CN114207443A - 评价移植肾慢性排斥反应和慢性肾脏病的发病或进展的可能性的方法、检查试剂盒和药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种评价被检者的移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的发病或进展的可能性的方法，其以从被检者采集的尿来源样本中的SYT17蛋白量为指标。另外，本发明提供一种用于预防和/或治疗移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的药物组合物，其包含选自由针对SYT17的特异性抗体和其衍生物以及针对SYT17的抑制性核酸组成的组中的至少1种物质，以及，提供一种用于评价移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的发病或进展的可能性的检查试剂盒，其包含针对SYT17的特异性抗体或其衍生物。

Description

评价移植肾慢性排斥反应和慢性肾脏病的发病或进展的可能 性的方法、检查试剂盒和药物组合物
技术领域
本发明涉及评价移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的发病或进展的可能性的方法和用于评价的检查试剂盒、以及用于预防和/或治疗移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的药物组合物。
背景技术
慢性肾脏病(Chronic Kidney Diseases、CKD)是指：以蛋白尿为代表的肾损伤和以肾小球滤过率为指标的肾功能下降中的任一者或两者持续了3个月以上的状态，在日本每8名成年人中就有1人患病。一旦慢性肾脏病的症状进展而达到终末期肾衰竭，则无法寄希望于药剂治疗效果，多数患者不得不进行人工透析。人工透析为对症疗法，因此进入终末期肾衰竭的患者需要终生持续接受人工透析，给患者造成了巨大的身体上和经济上的负担。另外，透析医疗费的增加已成为医疗经济方面值得关注的问题。
慢性肾脏病的诊断中，通过尿蛋白、尿白蛋白、血清肌酐(Cre)、尿素氮(BUN)和估算的肾小球滤过率(eGFR)之类的生物标志物来进行肾功能的评价。这些生物标志物虽然具有能够简便地进行测定或计算的优点，但是不适宜于在早期高灵敏度地检测肾功能损伤的进展。
另外，终末期肾衰竭的唯一根治疗法为肾移植。2013年的美国肾脏数据系统(非专利文献1)的数据显示，接受肾移植者的生存率好于透析患者。
影响肾移植成功率的主要问题是对同种移植物的免疫排斥。随之近年来免疫抑制剂、医疗技术的发展，急性免疫排斥的风险已经显著下降。但是，以慢性活动性抗体介导的排斥反应(Chronic active antibody-mediated rejection，CAAMR)为代表的较缓慢地进展的慢性排斥反应依然难以克服。
慢性排斥反应为肾移植后3个月起产生的排斥反应。慢性排斥反应通常在观察不到明确的临床症状的状态下缓慢地进展，很可能会因为未采取适宜的处置而发展到移植肾功能丧失。慢性排斥反应的诊断通常通过移植片的活体组织诊断(活检)来进行。但是，活检给被检者带来的负担大，另外也不是一种简便的方法。而且活检有时也会低估排斥反应的等级或漏检病变部。因此，能够简便且准确地判定慢性排斥反应的发病或进展的可能性的方法对于慢性排斥反应的诊断、适宜实施活检的时机的确定、在适宜的时机实施慢性肾脏病的预防性或治疗性处置而言有益，在肾移植治疗中具有重要的意义。
另一方面，被称为突触结合蛋白(synaptotagmins)的蛋白家族是已知的。突触结合蛋白是存在于经鉴定为钙/磷脂结合分子的突触泡上的膜蛋白，一般认为通过与钙离子的结合能力而在突触泡的胞吐作用(exocytosis)中作为钙传感器起作用。
据报道，突触结合蛋白家族在人类中存在17种亚型，其大多数在N末端侧具有跨膜区、在C末端侧的细胞质区具有两个C2区。被称为突触结合蛋白-17(Synaptotagmin-17、SYT17)的蛋白具有与人突触结合蛋白家族中共同的C末端侧的C2区结构相同的2个C2样结构域，但是不具有N末端的跨膜区。
据报道，SYT17蛋白在脑和肾脏中表达，特别是在红藻氨酸诱发的大鼠癫痫发作模型的海马中、另外在缺血再灌注损伤后的肾脏中，在近端肾小管中分别是增加的，表达量根据病情而变化(非专利文献2和非专利文献3)。但是，截至目前为止尚未发现关于慢性肾脏病和慢性排斥反应中SYT17蛋白的功能性作用和表达量的变化的报道。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：UNITED STATES RENAL DATA SYSTEM、[online]、[令和2年1月28日检索]、因特网<URL：https://www.usrds.org/>
非专利文献2：Jang,Y.S.,et al.,2004,Brain Res.999:203
非专利文献3：Han,K.H.,et al.,2007,Am.J.Physiol.Renal Physiol.292:F100
发明内容
发明要解决的课题
本发明的目的在于提供一种临床指标，其能够评价移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的发病或进展的可能性，能够对移植肾活检、必要的处置的实施提供适宜的信息。
用于解决课题的方案
本发明人们发现，与健康人相比，发生了移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的患者的尿样本中存在大量的SYT17蛋白，从而完成了以下的发明。
(1)一种评价被检者的移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的发病或进展的可能性的方法，其以从被检者采集的尿来源样本中的SYT17蛋白量为指标。
(2)根据(1)所述的方法，其包括：测定从被检者采集的尿来源样本中的SYT17蛋白量的工序；比较被检者尿来源样本中的SYT17蛋白量和截止值的工序，上述截止值是如下确定的：预先测定从已经发生了移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的多名患者和对照者中采集的尿来源样本中的SYT17蛋白量，使用这些测定值进行ROC分析，从而确定截止值；以及，在被检者尿来源样本中的SYT17蛋白量超过截止值的情况下，将被检者评价为已经发生了移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病或发生的可能性高的工序。
(3)根据(1)所述的方法，其包括：测定从被检者采集的尿来源样本中的SYT17蛋白量的工序；比较被检者尿来源样本中的SYT17蛋白量和从对照者采集的尿来源样本中的SYT17蛋白量的工序；以及，在被检者尿来源样本中的SYT17蛋白量比对照者尿来源样本中的SYT17蛋白量多的情况下，将被检者评价为已经发生了移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病或发生的可能性高的工序。
(4)根据(1)所述的方法，其包括：测定从被检者采集的第一尿来源样本中的SYT17蛋白量的工序；比较第一尿来源样本中的SYT17蛋白量和第二尿来源样本中的SYT17蛋白量的工序，所述第二尿来源样本是在采集第一尿来源样本之前的时间点从同一被检者采集的；以及，在第一尿来源样本中的SYT17蛋白量比第二尿来源样本中的SYT17蛋白量多的情况下，将被检者的移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病评价为在采集第一尿来源样本时，比采集第二尿来源样本时有进展的可能性高的工序。
(5)根据(1)～(4)中任一项所述的方法，其中，尿来源样本为尿中外泌体被浓缩的样本。
