CN113993902A - 抗her2结合分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及HER2/ErbB2的胞外结构域(ECD)的结合蛋白。更具体地，结合蛋白结合于在响应HER2扩增或活化的细胞中暴露的构象表位。

Description

抗HER2结合分子
本文中引用或参考的所有文献，以及本文中引用的文献中引用或参考的所有文献，连同本文中或以引用的方式并入本文中的任何文献中提及的任何产品的任何制造商的说明书、描述、产品规格和产品表，以引用的方式整体并入本文中。
序列表的电子提交的全部内容出于所有目的以引用的方式整体并入。
本申请要求2019年3月22日提交的澳大利亚临时专利申请AU 2019900973的优先权。该文献的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及HER2/ErbB2的胞外结构域(ECD)的结合蛋白。更具体地，结合蛋白结合于在响应HER2扩增或活化的细胞中暴露的构象表位。
背景技术
受体的ErbB家族包括驻留在细胞表面上的四个同源蛋白：表皮生长因子受体(EGFR；也称为ERBB1；HER1)；ERBB2(也称为HER2；Neu)；ERBB3(或HER3)；和ERBB4(或HER4)。
已经在许多癌症类型中鉴定了HER2的过表达和扩增，包括乳腺癌、胆道癌、结肠癌、子宫内膜癌、胃癌和胃食管连接部癌、多形性成胶质细胞瘤、头颈癌、卵巢癌、胰腺癌和尿道上皮癌。HER2过表达和扩增已显示与乳腺癌和胃/胃食管连接部(GEJ)癌症中的不良结果相关(Nagaraja等人，(2016)Eur J Surg Oncol 42(1):140-8)；然而，它对其它肿瘤类型的作用没有很好的定义。
HER2抗体的市场在2017年超过100亿美元，预期未来HER2抗体的销售量增加，新的临床适应症和市场正在出现。具有HER2过表达/扩增的患者中对靶向HER2的应答受若干临床病理学特征影响，包括肿瘤组织学、发育异常程度、疾病阶段和潜在风险因素的存在。HER2的扩增或过表达还用作多种肿瘤类型(包括乳腺癌、胃癌和妇科癌症)中抗HER治疗的预测性生物标志物(Slamon DJ等人，(1987)Science235{4785):177-82；Santin AD等人，(2005)Cancer 104(7):1391-7；Morrison C等人，(2006)J Clin Oncol 24(15):2376-85；Liu等人，(2010)J Thoracic Oncol 5(12):1922-32)。综述参见Parakh S等人，(2017)《癌症治疗评论》(Cancer Treatment Reviews)59:1-21。
HER2功能
HER2的胞外结构域不能结合任何已知的天然配体(Klapper LN等人，(1999)PNAS96(9):4995-5000)。与ErbB家族的其它成员不同，HER2采取在配体不存在下有利于HER2激酶的寡聚化和活化(对于其它ErbB家族成员，其需要配体活化)的构象(Garrett TP等人，(2002)Cell 110(6):763-73)。HER2的公开证实(Cho H-S等人，(2003)Nature 421(6924):756-60)使二聚臂永久可用于单体家族成员之间的同二聚体或异二聚体相互作用，以及预先存在的无活性二聚体的构象变化和低聚(Maruyama IN等人，(2014)Cells 3(2):304-30)，导致细胞内激酶结构域的自磷酸化和信号转导。HER2过表达增加EGF和神经调节蛋白对其受体的亲和力并降低配体从活性二聚体解离的速率。HER2过表达也已表明影响含HER2的异二聚体的回收和降解速率：EGFR-HER2异二聚体经历内吞循环而不是降解，这导致延长的EGFR信号转导(Huang G等人，(1999)J Cell Biochem 74(1):23-30)。在配体活化时形成的异二聚体中，HER2-HER3异二聚体似乎是HER2扩增的肿瘤中最有效的信号转导复合物(Tzahar E等人，(1996)Mol Cell Biol 16(10):5276-87)。通过HER2-HER3复合物的信号转导是通过HER3-依赖性磷酸化和随后PI3K/Akt信号传导通路的活化介导的(Pinkas-Kramarski R等人，(1996)EMBO J 15(10):2452)。体外研究证明HER2过表达导致恶性转化、抗细胞凋亡性质的发展、增加的侵袭性和耐药性。通过HER2-异源寡聚化的受体活化可能是驱动在HER2过表达细胞中观察到的细胞增殖的关键机制(Wolf-Yadlin A等人，(2006)MolSyst Biol 2(1):54)。
抗HER2定向疗法
已经尝试了许多不同的抑制HER2的方法，并且许多这些方法已经进入临床实践。
(i)针对HER2的结构域IV的单克隆抗体：较早的HER2抑制方法使用针对胞外结构域的单克隆抗体，其主要实例是曲妥单抗(Trastuzumab)(Albanell J等人，(1999)DrugsToday(Barc)35(12):931-46)。其它抗HER2抗体也已描述于例如Ko B-K等人，(2015)MolOncol 9(2):398-408；Mahdavi M等人，(2015)Monoclon Antib Immunodiagn Immunother34(3):213-21；Ceran C等人，(2012)Cancer Cell 6(2):117-27)。
(ii)针对HER2的结构域II的抗体：帕妥珠单抗(Pertuzumab)，被称为HER二聚化抑制剂的一类药物(Adams CW等人，(2006)55(6):717-27)结合HER2的胞外二聚化结构域II(不同于曲妥单抗的表位的表位)，抑制HER受体之间的二聚化(Adams CW，同上)。
(iii)HER2的小分子抑制剂：已经开发了靶向HER2的小分子抑制剂。许多靶向许多受体，包括ErbB家族的其他成员，其可能是有利的，因为侧枝信号转导可以是对HER2抑制剂的抗性的一种机制(Ritter CA等人，(2007)Clin Cancer Res 13(16):4909-19)。有两种批准的酪氨酸激酶抑制剂；拉帕替尼(lapatinib)是抑制EGFR和HER2激酶两者的口服小分子可逆抑制剂(Tevaarwerk AJ等人，(2009)Clin Ther 31:2332-48)，并且阿法替尼(afatinib)是EGFR、HER2和HER4酪氨酸激酶活性以及含有EGFR和HER2的二聚体的不可逆抑制剂(Li D等人，(2008)Oncogene 27(34):4702-11)。来那替尼(Neratinib)是HER1、HER2和HER4的不可逆泛酪氨酸激酶抑制剂。其似乎影响过表达HER2的细胞和扩增EGFR的细胞中的下游信号转导，并导致细胞凋亡和肿瘤生长减少(Rabindran SK等人，(2004)Can Res 64(11):3958-65)。妥卡替尼(Tucatinib)是选择性口服HER2抑制剂(Moulder-Thompson S等人，(2017)Clin Cancer Res clincanres 1496.2016)。
(iv)靶向HER2的抗体药物缀合物：HER2阳性癌细胞上的高表达和正常组织上的低表达使其成为抗体药物缀合物(ADC)的靶标。曲妥单抗抗体-药物偶联物(Ado-Trastuzumabemtansine，T-DM1)是第一个在实体瘤中被批准的抗HER2 ADC。它由与有效细胞毒类药物DM1(一种微管二聚化抑制剂)连接的曲妥单抗组成。T-DM1的抗肿瘤效应与曲妥单抗和DM1代谢物相关(Juntilla T等人，(2011)Breast Cancer Res Treat 128(2):347-56)。DM1代谢物破坏微管网络，导致细胞周期停滞和凋亡性细胞死亡。尽管T-DM1在高表达HER2的肿瘤中显示出最大的益处，但其在不同HER2表达亚组中显示出功效(Baselga J等人，(2016)Clin Cancer Res clincanres.2499.015)。ADC MM-302由与脂质体多柔比星连接的HER2靶向抗体组成。SYD985是另一种靶向HER2的基于曲妥单抗的ADC，其与毒性烷化剂抗生素倍癌霉素(duocarmycin)连接(Dokter W等人，(2014)Mol Cancer Ther 13(11):2618-29)。DS-8201a是靶向HER2的ADC，其包括与拓扑异构酶I抑制剂连接的人源化抗HER2抗体(Ogitani Y等人，(2016)Clin Cancer Res 22(20):5097-108)。XMT-1522是包括抗HER2抗体的抗HER2 ADC，HT-19连接至基于澳瑞他汀(auristatin)的细胞毒性有效负载(AF-HPA)(Bergstrom D等人，(2016)Can Res 76(4增刊)P4-14-28)。
(v)单克隆抗体：许多较新的抗HER2单克隆抗体正在临床开发中，这些包括10H8和8H11(Kim AY等人，(2013)ASCO年会会刊)，MGAH22(马吉妥昔单抗，margetuximab)，其是一种Fc优化的嵌合抗HER2单克隆抗体，厄妥索单抗(Ertumaxomab)，其是靶向HER2，T细胞特异性CD3抗原和FcγI/III型受体；和CMAB302(赛普汀，cipterbin)，其是曲妥单抗的生物类似物。
(vi)双特异性抗体：已经开发了靶向HER2/HER3异二聚体的双特异性抗体MM-111(McDonagh CF等人，(2012)Mol Cancer Ther 11(3):582-93)。人类早期研究中的许多第一项是评价作为单一疗法以及与曲妥单抗和各种化疗方案或拉帕替尼组合的HER2阳性实体瘤中的MM-111。MM-111也在胃肠恶性肿瘤中进行研究。MCLA-128是靶向HER2和Her3的具有增强的ADCC活性的人源化双特异性抗体(Calvo E等人，Abstract CT050 AACR 2016)。MCLA-128阻断通过HER2:Her3异二聚体甚至在高调蛋白浓度下的下游信号转导。GBR 1302是靶向CD3ε和HER2的另一种双特异性抗体，其在过表达HER2和非过表达HER2的肿瘤中显示有效的抗肿瘤活性后在早期临床试验中评价(Moretti P等人，(2016)BEAT GBR 1302)。ZW25是靶向HER2受体的胞外结构域上的两个不同表位的双特异性抗体，并且目前在1期临床试验中在表达HER2的癌症中进行评价。已经开发了另一种双特异性免疫毒素，其包括与白喉毒素-抗-EpCAM融合的抗-HER2单链可变片段(scFv)。
尽管有各种方法，仍然存在挑战。对单药剂曲妥单抗的主要抗性发生在70％的过表达HER2的乳腺癌中(Vogel CL等人，(2002)20(3):719-26)，大多数患者在治疗期间发展出抗性。已经提出了许多机制(参见Parakh S等人，同上)。与曲妥单抗相比，对帕妥珠单抗的抗性机制知之甚少。类似于其他抗HER2疗法，也发生了对T-DM1的原发性和获得性抗性(Tan X等人，(2013)Can Res 73(8增刊):4629)。而对T-DM1的抗性机制似乎取决于肿瘤的大小和治疗的持续时间；甚至在长潜伏期后也观察到抗性(Barok M等人，(2011)BreastCancer Res 13(2):R46)。
尽管曲妥单抗(赫赛汀)、帕妥珠单抗和T-DM1缀合物取得了成功，但是目前HER2抗体的毒性是剂量限制性的，并且抗性总是如上所述地发展。显然需要靶向HER2而没有相关毒性特征的新策略。
发明内容
本发明提供了分离的特异性结合蛋白，其在结构域II的构象柔性区域中结合HER2的胞外结构域(ECD)。特别地，结合蛋白识别HER2表位，该表位不显示来自野生型HER2序列的任何氨基酸序列改变或取代，并且响应于HER2扩增或活化而暴露于细胞中。构象暴露的表位仅在致瘤、过度增殖或异常细胞中发现，而在正常或野生型细胞中检测不到。“野生型”意指表达内源性HER2的细胞，但具体地排除过表达HER2基因的细胞；术语“野生型”是指存在于正常细胞而不是异常或致瘤细胞中的基因型或表型或其它特征。
有趣的是，本发明的结合蛋白不阻断帕妥珠单抗或曲妥单抗/赫赛汀与癌细胞上的HER2的结合，表明当构象暴露时，结构域II的该表位区域允许本结合分子结合而不阻断这些抗体的结合，潜在地允许双重治疗方法。更具体地，本发明人已经发现，尽管本发明的结合分子在癌细胞表面上结合较小比例的HER2(例如，当与帕妥珠单抗或曲妥单抗比较时)，但其在与帕妥珠单抗或曲妥单抗等效的浓度下在体内同样有效，尽管结合较少的受体。由于本发明的结合分子是内在化的并且是肿瘤细胞特异性的，因此它们理想地适合作为与其他HER2抗体的双重治疗方法中的药物缀合物或药剂。
本发明的特异性结合蛋白可以是抗体或其片段，例如其免疫原性片段，其在不存在异常表达和存在正常HER2翻译后修饰的情况下不结合或识别含有正常或野生型HER2表位的正常或野生型细胞。更具体地，本发明的特异性结合蛋白可以是识别HER2表位的抗体或其片段，HER2表位存在于过表达HER2的细胞中(例如，HER2基因被扩增)，特别是在异常翻译后修饰的存在下，并且在正常条件下，特别是在正常翻译后修饰的存在下，在表达HER2的细胞中不可检测。
本发明人已经发现了新的单克隆抗体，在此通过称为mAb104的抗体举例说明，其特异性识别异常表达的HER2。特别地，本发明的抗体识别在致瘤性，过度增殖性或异常细胞中发现的并且在正常或野生型细胞中不可检测的HER2表位。本发明的抗体进一步通过本文所述的抗体mAb105、mAb106和mAb107举例说明。
本发明提供了包括抗原结合结构域的HER2/ErbB结合蛋白，其中抗原结合结构域特异性地结合响应于HER2扩增或活化而暴露的HER2的结构域II内的表位。在一个实例中，HER2结合蛋白结合HER2的区域，该区域在致瘤性、过度增殖性或异常细胞中构象暴露，但在正常或野生型细胞中不暴露。
在另一个实例中，结合蛋白与其表位的结合不阻断帕妥珠单抗或曲妥单抗/赫赛汀的结合。在一个实例中，结合蛋白不是帕妥珠单抗或曲妥单抗。在一个实例中，结合蛋白结合包括如图1(SEQ ID NO：27)所示的成熟正常或野生型人HER2序列的第293至309位残基的区域。该区域在HER2胞外结构域(ECD)中形成结构域II的一部分。在一个具体实例中，表位包括氨基酸序列CPLHNQEVTAEDGTQRC(SEQ ID NO：1)。该表位在图1中以粗体和下划线序列显示。尽管该表位包括也存在于帕妥珠单抗结合的表位中的P294、L295和H296，但是目前描述的结合蛋白是非帕妥珠单抗阻断的，并且允许帕妥珠单抗同时结合HER2。表位可通过本领域技术人员已知的任何常规表位作图技术确定。
在一个实例中，结合蛋白不结合或基本上不结合人EGFR(HER1)或HER3或HER4。
在一个实例中，结合蛋白是具有本发明人已经鉴定和表征的抗体特征的结合蛋白，特别是识别异常表达的HER2的结合蛋白，如在扩增的HER2中发现的。在另一个实例中，结合蛋白结合表达高水平HER2的肿瘤细胞系。在一个实例中，使用免疫组织化学分析测定HER2过表达。在一个具体实例中，使用美国临床肿瘤学学会和美国病理学家协会(ASCO/CAP)对乳腺癌中HER2测试的建议(Wolff AC等人(2013)Journal of Clinical Oncology31(31):3997-4013)对染色模式进行评估和评分。
在另一个实例中，结合蛋白与选自乳腺癌、胃癌、鳞状细胞癌和结肠癌组成的组的癌细胞结合。在另一个实例中，结合蛋白结合选自乳腺(例如BT 474、SK-BR3、SUM 159PT、MDA-MB-453)、胃(例如NCI-N87、MK N7)、鳞状细胞癌(例如A431)和结肠癌(COLO205、LIM1215)组成的组的细胞系。
在另一个实例中，与帕妥珠单抗和/或曲妥单抗相比，结合蛋白在癌细胞的细胞表面上结合较小比例的HER2/ErbB。在另一个实例中，当通过流式细胞术评估时，结合蛋白以低于曲妥单抗或帕妥珠单抗的结合至少1个对数、至少2个对数或至少3个对数的数量级与表达HER2+的细胞结合。在某些实例中，结合蛋白结合癌细胞表面上表达的总HER2/ErB2的小于30％、小于20％、小于10％、小于5％或小于1％。在一个实例中，结合蛋白结合HER2/Erb2的比例为癌细胞表面上表达的总HER2/Erb2的约0.35-0.5％。
在一个实例中，结合蛋白不与正常胃粘膜结合。在另一个实例中，结合蛋白不与正常乳腺细胞结合。
在另一个实例中，结合蛋白能够内化到肿瘤细胞中。在某些实例中，结合蛋白在体内对肿瘤细胞(例如胃细胞)具有抗增殖作用。在其它实例中，结合蛋白具有与帕妥珠单抗或曲妥单抗相当的体内抗肿瘤作用。在另一个实例中，结合蛋白引起肿瘤细胞(例如，乳腺肿瘤细胞)的坏死。
本文所述的具有这种结合特征的示例性HER2结合蛋白包括称为mAb104或mAb106的抗体的可变区和/或CDR。
在一个实例中，结合蛋白以与指定为mAb104或mAb106的抗体相似或基本相同的水平，或以相似或基本相同的亲和力结合包括SEQ ID NO：1所示序列或由SEQ ID NO：1所示序列组成的肽，或结合人HER2 ECD中的序列。在特定实例中，结合蛋白结合包括如图1所示的成熟正常或野生型人HER2序列的第293至309位残基或由其组成的连续氨基酸序列。
在另一个实例中，HER2结合蛋白竞争性抑制称为mAb104或mAb106的抗体与人HER2的结合。在另一个实例中，蛋白竞争性抑制称为mAb104或mAb106的抗体与由SEQ ID NO：1所示序列组成的肽的结合。
在一个实例中，HER2结合蛋白以抗体结合量的75％以内的量结合包括SEQ ID NO：1所示序列或由SEQ ID NO：1所示序列组成的肽，所述抗体包括包括SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：4所示序列的VH和包括SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示序列的VL。
在一个实例中，通过使HER2结合蛋白与由SEQ ID NO：1中所示的序列组成的肽和与该肽接触的HER2结合蛋白的量(例如10μg/ml)接触来评估结合的蛋白或抗体的量。然后测定与肽结合的HER2结合蛋白的量，并与包括分别与肽结合的包括SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：4所示序列的VH和包括SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示序列的VL的抗体的量进行比较。在一个实例中，与肽结合的HER2结合蛋白的量在抗体结合量的约80％、或70％或60％或40％内。
本发明还提供了HER2结合蛋白，其竞争性抑制指定为以下的抗体的结合：
(i)mAb104，抗体包括VH和VL，VH包括SEQ ID NO：2中所示的序列，VL包括SEQ IDNO：3中所示的序列；或
(ii)mAb106，其包括VH和VL，VH包括SEQ ID NO：4中所示的序列，VL包括SEQ IDNO：5中所示的序列，至包括SEQ ID NO：1中所示的序列或由SEQ ID NO：1中所示的序列组成的肽或人HER2的ECD(例如图1)。
在一个实例中，HER2结合蛋白以2.90-3.20nM的亲和解离常数(KD)结合HER2的ECD，例如具有图1所示的序列。在另一个实例中，KD在约2.90至约3nM之间。在另一个实例中，KD为约3nM。
在一个实例中，通过在配备有链霉亲和素(SA)芯片的生物传感器中利用表面等离振子共振(SPR)并在芯片表面上捕获生物素偶联的人HER2肽(例如根据SEQ ID NO：1的肽)并使HER2结合蛋白在其上通过来评估KD。
当通过SA芯片生物素肽SPR评估时，本发明的示例性HER2结合蛋白具有约3nM(例如+/-0.2nM)的KD。在一个实例中，HER2结合蛋白对于mAb104或mAb106具有如表7所示的KD。
在一个实例中，本发明的HER2结合蛋白特异性结合人HER2。在一个实例中，通过ELISA评估蛋白的结合。
本发明的HER2结合蛋白可以是抗HER2重组或合成或单克隆抗体或其抗原结合片段。
在一个实例中，HER2结合蛋白是包括人重链和轻链恒定区序列的嵌合抗体。在另一个实例中，HER2结合蛋白是人源化或完全人抗体。
在一个实例中，HER2结合蛋白包括与mAb104的重链可变区序列(SEQ ID NO：2)具有至少55％同一性的重链可变区序列(VH)。
在一个实例中，HER2结合蛋白包括与mAb104的轻链可变区序列(SEQ ID NO：3)具有至少50％同一性的轻链可变区序列(VL)。
在一个实例中，结合蛋白包括；
(i)具有如下序列的VH CDR1：
GYX7FTX8YX9MX10(SEQ ID NO：6)
其中X7是S或T；X8是G或D；X9是F或G；X10是H或N；
(ii)具有如下序列的VH CDR2：
X19INX20YX21GX22X23X24YX25X26X27FKX28(SEQ ID NO：7)
其中X19是R或W；X20是P或T；X21是N或T；X22是D或K；X23是I或P；X24是R或T；X25是N或D；X26是Q或D；X27是N或D；且X28是D或G；
(iii)具有如下序列的VH CDR3：
X50X51X52X53X54X55X56X57X58X59X60X61FX62Y(SEQ ID NO：8)
其中X50不存在或是R；X51不存在或是F；X52不存在或是L；X53不存在或是N；X54不存在或是T；X55不存在或是V；X56不存在或是A；X57不存在或是G；X58不存在或是R；X59不存在或是S；X60是L或V；X61是N或Y；并且X62是A或D；
和/或
(iv)具有如下序列的VL CDR1：
X14X15SX16SX17X18X19X20X21X22X23X24X25X26X27(SEQ ID NO：9)
其中X14是K或S；X15是S或V；X16是Q或S；X17是L或不存在；X18是L或不存在；X19是D或不存在；X20是S或不存在；X21是D或不存在；X22是G或不存在；X23是K或V；X24是T或G；X25是F或S；X26是L或M；并且X27是N或Y；
(v)具有如下序列的VL CDR2：
LX35SX36LX37S(SEQ ID NO：10)
X35是D或E；X36是K或T；X37是S或A；以及
(vi)具有如下序列的VL CDR3：
X49QX50X51X52X53PX54T(SEQ ID NO：11)
其中X49是W或Q；X50是G或W；X51是T或S；X52是H或S；X53是F或N；且X54是W或P。
在一个实例中，HER2结合蛋白包括以下所列的重链可变区序列(VH)：
X1X2QLX3QSGPELX4KPGX5X6VKISCKASGYX7FTX8YX9MX10 WVX11QX12X13
X14X15X16LX17WX18GX19INX20YX21GX22X23X24YX25X26X27FKX28 X29X30X31X32X33X34X35X36SX37STAYX38X39X40X41X42LX43X44EDX45AX46X47X48CAX49 X50X51
X52X53X54X55X56X57X58X59X60X61FX62YWGQGTX63X64TVSX65(SEQ ID NO：12)
其中
X1是E或Q；X2是V或I；X3是Q或V；X4是V或K；X5是A或E；X6是S或T；X7是S或T；X8是G或D；X9是F或G；X10是H或N；X11是R或K；X12是S或A；X13是H或P；X14是V或G；X15是R或K；X16是S或G；X17是E或K；X18是I或M；X19是R或W；X20是P或T；X21是N或T；X22是D或K；X23是I或P；X24是R或T；X25是N或D；X26是Q或D；X27是N或D；X28是D或G；X29是K或R；X30是A或F；X31是S或A；X32是L或F；X33是T或S；X34是V或L；X35是D或E；X36是K或T；X37是S或A；X38是M或L；X39是E或Q；X40是L或I；X41是H或N；X42是R或N；X43是T或K；X44是S或N；X45是S或M；X46是V或T；X47是F或Y；X48是Y或F；X49是S或R；X50不存在或是R；X51不存在或是F；X52不存在或是L；X53不存在或是N；X54不存在或是T；X55不存在或是V；X56不存在或是A；X57不存在或是G；X58不存在或是R；X59不存在或是S；X60是L或V；X61是N或Y；X62是A或D；X63是P或T；X64是V或L；并且X65是A或S。
在一个实例中，HER2结合蛋白还包括以下所列的轻链可变区序列(VL)：
X1IVX2TQSPX3X4X5SVX6X7GX8X9X10X11X12X13CX14X15SX16SX17X18X19X20X21
X22X23X24X25X26X27 WX28X29QX30PX31X32SPKX33X34IYLX35SX36LX37SGVPX38RFX39GSGSGTX4 0X41X42LX43ISX44X45EAEDX46X47X48YYCX49QX50X51X52X53PX54TFGX55GTKLEX56KR(SEQ ID NO：13)
其中
X1是D或Q；X2是I或L；X3是L或A；X4是T或L；X5是L或M；X6是T或S；X7是F或P；X8是Q或E；X9是P或K；X10是A或V；X11是S或T；X12是I或M；X13是S或T；X14是K或S；X15是S或V；X16是Q或S；X17是L或不存在；X18是L或不存在；X19是D或不存在；X20是S或不存在；X21是D或不存在；X22是G或不存在；X23是K或V；X24是T或G；X25是F或S；X26是L或M；X27是N或Y；X28是L或Y；X29是L或Q；X30是R或K；X31是G或R；X32是Q或S；X33是R或P；X34是L或W；X35是V或T；X36是K或N；X37是D或A；X38是D或P；X39是T或S；X40是D或S；X41是F或Y；X42是T或S；X43是K或T；X44是R或S；X45是V或M；X46是L或A；X47是G或A；X48是V或T；X49是W或Q；X50是G或W；X51是T或S；X52是H或S；X53是F或N；X54是W或P；X55是G或A；并且X56是I或L。
在一个实例中，VH包括选自GYSFTGYFMH(SEQ ID NO：14)或GYTFTDYGMN(SEQ IDNO：15)的CDR1序列或由其组成。
在一个实例中，VH包括选自RINPYNGDIRYNQNFKD(SEQ ID NO：16)或WINTYTGKPTYDDDFKG(SEQ ID NO：17)的CDR2序列或由其组成。
在一个实例中，VH包括选自LNFAY(SEQ ID NO：18)或RFLNTVAGRSVYFDY(SEQ IDNO：19)的CDR3序列或由其组成。
在一个实例中，VL包括选自KSSQSLLDSDGKTFLN(SEQ ID NO：20)或SVSSSVGSMY(SEQID NO：21)的CDR1序列或由其组成。
在一个实例中，VL包括选自LVSKLDS(SEQ ID NO：22)或LTSNLAS(SEQ ID NO：23)的CDR2序列或由其组成。
在一个实例中，VL包括选自WQGTHFPWT(SEQ ID NO：24)或QQWSSNPPT(SEQ ID NO：25)的CDR3序列或由其组成。
本发明还提供了包括重链可变区序列(VH)的HER2结合蛋白，重链可变区序列具有分别包括以下或由以下组成的CDR1、CDR2和CDR3序列：
(i)SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16以及SEQ ID NO：18；或
(ii)SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17以及SEQ ID NO：19。
本发明还提供了包括轻链可变区序列(VL)的HER2结合蛋白，轻链可变区序列具有分别包括以下或由以下组成的CDR1、CDR2和CDR3序列：
(i)SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22以及SEQ ID NO：24；或
(ii)SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23以及SEQ ID NO：25；
在一个实例中，HER2结合蛋白包括具有包括或由SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18和/或SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：24组成的序列的CDR。
在一个实例中，HER2结合蛋白包括具有包括或由SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：19、和/或SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：25组成的序列的CDR。
在一个实例中，HER2结合蛋白包括VH和/或VL，VH包括与SEQ ID NO：2中所示序列具有至少55％同一性的序列，VL包括与SEQ ID NO：3中所示序列具有至少50％同一性的序列，或其人源化、嵌合或去免疫化形式。
在一个实例中，HER2结合蛋白包括VH和/或VL，VH包括与SEQ ID NO：4中所示序列具有至少55％同一性的序列，VL包括与SEQ ID NO：5中所示序列具有至少50％同一性的序列，或其人源化、嵌合或去免疫化形式。
在一个实例中，VH包括与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％同一性的序列。
在一个实例中，VL包括与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5具有至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％同一性的序列。
本发明还提供了包括以下或由以下组成的HER2结合蛋白：
(i)SEQ ID NO：2所示的VH和SEQ ID NO：3所示的VL；或
(ii)SEQ ID NO：4所示的VH和SEQ ID NO：5所示的VL。
在一个实例中，HER2结合蛋白是选自以下的抗原结合片段：
(i)单链Fv片段(scFv)；
(ii)二聚体scFv(di-scFv)；
(iii)连接至重链恒定区或Fc或重链恒定结构域(CH)2和/或CH3的(i)和/或(ii)中的至少一种；或
(iv)与增强抗体半衰期的蛋白连接的(i)和/或(ii)中的至少一种(例如，人血清白蛋白(HSA))。
在本发明的另一个实例中，VL和VH在分开的多肽链中。例如，HER2-结合蛋白是：
(i)双链抗体；
(ii)三链抗体；
(iii)四链抗体；
(iv)Fab；
(v)F(ab′)2；
(vi)Fv；或
(vii)连接至重链恒定区或Fc或重链恒定结构域(CH)2和/或CH3的(i)至(vi)中的至少一种；或
(viii)与增强抗体半衰期的蛋白连接的(i)至(vi)中的至少一种(例如HSA)。
本发明还提供了包括如本文所述的VH和VL的嵌合抗体，其中VH连接至重链恒定区且VL连接至轻链恒定区。
本发明还提供了包括如本文所述的VH和VL的嵌合抗体，其中VH连接至人重链恒定区且VL连接至人轻链恒定区。
基于本文的公开内容，本发明内容的HER2结合蛋白包括人的、人源化的、类人源化的、嵌合的和灵长类化的蛋白，这对本领域技术人员是显而易见的。
本发明的抗体可以属于任何类别，包括IgM、IgG、IgE、IgA、IgD或亚类。IgG的示例性亚类是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
在一个实例中，HER2结合蛋白是重组的。在一个实例中，HER2结合蛋白是合成的。
本发明还提供了能够结合mAb104或mAb106的抗独特型抗体或其抗原结合片段。
在一个实例中，本发明的HER2结合蛋白或抗体与另一部分缀合。该部分可以是可检测的或官能的部分。例如，部分选自放射性同位素、可检测标记、治疗性化合物、胶体、毒素、核酸、肽、蛋白、药物、增加受试对象中HER2结合蛋白半衰期的化合物及其混合物组成的组。在某些实例中，部分可选自免疫球蛋白或免疫球蛋白的片段或部分、治疗性化合物(例如化学疗法)、药物或生物活性剂、毒素或放射性核素。或者，部分可包括siRNA、DNA酶或核酶。任何前述部分的组合也包括在本发明中。在一个实例中，HER2结合蛋白是抗体-药物缀合物。在另一个实例中，抗体-药物缀合物包括连接至一甲基澳瑞他汀E(MMAE)、一甲基澳瑞他汀F(MMAF)、吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)或emtansine(DM1)的本发明的HER2结合蛋白。在某些实例中，通过连接化学实现连接。在一个实例中，药物经由HER2结合蛋白中存在的半胱氨酸或赖氨酸残基缀合至HER2结合蛋白。在其他实例中，连接是经由本领域已知的接头(例如，G-S接头)。在另一个实例中，抗体-药物缀合物能够在与肿瘤细胞上的HER2受体结合时内化。本发明还延伸至包括如本文所述的此类缀合物的组合物。
结合蛋白或抗体的血清半衰期可例如通过将补救受体结合表位掺入抗体中而增加，如US 5,739,277中所述。如本文所用，术语“补救受体结合表位”是指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区的表位，其负责增加IgG分子的体内血清半衰期。在另一个实例中，半衰期通过聚乙二醇化增加。
本发明还提供了编码本发明的HER2结合蛋白或抗体的分离的核酸。
本发明还提供了一种表达构建体，其包括与启动子可操作地连接的本发明的核酸。这样的表达构建体可以在载体(vector)例如质粒中。
在涉及单一多肽HER2结合蛋白的公开内容的实例中，表达构建体可以包括与编码该多肽链的核酸连接的启动子。
在涉及形成HER2结合蛋白的多种多肽的实例中，本发明的表达构建体包括可操作地连接至启动子的编码多肽中的一种的核酸(例如，包括VH)和可操作地连接至另一启动子的编码多肽中的另一种的核酸(例如，包括VL)。
在另一个实例中，表达构建体是双顺反子表达构建体，例如包括以下按5′至3′顺序可操作地连接的组分：
(i)启动子
(ii)编码第一多肽的核酸；
(iii)内部核糖体进入位点；以及
(iv)编码第二多肽的核酸。
例如，第一多肽包括VH且第二多肽包括VL，或第一多肽包括VL且第二多肽包括VH。
本发明还考虑了单独的表达构建体，其中一种编码第一多肽(例如，包括VH和任选的重链恒定区或其部分)，另一种编码第二多肽(例如，包括VL和任选的轻链恒定区)。例如，本发明还提供了一种组合物，其包括：
(i)第一表达构建体，其包括编码多肽的核酸(例如，包括可操作地连接至启动子的VH)；以及
(ii)第二表达构建体，其包括编码多肽的核酸(例如，包括可操作地连接至启动子的VL)，
其中第一和第二多肽缔合形成本发明的HER2结合蛋白。
本发明另外提供表达本发明的HER2结合蛋白或抗体的分离的细胞或基因修饰以表达本发明的HER2结合蛋白或抗体的重组细胞。在一个实例中，细胞是分离的杂交瘤细胞。在另一个实例中，细胞包括本发明的核酸或表达构建体或：
(i)第一表达构建体，其包括编码可操作地连接至启动子多肽(例如，包括VH)的核酸；以及
(ii)第二表达构建体，其包括编码可操作地连接至启动子多肽(例如，包括VL)的核酸，
其中第一和第二多肽缔合形成本发明的HER2结合蛋白或抗体。
本发明还提供了包括本发明的HER2结合蛋白或核酸或表达构建体或细胞和合适载体(carrier)的组合物。在一个实例中，组合物包括本发明的HER2结合蛋白。
在一个实例中，载体(carrier)是药学上可接受的。
本发明的组合物可以单独施用或与其它治疗、治疗剂或药剂组合施用，同时/并行或依次施用。在一个实例中，本发明的HER2结合蛋白或组合物与帕妥珠单抗或曲妥单抗组合施用。在另一个实例中，本发明的HER2结合蛋白或组合物与酪氨酸激酶抑制剂(例如，拉帕替尼)组合施用。还预期本文的HER2结合蛋白或组合物与抗癌疗法(例如化学疗法或放射疗法)同时或依序施用。在另一个实例中，本文所述的HER2结合蛋白或组合物与免疫治疗剂或免疫调节剂同时或相继施用。
本发明的HER2结合蛋白可用于治疗、诊断或检测。在一些实例中，HER2结合蛋白与用作治疗诊断的化疗剂连接。
本发明还提供了包括与可检测标记偶联的本文所述的HER2结合蛋白的诊断剂。在一个实例中，诊断剂用于体内或体外检测表达HER2的肿瘤细胞。
在一个实例中，诊断剂可用于检测受试对象中或从患有HER2阳性肿瘤或怀疑患有HER2阳性肿瘤的受试对象获得的生物样本中表达HER2的肿瘤细胞的存在。可检测标记的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、电子密标记、MRI标记和放射性材料。
本发明还提供如本文所述的HER2结合蛋白或诊断剂，其用于生物样本的组织学检查。制备组织学样本的方法是本领域技术人员所熟悉的。
本发明还提供了用于治疗或预防受试对象中表达HER2的癌症的方法，该方法包括向受试对象施用本发明的HER2结合蛋白或核酸或表达构建体或细胞或组合物。在一个实例中，受试对象是患有癌症例如乳腺癌的受试对象。
在一个实例中，方法包括向受试对象施用抗体或其人源化或去免疫化形式，抗体包括含有SEQ ID NO：2中所示序列的VH和/或含有SEQ ID NO：3中所示序列的VL。
在一个实例中，方法包括向受试对象施用抗体或其人源化或去免疫化形式，抗体包括含有SEQ ID NO：4中所示序列的VH和/或含有SEQ ID NO：5中所示序列的VL。
本发明还提供了用于药物的本发明的HER2结合蛋白或核酸或表达构建体或细胞或组合物。
本发明另外提供本发明的HER2结合蛋白或核酸或表达构建体或细胞或组合物，其用于治疗表达HER2的细胞增殖性病症。
在一个实例中，本发明提供治疗表达HER2的细胞增殖性病症的方法，其包括向有需要的受试对象施用本发明的HER2结合蛋白或核酸或表达构建体或细胞或组合物。在一个实例中，癌症选自乳腺癌、胃癌、胃食管癌、结肠癌和鳞状细胞癌组成的组。
在一个实例中，HER2结合蛋白以治疗有效量施用于受试对象。
优选地，受试对象是人。
本发明还提供了本发明的HER2结合蛋白或核酸或表达构建体或细胞在制备用于治疗表达HER2的癌症的药物中的用途。
本发明另外提供用于检测生物样本中的HER2的方法，该方法包括使样本与本发明的HER2结合蛋白或抗体接触以形成抗原-蛋白复合物并检测复合物，其中检测复合物指示样本中的HER2表达。
本发明还提供了包括根据SEQ ID NO：1的序列或由其组成的疫苗抗原，以及用于产生人HER2抗体的药学上可接受的载体(carrier)。
本发明还提供了用于产生HER2/ErbB2结合蛋白的方法，其包括用包括序列H-GCPLHNQEVTAEDGTQRC-NH2(SEQ ID NO：26)的环肽免疫啮齿动物；从免疫的啮齿动物的B细胞获得杂交瘤细胞系并从该杂交瘤细胞系纯化抗体。在一个实例中，肽通过二硫键环化。在一个实例中，肽通过Cys2和Cys18侧链之间的二硫键环化。在另一个实例中，肽与匙孔戚血蓝(KLH)蛋白连接。
附图说明
图1：包括22个氨基酸前导序列的人受体酪氨酸-蛋白激酶HER2的全长蛋白序列。在富含半胱氨酸的结构域II内由mAb104结合的肽表位以加下划线的粗体文本显示。
图2：用ELISA法比较10μg/mL的(A)mAb104、(B)mAb105、(C)mAb106和(D)mAb107与HER2胞外结构域、与产生抗体的匙孔戚血蓝蛋白(KLH)连接的环化和线状多肽免疫原，或与KLH连接的对照无关肽的结合。一式三份样本的结合活性通过使用Versamax酶标仪(分子装置)在405nm处的光密度吸光度读数测量，使用Softmax Pro 4.8软件和平均值±SD测定。mAb104(A)和mAb106(C)对所有固定的HER2形式显示出最强的结合活性，而mAb105(B)显示出最弱的结合。通过缺乏与对照肽的结合证实了特异性。结果代表两个独立的实验。
图3：通过western blot与细胞裂解物结合的抗体。洗涤SK-BR-3、BT-474、MDA-MB-453和NCI-N87细胞，裂解并免疫印迹内源HER2(商业阳性对照抗体2242，Cell SignalingTechnology，Beverly，MA)，mAb104、mAb105、mAb106、mAb107。结果代表两个独立的实验。
