TDP-43 / mt-tRNA binding inhibitor in the pharmaceutical composition and the dose calculated based on the content are finally determined by a doctor or veterinarian according to the information of each subject. It is determined by such judgment.
  • the content of the TDP-43 / mt-tRNA binding inhibitor in the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the conditions. In order to obtain the pharmacological effect of the TDP-43 / mt-tRNA binding inhibitor, when a large amount of the pharmaceutical composition is required, it can be divided into several times to reduce the burden on the subject.
  • the effective amount of a TDP-43 / mt-tRNA binding inhibitor per day for an adult is usually about 1 week to about 1 year, preferably about 1 month to about 12 months, divided into once or several times a day. May be administered over time.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be dissolved in a pharmaceutically acceptable solvent, if necessary.
  • “Pharmaceutically acceptable solvent” refers to a solvent usually used in the field of pharmaceutical technology.
  • any of water or an aqueous solution, or an organic solvent may be used.
  • the aqueous solution include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants, phosphate buffers, and sodium acetate buffers.
  • the auxiliary agent include D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride, low concentration nonionic surfactants, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, and the like.
  • the organic solvent includes ethanol.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier as required.
  • “Pharmaceutically acceptable carrier” refers to an additive usually used in the field of pharmaceutical technology. In addition to facilitating dosage form formation and maintaining the dosage form and drug effect, it is used to make the active ingredient TDP-43 / mt-tRNA binding inhibitor difficult to be degraded by enzymes in vivo. Therefore, it may be used as needed. Examples thereof include excipients, binders, disintegrants, fillers, emulsifiers, fluid addition regulators, lubricants, human serum albumin and the like.
  • Excipients include, for example, sugars such as monosaccharides, disaccharides, cyclodextrins and polysaccharides, metal salts, citric acid, tartaric acid, glycine, polyethylene glycol, pluronic, kaolin, silicic acid, or combinations thereof. It is done.
  • binder examples include starch paste using plant starch, pectin, xanthan gum, simple syrup, glucose solution, gelatin, tragacanth, methylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, shellac, paraffin, polyvinylpyrrolidone, or combinations thereof. Can be mentioned.
  • disintegrant examples include the starch, lactose, carboxymethyl starch, crosslinked polyvinylpyrrolidone, agar, laminaran powder, sodium bicarbonate, calcium carbonate, alginic acid or sodium alginate, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, sodium lauryl sulfate, stearin.
  • examples include acid monoglycerides or salts thereof.
  • fillers examples include petrolatum, the sugar and / or calcium phosphate.
  • emulsifiers examples include sorbitan fatty acid esters, glycerin fatty acid esters, sucrose fatty acid esters, and propylene glycol fatty acid esters.
  • Examples of the flow addition regulator and lubricant include silicate, talc, stearate or polyethylene glycol.
  • solubilizers suspending agents, diluents, dispersants, surfactants, stabilizers, absorption enhancers, bulking agents, moisturizers, adsorbents, disintegration inhibitors, coatings commonly used in medicine Agents, colorants, preservatives, preservatives, antioxidants, fragrances, flavoring agents, sweetening agents, buffering agents, tonicity agents, and the like may be included as appropriate.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present embodiment does not inactivate the TDP-43 / mt-tRNA binding inhibitor described in the first aspect, which is an active ingredient, and the pharmacological effect of the active ingredient in vivo after administration. If it is the form which can exhibit, it will not specifically limit.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition will depend on the mode of administration and / or formulation conditions. Administration methods can be broadly classified into oral administration and parenteral administration, so that dosage forms suitable for each administration method may be used.
  • Suitable dosage forms for oral administration include, for example, solid preparations (including tablets, pills, sublingual tablets, capsules, drops, troches), granules, powders, powders, liquids (internal solutions, suspensions). Agents, emulsions, and syrups).
  • the solid preparation can be made into a dosage form with a coating known in the art, for example, a sugar-coated tablet, a gelatin-encapsulated tablet, an enteric tablet, a film-coated tablet, a double tablet, or a multilayer tablet as necessary. .
  • a dosage form suitable for systemic or intra-tissue administration includes an injection that is a liquid.
  • Suitable dosage forms for transepidermal or transmucosal administration include solutions (including coating agents, eye drops, nasal drops, and inhalants), suspensions (including emulsions and creams), and powders (nasal drops).
  • the pharmaceutical composition of this embodiment is applied for treatment or prevention of TDP-43 intracellular abundance-related diseases.
  • the administration method is not limited, as described above, since many diseases related to TDP-43 intracellular abundance are nervous system diseases, systemic administration via the circulatory system or local administration directly to the nerve periphery Is preferred.
  • intravascular injection including intravenous injection and intraarterial injection
  • intravascular administration such as intralymphatic injection or local administration by intramuscular injection
  • injectables are combined with the above-mentioned excipients, emulsifiers, suspensions, surfactants, stabilizers, pH adjusters, etc. as appropriate, and mixed in unit dosage forms generally required for pharmaceutical practice. It can be formulated and is provided in unit dose ampoules or multi-dose containers.
  • each dosage form are not particularly limited as long as they are within the range of dosage forms known in the art for each dosage form.
  • Example 1 Identification of mt-tRNA binding region in TDP-43> (the purpose) The mt-tRNA binding region in TDP-43 is identified using mutant TDP-43.
  • lysine at position 136 is alanine (K136A)
  • lysine at position 140 is alanine (K140A)
  • lysine at position 145 is alanine (K145A)
  • both phenylalanine at positions 147 and 149 were replaced with leucine, and the nucleotide sequence encoding the substituted amino acid sequence.
  • the affinity gel bound with DAP-TDP-43 was washed 5 times with 1 mL of the lysis buffer, and 150 ⁇ L of protein-RNA extraction buffer (7 M urea, 350 mM NaCl, 1% SDS, 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)) , 10 mM EDTA, 2% 2-mercaptoethanol) for 5 minutes at 4 ° C.
  • the RNA co-immunoprecipitated with the eluted protein was separated from the gel by centrifuging at 1000 g for 5 minutes at 4 ° C., followed by phenol-chloroform extraction to separate the protein and RNA.
  • Protein was precipitated by mixing 3 times the amount of isopropanol in the organic layer after phenol-chloroform extraction, centrifuging at 20000 g for 10 minutes at 4 ° C., immediately washed once with 75% ethanol, and dried. RNA was recovered from the aqueous layer by isopropanol precipitation.
  • RNA recovered from cell extracts and Northern blotting are basically performed by Green, MR and Sambrook, J., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Fourth Ed., Cold. The method described in Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York was followed. After separation by 8% polyacrylamide gel electrophoresis containing 8M urea and 0.5 ⁇ TBE buffer, transfer to nylon membrane (Hybond-N +: Bio-Rad) using Trans-blot SD Cell (Bio-Rad) at 10V for 60 minutes. Transcribed under the conditions of The RNA and the membrane were crosslinked with UV, and then hybridized overnight at 42 ° C.
  • the mt-tRNA Asn probe and the mt-tRNA Gln probe used for detection have a sequence complementary to a base sequence specific to each mt-tRNA and the like.
  • the mt-tRNA Asn probe is a sequence complementary to the base sequence 40-73 of the mt-tRNA Asn gene (SEQ ID NO: 24: ctagaccaatgggacttaaacccacaaacactta) as Asn2, and the mt-tRNA Gln probe is the mt-tRNA Gln gene.
  • Has a complementary sequence SEQ ID NO: 22; tatgagaatcgaacccatccctgagaatcc) at positions 36 to 65 of the base sequence.
  • Each probe was labeled at the 3 ′ end using a Biotin 3 ′ End DNA Labeling kit (Thermo Fisher Scientific). The signal intensity of each RNA band was quantified using a LAS4000 image analyzer and MultiGauge software (Fujifilm).
  • Example 2 Relationship between mutant TDP-43 and cytotoxicity> (the purpose) The cytotoxicity induced by each mutant TDP-43 used in Example 1 is verified.
  • Example 3 Identification of TDP-43 binding region in mt-tRNA Asn > (the purpose) Contrary to Example 1, a TDP-43 binding region in a specific mt-tRNA is identified.
  • Mt-tRNA Asn was used as a specific mt-tRNA.
  • a DNA encoding mt-tRNA Asn (SEQ ID NO: 10) is cloned, and based on this, the nucleotide sequence of each region of mt-tRNA is changed to the corresponding region of the DNA encoding mt-tRNA Leu (SEQ ID NO: 23).
  • a DNA encoding a chimeric mt-tRNA (mt-tRNA Asn / Leu ) of mt-tRNA Asn and mt-tRNA Leu replaced with a base sequence was prepared. It is known that mt-tRNA Leu does not bind to TDP-43.
  • each chimeric mt-tRNA is shown in FIG.
  • the underlined portion is the base sequence derived from mt-tRNA Leu .
  • Ac-stem (Leu) is a chimeric mt-tRNA substituted partially nucleotide sequence of mt-tRNA Asn and (UAGAUUG) to the corresponding nucleotide sequence of mt-tRNA Leu (GUUAAGA).
  • D-loop (Leu) is obtained by replacing the D-loop region of mt-tRNA Asn with the D-loop region of mt-tRNA Leu
  • pAntiCdn (Leu) is the mt-tRNA Asn
  • Var-R (Leu) is obtained by replacing the variable regions of the mt-tRNA Asn in Var-R (Leu) of mt-tRNA Leu Yes
  • U-loop (Leu) is obtained by replacing the U-loop region of mt-tRNA Asn with the U-loop region of mt-tRNA Leu .
  • Expression plasmids containing DNA fragments encoding these chimeric mt-tRNAs were prepared, and the chimeric mt-tRNAs were synthesized using this plasmid as a template and using an in vitro transcription system.
  • TF-TDP-43-FLAG was expressed and purified by Escherichia coli using a trigger factor (TF) protein fusion TDP-43 expression vector pCOLD-TF DNA (Takara Bio Inc.).
  • PCOLD-TF-TDP-43-FLAG was prepared by inserting the TDP-43 gene fused with the FLAG peptide sequence at the C-terminus into an expression vector pCOLD-TF DNA in an expressible state.
  • pCOLD-TF-FLAG having only a FLAG sequence was used.
  • TF-TDP-43-FLAG or TF-FLAG was expressed using Rosetta TM 2 (DE3) pLysS Singles TM Competent Cells (Novagen Calbiochem) as an E.
  • coli strain for protein expression His-tag purification was performed with Ni-NTA agarose (Qiagen), and two-step purification was performed with FLAG-M2 agarose beads (SIGMA) using the FLAG tag to purify TF-TDP-43-FLAG and TF-FLAG.
  • SIGMA FLAG-M2 agarose beads
  • Fusion protein 200 ng, synthetic RNA 10 ng of 10 [mu] L RNA-protein binding solution (40mM Tris-HCl pH7.4, 30mM KCl, 1mM MgCl 2, 0.01% IGEPA CA-630, 1mM DTT, 1mg / mL BSA, 1mg / mL yeast tRNA) and incubated at 25 ° C. for 30 minutes for reaction.
  • the reaction solution was electrophoresed on a 6% polyacrylamide gel and then Northern blotted.
  • mt-tRNA Asn Probe mt-tRNA Asn gene sequences 7-34 of the complementary sequences as Asn1 in (SEQ ID NO 21: cagctaagcaccctaatcaactggcttc), and Asn2 described above, also in the mt-tRNA Leu probe mt- RNA bound to the fusion protein was detected using Leu1 consisting of a complementary sequence (SEQ ID NO: 25) at positions 1 to 30 of the base sequence of the tRNA Leu gene.
  • TDP-43 / mt-tRNA binding inhibitor inhibits binding of TDP-43 and specific mt-tRNA> (the purpose) Since it became clear from Example 3 that mt-tRNA Asn binds to TDP-43 via the variable region, a nucleotide containing a part of the variable region is an mt-tRNA Asn antagonist. It is verified that it becomes a TDP-43 / mt-tRNA binding inhibitor that binds to -tRNA and inhibits the binding between TDP-43 and mt-tRNA.