(6)根据(1)～(5)中任一项所述的方法，其中，被检者为肾移植的受体。
(7)根据(1)～(6)中任一项所述的方法，其中，成为慢性肾脏病的原因的肾疾病为膜性肾病、肾病综合征、狼疮性肾炎、糖尿病性肾病、IgA肾病、局灶节断性肾小球硬化、常染色体显性多发性囊性肾或慢性移植肾肾病。
(8)一种用于预防和/或治疗移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的药物组合物，其包含选自由针对SYT17的特异性抗体和其衍生物以及针对SYT17的抑制性核酸组成的组中的至少1种物质。
(9)根据(8)所述的药物组合物，其用于对尿中SYT17蛋白量多于对照者的尿中SYT17蛋白量或超过截止值的对象进行给药，上述截止值是如下确定的：预先测定从已经发生了移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的多名患者和对照者中采集的尿来源样本中的SYT17蛋白量，对这些测定值进行ROC分析，从而确定截止值。
(10)根据(8)或(9)所述的药物组合物，其中，成为慢性肾脏病的原因的肾疾病为膜性肾病、肾病综合征、狼疮性肾炎、糖尿病性肾病、IgA肾病、局灶节断性肾小球硬化、常染色体显性多发性囊性肾或慢性移植肾肾病。
(11)一种用于评价移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的发病或进展的可能性的检查试剂盒，其包含针对SYT17的特异性抗体或其衍生物。
(12)根据(11)所述的检查试剂盒，其还包括针对CD9的特异性抗体或其衍生物。
(13)根据(11)或(12)所述的检查试剂盒，其用于(8)～(10)中任一项所述的药物组合物的伴随诊断。
发明的效果
根据本发明，能够使用尿来源样本之类的可非侵入地且简便地采集的样本了解移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的发病或进展的可能性，另外能够进行其的预防和/或治疗。
附图说明
图1：图1A是示出来自被分类为正常病理组织组(NED)、纤维化组(IF/TA)、钙调神经磷酸酶毒性组(CNI-T)和慢性活动性抗体介导的排斥反应组(CAAMR)的肾移植患者的移植肾样本的、关于SYT17蛋白的免疫组织染色结果的代表性荧光显微镜照片。图1B是示出用ImageJ来定量免疫组织染色中检测到的SYT17信号的荧光强度的结果的图。***:p<0.001(根据Tukey检验)，n＝6。
图2是示出来自被分类为NED、IF/TA、CNI-T和CAAMR的肾移植患者的移植肾样本的、关于磷酸化NF-κB p65(p-p65)和磷酸化STAT3(pSTAT3)的免疫组织染色结果的代表性荧光显微镜照片。上边的3排图表示肾小管，下边的3排表示肾小球。图中的箭头表示p-p65和pSTAT3双阳性细胞。比例尺表示100μm。
图3是比较用IL-6或TNFα单独进行刺激、或者用它们进行共刺激的肾小管上皮细胞中的IL-6、CCL20和SYT17的表达量而得的图。图的纵轴表示相对于无刺激细胞中的各基因的表达量的相对表达量。
图4是示出用IL-6+TNFα或IL-6+IL-17刺激导入了用于敲除SYT17的siRNA(S1～S3)的人肾肾小球内皮细胞(HRGEC)和人肾近端肾小管上皮细胞(RPTEC)时的、IL-6和CCL2的mRNA表达量的图。图中，C为导入了阴性对照的siRNA的对照细胞，P为导入了阳性对照的siRNA的对照细胞。*:p<0.05(根据Dunnett检验)
图5是示出用TNFα刺激强制表达SYT17的HEK293T细胞时的NF-κB启动子活性和IL-6启动子活性的图。空白(Mock)为不强制表达SYT17的对照细胞。*:p<0.05(根据学生t检验)
图6：图6A是示出使用健康志愿者(Healthy)、NED和CAAMR的全尿样本的针对SYT17蛋白的免疫印迹结果的照片。图中，PC为过度表达SYT17蛋白的细胞的溶解物。图6B是示出使用健康志愿者、NED和CAAMR的尿中外泌体组分的针对SYT17蛋白的免疫印迹结果的照片。图6C是以SYT17/CD9形成来表示将尿中外泌体组分的免疫印迹中所检测到的SYT17和CD9的条带按照泳道用Image J软件进行定量的结果的图。
图7是示出肾移植患者组(NED、IF/TA、CNI-T、CAAMR)和健康志愿者的尿中外泌体组分中的SYT17/CD9(图7A)和现有临床标志物(N-乙酰基-β-D-葡糖胺糖苷酶(NAG)/Cre(图7B)、尿蛋白(U-TP)/Cre(图7C)、eGFR(图7D))的数据的图。*:p<0.05、**:p<0.01、***:p<0.001(根据Tukey检验)。
图8是示出SYT17/CD9与现有临床标志物(NAG/Cre(图8A)、U-TP/Cre(图8B)、eGFR(图8C))的相关性的图。
图9示出将SYT17/CD9的值设为解释变量、将慢性排斥反应的有无设为目标变量的ROC曲线。
图10是示出健康志愿者和慢性肾脏病患者组(CKD)的尿中外泌体组分的SYT17/CD9的图。*:p<0.05(根据学生t检验)。
图11是示出使用CKD患者的尿中外泌体组分的针对SYT17蛋白的免疫印迹结果的照片。图中，PC对应于阳性对照，NC对应于阴性对照，1～10对应于CKD患者的尿中外泌体组分。
图12是示出CKD患者尿中外泌体组分的SYT17/CD9的图。图中，用虚线示出健康志愿者的平均值。
图13是示出CKD患者尿中外泌体组分的SYT17/CD9的图。图中，用虚线示出健康志愿者的平均值。
具体实施方式
如后文实施例所示，本发明人们确认，从健康人和NED的尿中外泌体组分中几乎检测不到或者仅可检测到极微量的SYT17蛋白，另一方面，从肾移植后发生慢性排斥反应者中检测到了健康人或NED的10倍程度的SYT17蛋白。
另外，还通过实验确认了SYT17蛋白的表达通过同时活化NF-κB路径和STAT3路径而与使IL-6等炎症介质的表达/产生协同地增加的炎症通路(Inflammation amplifier)(Ogura et al.,Immunity.,2008,29(4),628-36.；Murakami et al.,J.Exp.Med.,2011,208(1),103-14.；Murakami et al.,Cell Reports,2013,3(3),946-59)有关。
炎症通路为本发明人们报道的诱导慢性炎症的病情的分子机制。若对成纤维细胞、角质形成细胞、血管内皮细胞等I型胶原蛋白阳性的非免疫细胞施加炎症刺激，则由非免疫细胞本身和所诱导的T细胞产生的IL-6和IL-17等细胞因子会在非免疫细胞内同时活化NF-κB路径和STAT3路径，以IL-6为代表的细胞因子、趋化因子、生长因子等的产生协同地增加。产生的IL-6作用于非免疫细胞本身，使炎症通路亢进，而趋化因子、生长因子引发细胞浸润、破坏稳态。已通过实验证明，该炎症通路的持续性亢进会诱导慢性炎症的病情。
关于SYT17蛋白，具体如后文实施例所示，确认了在CAAMR的肾小管中使NF-κB p65和STAT3的磷酸化(活化)亢进、用IL-6和TNFα共刺激人肾小管上皮细胞时IL-6和CCL20的表达量增加且SYT17的表达量也增加、另一方面在人肾小管上皮细胞内敲除SYT17时抑制IL-6和CCL2的表达、以及强制表达SYT17时使NF-κB启动子活性和IL-6启动子活性增强等。
这些发现表明，通过炎症通路而在肾小管上皮细胞内诱导表达的SYT17介由正反馈而促进炎症。因此，意味着尿来源样本中的SYT17蛋白量会成为关于与慢性炎症相关的慢性排斥反应、慢性肾脏病的发病、进展的有效的非侵入性的诊断标志物。另外，抑制SYT17的表达的物质、抑制SYT17的活性的物质能够抑制慢性排斥反应、慢性肾脏病中的炎症通路亢进，认为对于慢性排斥反应或慢性肾脏病的预防和/或治疗有用。
评价方法
