JP2022529232A - 抗ｈｅｒ２結合分子 - Google Patents

抗ｈｅｒ２結合分子 Download PDF

Info

Publication number
JP2022529232A
JP2022529232A JP2021559509A JP2021559509A JP2022529232A JP 2022529232 A JP2022529232 A JP 2022529232A JP 2021559509 A JP2021559509 A JP 2021559509A JP 2021559509 A JP2021559509 A JP 2021559509A JP 2022529232 A JP2022529232 A JP 2022529232A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
her2
seq
antibody
binding
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2021559509A
Other languages
English (en)
Inventor
アンドリュー・マーク・スコット
フイ・コン・ガン
ジャンチ・リュウ
サグン・パラク
Original Assignee
オリビア・ニュートン－ジョン・キャンサー・リサーチ・インスティテュート
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AU2019900973A external-priority patent/AU2019900973A0/en
Application filed by オリビア・ニュートン－ジョン・キャンサー・リサーチ・インスティテュート filed Critical オリビア・ニュートン－ジョン・キャンサー・リサーチ・インスティテュート
Publication of JP2022529232A publication Critical patent/JP2022529232A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

本開示は、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する結合タンパク質を指向する。さらに具体的には、結合タンパク質はＨＥＲ２の増幅または活性化に応答して細胞にて露出される立体構造エピトープに結合する。

Description

本明細書で引用または参照されるすべての文書、及び本明細書で引用される文書内で引用または参照されるすべての文書は、本明細書で言及される任意の製品に対するまたは本明細書での参照によって組み込まれる任意の文書内での任意の製造業者の指示、記述、製品仕様、及び製品シートとともに、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
配列表の電子申請の全内容は、あらゆる目的においてその全体が参照によって組み込まれる。
本出願は、２０１９年３月２２日に出願されたオーストラリア仮特許出願番号ＡＵ２０１９９００９７３の優先権を主張する。この文書の内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本開示は、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する結合タンパク質を指向する。さらに具体的には、結合タンパク質はＨＥＲ２の増幅または活性化に応答して細胞にて露出される立体構造エピトープに結合する。
受容体のＥｒｂＢファミリーは、細胞表面に存在する４つの相同タンパク質：上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ；ＥｒｂＢ１としても知られる；ＨＥＲ１）；ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２；Ｎｅｕとしても知られる）；ＥＲＢＢ３（またはＨＥＲ３）；及びＥＲＢＢ４（またはＨＥＲ４）を含む。
ＨＥＲ２の過剰発現及び増幅は、乳癌、胆道癌、結腸癌、子宮内膜癌、胃癌及び胃食道接合部癌、多形性膠芽腫、頭頸部癌、卵巣癌、膵臓癌、ならびに尿路上皮癌を含む、多くの種類のがんで確認されている。ＨＥＲ２の過剰発現及び増幅は、乳癌及び胃／胃食道接合部（ＧＥＪ）癌の予後不良と関連していることが示されている（Ｎａｇａｒａｊａ Ｖ．ｅｔ ａｌ．，（２０１６），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．４２（１）：１４０－８）；しかしながら、他の腫瘍型に対する影響は明確に定義されていない。