  • RNA oligonucleotide Var-1 (aaguguuuguggguuu) consisting of base sequences from positions 41 to 56 corresponding to the variable region and part of the T loop when the base at the 5 'end of mt-tRNA Asn is position 1.
  • RNA oligonucleotide Var-2 (guguuuguggg) (SEQ ID NO: 14) consisting of nucleotide sequences 43 to 53 corresponding to a part of the variable region and RNA oligonucleotide Var- consisting of nucleotide sequences 43 to 49 3 (guguuug) (SEQ ID NO: 26) was synthesized as a candidate mt-tRNA Asn inhibitor.
  • Gln1 consisting of a sequence complementary to the mt-tRNA Gln gene at positions 36 to 65 (SEQ ID NO: 27: tatgagaatcgaacccatccctgagaatcc) was used.
  • the competition assay was performed according to the method of Example 1.
  • a cell extract was prepared according to the method described in “(3) Preparation of cell extract” in Example 1, and then each mt-tRNA Asn inhibitor candidate was added to 400 nM.
  • the nucleic acid that is treated with the method described in Example 1 “(4) Immunoprecipitation and RNA recovery” and “(5) Urea-modified PAGE and Northern blotting”, and binds to DAP-TDP-43 containing a FLAG tag. was developed by electrophoresis.
  • mt-tRNA Asn binding to DAP-TD-43 was detected and quantified by Northern blotting.
  • the oligonucleotide probe used for detection the oligonucleotide of SEQ ID NO: 21 described above was used.
  • the signal intensity of the mt-tRNA Asn RNA band was quantified using a LAS4000 image analyzer and MultiGauge software (Fujifilm).

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Abstract

TDP-43細胞内存在量関連疾患治療薬を開発し、それを提供する。　TDP-43と特定のmt-tRNA間の結合におけるそれぞれの結合部位を同定し、当該同定結果に基づいて、TDP-43と特定のmt-tRNAとの結合を選択的に阻害することのできる結合阻害剤を開発した。

Description

ＴＤＰ－４３細胞内存在量関連疾患治療剤
　本発明は、ALSをはじめとするTDP-43細胞内存在量関連疾患の予防／又は治療剤、及びそれを有効成分とする医薬組成物に関する。
　筋萎縮性側索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis：以下、本明細書ではしばしば「ALS」と称する）は、脳幹、脊髄、運動ニューロンの病変によって上位運動ニューロン障害、下位運動ニューロン障害が進行し、それに伴う筋萎縮と筋力低下の原因によって上肢の機能障害、歩行障害、構音障害、嚥下障害、呼吸障害等の症状が現われる難治性の疾患である。人工呼吸器により比較的長期間生存する例も知られてはいるが、病勢の進展は、通常、比較的速く、発症後平均3.5年で主として呼吸筋の麻痺によって死亡することが多い。
　ALSのうち5～10％は、家族歴を伴うことから家族性筋萎縮性側索硬化症（家族性ALS）と呼ばれている。家族性ALSの約2割では、フリーラジカルを除去する酵素であるCu/Zn スーパーオキシドジスムターゼ（SOD1：superoxide dismutase 1）遺伝子の変異（ALS1）が報告されており（非特許文献１）、SOD1遺伝子がALSの原因遺伝子の1つと考えられている。また、その他のALSの原因遺伝子としては、アンジオゲニン(angiogenin)（非特許文献２）、小胞膜結合タンパク質（VAMP:vesicle-associated membrane protein）/シナプス小胞結合タンパク質B(synaptobrevin-associated membrane protein B)（非特許文献３）、TAR DNA結合タンパク質43（TAR DNA-binding protein-43：以下、本明細書ではしばしば「TDP-43」と称する）（非特許文献４）、及びfused in sarcoma/translated in liposarcoma(FUS/TLS)（非特許文献５）等の遺伝子が報告されている。しかし、これらの遺伝子異常により、ALSがどのように発症し、病態が進行するのか、その具体的な機序については明らかにされていない。
　Maruyamaら（非特許文献６）は、家族性ALS患者の6例中3例で、細胞内シグナル伝達に関与するNFκBを抑制するオプチニューリン（optineurin）の遺伝子に変異があることを開示している。変異型オプチニューリンは、NFκBの抑制活性を喪失していることから、NFκB阻害剤がALSの治療効果を持つ可能性が示唆されている。しかしながら、ALSの90～95％は、孤発性であり、多くのALS患者ではオプチニューリン遺伝子よりも、むしろTDP-43遺伝子において変異が見出されている。それ故、仮にNFκB阻害剤がALS治療における効果を有していたとしても、その治療効果は、ごく一部のALS患者にしか期待できない。
　Rothsteinら（非特許文献７）は、変異型SOD1遺伝子を有するALS患者の髄液で、野生型SOD1遺伝子を有する健常体と比較してグルタミン酸(以下しばしば「Glu」と略称する)の濃度が3倍近く増加すること、及び集団的研究でも孤発性ALS患者の約40%の髄液でGluの増加が確認されていることから、Gluの増加に伴うGlu毒がALSの発症機序において重要な役割を担っていることを示唆している。ALS患者におけるこのようなGluの増加は、アストロサイトでのGluの取り込みの喪失が原因と考えられている。それ故、Glu毒、特にグルタミン酸受容体のサブタイプであるα-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソオキサゾールプロピオン酸（AMPA）受容体を介したGlu増加によるGlu毒によって神経障害を生じた結果、孤発性ALSが発症するという仮説が有力である。例えば、ヒトALS運動ニューロンでは、AMPA受容体のサブユニットであるGluR2 Q/R部位のRNA編集率が低く、孤発性ALSの病態に重要な役割を果たすという報告（非特許文献８～１２）は、前記仮説を支持している。
　Lacomblezら（非特許文献１３）は、リルゾール（Riluzole）がALS患者の生存期間を僅かではあるが有意に延長できるという臨床試験結果を開示している。リルゾールは、前記仮説に基づいて開発されたグルタミン酸の拮抗剤である。現在のところ、このリルゾールのみがALSの治療薬として欧米及び日本において認可されている（商品名：リルテック）。しかし、リルゾールは、ALSの原因であるGlu増加を抑制するものではなく、Glu増加によるGlu毒効果を軽減する対処療法に過ぎないため、ALSの主症状である筋力低下や他の臨床症状に対する有効性はない。
　特許文献１には、メチルコバラミン（Methylcobalamin）の大量投与によりALSの臨床症状に一定の改善効果が認められることが開示されており、現在、メチルコバラミンの二重盲検比較試験が進められている。しかし、本薬剤も主にグルタミン酸による細胞死に対する抑制的効果（非特許文献１４）に基づいており、リルゾールの効果を大きく改善することは期待できない。ところで、高濃度のメチルコバラミンは、S-アデノシルメチオニンによるDNAのメチル化を競争的に阻害するため、遺伝子転写の高維持が可能となる(非特許文献１５)。したがって、それにより神経再生に必要な各種タンパク質の合成が促進される結果、脊髄や大脳の運動神経細胞の保護に及ぶのではないか、と推測されているが、実際にALSの病態、発症機構との関連性を示す証拠はなく、単なる一般論的推論に留まっている。
　また、ALSの診断には現在までのところ確定診断できる特異的臨床検査方法がなく、従来は、病歴や神経所見によって総合的に判定されており、発症早期の診断や正確な診断は困難とされている。
　これまでにALSの原因遺伝子の一つとして、家族性ALS及び孤発性ALSのいずれにおいても変異頻度の高いTDP-43遺伝子が示唆されており(非特許文献１６～２３)、またALS患者の病巣部の細胞では細胞質にTDP-43を含む沈着物が蓄積することも知られている（非特許文献１７）。しかしながら、TDP-43の細胞内における機能やTDP-43遺伝子の変異がALS発症とどのように関連するのか、その機序については、これまで全く不明であった。
特開平10-218775号公報
Rosen D.R., et al. 1993, Nature, 362(6415):59-62. Greenway M.J., et al. 2004, Neurology, 63(10):1936-8. Ratnaparkhi A., et al. 2008, PLoS One, 3(6):e2334. Arai T., et al. 2006, Biochem. Biophys. Res. Commun., 351(3):602-11. Kwiatkowski T.J. Jr, 2009, Science, 323(5918):1205-8 Maruyama H., et al., 2010, Nature, 465: 223-226 Rothstein J.D., et al., 1990, Ann, Neurol.,28:18-25. Trotti D., et al., 1999, Nat. Neurosci., 1999, 2:427-433. Rothstein J.D., 1996, Neuron, 16:675-686. Bruijn L.I., et al. 1997, Neuron, 18:327-338. Howland D.S., et al. 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, ;99:1604-1609. Rothstein, J.D., 2009, Ann. Neurol., 65 (suppl):S3-S9. Lacomblez L., 1996, Lancet, 347: 1425-1431. Akaike A., et al., 1993, Eur. J. Pharmacol., 241:1-6. Pfohl-Leszkowicz A, et al., 1991, Biochemistry, 30:8045-8051. Lagier-Tourenne, C. and Cleveland, D.W., 2009, Cell, 136;  1001-1004 Arai, et al., 2006, Biochem. Biophys. Res. Commun., 351:602-611 Neumann, et al., 2006, Science, 314, 130-133 Chen-Plotkin, et al., 2010, Nat. Rev. Neurol., 6: 211-220 Lagier-Tourenne, et al., 2010, Hum. Mol. Genet. 19: R46-R64 Kabashi, et al., 2008, Nat. Genet. 40:572-574 Sreedharan, et al., 2008, Science, 319:1668-1672 Pesiridis, G.S., et al., 2009, Hum. Mol. Genet., 18:R156-R162
