KR101832052B1 - 인테그린 αvβ5 저해제를 포함하는 당뇨병성 망막증 치료용 조성물 및 상기 저해제 스크리닝 방법 - Google Patents

Abstract

본원은 항-인테그린αvβ5 항체를 포함하는 당뇨병성 망막증 예방 및 치료용 조성물, 및 안지오포이어틴-2 및 인테그린 αvβ5 단백질간 상호작용을 억제하는 당뇨병성 망막증 치료용 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

Description

인테그린 αvβ5 저해제를 포함하는 당뇨병성 망막증 치료용 조성물 및 상기 저해제 스크리닝 방법 {Composition for treating diabetic retinopathy comprising inhibitors of Integrin αvβ5 and Screening method for the said inhibitors}

본원은 당뇨병성 망막증 치료제 분야이다.

당뇨병성 망막증(Diabetic Retinopathy, DR)은 가장 흔한 미세혈관 복합증이며 당뇨 환자 및 생산가능 인구의 시력 손상을 일으키는 주된 원인이다. DR이 진행됨에 따라 DR 후기에 신생혈관이 심각한 시력 손상을 일으키기는 하지만, 혈관 누수에 의한 황반부종은 DR의 어느 단계에서나 일어날 수 있고 시력을 손상시킬 수 있다.

따라서 당뇨병성 망막증을 치료하기 위한 다양한 기술이 개시되었다.

미국공개특허공보 제2015-0045296호는 당뇨병성 망막증 치료 방법에 관한 것으로 지질단백질인 Apolipoprotein E (apoE)를 이용한 당뇨병성 망막증 치료제를 개시하고 있다.

한편 성상세포는 뇌에서 뇌-혈관 장벽을 조절하는데 중요한 역할을 하지만, 혈관-망막 장벽에서의 역할을 자세히 알려져 있지 않다. 망막에서 성상세포는 혈관 피포(vascular ensheathment)에 포함되어 있으며, 당뇨(고혈당)에 의해 영향을 받는다. 하지만 당뇨 망막에서의 혈관 누수와 관련한 성상세포의 역할에 대하여는 알려져 있지 않다. DR에서 안지오포이어틴 2(Ang2)는 인테그린 시그널링을 통해 혈관주변세포 세포사멸을 유도하며(Park SW et al., Angiopoietin 2 induces pericyte apoptosis via alpha3beta1 integrin signaling in diabetic retinopathy. Diabetes 2014; 63: 3057-3068), 혈관주변세포에서 세포사멸이 일어나기 전에도 당뇨 마우스에서 초기에 국소 혈관 누수가 일어나며 내피 세포에서의 고혈당 및 당뇨 망막에서는 Ang2가 상향조절된다는 것이 알려져 있다.

그러나 Ang2/인테그린 시그널링의 조절에 성상세포가 관여되는지, 또한 상기 시그널링의 조절을 통해 초기 당뇨병증 망막증에서 혈관 누수를 방지할 수 있는지에 대하여는 알려진 바가 없으며, 새로운 기전에 기반한 보다 효과적인 치료제 및 치료방법의 개발이 필요하다.

본원은 성상세포에서 Ang2/인테그린 시그널링의 조절을 통한 당뇨병성 망막증 치료제를 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 세포에서 안지오포이어틴-2(Ang2) 및 인테그린 αvβ5 단백질을 제공하는 단계; 상기 안지오포이어틴-2 및 인테그린 αvβ5 단백질의 상호작용을 억제할 것으로 기대되는 시험물질과 상기 단백질을 접촉시키는 단계; 및 상기 안지오포이어틴-2 및 인테그린 αvβ5 단백질의 상호작용을 검출하는 단계로, 상기 시험물질과 접촉하지 않은 대조군과 비교하여 상기 시험물질과 접촉되어 상기 안지오포이어틴-2 및 인테그린 αvβ5 단백질의 상호작용이 감소된 경우, 상기 시험물질을 안지오포이어틴-2 및 인테그린 αvβ5 단백질간 상호작용을 억제하는 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, 당뇨병성 망막증 치료용 물질을 스크리닝하는 방법 또는 당뇨병이 발생한 망막 조직의 성상세포의 세포사멸 억제용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본원에 따른 방법은 세포에서 또는 세포외에서 수행될 수 있으며, 일 구현에에서 상기 인테그린 αvβ5 단백질은 이를 발현하는 세포의 형태로 제공된다.

본원에 따른 방법에서 안지오포이어틴-2(Ang2) 및 인테그린 αvβ5 단백질간의 상호작용의 억제 측정은 상기αvβ5를 발현하는 세포에서 GSK-3β/β-카테닌 경로가 억제되는지 여부로 측정될 수 있다.

다른 양태에서 본원은 또한 인테그린 αvβ5를 특이적으로 인식하는 폴리펩타이드를 포함하는 당뇨병성 망막증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본원에 따른 상기 인테그린 αvβ5를 특이적으로 인식하는 폴리펩타이드는 항체, 항체의 항원결합 단편, 항체 모방체, 앱타머, 또는 수용체를 포함하며, 일 구현예에서는 항체 또는 그 단편이다.

다른 양태에서 본원은 또한 인테그린 αvβ5와 Ang2의 상호작용을 억제하는 물질의 존재하에서 성상세포를 배양하여, 상기 세포에서 GSK-3β/β-카테닌 경로를 억제하는 단계를 포함하는, 성상세포 사멸 억제 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서 본원은 또한 인테그린 αvβ5와 Ang2의 상호작용을 억제하는 물질의 존재하에서 성상세포를 배양하여, 상기 세포에서 GSK-3β/β-카테닌 경로를 억제하는 단계를 포함하는, 망막 조직의 성상세포에서 GSK-3β/β-카테닌 경로를 억제하는 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서 본원은 또한 세포에서 Ang2의해 조절되는 GSK (Glycogen synthase kinase)-3β/β-카테닌 경로를 조절하는 물질을 스크리닝하는 방법으로, 상기 방법은 상기 세포에 Ang2, αvβ5, GSK (Glycogen synthase kinase)-3β 및 β-카테닌을 발현하는 단계; 상기 세포를 시험물질과 접촉하는 단계; 및 상기 세포에서 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 처리 결과 GSK (Glycogen synthase kinase)-3β의 탈인산화가 증가하고, 상기 β-카테닌의 인산화가 증가되는 경우, 상기 시험물질을 GSK (Glycogen synthase kinase)-3β/β-카테닌 경로를 활성화시키는 물질로 판단하거나; 또는 상기 세포에서 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 처리 결과 GSK (Glycogen synthase kinase)-3β의 탈인산화가 감소하고, 상기 β-카테닌의 인산화가 감소되는 경우, 상기 시험물질을 GSK (Glycogen synthase kinase)-3β/β-카테닌 경로를 억제하는 물질로 판단하는 단계를 포함한다.

본원에 따른 인테그린 αvβ5 억제제를 포함하는 당뇨병성 망막증 예방 및 치료용 조성물은, Ang2에 의한 GSK-3β 활성화를 통해 성상세포 세포사멸이 심화되고 이로인한 성상세포 손실을 방지하여 당뇨병성 망막증 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