本发明的第1方式涉及一种评价被检者的移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的发病或进展的可能性的方法，其以从被检者采集的尿来源样本中的SYT17蛋白量为指标。以下例示出优选的实施方式来说明本方式。
本方式的1个优选实施方式包括：测定从被检者采集的尿来源样本中的SYT17蛋白量的工序；比较被检者尿来源样本中的SYT17蛋白量和截止值的工序；以及，在被检者尿来源样本中的SYT17蛋白量超过截止值的情况下，将被检者评价为已经发生了移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病或发生的可能性高的工序。
本发明中的尿来源样本可以是尿本身，也可以是尿的浓缩物或部分纯化物等加工物，可根据SYT17蛋白的测定方法来适宜选择。例如，在使用TOF-MS等高灵敏度的测定方法时，尿来源样本可以是尿本身。另一方面，在使用免疫分析等通用测定方法时，从浓缩SYT17蛋白的观点出发，尿来源样本优选为尿的加工物。
尿的加工物优选为尿中外泌体被浓缩的加工物，其典型例子为从尿中回收的外泌体组分。外泌体组分从尿中的回收可以通过利用了颗粒沉降(pellet down)法、蔗糖缓冲法或密度梯度离心法等超速离心分离法的公知方法来进行。另外，可以使用例如MagCaptureExosome Isolation Kit PS(富士胶片和光纯药工业)、DiagExo(注册商标)UrinaryExosome Isolation kit(101Bio,LLC)等市售的尿中外泌体分离试剂盒进行回收。
尿来源样本中的SYT17蛋白量可以通过能够测定生物学试样中的目标蛋白的常规方法、例如以SYT17蛋白为对象的免疫分析、TOF-MS等高灵敏度质谱分析法等进行测定。
免疫分析可以使用针对SYT17蛋白的特异性抗体或其衍生物参照本领域技术人员公知或熟知的方法、例如The Immunoassay Handbook:Theory and Applications ofLigand Binding,ELISAand Related Techniques(4TH)、Elsevier的记载来进行。
本发明中，针对SYT17蛋白的特异性抗体、即与SYT17蛋白特异性结合的抗体是与非靶标蛋白相比，优先结合于SYT17蛋白的抗体。SYT17蛋白的特异性抗体也可以表述为与SYT17蛋白具有高的结合亲和性的抗体，具有比与非靶标蛋白的亲和力至少强2倍、优选至少强10倍、更优选至少强20倍、最优选至少强100倍的亲和力且能够与SYT17蛋白结合。如果抗体能够以不产生不期望的结果、典型地为不产生假阳性或假阴性等的程度检测SYT17蛋白的存在，则认为该抗体为针对SYT17蛋白的特异性抗体。
针对SYT17蛋白的特异性抗体例如可以起源于包括小鼠、大鼠、鲨鱼、兔、猪、仓鼠、骆驼、美洲驼、山羊或人在内的任意种属。另外，特异性抗体可以是免疫球蛋白分子的任意的类(作为例子，IgG、IgE、IgM、IgD或IgA)和亚类，优选为IgG。
本发明中，用于测定SYT17蛋白量的特异性抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，后述的药物组合物中使用的特异性抗体优选为单克隆抗体。另外，特异性抗体可以是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
针对SYT17蛋白的特异性抗体的衍生物可以是定义为来自上述抗体且保持了与抗原特异性结合的能力的抗体部分片段的抗原结合性片段、例如Fab(fragment of antigenbinding，抗原结合片段)、Fab'、F(ab')2、单链抗体(single chain Fv)、二硫键稳定化抗体(disulfide stabilized Fv)和包含CDR的肽等，但是不限于这些。
针对SYT17蛋白的特异性抗体和其衍生物可以使用本领域技术人员公知的方法来制作。例如，可以如下制作：基于人SYT17蛋白的氨基酸序列(在NCBI中以登录号NP_057608.2、NP_001317438.1、NP_001295086.1登录)或编码其的DNA的碱基序列(在NCBI中以登录号NM_016524.4、NM_001308157.2、NM_001330509.1登录)，通过基因重组方法制作SYT17蛋白，将其作为抗原对适当的动物进行免疫，再使该动物的B细胞与骨髓瘤细胞融合而得到杂交瘤，从而制作。关于杂交瘤法，请参照例如Meyaard et al.(1997)Immunity7:283-290；Wright et al.(2000)Immunity 13:233-242；Kaithamana et al.(1999)J.Immunol.163:5157-5164等。另外，也可以利用市售的抗SYT17抗体、例如Anti-SYT17HPA040811(Atlas antibodies)、抗SYT17抗体(Proteintech)、SYT17抗体(invitrogen)等，以及包含与这些抗体的CDR序列相同或序列一致性为90％以上的氨基酸序列作为CDR序列的抗体、包含与这些抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列相同或序列一致性为90％以上的氨基酸序列作为重链可变区和轻链可变区的抗体。
针对SYT17蛋白的特异性抗体和其衍生物可利用适当的标记化合物进行标记。作为标记化合物的例子，可列举荧光物质(例如FITC、罗丹明等)、金胶体等金属粒子、Luminex(注册商标，Luminex公司)等荧光微珠、色素蛋白(例如藻红蛋白、藻蓝蛋白等)、放射性同位素(例如3H、14C、32P、35S、125I、131I等)、酶(例如过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、生物素、链霉亲和素。
SYT17蛋白量可以以每单位体积的尿中的SYT17蛋白的质量、即SYT17蛋白浓度来表示，另外例如在采用荧光免疫分析中的荧光强度之类的能够以输出信号形式来检测目标蛋白的存在的方法时，也可以使用表示SYT17蛋白的输出信号的累积值作为蛋白量。
另外，可以根据测定方法以绝对值或相对于内部标准的相对值来表示SYT17蛋白量。在使用尿中外泌体被浓缩的样本的优选实施方式中，可以以相对于本领域技术人员视为外泌体标志物的蛋白质、例如CD9、CD63、CD81、ALIX等蛋白的量的相对值来表示SYT17蛋白量。
从被检者采集的尿来源样本中的SYT17蛋白量与截止值进行比较。截止值可以如下确定：预先测定从已经发生了移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的多名患者和对照者中采集的尿来源样本中的SYT17蛋白量，使用这些测定值进行ROC分析，从而确定截止值。
具体而言，将尿来源样本中的SYT17蛋白量的值作为解释变量、将慢性排斥反应或慢性肾脏病的发病的有无、即是已经发生了移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的患者还是对照者作为目标变量进行ROC分析，制作横轴取1-特异度(假阳性率)、纵轴取灵敏度(阳性率)的ROC曲线。接着，可以利用通常用于由ROC曲线求出截止值的方法、例如将截止值设为Youden's index(灵敏度+特异度-1)达到最大的点的方法或将截止值设为与ROC曲线的左上角的距离最小的角的方法等确定截止值。
对照者是指临床上判定为未发生慢性排斥反应和慢性肾脏病的人。对照者不限于也未呈现出慢性排斥反应和慢性肾脏病以外的任何疾病、症状的人，作为其例子，除了可列举未观察到包括肾脏在内的特别迹象的健康人以外，还可列举接受了肾移植且移植肾未观察到特别的迹象的人(无疾病迹象(No Evidence of Diseases)，NED)。