ＨＥＲ２抗体の市場は２０１７年に１００億米ドルを超え、将来的にはＨＥＲ２抗体の売上増加が見込まれ、新しい臨床適応症及び市場が出現している。ＨＥＲ２の過剰発現／増幅を伴う患者にてＨＥＲ２を標的とすることに対する反応は、腫瘍組織学、退形成の程度、疾患の病期、及び潜在的な危険因子の存在を含むいくつかの臨床病理学的特徴によって影響を受ける。ＨＥＲ２の増幅または過剰発現は、乳癌、胃癌、婦人科癌を含む種々の腫瘍型における抗ＨＥＲ治療の予測生体マーカーとしても役立つ（Ｓｌａｍｏｎ ＤＪ．ｅｔ ａｌ．，（１９８７），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５｛４７８５）：１７７－８２；Ｓａｎｔｉｎ ＡＤ．ｅｔ ａｌ．，（２００５），Ｃａｎｃｅｒ，１０４（７）：１３９１－７；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，（２００６），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２４（１５）：２３７６－８５；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，（２０１０），Ｊ．Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｏｎｃｏｌ．５（１２）：１９２２－３２）。概説については、Ｐａｒａｋｈ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，（２０１７），Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｒｅｖｉｅｗｓ，５９：１－２１を参照のこと。
ＨＥＲ２の機能
ＨＥＲ２の細胞外ドメインは既知の天然リガンドを結合することができない（Ｋｌａｐｐｅｒ ＬＮ．ｅｔ ａｌ．，（１９９９），ＰＮＡＳ，９６（９）：４９９５－５０００）。ＥｒｂＢファミリーの他のメンバーとは異なって、ＨＥＲ２は、リガンドの非存在下でＨＥＲ２キナーゼ（他のＥｒｂＢファミリーメンバーについてはリガンドの活性化を必要とする）のオリゴマー化及び活性化に好都合である立体構造を採用する（Ｇａｒｒｅｔｔ ＴＰ．ｅｔ ａｌ．，（２００２），Ｃｅｌｌ，１１０（６）：７６３－７３）。ＨＥＲ２の開放確認（Ｃｈｏ Ｈ－Ｓ．ｅｔ ａｌ．，（２００３），Ｎａｔｕｒｅ，４２１（６９２４）：７５６－６０）によって、二量体化アームが単量体ファミリーメンバー間のホモ二量体またはヘテロ二量体の相互作用、ならびに既存の不活性二量体の立体構造変化及びオリゴマー化に恒久的に利用可能になる（Ｍａｒｕｙａｍａ ＩＮ．ｅｔ ａｌ．，（２０１４），Ｃｅｌｌｓ，３（２）：３０４－３０）ということは、細胞内キナーゼドメインの自己リン酸化及びシグナル伝達につながる。ＨＥＲ２の過剰発現は、ＥＧＦ及びニューレグリンの受容体への親和性を高め、活性がある二量体からのリガンド解離の速度を低下させる。ＨＥＲ２の過剰発現はまた、ＨＥＲ２含有ヘテロ二量体のリサイクル及び分解速度にも影響を与えることが示されており：ＥＧＦＲ－ＨＥＲ２ヘテロ二量体は分解ではなくエンドサイトーシスのリサイクルを受け、ＥＧＦＲシグナル伝達の延長をもたらす（Ｈｕａｎｇ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，（１９９９），Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．７４（１）：２３－３０）。リガンド活性化の際に形成されるヘテロ二量体のうち、ＨＥＲ２－ＨＥＲ３ヘテロ二量体はＨＥＲ２増幅腫瘍において最も強力なシグナル伝達複合体であると思われる（Ｔｚａｈａｒ Ｅ．ｅｔ ａｌ．，（１９９６），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６（１０）：５２７６－８７）。ＨＥＲ２－ＨＥＲ３複合体を介したシグナル伝達には、ＨＥＲ３依存性リン酸化と、それに続くＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路の活性化とが介在する（Ｐｉｎｋａｓ－Ｋｒａｍａｒｓｋｉ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，（１９９６），ＥＭＢＯ Ｊ．１５（１０）：２４５２）。試験管内試験は、ＨＥＲ２の過剰発現が悪性形質転換、抗アポトーシス特性の発達、侵襲性の増加、及び薬剤耐性につながることを示している。ＨＥＲ２ヘテロオリゴマー化を介した受容体の活性化は、ＨＥＲ２過剰発現細胞で観察される細胞増殖を促進する重要なメカニズムである可能性がある（Ｗｏｌｆ－Ｙａｄｌｉｎ Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００６），Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．２（１）：５４）。
抗ＨＥＲ２指向型療法
ＨＥＲ２を阻害するための多くの異なるアプローチが試みられており、これらの多くが臨床診療に入っている。
（ｉ）ＨＥＲ２のドメインＩＶに対するモノクローナル抗体：ＨＥＲ２阻害への初期のアプローチでは、細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体が使用されていたが、その卓越した例はトラスツズマブである（Ａｌｂａｎｅｌｌ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（１９９９），Ｄｒｕｇｓ Ｔｏｄａｙ（Ｂａｒｃ），３５（１２）：９３１－４６）。他の抗ＨＥＲ２抗体もまた、例えば、Ｋｏ Ｂ－Ｋ．ｅｔ ａｌ．，（２０１５），Ｍｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．９（２）：３９８－４０８；Ｍａｈｄａｖｉ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（２０１５），Ｍｏｎｏｃｌｏｎ Ａｎｔｉｂ Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，３４（３）：２１３－２１；Ｃｅｒａｎ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，（２０１２），Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，６（２）：１１７－２７に記載されている。