图4：分别指定mAb104(A和B)和mAb106(C和D)的重链和轻链的CDR(用粗体和下划线表示)。由Kabat和Chothia编号的CDR命名。
图5：HER2抗体(A)曲妥单抗(B)mAb106和(C)mAb104与HER2 ECD的结合的比较通过表面等离振子共振使用BIAcore T200生物传感器在320μg/mL至10μg/mL(2133至66nM)的抗体浓度检测。痕迹代表抗体在溶液中与固定的重组HER2 ECD的结合和解离。结果代表两个或多个实验
图6：基于ELISA的HER2-ECD结合竞争测定(A)曲妥单抗和帕妥珠单抗不影响mAb104结合(B)mAb104不影响曲妥单抗结合(C)mAb104部分影响帕妥珠单抗与酶标板结合的重组HER2 ECD结合。(数据；平均值±SE；n＝3)结果代表两个实验。
图7-1至7-4：基于FACS的竞争测定。与10倍过量的mAb104(100μg/mL)预孵育不影响BT-474细胞(A和B)、SK-BR-3细胞(C和D)、NCI-N87细胞(E和F)或OE-19细胞(G和H)上的10μg/mL曲妥单抗或帕妥珠单抗结合癌细胞表面HER2。结果代表两个或多个实验。
图8-1：在4％SDS-PAGE上分离癌细胞系的裂解物，并用(A)mAb104、(B)抗HER2和(C)抗HER3印迹。GAPDH用作蛋白标准化的上样对照。泳道1：分子量标志物。结果代表三个实验。
图8-2.ELISA分析。用重组sEGFR胞外域或HER2、HER3或HER4的ECD包被mAb104(3-10,000ng/mL)结合酶标板的特异性。包括单独的pNPP底物和二级抗小鼠抗体-碱性磷酸酶缀合物的对照。(数据；平均值±SE；n＝3)。
图9-1至9-3：mAb104(A和B)单独或与曲妥单抗(C和D)或帕妥珠单抗(E和F)组合对SK-BR-3(A、C和E)或BT-474细胞(B、D和F)的体外生长的影响，如通过MTS测定所测量。将细胞与mAb104、曲妥单抗、帕妥珠单抗、同种型对照作为单一疗法或与曲妥单抗+帕妥珠单抗，曲妥单抗+mAb104或帕妥珠单抗+mAb104组合在去血清培养基中孵育5-7天。在基线和实验结束时测定活细胞数。结果表示为平均值±SD，n＝3。数据代表两个或多个独立实验。*mAb014，帕妥珠单抗和同种型对照抗体没有抗增殖作用并且彼此重叠。
图10-1和10-2：单一疗法(A和B)或与曲妥单抗或帕妥珠单抗(C和D)联合使用时，mAb104在体外不影响MAPK通路的下游信号转导和(A)SK-BR-3和(B)BT474细胞中的Akt。将细胞在去血清培养基中孵育，在进行全细胞裂解之前，用100μg/mL的mAb104、曲妥单抗、帕妥珠单抗单独或组合处理24h。然后将等量的裂解物上样并在4-12％凝胶上分离，然后转移到硝酸纤维素膜上。如图所示对膜进行免疫印迹。结果代表两个实验。
图11-1和11-2：单一疗法(A和B)或与曲妥单抗或帕妥珠单抗(C和D)联合使用时，mAb104在体外不影响MAPK通路的配体依赖性磷酸化和(A)SK-BR-3和(B)BT474细胞中的Akt。将细胞在去血清培养基中孵育，用100μg/mL的mAb104、曲妥单抗和帕妥珠单抗单独或组合处理24h，然后加入100ng EGF10min。全细胞裂解后，将等量的裂解物上样并在4-12％凝胶上分离，然后转移到硝酸纤维素膜上。如图所示对膜进行免疫印迹。结果代表两个实验。
图12-1至12-4：在用曲妥单抗、帕妥珠单抗和mAb104作为单一疗法和组合(所有组中的总抗体为0.1mg/mL)(A至H)BT474细胞和(I至P)SK-BR-3细胞处理4h后，通过膜联蛋白-V和碘化丙啶(PI)染色的流式细胞术分析评估治疗对乳腺癌细胞活力和凋亡的影响。
图13：mAb104在BT-474乳腺癌异种移植物中的抗肿瘤作用。用1mg mAb104、曲妥单抗、帕妥珠单抗、同种型对照处理小鼠(n＝5)。治疗开始时的肿瘤体积为100-120mm3。生长曲线中所示的数据表示平均肿瘤体积±S.E.各治疗组中的肿瘤显著小于对照组*p<0.001对照对比mAb104；**p<0.0001对照对比曲妥单抗和帕妥珠单抗。
图14：mAb104在BT-474异种移植物中的抗肿瘤作用。用0.5mg mAb104、曲妥单抗、帕妥珠单抗、同种型对照处理小鼠(n＝5/组)。治疗开始时的肿瘤体积为120-150mm3。生长曲线中所示的数据表示平均肿瘤体积±S.E.*p<0.01，对照对比mAb104治疗组。
图15-1至15-3：(A)mAb104在HER2-阳性乳腺PDX模型中的抗肿瘤效应。用0.5mgmAb104、曲妥单抗、帕妥珠单抗、同种型对照处理小鼠(n＝5/组)。治疗开始时的肿瘤体积为100-120mm3。(B)mAb104与曲妥单抗组合在BT-474异种移植物中的抗肿瘤作用。用总剂量0.5mg的mAb104+曲妥单抗、曲妥单抗+帕妥珠单抗或同种型对照处理小鼠(n＝5)。治疗开始时的肿瘤体积为120-150mm3。*p<0.0001对照组对比曲妥单抗/mAb104。(c)mAb104与曲妥单抗组合在HER2阳性乳腺PDX模型中的抗肿瘤作用。用总剂量0.5mg的mAb104+曲妥单抗、曲妥单抗+帕妥珠单抗或同种型对照处理小鼠(n＝5)。治疗开始时的肿瘤体积为120-150mm3。*p<0.0001，对照组对比mAb104；**p<0.001，曲妥单抗对比曲妥单抗/mAb104。组A-C)的生长曲线中所示的数据表示平均肿瘤体积±S.E.。
图16-1和16-2：通过免疫组织化学评估BT-474异种移植肿瘤的以下影响：抗HER2单一疗法(0.5mg剂量)对(A)通过Ki67的增殖(B)通过染色磷酸化-Akt的下游信号转导(C)通过染色足萼糖蛋白对脉管系统的作用；或mAb104与曲妥单抗(0.5mg总蛋白剂量)的组合对(D)通过Ki67的增殖，(E)通过染色磷酸化-Akt的下游信号转导(F)通过染色足萼糖蛋白对脉管系统的作用的影响。*p<0.001对照组对比曲妥单抗。
图17：如通过MTS测定，mAb104在体外不抑制(A)NCI-N87和(B)OE19胃癌细胞的生长。将细胞与作为单一疗法(A和B)的mAb104、曲妥单抗、帕妥珠单抗、同种型对照在去血清培养基中孵育5-7天。在基线和实验结束时测定活细胞数。结果表示为平均值±SD，n＝3。数据代表两个或多个独立实验。*p<0.0001，对照对比曲妥单抗。
图18：如通过MTS测定，mAb104在体外不抑制(A)NCI-N87和(B)OE19胃癌细胞的生长。将细胞与mAb104与曲妥单抗+帕妥珠单抗，曲妥单抗+mAb104或帕妥珠单抗+mAb104组合在去血清培养基中孵育5-7天。在基线和实验结束时测定活细胞数。结果表示为平均值±SD，n＝3。数据代表两个或多个独立实验。*p≤0.005，与对照相比
图19-1和19-2：单一疗法(A和B)或与曲妥单抗或帕妥珠单抗(C和D)联合使用时，mAb104在体外不影响MAPK通路的下游信号转导和(A)NCI-N87和(B)OE-19细胞中的Akt。将细胞在去血清培养基中孵育，在进行全细胞裂解之前，用100μg/mL的mAb104、曲妥单抗、帕妥珠单抗单独或与曲妥单抗或帕妥珠单抗组合处理24h。然后将等量的裂解物上样并在4-12％凝胶上分离，然后转移到硝酸纤维素膜上。如图所示对膜进行免疫印迹。结果代表两个实验。
图20-1和20-2：单一疗法(A和B)或与曲妥单抗或帕妥珠单抗(C和D)联合使用时，mAb104在体外不影响MAPK通路的配体依赖性磷酸化和(A)NC-N87和(B)OE-19细胞中的Akt。将细胞在去血清培养基中孵育，用100μg/mL的mAb104、曲妥单抗和帕妥珠单抗单独或组合处理24h，然后加入100ng EGF 10min。全细胞裂解后，将等量的裂解物上样并在4-12％凝胶上分离，然后转移到硝酸纤维素膜上。如图所示对膜进行免疫印迹。结果代表两个实验。
图21-1和21-2：在用曲妥单抗、帕妥珠单抗和mAb104作为单一疗法和组合(A和B)NCI-N87胃癌和(C)OE-19食管癌细胞治疗4h后，通过碘化丙啶(PI)染色评估治疗对癌细胞活力和凋亡的影响。
图22：融合的OE-19细胞用于迁移测定。在0或100μg/mL抗体孵育的0h和90h收集的图像。与剂量为100μg/mL的对照抗体相比，抗体在处理后90h不延迟OE-19细胞的迁移。
图23：mAb104在NCI-N87异种移植物中的抗肿瘤作用。用1mg mAb104、曲妥单抗、帕妥珠单抗、同种型对照处理小鼠(n＝5)处理或不处理。治疗开始时的肿瘤体积为100-120mm3。生长曲线中所示的数据表示平均肿瘤体积±S.E.*p≤0.01，对照对比mAb104。
图24：mAb104在NCI-N87异种移植物中的抗肿瘤作用。用0.5mg mAb104、曲妥单抗、帕妥珠单抗、同种型对照处理小鼠(n＝5)处理或不处理。治疗开始时的肿瘤体积为100-120mm3。显示了生长曲线(A)和生存曲线(B)。生长曲线中所示的数据表示平均肿瘤体积±S.E.存活分析的终点是肿瘤体积>1000mm3或垂死状态。*p<0.001，对照对比mAb104；**p<0.0001对照对比治疗组。
图25：mAb104在NCI-N87异种移植物中的抗肿瘤作用。用0.1mg mAb104、曲妥单抗、帕妥珠单抗、同种型对照处理小鼠(n＝5)处理或不处理。治疗开始时的肿瘤体积为100-120mm3。显示了生长曲线(A)和生存曲线(B)。生长曲线中所示的数据表示平均肿瘤体积±S.E.存活分析的终点是肿瘤体积>1000mm3或垂死状态。*p≤0.001，对照对比mAb104；**p<0.0002对照对比治疗组。
图26：mAb104在OE-19异种移植物中的抗肿瘤作用。用1mg mAb104、曲妥单抗、帕妥珠单抗、同种型对照处理小鼠(n＝5)处理或不处理。治疗开始时的肿瘤体积为100-120mm3。生长曲线中所示的数据表示平均肿瘤体积±S.E.*p≤0.0001，对照对比mAb104。
图27：mAb104在OE-19异种移植物中的抗肿瘤作用。用0.5mg mAb104、曲妥单抗、帕妥珠单抗、同种型对照处理小鼠(n＝5)。治疗开始时的肿瘤体积为100-120mm3。显示了生长曲线(A)和生存曲线(B)。生长曲线中所示的数据表示平均肿瘤体积±S.E.存活分析的终点是肿瘤体积>1000mm3或垂死状态。*p<0.001，对照对比曲妥单抗。**p<0.006，对照对比治疗组。
图28：mAb104与曲妥单抗组合在NCI-N87异种移植物中的抗肿瘤作用。用总剂量0.5mg的mAb104+曲妥单抗、曲妥单抗+帕妥珠单抗或同种型对照处理小鼠(n＝5)。治疗开始时的肿瘤体积为100-120mm3。生长曲线中所示的数据表示平均肿瘤体积±S.E.*p<0.0001，对照组对比mAb104；**p<0.001，曲妥单抗对比曲妥单抗/mAb104。
图29：mAb104与曲妥单抗组合在OE-19异种移植物中的抗肿瘤作用。用总剂量0.5mg的mAb104+曲妥单抗、曲妥单抗+帕妥珠单抗或同种型对照处理小鼠(n＝5)。治疗开始时的肿瘤体积为100-120mm3。显示了生长曲线(A)和生存曲线(B)。生长曲线中所示的数据表示平均肿瘤体积±S.E.存活分析的终点是肿瘤体积>1000mm3或垂死状态。*p<0.0001对照组对比曲妥单抗/mAb104；**p<0.0001对照对比曲妥单抗/帕妥珠单抗；***p<0.0001曲妥单抗对比曲妥单抗/mAb104；±p<0.0005，对照对比治疗组。
图30-1和30-2：通过免疫组织化学评估NCI-N87异种移植肿瘤抗HER2单一疗法(0.5mg剂量)(A至C)或与曲妥单抗组合(D至F)对(A和D)通过Ki67增殖的作用；(B和E)通过磷酸化-Akt染色的下游信号转导和(C和F)通过足萼糖蛋白染色对脉管系统的影响。
图31-1和31-2：通过免疫组织化学评估OE-19异种移植肿瘤抗HER2单一疗法(0.5mg剂量)(A至C)或与曲妥单抗组合(D至F)对(A和D)通过Ki67增殖的作用；(B和E)通过磷酸化-Akt染色的下游信号转导和(C和F)通过足萼糖蛋白染色对脉管系统的影响。
图32：用于测定89Zr标记的抗HER抗体的免疫反应性部分的结合测定。A)显示了根据增加的细胞浓度的特异性结合对总应用放射性的常规图。B)和C)是与A中相同的数据的双倒数图，允许针对代表无限抗原过量的条件确定免疫反应性级分。
图33：A)的结合的斯卡查德图89Zr-labelled mAb104 and B)89Zr-labelledHerceptin/Trastuzumab binding to NCI-N87 gastric carcinoma cells.横坐标表示特异性结合的抗体的浓度，纵坐标是特异性结合的抗体与反应性的游离抗体的浓度之比。由横坐标处的截距值确定每个细胞的结合容量，并由线的斜率确定缔合常数。
图34.A)锆-89标记的mAb104在携带过表达HER2的NCI-N87胃癌异种移植物的小鼠中的生物分布。B)锆-89标记的mAb104和同种型对照在携带NCI-N87异种移植物的小鼠的血液和肿瘤中的生物分布。用mAb104证明了高特异性肿瘤摄取。(数据平均值±SEM，n＝5)。
序列表关键字
SEQ ID NO:1：HER2/ErbB2表位序列
SEQ ID NO:2：mAb104的VH
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SEQ ID NO:4：mAb106的VH
SEQ ID NO:5：mAb106的VL
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SEQ ID NO:27：HER2/ErbB2的序列
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SEQ ID NO:55：轻链引物序列
具体实施方式
一般术语
在整个说明书中，除非另有特别说明或上下文另有要求，引用单个步骤、物质组成、步骤组或物质组成组应被认为包括一个和多个(即一个或更多个)那些步骤、物质组成、步骤组或物质组成组。
本领域技术人员将理解，除了具体描述的那些之外，本发明易于变化和修改。应当理解，本发明包括所有这样的变化和修改。本发明还包括本说明书中单独或共同提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征中的任何两个或更多个的任何和所有组合。
本发明不限于本文描述的特定实施例的范围，这些实施例仅用于示例性目的。功能上等同的产物、组合物和方法清楚地在本发明的范围内。
除非另外具体说明，否则应对其加以必要的变更后适用于本发明的任何其他实例。
除非另有明确定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均应被视为具有与本领域(例如，在细胞培养、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学中)普通技术人员通常理解的相同含义。
除非另有说明，本公开中使用的重组蛋白、重组DNA技术、分子生物学、微生物学、细胞培养和免疫学技术是本领域技术人员熟知的标准方法。这些技术在以下来源文献中都有描述和解释，例如，J.Perbal，《分子克隆实用指南》(A Practical Guide to MolecularCloning)，John Wiley and Sons(1984)，J.Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)，T.A.Brown(编)，《基本分子生物学：一种实用方法》(Essential MolecularBiology：A Practical Approach)，第1卷和第2卷，IRL Press(1991)，D.M.Glover和B.D.Hames(编)，《DNA克隆：一种实用方法》(DNA Cloning：A Practical Approach)，第1-4卷，IRL Press(1995和1996)，以及F.M.Ausubel等人，(编)，《分子生物学现行实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)，Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括目前为止的所有更新)，Ed Harlow和David Lane(编)《抗体：实验室手册》(Antibodies：A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，(1988)，以及以及J.E.Coligan等人，(编)，《免疫学现行实验指南》(Current Protocols inImmunology)，John Wiley&Sons(包括目前为止的所有更新)。
本文中可变区及其部分、免疫球蛋白、抗体及其片段的描述和定义可通过Kabat，1987和/或1991，Bork等人，1994和/或Chothia和Lesk，1987和/或1989或Al-Lazikani等人，1997或Lefranc M.-P.的IMGT编号(the IMGT numbering of Lefranc M.-P.)，(1997)Immunology 5Today 18，509中的讨论进一步阐明。
在整个说明书中，词语“包括(comprise)”或诸如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”的变化形式将被理解为意指包括所陈述的要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的组，但不排除任何其他要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的组。
如本文所使用的，术语“从…衍生”应当用于表示指定的整数可以从特定的源获得，尽管不必直接从该源获得。
在肽序列的上下文中，术语“由…组成”或“基本上由…组成”是指具有确定数目的残基的肽序列，其未共价连接至较大产物。
除非另外具体说明，否则本文中的任何实施例应被理解为比照适用于任何其他实施例。
选定定义
如本文所用，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。术语“一(a)(或一(an))”以及术语“一个或多个”和“至少一个”在本文中互换使用。
此外，“和/或”在本文中使用时应视为两个指定特征或组分中的每一者与或不与另一者的具体公开。因此，本文中在诸如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样地，在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方案中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
术语“约”在本文中用于表示大约、粗略地、在…周围或在…的区域中。当术语“约”与数值范围结合使用时，其通过将边界延伸到数值的上方和下方来修饰该范围。通常，术语“约”在本文中用于将高于和低于值的数值向上或向下(更高或更低)改变10％(％)。
应当理解，本文的HER2结合蛋白和抗体、核酸、细胞和载体(vector)是分离的形式。“分离的”是指多肽、抗体、多核苷酸、载体(vector)或细胞，其为天然未发现的形式。分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体(vector)或细胞包括已被纯化至其不再呈天然发现形式的程度的那些。在一些方面，分离的抗体、多核苷酸、载体(vector)或细胞是基本上纯的。在一些方面分离的抗体、多核苷酸、载体(vector)或细胞是“重组的”。
本文所用的术语“HER2”应理解为是指图1中所示的人HER2受体，特别是由野生型HER2序列的氨基酸残基190-269代表的HER2受体的结构域II(Coussens L等人，(1985)Science 230(4730):1132-9)。术语HER2可与ErbB2互换使用。
术语“异常表达”或“异常表达的”旨在包括其中存在异常(通常增加)量/水平的蛋白的状态，而与异常量或水平的直接原因无关。异常表达包括并考虑任何情况或改变，其中细胞中的蛋白表达或翻译后修饰机制由于蛋白的表达增强或水平或量增加而受影响或以其他方式破坏，包括其中改变的蛋白，如突变的蛋白或因序列改变、缺失或插入或改变折叠而引起的变体被表达。在本文中，异常表达与在致肿瘤的、过度增殖的或异常细胞而非野生型或正常细胞中观察到的HER2表达相关。
如本文所用，术语“亲和力”是指单个分子与其配体的结合强度，并且通常表示为两种试剂的可逆结合的平衡解离常数(KD)。它由HER2结合蛋白和HER2之间的Koff/Kon比率确定。KD与亲和力成反比关系。KD值与HER2结合蛋白的浓度有关，因此KD值越低(浓度越低)，结合蛋白的亲和力越高。本发明的HER2结合蛋白对HER2的亲和力可以是例如约100纳摩尔(nM)至约0.1nM，约100nM至约1皮摩尔(pM)，或约100nM至约1飞摩尔(fM)或更高。
如本文所用，关于HER2结合蛋白与靶标的相互作用的术语“结合”意指所述相互作用取决于靶标上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在。例如，HER2结合蛋白识别并结合特异性蛋白结构，而不是一般的蛋白。
本文所用的术语“结合蛋白”旨在描述彼此具有结合特异性的一对分子的成员。特异性结合对的成员可以是天然来源的或全部或部分合成产生的。该对分子中的一个成员在其表面上具有区域或空腔，其特异性结合该对分子中的另一个成员的特定空间和极性组织并因此与其互补。因此，该对的成员具有彼此特异性结合的性质。特异性结合对类型的实例是抗原-抗体、生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受体、受体-配体、酶-底物。本申请涉及抗原-抗体型反应。
术语“抗体”描述了天然或部分或全部合成产生的免疫球蛋白。该术语还包括具有与抗体结合结构域同源的结合结构域的任何多肽或蛋白。该术语也包括CDR移植抗体。“抗体”是结合特定表位的任何免疫球蛋白，包括抗体及其片段。该术语包括多克隆，单克隆和嵌合抗体，在美国专利4,816,397和4,816,567号中进一步详细描述了最后提及的抗体。术语“抗体”包括野生型免疫球蛋白(Ig)分子，其通常包括4条全长多肽链，2条重(H)链和2条轻(L)链，或其等同的Ig同源物(例如，骆驼科纳米抗体，其仅包括重链)；包括保留Ig分子的基本表位结合特征的全长功能性突变体、变体或其衍生物，并且包括双特异、双特异性、多特异性和双可变结构域抗体；免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。由于抗体可以多种方式修饰，术语“抗体”应解释为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任何特异性结合成员或物质。因此，该术语包括抗体的抗体片段、衍生物、功能等效物和同源物，包括包括免疫球蛋白结合结构域的任何多肽，无论是天然的或完全或部分合成的。因此包括包括与另一种多肽融合的免疫球蛋白结合结构域或等同物的嵌合分子。嵌合抗体的克隆和表达描述于EP-A-0120694和EP-A-0125023以及美国专利4,816,397和4,816,567号中。术语“抗体”的含义还包括任何“抗体片段”。
“抗体片段”是指包括至少一条非全长多肽链的分子，包括(i)Fab片段，其为由可变轻链(VL)、可变重链(VH)、恒定轻链(CL)和恒定重链1(CH1)结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，其是包括通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fab(Fd)片段的重链部分，其由VH和CH1结构域组成；(iv)可变片段(Fv)片段，其由抗体的单臂的VL和VH结构域组成，(v)结构域抗体(dAb)片段，其包括单个可变结构域(Ward,E.S.等人，Nature 341，544-546(1989))；(vi)骆驼科抗体；(vii)分离的互补决定区(CDR)；(viii)单链Fv片段，其中VH结构域和VL结构域通过允许两个结构域缔合形成抗原结合位点的肽接头连接(Bird等人，Science，242，423-426，1988；Huston等人，PNAS USA，85，5879-5883，1988)；(ix)双抗体，其为二价双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单一多肽链上表达，但使用太短而不能在同一链上的两个结构域之间配对的接头，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(WO94/13804；P.Holliger等人，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.)USA 90 6444-6448，(1993))；和(x)线性抗体，其包括一对串联Fv片段(VH-CH1-VH-CH1)，串联Fv片段与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区；(xi)多价抗体片段(scFv二聚体、三聚体和/或四聚体(Power和Hudson，J Immunol.Methods 242：193-204 9(2000))；和(xii)重链和/或轻链的其它非全长部分，或其突变体、变体或衍生物，单独或以任何组合。
本文所用的术语“抗原结合片段”包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、Fd、单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fvs(sdFv)、VL和VH结构域片段、结构域抗体、三特异性(Fab3)、双特异性(Fab2)、双抗体((VL-VH)2或(VH-VL)2)、三抗体(三价)、四抗体(四价)、小抗体((scFv-CH3)2)、双特异性单链Fv(Bis-scFv)、IgGδCH2、scFv-Fc和(scFv)2-Fc。“Fab片段”由抗体分子的单价抗原结合片段组成，并且可以通过用木瓜蛋白酶酶切整个抗体分子产生，以产生由完整轻链和部分重链组成的片段。抗体分子的“Fab'片段”可以通过用胃蛋白酶处理完整抗体分子，然后还原以产生由完整轻链和部分重链组成的分子而获得。以这种方式处理的每个抗体分子获得两个Fab’片段。抗体的“F(ab')2片段”由通过两个二硫键结合在一起的两个Fab'片段的二聚体组成，并且通过用胃蛋白酶处理完整抗体而不随后还原而获得。“Fv片段”是含有表达为两条链的轻链可变区和重链可变区的基因工程片段。“单链抗体”(SCA)是基因工程化的单链分子，其含有通过合适的柔性多肽接头连接的轻链可变区和重链可变区。
如本文所用，“抗体可变区”是指包括互补决定区(CDR，即CDR1、CDR2和CDR3)的氨基酸序列的抗体分子的轻链和重链的部分和框架区(FR)。VH指重链的可变区。VL指轻链的可变区。根据本发明使用的方法，指定给CDR和FR的氨基酸位置可根据Kabat(具有免疫学意义的蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)(NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.，1987和1991))或Chotia和Lesk 1987J.MolBiol.196:901-917)。抗体或抗原结合片段的氨基酸编号也根据Kabat的编号。
本文所用的术语“恒定区”(CR)是指赋予效应子功能的抗体分子部分。受试对象人源化抗体的恒定区来源于人免疫球蛋白。重链恒定区可以选自以下五种同种型中的任一种：α、δ、ε、γ或μ。此外，各种亚类的重链(例如重链的IgG亚类)负责不同的效应子功能，因此，通过选择所需的重链恒定区，可以产生具有所需效应子功能的抗体。示例性的重链恒定区是γ1(IgG1)、γ2(IgG2)和γ3(IgG3)和γ4(IgG4)。轻链恒定区可以是κ或λ型，优选κ型。
“框架区”(下文称为FR)是除CDR残基以外的那些可变结构域残基。天然存在的抗体的每个可变结构域典型地具有被鉴定为FR1、FR2、FR3和FR4的四个FR。
本文所用的术语“互补决定区”(syn CDR；即CDR1、CDR2和CDR3)是指抗体可变结构域的氨基酸残基，其存在是抗原结合所必需的。每个可变结构域通常具有三个CDR区，标识为CDR1、CDR2和CDR3。每个互补决定区可以包括来自如Kabat定义的CDR区的氨基酸残基(即约残基24-34或24-39(L1))，轻链可变结构域中的50-56或55-61(L2)和89-97或93-102(L3)以及重链可变结构域中的31-35或26-35(H1)、50-65或50-66(H2)和95-102或97-108(H3)；Kabat等人，具有免疫学意义的蛋白序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))和/或来自“高变环”的那些残基，即轻链可变结构域中的大约残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和重链可变结构域中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk(1987)J.Mol Biol.196：901-917)。在一些情况下，互补决定区可包括来自根据Kabat定义的CDR区和高变环的氨基酸。技术人员将意识到FR的定位中的一些变化，例如作为突变(例如缺失和/或插入)的结果，例如至多5个残基变化、或4个残基变化、或2个残基变化、或1个残基变化(例如，如本文的示例性抗体)。
本文所用的术语“单克隆抗体”是指单分子组合物的抗体分子的制剂。单克隆抗体显示对特定表位的单一结合特异性和亲和力。单克隆抗体可以从任何动物产生，例如小鼠、大鼠、兔、猪等，或者可以合成产生并且部分或完全是人序列。
术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种(例如鼠)或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分则与衍生自特定物种(例如灵长类动物)或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列，以及这些抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它们表现出所需的生物学活性。
术语“人源化抗体”应理解为是指通常使用重组技术制备的嵌合分子，其具有衍生自非人物种免疫球蛋白的表位结合位点和基于人免疫球蛋白的结构和/或序列的分子的剩余免疫球蛋白结构。抗原结合位点优选包括来自非人抗体的互补决定区(CDR)，该互补决定区被移植到人抗体的可变结构域中的适当框架区和来自人抗体的剩余区。
本文所用的与抗体分子和结合蛋白有关的术语“人抗体”是指具有可变(例如VH、VL、CDR和FR区)和恒定抗体区的抗体，其衍生自或对应于人(例如人种系或体细胞)中发现的序列。
本文所用的术语“特异性结合”是指结合蛋白或抗体与特定细胞或物质的反应或结合比与其它细胞或物质的反应或结合更频繁、更快速、持续时间更长和/或亲和力更大。通过阅读该定义还可以理解，例如，特异性结合第一靶标的抗体可以或可以不特异性结合第二靶标。因此，“特异性结合”不一定需要另一分子的排他性结合或不可检测的结合，这包括在术语“选择性结合”中。通常，但不是必须地，结合是指特异性结合。
如本文所用，术语“细胞增殖性病症”及其语法变化形式在用于提及细胞、组织或器官时是指任何不合需要的、过度或异常的细胞、组织或器官生长、增殖、分化或存活。不期望的细胞增殖病症包括疾病和生理病症，包括以受试对象中不期望的、过度的或异常的细胞数量、细胞生长、细胞增殖、细胞存活或分化为特征的良性增生病症。此类病症的具体实例包括转移性和非转移性瘤形成、肿瘤和癌症(恶性肿瘤)。
术语“同一性”及其语法变体是指两个或更多个参考实体是相同的。因此，当两个抗体序列相同时，它们至少在参考区域或部分内具有相同的氨基酸序列。当两个核酸序列相同时，它们至少在参考区域或部分内具有相同的多核苷酸序列。同一性可以在序列的限定区域(区域或结构域)上。多核苷酸的％同一性由GAP(Needleman和Wunsch，J.MolBiol.48:444-453.1970)分析(GCG程序)，其中缺口创建罚分＝5，缺口延伸罚分＝0.3。除非另有说明，查询序列长度为至少45个核苷酸，GAP分析在至少45个核苷酸的区域上比对两个序列。优选地，查询序列长度为至少100个核苷酸，GAP分析在至少100个核苷酸的区域上比对两个序列。最优选地，两个序列在它们的整个长度上进行比对。
术语“分离的”，包括DNA、RNA或蛋白，是指多核苷酸/多肽，其至少部分地从与其天然状态相关或连接的多核苷酸/多肽序列中分离。优选地，分离的多核苷酸/多肽至少60％不含，优选至少75％不含，最优选至少90％不含与它们天然相关的其它组分。
本文所用的术语“核酸”可与术语“多核苷酸”互换使用。
本文所用的术语“药物组合物”是指含有至少一种治疗或生物活性剂并适于给予患者的任何组合物。这些制剂中的任一种可通过本领域熟知和接受的方法制备。参见例如Gennaro,A.R.编，《雷明顿:药学的科学与实践》(Remington:The Science and Practiceof Pharmacy)，第20版，Mack Publishing Co.，Easton,Pa.(2000)。
本文所用的短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内适用于与人类和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应和/或其它问题或并发症、与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
“受试对象”是指需要诊断、预后或治疗的任何受试对象，特别是哺乳动物受试对象。如本文所用，术语“受试对象”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类、绵羊、狗、猫、马、牛、熊、鸡、两栖动物、爬行动物等，并且在适当时可与术语“患者”互换使用。优选地，受试对象是灵长类动物。特别地，受试对象是人。
如本文所用，提及“相似”结合水平应理解为意指抗体以在其结合另一抗原的水平的约30％或25％或20％内的水平结合抗原。该术语还可以指一种抗体以另一种抗体结合相同抗原的水平的约30％或25％或20％内的水平结合抗原。
如本文所用，提及“基本上相同水平”的结合应理解为意指抗体以在其结合另一抗原的水平的约15％或10％或5％内的水平结合抗原。该术语还可以指一种抗体以另一种抗体结合相同抗原的水平的约5％或4％或3％内的水平结合抗原。
术语“竞争性抑制”应理解为本发明的蛋白减少或防止所述产生的抗体(例如mAb104)与人HER2的结构域II或其片段的结合。从前述内容将显而易见的是，蛋白不需要完全抑制抗体的结合，仅需要以统计学显著的量降低结合，例如至少约10％或20％或30％或40％或50％或60％或70％或80％或90％或95％。测定结合的竞争性抑制的方法是本领域已知的和/或本文描述的。例如，抗体在存在或不存在蛋白的情况下暴露于HER2或其片段。如果在蛋白存在下的抗体结合少于在蛋白不存在下的抗体结合，则认为蛋白竞争性抑制抗体的结合。在一个实例中，蛋白和抗体基本上同时暴露于HER2。测定结合的竞争性抑制的其它方法对于本领域技术人员是显而易见的和/或在本文中描述。在一个实例中，蛋白的抗原结合结构域竞争性抑制抗体的结合。
在两个表位的上下文中，“重叠”是指两个表位共有足够数量的氨基酸残基以允许与一个表位结合的抗体竞争性抑制与另一个表位结合的抗体的结合。例如，表位共有至少一个或两个或三个或四个或五个或六个或七个或八个或九个或十个氨基酸。
如本文所用，术语“基本上不结合”应理解为意指蛋白(例如抗体)以低于背景以上10％或8％或6％或5％的水平结合候选抗原。背景可以是在蛋白不存在下和/或在阴性对照蛋白(例如同种型对照抗体)存在下检测的结合信号水平和/或在阴性对照抗原存在下检测的结合水平。使用生物传感器分析(例如Biacore)检测结合水平，其中蛋白被固定并与抗原接触。
术语“治疗有效量”应理解为意指足够量的抗体或抗原结合片段以将细胞增殖病症的一种或多种症状减少或抑制至低于所观察到的且被接受为该病症的临床特征的水平。本领域技术人员将意识到，这样的量将根据的抗体、片段和/或具体的受试对象和/或疾病的类型或严重性或水平而变化。因此，该术语不应被解释为将本发明限制为特定量。
如本文所用，术语“治疗(treat，treating，treatment)”及其语法变化形式意指使个别患者经受其中期望在患者中获得生理反应或结果的方案、疗程、过程或疗法。由于每个被治疗的患者可能对特定的治疗方案、疗程、过程或治疗没有反应，因此治疗不需要在每个患者或患者群体中实现期望的生理反应或结果。因此，给定的患者或患者群体可能对治疗没有响应或响应不足。
术语“肿瘤”或“癌症”可互换使用，是指其生长、增殖或存活大于正常对应细胞(例如细胞增殖性或分化性病症)的生长、增殖或存活的细胞或细胞群体。通常，生长是不受控制的。
术语“104抗体”或“mAb104”以及未具体列出的任何变体可在本文中互换使用，并且如在本申请和权利要求书中通篇使用的，是指包括单个或多个蛋白的蛋白材料，并且延伸至具有本文所述的氨基酸序列数据以及本文和权利要求书中阐述的活性谱的那些蛋白。因此，显示基本上等同或改变的活性的蛋白也被考虑。这些修饰可以是有意的，例如通过定点诱变获得的修饰，或者可以是偶然的，例如通过在作为复合物或其指定亚单位的生产者的宿主中突变获得的修饰。此外，术语“104抗体”或“mAb104”意欲在其范围内包括本文具体列举的蛋白以及所有基本上同源的类似物和等位基因变体。
具体实施方式
本发明不限于本文描述的特定实施方案的范围，这些实施例仅用于示例性目的。
抗体产生
通过杂交瘤制备单克隆抗体的一般方法是众所周知的。无限增殖的产生抗体的细胞系也可以通过融合以外的技术产生，例如用致癌DNA直接转化B淋巴细胞或用EB病毒转染。参见例如M.Schreier等人，“杂交瘤技术(Hybridoma Techniques)”(1980)；Hammerling等人，“单克隆抗体和T细胞杂交瘤(Monoclonal Antibodies And T-cell Hybridomas)”(1981)；Kennett等人，“单克隆抗体(Monoclonal Antibodies)”(1980)；还参见美国专利4,341,761；4,399,121；4,427,783；4,444,887；4,451,570；4,466,917；4,472,500；4,491,632；4,493,890号。可针对各种性质筛选针对HER2产生的单克隆抗体组；即，同种型、表位、亲和力等，如本文所述。特别感兴趣的是与异常表达的HER2的结构域II结合的单克隆抗体。这种单克隆可在特异性结合成员活性测定中容易地鉴定。当天然或重组特异性结合成员的免疫亲和纯化是可能的时，高亲和力抗体也是有用的。可用于实施本发明的单克隆抗体可通过启动包括含有分泌具有适当抗原特异性的抗体分子的杂交瘤的营养培养基的单克隆杂交瘤培养物来产生。将培养物维持在足以使杂交瘤分泌抗体分子到培养基中的条件和时间下。然后收集含有抗体的培养基。然后可以通过众所周知的技术进一步分离抗体分子。
本发明的抗体还可以通过用对应于包括成熟正常或野生型人HER2的残基277至312或残基293至309的环肽的纯化抗原免疫动物来产生。
本发明的HER2结合蛋白还可以通过标准技术如固相肽合成和/或天然蛋白连接来合成。
另外可用于抗体方法的合适技术包括亲和纯化、非变性凝胶纯化、HPLC或RP-HPLC、尺寸排阻、在蛋白A柱上纯化，或这些技术的任何组合。抗体同种型可使用ELISA测定法测定，例如，人Ig可使用小鼠Ig-吸收的抗人Ig鉴定。
重组抗体生产
本发明的抗体和抗原结合片段也可以使用本领域技术人员容易获得的技术和材料重组生产。