需要说明的是，本说明书全文中，“被检者”、“对照者”、“患者”和“对象”不限于人，也包含例如下述哺乳动物：包括小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠在内的啮齿类；包括人、黑猩猩、罗猴在内的灵长类；包括猪、牛、山羊、马、绵羊在内的家畜；包括狗、猫在内的观赏动物。术语“被检者”、“对照者”和“患者”可以替换为“被检对象”、“对照对象”和“罹患对象”。本发明中，被检者、对照者、患者和对象优选为人。另外，被检者、对照者和患者优选为同一种属的动物。
对照者尿来源样本优选为与被检者尿来源样本实施了相同处理的样本。具体而言，被检者尿来源样本为尿本身的情况下，优选使用尿本身作为对照者尿来源样本，在被检者尿来源样本为尿的加工物的情况下，优选使用相应的尿加工物作为对照者尿来源样本。另外，对照者尿来源样本中的SYT17蛋白量优选通过与被检者尿来源样本中的SYT17蛋白的测定相同的方法来测定。
在某一特定实施方式中，在以相对于CD9蛋白量的相对值表示SYT17蛋白量的情况下，截止值可以为0.42以上。例如，将截止值设为0.42的情况下，如后述的实施例所示，可以以灵敏度77％、特异度87％来评价发生了被检者的移植肾慢性排斥反应或发生的可能性高。
当被检者尿来源样本中的SYT17蛋白量超过截止值时，预测被检者已经发生了移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病或者发生的可能性高，医生可基于该信息进行诊断，另外可进行针对移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的发病或进展的预防性处置或治疗性处置。
本发明中成为对象的被检者是存在发生移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的可能性的人。特别地，成为发生移植肾慢性排斥反应的可能性的评价对象的被检者为接受了肾移植手术的人，即肾移植受体。另外，成为发生慢性肾脏病的可能性的评价对象的被检者没有特别限制，为期望进行评价的被检者即可，优选为已罹患或有可能罹患成为慢性肾脏病的原因的肾疾病的人。
本发明中的成为慢性肾脏病的原因的肾疾病可以是原发性肾疾病，也可以是继发性肾疾病，还可以是遗传性/先天性肾疾病。另外，可以是肾小球疾病、血管性疾病或肾小管间质疾病。作为成为慢性肾脏病的原因的肾疾病的例子，可列举膜性肾病(包括特发性膜性肾病)、肾病综合征(包括原发性肾病综合征、微小病变型肾病综合征)、狼疮性肾炎、慢性移植肾肾病、糖尿病性肾病、IgA肾病、局灶节断性肾小球硬化、肾硬化症、肺出血-肾炎综合征、多发性嚢性肾(包括常染色体显性多发性囊性肾)、尿酸性肾病、肥胖相关性肾病等。
第1方式的评价方法的另一优选实施方式包括：测定从被检者采集的尿来源样本中的SYT17蛋白量的工序；比较被检者尿来源样本中的SYT17蛋白量与从对照者采集的尿来源样本中的SYT17蛋白量的工序；以及，在被检者尿来源样本中的SYT17蛋白量比对照者尿来源样本中的SYT17蛋白量多的情况下，将被检者评价为已经发生了移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病或发生的可能性高的工序。各工序的说明和术语的定义只要在下文中没有特别说明则如上所述。
该实施方式中，从被检者采集的尿来源样本中的SYT17蛋白量与从对照者采集的尿来源样本中的SYT17蛋白量进行比较。对照者尿来源样本中的SYT17蛋白量优选使用与被检者尿来源样本实施了相同处理的对照者尿来源样本、并且通过与被检者尿来源样本中的SYT17蛋白的测定相同的方法进行测定，但是并非必须同时对被检者尿来源样本和对照者尿来源样本中的SYT17蛋白量进行测定，对照者尿来源样本中的SYT17蛋白量可以是预先测定的。例如，可以预先对从多个对照者采集的尿来源样本中的SYT17蛋白量进行测定，由它们的测定值确定平均值、中央值及其它基准值，并用于与被检者尿来源样本中的SYT17蛋白量的比较中。
在被检者尿来源样本中的SYT17蛋白量比对照者尿来源样本中的SYT17蛋白量多的情况下，预测被检者已经发生了移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的或发生的可能性高，医生可以基于该信息进行诊断，另外可以进行针对移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的发病或进展的预防性处置或治疗性处置。例如当被检者尿来源样本中的SYT17蛋白量为对照者尿来源样本中的该量的至少4倍以上、优选为至少6倍以上、更优选为至少8倍以上、进一步更优选为10倍以上时，可以将被检者评价为已经发生了移植肾慢性排斥反应或发生的可能性高。另外，当被检者尿来源样本中的SYT17蛋白量比对照者尿来源样本中的该量多时，例如为至少1.2倍以上、优选为至少1.5倍以上、更优选为至少1.8倍以上、进一步优选为至少2倍以上、更进一步优选为至少3倍以上、特别优选为至少5倍以上时，可以将被检者评价为已经发生了慢性肾脏病或发生的可能性高。
第1方式的评价方法的又一优选实施方式包括：测定从被检者采集的第一尿来源样本中的SYT17蛋白量的工序；比较第一尿来源样本中的SYT17蛋白量和第二尿来源样本中的SYT17蛋白量的工序，所述第二尿来源样本是在采集第一尿来源样本之前的时间点从同一被检者采集的；以及，在第一尿来源样本中的SYT17蛋白量比第二尿来源样本中的SYT17蛋白量多的情况下，将被检者的移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病评价为在采集第一尿来源样本时，比采集第二尿来源样本时有进展的可能性高。各工序的说明和术语的定义只要在下文中没有特别说明则如上所述。
该实施方式中，从被检者采集的第一尿来源样本中的SYT17蛋白量与第二尿来源样本中的SYT17蛋白量进行比较。这里，第二尿来源样本是在采集第一尿来源样本之前的时间点从同一被检者采集的尿来源样本，即，来自在用于得到第一尿来源样本的尿液采集之前的时间点从同一被检者采集的尿的样本。第一和第二尿来源样本优选为实施了相同处理的尿来源样本，并且优选通过相同测定方法来测定SYT17蛋白量。但是，并非必须同时对第一和第二尿来源样本的SYT17蛋白量进行测定，第二尿来源样本中的SYT17蛋白量可以是预先测定的。需要说明的是，“第一”、“第二”这些术语不是指尿来源样本采集的时序系列，是为了对评价对象的尿来源样本和比较对象的尿来源样本加以区分而使用的。
第一尿来源样本中的SYT17蛋白量比第二尿来源样本中的SYT17蛋白量多的情况下，预测在采集第二尿来源样本时被检者的移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病与采集第一尿来源样本时相比有进展的可能性高，医生可以基于该信息进行诊断，另外可以进行针对移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的发病或进展的预防性处置或治疗性处置。
第1方式的评价方法也可以表述为：以从被检者采集的尿来源样本中的SYT17蛋白量为指标，来检查或判定被检者的移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的发病或进展的可能性的方法，另外也可以表述为：辅助被检者的移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的发病或进展的诊断的方法或取得用于诊断被检者的移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的发病或进展的数据的方法。