（ｉｉ）ＨＥＲ２のドメインＩＩに対する抗体：ＨＥＲ二量体化阻害剤として知られるファースト・イン・クラスの薬剤であるペルツズマブ（Ａｄａｍｓ ＣＷ．ｅｔ ａｌ．，（２００６），５５（６）：７１７－２７）はＨＥＲ２の細胞外二量体化ドメインＩＩ（トラスツズマブのエピトープとは異なるエピトープ）に結合して、ＨＥＲ受容体間の二量体化を阻害する（Ａｄａｍｓ ＣＷ、上記）。
（ｉｉｉ）ＨＥＲ２の小分子阻害剤：ＨＥＲ２を標的とする小分子阻害剤が開発されている。多くは、ＥｒｂＢファミリーの他のメンバーを含む多くの受容体を標的とし、それは、副次的なシグナル伝達がＨＥＲ２阻害剤に対する耐性のメカニズムの１つであり得るので有利であり得る（Ｒｉｔｔｅｒ ＣＡ．ｅｔ ａｌ．，（２００７），Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３（１６）：４９０９－１９）。２つの承認されたチロシンキナーゼ阻害剤がある；ラパチニブは、ＥＧＦＲキナーゼとＨＥＲ２キナーゼの双方を阻害する経口小分子可逆的阻害剤であり（Ｔｅｖａａｒｗｅｒｋ ＡＪ．ｅｔ ａｌ．，（２００９），Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒ．３１：２３３２－４８）、アファチニブはＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及びＨＥＲ４のチロシンキナーゼ活性ならびにＥＧＦＲ含有二量体及びＨＥＲ２含有二量体の不可逆的阻害剤である（Ｌｉ Ｄ．ｅｔ ａｌ．，（２００８），Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２７（３４）：４７０２－１１）。ネラチニブは、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、及びＨＥＲ４の不可逆的な汎チロシンキナーゼ阻害剤である。それは、ＨＥＲ２過剰発現及びＥＧＦＲ増幅の細胞の下流シグナル伝達に影響を及ぼし、アポトーシス及び腫瘍増殖低下をもたらすと思われる（Ｒａｂｉｎｄｒａｎ ＳＫ．ｅｔ ａｌ．，（２００４），Ｃａｎ．Ｒｅｓ．６４（１１）：３９５８－６５）。ツカチニブは選択的経口ＨＥＲ２阻害剤である（Ｍｏｕｌｄｅｒ－Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，（２０１７），Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．ｃｌｉｎｃａｎｒｅｓ，１４９６．２０１６）。
（ｉｖ）ＨＥＲ２を標的とする抗体薬物複合体：ＨＥＲ２陽性がん細胞での高発現及び正常組織での低発現はそれを抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の標的としている。Ａｄｏ－トラスツズマブエムタンシン（Ｔ－ＤＭ１）は固形腫瘍で承認された最初の抗ＨＥＲ２のＡＤＣである。それは、微小管二量体化の阻害剤である強力な細胞傷害剤ＤＭ１に連結されたトラスツズマブで構成されている。Ｔ－ＤＭ１の抗腫瘍効果はトラスツズマブ及びＤＭ１代謝物に関連している（Ｊｕｎｔｉｌｌａ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，（２０１１），Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．１２８（２）：３４７－５６）。ＤＭ１代謝物は微小管ネットワークを破壊し、細胞周期の停止及びアポトーシス細胞死につながる。Ｔ－ＤＭ１はＨＥＲ２を高度に発現する腫瘍で最大の効果を示す一方で、さまざまなＨＥＲ２発現亜群に対して有効性を示す（Ｂａｓｅｌｇａ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２０１６），Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．ｃｌｉｎｃａｎｒｅｓ，２４９９．０１５）。ＡＤＣ ＭＭ－３０２はリポソームドキソルビシンに連結されたＨＥＲ２標的化抗体で構成されている。ＳＹＤ９８５は、有毒なアルキル化剤抗生物質デュオカルマイシンに連結された別のＨＥＲ２を標的とするトラスツズマブ系のＡＤＣである（Ｄｏｋｔｅｒ Ｗ．ｅｔ ａｌ．，（２０１４），Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１３（１１）：２６１８－２９）。ＤＳ－８２０１ａは、トポイソメラーゼＩ阻害剤に連結されたヒト化抗ＨＥＲ２抗体で構成されるＨＥＲ２を標的とするＡＤＣである（Ｏｇｉｔａｎｉ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，（２０１６），Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２２（２０）：５０９７－１０８）。ＸＭＴ－１５２２は、オーリスタチン系の細胞傷害性ペイロード（ＡＦ－ＨＰＡ）に連結された抗ＨＥＲ２抗体、ＨＴ－１９を含む抗ＨＥＲ２のＡＤＣである（Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ Ｄ．ｅｔ ａｌ．，（２０１６），Ｃａｎ．Ｒｅｓ．７６（４ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ），Ｐ４－１４－２８）。