　本発明者らは、ALSの効果的治療法を発見すべくALSの患者の中で変異頻度が最も高いTDP-43の研究を行った。その結果、TDP-43の発現量の増加、又はALS患者で見られる変異型TDP-43の発現によって、細胞死が誘導されること、その誘導がTDP-43と特定のミトコンドリアtRNA(以下、本明細書ではしばしば「mt-tRNA」と称する)との結合量の増加と相関すること、そして、その結合を正常値まで低減させることで細胞死が生じなくなることを見いだした。そこで、それらの知見に基づきTDP-43の細胞内存在量に関連する疾患（TDP-43細胞内存在量関連疾患）の認定方法の発明をWO2013/129603において提供した。
　しかし、ALSをはじめとするTDP-43細胞内存在量関連疾患に対して治療薬となり得る化合物までは得られていなかった。それ故、TDP-43細胞内存在量関連疾患治療薬の開発とその提供が望まれていた。
　上記課題を解決するために、本発明者らはTDP-43と特定のmt-tRNA間の結合におけるそれぞれの結合部位を同定し、当該同定結果に基づいて、TDP-43と特定のmt-tRNAとの結合を選択的に阻害することのできる結合阻害剤を開発した。また、この結合阻害剤を有効成分としてTDP-43細胞内存在量関連疾患の予防／又は治療剤を開発した。本願発明は、当該開発結果に基づくものであって、以下を提供する。
　（１）TDP-43とmt-tRNAとの結合阻害剤であって、（ａ）mt-tRNAにおける可変領域の全部又は一部からなる領域に結合する分子、（ｂ）mt-tRNAにおける可変領域の全部又は一部からなる領域を遮蔽する分子、（ｃ）配列番号１で示すアミノ酸配列における136位のリジン、145位のリジン、147位のフェニルアラニン及び149位のフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸を少なくとも1つ含むTDP-43の一部からなる領域に結合する分子、又は（ｄ）配列番号１で示すアミノ酸配列における136位のリジン、145位のリジン、147位のフェニルアラニン及び149位のフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸の少なくとも1つ含むTDP-43の一部からなる領域を遮蔽する分子からなり、前記mt-tRNAは、mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、mt-tRNAPro及びmt-tRNAGluからなる群から選択されるいずれかのmt-tRNAである、前記結合阻害剤。
　（２）前記分子が核酸、ペプチド、低分子化合物、又はそれらの組み合わせで構成される、（１）に記載の結合阻害剤。
　（３）前記核酸が配列番号２（guguuugugg）、配列番号３（cagggau）、配列番号４（auggugg）及び配列番号５（uuggucg）で示すいずれか一の塩基配列を含むヌクレオチドからなり、TDP-43と結合する、（２）に記載の結合阻害剤。
　（４）前記核酸が前記mt-tRNAにおける可変領域の全部又は一部からなる領域に相補的な塩基配列を含むヌクレオチドからなり、前記いずれか一のmt-tRNAに結合する、（２）に記載の結合阻害剤。
　（５）前記mt-tRNAにおける可変領域が配列番号６（cuaaguguuuguggg）、配列番号７（uucucagggauggg）、配列番号８（gcuaaugguggagu）、及び配列番号９（aucauuggucgugg）で示すいずれか一の塩基配列からなる、（４）に記載の結合阻害剤。
　（６）前記ペプチドが配列番号１で示すアミノ酸配列において136位～149位のアミノ酸配列を含み、全長100アミノ酸以下のペプチドからなる、前記いずれか一のmt-tRNAに結合する、（２）に記載の結合阻害剤。
　（７）前記核酸が（６）に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子発現系である、（２）に記載の結合阻害剤。
　（８）（１）～（７）のいずれかに記載のTDP-43とmt-tRNAとの結合阻害剤を有効成分とするTDP-43細胞内存在量関連疾患治療用医薬組成物。
　（９）前記TDP-43細胞内存在量関連疾患が筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭葉変性症、アルツハイマー病、及びパーキンソン病からなる群から選択される、（８）に記載の医薬組成物。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-253332号の開示内容を包含する。
　本発明のTDP-43と特定のmt-tRNAとの結合阻害剤は、TDP-43細胞内存在量関連疾患の治療用医薬組成物の有効成分として利用することができる。
　本発明のTDP-43細胞内存在量関連疾患治療用医薬組成物は、従来有効な治療法が知られていないALS及び前頭側頭葉変性症等のTDP-43細胞内存在量関連疾患の治療法となり得る。
TDP-43の三次元構造を示す図である。配列番号１で示すTDP-43において、特定のmt-tRNAとの結合に関与する4つのアミノ酸K136、K145、F147、及びF149と、特定のmt-tRNAとの結合に関与しない1アミノ酸K140の位置を矢印で示している。前記4つのアミノ酸は、立体構造で互いに近位に位置し、特定のmt-tRNAとの結合領域を構成していることがわかる。 実施例１の結果を示すノザンブロット図である。IPは、細胞抽出液からDAP-TDP-43のプルダウンによって共免疫沈降した各RNAを示す結果である。図中、Inputは細胞抽出液中における各RNAを示す結果である。上段2図のmt-tRNAAsn、mt-tRNAGlnは、ノザンブロットの結果であり、上段3つ目の5S rRNAは、PAGEの結果である。最下段のBiotinは、ウエスタンブロットによるDAP-TDP-43の検出結果である。 実施例１で調製した各変異型TDP-43によって誘導される細胞毒性の結果を示す図である。図中、Doxはドキシサイクリンを示す。 実施例３で調製したmt-tRNAAsnとmt-tRNALeuの各種キメラmt-tRNAの塩基配列を示す。１は母体となる野生型mt-tRNAAsnの塩基配列、２はAcceptor stem領域がmt-tRNALeu由来のキメラmt-tRNAにおける塩基配列、３はD-loop領域がmt-tRNALeu由来のキメラmt-tRNAにおける塩基配列、４はanticodon loop領域がmt-tRNALeu由来のキメラmt-tRNAにおける塩基配列、５は可変領域がmt-tRNALeu由来のキメラmt-tRNAにおける塩基配列、６はU-loop領域がmt-tRNALeu由来のキメラmt-tRNAにおける塩基配列、そして７は野生型mt-tRNALeuの塩基配列である。キメラmt-tRNAの塩基配列において下線部はmt-tRNALeu由来の配列に置換した領域を示す。なお、実施例において調製したこれらのmt-tRNAをコードするDNA断片の塩基配列は、図示する塩基のU（ウラシル）をT（チミン）に置き換えている。 実施例３のゲルシフトアッセイの結果を示す。この図は、陽性対照の野生型mt-tRNAAsnと陰性対照の野生型mt-tRNALueの結果を示している。レーン１～３の下方のバンドは遊離mt-tRNAAsnを、レーン４～６の下方のバンドは遊離mt-tRNALeuを示す。レーン３の上方のバンドはTDP-43-mt-tRNA複合体を示している。図中、NTは阻害剤候補核酸未処理（Nucleic acid Treatment)を、TFはTrigger factorを示す。 実施例３のゲルシフトアッセイの結果を示す。この図は、各キメラmt-tRNAの結果を示している。全レーンの下方のバンドは遊離の各キメラmt-tRNAAsnを示す。またレーン３、６、９、及び１２の上方のバンドは各キメラmt-tRNAとTDP-43からなるTDP-43-mt-tRNA複合体を示している。 実施例３のゲルシフトアッセイの結果を示す。この図は、各キメラmt-tRNAの結果を示している。全レーンの下方のバンドは遊離の各キメラmt-tRNAAsnを示す。またレーン３、６、及び９の上方のバンドは各キメラmt-tRNAとTDP-43からなるTDP-43-mt-tRNA複合体を示している。レーン６のキメラmt-tRNAとTDP-43の複合体の量が著しく減少していることがわかる。 実施例４のmt-tRNAAsn阻害剤候補を用いた、TDP-43と特定のmt-tRNAとの結合を阻害した図である。Aは、使用した各mt-tRNAAsn阻害剤候補の塩基配列を示す。太字は可変領域のループ部を構成する塩基配列を示している。Bは、DAP-TDP-43のプルダウンによって共免疫沈降した各RNAを示すPAGEの結果である。図中、NTは阻害剤候補核酸未処理を、IPは共免疫沈降を、NBはノザンブロットを、そしてWBはウェスタンブロットを示す。
１．TDP-43とmt-tRNAとの結合阻害剤
１－１．概要
　本発明の第１の態様は、TDP-43と特定のmt-tRNAとの結合阻害剤（本明細書では「TDP-43/mt-tRNA結合阻害剤」又は単に「結合阻害剤」と略称する）である。本発明のTDP-43/mt-tRNA結合阻害剤は、TDP-43と特定のmt-tRNAにおいて、それぞれの結合部位のいずれかに結合して、両者の結合を阻害する物質で構成される。本発明のTDP-43/mt-tRNA結合阻害剤によれば、TDP-43細胞内存在量関連疾患において、その治療用医薬組成物の有効成分として利用することができる。
１－２．定義
　本明細書で頻用する以下の用語について定義する。
　「TAR DNA結合タンパク質-43（TDP-43:TAR DNA-binding Protein 43kDa）」とは、ヘテロ核内リボ核酸タンパク質（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein：hnRNP）の一種である。分子内にRNA結合配列であるRRM(RNA Recognition Motif)ドメインを2つ有し、4種のmt-tRNAや、アミノ酸の生合成又は代謝における足場となるスキャホールドタンパク質として機能する。また、細胞内で核質と細胞質の間を行き来して当該4種のmt-tRNAやアミノ酸の細胞内存在量を制御している（WO2013/129603）。
　本明細書においてTDP-43は、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるヒト野生型TDP-43の他、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、後述するmt-tRNA結合領域以外の領域で、1個又は複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換したアミノ酸配列からなるヒト変異型TDP-43、及び配列番号１で示されるアミノ酸配列、好ましくは2つのRRM以外のアミノ酸配列と85％以上、90％以上、95％以上、97％以上、又は98％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつヒト野生型TDP-43と同等の機能を有する他生物種のTDP-43オルソログを包含する。
　本明細書において「複数個」とは、2～10の整数、例えば、2～7、2～5、2～4、2～3の整数をいう。
　本明細書において「同一性」とは、2つのアミノ酸配列間において、必要に応じて一方又は双方にギャップを導入しながら両配列をアミノ酸の一致数が最大となるようにアラインメントしたときに、一方のアミノ酸配列におけるアラインメント対象領域の全アミノ酸数に対する他方のアミノ酸配列の前記一致したアミノ酸数の割合（％）をいう。
　前記配列番号１で示されるアミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸の置換又は欠失を含むアミノ酸配列からなるヒト変異型TDP-43の具体例としては、例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列において開始メチオニンを1位としたとき（以下、本明細書において同様とする）に、90位のアラニンがバリン（A90V）（以下、本明細書では、配列番号１におけるアミノ酸位置を数値で示し、その位置における野生型アミノ酸を数値前に、変異後のアミノ酸を数値後に、それぞれ1文字表記で示す）に、169位のアスパラギン酸がグリシン（D169G）に、267位のアスパラギンがセリン（N267S）に、287位のグリシンがセリン（G287S）に、290位のグリシンがアラニン（G290A）に、292位のセリンがアスパラギン（S292N）に、294位のグリシンがアラニン（G294A）に、294位のグリシンがバリン（G294V）に、295位のグリシンがアルギニン（G295R）に、295位のグリシンがセリン（G295S）に、298位のグリシンがセリン（G298S）に、311位のメチオニンがバリン（M311V）に、315位のアラニンがトレオニン（A315T）に、315位のアラニンがグルタミン酸（A315E）に、331位のグルタミンがリジン（Q331K）に、332位のセリンがアスパラギン（S332N）に、335位のグリシンがアスパラギン酸（G335D）に、337位のメチオニンがバリン（M337V）に、343位のグルタミンがアルギニン（Q343R）に、345位のアスパラギンがリシン（N345K）に、348位のグリシンがシステイン（G348C）に、352位のアスパラギンがセリン（N352S）に、352位のアスパラギンがトレオニン（N352T）に、357位のグリシンがセリン（G357S）に、361位のアルギニンがセリン（R361S）に、363位のプロリンがアラニン（P363A）に、378位のアスパラギンがアスパラギン酸（N378D）に、379位のセリンがシステイン（S379C）に、379位のセリンがプロリン（S379P）に、382位のアラニンがプロリン（A382P）に、382位のアラニンがトレオニン（A382T）に、383位のイソロイシンがバリン（I383V）に、384位のグリシンがアルギニン（G384R）に、390位のアスパラギンがアスパラギン酸（N390D）に、390位のアスパラギンがセリン（N390S）に、若しくは393位のセリンがロイシン（S393L）に、それぞれ置換した変異、又は374位のチロシン以降が欠失した変異を有するヒト変異型TDP-43が挙げられる。好ましくはD169G、G298S、又はR361Sの変異を有するヒト変異型TDP-43である。