또한 본원에 따른 Ang2 및 인테그린 αvβ5 단백질간 상호작용을 억제하는 당뇨병성 망막증 치료용 물질의 스크리닝 방법은 상기 방법에 의해 스크리닝 된 물질은 GSK-3β 활성화를 통해 성상세포 세포사멸이 심화되고 이로인한 성상세포 손실을 방지하여 당뇨병성 망막증 예방 및 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 초기 당뇨병 마우스에서 망막 혈관 누수와 더불어 망막 성상 세포 손실이 일어남을 나타내는 것이다. 3주 동안 스트렙토조토신으로 유도한 당뇨병 마우스(DM) 및 동일-연령의 대조군(Con)에서 망막 혈관 누수 및 성상세포 분포를 평가하였다. (a) 당뇨병성 망막에서 중간 주변부 망막에서의 중심 성상세포 손실의 대표적 부위를 나타내었다(최초 배율 x 400; 스케일 바, 100㎛). 백색 화살머리는 당뇨 망막 혈관에서의 성상세포 손실을 가리킨다. (b) 상대적 성상세포 커버리지(성상세포 및 혈관의 공동위치 지역/혈관 면적)가 나타나 있으며 대조군의 것을 기준으로 노말라이즈하였다. (c) FITC-덱스트란(70kD) 존재하에서 망막 혈관 누수를 측정하였고 상대적 망막 혈관 누수(%)가 대조군 마우스의 것을 기준으로 노말라이즈되어 나타나 있다. (c) 각 그룹당 샘플 사이즈는 막대그래프에 기재되어 있다. 막대그래프는 평균±S.E.M.을 나타낸다; *P<0.01 by 스튜던트‘s t-테스트.
도 2는 초기 당뇨 망막에서 Ang2를 저해하면 성상세포 손실 및 혈관 누수를 감소시켰다. (a-c) 대조군 마우스(Con) 및 당뇨 마우스(DM) 망막에서 스트렙토조토신으로 당뇨 유도한지 1, 3, 5 및 7주 후에 qPCR로 망막 mRNA를 측정하여, Rn18s mRNA 기준으로 노말라이즈하였다. (a) Ang2 mRNA. (b) Ang1 mRNA. (c) Vegfa mRNA. (d?f) 항-Ang2-중화 항체(Anti-Ang2 Ab, 1 μg) 또는 PBS를 2-주령 DM에게 주입하였다. 주입 후 1주일 후에 3-주령이 된 DM에서 망막 성상세포 및 망막 혈관 누수를 측정하였다. (d) 당뇨 망막(PBS)에서 나타난 중심 성상세포 손실이 항-Ang2 Ab가 주입된 당뇨 마우스에서는 회복되었다(최초 배율 x 400; 스케일 바, 100㎛). 백색 화살 머리는 당뇨 망막 혈관에서의 성상세포 손실을 가리킨다. (e) IB4+ 혈관 면적 당 공동위치 지역으로 상대적 성상세포 커버리지(%; Anti-Ang2 Ab)를 계산하여, 대조군의 것을 기준으로 하여 노말라이즈하였다. (f) FITC-덱스트란 존재하의 상대적 망막 혈관 누수(%; 항-Ang2 Ab)를 대조군 마우스의 것을 기준으로 노말라이즈하여 나타내었다. (g) 7주 째에서의 STZ-유도 당뇨 및 비당뇨 대조군 마우스의 체중 및 혈당 수준. 각 그룹의 샘플 사이즈는 막대그래프에 나타나 있다. 막대그래프는 평균±S.E.M.을 나타낸다; *P<0.01 및 ***P<0.001 by ANOVA 및 스튜던트‘s t-테스트 도 3은 고포도당(HG; 25 mM 포도당) 존재하에서는 Ang2가 성상세포 세포사멸을 상승적으로 유도한다는 것을 나타낸 것이다. HG 조건 하에서의 세포 생존율 및 성상세포 세포사멸에 대한 Ang2의 효과를 측정하였다. HG 하에서 Ang2 (300 ng/ml)와 함께 48시간 동안 성상세포를 배양하여 대조군(Con)과 비교하였다. (a) MTT 분석법으로 세포 생존율을 평가하였다. Ang2는 성상세포에서 HG-유도 세포 사멸을 악화시킨다. (b) 동일한 실험 조건에서 성상세포에서 얻은 융해물에서 Bax 및 절단 PARP에 대한 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. β-튜불린을 로딩 대조군으로 사용하였다. (c) 아넥신-V FITC 및 PI로 성상세포를 염색시켜 유세포 분석기로 분석하였다. 총 세포 집단 중의 세포사멸 세포의 퍼센트로 세포 세포사멸을 표현하였다. HG는 성상세포 세포사멸을 유도하고 Ang2는 상기 세포사멸을 악화시킨다. 막대그래프는 세 개의 독립된 실험의 평균±S.E.M.을 나타낸다. HG, 고 만니톨(5 mM 포도당 + 20 mM 만니톨); NG, 정상 혈당( 5mM 포도당). *P<0.05 by Student’s t-test.
도 4는 고포도당 조건(HG; 25mM 포도당)에서 GSK-3β/β-카테닌 경로를 통해 Ang2가 성상세포 세포사멸을 유도한다는 것을 나타낸다. 비록 성상세포를 HG 조건 하에서 48시간 배양한 후 Ang2 (300 ng/ml)를 기재된 시간 동안 처리하였다. (a) HG(48h) 조건 하에서 15, 30, 및 60분 동안 Ang2로 처리한 성상세포에서 얻은 융해물에 대해 phospho-GSK-3β (Ser9) 및 phospho-β-catenin (Thr41/Ser45)에 대한 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. (b) 총 48시간 동안 HG 조건에서 24 및 48시간 동안 Ang2로 처리한 성상세포에서 얻은 융해물에 대해 β-카테닌에 대한 웨스턴 블랏분석을 수행하였다. (c) 유도한지 48시간 후에, SB216763 (GSK-3β inhibitor, 10μM)를 1시간 동안 전처리하였다. 그 후, Ang2를 30분 동안 처리하였다. phospho-GSK-3β (Ser9) 및 phospho-β-catenin (Thr41/Ser45)에 대하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. (d 및 e) Ang2 또는 SB216764 존재하에서 48시간 동안 HG 조건 하에서 성상세포를 배양하였다. (d) β-카테닌에 대한 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. (e) FACS 분석법으로 세포사멸 세포 카운트를 평가하였다. 막대그래프는 세 개의 독립된 실험의 평균±S.E.M.을 나타낸다. *P<0.05 by Student’s t-test. 데이터는 세 개의 독립된 실험을 나타낸다. β-튜불린을 로딩 대조군으로 사용하였다.
도 5는 성상세포에서 고포도당 조건에서 Ang2 수용체로서 인테그린 αvβ5를 증가시킨다는 것을 나타낸 것이다. (a) HRMEC 및 성상세포에서 얻은 융해물에 대해 Tie-2 및 Tie-1 발현에 대한 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. (b) 정량적 RT-PCR로 TIE2 및 TIE1 mRNA 전사를 평가하였다. TIE2 및 TIE1 mRNA 수준을 β-액틴 mRNA로 노말라이즈하여 HRMEC와 비교한 폴드 인덕션(fold induction)으로 기록하였다. *P<0.001 by Student’s t-test. (c) 48시간의 25mM 고포도당(HG) 배양 후 Ang2 (300 ng/ml) 또는 GRGDS (0.5 mg/ml)로 30분 동안 처리한 성상세포에서 얻은 융해물에 대해 phospho-β-catenin (Thr41/Ser45) 및 β-catenin에 대한 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. (d) 48시간 동안 HG 조건하에 있던 성상세포에서 얻은 융해물에 대해 인테그린 αv, β3, 및 β5에 대한 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. β-튜불린을 로딩 대조군으로 사용하였다. 데이터는 3회의 독립적인 실험을 나타낸다. ITGαv (e), ITGβ3 (f), 및 ITGβ5 (g) mRNA 전사를 평가하여 정량적 RT-PCR로 β-액틴 mRNA로 노말라이즈하였다. 모든 mRNA 수준은 정상 포도당(NG, 5 mM)과 비교하여 몇배 유도되었는지 기재하였다. *P<0.05 by Student’s t-test. (h) Ang2(500ng), 인테그린 αvβ5 (500 ng) 및 인테그린 αvβ5 항체(2 μg)를 배양한 후, 상기 면역 복합체를 공동-면역침강시켜 Ang2가 인테그린 αvβ5에 직접적으로 결합하는 것을 보여주었다. 그후, 이들을 Ang2 및 인테그린 αv에 대해 분석하였다. 동일한 양의 재조합 Ang2 및 인테그린 α3β1를 인풋으로 사용하였다. Con, 대조군.
도 6은 Ang2-유도 성상세포 세포사멸이 αvβ5 인테그린 억제에 의해 저해된다는 것을 나타낸 것이다. (a) 25mM 고포도당 조건에서 30분 동안 Ang2 (300 ng/ml) 또는 다양한 인테그린-블락킹 항체(10 μg/ml, α1, α2, α3, α4, α5, α6, 및 αv)로 처리한 성상세포에서 얻은 융해물에 대해 phospho-β-catenin (Thr41/Ser45) 및 β-카테닌에 대한 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. (b 및 c) Ang2 및 항-인테그린 α3 또는 αv 항체와 함께 48시간 동안 성상세포를 배양하였다. (b) β-카테닌에 대한 웨스턴 블랏을 수행하였다(ImageJ quantification; N= 3, mean±S.E.M.). (c) 항-인테그린 α3 항체 존재하의 성상세포 세포사멸을 FACS로 분석하여 총 세포군 중 세포사멸 세포의 퍼센트로 표현하였다. (d 및 e) HG 조건에서 Ang2 및 항-인테그린 β1 항체(10 μg/ml)와 함께 성상세포를 배양하였다. (d) β-카테닌에 대한 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. β-튜불린을 로딩 대조군으로 사용하였다. 데이터는 3회의 독립적인 실험을 나타낸다. (e) 항-인테그린 β1 항체 존재하의 성상세포 세포사멸을 FACS로 분석하여 총 세포군 중 세포사멸 세포의 퍼센트로 표현하였다. (f 및 g) HG 조건에서 Ang2 및 항-인테그린αvβ3 또는 αvβ5 항체(10 μg/ml)와 함께 48시간동안 성상세포를 배양하였다. (f) β-카테닌에 대한 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. β-튜불린을 로딩 대조군으로 사용하였다. 데이터는 3회의 독립적인 실험을 나타낸다. (g) 항-인테그린 αvβ5 항체 존재하의 성상세포 세포사멸을 FACS로 분석하여 총 세포군 중 세포사멸 세포의 퍼센트로 표현하였다. Ang2 처리와 비교하여 #P>0.05, *P<0.05 by Student’s t-test.
도 7은 αvβ5 인테그린을 저해하면 STZ-유도 당뇨 마우스(DM)에서 성상세포 손실이 감소된다는 것을 나타낸 것이다. 항-αvβ5-인테그린-중화 항체(Anti-αvβ5 Ab, 1 μg) 또는 PBS를 2주령의 DM에게 유리체내로 주입하였다. 주입 후 1주일이 된 3-주령 DM에서 망막 성상세포를 평가하였다. (a) 당뇨 망막(PBS)에서 나타난 중심 성상세포 손실이 항-αvβ5 Ab-주입 DM(최초 배율 x 400; 스케일 바, 100μm)에서 회복되었다. (b) 상대적 성상세포 커버리지(%)는 IB4+ 혈관 면적 당 혈관 및 성상세포의 공동-위치 면적으로 계산하여 대조군 마우스의 수치 기준으로 노말라이즈하였다. 각 그룹당 샘플 사이즈는 막대그래프에 나타나 있다. 막대그래프는 평균±S.E.M으로 나타낸다.: *P<0.001 by Student’s t-test.

