KR20060079258A - 항-ＥｒｂＢ２ 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명의 항-ErbB2 항체는 ErbB2의 도메인 1의 에피토프에 결합하고, 세포자멸을 통하여 세포사멸을 유도한다. 상기 항체의 다양한 용도가 본 발명에 포함된다.

ErbB2, 도메인 1, 에피토프, 세포자멸(apoptosis), 항-ErbB2 항체

Description

항-ＥｒｂＢ２ 항체{Anti-ErbB2 Antibodies}

도 1A 및 1B는 각각 세포에 대한 세포자멸의 효과 및 세포자멸을 검출하는 방법을 도시한 것이다. 도 1A는 프로그램된 세포 사멸 (세포자멸)을 받은 세포에 발생하는 생리적 변화를 도시한 것이다. 도 1B는 원형질막의 내부 소엽으로부터 세포 외부로의 포스파티딜 세린(PS)의 이동을 도시한 것이다. 아넥신 V는 PS에 특이적으로 결합하여 세포자멸의 측정 수단을 제공한다.

도 2는 항-ErbB2 항체의 에피토프 특이성을 도시한 것이다. MAb는 7C2의 BT474 세포에 대한 결합을 차단하기 위해 사용하였다. 항-ErbB2 항체 50 ㎍으로 (빙상에서 15분) 예비처리되거나 비처리된 BT474 세포 (0.5 x 10⁶)를 2회 세척하고, 1% FBS/PBS 0.1 ml 중에 현탁시키고 플루오레세인이소티오시아네이트 (FITC) 접합된 7C2 항체와 함께 인큐베이션하였다 (빙상에서 15분). 인큐베이션 후에, 세포 현탁액을 1% FBS/PBS로 2회 세척하여 결합하지 않은 플루오로크롬을 제거하고, 1% 파라포름알데히드/PBS로 고정시키고 유동 세포 측정법에 의해 분석하였다.

도 3A 내지 3D는 ErbB2를 과다발현하는 인간 유방암 세포에 대한 항-ErbB2 항체의 효과를 도시한 것이다. 수확시에 정상 막 기능을 갖는 세포("생존" 세포)는 DNA 염료 7AAD를 차단하고, 막 투과 처리에 Hoechst로 우선적으로 염색된다. 이들 세포에 대한 분석은 세포 주기의 G₀/G₁기 (주피크) 및 S-G₂-M기 (이중 화살표로 나타냄)의 세포에서 최고의 DNA 프로필 (우측 패널)을 보인다. 중앙 패널에서, 화살표로 나타낸 세포 집단은 죽은 세포를 나타내고, 그 일부는 수확시에 비정상적인 투과 특성을 갖고 그의 핵 DNA를 분해하였다. 4 x 10⁴ BT474 세포/ml을 이소형 매치 대조군 Ig (도 3A), 단클론 항체 4D5 1㎍ (도 3B), 단클론 항체 7C2 50 ㎍ (도 3C) 또는 4D5 항체 1 ㎍ + 7C2 항체 50 ㎍ (도 3D)를 함유하는 배지 중에서 72시간 인큐베이션시켰다. 죽은 세포의 비율은 중앙 패널에 나타내고(7AAD 형광물질 대 Hoechst 형광물질), 세포 주기의 S, G₂ 및 M기에서 생존 세포의 비율은 우측 패널에 나타내였다 (Hoechst 형광물질 대 세포 총수). 왼쪽 패널은 전방 및 직각 광 산란에 의해 측정한 세포의 크기를 도시한 것이다.

도 4A 및 4B는 DNA 합성에 대한 4D5 및 7C2 항체의 첨가 효과 및 BT474 세포의 생존성을 보여준다. 양 실험의 평균±S.D.을 도시하였다. 도 4A에서, 8 x 10³ 세포/0.2 ml/웰을 4D4 (0.05 ㎍/ml) 및(또는) 7C2 (50 ㎍/ml)로 72시간 동안 처리하고 마지막 12시간 동안 1μCi[³H]-티미딘으로 처리하였다 (3회). 도 4B에서, 세포 생존성의 경우, 세포 총수를 수득하고 생존성은 FACS 분석에 의해 측정하였다. 7C2 및 7C2 + 4D5 처리의 표준 편차는 두 경우 모두 너무 작아서 (1 x 10³ 세포) 도면에서 볼 수 없다.

도 5A 내지 5F는 BT474 유방암 세포에서의 항-ErbB2 MAb에 의한 세포자멸의 유도를 도시한 것이다. 도 5A, 5C 및 5E는 세포 크기의 지표인 전방 산란(FS) 대 log FITC (아넥신 V 결합을 의미)의 그래프를 도시한 것이다. 도 5B, 5D 및 5F는 log FITC 대 log 요오드화프로피듐(PI)의 4분할 그래프로서, 4분면의 4는 아넥신 V 양성 세포율을 나타내고, 4분면의 2는 아넥신 V/PI 양성 세포율을 나타낸다. 미처리 세포는 원내에서 알 수 있는 바와 같이 균일한 크기 및 형광 신호를 보이고, 생존율은 85%이다 (도 5A). 낮은 아넥신 V 결합을 보이는 것 외에, 이들 세포는 PI를 흡수하지 않으며, 이것은 막 통합성에 변화가 없음을 의미한다. 10 ㎍/ml MAb 7C2를 사용하여 3일간 처리한 결과 생존 세포 비율의 저하(25.3%까지, 도 5E), 세포의 거의 전체 군집의 보다 작은 FITC 양성 군집으로의 변화(도 5E)를 야기하였다. 도 5F에 도시한 바와 같이, MAb 7C2는 아넥신 V 양성/PI 양성 세포의 비율의 7 내지 8배 증가를 유도하고, 이것은 세포자멸성 세포 사멸을 의미한다. 항증식성 MAb인 4D5는 작은 정도의 세포자멸 (대조군의 2.5배, 도 5C 및 5D)을 유도한다.

도 6은 MAb 7C2의 효과가 투여량 의존성임을 보여준다. 아넥신 V 양성 및 PI 양성 세포의 숫자의 증가에 의해 측정된 바와 같은 MAb 7C2BT474 유방암 세포에서의 세포자멸의 유도는 0.1 ㎍/ml의 농도에서 분명히 나타나고 1 ㎍/ml에서 최대치에 도달한다.

도 7A 및 7B는 각각 BT474 및 SKBR3 유방암 세포에서의 MAb 7C2 유도 세포자멸의 시간 곡선이다. 10 ㎍/ml MAb 7C2를 사용한 BT474 세포 (도 7A) 및 SKBR3 세포 (도 7B)의 처리는 처리 개시 15분 후에 조기에 생존 세포(아넥신 V 및 PI 음성 세포)의 비율의 저하를 유도하고 24시간에서 최대치에 도달하였다. BT474 세포주 는 SKBR3 세포에 비해 MAb 7C2의 세포자멸 유도 효과에 보다 감수성이다.

도 8A 내지 8E는 항-ErbB2 MAb에 대한 상이한 세포주의 반응을 도시한 것이다. BT474, SKBR3 및 MCF7 유방암 세포주 및 정상 인간 유방 상피세포(HMEC) (각각 도 8A 내지 8D)를 항-ErbB2 MAb 4D5, 3H4, 7F3, 7C2, 2H11, 3E8 및 7D3; muMAb 4D5 (hu4D5)의 인간화 변형체; 또는 이소형-경쟁 무관 대조군 MAb 1766과 함께 인큐베이션하였다. 3일 동안 10 ㎍/ml의 MAb 농도에서 처리하였다. 데이타는 2 내지 9의 별개의 실험으로부터 취합하고, 대조군 세포에 대한 아넥신 V 결합의 평균 증가배수(±s.e.)로서 표시하였다. MAb 7C2 및 4D5에 대한 BT474 유방암 세포의 반응은 도 5에 도시하였다 (각각 대조군에 비해 9배 및 2.5배). 또한, BT474 세포와 유사한 ErbB2를 높은 수준으로 발현하는 SKBR3 유방암 세포주에서의 세포자멸의 유도가 MAb 7C2 처리 후에 발생한다 (MAb 4D5 처리시에는 보다 작은 정도로 발생). 또한, MAb 7F3는 BT474 및 SKBR3 세포주 모두에서 세포자멸을 유도한다. 정상적인 ErbB2 수준을 발현하는 MCF7 유방암 세포 및 HMEC는 항-ErbB2 MAb 처리 후에 아넥신 V 결합의 변화를 보이지 않았다. 이러한 결과는 ErbB2의 발현이 항-ErbB2 MAb에 대한 반응에 요구된다는 것을 시사한다. 도 8E에서, ErbB2를 과다발현하는 작지않은 폐 선암 세포주 (Calu-3)는 항-ErbB2 MAb에 의한 세포자멸의 유도에 대해 시험하였다. 7C2 또는 7F3 처리는 아넥신 V의 결합을 증가시켰다.

도 9A 내지 9I는 세포 주기 진행 및 세소 사멸에 대한 MAb 7C2 및 4D5의 효과를 도시한 것이다. 미처리 BT474 세포는 주로 아넥신 V 음성 및 PI 음성이고 (도 9A, 4분면의 3), 정상 세포 주기 DNA 히스토그램을 보여준다 (도 9B 및 9C). 10 ㎍/ml MAb 4D5로 처리된 세포는 PI 흡수 및 아넥신 V-FITC 결합의 증가를 보여준다 (도 9D, 4분면의 2). 대부분의 명백한 효과는 세포 주기 진행에 대한 것이고, MAb 4D5는 S기에서 세포의 비율을 거의 완전히 감소시킨다 (도 9E 및 F). MAb 7C2는 PI 흡수 및 아넥신 V-FITC 결합에 의해 측정된 바와 같이 상당한 양의 BT474 세포 사멸을 유도한다 (도 9G, 4분면의 2). 세포 주기 분석은 서브-G₀/G₁ 또는 군집의 존재 (도 9I), 아넥신 V 결합의 높은 수준을 보이는 세포와 함께 세포자멸성 세포의 특성(도 9H, 4분면의 1)을 보인다.

도 10A 내지 9F는 도 9A 내지 9I의 DNA 히스토그램의 곡선 적합화 분석 결과이고, 대조군 세포 (61% S기 세포)에 비해 MAb 7C2 처리 후에 S기 세포 비율 (52%)의 거의 무변화를 보여주지만, MAb 4D5에 대한 반응에서 S기 세포의 숫자의 큰 감소(6%까지) (각각 도 10C, 10A 및 10B)를 보인다. 세포의 세포자멸성 군집에 대한 분석 (4분면의 2, 9A, D 및 G로부터의 아넥신 V/PI 양성 세포)은 전체 세포 군집에 비해 S기 세포의 비율에 차이를 보이지 않는다 (도 10D 대조군=55%; 도 10E MAb 4D5=7%; 도 10F MAb 7C2=56%). 또한, G₀/G₁ 및 G₂/M기는 아무런 변화를 보이지 않고(도 10A 및 D, B 및 E, C 및 F 비교), 이것은 세포가 모든 세포 주기에서 존재하고, MAb 유도 세포자멸성 세포 사멸이 세포 주기에 특이적이지 않다는 것을 나타낸다.

도 11A 및 B는 MAb 7C2 유도 세포자멸이 성장 정지에 의해 증강된다는 것을 보여준다. 세포 주기 연구로부터의 데이타 외에, 비데오 시간 경과 기록으로부터 일정 비율의 MAb 7C2 처리 세포는 계속 증식하지만 다른 세포는 세포자멸을 받는다는 것을 관찰하였다. 따라서, 세포 성장의 억제가 MAb 7C2의 세포자멸 유도 활성을 증가시키는지를 결정하기 위해 실험을 수행하였다. BT474 세포를 3일 동안 혈청 제거하여 세포 정지를 유도한 후, 10 ㎍/ml MAb 7C2 또는 4D5로 3일 동안 처리하여 세포 주기 효과 뿐만 아니라 생존성 (아넥신 V-FITC 결합 및 PI 흡수)를 분석하였다. 혈청 제거(0.1% FBS로 보충된 배지 중에서 인큐베이션에 의해)는 S기 세포의 비율을 33%로부터 (10% FBS 중에서) 10%로 (도 11A)로 감소된 것에 의해 알 수 있는 바와 같이 증식을 효과적으로 저하시킨다. MAb 4D5의 효능있는 항증식 활성은 이전의 성장 정지에 의해서 추가로 증가되지 않는다. MAb 7C2 처리 세포에서 혈청을 제거하고 제거하지 않은 상태에서 S기 세포의 비율은 대조군과 유사하였다. 도 11B는 혈청 고갈이 미처리 세포의 세포 생존성에 유해한 효과를 주지 않음을 보여준다. 그러나, 생존성은 일정 기간의 혈청 제거 후에 10 ㎍/ml MAb 4D5로 처리된 BT474 세포에서 55%로 저하된다. 또한, 10 ㎍/ml MAb 7C2로 성장 정지 세포를 처리하여 아넥신 V 음성 및 PI 음성 세포의 비율이 10%로 감소되기 때문에 전체 배양물을 거의 완전하게 제거한다.

도 12는 ErbB2의 도메인 1의 아미노산 서열 (서열 1)을 밑줄과 함께 도시한 것이다. 진한 아미노산은 결실 맵핑(mapping)에 의해 결정된 MAb 7C2 및 7F3에 의해 인식되는 에피토프, 즉 "7C2/7F3 에피토프" (서열 2)의 위치를 나타낸 것이다.

도 13은 절단(truncation) 변이체 분석 및 부위 특이적 변이에 의해 측정된 ErbB2의 세포외 도메인의 에피토프 맵핑을 도시한 것이다 (Nakamura et al., J. of Virology 67(10):6179-6191 (1993년 10월); Renz et al., J. Cell Biol. 125(6):1395-1406 (1994년 6월)). 세포자멸 유도 MAb 7C2 및 7F3는 수용체의 N 말단에서 에피토프에 결합하지만, 항증식성 MAb 4D5 및 3H4는 트랜스멤브레인 도메인에 인접하여 결합한다. 다양한 ErbB2-ECD 절단 또는 포인트 돌연변이체를 중합 효소 연쇄 반응 기술을 사용하여 cDNA로부터 제조하였다. ErbB2 변이체는 포유동물 발현 플라스미드에서 gD 융합 단백질로서 발현되었다. 상기 발현 플라스미드는 삽입된 cDNA의 하류에 위치한 SV40 종결 및 폴리아데닐화 신호를 갖는 사이토메갈로바이러스 프로모터/인핸서를 사용한다. 플라스미드 DNA를 사용하여 293S 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 1일 후에, 세포를 1% 투석된 태아 소 혈청 및 각각 25 μCi의 ³⁵S 메티오닌 및 ³⁵S 시스테인을 함유하는 메티오닌 및 시스테인 부재의 저 글루코스 DMEM 중에서 철야 대사적으로 표지시켰다. 상등액을 수거하고, ErbB2 MAb 또는 대조군 항체를 상등액에 첨가하여 4℃에서 2 내지 4시간 인큐베이션하였다. 복합체를 침전시키고 10 내지 20% 트리신 SDS 구배 겔에 적용하고 100 V에서 전기영동시켰다. 겔을 멤브레인 상에 전기 블로팅시키고 방사성사진술에 의해 분석하였다.

도 14A 내지 14E는 항-ErbB2 MAb의 효과가 에피토프 특이적이라는 것을 보여준다. 항-ErbB2 MAb의 항증식성 또는 세포자멸 유도 효과가 에피토프 특이성에 관련되는지를 결정하기 위해서, BT474 세포를 4종의 상이한 MAb로 3일 동안 처리하고 세포 주기 분석을 위해 Hoechst 33342로 염색하였다. MAb는 ErbB2 세포외 도메인 상의 아미노산 22 내지 53 (서열 2)에 결합하는 7C2 및 7F3 (각각 도 14B 및 C); 서열 529 내지 625 (서열 4) (도 14D)에 결합하는 4D5; 및 아미노산 541 내지 599 (서열 3) (도 14E)에 결합하는 3H4이었다. 7C2 및 7F3는 모두 세포자멸을 유도하지만(각각 세포 군집의 60.5% 및 53.4%까지), 미처리 세포(52.5%, 도 14A)에 비해 S기 세포 (각각 64.9% 및 58.7%)의 비율을 감소시키지 않았다. 이와 대조적으로, ErbB2 트랜스멤브레인 영역에 인접하여 결합하는 MAb 4D5 및 3H4는 효능있는 항증식 활성을 보이지만(각각 %S=5.4 및 10.5, 대조군 S=52.5%), 세포자멸성 세포 사멸시에 7C2 또는 7C2만큼 효과적이지 않다 (세포자멸율: 4D5=41.9, 3H4=26.3, 대조군=15.8%).

도 15는 실시예 3에서 측정되는 바와 같이 SKOV3 난소 선암 세포주에서의 항-HER2 MAb 7C2에 의한 세포자멸의 유도를 도시한 것이다.

도 16은 항-HER2 MAb와의 조합 처리에서 항-HER2 MAb 7C2가 항-HER2 MAb 4D5 투여 전에 투여되는 경우 (실시예 3 참조) BT474 유방암 세포에 대한 세포자멸 효과의 증가시킨다는 것을 보여준다.

도 17은 실시예 4에서 설명되는 바와 같이 무모 마우스에서 항-HER2 MAb 단독 투여 또는 BT474M1 이종이식편(xenograft)의 평균 종양 부피(mm³)±1 s.e.과 조합 투여의 효과를 보여준다. 항체는 6일차에 시작하여 주당 2회 투여된다.

본 발명은 일반적으로 ErbB2 수용체에 결합하는 항체에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 ErbB2의 도메인 1 내의 에피토프에 결합하여 세포자멸(apoptosis)를 통한 세포 사멸을 유도하는 항-ErbB2 항체에 관한 것이다.

세포 성장 및 분화를 조절하는 신호 전달은 다양한 세포 단백질의 인산화에 의해 부분적으로 조절된다. 단백질 티로신 키나제는 상기 과정에 관여하는 효소이다. 수용체 단백질 티로신 키나제는 세포내 기질의 리간드-자극 티로신 인산화를 통한 세포 성장을 지시하는 것으로 생각된다. 성장 인자 수용체 단백질 티로신 키나제의 클래스 I 아군은 erbB1 유전자에 의해 코딩되는 170 kDa 상피 성장 인자 수용체(EGFR)을 포함한다. erbB1은 인간 종양에 관련된다. 특히, 상기 유전자의 발현 증가는 유방, 방광, 폐, 두부, 목 및 위의 암종에서 관찰되었다. EGRF에 대한 모노클로날 (단클론) 항체는 상기 종양의 치료제로 평가되었다 [예를 들어 Baselga et al., Pharmac. Ther. 64:127-154 (1994) 및 Masui et al., Cancer Research 44:1002-1007 (1984) 참조].

문헌 [Wu et al., J. Clin. Invest. 95:1897-1905 (1995)]에는 항-EGFR 단클론 항체 (mAb) 225 (경쟁적으로 EGF 결합을 억제하고 상기 수용체의 활성화를 차단함)가 인간 결장직장암 세포주 DiFi(EGFR을 높은 수준으로 발현함)의 G1 세포 주기 정지 및 프로그램된 세포 사멸(세포 자멸)을 유도할 수 있다고 보고되었다. IGF-1 또는 고농도의 인슐린 첨가는 mAb 225에 의해 유도되는 세포자멸을 지연시킬 수 있지만, G1 정지는 IGF-1 또는 인슐린의 첨가에 의해 전환시킬 수 없었다.

클래스 1 아군의 제2 구성원 p185^neu는 본래 화학적으로 처리된 쥐의 신경아세포로부터의 형질전환 유전자의 생성물로서 동정되었다. neu 전발암 유전자 (protooncogene)의 활성화된 형태는 코딩된 단백질의 트랜스멤브레인 영역에서의 포인트 돌연변이 (발린의 글루탐산으로의 변이)에 기인한다. neu (erbB2 또는 HER2로 칭해짐)의 인간 상동체의 증폭은 유방 및 난소암에서 관찰되었고 빈약한 예후와 밀접한 관련이 있다 [Slamon et al., Science, 235:177-182 (1987); 및 Slamon et al., Science, 244:707-712 (1989)]. 따라서, Slamon 등의 미국 특허 제4,968,603호에는 종양 세포에서 erbB2 유전자 증폭 및 발현을 측정하기 위한 다양한 진단 방법이 기재되어 있다. 현재까지, neu 전발암 유전자와 유사한 포인트 돌연변이가 인간 종양에 대해서는 보고되지 않았다. 또한, erbB2의 과다발현(증폭에 의해 자주, 그러나 일정하지 않음)은 위, 자궁내막, 침선, 폐, 신장, 결장, 갑상선, 췌장 및 방광의 종양을 포함하여 다른 종양에서도 관찰되었다 [King et al., Science, 229:974(1985); Yokota et al., Lancet: 1:765-767 (1986); Fukushigi et al,, Mol Cell Biol., 6:955-958(1986); Geurin et al., Oncogene Res., 3:21-31 (1988); Cohen et al., Oncogene, 4:81-88 (1989); Yonemura et al., Cancer Res., 50:421-425 (1990); Kern et al., Cancer Res. 50:5184(1990); Park et al., Cancer Res., 49:6605(1989); Zhau et al., Mol. Carcinog., 3:354-357 (1990); Aasland et al., Br. J. Cancer 57:358-363(1988); Williams et al., Pathiobiology 59:46-52(1991); 및 McCann et al., Caner, 65:88-92(1990) 참조].