　本明細書において「特定のmt-tRNA」（本明細書においては、しばしば単に「mt-tRNA」とも称する）とは、TDP-43と結合し得る前述の4種のmt-tRNAをいう。この4種は、mt-tRNAAsnが配列番号１０で、mt-tRNAGlnが配列番号１１で、mt-tRNAProが配列番号１２で、そしてmt-tRNAGluが配列番号１３で示される。
　本明細書において「TDP-43-mt-tRNA複合体」とは、TDP-43と特定のmt-tRNAの結合によって形成されるRNAタンパク質複合体をいう。TDP-43-mt-tRNA複合体は、TDP-43上のmt-tRNA結合領域と特定のmt-tRNA上のTDP-43結合領域の結合を介して構成される。
　本明細書において「mt-tRNA結合領域」とは、特定のmt-tRNAとの結合に直接関与するTDP-43のアミノ酸配列上の一部領域をいう。mt-tRNA結合領域は、配列番号１で示すアミノ酸配列をTDP-43の基準アミノ酸配列にした場合に、図１に示す4つのアミノ酸、すなわち136位のリジン（K136）、145位のリジン（K145)、147位のフェニルアラニン（F147)、及び149位のフェニルアラニン（F149)を含むアミノ酸配列からなる。TDP-43が前述のヒト変異型TDP-43又は他生物種のTDP-43オルソログの場合であれば、そのアミノ酸配列を配列番号１で示すヒトTDP-43のアミノ酸配列とアラインメントした時に、K136、K145、F147、及びF149に対応する4つの位置のアミノ酸を含むアミノ酸領域が該当する。
　本明細書において「TDP-43結合領域」とは、TDP-43との結合に直接関与する特定のmt-tRNAの塩基配列上の領域をいう。TDP-43結合領域は、特定のmt-tRNAの可変領域（Variable region）の全部又は一部で構成される。各mt-tRNAの可変領域はmt-tRNAAsnでは配列番号６（CUAAGUGUUUGUGGG）で示される塩基配列、mt-tRNAGlnでは配列番号７（UUCUCAGGGAUGGG）で示される塩基配列、mt-tRNAProでは配列番号８（GCUAAUGGUGGAGU）で示される塩基配列、そしてmt-tRNAGluでは配列番号９（AUCAUUGGUCGUGG）で示される塩基配列からなる。TDP-43結合領域は、これらの可変領域において、mt-tRNAAsnであれば少なくとも配列番号２（GUGUUUGUGG）、mt-tRNAGlnであれば少なくとも配列番号３（CAGGGAU）、mt-tRNAProであれば少なくとも配列番号４（AUGGUGG）、そしてmt-tRNAGluであれば少なくとも配列番号５（UUGGUCG）で示す塩基配列を含む。
　本明細書において「TDP-43/mt-tRNA結合阻害剤」とは、TDP-43-mt-tRNA複合体の形成を阻害する分子をいう。一般に、結合阻害剤には、標的物質に結合し、その結合領域を遮蔽して、標的物質が本来結合すべき相手分子がその結合領域に結合するのを物理的に阻止する遮蔽分子（ブロッカー）や、相手分子の結合領域に結合可能な相手分子に類似した構造を有し、結合領域を巡って相手分子と競合し合う拮抗分子（アンタゴニスト）が知られているが、本明細書におけるTDP-43/mt-tRNA結合阻害剤はどちらであってもよい。
１－３．構成
　本発明のTDP-43/mt-tRNA結合阻害剤は、標的対象に基づいて、TDP-43阻害剤、及びmt-tRNA阻害剤に大別できる。各阻害剤の構成は、以下の通りである。
１－３－１．TDP-43阻害剤
　本明細書において「TDP-43阻害剤」とは、TDP-43を標的物質とする分子であり、TDP-43のmt-tRNA結合領域の一部又は全部に結合して、又はTDP-43のmt-tRNA結合領域の一部又は全部を遮蔽して、TDP-43が特定のmt-tRNAと結合するのを阻害する。ここで「mt-tRNA結合領域の一部」とは、mt-tRNA結合領域において、K136、K145、F147、及びF149からなる群、好ましくはK136、K145、及びF147及びF149（本明細書では、しばしば「F147/F149」と表記する）からなる群、から選択されるアミノ酸の少なくとも1つを含む領域である。
　TDP-43阻害剤には、核酸性TDP-43阻害剤、ペプチド性TDP-43阻害剤、低分子化合物性TDP-43阻害剤、及びその組み合わせTDP-43阻害剤が含まれる。以下、核酸性TDP-43阻害剤及びペプチド性TDP-43阻害剤について説明をする。
（１）核酸性TDP-43阻害剤
　「核酸性TDP-43阻害剤」とは、核酸で構成されたTDP-43阻害剤である。核酸性TDP-43阻害剤を構成する核酸には、DNA及び／又はRNAのような天然型核酸の他、非天然型核酸が含まれる。本明細書において「非天然型核酸」とは、天然型核酸に類似の構造及び／又は性質を有する人工的に構築された核酸類似体をいう。例えば、ペプチド核酸（PNA：Peptide Nucleic Acid）、ホスフェート基ペプチド核酸（PHONA）、架橋化核酸（BNA/LNA：Bridged Nucleic Acid/Locked Nucleic Acid）、モルホリノ核酸等が挙げられる。核酸性TDP-43阻害剤を構成する核酸は、前記いずれの核酸であってもよい。好ましくは天然型核酸、すなわちDNA、RNA、又はそれらの組み合わせのみからなる核酸、又はそれに１又は数個の非天然型核酸を含んだ核酸である。
　また、核酸性TDP-43阻害剤を構成する核酸は、蛍光色素（例えば、フルオレサミン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、FITC、cy3、cy5、FAM、HEX、VIC）、クエンチャー物質（TAMRA、DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、又はBHQ-3）、ビオチン若しくは（ストレプト）アビジン、又は磁気ビーズ等の修飾物質、あるいはアイソトープ（例えば、32P、33P、35S）等を用いて修飾又は標識することもできる。これら修飾物質等の修飾／標識位置は、その修飾物質等の特性や、使用目的に応じて適宜定めればよい。一般的には、核酸性TDP-43阻害剤の5’又は3’末端部に修飾されることが多い。また、一つの核酸性TDP-43阻害剤が一以上の修飾物質等で修飾されていても構わない。
　核酸性TDP-43阻害剤には、例えば、TDP-43のmt-tRNA結合領域に結合するアンタゴニスト核酸、又は核酸アプタマーが挙げられる。以下、各核酸性TDP-43阻害剤について具体的に説明をする。
　（１－１）アンタゴニスト核酸
　「アンタゴニスト核酸」とは、標的物質の核酸結合領域に結合してアンタゴニストとして機能するヌクレオチドである。アンタゴニスト核酸は、標的物質の核酸結合領域を巡り、その核酸結合領域に本来結合すべき相手方核酸分子と競合する。アンタゴニスト核酸には、例えば、相手方核酸分子の不活性型で標的物質との結合性を維持したヌクレオチド、相手方核酸分子と構造的に類似したヌクレオチド、及び標的物質との結合領域を含む相手方核酸分子の一部からなるヌクレオチド等が挙げられる。また、アンタゴニスト核酸を構成する核酸は、前述のように天然型核酸又は非天然型核酸、DNA又はRNAを問わないが、好ましくはRNAである。
　核酸性TDP-43阻害剤におけるアンタゴニスト核酸の具体例としては、TDP-43結合領域が保持された不活性型mt-tRNA（例えば、アンチコドンループに変異を有する特定のmt-tRNA）や、TDP-43結合領域を含む可変領域の全部又は一部からなるヌクレオチドが挙げられる。前記可変領域の一部からなるヌクレオチドには、例えば、mt-tRNAAsnであれば少なくとも配列番号２（GUGUUUGUGG）で示す塩基配列を含むヌクレオチド、mt-tRNAGlnであれば少なくとも配列番号３（CAGGGAU）で示す塩基配列を含むヌクレオチド、mt-tRNAProであれば少なくとも配列番号４（AUGGUGG）で示す塩基配列を含むヌクレオチド、そしてmt-tRNAGluであれば少なくとも配列番号５（UUGGUCG）で示す塩基配列を含むヌクレオチドが挙げられる。より具体的には、mt-tRNAAsnであれば、例えば、配列番号１４（GUGUUUGUGGG）や配列番号１５（AAGUGUUUGUGGG）で示す塩基配列からなるヌクレオチド、mt-tRNAGlnであれば、例えば、配列番号２８（CAGGGAUGGG）や配列番号２９（CUCAGGGAUGGG）で示す塩基配列からなるヌクレオチド、mt-tRNAProであれば、例えば、配列番号３０（AUGGUGGAGU）や配列番号３１（UAAUGGUGGAGU）で示す塩基配列からなるヌクレオチド、そしてmt-tRNAGluであれば、例えば、配列番号３２（UUGGUCGUGG）や配列番号３３（CAUUGGUCGUGG）で示す塩基配列からなるヌクレオチドが挙げられる。
　核酸性TDP-43阻害剤におけるアンタゴニスト核酸は、前記TDP-43結合領域である可変領域の全部又は一部の配列に加え、その5'末端及び／又は3’末端にそれ以外の塩基を1又は複数個含んでいてもよい。例えば、前述の配列番号１５（AAGUGUUUGUGGG）で示す塩基配列からなるヌクレオチドの3’末端にUループを構成する塩基配列の一部を連結した配列番号１６（AAGUGUUUGUGGGUUU）からなるヌクレオチドであってもよい。
　（１－２）核酸アプタマー
　「アプタマー」とは、標的物質と特異的に結合する能力を持ったリガンド分子である。アプタマーは、自身の立体構造によって標的物質と強固、かつ特異的に結合し、標的物質の機能を特異的に抑制することができる。
　本明細書において、「核酸アプタマー」とは、核酸で構成されたアプタマーであって、水素結合等を介した一本鎖核酸分子の二次構造、さらに三次構造に基づいて形成される立体構造によって標的物質と強固、かつ特異的に結合し、標的物質の生理活性等の機能を特異的に阻害又は抑制する能力を持つリガンド分子をいう。
　核酸アプタマーは、RNAのみで構成されるRNAアプタマーとDNAのみで構成されるDNAアプタマーが知られているが、本明細書における核酸アプタマーを構成する核酸は、特に限定はしない。例えば、DNAアプタマー、RNAアプタマー、DNAとRNAの組み合わせで構成されるアプタマー等を含む。
　本実施形態における核酸アプタマーの標的物質は、TDP-43である。核酸アプタマーはTDP-43のmt-tRNA結合領域に結合して、又はTDP-43の他の領域に結合して、当該結合領域の全部又は一部を遮蔽して、特定のmt-tRNAがTDP-43のmt-tRNA結合領域に結合することを阻止する遮蔽分子として機能する。
　核酸アプタマーを作製する場合、RNAアプタマーであれば、例えば、SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)法を用いて試験管内選別により作製することができる。SELEX法とは、ランダム配列領域とその両末端にプライマー結合領域を有するRNA分子で構成されるRNAプールから標的物質であるTDP-43のmt-tRNA結合領域に結合したRNA分子を選択し、回収後にRT-PCR反応によって増幅した後、得られたcDNA分子を鋳型として転写を行い、次のラウンドのRNAプールにするという一連のサイクルを数～数十ラウンド繰り返して、標的物質に対してより結合力の強いRNAを選択する方法である。ランダム配列領域とプライマー結合領域の塩基配列長は特に限定はしない。通常、ランダム配列領域は20～80塩基、プライマー結合領域は、それぞれ15～40塩基の範囲である。標的物質への特異性を高めるためには、標的物質に類似する分子とRNAプールとを混合し、その分子と結合しなかったRNA分子からなるプールを用いればよい。このような方法によって最終的に得られたRNA分子をRNAアプタマーとして利用する。SELEX法は、公知の方法であり、具体的な方法は、例えば、Panら（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., (1995) 92: 11509-11513）に準じて行えばよい。
（２）ペプチド性TDP-43阻害剤
　「ペプチド性TDP-43阻害剤」とは、ペプチドで構成されたTDP-43阻害剤である。ペプチド性TDP-43阻害剤は、前記核酸アプタマーと同様に、標的物質であるTDP-43のmt-tRNA結合領域に結合して、又はTDP-43の他の領域に結合して、当該結合領域の全部又は一部を遮蔽して、特定のmt-tRNAがTDP-43のmt-tRNA結合領域に結合することを阻止する遮蔽分子として機能する。