초기 당뇨의 망막에서는 망막 혈관 누수와 함께 망막 성상세포 손실이 일어난다. 본원에서는 고포도당 조건에서 망막 성상세포 손실 및 상기 혈관 누수는 Angiopoetin 2(Ang2)와 관련이 있고, 상기 Ang2는 망막 성상세포 세포사멸을 유도하며, 상기 Ang2에 의한 성상세포 세포사멸은 GSK-3β/β-카테닌 경로를 통해 이루어지고, Ang2를 저해하면 성상세포 손실 및 혈관 누수가 감소되고, 고포도당 조건에서는 상기 Ang2의 수용체로서 인테그린 αvβ5가 증가되는 것을 규명한 것에 근거한 것이다.

이에 한 양태에서 본원은 항-인테그린αvβ5를 특이적으로 인식하는 폴리펩타이드를 포함하는 당뇨병성 망막증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

본원에 따른 폴리펩타이드가 결합하는 인테그린 αVβ5는‘인테그린’패밀리에 속하며 인테그린은 α, β 두 소단위의 헤테로2합체로 구성되는 막관통형 당단백질로 다양한 종류의 α와 β의 조합 양상에 의해 분류된다. 인테그린은 세포 표면에 존재하여 피브로넥틴, 콜라겐 등의 세포외 기질에 세포가 접착할 때 작용하며 때로는 세포의 상호작용, 면역, 지혈 등에도 관여한다. 인테그린 αVβ5는 인테그린 알파 V 및 인테그린 베타 5의 두 요소로 구성되어 있는 인테그린의 한 가지 형태이다.

본원에서는 인테그린 αvβ5는 고포도당 조건에서 Ang2와 직접 결합함으로써 Ang2에 대한 수용체로 작용하는 것을 규명하여, 본원에 따른 인테그린αvβ5를 특이적으로 인식하는 폴리펩타이드는 이의 Ang2와의 상호작용을 억제하여, 관련세포에서 GSK-3β 활성화를 억제하여, 세포의 사멸을 억제할 수 있다.

본원에 따른 폴리펩타이드는 표적세포에서 발현되는 인테그린αvβ5에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩타이드로서 Ang2와의 상호작용을 억제하며, 이러한 효과를 나타내는 한 다양한 형태의 폴리펩타이드가 포함될 수 있으며, 예를 들면 항체, 항체의 항원결합 단편, 항체 모방체, 앱타머, 또는 수용체를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.

본원에 따른 일 구현에서는 항체가 사용되며, 이러한 항체는 폴리클로날, 모노클로날 항체, 또는 키메라 또는 인간화 항체, 전장 항체 또는 그 단편을 포함하는 것이다.

본원에 따른 다른 구현예에서는 항원결합단편이 사용되며, 이러한 항원결합단편은 전장 항체 중에서 항원결합 부위의 전부 또는 일부를 포함하는 것으로, 예를 들면 scFv (후술하는 내용 참조), BITE (예를 들면 미국 특허 제7235641호 참조), TandAb(예를 들면 미국 공개특허 제2005-089519호 참조), Immunobody (예를 들면 미국 공개특허 제2004-146505호 참조), Flexibody (예를 들면 미국 특허 제6838254호 참조), Nanobody (예를 들면 미국 공개특허 제2003-088074호 참조), Triomab (예를 들면 미국 특허 제6551592호 참조), Troybody (예를 들면 미국 특허 제6294654호 참조), Pepbody (예를 들면 미국 공개특허 제2004-101905호 참조), Vaccibody (예를 들면 미국 공개특허 제2004-253238호 참조), SMIP (예를 들면 미국 공개특허 제2008-227958호 참조), Fab (fragment antigen binding fragment, 실시예의 내용 참조), mAb2 (예를 들면 미국 공개특허 제2009-298195호 참조), UniBody (예를 들면 미국 특허 제7235641호 참조), Fv (Fragment variable), dAB (예를 들면 미국 공개특허 제2006-280734호 참조), scFV-Fc, Diabody (예를 들면 미국 특허 제7235641호 참조), Tetrabody (예를 들면 미국 특허 제7235641호 참조), Minibody (예를 들면 미국 특허 제7235641호 참조), scFab (single chain Fab), Fcab (예를 들면 미국 공개특허 제2009-298195호 참조)를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 다른 구현예에서는 항체 모방체가 사용되며, 이러한 항체 모방체는 DARPin (예를 들면 미국 특허 제7417130호 참조), Tetranectin (예를 들면 미국 공개특허 제2004-132094호 참조), Affibody (예를 들면 미국 특허 제5831012호 참조), Transbody (예를 들면 미국 공개특허 제2004=023334호 참조), Anticalin (예를 들면 미국 특허 제7250297호 참조), AdNectin (예를 들면 미국 특허 제6818418호 참조), Affilin (예를 들면 미국 특허 제7838629호 참조), Microbody (예를 들면 미국 특허 제7186524호 참조), Peptide aptamer (예를 들면 미국 특허 제6004746호 참조), Phylomer (예를 들면 미국 특허 제6994982호 참조), Stradobody (예를 들면 미국 공개특허 제2010-239633호 참조), Avimer (예를 들면 미국 특허 제7803907호 참조), Evibody (예를 들면 미국 특허 제7166697호 참조), 또는 Fynomer (예를 들면 미국 공개특허 제2010-119446호 참조)를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 사용된 용어 ‘예방’은 본원 조성물의 투여로 당뇨병성 망막증의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 당뇨병성 망막증에 치료효과가 있는 본원의 본원 조성물은 당뇨병성 망막증의 초기 증상, 또는 나타나기 전에 복용할 경우 이러한 질환을 예방할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.

본원에 사용된 용어 ‘치료’는 본원 조성물의 투여로 당뇨병성 망막증의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 본원의 조성물이 효과가 있는 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.

본원에 사용된 용어 ‘당뇨병성 망막증’은 전신 질환인 당뇨병에 의해 말초 순환 장애가 발생하는데, 이때 망막의 미세순환에 장애가 생겨 시력 감소가 발생하는 눈의 합병증을 포함하며, 초기 당뇨망막증에서는 군데군데 작은 빨간 반점, 미세혈관류, 망막출혈을 나타낸다.