쥐 neu 및 인간 erbB2 단백질 생성물에 대한 항체가 문헌에 기재되었다. 문헌[Drebin et al., Cell 41:695-706 (1985)]는 쥐 neu 유전자 생성물에 대해 작용하는 IgG2a 단클론 항체를 언급하였다. 7.16.4로 불리는 이 항체는 B104-1-1 세포(neu 전발암 유전자로 형질감염된 NIH-3T3 세포)에 대한 세포 표면 p185 발현의 하향 조절(down-modulation)을 야기하고, 이들 세포의 콜로니 형성을 억제한다. 상기 문헌의 699면에는 상기 항체가 연질 아가 내의 neu 형질전환된 세포에 대해 비가역적 세포독성 효과보다는 세포 정지 효과를 갖는다고 기재되어 있다. 문헌[Drebin et al. PNAS (USA) 83:9129-9133 (1986)]에서, 7.16.3 항체는 무모(nude) 생쥐에 이식된 쥐 신경아세포 (이로부터 neu 발암유전자가 처음 단리됨) 뿐만 아니라 neu 형질전환된 NIH-3T3 세포의 종양원성 성장을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 문헌[Drebin et al., Oncogene 2:387-394 (1988)]에는 쥐 neu 유전자 생성물에 대한 일군의 항체 생성을 논의하였다. 상기 모든 항체는 연질 아가에 현탁된 neu 형질전환된 세포의 성장에 대해 세포 정지 효과를 보이는 것으로 밝혀졌다. IgM, IgG2a 및 IgG2b 이소형의 항체는 보체의 존재 하에 neu 형질전환된 세포의 상당한 시험관내 용균을 매개할 수 있지만, 상기 항체 어느 것도 neu 형질전환된 세포의 항체 의존성 세포의 세포 독성 (ADCC)의 높은 수준을 매개할 수 없었다. 문헌[Drebin et al., Oncogene 2:273-277 (1988)]은 p185 분자 상의 2개의 상이한 영역과 반응성인 항체의 혼합물이 무모 마우스에 이식된 neu 형질전환된 NIH-3T3 세포에 대해 상승적 항종양 효과를 야기한다고 보고하였다. 항-nue 항체의 생물학적 효과는 문헌[Myers et al., Meth. Enzym. 198:277-290 (1991) 및 1994년 10월 1일 공개된 국제 특허 출언 공개 제WO94/22478호]에 보고되었다.

문헌[Hudziak et al., Mol. Cell. Biol. 9(3):1165-1172 (1989)]에는 인간 유방암 세포주 SKBR3을 사용하여 특성화한 일군의 항-ErbB2 항체의 생성이 기재되어 있다. 상기 항체에 노출시킨 후 SKBR3 세포의 상대적 세포 증식은 72시간 후에 단일층의 크리스탈 바이올렛 염색에 의해 측정하였다. 상기 분석을 사용하여 세포 증식을 56% 억제하는 4D5로 불리는 항체를 사용하여 최대 억제를 얻었다. 7C2 및 7F3를 포함하여 상기 군의 다른 항체는 상기 분석에서 보다 작은 정도로 세포 증식을 저하시켰다. 상기 문헌에서는 SKBR3 세포가 배지로부터 항체의 제거 후에 거의 정상 속도로 성장을 다시 시작하기 때문에 4D5 항체의 SKBR3 세포에 대한 효과가 세포독성이라기 보다는 세포정지성이라고 결론지었다. 항체 4D5는 또한 p185^erbB2 과다발현 유방 종양 세포주를 TNF-α의 세포 독성 효과에 감수성으로 만든다는 것이 밝혀졌다 (1989년 7월 27일 공개된 국제 특허 출원 공개 제W089/06692호 참조). 문헌[Hudziak et al.]에서 논의된 항-ErbB2 항체는 또한 다른 문헌[Fendly et al., Cancer Research 50:1550-1558 (1990); Kotts et al., In Vitro 26(3):59A (1990); Sarup et al., Growth Regulation 1:72-82 (1991); Shepard et al., J. Clin. Immunol. 11(3):117-127 (1991); Kumar et al., Mol. Cell. Biol. 11(2)979-986 (1991); Lewis et al., Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263 (1993); Pietras et al. Oncogene 9:1829-1838 (1994); Vitetta et al., Cancer Research 54:5301-5309 (1994); Sliwkowski et al., J. Biol. Chem. 269(20):14661-14665(1994); Scott et al., Chem. 266:14300-5(1991); 및 D'Souza et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91:7202-7206 (1994)]에서 특성화되었다.

문헌 [Tagliabue et al., Int. J. Cancer 47:933-937 (1991)]에는 ErbB2를 과다발현하는 폐 선암 세포주 (Calu-3)에 대한 반응성으로 선택되는 2개의 항체가 기재되었다. MGR3으로 불리는 항체 중의 하는 ErbB2를 인식하여 인산화를 유도하고 시험관내 종양 세포 증식을 억제한다.

문헌 [McKenzie et al., Oncogene 4:543-548 (1989)]은 TA1로 명명된 항체를 포함하여 에피토프 특이성이 상이한 일군의 항-ErbB2 항체를 기재하고 있다. 이 TA1 항체는 ErbB2의 세포내 흡수(endocytosis)의 촉진을 유도하는 것으로 밝혀졌다 (Maier et al., Cancer Res. 51:5361-5369 (1991) 참조). 문헌[Bacus et al. Molecular Carcinogenesis 3:350-362(1990)]은 TA1 항체가 유방암 세포주 AU-565 (erbB2 유전자를 과다발현함) 및 MCF-7 (erbB2 유전자를 과다발현하지 않음)의 성숙을 유도한다고 보고하였다. 상기 세포에서의 성장 및 성숙 표현형의 수득의 억제는 세포 표면에서의 ErbB2 수용체의 수준 저하 및 세포질에서의 일시적인 수준 증가와 관련되는 것으로 밝혀졌다.

문헌 [Stancovski et al., PNAS (USA) 88:8691-8695 91991)]은 일군의 항-ErbB2 항체를 생성시켜 무모 마우스에 복강내 주사하고 erbB2 유전자의 과다발현에 의해 형질전환된 무린 섬유아세포의 종양 성장에 대한 효과를 평가하였다. 상이한 수준의 종양 억제가 4개의 항체에서 검출되었지만, 항체 중의 하나 (N28)는 일관되게 종양 성장을 자극하였다. 단클론 항체 N28은 ErbB2 수용체의 상당한 인산화를 유도하였지만, 다른 4개의 항체는 일반적으로 낮은 인산화 유도 활성을 보이거나 전혀 보이지 않았다. 또한, SKBR3 세포의 증식에 대한 항-ErbB2 항체의 효과를 분석하였다. 상기 SKBR3 세포 증식 분석에서, 2개의 항체 (N12 및 N29)는 대조군에 비해 세포 증식의 저하를 야기하였다. 보체 의존성 세포독성 (CDC) 및 항체 매개 세포 의존성 세포독성 (ADCC)를 통한 시험관내 세포 용균을 유도하는 상이한 항체의 능력을 평가하고, 상기 문헌의 저자들은 항체의 억제 기능이 CDC 또는 ADCC 때문이 아니라고 결론지었다.

문헌 [Bacus et al., Cancer Research 52:2580-2589 (1992)]은 상기 문헌 [Bacus et al(1990) 및 Stancovski et al]에 기재된 항체를 특성화하였다. Stancovski 등의 복강내 연구를 확장하여, 인간 ErbB2를 과다발현하는 마우스 섬유아세포를 함유하는 무모 마우스 내로 정맥내 주사한 후 항체의 효과를 분석하였다. 초기 연구에서 관찰된 바와 같이, N28은 종양 성장을 촉진하지만, N12 및 N29는 ErbB2 발현 세포의 성장을 상당히 억제하였다. 또한, 부분적인 종양 억제가 N24 항체에서 관찰되었다. Bacus 등은 또한 MCF-7 (낮은 수준의 수용체 함유) 뿐만 아니라 인간 유방암 세포주 AU-565 및 MDA-MB453 (ErbB2를 과다발현)에서의 성숙 표현현을 촉진하는 항체의 능력을 시험하였다. Bacus 등은 체내 종양 억제와 세포 분화 사이의 관계를 파악하고, 종양 자극 항체 N28이 분화에 영향을 주지 않고, N12, N29 및 N24 항체의 종양 억제 작용은 상기 항체가 유도하는 분화의 정도와 밀접한 관련이 있다고 보고하였다.

문헌 [Xu et al., Int. J. Cancer 53:401-408(1993)]은 일군의 항-ErbB2 항 체의 에피토프 결합 특이성 뿐만 아니라 SKBR3 세포의 앵커리지 비의존성 및 앵커리지 의존성 성장을 억제하는 능력 (개개의 항체 및 항체의 조합에 의한), 세포 표면 ErbB2를 조절하는 능력 및 리간드 자극 앵커리지 비의존성 성장을 억제하는 능력을 평가하였다 (항-ErbB2 항체 조합물에 대해서는 1994년 1월 6일 공개된 국제 특허 출원 공개 제WO94/00136호 및 Kasprzyk et al., Cancer Research 52:2771-2776 (1992) 참조). 다른 항-ErbB2 항체는 문헌 [Hancock et al., Cancer Res. 5:4575-4580 (1991); Shawver et al. Cancer Res. 54:1367-1373 (1994); Arteaga et al. Cancer Res. 54:3578-3765 91994) 및 Harwerth et al., J. Biol. Chem. 267:15160-15167 (1992)]에서 논의되었다.

또한, erbB2에 관련된 다른 유전자, 소위 erbB3 또는 HER3도 문헌에 기술되었다 (미국 특허 제5,183,884 및 동 제5,480,968호 참조). ErbB3은 매우 작은 티로신 키나제 활성을 보이거나 전혀 갖지 않기 때문에 ErbB 수용체군 중에서 특이한 것이다. 그러나, ErbB3이 ErbB2와 함께 발현될 때, 활성 신호 전달 복합체가 형성되고 ErbB2에 대한 항체가 상기 복합체를 붕괴시킬 수 있다 (Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665 (1994)). 또한, 헤레굴린 (HRG)에 대한 ErbB3의 친화도는 ErbB2와 동시발현될 때 보다 높은 친화도 상태로 증가한다. 예를 들어, ErbB2-ErbB2 단백질 복합체에 대해서는 Levi et al., Journal of Neuroscience 15:1329-1340 91995); Morrissey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1431-1435 91995) 및 Lewis et al., Cancer Res., 56:1457-1465 (1996) 참조.

성장 인자 수용체 단백질 티로신 키나제의 클래스 I 아군은 추가로 HER4/p180^erbB4 수용체를 포함하도록 확장되었다 (유럽 특허 출원 제599,274호; Plowman et al., Plownman et al., Nature, 366:473-475 (1993) 참조). Plown 등은 HER4 발현 증가가 유방 선암을 포함하여 상피 기원의 특정 암종과 밀접한 관련이 있다는 것을 발견하였다. ErbB3과 같이 상기 수용체는 ErbB2와 활성 신호 전달 복합체를 형성한다 (Carraway and Cantley, Cell 78:5-8(1994)).

또한, ErbB2 활성화에 대한 탐구는 일군의 헤레굴린 폴리펩티드를 발견하였다. 이들 펩티드는 단일 유전자의 다른 스플라이싱에 의해 생성되는 것으로 보이고, 뉴로굴린(NGR), neu 분화 인자 (NDF), 헤레굴린(HRG), 신경교 성장 인자 (GGF) 및 아세틸콜린 수용체 유도 활성 (ARIA)으로 문헌에서 지칭된다. 예를 들어 Groenen et al., Growth Factors 11:235-257 (1994); Lemke, G. Molec. & Cell. Neurosci. 7:247-262 (1996) 및 Lee et al., Pharm. Rev. 47:51-85 (1995) 참조.

발명의 요약

본 발명은 적어도 부분적으로는 특정 항-ErbB2 항체가 세포자멸을 통하여 ErbB2 과다발현 세포 (예를 들어 BT474, SKBR3, SKOV3 또는 Calu 3 세포)의 사멸을 유도할 수 있다는 놀라운 발견에 관한 것이다. 문헌[Wu et al., J. Clin. Invest. 95:1897-1905 (1995)]에 기재된 세포자멸성 항-EGFR 항체와 달리, 본 발명의 항-ErbB2 항체는 오토크린 루프(autocrine loop)의 붕괴에 의한 세포자멸을 유도하지 않는 것으로 생각된다. 상기 세포 사멸 유도 특성을 갖는 상기 항체는 일반적으로 ErbB2의 세포외 도메인 내의 영역, 예를 들어 ErbB2의 도메인 1 내의 에피토프에 결합할 것이다. 바람직하게는, 항체는 본원에서 설명되는 7C2 및(또는) 7F3 항체에 의해 결합되는 ErbB2 에피토프에 결합할 것이다.

바람직한 항체는 단클론 항체, 예를 들어 인간화 항체이다. 특히 흥미로운 항체는 상기 특성 외에 약 10 nM, 바람직하게는 1 nM 이상의 친화도로서 ErbB2 수용체에 결합하는 것이다.

특정 실시형태에서, 항체는 예를 들어 수용체의 친화도 정제 또는 진단 분석을 위해 고체상에 (예를 들어 공유결합에 의해) 고정화된다. 진단 용도를 위해, 표지된 항체 (즉, 검출가능한 표지에 결합된 항체)를 제공하는 것이 유리할 수도 있다.

상기 설명한 항체는 항체 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 임의로는, 상기 조성물은 제2의 항-ErbB2 항체, 특히 본원에서 설명되는 7C2/7F3 항체가 결합하는 것과 상이한 ErbB2 수용체 상의 에피토프에 결합하는 항체를 추가로 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 제2 항체는 세포 배양시에 SKBR3 세포의 성장을 50 내지 100% 억제하는 것이다 (즉, 4D5 항체 및 그의 기능적 등가물). 치료 용도의 조성물은 멸균될 수 있고 동결건조될 수 있다.

또한, 본 발명은 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함하는 상기 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자; 발현 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포에 의해 인식되는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 상기 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터; 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포 (예를 들어 하이브리도마 세포주); 및 상기 핵산을 포함하는 세포를 배양하여 항-ErbB2 항체를 발현시키는 단계 및 임의로 숙주 세포 배양물, 바람직하게는 숙주 세포 배양 배지로부터 항체를 회수하는 단계로 이루어지는 항체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 본원에서 설명되는 항-ErbB2 항체를 사용하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 세포, 예를 들어 ErbB2를 과다발현는 암세포를 본원에서 설명되는 세포 사멸 유도 유효량의 항-ErbB2 항체에 노출시키는 단계를 포함하는 세포 사멸을 유도하는 방법을 제공한다. 상기 세포는 세포 배양 상태이거나 포유동물, 예를 들어 암에 걸린 포유동물 체내에 있을 수 있다. 본 발명은 또한 ErbB2를 과다발현하는 세포를 본원에서 설명되는 세포 사멸 유도 유효량의 외인성 항-ErbB2 항체를 상기 세포에 노출시키는 것을 포함하는 ErbB2를 과다발현하는 세포의 세포 자멸을 유도하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 본원에서 설명되는 제약상 유효량의 항-ErbB2 항체를 포유동물에게 투여하는 것으로 이루어지는, ErbB2 수용체의 과다발현이라는 특징을 갖는 질환으로 고통받는 포유동물의 치료 방법을 제공한다. 상기 방법에 따르면, 추가의 항-ErbB2 항체, 특히 본원에서 설명되는 7C2/7F3 항체가 결합하는 것과 상이한 ErbB2 에피토프에 결합하는 항체(예를 들어 도메인 1에 결합하지 않는 항체)를 사용할 수 있다. 한 실시형태에서, 제2 항체는 세포 배양시에 SKBR3 세포의 성장을 50 내지 100% 억제하고, 임의로 4D5가 결합하는 ErbB2 상의 에피토프에 결합한다.

후술되는 실시예 2에서, 세포사멸 유도 항체 7C2는 성장이 정지된 세포의 전체 배양물을 거의 완전히 제거하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 상기 설명한 시험관내 및 체내 방법에서 본원에서 설명되는 세포사멸 유도 항체를 성장 억제제와 함께 조합하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 높은 수준의 세포자멸은 세포자멸성 항-ErbB2 항체 투여 전에 성장 저해제를 투여함으로써 달성될 수 있다. 그러나, 동시 투여 또는 항-ErbB2 항체의 선투여도 고려될 수 있다.

또한, 본 발명은 항-ErbB2 항체를 보유하는 용기 및 항체가 암과 같은 ErbB2 과다발현이라는 특징을 갖는 질환의 치료에 사용될 수 있음을 나타내는 용기 상의 라벨 또는 용기와 함께 라벨을 포함하는 상기 체내 방법에 사용하기 위한 제품을 제공한다.

다른 특징으로, 본 발명은 항체를 ErbB2를 함유하는 것으로 추정되는 세포와 접촉시키는 단계 및 결합이 발생하였는지를 검출하는 단계로 이루어지는, 시험관내 또는 체내 ErbB2를 검출하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 세포를 본원에서 설명되는 항체에 노출시키는 단계 및 세포에 대한 항체의 결합 정도를 측정하는 단계로 이루어지는, ErbB2의 발현 증폭이라는 특징을 갖는 종양의 검출 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 분석에 사용되는 항체는 표지될 것이고, ErbB2를 검출하기 위해 항체를 사용하는 지시서와 함께 키트의 형태로서 공급될 것이다. 본원의 분석은 시험관내 분석(예를 들어 ELISA 분석) 또는 체내 분석일 수 있다. 체내 종양 진단을 위해, 항체는 방사성 동위원소에 결합되어 포유동물에게 투여되는 것이 바람직하고, 포유동물의 조직에 대한 항체의 결합 정도는 방사성에 대한 외부 스캐닝에 의해 검출된다.

1. 정의

다른 언급이 없는 한, 용어 "ErbB2"는 ErbB2 단백질을 의미하고, "erbB2"는 인간 erbB2 유전자를 의미한다. 인간 erbB2 유전자 및 ErbB2 단백질은 문헌[예를 들어 Swmba et al., PNAS (USA) 82:6497-6501) 및 Yamamoto et al., Nature 319:230-234(1986)]에 기재되어 있다 (Genebank 기탁 번호 X03363). ErbB2는 4개의 도메인 (도메인 1-4)을 포함한다. ErbB2의 세포외 도메인의 아미노 말단의 "도메인 1"은 도 12에 도시되었다 (Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1746-1750 (1993) 참조).

"에피토프 7C2/7F3"은 7C2 및(또는) 7F3 항체(각각 후술되는 바와 같이 ATCC에 기탁됨)가 결합하는 ErbB2의 세포외 도메인의 N 말단에 위치한 영역이다. 7C2/7F3 에피토프에 결합하는 항체를 스크리닝하기 위해서, 문헌[Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 바와 같은 통상의 교차 차단(cross-blocking) 분석을 수행할 수 있다. 별법으로, 에피토프 맵핑을 수행하여 (실시예 2 참조) 항체가 ErbB2 상의 7C2/7F3 에피토프(즉, ErbB2의 대략 잔기 22 내지 대략 잔기 53의 영역 내의 하나 이상의 잔기 (서열 2))에 결합하는지를 조사할 수 있다.

"에피토프 4D5"는 항체 4D5 (ATCC CRL 10463)가 결합하는 ErbB2의 세포외 도메인 내의 영역이다. 이 에피토프는 ErbB2의 트랜스멤브레인 영역에 가깝다. 4D5 에피토프에 결합하는 항체를 스크리닝하기 위해서, 문헌[Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 바와 같은 통상의 교차 차단 분석을 수행할 수 있다. 별법으로, 에피토프 맵핑을 수행하여 (실시예 2 참조) 항체가 ErbB2 상의 4D5 에피토프(즉, ErbB2의 대략 잔기 529, 예를 들어 대략 잔기 561 내지 대략 잔기 625의 영역 내의 하나 이상의 잔기 (서열 4))에 결합하는지를 평가할 수 있다.