　ペプチド性阻害剤には、例えば、標的物質であるTDP-43に対する抗体（抗TDP-43抗体）又はその断片が挙げられる。以下、抗TDP-43抗体及びその断片について具体的に説明をする。
　（２－１）抗TDP-43抗体
　「抗TDP-43抗体」とは、TDP-43に対して免疫応答性を示す抗体である。本明細書の抗TDP-43抗体は、TDP-43を構成するアミノ酸配列の一部をエピトープとして認識し、TDP-43に特異的に結合し、TDP-43のmt-tRNA結合領域を遮蔽できる抗体であればよい。例えば、mt-tRNA結合領域の一部をエピトープとする抗TDP-43抗体が挙げられる。具体的なエピトープとして、例えば、配列番号１で示すヒトTDP-43のアミノ酸配列において、K136、K145、F147、又はF149のうち少なくとも1のアミノ酸を含み、5～20個、7～18個、又は8～15個の連続するアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。一例として、配列番号１で示すヒトTDP-43のアミノ酸配列において136位～149位の14アミノ酸からなるペプチドが該当する。
　本発明で使用する抗体の由来生物種は、特に限定はしない。鳥類及び哺乳動物を使用すればよい。例えば、ニワトリ、ダチョウ、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ロバ、ヒツジ、ラクダ、ウマ、又はヒト等が挙げられる。
　本発明で使用する抗体は、TDP-43のアミノ酸配列上のエピトープを認識し、TDP-43に対して免疫応答性を示し、mt-tRNA結合領域を遮蔽できる抗体である限り、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれであってもよい。また、ポリクローナル抗体を包含する血清であってもよい。
　本明細書において「ポリクローナル抗体」とは、前述の抗原ペプチドに特異的に結合し、かつそれを認識することのできる異なる複数種の免疫グロブリン群をいう。また、本明細書において「モノクローナル抗体」とは、抗原に特異的に結合し、かつそれを認識することのできる単一種の免疫グロブリン、又は免疫グロブリンに含まれる少なくとも1組の軽鎖可変領域（VL領域）及び重鎖可変領域（VH領域）を包含する合成抗体又は組換え抗体をいう。
　本発明で使用する抗体が免疫グロブリン分子で構成される場合、免疫グロブリンは任意のクラス（例えば、IgG、IgE、IgM、IgA、IgD及びIgY）、又は任意のサブクラス（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2）とすることができる。
　「合成抗体」とは、化学的に又は組換えDNA法を用いることによって合成した抗体をいう。例えば、組換えDNA法を用いて新たに合成された抗体が挙げられる。具体的には、例えば、scFv（single chain Fragment of variable region：単鎖抗体）、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）又はテトラボディ（tetrabody）等が挙げられる。免疫グロブリン分子において、機能的な抗原結合部位を形成する一組の可変領域（軽鎖可変領域VL及び重鎖可変領域VH）は、軽鎖と重鎖という別々のポリペプチド鎖上に位置する。scFvは、免疫グロブリン分子において、VL及びVHを十分な長さの柔軟性リンカーによって連結し、1本のポリペプチド鎖に包含した構造を有する分子量約35kDa以下の合成抗体である。scFv内において1組の可変領域は、互いに自己集合して1つの機能的な抗原結合部位を形成することができる。scFvは、それをコードする組換えDNAを、公知技術を用いてベクターに組み込み、発現させることで得ることができる。ダイアボディは、scFvの二量体構造を基礎とした構造を有する分子である(Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448)。例えば、上記リンカーの長さが約12アミノ酸残基よりも短い場合、scFv内の2つの可変領域は自己集合できないが、2つのscFvを相互作用させてダイアボディを形成させることにより、一方のscFvのVLが他方のscFvのVHと集合可能となり、2つの機能的な抗原結合部位を形成することができる。さらに、scFvのC末端にシステイン残基を付加させることにより、2本のscFvどうしのジスルフィド結合が可能となり、安定的なダイアボディを形成させることもできる。このようにダイアボディは二価の抗体断片である。トリアボディ、及びテトラボディは、ダイアボディと同様にscFv構造を基本とした、その三量体、及び四量体構造を有する、それぞれ、三価、及び四価の抗体である。ダイアボディ、トリアボディ、及びテトラボディは、多重特異性抗体であってもよい。「多重特異性抗体」とは、多価抗体、すなわち抗原結合部位を一分子内に複数有する抗体において、それぞれの抗原結合部位が異なるエピトープと結合する抗体をいう。例えば、ダイアボディにおいて、それぞれの抗原結合部位が異なるエピトープと結合する二重特異性抗体（Bispecific抗体）が挙げられる。
　「組換え抗体」とは、キメラ抗体、又はヒト化抗体をいう。「キメラ抗体」とは、異なる動物由来の抗体のアミノ酸配列を組み合わせて作製される抗体で、ある抗体の定常領域（C領域）を他の抗体のC領域で置換した抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体のC領域をヒト抗体のC領域と置き換えた抗体が該当する。「ヒト化抗体」とは、ヒト抗体におけるCDRをヒト以外の哺乳動物由来の抗体におけるCDRと置換したモザイク抗体である。
　本発明で使用する抗体は、必要に応じて修飾することができる。ここでいう修飾は、グリコシル化のような抗原特異的結合活性に必要な機能上の修飾や抗体検出に必要な標識上の修飾を含む。抗体上のグリコシル化修飾は、標的対象であるTDP-43に対する抗体の親和性を調整するために行われる。具体的には、例えば、抗体可変領域のフレームワーク領域において、グリコシル化したアミノ酸残基を置換により除去する改変等が挙げられる。また、蛍光色素（FITC、ローダミン、テキサスレッド、Cy3、Cy5）、蛍光タンパク質（例えば、PE、APC、GFP）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ）、放射性同位元素（例えば、3H、14C、35S）又はビオチン若しくは（ストレプト）アビジンを用いて、抗体を標識することができる。
　本発明で使用する抗TDP-43抗体は、前述のエピトープのアミノ酸配列情報等に基づいて調製した抗原ペプチドを免疫原として当該分野の常法によって得ることができる。また、免疫原情報を提示して、各メーカーに委託製造することも可能である。以下、当該分野での一般的な免疫作製方法を簡単に説明する。
　まず、免疫原であるTDP-43断片を緩衝液に溶解して調製した免疫原溶液を、免疫動物である哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギ等に投与して免疫する。この際、効果的に免疫するために、必要に応じてアジュバントを添加してもよい。アジュバントは、市販の完全フロイントアジュバント（FCA）、不完全フロイントアジュバント（FIA）等を単独で又は混合して使用することができる。免疫原の投与方法としては、例えば、FIA又はFCAを用いた皮下注射、FIAを用いた腹腔内注射、又は塩化ナトリウムを用いた静脈注射が挙げられるが、この限りでない。免疫原の１回の投与量は、免疫動物の種類、投与経路等により適宜決定されるものであるが、動物１匹当たり約50～200μgである。また、免疫の間隔は特に限定されず、初回免疫後、数日から数週間間隔で、好ましくは1～4週間間隔で、2～6回、好ましくは3～4回追加免疫を行う。初回免疫より後に、免疫動物の血清中の抗体価の測定をELISA（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）法等により行い、抗体価が充分な上昇を見せれば、免疫原を静脈内又は腹腔内に注射し、最終免疫とする。抗TDP-43ポリクローナル抗体を取得する場合には、最終免疫後に、免疫動物から全血を回収すれば、当該ポリクローナル抗体を含む抗血清を得ることができる。一方、抗TDP-43モノクローナル抗体を取得する場合には、最終免疫の日から2～5日後、好ましくは3日後に、抗体産生細胞を採取して、当該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを調製すればよい。抗体産生細胞は、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が該当するが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
　抗TDP-43モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマは、免疫動物から得た抗体産生細胞とミエローマ細胞を細胞融合することによって作製できる。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞には、一般的に入手容易なマウス等由来の株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではHAT選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生育できる性質を有するものが好ましい。また、株化細胞は、免疫動物と同種系の動物に由来するものが好ましい。ミエローマ細胞は、例えば、BALB/cマウス由来のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRT）欠損細胞株である、P3X62-Ag.8株（ATCCTIB9）、P3X63-Ag.8.U1株（JCRB9085）、P3/NSI/1-Ag4-1株（JCRB0009）、P3x63Ag8.653株（JCRB0028）又はSP2/0-Ag14株（JCRB0029）等を利用することができる。
　細胞融合は、血清フリーのDMEM、RPMI1640培地等の動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞とミエローマ細胞を約1：1～20：1の割合で混合し、細胞融合促進剤の存在下にて融合すればよい。細胞融合促進剤には、平均分子量1,5kDa～4kDaのポリエチレングリコール(PEG)等の10～80％溶液を使用すればよい。また、融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を併用することもできる。さらに、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることも可能である。
　細胞融合処理後の細胞から目的とする抗TDP-43モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選別するには、細胞懸濁液を、例えば、ウシ胎児血清含有RPMI1640培地等で適当に希釈後、96ウェルマイクロタイタープレート上に2×106個／ウェル程度で播種し、各ウェルに選択培地を加えて培養すればよい。培養温度は20～40℃、好ましくは37℃である。ミエローマ細胞がHGPRT欠損株又はチミジンキナーゼ（TK）欠損株であれば、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含む選択培地（HAT培地）で培養することで、抗体産生細胞とミエローマ細胞のハイブリドーマのみを選択的に生育、及び増殖させることができる。したがって、選択培地で培養開始後、約10日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして選択すればよい。次に、選択したハイブリドーマを産生する抗体のTDP-43に対する結合活性を指標としてさらに選抜する。続いて、TDP-43への結合活性を持つ抗体については、交差性の試験を行い、許容できる抗体を産生するハイブリドーマを選択する。許容できる交差性とは、目的とする抗体の用途において、無視しうる程度の交差性を意味する。得られた抗TDP-43モノクローナル抗体のTDP-43への反応特異性を確認するには、例えば、ELISA法を利用すればよい。
　作製したハイブリドーマから抗TDP-43モノクローナル抗体は、宿主動物を腹水化することで得ることができる。具体的には、ハイブリドーマを作製する際に使用した融合パートナー（例えば、脾臓細胞とミエローマ細胞）の由来細胞と同種の動物（例えばマウス）、又は免疫不全動物（例えばヌードマウス）の腹腔内に作製したハイブリドーマを接種し、腹水を適宜採取することにより、目的の抗TDP-43モノクローナル抗体を含む腹水液を回収することができる。より具体的には、SP2/0細胞を融合パートナーとしたハイブリドーマを、プリスタン接種後10日間を経たBALB／cマウスの腹腔中に接種することにより、抗体を含む腹水液を回収できる。