또한 본원의 약학 조성물은 단독으로, 또는 수술, 약물치료 및 생물학적반응조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본원의 약학 조성물은 상기 언급한 유효성분 이외에 추가로 약학적 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 담체란 사용되는 투여량 및 농도에 노출되는 세포 또는 포유동물에 무독성인 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제를 의미하는 것이다. 이러한 담체의 예로는 식염수, 링거액, 완충 식염수, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충액, 아스코르브산을 비롯한 산화방지제, 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩타이드, 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈, 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신, 단당류, 이당류 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물, 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA, 당 알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨, 염 형성 카운터 이온, 예를 들어 나트륨, 및(또는) 비이온계 계면활성제, 예를 들어 트윈, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 플루로닉스(PLURONICS)를 들 수 있다.

필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제형화할 수 있다.

경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명으로 표시되는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다.

비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본원의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 특히 비경구 투여가 바람직하다. 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적 또는 치료적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 화합물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏당 0.01μg 내지 100 mg, 바람직하게는 0.01μg 내지 10 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

다른 양태에서 본원은 안지오포이어틴-2(Ang2) 및 인테그린 αvβ5 단백질의 상호작용을 억제하여 이러한 물질을 성상세포 사멸 억제제 또는 당뇨병성 망막증 치료제로 스크리닝하는 방법을 제공한다.

일 구현예에서 상기 방법은 안지오포이어틴-2(Ang2) 및 인테그린 αvβ5 단백질을 제공하는 단계; 상기 안지오포이어틴-2 및 인테그린 αvβ5 단백질의 상호작용을 억제할 것으로 기대되는 시험물질과 상기 단백질을 접촉시키는 단계; 및 상기 안지오포이어틴-2 및 인테그린 αvβ5 단백질의 상호작용을 검출하는 단계로, 상기 시험물질과 접촉하지 않은 대조군과 비교하여 상기 시험물질과 접촉되어 상기 안지오포이어틴-2 및 인테그린 αvβ5 단백질의 상호작용이 감소된 경우, 상기 시험물질을 안지오포이어틴-2 및 인테그린 αvβ5 단백질간 상호작용을 억제하는 후보물질로 선별하는 단계를 포함한다.

본원의 방법에 사용되는 시험물질은 인테그린 αvβ5와 Ang2의 상호작용을 억제할 것으로 기대되는 물질로, 예를 들면 약물의 스크리닝 목적을 위해서는 화합물은 저분자량의 치료효과를 갖는 것이 사용될 수 있다. 예를 들면 중량이 400 Da, 600 Da 또는 800 Da과 같은 약 1000 Da 내외의 화합물이 사용될 수 있다. 목적에 따라 이러한 화합물은 화합물 라이브러리의 일부를 구성할 수 있으며, 라이브러리를 구성하는 화합물의 숫자도 수십개부터 수백만개까지 다양하다. 이러한 화합물 라이브러리는 펩타이드, 펩토이드 및 기타 환형 또는 선형의 올리고머성 화합물, 및 주형을 기본으로 하는 저분자 화합물, 예컨대 벤조디아제핀, 하이단토인, 바이아릴, 카보사이클 및 폴리사이클 화합물 (예컨대 나프탈렌, 페노티아진, 아크리딘, 스테로이드 등), 카보하이드레이트 및 아미노산 유도체, 디하이드로피리딘, 벤즈하이드릴 및 헤테로사이클 (예컨대 트리아진, 인돌, 티아졸리딘 등)을 포함하는 것일 수 있으나, 이는 단지 예시적인 것으로 이로 한정되는 것은 아니다. 일 실시예에서 항- 인테그린 αvβ5 항체일 수 있다.

본원의 스크리닝 방법에 사용될 수 있는 안지오포이어틴-2(Ang2) 및 인테그린 αvβ5 단백질은 앞서 언급한 바 또는 본원의 실시예에 기재된 바를 참조할 수 있으며, 스크리닝을 하는 구체적 방법에 따라 안지오포이어틴-2(Ang2) 및 인테그린 αvβ5 단백질 및/또는 이를 발현하는 세포가 본 방법에 사용될 수 있다. 한 구현예에서는 동물세포, 망막세포 또는 성상세포가 사용될 수 있으나, 상기와 같은 효과를 측정할 수 있는 한 이로 제한되는 것은 아니다.

안지오포이어틴-2(Ang2)는 안지오포이어틴 패밀리에 속하는 일원으로 혈관의 성장인자로 알려져 있으며, 그 서열은 공지된 것으로 단백질 서열은 예를 들면 인간 단백질 서열은 NM_001147로 공지되어 있다.

본원 방법에 따른 안지오포이어틴-2(Ang2) 및 인테그린 αvβ5 단백질의 상호작용 억제여부의 분석에는 공지된 단백질을 정성적 또는 정량적으로 검출하는 다양한 방법이 사용될 수 있다.

상기 본원에 사용되는 Ang2 및 인테그린 αvβ5 단백질은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 특히 스크리닝 단백질의 제조방법은 유전자 재조합 기술을 이용하는 것이다. 예를 들면 상기 단백질을 코딩하는 상응하는 유전자를 포함하는 플라스미드를 원핵 또는 진핵세포 세포 예를 들면 곤충세포, 포유류 세포에 전달하여 과발현 시킨 후 정제하여 사용할 수 있다. 상기 플라스미드는 예를 들면 본원의 예시적 구현예에서 사용한 것과 같은 동물 세포주에 트랜스팩션한 후, 발현된 단백질을 정제하여 사용할 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

또는 스크리닝 단백질을 암호화하는 DNA 또는 RNA 서열을 적당한 숙주 세포에서 발현시켜 그 세포 파쇄물을 만들거나 상기 스크리닝 단백질의 mRNA를 시험관내에서 번역한 후 당업계에 공지된 단백질 분리 방법에 의해 스크리닝 단백질을 정제할 수 있다. 통상, 세포잔여물(cell debris) 등을 제거하기 위해 상기 세포 파쇄물 또는 시험관내 번역한 결과물을 원심분리한 후, 침전, 투석, 각종 컬럼 크로마토그라피 등을 적용한다. 이온교환 크로마토그라피, 겔-퍼미에이션 크로마토그라피, HPLC, 역상-HPLC, 프렙용 SDS-PAGE, 친화성 컬럼 등은 컬럼 크로마토그라피의 예이다. 친화성 컬럼은, 예를 들어, 항-스크리닝 단백질 항체를 이용하여 만들 수 있다.

일 구현예에서, 안지오포이어틴-2(Ang2) 및 인테그린 αvβ5 단백질은 이를 발현하는 세포의 형태로 제공될 수 있다. 특히 αvβ5 단백질은 막에 존재하는 단단백질로서 이를 막에 발현하는 세포의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들면 포유류 세포, 망막세포 또는 성상세포가 사용될 수 있으며, 이러한 세포를 세포배양 플레이트에 배양한 후, 여기에 시험물질을 첨가한 후, 일정 시간 후에 세포로부터, 총 단백질을 추출하여, 예를 들면 공동면역침전법, 면역형광법을 통하여 HBx 및 APC의 상호작용 여부를 확인할 수 있다. 대조군(시험물질을 처리하지 않은 경우)과 비교하여, 단백질 간의 상호작용을 억제한 것을 당뇨병성 망막증 또는 성상세포 사멸 억제제 후보물질로 선별할 수 있다.

상기 정제된 단백질의 접촉은 시험관내에서 이들을 직접 사용하여 시험물질의 부재 또는 존재하에서 결합여부를 확인할 수 있다. 이 경우 단백질은 검출의 편이를 위해 다양한 표식물질, 예를 들면 바이오틴, 형광물질, 아세틸화, 방사선 동위원소와 같은 것으로 공지된 방법 또는 시중의 단백질 표지 키트를 사용하여 표지될 수 있으며, 표지된 물질에 적합한 검출기기를 사용하여 검출될 수 있다. 단백질-단백질 상호작용은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들면 세포내 단백질의 결합/상호작용을 확인하는 이스트투하이브리드법, 콘포칼현미경법. 공동면역침전법, 표면플라즈마공명 (SPR) 및 스펙트로스코피법을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니며, 이러한 방법에 관한 비교 및 자세한 실험법에 관한 추가의 참고문헌은 Berggard et al., (2007) "Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions", PROTEOMICS Vol7: pp 2833 - 2842에 기재된 것을 참고할 수 있다.