용어 "세포 사멸의 유도"는 생존가능 세포를 비생존성으로 만드는 항체의 능력을 의미한다. "세포"는 ErbB2 수용체를 발현하는 세포, 특히 ErbB2 수용체를 과다발현하는 세포이다. ErbB2를 "과다발현"하는 세포는 동일한 조직형의 비암세포에 비해 통상의 수준보다 상당히 큰 ErbB2 수준을 갖는다. 바람직하게는, 세포는 암세포, 예를 들어 유방, 난소, 위, 자궁내막, 침선, 폐, 신장, 결장, 갑상선, 췌장 및 방광 세포이다. 시험관 내에서, 세포는 SKBR3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 또는 SKOV3 세포일 수 있다. 시험관내 세포 사멸은 항체 의존성 세포 독성 (ADCC) 또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)에 의해 유도되는 세포 사멸과 구별하기 위해 보체 및 면역 효과기 세포의 부재 하에 측정할 수 있다. 따라서, 세포 사멸 분석은 열 불활성화 혈청을 사용하여(즉, 보체의 부재 하에) 및 면역 효과기 세포의 부재 하에 수행될 수 있다. 항체가 세포 사멸을 유도할 수 있는지를 결정하기 위해서, 요오드화프로피듐(PI)(실시예 2 참조), 트리판 블루 (Moore et al., Cytotechnology 17:1-11 (1995) 참조) 또는 7AAD (실시예 1 참조)의 흡수에 의해 평가되는 막 통합성의 상실을 비처리 세포에 비교하여 평가할 수 있다. 바람직한 세포 사멸 유도 항체는 "BT474 세포에서 PI 흡수 분석"(하기 참조)에서 PI 흡수를 유도하는 항체이다.

문구 "세포자멸의 유도"는 아넥신 V의 결합, DNA의 단편화, 세포 수축, 소포체의 팽창, 세포 단편화 및(또는) 막 비지클(세포자멸체로 칭함)의 형성에 의해 측정되는 프로그램된 세포 사멸을 유도하는 항체의 능력을 의미한다 (도 1A 및 B 참조). 세포는 ErbB2 수용체를 과다발현하는 세포이다. 바람직하게는, "세포"는 종양 세포, 예를 들어 SKBR3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 또는 SKOV3 세포일 수 있다. 세포자멸에 관련된 세포 반응을 평가하기 위해 다양한 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 포스파티딜 세린(PS) 전이는 아넥신 결합(실시예 2 참조)에 의해 측정할 수 있고, DNA 단편화는 실시예 2에 기재된 바와 같이 DNA 래더링(laddering)을 통하여 평가할 수 있고, DNA 단편화와 함께 핵/크로마틴 농축은 저2배체(hypodiploid) 세포의 증가에 의해 평가할 수 있다. 바람직하게는, 세포자멸을 유도하는 항체는 "BT474 세포를 사용한 아넥신 결합 분석" (하기 참조)에서 미처리 세포에 비해 아넥신 결합을 약 2 내지 50배, 바람직하게는 약 5 내지 50배, 가장 바람직하게는 약 10 내지 50배 유도하는 항체이다.

때때로, 세포자멸 유도 항체는 ErbB2/ErbB3 복합체 (예를 들어 7F3 항체)의 HRG 결합/활성화를 차단하는 것이다. 다른 환경에서, 항체는 HRG에 의한 ErbB2/ErbB3 수용체 복합체의 활성화를 그다지 차단하지 않는 항체 (예를 들어 7C2)이다. 또한, 항체는 세포자멸을 유도하지만 S기 세포의 비율을 크게 저하시키지 않는 7C2와 같은 항체(예를 들어 도 10에서 측정된 바와 같이 대조군에 비해 상 기 세포의 비율을 단지 약 0 내지 10% 감소시키는 항체)일 수 있다.

본 발명에서 항체는 인간 ErbB2에 특이적으로 결합하고, erbB1, erbB3 및(또는) erbB4 유전자에 의해 코딩되는 것과 같은 다른 단백질과 그다지 교차반응하지 않는 7C2와 같은 항체이다. 때때로, 항체는 문헌[Schecter et al., Nature 312:513(1984) 및 Drebin et al., Nature 312:545-548(1984)]에 기재된 바와 같이 쥐 neu 단백질과 그다지 교차반응하지 않을 수 있다. 이러한 실시형태에서, 항체의 상기 단백질의 결합 (예를 들어 내인성 수용체에 대한 세포 표면 결합)의 정도는 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석 또는 방사성 면역 침전법 (RIA)에 의해 측정시에 약 10% 미만일 것이다.

"헤레굴린 (HRG)"은 ErbB2-ErbB3 및 ErbB2-ErbB4 단백질 복합체를 활성화시키는(즉, 부착시에 복합체 내의 티로신 잔기의 인산화를 유도하는) 폴리펩티드를 의미한다. 상기 용어에 포함되는 다양한 폴리펩티드는 문헌[Holmes et al., Science, 256:1205-1210(1992); WO92/20798; Wen et al., Mol. Cell. Biol., 14(3):1909-1919; 및 Marchionni et al., Nature, 362:312-318(1993)]에 기재되어 있다. 상기 용어는 천연 HRG 폴리펩티드의 생물학적 활성 단편 및(또는 변이체), 예를 들어 그의 EGF 유사 도메인 단편 (예를 들어 HRGβ1_177-244)를 포함한다.

"ErbB2-ErbB3 단백질 복합체" 및 "ErbB2-ErbB4 단백질 복합체"는 각각 ErbB2 수용체 및 ErbB3 수용체 또는 ErbB4 수용체의 올리고머에 비공유적으로 결합된다. 복합체는 이들 수용체 둘 모두를 발현하는 세포가 HRG에 노출될 때 복합체가 형성 되고 문헌[Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665(1994)]에 기재된 바와 같이 면역침전에 의해 단리되고 SDS-PAGE에 의해 분석될 수 있다.

"항체"(Ab) 및 "면역글로불린"(Ig)은 동일한 구조적 특성을 갖는 당단백질이다. 항체는 특이적인 항원에 결합 특이성을 보이지만, 면역글로불린은 항체 및 항원 특이성이 결여된 다른 항체 유사 분자를 모두 포함한다. 항체 유사 분자 종류의 폴리펩티드는 예를 들어 림프계에 의해 낮은 수준으로, 골수종 세포에 의해 증가된 수준으로 생성된다.

"천연 항체" 및 "천연 면역글로불린"은 일반적으로 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성되는 약 150,000 달톤의 헤테로테트라머의 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 디술피드 공유결합에 의해 중쇄에 연결되고, 디술피드 결합의 숫자는 상이한 면역글로불린 이소형의 중쇄 사이에서 변한다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는 규칙적으로 떨어진 사슬 내부의 디술피드 결합을 갖는다. 각각의 중쇄는 한 말단에 가변 도메인(V_H) 및 이 도메인에 후속하는 많은 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 한 말단에 가변 도메인(V_L) 및 다른 말단에 불변 도메인을 갖고, 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 대향 위치하고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 대향 위치한다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 생각된다.

용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체 사이에서 서열이 크게 상이하고 그 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다는 사실 을 의미한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 걸쳐 균일하게 분포되지 않는다. 가변성은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두의 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 초가변 영역으로 불리는 3개의 세그먼트에 집중된다. 가변 도메인의 보다 높은 보존 부분은 프레임워크(FR)로 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 β-시트 구조를 연결하는, 일부 경우에 β-시트 구조의 일부를 형성하는, 3개의 CDR에 의해 연결된 β-시트 배열을 주로 채택하는 4개의 FR 영역을 포함한다. 각 사슬 내의 CDR은 FR 영역에 의해 서로 매우 근접하게 유지되고, 다른 사슬의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다 (Kabat et al., NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pages 647-669 (1991) 참조). 불변 도메인은 항체의 항원 결합시에 직접 관여하지 않지만, 항체 의존적 세포 독성에서 항체의 참가와 같은 상이한 효과기 기능을 보인다.

항체의 파파인 분해는 2개의 동일한 항원 결합 단편, 소위 하나의 항원 결합 부위를 각각 갖는 "Fab" 단편, 및 그 이름이 쉽게 결정화되는 그의 능력을 반영하는 나머지 "Fc" 단편을 생성한다. 펩신 처리는 2개의 항원 결합 부위를 갖고 계속 항원을 교차 연결시킬 수 있는 F(ab')₂ 단편을 생성시킨다.

"Fv"는 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 단단하게 비공유결합된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 이것은 각각의 가변 도메인이 상호작용하여 V_H-V_L 이량체의 표면 상의 항원 결합 부위를 한정하는 배열로 존재한다. 집합적으로, 6개의 CDR은 항체에 대한 하원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 하나의 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 단지 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)의 경우에도 전체 결합 부위보다 친화성은 낮지만 항원을 인식하여 항원에 결합하는 능력을 갖는다.

또한, Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하여 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇개의 잔기의 첨가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 함유하는 Fab'를 의미한다. F(ab')₂ 항체 단편은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 몇쌍의 Fab' 단편으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 공지되었다.

임의의 척추동물종으로부터의 항체(면역글로불린)의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2개의 명백하게 상이한 종류 중의 하나로 분류될 수 있다.

중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 클래스로 분류될 수 있다. 면역글로불린에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개의 주요 클래스가 존재하고, 이들 중 몇개는 추가로 서브클래스(이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 분류될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스에 대응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε,γ 및 μ로 지칭된다. 면역글로불린의 상이한 클래스의 서브유닛 구조 및 3차원 배열은 잘 알려져 있다.

용어 "항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 완전한 단클론 항체, 다클론 항체, 2개 이상의 완전한 항체로부터 형성된 다특이성 항체 (예를 들어 이중특이적 항체), 및 요구되는 생물학적 활성을 보이는 항체 단편을 포함한다.

"항체 단편"은 완전한 항체의 일부, 바람직하게는 완전한 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, F(ab'), F(ab')₂, 및 Fv 단편, 디아바디(diabody), 선형 항체 (Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)), 단일쇄 항체 분자, 및 항체 단편으로부터 형성된 다특이성 항체를 포함한다.

용어 "단클론 항체"는 실질적으로 상동성인 항체의 군집으로부터 수득된 항체, 즉 소량 존재할 수 있는 자연발생 변이를 제외하고 군집을 구성하는 개개의 동일한 항체를 의미한다. 단클론 항체는 단일 항원 부위에 대해 작용하는 높은 특이성을 갖는다. 또한, 일반적으로 상이한 항원 결정자(에피토프)에 대해 작용하는 상이한 항체를 포함하는 통상의 (다클론성) 항체 제제와는 달리, 각각의 단클론 항체는 항원 상의 단일 항원 결정자에 대해서만 작용한다. 특이성 외에, 단클론 항체는 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않은 하이브리도마 배양에 의해 합성되기 때문에 유리하다. "단클론"은 실질적으로 상동성인 항체 군집으로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내고, 어떤 특정 방법에 의해 항체 생성을 요구하는 것으로서 해석되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단클론 항체는 문헌[Kohler et al., Nature, 256:49591975)]에 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법 (예를 들어 미국 특허 제4,816,567호 참조)에 의해 제조될 수 있다. "단클론 항체"는 또한 문헌 [예를 들어 Clackson et al., Nature, 352:624-628(1991) 및 Mark et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.

본원의 단클론 항체는 구체적으로 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래하거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 대응하는 서열과 동일하거나 상동성이고 사슬(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래하거나 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 대응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라(chimera)" 항체(면역글로불린) 및 요구되는 생물학적 활성을 보이는 이 항체의 단편을 포함한다(미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)).

비인간(예를 들어 무린) 항체의 "인간화" 형태는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 비인간 면역글로불린으로부터 유래한 최소 서열을 함유하는 그의 단편 (예를 들어 Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ 또는 항체의 다른 항원 결합 서열)이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용체(인간 면역글로불린)의 상보성 결정 영역 (CDR)로부터의 잔기가 마우스, 쥐 또는 토끼와 같은 비인간종(공여체 항체)의 CDR로부터의 잔기로 대체된, 요구되는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 인간 면역글로불린이다. 일부 경우, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR)은 대응하는 비인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용체 항체 또는 도입되는 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변이체는 추가로 정제하여 항체 성능을 최대화시킬 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 비인간 면역글로불린의 CDR 영역에 대응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역이 인간 면역글로불린 서열의 영역인 하나 이상, 일반적으로 2개의 가변 도메인 모두를 실질적으로 포함할 것이다. 또한, 인간화 항체는 적어도 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 일반적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역의 일부를 포함할 것이다 (Jones et al., Nature, 321:522-525(1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-329 91988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992) 참조). 인간화 항체는 항체의 항원 결합 영역이 목적 항원을 사용하여 짧은 꼬리 원숭이를 면역처리하여 생산된 항체로부터 유래된 PRIMATIZED(등록상표) 항체를 포함한다.

"단일쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 사슬 중에 존재하는 항체의 V_H 및 V_L 도메인을 포함한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합에 바람직한 구조를 형성하도록 하는 V_H 및 V_L 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 포함한다(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg 및 Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) 참조).

용어 "디아바디"는 동일한 폴리페티드 사슬 (V_H-V_L) 내의 경쇄 가변 도메인(V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H)을 포함하는, 2개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 의미한다. 동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이의 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용하여, 도메인을 다른 사슬의 상보성 도메인과 강제 로 페어링시켜 2개의 항원 결합 부위를 생성시킨다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097, WO93/11611 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)에 보다 상세하게 기재되어 있다.

"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 동정 및 분리 및(또는) 회수된 항체이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 항체는 (1) 로리 (Lowry) 방법에 의해 측정시 95 중량% 초과, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과의 항체로, (2) 스피닝 컵(spinning cup) 서열 결정 장치를 사용하여 N 말단 또는 내부 아미노산의 15 잔기 이상을 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루, 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질하게 정제될 것이다. 항체의 천연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에, 단리된 항체는 재조합 세포 내의 항체를 포함할 것이다. 그러나, 단리된 항체는 일반적으로 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

용어 "샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 체내 혈청 반감기를 증가시키는 기능을 수행하는 IgG 분자 (예를 들어 IgG₁, IgG₂, IgG₃ 또는 IgG₄)의 Fc 영역의 에피토프를 의미한다.

"치료"는 치료적 처리 및 예방적 또는 억제적 조치를 모두 의미한다. 치료를 필요로 하는 대상은 질환이 억제되어야 하는 대상 뿐만 아니라 이미 질환을 앓 고 있는 대상을 포함한다.

치료를 위한 "포유동물"은 인간, 가축, 및 동물원, 경기용 또는 애완 동물, 예를 들어 개, 말, 고양이, 소 등을 포함하여 포유동물로서 분류된 모든 동물을 의미한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.

"질환"은 항-ErbB2 항체를 사용한 치료에 의해 호전되는 모든 상태이다. 이것은 포유동물이 문제의 질환에 걸리게 하는 병리학적 상태를 포함하여 만성 및 급성 질환 또는 질병을 포함한다. 본원에서 치료되는 질환의 예는 양성 및 악성 종양, 백혈병 및 임파성 악성 질환, 신경, 신경교, 성상세포, 시상하부 및 다른 선, 마크로파지, 상피, 기질 및 포배강 질환, 및 염증성, 혈관형성 및 면역학적 질환을 포함하고, 이에 제한되지 않는다.

용어 "암" 및 "암성"은 비조절된 세포 성장이라는 특징을 갖는 포유동물의 생리학적 상태를 의미하거나 설명한다. 암의 예는 암종, 임파종, 아세포종, 육종 및 백혈병을 포함하고, 이에 제한되지 않는다. 상기 암의 보다 구체적인 예는 편평상피세포암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 위암, 췌장암, 신경교아세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암, 침선암종, 신장암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간암종 및 상이한 종류의 두부 및 목암을 포함한다.

용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 저해하거나 억제하고(하거나) 세포를 파괴시키는 물질을 의미한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어 I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰ 및 Re¹⁸⁶), 화학요법제 및 독소, 예를 들면 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성을 갖는 독소 또는 그의 단편을 포함하는 것으로 의도된다.

"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 이의 예는 아드리아미신, 독소루비신, 5-플루오로우라실, 시토신 아라비노시드 ("Ara-C"), 시클로포스파미드, 티오테파, 부술판, 시톡신, 탁솔, 톡솔테레, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 멜팔란, 빈블라스틴, 블레오마이신, 에토포시드, 이포스파미드, 미토마이신 C, 미톡산트론, 빈크레이스틴, 비노렐빈, 카르보플라틴, 테니포시드, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신, 에스페라미신 (미국 특허 제4,675,187호 참조), 멜팔란 및 다른 관련 질소 머스타드를 포함한다. 또한, 타목시펜 및 오나프리스톤과 같은 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 호르몬 제제도 상기 정의에 포함된다.

"성장 억제제"는 세포, 특히 ErbB2 과다발현 암세포의 시험관 내 또는 체내 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 따라서, 성장 억제제는 ErbB2 과다발현 세포의 S기 비율을 크게 감소시키는 물질이다. 성장 억제제의 예는 세포 주기 진행을 (S기 이외의 시기에서)차단하는 물질, 예를 들어 G1 정지 및 M기 정지를 유도하는 물질을 포함한다. 전통적인 M기 차단제는 빈카스 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁솔, 및 토포 II 억제제, 예를 들어 독소루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 브레오마이신을 포함한다. 또한, G1을 정지시키는 물질, 예를 들어 DNA 알킬화제, 예를 들어 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라 틴, 메톡트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 아라-C는 S기 정지에도 작용한다. 추가 정보는 문헌 [Murakami et al., The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., "Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" (WB Saunders: Philadelphia, 1995), Chapter 1, 특히 13면]에 기재되어 있다. 4D5 항체 (및 그의 기능성 등가물)도 상기 목적을 위해 사용할 수 있다.

"시토킨"은 하나의 세포 군집에 의해 방출되는, 세포내 매개제로서 다른 세포에 대해 작용하는 단백질의 일반 명칭이다. 이러한 시토킨의 예는 임포킨, 모노킨 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬이다. 시토킨에는 성장 호르몬, 예를 들어 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 파라티로이드 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신; 당단백질 호르몬, 예를 들어 난포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬(TSH) 및 황체 호르몬 (LH); 간 성장 인자; 섬유아세포 성장 인자; 프로락틴; 태반 락토겐 종양 괴사 인자-α 및 -β; 물레리안 억제 물질; 마우스 고나도트로핀 연합 펩티드; 인히빈; 악티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); 신경 성장 인자, 예를 들어 NGF-β; 혈소판 성장 인자; 변형 성장 인자 (TGF), 예를 들어 TGF-α 및 TGF-β; 인슐린 유사 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도 인자; 인터페론, 예를 들어 인터페론-α, -β 및 -γ; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어 마크로파지-CSF (M-CSF); 과립구-마크로파지-CSF(GM-CSF); 및 과립구-CSF(G-CSF); 인터루킨(IL), 예를 들어 IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; 종양 괴사 인자, 예를 들어 TNF-α 및 TNF-β; 및 LIF 및 키 트 리간드(KL)를 포함하여 다른 폴리펩티드 인자가 포함된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 시토킨은 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질 및 천연 서열 시토킨의 생물학적 활성 등가물을 포함한다.

용어 "전구약물"은 모 약물에 비해 종양 세포에 대한 세포독성이 작고 효소에 의해 활성화되거나 보다 활성인 모 형태로 전환될 수 있는 제약상 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 의미한다 (예를 들어 Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615the Meeting Belfast (1986) and Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp.247-267, Humana Press (1985) 참조). 본 발명의 전구약물은 인산염 함유 전구약물, 티오포스페이트 함유 전구약물, 황산염 함유 전구약물, 펩티드 함유 전구약물, D-아미노산 변형 전구약물, 글리코실화 전구약물, β-락탐 함유 전구약물, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드 함유 전구약물 또는 임의로 치환된 페닐아세트아미드 함유 전구약물, 5-플루오로시토신 및 보다 활성인 세포 독성 유리 약물로 전환될 수 있는 다른 5-플루오로우리딘 전구약물을 포함하고, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 사용하기 위한 전구약물 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예는 상기한 바와 같은 화학요법제를 포함하고, 이에 제한되지 않는다.

"표지"는 항체에 직접 또는 간접적으로 결합되어 "표지" 항체를 생성시키는 검출가능 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 자체로 검출가능하거나(예를 들어 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소 표지의 경우 검출가능한 기 질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매할 수 있다.

"고상"은 본 발명의 항체가 부착될 수 있는 비수성 매트릭스를 의미한다. 고상의 예는 부분적으로 또는 완전하게 유리 (예를 들어 세공 조절된 유리), 폴리사카리이드 (예를 들어 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알콜 및 실리콘을 포함한다. 특정 실시형태에서, 내용에 따라 고상은 분석 플레이트의 웰을 포함할 수 있다. 즉, 고상은 정제 컬럼 (예를 들어 친화도 크로마토그래피 컬럼)이다. 이 용어는 또한 미국 특허 제4,275,149호에 기재된 것과 같은 별개 입자의 비연속적 고상을 포함한다.

"리포좀"은 약물 (예를 들어 항-ErbB2 항체, 및 임의로 화학요법제)의 포유동물로의 전달에 유용한 다양한 형태의 지질, 인지질 및(또는) 계면활성제로 구성되는 작은 베시클이다. 리포좀의 성분은 통상 생물학적 막의 지질 배열과 유사한 2층 형성으로 배열된다. "단리된" 핵산 분자는 통상 항체 핵산의 천연 공급원에서 함께 결합되는 하나 이상의 오염 핵산 분자로부터 동정 및 분리된 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 상태가 아니다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 천연 상태로 존재하는 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 단리된 핵산 분자는 항체를 발현하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하고, 예를 들어 핵산 분자는 자연 세포의 핵산과 상이한 염색체내 위치에 존재한다.