而且，能够通过监测正在接受给药等某些处置的接受了肾移植的患者或肾脏病患者中尿来源样本中的SYT17蛋白量，来判定上述处置作为针对该患者的移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的发生的预防性处置是否有效。另外，能够通过监测正在接受给药等某些处置的发生了移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的患者中尿来源样本中的SYT17蛋白量，来判定上述处置作为针对该患者的移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的治疗性处置是否有效。因此，作为另一方式，本发明还提供针对移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的发生的预防性处置或治疗性处置的有效性的判定方法。
药物组合物
作为另一方式，本发明提供一种用于预防和/或治疗移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的药物组合物，其包含选自由针对SYT17的特异性抗体和其衍生物、以及针对SYT17的抑制性核酸组成的组中的至少1种物质。
本说明书中使用的术语“预防”和“预防性处置”包括：以防止或抑制疾病的罹患或发生等为目的的、医学上允许的全部类型的预防性干预。另外，术语“治疗”和“治疗性处置”包括：以疾病的治愈、暂时性缓解等为目的的、医学上允许的全部类型的治疗性干预。即，慢性肾脏病的治疗或预防、以及治疗性或预防性处置包括：包含使慢性肾脏病的进展延迟或停止、使病变缩小或消失、预防发病或防止复发等在内的各种目的的、医学上允许的干预。
本方式的药物组合物含有选自由针对SYT17的特异性抗体和其衍生物以及针对SYT17的抑制性核酸组成的组中的至少1种物质作为有效成分。这里“含有……作为有效成分”是指含有有效量的物质。另外，有效量是指对于疾病的预防和/或治疗而言有效的量，可根据用法、对象的年龄、疾病的状态等条件适宜地决定。
针对SYT17的抑制性核酸可以是：能够抑制由SYT17基因转录编码SYT17蛋白的mRNA(也称为SYT17 mRNA)的核酸、能够分解该mRNA的核酸、以及能够抑制由该mRNA翻译蛋白质的核酸，作为其典型例，可列举本领域技术人员能够基于SYT17基因的碱基序列或编码SYT17蛋白的mRNA的碱基序列而设计、制作的反义核酸或引起RNA干扰的核酸，例如siRNA、shRNA、miRNA等。作为市售的抑制性核酸的例子，可列举人(human)si-SYT17s28627、s28628和s28629(均为赛默飞世尔(Thermo Fisher)公司的)。
另外，处于适当的表达启动子的支配下而能够转录诱导上述反义核酸或引起RNA干扰的核酸的DNA、以及上述反义核酸或引起RNA干扰的核酸的碱基序列的一部分被修饰而提高了相对于核酸酶分解的稳定性的核酸也作为与上述反义核酸或引起RNA干扰的核酸在功能上等价的核酸而包含在本发明所称的抑制表达的抑制性核酸中。作为用于提高相对于核酸酶分解的稳定性的修饰，可列举2'O-甲基化、2'-F化、4'-硫化等。
进一步地，上述RNA的核糖核苷酸的一部分被置换为对应的脱氧核糖核苷酸或核苷酸类似物的嵌合RNA也包含在本发明所称的抑制表达的抑制性核酸中。作为核苷酸类似物，可列举例如5位修饰尿苷或胞苷，例如5-(2-氨基)丙基尿苷、5-溴尿苷等；8位修饰腺苷或鸟苷，例如8-溴鸟苷等；脱氮核苷酸，例如7-脱氮-腺苷等；O-或N-烷基化核苷酸，例如N6-甲基腺苷等。上述抑制性核酸中被修饰或被置换的碱基的种类或个数只要不会导致丧失抑制靶分子表达的能力就没有特别限制。
上述抑制性核酸可利用基因重组技术或化学合成技术人工合成。作为基因重组方法、核酸的化学合成方法、以及非天然型碱基的合成方法或包含这些的核酸的合成方法，可以采用本领域技术人员熟知的方法。另外，可以通过使用所谓的DNA合成仪等设备来合成核酸。
药物组合物中使用的针对SYT17的特异性抗体和其衍生物为能够与SYT17蛋白特异性结合而中和其活性的抗体和抗体衍生物。针对SYT17蛋白的特异性抗体和其衍生物的定义和优选实施方式等的说明如评价方法的项目中所述。
针对SYT17的特异性抗体或其衍生物对SYT17蛋白的活性的中和可以通过向移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的模型动物给予特异性抗体或其衍生物并评价其症状的改善或进展的延迟来进行确认。另外，SYT17蛋白的活性的中和也可以通过对利用IL-6、TNFα之类炎症放大因子进行刺激而使炎症通路亢进的肾小管细胞、肾小球内皮细胞等肾细胞加入特异性抗体或其衍生物、并且评价其炎症亢进的抑制来进行确认。
本方式的药物组合物给药于发生了移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病或有发病可能的对象。特别地，用于预防和/或治疗移植肾慢性排斥反应的药物组合物的给药对象为接受了肾移植手术的对象，即，肾移植受体。
在特定的实施方式中，药物组合物给药于尿中SYT17蛋白量多于对照者或超过截止值的对象。药物组合物的给药对象的尿中SYT17蛋白量多于对照者或超过截止值这一点可以使用评价方法的项目中所述的方法来确认。
能够通过药物组合物预防和/或治疗的成为慢性肾脏病的原因的肾疾病只要是确认SYT17的表达亢进的疾病就没有限制，可以为原发性肾疾病，也可以为继发性肾疾病，可以为遗传性、先天性肾疾病。另外，可以为肾小球疾病，可以为血管性疾病，可以为肾小管间质疾病。作为成为慢性肾脏病的原因的肾疾病的例子，可列举膜性肾病(包括特发性膜性肾病)、肾病综合征(包括原发性肾病综合征、微小变化型肾病综合征)、狼疮性肾炎、慢性移植肾肾病、糖尿病性肾病、IgA肾病、局灶节断性肾小球硬化、肾硬化症、肺出血－肾炎综合征、多发性嚢性肾(包括常染色体显性多发性囊性肾)、尿酸性肾病、肥胖相关性肾病等。
只要能够向肾脏的炎症部位递送有效量，则药物组合物可以以任意的途径给药，优选静脉内给药、动脉内给药、腹腔内给药、皮下给药、肌肉内给药、局部给药等非经口途径给药。另外，所述药物组合物的制剂只要为适合于给药途径的制剂即可，例如为注射剂或点滴剂等。
通过将药物组合物给药于需要治疗移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病或有可能发生移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的对象，从而能够缓和、缓解移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的症状或预防其发病。即，本发明的另一方式也可以表述为：一种移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的预防方法和/或治疗方法，其包括：向需要治疗移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病或有可能发生移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的对象给药有效量的选自由针对SYT17的特异性抗体和其衍生物以及针对SYT17的抑制性核酸组成的组中的至少1种物质。预防和/或治疗方法中的药物组合物的有效量、包含药物组合物的制剂、形态、给药方法等如以上所说明。
另外，根据本发明，还提供一种预防或治疗移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的发病或进展的方法。该方法包括：对于通过第1方式的评价方法评价为已经发生了移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病或发生的可能性高者、或者移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病被评价为在采集第一尿来源样本时比采集第二尿来源样本时进展的可能性高者，进行针对移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的发病或进展的预防性处置或治疗性处置。