다른 측면에서 본원에 따른 방법에서 안지오포이어틴-2(Ang2) 및 인테그린 αvβ5 단백질간의 상호작용의 억제 측정은 상기 αvβ5를 발현하는 세포에서 GSK-3β/β-카테닌 경로가 조절되는지 여부로 측정될 수 있으며, 이러한 방법은 본원의 실시예에 기재된 것을 참조해서 수행될 수 있다. GSK-3β/β-카테닌 경로는 본원 실시예에 기재된 바와 같이 인테그린 αvβ5 단백질에 의해 GSK-3β가 탈인산화되고, 이러한 탈인산화된 GSK-3β는 β-카테닌을 인산화시켜 이의 분해를 유도하게 된다.

본 방법에서 사용되는 인테그린 αvβ5 단백질의 양, 세포의 종류 및 시험물질의 양 및 종류 등은 사용하는 구체적인 실험방법 및 시험물질의 종류에 따라 달라지며, 당업자라면 적절한 양을 선택할 수 있을 것이다. 실험결과 시험물질과 접촉되지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 존재하에서 인테그린 αvβ5를 저해하는 물질을 후보 물질로 선별한다. 대조군과 비교 약 99% 이상 증가, 약 95% 이상 증가, 약 90% 이상 증가, 약 85% 이상 증가, 약 80% 이상 증가, 약 75% 이상 증가, 약 70% 이상 증가, 약 65% 이상 증가, 약 60% 이상 증가, 약 55% 이상 증가, 약 50% 이상 증가, 약 45% 이상 증가, 약 40% 이상 증가, 약 30% 이상 증가, 약 20% 이상 증가를 의미하나, 이를 벗어나는 범위를 제외하는 것은 아니다.

또한 이런 치료제를 스크리닝하는 방법으로는, 다수의 공지의 방법을 사용할 수 있으며, 당업자라면 구체적인 실시양태에 따라 적절한 방법을 선택할 수 있다. 스크리닝에 사용하기 위한 시험물질을 포함하는 시료로서는 조직 추출액, 유전자 라이브러리의 발현산물, 합성화합물, 합성 펩티드, 천연 화합물 등이 있으나 이에 제한되지는 않는다.

다른 측면에서 본원은 인테그린 αvβ5와 Ang2의 상호작용을 억제하는 물질의 존재하에서 성상세포를 배양하여, 상기 세포에서 GSK-3β/β-카테닌 경로를 억제하는 단계를 포함하는, 성상세포 사멸 억제 방법에 관한 것이다. 일구현에에서 상기 방법은 인비트로에서 수행되는 것이며, 상호작용을 억제하는 물질 및 세포는 앞서 언급한 사항 및 본원의 실시예에 기재된 것을 참조할 수 있다.

또 다른 측면에서 본원은 또한 인테그린 αvβ5와 Ang2의 상호작용을 억제하는 물질의 존재하에서 성상세포를 배양하여, 상기 세포에서 GSK-3β/β-카테닌 경로를 억제하는 단계를 포함하는, 망막 조직의 성상세포에서 GSK-3β/β-카테닌 경로를 억제하는 방법에 관한 것이다. 일구현에에서 상기 방법은 인비트로에서 수행되는 것이며, 상호작용을 억제하는 물질 및 세포는 앞서 언급한 사항 및 본원의 실시예에 기재된 것을 참조할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실 시 예

실험재료 및 방법

세포 배양. 망막조직 유래의 HRMEC (Human Retinal Microvascular Endothelial Cell)(Applied Cell Biology Research Institute, Kirkland, WA, USA) 및 인간 뇌 성상세포 (Astrocyte)(Applied Cell Biology Research Institute)를 각각 M199 배지 및 성장 요소를 함유하는 20% FBS가 첨가된 DMEM (Hyclone, Logan, UT, USA)에서 관리하였다. 모든 세포는 5%CO₂ 및 37℃에서 인큐베이터에서 배양하였다.

시약 및 항체. 재조합 인간 Ang2, 인간 인테그린 αvβ5, PE(phycoerythrin) -접합 항-내피-특이성 수용체 타이로신 키나아제 2(Tie-2) 마우스 IgG 항체, 마우스 Ang2 ELISA 키트, 마우스 VEGF ELISA 키트, 인간 포스포-키나아제 분석 키트, 항-인테그린 αvβ3, 및 항-인테그린αvβ5 (clone P5H9, MAB2528) 중화 항체는 R&D systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였다. 마우스 Ang1 ELISA 키트는 MyBioSource (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다. 항-Bax 항체는 Epitomics(Burlingame, CA, USA)에서 구입하였다. 항-포스포 GSK-3β (Ser9), 항-포스포 β-카테닌, 항-β-카테닌, 및 항-PARP 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서 구입하였다. 항-Tie-1 및 퍼옥시다아제-접합 이차 항체는Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)에서 구입하였다. 항-Tie-2 항체, GRGDS 펩타이드, 및 SB216763는 Millipore (Billerica, MA, USA)에서 구입하였다. MTT((3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리늄 브로마이드), STZ, 및 FITC-덱스트란(70 kD)은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. FITC-접합 아넥신-V/PI 분석 키트는 BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA)에서 구입하였다. 항-GFAP, 항-인테그린 αv, β1, β3, β5, 및 항-Ang2 항체는 Abcam (Cambridge, MA, USA)에서 구입하였다. 항-마우스 Ang2-블락킹 항체(Angy-2-1)는 Adipogen (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다. 항-인테그린 α3 (clone P1B5, MAB1952), 항-인테그린 β1 (clone 6S6, MAB2253), 및 α-인테그린-블락킹 및 IHC 키트(α1-6, v)는 Millipore에서 구입하여 기능적 블락킹에 사용하였다.

동물실험. 본 명세서의 모든 동물 실험은 안과연구에 대한 동물사용규정과 서울대학교 동물관리사용위원회의 가이드라인을 준수하여 행하여졌다. 6-주령의 무균 수컷 C57BL/6J 마우스는 Central Lab. Animal Inc. (Seoul, Korea)에서 구입하였다. STZ를 180mg/체중 kg의 농도로 10mM의 시트레이트 버퍼(pH 4.5)에 녹여서 복강내 일회 주사하여 당뇨를 유발하였다. 동일 연령의 대조군에는 시트레이트 버퍼만을 주사하였다. STZ 주사 4일 후 혈당 수준이 4300mg/dl인 마우스가 당뇨 유발이 된 것으로 처리하였다.

당뇨유발 마우스와 대조군 마우스는 당뇨유발 3주 후 안락사시켰고, 마우스의 눈을 마취상태에서 채취하여, ELISA에 쓰일 조직은 -80℃에서 즉시 냉동시켰고, 망막 플랫 마운트(retinal flat mount)에 쓰일 조직은 4% 파라포름알데히드에서 고정시켰다. 혈당 수준(Accu-Chek, Roche, Indianapolis, IN, USA) 및 체중은 지속적으로 모니터하였다.

ELISA. 마우스의 두 개의 망막을 모았다(각 그룹당 N=6). 망막, 유리체 및 망막을 포함한 샘플을 균질화하여 컴플리트 프로테아제 저해제 칵테일(Roche)와 함께 500㎕ RIPA 버퍼에서 간략히 소니케이션하여 융해시켰다. 12000rpm에서 20분간 원심분리한 후, 상청액을 모았다. 제조자의 매뉴얼에 따라 ELISA 키트를 이용하여 Ang1, Ang2, 및 VEGF 수준을 측정하였다. 상기 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 키트(Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용하여 측정하였다. Ang1 (ng), Ang2 (pg), 및 VEGF 수준(pg)을 망막 단백질(mg)에 대해 표준화하였다.

망막 혈관 누수의 정량적 및 정성적 평가. 혈관 누수를 측정하기 위하여 3-주령의 STZ-유도 당뇨 마우스를 사용하였다. 깊게 마취한 마우스에게 PBS에 용해시킨 FITC-덱스트란을 정맥주사하였다. 주입 1시간 후, 눈을 적출하여 4% 파라포름알데히드에 1시간 동안 고정하였다. 망막을 2 x PBS에서 해부하여, 플랫-마운트 한 후 x40 및 x100 배율로 형광현미경(Eclipse 90i, Nikon, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.

혈관 누수를 정량분석하기 위하여, 각 마우스의 중간-주변부 망막(0.5 μm x 0.5 μm)에서의 4개의 대표적 누수 부위를 선택하였다(N=6-7). 시신경 헤드에서 모양체까지 망막의 중간 3분의 1을 지정하여 중간-주변부 망막으로 정하였다. 상기 이미지를 ImageJ (1.47v, NIH, Bethesda, MD, USA)로 송출하였다. 이에 자동 아이소데이타 알고리즘에 근거하여 색 역치에 대해 이미지를 조정하였고, FITC가 있는 흥미 부위를 적색으로 표시하였다. 그 후 적색 지역을 측정하였다. 상기 데이터는 혈관 누수(%)로 표현하였는데, 이는 대조군 마우스의 것을 기준으로 하여 노말라이즈하였다.