표현 "조절 서열"은 특정 숙주에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 의미한다. 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열, 및 리보좀 결합 서열을 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아 데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계를 갖도록 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 프리서열 또는 분비 리더용 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프리단백질로서 발현된다면 폴리펩티드용 DNA에 작동가능하게 연결되거나, 프로모터 또는 인핸서는 코딩 서열의 전사에 영향을 끼친다면 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나, 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 촉진시키도록 위치한다면 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 바람직하게는, "작동가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 인접하고, 분비 리더의 경우에는 인접하고 해독 페이스로 존재한다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요가 없다. 연결은 용이한 제한 부위에 라이게이션에 의해 수행된다. 제한 부위가 존재하지 않는 경우에는, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 통상의 방법에 따라 사용한다.

"세포", "세포주" 및 "세포 배양"은 서로 대체 사용되고, 이러한 표현은 모두 자손을 포함한다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 모든 1차 대상 세포 및 이로부터 유도된 배양 세포를 몇대의 자손에 상관없이 포함한다. 또한, 모든 자손은 인공의 또는 우연한 돌연변이에 의해 DNA 함량에서 정확하게 동일하지 않을 수 있음을 알 수 있다. 처음 형질전환된 세포에서 스크리닝된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변이체 후손도 포함된다. 각각의 명칭이 의미하는 바는 본원의 기재내용으로부터 분명하게 알 수 있을 것이다.

II. 본 발명의 실시 양식

A. 항체 제조

이하에서 청구된 항체의 생산을 위한 예시적인 기술에 관하여 설명한다. 항체 생산에 사용되는 ErbB2 항원은 예를 들면, ErbB2의 세포외 도메인의 가용성 형태; 도메인 1 펩티드와 같은 펩티드 또는 그의 일부 (예를 들면, 7C2 또는 7F3 에피토프를 포함하는)일 수 있다. 별법으로, 세포 표면에서 ErbB2를 발현하는 세포 (예를 들면, ErbB2를 과다발현하도록 변형시킨 NIH-3T3 세포 {하기 실시예 1 및 2 참조} 또는 SKBR3 세포와 같은 종양 세포주 {문헌[스탄코브스키 (Stancovski) 등, PNAS (USA) 88: 8691-8695 (1991)] 참조)를 사용하여 항체를 생산할 수 있다. 항체를 생산하기 위해 유용한 ErbB2의 다른 형태는 당업계의 기술자에게 명백할 것이다.

(i) 다클론 항체

다클론 항체는 바람직하게는 관련 항원 및 보조제를 다수회 피하(sc) 또는 복강내(ip) 주사하여 동물 내에서 배양시킨다.

관련 항원을, 면역시키고자 하는 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들면, 키홀 삿갓조개(keyhole limpet) 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 타이로글로불린, 또는 대두 트립신 억제제에, 이관능성 또는 유도화제, 예를 들면, 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통해 결합), N-히드록시숙신이미드 (라이신 잔기를 통해), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl₂, 또는 R¹N=C=NR (여기에서, R 및 R¹은 상이한 알킬기이다)를 사용하여 결합시키는 것이 유용할 수 있다.

동물을 예를 들면, 100 ㎍ 또는 5 ㎍의 단백질 또는 결합물 (각각 토끼와 마 우스에 대해)을 3 부피의 프로인드(Freund's) 완전 보조제와 혼합하고, 용액을 다수 부위에 피내 주사함으로써 항원, 면역원성 결합물 또는 유도체에 대해 면역화시킨다. 1개월 후에, 동물을 원래의 양의 1/5 내지 1/10의 프로인드 완전 보조제 중의 펩티드 또는 결합물로 다수 부위에 피하 주사함으로써 부스팅시켰다. 7 내지 14일 후, 동물을 출혈시키고, 혈청을 항체 역가에 대해 분석하였다. 역가가 정체 (plateau)될 때까지 동물을 부스팅시킨다. 바람직하게는, 동물을 상이한 단백질에, 및(또는) 상이한 가교결합제를 통해 결합된 동일 항원의 결합물로 부스팅시킨다. 결합물은 또한 단백질 융합으로서 재조합 세포 배양에서 제조할 수 있다. 또한, 명반(alum)과 같은 응집제를 사용하여 면역 반응을 증진시킨다.

(ii) 단클론 항체

단클론 항체는 실질적으로 균질 항체의 집단으로부터 얻으며, 즉, 집단을 이루는 개별적인 항체들은 소량 존재할 수 있는 가능한 자연 변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 변형 "단클론"은 별개의 항체들의 혼합물이 아닌 항체의 특성을 지시한다.

예를 들면, 단클론 항체는 문헌[코흘러 (Kohler) 등, Nature, 256: 495 (1975)]에서 처음 기술된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있거나, 재조합 DNA 방법 (미국 특허 제4,816,567호)을 이용하여 제조할 수 있다.

하이브리도마 방법에서, 면역화를 위해 사용된 단백질에 충분하게 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 백혈구를 유도하도록 마우스, 또는 햄스터와 같은 다른 적절한 숙주 동물을 상기한 바와 같이 면역화시킨다. 별법으로, 백혈구를 시 험관 내에서 면역화시킬 수 있다. 이어서, 백혈구를 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다 [고딩 (Goding), Monoclonal Antibodies: Principle and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)].

이렇게 제조한 하이브리도마 세포를 바람직하게는 비융합 골수종 모세포의 성장 또는 생존을 억제시키는 1종 이상의 물질을 함유하는 적합한 배지 중에 접종하고 배양시킨다. 예를 들면, 골수종 모세포가 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 결핍된 경우, 하이브리도마용 배지는 전형적으로 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이며, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제시킨다.

바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 높은 수준의 안정한 생산을 지지하며, HAT 배지와 같은 배지에 감수성이 있는 것이다. 이들 중, 바람직한 골수종 세포주는 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center, 미국 캘리포니아주 샌디에고)로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11, 및 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, 미국 매릴랜드주 록빌)으로부터 입수가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포로부터 유래된 것과 같은 쥐 골수종 세포주이다. 사람 골수종 세포주 및 마우스-사람 헤테로골수종 세포주가 또한 사람 단클론 항체의 생산에 대해 기술되었다 [코즈보르 (Kozbor), J. Immunol., 133: 3001 (1984); 및 브로듀어 (Brodeur) 등, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)].

하이브리도마 세포가 성장하는 배지를 항원에 대해 유도된 단클론 항체의 생산에 대해 분석하였다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단클론 항체의 결합 특이성을 면역침강법에 의해, 또는 방사성면역분석법 (RIA) 또는 효소 결합 면역 흡수 분석법 (ELISA)과 같은 시험관내 결합 분석에 의해 측정하였다.

단클론 항체의 결합 친화도는 예를 들면, 먼슨 (Munson) 등 [Anal. Biochem., 107: 220 (1980)]의 스캐차드 (Scatchard) 분석에 의해 측정할 수 있다.

원하는 특이성, 친화도 및(또는) 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 제한 희석 절차에 의해 클론을 서브클로닝시키고 표준 방법 [고딩, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]으로 배양시켰다. 이러한 목적에 적합한 배지는 예를 들면, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수종양으로서 생체내 배양시킬 수 있다.

서브클론에 의해 분비된 단클론 항체는 예를 들면, 단백질 A-세파로즈 (Sepharose), 히드록시아파티트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피와 같은 통상의 면역글로불린 정제 절차에 의해 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리시킨다.

단클론 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 절차 (예를 들면, 쥐 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써)를 이용하여 쉽게 분리되고 서열결정된다. 하이브리도마 세포는 그러한 DNA의 바람직한 기원으로서 작용한다. 일단 분리되면, DNA는 발현 백터 내로 넣을 수 있고, 이어서, 그렇지 않으면 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 이. 콜리(E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 단클론 항체를 합성시킨다. 항체를 코딩하는 DNA의 세균에서의 재조합 발현에 대한 리뷰 문헌은 문헌[스케라 (Skerra) 등, Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993); 및 플뤼턴 (Plueckthun), Immunol. Revs., 130: 151-188 (1992)]을 포함한다.

다른 실시형태에서, 항체 또는 항체 단편을 문헌[맥카퍼티 (McCafferty) 등, Nature, 348: 551-554 (1990)]에 기술된 기법을 이용하여 생산된 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 문헌[클랙슨 (Clackson) 등, Nature, 352: 624-628 (1991) 및 막스 (Marks) 등, J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)]에서는 파지 라이브러리를 사용하는 쥐 및 사람 항체의 단리를 각각 기술하였다. 이후의 문헌에서는 체인 서플링(chain shuffling)에 의한 고친화도(nM 범위)의 사람 항체의 생산 [막스 등, Bio/Technology 10: 779-783 (1992)] 뿐만 아니라, 매우 큰 파지 라이브러리의 제조 전략으로서의 조합 감염 및 생체내 재조합 [워터하우스 (Waterhouse) 등, Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)]을 기술하였다. 따라서, 이들 기법은 단클론 항체의 단리를 위한 전통적인 단클론 항체 하이브리도마 기법과 병용가능한 방법이다.

DNA는 또한 예를 들면, 동종 쥐 서열 대신 사람 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환함으로써 (미국 특허 제4,816,567호; 문헌[모리슨 (Morrison) 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851 (1984)]), 또는 비면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전체 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유 결합시킴으로써 변형시킬 수 있다.

전형적으로 그러한 비면역글로불린 폴리펩티드는 항체의 불변 도메인에 대해 치환되거나, 항체의 한 항체-결합 부위의 가변 도메인에 대해 치환되어 항원에 특이성을 갖는 하나의 항체-결합 부위 및 상이한 항원에 특이성을 갖는 다른 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성시킨다.

(iii) 인간화 항체 및 사람 항체

비사람 항체를 인간화시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 바람직하게는, 인간화 항체는 비사람 기원으로부터의 그에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비사람 아미노산 잔기는 종종 "임포트(import)" 잔기로 부르며, 전형적으로 "임포트" 가변 도메인으로부터 취한다. 인간화는 사람 항체의 상응하는 서열 대신 설치류 CDRs 또는 CDR 서열로 치환함으로써 본질적으로 윈터 (Winter) 등의 방법 [존스 (Jones) 등, Nature, 321: 522-525 (1986); 리치만 (Riechmann) 등, Nature, 332: 323-327 (1988); 베르호옌 (Verhoeyen) 등, Science, 239: 1534-1536 (1988)]에 따라 수행할 수 있다. 따라서, 그러한 "인간화" 항체는 실질적으로 보다 적은 무손상 사람 가변 도메인이 비사람 종으로부터 상응하는 서열에 의해 치환된 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제, 인간화 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기를 설치류 항체에서 유사한 부위로부터의 잔기로 치환시킨 사람 항체이다.

인간화 항체를 제조하기 위해 사용되는 사람 가변 도메인 (경쇄 및 중쇄 도메인 모두)의 선택은 항원성을 감소시키기 위해 매우 중요하다. 소위 "베스트핏(best-fit)" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 공지의 사람 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 이어서, 설치류의 서열에 가장 근접한 사람 서열을 인간화 항체를 위한 사람 프레임워크(FR)로서 수용한다 [심스 (Sims) 등, J. Immunol, 151: 2296 (1993); 코티아 (Chothia) 등, J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)]. 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군의 모든 사람 항체의 인식 서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 사용한다. 몇종의 상이한 인간화 항체에 대해 동일한 프레임워크를 사용할 수 있다 [카터 (Carter) 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); 프레스타 (Presta) 등, J. Immnol., 151: 2623 (1993)].

항원에 대한 높은 친화도와 다른 양호한 생물학적 특성을 보유하면서 항체를 인간화시키는 것이 또한 중요하다. 이러한 목적을 이루기 위해, 바람직한 방법에 따라, 인간화 항체는 모서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하는 모서열과 다양한 구상되는 인간화 생성물의 분석 과정에 의해 제조한다. 3차원 면역글로불린 모델이 일반적으로 이용가능하고, 당업계의 기술자에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 배위 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 디스플레이를 점검하면 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기들의 유망한 역할을 분석할 수 있으며, 즉, 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 끼치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, 표 적 항원(들)에 대한 증가된 친화성과 같은 원하는 항체 특성을 성취하도록, 수여자 및 임포트 서열로부터 FR 잔기를 선택하고 결합시킬 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 영향을 끼치는데 직접적으로 및 가장 실질적으로 관여된다.

별법으로, 지금은 내인성 면역글로불린 생산의 부재하에 면역시 사람 항체의 완전한 레퍼터리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들면, 마우스)을 제조할 수 있다. 예를 들면, 키메라 및 생식세포주 돌연변이 마우스에서 항체의 중쇄 연결 영역 (J_H) 유전자를 동질적으로 삭제시키면 내인성 항체 생산의 완전히 억제시키는 것이 기술되었다. 사람 생식세포주 면역글로불린 유전자 배열을 그러한 생식세포주 돌연변이 마우스에 전달시키면 항원 챌린지시 사람 항체를 생산할 것이다. 예를 들면, 문헌[제이코보비츠 (Jakobovits) 등, Proc, Natl. Acad, Sci. USA, 90: 2551 (1993); 제이코보비츠 등, Nature, 362: 255-258 (1993); 브루거만 (Bruggermann) 등, Year in Immuno., 7: 33 (1993)] 참조. 사람 항체는 또한 파지-디스플레이 라이브러리로부터 유래될 수 있다 [후겐붐 (Hoogenboom) 등, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); 막스 등, J. Mol. Bio., 222: 581-597 (1991)].

(iv) 항체 단편

항체 단편을 생산하기 위한 다양한 기법이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 단백질의 단백질 분해성 소화에 의해 유래되었다 (예를 들면, 문헌[모리모토 (Morimoto) 등, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) 및 브렌난 (Brennan) 등, Science, 229: 81 (1985)]을 참조). 그 러나, 이들 단편은 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리시킬 수 있다. 별법으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜리로부터 직접 회수하고 화학적으로 결합시켜 F(ab')₂ 단편을 형성할 수 있다 [카터 (Carter) 등, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)]. 다른 방법에 따라, F(ab')₂ 단편을 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리시킬 수 있다. 항체 단편을 생산하기 위한 다른 기법은 숙련된 당업자에게 명백할 것이다. 다른 실시형태에서, 선택된 항체는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다. 국제 특허 공개 제WO 93/16185호 참조.

(v) 이중특이적 항체

이중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 항체이다. 예시적인 이중특이적 항체는 ErbB2 단백질의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 예를 들면, 하나의 아암은 7C2/7F3 에피토프과 같은 ErbB2의 도메인 1에서의 에피토프에 결합할 수 있고, 다른 하나의 아암은 상이한 ErbB2 에피토프, 예를 들면, 4D5 에피토프에 결합할 수 있다. 그러한 다른 항체는 ErbB2 결합 부위를 EGFR, ErbB3 및(또는) ErbB4에 대한 결합 부위(들)에 결합시킬 수 있다. 별법으로, 항-ErbB2 아암은 T-세포 수용체 분자와 같은 백혈구 상의 트리거링 분자 (예를 들면, CD2 또는 CD3), 또는 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)과 같은 IgG (FcγR)에 대한 Fc 수용체에 결합하는 아암과 결합시킬 수 있다. 이중특이적 항체는 ErbB2를 발현하는 세포에 세포독성제를 배치시키기 위해 사용할 수 있다. 이들 항체는 ErbB2-결합 아암 및 세포독성제 (예를 들면, 사포 린, 항-인터페론-α, 빙카 알칼로이드, 리신 A 사슬, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)과 결합하는 아암을 갖는다. 이중특이적 항체는 완전한 길이의 항체 또는 항체 단편 (예를 들면, F(ab')₂ 이중특이적 항체)으로서 제조할 수 있다.

이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 완전한 길이의 이중특이적 항체의 전통적인 제법은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시발현에 기초하며, 여기에서, 2개의 사슬은 상이한 특이성을 갖는다 [밀스타인 (Millstein) 등, Nature, 305: 537-539 (1983)]. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 구분으로 인해, 이들 하이브리도마 (쿠아드로마)는 10개의 상이한 항체 분자의 가능한 혼합물을 생산하며, 이중 하나만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 보통 친화도 크로마토그래피 단계로 수행되는 정확한 분자의 정제는 다소 번거롭고, 생성물 수율이 낮다. 유사한 절차가 국제 특허 공개 제WO 93/08829호 및 문헌[트라우네커(Traunecker) 등, EMBO J., 10: 3655-3659 (1991)]에 기재되어 있다.

다른 방법에 따라, 원하는 결합 특이성(항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체의 가변 도메인을 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 융합은 바람직하게는 힌지, CH2의 적어도 일부 및 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 사용한다. 경쇄 결합을 위해 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 융합물의 적어도 하나에 존재하는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합물, 및 원하는 경우 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터에 삽입하고, 적당한 숙주 유기체로 동시형질감염시킨다. 이렇게 하면 제작에 사용된 비동등한 비율의 3개의 폴리펩티드 사슬이 최적의 수율을 제공하는 경우 실시예에서 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 우수한 융통성을 제공한다. 그러나, 동등한 비율의 적어도 2개의 폴리펩티드 사슬의 발현이 높은 수율을 제공하는 경우 또는 비율이 특히 중요하지 않은 경우, 2개 또는 3개의 모든 폴리펩티드 사슬에 대한 코딩 서열을 하나의 발현 벡터 내에 삽입하는 것도 가능하다.

이 방법의 바람직한 실시형태에서, 이중특이적 항체는 한 아암에서 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄와 다른 아암에서 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성을 제공함)으로 이루어진다. 이중특이적 분자의 단지 1/2에서의 면역글로불리 경쇄가 손쉬운 분리 방식을 제공하므로, 이러한 비대칭 구조가 원하지 않는 면역글로불린 사슬 조합물로부터 원하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이 방법은 국제 특허 공개 제WO 94/04690호에 기술되어 있다. 이중특이적 항체를 생산하기 위한 보다 상세한 내용은 예를 들면, 문헌[수레쉬(Suresh) 등, Methods in Enzymmology, 121: 210(1986)] 참조.

국제 특허 공개 제WO 96/27011호에 기재된 다른 방법에 따라, 한 쌍의 항체 분자들 사이의 계면을 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 헤테로다이머의 백분율을 최대화하도록 유전공학적으로 처리할 수 있다. 바람직한 계면은 항체 불변 도메인의 C_H3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄 (예를 들면, 티로신 또는 트립토판)으로 치환시킨다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄 (예를 들면, 알라민 또는 트레오닌)로 치환시킴으로써 제2 항체의 계면 상에 큰 측쇄(들)에 동일하거나 유사한 크기의 보충적인 "공간"이 생성된다. 이렇게 하여 호모다이머와 같은 다른 원하지 않는 최종 생성물 보다 헤테로다이머의 수율을 증가시키는 기전을 제공한다.

이중특이적 항체는 가교결합된 또는 "헤테로결합" 항체를 포함한다. 예를 들면, 헤테로결합물 내의 항체 중 하나는 아미딘과 결합되고, 다른 하나는 비오틴과 결합될 수 있다. 그러한 항체는 예를 들면, 면역계 세포를 원하지 않는 세포에 표적화시키기 위해 (미국 특허 제4,676,980호), 및 HIV 감염의 치료를 위해 (국제 특허 공개 제WO 91/00360호, 동 제WO 92/200373호, 및 유럽특허 제EP03089호) 제안되었다. 헤테로결합 항체는 임의의 편리한 가교결합 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 적합한 가교결합제는 당업계에 공지되어 있고, 많은 가교결합 기법과 함께 미국 특허 제4,676,980호에 기술되어 있다.

항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 제조하는 기법은 또한 문헌에 기술되어 있다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 화학적 연결을 이용하여 제조할 수 있다. 문헌[브렌난(Brennan) 등, Science, 229: 81 (1985)]에서는 F(ab')₂ 단편을 제조하기 위해 무손상 항체를 단백분해적으로 절단시키는 절차를 기술하였다. 이들 단편은 디티올 착화제인 아비산나트륨의 존재하에 환원되어 인근(vicinal) 디티올을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지한다. 이어서, 생성된 Fab' 단편을 티오 니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 이어서, Fab'-TNB 유도체 중 하나를 머캅토에틸아민으로 환원시킴으로써 Fab'-티올로 재전환시키고, 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성한다. 생산된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정을 위한 제제로서 사용할 수 있다.

최근의 진보로 이. 콜리로부터 Fab'-SH 단편의 직접적인 회수가 용이해졌고, 이는 이중특이적 항체를 형성하도록 화학적으로 결합될 수 있다. 문헌[샐래비(Shalaby) 등, J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)]에서는 완전한 인간화 이중특이적 항체 F(ab')₂ 분자의 생산을 기술하였다. 각각의 Fab' 단편은 이. 콜리로부터 개별적으로 분비되고, 시험관 내에서 화학 결합시켜 이중특이적 항체를 형성한다. 이렇게 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과다발현하는 세포 및 정상 사람 T 세포에 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 사람 유방암 표적에 대해 사람 세포독성 림프구의 용해 활성을 유발시킨다.