可变结构域可以衍生自任何种系或重排的人可变结构域，或者可以是基于已知人可变结构域的共有序列的合成可变结构域。使用重组DNA技术，可以将本发明的CDR衍生序列导入到缺乏CDR区的可变结构域的所有组成成分中。例如，Marks等人(Bio/Technology，1992，10:779-783)描述了产生抗体可变结构域的所有组成成分的方法，其中针对或邻近可变结构域区域的5'端的共有引物与针对人VH基因的第三框架区的共有引物联合使用，以提供缺乏一个或多个CDR的VH可变结构域的所有组成成分。Marks等人进一步描述了该所有组成成分如何与特定抗体的CDR组合。使用类似的技术，本发明的CDR衍生序列可以用缺乏一个或多个CDR的VH或VL结构域的所有组成成分进行改组，并且改组的完整VH或VL结构域与同源VL或VH结构域组合以提供本发明的抗体。然后可以在合适的宿主系统如WO92/01047的噬菌体展示系统中展示所有组成成分，以便可以选择合适的特异性结合成员。所有组成成分可以由从104个单独成员向上的任何组成，例如从106到108或1010个成员。Stemmer(Nature，1994，370:389-391)也公开了类似的改组或组合技术，他描述了与β-内酰胺酶基因相关的技术，但观察到该方法可用于产生抗体。
也可以使用本领域已知的选择和/或诱变方法使抗体亲和力成熟。
本发明的重组抗体也可以通过如US 5,969,108中公开的噬菌体展示方法产生。
本发明的抗体还可以包括抗体恒定区或其部分。例如，基于SEQ ID NO：3或5的抗体可在其C端连接至包括人CK或Cλ链的抗体轻链恒定结构域。类似地，基于SEQ ID NO：2或4的抗体可在其C端连接至衍生自任何抗体同种型(例如IgG、IgA、IgE、IgD和IgM)和任何同种型亚类(特别是IgGl、IgG2b和IgG4)的免疫球蛋白重链的全部或部分。
对于重组生产，优选分离编码本发明抗体的核酸并将其插入可复制载体(vector)中用于进一步克隆(DNA扩增)或用于表达。使用常规方法(例如，通过使用能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的DNA的寡核苷酸探针)容易地分离或合成编码抗体的DNA。许多载体(vector)是可用的。载体(vector)组分通常包括但不限于以下的一个或多个：信号序列、编码本发明的抗体或其片段的序列(例如，来源于本文提供的信息)、增强子元件、启动子和转录终止序列。
(i)信号序列组分。本发明的抗体不仅可以直接重组产生，也可以作为与异源多肽的融合多肽产生，其优选为信号序列或在成熟蛋白或多肽的N端具有特异性切割位点的其它多肽。优选选择的异源信号序列是被宿主细胞识别和加工(即，被信号肽酶切割)的序列。对于不识别和加工天然抗体信号序列的原核宿主细胞，信号序列被选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或热稳定肠毒素II前导序列的原核信号序列取代。对于酵母分泌，天然信号序列可被例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列或酸性磷酸酶前导序列、白色念珠菌葡糖淀粉酶前导序列，或在WO 90/13646中描述的信号取代。在哺乳动物细胞表达中，可获得哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gD信号。这种前体区域的DNA在阅读框中与编码抗体的DNA连接。
(ii)启动子组分。表达和克隆载体通常含有能被宿主生物识别并与抗体核酸有效连接的启动子。适用于原核宿主的启动子包括phoA启动子，β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子如tac启动子。然而，其它已知的细菌启动子也是合适的。用于细菌系统的启动子也将含有与编码抗体的DNA可操作连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
已知启动子用于真核生物。事实上，所有真核基因都具有位于转录起始位点上游约25-30个碱基的富含AT的区域。在许多基因转录起始点上游70-80个碱基处发现的另一个序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核生物基因的3'端是AATAAA序列，其可以是将多聚A尾添加到编码序列的3'端的信号。所有这些序列都适当地插入真核表达载体中。用于酵母宿主的合适的启动子序列的实例包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子，如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡糖异构酶和葡糖激酶。其它酵母启动子是具有受生长条件控制的转录的额外优点的诱导型启动子，是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。用于酵母表达的合适载体(vector)和启动子进一步描述于EP73,657。酵母增强子也有利地与酵母启动子一起使用。
哺乳动物宿主细胞中来自载体(vector)的抗体转录受到例如从病毒基因组获得的启动子的控制，病毒例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)。CMV、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒、最优选猿猴病毒40(SV40)，来自异源哺乳动物启动子，例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，来自热休克启动子，条件是这些启动子与宿主细胞系统相容。
(iii)增强子元件组分。高等真核生物对编码本发明抗体的DNA的转录通常通过将增强子序列插入到载体(vector)中来增加。现在已知许多来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括位于复制起点晚期侧的SV40增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起点晚期侧的多瘤病毒增强子和腺病毒增强子。还参见Yaniv(1982)Nature 297：17-18关于用于激活真核启动子的增强元件。增强子可以在抗体编码序列的5'或3'位置剪接到载体(vector)中，但优选位于启动子的5'位点。
(iv)转录终止组分。用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物体的有核细胞)的表达载体也将含有终止转录和稳定mRNA所需的序列。这些序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA的5'和有时3'非翻译区获得。这些区域含有在编码抗体的mRNA的非翻译部分中转录为聚腺苷酸化片段的核苷酸片段。一种有用的转录终止组件是牛生长激素聚腺苷酸化区域。参见WO94/11026和其中公开的表达载体(vector)。
(v)宿主细胞的选择和转化。用于在本文载体(vector)中克隆或表达DNA的合适宿主细胞是上述原核生物、酵母或高等真核细胞。用于此目的的合适的原核生物包括真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，例如埃希氏菌属，例如大肠杆菌、肠杆菌、欧文氏菌属、克雷伯氏菌属、变形杆菌属，沙门氏菌属，例如鼠伤寒沙门氏菌，沙雷氏菌属，例如粘质沙雷氏菌和志贺氏菌属，以及杆菌属，例如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，假单胞菌属如铜绿假单胞菌和链霉菌属。一优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC31,446)，尽管其它菌株如大肠杆菌B、大肠杆菌X 1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)是合适的。这些实施例是说明性的而不是限制性的。
除原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母是抗体编码载体(vector)的合适克隆或表达宿主。酿酒酵母或普通面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其它属、种和菌株在本文中通常可用和有用的，例如粟酒裂殖酵母；克鲁维酵母属宿主，例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、维克拉姆克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.marxianus)以及马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(EP 402,226)；毕赤酵母(EP 183,070)；假丝酵母属；里氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌；许旺酵母属如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌，例如脉孢菌属、青霉属、弯颈霉属和曲霉属(Aspergillus)宿主，例如构巢曲霉和黑曲霉。
用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞来源于多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经从宿主例如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)，埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)，白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)，黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyxmori)中鉴定了许多杆状病毒株和变体以及相应的许可性昆虫宿主细胞。用于转染的多种病毒株是公众可获得的，例如苜蓿银纹夜蛾NPV的L-I变体和家蚕NPV的Bm-5株，并且这些病毒可以用作本发明的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。
有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是SV40转化的猴肾CVl系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚肾细胞系(293或293细胞亚克隆用于在悬浮培养物中生长，Graham等人(1977)Gen Virol.36:59)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞(CHO，Urlaub等人(1980)Proc.Natl.Acad.Sci USA77：4216)；小鼠足细胞(TM4，Mather(1980)Biol.Reprod.23:243-251)；猴肾细胞(CVl ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCCCRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人(1982)AnnalsN.Y.Acad.Sci.383：44-68)；MRC 5细胞；FS4细胞；和PER.C6TM(Crucell NV)。
功能等效抗体
本发明还考虑了抗体或其抗原结合片段，其具有本发明抗体的重链和轻链可变区序列的一个或多个氨基酸添加、缺失或取代，但仍保留本发明抗体的功能。这些修饰可以是有意的，例如通过定点诱变，或者可以是偶然的，例如通过表达抗体的宿主中的突变获得的那些。
可以使用本领域已知的任何技术制备突变体(改变的)多肽。例如，本发明的多核苷酸可以进行体外诱变。这样的体外诱变技术包括将多核苷酸亚克隆到合适的载体(vector)中，将该载体(vector)转化到“突变”菌株如大肠杆菌XL-1红色(Stratagene)并将转化的细菌繁殖适当的代数。使用本文描述的技术可以容易地筛选衍生自突变/改变的DNA的产物以确定它们是否具有受体结合和/或抑制活性。
在设计氨基酸序列突变体时，突变位点的位置和突变的性质将取决于待修饰的特征。突变位点可以单独或串联修饰，例如，通过(1)首先用保守的氨基酸选择替换，然后根据获得的结果用更多的自由基选择替换，(2)删除目标残基或(3)插入邻近定位位点的其他残基。
氨基酸序列缺失一般为约1-15个残基，更优选约1-10个残基，通常约1-5个连续残基。
取代突变体在抗体和/或免疫球蛋白链分子中(包括在可变区中)具有至少一个氨基酸残基被去除，并且在其位置插入不同的残基。取代诱变最感兴趣的位点包括鉴定为对抗原结合重要的位点。这些位点，特别是属于人抗体和/或免疫球蛋白链的至少三个其它相同保守位点的序列的位点，优选以相对保守的方式被取代。这种保守取代显示在下表中“示例性取代”的标题下。
本发明还包括保守氨基酸取代。这些是指下表中列出的氨基酸取代。
示例性取代
Figure BDA0003342276390000281
Figure BDA0003342276390000291
本文的氨基酸优选为“L”异构形式。然而，D异构形式的残基可以取代任何L-氨基酸残基，只要该多肽保留了免疫球蛋白结合的所需功能特性。修饰还包括结构和功能类似物，例如具有合成或非天然氨基酸或氨基酸类似物和衍生形式的肽模拟物。
嵌合抗体
嵌合抗体通过重组方法，通过将获自一个物种的抗体生产细胞的可变轻链和重链区(VL和VH)与来自另一个物种的恒定轻链和重链区组合来制备。典型地，嵌合抗体利用啮齿动物或兔可变区和人恒定区，以产生主要具有人结构域的抗体。例如，嵌合抗体包括与人恒定区融合的本文根据任何实施方案的小鼠抗体的可变区。此类嵌合抗体的产生是本领域已知的，并且可以通过标准手段实现(如描述于例如Morrison，Science 229：1202(1985)；Oi等人，BioTechniques 4:214(1986)；Gillies等人，(1989)J.Immunol.Methods 125:191-202；美国专利5,807,715；4,816,567和4,816,397号中)。还考虑本发明的嵌合抗体的人恒定区可以选自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5、IgG6、IgG7、IgG8、IgG9、IgGl0、IgG11、IgG12、IgG13、IgG14、IgG15、IgG16、IgG17、IgG18或IgG19恒定区。
人源化和人抗体
本发明的抗体可以是人源化抗体或人抗体。非人(例如鼠)抗体的人源化形式是嵌合免疫球蛋白，免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原结合亚序列)，其含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的互补决定区(CDR)的残基被具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基替代。人源化抗体还可以包括既不存在于受体抗体中也不存在于导入的CDR或框架序列中的残基。一般而言，人源化抗体将包括基本上所有的至少一个，通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，并且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体最佳地还将包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区(Fc)的一部分(Jones等人，(1986)Nature，321:522-525；Riechmann等人(1988)，Nature 332:323-329；和Presta(1992)Curr Op Struct Biol，2:593-59)。
人源化非人抗体的方法是本领域已知的。通常，人源化抗体具有一个或多个从非人来源导入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。人源化基本上可以按照Jones等人，同上；Riechmann等人，同上；Verhoeyen等人(1988)Science，239:1534-1536)的方法进行，用啮齿动物CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列。因此，这种“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567号)，其中基本上没有完整的人可变结构域被来自非人物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能一些FR残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。
还可以使用本领域已知的各种技术产生人抗体，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom和Winter(1991)J Mol Biol，227:381；Marks等人(1991)，J Mol Biol，222:581)。Cole等人的技术和Boerner等人也适用于制备人单克隆抗体(Cole等人，单克隆抗体和癌症疗法(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)，Alan R.Liss，p.77(1985)和Boerner等人(1991)J Immunol，147:86-95)。类似地，人抗体可以通过将人免疫球蛋白基因座导入转基因动物，例如其中内源免疫球蛋白基因已经部分或完全失活的小鼠中来制备。在攻击后，观察到人抗体产生，其在所有方面都与在人中看到的非常相似，包括基因重排、组装和抗体所有组成成分。该方法描述于例如美国专利5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016号中。
也可以使用称为“导向选择”的技术产生识别选定表位的完全人抗体。在该方法中，选择的非人单克隆抗体，例如小鼠抗体，用于指导选择识别相同表位的完全人抗体(Jespers等人，Bio/technology 12:899-903(1988))。
也可以使用本领域已知的选择和/或诱变方法使抗体亲和力成熟。优选的亲和力成熟抗体的亲和力是制备成熟抗体的起始抗体(通常是鼠的、人源化的或人的)的5倍，更优选10倍，甚至更优选20或30倍。
类人源化和灵长类化蛋白
本发明的HER2结合蛋白可以是类人源化蛋白。术语“类人源化蛋白”是指通过WO2007/019620中描述的方法制备的蛋白。类人源化HER2结合蛋白包括抗体的可变区，其中可变区包括来自新世界灵长类抗体可变区的FR和来自非新世界灵长类抗体可变区的CDR。例如，类人源化HER2结合蛋白包括抗体的可变区，其中可变区包括来自新世界灵长类动物抗体可变区的FWR和来自小鼠抗体的CDR，例如如本文所述。在一个实例中，同人源化HER2结合蛋白是HER2结合抗体，其中一个或两个可变区是类人源化的。
本发明的HER2结合蛋白可以是灵长类化蛋白。“灵长类化蛋白”包括来自在免疫非人灵长类动物(例如食蟹猴)后产生的抗体的可变区。任选地，将非人灵长类抗体的可变区与人恒定区连接以产生灵长类化抗体。产生灵长类化抗体的示例性方法描述于US 6113898中。
去免疫化抗体和蛋白
本发明还涉及去免疫化抗体或HER2结合蛋白。去免疫抗体具有一个或多个表位，例如，去除(即，突变)的B细胞表位或T细胞表位，从而降低受试对象产生针对抗体或蛋白的免疫应答的可能性。产生去免疫化抗体和蛋白的方法是本领域已知的，并且描述于例如WO00/34317、WO 2004/108158和WO 2004/064724中。
基于本文的描述，引入合适的突变并表达和测定所得蛋白的方法对于本领域技术人员而言是显而易见的。
含有蛋白的抗体可变区。
单结构域抗体
在一些实施例中，本发明的HER2结合蛋白是单结构域抗体(其可与术语“结构域抗体”或“dAb”互换使用)。单结构域抗体是包括抗体重链可变区的全部或部分的单多肽链。在某些实例中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见例如US6248516；WO 90/05144和/或WO 2004/058820)。
双抗体、三抗体、四抗体
包括抗体抗原结合结构域的示例性HER2结合蛋白是双抗体、三抗体、四抗体和更高级的蛋白复合物，例如WO 98/044001和WO 94/007921中描述的那些。
例如，双抗体是包括两条关联的多肽链的蛋白，每条多肽链包括结构VL-X-VH或VH-X-VL，其中VL为抗体轻链可变区，VH为抗体重链可变区，X是包括不足以允许单一多肽链中的VH和VL缔合或不存在的残基的接头，并且其中一条多肽链的VH与另一条多肽链的VL结合形成抗原结合位点，即，而形成能够特异性结合一个或多个抗原的Fv分子。VL和VH在每条多肽链中可以是相同的，或者VL和VH在每条多肽链中可以是不同的，以便形成双特异性二聚抗体(即，包括具有不同特异性的两个Fv)。
单链Fv(scFv)片段
本领域技术人员知道scFv包括单一多肽链中的VH和VL区。多肽链在VH和VL之间还包括多肽接头，其能使scFv能够形成抗原结合所需的结构(即，使单一多肽链的VH和VL彼此缔合以形成Fv)。例如，接头包括超过12个氨基酸残基，其中(Gly4Ser)3是scFv的更有利接头之一。
本发明还考虑了二硫化物稳定的Fv(或diFv或dsFv)，其中单个半胱氨酸残基被引入VH的FR和VL的FR中，并且半胱氨酸残基通过二硫键连接以产生稳定的Fv(参见例如Brinkmann等人，(1993)Proc Natl Acad Sci USA 90:547-551)。
可替换地或附加地，本发明提供二聚体scFv，即包括通过非共价或共价连接，例如通过亮氨酸拉链结构域(例如衍生自Fos或Jun)连接的两个scFv分子的蛋白(参见例如Kruif和Logtenberg，1996)。或者，两个scFv通过足够长度的肽接头连接，以允许两个scFv形成并结合抗原，例如，如US20060263367中所述。
关于scFv的综述，参见Ahmad ZA等人，(2012)Clinical and DevelopmentalImmunology doi:10.1155/2012/980250。
微抗体
本领域技术人员将意识到微抗体包括与抗体的(CH2和/或(CH3结构域融合的抗体的VH和VL结构域。任选地，微抗体包括VH和VL之间的铰链区，有时这种构象称为柔性微抗体。微抗体不包括CH1或CL。在一个实例中，VH和VL结构域与抗体的铰链区和CH3结构域融合。微抗体的至少一个可变区以本发明的方式结合HER2。例如在WO 94/09817中描述了示例性微抗体及其制备方法。
其它含蛋白的抗体可变区
本发明还考虑了含有HER2结合蛋白的其他可变区，例如：
(i)“键和孔”双特异性蛋白，如US 5,731,168中所述；
(ii)异源缀合蛋白，例如如US 4,676,980中所述；
(iii)使用化学交联剂产生的异源缀合蛋白，例如如US 4,676,980中所述；
(iv)Fab'-SH片段，例如如Shalaby(1992)j Exp Med 1；175(1):217-25中所述；
(v)单链Fab；或
(vi)Fab3(例如，如EP 19930302894中所述)。
含有蛋白的基于非抗体的抗原结合结构域
免疫球蛋白和免疫球蛋白片段
本发明的化合物的实施例是包括免疫球蛋白的可变区的蛋白，所述免疫球蛋白例如T细胞受体或重链免疫球蛋白(例如，IgNA、骆驼抗体)。
术语“免疫球蛋白”应理解为包括包括免疫球蛋白结构域的抗原结合蛋白。示例性免疫球蛋白是抗体。术语“免疫球蛋白”包括的另外的蛋白包括结构域抗体、骆驼科抗体和来自软骨鱼类(即，免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR))的抗体。通常，骆驼抗体和IgNAR包括VH，然而缺少VL并且通常被称为重链免疫球蛋白。其他“免疫球蛋白”包括T细胞受体。
重链免疫球蛋白
重链免疫球蛋白在结构上不同于许多其它形式的免疫球蛋白(例如抗体)，因为它们包括重链，但不包括轻链。因此，这些免疫球蛋白也称为“仅重链抗体”。重链免疫球蛋白存在于例如骆驼科动物和软骨鱼(也称为IgNAR)中。
存在于天然存在的重链免疫球蛋白中的可变区通常称为骆驼Ig中的“VHH结构域”和IgNAR中的V-NAR，以便将它们与存在于常规4-链抗体中的重链可变区(称为“VH结构域”)和存在于常规4-链抗体中的轻链可变区(称为“VL结构域”)区分开来。
重链免疫球蛋白不需要存在以高亲和力和高特异性结合相关抗原的轻链。这意味着单结构域结合片段可以来源于重链免疫球蛋白，其易于表达并且通常是稳定和可溶的。尤其在以下参考文献WO 94/04678、WO 97/49805和WO 97/49805中尤其发现了对来自骆驼科动物的重链免疫球蛋白及其可变区以及它们的生产和/或分离和/或使用方法的一般性描述。
尤其在WO2005/118629中发现来自软骨鱼的重链免疫球蛋白及其可变区的一般描述和它们的生产和/或分离和/或使用的方法。
V-样蛋白
本发明的HER2结合蛋白的实施例是T细胞受体。T细胞受体具有结合成类似于抗体Fv模块的结构的两个V结构域。Novotny等人，美国科学学院学报(Proc Natl Acad SciUSA)88：8646-8650，1991描述了如何将T细胞受体的两个V结构域(称为α和β)融合并表达为单链多肽，以及如何改变表面残基以降低直接类似于抗体scFv的疏水性。描述包括两个V-α和V-β结构域的单链T细胞受体或多聚体T细胞受体的生产的其他公开包括WO 1999/045110或WO 2011/107595。
包括抗原结合结构域的其他非抗体蛋白包括具有V-样结构域的蛋白，其通常是单体的。包括此类V-样结构域的蛋白的实施例包括CTLA-4、CD28和ICOS。包括此类V-样结构域的蛋白的进一步公开内容包括在WO 1999/045110中。
Adnectins
在一个实例中，本发明的HER2结合蛋白是adnectin。
Adnectins基于人纤连蛋白的第十个III型纤连蛋白(10Fn3)结构域，其中环区被改变以赋予抗原结合。例如，可以工程化10Fn3结构域的β-夹心的一端的三个环以使Adnectin能够特异性识别抗原。更多细节参见US 20080139791或WO2005/056764。
Anticalins
在另一个实例中，本发明的HER2结合蛋白是anticalin。Anticalins衍生自脂质运载蛋白，脂质运载蛋白是细胞外蛋白的家族，其运输小的疏水性分子如类固醇、后胆色素类、类视黄醇和脂质。脂质运载蛋白具有刚性β-折叠二级结构，其在圆锥形结构的开口端具有多个环，该环可被工程化以结合抗原。这种工程化的脂质运载蛋白称为anticalins。对于anticalins的进一步描述，参见US 7250297B1或US 20070224633。
亲和体(affibody)
在另一个实施例中，本发明的HER2结合蛋白是亲和体。亲和体是来源于金黄色葡萄球菌的蛋白A的Z结构域(抗原结合结构域)的支架，其可以被工程化以结合抗原。Z结构域由约58个氨基酸的三螺旋束组成。通过表面残基的随机化产生文库。更多细节参见EP1641818。
高亲和性多聚体(Avimers)
在另一个实施例中，本发明的HER2结合蛋白是高亲和性多聚体。高亲和性多聚体是衍生自A-结构域支架家族的多结构域蛋白。约35个氨基酸的天然结构域采用限定的二硫化物键合结构。多样性是通过改组A-结构域家族所显示的天然变异而产生的。更多细节参见WO 2002088171。
锚蛋白重复蛋白(DARPins)
在另一个实例中，本发明的HER2结合蛋白是设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)。DARPin衍生自Ankyrin，Ankyrin是介导整合膜蛋白与细胞骨架附着的蛋白家族。单个锚蛋白重复序列是由两个α-螺旋和一个β-转角组成的33残基基序。它们可以通过随机化每个重复的第一个α-螺旋和β-转角中的残基而被工程化以结合不同的靶抗原。它们的结合界面可以通过增加模块的数量来增加(亲和力成熟的方法)。更多细节参见US 20040132028。
其他非抗体多肽
包括结合结构域的其它非抗体蛋白包括基于人γ-晶状体蛋白和人泛素(affilins)、人蛋白酶抑制剂的kunitz型结构域、Ras-结合蛋白AF-6的PDZ-结构域、蝎毒素(卡律蝎毒素(charybdotoxin))、C-型凝集素结构域(tetranectins)的那些。
恒定区
本发明涵盖包括可变区和恒定区或其结构域(例如Fc、CH2和/或CH3结构域)的HER2结合蛋白。本领域技术人员公开内容和本文讨论的参考文献，本领域技术人员将意识到术语恒定区和恒定结构域的含义。
可用于产生本发明的HER2结合蛋白的恒定区序列可从许多不同来源获得。在一些实例中，HER2结合蛋白的恒定区或其部分衍生自人抗体。此外，恒定结构域或其部分可衍生自任何抗体类别，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，和任何抗体同种型，包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。在一个实例中，使用人同种型IgGl。
各种恒定区基因序列可以以公众可获得的保藏物的形式获得，或者其序列可以从公众可获得的数据库获得。可以选择具有特定效应子功能(或缺乏特定效应子功能)或具有特定修饰以降低免疫原性的恒定区。
在一个实例中，本发明的蛋白具有或展示促进或实现表达HER2的细胞的至少部分耗竭、实质耗竭或消除的效应子功能。这种效应子功能可增强对Fc受体的结合亲和力、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在一个实例中，HER2结合蛋白能够诱导增强水平的效应子功能。
在一个实例中，由恒定区诱导的效应子功能的水平相对于IgG1抗体的野生型Fc区或IgG3抗体的野生型Fc区增强。
在另一个实例中，与没有修饰的恒定区相比，修饰恒定区以增加其能够诱导的效应子功能的水平。这样的修饰可以在氨基酸水平和/或二级结构水平和/或三级结构水平和/或在Fc区的糖基化。
本领域技术人员将理解，更大的效应物功能可以以多种方式中的任一种表现，例如更高水平的效应，更持久的效应或更快的效应速率。示例性恒定区修饰包括氨基酸取代，诸如，S239D/I332E，根据Kabat的EU索引编号，或S239D/A330L/I332E，根据Kabat的EU索引编号。
增加Fc区诱导效应子功能的能力的其它氨基酸取代是本领域已知的和/或描述于例如US 6737056或US 7317091中。
在一个实例中，改变恒定区的糖基化以增加其诱导增强的效应子功能的能力。在一些实例中，根据本发明的Fc区包括缺乏(直接或间接)连接至Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构，即Fc区是“无岩藻糖基化的”。这些变体可具有改善的诱导ADCC的能力。产生无岩藻糖基化抗体的方法包括在不能表达α-1,6-岩藻糖基转移酶(FUT8)的细胞系中表达HER2结合蛋白(例如，如Yumane-Ohnuki等人，2004中所述)。其他方法包括使用固有地产生能够诱导增强的效应子功能的抗体的细胞系(例如用于生产病毒疫苗的鸭胚胎衍生的干细胞，WO2008/129058；禽类
Figure BDA0003342276390000351
细胞中的重组蛋白生产，WO 2008/142124)。
HER2结合蛋白还可以包括能够诱导增强的CDC水平的Fc区。例如，IgG1和IgG3的杂合体产生具有增强的CDC活性的抗体(Natsume等人，2008)。
测定抗体或其抗原结合片段诱导效应子功能的能力的方法是本领域已知的和/或本文描述的。
在另一个实例中，蛋白包括一个或多个增加HER2结合蛋白半衰期的氨基酸取代。例如，HER2结合蛋白包括恒定区，恒定区包括增加恒定区对新生儿Fc区(FcRn)的亲和力的一个或多个氨基酸取代。例如，恒定区在较低pH(例如约pH6.0)下对FcRn具有增加的亲和力，以促进内体中的Fc/FcRn结合。在一个实例中，恒定区在约pH6时与其在约pH7.4时的亲和力相比具有增加的对FcRn的亲和力，这促进Fc在细胞再循环后再释放到血液中。这些氨基酸取代可用于通过减少从血液的清除来延长蛋白的半衰期。
根据EU编号系统，示例性的氨基酸取代包括T250Q和/或M428L或T252A、T254S和T266F或M252Y、S254T和T256E或H433K和N434F。另外的或替代的氨基酸取代描述于例如US20070135620或US 7083784中。
本发明的HER2结合蛋白可包括IgG4恒定区或稳定的IgG4恒定区。术语“稳定的IgG4恒定区”应理解为是指已被修饰以降低Fab臂交换或经历Fab臂交换的倾向或形成半抗体或形成半抗体的倾向的IgG4恒定区。“Fab臂交换”指人IgG4的蛋白修饰类型，其中IgG4重链和连接的轻链(半分子)与另一IgG4分子交换成重-轻链对。因此，IgG4分子可获得识别两种不同抗原的两种不同Fab臂(产生双特异性分子)。Fab臂交换在体内自然发生，并且可以通过纯化的血细胞或还原剂如还原型谷胱甘肽在体外诱导。当IgG4抗体解离形成各自含有单个重链和单个轻链的两个分子时，形成“半抗体”。
在一个实例中，根据Kabat系统，稳定的IgG4恒定区在铰链区的位置241处包括脯氨酸。该位置对应于根据EU编号系统的铰链区域的位置228。在人IgG4中，该残基通常是丝氨酸。丝氨酸取代脯氨酸后，IgG4铰链区包括序列CPPC。在这点上，技术人员将意识到“铰链区”是抗体重链恒定区的富含脯氨酸的部分，其连接Fc和Fab区，赋予抗体的两个Fab臂上的移动性。铰链区包括参与重链间二硫键的半胱氨酸残基。根据Kabat的编号系统通常被定义为人IgGl1的从Glu226至Pro243的伸展。通过将形成重链间二硫键(S-S)的第一个和最后一个半胱氨酸残基置于相同位置，其他IgG同种型的铰链区可以与IgGl1序列比对(参见例如WO 2010/080538)。
修饰的蛋白
本发明提供与本发明的序列具有至少80％同一性并且具有本文所述或要求保护的相同功能特性的HER2结合蛋白。
在一个实例中，本发明的HER2结合蛋白包括与本文公开的VL序列具有至少90％或91％或92％或93％或94％或95％或96％或97％或98％或99％同一性的序列，例如SEQ IDNO：3。
在另一个实例中，本发明的HER2结合蛋白包括与本文的本发明的VH具有至少90％或91％或92％或93％或94％或95％或96％或97％或98％或99％同一性的序列，例如SEQ IDNO：2。
本发明还提供了编码前述蛋白的核酸或在中度至高度严格条件下与其杂交的核酸。
本发明还包括编码包括SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示序列的蛋白的核酸，由于遗传密码简并性，序列不同于本文的示例性序列。
本发明还包括编码包括SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示序列的蛋白的核酸，由于遗传密码简并性，序列不同于本文的示例性序列。
核酸或多肽的％同一性通过GAP(Needleman和Wunsch 1970)分析(GCG程序)确定，缺口产生罚分＝5，缺口延伸罚分＝0.3。查询序列优选长度为至少50个残基，GAP分析在至少50个残基的区域上比对两个序列。例如，查询序列长度为至少100个残基，GAP分析在至少100个残基的区域上比对两个序列。在一个实例中，两个序列在它们的整个长度上进行比对。
经修饰的糖基化
抗体的糖基化模式可以从参考抗体的原始糖基化模式改变。改变是指删除抗体中发现的一个或多个碳水化合物部分，和/或添加抗体中不存在的一个或多个糖基化位点，和/或向参考抗体的原始糖基化模式添加一个或多个碳水化合物部分。抗体的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基侧链的连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是碳水化合物部分与天冬酰胺侧链酶促连接的识别序列。因此，这些三肽序列中的任一个在多肽中的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一连接到羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。通过改变氨基酸序列使其含有一个或多个上述三肽序列(对于N-连接的糖基化位点)，方便地实现向抗体添加糖基化位点。还可以通过在原始抗体的序列中添加或取代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行改变(对于O-连接的糖基化位点)。
本发明的抗体的修饰的糖形可用于多种目的，包括但不限于增强或降低效应子功能和/或修饰抗体的半衰期(参见例如WO/2007/010401)。这种改变可导致C1q和CDC结合或FcγR和ADCC结合的减少或增加。例如，可以在重链恒定区的一个或多个氨基酸残基中进行取代，从而导致效应子功能的改变，同时保持与修饰的抗体相比结合抗原的能力，参见US5,624,821和US 5,648,260。工程化的糖形可以通过本领域技术人员已知的任何方法产生，例如通过使用工程化的或变体表达菌株，通过与一种或多种酶，例如β(l,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIl 1)共表达，通过在各种生物体或来自各种生物体的细胞系中表达抗体或其片段，或通过在表达抗体或片段后修饰碳水化合物。产生工程化糖形的方法是本领域已知的，包括但不限于Umana等人，1999，Nat.Biotechnol 17:176-180；Davies等人，2007Biotechnol Bioeng 74：288-294；Shields等人，2002，J Biol Chem 277：26733-26740；Shinkawa等人，2003，J Biol Chem 278：3466-3473)美国专利第6,602,684号；美国专利第10/277,370号；美国专利第10/113,929号；PCT WO 00/61739A1；PCT WO 01/292246A1；PCT WO 02/311140Al；PCT WO 02/30954A1；
Figure BDA0003342276390000371
技术(Biowa,Inc.Princeton,N.J.)；GlycoMAbTM糖基化工程技术(GLYCART biotechnology AG，苏黎世，瑞士)。参见例如WO 00061739；EA01229125；US 20030115614；Cong等人(2004)JMB，336：1239-49。
效应子功能
可能需要就效应子功能而言修饰本发明的抗体，例如以便增强抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可以通过在抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸取代来实现。可替换地或附加地，可以在Fc区域引入半胱氨酸残基，从而允许在该区域形成链间二硫键。如此产生的同源二聚抗体可具有改善的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。参见Caron等人，J。J.ExpMed.176:1 191-1 195(1992)和Shopes，B.J.Immunol.148:2918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同源二聚体抗体也可以使用Wolff等人，Research 53:2560-2565(1993)描述的异双功能交联剂制备。或者，可以改造具有双Fc区的抗体，从而可以增强补体裂解和ADCC能力。参见Stevenson等人，抗癌药物设计(Anti-Cancer Drug Design)3:219-230(1989)。
半衰期