성상세포에 의한 망막 혈관 커버리지의 정량. 망막 성상세포의 형태 및 정량적 혈관 커버리지를 측정하기 위하여, 성상세포에 대하여 GFAP에 대비시키고 혈관에 대해 IB4로 대비시켜 망막 플랫 마운트를 면역염색하였다. 상기 망막을 공초점 현미경(Leica TCS STED, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)으로 관찰하였다. 간략히 보면, 눈을 적출하여 4% 포름알데히드로 1시간 동안 고정시켰다. 상기 망막을 2xPBS에서 해부하여 -20℃에서 밤새 100% 메탄올에서 배양시켰다. 그 후, 실온에서 1시간 동안 Perm/Block 용액(0.3% Triton-X and 0.2% BSA in PBS)에서 상기 망막을 블락하였다. 그 후, 항-GFAP 항체(1:100) 및 알렉사 플루오르 594-접합된 항-IB4 항체(1:100) 존재하에 4℃에서 밤새 Perm/Block 용액에서 배양하였다. 그 후, 상기 망막을 PBS로 반복 세척하고 이차 항체(1:200) 존재하에 실온에서 1시간 동안 배양하였다. PBS로 세척한 후, 상기 망막을 Fluoromount 액상 마운팅 배지(Sigma-Aldrich)로 마운트하였다. 각 마우스에서 중간-주변부 망막에서 성상세포가 소실되는 대표적 부위를 선택하였다(N=6-8). 성상세포의 형태는 z-스택(배율 x 400)의 최대 프로젝션 이미지로 분석하였다. 성상세포에 의한 혈관 커버리지를 분석하기 위하여, 성상세포 및 망막 혈관의 공동위치 부위를 망막 혈관의 부위로 나누었다(성상세포 커버리지 = 공동위치 부위/혈관 부위). Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF) software를 사용하여 공동위치 부위를 계산하였다(Leica Microsystems; 역치 및 배경 수치는 각각 30 및 20%). 상기 이미지를 Imaris software (Ver.7.6.5, Bitplane, Belfast, UK)로 송출시켜 혈관 부위를 분석하였다. 그 후, 성상세포에 의한 혈관 커버리지를 대조군의 것을 기준으로 노말라이즈하였다(상대적 성상세포 커버리지 %; 도 3).

항- Ang2 및 항- 인테그린 -중화 항체의 유리체내 주입. STZ로 당뇨 유발시킨 후 2주 후에 깊은 마취 상태하에서 1㎍의 항-Ang2-중성화 항체 및 1㎍의 항-인테그린 αvβ5 항체(클론 P5H9)를 함유하는 1 마이크로리터를 유리체내로 주입하였다. 몇균 PBS를 대조군으로 주입하였다. 주입한지 7일 후에, 혈관 누수 및/또는 성상세포 분석을 하기 위하여 망막에 망막 플랫 마운트를 수행하였다.

세포 생존 분석. 모든 실험에서 2.5 × 10⁴ 세포를 96-웰 플레이트에 씨드하였다. 24시간 후에, 정상 포도당(5mM 포도당), 고포도당(25mM 포도당), 및 삼투압 대조군으로써 고 만니톨(5mM 포도당 플러스 20mM 만니톨) 상태하에서 Ang2 (300 ng/ml)를 48시간 동안 세포에 처리하였다. 세포 생존율을 제조자의 매뉴얼에 따라 MTT 분석법으로 측정하였다. 각 실험 조건마다 3회의 독립적 실험을 수행하였다.

FACS 분석법. 세포 사멸을 평가하기 위하여, 정상 포도당, 고 만니톨, 및 고포도당 조건에서 5x10⁵ 세포에 Ang2 (300 ng/ml)를 37℃에서 48시간 동안 처리하였다. 인테그린 블락킹의 효과를 결정하기 위하여, Ang2를 첨가하기 전에 항-인테그린-블락킹 항체(10 μg/ml)를 1시간 처리하였다. 상기 세포를 모아 PBS로 두 번 세척하였다. FITC 아넥신-V 및 PI으로 15분 동안 세포를 염색하여, 상기 세포를 유세포 분석기로 분석하였다. 아넥신 V-양성/PI-음성 세포를 세포사멸인 것으로 결정하였다.

정량적 RT- PCR . RNeasy Plus Mini kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 세포에서 총 RNA를 모아 분리하였다. 2.5 μM 올리고-dT 프라이머, 1 mM dNTPs, 및 MuLV 역전사효소를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 7900HT real-time PCR (Applied Biosystems)를 사용하여 qPCR master mix for SYBR Green PCR master mix (Applied Biosystems, Life technologies, Gaithersburg, MD, USA)에서 정량적 실시간 PCR(qPCR)을 수행하였다. qPCR 조건은 하기와 같이 세팅하였다 : (i) 95 ℃ for 10 min 및 (ii) 50 cycles of 5 s at 95 ℃ 및 20 s at 60 ℃. 평균 량은 각 샘플당 3번 qPCR을 하여 계산하였고 대조군 유전자 기준으로 노말라이즈하였다.

제조자의 매뉴얼에 따라 TRI Reagent (Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA)를 사용하여 망막에서 총 RNA를 분리하였다. High Capacity RNA-to-cDNA kit (Life Technologies)로 cDNA를 제조하였다. TaqMan Fast Advanced Master Mix (Life Technologies) 및 specific Gene Expression Assays (cat. no. 4331182; Life Technologies)가 있는 StepOnePlus Real-Time PCR System (Life Technologies)을 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다. 유전자 발현 분석의 생산물 ID 는 하기와 같다 : Angpt1: Mm00456503_m1; Angpt2: Mm00545822_m1; Vegfa: Mm00437306_m1; 및 Rn18s: Mm03928990_g1. 모든 절차는 MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCE Experiments) (Bustin et al., Clin Chem. 2009 Apr;55(4):611-22) 가이드라인에 따라 수행되었다.

면역침강 및 면역블랏팅 . 면역침강을 하기 위하여, Ang2 (500 ng) 및 인테그린 αvβ5 (500 ng)를 G-Sepharose 비드 (Millipore)로 4℃에서 1시간 동안 프리클리어(preclear)하였다. 그 후, 상기 복합체 및 항-인테그린 αvβ5 항체(2 μg)를 G-Sepharose 비드 존재하에서 4℃에서 밤새 배양하였다. 상기 면역 복합체를 원심분리로 모아 버퍼로 세 번 세척하였다. 면역블랏팅을 하기 위하여, 세포를 모아 프로테아제 저해제 칵테일이 있는 RIPA 버퍼에 용해하였다. 단백질 융해물을 SDS 폴리아크릴아마이드 겔로 분석하였고 나이트로셀룰로오즈 멤브레인으로 옮겼다. 상기 멤브레인을 1차 항체(1 : 1000)와 함께 4℃에서 밤새 배양하고 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 상기 멤브레인을 증강된 화학발광 기질(Pierce)과 함께 배양하여 필름 또는 LAS 4000 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)에 노출시켰다.

통계 분석. 두 개의 그룹에는 표준 양 방향 꼬리 스튜던트 t-검정을 사용하여 통계분석을 수행하였고, 다수 그룹에는 일 방향 ANOVA 및 Bonferroni’s 다중 비교가 있는 사후검정(post hoc test)을 각각 수행하였다(SPSS Statistics 20.0, IBM, Armonk, NY, USA). *P<0.05는 통계적으로 중요한 것으로 여겨진다. 정량적 데이터 및 도면에는 평균 ± S.E.M.으로 나타내었다.

실시예 1. 초기 당뇨 마우스에서 망막 혈관 누수과 함께 망막 성상세포 손실 발생 확인

망막 성상세포 커버리지 대 망막혈관이 당뇨 마우스 망막에서 약화되는지 알아보기 위하여, 당뇨 마우스의 망막 플랫 마운트에 면역조직화학분석을 수행하였다. STZ로 유발시킨지 3주 된 당뇨 마우스 및 동일 연령의 비당뇨 대조군 마우스에서 GFAP(glial fibrillary acidic protein)-표지된 성상세포를 평가하였다. 흥미롭게도, 당뇨 망막에서 망막 혈관에 대한 성상세포 커버리지의 중심이 소실되는 것이 관찰되었다(도 1a). 망막 혈관에 대한 상대적 성상세포 커버리지(42.0±6.4%)가 대조군 망막의 것과 비교하여 당뇨 망막에서 상당히 감소하였다(100.0±5.4%, P<0.001; 도 1b). 또한 망막 혈관 누수를 FITC(fluorescein isothiocyanate)-덱스트란 존재하에서 평가하였다. 망막 혈관 누수가 대조군 망막(100.0±16.0%)과 비교하여 당뇨 망막(196.5±7.1%)에서 상당히 증가하였다(P<0.001; 도 1c). 이러한 결과는 초기 당뇨 마우스에서, 망막 성상세포 손실에 망막 혈관 유수 증가가 수반되는 것을 나타낸다.