재조합 세포 배양물로부터 직접적으로 이중특이적 항체 단편을 제조하고 단리시키는 다양한 기법이 또한 기술되어 있다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 류신 지퍼(zippers)를 사용하여 생산되었다 [코스텔나이(Kostelny) 등, J. Immunol., 148(5); 1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드를 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결시켰다. 항체 호모다이머를 힌지 영역에서 환원시켜 모노머를 형성한 다음, 재산화시켜 항체 헤테로다이머를 형성하였다. 이 방법은 또한 항체 호모다이머의 생산에 이용될 수 있다. 문헌[홀 린저(Hollinger) 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)]에 기술되어 있는 "디아바디" 기법에서는 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 대안적인 기전을 제공하였다. 단편은 동일 사슬 상의 2개의 도메인 사이를 짝지우기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인(V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인(V_H)을 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 V_H 및 V_L 도메인은 다른 단편의 상보적인 V_L 및 V_H 도메인과 짝을 이루게 되어, 2개의 항원 결합 부위를 형성하게 된다. 단일 사슬 Fv (sFv)를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 다른 방법이 또한 보고되었다 (문헌[그루버(Gruber) 등, J. Immunol., 152: 5368 (1994)] 참조).

2 이상의 역가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들면, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다 [투트(Tutt) 등, J. Immunol. 147: 60 (1991)].

(vi) 원하는 특성을 갖는 항체의 스크리닝

항체를 생산하는 기법은 상기에 기술하였다. 상기한 특징을 갖는 이들 항체를 선별한다.

세포 사멸을 유도하는 항체를 선별하기 위해, 예를 들면, PI, 트리판 블루 또는 7AAD 흡수에 의해 지시되는 막 자체의 손실을 대조군에 비해 평가하였다. 바람직한 평가는 "BT474 세포를 사용한 PI 흡수 분석"이다. 이 분석에 따라, BT474 세포 (이는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection, 매릴랜드주 록빌))으로부터 입수할 수 있음)를 10% 열불활성화 FBS (Hyclone) 및 2mM L-글루타민을 보충한 둘베코 개질 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle Medium; D- MEM):Ham's F-12 (50:50)에서 배양시킨다. (따라서, 분석은 보체 및 면역 작동기(effector) 세포의 부재하에 수행한다.) BT474 세포를 100×20 ㎜의 접시에 접시당 3×10⁶의 밀도로 접종하고 밤새 부착시킨다. 이어서, 배지를 제거하고, 신선한 배지만 또는 10㎍/㎖의 적절한 MAb를 함유하는 배지로 교체한다. 세포를 3일 동안 배양시킨다. 각각의 처리 후, 단일층을 PBS로 세척하고 트립신 분해 (trypsinization)에 의해 탈착시킨다. 이어서, 세포를 4℃에서 12000rpm으로 4분 동안 원심분리시키고, 펠렛을 3㎖의 빙냉 Ca^{2 +} 결합 완충액 (10 mM Hepes, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl₂)에 재현탁시키고, 세포 덩어리를 제거하기 위해 35㎜ 여과기 캐핑된 12×75 시험관 (시험관당 1㎖, 처리군당 3개의 시험관)에 분취하였다. 이어서, 시험관에 PI (10㎍/㎖)을 넣었다. FACSCAN™ 유동 세포 계산기 및 FACSCONVERT™ CellQuest 소프트웨어 (Becton Dickinson)를 사용하여 시료를 분석할 수 있다. PI 흡수에 의해 측정할 때 통계학적으로 유의한 수준으로 세포를 사멸시키는 항체를 선별하였다.

세포자멸을 유발하는 항체를 선별하기 위해, 하기 실시예 2에 기술한 바와 같은 "BT474 세포를 사용하는 아넥신 결합 분석"이 이용가능하다. 앞서 단락에서 기술한 바와 같이 BT474 세포를 배양하고 접시에 접종시켰다. 이어서, 배지를 제거하고, 신선한 배지만 또는 10㎍/㎖의 MAb를 함유하는 배지로 교체한다. 3일간의 배양 기간 이후, 단일층을 PBS로 세척하고 트립신분해에 의해 탈착시켰다. 이어 서, 상기 논의한 바와 같이 세포 사멸 분석을 위해 세포를 원심분리시키고, Ca^{2 +} 결합 완충액에 재현탁시키고, 시험관에 분취하였다. 이어서, 시험관에 표지된 아넥신 (예를 들면, 아넥신 V-FTIC) (1㎍/㎖)을 넣었다. FACSCAN™ 유동 세포 계산기 및 FACSCONVERT™ CellQuest 소프트웨어 (Becton Dickinson)를 사용하여 시료를 분석할 수 있다. 대조군에 비해 통계학적으로 유의한 수준의 아넥신 결합을 유도하는 항체를 세포자멸 유도 항체로서 선별하였다.

앞서 단락에서 논의한 아넥신 결합 분석 이외에, "BT474 세포를 사용하는 DNA 염색 분석"이 이용가능하다. 이 분석을 수행하기 위해, 앞서의 두 단락에 기술한 바와 같이 관심있는 항체로 처리한 BT474 세포를 9㎍/㎖의 HOECHST 33342™을 사용하여 37℃에서 2시간 동안 배양시킨 다음, MODFITLT™ 소프트웨어 (Verity Software House)를 사용하여 EPICS ELITE™ 유동 세포 계산기 (Coulter Corporation) 상에서 분석하였다. 비처리 세포 (100% 이하의 자멸 세포) 보다 2배 이상 (바람직하게는 3배 이상)으로 세포자멸 세포의 비율을 변화시키는 항체를 이 분석을 이용한 세포자멸 유도 항체로서 선별할 수 있다.

관심있는 항체에 의해 결합된 ErbB2 상의 에피토프에 결합하는 항체를 스크리닝하기 위해, 문헌[Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 에드 할로우(Ed Harlow) 및 데이빗 레인(David Lane) (1988)]에 기술된 것과 같은 보통의 교차 차단 분석을 수행할 수 있다. 별법으로, 실시예 2에 기술된 에피토프 맵핑을 수행할 수 있다.

세포 배양물에서 SKBR3 세포의 성장을 50-100% 억제하는 항-ErbB2 항체를 동정하기 위해, 국제 특허 공개 제WO 89/06692호에 기재된 SKBR3 분석을 수행할 수 있다. 이 분석에 따라, SKBR3 세포를 10% 태아 송아지 혈청, 글루타민 및 페니실린 스트렙토마이신을 보충한 F12 및 DMEM 배지의 1:1 혼합물 중에서 배양시켰다. SKBR3 세포를 35㎜ 세포 배양 접시 내에 20,000 세포로 플레이팅시켰다 (2㎖/35㎜ 접시). 1 접시당 2.5㎍/㎖의 항-ErbB2 항체를 첨가하였다. 6일 후, 비처리 세포에 대한 세포의 수를 전자적 COULTER™ 세포 계수기를 사용하여 계수하였다. SKBR3 세포의 성장을 50-100% 억제하는 항체가 원하는 바의 세포자멸 항체와 함께 선별된다.

(vii) 효과기 기능 유전공학적 처리

예를 들면, 암을 치료하는 데 있어서 항체의 유효성을 증가시키기 위해, 작동기 기능에 대해 본 발명의 항체를 개질시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 시스테인 잔기(들)을 Fc 영역에 도입하여, 이 영역에서 쇄간 디술피드 결합 형성을 허용할 수 있다. 이렇게 생산된 호모다이머 항체는 증진된 내부이행(internalization) 능력 및(또는) 증가된 보체-매개 세포 사멸 및 항체 의존성 세포독성(ADCC)를 가질 수 있다. 문헌[카론(Caron) 등, J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992); 및 쇼페스, 비. (Shopes, B.) J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)] 참조. 문헌[울프(Wolff) 등, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)]에 기술된 바와 같이 헤테로이관능성 가교결합기를 사용하여 증진된 항종양 활성을 갖는 호모다이머 항체를 또한 제조할 수 있다. 별법으로, 이중 Fc 영역을 갖는 항체를 유전공학적으 로 처리할 수 있고, 이에 의해 보체 용해 및 ADCC 능력을 증진시킬 수 있다. 문헌[스테벤슨(Stevenson) 등, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)] 참조.

(viii) 면역결합물

본 발명은 또한 화학요법제, 독소(예를 들면, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소 (예를 들면, 방사성결합물)에 결합된 본원에 기술한 항체를 포함하는 면역결합물에 관한 것이다.

그러한 면역결합물의 생산에 유용한 화학요법제는 상기 기술하였다. 사용될 수 있는 효소 활성 독소 및 그의 단편은 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 엑소톡신 A 사슬 (슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa)로부터), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모덱신 A 사슬, 알파-사르신, 알루라이츠 포르디 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이놀라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 (momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노미신, 에노미신 및 트리코테센을 포함한다. 방사성결합된 항-ErbB2 항체를 생산하기 위해 다양한 방사성뉴클리드가 이용가능하다. 그 예로는 ²¹¹Bi, ¹³¹I, ⁹⁰Y 및 ¹⁸⁶Re를 포함한다.

항체 및 세포독성제의 결합은 다양한 2기능성 단백질 결합제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도 에스테르의 2기능성 유도체 (예를 들어 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예를 들어 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어 글루타르 알데히드), 비스-아지도 화합물(예를 들어 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어 톨리엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 수행된다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science 238:1098(1987)]에 기재된 바에 따라 제조될 수 있다. 탄소-14 표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)는 방사성 뉴클레오티드를 항체에 결합시키기 위한 킬레이팅제의 예이다 (예를 들어 WO94/11026 참조).

다른 실시형태에서, 항체는 종양 예비 표적화에 사용하기 위한 "수용체" (예를 들어 스트렙타비딘)에 결합될 수 있고, 항체-수용체 결합체는 환자에게 투여된 후 정화제를 사용하여 비결합된 결합체를 순환물로부터 제거하고 이어서 세포독성제(예를 들어 방사성 뉴클레오티드)에 결합된 "리간드"(예를 들어 아비딘)이 투여된다.

(ix) 면역리포좀

항-ErbB2 항체는 또한 면역리포좀으로서 제조될 수도 있다. 항체를 함유하는 리포좀은 공지의 방법에 의해 제조된다 [Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030(1980); 및 미국 특허 제4,485,045호 및 4,544,545호]. 순환 시간이 증강 된 리포좀은 미국 특허 제5,013,556호에 기재되어 있다.

특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)를 포함하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발법에 의해 생성될 수 있다. 리포좀은 한정된 세공 크기를 갖는 필터를 통하여 압출하여 목적 직경을 갖는 리포좀을 생성시킨다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편은 디술피드 교환 반응을 통하여 문헌[Martin et al., Biol. Chem. 257:286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 리포좀에 결합될 수 있다. 화학요법제(예를 들어 독소루비신)은 리포좀 내에 임의로 함유된다 [Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19)1484(1989) 참조].

(x) 항체 의존적 효소 매개 전구약물 요법 (ADEPT)

본 발명의 항체는 또한 전구약물(예를 들어 펩티딜 화학요법제, WO81/01145 참조)을 활성 함암 약물로 전환시키는 전구약물 활성화 효소에 항체를 결합시킴으로써 ADEPT에 사용될 수 있다 (예를 들어 WO88/07378 및 미국 특허 제4,975,278호 참조).

ADEP에 유용한 면역결합체의 효소 성분은 전구약물을 그의 보다 활성인 세포독성 형태로 전화시키는 방식으로 전구약물에 대해 작용할 수 있는 효소를 포함한다.

본 발명의 방법에 유용한 효소는 인산염 함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 알칼리 포스파타제; 황산염 함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 알칼리 아릴술파타제; 비독성 5-플루오로시토신을 항암제인 5-플루 오로우라실로 전환시키는데 유용한 시토신 데아미나제; 펩티드 함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 프로테아제, 예를 들어 세라티아 프로테아제, 써모리신, 서브틸리신, 카르복시펩티다제 및 카베신 (예를 들어 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환체를 함유하는 전구약물을 전환시키는데 유용한 D-알라닐카르복시펩티다제; 글리코실화 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 탄수화물 분해 효소, 예를 들어 β-갈라토시다제 및 뉴라미니다제; β-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 β-락타마제; 및 각각 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸기로 아민 질소에서 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 페니실린 아미다제, 예를 들어 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제를 포함하고, 이에 제한되지 않는다. 별법으로, 당업계에 "아브짐(abzyme)"으로도 알려진 효소 활성을 갖는 항체를 사용하여 본 발명의 전구약물을 유리 활성 약물로 전환시킬 수 있다 (예를 들어 Massey, Nature 328:457-458(1987) 참조). 항체-아브짐 결합체는 아브짐의 종양 세포 군집으로의 전달에 대해서 본원에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.

본 발명의 효소는 상기 논의한 헤테로 2기능성 가교결합제의 사용과 같은 당업계에 공지된 기술에 의해 항-ErbB2 항체에 공유결합될 수 있다. 별법으로, 본 발명의 효소의 적어도 기능적 활성 부분에 연결된 본 발명의 항체의 적어도 항원 결합 영역을 포함하는 융합 단백질은 당업계에 공지된 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조할 수 있다 (예를 들어 Neuberger et al., Nature, 312:604-608(1984) 참조).

(xi) 항체-샐비지 수용체 결합 에피토프 융합

본 발명의 특정 실시형태에서, 예를 들어 종양 투과를 증가시키기 위해서 완전한 항체보다는 항체 단편을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이 경우, 항체 단편은 그의 혈청 반감기를 증가시키기 위해 변형되는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 예를 들어 샐비지 수용체 결합 에피토프를 항체 단편에 (예를 들어 항체 단편의 적절한 영역의 변이에 의해 또는 예를 들어 DNA 또는 펩티드 합성에 의해 항체 단편의 말단 또는 중앙에 융합되는 펩티드 태그에 에피토프를 도입함으로써) 도입함으로써 달성될 수 있다.

체내 반감기가 증가된 상기 항체 변이체를 제조하는 체계적인 방법은 몇단계로 이루어진다. 제1 단계는 IgG 분자의 Fc 영역의 에피토프에 결합하는 샐비지 수용체의 서열 및 배열을 동정하는 단계를 수반한다. 에피토프가 동정된 후에 목적 항체의 서열은 동정된 결합 에피토프의 서열 및 배열을 포함하도록 변형된다. 서열이 변이된 후에, 항체 변이체는 본래의 항체보다 긴 체내 반감기를 갖는지를 확인하기 위해 시험된다. 항체 변이체가 시험시에 보다 긴 체내 반감기를 갖지 않으면, 그 서열은 동정된 결합 에피토프의 서열 및 배열을 포함하도록 추가로 변형된다. 변형된 항체는 보다 긴 체내 반감기에 대해 시험되고, 이 과정은 보다 긴 체내 반감기를 보이는 분자가 수득될 때까지 계속된다.

이와 같이 목적 항체에 도입된 샐비지 수용체 결합 에피토프는 상기 정의된 바와 같은 적합한 에피토프이고, 그의 특성은 변형된 항체의 종류에 따라 결정될 것이다. 이전은 목적 항체가 게속 생물학적 활성을 갖도록 제조된다.

에피토프는 Fc 도메인의 하나 또는 두개의 루프로부터의 1 이상의 아미노산 잔기가 항체 단편의 유사 위치로 이전된 영역을 구성하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, Fc 도메인의 하나 또는 두개의 루프로부터의 3개 이상의 잔기가 이전된다. 보다 더 바람직하게는, 에피토프는 Fc 영역(예를 들어 IgG의)의 CH2 도메인으로부터 선발되어 항체의 CH1, CH3 또는 V_H 영역, 또는 하나 이상의 상기 영역으로 이전된다. 별법으로, 에피토프는 Fc 영역의 CH2 도메인으로부터 선발되어 항체 단편의 C_L 영역 또는 V_L 영역, 또는 두 영역 모두로 이전된다.

가장 바람직한 한 실시형태에서, 샐비지 수용체 결합 에피토프는 서열 (5'에서 3'으로) PKNSSMISNTP (서열 5)를 포함하고, 임의로 HQSLGTQ (서열 6), HQNLSDGK (서열 7), HQNISDGK (서열 8) 및 VISSHLGQ (서열 9)로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 추가로 포함하고, 특히 항체 단편은 Fab 또는 F(ab')₂이다. 가장 바람직한 다른 실시형태에서, 샐비지 수용체 결합 에피토프는 서열(들) (5'에서 3'으로) HQNLSDGK (서열 7), HQNISDGK (서열 8) 또는 VISSHLGQ (서열 9) 및 서열 PKNSSMISNTP (서열 5)를 함유하는 폴리펩티드이다.

B. 벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법

본 발명은 또한 본원에서 기술되는 항체를 코딩하는 단리된 핵산, 이 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 및 항체를 제조하는 재조합 기술을 제공한다. 재조합 항체의 생산 외에, 본원에서 개시되는 항체를 코딩하는 핵산을 사용하여 예를 들어 1996년 3월 14일 공개된 WO96/07321의 교시에 따라 ErbB2 단백질의 세포 표면 발현을 억제할 수 있다. 예를 들어, 항체는 발현 벡터(예를 들어 바이러스 또는 플라스미드 벡터)에 제공된 단일쇄 Fv 단편일 수 있고, 벡터는 세포에 도입되어 ErbB2 단백질에 세포 내에서 결합하여 세포 사멸을 유도한다.

재조합 항체의 생산을 위해, 이 항체를 코딩하는 핵산을 단리하여 추가 클로닝용 (DNA의 증폭) 또는 발현용 복제가능 벡터에 삽입한다. 단클론 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 방법을 사용하여 (예를 들어 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 용이하게 단리하고 서열을 결정한다. 많은 벡터를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 벡터 성분은 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 성분, 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함하고, 이에 제한되지 않는다.

(i) 신호 서열 성분

본 발명의 항-ErbB2 항체는 직접 재조합 방법에 의해 생산될 수 있을 뿐만 아니라 바람직하게는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N 말단에서 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드 또는 신호 서열인 이종성 폴리펩티드를 갖는 융합 폴리펩티드로서 생산될 수 있다. 바람직하게 선택되는 이종성 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되어 처리되는(즉, 신호 펩티다제에 의해 절단되는) 서열이다. 천연 항-ErbB2 항체 신호 서열을 인식하여 처리하는 원핵 숙주 세포의 경우, 신호 서열은 예를 들어 알칼리 포스파타제, 페니실리나제, lpp 또는 열 안정성 엔테로톡신 II 리더로부터 선택되는 원핵생물 신호 서열에 의해 대체된다. 효모 분비의 경우, 천연 신호 서열은 예를 들어 효모 인버타제 리더, α 인자 리더 (사카로마이세스(Saccharomyce) 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) α-인자 리더) 또는 산 포 스파타제 리더, 씨. 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라제 리더 또는 WO90/13646에 기재된 신호에 의해 대체될 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열 및 바이러스 분비 리더, 예를 들어 단순포진 바이러스 gD 신호를 사용할 수 있다.

상기 전구체 영역의 DNA는 항-ErbB2 항체를 코딩하는 DNA에 인 프레임(in frame)으로 라이게이션된다.

(ii) 복제 기점 성분

발현 및 클로닝 벡터는 모두 벡터가 1종 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제할 수 있도록 만드는 핵산 서열을 함유한다. 바람직하게는, 클로닝 벡터에서 상기 서열은 벡터가 숙주 세포의 염색체 DNA와 무관하게 독립적으로 복제할 수 있도록 만드는 서열이고, 복제 기점 또는 자동 복제 서열을 포함한다. 이러한 서열은 다양한 세균, 효모 및 바이러스에 대해 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람 음성 세균에 적합하고, 2μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)는 포유동물 세포의 클로닝 벡터에 유용하다. 바람직하게는, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에 필요하지 않다 (SV40 기점은 초기 프로모터를 함유하기 때문에 일반적으로 사용될 수 있다).

(iii) 선발 유전자 성분

발현 및 클로닝 벡터는 선발가능 마커로도 불리는 선발 유전자를 함유할 수 있다. 대표적인 선발 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라싸이클린에 내성을 부여하는 단백질, (b) 영양요구성 결함을 보완하는 단백질 또는 (c) 복합 배지로부터 이용할 수 없는 중요한 영양물질을 공급하는 단백질을 코딩하고, 예를 들어 바실러스(Bacillus)의 경우 D-알라닌 라세마제를 코딩한다.

한 선발 개요의 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용한다. 이종성 유전자로 성공적으로 형질전환된 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생산하여 선발 과정에서 생존하게 된다. 이러한 우성 선발의 예는 약물 네오마이신, 마이코페놀산 및 히그로마이신을 사용한다.

포유동물 세포에 적합한 선택가능한 마커의 다른 예는 항-ErbB2 항체 핵산을 수용할 수 있는 세포의 동정을 가능하게 하는 것, 예를 들어 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등이다.

예를 들어, DHFR 선발 유전자로 형질전환된 세포는 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 모든 형질전환체를 배양함으로써 먼저 동정된다. 야생형 DHFR이 사용될 경우, 적합한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결여된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주이다.