为了增加抗体的血清半衰期，可以将补救受体结合表位掺入抗体(尤其是抗体片段)中，例如，如美国专利5,739,277号中所述。如本文所用，术语“补救受体结合表位”是指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区的表位，其负责增加IgG分子的体内血清半衰期。或者，可通过聚乙二醇化增加抗体半衰期。
测定本发明的结合蛋白的活性
结合测定
这种测定法的一种形式是抗原结合测定，例如，如Scopes(1994)蛋白纯化：原理和实践(Protein Purification:principles and practice)Springer-Verlag中所述。这种方法通常包括标记HER2结合蛋白并将其与固定的抗原或其片段接触，例如，如图1所示的包括成熟正常或野生型人HER2的第293至309位残基的蛋白。洗涤除去非特异性结合蛋白后，检测标记物的量，结果检测结合蛋白的量。当然，可固定HER2结合蛋白并标记抗原。也可以使用淘选型测定。本文的实施例描述了基于流式细胞术的结合测定。
竞争性抑制本发明的HER2抗体与表位结合的HER2结合蛋白可使用本领域已知的常规竞争结合测定法例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)来筛选和鉴定。
竞争性结合测定
用于测定竞争性抑制本发明的抗体(例如mAb104)的结合的HER2结合蛋白的测定法对于本领域技术人员将是显而易见的。例如，本发明的抗体缀合至可检测标记，例如荧光标记或放射性标记。然后将标记的抗体和测试的HER2结合蛋白混合与HER2或包括其表位(例如对应于人HER2的结构域II的残基293至309)的肽接触。然后测定标记抗体的水平，并与在不存在HER2结合蛋白的情况下将标记抗体与HER2或包括其表位的肽接触时测定的水平进行比较。如果与不存在HER2结合蛋白相比，在测试HER2结合蛋白存在下标记抗体的水平降低，则HER2结合蛋白竞争性抑制抗体的结合。
任选地，将测试HER2结合蛋白缀合与抗体不同的标记。这允许检测测试HER2结合蛋白与蛋白或表位的结合水平。
在另一个实例中，在使HER2或包括其表位的肽与本文所述的抗体接触之前，允许测试HER2结合蛋白结合HER2或包括其表位的肽。与不存在HER2结合蛋白相比，存在HER2结合蛋白时结合抗体量的减少表明HER2结合蛋白竞争性抑制抗体与HER2的结合。还可以使用标记的HER2结合蛋白进行交互测定，并且首先允许抗体结合HER2或包括其表位的肽。在这种情况下，与不存在抗体相比，在抗体存在下与HER2或包括其表位的肽结合的标记HER2结合蛋白的量减少表明HER2结合蛋白竞争性抑制抗体与HER2的结合。
亲和力测定
任选地，测定HER2结合蛋白对HER2或其含有表位的肽的解离常数(Kd)或缔合常数(Ka)或结合常数(KD，即Ka/Kd)。在一个实施例中，通过放射性标记的或荧光标记的HER2结合测定来测量HER2结合蛋白的这些常数。该测定在滴定系列的未标记HER2存在下使HER2结合蛋白与最小浓度的标记的HER2平衡。洗涤除去未结合的HER2后，测定标记物的量。根据另一个实施例，通过使用表面等离子共振测定来测量常数，例如，使用具有固定化HER2或其区域的BIAcore表面等离振子共振(BIAcore，Inc.制，Piscataway，NJ)。
蛋白检测测定
本发明的一个实例检测HER2或表达HER2的细胞(例如乳腺癌细胞)的存在。使用本领域技术人员已知的多种技术中的任一种来确定蛋白质或细胞的量、水平或存在，例如如技术选自流式细胞术、免疫组织化学、免疫荧光、免疫印迹、Western blot、斑点杂交、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定、荧光共振能量转移(FRET)、基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)、电喷雾电离(ESI)、质谱分析(包括串联质谱分析、例如LC MS/MS)、生物传感器技术、消逝光纤技术或蛋白芯片技术组成的组。
在一个实例中，用于测定蛋白的量或水平的测定法是半定量测定法。在另一个实例中，用于测定蛋白的量或水平的测定法是定量测定法。
例如，用免疫测定检测蛋白，例如使用选自免疫组织化学，免疫荧光，酶联免疫吸附测定(ELISA)，荧光联免疫吸附测定(FLISA)，Western blotting，放射免疫测定(RIA)，生物传感器测定，蛋白芯片测定和免疫染色测定(例如免疫荧光)组成的组的测定。
标准固相ELISA或FLISA形式在测定来自各种样本的蛋白浓度中特别有用。
在一种形式中，ELISA或FLISA包括将本发明的HER2结合蛋白或结合HER2的不同表位的蛋白固定在固体基质上，例如膜、聚苯乙烯或聚碳酸酯微孔、聚苯乙烯或聚碳酸酯浸渍片或玻璃支持物。然后使样本与固定化蛋白物理相关，HER2被结合或“捕获”。然后使用与HER2的不同表位结合的第二标记化合物检测结合的HER2。或者，可以使用结合第二(检测)抗体的第三标记抗体。对于本领域技术人员显而易见的是，本文所述的测定形式适用于高通量形式，例如筛选过程的自动化或微阵列形式。此外，上述测定的变化对于本领域技术人员而言是显而易见的，例如竞争性ELISA。
在另一个实例中，使用本领域已知的方法，例如免疫组织化学或免疫荧光，在细胞内或细胞上检测多肽。使用免疫荧光的方法是示例性的，因为它们是定量的或至少半定量的。定量染色细胞的荧光程度的方法是本领域已知的，并描述于例如Cuello，1984。
生物传感器装置通常采用与电流或阻抗测量元件结合的电极表面，电流或阻抗测量元件被整合到与测定基质结合的装置中(例如在US 5567301中描述的)。将本发明的HER2结合蛋白掺入生物传感器装置的表面上并使生物样本与装置接触。生物传感器装置检测到的电流或阻抗的变化指示蛋白与HER2结合蛋白的结合。本领域已知的一些形式的生物传感器还依赖于表面等离子体共振(SPR)来检测蛋白相互作用，由此反射的表面等离子体共振表面的变化指示蛋白与配体或抗体结合(US 5485277和US 5492840)。
由于使这种系统易于适应微米或纳米尺度，生物传感器特别用于高通量分析。此外，这样的系统方便地适于结合几种检测试剂，允许诊断试剂在单个生物传感器单元中的多路复用。这允许同时检测少量体液中的几种蛋白或肽。
蛋白与HER2的结合也可用本文实施例中的流式细胞术检测。
由本发明的结合蛋白结合的表位
本发明人已经产生了对存在于致瘤的、过度增殖的或异常细胞而不是野生型或正常细胞中的人HER2的结构域II中的构象暴露的表位具有特异性的结合分子。该构象暴露的表位位于结构域II的远端部分，侧接二硫键，允许该区域的灵活变化和该表位的暴露已与mAb104结合。特别地，表位似乎在响应HER2扩增或活化的细胞中暴露。关于本发明的抗体特别令人惊讶的是它们不阻断帕妥珠单抗或曲妥单抗与HER2的胞外结构域的结合，表明当构象暴露时结构域II的该表位区域允许抗体结合而不阻断这些抗体的结合，潜在地允许双重治疗方法。
已经确定了与HER2结合的帕妥珠单抗的晶体结构(参见Franklin MC等人，(2004)Cancer Cell第5卷：317-328)。帕妥珠单抗在结构域II的中心附近结合HER2，空间阻断受体二聚化和信号转导所必需的结合口袋。可以理解，帕妥珠单抗的CDR H3使疏水和氢键与HER2的残基Lys311和His296接触。His296完全包埋在帕妥珠单抗结合中。由于帕妥珠单抗通过封闭HER2上接受异二聚体受体配偶体的二聚化环的口袋而特异性抑制HER2异二聚体化，不希望受理论束缚，本发明人假定本发明的结合分子(例如mAb104)在空间上可能结合HER2中的表位环的不同面上。发明人假设，当受体由于氧化还原二硫键转换或在癌症中HER2过表达或缺氧的条件下异常表达而发生构象变化时，或者当HER2与二聚化配偶体接合并经历构象变化以揭示由当前结合分子结合的环时，该表位可能在癌细胞表面的受体子集中被揭示，从而使其更容易获得。此外，已知在表位区域内，抗体不结合该区域中的每个氨基酸，并且由于mAb104表位的构象性质，这可以解释为什么紧密相对的表位不影响两种抗体的结合。
在一个实例中，HER2结合蛋白抑制HER2异二聚体化。
抗体缀合物
本发明还提供了如本文所述的HER2结合蛋白，其缀合至部分。部分可包括但不限于可检测或功能性标记。在一些实施方案中，部分选自放射性同位素、可检测标记、治疗性化合物、胶体、毒素、核酸、肽、蛋白、增加受试对象中HER2结合蛋白半衰期的化合物及其混合物组成的组。如本领域技术人员所理解的，该部分可以分类为上述列表中的一个或多个。例如，该部分可分为治疗性化合物和毒素。
在一些实施方案中，部分是放射性同位素。合适的放射性同位素包括同位素3H、14C、32P、33P、35S、36Cl、47Sc、51Cr、57Co、58Co、59Fe、67Ga、68Ga、89Zr、90Y、121I、124I、125I、131I、111In、177Lu、211At、198Au、67Cu、223Ra、225Ac、213Bi、99Tc和186Re，它们可以使用抗体成像领域已知的常规化学方法连接到本发明的抗体上。
在一些实施方案中，部分是可检测的标记。合适的可检测标记包括但不限于放射性标记，例如同位素3H、14C、32P、33P、35S、36Cl、47Sc、51Cr、57Co、58Co、59Fe、67Ga、68Ga、89Zr、90Y、121I、124I、125I、131I、111In、177Lu、211At、198Au、67Cu、223Ra、225Ac、213Bi、99Tc和186Re，其可以使用抗体成像领域已知的常规化学方法连接到本发明的抗体上。标记还包括荧光标记(例如荧光素、若丹明、德克萨斯红、藻红蛋白)和本领域常规用于MRI-CT成像的标记。它们还包括酶标记，例如辣根过氧化物酶、β-葡糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、碱性磷酸酶和氯霉素转移酶。标记还包括肽标签，如T7-、his-、myc-、HA-和FLAG-标签。标记还包括化学部分，如生物素，其可通过与特定的同源可检测部分如标记的抗生物素蛋白结合来检测。标记还包括电子致密试剂；能量转移分子；顺磁性标记、化学发光(咪唑、荧光素酶)；和生物发光剂。
在一些实施方案中，部分是核酸。合适的核酸包括双链DNA、单链DNA、siRNA、DNA酶或核酶。
在一些实施方案中，部分是治疗性化合物。合适的治疗性化合物包括能够改变生物反应(例如但不限于抑制或防止细胞的表达活性，引起细胞的破坏，或以其它方式影响细胞的功能)的化合物。此类治疗性化合物包括，例如但不限于，化学消融剂、毒素、免疫调节剂、细胞因子、细胞毒类药物、化学治疗剂和/或药物、并且包括但不限于以下：4-去乙酰长春碱-3-碳水化合物；5-氟-2′-脱氧尿苷；5-氟尿嘧啶；5-氟尿嘧啶脱碳；6-巯嘌呤；6-硫鸟嘌呤；相思子毒素；相思子毒素A链；放线菌素D；1-脱氢睾酮；阿霉素；油桐蛋白；烷化剂；烷基磷酸胆碱；氨基蝶呤；血管生成素；血管抑制素；蒽环类；氨茴霉素；抗血管生成药；抗叶酸剂；抗代谢物；抗有丝分裂物质；抗生素；阿糖胞苷；天冬酰胺酶澳瑞他汀衍生物(参见例如但不限于美国专利公开2008/0300192、2009/0018086、2009/0018086和2009/0111756号，其各自通过引用整体并入本文)；澳瑞他汀E(参见，例如但不限于，美国专利5,635,483号，其通过引用整体并入本文)；澳瑞他汀E戊酰基苄基腙；澳瑞他汀F亚苯基二胺；澳瑞他汀；auromycins；二碘苯酚芥；铋；博来霉素；白消安；卡奇霉素；卡铂；洋红霉素；卡莫司汀；cc-1065化合物(参见，例如但不限于，美国专利5,475,092、5,585,499、5,846,545、6,534,660、6,586,618、6,756,397、7,049,316、7,329,760、7,388,026、7,655,660和7,655,661号，美国专利公开2007/0135346、2008/0260685、和2009/0281158、和2009/0318668号，以及PCT公开第WO 2009/017394号，其各自通过引用整体并入本文)；苯丁酸氮芥；顺式-二氯二胺铂(顺铂)；克拉屈滨；秋水仙素(秋水仙碱)；卡贝塔汀；巴豆毒素；curicin；环磷酰胺；阿糖胞苷；细胞松弛素B；阿糖胞苷；细胞毒素；达卡巴嗪；更生霉素(放线菌素)；柔红霉素(道诺霉素)；香石竹毒蛋白；二溴甘露醇；二羟基蒽二酮(dihydroxy anthracin dione)；白喉毒素；尾海兔素-10；多西紫杉醇(doxetaxel)；多柔比星；多柔比星酰肼；倍癌霉素(参见，例如但不限于，美国专利7,214,685号，其通过引用整体并入本文)；吐根碱；内皮抑素；埃尼蒂恩(enediyenes)；伊诺霉素；表柔比星；埃斯培拉霉素化合物(参见，例如但不限于，美国专利4,675,187号，其通过引用整体并入本文)；溴化乙锭；依托泊苷；氟达拉滨白树毒素；吉非替尼，吉西他滨；糖皮质激素；短杆菌肽D；粒细胞集落刺激因子；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；伊达比星；嵌入剂；白介素-1；白介素-2；白介素-6；利多卡因；洛莫司汀；淋巴因子；美登醇(maytansinols)(参见例如但不限于美国专利4,137,230、4,151,042、4,162,940、4,190,580、4,225,494、4,228,239、4,248,870、4,256,746、4,260,608、4,263,294、4,264,596、4,265,814、4,294,757、4,307,016、4,308,268、4,308,269、4,309,428、4,317,821、4,320,200、4,322,348、4,331,598、4,360,462、4,361,650、4,362,663、4,364,866、4,371,533、4,424,219、4,450,234、5,141,736和5,217,713号，其各自通过引用整体并入本文)；氮芥；美法仑(及其他相关氮芥)；甲氨蝶呤；小沟结合物；光神霉素；丝林霉素(mitogellin)；丝裂霉素C；丝裂霉素；米托蒽醌；MMAF-二甲基氨基乙基胺；MMAF-N-t-丁基；MMAF-四甘醇；药莲毒素(modeccin)A链；苦瓜抑制剂；单甲基澳瑞他汀E(MMAE)(参见，例如但不限于美国专利6,884,869、7,098,308、7,256,257和7,423,116号，以及美国专利公开2003/0083263、2004/0157782、2005/0009751、2005/0113308和2006/0229253号，其各自通过引用整体并入本文)；单甲基澳瑞他汀F(MMAF)(参见，例如但不限于美国专利7,498,298号，以及美国专利公开2008/0226657、2008/0248051、2008/0248053和2009/0047296号，其各自通过引用整体并入本文)；吗啉代多柔比星；N2′-脱乙酰基-N2′-(c-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)(参见，例如但不限于，美国专利5,208,020号，其通过引用整体并入本文)；N2′-脱乙酰基-N2′-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊烷基)-美登素(DM4)(参见，例如但不限于，美国专利7,276,497号，其通过引用整体并入本文)；新制癌菌素；神经生长因子(和其他生长因子)；奥那司酮；紫杉醇；PE40；酚霉素；美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)；血小板衍生生长因子；普卡霉素；泼尼松；普鲁卡因；甲基苄肼；普萘洛尔；假单胞菌外毒素A；嘌呤霉素；吡咯并苯并二氮杂卓，放射性同位素(例如，如但不限于At211、Bi212、Bi213、Cf252、I125、I131、In111、Ir192、Lu177、P32、Re186、Re188、Sm153、Y90和W188)；局限曲霉素(retstrictocin)；局限曲菌素；蓖麻毒蛋白A；蓖麻毒蛋白；肥阜草抑制剂；皂草素；链脲佐菌素；苏拉明；三苯氧胺；紫杉类；紫杉烷类；他克唑；替尼泊甙；丁卡因；噻替哌苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)；噻替派；血栓形成剂；组织纤溶酶原激活物；拓扑异构酶I抑制剂；拓扑异构酶II抑制剂；toxotere；单端孢霉烯族化合物(tricothecenes)；肿瘤坏死因子；长春碱；长春花生物碱；长春花属；长春新碱；长春地辛；长春瑞滨；钇；α-干扰素；α-八叠球菌；和β-干扰素，以及其类似物、同源物、片段、变体和衍生物(还参见Garnett(2001)先进药物输送评论(Advanced drug Delivery Reviews)53:171-216，通过引用将其整体并入本文)。
在优选的实施方案中，治疗性化合物选自澳瑞他汀或其衍生物、美登素或其衍生物(也称为美登醇)或吡咯并苯并二氮杂卓或其衍生物组成的组。在一个实例中，治疗剂是N2′-脱乙酰基-N2′-(c-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)。在另一个实例中，治疗剂是单甲基澳瑞他汀E(MMAE)。在另一个实例中，治疗剂是吡咯并苯并二氮杂卓。
本发明还考虑了例如在WO 93/21232中描述的免疫毒素缀合物。
合适的胶体包括胶体金和金纳米颗粒。HER2结合蛋白可通过本领域技术人员已知的技术缀合至胶体(参见Jazayeri等人(2016)传感与生物传感研究(Sensing and Bio-Sensing Research)，9:17-22)。
在一些实施方案中，部分是毒素。合适的毒素包括但不限于细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或这种毒素的酶活性片段。所用的酶活性毒素及其片段是白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思子毒素A链、药莲毒素(modeccin)A链、α-八叠球菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、肥阜草抑制剂、多花白树毒蛋白、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯族化合物。
在一些实施方案中，部分是增加受试对象中HER2结合蛋白的半衰期的化合物。增加受试对象中HER2结合蛋白的半衰期的合适化合物包括PEG、重组PEG模拟物(包括柔性多肽如XTEN、弹性蛋白样多肽、明胶样多肽和(Pro-Ala-Ser)n)、碳水化合物(如葡聚糖、羟乙基淀粉、聚唾液酸和透明质酸)和肽/多肽(如IgG的白蛋白和Fc蛋白)。
此外，本发明的HER2结合蛋白，特别是抗体及其片段，可以缀合至二抗以形成抗体异源缀合物(参见，例如但不限于，美国专利4,676,980号，其通过引用整体并入本文)，可以单独或与另一种药剂(例如但不限于上述药剂)联合给药(有或没有与其连接或缀合的药剂)，和/或可以缀合到能够将前药转化为其活性形式的抗癌前药活化酶上。
如本领域技术人员将理解的，上述部分以及其它合适的部分可以以任何合适的方式缀合或连接至本发明的HER2结合蛋白，特别是抗体及其片段，以产生抗体缀合物。例如但不限于，在本发明的各种实施方案中，HER2结合蛋白和部分可以共价连接和/或可以使用接头、间隔区和/或延伸化合物缀合，其在本发明的各种实施方案中是可裂解的，不可裂解的，并且导致试剂被靶细胞内化。
例如，此类接头、间隔区和/或延伸化合物包括但不限于以下：氨基苯甲酸间隔区(参见，例如但不限于，美国专利7,091,186和7,553,816号，其各自通过引用整体并入本文)；马来酰亚胺基己酰基；对氨基苄基氨基甲酰基(PAB)；溶酶体酶切割接头(参见，例如但不限于，美国专利6,214,345号，其通过引用整体并入本文)；马来酰亚胺基己酰基-聚乙二醇(MC(PEG)6-OH)；N-甲基-缬氨酸瓜氨酸；4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)(参见，例如但不限于，Yoshitake等人，(1979)Eur.J.Biochem.，101，395-399，其通过引用整体并入本文)；4-(2-吡啶基二硫代)丁酸N-琥珀酰亚胺基酯(SPDB)(参见，例如但不限于，美国专利4,563,304号，其通过引用整体并入本文)；4-(2-吡啶基硫代)戊酸N-琥珀酰亚胺酯(SPP)；缬氨酸-瓜氨酸；以及其它接头、间隔区和/或延伸化合物(参见例如但不限于美国专利7,090,843、7,223,837和7,659,241号，以及美国专利公开2004/0018194、2004/0121940、2006/0116422、2007/0258987、2008/0213289、2008/0241128、2008/0311136、2008/0317747和2009/0010945号，其各自通过引用整体并入本文)。
一般而言，用于将上述部分以及其它部分连接和/或缀合至本发明的HER2结合蛋白，特别是抗体及其片段的技术是本领域已知的。在本发明的各种实施方案中，HER2结合蛋白和部分可以通过存在于HER2结合蛋白中的赖氨酸或半胱氨酸残基共价连接和/或缀合。在一个实施方案中，MMAE部分通过与半胱氨酸残基缀合而连接。在一个实施方案中，DM1部分通过与赖氨酸残基缀合而连接。在一个实施方案中，PBD(吡咯并苯并二氮杂卓)部分通过与半胱氨酸残基缀合而连接。合适的缀合化学综述于Jain等人(2015)PharmaceuticalResearch，32:3526中。还可参见，例如但不限于，Amon等人，“用于癌症治疗中药物的免疫靶向的单克隆抗体(Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy)”，在单克隆抗体和癌症治疗(Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy)中，Reisfeld等人(编)，pp.243-56(Alan R.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等人，“药物递送的抗体(Antibodies For Drug Delivery)”，在受控药物递送(Controlled Drug Delivery)(第二版)”中，Robinson等人，(编)，pp.623-53(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe，“癌症治疗中细胞毒类药物的抗体载体：综述(Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In CancerTherapy:A Review)”，在单克隆抗体84：生物学和临床应用(Monoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications)中，Pinchera等人(编)，pp.475-506(1985)；“在癌症治疗中放射性标记抗体的治疗用途的分析、结果和未来前景(Analysis,Results,AndFuture Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy)”，在用于癌症检测和治疗的单克隆抗体(Monoclonal Antibodies For CancerDetection And Therapy)中，Baldwin等人(编),pp.303-16(Academic Press 1985)和Thorpe等人，“抗体-毒素偶联物的制备和细胞毒性特性(The Preparation And CytotoxicProperties Of Antibody-Toxin Conjugates)”，Immunol.Rev.，62:119-58(1982)，Parslow等人(2016)Biomedicines,4,14，其各自通过引用整体并入本文。
在其中连接的部分是肽或多肽的实施方案中，缀合物可以是其中HER2结合蛋白和肽或多肽形成单一连续多肽链的融合蛋白。这些融合蛋白可以使用本领域已知的技术生产，包括重组技术或合成技术。
此外，抗体(包括其片段)和调节特异性结合成员、抗体和/或其亚单位的产生或活性的药物可具有某些诊断应用，并且可例如用于检测和/或测量病症，诸如癌症、癌前病变、与过度增殖性细胞生长相关或由过度增殖性细胞生长引起的病症等。例如，特异性结合成员、抗体或其亚单位可用于在多种细胞培养基中通过已知技术如杂交瘤技术利用例如融合的小鼠脾淋巴细胞和骨髓瘤细胞产生针对自身的多克隆和单克隆抗体。同样地，可以发现或合成模拟或拮抗本发明的特异性结合成员的活性的小分子，并且可以将其用于诊断和/或治疗方案中。
放射性标记的特异性结合成员，特别是抗体及其片段，可用于体外诊断技术和体内放射成像技术以及放射免疫治疗。在体内成像的情况下，本发明的特异性结合成员可以缀合到成像剂而不是放射性同位素，包括但不限于磁共振图像增强剂，其中例如抗体分子通过螯合基团装载有大量顺磁性离子。螯合基团的实例包括EDTA、卟啉、聚胺冠醚和聚肟。顺磁性离子的实例包括钆、铁、锰、铼、铕、镧、钬和ferbium。在本发明的另一方面，放射性标记的特异性结合成员，特别是抗体及其片段，特别是放射免疫缀合物可用于放射免疫治疗，特别是作为用于癌症治疗的放射性标记的抗体。在更进一步的方面，放射性标记的特异性结合成员，特别是抗体及其片段可用于放射免疫引导的手术技术，其中它们可以在手术去除癌细胞、癌前细胞、肿瘤细胞和过度增殖细胞之前、期间或之后鉴定和指示这些细胞的存在和/或位置。
竞争性抑制
竞争性抑制本发明的HER2抗体与表位结合的抗体可使用本领域已知的常规竞争结合测定法例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)来筛选和鉴定。
本发明的组合物
根据本发明的包括其缀合物的HER2结合蛋白通常将以药物组合物的形式施用，药物组合物可包括除HER2结合蛋白、HER2抗体或其抗原结合片段之外的至少一种组分。因此，根据本发明的药物组合物，以及根据本发明的用途，除了活性成分之外，还可以包括药学上可接受的赋形剂、载体(carrier)、缓冲液、稳定剂或本领域技术人员熟知的其他材料。这些物质应该是无毒的并且不应干扰活性成分的功效。载体(carrier)或其它材料的确切性质将取决于给药途径，其可以是口服或通过注射，例如静脉内。
用于口服给药的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉末或液体形式。片剂可包括固体载体(carrier)如明胶或佐剂。液体药物组合物通常包括液体载体(carrier)如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液、右旋糖或其它糖溶液或二醇如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
对于静脉内、注射或在病痛部位注射，活性成分将是肠胃外可接受的水溶液的形式，其是无热原的并且具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员能够使用例如等渗载体(vehicle)如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸林格氏注射液制备合适的溶液。根据需要，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲液、抗氧化剂和/或其它添加剂。
在一些实施方案中，脂质体和/或纳米颗粒也可与活性成分一起使用。脂质体的形成和使用通常是本领域技术人员已知的。脂质体可由分散在水性介质中并自发形成多层同心双层囊泡(也称为多层囊泡(MLV))的磷脂形成。MLV通常可具有25nm至4μm的直径。MLV的超声处理导致形成直径在200至500埃范围内的小单层囊泡(SUV)，在核中含有水溶液。当分散在水中时，磷脂可以形成不同于脂质体的各种结构，这取决于脂质与水的摩尔比。在低比例下，脂质体是优选的结构。脂质体的物理特性取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在。脂质体可显示对离子和极性物质的低渗透性，但在高温下经历相变，这显著改变它们的渗透性。相变涉及从称为凝胶态的紧密堆积的有序结构到称为流体态的松散堆积的无序结构的变化。
HER2结合蛋白或包括其的组合物可单独施用或与其它治疗、治疗剂或药剂组合施用，同时或依次施用，这取决于待治疗的病症。此外，本发明考虑并包括包括本文所述的HER2结合蛋白和其它试剂或治疗剂(例如抗癌剂或治疗剂、激素、其它抗HER2剂或抗体、或抗EGFR剂或抗体)的组合物。更一般地，这些抗癌剂可以是酪氨酸激酶抑制剂或磷酸化级联抑制剂、翻译后调节剂、细胞生长或分裂抑制剂(例如抗有丝分裂剂)或信号转导抑制剂。其它治疗或疗法可包括给予合适剂量的疼痛缓解药物，例如非甾体抗炎药(例如阿司匹林、对乙酰氨基酚、布洛芬或酮洛芬)或阿片制剂，例如吗啡或止吐药。组合物可以与酪氨酸激酶抑制剂(包括但不限于AG1478和ZD1839、STI571、OSI-774、SU-6668)、多柔比星、替莫唑胺、顺铂、卡铂、亚硝基脲、甲基苄肼、长春新碱、羟基脲、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、环磷酰胺、表鬼臼毒素、卡莫司汀、洛莫司汀和/或其它化疗剂组合(依次(即之前或之后)或同时)施用。因此，这些药剂可以是抗HER2特异性药剂或酪氨酸激酶抑制剂，例如拉帕替尼、阿法替尼、AG1478、ZDl 839、STI571、OSI-774或SU-6668、或者可以是更常见的抗癌和抗肿瘤药剂、例如多柔比星、顺铂、替莫唑胺、亚硝基脲、甲基苄肼、长春新碱、羟基脲、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、环磷酰胺、表鬼臼毒素、卡莫司汀或洛莫司汀。此外，该组合物可以与激素(如地塞米松)、免疫调节剂(如白细胞介素)、肿瘤坏死因子(TNF)或其他刺激免疫反应并减少或消除癌细胞或肿瘤的细胞因子或血管生成抑制剂一起使用。
在一些实例中，HER2结合蛋白或包括其的组合物与化学治疗剂、放射免疫治疗剂或免疫治疗剂组合。在一个实例中，免疫治疗剂是检查点抑制剂。在另一个实例中，该检查点抑制剂选自易普利姆玛(Ipilimumab，CTLA4)、纳武利尤单抗(nivolumab，PD-1)、派姆单抗(pembrolizumab，PD-1)、阿特珠单抗(atezolizumab，PD-L1)、阿利库单抗(avelumab，PD-L1)、德瓦鲁单抗(durvalumab，PD-L1)和西米普利单抗(cemiplimab，PD-1)。
在一些实例中，HER2结合蛋白或包括其的组合物与免疫抑制药物一起施用。
在一些实例中，HER2结合蛋白或包括其的组合物与免疫调节剂一起施用。合适的免疫调节剂的实例包括白介素(例如IL-2、IL-7、IL-12)、细胞因子(例如干扰素、G-CSF)、趋化因子(例如CCL3、CCL26和CXCL7)和免疫调节酰亚胺药物(例如沙利度胺)。
本发明的HER2结合蛋白可以经由任何合适的途径施用于需要治疗的患者，通常通过注射到血流或CSF中，或直接注射到肿瘤部位中。精确的剂量将取决于许多因素，包括抗体是用于诊断还是用于治疗，肿瘤的大小和位置，HER2结合蛋白的精确性质(无论是全抗体、片段、双抗体等)，和附着于抗体的可检测或功能标记的性质。当放射性核素用于治疗时，合适的最小单剂量为约45mCi/m2，最大为约250mCi/m2。优选的剂量范围为15-40mCi，进一步优选的剂量范围为20至30mCi或10至30mCi。这种治疗可能需要骨髓或干细胞替代。用于肿瘤成像或肿瘤治疗的典型抗体剂量为0.5至40mg，优选1至4mg F(ab')2形式的抗体。裸抗体优选以每剂20至1000mg蛋白，或每剂20至500mg蛋白，或每剂20至100mg蛋白的剂量施用。这是用于成人患者的单次治疗的剂量，其可以针对儿童和婴儿成比例地调整，并且还针对与分子量成比例的其他抗体形式调整。根据医师的判断，可以每天，每周两次，每周或每月间隔重复治疗。
合适的血管生成抑制剂(抗血管生成剂)的实例包括但不限于尿激酶抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂(如马立马司他(marimastat)、癌立消(neovastat)、BAY 129566、AG3340、BMS 275291和类似试剂)、内皮细胞迁移和增殖的抑制剂(如TNP470、角鲨胺、2-甲氧基雌二醇、combretastatin、内皮抑素、血管抑制素、青霉胺、SCH66336(Schering-PloughCorp，Madison，NJ)、R115777(Janssen Pharmaceutica,Inc，Titusville，NJ)和类似试剂)、血管生成生长因子的拮抗剂(如ZD6474、SU6668、抗血管生成剂和/或其受体的抗体(如VEGF、bFGF和血管生成素1)、沙利度胺、沙利度胺类似物(如CC5013)、Sugen 5416、SU5402、抗血管生成核酶(如angiozyme)、干扰素α(如干扰素α2a)、苏拉明和类似药物)、VEGF-R激酶抑制剂和其它抗血管生成酪氨酸激酶抑制剂(如SU011248)、内皮特异性整合蛋白/存活信号转导抑制剂(如vitaxin和类似药物)、铜拮抗剂/螯合剂(如四硫代钼酸盐、卡托普利和类似药物)、羧酰氨基三唑(CAI)、ABT627、CM101、白介素12(IL12)、IM862、PNU145156E以及抑制血管生成的核苷酸分子(如反义-VEGF-cDNA、编码血管抑制素的cDNA、编码p53的cDNA和编码缺陷型VEGF受体2的cDNA)和类似试剂。血管生成，新血管形成和/或其它血管形成的抑制剂的其它实例是抗血管生成的肝素衍生物和相关分子(例如肝素酶III)、替莫唑胺、NK4、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、环加氧酶2抑制剂、低氧诱导因子1抑制剂、抗血管生成的大豆异黄酮、奥替普拉、烟曲霉素及其类似物、生长抑素类似物、戊聚糖多硫酸酯、替考加兰钠、达肝素、肿瘤抑素、血小板反应蛋白、NM3、卡贝塔汀、血管能抑素、avastatin、针对其它相关靶标的抗体(例如抗-α-v/β-3整合蛋白和抗-kininostatin mAb)和类似药剂。
测量细胞活力和增殖
细胞毒性和存活力(细胞凋亡、裂解、生长增殖等)可基于本领域已知的量热、发光、辐射或荧光测定法并如本文实施例中以多种方式测量。用于测定细胞活力的比色技术包括例如台盼蓝排除法。简言之，细胞用台盼蓝染色并用血细胞计数器计数。活细胞排除染料，而死细胞和濒死细胞吸收蓝色染料并在光学显微镜下容易区分。中性红被活细胞吸附并在细胞溶酶体中浓缩；可用光学显微镜通过定量中性红染色细胞的数量来确定活细胞。
用于测定细胞活力的荧光技术包括例如碘化丙啶(propidium iodide)，荧光DNA嵌入剂。碘化丙啶从活细胞中排除，但染色死细胞的细胞核。然后可以使用碘化丙啶标记的细胞的流式细胞术来定量活细胞和死细胞。乳酸脱氢酶(LDH)的释放指示细胞的结构损伤和死亡，并且可以通过分光光度酶测定来测量。将溴脱氧尿苷(BrdU)掺入到新合成的DNA中，并用荧光染料标记的抗体检测。荧光染料Hoechst 33258标记DNA并可用于定量细胞增殖(例如流式细胞术)。荧光染料羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE或CFDA-SE)的定量掺入可提供细胞分裂分析(例如流式细胞术)。该技术可用于体外或体内。7-氨基放线菌素D(7-AAD)是荧光嵌入剂，其在与DNA结合时经历光谱偏移，并且可以提供细胞分裂分析(例如，流式细胞术)。
用于测定细胞增殖的放射性测量技术包括，例如，[3H]-胸苷，其被掺入活细胞的新合成的DNA中并经常用于测定细胞的增殖。可以通过闪烁计数来定量从死亡细胞释放的铬(51Cr)以定量细胞活力。
用于测定细胞活力的发光技术包括例如CellTiter-Glo发光细胞活力测定(Promega Madison Wis.)。该技术量化存在的ATP的量以确定活细胞的数目。
用于测定细胞活力和细胞增殖的市售试剂盒包括例如Cell ProliferationBiotrak ELISA(Amersham Biosciences Piscataway，N.J.)；Guava ViaCount Assay，其基于荧光试剂的差异摄取提供快速细胞计数和活力测定(Guava Technologies，Hayward，Calif.)；CyQUANT.细胞增殖测定试剂盒(Molecular Probes,Inc.,Eugene,Oreg.)；和CytoLux测定试剂盒(PerkinElmer Life Sciences Inc.,Boston,Mass.)。DELFIA测定试剂盒(PerkinElmer Life Sciences Inc.,Boston,Mass.)可以使用时间分辨荧光测定法测定细胞增殖和活力。定量细胞增殖测定是基于荧光的测定，其测量来自裂解细胞的DNA-染料复合物的荧光(Stratagene,La Jolla,Calif.)。CellTiter-Glo细胞活力测定是用于测量细胞活力的发光测定(Promega,Madison Wis.)。
应用
(i)诊断和治疗用途
本发明的HER2结合蛋白，特别是抗体或其片段的独特特异性，由此结合蛋白识别HER2/ErbB2表位，该表位在致瘤、过度增殖或异常细胞中发现，并且在正常或野生型细胞中检测不到，并且其中蛋白与扩增的EGFR结合而不与野生型HER2结合，为识别、表征、靶向和治疗、减少或消除多种致瘤细胞类型和肿瘤类型(例如头颈部、乳腺、肺、膀胱或前列腺肿瘤和神经胶质瘤)提供了诊断和治疗用途，没有以前已知的HER2抗体可能出现的与正常组织摄取相关的问题。
因此，利用本发明的结合蛋白，特别是抗体或其片段，可以识别、分离、表征、靶向和治疗或消除过表达HER2(例如通过扩增)的细胞。
因此，本发明的HER2结合蛋白(例如抗体)可以通过染色或以其他方式识别其中存在HER2过表达的那些肿瘤或细胞来特异性地分类HER2肿瘤或致肿瘤细胞的性质。此外，本发明的抗体，如mAb104所示例的，证明了针对含有扩增的HER2和HER2阳性异种移植物的肿瘤的显著体内抗肿瘤活性。
如上所述，本发明人已经发现，当在正常细胞中表达时，本发明的HER2结合蛋白识别HER2的肿瘤相关形式，但不识别正常的野生型受体。据信抗体识别依赖于响应HER2扩增或活化的构象，其打开构象暴露的表位用于结合。
显示mAb104抑制人肿瘤的过表达的(例如扩增的)HER2异种移植物的生长并诱导此类肿瘤内的坏死。
(ii)治疗性HER2结合蛋白及其用途
体内特性，特别是关于肿瘤：本发明的HER2结合蛋白的血液比率和清除率将至少与mAb104相当。在人或动物受试对象给药后，这种特异性结合成员将显示>1:1的峰值肿瘤与血液比率。优选地，在这样的比率下，特异性结合成员还将具有大于1:1，优选地大于2:1，更优选地大于5:1的肿瘤与器官比率。优选地，在这样的比率下，结合蛋白在远离肿瘤部位的器官中也具有<1:1的器官与血液比率。这些比例排除了给予的结合蛋白分解代谢和分泌的器官。因此，在scFv和Fab的情况下，结合成员将通过肾脏分泌。在全部IgG的情况下，清除将至少部分地经由肝脏。完整抗体的峰定位比通常在HER2结合蛋白给药后10至200h之间达到。更具体地，该比率可以在无胸腺裸小鼠一侧皮下形成的约0.2至1.0g的肿瘤异种移植物中测量。
本发明的HER2结合蛋白(例如抗体)可以用可检测或功能性标记或部分标记。如本领域技术人员所理解的，标签可以在多于一个类别下定义。可检测标记包括但不限于放射性标记，例如同位素3H、14C、32P、35S、36C1、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、1211、1241、1251、131I、πιIn、211At、198Au、67Cu、225Ac、213Bi、99Tc和186Re，其可使用抗体成像领域中已知的常规化学方法连接到本发明的抗体。标记还包括荧光标记和本领域常规用于MRI-CT成像的标记。它们还包括酶标记如辣根过氧化物酶。标记物还包括化学部分，如生物素，其可通过与特定的同源可检测部分如标记的抗生物素蛋白结合来检测。