실시예 2. 초기 당뇨 망막에서 Ang2의 저해로 인한 성상세포 손실 및 혈관 누수를 감소 확인

초기 당뇨 망막에서 성장 인자가 혈관 누수 및 성상세포 손실 증가와 연관되어 있는지를 확인하기 위하여, 망막 혈관 내피 성장인자(VEGF) 및 Ang1/2에 대해 ELISA를 수행하였다. 당뇨 유발 1주 및 3주에 망막 Ang2 수준이 증가하였다(88.9±1.3 pg/mg에서 각각 98.11±2.2 및 102.7±4.6 pg/mg까지, P=0.018 by one-way ANOVA). 사후검정에서, 3주에서의 Ang2는 대조군과 비교하여 상당히 증가하였다(P= 0.017). 그러나 당뇨 유발 후 3주째에는 망막 VEGF 및 Ang1 수준은 유의하게 변하지는 않았다. 당뇨 망막에 대한 qPCR 분석에서(당뇨 유발 후 7주), Ang2 및 Ang1 mRNA는 3주 후에 상당히 증가하였다(도 2a 및 b). 하지만, Vegfa mRNA는 5주 후에 상당히 증가하였다(도 2c). ELISA 및 qPCR에 사용된 마우스에 대한 물리적 대사 파라미터는 도 2g에 나타나 있다. 혈관 누수 증가가 Ang2에 의한 성상세포 손실에 기인한 것인지 여부를 규명하기 위하여, STZ 주입 후 2주째에 당뇨 마우스에 Ang2-블락킹 항체를 주입하였다. 대조군으로 PBS-주입 당뇨 마우스에서의 성상세포 커버리지 손실(100.0±15.2%, P<0.05; 도 2d 및 e)과 비교하여, 항-Ang2-블락킹 항체 주입 마우스의 망막에서의 성상세포 커버리지(349.3±49.8%)가 증가한 것으로 나타났다. 또한, 항-Ang2-블락킹 Ang2는 PBS-주입 당뇨 망막에서의 혈관 누수(100.0±5.3%, P<0.05; 도 2f)와 비교하여 혈관 누수가 약화되었다(72.4±6.3%). 이러한 결과는 Ang2에 의한 성상세포 손실이 망막 혈관 누수와 관련이 있으며 이로 인해 STZ-당뇨 마우스에서 망막 혈관 누수가 일어났다는 것을 의미한다.

실시예 3. 고포도당에서 Ang2에 의한 성상세포 세포사멸 유도 확인

인 비트로에서 성상세포의 세포 생존성에 대한 Ang2의 효과를 알아보기 위하여, MTT{3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리눔 브로마이드} 분석 및 FACS(fluorescence-activated cell sorting) 분석을 수행하였다. 고포도당에서 Ang2는 혈관 주위 세포(pericyte) 사멸을 이끌었다. 유사하게, 상기는 고포도당에서 성상세포 사멸을 심화시켰다(76.8±2.2% from 85.5±3.3%, P<0.05; 도 3a). 다음으로, 성상세포 사멸이 세포사멸 경로에 의해 매개되는지를 조사하였다. 그 결과 실지로 Ang2는 고포도당에서 Bax 증가와 함께 세포사멸 경로를 유도하였고 폴리(ADP-라이보스) 폴리머라아제(PARP)를 절단하였다(도 3b). 그 후, 성상세포 세포사멸을 아넥신-V/프로피디움 아이오다이드(PI) FACS 분석으로 평가하였다. Ang2는 포도당 농도와 상관없이 세포사멸성 세포 개체군을 증가시켰다. 중요한 것은 고포도당으로 유도된 성상세포 세포사멸은 Ang2에 의해 상당히 심화되었다(32.6±4.4% from 18.0±2.6%, P<0.05; 도 3c). 이러한 데이터는 Ang2가 특히 고포도당 조건에서 성상세포 세포사멸을 유도한다는 것을 나타낸다.

실시예 4. 고포도당 조건에서 Ang2에 의한 세포사멸 유도 기전 규명: GSK - 3 β/β-카테닌 경로

고포도당에서 Ang2가 성상세포 세포사멸을 매개하는 기전을 확인하고자 하였다. 성상세포를 고포도당 조건에서 48시간 동안 배양하고, Ang2 (300 ng/ml)를 일정시간 동안 처리하였다. Ang2가 GSK-3β (Ser9)를 탈인산화시키고, β-카테닌을 인산화시킴으로써 GSK-3β 활성화를 유도(도 4a)하고, 상기는 고포도당 조건에서 β-카테닌 분해가 되는 것(도 4b)을 발견하였다. 그 후, Ang2-매개 성상세포 세포사멸에 대한 GSK-3β/β-카테닌 경로의 역할을 결정하기 위하여, GSK-3β 저해제 (SB216763, 10 μM, 1 h 전처리)로 성상세포를 처리하였다. 그 결과 GSK-3β는 30분에 Ang2의 유도로 β-카테닌이 인산화되고(도 4c) 연이어 48시간에 β-카테닌이 분해(도 4d)되는 것을 감소시켰다. 즉 GSK-3β를 저해하면 고포도당 하에서 Ang2가 성상세포 세포사멸을 유도하는 것이 효과적으로 약화되었다(13.4± 0.8% from 27.8±3.2%, P<0.05; 도 4e). 이러한 결과는 고포도당 조건에서 GSK-3β과 이에 의한 β-카테닌 경로를 통해 Ang2가 성상세포 세포사멸을 유도한다는 것을 나타낸다.

실시예 5. 고포도당에 의해 성상세포에서 Ang2 수용체로서의 인테그린 αvβ 5이 증가 규명

성상세포에서 Ang2-유도 세포사멸을 매개하는 것이 어느 수용체인지 밝히고자 하였다. 잘 알려진 Ang2 수용체인 Tie-2 수용체가 Ang2-유도 성상세포 세포사멸과 관련이 있는지 알아보기 위하여, HRMEC(human retinal microvascular endothelial cell) 및 성상세포에서 얻은 융해물에 대해 Tie-2 및 Tie-1에 대한 웨스턴 블랏 분석(도 5a) 및 실시간 PCR(도 5b)을 수행하였다. 종전 연구에서 나타난 바와 같이(Park SW, et al., Diabetes 2014; 63; 3057?3068.; Lee J, et al., Sci Transl Med 2013; 5: 203ra 127), 성상세포는 Tie-2 또는 Tie-1을 발현하지 않았지만 HRMEC는 Tie-2 및 Tie-1을 발현하였다. Tie-2를 발현하는 HRMEC와 비교하여 성상세포는 FACS 분석에서 Tie-2를 발현하지 않았다(데이타는 나타나있지 않음). 다음으로, 인테그린이 고포도당 조건에서 성상세포 세포사멸에서 Ang2에 대한 수용체로 작용하는지를 알아보기 위하여, 고포도당 조건에서 Ang2 및 H-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-OH (GRGDS) 펩타이드와 함께 성상세포를 배양하였다. GRGDS (0.5 mg/ml)는 Ang2-유도 β-카테닌 인산화를 약화시켰다(도 5c). 이러한 결과는 인테그린 시그널링이 Ang2-유도 β-카테닌 인산화에 관여한다는 것을 나타낸다.

다음으로, 고포도당이 인테그린의 발현 패턴을 변화시키는지 알아보기 위하여, 성상세포에서 발현되는 것으로 알려진 αv, β3, 및 β5에 대하여 정량적 RT-PCR 및 웨스턴 블랏 연구를 수행하였다. 성상세포는 주로 αv 및 β5 인테그린을 발현하였고, 흥미롭게도 고포도당 조건은 β5-인테그린 발현을 증가시켰다(도 5d). 비록 고포도당이 48시간 동안 ITGαv (도 5e), ITGβ3 (도 5f) mRNA 수준을 증가시키지 않았지만, ITGβ5 mRNA 수준을 상당히 증가시켰다(P= 0.002 by one-way ANOVA, 24 h: 1.24±0.04-fold; P<0.05 및 48 h: 1.41±0.00-fold, P= 0.002 by post hoc test, respectively; 도 5g).