별법으로, 항-ErbB2 항체, 야생형 DHFR 단백질 및 다른 선택가능한 마커, 예를 들어 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)를 코딩하는 DNA 서열로 형질전화되 또는 동시형질전환된 숙주 세포(특히 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는 아미노글리코시드계 항생제, 예를 들어 카나마이신, 네오마이신 또는 G418과 같은 선발가능 마커에 대한 선발 물질을 함유하는 배지 중에서의 세포 성장에 의해 선발될 수 있다 (미국 특허 제4,965,199호).

효모에 사용하기 적합한 선발 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39(1979)). trp1 유전자는 트립토판 중에서의 성장능이 결여된 효모의 변이주(예를 들어 ATCC 44076 또는 PEP4-1)에 대한 선발 마커를 제공한다 (Jones, Genetics, 85:12(1977)). 효모 숙주 세포 게놈에 trp1 손상의 존재는 트립토판 부재하의 성장에 의해 형질전환을 검출하기에 효과적인 환경을 제공한다. 이와 유사하게, Leu2-결여 효모 균주(ATCC 20,622 또는 38,626)은 Leu2 유전자를 함유하는 공지의 플라스미드로 보완된다.

또한, 1.6 ㎛ 환형 플라스미드 pKD1로부터 유래한 벡터는 클루이베로마이세스 효모의 형질전환에 사용될 수 있다. 별법으로, 재조합 카프 키모신의 대량 생상용 발현 벡터는 케이. 락티스(K. lactis)에 대해 보고되었다 (Van den Berg, Bio/Technology, 8:135(1990)). 클루이베로마이세스의 산업적 균주에 의한 성숙 재조합 인간 혈청 알부민의 분비를 위한 안정한 다카피수의 발현 벡터도 문헌에 개시되어 있다 (Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)).

(iv) 프로모터 성분

발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 숙주 세포에 의해 인식되고 항-ErbB2 항체 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 원핵 숙주세포에 사용하기 적합한 프로모터는 phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼린 포스파타제, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예를 들 어 tac 프로모터를 포함한다. 그러나, 다른 공지의 세균 프로모터도 적합하다. 또한, 세균 시스템에 사용하기 위한 프로모터는 항-ErbB2 항체를 코딩하는 DNA에 갖동가능하게 연결된 샤인-달가노(S.D.) 서열을 함유할 것이다.

진핵생물을 위한 프로모터 서열도 공지되어 있다. 실질적으로, 모든 진핵세포 유전자는 전가 개시 부위로부터 약 25 내지 30 염기 상류에 위치한 AT 풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 개시 부위 70 내지 80 염기 상류에서 발견되는 다른 서열은 CNCAAT 영역(여기서 N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있음)이다. 대부분의 진핵세포 유전자의 3' 밀단에 코딩 서열의 3' 밀단에 폴리A 테일의 부가를 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 존재한다. 이들 모든 서열은 진핵세포 발현 벡터에 적합하게 삽입된다.

효모 숙주에 사용하기 적합한 프로모터 서열의 에는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 당분해 효소, 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 무타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제를 포함한다.

성장 조건에 의해 조절되는 추가의 전사 잇점을 갖는 유도가능 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사에 관련된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 및 말토스 및 갈락토스 이용에 작용하는 효소에 대한 프로모터 영역 이다. 효모 발현에 사용하기 적합한 벡터 및 프로모터는 추가로 EP 73,657에 기재되어 있다. 또한, 효모 인핸서는 효모 프로모터와 함계 유리하게 사용된다.

포유동물 숙주 세포에서의 벡터로부터의 항-ErbB2 항체 전사는 예를 들어 바이러스, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스 (예를 들어 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 가장 바람직하게는 원숭이 바이러스 40(SV40)의 게놈으로부터, 이종성 포유동물 프로모터, 예를 들어 악틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 열 충격 프로모터로부터 수득된, 숙주 세포 시스템에 사용성인 프로모터에 의해 조절된다.

SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 기점을 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 인간 사이토메갈로바이러스의 중기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 소 유두종 바이러스를 벡터로서 사용여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템은 미국 특허 제4,419,446호에 개시되어 있다. 상기 시스템의 변형은 미국 특허 제4,601,978호에 기재되어 있다. 단순포진 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터의 조절 후에 마우스 세포에서의 인간 β-인터페론 cDNA 발현에 대해서는 문헌 [Reyes et al., Nature, 297:598-601 (1982)] 참조. 별법으로, 라우스(Rous) 육종 바이러스의 긴 말단 반복체가 프로모터로서 사용될 수 있다.

(v) 인핸서 성분

고등 진핵세포에 의한 본 발명의 항-ErbB2 항체를 코딩하는 DNA의 전사는 인 핸서 서열을 벡터에 삽입함으로써 종종 증가된다. 많은 인핸서 서열은 포유동물 유전자(글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)으로부터 알려져 있다. 그러나, 일반적으로 진핵세포 바이러스로부터 유래한 인핸서를 사용한다. 그 예는 복제 기점의 뒷부분 상의 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 츠로모터 인핸서, 복제 기점의 뒷부분 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 진핵세포 프로모터의 활성화를 위한 인핸서 성분에 대해서는 문헌 [Yaniv, Nature, 287:17-18 91982)] 참조. 인핸서는 항-ErbB2 항체 코딩 서열에 5' 또는 3' 위치에서 벡터에 스플라이싱될 수 있지만, 프로모터로부터 5' 부위에 위치하는 것이 바람직하다.

(vi) 전사 종결 성분

진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 생물로부터 유래한 응집 세포)에 사용되는 발현 벡터는 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 포함할 수 있다. 상기 서열은 진핵세포 또는 바이러스 또는 cDNA의 5' 및 때로는 3' 비번역 영역으로부터 확보된다. 이들 영역은 항-ErbB2 항체를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 세그먼트를 함유한다. 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO94/11026의 내용 및 발현 벡터 참조.

(vii) 숙주 세포의 선발 및 형질전환

본원에서 벡터 내의 DNA를 클로닝 또는 발현하기 적합한 숙주 세포는 원핵세포, 효모 또는 상기 기술된 고등 진핵세포이다. 상기 목적에 적합한 원핵세포는 진정세균, 예를 들어 그람 음성 또는 그람 양성 생물, 예를 들어 엔테로박테리아, 예를 들어 에셔리치아(Escherichia), 예를 들어 이. 콜리 (E. coli), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피무리움(typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스(marcescans) 및 시겔라(Shigella), 및 바실러스(Bacillus), 예를 들어 비. 섭틸리스(subtilis) 및 비. 리체니포르미스(licheniformis) (예를 들어 1989년 4월 12일자로 공표된 DD 266,710에 기재된 비. 리체니포르미스 41P), 슈도모나스(Pseudomonas), 예를 들어 피. 아에루기노사(aeruginosa) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함한다. 한가지 바람직한 이. 콜리 클로닝 숙주는 이. 콜리 294(ATCC31,446)이지만, 다른 균주, 예를 들어 이. 콜리 B, 이. 콜리 X1776(ATCC31,537) 및 이. 콜리 W3110 (ATCC27,325)도 적합하다. 이러한 예는 단지 예시적인 것으로서 이에 제한되는 것은 아니다.

원핵세포 외에, 필라멘트상 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 항-ErbB2 항체 코딩 벡터의 클로닝 또는 발현 숙주로서 적합하다. 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상의 제빵 효모가 하등 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용된다. 그러나, 많은 다른 속, 종 및 균주, 예를 들어 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클로이베로마이세스 숙주, 예를 들어 케이. 락티스(lactis), 케이. 프라길리스(fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(ATCC 16,045), 케이. 위케라미 (wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티이(waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (drosophilarum) (ATCC 36,906), 케이. 테르모톨레란스(thermotolerans) 및 케이. 막시아누스(marxianus); 야로위아(yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070); 칸디다(Candida); 트리코데르마 레에시아 (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa); 시와니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어 시와니오마이세스 옥시덴탈리스(occidentalis); 및 섬유상 진균, 예를 들어 뉴로스포라, 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) 및 아스퍼길러스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스(nidulans) 및 에이. 니게르(niger)가 통상 유용하게 사용된다.

글리코실화 항-ErbB2 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 생물로부터 유래한다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포이다. 많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체 및 숙주, 예를 들어 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (모충), 애데스 애깁티(Aedes aegypti) (모기), 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster) (과일파리), 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)로부터 유래한 대응하는 허용되는 곤충 숙주 세포가 동정되었다. 형질감염을 위한 다양한 균주, 예를 들어 오토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주를 구입할 수 있고, 상기 바이러스는 본 발명에 따라 본원의 바이러스로서, 특히 스포돕테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 사용될 수 있다.

면화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양체도 숙주로서 사용될 수 있다.

그러나, 척추동물 세포에 대한 관심이 가장 크고, 척추동물 세포의 배양 (조직 배양)에서의 증식이 일반적인 방법으로 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배(胚) 신장 라인 (293 또는 현탁 배양에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59(1997)); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Uraub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216(1980)); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 그린 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL 1785); 인간 경부암 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 쥐 간세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68(1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간종양 세포주 (Hep G2)이다.

숙주 세포는 항-ErbB2 항체 생산을 위한 상기 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고, 프로모터 유도, 형질전환체 선발 또는 목적 유전자 코딩 유전자 증폭에 적합하게 개질된 통상의 영양 배지 중에서 배양된다.

(viii) 숙주 세포 배양

본 발명의 항-ErbB2 항체를 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지 중에서 배양할 수 있다. 통상 사용가능한 배지, 예를 들어 Ham F10 (Sigma), 최소 필수 배지 ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma), 및 Dulbecco 개질 Eagle 배지 ((DMEM), Sigma)가 숙주 세포의 배양에 적합하다. 또한, 문헌[Ham et al., Meth. Enz., 58:44(1979), Barnes et al., Anal. Biochem., 102:255 (1980), 미국 특허 제4,767,704호; 제4,657,866호, 제4,927,762호, 제4,560,655호 또는 제5,122,469호; WO90/03430, WO87/00195, 또는 미국 특허 등록 제30,985호]에 기재된 배지를 숙주 세포 배양 배지로서 사용할 수 있다. 이들 배지는 호르몬 및(또는) 다른 성장 인자 (예를 들어 인슐린, 트랜스페린, 또는 상피 성장 인자), 염 (예를 들어 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충액 (예를 들어 HEPES), 뉴클레오티드 (예를 들어 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들어 GENTAMYCIN (등록상표) 약물), 미량 원소(마이크로몰 범위의 최종 농도로 통상 존재하는 무기 화합물) 및 글루코스 및 등가의 에너지 공급원으로 필요에 따라 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충물이 당업계의 숙련가에게 공지된 적합한 농도로 포함될 수도 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 대해 이전에 사용된 조건이고, 당업계의 숙련가에게 자명하다.

(ix) 항-ErbB2 항체의 정제

재조합 기술을 사용할 떼, 항체는 세포내에서, 세포질 주변(periplasm) 공간에서 생산될 수 있거나 또는 배지로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포내에서 생산되는 경우, 제1 단계로서 파쇄 입자, 숙주 세포 또는 용균 단편이 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 문헌[Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]에는 이. 콜리의 세포질 주변 공간에 분비된 항체를 단리하는 방법이 기재되어 있다. 세포 페이스트는 아세트산나트륨(pH3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드(PMSF)의 존재 하에 약 30분에 걸쳐 해동된다. 세포 파쇄물은 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 항체가 배지로 분비되는 경우에는, 상기 발현 시스템으로부터의 상등액은 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어 Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 장치를 사용하여 먼저 농축하는 것이 바람직하다. PMSF와 같은 프로테아제 억제제는 단백질분해를 억제하기 위해 상기 단계에 포함될 수 있고, 항생도제는 외래 오염물의 성장을 억제하기 위해 포함될 수 있다.

세포로부터 제조되는 항체 조성물은 예를 들어 히드록실아파티드 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화도 크로마토그래피, 바람직하게는 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있다. 친화도 리간드로서의 단백질 A의 적합성은 항체에 조재하는 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 좌우된다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기재로 한 항체의 정제에 사용될 수 있다 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3을 위해 추천된다 (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). 친화도 리간드가 결합되는 매트릭스는 가장 흔하게는 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 사용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스는 세공 조절된 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스를 사용하여 달성할 수 있는 것 보다 신속한 유속 및 짧은 처리 시간을 가능하게 한다. 항체가 C_H3 도메인을 포함하는 경우에는, Bakerbond ABX 수지(등록상표) (J.T. Baker, 미국 뉴저지주 Phillipsburg 소재)가 정제에 유용하다. 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예를 들어 이온 교환 컬럼에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상에서의 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSE(등록상표) 상에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지(예를 들어 폴리아스파르산 컬럼) 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전이 회수되는 항체에 따라 사용가능하다.

예비 정제 단계(들) 후에, 목적 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물은 약 2.5 내지 4.5의 pH의 용출 완충액을 사용하는, 바람직하게는 낮은 염 농도 (예를 들어 약 0 내지 0.25 M 염)에서 수행되는 저 pH 소수성 크로마토그래피에 적용할 수 있다.

C. 제약 제제

항체의 치료 제제는 목적 순도를 갖는 항체를 임의의 제약상 허용되는 담체, 부형체 또는 안정화제와 함께 혼합함으로써 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 제조되어 보관된다 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). 적합한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 복용자에게 비독성이고, 완충액, 예를 들어 인산염, 시트레이트 및 기타 유기산 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예를 들어 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하여 일당류, 이당류 및 기타 탄수화물; 킬레이팅제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대 이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착체 (예를 들어 Zn-단백질 착체); 및(또는) 비이온계 계면활성제, 예를 들어 TWEEN(등록상표), PLURONICS (등록상표) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)를 포함한다.

또한, 제제는 치료되는 특정 증상에 필요한 1 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 해로운 영향을 주지 않는 보완적 활성을 갖는 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, 한 제제 내에 EGFR, ErbB2 (예를 들어 ErbB2 상의 상이한 에피토프에 결합하는 항체), ErbB3, ErbB4 또는 혈관 내피 인자 (VEGF)에 결합하는 항체를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 별법으로, 또는 추가로 조성물은 세포 독성제, 시토킨 또는 성장 억제제를 포함할 수 있다. 상기 분자는 의도하는 목적에 효과적인 양으로 조합하여 존재하는 것이 적합하다.

또한, 활성 성분은 예를 들어 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 중에서 코아세르베이션(coacervation) 기술 또는 계면 중합, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴 마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 의해 제조된 마이크로캡슐에 봉입될 수 있다. 상기 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개 시되어 있다.

체내 투여에 사용되는 제제는 멸균처리되어야 한다. 이것은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 수행된다.

서방성 제제도 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 형태의 반투과성 매트릭스를 포함한다. 서방성 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔(예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리9비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT (등록상표) (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상 동안 분자의 방출을 가능하게 하지만, 특성 히드로겔은 보다 단기간 동안 단백질을 방출시킨다. 캡슐화된 항체가 장시간 동안 유지될 때, 이들 항체는 37℃에서 수분에 대한 노출의 결과로서 변성되거나 응집될 수 있고, 이것은 생물학적 활성의 상실 및 면역원성의 변화 가능성을 야기한다. 관련 메카니즘에 따라서 안정화를 위해 합리적인 전략을 고안할 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 교환을 통한 분자내 S-S 결합의 형성으로 밝혀지면, 안정화는 술프히드릴 잔기를 개질시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키고 수함량을 조절하고, 적절한 첨가제를 사용하고, 특정 중합체 매트릭스 조성물을 개발함으로써 달성할 수 있다.

D. 항체의 비치료적 사용

본 발명의 항체는 친화도 정제제로서 사용될 수 있다. 이 방법에서, 항체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 Sephadex 수지 또는 여과지와 같은 고체상 상에 고정된다. 고정된 항체는 정제되는 ErbB2 단백질 (또는 그의 단편)을 함유하는 시료와 접촉한 후 지지체는 고정된 항체에 결합하는 ErbB2 단백질을 제외하고 시료 내의 모든 물질을 실질적으로 제거하는 적합한 용매로 세척된다. 최종적으로, 지지체는 항체로부터 ErbB2 단백질을 방출시키는 pH5.0의 글리신 완충액과 같은 다른 적합한 용매로 세척된다.

또한, 항-ErbB2 항체는 ErbB2 단백질의 진단법, 예를 들어 특정 세포, 조직 또는 혈청에서의 그의 발현의 검출에 유용할 수 있다. 따라서, 항체는 인간 악성종양의 진단에 사용될 수 있다 (미국 특허 제5,183,884호 참조).

진단 용도를 위해, 항체는 일반적으로 검출가능 잔기로 표지될 것이다. 많은 표지를 사용할 수 있고, 다음과 같은 범주로 분류할 수 있다.

(a) 방사성 동위 원소, 예를 들어 ³⁵S, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H 및 ¹³¹I. 항체는 문헌 [예를 들어 Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed., Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs., (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 방사성 동위원소로 표지할 수 있고, 방사성은 신틸레이션 계수기를 사용하여 측정할 수 있다.

(b) 형광 표지, 예를 들어 희토류 킬레이트 (유로퓸 킬레이트) 또는 플루오 레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, Lissamine, 피코에리트린 및 Texas Red를 사용할 수 있다. 형광 표지는 예를 들어 상기 문헌 [Current Protocols in Immunology]에 개시된 기술을 사용하여 항체에 결합시킬 수 있다. 형광은 형광계를 사용하여 측정할 수 있다.

(c) 상이한 효소-기질 표지를 사용할 수 있고, 미국 특허 제4,275,149호는 이러한 몇몇 표지를 제공한다. 효소는 다양한 기술을 사용하여 측정할 수 있는 발색 기질의 화학적 변화를 촉매화하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 효소는 분광광도계로 측정될 수 있는 기질의 색깔 변화를 촉매화할 수 있다. 별법으로, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변형시킬 수 있다. 형광의 변화를 정량하는 기술은 상기한 바와 같다. 화학발광 기질은 화학 반응에 의해 전자적으로 여기된 후, 측정될 수 있는(예를 들어 화학발광계를 사용하여) 광을 방출하거나 형광 수용체에 에너지를 제공할 수 있다. 효소 표지의 예는 루시퍼라제 (예를 들어 개똥벌레 루시퍼라제 및 세균 루시퍼라제; 미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디히드로프탈아진디온, 말레이트 데히드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제, 예를 들어 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO), 알칼린 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제 (예를 들어 글루코스 옥시다제, 칼락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제), 헤테로시클릭 옥시다제 (예를 들어 우리카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 효소를 항체에 결합시키는 기술은 문헌[O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981)]에 기재되어 있다.

효소-기질 조합물의 예는 예를 들어 (i) 염료 전구체 (예를 들어 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 히드로클로라이드 (TMB))를 산화시키는 기질로서의 수소 퍼옥시다제와 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO); (ii) 알칼린 포스파타제 (AP)와 발색 기질로서의 파라-니트로페닐 포스페이트; 및 (iii) β-D-갈락토시다제 (β-D-Gal)와 발색 기질 (예를 들어 p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제) 또는 형광 기질 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다제를 포함한다.

많은 다른 효소-기질 조합물이 당업계의 숙련가에게 공지되어 있다. 이러한 조합물은 개요는 미국 특허 제4,275,149호 및 제4,318,980호 참조.

때로, 표지는 항체에 간접적으로 결합된다. 숙련가는 이를 달성하는 다양한 기술을 이해할 것이다. 예를 들어, 항체는 비오틴에 결합될 수 있고, 상기 언급한 3개의 넓은 범주의 항체 중의 하나가 아비딘에 결합될 수 있거나, 이와 반대로 결합될 수도 있다. 비오틴은 아비딘에 선택적으로 결합하여 표지가 상기 간접적인 방식으로 결합될 수 있다. 별법으로, 표지의 항체에 대한 간접적인 결합을 달성하기 위해 항체는 작은 합텐 (예를 들어 디곡신)에 결합되고, 상기한 상이한 종류의 표지 중의 하나가 항-합텐 항체 (예를 들어 항-디곡신 항체)와 결합된다. 이와 같이, 표지와 항체의 간접적인 결합을 달성할 수 있다.

본 발명의 다른 실시형태에서, 항-ErbB2 항체는 표지될 필요가 없고, 그의 존재는 항-ErbB2 항체에 결합하는 표지된 항체를 사용하여 검출할 수 있다.

본 발명의 항체는 공지의 분석법, 예를 들어 경쟁적 결합 분석, 직간접 샌드위치 분석 및 면역침전 분석법에 사용될 수 있다 [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)].

경쟁적 결합 분석은 제한된 양의 항체와 결합하기 위해 시험 시료 분석물과 경쟁하는 표지된 표준물질의 능력에 의존한다. 시료 내의 ErbB2 단백질의 양은 항체에 결합하게 되는 표준물질의 양에 반비례한다. 결합되는 표준물질의 양의 결정을 용이하게 하기 위하여, 항체는 경쟁 전후에 불용화되어 항체에 결합되는 표준물질과 분석물이 결합되지 않은 표준물질과 분석물로부터 편리하게 분리될 수 있도록 하는 것이 바람직하다.