功能标记包括设计成靶向肿瘤部位以引起肿瘤组织破坏的物质。这种功能性标记包括细胞毒性药物如5-氟尿嘧啶或蓖麻毒蛋白和酶如细菌羧肽酶或硝基还原酶，它们能够在肿瘤部位将前药转化为活性药物。
此外，包括多克隆和单克隆抗体的抗体，以及调节结合蛋白、抗体和/或其亚单位的产生或活性的药物可具有某些诊断应用，并且可例如用于检测和/或测量病症，诸如癌症、癌前病变、与过度增殖性细胞生长相关或由过度增殖性细胞生长引起的病症等。例如，HER2结合蛋白、抗体或其亚单位可用于在多种细胞培养基中通过已知技术如杂交瘤技术利用例如融合的小鼠脾淋巴细胞和骨髓瘤细胞产生针对自身的多克隆和单克隆抗体。同样地，可以发现或合成模拟或拮抗本发明的HER2结合蛋白的活性的小分子，并且可以将其用于诊断和/或治疗方案中。
放射性标记的HER2结合蛋白，特别是抗体及其片段，可用于体外诊断技术和体内放射成像技术以及放射免疫治疗。在体内成像的情况下，本发明的HER2结合蛋白可以缀合到成像剂而不是放射性同位素，包括但不限于磁共振图像增强剂，其中例如抗体分子通过螯合基团装载有大量顺磁性离子。螯合基团的实例包括EDTA、卟啉、聚胺冠醚和聚肟。顺磁性离子的实例包括钆、铁、锰、铼、铕、镧、钬和ferbium。在本发明的另一实例中，放射性标记的HER2结合蛋白，特别是抗体及其片段，特别是放射免疫缀合物可用于放射免疫治疗，特别是作为用于癌症治疗的放射性标记的抗体。在更进一步的实例中，放射性标记的HER2结合蛋白，特别是抗体及其片段可用于放射免疫引导的手术技术，其中它们可以在手术去除癌细胞、癌前细胞、肿瘤细胞和过度增殖细胞之前、期间或之后鉴定和指示这些细胞的存在和或位置。
本发明的免疫偶联物或抗体融合蛋白，其中本发明的HER2结合蛋白，特别是抗体及其片段缀合或连接至其他分子或试剂还包括但不限于缀合至化学消融剂、毒素、免疫调节剂、细胞因子、细胞毒类药物、化疗剂或药物的结合蛋白。
已经使用各种抗体免疫偶联物证实了放射免疫疗法(RAFT)的功效。已经在结直肠癌中评价了131I标记的人源化抗癌胚抗原(抗CEA)抗体hMN-14(Behr TM等人(2002)Cancer94(增刊4)：1373-81)并且在甲状腺髓样癌中评估了具有90Y标记的相同抗体(Stein R等人(2002)Cancer 94(1):51-61)。还评估并报道了使用单克隆抗体的放射免疫疗法用于非何杰金氏淋巴瘤和胰腺癌(Goldenberg DM(2001)Crit Rev Oncol Hematol 39(1-2):195-201；Gold DV等人(2001)Crit Rev Oncol Hematol 39(1-2)147-54)。在美国专利6,306,393和6,331,175中也描述了使用特定抗体的放射免疫治疗方法。
放射免疫导向手术(RIGS)已经证明了功效和有用性，包括使用抗CEA抗体和针对肿瘤相关抗原的抗体(Kim JC等人(2002)Int J Cancer 97(4):542-7；Schneebaum S等人(2001)World J Surg 25(12):1495-8；Avital S等人(2000)Cancer 89(8):l092-8；McLosh DG等人(1997)Cancer Biothcr Radiopharai 12(4):2S7-94)。
本发明的HER2结合蛋白(例如抗体)可以经由任何合适的途径施用于需要治疗的患者，通常通过注射到血流或CSF中，或直接注射到肿瘤部位中。精确的剂量将取决于许多因素，包括抗体是用于诊断还是用于治疗，肿瘤的大小和位置，抗体的精确性质(无论是全抗体、片段、双抗体等)，和附着于抗体的可检测或功能标记的性质。当放射性核素用于治疗时，合适的最大单剂量为约45mCi/m2，最大为约250mCi/m2。优选的剂量范围为15-40mCi，进一步优选的剂量范围为20至30mCi或10至30mCi。这种治疗可能需要骨髓或干细胞替代。用于肿瘤成像或肿瘤治疗的典型抗体剂量为0.5至40mg，优选1至4mg F(ab')2形式的抗体。裸抗体优选以每剂20至1000mg蛋白，或每剂20至500mg蛋白，或每剂20至100mg蛋白的剂量施用。这是用于成人患者的单次治疗的剂量，其可以针对儿童和婴儿成比例地调整，并且还针对与分子量成比例的其他抗体形式调整。根据医师的判断，可以每天，每周两次，每周或每月间隔重复治疗。
这些制剂可包括第二结合蛋白，如本文的EGFR结合蛋白或HER2结合蛋白。在一个特别优选的形式中，该第二结合蛋白是曲妥单抗。
(iii)抗癌治疗
本发明的HER2结合蛋白(例如抗体)可用于多种应用，包括研究，诊断和治疗应用。在一个实例中，本发明提供了治疗或预防受试对象中的病症的方法。如本文所用，“病症”是正常功能的破坏或干扰。
(iv)诊断测定
本发明还涉及多种体外或体内诊断应用，包括通过参考异常表达的HER2被本发明的HER2结合蛋白(例如抗体)识别的能力来检测异常表达的HER2的存在的方法。本发明抗体的诊断应用包括本领域技术人员熟知和标准的体外和体内应用，并基于本说明书。用于体外评估和评价HER2状态，特别是关于HER2异常表达的诊断测定和试剂盒可用于诊断，评价和监测患者样本，包括已知患有或怀疑患有癌症、癌前病症、与过度增殖性细胞生长相关的病症的那些或来自肿瘤样本。HER2状态的评估和评价还可用于确定患者对药物临床试验的适合性或用于施用本发明的特定化学治疗剂或特异性结合成员(特别是抗体)(包括其组合)与不同药剂或抗体的适合性。这种类型的诊断性监测和评估在实践中已经利用针对乳腺癌中HER2蛋白的抗体(Hercep Test,Dako Corporation)，其中该测定也用于评价患者使用赫赛汀的抗体疗法。体内应用包括肿瘤成像或评估个体的癌症状态，包括放射成像。
细胞中HER2的存在可以在本领域技术人员已知的体外或体内免疫学方法中确定。例如，HER2受体与一种或多种抗体形成复合物，并且该复合物的一个成员用可检测标记物标记。最常用于这些研究的标记是放射性元素、酶、当暴露于紫外光时发荧光的化学品等。许多荧光材料是已知的并且可以用作标记。这些包括例如荧光素、若丹明、金胺、德克萨斯红、AMCA蓝和荧光黄。抗HER2抗体也可以用放射性元素或酶标记。放射性标记可以通过任何当前可用的计数程序来检测。优选的同位素可选自3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、121I、1241、1251、131I5 111In、211At、198Au、67Cu、225Ac、213Bi、99Tc和186Re。酶标记物同样是有用的，并且可以通过任何目前使用的比色、分光光度、荧光分光光度、电流或气体计量技术来检测。通过与桥连分子如碳二亚胺、二异氰酸酯、戊二醛等反应将酶缀合到所选颗粒上。在这些方法中可以使用的许多酶是已知的并且可以使用。优选过氧化物酶、β-葡糖醛酸酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶加过氧化物酶和碱性磷酸酶。美国专利号3,654,090、3,850,752和4,016,043是以其公开的替代标记材料和方法为例提及的。
试剂盒
本发明还考虑了包括本发明的HER2结合蛋白的治疗或诊断试剂盒用于本治疗方法的用途。此类试剂盒通常在合适的容器装置中含有本发明的至少一种HER2结合蛋白(诸如抗体或片段)的药学上可接受的制剂。该试剂盒可用于检测生物样本中HER2受体的存在。本发明的抗体组合物可以液体或冻干形式提供，单独或与对其它表位特异性的其它抗体组合。可标记或未标记的抗体可与辅助成分(例如缓冲液，如Tris、磷酸盐和碳酸盐、稳定剂、赋形剂、抗微生物剂和/或惰性蛋白，例如牛血清白蛋白)一起包括在试剂盒中。例如，抗体可作为与辅助成分的冻干混合物提供，或辅助成分可单独提供以供使用者组合。基于活性抗体的量，这些辅助物质通常以小于约5wt％存在，并且基于抗体浓度，通常以至少约0.001wt％的总量存在。当使用能够结合抗体的二抗时，这样的抗体可以在试剂盒中提供，例如在单独的小瓶或容器中。二抗(如果存在)通常被标记，并且可以以与本文的抗体制剂类似的方式配制。
可以制备适合由医学专家使用的商业测试试剂盒以确定在怀疑的靶细胞中存在或不存在HER2的异常表达，包括但不限于扩增的HER2。根据以上讨论的测试技术，此类试剂盒的一个类别将至少含有标记的HER2或其结合配偶体，例如对其特异性的抗体，并且当然取决于所选择的方法的指导，例如“竞争性”、“夹心式”、“DASP”等。试剂盒还可以含有外周试剂，例如缓冲液、稳定剂等。
因此，可制备用于证明细胞存在或能够异常表达HER2的测试试剂盒，其包括：
(a)预定量的至少一种经标记的免疫化学反应性组分，其通过将本文所述的HER2结合蛋白或其特异性结合配偶体直接或间接连接至可检测标记而获得；
(b)其他试剂；以及
(c)试剂盒的使用说明。
更具体地，诊断测试试剂盒可以包括：
(a)已知量的如上所述的HER2结合蛋白(或结合配偶体)，其通常结合至固相以形成免疫吸附剂，或在替代方案中，结合至合适的标签，或多种此类终产物等(或其结合配偶体)，每种中的一种；
(b)必要时，其他试剂；以及
(c)测试试剂盒的使用说明。
在另一个实例中，可制备测试试剂盒并用于上述目的，其根据预定方案(例如“竞争性”、“夹心”、“双抗体”等)操作，并且包括：
(a)通过将HER2结合蛋白与可检测标记偶联获得的标记组分；
(b)一种或多种另外的免疫化学试剂，其中至少一种试剂是配体或固定化配体，配体选自以下组成的组：
(i)能够与标记的组分(a)结合的配体；
(ii)能够与标记组分(a)的结合配偶体结合的配体；
(iii)能够与至少一种待测定组分结合的配体；以及
(iv)能够与至少一种待测定组分的至少一种结合配偶体结合的配体；以及
(c)实施检测和/或测定HER2，HER2结合蛋白和其特异性结合配偶体之间的免疫化学反应的一种或多种组分的方案的指导。
根据上文，可以制备用于筛选有效调节HER2活性，HER2异常表达和/或HER2结合蛋白活性或结合的潜在药物的测定系统。可以将受体或结合蛋白引入到测试系统中，也可以将预期药物引入到所得细胞培养物中，然后检查培养物以观察细胞的S期活性的任何变化，这是由于单独加入预期药物，或由于加入量的已知试剂的作用。
本领域技术人员将理解，在不脱离如广泛描述的本发明的范围的情况下，可以对如具体实施方案中所示的本发明做出许多变化和/或修改。因此，本实施方案在所有方面都被认为是说明性的而非限制性的。
在以下非限制性实施例中进一步描述本发明。
实施例
本领域技术人员应当理解，在不脱离本公开的广义范围的情况下，可以对上述实施方案行多种变化和/或修改。因此，本实施方案在所有方面都被认为是说明性的而非限制性的。
材料和方法
细胞系和培养条件
亲本系获自美国模式菌种收集中心(ATCC，USA)，Asterand Bioscience(USA)，路德维希癌症研究所或澳大利亚细胞库(澳大利亚)。将细胞在供应商推荐的培养基中在37℃孵育器中用5％CO2培养。所有培养基补充有10％胎牛血清(FCS)(CSL，Melbourne，Victoria，澳大利亚)，2mM谷氨酰胺(Sigma Chemicals Co，St Louis，MO，USA)和2mM青霉素/链霉素(Life Technologies，Grand Island，NY，USA)。细胞传代，当80％汇合时更换其培养基。细胞在指数生长期用于实验。为了传代贴壁细胞，除去培养基并加入适当体积(基于生长表面积)的含有2mM EDTA和胰蛋白酶(Life technologiesTM，澳大利亚)的PBS溶液。细胞系描述于表1中。
表1细胞系
Figure BDA0003342276390000511
抗体和抗原
一抗购自下表2中所列的市售来源或使用蛋白-g亲和层析从杂交瘤上清液纯化。
表2本申请使用的抗体
Figure BDA0003342276390000521
抗原
线性和环化的肽免疫原和不相关的对照肽由Mimitopes Pty Ltd(Clayton，澳大利亚)化学合成并与匙孔戚血蓝蛋白(KLH)偶联。线性肽序列是H-CPLHNQEVTAEDGTQR-NH2，环状肽序列是H-GCPLHNQEVTAEDGTQRC-NH2，其中N端的H-是指游离胺。还制备了与KLH偶联的对照无关肽H-LEEKKGNYVVTDHC-NH2。
基于先前公开的方法，HER2胞外结构域(HER2-ECD)在学术合作者A.W.Burgess教授(沃尔特和伊丽莎·霍尔医学研究所(The Walter and Eliza Hall Institute ofMedical Research))的实验室中产生(Xu Y，Soo P，Walker F，Zhang HH，Redpath N，TanCW等人，LRIG1 extracellular domain:Structure and function analysis.Journal ofmolecular biology.2015；427(10):1934-48.)。简言之，将对应于人HER2-ECD的合成DNA
Figure BDA0003342276390000531
克隆到表达载体(vector)中，在Hi5昆虫细胞中表达，并通过抗FLAG M2珠(Sigma-Aldrich)纯化。在20mM Tris–HCl(pH8.5)和100mM NaCl中通过凝胶过滤进一步纯化蛋白。
细胞生物学试剂和来源
试剂的细节在下表中提供。
表3所用试剂
Figure BDA0003342276390000532
培养基和溶液
琼脂糖(1-1.5％)：将琼脂糖溶解在1×TAE中至终浓度为1-1.5％w/v。
琼脂糖缓冲液1x：10mM BisTris HCl pH6.5；0.2mM EDTA；100mM NaCl。
封闭缓冲液：5％w/v脱脂奶粉(Fonterra，Mount Waverly，澳大利亚)，0.1％v/v吐温20(ICN Biomedicals)在Tris缓冲盐水(TBS；20mM Tris-HCl，150mM NaCl)。
二乙醇胺-HCl缓冲液：二乙醇胺(10％或0.1M)，MgCl2.6H2O(1mM)，NaN3
DMEM-10：杜皮克氏改良爱哥尔氏培养基(Dulbeccos modified eagles medium)补充有10％FCS，2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺GlutaMAXTM)，100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素。
EDTA-PBS：2mM的EDTA的PBS溶液，不含Ca2+或Mg2+。
EDTA-PBS-3％FCS：补充有3％FCS的EDTA-PBS。
MATRIGELTM基质：
组合物MATRIGELTM基质(产品信息)
Figure BDA0003342276390000541
RIPA缓冲液：50mM Tris，150mM NaCl，5mM EDTA，0.5％脱氧胆酸钠，10mM NaF和蛋白酶抑制剂(pH7.5)。
RPMI-10培养基：RPMI-1640含有10％胎牛血清(FCS)，2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(GlutaMAXTM)，100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素。
运行缓冲液(Western blot)：将
Figure BDA0003342276390000551
SDS运行缓冲液(Invitrogen)在milliqH2O中稀释至1×运行缓冲液。
TBS(10×)：24.2g
Figure BDA0003342276390000552
碱；80g氯化钠；970ml H2O，使用HCL调节pH至7.5，总体积为1000ml。
TBS-T：补充有0.05％
Figure BDA0003342276390000553
20的1×TBS。
细胞生物学仪器
下表提供了细胞生物学仪器的详细信息。
表4仪器详情
Figure BDA0003342276390000554
小鼠的免疫和单克隆抗体产生
用含有HER2胞外结构域构象暴露区域的30μg肽免疫雌性BALB/c小鼠，如通过结构建模确定的，序列H-GCPLHNQEVTAEDGTQRC-NH2(SEQ ID NO：26)合成为环肽，与匙孔戚血蓝蛋白(KLH)偶联为载体(carrier)蛋白。以四周的间隔向腹膜内注射。在磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH7.2)中制备抗原，然后与弗氏完全佐剂(Sigma，St.Louis，MO)(Flies DB，Chen L.Asimple and rapid vortex method for preparing antigen/adjuvant emulsions forimmunization.Journal of immunological methods.2003；276(1):239-42)混合用于第一次注射，与弗氏不完全佐剂混合用于第二次注射。然后进行两次单独的肽免疫原的加强注射。最后一次免疫后3天，处死小鼠，收获来自超免疫小鼠的脾细胞并以1:50的比例与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合以产生杂交瘤(Yokoyama WM，Christensen M，Santos GD，MillerD，Ho J，Wu T等人，Production of monoclonal antibodies.Current protocols inimmunology.2006:2.5.1-2.5.29)。融合细胞在补充有10％FCS和添加剂的完全RPMI培养基中生长。使用间接ELISA筛选生长细胞的上清液。
酶联免疫吸附测定(ELISA)
将聚苯乙烯96孔板用3μg/mL HER2-ECD肽-KLH抗原作为线性或环状肽，阴性对照-KLH缀合的肽或PBS中的重组HER2 ECD在40℃下过夜包被。在室温(RT)下用含3％FCS的PBS封闭板1h。将板与以1:50稀释度开始的连续稀释的杂交瘤上清液以及适当的对照一起孵育1h。洗涤三次后，将板与抗小鼠IgG HRP缀合物(1:2000稀释)在室温下孵育1h。再洗涤三次后，使用pNPP底物测量磷酸酶活性，使用具有Softmax Pro 4.8软件的Versamax酶标仪(分子装置)在405nm处读取吸光度(OD)。
从4个候选克隆(本文称为mAb104、mAb105、mAb106或mAb107)中鉴定阳性杂交瘤纯化抗体后，用ELISA进行评估。将聚苯乙烯96孔板用PBS中的3％FCS在室温下包被1h。通过在0.1％乙酸中稀释肽达到1mg/mL的最终肽浓度。将该肽溶液在3％FCS-PBS中进一步稀释至30μg/ml。将板与偶联KLH、HER2-ECD或阴性对照肽-KLH的线性或环状肽免疫原在稀释缓冲液(3％FCS-PBS)中于RT孵育1h。用0.05％吐温20-PBS洗涤板三次后，将孔与10μg/mLmAb104、mAb105、mAb106或mAb107再孵育1h。洗涤后，将板与抗小鼠Ig-碱性磷酸酶(SigmaA-3688)(1:3000稀释)在室温下孵育1h。再洗涤三次后，使用pNPP底物测量磷酸酶活性，使用具有Softmax Pro 4.8软件的Versamax酶标仪(分子装置)在405nm处读取光密度吸光度。
将聚苯乙烯96孔板用50ml/孔，3μg/mL重组ErbB2 ECD、ErbB3 ECD、ErbB4 ECD或EGFR501的PBS溶液在40℃包被过夜。在室温(RT)下用含3％FCS的PBS封闭板1h。在室温下将板与10μg/mL连续稀释的纯化抗体以及适当的对照一起孵育1h。洗涤三次后，将板与抗小鼠IgG AP缀合物(1:2000稀释)在室温下孵育1h。再洗涤三次后，使用pNPP底物测量磷酸酶活性，使用SPECTROstar酶标仪(BMG LABTECH，Victoria，澳大利亚)在405nm处读取吸光度(OD)。
FACS分析
将细胞(1×104)接种于96孔板中，加入10μg/ml抗HER2抗体或IgG1同种型对照抗体，4℃孵育1h。人源化抗体使用Alexa-488-缀合的抗人IgG抗体检测曲妥单抗和帕妥珠单抗。使用Alexa-488-缀合的抗-小鼠IgG抗体检测结合的mAb104、mAb105、mAb106或mAb107或小鼠同种型对照LMH-3，并在Becton Dickinson FACScan(CellQuestPro 4.0.2版)上读取荧光。阴性对照包括单独的二抗和单独的细胞背景荧光。
生物传感器分析
在BIAcoreTM T200系统中使用羧甲基葡聚糖涂覆的传感器芯片(CM5-S，GE LifeSciences)进行表面等离子体共振(SPR)动力学分析。使用标准胺偶联化学(0.05M NHS/0.2M EDC)将测试通道衍生为200响应单位(RU)的HER2-ECD。用乙醇胺衍生用于校正折射率效应的空白对照通道。
将mAb104、mAb106、帕妥珠单抗或曲妥单抗抗HER2抗体的样本在PBS/0.005％吐温20缓冲液中稀释至320μg/mL至0μg/mL的浓度，稀释两倍(2133至0nM)。将样本以45uL/min注射200s(30μL、30μL、10μL/min)，PBS缓冲液含有在固定化HER2-ECD上的0.005％吐温-20，使用PBS/0.005％吐温20作为运行缓冲液。在注射阶段之后，通过使运行缓冲液在芯片表面上流动600s来监测解离。洗脱结合的抗体并通过以30uL/min注射30μl的50mM NaOH 30s在样本之间再生芯片表面。
Western Blot分析
使用Western blot测定抗HER2单克隆抗体对天然HER2的反应性。胰蛋白酶消化的细胞用RIPA缓冲液[50mM Tris pH7.5，150mM NaCl，5mM EDTA，200mM Na3VO4，0.5％脱氧胆酸盐，0.05％SDS，10mM NaF和蛋白酶抑制剂混合物组1m，CA，USA)]裂解20min，并以17,000rpm离心15min。在4-12％梯度Nu-PAGE凝胶上运行10μg细胞裂解蛋白，并使用
Figure BDA0003342276390000571
2凝胶转移装置(ThermoFisher)电转移到硝酸纤维素膜上。使用市售抗体和mAb104结合的HER2通过用相应抗体探测印迹来评估EGFR和HER2的存在。在Storm 804Phosphoimager(Amersham Bioscience)上观察印迹，使用ImageQuant TL图像分析软件(2005版)进行分析。
免疫组织化学
为了证实mAb104的肿瘤选择性，开发了免疫组织化学方法并用于筛选一系列正常和肿瘤组织类型的mAb104反应性。在如上优化条件之前，评价抗原修复、一抗浓度和孵育时间的变化。在下文中，仅简要讨论最终方案。将载玻片置于60℃的烘箱中30min，并转移至二甲苯浴中，10min后更换浴。然后将载玻片在两次更换的100％乙醇中再水合，每次10min，然后在70％乙醇浴中再水合10min。载玻片在双蒸(dd)H2O中漂洗三次，每次洗涤持续约2min。然后将载玻片在3％H2O2中淬灭20min。通过在100℃下在10％(v/v)EDTA缓冲浴中处理载玻片30min实现抗原修复。冷却并用磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗后，将载玻片在蛋白封闭剂(SuperBlockTMT20，
Figure BDA0003342276390000572
)中预孵育60min。然后将载玻片与mAb104一抗(2.5μg/mL)在室温下孵育60min。用一抗染色后，用链霉亲和素-辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗鼠二抗(Dakocytomation，Carpinteria，CA，USA)检测结合的抗体。结合的抗体用3,3′-二氨基联苯胺(DAB)底物检测并在苏木精和伊红(H&E)(BDH Laboratory，Poole，UK)中复染，在乙醇和二甲苯中脱水并固定。
使用该方法，使用组织微阵列(TMA)在来自9-27个不同人类供体的11种正常人组织和10种常见肿瘤类型(乳腺导管内癌、间皮瘤、结肠直肠和胃腺癌、肾细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、肝细胞癌、前列腺腺癌和脑胶质母细胞瘤)中检查这些蛋白的表达。肿瘤和正常组织不是来自同一患者(即不匹配)。人组织获自解剖学病理学系，奥斯汀健康(澳大利亚墨尔本)。该研究得到了奥斯汀健康人体研究和伦理委员会的批准。
Ki-67：人蛋白Ki-67蛋白的表达与细胞增殖严格相关，并存在于细胞周期的所有活动阶段(Gerdes J，在人类恶性肿瘤的免疫组织学诊断和预后评估中有用的编辑器Ki-67和其他增殖标志物(editor Ki-67and other proliferation markers useful inimmunohistological diagnostic and prognostic evaluations in humanmalignancies)，癌症生物学研讨会(1990))。在100℃下在水中的10％(v/v)柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中回收抗原20min。冷却后，在室温下用蛋白封闭剂(SuperBlockTMT20，
Figure BDA0003342276390000581
)封闭非特异性结合位点20min。将兔抗人Ki-67一抗(RM-9106-S1，
Figure BDA0003342276390000582
)以1:100稀释于封闭缓冲液中，室温孵育2h。在洗去过量的抗体后，使用合适种类的二抗(Dakocytomation，Carpinteria，CA，USA)在室温下检测结合的抗体30min。用3,3'-二氨基联苯胺(DAB)底物检测结合的抗体。然后载玻片在苏木精和伊红(H&E)(BDHLaboratory，Poole，UK)中复染，在乙醇和二甲苯中脱水并固定。
细胞凋亡：使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)dUTP缺口末端标记(TUNEL)测定法，通过原位细胞死亡检测试剂盒，荧光素(11684795910Roche，USA)检测凋亡细胞。将由石蜡包埋的组织产生的载玻片脱蜡并如上所述再水合，并在ddH2O中漂洗三次，每次洗涤持续约2min。将组织切片在蛋白酶K工作溶液中在室温下孵育20min，然后在PBS漂洗中漂洗两次。根据产品规格制备阳性和阴性对照。将100μl TUNEL反应混合物或100μl用于阴性对照的对照标记溶液加入到每个载玻片上，并在37℃的加湿室中孵育60min。孵育期后，用PBS洗涤载玻片三次。在施加以避免蒸发损失之后，将50μl的Covertor-POD施加到具有盖玻片的载玻片上，并在37℃下在加湿室中孵育30min。用PBS洗涤三次后，将50-100μl DAB底物施加到载玻片上并在室温下孵育10min。用PBS洗涤载玻片并在光学显微镜下分析。
足萼糖蛋白：从石蜡包埋的组织产生的载玻片如前进行脱蜡和再水合。在室温下将载玻片在3％H2O2中淬灭20min后，通过将载玻片在10％(v/v)柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中在100℃水浴中孵育20min来回收抗原。将15μg/mL山羊抗小鼠足萼糖蛋白一抗(货号AF1556，R&D
Figure BDA0003342276390000583
)添加至各载玻片并在室温下孵育2h。然后洗涤切片并使用抗山羊HRP检测结合的抗体，在苏木精和伊红(H&E)(BDH Laboratory，Poole，UK)中复染，在乙醇和二甲苯中脱水并固定。
p-Akt：将由石蜡包埋组织产生的载玻片通过加热至60℃脱蜡，并在二甲苯和分级醇中再水合。在ddH2O中清洗载玻片三次后，通过在95％水浴中在0.01M柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中孵育载玻片20min进行抗原修复。一旦使载玻片冷却，在PBS和50mm Tris-HCl(pH7.6)，150mm NaCl，吐温20(0.1％；TBS-T)。通过在室温下在含有3％过氧化氢的TBS-T中孵育15min来淬灭内源性过氧化物酶活性。然后将切片在一抗(兔多克隆磷酸-Akt(Ser473；Cell Signaling Technology，Beverly，MA，货号9277，IHC特异性)在TBS-T中以1:100稀释度在4℃下孵育过夜。在TBS-T中清洗载玻片三次后，每次清洗持续约两min，将载玻片以1:200的稀释度在兔生物素化的二抗中孵育1h。结合的抗体用DAB底物检测并在苏木精和伊红(H&E)(BDH Laboratory，Poole，UK)中复染，在乙醇和二甲苯中脱水并固定。
细胞增殖测定
将去血清培养基中的细胞(1×104)接种在96孔微量滴定板中并使其粘附过夜。第二天加入连续稀释的具有适当对照的抗体，并在时间0(T＝0)测量。将剩余的细胞板孵育3至5天。用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑(MTS)作为底物(Promega，澳大利亚)，使用MTS比色活力测定法评估细胞活力。使用VersaMax酶标仪(Molecular Devices，USA)和SoftMax Pro5.4.1软件(MolecularDevices，USA)在490nm评估吸光度。还测定630nm处的吸光度作为背景，并从490nm读数中减去该值。实验一式三份进行并重复2至3次独立的运行。将所有数据归一化为化合物添加时的信号(T＝0)。使用GraphPad prism 4.03(Graphpad Software Inc，La Jolla，CA，USA)分析剂量-反应曲线。
下游信号转导
将细胞(1×106)一式两份接种到6孔板中并使其建立过夜。弃去各孔中的培养基，用含有总浓度为10mg/mL的所需抗体的无血清培养基替换。在指定的时间点(24h)，在室温下用100ng EGF处理一半孔10min。通过用冰冷的PBS洗涤来终止反应，并用RIPA缓冲液[50mM Tris pH 7.5，150mM NaCl，5mM EDTA，200mM Na3VO4，0.5％脱氧胆酸盐，0.05％SDS，10mM NaF和蛋白酶抑制剂混合物组1m，CA，USA)]裂解30min。然后以17,000rpm离心15min。使用Bio-Rad蛋白测定试剂盒(Bio-Rad Laboratories，Hemel Hempstead，UK)测定总蛋白浓度。使用购自Cell Signaling Technology的针对HER2(#4290)、pHER2(#2243)、HER3(#12708)、pHER3(#4791)、EGFR(#4267)、pEGFR(#3777)、AKT(#4691)、pAKT(#4060)、ERK(#4695)和pERK(#4370)的商业抗体通过Western blotting评估MAPK活化。抗-GAPDH(AbC-1001)抗体购自AbClon。使用AbSignal(AbClon，AbC-3001)显现条带。
通过酶联免疫吸附测定(ELISA)的细胞死亡检测
根据制造商的说明，使用ELISA分析(细胞死亡检测ELISAPlus试剂盒；RocheMolecular Biochemicals)(Holdenrieder S，Stieber P，Bodenmüller H，Fertig G，FürstH，Schmeller N等人，Nucleosomes in serum as a marker for cell death.ClinicalChemistry and Laboratory Medicine.2001；39(7):596-605)评估细胞死亡和凋亡。简言之，在96孔板中培养细胞并使其建立过夜。用曲妥单抗、帕妥珠单抗和mAb104作为单一疗法和组合在去血清(1％)的生长培养基中处理细胞24h。将板在4℃下以200×g离心10min。小心地除去上清液，加入200μl生产商的裂解缓冲液，并在室温下孵育30min。孵育后，将板离心，并将20μl上清液和细胞裂解物溶液一式三份放入链霉亲和素包被的微孔板中。将另外80μL含有抗-组蛋白-生物素和抗-DNA-POD混合物的免疫试剂加入上清液中。将板在室温下在振荡培养箱中孵育2h。用ABTS(2,2'-联胺双-3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)作为底物，在405nm的波长和490nm的参考波长下，使用Versamax酶标仪(Molecular Devices)运行Softmax Pro 4.8软件，通过光度定量测定细胞凋亡的程度。
细胞凋亡分析
使用碘化丙啶(PI)摄取和膜联蛋白V的结合测定细胞活力。简言之，在24孔板中培养细胞(5×104)并使其建立过夜。将细胞用抗体作为单一疗法并与适当的对照组合或在培养基中处理24h。将细胞转移到96孔板中，用冷PBS洗涤3次后，在黑暗中在室温下轻微搅拌下将其重悬于含有2.5μl FITC膜联蛋白V和2.5μl PI的结合缓冲液中15min。孵育后加入另外的150μl结合缓冲液，然后进行流式细胞术分析。
迁移(伤口愈合)试验
为了评估mAb014对细胞迁移的影响，将OE-19细胞(1×105)接种在6孔板中并使其生长至80％汇合。使用100μl移液管尖端在每个孔中产生三个平行划痕。用100μg/mL的所需抗体或同种型对照处理细胞。在处理后立即(指定为T0)拍摄相位控制显微镜照片72h。
mAb104对ErbB受体二聚化的作用
将去血清培养基中的细胞接种在12孔板中并使其粘附过夜。用10μg/mL相关抗体或对照一式两份处理细胞1h。在指定的时间点，在室温下用100ng EGF处理一半孔10min。通过用冰冷的PBS洗涤来终止反应，并将细胞与BS3(双(磺基琥珀酰亚胺基)底物((BS3)，Pierce，Rockford，IL，USA)在室温下孵育20min，并根据制造商的说明轻轻摇动(StarosJV.N-hydroxysulfosuccinimide active esters:bis(N-hydroxysulfosuccinimide)esters of two dicarboxylic acids are hydrophilic,membrane-impermeant,proteincross-linkers.Biochemistry.1982；21(17):3950-5)。用含有10mM Tris-HCl的缓冲液淬灭交联反应混合物后，用冷PBS洗涤细胞两次，并用RIPA缓冲液[50mM Tris pH 7.5，150mMNaCl，5mM EDTA，200mM Na3VO4，0.5％脱氧胆酸盐，0.05％SDS，10mM NaF和蛋白酶抑制剂混合物组1M，CA，USA)]裂解30min。用相关抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀，并对EGFR和HER2进行免疫印迹。
DNA凝胶电泳
在含有1％(w/v)DNA级琼脂糖(Bioline)的凝胶上进行DNA凝胶电泳，琼脂糖在1×Tris-乙酸EDTA(TAE)缓冲液(Invitrogen)中用
Figure BDA0003342276390000602
安全DNA凝胶染料(Invitrogen)制备。在加载到琼脂糖凝胶上之前，用10×Orange G(Sigma)凝胶加载缓冲液储备液稀释所有DNA样本。在70-150V下进行电泳，1kb Plus DNA ladder(Invitrogen)用作大小估计的参考。将DNA条带可视化并在UV光下在透照器(Bio-Rad)上拍照。
杂交瘤cDNA合成
高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems，California，USA)用于使用20μl的反应体积将10μL(～1-5μg)RNA逆转录(RT)成cDNA。根据标准方法，使用T100TM(BIO-RAD，USA)或
Figure BDA0003342276390000601
(Eppendorf，USA)热循环仪，在如下反应和循环条件，在200μl薄壁聚丙稀PCR管(Eppendorf，USA)中进行cDNA合成。
cDNA合成条件：
25℃10min
37℃120min
85℃5min
4℃保持
鼠轻链可变区引物：
(i)ATG AAG TTG CCT GTT AGG CTG TTG GTG CTG(SEQ ID NO：28)
(ii)ATG GAG WCA GAC ACA CTC CTG YTA TGG GT(SEQ ID NO：29)
(iii)ATG AGT GTG CTC ACT CAG GTC CTG GSG TTG(SEQ ID NO：30)
(iv)ATG AGG RCC CCT GCT CAG WTT YTT GGM WTC TTG(SEQ ID NO：31)
(v)ATG GAT TTW CAG GTG CAG ATT WTC AGC TTC(SEQ ID NO：32)
(vi)ATG AGG TKC YYT GYT SAG YTY CTG RGG(SEQ ID NO：33)
(vii)ATG GGC WTC AAG ATG GAG TCA CAK WYY CWG G(SEQ ID NO：34)
(viii)ATG TGG GGA YCT KTT TYC MMT TTT TCA ATT G(SEQ ID NO：35)
(ix)ATG GTR TCC WCA SCT CAG TTC CTT G(SEQ ID NO：36)
(x)ATG TAT ATA TGT TTG TTG TCT ATT TCT(SEQ ID NO：37)
(xi)ATG GAA GCC CCA GCT CAG CTT CTC TTC C(SEQ ID NO：38)
(xii)ATG AAG TTT CCT TCT CAA CTT CTG CTC(SEQ ID NO：39)
鼠轻链可变区反向引物序列：
MKC：TGG ATG GTG GGA AGA TG(SEQ ID NO：40)
鼠重链可变区引物：
(i)ATG AAA TGC AGC TGG GTC ATS TTC TTC(SEQ ID NO：41)
(ii)ATG GGA TGG AGC TRA TCA TSY TCT T(SEQ ID NO：42)
(iii)ATG AAG WTG TGG TTA AAC TGG GTT TTT(SEQ ID NO：43)
(iv)ATG RAC TTT GWY TCA GCT TGR TTT(SEQ ID NO：44)
(v)ATG GAC TCC AGG CTC AAM AGT TTT CCT T(SEQ ID NO：45)
(vi)ATG GCT GTC YTR GSG CTR CTC TTC TGC(SEQ ID NO：46)
(vii)ATG GRA TGG AGC KGG RTC TTT MTC TT(SEQ ID NO：47)
(viii)ATG AGA GTG CTG ATT CTT TTG TG(SEQ ID NO：48)
(ix)ATG GMT TGG GTG TGG AMC TTG CTA TTC CTG(SEQ ID NO：49)
(x)ATG GGC AGA CTT ACA TTC TCA TTC CTG(SEQ ID NO：50)
(xi)ATG GAT TTT GGG CTG ATT TTT TTT ATT G(SEQ ID NO：51)
(xii)ATG ATG GTG TTA AGT CTT CTG TAC CTG(SEQ ID NO：52)
鼠重链可变区反向引物序列：
MHC:CCAGTGGATAGACAGATG(SEQ ID NO：53)
鼠轻链可变区简并正向和反向引物：
κF:GCC GAA TTC GAY ATT GTG MTS ACM CAR WCT MCA(SEQ ID NO：54)
κR:CCG GTC GAC GGA TAC AGT TGG TGC AGC ATC(SEQ ID NO：55)
符号注释：
R＝A或G，Y＝C或T，M＝A或C，K＝G或T，S＝G或C，W＝A或T，H＝A或T或C
B＝G或T或C，D＝G或A或T，N＝A或C或G或T，V＝G或A或C
聚合酶链反应