该方法的例示性实施方式包括下述工序：测定从被检者采集的尿来源样本中的SYT17蛋白量的工序；比较被检者尿来源样本中的SYT17蛋白量和截止值的工序，上述截止值是如下确定的：预先测定从已经发生了移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的多名患者和对照者中采集的尿来源样本中的SYT17蛋白量，使用这些测定值进行ROC分析，从而确定截止值；以及，在被检者尿来源样本中的SYT17蛋白量超过截止值时，对被检者进行针对移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的发病或进展的预防性处置或治疗性处置的工序。
该方法的另一例示性实施方式包括下述工序：测定从被检者采集的尿来源样本中的SYT17蛋白量的工序；比较被检者尿来源样本中的SYT17蛋白量和从对照者采集的尿来源样本中的SYT17蛋白量的工序；以及，在被检者尿来源样本中的SYT17蛋白量比对照者尿来源样本中的SYT17蛋白量多的情况下，对被检者进行针对移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的发病或进展的预防性处置或治疗性处置的工序。
该方法又一例示性实施方式包括下述工序：测定从被检者采集的第一尿来源样本中的SYT17蛋白量的工序；比较第一尿来源样本中的SYT17蛋白量和第二尿来源样本中的SYT17蛋白量的工序，所述第二尿来源样本是在采集第一尿来源样本之前的时间点从同一被检者采集的；以及，在第一尿来源样本中的SYT17蛋白量比第二尿来源样本中的SYT17蛋白量多的情况下，对被检者进行针对移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的发病或进展的预防性处置或治疗性处置的工序。
在预防或治疗移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的发病或进展的方法中，预防性处置或治疗性处置优选为人工透析、肾移植或上述药物组合物的给药。
检查试剂盒
作为另一方式，本发明提供一种检查试剂盒，其用于评价移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的发病或进展的可能性，所述检查试剂盒包含针对SYT17的特异性抗体或其衍生物。
检查试剂盒除了针对SYT17的特异性抗体或其衍生物以外，还可以包含针对被识别为外泌体标志物的蛋白、例如CD9、CD63、CD81、ALIX等蛋白的特异性抗体或其衍生物，特别优选包含针对CD9的特异性抗体或其衍生物。检查试剂盒可以还包含免疫分析所需的器具、试剂、例如平板等载体、封闭溶液、洗涤液和显色底物等试剂。
在上述评价方法中，本方式的检查试剂盒可以用于测定从被检者采集的尿来源样本中的SYT蛋白量。另外，本方式的检查试剂盒还可以用于筛选要给药上述药物组合物的对象，具体而言可以用于筛选尿中SYT17蛋白量多于对照者或超过截止值的对象，因此作为伴随诊断药也是有用的。
通过以下实施例进一步详细地说明本发明，但是本发明不受这些限定。
实施例
实验方法
1)患者和尿样本
得到北海道大学病院伦理委员会的许可，在2016年至2019年间由健康志愿者、慢性肾脏病(CKD)患者和肾移植(KTx)患者得到全尿。KTx患者的尿液采集在程序性活检时进行，不包括穿刺(エピソード)活检时的尿。尿以1,500rpm离心分离5分钟后回收上清并在-80℃保存。
需要说明的是，KTx患者全部为接受了泼尼松、霉酚酸和他克莫司或环孢素标准免疫抑制治疗的患者。另外，根据程序性活检的组织学结果，将KTx患者基于Banff分类(2017)分为正常病理组织组(NED、n＝20)、纤维化组(肾小管萎缩和间质纤维化(interstitialfibrosis and tubular atrophy)，IF/TA，n＝19)、钙调神经磷酸酶毒性组(CNI-T，n＝17)和慢性活动性抗体介导的排斥反应组(CAAMR，n＝22)这4组。
另外，在结果如图10所示的试验中，CKD患者为膜性肾病(n＝2，均为蛋白尿阳性)、原发性肾病综合征(n＝1)、和狼疮性肾炎(n＝2)患者。在结果如图11和12所示的试验中，CKD患者为膜性肾病(蛋白尿阳性n＝1、蛋白尿阴性n＝2)、微小变化型肾病综合征(n＝2)、肾病综合征(n＝1)、糖尿病性肾病(n＝1)、IgA肾病(n＝2)、和局灶节断性肾小球硬化(n＝1)。在结果如图13所示的试验中，CKD患者为常染色体显性多发性囊性肾(n＝10)。
2)免疫组织染色
基于Kawamoto,et al.,2003.Arch.Histol.Cytol.66:123中记载的方法，由从KTx患者得到的移植肾程序性活检的剩余样本制作冷冻切片或石蜡切片。详细而言，首先将移植肾样本包埋于化合物并在-80℃冷冻。使用切片机制作冷冻切片(10μm)，用乙醇脱水后，用甲醛固定。为了检测SYT17蛋白，加入作为一抗的抗SYT17抗体(1/200，Proteintech)和兔IgG同种型对照(1/5000，Cell Signaling Technology)，在4℃反应一晚，接着加入作为二抗的驴抗兔IgG(H+L),Alexa Fluor 546(1/1000，Life Technologies)或驴抗兔IgG(H+L),Hoechst33342三盐酸盐三水合物(1/3,000，Life Technologies)，在常温反应。将反应后的切片用25％甘油包埋，用福尔马林固定，作为石蜡切片。
对于连续切片，将磷酸化STAT3和磷酸化NF-κB用兔抗STAT3pY705(1:200，CellSignaling Technology)、兔抗磷酸化NF-κB p65 Ser276(1/400、Sigma Aldrich)或对照抗体(Cell Signaling Technology)进行检测，进而为了使免疫染色的信号增强和可视化，使用兔IgG Elite ABC Kit和ImmPACT DAB(Vector Laboratories，Burlingame)进行检测。使用BZ-9000显微镜(基恩士(KEYENCE))进行切片的分析。
3)尿中外泌体的分离
使用MagCapture Exosome Isolation Kit PS(富士胶片和光纯药工业)按照制造商的步骤从1ml的全尿样本中回收外泌体，添加1/100量的蛋白酶抑制剂(Z-Leu-Leu-Leu-al(注册商标)，西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich))后，在-20℃保存。
4)免疫印迹
将全尿样本和尿中外泌体组分溶解于SDS缓冲液(10％SDS、10％甘油、0.04％溴酚蓝、0.5M Tris-HCl pH 6.8、和10％2-巯基乙醇)，在60℃下煮10分钟。用SDS-PAGE分离后，使凝胶中的蛋白转录到PVDF膜(密理博(Millipore))。免疫印迹使用Can Get SignalImmunoreaction Enhancer Solution(东洋纺(Toyobo))按照制造商的步骤进行。作为一抗，使用抗-SYT17(1/2500，HPA040811，Atlas Antibodies)和抗CD9抗体(1/1000，SystemBiosciences)，作为二抗，使用山羊抗兔lgG(H+L)HRP抗体(1/10,000，赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))和山羊抗兔HRP抗体(1/20000，System Biosciences)。在SYT17的检测中，使用信号增强液Pierce(注册商标)Western Blot Signal Enhancer(Thermo Fisher Scientific)。蛋白质的可视化按照制造商的步骤使用Pierce(商标)ECL+Western Blotting Substrate(Thermo Fisher Scientific)进行。薄膜用自动X射线薄膜展开装置(FPM 100，Fuji Medical Film)进行显影。免疫印迹的结果使用Image J软件定量化。