샌드위치 분석법은 검출되는 단백질의 상이한 면역원성 부분 또는 에피토프에 각각 결합할 수 있는 2개의 항체의 사용을 수반한다. 샌드위치 분석법에서, 시료 분석물은 고형 지지체 상에 고정된 제1 항체에 의해 결합되고, 이어서 제2 항체는 분석물에 결합하여 불용성 3부분 복합체를 형성한다 (미국 특허 제4,376,110호 참조). 제2 항체 자체는 검출가능한 잔기로 표지될 수 있거나(직접 샌드위치 분석) 또는 검출가능한 잔기로 표지된 항-면역글로불린 항체를 사용하여 측정될 수 있다 (간접 샌드위치 분석). 예를 들어, 샌드위치 분석의 한 종류는 ELISA 분석법으로서, 이 경우 검출가능한 잔기는 효소이다.

면역조직화학법의 경우, 종양 시료는 신선하거나 동결된 것일 수 있거나 또는 예를 들어 포르말린과 같은 방부제와 함께 파라핀에 함침되어 고정될 수 있다.

또한, 항체는 체내 진단 분석에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 항체는 방 사성 핵종 (예를 들어 ¹¹¹In, ⁹⁹Tc, ¹³¹I, ¹²⁵I, ³H, ³²P 또는 ³⁵S)으로 표지되어 이뮤노신티오그래피(immunoscintiography)를 사용하여 종양을 위치시킬 수 있다.

E. 진단 키트

편리성의 문제로서, 본 발명의 항체는 키트, 즉 소정량의 시약의 조합물의 패키지 및 진단 분석 수행 지침서로 제공될 수 있다. 항체가 효소로 표지되는 경우, 키트는 효소가 필요로 하는 기질 및 코팩터 (예를 들어 검출가능 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체)를 포함할 것이다. 또한, 다른 첨가제, 예를 들어 안정화제, 완충액 (블록 완충액 또는 용균 완충액) 등이 포함될 수 있다. 상이한 시약의 상대적인 양은 분석법의 감도를 실질적으로 최적화하는 시약 용액의 농도를 제공하기 위해 광범위하게 변경될 수 있다. 특히, 시약은 용해시에 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공하는 부형제를 포함하는, 일반적으로 동결건조된 무수 분말로서 제공될 수 있다.

F. 항체의 치료적 용도

본 발명의 항-ErbB2 항체는 ErbB2 수용체의 과다발현 및(또는) 활성화라는 특징을 갖는 질환을 포함하여 상이한 질환의 치료에 사용될 수 있다. 항-ErbB2 항체로 치료되는 질환 또는 질병의 예는 양성 또는 악성 종양 (예를 들어 간, 신장, 방광, 유방, 위장, 난소, 직장결장, 전립선, 췌장, 폐, 음부, 갑상선, 간 암종; 육종; 신경교아세포종; 및 상이한 종류의 두부 및 목암); 백혈병 및 임파성 악성 종양; 다른 질환, 예를 들어 신경, 신경교, 성상세포, 시상하부 및 다른 선, 마크로 파지, 상피, 기질 및 포배강 질환, 및 염증성, 혈관형성 및 면역학적 질환을 포함한다.

본 발명의 항체는 포유동물, 바람직하게는 인간에게 공지의 방법, 예를 들어 볼러스로서 정맥내 투여에 의해, 일정 시간에 걸친 연속 주입에 의해, 또는 근내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액낭내, 수강(髓腔)내, 경구, 국소 또는 흡입 경로에 의해 투여된다. 항체의 정맥내 투여가 바람직하다.

다른 치료법을 본 발명의 항-ErbB2 항체의 투여와 조합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시되는 항체로 치료되는 환자는 방사선 치료법을 받을 수도 있다. 별법으로, 또는 추가로 화학치료제를 환자에게 투여할 수 있다. 상기 화학치료제의 제조 및 투여 계획은 제조자의 지시에 따라 또는 처방의의 결정에 따라 사용할 수 있다. 또한, 상기 화학치료제의 제조 및 투여 계획은 문헌 [Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, William & Wilkins, Baltimore, MD (1992)]에 기재되어 있다. 화학치료제는 항체 투여 전 또는 후에, 또는 항체와 동시에 투여될 수 있다. 항체는 투여량이 공지된 항-에스테로겐 화합물, 예를 들어 타목시펜 또는 항-프로게스테론, 예를 들어 오나프리스톤 (EP 616812 참조)과 조합될 수 있다.

또한, 다른 종양 관련 항원에 대한 항체, 예를 들어 EGFR, ErbB3, ErbB4 또는 혈관 내피 인자 (VEGF)에 결합하는 항체를 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 별법으로, 또는 추가로 2 이상의 항-ErbB2 항체가 환자에게 동시투여될 수 있다. 때때로, 1 이상의 시토킨을 환자에게 투여하는 것이 유리할 수 있다. 바람직한 실 시형태에서, 항-ErbB2 항체는 성장 억제제와 함께 동시투여된다. 예를 들어, 성장 억제제가 먼저 투여된 후, 항-ErbB2 항체가 투여될 수 있다. 그러나, 동시 투여 또는 항-ErbB2 항체의 선투여도 가능하다. 성장 억제제의 적합한 투여량은 현재 사용되는 양이고 성장 억제제와 항-ErbB2 항체의 조합 작용 (시너지)에 의해 저하될 수 있다.

질병의 억제 또는 치료를 위해, 항체의 적합한 투여량은 상기한 바와 같은 치료되는 질병의 종류, 질병의 심도 및 경과에 따라 결정되고, 항체는 에방 또는 치료 목적, 사전 치료, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 처방 의사의 판단에 따라 투여된다. 항체는 한번에 또는 일정 치료 기간에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다.

질병의 종류 및 심도에 따라, 항체 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (즉, 0.1 내지 20 mg/kg)이 예를 들어 1회 이상의 개별 투여에 의해 또는 연속 주입에 의해 환자에 투여되는 초기 가능 투여량이다. 일반적인 1일 투여량은 상기 인자에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 질환에 따라 치료는 질병의 증상이 목적 수준으로 억제될 때까지 유지된다. 그러나, 다른 투여 요법도 유용할 수 있다. 상기 치료법의 진행은 통상의 기술 및 분석법에 의해 용이하게 모니터할 수 있다.

G. 제품

본 발명의 또다른 실시형태에서, 상기 질환의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 제품은 용기 및 라벨을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 제조될 수 있다. 용기는 질환 치료에 유효한 조성물을 보유하고 멸균 출입구를 가질 수 있다(예를 들어 용기는 정맥내 투여 용액 백 또는 피하주사 바늘이 침투가능한 스토퍼를 갖는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 활성 물질은 항-ErbB2 항체이다. 용기 상의 또는 용기에 부착된 라벨은 조성물이 대상 질환의 치료에 사용된다는 것을 나타낸다. 제품은 추가로 제약상 허용되는 완충액, 예를 들어 인산염 완충 염수, Ringer 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제품은 사용 지침서와 함께 다른 완충액, 희석제, 여과기, 바늘, 시린지 및 패키지 삽입물을 포함하여 상업적 및 사용자 측면에서 바람직한 다른 물질을 포함할 수 있다.

H. 미생물 기탁

다음과 같은 하이브리도마 세포주를 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 블리바드 10801 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC)에 기탁하였다.

항체 이름 ATCC 번호 기탁일

7C2 ATCC HB-12215 1996년 10월 17일

7F3 ATCC HB-12216 1996년 10월 17일

4D5 ATCC CRL 10463 1990년 5월 24일

이들은 특허 절차의 목적를 위한 미생물 기탁의 국제적 승인에 대한 부다페스트 조약 및 규칙의 규정 하에 기탁되었다. 이것은 기탁일로부터 30년 동안 생존 배양물의 유지를 보장한다. 세포주는 부다페스트 조약의 조건 하에 ATCC로부터 입수가능하고, (a) 배양물은 37 CFR §1.14 및 35 USC §122 하에 권한이 부여된 위원장이 결정한 사람에게 특허 출원 계류 중에 분양될 수 있고, (b) 기탁된 배양물의 분양에 대한 모든 제한은 특허 허여시에 제거되고 이는 취소할 수 없다는 것을 보장하는 Genetech, Inc.와 ATCC 사이의 협정의 규제를 받는다.

본 출원의 양수인은 기탁된 배양물이 적합한 조건 하에 배양시에 사멸하거나 상실되거나 또는 파괴될 경우, 이를 통지시에 동일한 배양물의 생존가능 표본으로 신속하게 교체할 것임을 동의하였다. 기탁된 세포주의 분양은 각국의 특허법에 따라 그 정부의 관할 하에 허여된 특허권에 반하여 발명을 실시할 허가로서 생각되지 않아야 한다.

상기한 내용은 당업계의 숙련가가 본 발명을 실시할 수 있기에 충분한 것으로 생각된다. 본 발명은 기능적으로 균등한 모든 항체를 그 범위에 포함하기 때문에 기탁된 항체로 한정되지 않는다. 본원에서 물질의 기탁은 본원에 포함된 기재 내용이 그의 최량의 실시형태를 포함하여 본 발명의 특징의 실시를 가능하게 하기에 부적합함을 인정하는 것으로서 생각되어서는 안되고, 또한 특허 청구의 범위를 본원에서 제시한 구체적인 예로 한정하는 것으로서 간주하지 않아야 한다. 실제로, 당업계의 숙련가는 본원에서 나타내고 기술된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형을 상기 기재 내용으로부터 용이하게 생각해 낼 수 있으며, 이는 본 발명의 특허 청구의 범위에 포함된다.

하기 실시예는 본 발명을 단지 예시하고자 한 것으로, 본 발명을 제한하지 않는다. 본원에서 인용된 모든 내용은 본원에 참고로 포함된다.

실시예 1

세포 사멸의 유도

세포주: 확립된 인간 유방암 세포 BT474 및 MDA-MB-231 (ATCC로부터 입수가능함)을 10% 열 불안정화 태아 소 혈청 (FBS) (HyClone, 미국 유타주 로간 소재), 피루브산나트륨, L-글루타민 (2 mM), 비필수 아미노산 및 2x 비타민 용액으로 보충된 최소 필수 배지 (Gibco, 미국 뉴저지주 그랜드 아일랜드 소재) 중에서 배양하고, 5% CO₂ 중에서 37℃에서 유지시켰다 (Zhang et al, Invas. & Metas. 11(4)204-215 (1991) 및 Price et al., Cancer Res. 50(3):717-721 (1990)).

항체: ErbB2의 세포외 도메인에 특이적인 항-ErbB2 IgG₁κ 무린 단클론 항체 4D5 및 7C2를 문헌[Fendly et al., Cancer Research 50:1550-1558 (1990) 및 WO89/06692)에 기재된 바와 같이 생산하였다. 문헌 [Hudziak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84:7159 (1987)]에 기재된 바와 같이 생산한 NIH 3T3/HER2-3₄₀₀ 세포 (약 1 x 10⁵ ErbB2 분자/세포를 발현함)를 25 mM EDTA 함유 인산염 완충 염수(PBS)를 사용하여 수거한 후 이를 사용하여 BALB/c 마우스를 면역처리하였다. 0, 2, 5 및 7주에서 마우스에게 0.5 ml PBS 중의 10⁷ 세포를 복강내 주사하였다. ³²P 표지된 ErbB2를 면역침전시키는 항혈청을 갖는 마우스에게 9 및 13주에서 밀 배 아글루티닌-세파로스 (WGA) 정제된 ErbB2 멤브레인 추출물을 복강내 주사하였다. 이 어서, ErbB2 제제 0.1 ml을 정맥내 주사하고, 비장세포를 마우스 골수종 세포주 X63-Ag8.653과 융합시켰다. ELISA 및 방사성 면역 침전에 의해 하이브리도마 상등액을 ErbB2 결합에 대해 스크리닝하였다. MOPC-21 (IgG1) (미국 노쓰캐롤라이나주 더햄 소재의 Cappell)을 이소형 매치 대조군으로서 사용하였다.

세포 주기 상태 및 생존성의 분석: FACSTAR PLUS (등록상포) (미국 캘리포니아주 산 호세 소재의 Becton Dickinson Immunocytometry System USA) 상의 유동 세포 계산기에 의해 세포의 생존성 및 주기를 동시에 조사하였다. 유방 종양 세포는 인산염 완충 염수 (PBS)로 단일층을 세척하고, 0.05% 트립신 및 0.53 mM EDTA (Gibco) 중에서 세포를 배양하고, 배양 배지 중에 재현탁시켜 수거하였다. 세포를 1% FBS 함유 PBS로 2회 세척하고, 펠렛을 50 ㎕의 400 μM 7 아미노 악티노마이신 D (7AAD) (미국 오레곤 주 유진 소재의 Molecular Probes), 모든 투과가능 세포를 염색하는 생체 염료와 함께 빙상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 PBS 중의 0.5% 파라포름알데히드 1.0 ml로 고정시키고, 5% TWEEN 20(등록상표)를 함유하는 220 ㎕의 10 ㎕/ml HOECHST 33342 (등록상표) 염료 (또한 DNA 결합 염료)를 사용하여 4℃에서 16시간 동안 투과시키고 염색하였다.

1 x 10⁴ 세포로부터의 데이타를 수거하고 LYSYS II (등록상표) 소프트웨어를 사용하여 저장하고, PAINT-A-GATE (등록상표) (Becton Dickinson)을 사용하여 분석하였다 (Darzynkiewica et al. Cytometry 13:795-808 (1992) 및 Picker et al., J. Immunol. 150(3):1105-1121 (1993)). 세포의 생존성 및 세포 주기의 각 단계에서 의 세포의 비율을 각각 7AAD 및 Hoechst 염색을 사용하여 막기능 정상의 단일 세포에 대해 측정하였다. (세포 이중체는 Hoechst 시그날의 폭 대 면적의 펄스 분석에 의해 배제되었다.) 세포수는 세포 계산기를 사용하여 측정하였다.

DNA 합성: 8 x 10³ 세포/웰의 3중 배양물을 96웰 평면 바닥 플레이트 중에 플레이팅하고 철야 부착시킨 후, 항-ErbB2 또는 대조용 Ig의 존재 또는 부재 하에 상이한 기간 동안 인큐베이션하였다. 마지막 12시간 배양 동안 웰을 1μCi³H-티미딘(미국 버지니아주 알링톤 소재의 Amersham)으로 처리하였다

ErbB2의 세포외 도메인에 대한 결합의 친화도: 방사성 요오드화 항-ErbB2 항체를 요오도겐 방법에 의해 제조하였다 (Fracker et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 80:849-857 (1978)). 결합 분석은 96웰 조직 배양 플레이트 중에서 배양된 BT474 세포의 단일층을 사용하여 수행하였다 (Falcon, Becton Dickenson Labware, Lincoln Park, N.J.). 세포를 트립신으로 처리하고, 10⁴ 세포/웰의 밀도로 96웰 플레이트의 웰에 접종하고 철야 부착시켰다. 단일층을 0.1% 나트륨 아지드로 보충된 차가운 배양 배지로 세척한 후, 빙상에서 4시간 동안 0.1% 아지드가 첨가된 차가운 배양 배지 중에서 ¹²⁵I-항-ErbB2 항체의 100 ㎕의 연속 희석액과 함께 3회 인큐베이션하였다. 비특이적 결합은 총 100 ㎕의 부피의 100배 몰 과량의 비방사성 항체로 각각의 시료를 침전시켜 평가하였다. 결합하지 않은 방사성은 0.1% 소듐 아지드가 첨가된 차가운 배지로 2회 세척하였다. 세포 결합 방사성은 150 ㎕ 0.1 M NaOH/웰 로 세포를 용해시킨 후에 감마 계수기로 검출하였다. 항-ErbB2 결합 상수 (Kd)는 Scatchard 분석에 의해 측정하였다.

결과: 항-ErbB2 항체(7C2 및 4D5)의 결합 친화도는 Scatchard 분석에 의해 측정하였다. 결합 상수 (Kd)는 6.5 x 10^-9 M (4D5) 및 2.9 x 10^-9 M(7C2)이었다. 차단 실험은 비표지된 항체 및 이어서 FITC-7C2를 사용하여 수행하였다. 도 2에 도시한 바와 같이, 4D5는 7C2와 상이한 에피토프와 반응한다.

ErbB2를 과다발현하는 BT474 인간 유방암 세포의 성장에 대한 항체의 효과를 조사하였다. 도 3A는 이소형 매치 대조군과 함께 인큐베이션된 세포의 유동 세포 분석법의 결과를 도시한 것이다. 세포의 10 내지 12%는 사멸하였고, 생존 세포의 28%는 세포 주기의 S-G₂-M기에 있었다. 세포를 배지만을 사용하여 인큐베이션한 경우에도 유사한 결과를 수득하였다. 4D5를 사용한 처리(도 3B)는 대조군 세포에 비해 전방 광 산란에 의해 측정시에 세포 크기의 감소, 사멸 세포 비율의 약간의 증가 (27,0%) 및 G₀/G₁ 세포의 증가(94%)와 동시에 S-G₂-M에서의 생존 세포의 현저한 감소(6.3%)를 유도하였다. 세포 총수는 46.7% 감소하였다. 특정 이론에 지지되지는 않지만, 4D5는 1차적으로 G₀/G₁에서 세포 주기 정지(CCA)를 유도하지만, 상당한 비율의 세포가 사멸하는 것으로 보인다. 도 3C는 BT474 세포를 50 ㎍/ml의 7C2와 함께 배양한 결과를 도시한 것이다. 대조군 세포에 비해(비도시), 나머지 생존 세포의 전방 광 산란의 변화, 사멸 세포의 현저한 증가(72%) 및 세포 총수의 70% 감소는 보이지 않았다. 따라서, 생존 세포는 85% 감소하였다. 주기 순환 세포의 경 미한 저하(21%, 대조군 평균 29%)가 있지만, 세포 사멸이 크기 때문에 CCA를 주기 순환 세포의 우선적인 손실과 구별하는 것은 어려웠다. 따라서, 7C2 및 4D5는 세포에 상이하게 영향을 끼치고, 7C2는 세포 사멸을 우세하게 유도하지만 4D5는 CCA를 우세하게 유도한다. 도 3D는 50 ㎍/ml 7C2와 1 ㎍/ml 4D5를 BT474 세포에 동시에 첨가한 경우의 결과를 도시한 것이다. 7C2만을 처리한 경우에 비해 사멸 세포의 비율은 증가하지 않았다 (도 3C). 그러나, 나머지 생존가능 세포의 숫자는 추가로 50% 감소하였다. 또한, 투과가능 막을 모두 갖는 세포가 현저하게 증가하였고, DNA가 상당히 분해되었다 (<1X). 나머지 생존가능 세포의 일부분에 대한 분석 결과, 4D5만으로 처리된 세포와 유사하게 주기 순환 세포가 감소하였다 (도 3B과 도 3D 비교).

또다른 대조군으로서, 정상 수준의 ErbB2를 발현하는 MDA-MB-231 유방암 세포 (Lewis et al., Cancer Immunol. Immunther. 37:255-263(1993))를 4D5 또는 7C2로 처리하였다. 대조군에 비해, 어느 항체도 상기 세포의 성장에 영향을 끼치지 않았다 (S-G₂-M기의 생존가능 세포 27 내지 28% 및 사멸 세포 12 내지 13%).

두 항체의 첨가 효과는 4D5의 최적 미만 투여량(0.05 ㎍/ml)을 사용했을 때 분명하게 나타났다. 도 4A는 티미딘 혼입이 각각 7C2 및 4D5로 처리된 세포에서는 22.3% 및 23% 감소하고, 4D5 및 7C2로 처리된 세포에서는 58% 감소하였음을 보여준다. 20 ㎍ 7C2 및 0.1 ㎍ 4D5를 사용한 또다른 실험은 유사한 결과를 보였다. 즉, 티미딘 혼입은 7C2 단독, 4D5 단독, 또는 4D5 + 7C2로 각각 처리된 세포에서 41%, 25% 및 72% 감소하였다. 도 4B는 생존가능 세포의 총수를 도시한 것이다. 세포 총수를 측정하고, FACS 분석을 사용하여 생존가능 세포의 숫자를 확립하였다. 생존가능 세포의 총수는 각각 7C2, 4D5 또는 이들의 조합물로 처리된 세포에서 미처리 대조군에 비해 64%, 29% 및 84% 감소하였다.

실시예 2

세포자멸의 유도

물질 및 세포 배양: 모든 종양 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션으로부터 입수하였다. 세포를 10% 열 불안정화 태아 소 혈청 (FBS) (HyClone) 및 2 mM L-글루타민으로 보충된 둘베코 개질 이글 배지 (D-MEM):Ham F-12 (50:50) 중에서 배양하였다. 인간 유방 상피 세포 (HMEC)를 Clonetics로부터 구입하여 소 뇌하수체 추출물을 함유하는 MEGM (유방 상피 성장 배지, Glonetics) 중에서 배양하였다. 사용된 생화학물질은 아넥신 V-FTIC (BioWhittaker, Inc.), 요오드화 프로피듐 (PI, Molecular Probes, Inc.) 및 HOECHST 33342 (등록상표, Calbiochem)이었다. 항-ErbB2 단클론 항체 (Mab)를 문헌 [Fendly et al., Cancer Research 50:1550-1558 (1990) 및 WO89/06692]에 기재된 바와 같이 생산하였다 (상기 실시예 1 참조). 시험된 항-ErbB2 MAb는 4D5, 7C2, 7F3, 3H4, 2C4, 2H11, 3E8 및 7D3로 명명되었다. 이소형 매치 대조군 MAb 1766은 다순 포진 바이러스 (HSV-1) 당단백질 D에 대해 작용한다.