　また、本発明におけるハイブリドーマは、適した培地を用いて培養を行うことにより抗体生産に用いることが出来る。具体的にはハイブリドーマSFM培地（Thermo Fisher Scientific社）の中に1×10５細胞/mLとなるようにハイブリドーマを接種し、37℃の5％CO2インキュベータにてハイブリドーマが死滅するまで培養することによって抗TDP-43モノクローナル抗体を含む培養液上清を得ることもできる。
　また、抗TDP-43モノクローナル抗体のアミノ酸配列が明らかであれば、そのアミノ酸配列に基づいて（Kabat E.A., et al., 1991, Sequences of proteins of immunological interest, Vol.1, eds.5, NIH publication）、化学的合成法や組換えDNA技術を用いることによって調製してもよい。
　（２－２）抗体断片
　「抗体断片」とは、前記抗TDP-43抗体の一部からなり、かつ抗TDP-43抗体と同様にTDP-43に対して免疫応答性を示し、TDP-43のmt-tRNA結合領域を遮蔽できるポリペプチドである。
　抗体断片には、例えば、Fab、F(ab')2、Fab'等が挙げられる。Fabは、抗TDP-43抗体を構成するIgG分子がパパインによって切断されて生じる抗体断片である。H鎖定常領域（重鎖定常領域：以下CHと表記する）を構成する3つのドメイン（CH1、CH2、CH3）のうちVHに隣接するCH1とVH、及び完全長の軽鎖（L鎖）から構成される。F(ab')2は、IgG分子がペプシンによって切断されて生じるFab'の二量体である。Fab'は、Fabよりもヒンジ部を含む分だけH鎖が若干長いが実質的にはFabと同等の構造を有する。Fab'は、F(ab')2をマイルドな条件下で還元し、ヒンジ領域のジスルフィド連結を切断することによって得ることができる。これらの抗体断片は、いずれも抗原結合部位を包含していることから、抗原エピトープと特異的に結合する能力を有している。
（３）低分子化合物性TDP-43阻害剤
　本明細書において「低分子化合物性TDP-43阻害剤」とは、分子量10000以下の低分子化合物で構成されたTDP-43阻害剤である。
１－３－２．mt-tRNA阻害剤
　本明細書において「mt-tRNA阻害剤」とは、特定のmt-tRNAのいずれか一以上を標的物質とする分子であり、特定のmt-tRNA上のTDP-43結合領域の一部又は全部に結合して、又は特定のmt-tRNA上のTDP-43結合領域の一部又は全部を遮蔽して、特定のmt-tRNAとTDP-43との結合、及びそれによるTDP-43-mt-tRNA複合体の形成を阻害する。ここで「TDP-43結合領域の一部」とは、TDP-43結合領域において、mt-tRNAAsnであれば少なくとも配列番号２（GUGUUUGUGG）で示す塩基配列を含む領域、mt-tRNAGlnであれば少なくとも配列番号３（CAGGGAU）で示す塩基配列を含む領域、mt-tRNAProであれば少なくとも配列番号４（AUGGUGG）で示す塩基配列を含む領域、そしてmt-tRNAGluであれば少なくとも配列番号５（UUGGUCG）で示す塩基配列を含む領域が挙げられる。
　mt-tRNA阻害剤には、核酸性mt-tRNA阻害剤、ペプチド性mt-tRNA阻害剤、低分子化合物性mt-tRNA阻害剤、及びその組み合わせmt-tRNA阻害剤が含まれる。以下、核酸性mt-tRNA阻害剤及びペプチド性mt-tRNA阻害剤について説明をする。
（１）核酸性mt-tRNA阻害剤
　「核酸性mt-tRNA阻害剤」とは、核酸で構成されたmt-tRNA阻害剤である。核酸性mt-tRNA阻害剤は、標的物質が異なることを除けば、その基本構成は前述の核酸性TDP-43阻害剤と同じである。したがって、核酸性TDP-43阻害剤と同様の構成についての説明は省略し、ここでは、原則として核酸性mt-tRNA阻害剤に特徴的な構成のみを説明する。
　核酸性mt-tRNA阻害剤は、各特定のmt-tRNAのTDP-43結合領域に結合するアンチセンスDNA、及び核酸アプタマーが挙げられる。以下、各核酸性mt-tRNA阻害剤について具体的に説明をする。
　（１－１）アンチセンスDNA
　アンチセンスDNAとは、通常、標的遺伝子のmRNAを標的物質として、その塩基配列の全部又は一部に対して相補的な塩基配列で構成されるDNA分子である。アンチセンスDNAは、標的物質に塩基対合を介して結合し、標的物質の機能を阻害する。
　本明細書の「アンチセンスDNA」は、特定のmt-tRNAを標的物質として、その可変領域の全部又は一部、好ましくはTDP-43結合領域の全部又は一部の塩基配列に相補的な塩基配列で構成される。特定のmt-tRNAのいずれか一のmt-tRNAの可変領域、好ましくはTDP-43結合領域に塩基対合を介して結合し、TDP-43結合領域を遮蔽することで、TDP-43-mt-tRNA複合体の形成を阻害する。本明細書のアンチセンスDNAの具体例として、mt-tRNAAsnを標的物質とするアンチセンスDNAであれば少なくとも配列番号１７（ACAAACAC）で示す塩基配列を含むヌクレオチド、mt-tRNAGlnを標的物質とするアンチセンスDNAであれば少なくとも配列番号１８（ATCCCTG)で示す塩基配列を含むヌクレオチド、mt-tRNAProを標的物質とするアンチセンスDNAであれば少なくとも配列番号１９（CCACCAT）で示す塩基配列を含むヌクレオチド、そしてmt-tRNAGluを標的物質とするアンチセンスDNAであれば少なくとも配列番号２０（CGACCAA）で示す塩基配列を含むヌクレオチドが挙げられる。アンチセンスDNAは、原則としてDNAのみで構成されるが、PNAやLNAのような核酸類似体やRNAも１又は数個であれば含むことができる。アンチセンスDNAの塩基長は、特に限定はしないが、通常は7～25塩基、好ましくは10～20塩基の長さで足りる。
　アンチセンスDNAは、各特定のmt-tRNA上の可変領域の全部又は一部に対する相補配列に加え、その5'末端及び／又は3’末端に、mt-tRNAの可変領域に隣接する他の領域の一部に相補的な塩基を1又は複数個含んでいてもよい。
　アンチセンスDNAは、当該分野における公知の核酸合成技術を用いて作製することができる。例えば、Green, M.R. and Sambrook, J., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkを参考にすればよい。又は、各メーカーで委託製造することもできる。
　（１－２）核酸アプタマー
　核酸性mt-tRNA阻害剤の核酸アプタマーも基本構成や作製方法は前述の核酸性TDP-43阻害剤の核酸アプタマーと同じであることから、ここでは前記核酸アプタマーと共通する構成については省略する。
　本実施形態における核酸アプタマーの標的物質は、特定のmt-tRNAである。核酸アプタマーは,特定のmt-tRNAのいずれか一のTDP-43結合領域に結合して、又はTDP-43の他の領域に結合して、当該結合領域の全部又は一部を遮蔽して、TDP-43が特定のmt-tRNAのTDP-43結合領域に結合することを阻止する遮蔽分子として機能する。
（２）ペプチド性mt-tRNA阻害剤
　「ペプチド性mt-tRNA阻害剤」とは、ペプチドで構成された特定のmt-tRNA阻害剤である。ペプチド性mt-tRNA阻害剤は、標的物質である特定のmt-tRNAのいずれか一のTDP-43結合領域に結合することにより、TDP-43との間でTDP-43結合領域を巡り競合するアンタゴニストとして機能するアンタゴニストペプチドが挙げられる。以下、アンタゴニストペプチドについて具体的に説明をする。
（２－１）アンタゴニストペプチド
　「アンタゴニストペプチド」とは、標的物質のペプチド結合領域に結合してアンタゴニストとして機能するペプチドである。アンタゴニストペプチドは、標的物質のペプチド結合領域を巡り、そのペプチド結合領域に本来結合すべき相手方ペプチドと競合する。アンタゴニストペプチドには、例えば、相手方ペプチドの不活性型で標的物質との結合性を維持したペプチド、相手方ペプチドと構造的に類似したペプチド、及び標的物質との結合領域を含む相手方ペプチドの一部からなるペプチド等が挙げられる。
　ペプチド性TDP-43阻害剤におけるアンタゴニストペプチドの具体例としては、mt-tRNA結合領域が保持された不活性型TDP-43（例えば、RRMの一部に変異を有する変異型TDP-43）や、mt-tRNA結合領域を含むTDP-43の一部からなるペプチドが挙げられる。
　mt-tRNA結合領域を含むTDP-43の一部からなるペプチドには、例えば、K136、K145、F147、及びF149の4つのアミノ酸を含む136位～149位の14アミノ酸からなるペプチド、又はこの14アミノ酸からなるペプチドを含むTDP-43上の15～100アミノ酸からなるペプチド、好ましくは18～50アミノ酸又は20～40アミノ酸からなるペプチドが挙げられる。
　なお、核酸性mt-tRNA阻害剤に分類され得るが、上記アンタゴニストペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子発現系も本発明のTDP-43/mt-tRNA結合阻害剤となり得る。
２．TDP-43細胞内存在量関連疾患治療用医薬組成物
２－１．概要
　本発明の第２の態様は、TDP-43細胞内存在量関連疾患治療用医薬組成物（本明細書では、しばしば単に「医薬組成物」と略称する）である。この医薬組成物は、前記第１態様のTDP-43/mt-tRNA結合阻害剤を有効成分とし、TDP-43細胞内存在量関連疾患治療用又は予防用として利用することができる。本発明の医薬組成物によれば、従来対処療法しか知られていなかったALS等のTDP-43細胞内存在量関連疾患に対する効果的治療法を提供することができる。
２－２．定義
　本明細書において「TDP-43細胞内存在量関連疾患」とは、TDP-43に関して、1細胞あたりの存在量が健常体のそれよりも統計学的に有意に増加又は減少している疾患をいう。TDP-43は、健常体の細胞内においては、1細胞あたりの存在量が極めて厳格に制御されている（Ayala, Y.M., et al., 2011, EMBO J. 30(2):277-288.）。したがって、その細胞内存在量が通常範囲を逸脱して変動した場合、その個体は、身体に何らかの変調をきたすことになる。TDP-43細胞内存在量関連疾患は、TDP-43の細胞内存在量が通常範囲を逸脱した疾患であれば、疾患の種類を問わない。TDP-43の細胞内存在量の変動と疾患との関連性が未解明である疾患であってもよい。好ましくは細胞あたりの前記TDP-43の存在量が健常体のそれと比較して、統計学的に有意に増加することが知られている疾患である。
　TDP-43細胞内存在量関連疾患の具体例として、TDP-43の存在量が健常体のそれと比較して統計学的に有意に増加することが知られている疾患の多くは神経系疾患である。それ故、神経系疾患は、本発明の対象疾患として好適である。そのような神経疾患としては、例えば、ALS、前頭側頭葉変性症（FTLD：frontotemporal lobar degeneration；ピック球を有するピック病を含むものとする。）、アルツハイマー病（AD：Alzheimer disease）、又はパーキンソン病（PD：Parkinson disease）が挙げられる。ALS又はFTLDは、本発明の対象疾患として好ましい。
　本明細書において「健常体」とは、少なくともTDP-43細胞内存在量関連疾患に罹患していない動物個体、好ましくはいずれの疾患にも罹患していない健康な動物個体をいう。好ましくは哺乳動物個体、より好ましくはヒトである。
　本明細書において「統計学的に有意」とは、被検体由来の細胞、及びそれと同等数の健常体由来の細胞中に存在するTDP-43の量的差異を統計学的に処理したときに、両者間に有意差があることをいう。具体的には、例えば、危険率（有意水準）が5％、1％又は0.1％より小さい場合が挙げられる。統計学的処理の検定方法は、有意性の有無を判断可能な公知の検定方法を適宜使用すればよく、特に限定しない。例えば、スチューデントｔ検定法、多重比較検定法を用いることができる。
　本明細書において「（細胞内）存在量」とは、細胞中に含まれる測定物質の分量をいう。存在量は、濃度、蛍光強度、イオン強度又は放射線強度のような相対量であってもよいし、容量のような所定細胞数あたりの測定物質の絶対量であってもよい。
　本明細書において「TDP-43との結合量」とは、所定量のTDP-43と直接的又は間接的に結合する測定物質の相対量又は絶対量をいう。したがって、「測定物質の、細胞内存在量又はTDP-43との結合量を測定する」とは、測定物質の、細胞内存在量又はTDP-43との結合量を定量することである。
　本明細書において「治療」とは、罹患した疾患及び／又はそれに伴う症状を緩和又は除去することをいう。また本明細書において「予防」とは、疾患の罹患や発症を未然に防ぐことをいう。
２－３．構成
２－３－１．有効成分
　本発明の医薬組成物は、第１態様に記載のTDP-43/mt-tRNA結合阻害剤を有効成分として包含する。TDP-43/mt-tRNA結合阻害剤は二以上含んでいてもよい。例えば、アンタゴニスト核酸とアンチセンスDNAを包含することができる。