5)表达载体的细胞内导入和报告基因检测
向预先用在IL-6启动子下具有萤火虫荧光酶素基因的pGL4.20[luc2/Puro](Promega)或在NF-κB启动子下具有萤火虫荧光酶素基因的pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro](Promega)和作为内部对照的海肾荧光酶素的表达载体pGL4.74[hRluc/TK](Promega)分别进行了转化的2种HEK293T细胞中，使用聚乙烯亚胺转染整合有SYT17基因的pEF-BOS载体(Mizushima,S.et al.,1990,Nucleic Acids Res 18:5322)。转染起24小时后回收细胞，用TNFα(50ng/ml)刺激6小时。回收细胞制备全细胞溶解物，通过双荧光素酶分析评价TNFα刺激存在下或不存在下的IL-6启动子和NF-κB启动子的启动子活性变化。荧光酶素活性的测定使用双荧光素酶报告基因检测系统(Dual Luciferase Reporter AssaySystem)(Promega)通过发光计(GloMax(注册商标)-Multi Detection System，Promega)进行，利用海肾荧光酶素反应的发光强度对萤火虫荧光酶素反应的发光强度进行校正。
6)利用siRNA进行的敲除
作为敲除SYT17的表达的siRNA，使用人si-SYT17(S1:s28627，S2:s28628，S3:s28629，均为Thermo Fisher)，作为阴性对照，使用human si-nontarget(Ambion Silencerselect 4390843)，作为阳性对照，使用敲除NF-κB p65亚单位的表达的p65 siRNA(AmbionSilencer select 4427038)，进行以下实验。人si-SYT17的碱基序列如下所述。
S1:s28627
有义链序列5'-GCCUAGUGUUUACAGUUUUtt-3'(序列号1)
反义链5'-AAAACUGUAAACACUAGGCtg-3'(序列号2)
S2:s28628
有义链5'-GCUGGUGCAUGGACUCAAAtt-3'(序列号3)
反义链5'-UUUGAGUCCAUGCACCAGCtg-3'(序列号4)
S3:s28629
有义链5'-GCUCUCCACUCAUCGAUAUtt-3'(序列号5)
反义链5'-AUAUCGAUGAGUGGAGAGCtg-3'(序列号6)
第1天时，将人肾近端肾小管上皮细胞(RPTEC)或人肾肾小球内皮细胞(HRGEC)以1.4×103个细胞/孔播种于96孔板，向各孔中添加siRNA溶液(每孔18μl的Opti-MEM(ThermoFisher)和0.5μL的5μM siRNA溶液)和转染试剂(每孔0.28μl的Lipofectamine RNAiMAX(Thermo Fisher Scientific))，培养一晚。第2天追加向180μL的DMEM(富士胶片和光纯药工业)中混合10％FBS(Thermo Fisher Scientific)而成的培养基，进一步培养一晚。第3天在进行2小时的血清饥饿处理后，用人IL-6(R&D Systems)100ng/mL+人可溶性IL-6Rα(R&DSystems)100ng/mL、和人IL-17(PeproTech)50ng/mL或人TNFα(PeproTech)50ng/mL刺激3小时而活化STAT3和NF-κB。使用RNA Extraction Kit(Toyobo)提取mRNA后进行逆转录反应，通过定量PCR测定相对于管家基因GAPDH的IL-6和CCL2的mRNA表达量。使用的引物如下所示。
IL-6：
正向引物5'-GGTACATCCTCGACGGCATCT-3'(序列号7)
反向引物5'-GTGCCTCTTTGCTGCTTTCAC-3'(序列号8)
CCL2：
正向引物5’-CAGCCAGATGCAATCAATGCC-3'(序列号9)
反向引物5’-TGGAATCCTGAACCCACTTCT-3'(序列号10)
GAPDH：
反向引物5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'(序列号11)
反向引物5'-CGCTCCTGGAAGATGGTG-3'(序列号12)
7)统计分析
统计分析中，将各KTx组的样品量设为20而进行。将效应量设为约1.4、将两侧显著水平假定为0.05时，该样品量在使用Tukey检验时会带来80％的检验功效。在2组间的比较中，使用卡方检验或学生t检验。在多组间的比较中，使用Tukey检验或Dunnett检验。ROC曲线表示二元分类(有排斥反应vs无排斥反应)的性能。使用约登指数(Youden's index)由ROC曲线确定截止值。统计分析中，使用JMP(注册商标)14(SAS Institute Inc)。将p值小于0.05设为组间有显著差异(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)。误差棒表示各组的标准偏差(SD)。
实施例
1)肾组织中的SYT17蛋白的表达分析
由移植肾样本的免疫组织染色确认：CAAMR组与NED组、IF/TA组和CNI-T组相比，SYT17蛋白主要在肾小管上皮细胞中强列表达(图1)。另外还确认，SYT17蛋白主要位于细胞质(未图示)。
另外确认，与其它KTx组相比，CAAMR组的肾小管区域中NF-κB p65和STAT3的磷酸化(活化)是亢进的(图2)。进一步地，根据转录组分析确认：当用IL-6和TNFα对人肾小管上皮细胞进行共刺激时，IL-6和CCL20的表达量增加，并且SYT17的表达量也增加(图3)。
2)SYT17的敲除
对于转染有能够将SYT17的表达敲除的3种si-RNA S1～S3的肾小球内皮细胞(HRGEC)和近端肾小管细胞(RPTEC)，分别用IL-6+TNFα或IL-6+IL-17进行刺激，结果IL-6和CCL2的表达受到抑制(图4)。
3)SYT17的强制表达
通过荧光酶素分析来评价用TNFα刺激强制表达SYT17的HEK293T细胞时的NF-κB启动子活性和IL-6启动子活性。确认了由于SYT17的过表达和TNFα的刺激，NF-κB启动子活性和IL-6启动子活性亢进(图5)。
以上的结果表明：CAAMR的肾小管细胞中，IL-6、CCL20之类的炎症放大因子使NF-κB和STAT3活化，该活化进一步诱导SYT17蛋白的表达，介由正反馈促进了移植肾中的炎症。
4)KTx患者尿中外泌体中的SYT17蛋白的检测
通过全尿样本和尿中外泌体组分的免疫印迹确认：SYT17蛋白在全尿样本中检测不到、但是在尿中外泌体组分中能够检测到；以及CAAMR组与健康志愿者和NED组相比，作为外泌体标志物的针对CD9的SYT17蛋白的相对水平(SYT17/CD9)上升(图6)。