세포자멸의 유도 측정을 위한 유동 세포 측정 실험: 세포를 100 x 20 mm 접 시에 접시 당 3 x 10⁶의 밀도로 접종하고, 철야 부착시켰다. 배지를 제거하고 신선 배지 단독 또는 적절한 MAb 10 ㎍/ml를 함유하는 배지로 교체하였다. 대부분의 실험에서, 세포를 3일 동안 인큐베이션하였다. 경시적 연구를 위해, 세포를 0.25, 0.5, 1, 2, 24, 72, 96시간 또는 7 또는 10일 동안 처리하였다. 투여량 반응 실험에 사용된 MAb 농도는 0.01, 0.1, 1 및 10 ㎍/ml이었다. 각각의 처리를 실시한 후, 상등액을 각각 수거하여 빙상에서 유지시키고, 트립신 처리에 의해 단일층을 탈착시키고 대응하는 상등액과 함께 모았다. 세포를 이어서 4℃에서 5분 동안 1,200 rpm에서 원심분리하고, 펠렛을 빙냉 Ca^{2 +} 결합 완충액 (10 mM Hepes, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl₂) 3 ml 중에 재현탁시키고 세포 응집물을 제거하기 위해 35 mm 여과기가 구비된 12 x 75 튜브 (튜브당 1 ml, 처리군당 3 튜브)에 분취하였다. 이어서, 각 군의 3 튜브에 아넥신 V-FTIC (1 ㎍/ml) 또는 PI (10 ㎍/ml) 또는 아넥신 V-FTIC + PI를 첨가하였다. FACSCAN™ 유동 세포 계산기 및 FACSCONVERT™ CellQuest 소프트웨어 (Becton Dickinson)를 사용하여 시료를 분석하였다. 세포 주기 분석을 위해, 세포를 37℃에서 2시간 동안 9 ㎍/ml HOECHST 33342 (등록상표)와 함께 인큐베이션한 후, MODFIT LT (등록상표) 소프트웨어 (Verity Software House)를 사용하여 EPICS ELITE (등록상표) 유동 세포 계산기 (Coulter Corporation) 상에서 분석하였다.

혈청 결여 실험은 다음과 같은 방식으로 수행하였다. BT474 유방암 세포를 100 x 20 mm 접시에 접시 당 5 x 10⁶의 밀도로 배양 배지에 접종하였다. 1일 후에, 배지를 0.1% FBS를 함유하는 배지로 교체하고, 세포를 3일 동안 배양하였다. 이어서, 세포에 0.1% FBS로 보충된 신선 배지 중의 10 ㎍/ml의 MAb 7C2 또는 4D5를 공급하였다. 3일 동안 배양한 후, 아넥신 V 결합, PI 흡수 및 세포 주기 진행을 상기와 같이 분석하였다. 혈청 결여 세포와 혈청 비결여 세포의 성장을 비교하기 위해서, 모든 시점에서 10% FBS로 보충된 배지에서 인큐베이션된 각 접시의 BT474 세포를 동시에 연구하였다.

DNA 래더 형성의 검출: DNA의 뉴클레오좀 내 단편화를 측정하기 위해서 BT474 유방암 세포를 플레이팅하고 상기한 바와 같이 10 ㎍/ml MAb 4D5 또는 7C2로 3일 동안 처리하였다. DNA를 추출하고, ³²P로 말단 표지하고 5 ㎍/ml 에티듐 브로마이드를 함유하는 2% 아가로스 겔 상에서 이동시켰다. 겔을 건조시키고 Kodak 필름에 노출시켰다. 세포자멸의 증거인 DNA 래더의 형성이 3일 동안 10 ㎍/ml MAb 7C2 또는 4D5로 처리된 BT474 유방암 세포에서 관찰되었다.

전자 현미경 연구: BT474 세포를 3일 동안 10 ㎍/ml MAb 7C2로 처리하고 0.1 M 카코딜레이트 완충액 중의 1.25% 포름알데히드/1% 글루타르알데히드 중에 고정시켰다. 고정 후에는 카코딜레이트 완충액 중의 2% 오산화오스뮴 중에서 처리하였다. 고정된 세포를 우라닐 아세테이트 중에서 말단 차단 염색을 실시하고, 에탄올로 탈수시키고 Eponet 중에 봉매시켰다. 박편 절단기를 사용하여 박편을 절단하고 Philips CM12 (등록상표) 전자 현미경 하에 관찰하였다. 세포자멸성 세포에 전형 적인 핵 및 세포질 농축을 보이는 크게 수축된 세포가 MAb 7C2로 처리한 후에 관찰되었다. 세포자멸성 세포는 최종적으로 아래에 있는 세포에 의해 섭취 (phagocytosis)된다.

수행된 실험의 결과를 도 5 내지 14에 도시하였다. 특정 항-ErbB2 MAb는 전자 현미경, 아넥신 V 결합, DNA의 세포 주기 분석, DNA 래더링 및 경시적 비디오현미경에 의해 입증된 바와 같이 ErbB2를 과다발현하는 인간 종양 세포주의 세포자멸을 유도한다. ErbB2 세포외 도메인 상의 동일한 에피토프를 인식하는 항-ErbB2 MAb 7C2 및 7F3은 가장 효능있는 세포자멸 유도 효과를 보인다. 상이한 ErbB2 에피토프를 인식하는 항-ErbB2 MAb 4D5는 그의 효과적인 증식 저하 외에 소량의 세포자멸을 유도한다. 7C2 또는 4D5에 의한 세포자멸성 세포 사멸의 유도는 세포 주기에 무관한 것으로 보인다. 혈청 결여에 의하거나 또는 4D5, 이어서 7C2의 처리에 의한 성장의 억제는 배양물의 완전한 세포 사멸을 야기할 수 있다.

실시예 3

난소 세포의 세포자멸 및 조합 처리

방법: SKOV3 세포를 20 x 100 mm 접시에 접시 당 10⁶의 밀도로 접종하고, 2 내지 3일 동안 부착시켰다. 배지를 제거하고 신선 배지 단독 또는 적절한 항-HER2 MAb를 함유하는 배지로 교체하였다. 단일 MAb 처리에 대한 연구를 위해, 세포를 10 ㎍/ml MAb 7C2 또는 4D5와 함께 3일 동안 인큐베이션하였다. 항체 조합 처리를 위해, BT474 세포를 먼저 0.25 또는 0.5 ㎍/ml MAb 7C2로 24시간 동안 처리하였다. 이 처리 후에, 10 ㎍/ml MAb 4D5를 가하고 세포를 3일 이상 인큐베이션하였다. 각각의 처리 후에, 상등액을 각각 수거하여 빙상에서 유지시키고, 트립신 처리에 의해 단일층을 탈착시키고 대응하는 상등액과 함께 모았다. 세포를 이어서 4℃에서 5분 동안 1,200 rpm에서 원심분리하고, 펠렛을 빙냉 Ca^{2 +} 결합 완충액 (10 mM Hepes, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl₂) 중에 재현탁시키고, 35 mm 여과기가 구비된 12 x 75 튜브에 분취하였다. 세포를 아넥신 V-FTIC 1 ㎍/ml 및 PI 10 ㎍/ml로 염색하고, FACSCAN™ 유동 세포 계산기 및 FACSCONVERT™ CellQuest 소프트웨어 (Becton Dickinson)를 사용하여 시료를 분석하였다.

난소 세포의 세포자멸의 유도: MAb 7C2로 처리한 지 3일 후에 생존가능 (아넥신 V 음성/PI 음성) 세포의 비율은 SKOV3 난소암 세포주에서 48% 감소 (아넥신 V 결합의 3.8배 증가)하였다 (도 15).

조합 처리: MAb 7C2 및 4D5의 연속 처리에 의한 세포자멸의 유도는 어느 한 항체만을 처리한 경우에 비해 부가적인 효과를 야기한다 (도 16). 0.5 ㎍/ml MAb 7C2 및 10 ㎍/ml 4D5 순으로 BT474 유방암 세포를 처리하면 생존가능 (아넥신 V 음성/PI 음성) 세포를 MAb 4D5 단독 처리시의 68% 또는 7C2 단독 처리시의 29.1% 감소와 달리 12% 감소시킨다. 또한, 상기 부가적인 효과는 MAb 7C2의 최적 미만 투여량 처리시에도 관찰되는데, 0.25 ㎍/ml 7C2 + 10 ㎍/ml 4D5로 처리하면 생존가능 세포를 MAb 4D5 단독 처리시의 37.5% 및 7C2 단독 처리시의 77% 감소와 달리 37.5% 감소시킨다. MAb 7C2 및 4D5의 동시 첨가 또는 7C2 전에 MAb 4D5의 첨가는 세포 사멸에 대한 부가적인 효가를 야기하지 않는 것으로 보인다. 따라서, 특정 이론에 지지되지는 않지만, MAb 7C2, MAb 4D5 순의 순차 적용은 세포자멸 효과를 증강시키는데 중요할 수 있다.

실시예 4

항-HER2 MAb의 체내 효과

HER2 과다발현 종양에 대한 항-HER2 MAb의 효과를 평가하기 위해 인간 유방암 세포를 과다발현하는 HER2의 이종이식편 모델을 확립하였다. 모델은 무모 마우스에서 성장하기 위해 체내에서 선발된 BT474 세포주인 BT474M1를 사용한다. 종양 보유 마우스를 단클론 항체 4D5, 7C2 또는 7F3으로 주당 2회 처리하였다. 종양 성장은 매주 2회 종양 크기를 측정하여 평가하였다. 4D5 단클론 항체는 BT474M1 세포주로부터 HER2를 과다발현하는 이종이식편 종양에 대한 상당한 성장 억제 효과를 보유하였다. 이 결과는 이전에 문헌에 공개된 결과와 유사하다. 단클론 항체 7C2 및 7F3은 시험 투여량에서 그 자신에 대해 적당한 성장 억제 효과를 갖고, 4D5의 성장 억제 효과는 상당히 증가시켰다. 어느 항체도 시험 동물에 대해 독성 효과를 보이지 않았다.

동물 모델: NCR.nu/nu 마우스 (동종 암컷, 4주령)에게 종양의 성장을 유지하기 위해 서방성 17β 에스트라디올 펠렛 0.71 mg을 피하 이식하였다. 마우스에게 에스트로겐을 이식한 지 24시간 후에 MATRIGEL (등록상표) 중의 5백만 BT474M1 종양 세포를 피하 주사에 의해 접종하였다. 마우스의 상태를 매일 모니터하고, 종양을 매주 2회 조사하였다. 종양 측정치를 수집하여 그에 대한 보고서를 작성하였 다. 연구 동안 독성을 평가하기 위해서 마우스의 체중을 매주 측정하였다. 105마리의 마우스를 접종하고 모두 연구에서 평가하였다.

처리 프로토콜: 마우스를 랜덤하게 7개의 처리군(군당 15마리) 중의 하나로 분류하였다. 종양 접종 6일 후에 처리를 개시하였다. 군 사이의 일관성을 보장하기 위해서 처리 개시 전에 모든 마우스의 종양 크기 및 처리군 각각의 평균 종양 크기를 조사하였다. 처리군은 다음과 같다:

1) 비히클 대조물 주사 - 매주 2회 복강내(IP) 100 ㎕ 주사.

2) 무관 항체 (αgp120) (이소형 매치) - 매주 2회 100 ㎕ 중의 10 mg/kg IP 주사.

3) MAb 7C2 - 매주 2회 100 ㎕ 중의 10 mg/kg IP 주사.

4) MAb 7F3 - 매주 2회 100 ㎕ 중의 10 mg/kg IP 주사.

5) MAb 4D5 - 매주 2회 100 ㎕ 중의 10 mg/kg IP 주사.

6) MAb 7C2(10 mg/kg) + MAb 4D5(10 mg/kg) - 매주 100 ㎕로 IP 주사.

7) MAb 7F3(10 mg/kg) + MAb 4D5(10 mg/kg) - 매주 100 ㎕로 IP 주사.

모든 처리군을 복강내 주사에 의해 주당 2회씩 총 10회 처리하엿다. 처리군 1 내지 4는 이 시점에서 큰 종양 크기에 의해 사망하였다. 처리군 5 내지 7은 계속하여 항체로 총 16회 처리하였다. 연구 전반에 결쳐, 마우스의 상태의 매일, 종양 측정은 주 2회, 체중에 대해서는 매주 모니터하였다. 각각의 마우스 데이타 및 처리군의 평균 데이타를 유효할 때까지 준비하였다.

실험의 종료: 처리 종결 후에, 처리군 1 내지 4의 마우스는 상기 처리군 내 의 큰 종양 크기에 의해 사망하였다. 종양 부피는 4 g (4,000 mm³)을 초과하지 않았다. 마우스의 체중은 상당히 감소하였고, 처리 개시시의 체중의 15%를 초과하는 체중의 감소를 보였다. 실험 종료 후에, 모든 마우스는 사망하였다.

결과: HER2 성장 인자 수용체에 대해 작용하는 단클론 항체 4D5, 7C2 및 7F3를 HER2 수용체를 과다발현하는 마우스 이종이식편 모델에 사용하였다. 항체는 단독으로 및 세포자멸성 항체 (7C2 및 7F3)과 성장 억제제 (4D5)와 조합하여 사용하였다. 세포자멸성 항체 (7C2 및 7F3)는 연구 초기에 성장 억제 효과를 갖고, 이 효과는 늦은 시점에서 상실되었다 (도 17). 성장 억제 항체인 4D5는 이전 연구에서 보고된 바와 같이 연구 전반에 걸쳐 현저한 성장 억제 효과를 가졌다. 4D5와 7C2 또는 7F3의 조합물은 성장 억제 효과를 현저하게 보였고, 4D5/7C2가 가장 우수한 조합이었다. 4D5 단독 처리군 및 4D5/7C2 처리군에서 한번의 완전한 억제가 있었다. 항체 대조군 (항-gp120 MAb)은 염수 처리 대조군과 동일하였다. 체중은 종양 접종 후 초기에 증가한 후, 나머지 연구 기간에 걸쳐 유지되었다. 어느 항체도 마우스에 대한 독성 효과를 보이지 않았다.

본 발명은 적어도 부분적으로는 특정 항-ErbB2 항체가 세포자멸을 통하여 ErbB2 과다발현 세포 (예를 들어 BT474, SKBR3, SKOV3 또는 Calu 3 세포)의 사멸을 유도할 수 있다는 놀라운 발견에 관한 것이다.

SEQUENCE LISTING (1) GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: Genentech, Inc. Board of Regents, University of Texas System (ii) TITLE OF INVENTION: Anti-ErbB2 Antibodies (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 9 (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS: (A) ADDRESSEE: Genentech, Inc. (B) STREET: 1 DNA Way (C) CITY: South San Francisco (D) STATE: California (E) COUNTRY: USA (F) ZIP: 94080 (v) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: 3.5 inch, 1.44 Mb floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: WinPatin (Genentech) (vi) CURRENT APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: (B) FILING DATE: (C) CLASSIFICATION: (viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION: (A) NAME: Lee, Wendy M. (B) REGISTRATION NUMBER: 40,378 (C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: P1053R2PCT (ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION: (A) TELEPHONE: 650/225-1994 (B) TELEFAX: 650/952-9881 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:1: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 166 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:1: Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu 1 5 10 15 Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val 20 25 30 Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser 35 40 45 Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu 50 55 60 Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg 65 70 75 Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala 80 85 90 Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr 95 100 105 Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu 110 115 120 Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln 125 130 135 Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys 140 145 150 Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg 155 160 165 Ala 166 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 32 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2: Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro 1 5 10 15 Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln 20 25 30 Gly Cys 32 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:3: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 59 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:3: Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val 1 5 10 15 Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln 20 25 30 Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val 35 40 45 Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg 50 55 59 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:4: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 97 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:4: Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu 1 5 10 15 Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg 20 25 30 His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser 35 40 45 Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala 50 55 60 His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly 65 70 75 Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp 80 85 90 Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro 95 97 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:5: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 11 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:5: Pro Lys Asn Ser Ser Met Ile Ser Asn Thr Pro 1 5 10 11 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:6: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 7 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:6: His Gln Ser Leu Gly Thr Gln 1 5 7 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:7: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 8 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:7: His Gln Asn Leu Ser Asp Gly Lys 1 5 8 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:8: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 8 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:8: His Gln Asn Ile Ser Asp Gly Lys 1 5 8 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:9: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 8 amino acids (B) TYPE: Amino Acid (D) TOPOLOGY: Linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:9: Val Ile Ser Ser His Leu Gly Gln 1 5 8

Claims (29)

1. 도메인 1 (서열 1: SEQ ID NO: 1)내의 ErbB2 상의 에피토프에 결합하는 단리된 항체의 유효량 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, ErbB2를 과다발현하는 세포에서 세포 사멸을 유도함으로써 암을 치료하는 제약 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 세포가 암세포인 제약 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 세포가 포유동물 내에 있는 것인 제약 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 제약 조성물.
5. 제1항에 있어서, 서열 2의 아미노산 서열로 이루어지는 ErbB2 상의 에피토프에 결합하지 않는 제2의 항-ErbB2 항체를 추가로 포함하는 제약 조성물.
6. 제1항에 있어서, ErbB2에 결합하며 세포 배양시에 SKBR3 세포의 성장을 50 내지 100% 억제하는 제2의 항체를 추가로 포함하는 제약 조성물.
7. 제6항에 있어서, 세포가 제2의 항체에 노출되기 전에, 도메인 1 (서열 1)내의 ErbB2 상의 에피토프에 결합하는 항체에 상기 세포가 노출되는 것인 제약 조성 물.
8. 제6항에 있어서, 제2의 항체가 서열 4 (SEQ ID NO: 4)의 아미노산 서열로 이루어지는 ErbB2 상의 에피토프 4D5에 결합하는 것인 조성물.
9. 제8항에 있어서, 제2의 항체가 ATCC CRL 10463인 ATCC 번호로 기탁된 항체 4D5의 가변 도메인 (variable domain)을 갖는 것인 제약 조성물.
10. 제1항에 있어서, 성장 억제제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
11. 제1항에 있어서, 화학치료제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
12. 제1항에 있어서, 방사선과 조합하여 사용되는 제약 조성물.
13. 제1항에 있어서, 상기 단리된 항체가 세포 자멸을 통하여 세포 사멸을 유도하는 것인 제약 조성물.
14. 제1항에 있어서, 상기 단리된 항체가 모노클로날 항체인 제약 조성물.
15. 제1항에 있어서, 상기 단리된 항체가 인간의 항체인 제약 조성물.
16. 제1항에 있어서, 상기 단리된 항체가 무손상 항체인 제약 조성물.
17. 제16항에 있어서, 상기 단리된 항체가 인간 IgG 중쇄 불변 도메인 (constant domain)을 포함하는 것인 제약 조성물.
18. 제1항에 있어서, 상기 단리된 항체가 로리 (Lowry) 방법에 의하여 95중량%를 초과하도록 정제된 것으로 결정되는 것인 제약 조성물.
19. 제18항에 있어서, 상기 단리된 항체가 로리 (Lowry) 방법에 의하여 99중량%를 초과하도록 정제된 것으로 결정된 것인 제약 조성물.
20. 도메인 1 (서열 1)내의 ErbB2 상의 에피토프에 결합하며, BT474 세포를 사용하는 아넥신 결합 분석에서 항체로 비처리된 세포에 비교하여 아넥신 결합을 약 5 내지 50 배 유도시키는 단리된 항체의 유효량 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, ErbB2를 과다발현하는 세포에서 세포 사멸을 유도함으로써 암을 치료하는 제약 조성물.
21. 제20항에 있어서, 상기 세포가 암세포인 제약 조성물.
22. 제20항에 있어서, 상기 세포가 포유동물 내에 있는 것인 제약 조성물.
23. 제22항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 제약 조성물.
24. 제20항에 있어서, 상기 단리된 항체가 세포 자멸을 통하여 세포 사멸을 유도하는 것인 제약 조성물.
25. 제20항에 있어서, 상기 단리된 항체가 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 제약 조성물.
26. 제20항에 있어서, 성장 억제제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
27. 제20항에 있어서, 화학치료제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
28. 제20항에 있어서, 방사선과 조합하여 사용되는 제약 조성물.
29. 도메인 1 (서열 1)내의 ErbB2 상의 에피토프에 결합하는 제1의 항체에 ErbB2를 과다발현하는 세포를 노출시키는 단계; 및

    그 후에 상기 제1 항체의 결합 부위 이외의 ErbB2 도메인에 결합하는 제2의 항체에 상기 세포를 노출시키는 단계

    를 포함하는, 세포 사멸을 유도하는 시험관내 방법.

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