为了扩增用于克隆的DNA片段，根据制造商的说明书使用
Figure BDA0003342276390000621
Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)。根据标准方法，使用T100TM(BIO-RAD，USA)或
Figure BDA0003342276390000622
(Eppendorf)热循环仪，在如下反应和循环条件，在200μl薄壁聚丙稀PCR管(Eppendorf)中进行PCR反应混合。
PCR条件：
94℃3min
(94℃1min→x Ca55-90sb→72℃2min)持续15-25个循环
72C/10min
4℃保持
体内研究
将NOD-SCID-IL2R-/-小鼠(4至6周龄，动物研究中心，Perth，澳大利亚)用5×106的NCI-N87或8×106的BT-474细胞皮下注射到基质胶(Matrigel，BD Biosciences)中的侧区域中。注射BT-474细胞的小鼠在24h前植入雌激素颗粒。使用公式(L×W2)/2计算肿瘤体积，其中“W”表示肿瘤的宽度，“L”表示肿瘤的长度。使肿瘤生长至约100mm3大小，然后将小鼠随机分成不同的治疗组。未能移植的肿瘤从进一步分析中排除。以腹膜内注射指示的剂量每周三次给予治疗，持续三周。在治疗后观察动物，当平均肿瘤体积>1000mm3时处死动物，或表现出长期的应激症状。切除死后肿瘤并加工为福尔马林固定，石蜡包埋的标本切片，收集用于反相蛋白阵列(RPPA)并将过量组织储存在-80℃下。在治疗结束时，如下计算肿瘤生长抑制百分比(％TGI)：％TGI＝[1-{T/T0/C/C0}/1-{C0/C}]×100其中T＝终点时治疗的平均肿瘤体积，T0＝时间0时治疗的平均肿瘤体积，C＝终点时对照的平均肿瘤体积，C0＝时间0时载体(vehicle)对照的平均肿瘤体积。
所有动物研究方案均获得了奥斯汀健康动物伦理委员会的批准(方案#A2015/05297)，并科学动物管理和使用规范(2013年第8版)进行。
反相蛋白阵列(RPPA)
从过度表达HER2的乳腺PDX肿瘤中提取蛋白，并如前进行RPPA(Hennessy BT，LuY，Gonzalez-Angulo AM，Carey MS，Myhre S，Ju Z等人，A technical assessment of theutility of reverse phase protein arrays for the study of the functionalproteome in non-microdissected human breast cancers.Clinical proteomics.2010；6(4):129)。使用裂解缓冲液(货号#9803，Cell Signaling Technology，Beverly，MA，USA)，补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Roche Applied Science货号#05056489001，Penzberg德国)，通过均化裂解在处理结束时获得的肿瘤样本。使用PierceTMBCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度，标准化为1mg/mL，样本用2-巯基乙醇和SDS煮沸。将处理过的蛋白裂解物送到MD安德森癌症中心，Houston，TX，USA进行如下的RPPA分析。
将裂解物用裂解缓冲液以5倍系列稀释度连续稀释以获得1:16稀释度。将裂解物以11×11格式排列在硝酸纤维素包被的载玻片(Grace Biolab)上。通过基于酪胺的信号放大方法用297个经确认的第一抗体探测样本，并通过DAB比色反应显现。通过Array-Pro分析仪(Meyer Instruments，INC.Houston，TX)扫描，分析和定量载玻片以产生斑点强度。
用逻辑模型(“超曲线拟合”，由美国德克萨斯州休斯顿MD安德森癌症中心的生物信息学和计算生物学系开发)拟合各稀释曲线。所有数据通过蛋白负荷校正因子的中位数抛光标准化，并使用所有抗体实验的中位数表达水平转化为线性值。热图中的“红色”表示高于中值，“绿色”表示低于中值。
统计分析
使用
Figure BDA0003342276390000631
5.04版进行分析。所有p值均为双侧，值≤0.05视为显著。
为了比较平均值，使用Student t-检验或非参数Mann Whitney U检验，其中仅考虑两组。为了在三个或更多个组之间进行比较，通过ANOVA分析参数数据，并且如果p≤0.05，则使用Bonferroni方法进行事后检验以确定哪组显著不同。多组采用的非参数检验是克鲁斯卡尔-沃利斯检验(Kruskal-Wallis test)，如果p≤0.05，则进行事后检验以确定哪组显著不同。
还比较了各组的存活率，如果所有组的时序检验(log-rank test)显著不同(p≤0.05)，则通过进一步的时序检验进行事后检验以确定哪组显著不同。
实施例1-体外抗体产生和表征
前面描述了免疫抗原和免疫方案。通过一系列涉及HER2肽，重组蛋白和表达HER2的基于细胞的测定的免疫和筛选策略，发明人最终成功地产生针对HER2的结构域II的构象柔性区的肿瘤特异性单克隆抗体。
本发明人用与生物素、GST、MBP和KLH载体(carrier)蛋白连接的线性肽和经转染以表达erbB2的Baf/03造血细胞(在细胞表面上不表达HER成员)进行免疫策略，erbB2具有半胱氨酸突变以暴露肽环，但在产生任何克隆方面不成功。用表达突变体的细胞加重组突变ECD ErbB2的免疫不产生结合肽的mAb，但结合到ErbB2的ECD内的不同位置。发明人用与KLH连接的环化肽免疫一次后，他们能够获得识别该肽并与erbB2表达细胞结合的单克隆抗体克隆。这总结在下表(表5)中。
表5免疫方案的结果
Figure BDA0003342276390000641
使用免疫方案，本发明人产生了杂交瘤克隆，其产生了针对HER2胞外结构域的构象暴露区域的新单克隆抗体(mAb)，其被认为仅在肿瘤细胞中发现的条件下可用于结合。通过用来自HER2胞外结构域的肽免疫原免疫小鼠，产生针对构象表位的这些单克隆抗体：H-GCPLHNQEVTAEDGTQRC-NH2(SEQ ID NO：1)通过半胱氨酸(C)残基折叠成环，并与KLH蛋白连接。该序列在图1提供的人HER2序列中加下划线。该序列是在以下链接处导出的ncbi数据库：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_004439.2。
该区域在结构域II内，但远离帕妥珠单抗的已知表位(Franklin MC等人，(2004)从ErbB2-帕妥珠单抗复合物的结构深入了解ErbB信号(Insights into ErbB signalingfrom the structure of the ErbB2-Pertuzumab complex.)Cancer cell.5(4):317-2)。
杂交瘤的筛选
用基于ELISA的试验筛选杂交瘤培养物上清液(称为mAb104、mAb105、mAb106和mAb107)对HER2胞外结构域(ECD)以及产生抗体所针对的抗原的环(环状)和线性肽的反应性的特异性。使用蛋白-G亲和层析从杂交瘤上清液中提取纯化的抗体。在还原和非还原条件下通过SDS-PAGE分析证实洗脱的抗体的完整性。通过单克隆抗体同种型试剂盒(赛默飞世尔科技公司，IL，USA)检测所选抗体的免疫球蛋白同种型，发现所有抗体均为具有K-轻链的IgG1。纯化的mAb的ELISA分析结果如图2所示。
单克隆抗体mAb104和mAb106显示对所有肽构型的最强结合活性，而mAb105显示最低结合(见图2B)。选择产生具有最高亲和力的抗体的克隆用于进一步开发，即mAb104和mAb106，并选择它们的抗体用于进一步分析和表征。
FACS检测杂交瘤细胞的结合力
通过流式细胞术在过表达HER2的乳腺癌细胞系(BT474、SK-BR-3和MDA-MB-453)和胃癌细胞系(NCI-N87)上测试10μg/ml纯化抗体(mAb104、mAb105、mAb106和mAb107)与细胞HER2的结合程度。
结果总结在下表6中并且代表两个或更多个实验。
表6：抗体的FACS分析
mAb104 mAb105 mAb106 mAb107
MDA-MB-453 + - - -
BT 474 ++ - + -
SK-BR-3 ++ - - -
NCI-N87 +++ - +++ +++
在所有评价的细胞系中，mAb104与其它抗体相比显示最高的结合。在所评价的细胞系中，mAb104在NCI-N87和SK-BR-3细胞系中显示出最高的对数偏移。在所评价的任何细胞系中均未观察到mAb105结合。对于所有抗体，结合低于商业HER2结合抗体。本发明人提出，这些抗体与细胞表面上的一部分受体结合，表位仅暴露于HER2受体群体的一部分。
通过Western Blot的结合分析
通过Western blot分析在人乳腺癌细胞系(BT474、SK-BR-3和MDA-MB-453)和胃癌细胞系(NCI-N87)中进一步评价这些新抗体结合HER2蛋白的能力。洗涤胰蛋白酶消化的细胞，裂解并用各自纯化的抗体免疫印迹。抗HER2抗体2242(Cell Signaling Technology，Beverly，MA)用作阳性对照。
与先前的ELISA和FACS数据一致，mAb104在所有细胞系中显示最强的结合(mAb104>mAb106>mAb107>mAb105)(图3)，并与所有四种测试的细胞系结合。
mAb104和mAb106的序列
使用BioLine Isolate II PCR和凝胶提取试剂盒(BIO-52059)纯化PCR反应。使用与测序引物扩增产物相同的引物，将纯化的扩增产物送至Monash Micromon DNA测序设施进行Sanger DNA测序。
CDR根据Chothian和Kabat编号系统以及落入两者中的CDR中的氨基酸来定义。重链和轻链可变区序列如图4所示。
下面提供了用于每个抗体的互补决定区序列：
mAb104 VH链
CDR1：GYSFTGYFMH(SEQ ID NO：14)
CDR2：RINPYNGDIRYNQNFKD(SEQ ID NO：16)
CDR3：LNFAY(SEQ ID NO：18)
mAb104 VL链
CDR1：KSSQSLLDSDGKTFLN(SEQ ID NO：20)
CDR2：LVSKLDS(SEQ ID NO：22)
CDR3：WQGTHFPWT(SEQ ID No：24)
mAb106 VH链
CDR1：GYTFTDYGMN(SEQ ID NO：15)
CDR2：WINTYTGKPTYDDDFKG(SEQ ID NO：17)
CDR3：RFLNTVAGRSVYFDY(SEQ ID NO：19)
mAb106 VL链
CDR1：SVSSSVGSMY(SEQ ID NO：21)
CDR2：LTSNLAS(SEQ ID NO：23)
CDR3：QQWSSNPPT(SEQ ID NO：25)
BIAcore分析
mAb104结合的表位侧接二硫键，这提示表位位点周围的灵活性和在某些条件或环境下暴露于mAb104结合的表位。
使用BIAcore T200通过表面等离子体共振(BIAcore)检测纯化的mAb104和mAb106与曲妥单抗相比对HER2的结合特性和表观亲和力。将重组HER2胞外结构域固定在CM5传感器芯片上，然后将各种浓度的mAb104，mAb106和商品抗HER2 mAb通过传感器以测定表观结合亲和力。
如图5C所示，mAb104表现出高结合亲和力，KD在纳摩尔范围内。mAb104的结合亲和力比报道的曲妥单抗的结合亲和力低一log，并且与帕妥珠单抗的结合亲和力相似(表7)。
表7：mAb104的结合亲和力
抗体 K<sub>D</sub>(nM) Chi<sup>2</sup>
mAb104 2.91 0.03
mAb106 3.18 0.13
曲妥单抗 0.1 0.12
帕妥珠单抗 1.9 14.3
总之，mAb104、mAb106和mAb107结合过表达HER2的肿瘤细胞的谱。mAb104似乎始终显示比mAb106更强的体外结合。基于这些初始筛选试验的结果，选择mAb104用于进一步评价。
实施例2表位分析和竞争测定
利用前面描述的方法，根据抗体Fv结构域的同源建模3D结构和人HER2的已知X射线结构，计算预测了与位于HER2结构域II上的抗原表位结合的mAb104抗体可变结构域(Zhang W，Zeng X，Zhang L，Peng H，Jiao Y，Zeng J等人，人源单克隆抗体(MAb 4-5)识别的新型布尼亚病毒(SFTS病毒)糖蛋白表位的计算鉴定(Computational identificationof epitopes in the glycoproteins of novel bunyavirus(SFTS virus)recognized bya human monoclonal antibody(MAb 4-5))，Journal of Computer-Aided MolecularDesign.2013；27(6):539-50)。
将预测的mAb104的HER2结合与已知的帕妥珠单抗和曲妥单抗结合HER2的晶体结构进行比较(Hu S，Sun Y，Meng Y，Wang X，Yang W，Fu W等人，ErbB2胞外结构域同源二聚体的分子结构(Molecular architecture of the ErbB2 extracellular domainhomodimer.)Oncotarget.2015；6(3):1695)。不希望受理论束缚，认为mAb104与HER2的结合需要在受体活化时发生的构象变化，如先前针对EGFR/HER1(Garrett TP，Burgess AW，GanHK，Luwor RB，Cartwright G，Walker F等人，特异性针对肿瘤相关EGFR局部错误折叠区域的抗体(Antibodies specifically targeting a locally misfolded region of tumourassociated EGFR.)Proceedings of the National Academy of Sciences.2009；106(13):5082-7)其中HER2 ECD的结构域II的二硫键可以动态形成和断裂。
与其他已知的HER2结合抗体相比，由mAb104识别的表位
抗体H2-18(Lu等人(2016)Oncotarget 7(41))，中国专利CN 104447993识别HER2/ErbB2的结构域I内的表位。H2-18在体内和体外抑制曲妥单抗抗性乳腺癌细胞的生长，并在曲妥单抗敏感性和抗性乳腺癌细胞系中诱导程序性细胞死亡。
抗体A21(Hu S等人(2015)Oncotarget 6(3):1695-1706)似乎识别包括大部分来自ErbB2 EC结构域I的大区域的构象表位。发现A21的抗体二价对于其对肿瘤细胞的抑制活性以及ErbB2磷酸化和受体下调是必需的。
曲妥单抗/赫赛汀(4D5)与ErbB2的亚结构域IV中的近膜区结合，并且可以通过金属蛋白酶切割中断ErbB2的活化，并且还阻断ErbB2二聚化。
帕妥珠单抗(2C4)与亚结构域II内或附近的表位可直接破坏ErbB2和其它ErbB受体之间的结合，并因此抑制肿瘤细胞生长。
由帕妥珠单抗和mAb104识别的表位仅共有3个氨基酸，即P294、L295和H296，尽管可以理解，H296在帕妥珠单抗结合时被完全掩盖(Franklin MC等人，(2004)Cancer Cell5:317)。由帕妥珠单抗结合的表位由H245，Y252，F257，D285，V286，S288，T290，P294，L295，H296，K311，K314和P315组成。
相反，mAb104识别的表位是序列CPLHNQEVTAEDGTQRC(SEQ ID NO：1)。
尽管两种抗体都识别HER2的结构域II内的表位，但是由帕妥珠单抗和mAb104结合的表位是明显不同的。
不希望受理论束缚，本发明人假定帕妥珠单抗和mAb104与HER2/ErbB2的结构域II的相对面/侧面结合，因此解释了为什么mAb104不阻断帕妥珠单抗的结合，尽管是紧密相对的表位。结构域II中的构象变化，例如在活化，缺氧条件和/或异常表达期间发生的构象变化，将允许抗体与结构域II中的CPLHNQEVTAEDGTQRC结合和mAb104单独与HER2受体的小亚群结合，HER2受体已经经历这种构象变化。然而，如果例如mAb104表位(C293/C309(编号不包括前导序列))之前的二硫键(C277/C289(编号不包括前导序列))被瞬时断裂或经历二硫键转换，允许重排暴露mAb104表位的结构域II的至少一部分，则所需的构象变化是可能的。在重排过程中，帕妥珠单抗结合表位大部分保持不受干扰。然而，在吸附用于ELISA捕获的重组HER2-ECD的计算机模拟中，结构域II的结构重排是固定的，并且mAb104结合的较小空间位阻可导致降低的帕妥珠单抗结合(例如，如下所示)。结合亲和力的可能损失可以通过两种抗体之间的协同相互作用来平衡。
竞争测定
为了更好地定义mAb104的表位，使用ELISA比较mAb104与HER2-ECD的结合和干扰帕妥珠单抗的结构域II结合抗体和曲妥单抗的空间上远离的结构域IV表位的结合的能力(图6)。在这些实验中，发明人评价了与mAb014预孵育对曲妥单抗和帕妥珠单抗结合的影响(图6B和C)，并且还测定了与曲妥单抗和帕妥珠单抗预孵育对mAb104结合的影响。
发明人显示曲妥单抗和mAb104不影响彼此与HER2-ECD的结合(图6A和B)。本发明人还证明了预先与帕妥珠单抗孵育不影响mAb104结合(图6A)。然而，有趣的是，在与mAb104孵育之前，降低了帕妥珠单抗与HER2-ECD的结合(图6C)，表明mAb104与其表位的结合可能在某些情况下导致帕妥珠单抗的一些空间位阻。
mAb104与帕妥珠单抗和曲妥单抗之间对内源性HER2的竞争通过流式细胞术在过表达HER2的乳腺(BT474和SK-BR-3；图7-1和7-2)和胃细胞系(NCI-N87和OE19；图7-3和7-4)使用上述两种连续孵育方法进一步研究。这些组的实验使用高剂量(100μg/mL)的mAb104预孵育以最大化观察到的对曲妥单抗和帕妥珠单抗结合的影响的变化。在与高得多剂量的mAb104孵育不影响曲妥单抗或帕妥珠单抗与细胞表面HER2的结合。使用流式细胞术和ELISA的与帕妥珠单抗竞争的mAb104的结果中的不一致性可以通过测定中的抗原制剂之间的差异来解释，即，当通过流式细胞术分析时，HER2的存在处于其生理构象，而在ELISA中是部分变性的，以及随后的表位呈递和可用性。
实施例3 mAb104与细胞表面HER2的结合
本发明人使用一组具有差异HER2表达的细胞系通过FACS分析检查了mAb104结合的模式和效率。
结果汇总在下表8中。将结果与仅有二抗的结合进行比较。
表8mAb104的结合
赫赛汀 帕妥珠单抗 mAb104
BT-474 +++ +++ -
SK-BR-3 +++ +++ -
NCI-N87 +++ +++ ++
OE-19 +++ +++ +
MDA-MB-231 ND ND -
MCF-7 ND ND -
FACS分析mAb104与HER2表达细胞BT474、SK-BR-3、NCI-N87、OE-19、MDA-MB-231和MCF7细胞的结合，分别与10μg/mL曲妥单抗、帕妥珠单抗、mAb104或仅二抗共同孵育，通过FACS分析结合程度。结果代表两个或多个实验
在过表达HER2的细胞系中，mAb104在胃细胞系NCI-N87中显示与HER2群体的最强结合，在低HER2表达细胞系(MDA-MB-231和MCF-7)中观察到可忽略的HER2结合。
曲妥单抗(赫赛汀)和帕妥珠单抗FACS显示出更大的荧光，表明当与mAb104(表8)相比时，它们与所有评价的细胞系上更多数量的HER2受体结合，在不同细胞系上两种人源化抗体之间没有观察到结合程度的差异。本发明人的发现支持假设mAb104与细胞表面上的受体亚群结合，并且将解释在抗体之间的结合程度中观察到的差异。
mAb104对HER2的特异性
为了证实mAb104对内源性表达的HER2和HER3的特异性，本发明人使用在还原条件下制备的不同HER2阳性和阴性癌细胞系裂解物进行了western blot分析(图8-1)。
使用抗体2242作为总HER2的阳性对照，抗体是来自细胞信号转导技术的市售抗体，其针对细胞内HER2表位产生。如图8A所示，mAb104对多种表达HER2的癌细胞系显示出强反应性，并且与提供代表多种细胞系的HER2过表达状态的阳性信号的对照抗体相当。mAb104和对照2242HER2结合的相关性反映了在还原条件下被mAb104识别的HER2表位。HER3表达水平在所研究的癌细胞系中非常低，如也通过FACS分析和先前在其它研究中观察到的(Brockhoff G，Heiss P，Schlegel J，Hofstaedter F，Knuechel R.表皮生长因子受体、c-erbB2和c-erbB3受体的相互作用以及SK-BR-3和BT474乳腺癌细胞的相关细胞周期动力学(Epidermal growth factor receptor，c-erbB2 and c-erbB3 receptor interaction，and related cell cycle kinetics of SK-BR-3and BT474 breast carcinoma cells.)Cytometry Part A.2001；44(4):338-48.)。
用ELISA法评估HER2/ErbB2的特异性。如图8-2所示，mAb104特异于ErbB2/HER2并且不结合EGFR/HER1胞外域，或ErbB3/HER3或ErbB4/HER4的ECD。
mAb104在体外乳腺癌中的功效
实施例4 mAb104的抗增殖作用
mAb104作为单一疗法以及与曲妥单抗或帕妥珠单抗联合使用对HER2过表达乳腺癌细胞系增殖的影响是通过在去血清条件(1％FCS)中经MTS细胞增殖试验使用增加浓度至100μg/mL的最大浓度来测定的(图9)。
与同种型对照抗体相比，曲妥单抗显著降低BT-474(图9B)和SK-BR-3(图9A)的增殖(分别为p＝0.0006和p＝0.0005；双侧)，而帕妥珠单抗单药治疗在评价的细胞系中没有任何显著的抗增殖活性(分别为p＝0.22和p＝0.15；双侧见图9A和9B)。这些发现与其他研究一致(Brockhoff G，Heckel B，Schmidt-Bruecken E，Plander M，Hofstaedter F，Vollmann A等人，Differential impact of Cetuximab,Pertuzumab and Trastuzumab onBT474 and SK-BR-3breast cancer cell proliferation.Cell proliferation.2007；40(4):488-507；Tokuda Y，Ohnishi Y，Shimamura K，Iwasawa M，Yoshimura M，Ueyama Y等人，In vitro and in vivo anti-tumour effects of a humanised monoclonalantibody against c-erbB-2product.British journal of cancer.1996；73(11):1362；Yamashita-Kashima Y，Iijima S，Yorozu K，Furugaki K，Kurasawa M，Ohta M等人，Pertuzumab in combination with Trastuzumab shows significantly enhancedantitumour activity in HER2-positive human gastric cancer xenograftmodels.Clinical Cancer Research.2011；17(15):5060-70；Nahta R，Hung M-C，EstevaFJ.The HER-2-targeting antibodies Trastuzumab and Pertuzumab synergisticallyinhibit the survival of breast cancer cells.Cancer research.2004；64(7):2343-6；Gong SJ，Jin CJ，Rha SY，Chung HC.Growth inhibitory effects of Trastuzumab andchemotherapeutic drugs in gastric cancer cell lines.Cancer letters.2004；214(2):215-24；Ko B-K，Lee S-Y，Lee Y-H，Hwang I-S，Persson H，Rockberg J等人，Combination of novel HER2-targeting antibody 1E11 with Trastuzumab showssynergistic antitumour activity in HER2-positive gastric cancer.Molecularoncology.2015；9(2):398-408；Tomioka H，Mukohara T，Kataoka Y，Ekyalongo RC，Funakoshi Y，Imai Y等人，Inhibition of the mTOR/S6K signal is necessary toenhance fluorouracil-induced apoptosis in gastric cancer cells with HER2amplification.International journal of oncology.2012；41(2):551-8)。
与同种型对照抗体相比，mAb104在任何细胞系SK-BR-3和BT-474中未显示任何显著的生长抑制(分别为p＝0.33和p＝0.2；双侧)(图9A和9B)。
如图9C和9D所示，曲妥单抗和帕妥珠单抗的组合显著抑制所评价的细胞系中的增殖(BT474 p＝0.0008和SK-BR-3p＝0.0007；双侧)；然而，与曲妥单抗单药治疗相比，没有统计学显著性差异(BT-474p＝0.59和SK-BR-3p＝0.51；双侧)。
将mAb104珠单抗或帕妥珠单抗中加入mAb104不影响曲妥单抗和帕妥珠单抗各自的抗细胞增殖活性(图9C-F)。在评价的细胞系中，mAb104与曲妥单抗组合的抗增殖作用与曲妥单抗与帕妥珠单抗组合的抗增殖作用没有统计学差异(BT-474p＝0.66；SK-BR-3p＝0.47)。
因此，与曲妥单抗和帕妥珠单抗不同，mAb104对HER2阳性细胞系没有可检测的抗增殖作用。体内发生的多种受体激酶和信号转导途径的复杂相互作用不能总是在体外完全复制，并且捕获需要经历构象变化的活化受体的治疗剂的影响在体外可能是不可测量的。靶向活化的EGFR上的构象暴露的表位的抗体已经在体内显示出显著的抗肿瘤活性，尽管在体外未能显示出任何生长抑制或改变的信号转导[Johns TG，Perera RM，Vernes SC，Vitali AA，Cao DX，Cavenee WK等人，表皮生长因子受体特异性抗体对胶质瘤异种移植的疗效受受体水平、激活状态和异二聚化的影响(The efficacy of epidermal growthfactor receptor–specific antibodies against glioma xenografts is influencedby receptor levels,activation status,and heterodimerization.)Clinical CancerResearch.2007；13(6):1911-25]。
实施例5 mAb104对ErbB受体和下游信号转导途径的作用
考虑到在增殖测定中观察到的mAb104的功能差异。本发明人试图检测mAb104处理24h后对血清饥饿条件下SK-BR-3和BT-474乳腺癌细胞系中MAPK和Akt配体非依赖性途径的影响。为了评价mAb104对配体依赖性信号转导途径的作用，将细胞系用抗HER2抗体处理24h，然后加入100ng EGF 10min。
配体非依赖性和依赖性效应的结果分别呈现于图10和11中。本发明人集中于EGFR-HER2信号转导，因为HER3表达水平在癌细胞系中非常低，如图8所证明的，这与其它研究一致(Brockhoff G等人，表皮生长因子受体、c-erbB2和c-erbB3受体的相互作用以及SK-BR-3和BT474乳腺癌细胞的相关细胞周期动力学(Epidermal growth factor receptor,c-erbB2 and c-erbB3 receptor interaction,and related cell cycle kinetics of SK-BR-3and BT474 breast carcinoma cells.)Cytometry Part A.2001；44(4):338-48)。
在这一系列实验中(图10和11)，本发明人了用曲妥单抗和帕妥珠单抗治疗24h没有显著降低HER2阳性乳腺癌细胞系BT-474和SK-BR-3中的总HER2表达，如其他人先前所证明的(Molina MA等人，(2001)Cancer research.61(12):4744-9；Lu Q等人，(2016)Oncotarget.2016；7(41):67129)。
还使用磷酸特异性抗体评估抗HER2抗体对Akt和MAPK途径的作用。在两种乳腺癌细胞系细胞(BT-474和SK-BR-3)中，曲妥单抗处理导致Akt磷酸化的降低而总Akt蛋白水平没有变化，这代表磷酸化活性的降低而不是Akt蛋白的下调。这些发现也与其他研究一致(Lu Q等人，同上；Yakes FM等人，(2002)Cancer research.62(14):4132-41)。
在BT-474细胞中，曲妥单抗处理导致MAPK活性的降低，如磷酸-MAPK的降低所示(图10C和D)。相反，在SK-BR-3细胞中没有显示出MAPK活性的变化(图10A和B)，这与其它研究一致(Cuello M等人，(2001)Cancer research.61(12):4892-900)。
如图10A和B所示，用mAb104作为单一疗法的治疗没有导致评价的细胞系中总蛋白或磷酸化蛋白的量的可检测变化。
在BT-474细胞中，曲妥单抗和帕妥珠单抗的组合与单独的任一种药剂相比在更大程度上降低了磷酸化-Akt和磷酸化p44/p42 MAPK的水平，而对总Akt或MAPK没有观察到影响(图10D)。相反，在SK-BR-3中，通过MAPK级联的信号转导不被药物的组合抑制，如先前已经描述的磷酸化p44/p42 MAPK的未改变的水平所显示的(Nahta R等人，(2004)Cancerresearch.64(7):2343-6)。使用曲妥单抗和mAb104以及曲妥单抗和帕妥珠单抗的组合观察到Akt和MAPK信号级联的类似变化。两种药物组合之间的下调程度没有显著差异(图10C和D)。
在配体刺激的条件下(图11)，曲妥单抗和帕妥珠单抗不影响BT-474中的MAPK或Akt信号通路(图11A和B)。在SK-BR-3细胞系中，EGF刺激后10min，用帕妥珠单抗预先处理导致Akt磷酸化减少，而总Akt没有变化(图11A)。这些发现与其他报告一致(Henjes F等人，(2012)Oncogenesis 1(7):e16)。曲妥单抗由于配体非依赖性信号转导的废除而抑制Akt介导的信号转导，而帕妥珠单抗阻止配体诱导的信号转导。向mAb104处理的细胞中加入EGF不会导致所评价的乳腺癌细胞系中总的或磷酸化的MAPK和Akt途径蛋白的量的改变。在两种细胞系中，当用各种mAb104组合处理时，与对照抗体相比，对MAPK或Akt信号转导没有影响(图11C和D)。
实施例6 mAb104对体外细胞凋亡的作用
使用死细胞凋亡试剂盒(赛默飞世尔科技，货号V13241)，使用流式细胞术测定mAb104在BT-474和SK-BR-3细胞中的凋亡诱导活性。通过象限分析定量早期和晚期凋亡细胞级分。与仅有的细胞相比，用曲妥单抗或帕妥珠单抗处理没有诱导任何细胞凋亡，这与先前的研究一致(Rockhoff G等人，(2007)Cell proliferation.40(4):488-507；Nahta R等人，(2004)Cancer Research 64(7):2343-6；Lu Q等人，同上)(图12)。与BT-474相比(图12A-G)，用曲妥单抗处理SK-BR-3细胞导致更大量的凋亡细胞，然而这在统计学上不显著(图12I-O)。类似地，与仅细胞相比，mAb104在评价的细胞系中不诱导任何显著的细胞凋亡(p＝0.494)。在抗体之间没有观察到凋亡活性的差异(p＝0.726)。
与单一药剂处理相比，在暴露于用曲妥单抗和帕妥珠单抗或mAb104的组合处理的细胞中没有观察到凋亡活性的增加。在BT-474中，在用曲妥单抗单药治疗后，89.9％的细胞存活，而在用曲妥单抗和mAb104治疗后为91.8％(图12A-G)。在曲妥单抗和帕妥珠单抗或mAb104的组合之间没有观察到凋亡活性的差异(图12A-F和G)。
有趣的发现是，与仅用细胞以及曲妥单抗和帕妥珠单抗相比，用mAb104处理后观察到更多数量的坏死细胞(图12H和P)，然而该差异在统计学上不显著。在BT-474细胞中，1.8％的细胞经历坏死，而在所有其它组中<0.5％的细胞经历坏死；类似地，与其它治疗组相比，用mAb104处理后SK-BR-3细胞经历坏死的数目更高(图12P)，然而该差异在统计学上不显著。有趣的是，用mAb104联合曲妥单抗处理的细胞没有导致经历坏死的细胞数量增加。
体内发生的多种受体激酶和信号转导途径的复杂相互作用不能总是在体外完全复制，并且可以反映HER2加工和功能的差异，并且肿瘤微环境对HER2功能或体内其它因素的影响是待证实的靶向HER2上构象暴露的表位的mAb104的功能效应所必需的。靶向活化的EGFR上的构象暴露的表位的抗体已经在体内显示出显著的抗肿瘤活性，尽管在体外未能显示出任何生长抑制或改变的信号转导(Johns TG，Perera RM，Vernes SC，Vitali AA，CaoDX，Cavenee WK等人，表皮生长因子受体特异性抗体对胶质瘤异种移植的疗效受受体水平、激活状态和异二聚化的影响(The efficacy of epidermal growth factor receptor–specific antibodies against glioma xenografts is influenced by receptorlevels,activation status,and heterodimerization.)Clinical CancerResearch.2007；13(6):1911-25)。
尽管mAb104缺乏可检测的体外活性，本发明人继续研究其在过度表达HER2的癌症异种移植模型中的体内作用。
mAb104的体内功效
实施例7 mAb104单一疗法在HER2-过表达/扩增的ER-阳性乳腺癌异种移植物中的 功效
本发明人评价了mAb104在携带ER阳性，过表达HER2的乳腺癌细胞系BT-474的已建立肿瘤异种移植物的小鼠中的功效。一旦肿瘤体积达到100-120mm3，每周三次施用mAb104，曲妥单抗，帕妥珠单抗或对照抗体的1mg/抗体治疗剂量，持续三周。
结果示于图13中。在治疗结束时(第32天)，治疗组中的所有肿瘤显著小于对照组(ANOVA p<0.0006)。使用Bonferroni方法的事后检验显示，与对照组相比，所有治疗组均显著较小(p≤0.001)。在第32天，平均肿瘤体积为337.2mm3(对照组)、4.8mm3(曲妥单抗)、6.7mm3(帕妥珠单抗)和48.7mm3(mAb104)。在曲妥单抗和帕妥珠单抗治疗组中持续显著的抗肿瘤反应直至研究结束(第39天)，治疗停止后一周。然而，对于mAb104，肿瘤生长在治疗停止后恢复。在研究结束时(第39天)，在治疗组之间没有观察到生长抑制的显著差异(p＝0.14)。
本发明人还评价了在建立的BT-474肿瘤异种移植物(120-150mm3)上每周施用三次持续三周的mAb104，曲妥单抗，帕妥珠单抗和对照IgG的较低剂量0.5mg/抗体治疗的功效。
结果示于图14中。曲妥单抗治疗废除了进一步的肿瘤生长；与对照组相比，帕妥珠单抗和mAb104降低了肿瘤生长速率。在研究结束时(第52天)，所有治疗组中的肿瘤显著小于对照组(ANOVA p<0.038)。测量的平均肿瘤体积为927.5mm3(对照)、182.4mm3(曲妥单抗)、415.0mm3(帕妥珠单抗)和469.1mm3(mAb104)。使用Bonferroni方法的事后测试显示，与对照相比，治疗组中的小鼠具有显著更小的肿瘤(曲妥单抗p＝0.0035，帕妥珠单抗p＝0.02和mAb014 p＝0.008)。在0.5mg/mL下，mAb104在该模型中显示出与帕妥珠单抗相似的抗肿瘤功效(p＝0.97，双侧)。虽然用曲妥单抗治疗导致数值上更大的肿瘤生长抑制，但是在研究结束时(第51天)，曲妥单抗和帕妥珠单抗(p＝0.22，双侧)或mAb104(p＝0.15，双侧)之间没有显著差异。
通过log-rank分析的存活在出于伦理考虑(即肿瘤大小≤1000mm3)剔除对照组时，用抗HER2抗体处理的小鼠的存活率显著长于对照组(p<0.002)。对照组小鼠的中位存活期为41天，而在实验终止时(第52天)，治疗组中的小鼠未达到中位存活期。
实施例8 mAb104单一疗法在HER2-过表达/扩增的乳腺PDX模型中的功效
本发明人评价了mAb104在HER2-过表达/扩增的乳腺患者来源的异种移植物(PDX)模型中的作用。供体样本未经处理，因此假定抗HER2治疗的肿瘤易感性为100％。一旦确定了在第64天测量的100-120mm3之间的肿瘤体积，用总剂量0.5mg的mAb104、曲妥单抗、帕妥珠单抗或对照IgG治疗小鼠，每周三次，持续三周。肿瘤生长曲线的结果示于图15A。
抗HER2治疗对PDX的生长速率有直接影响。在第86天停止治疗后，所有抗HER2治疗显示出等同的抗肿瘤功效，并且肿瘤生长速率的延迟持续至～第125天，此时肿瘤生长曲线开始与对照组生长速率平行。在研究结束时，第145天，出于伦理考虑剔除对照组。在第145天，所有治疗组均显著小于对照组(ANOVA p<0.04)(图15A)。使用Bonferroni方法的事后测试显示，与对照相比，治疗组中的小鼠具有显著更小的肿瘤(曲妥单抗p＝0.02；帕妥珠单抗＝0.02和mAb104 p＝0.038)。平均肿瘤体积为1099.2mm3(对照)、761.2mm3(mAb104)、632.8mm3(曲妥单抗)和691.3mm3(帕妥珠单抗)。mAb104在该模型中显示出与批准的HER2靶向疗法强且等同的抗肿瘤活性，在抗HER2疗法之间没有显著差异(p＝0.547(双侧)曲妥单抗vs.mAb104和p＝0.754(双侧)帕妥珠单抗vs.mAb104)。
在存活分析中，治疗组中的小鼠具有比对照组显著更长的存活(p<0.0005)，事后测试显示用抗HER2抗体处理的所有组与对照小鼠相比存活显著更长，p<0.001)。对照组小鼠的中位存活期为145天，而在实验终止时，治疗组中的小鼠未达到中位存活期。
实施例9 mAb104与曲妥单抗组合在过度表达/扩增HER2的ER阳性乳腺异种移植物 中的功效
曲妥单抗和帕妥珠单抗的组合在文献中已经证明与单独的任一种抗体相比更有效的抗肿瘤活性和预防转移性肿瘤扩散，不依赖于HER2表达。鉴于mAb104与曲妥单抗和帕妥珠单抗相比的不同的结构域II表位结合位点，以及发明人对mAb104作为体内单一疗法的有效抗肿瘤活性的观察，发明人继续评价与单独的曲妥单抗或与帕妥珠单抗组合的mAb104与曲妥单抗的组合。
本发明人在建立的BT-474乳腺癌异种移植肿瘤模型中评价了mAb104与曲妥单抗的组合的效果。每只小鼠接受0.25mg曲妥单抗和0.25mg mAb104或帕妥珠单抗以达到0.5mg/治疗或等效对照抗体的总剂量，每周三次，持续三周。一旦平均肿瘤体积为100-120mm3，就开始治疗。