　医薬組成物に配合される第１態様に記載のTDP-43/mt-tRNA結合阻害剤の量（含有量）は、包含されるTDP-43/mt-tRNA結合阻害剤の種類及び／又はその有効量（投与量又は摂取量）、疾患の種類、剤形、並びに後述する担体の種類等によって異なることから、それぞれの条件を勘案して適宜定めればよい。本明細書において「有効量」とは、医薬組成物においてTDP-43/mt-tRNA結合阻害剤がその機能を発揮する上で必要な量であって、かつそれを投与する生体に対して有害な副作用をほとんど又は全く付与しない量をいう。この有効量は、被験体の情報、投与経路、及び投与回数等の様々な条件によって変化し得る。
　本明細書において「被験体」とは、医薬組成物の投与対象となる生体をいう。例えば、ヒト、愛玩動物（イヌ、ネコ、ウサギ等）、競走馬、実験動物（マウス、ラット、モルモット、サル等）、家畜（ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリ、ダチョウ等）等が該当する。好ましくはヒトである。また、「被験体の情報」とは、医薬組成物を投与する被験体の様々な個体情報であって、例えば、ヒトの場合であれば、全身の健康状態、TDP-43細胞内存在量関連疾患の進行度や重症度、年齢、体重、性別、薬剤感受性、併用薬物の有無及び治療に対する耐性等を含む。
　医薬組成物中のTDP-43/mt-tRNA結合阻害剤の含有量、及びそれに基づいて算出される投与量は、個々の被験体の情報等に応じて、最終的には医師、又は獣医師等の判断によって決定される。このように本発明の医薬組成物におけるTDP-43/mt-tRNA結合阻害剤の含有量は、条件より異なる。TDP-43/mt-tRNA結合阻害剤の薬理効果を得る上で、医薬組成物の大量投与が必要な場合、被験体に対する負担軽減のために数回に分割して投与することもできる。例えば、通常成人1日当たりのTDP-43/mt-tRNA結合阻害剤の有効量を、1日1回又は数回に分けて、約1週間～約1年間、好ましくは約1ヶ月～約12ヶ月にわたり投与してもよい。
２－３－２．溶媒
　本発明の医薬組成物は、必要に応じて薬学的に許容可能な溶媒中に溶解することができる。「薬学的に許容可能な溶媒」とは、製剤技術分野において通常使用する溶媒をいう。例えば、水若しくは水溶液、又は有機溶剤のいずれであってもよい。水溶液には、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液が挙げられる。補助剤には、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム、その他にも低濃度の非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。有機溶剤には、エタノールが挙げられる。
２－３－３．担体
　本発明の医薬組成物は、必要に応じて薬学的に許容可能な担体を含むことができる。「薬学的に許容可能な担体」とは、製剤技術分野において通常使用する添加剤をいう。剤形形成を容易にし、また剤形及び薬剤効果を維持する他、有効成分であるTDP-43/mt-tRNA結合阻害剤が生体内の酵素等によって分解を受け難くするために用いられるものであって、必要に応じて適宜使用すればよい。例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、滑沢剤、ヒト血清アルブミン等が挙げられる。
　賦形剤には、例えば、単糖、二糖類、シクロデキストリン及び多糖類のような糖、金属塩、クエン酸、酒石酸、グリシン、ポリエチレングリコール、プルロニック、カオリン、ケイ酸、又はそれらの組み合わせが挙げられる。
　結合剤には、例えば、植物デンプンを用いたデンプン糊、ペクチン、キサンタンガム、単シロップ、グルコース液、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セラック、パラフィン、ポリビニルピロリドン又はそれらの組み合わせが挙げられる。
　崩壊剤としては、例えば、前記デンプンや、乳糖、カルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、アルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド又はそれらの塩が挙げられる。
　充填剤としては、ワセリン、前記糖及び／又はリン酸カルシウムが例として挙げられる。
　乳化剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルが例として挙げられる。
　流動添加調節剤及び滑沢剤としては、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩又はポリエチレングリコールが例として挙げられる。
　必用であれば、さらに医薬において通常用いられる可溶化剤、懸濁剤、希釈剤、分散剤、界面活性剤、安定剤、吸収促進剤、増量剤、保湿剤、吸着剤、崩壊抑制剤、コーティング剤、着色剤、保存剤、防腐剤、抗酸化剤、香料、風味剤、甘味剤、緩衝剤、等張化剤等を適宜含むこともできる。
２－３－４．剤形
　本実施形態の医薬組成物の剤形は、有効成分である第１態様に記載のTDP-43/mt-tRNA結合阻害剤を不活化させず、投与後に生体内で有効成分の薬理効果を発揮し得る形態であれば特に限定しない。一般に、医薬組成物の剤形は、投与法及び／又は処方条件によって異なる。投与法は、経口投与と非経口投与に大別することができるので、それぞれの投与法に適した剤形にすればよい。
　経口投与に適した剤形としては、例えば、固形剤（錠剤、丸剤、舌下剤、カプセル剤、ドロップ剤、トローチ剤を含む）、顆粒剤、粉剤、散剤、液剤（内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤を含む）等が挙げられる。固形剤は、必要に応じて当該技術分野で公知の剤皮を施した剤形、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠にすることができる。
　非経口投与は、全身投与及び局所投与に細分され、局所投与は組織内投与、経表皮投与、経粘膜投与及び経直腸的投与にさらに細分されることから、医薬組成物もそれぞれの投与法に適した剤形にすればよい。例えば、全身又は組織内投与に適した剤形としては、液剤である注射剤が挙げられる。経表皮投与又は経粘膜投与に適した剤形としては、液剤（塗布剤、点眼剤、点鼻剤、吸引剤を含む）、懸濁剤（乳剤、クリーム剤を含む）、粉剤（点鼻剤、吸引剤を含む）、ペースト剤、ゲル剤、軟膏剤、硬膏剤等を挙げることができる。経直腸的投与に適した剤形としては、坐剤等を挙げることができる。
　本形態の医薬組成物は、TDP-43細胞内存在量関連疾患の治療又は予防用として適用される。投与方法は、限定はされないが、前述のようにTDP-43細胞内存在量関連疾患の多くは神経系疾患であることから、循環系を介した全身投与か、神経周辺へ直接投与する局所投与が好ましい。具体的には、例えば、血管内注射（静脈内注射、動脈内注射を含む）若しくはリンパ管内注射等の循環器内投与又は筋肉内注射による局所投与が挙げられる。注射剤には、前記賦形剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、pH調節剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化すればよく、単位用量アンプル又は多用量容器の状態で提供される。
　なお、上記各剤形の具体的な形状、大きさについては、それぞれの剤形において当該分野で公知の剤形の範囲内にあればよく、特に限定はしない。
　本発明の医薬組成物の製造方法については、当該技術分野の常法に従って製剤化すればよい。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (Merck Publishing Co., Easton, Pa.)に記載された方法を参照することができる。
＜実施例１：TDP-43におけるmt-tRNA結合領域の同定＞
（目的）
　TDP-43におけるmt-tRNA結合領域を、変異型TDP-43を用いて同定する。
（方法）
（１）変異型TDP-43の調製
　FLAGタグ融合変異型TDP-43発現ベクターの調製方法は、前回本発明者らが使用したWO2013/129603の実施例１に記載の「（１）DAPタグ付TDP-43発現ベクターの調製」の方法に準じた。配列番号１で示すアミノ酸配列からなるヒトTDP-43をコードするDNA断片に基づいて、136位のリジンをアラニンに（K136A）、140位のリジンをアラニンに（K140A)、145位のリジンをアラニンに（K145A)、及び147位と149位の両フェニルアラニンをロイシンに、それぞれ置換したアミノ酸配列をコードする塩基配列に置換した。
（２）ドキシサイクリン誘導型細胞系を用いたTDP-43の発現
　各置換型TDP-43をコードするDNA断片をWO2013/129603の実施例１「（２）ドキシサイクリン誘導型細胞系の構築」に記載の方法に従って、Flp-In-T-REx Expression System（Thermo Fisher Scientific）を用いてFlp-In-T-REx 293細胞（293 TRex細胞）の染色体に組み込み、薬剤誘導株を作製した。続いて、ドキシサイクリンにより各野生型及び変異型TDP-43の発現を誘導した。
（３）細胞抽出液の調製
　TDP-43発現誘導後の細胞抽出液の調製は、Izumikawaら（Biochem J., 2008, 413(3):505-516）の方法に従った。すなわち、細胞をPBSでリンスした後、2mM リボヌクレオシド-バナジル複合体、1mM PMSF、2μg/mL アプロチニン、2μg/mL ペプスタチンA及び2μg/mL リューペプチンを含む細胞塊5倍量の溶解バッファ（50ｍM Tris/HCl (pH7.4)、150mM NaCl、0.5％（w/v） IGEPAL CA-630）で30分間、氷中にて懸濁した。20000gで30分間4℃にて遠心し、上清を細胞抽出液として回収した。細胞抽出液中のタンパク質濃度は、Protein Assay(Bio-Rad)によって測定した。
（４）免疫沈降とRNA回収
　FLAGタグを含むDAP-TDP-43を免疫沈降するために、2×107細胞の細胞抽出液から6mgのタンパク質画分を調製し、15μLのANTI-FLAG-M2 アフィニティーゲル(Sigma-Aldrich)を加えて、4℃で2時間インキュベートした。DAP-TDP-43が結合した前記アフィニティーゲルを1mLの前記溶解バッファで5回洗浄し、150μLのタンパク質-RNA抽出バッファ（7M ウレア、350mM NaCl、1％ SDS、10mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM EDTA、2％ 2-メルカプトエタノール）を用いて、4℃で5分間溶出した。溶出したタンパク質と共免疫沈降したRNAを1000gで4℃にて5分間遠心することによってゲルから分離し、その後、フェノール-クロロホルム抽出を行い、タンパク質とRNAを分離した。タンパク質は、フェノール-クロロホルム抽出後の有機層に3倍量のイソプロパノールを混合し、20000gで4℃にて10分間遠心することで沈殿させ、75％エタノールで直ちに一度洗浄し、乾燥させた。RNAは、水層からイソプロパノール沈殿によって回収した。
（５）ウレア変性PAGEとノザンブロッティング
　細胞抽出液から回収したRNAの分離及びノザンブロッティングは、基本的には、Green, M.R. and Sambrook, J., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkに記載の方法に従った。8Mウレアと0.5×TBEバッファを含む8％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した後、Trans-blot SD Cell（Bio-Rad）を用いてナイロンメンブレン（Hybond-N+：Bio-Rad）に10V、60分間の条件で転写した。RNAとメンブレンをUVで架橋した後、ビオチン化プローブを用いてハイブリダイゼーション溶液PERFECTHYB PLUS(SIGMA)中で42℃にて一晩ハイブリダイズした。メンブレンをPERFECTHYB PLUSTechnical Bulltinに則った溶液で洗浄を行い、Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module kit (Thermo Fisher Scientific)を用いて添付の説明書に従ってRNAを検出した。検出に用いたmt-tRNAAsnプローブ及びmt-tRNAGlnプローブは、それぞれのmt-tRNA等に特異的な塩基配列に対して相補的な配列を有する。すなわち、mt-tRNAAsnプローブは、Asn2としてmt-tRNAAsn遺伝子の塩基配列40～73位に相補的な配列（配列番号２４：ctagaccaatgggacttaaacccacaaacactta）を、またmt-tRNAGlnプローブは、mt-tRNAGln遺伝子の塩基配列の36～65位に相補的な配列（配列番号２２；tatgagaatcgaacccatccctgagaatcc）を有する。各プローブは、3’末端をBiotin 3′ End DNA Labeling kit (Thermo Fisher Scientific)を用いて標識化した。各RNAバンドのシグナル強度は、LAS4000イメージアナライザーとMultiGauge software (Fujifilm)を用いて定量した。