한편, 고포도당은 ITGβ8 mRNA(0.72±0.01-fold for 48 h, P<0.01)를 감소시켰다. 또한 αv가 β5에 대한 독점적 파트너이므로 Ang2가 인테그린 αvβ5로 직접 결합하는 것을 규명하고자 하였다. 그 결과 공동-면역침전 분석법에서 Ang2가 인테그린 αvβ5에 직접 결합하는 것으로 나타났다(도 5h). 이러한 결과는 성상세포에서 Ang2에 대한 수용체로써 인테그린 αvβ5가 고포도당 조건에 의해 증가된다는 것을 나타낸다.

실시예 6. αvβ5 인테그린 억제에 의한 Ang2에 의해 유도된 성상세포 세포사멸이 저해 효과

인테그린 서브유닛에 의해 Ang2-유도 성상세포 세포사멸이 일어나는지를 알아보기 위하여, 인테그린 α 서브유닛(α1-6 및 αv)를 스크리닝하였다. 인테그린 α3- 및 αv-블락킹 항체가 Ang2-유도 β-카테닌 인산화를 약화시켰다(도 6a). 인테그린 복합체를 더 상세히 조사하기 위하여, 인테그린 α3-, αv-, 및 β1-블락킹 항체를 실험하였다. 인테그린 αv-블락킹 항체만이 Ang2-유도 β-카테닌 분해를 상당히 저해하였다(도 6b 및 d). 실제로 인테그린 α3- 및 β1-블락킹 항체는 Ang2-유도 성상세포 세포사멸에 영향을 미치지 않았다(도 6c 및 e). 따라서 αv 및 이에 대응하는 서브유닛인 β3 및 β5로 대상을 좁혔다. αvβ3- 및 αvβ5-인테그린-블락킹 항체에 대해서도 동일한 실험 절차를 수행하였고, αvβ5 인테그린을 블락킹 할때만 Ang2-유도 β-카테닌 분해는 저해되었다(도 6f). 또한 αvβ5 인테그린을 억제하면 Ang2-유도 성상세포 세포사멸이 효과적으로 감소하였다(19.3±1.4% from 25.2±1.2%, P<0.05; 도 6g). 이러한 결과는 αvβ5 인테그린을 저해하면 성상세포의 세포사멸을 감소시킬 수 있음을 나타낸다.

실시예 7. αvβ5 인테그린의 저해에 의한 당뇨망막증에서 성상세포 손실 감소 효과

상기 인 비트로 실험에 근거하여, 다음으로 STZ 유도 후 2주째에 1㎍의 항-αvβ5-인테그린 항체를 당뇨 마우스 유리체내에 주입하였다. 유리체내 주입 후 1주일 후에 망막을 분리하여 성상세포를 측정하기 위하여 GFAP로 염색하였다(도 7a). 인 비보에서, 대조군으로서 PBS를 주입한 당뇨 마우스에서의 성상세포 손실(53.1±8.6%, P=0.003; 도 7b)과 비교하여 항-αvβ5-인테그린 항체를 유리체내로 주입하였을 때 당뇨 망막에서 성상세포 손실이 효과적으로 감소하였다(128.3±16.4%). 이러한 인 비보 데이터를 통해 성상세포 손실은 당뇨 망막에서 αvβ5 인테그린을 통해 일어난다는 것을 알 수 있다.

종합하면, 당뇨 망막에서 αvβ5 인테그린을 통해 Ang2가 성상세포 세포사멸을 유도하고, GSK-3β-특이적 저해제가 상기 세포사멸을 방지한다는 것을 입증하였다. 즉. GSK-3β를 저해하는 것이 당뇨병성 망막증의 치료타겟이 되며, 특히 인테그린 αvβ5가 Ang2-유도 성상세포 세포사멸의 치료 타겟이 된다는 것을 본원에서 밝혔다. 즉 Ang2/인테그린 시그널링을 저해하면 당뇨병성 망막증에서 일어나는 성상세포 손실 및 혈관 누수를 방지할 수 있다.

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims (10)

1. 안지오포이어틴-2(Ang2) 및 인테그린 αvβ5 단백질을 제공하는 단계;
   상기 안지오포이어틴-2 및 인테그린 αvβ5 단백질의 상호작용을 억제할 것으로 기대되는 시험물질과 상기 단백질을 접촉시키는 단계; 및
   상기 안지오포이어틴-2 및 인테그린 αvβ5 단백질의 상호작용을 검출하는 단계로, 상기 시험물질과 접촉하지 않은 대조군과 비교하여 상기 시험물질과 접촉되어 상기 안지오포이어틴-2 및 인테그린 αvβ5 단백질의 상호작용이 감소된 경우, 상기 시험물질을 안지오포이어틴-2 및 인테그린 αvβ5 단백질간 상호작용을 억제하는 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, 당뇨병성 망막증 치료용 물질을 스크리닝하는 방법.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 인테그린 αvβ5 단백질은 이를 발현하는 세포의 형태로 제공되는 것인, 방법.
   
3. 안지오포이어틴-2(Ang2) 및 인테그린 αvβ5 단백질을 제공하는 단계;
   상기 안지오포이어틴-2 및 인테그린 αvβ5 단백질의 상호작용을 억제할 것으로 기대되는 시험물질과 상기 단백질을 접촉시키는 단계; 및
   상기 안지오포이어틴-2 및 인테그린 αvβ5 단백질의 상호작용을 검출하는 단계로, 상기 시험물질과 접촉하지 않은 대조군과 비교하여 상기 시험물질과 접촉되어 상기 안지오포이어틴-2 및 인테그린 αvβ5 단백질의 상호작용이 감소된 경우, 상기 시험물질을 안지오포이어틴-2 및 인테그린 αvβ5 단백질간 상호작용을 억제하는 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, 당뇨병이 발생한 망막 조직의 성상세포의 세포사멸 억제용 물질을 스크리닝하는 방법.
   
4. 제 3 항에 있어서, 상기 인테그린 αvβ5 단백질은 이를 발현하는 세포의 형태로 제공되는 것인, 방법.
   
5. 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 안지오포이어틴-2(Ang2) 및 인테그린 αvβ5 단백질간의 상호작용의 억제 측정은 상기 αvβ5를 발현하는 세포에서 GSK (Glycogen synthase kinase)-3β-β-카테닌 경로가 억제되는지 여부로 측정되는 것인, 방법.
   
6. 삭제
7. 삭제
8. 인테그린 αvβ5와 Ang2의 상호작용을 억제하는 물질의 존재하에서 성상세포를 배양하여, 상기 세포에서 GSK-3β-β-카테닌 경로를 억제하는 단계를 포함하는, 인비트로 또는 인간을 제외한 동물에서 성상세포 사멸 억제 방법.
   
9. 인테그린 αvβ5와 Ang2의 상호작용을 억제하는 물질의 존재하에서 성상세포를 배양하여, 상기 세포에서 GSK-3β-β-카테닌 경로를 억제하는 단계를 포함하는, 인비트로 또는 인간을 제외한 동물의 망막 조직의 성상세포에서 GSK-3β-β-카테닌 경로를 억제하는 방법.
   
10. 세포에서 Ang2의해 조절되는 GSK (Glycogen synthase kinase)-3β/β-카테닌 경로를 조절하는 물질을 스크리닝하는 방법으로, 상기 방법은
    상기 세포에 Ang2, αvβ5, GSK (Glycogen synthase kinase)-3β 및 β-카테닌을 발현하는 단계;
    상기 세포를 시험물질과 접촉하는 단계; 및
    상기 세포에서 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 처리 결과 GSK (Glycogen synthase kinase)-3β의 탈인산화가 증가하고, 상기 β-카테닌의 인산화가 증가되는 경우, 상기 시험물질을 GSK (Glycogen synthase kinase)-3β/β-카테닌 경로를 활성화시키는 물질로 판단하거나; 또는 상기 세포에서 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 처리 결과 GSK (Glycogen synthase kinase)-3β의 탈인산화가 감소하고, 상기 β-카테닌의 인산화가 감소되는 경우, 상기 시험물질을 GSK (Glycogen synthase kinase)-3β/β-카테닌 경로를 억제하는 물질로 판단하는 단계를 포함하는, 방법.

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