结果如图15B所示。抗肿瘤功效在治疗开始的10天内是明显的，并且在治疗停止后继续。在研究期第50天结束时，由于肿瘤负荷的伦理原因，对照组被剔除。单独曲妥单抗组和组合组中的平均±SD肿瘤体积显著小于对照组(ANOVA p<0.0001)。然后用Bonferroni方法进行事后检验。用组合疗法治疗的肿瘤显著小于对照组(p<0.0001)，测量为88.9mm3(mAb104加曲妥单抗)和43.6mm3(曲妥单抗加帕妥珠单抗)。在任何治疗组中都没有看到肿瘤的完全消退(图15B)。与单独曲妥单抗相比，mAb104和曲妥单抗的同时治疗导致更大的肿瘤减少，然而，组合和单一治疗组之间的肿瘤大小差异在统计学上不显著(通过ANOVA，p＝0.09)。
存活分析显示，与对照组相比，两个组合组中的小鼠具有显著更长的存活(p<0.002)。对照组的中位存活期为44天，而组合治疗组中的小鼠未达到中位存活期。Log rank分析显示两个组合组之间无统计学差异(p＝0.21，双侧)；与mAb104单一疗法相比，用mAb104和曲妥单抗治疗显著抑制肿瘤生长(p 0.04，双侧)(图15A)。
因此，这表明mAb104与曲妥单抗的组合与单独的任一单一疗法相比提供增强的抗肿瘤活性。
实施例10 mAb104与曲妥单抗组合在HER2-过表达/扩增的ER阳性乳腺PDX模型中 的功效
本发明人评价了在HER2-过表达/扩增的乳腺PDX模型中同时进行的抗体治疗的效果。供体样本是未使用抗HER2处理的，因此假定100％肿瘤对处理敏感。一旦确定了在100-120mm3之间测量的肿瘤体积，用每周三次0.5mg的总治疗剂量的曲妥单抗或同种型对照单独或组合的mAb104和曲妥单抗，或曲妥单抗加帕妥珠单抗治疗小鼠，持续三周。
在第85天完成治疗时，观察到所有治疗组与对照组相比的显著差异(p<0.0001)(图15C)。此外，组合组比单独的曲妥单抗更有效(p＝0.001)。组合组的更大抗肿瘤功效持续到研究在第145天终止，此时对照组由于肿瘤负荷的伦理原因而被剔除。在第145天，所有治疗组中的肿瘤保持显著小于对照组(p<0.0001)。测量的平均肿瘤体积为164.4mm3(mAb104加曲妥单抗)和84.2mm3(曲妥单抗加帕妥珠单抗)(图15C)。两个组合组之间的肿瘤体积差异未达到统计学显著性(p＝0.46，双侧)。在任何治疗组中没有看到肿瘤的完全消退。
与曲妥单抗单一疗法相比，mAb104和曲妥单抗的同时治疗导致显著更大的肿瘤体积收缩(通过ANOVA，p<0.0001)。然后用Bonferroni方法进行事后检验。与单一药剂曲妥单抗相比，组合组中的肿瘤显著更小(p<0.0049)。
存活分析显示，与对照组(p<0.0005)以及单一治疗组中的小鼠(p＝0.0014)相比，两个组合组中的小鼠具有显著更长的存活。对照组的中位存活期为145天，组合治疗组中小鼠的中位存活期未达到。
图15A和C中的结果表明，在第145天之后，单独的曲妥单抗的平均肿瘤大小为632.8mm3、mAb104为761.2mm3。当mAb104与曲妥单抗组合时，肿瘤大小显著降低至164.4mm3。这种肿瘤大小的减小表明，与单独使用曲妥单抗或mAb104的单一疗法相比，mAb104与曲妥单抗的组合导致增强的抗肿瘤活性。
实例11反相蛋白阵列(RPPA)分析
在第85天完成治疗时收集从HER2-乳腺PDX肿瘤(n＝2/组)获得的裂解物并通过RPPA分析。检测总蛋白和/或其活化形式的一组超过300种抗体包括在该RPPA分析中。关键蛋白参与关键信号转导途径，包括磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT途径、细胞外信号调节激酶(ERK)/促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径、Janus激酶(JAK)/信号传导与转录活化因子(STAT)途径、凋亡途径、细胞周期(包括细胞死亡和存活)。将收集的数据标准化用于蛋白装载，并转化为线性值用于分析。将百分比倍数变化计算为对照组和用曲妥单抗，帕妥珠单抗或mA104或组合治疗的肿瘤样本之间的蛋白表达差异的比率。
尽管mAb104在HER2-乳腺PDX模型中显示出显著的抗肿瘤活性，但与所评价的其它抗体相比，没有看到蛋白水平的显著变化(表9)。
表9：通过RPPA评估的用曲妥单抗、帕妥珠单抗和mAb104处理的关键蛋白的差异表达
Figure BDA0003342276390000751
Figure BDA0003342276390000761
Figure BDA0003342276390000762
Figure BDA0003342276390000771
Figure BDA0003342276390000781
*ns：不显著。该列表评价了关键途径激酶及其下游效应物的倍数变化。将倍数变化计算为对照组和治疗组之间蛋白表达差异的比率。使用t-检验得到p值用于所示的比较。
实施例12建立的肿瘤的免疫组织化学分析
在最后一次治疗后1天处死携带来自单一疗法和组合治疗组中的每一个的已建立的BT-474乳腺肿瘤异种移植物的小鼠(n＝2)，并且获得异种移植物组织样本并制备用于肿瘤增殖、下游信号转导和血管生成的IHC分析。
通过Ki67染色检测mAb104单一疗法对肿瘤增殖的作用，结果示于图16A。在BT-474异种移植肿瘤中，与对照组相比，用抗HER2抗体治疗没有显著降低增殖(通过ANOVA，p＝0.625，事后分析证明不同治疗组之间没有差异)。平均H-评分为102.6(对照)、83.9(曲妥单抗)、91.1(帕妥珠单抗)和99.7(mAb104)。
为了确定抗增殖作用是否是通过下调Akt途径介导的，通过磷蛋白测定评估Akt(图16B)。在BT-474中，在治疗组和对照组之间没有观察到磷酸-Akt的H-评分的显著差异(通过ANOVA，p＝0.958，在事后分析中治疗组没有差异)。平均H-评分为129.6(对照)、124.3(曲妥单抗)、114.6(帕妥珠单抗)和132.5(mAb104)。
曲妥单抗已显示具有抗血管生成作用(Parakh S，(2017)Cancer treatmentreviews.59:1-21)，因此，本发明人通过足萼糖蛋白染色检验了mAb104对肿瘤组织中微血管密度的影响(图16C)。如前所述进行免疫组织化学染色。微血管密度(％)由存活区域中阳性染色面积与总观察面积的比率计算。在BT-474异种移植肿瘤中，虽然观察到显著的曲妥单抗抗血管生成活性(p<0.001)，但与对照抗体相比，mAb104和帕妥珠单抗对肿瘤血管系统没有任何显著影响(p＝0.987)。
与对照相比(p<0.05)和与曲妥单抗和mAb104相比(p＝0.017，双侧)，曲妥单抗和帕妥珠单抗的组合显著降低增殖。平均H-评分为129.6(对照)、7.4(曲妥单抗加帕妥珠单抗)和97.6(曲妥单抗加mAb104)(图16D)。这些发现类似于先前的报道(Brockhoff G，(2007)Cell proliferation.40(4):488-507)。
当与对照抗体相比时，在用曲妥单抗加帕妥珠单抗或曲妥单抗加mAb104处理的BT-474肿瘤样本中未观察到对pAkt(图16E)或血管生成(图16F)的影响。
胃癌
实施例13 mAb104在体外的抗增殖作用
在体外，曲妥单抗显著(p<0.0001)抑制NCI-N87的生长并影响OE-19胃癌细胞的增殖(图17)，这与先前的报道一致(Gravalos C等人，(2008)Annals of oncology.19(9):1523-9)。与对照抗体相比，作为单一疗法的帕妥珠单抗在评价的细胞系中不具有任何显著的抗增殖活性(NCI-N87 p＝0.02；和OE19p＝0.96)。这些发现与其他研究一致，尽管孵育时间和剂量不同(Brockhoff G等人，(2007)Cell proliferation.40(4):488-507；Tokuda Y等人，(1996)British journal of cancer.73(11):1362；Yamashita-Kashima Y等人，(2011)Clinical Cancer Research.17(15):5060-70；Nahta R等人，(2004)Cancerresearch.64(7):2343-6；Gong SJ等人，(2004)Cancer letters.214(2):215-24；Ko B-K等人，(2015)Molecular oncology.9(2):398-408；Tomioka H等人，(2012)Internationaljournal of oncology.41(2):551-8)。
与同种型对照抗体相比，单克隆抗体mAb104在体外也没有表现出明显的生长抑制作用(NCI-N87p＝0.34；和OE19 p＝0.12)(图17)。这与评价靶向EGFR受体上构象暴露表位的抗体的其它体外研究一致(Johns TG等人，(2003)Proceedings of the NationalAcademy of Sciences.100(26):15871-6；Johns TG等人，(2007)Clinical CancerResearch.13(6):1911-25)。
曲妥单抗和帕妥珠单抗的组合显著抑制所评价的胃/GEJ细胞系中的增殖(图18)。然而，与曲妥单抗单药治疗相比没有统计学差异。评估mAb104与曲妥单抗或帕妥珠单抗组合对增殖的作用；与单独的单独抗体相比，mAb104的加入没有增加抗增殖作用。显着地，mAb104和曲妥单抗的组合与曲妥单抗和帕妥珠单抗的组合没有统计学差异(NCI-N87 p＝0.29；和OE19 p＝0.14)。
实施例14 mAb104对ErbB受体和下游信号转导途径的作用
在过度表达HER2的胃癌细胞系NCI-N87和OE19中，用抗HER2抗体作为单一疗法的治疗不影响MAPK和AKT信号转导途径中的总蛋白或磷酸化蛋白，这与先前的报道一致(KoB-K等人，(2015)Molecular oncology.9(2):398-408；Tomioka H等人，(2012)International journal of oncology.41(2):551-8))(图19A和B)。
曲妥单抗和帕妥珠单抗或mAb104在NCI-N87胃癌细胞系中的组合治疗导致磷酸化-akt和磷酸化p44/p42 MAPK的下调，而总蛋白水平保持不变(图19C和D)。
在配体刺激的条件下(图20A和B以及20C和D)，mAb104在评价的细胞系中不影响MAPK或Akt信号通路。当mAb014与曲妥单抗和帕妥珠单抗组合使用时，也观察到这种效果的缺乏(图20C和D)。
在该细胞系中用曲妥单抗和帕妥珠单抗组合治疗的信号转导中描述的变化与其它研究(Yamashita-Kashima Y等人，(2011)Clinical Cancer Research.17(15):5060-70；Ko B-K等人，(2015)Molecular oncology.9(2):398-408；Tomioka H等人，(2012)International journal of oncology.41(2):551-8)一致，并且与用曲妥单抗和mAb104观察到的那些类似。这些结果表明mAb104与曲妥单抗联合抑制ErbB家族蛋白的活性并抑制下游信号转导。相反，当用曲妥单抗与帕妥珠单抗或mAb104的组合治疗时，在OE19中未观察到总蛋白或活化蛋白ErbB家族蛋白或MAPK和Akt信号级联的变化。在两种胃癌细胞系中，用帕妥珠单抗和mAb104的组合治疗对信号级联以及总的或磷酸化的ErbB蛋白水平没有影响。
实施例15 mAb104对胃癌细胞凋亡的作用
流式细胞术用于测定NCI-N87(图21A和B)和OE-19细胞系(图21C)中mAb104的凋亡诱导活性，早期和晚期凋亡细胞级分通过象限分析(图21)定量。与对照抗体相比，用曲妥单抗处理的细胞不诱导细胞凋亡；与之相比，用帕妥珠单抗治疗在细胞凋亡的晚期产生更多的细胞。这些发现与其他已发表研究一致。与曲妥单抗或帕妥珠单抗单一药剂治疗相比，mAb104增加晚期凋亡细胞群体。在OE-19中，与对照抗体相比，没有抗体作为单一疗法或组合诱导任何凋亡(图21C)。
与组合的曲妥单抗和mAb104相比，组合的曲妥单抗和帕妥珠单抗治疗导致显著更多的凋亡细胞。在用曲妥单抗和帕妥珠单抗处理后，61.4％的细胞存活，而在用mAb104处理曲妥单抗后为90.5％(图21A)。与对照抗体或其它单一疗法相比，曲妥单抗和mAb104组合不诱导细胞凋亡。
一个显著的发现是与对照抗体和曲妥单抗和帕妥珠单抗相比，在用mAb104处理后观察到更多数量的坏死细胞(图21C)。在所评价的两种细胞系中，与其它治疗组相比，mAb014处理后坏死细胞增加两倍。有趣的是，用mAb104联合曲妥单抗处理的细胞没有导致经历坏死的细胞数量增加。
实施例16 mAb104对迁移(伤口愈合)试验的作用
由于其形态和生长模式，OE-19细胞系用于评价mAb104对迁移的作用。NCI-N87细胞通常最初附着在小岛中，然后增殖成致密的斑块，因此难以正确估计汇合度，因此不使用。在处理后72h，与100μg/mL剂量的对照抗体相比，添加抗体不延迟OE-19细胞的迁移(图22)。
乳腺癌细胞系BT-474通常形成紧密多层集落的贴壁，这些集落很少融合，因此不适于该测定。
实施例17 mAb104单一疗法在HER2-过表达/扩增的胃癌异种移植物中的功效
发明人检测了mAb104在带有过表达HER2的胃癌细胞系NCI-N87的异种移植物的小鼠中的抗肿瘤活性。用mAb104、曲妥单抗、帕妥珠单抗和对照IgG治疗小鼠，每周三次注射，持续三周。在所有实验中，当平均肿瘤体积为100-120mm3时开始治疗。涉及NCI-N87异种移植物模型的初步实验使用不同的治疗剂量以证实mAb104在肿瘤模型中的功效。
使用1mg/治疗的初始剂量，结果如图23所示。在治疗结束时(第28天)，治疗组中的所有肿瘤显著小于对照组(ANOVA p<0.0001)。用Bonferroni方法进行事后检验。所有治疗组中的肿瘤显著较小，p<0.0001)；平均肿瘤体积为333.9mm3(对照)、56.1mm3(曲妥单抗)、77.9mm3(帕妥珠单抗)和66.1mm3(mAb104)，在不同治疗组之间没有观察到生长抑制的统计学差异(p>0.05)。
基于用1mg剂量观察到的功效，使用0.5mg/治疗的较低剂量重复实验。肿瘤生长曲线如图24所示。在治疗结束时(第32天)，治疗组中的所有肿瘤显著小于对照组(ANOVA p<0.0001)。Bonferroni方法的事后检验显示所有治疗组均显著小于对照组(p<0.0001)。平均肿瘤体积分别为280.8mm3(对照)、104.0mm3(曲妥单抗)、152.2mm3(帕妥珠单抗)和105.7mm3(mAb104)。在治疗组之间没有观察到生长抑制的统计学差异。从所有抗体组的治疗开始直到第50天，治疗停止后22天，肿瘤生长的停止是明显的。
用抗HER2抗体处理的小鼠与对照组相比具有显著更长的存活(ANOVA p<0.0002，事后检验显示所有处理组与对照小鼠相比存活显著更长，p<0.0001)。在研究的第100天结束时，mAb104表现出显著的存活优势，60％的动物存活，相比之下，曲妥单抗为20％，而在其它组中没有。各组的中位存活期为59天(对照)、91天(曲妥单抗)、83天(帕妥珠单抗)，并且在实验终止时(第100天)在用mAb104处理的小鼠中未达到。这种观察可能是由于鼠mAb104与人源化构建体相比在小鼠循环中具有预期更长的半衰期。
当使用0.1mg/治疗的剂量在已建立的NCI-N87胃癌异种移植物中重复实验时，观察到类似的有效体内功效(图25)。在治疗结束时(第28天)，治疗组中的所有肿瘤显著小于对照组(ANOVA p<0.0001。平均肿瘤体积分别为340.4mm3(对照)、136.3mm3(曲妥单抗)、147.5mm3(帕妥珠单抗)和104.4mm3(mAb104)。在治疗组之间没有观察到生长抑制的统计学差异(图25A)。
通过log-rank分析，用0.1mg/剂量的抗HER2抗体处理的小鼠与对照组相比具有显著更长的存活(p<0.0001，事后测试显示所有处理组与对照小鼠相比存活显著更长，p<0.0002)(图25B)。对于用mAb104处理的小鼠，各组的中位存活期为62天(对照)、83天(曲妥单抗)、79天(帕妥珠单抗)和83天。
实施例18 mAb104单一疗法在HER2-过度表达/扩增的胃食管癌异种移植物中的功 效
发明人检测了mAb104在携带OE-19异种移植物的小鼠中的体内抗肿瘤活性。小鼠接受1mg/抗体剂量的mAb104、曲妥单抗、帕妥珠单抗和对照IgG治疗，每周三次，持续三周。当平均肿瘤体积为100-120mm3时开始治疗。在这个快速生长的肿瘤模型中，由于肿瘤体积超过了伦理批准的1000mm3，在完成治疗计划(第19天；接受的抗体剂量-5)之前，用同种型对照抗体治疗的小鼠被剔除。
结果如图26所示。在第19天，治疗组中的所有肿瘤显著小于对照组(ANOVA p<0.0001)。用Bonferroni方法进行事后检验。各治疗组中的肿瘤显著小于对照组(p<0.0001)。在研究结束时，曲妥单抗，帕妥珠单抗或mAb104之间的肿瘤生长抑制没有统计学差异(p＝0.16)。
发明人使用0.5mg/治疗的较低剂量重复该实验，肿瘤生长曲线示于图27中。当平均肿瘤体积为100-120mm3时开始治疗。在研究结束时(第25天)，治疗组中的平均肿瘤体积为974.8mm3(对照)、782.0mm3(mAb104)、474.5mm3(曲妥单抗)、832.0mm3(帕妥珠单抗)。曲妥单抗组治疗的肿瘤显著小于对照组(p<0.001)。尽管mAb104和帕妥珠单抗组中的肿瘤在数值上更小，但在Bonferroni方法之后，生长抑制的差异没有达到统计学差异。在帕妥珠单抗和mAb104之间没有观察到生长抑制的统计学差异(p＝0.39，两组比较均为双尾)。曲妥单抗比两种帕妥珠单抗更有效(p＝0.024；双侧)和mAb104(p＝0.004；双侧)(图27A)。
通过log-rank分析，用抗HER2抗体处理的小鼠与对照组相比具有显著更长的存活(p<0.0005，其中事后测试显示所有处理组与对照小鼠相比存活显著更长，p<0.006)。各组的中位存活期为25天(对照)、30天(帕妥珠单抗)、30天(mAb104)和35天(曲妥单抗)(图27B)。
实施例19 mAb104与曲妥单抗组合在NCI-N87胃癌异种移植物中的功效
发明人在NCI-N87异种移植模型中评估了mAb104与曲妥单抗的组合的功效。用总剂量0.5mg的同时mAb104和曲妥单抗，曲妥单抗和帕妥珠单抗或仅用对照IgG处理小鼠。每只小鼠接受0.25mg曲妥单抗和0.25mg mAb104或帕妥珠单抗以达到0.5mg/治疗的总剂量。当平均肿瘤体积为100-120mm3时，在第9天开始治疗，肿瘤生长曲线示于图28中。
随着治疗的开始，在所有抗体治疗中观察到立即的抗肿瘤功效，并且在第24天治疗停止后继续肿瘤生长消除，在组合治疗组中观察到更延长的抗肿瘤功效。在第57天，当对照组中的平均体积达到伦理批准的1000mm3时，将对照组中的小鼠剔除。在该时间点，组合治疗组中的肿瘤保持显著小于对照(ANOVA p<0.0001)(图28)。
组合组中的平均肿瘤体积测量为104.9mm3(mAb104+曲妥单抗组)和31.9mm3(曲妥单抗+帕妥珠单抗组)。使用Bonferroni方法的事后检验显示，两个治疗组都显著小于对照组(p<0.05)。两个组合组之间未见统计学差异(p＝0.27)。在任何治疗组中没有看到肿瘤的完全消退。
在研究结束时，通过方差分析，与单剂治疗组相比，曲妥单抗/帕妥珠单抗和曲妥单抗/mAb104治疗组相比产生显著更小的肿瘤体积(p＝0.005)，事后检验显示mAb104和曲妥单抗与单剂曲妥单抗相比p<0.05。
在实验终止时未达到用抗HER2抗体组合处理的小鼠的中位存活期。
实施例20 mAb104与曲妥单抗组合在OE19胃食管癌异种移植物中的功效
在OE19异种移植肿瘤模型中评价mAb104与曲妥单抗组合的功效。与先前的实验一样，用总剂量0.5mg的同时mAb104和曲妥单抗，或曲妥单抗和帕妥珠单抗，单独的0.5mg曲妥单抗或仅用对照IgG治疗小鼠，其中时平均肿瘤体积为100-120mm3。肿瘤生长曲线结果如图29所示。
当对照组的平均体积达到伦理批准的1000mm3时，在第25天终止研究。在该时间点，治疗组中的平均肿瘤体积为974.8mm3(对照)、88.8mm3(mAb104加曲妥单抗)和99.8mm3(曲妥单抗加帕妥珠单抗)(图29A)。使用Bonferroni方法的事后检验显示，两个治疗组都显著小于对照组(p<0.0001)。在任何治疗组中没有看到肿瘤的完全消退。
与单一药剂治疗组相比，用mAb104和曲妥单抗的同时治疗导致显著更大的肿瘤体积收缩(通过ANOVA，p<0.0001，其中事后检验显示组合组与单一药剂治疗组相比p<0.0001)。
存活分析显示，与对照组(p<0.0005)以及单一治疗组中的小鼠(p<0.005)相比，两个组合组中的小鼠具有显著更长的存活(图29B)。对照组的中位存活期为25天，而组合治疗组中的小鼠未达到中位存活期。两个组合组之间的log rank分析未见统计学差异(p＝0.11，双侧)。
实施例21建立的肿瘤的免疫组织化学分析
最后一次治疗后1天处死来自胃和食管癌单一疗法和组合疗法治疗组的小鼠的子集(n＝2)，获得异种移植组织并准备用于肿瘤增殖、下游信号转导和血管生成的IHC分析。NCI-N87异种移植物的抗HER2单一疗法后的结果呈现于图30A至C中，组合疗法呈现于图30D至F中。OE-19食管癌异种移植物的抗HER2单一疗法后的结果呈现于图31A至C中，组合疗法呈现于图31D至F中。
增殖：通过Ki-67染色检测mAb104对肿瘤增殖的作用，结果示于图30，组A。在用抗HER2抗体作为单一药剂处理的NCI-N87肿瘤中，所有抗体与对照组相比显著降低增殖(通过ANOVA，p＝0.02)。平均H-评分为134.8(对照)、126.8(曲妥单抗)、106.6(帕妥珠单抗)和98.1(mAb104)。如图30的D组所示，与对照相比，曲妥单抗和帕妥珠单抗或mAb104的组合没有显著降低增殖(p＝0.193)，在两种组合(p＝0.726)之间观察到的抗增殖作用没有差异，如图30D至F所示。
快速生长的OE-19肿瘤的分析(图31A)表明，与任何抗HER2单一疗法的对照抗体相比，增殖没有显著降低(p＝0.79，通过ANOVA)。平均H-评分为153.4(对照)、127.5(曲妥单抗)、146.0(帕妥珠单抗)和138.6(mAb104)。类似地，如图31A至C所示，与对照抗体相比，曲妥单抗与帕妥珠单抗(p＝0.4320，双侧)或mAb104(p＝0.554，双侧)的组合没有显著降低增殖。
下游信号转导：为了确定体内观察到的抗肿瘤作用是否是通过下调Akt途径介导的，通过磷蛋白测定评估pAkt(图30B NCI N87；图31B)OE19)。在NCI-N87中，在治疗组和对照组之间没有观察到磷酸-Akt的H-评分的显著差异(通过ANOVA，p＝0.532)。平均H-评分为87.7(对照)、87.6(曲妥单抗)、78(帕妥珠单抗)和78.5(mAb104)。在OE19异种移植物中观察到类似的发现；与对照相比，mAb104不显著影响Akt途径(p＝0.192)。
血管系统：本发明人通过足萼糖蛋白染色检验了mAb104对肿瘤组织中微血管密度的影响。NCI N87的结果呈现于图30C中；图31F为OE-19异种移植物。微血管密度(％)由存活区域中阳性染色面积与总观察面积的比率计算。在NCI-N87和OE-19异种移植肿瘤中，当与同种型对照抗体(p＝1.00NCI-N87和p＝0.054OE-19)相比时，mAb104和阳性对照曲妥单抗对肿瘤脉管系统不具有任何显著影响。
实施例22通过免疫组织化学测定肿瘤和正常组织中mAb104结合的特异性
在一系列正常人和肿瘤组织中定性评价mAb104的染色模式，并与使用用于HER2临床试验的兔抗HER2单克隆抗体Ventana 4B5(Tucson，Arizona)的HER2染色模式进行比较。使用美国临床肿瘤学学会和美国病理学家学会(ASCO/CAP)对乳腺癌中HER2测试的建议(Wolff AC，Hammond MEH，Hicks DG，Dowsett M，McShane LM，Allison KH等人，Recommendations for human epidermal growth factor receptor 2testing in breastcancer:American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologistsclinical practice guideline update.Journal of Clinical Oncology.2013；31(31):3997-4013)如下评价和评分染色模式：3+，>10％具有均匀强烈膜染色的侵袭性肿瘤细胞；2+，>10％具有不完全或弱膜染色的侵袭性肿瘤细胞或≤10％具有强膜染色的侵袭性肿瘤细胞；1+，>10％具有微弱不完全膜染色的侵袭性肿瘤；0如果没有染色或≤10％的浸润性肿瘤细胞染色微弱。HER2染色IHC 3+阳性，2+可疑，1+和0阴性。使用Hofmann等人(Hofmann M，Stoss O，Shi D，Büttner R，Van De Vijver M，Kim W等人，Assessment of a HER2scoring system for gastric cancer:results from a validationstudy.Histopathology.2008；52(7):797-805)在ToGA试验(Bang Y-J等人，(2010)Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone fortreatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junctioncancer(ToGA):a phase 3,open-label,randomised controlled trial.TheLancet.2010；376(9742):687-97)和Rüschoff等人(Rüschoff J，Dietel M，Baretton G，Arbogast S，Walch A，Monges G等人，HER2 diagnostics in gastric cancer—guidelinevalidation and development of standardized immunohistochemicaltesting.Virchows Archiv.2010；457(3):299-307)提出的评分方案对胃/GOJ组织的染色模式进行评分：0，在<10％的肿瘤细胞中没有染色或膜反应性；1+在10％的肿瘤细胞中弱膜反应性；2+在≥10％的细胞中出现中度/弱完全或基底外侧膜染色，3+在≥10％的肿瘤细胞中出现强完全或基底外侧膜染色。0和1+的评分被视为阴性，≥2+的评分被报告为阳性。类似于乳腺癌，仅膜染色而非细胞质染色被考虑用于HER2评分(数据未显示)。
正常组织
在正常组织中HER2表达的报道非常有限。此外，仅在有限数量的细胞类型中发现HER2表达，具有异质组织间和内部表达(Margan MM，Jitariu AA，Cimpean AM，Nica C，Raica M.Molecular Portrait of the Normal Human Breast Tissue and ItsInfluence on Breast Carcinogenesis.Journal of breast cancer.2016；19(2):99-111)。
1)脑
HER2在反应性星形胶质细胞、神经元和脑膜细胞中的表达是异质的，具有不同程度的表达和表达频率并不常见(Wolff AC，Hammond MEH，Hicks DG，Dowsett M，McShaneLM，Allison KH等人，乳腺癌人表皮生长因子受体2检测建议：美国临床肿瘤学会/美国病理学家学会临床实践指南更新(Recommendations for human epidermal growth factorreceptor 2testing in breast cancer:American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists clinical practice guideline update.)Journalof Clinical Oncology.2013；31(31):3997-4013)。在我们手中，用mAb104或用对照抗HER2抗体4B5在正常脑组织中没有检测到HER2染色。
2)乳房组织
HER2在正常人乳腺组织中较少表达，在胎儿组织和恶性乳腺组织中以相当高的水平表达(
Figure BDA0003342276390000841
MH，Knappskog S，Haynes BP，
Figure BDA0003342276390000842
PE，Mellgren G.Inverse regulationof EGFR/HER1 and HER2-4 in normal and malignant human breast tissue.PloSone.2013；8(8):e74618)。在所评价的8个正常乳腺组织样本中，用mAb104或4B5未见HER2染色。
3)大肠
大肠组织中HER2蛋白染色弱(1+)，结肠上皮基底膜中几乎全部(20/21样本)用抗HER2抗体；结果与文献一致(Seo AN，Kwak Y，Kim D-W，Kang S-B，Choe G，Kim WH等人，HER2status in colorectal cancer:its clinical significance and the relationshipbetween HER2 gene amplification and expression.PloS one.2014；9(5):e98528)。使用HercepTest评分标准，这些发现对于HER2结合是阴性的。相反，mAb104在所有测试的样本中均未显示对正常大肠组织的反应性。
4)心脏组织
在一项评价人类心肌中HER2表达的研究中，在60例心脏异常肥大或心肌炎的病例中有6例检测到弱不连续膜染色(Fuchs IB，Landt S，Bueler H，Kuehl U，Coupland S，Kleine-Tebbe A等人，Analysis of HER2 and HER4 in human myocardium to clarifythe cardiotoxicity of Trastuzumab(HerceptinTM).Breast cancer research andtreatment.2003；82(1):23-8)。值得注意的是，mAb104在正常心脏组织中不显示任何膜或细胞质结合，因此我们假定用mAb104治疗不太可能引起心脏毒性，如用抗HER2抗体曲妥单抗所观察到的。
5)肾组织
在正常肾组织中，mAb104在所测试的23(17％)个样本中的4个的收集管中弱染色(1+)。使用兔单克隆4B5抗体，超过50％的样本(23个样本中的12个)过表达HER2蛋白(2+/3+)。染色局限于收集管和远端肾单位，与其他研究一致(Wang H，Liu C，Han J，Zhen L，Zhang T，He X等人，HER2 expression in renal cell carcinoma is rare andnegatively correlated with that in normal renal tissue.Oncology letters.2012；4(2):194-8；Latif Z，Watters A，Bartlett J，Underwood M，Aitchison M.Geneamplification and overexpression of HER2 in renal cell carcinoma.BJUinternational.2002；89(1):5-9)。
6)肝脏
在我们的分析中，用mAb104和4B5测试的所有13个样本的HER2染色均为阴性。Liu等人(Liu J，Ahiekpor A，Li L，Li X，Arbuthnot P，Kew M等人，Increased expression ofErbB-2in liver is associated with hepatitis B×antigen and shorter survivalin patients with liver cancer.International journal of cancer.2009；125(8):1894-901)报道了类似的发现，其报道了正常人肝脏中微弱的或没有HER2染色。
7)肺
所有13个评价的正常肺组织样本没有用mAb104和4B5染色HER2，与以前公开的数据一致(Takenaka M，Hanagiri T，Shinohara S，Kuwata T，Chikaishi Y，Oka S等人，Theprognostic significance of HER2 overexpression in non-small cell lungcancer.Anticancer research.2011；31(12):4631-6.)。
8)胃内
很少有研究研究了HER2在正常胃粘膜中的表达。在我们的手中，4B5显示分泌上皮的中等至强(2+/3+)细胞质和膜HER2染色，频率为81％。相反，我们使用104抗体的发现显示胃(壁)腺的弱细胞质染色，其使用ToGA评分标准转化为0％频率。
9)膀胱
在正常尿路上皮组织中，mAb104和mAb 4B5在评价的所有11个样本中没有检测到HER2表达。使用这两种抗体，在细胞质中观察到非特异性弱(1+)染色。在Hammam等人(Hammam O，Nour HH，Mosaad M，Akl M，Khalil H，al Ganzory H等人，The clinicalsignificance of HER2 protein amplification/expression in urinary bladderlesion.Arab journal of urology.2015；13(2):146-52)的研究中，HER2蛋白在正常尿道上皮组织或炎性膀胱损伤中不表达。
10)头颈部
10份正常口咽组织样本用mAb104染色；在8个样本(80％)中观察到非特异性染色(1+)，主要见于肌肉和膜。在一项评价正常口腔上皮中HER2表达的研究中，所有样本的膜和细胞质HER2染色均为阳性，细胞质染色限于正常上皮中的基底层和副基底层(Pardis S，Sardari Y，Ashraf MJ，Tadbir AA，Ebrahimi H，Purshahidi S等人，Evaluation oftissue expression and salivary levels of HER2/neu in patients with head andneck squamous cell carcinoma.Iranian journal of otorhinolaryngology.2012；24(69):161).
表10：IHC mAb104结合正常组织
Figure BDA0003342276390000861
肿瘤组织
在肿瘤组织中，本发明人已经显示mAb104和HER2结合之间在一系列检查的肿瘤组织中的高度一致性。显着地，mAb104和对照抗体在HER2阳性侵入性导管乳腺癌和胃癌中具有相似的结合。两种抗体之间的主要差异是在一些肿瘤组织中用mAb104观察到的细胞质染色频率增加(数据未显示)。
1.乳腺肿瘤
评价10个浸润性导管乳腺癌样本的HER2染色并与mAb104的染色模式比较。使用4B5抗体发现两个样本(20％)为HER2阳性(即3+)。在这些样本中，mAb104在一个样本中显示阳性染色(IHC 3+)，另一个样本显示通过肿瘤的微弱不完全膜染色(1+)。当用两种抗体染色时，两个样本显示不明确的染色(2+)，用FISH进一步评价显示非扩增。其余6份样本的两种抗体均为阴性。两种抗体均未见细胞质染色。这些结果显示了两种抗体之间的高一致率，用mAb104没有证实假阳性结果。
2.胃/GOJ肿瘤
本发明人评价了mAb104在胃/胃食管肿瘤样本中的结合，并将其与对照抗体4B5的染色模式进行了比较。与先前的研究一致，我们观察到膜HER2过表达主要在肠型胃癌中，而在弥漫型胃癌中HER2表达主要被视为细胞质染色(Jindal Y，Varma K，Misra V，Kumar R，Singh A，Misra SPl.Cytoplasmic expression of HER2 in gastric adenocarcinoma:anunusual finding.IJMRPS.2016 3(8):67-77).总共评价了肠组织学的51个胃肿瘤样本：与用4B5抗体少于2％相比，用mAb104几乎27％的样本具有弱的细胞质染色。在两个样本(～4％)中观察到mAb104的阳性膜染色，评分分别为2+和3+。类似地，在三个肿瘤(～6％)中观察到4B5的阳性膜染色，其中两个样本显示强3+染色，一个样本评分为2+。在几乎14％的病例中观察到弱的膜染色(即1+)，然而按照上述评分标准，这些被报告为阴性。这些发现与TOGA试验一致，TOGA试验报道IHC 3+/FISH＝阴性肿瘤患者的阳性率为2-3％(Bang Y-J，Van Cutsem E，Feyereislova A，Chung HC，Shen L，Sawaki A等人，Trastuzumab incombination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment ofHER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer(ToGA):aphase 3,open-label,randomised controlled trial.The Lancet.2010；376(9742):687-97)。总共23个GOJ肿瘤患者样本也用mAb104和4B5观察到的相似的膜结合模式染色，然而mAb104显示更高的细胞质染色。由于膜染色较弱(即1+)，膜和细胞质染色均报告为阴性。文献中报道的胃/GEJ癌症中HER2过表达的可变性可以通过在一些研究中报道细胞质以及膜染色来解释。
3.结直肠
在评价的25例原发性结肠直肠肿瘤中，15例(60％)为中度分化，4例(16％)为中度至低分化，6例(24％)为低分化。MAb104在几乎40％的病例中显示弱扩散细胞质染色，没有观察到膜结合。相反，在约15％的病例中观察到4B5对肿瘤病灶区域的弱(1+)膜染色，观察到最低的细胞质染色。与膜性相比，HER2的细胞质定位在结直肠癌中更频繁地发生，并且已在高达63％的病例中报道(Seo AN，Kwak Y，Kim D-W，Kang S-B，Choe G，Kim WH等人，HER2status in colorectal cancer:its clinical significance and the relationshipbetween HER2 gene amplification and expression.PloS one.2014；9(5):e98528,BlokEJ,Kuppen PJ,van Leeuwen JE,Sier CF.Cytoplasmic overexpression of HER2:a keyfactor in colorectal cancer.Clinical Medicine Insights Oncology.2013；7:41)。
4.膀胱
检查了7例移行细胞癌，其中4例为高分级。mAb104和4B5都显示相似的结合模式；用两种抗体观察到异质性染色，其特征在于评分为2+的区域与评分为1+的区域分开。在3个病例中观察到不完全的膜染色，其余3个病例为HER2染色阴性。在三个病例中观察到mAb104的非特异性细胞质染色。HER2表达的报告存在差异，因为一些作者认为2+和3+评分为阳性，而其他作者仅考虑3+评分。此外，在35％的病例中报道了瘤内异质性，这可以解释在相同样本中观察到的异质染色模式(Lae M，Couturier J，Oudard S，Radvanyi F，Beuzeboc P，Vieillefond A.Assessing HER2 gene amplification as a potential target fortherapy in invasive urothelial bladder cancer with a standardizedmethodology:results in1005patients.Annals of Oncology.2009；21(4):815-9).