（結果）
　図２に結果を示す。K136AとK145A及びF147/149Lの変異型TDP-43ではmt-tRNAAsn及びmt-tRNAGlnの検出量が野生型TDP-43（WT)と比較して低下していた。一方、K140Aの変異型TDP-43ではmt-tRNAAsn及びmt-tRNAGlnのいずれも野生型TDP-43と同程度の検出量であった。この結果は、TDP-43において、K136、K145、F147、及びF149がいずれも特定のmt-tRNAとの結合に関与する重要なアミノ酸であり、mt-tRNA結合領域を構成するアミノ酸の一部であることを強く示唆している。
＜実施例２：変異型TDP-43と細胞毒性との関係＞
（目的）
　実施例１で用いた各変異型TDP-43によって誘導される細胞毒性について検証する。
（方法）
　野生型及び前記実施例１で調製した変異型TDP-43の過剰発現系を用いて、ヒト細胞における細胞毒性能について調べた。DAP-TDP43 (WT)、DAP-K136A、DAP-K140A、DAP-K145A、及びDAP-F147/149Lの各細胞培養液にドキシサイクリン（Dox）を添加し、添加0時間後及び48時間後の細胞数をBurker-Turk chamber (Hirschmann; Laborgerate Hilgenberg)で視覚的に細胞数をカウントすることによって算出した。
（結果）
　結果を図３に示す。野生型TDP-43とK140A変異型TDP-43では、同程度の細胞毒性が認められたが、K136A、K145A、及びF147/149Lの変異型TDP-43では、細胞毒性が認められなかった。この結果は、実施例１の結果と一致している。つまり、この結果は、TDP-43による細胞毒性は、TDP-43と特定のmt-tRNAの結合が原因であることを強く示唆している。この結果は、TDP-43又は特定のmt-tRNAの結合領域に結合するか、いずれかの結合領域を遮蔽して、TDP-43と特定のmt-tRNAとの結合を阻害する分子は、TDP-43による細胞毒性を低減又は消去することができることを示している。
＜実施例３：mt-tRNAAsnにおけるTDP-43結合領域の同定＞
（目的）
　実施例１とは逆に、特定のmt-tRNAにおけるTDP-43結合領域を同定する。
（方法）
　特定のmt-tRNAとしてmt-tRNAAsnを用いた。mt-tRNAAsnをコードするDNA（配列番号１０）をクローニングし、これをベースに、mt-tRNAの各領域の塩基配列をmt-tRNALeuをコードするDNA（配列番号２３）の対応する領域の塩基配列に置き換えたmt-tRNAAsnとmt-tRNALeuのキメラmt-tRNA（mt-tRNAAsn/Leu）をコードするDNAを調製した。mt-tRNALeuはTDP-43に結合しないことが知られている。
　各キメラmt-tRNAの塩基配列を図４に示す。各キメラmt-tRNAの塩基配列において、下線部がmt-tRNALeu由来の塩基配列である。例えば、Ac-stem(Leu)は、mt-tRNAAsnの一部塩基配列（UAGAUUG）をmt-tRNALeuの対応する塩基配列（GUUAAGA）に置換したキメラmt-tRNAである。同様に、図４において、D-loop(Leu)はmt-tRNAAsnのD-loop領域をmt-tRNALeuのD-loop領域に置換したものであり、pAntiCdn(Leu)はmt-tRNAAsnのanticodon loop領域をmt-tRNALeuのanticodon loop領域に置換したものであり、Var-R(Leu)はmt-tRNAAsnの可変領域をmt-tRNALeuのVar-R(Leu)に置換したものであり、そしてU-loop(Leu)はmt-tRNAAsnのU-loop領域をmt-tRNALeuのU-loop領域に置換したものである。これらのキメラmt-tRNAをコードするDNA断片を含む発現プラスミドを作製し、これを鋳型にしてin vitro transcription systemを用いて上記キメラmt-tRNAを合成した。
　トリガー因子（TF: Trigger Factor）タンパク質融合TDP-43発現ベクターpCOLD-TF DNA（タカラバイオ社）を用いて、TF-TDP-43-FLAGの大腸菌による発現精製を行った。C末端にFLAGペプチド配列を融合したTDP-43遺伝子を発現ベクターpCOLD-TF DNAに発現可能な状態で挿入したpCOLD-TF-TDP-43-FLAGを作製した。コントロールにはFLAG配列のみを持つpCOLD-TF-FLAGを用いた。タンパク質発現用大腸菌株としてRosettaTM 2(DE3)pLysS SinglesTM Com petent Cells（ノバジェン・カルビオケム）を用い、TF-TDP-43-FLAG又はTF-FLAGを発現した。Ni-NTA agarose(キアゲン)でHisタグ精製を行い、FLAG-M2 agarose beads（SIGMA）でFLAGタグを利用して２段階精製し、TF-TDP-43-FLAG及びTF-FLAGを精製した。CUGA in vitro Transcription Kit （ニッポンジーン）を用いて野生型mt-tRNA及び各キメラmt-tRNAのRNA合成を行い、LC精製を行った。融合タンパク質200ng、合成RNA 10ngを10μLのRNA-タンパク質結合溶液（40mM Tris-HCl pH7.4, 30mM KCl, 1mM MgCl2, 0.01% IGEPA CA-630, 1mM DTT, 1mg/mL BSA, 1mg/mL yeast tRNA）内で混合し、25℃にて30分間インキュベートし反応させた。反応溶液を6％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、ノザンブロットを行った。mt-tRNAAsnプローブにはAsn1としてmt-tRNAAsn遺伝子の塩基配列7～34位に相補的な配列（配列番号２１：cagctaagcaccctaatcaactggcttc）、及び前述のAsn2を、またmt-tRNALeuプローブにはmt-tRNALeu遺伝子の塩基配列の1～30位に相補的な配列（配列番号２５）からなるLeu1を用い、融合タンパク質と結合したRNAを検出した。
（結果）
　結果を図５－１～図５－３に示す。陽性対照のmt-tRNAAsnはTG-TDP-43との結合が認められたが、陰性対照のmt-tRNALueではTG-TDP-43との結合は認められていない（図５－１）。一方、キメラmt-tRNAではVar-R(Leu)のみがTG-TDP-43との結合が大幅に低下した（図５－２、図５－３）。この結果は、mt-tRNAAsnが可変領域でTDP-43と結合していることを示唆している。
＜実施例４：TDP-43/mt-tRNA結合阻害剤によるTDP-43と特定のmt-tRNAの結合阻害＞
（目的）
　実施例３からmt-tRNAAsnが可変領域を介してTDP-43と結合することが明らかになったことから、可変領域の一部を含むヌクレオチドがmt-tRNAAsnのアンタゴニストとしてTDP-43のmt-tRNAに結合し、TDP-43とmt-tRNAとの結合を阻害するTDP-43/mt-tRNA結合阻害剤になることを検証する。
（方法）
　mt-tRNAAsnの5’末端の塩基を1位としたときに、可変領域とTループの一部に相当する41～56位の塩基配列からなるRNAオリゴヌクレオチドVar-1（aaguguuuguggguuu）（配列番号１６）、可変領域の一部に相当する43～53位の塩基配列からなるRNAオリゴヌクレオチドVar-2（guguuuguggg）（配列番号１４）及び43位～49位の塩基配列からなるRNAオリゴヌクレオチドVar-3（guguuug）（配列番号２６）をmt-tRNAAsn阻害剤候補として合成した。mt-tRNAGlnプローブにはmt-tRNAGln遺伝子の塩基配列36～65位に相補的な配列（配列番号２７：tatgagaatcgaacccatccctgagaatcc）からなるGln1を用いた。
　競合アッセイは、実施例１の方法に準じて行った。まず、実施例１の「（３）細胞抽出液の調製」に記載の方法に従って細胞抽出液を調製した後、400nMとなるように各mt-tRNAAsn阻害剤候補を添加した。続いて、実施例１の「（４）免疫沈降とRNA回収」及び「（５）ウレア変性PAGEとノザンブロッティング」に記載の方法に従って処理してFLAGタグを含むDAP-TDP-43と結合する核酸を電気泳動により展開した。そして、ノザンブロッティングによりDAP-TD-43に結合するmt-tRNAAsnを検出し、定量した。検出に用いたオリゴヌクレオチドプローブには、前述の配列番号２１のオリゴヌクレオチドを利用した。mt-tRNAAsnのRNAバンドのシグナル強度は、LAS4000イメージアナライザーとMultiGauge software (Fujifilm)を用いて定量した。
（結果）
　結果を図６に示す。mt-tRNAAsn阻害剤候補のVar-1及びVar-2は、mt-tRNAAsnとTDP-43のみならずmt-tRNAGlnとTDP-43の結合も阻害した。一方、Var-3では、TDP-43とmt-tRNAとの結合阻害は認められなかった。この結果は、mt-tRNAの可変領域の全部又は一部を含むRNAオリゴヌクレオチドは、TDP-43のmt-tRNA結合領域にアンタゴニスト核酸として結合し、特定のmt-tRNAの種類にかかわらずTDP-43とmt-tRNAとの結合を阻害するTDP-43/mt-tRNA結合阻害剤となることを示唆している。ただし、mt-tRNAにおける可変領域の一部が、配列番号２６で示す塩基配列以下の場合には、阻害効果がないことが明らかとなった。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (9)

  1. 　TAR DNA結合タンパク質-43とmt-tRNAとの結合阻害剤であって、
    （ａ）mt-tRNAにおける可変領域の全部又は一部からなる領域に結合する分子、
    （ｂ）mt-tRNAにおける可変領域の全部又は一部からなる領域を遮蔽する分子、
    （ｃ）配列番号１で示すアミノ酸配列において136位のリジン、145位のリジン、147位のフェニルアラニン及び149位のフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸を少なくとも1つ含むTAR DNA結合タンパク質-43の一部からなる領域に結合する分子、又は
    （ｄ）配列番号１で示すアミノ酸配列における136位のリジン、145位のリジン、147位のフェニルアラニン及び149位のフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸の少なくとも1つ含むTAR DNA結合タンパク質-43の一部からなる領域を遮蔽する分子、
    からなり、
    　前記mt-tRNAは、mt-tRNAAsn、mt-tRNAGln、mt-tRNAPro及びmt-tRNAGluからなる群から選択されるいずれかのmt-tRNAである、
    　前記結合阻害剤。
  2. 　前記分子が核酸、ペプチド、低分子化合物、又はそれらの組み合わせで構成される、請求項１に記載の結合阻害剤。
  3. 　前記核酸が配列番号２（guguuugugg）、配列番号３（cagggau）、配列番号４（auggugg）及び配列番号５（uuggucg）で示すいずれか一の塩基配列を含むヌクレオチドからなり、TAR DNA結合タンパク質-43と結合する、請求項２に記載の結合阻害剤。
  4. 　前記核酸が前記mt-tRNAにおける可変領域の全部又は一部からなる領域に相補的な塩基配列を含むヌクレオチドからなり、前記いずれか一のmt-tRNAに結合する、請求項２に記載の結合阻害剤。
  5. 　前記mt-tRNAにおける可変領域が配列番号６（cuaaguguuuguggg）、配列番号７（uucucagggauggg）、配列番号８（gcuaaugguggagu）、及び配列番号９（aucauuggucgugg）で示すいずれか一の塩基配列からなる、請求項４に記載の結合阻害剤。
  6. 　前記ペプチドが配列番号１で示すアミノ酸配列において136位～149位のアミノ酸配列を含み、全長100アミノ酸以下のペプチドからなる、前記いずれか一のmt-tRNAに結合する、請求項２に記載の結合阻害剤。
  7. 　前記核酸が請求項６に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子発現系である、請求項２に記載の結合阻害剤。
  8. 　請求項１～７のいずれか一項に記載のTAR DNA結合タンパク質-43とmt-tRNAとの結合阻害剤を有効成分とするTAR DNA結合タンパク質-43細胞内存在量関連疾患治療用医薬組成物。
  9. 　前記TAR DNA結合タンパク質-43細胞内存在量関連疾患が筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭葉変性症、アルツハイマー病、及びパーキンソン病からなる群から選択される、請求項８に記載の医薬組成物。
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