另外，将增加了样本数的尿中外泌体组分的SYT17/CD9定量结果与其它临床参数的结果一起示于图7。SYT17/CD9在健康志愿者组中为0.12±0.09，在NED组中为0.13±0.17，在IF/TA组中为0.22±0.35，在CNI-T组中为0.40±0.35，在CAAMR组中为1.34±1.05，CAAMR组与其它组相比，尿中外泌体的相对的SYT17蛋白水平显著高(图7A)。与此相对地，目前临床上使用的标志物即N-乙酰基-β-D-葡糖胺糖苷酶(NAG)/Cre、尿蛋白(U-TP)/Cre和eGFR未能将CAAMR组与其它组区分开(图7B～D)。另外，未观察到SYT17/CD9和这些临床参数的明显相关性(图8A～C)。另外，将SYT17/CD9的值作为解释变量、将慢性排斥反应的有无、即是CAAMR组还是其它组(健康志愿者、NED组、IF/TA组、CNI-T组)作为目标变量进行ROC分析，结果ROC曲线表明AUC＝0.82，精度为中等程度(图9)。由ROC分析得到的SYT17/CD9的最佳截止值为0.42，此时的灵敏度为77％、特异性为87％。
5)CKD患者尿中外泌体中的SYT17蛋白的检测
对于CKD患者的尿中外泌体组分，也确认到了与CAAMR患者同样的结果(图10)。
进一步增加样本数，通过免疫印迹检测CKD患者的尿中外泌体组分中所含的SYT17蛋白(将一例示于图11)，对每一泳道定量所检测到的SYT17和CD9的条带强度，计算SYT17/CD9(图12、13)。图11和12中的1～10的编号分别相当于以下的CKD患者尿中外泌体组分的数据。
1：膜性肾病(蛋白尿阳性)
2：微小变化型肾病综合征
3：膜性肾病(蛋白尿阴性)
4：糖尿病性肾病
5：IgA肾病
6：微小变化型肾病综合征
7：IgA肾病
8：肾病综合征
9：局灶节断性肾小球硬化
10：膜性肾病(蛋白尿阴性)
需要说明的是，图12中右侧的5个条棒(11至15)是结果示于图10的试验中所分析的5名CKD患者各自的定量值。另外，图12和13中，用虚线示出了由健康志愿者(n＝15)的尿中外泌体组分同样定量而得的SYT17/CD9的平均值0.9(需要说明的是，SYT17/CD9的标准偏差为约0.2)。
尿中外泌体组分中，SYT17/CD9的值在全部CKD患者中均高于健康志愿者的平均值，蛋白尿阴性的膜性肾病显示出超过健康志愿者平均值的1倍的值，常染色体显性多发性囊性肾显示出为约2倍以上，此外的CKD(蛋白尿阳性的膜性肾病、微小变化型肾病综合征、糖尿病性肾病、IgA肾病、肾病综合征、局灶节断性肾小球硬化、狼疮性肾炎)显示出为3倍以上的值。
上述实施例示出的结果表明，尿中、特别是尿中外泌体组分的SYT17蛋白水平为慢性排斥反应或慢性肾脏病的诊断标志物。
序列表自由文本
序列号1：针对SYT17的siRNA的人si-SYT17 s28627的有义链的碱基序列
序列号2：针对SYT17的siRNA的人si-SYT17 s28627的反义链的碱基序列
序列号3：针对SYT17的siRNA的人si-SYT17 s28628的有义链的碱基序列
序列号4：针对SYT17的siRNA的人si-SYT17 s28628的反义链的碱基序列
序列号5：针对SYT17的siRNA的人si-SYT17 s28629的有义链的碱基序列
序列号6：针对SYT17的siRNA的人si-SYT17 s28629的反义链的碱基序列
序列号7：IL-6正向引物的碱基序列
序列号8：IL-6反向引物的碱基序列
序列号9：CCL2正向引物的碱基序列
序列号10：CCL2反向引物的碱基序列
序列号11：GAPDH正向引物的碱基序列
序列号12：GAPDH反向引物的碱基序列
Figure IDA0003499900530000011
Figure IDA0003499900530000021
Figure IDA0003499900530000031
Figure IDA0003499900530000041

Claims (13)

1.一种评价被检者的移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的发病或进展的可能性的方法，其以从被检者采集的尿来源样本中的SYT17蛋白量为指标。
2.根据权利要求1所述的方法，其包括：
测定从被检者采集的尿来源样本中的SYT17蛋白量的工序；
比较被检者尿来源样本中的SYT17蛋白量和截止值的工序，所述截止值是如下确定的：预先测定从已经发生了移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的多名患者和对照者中采集的尿来源样本中的SYT17蛋白量，使用这些测定值进行ROC分析，从而确定截止值；以及，
在被检者尿来源样本中的SYT17蛋白量超过截止值的情况下，将被检者评价为已经发生了移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病或发生的可能性高的工序。
3.根据权利要求1所述的方法，其包括：
测定从被检者采集的尿来源样本中的SYT17蛋白量的工序；
比较被检者尿来源样本中的SYT17蛋白量和从对照者采集的尿来源样本中的SYT17蛋白量的工序；以及，
在被检者尿来源样本中的SYT17蛋白量比对照者尿来源样本中的SYT17蛋白量多的情况下，将被检者评价为已经发生了移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病或发生的可能性高的工序。
4.根据权利要求1所述的方法，其包括：
测定从被检者采集的第一尿来源样本中的SYT17蛋白量的工序；
比较第一尿来源样本中的SYT17蛋白量和第二尿来源样本中的SYT17蛋白量的工序，所述第二尿来源样本是在采集第一尿来源样本之前的时间点从同一被检者采集的；以及，
在第一尿来源样本中的SYT17蛋白量比第二尿来源样本中的SYT17蛋白量多的情况下，将被检者的移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病评价为在采集第一尿来源样本时，比采集第二尿来源样本时有进展的可能性高的工序。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，尿来源样本为尿中外泌体被浓缩的样本。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，被检者为肾移植的受体。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，成为慢性肾脏病的原因的肾疾病为膜性肾病、肾病综合征、狼疮性肾炎、糖尿病性肾病、IgA肾病、局灶节断性肾小球硬化、常染色体显性多发性囊性肾或慢性移植肾肾病。
8.一种用于预防和/或治疗移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的药物组合物，其包含选自由针对SYT17的特异性抗体和其衍生物以及针对SYT17的抑制性核酸组成的组中的至少1种物质。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其用于对尿中SYT17蛋白量多于对照者的尿中SYT17蛋白量或超过截止值的对象进行给药，所述截止值是如下确定的：预先测定从已经发生了移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的多名患者和对照者中采集的尿来源样本中的SYT17蛋白量，对这些测定值进行ROC分析，从而确定截止值。
10.根据权利要求8或9所述的药物组合物，其中，成为慢性肾脏病的原因的肾疾病为膜性肾病、肾病综合征、狼疮性肾炎、糖尿病性肾病、IgA肾病、局灶节断性肾小球硬化、常染色体显性多发性囊性肾或慢性移植肾肾病。
11.一种用于评价移植肾慢性排斥反应或慢性肾脏病的发病或进展的可能性的检查试剂盒，其包含针对SYT17的特异性抗体或其衍生物。
12.根据权利要求11所述的检查试剂盒，其还包括针对CD9的特异性抗体或其衍生物。
13.根据权利要求11或12所述的检查试剂盒，其用于权利要求8～10中任一项所述的药物组合物的伴随诊断。
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