5.肺
在评价的32例NSCLC病例中，13例(40％)为腺癌，19例(60％)为鳞状细胞癌(SCC)。在SCC病例中，用mAb104观察到微弱的细胞质染色和中等程度的支气管上皮染色(1+)；4B5显示更高强度的细胞质染色，没有膜结合。在腺癌中，两种抗体都显示不完全的膜结合(1+)，具有弱的细胞质染色。在高达11％的病例中报道了HER2细胞质染色，并且在一些报道中，在患者组织和细胞系中观察到比膜更频繁(Cheng C-M，Tsuneyama K，Matsui K，Takahashi H，Ishizawa S，Takano Y.Cytoplasmic expression of c-erbB2 in non-small cell lung cancers.Virchows Archiv.2005；446(6):596-603)。
6.脑和头颈部
在所有10例胶质母细胞瘤和28例HNSCC中，mAb104和4B5染色均为阴性。
7.肾细胞癌
评估了24个肿瘤，其中23个是透明细胞类型，1个具有混合组织学和病灶肉瘤样生长；7例(29％)为3级；11例2级(46％)和6例(25％)1级。未观察到mAb104的染色。当用4B5染色时，在一个样本中的<5％的细胞中观察到弱的膜染色。两种抗体均可见弱的非特异性细胞质染色。
8.肝
在评价的14个肝细胞肿瘤中，mAb104和4B5没有显示出膜染色，然而用两种抗体都观察到弱的细胞质染色。mAb104的细胞质染色比4B5更扩散。
表11：各种肿瘤组织中的IHC mAb104
Figure BDA0003342276390000881
实施例23mAb104结合的Lindmo和斯卡查德分析
放射标记的抗HER2抗体与过表达NCI-N87细胞的ErbB2通过线性外推法与无限抗原过剩的NCI-N87细胞结合，用Lindmo法测定其免疫反应性(Lindmo等人(1984)Journal ofImmunological Methods 72:77-89)如前所述(Lee FT等人，(2001)Cancer Res 61:4474-4482)。对于该抗体-抗原系统，在抗原过量的条件下将2亿个细胞用于结合测定。使用斯卡查德分析来计算表观缔合常数(Ka)和每个细胞结合的抗体分子的数目(Lindmo等人,同上)。斯卡查德分析表明，89Zr-mAb104具有4.0×108M-1的表观Ka，并且结合容量为每个细胞结合约4,203个抗体，而89Zr-赫赛汀具有Ka＝2.93×108M-1并且每个细胞结合约200倍多(913,990)的结合位点(图32和33)。
实施例24.mAb 104在荷瘤裸鼠中的生物分布
在携带过表达HER2的NCI-N87异种移植物的裸鼠中比较mAb104和同种型对照抗体的生物分布。结果示于图34中。89Zr标记的mAb104在9天的研究中表现出高的特异性肿瘤摄取，正常组织表现出放射性标记的完整抗体的典型清除模式。相反，对于同种型对照肿瘤没有观察到肿瘤摄取。
在治疗研究中观察到的mAb104的高特异性摄取和抗肿瘤功效表明，尽管在任何单个时间点，例如FACS或斯卡查德分析，mAb104结合癌细胞表面上的HER2亚群，表位在体内的可用性使得有效的癌症特异性靶向成为可能，并表明比结合正常组织并在临床中具有相关毒性的其它HER2抗体高得多的治疗比率。
序列表
<110> 奥利维亚·牛顿-约翰癌症研究所（Olivia Newton John Cancer ResearchInstitute）
<120> 抗HER2结合分子
<130> 526731PCT
<150> AU 2019900973
<151> 2019-03-22
<160> 55
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(homo sapiens)
<400> 1
Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg
1 5 10 15
Cys
<210> 2
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> mAb104的VH序列
<400> 2
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Phe Met His Trp Val Arg Gln Ser His Val Arg Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Ile Arg Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu His Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Phe Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Leu Asn Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val
100 105 110
Ser Ala
<210> 3
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> mAb104的VL序列
<400> 3
Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Phe Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Phe Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 4
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> mAb106的VH序列
<400> 4
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Lys Pro Thr Tyr Asp Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Phe Leu Asn Thr Val Ala Gly Arg Ser Val Tyr Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 5
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> mAb106的VL序列
<400> 5
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser Val Gly Ser Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Gly Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100 105
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> VH CDR1序列
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<222> (3)..(3)
<223> X是S或T
<220>
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<222> (6)..(6)
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<220>
<221> SITE
<222> (8)..(8)
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<220>
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<222> (10)..(10)
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> VH CDR2
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<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
<222> (14)..(14)
<223> X= N或D
<220>
<221> SITE
<222> (17)..(17)
<223> X= D或G
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1 5 10 15
Xaa
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
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<220>
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<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<221> SITE
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<220>
<221> SITE
<222> (8)..(8)
<223> X= 不存在或G
<220>
<221> SITE
<222> (9)..(9)
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<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
<222> (14)..(14)
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<400> 8
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Tyr
1 5 10 15
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
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<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
<222> (9)..(9)
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<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
<222> (16)..(16)
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Xaa Xaa Ser Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
<210> 10
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> VL CDR2
<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<223> X= S或A
<400> 10
Leu Xaa Ser Xaa Leu Xaa Ser
1 5
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> VL CDR3
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(1)
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<220>
<221> SITE
<222> (3)..(3)
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<220>
<221> SITE
<222> (4)..(4)
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<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
<222> (6)..(6)
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<220>
<221> SITE
<222> (8)..(8)
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Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr
1 5
<210> 12
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> VH序列
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(1)
<223> X=E或Q
<220>
<221> SITE
<222> (2)..(2)
<223> X= V或I
<220>
<221> SITE
<222> (5)..(5)
<223> X= Q或V
<220>
<221> SITE
<222> (12)..(12)
<223> X= V或K
<220>
<221> SITE
<222> (16)..(16)
<223> X= A或E
<220>
<221> SITE
<222> (17)..(17)
<223> X= S或T
<220>
<221> SITE
<222> (28)..(28)
<223> X= S或T
<220>
<221> SITE
<222> (31)..(31)
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<220>
<221> SITE
<222> (33)..(33)
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<220>
<221> SITE
<222> (35)..(35)
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<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
<222> (38)..(38)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> SITE
<222> (40)..(40)
<223> X= S或A
<220>
<221> SITE
<222> (41)..(41)
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<220>
<221> SITE
<222> (42)..(42)
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<220>
<221> SITE
<222> (43)..(43)
<223> X= R或K
<220>
<221> SITE
<222> (44)..(44)
<223> X= S或G
<220>
<221> SITE
<222> (46)..(46)
<223> X= E或K
<220>
<221> SITE
<222> (48)..(48)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> SITE
<222> (50)..(50)
<223> X= R或W
<220>
<221> SITE
<222> (53)..(53)
<223> X= P或T
<220>
<221> SITE
<222> (55)..(55)
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<220>
<221> SITE
<222> (57)..(57)
<223> X= D或K
<220>
<221> SITE
<222> (58)..(58)
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<220>
<221> SITE
<222> (59)..(59)
<223> X= R或T
<220>
<221> SITE
<222> (61)..(61)
<223> X= N或D
<220>
<221> SITE
<222> (62)..(62)
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<220>
<221> SITE
<222> (63)..(63)
<223> X= N或D
<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
<222> (82)..(82)
<223> X= E或Q
<220>
<221> SITE
<222> (83)..(83)
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<220>
<221> SITE
<222> (84)..(84)
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<220>
<221> SITE
<222> (85)..(85)
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<220>
<221> SITE
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<223> X= T或K
<220>
<221> SITE
<222> (88)..(88)
<223> X= S或N
<220>
<221> SITE
<222> (91)..(91)
<223> X= S或M
<220>
<221> SITE
<222> (93)..(93)
<223> X= V或T
<220>
<221> SITE
<222> (94)..(94)
<223> X= F或Y
<220>
<221> SITE
<222> (95)..(95)
<223> X= F或Y
<220>
<221> SITE
<222> (98)..(98)
<223> X= S或R
<220>
<221> SITE
<222> (99)..(99)
<223> X= 不存在或R
<220>
<221> SITE
<222> (100)..(100)
<223> X= 不存在或F
<220>
<221> SITE
<222> (101)..(101)
<223> X= 不存在或L
<220>
<221> SITE
<222> (102)..(102)
<223> X= 不存在或N
<220>
<221> SITE
<222> (103)..(103)
<223> X= 不存在或T
<220>
<221> SITE
<222> (104)..(104)
<223> X= 不存在或N
<220>
<221> SITE
<222> (105)..(105)
<223> X= 不存在或A
<220>
<221> SITE
<222> (106)..(106)
<223> X= 不存在或G
<220>
<221> SITE
<222> (107)..(107)
<223> X= 不存在或R
<220>
<221> SITE
<222> (108)..(108)
<223> X= 不存在或S
<220>
<221> SITE
<222> (109)..(109)
<223> X= L或V
<220>
<221> SITE
<222> (110)..(110)
<223> X= N或Y
<220>
<221> SITE
<222> (112)..(112)
<223> X= A或D
<220>
<221> SITE
<222> (119)..(119)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> SITE
<222> (120)..(120)
<223> X= V或L
<220>
<221> SITE
<222> (124)..(124)
<223> X= A或S
<400> 12
Xaa Xaa Gln Leu Xaa Gln Ser Gly Pro Glu Leu Xaa Lys Pro Gly Xaa
1 5 10 15
Xaa Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Xaa Phe Thr Xaa Tyr
20 25 30
Xaa Met Xaa Trp Val Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Trp Xaa
35 40 45
Gly Xaa Ile Asn Xaa Tyr Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Phe
50 55 60
Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Glu Asp Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Cys
85 90 95
Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Xaa Xaa Thr Val Ser Xaa
115 120
<210> 13
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> VL序列
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(1)
<223> X= D或Q
<220>
<221> SITE
<222> (4)..(4)
<223> X= I或L
<220>
<221> SITE
<222> (9)..(9)
<223> X= L或A
<220>
<221> SITE
<222> (10)..(10)
<223> X= T或L
<220>
<221> SITE
<222> (11)..(11)
<223> X= L或M
<220>
<221> SITE
<222> (14)..(14)
<223> X= T或S
<220>
<221> SITE
<222> (15)..(15)
<223> X= F或P
<220>
<221> SITE
<222> (17)..(17)
<223> X= T或S
<220>
<221> SITE
<222> (18)..(18)
<223> X= P或K
<220>
<221> SITE
<222> (19)..(19)
<223> X= P或K
<220>
<221> SITE
<222> (20)..(20)
<223> X= A或V
<220>
<221> SITE
<222> (21)..(21)
<223> X= S或T
<220>
<221> SITE
<222> (22)..(22)
<223> X= I或M
<220>
<221> SITE
<222> (24)..(24)
<223> X= S或T
<220>
<221> SITE
<222> (25)..(25)
<223> X= K或S
<220>
<221> SITE
<222> (27)..(27)
<223> X= S或V
<220>
<221> SITE
<222> (29)..(29)
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<220>
<221> SITE
<222> (30)..(30)
<223> X= L或不存在
<220>
<221> SITE
<222> (31)..(31)
<223> X= L或不存在
<220>
<221> SITE
<222> (32)..(32)
<223> X= D或不存在
<220>
<221> SITE
<222> (33)..(33)
<223> X= S或不存在
<220>
<221> SITE
<222> (34)..(34)
<223> X= D或不存在
<220>
<221> SITE
<222> (35)..(35)
<223> X=G或不存在
<220>
<221> SITE
<222> (36)..(36)
<223> X= K或V
<220>
<221> SITE
<222> (37)..(37)
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<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
<222> (39)..(39)
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<220>
<221> SITE
<222> (41)..(41)
<223> X= L或Y
<220>
<221> SITE
<222> (42)..(42)
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<220>
<221> SITE
<222> (44)..(44)
<223> X= R或K
<220>
<221> SITE
<222> (46)..(46)
<223> X= G或R
<220>
<221> SITE
<222> (47)..(47)
<223> X= Q或S
<220>
<221> SITE
<222> (51)..(51)
<223> X= R或P
<220>
<221> SITE
<222> (52)..(52)
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<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
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<220>
<221> SITE
<222> (60)..(60)
<223> X= D或A
<220>
<221> SITE
<222> (65)..(65)
<223> X= D或P
<220>
<221> SITE
<222> (68)..(68)
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<220>
<221> SITE
<222> (75)..(75)
<223> X= D或S
<220>
<221> SITE
<222> (76)..(76)
<223> X= T或S
<220>
<221> SITE
<222> (77)..(77)
<223> X= T或S
<220>
<221> SITE
<222> (79)..(79)
<223> X= K或T
<220>
<221> SITE
<222> (82)..(82)
<223> X= R或S
<220>
<221> SITE
<222> (83)..(83)
<223> X= V或M
<220>
<221> SITE
<222> (88)..(88)
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<220>
<221> SITE
<222> (89)..(89)
<223> X= G或A
<220>
<221> SITE
<222> (90)..(90)
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<220>
<221> SITE
<222> (94)..(94)
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<220>
<221> SITE
<222> (96)..(96)
<223> X= G或W
<220>
<221> SITE
<222> (97)..(97)
<223> X= T或S
<220>
<221> SITE
<222> (98)..(98)
<223> X= H或S
<220>
<221> SITE
<222> (99)..(99)
<223> X= F或N
<220>
<221> SITE
<222> (101)..(101)
<223> X= W或P
<220>
<221> SITE
<222> (105)..(105)
<223> X= G或A
<220>
<221> SITE
<222> (111)..(111)
<223> X= I或L
<400> 13
Xaa Ile Val Xaa Thr Gln Ser Pro Xaa Xaa Xaa Ser Val Xaa Xaa Gly
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Ser Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Gln Xaa Pro Xaa Xaa Ser
35 40 45
Pro Lys Xaa Xaa Ile Tyr Leu Xaa Ser Xaa Leu Xaa Ser Gly Val Pro
50 55 60
Xaa Arg Phe Xaa Gly Ser Gly Ser Gly Thr Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Ile
65 70 75 80
Ser Xaa Xaa Glu Ala Glu Asp Xaa Xaa Xaa Tyr Tyr Cys Xaa Gln Xaa
85 90 95
Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr Phe Gly Xaa Gly Thr Lys Leu Glu Xaa Lys
100 105 110
Arg
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> VH CDR1
<400> 14
Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Phe Met His
1 5 10
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> VH CDR1
<400> 15
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Gly Met Asn
1 5 10
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> VH CDR2
<400> 16
Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Ile Arg Tyr Asn Gln Asn Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> VH CDR2
<400> 17
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Lys Pro Thr Tyr Asp Asp Asp Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> VH CDR3
<400> 18
Leu Asn Phe Ala Tyr
1 5
<210> 19
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> VH CDR3
<400> 19
Arg Phe Leu Asn Thr Val Ala Gly Arg Ser Val Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 20
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> VL CDR1
<400> 20
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Phe Leu Asn
1 5 10 15
<210> 21
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> VL CDR1
<400> 21
Ser Val Ser Ser Ser Val Gly Ser Met Tyr
1 5 10
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> VL CDR2
<400> 22
Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser
1 5
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> VL CDR2
<400> 23
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> VL CDR3
<400> 24
Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Trp Thr
1 5
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> VL CDR3
<400> 25
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr
1 5
<210> 26
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 用于免疫的环化肽
<400> 26
Gly Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln
1 5 10 15
Arg Cys
<210> 27
<211> 1255
<212> PRT
<213> 智人(homo sapiens)
<400> 27
Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu
1 5 10 15
Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys
20 25 30
Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His
35 40 45
Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr
50 55 60
Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val
65 70 75 80
Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu
85 90 95
Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr
100 105 110
Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro
115 120 125
Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser
130 135 140
Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln
145 150 155 160
Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn
165 170 175
Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys
180 185 190
His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser
195 200 205
Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys
210 215 220
Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys
225 230 235 240
Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu
245 250 255
His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val
260 265 270
Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg
275 280 285
Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu
290 295 300
Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln
305 310 315 320
Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys
325 330 335
Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu
340 345 350
Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys
355 360 365
Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp
370 375 380
Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe
385 390 395 400
Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro
405 410 415
Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg
420 425 430
Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu
435 440 445
Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly
450 455 460
Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val
465 470 475 480
Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr
485 490 495
Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His
500 505 510
Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys
515 520 525
Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys
530 535 540
Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys
545 550 555 560
Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys
565 570 575
Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp
580 585 590
Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu
595 600 605
Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln
610 615 620
Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys
625 630 635 640
Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser
645 650 655
Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly
660 665 670
Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg
675 680 685
Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly
690 695 700
Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu
705 710 715 720
Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys
725 730 735
Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile
740 745 750
Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu
755 760 765
Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg
770 775 780
Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu
785 790 795 800
Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg
805 810 815
Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly
820 825 830
Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala
835 840 845
Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe
850 855 860
Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp
865 870 875 880
Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg
885 890 895
Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val
900 905 910
Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala
915 920 925
Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro
930 935 940
Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met
945 950 955 960
Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe
965 970 975
Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu
980 985 990
Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu
995 1000 1005
Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr
1010 1015 1020
Leu Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly
1025 1030 1035
Ala Gly Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg
1040 1045 1050
Ser Gly Gly Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu
1055 1060 1065
Glu Ala Pro Arg Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser
1070 1075 1080
Asp Val Phe Asp Gly Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu
1085 1090 1095
Gln Ser Leu Pro Thr His Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser
1100 1105 1110
Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val
1115 1120 1125
Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln Pro Glu Tyr Val Asn Gln Pro
1130 1135 1140
Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro Arg Glu Gly Pro Leu Pro
1145 1150 1155
Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu Arg Pro Lys Thr Leu
1160 1165 1170
Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val Phe Ala Phe Gly
1175 1180 1185
Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln Gly Gly Ala
1190 1195 1200
Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala Phe Asp
1205 1210 1215
Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala Pro
1220 1225 1230
Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr
1235 1240 1245
Leu Gly Leu Asp Val Pro Val
1250 1255
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<400> 28
atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg 30
<210> 29
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<220>
<221> SITE
<222> (7)..(7)
<223> n= a或t
<220>
<221> SITE
<222> (22)..(22)
<223> n= c或t
<400> 29
atggagncag acacactcct gntatgggt 29
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<220>
<221> SITE
<222> (26)..(26)
<223> n= g或c
<400> 30
atgagtgtgc tcactcaggt cctggngttg 30
<210> 31
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<220>
<221> SITE
<222> (7)..(7)
<223> n= a或g
<220>
<221> SITE
<222> (19)..(19)
<223> n= a或t
<220>
<221> SITE
<222> (22)..(22)
<223> n= c或t
<220>
<221> SITE
<222> (27)..(27)
<223> n= a或c
<220>
<221> SITE
<222> (28)..(28)
<223> n= a或t
<400> 31
atgaggnccc ctgctcagnt tnttggnntc ttg 33
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<220>
<221> SITE
<222> (9)..(9)
<223> n= a或t
<220>
<221> SITE
<222> (22)..(22)
<223> n= a或t
<400> 32
atggatttnc aggtgcagat tntcagcttc 30
<210> 33
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<220>
<221> SITE
<222> (8)..(8)
<223> n= g或t
<220>
<221> SITE
<222> (10)..(11)
<223> n= c或t
<220>
<221> SITE
<222> (14)..(14)
<223> n= c或t
<220>
<221> SITE
<222> (16)..(16)
<223> n= g或c
<220>
<221> SITE
<222> (19)..(19)
<223> n= c或t
<220>
<221> SITE
<222> (21)..(21)
<223> n= c或t
<220>
<221> SITE
<222> (25)..(25)
<223> n= a或g
<400> 33
atgaggtncn ntgntnagnt nctgngg 27
<210> 34
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<220>
<221> SITE
<222> (7)..(7)
<223> n= a或t
<220>
<221> SITE
<222> (24)..(24)
<223> n= g或t
<220>
<221> SITE
<222> (25)..(25)
<223> n= a或t
<220>
<221> SITE
<222> (26)..(27)
<223> n= c或t
<220>
<221> SITE
<222> (29)..(29)
<223> n= a或t
<400> 34
atgggcntca agatggagtc acannnncng g 31
<210> 35
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<220>
<221> SITE
<222> (10)..(10)
<223> n= c或t
<220>
<221> SITE
<222> (13)..(13)
<223> n= g或t
<220>
<221> SITE
<222> (17)..(17)
<223> n= c或t
<220>
<221> SITE
<222> (19)..(20)
<223> n= a或c
<400> 35
atgtggggan ctntttycnn tttttcaatt g 31
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<220>
<221> SITE
<222> (6)..(6)
<223> n= a或g
<220>
<221> SITE
<222> (10)..(10)
<223> n= a或t
<220>
<221> SITE
<222> (13)..(13)
<223> n= g或c
<400> 36
atggtntccn canctcagtt ccttg 25
<210> 37
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<400> 37
atgtatatat gtttgttgtc tatttct 27
<210> 38
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<400> 38
atggaagccc cagctcagct tctcttcc 28
<210> 39
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<400> 39
atgaagtttc cttctcaact tctgctc 27
<210> 40
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<400> 40
tggatggtgg gaagatg 17
<210> 41
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<220>
<221> SITE
<222> (21)..(21)
<223> n= g或c
<400> 41
atgaaatgca gctgggtcat nttcttc 27
<210> 42
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<220>
<221> SITE
<222> (14)..(14)
<223> n= a或g
<220>
<221> SITE
<222> (20)..(20)
<223> n= g或c
<400> 42
atgggatgga gctratcats ytctt 25
<210> 43
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<220>
<221> SITE
<222> (7)..(7)
<223> n= a或t
<400> 43
atgaagntgt ggttaaactg ggttttt 27
<210> 44
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<220>
<221> SITE
<222> (4)..(4)
<223> n= a或g
<220>
<221> SITE
<222> (11)..(11)
<223> n= a或t
<220>
<221> SITE
<222> (12)..(12)
<223> n= c或t
<220>
<221> SITE
<222> (21)..(21)
<223> n= a或g
<400> 44
atgnactttg nntcagcttg nttt 24
<210> 45
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<220>
<221> SITE
<222> (18)..(18)
<223> n= a或c
<400> 45
atggactcca ggctcaanag ttttcctt 28
<210> 46
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<220>
<221> SITE
<222> (10)..(10)
<223> n= c或t
<220>
<221> SITE
<222> (12)..(12)
<223> n= a或g
<220>
<221> SITE
<222> (14)..(14)
<223> n= g或c
<220>
<221> SITE
<222> (18)..(18)
<223> n= a或g
<400> 46
atggctgtcn tngngctnct cttctgc 27
<210> 47
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<220>
<221> SITE
<222> (5)..(5)
<223> n= a或g
<220>
<221> SITE
<222> (13)..(13)
<223> n= g或t
<220>
<221> SITE
<222> (16)..(16)
<223> n= a或g
<220>
<221> SITE
<222> (22)..(22)
<223> n= a或c
<400> 47
atggnatgga gcnggntctt tntctt 26
<210> 48
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<400> 48
atgagagtgc tgattctttt gtg 23
<210> 49
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<220>
<221> SITE
<222> (5)..(5)
<223> n= a或c
<220>
<221> SITE
<222> (17)..(17)
<223> n= a或c
<400> 49
atggnttggg tgtgganctt gctattcctg 30
<210> 50
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<400> 50
atgggcagac ttacattctc attcctg 27
<210> 51
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<400> 51
atggattttg ggctgatttt ttttattg 28
<210> 52
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<400> 52
atgatggtgt taagtcttct gtacctg 27
<210> 53
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<400> 53
ccagtggata gacagatg 18
<210> 54
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<220>
<221> SITE
<222> (12)..(12)
<223> n= c或t
<220>
<221> SITE
<222> (19)..(19)
<223> n= a或c
<220>
<221> SITE
<222> (21)..(21)
<223> n= g或c
<220>
<221> SITE
<222> (24)..(24)
<223> n= a或c
<220>
<221> SITE
<222> (27)..(27)
<223> n= a或g
<220>
<221> SITE
<222> (28)..(28)
<223> n= a或t
<220>
<221> SITE
<222> (31)..(31)
<223> n= a或c
<400> 54
gccgaattcg anattgtgnt nacncannct nca 33
<210> 55
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 引物
<400> 55
ccggtcgacg gatacagttg gtgcagcatc 30

Claims (20)

1.一种包括抗原结合结构域的HER2/ErbB2结合蛋白，其中，所述抗原结合结构域特异性结合HER2的结构域II内的表位，包括根据图1(SEQ ID NO：27)的所述成熟正常或野生型人HER2序列的第293至309位残基，并且所述表位响应于HER2扩增或活化而暴露，并且其中所述表位在致瘤性、过度增殖性或异常细胞中表达，但在正常或野生型细胞中不表达。
2.根据权利要求1所述的HER2结合蛋白，其中，所述表位包括所述氨基酸序列CPLHNQEVTAEDGTQRC(SEQ ID NO：1)。
3.根据权利要求1或2所述的HER2结合蛋白，其中，所述HER2结合蛋白是抗体或其抗原结合片段，其包括：
(i)与mAb104的重链可变区序列(SEQ ID NO：2)具有至少55％同一性的重链可变区序列(VH)；和/或
(ii)与mAb104的轻链可变区序列(SEQ ID NO：3)具有至少50％同一性的轻链可变区序列(VL)。
4.根据前述权利要求中任一项所述的HER2结合蛋白，其中，所述结合蛋白包括：
(i)具有如下序列的VH CDR1：
GYX7FTX8YX9MX10(SEQ ID NO：6)
其中X7是S或T；X8是G或D；X9是F或G；X10是H或N；
(ii)具有如下序列的VH CDR2：
X19INX20YX21GX22X23X24YX25X26X27FKX28(SEQ ID NO：7)
其中X19是R或W；X20是P或T；X21是N或T；X22是D或K；X23是I或P；X24是R或T；X25是N或D；X26是Q或D；X27是N或D；且X28是D或G；
(iii)具有如下序列的VH CDR3：
X50X51X52X53X54X55X56X57X58X59X60X61FX62Y(SEQ ID NO：8)
其中X50不存在或是R；X51不存在或是F；X52不存在或是L；X53不存在或是N；X54不存在或是T；X55不存在或是V；X56不存在或是A；X57不存在或是G；X58不存在或是R；X59不存在或是S；X60是L或V；X61是N或Y；并且X62是A或D；
和/或
(iv)具有如下序列的VL CDR1：
X14X15SX16SX17X18X19X20X21X22X23X24X25X26X27(SEQ ID NO：9)
其中X14是K或S；X15是S或V；X16是Q或S；X17是L或不存在；X18是L或不存在；X19是D或不存在；X20是S或不存在；X21是D或不存在；X22是G或不存在；X23是K或V；X24是T或G；X25是F或S；X26是L或M；并且X27是N或Y；
(v)具有如下序列的VL CDR2：
LX35SX36LX37S(SEQ ID NO：10)
X35是D或E；X36是K或T；X37是S或A；以及
(vi)具有如下序列的VL CDR3：
X49QX50X51X52X53PX54T(SEQ ID NO：11)
其中X49是W或Q；X50是G或W；X51是T或S；X52是H或S；X53是F或N；且X54是W或P。
5.根据前述权利要求中任一项所述的HER2结合蛋白，其中，所述结合蛋白包括以下所示的重链可变区序列(VH)：
X1X2QLX3QSGPELX4KPGX5X6VKISCKASGYX7FTX8YX9MX10 WVX11QX12X13
X14X15X16LX17WX18GX19INX20YX21GX22X23X24YX25X26X27FKX28 X29X30X31X32X33X34X35X36SX37STAYX3 8X39X40X41X42LX43X44EDX45AX46X47X48CAX49 X50X51
X52X53X54X55X56X57X58X59X60X61FX62YWGQGTX63X64TVSX65(SEQ ID NO：12)
其中
X1是E或Q；X2是V或I；X3是Q或V；X4是V或K；X5是A或E；X6是S或T；X7是S或T；X8是G或D；X9是F或G；X10是H或N；X11是R或K；X12是S或A；X13是H或P；X14是V或G；X15是R或K；X16是S或G；X17是E或K；X18是I或M；X19是R或W；X20是P或T；X21是N或T；X22是D或K；X23是I或P；X24是R或T；X25是N或D；X26是Q或D；X27是N或D；X28是D或G；X29是K或R；X30是A或F；X31是S或A；X32是L或F；X33是T或S；X34是V或L；X35是D或E；X36是K或T；X37是S或A；X38是M或L；X39是E或Q；X40是L或I；X41是H或N；X42是R或N；X43是T或K；X44是S或N；X45是S或M；X46是V或T；X47是F或Y；X48是Y或F；X49是S或R；X50不存在或是R；X51不存在或是F；X52不存在或是L；X53不存在或是N；X54不存在或是T；X55不存在或是V；X56不存在或是A；X57不存在或是G；X58不存在或是R；X59不存在或是S；X60是L或V；X61是N或Y；X62是A或D；X63是P或T；X64是V或L；并且X65是A或S；
和/或
如下所示的轻链可变区序列(VL)：
X1IVX2TQSPX3X4X5SVX6X7GX8X9X10X11X12X13CX14X15SX16SX17X18X19X20X21
X22X23X24X25X26X27 WX28X29QX30PX31X32SPKX33X34IYLX35SX36LX37SGVPX38RFX39GSGSGTX40X41X42LX43ISX44X45EAEDX46X47X48YY CX49QX50X51X52X53PX54TFGX55GTKLEX56KR(SEQ ID NO：13)
其中
X1是D或Q；X2是I或L；X3是L或A；X4是T或L；X5是L或M；X6是T或S；X7是F或P；X8是Q或E；X9是P或K；X10是A或V；X11是S或T；X12是I或M；X13是S或T；X14是K或S；X15是S或V；X16是Q或S；X17是L或不存在；X18是L或不存在；X19是D或不存在；X20是S或不存在；X21是D或不存在；X22是G或不存在；X23是K或V；X24是T或G；X25是F或S；X26是L或M；X27是N或Y；X28是L或Y；X29是L或Q；X30是R或K；X31是G或R；X32是Q或S；X33是R或P；X34是L或W；X35是V或T；X36是K或N；X37是D或A；X38是D或P；X39是T或S；X40是D或S；X41是F或Y；X42是T或S；X43是K或T；X44是R或S；X45是V或M；X46是L或A；X47是G或A；X48是V或T；X49是W或Q；X50是G或W；X51是T或S；X52是H或S；X53是F或N；X54是W或P；X55是G或A；并且X56是I或L。
6.根据前述权利要求中任一项所述的HER2结合蛋白，其中，所述VH包括：
(i)选自GYSFTGYFMH(SEQ ID NO：14)或GYTFTDYGMN(SEQ ID NO：15)的CDR1序列；
(ii)选自RINPYNGDIRYNQNFKD(SEQ ID NO：16)或WINTYTGKPTYDDDFKG(SEQ ID NO：17)的CDR2序列；
(iii)选自LNFAY(SEQ ID NO：18)或RFLNTVAGRSVYFDY(SEQ ID NO：19)的CDR3序列；以及
其中所述VL包括：
(iv)选自KSSQSLLDSDGKTFLN(SEQ ID NO：20)或SVSSSVGSMY(SEQ ID NO：21)的CDR1序列；
(v)选自LVSKLDS(SEQ ID NO：22)或LTSNLAS(SEQ ID NO：23)的CDR2序列；以及
(vi)选自WQGTHFPWT(SEQ ID NO：24)或QQWSSNPPT(SEQ ID NO：25)的CDR3序列。
7.根据前述权利要求中任一项所述的HER2结合蛋白，其中，所述HER2结合蛋白包括：
重链可变区序列(VH)，其具有分别包括以下或由以下组成的CDR1、CDR2和CDR3序列：
(i)SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16以及SEQ ID NO：18；或
(ii)SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17以及SEQ ID NO：19；
和/或
轻链可变区序列(VL)，其具有分别包括以下或由以下组成的CDR1、CDR2和CDR3序列：
(i)SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22以及SEQ ID NO：24；或
(ii)SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23以及SEQ ID NO：25。
8.根据前述权利要求中任一项所述的HER2结合蛋白，其中，所述HER2结合蛋白包括具有包括SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22和SEQID NO：24的序列的CDR。
9.根据前述权利要求中任一项所述的HER2结合蛋白，其中，所述HER2结合蛋白包括具有包括SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：19，以及SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：25的序列的CDR。
10.根据前述要求中任一项的HER2结合蛋白，其中，所述HER2结合蛋白包括VH和/或VL，所述VH包括与SEQ ID NO：2中所示所述序列具有至少55％同一性的序列，所述VL包括与SEQID NO：3中所示所述序列具有至少50％同一性的序列，或其人源化、嵌合或去免疫化形式。
11.根据前述要求中任一项的HER2结合蛋白，其中，所述HER2结合蛋白包括VH和/或VL，所述VH包括与SEQ ID NO：4中所示所述序列具有至少55％同一性的序列，所述VL包括与SEQID NO：5中所示所述序列具有至少50％同一性的序列，或其人源化、嵌合或去免疫化形式。
12.根据前述权利要求中任一项所述的HER2结合蛋白，其中，所述HER2结合蛋白包括：
(i)SEQ ID NO：2所示的VH和SEQ ID NO：3所示的VL；或
(ii)SEQ ID NO：4所示的VH和SEQ ID NO：5所示的VL。
13.根据权利要求3至12中任一项所述的HER2结合蛋白，其中，所述抗原结合片段是：
(i)单链Fv片段(scFv)；
(ii)二聚体scFv(di-scFv)；
(iii)连接至重链恒定区或Fc或重链恒定结构域(CH)2和/或CH3的(i)和/或(ii)中的至少一种；或
(iv)与增强抗体半衰期的蛋白连接的(i)和/或(ii)中的至少一种。
14.根据前述权利要求中任一项所述的HER2-结合蛋白，其中，所述抗原结合片段是：
(i)双链抗体；
(ii)三链抗体；
(iii)四链抗体；
(iv)Fab；
(v)F(ab′)2；
(vi)Fv；或
(vii)连接至重链恒定区或Fc或重链恒定结构域(CH)2和/或CH3的(i)至(vi)中的至少一种；或
(viii)与增强抗体半衰期的蛋白连接的(i)至(vi)中的至少一种。
15.根据前述权利要求中任一项所述的HER2-结合蛋白，其与可检测的或功能性的部分缀合。
16.根据权利要求1至14中任一项所述的HER2-结合蛋白，其缀合至药物。
17.一种组合组合物，其包括(i)根据权利要求1至14中任一项所述的HER2结合蛋白和(ii)抗HER2抗体、化疗剂、放射免疫治疗剂或免疫治疗剂或其组合。
18.一种组合物，其包括根据权利要求1-16中任一项所述的HER2结合蛋白和合适的载体(carrier)。
19.一种治疗受试对象中表达HER2的癌症的方法，其包括向有需要的受试对象施用根据权利要求1至16中任一项所述的HER2结合蛋白，根据权利要求17所述的组合或根据权利要求18所述的组合物。
20.一种用于检测生物样本中的HER2的方法，所述方法包括使样本与根据权利要求1至16中任一项所述的HER2结合蛋白或抗体接触并检测所述复合物，其中检测所述复合物指示所述样本中的HER2表达。
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