（ｖ）モノクローナル抗体：臨床現場では多くの新しい抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体が開発されており、これらには１０Ｈ８及び８Ｈ１１（Ｋｉｍ ＡＹ．ｅｔ ａｌ．，（２０１３）ＡＳＣＯ年次総会の議事録）、Ｆｃが最適化されたキメラ抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体であるＭＧＡＨ２２（マルゲツキシマブ）、ＨＥＲ２を標的とする三機能性抗体であるエルツマクソマブ、Ｔ細胞特異的ＣＤ３抗原及びＦｃγＩ／ＩＩＩ型受容体；ならびにトラスツズマブのバイオ後続医薬品であるＣＭＡＢ３０２（シプテルビン）が挙げられる。
（ｖｉ）二重特異性抗体：ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体を標的とする二重特異性抗体ＭＭ－１１１が開発されている（ＭｃＤｏｎａｇｈ ＣＦ．ｅｔ ａｌ．，（２０１２），Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１１（３）：５８２－９３）。ファースト・イン・ヒューマンの初期段階試験の多くは、ＨＥＲ２陽性固形腫瘍において単剤療法として、またトラスツズマブと種々の化学療法投薬計画またはラパチニブとの併用でＭＭ－１１１を評価している。ＭＭ－１１１は消化管の悪性腫瘍でも研究されている。ＭＣＬＡ－１２８は、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３を標的とするＡＤＣＣ活性が増強されたヒト化二重特異性抗体である（Ｃａｌｖｏ Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ａｂｓｔｒａｃｔ ＣＴ０５０ ＡＡＣＲ，２０１６）。ＭＣＬＡ－１２８は、ヘレグリン濃度が高い場合でもＨＥＲ２：Ｈｅｒ３ヘテロ二量体を介した下流のシグナル伝達を遮断する。ＧＢＲ １３０２は、ＨＥＲ２過剰発現及び非過剰発現の腫瘍で強力な抗腫瘍活性を示した後、初期段階の臨床試験で評価されているＣＤ３εとＨＥＲ２とを標的とする別の二重特異性抗体である （Ｍｏｒｅｔｔｉ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，（２０１６），ｔｈｅ ＢＥＡＴ ＧＢＲ，１３０２）。ＺＷ２５は、ＨＥＲ２受容体の細胞外ドメイン上の２つの異なるエピトープを標的とする二重特異性抗体であり、現在、第１相臨床試験においてＨＥＲ２を発現しているがんで評価されている。ジフテリア毒素－抗ＥｐＣＡＭに融合した抗ＨＥＲ２単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含むさらなる二重特異性免疫毒素が開発されている。
種々のアプローチにもかかわらず、まだ難題がある。単剤トラスツズマブに対する一次耐性は、ＨＥＲ２過剰発現乳癌の７０％で発生し（Ｖｏｇｅｌ ＣＬ．ｅｔ ａｌ．（２００２），２０（３）：７１９－２６）、大多数の患者が治療中に耐性を発症する。いくつかのメカニズムが提案されている（上記のＰａｒａｋｈ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，を参照のこと）。トラスツズマブとは対照的に、ペルツズマブに対する耐性のメカニズムはよくわかっていない。他の抗ＨＥＲ２療法と同様に、Ｔ－ＤＭ１に対する一次及び後天性の耐性も発生している（Ｔａｎ Ｘ．ｅｔ ａｌ．，（２０１３），Ｃａｎ．Ｒｅｓ．７３（８，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）：４６２９）。Ｔ－ＤＭ１に対する耐性メカニズムは腫瘍のサイズ及び治療期間に依存していると思われる一方で、長い潜伏期間の後でさえ耐性は観察されている（Ｂａｒｏｋ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（２０１１），Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３（２）：Ｒ４６）。
トラスツズマブ（ハーセプチン）、ペルツズマブ、及びＴ－ＤＭ１複合体の成功にもかかわらず、現在のＨＥＲ２抗体の毒性は用量制限であり、上記で議論したように耐性が常に発生する。関連する毒性プロファイルなしでＨＥＲ２を標的とする新しい戦略が明らかに必要とされている。
オーストラリア仮特許出願番号ＡＵ２０１９９００９７３
Ｎａｇａｒａｊａ Ｖ．ｅｔ ａｌ．，（２０１６） Ｅｕｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．４２（１）：１４０－８ Ｓｌａｍｏｎ ＤＪ．ｅｔ ａｌ．，（１９８７），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５｛４７８５）：１７７－８２ Ｓａｎｔｉｎ ＡＤ．ｅｔ ａｌ．，（２００５），Ｃａｎｃｅｒ，１０４（７）：１３９１－７ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，（２００６），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２４（１５）：２３７６－８５ Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，（２０１０），Ｊ．Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｏｎｃｏｌ．５（１２）：１９２２－３２ Ｐａｒａｋｈ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，（２０１７），Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｒｅｖｉｅｗｓ，５９：１－２１ Ｋｌａｐｐｅｒ ＬＮ．ｅｔ ａｌ．，（１９９９），ＰＮＡＳ，９６（９）：４９９５－５０００ Ｇａｒｒｅｔｔ ＴＰ．ｅｔ ａｌ．，（２００２），Ｃｅｌｌ，１１０（６）：７６３－７３ Ｃｈｏ Ｈ－Ｓ．ｅｔ ａｌ．，（２００３），Ｎａｔｕｒｅ，４２１（６９２４）：７５６－６０ Ｍａｒｕｙａｍａ ＩＮ．ｅｔ ａｌ．，（２０１４），Ｃｅｌｌｓ，３（２）：３０４－３０ Ｈｕａｎｇ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，（１９９９），Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．７４（１）：２３－３０ Ｔｚａｈａｒ Ｅ．ｅｔ ａｌ．，（１９９６），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６（１０）：５２７６－８７ Ｐｉｎｋａｓ－Ｋｒａｍａｒｓｋｉ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，（１９９６），ＥＭＢＯ Ｊ．１５（１０）：２４５２ Ｗｏｌｆ－Ｙａｄｌｉｎ Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００６），Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．２（１）：５４ Ａｌｂａｎｅｌｌ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（１９９９），Ｄｒｕｇｓ Ｔｏｄａｙ（Ｂａｒｃ），３５（１２）：９３１－４６ Ｋｏ Ｂ－Ｋ．ｅｔ ａｌ．，（２０１５），Ｍｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．９（２）：３９８－４０８ Ｍａｈｄａｖｉ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（２０１５），Ｍｏｎｏｃｌｏｎ Ａｎｔｉｂ Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，３４（３）：２１３－２１ Ｃｅｒａｎ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，（２０１２），Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，６（２）：１１７－２７ Ａｄａｍｓ ＣＷ．ｅｔ ａｌ．，（２００６），５５（６）：７１７－２７ Ｒｉｔｔｅｒ ＣＡ．ｅｔ ａｌ．，（２００７），Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３（１６）：４９０９－１９ Ｔｅｖａａｒｗｅｒｋ ＡＪ．ｅｔ ａｌ．，（２００９），Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒ．３１：２３３２－４８ Ｌｉ Ｄ．ｅｔ ａｌ．，（２００８），Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２７（３４）：４７０２－１１ Ｒａｂｉｎｄｒａｎ ＳＫ．ｅｔ ａｌ．，（２００４），Ｃａｎ．Ｒｅｓ．６４（１１）：３９５８－６５ Ｍｏｕｌｄｅｒ－Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，（２０１７），Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．ｃｌｉｎｃａｎｒｅｓ，１４９６．２０１６ Ｊｕｎｔｉｌｌａ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，（２０１１），Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．１２８（２）：３４７－５６ Ｂａｓｅｌｇａ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２０１６），Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．ｃｌｉｎｃａｎｒｅｓ，２４９９．０１５ Ｄｏｋｔｅｒ Ｗ．ｅｔ ａｌ．，（２０１４），Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１３（１１）：２６１８－２９ Ｏｇｉｔａｎｉ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，（２０１６），Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２２（２０）：５０９７－１０８ Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ Ｄ．ｅｔ ａｌ．，（２０１６），Ｃａｎ．Ｒｅｓ．７６（４ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ），Ｐ４－１４－２８ Ｋｉｍ ＡＹ．ｅｔ ａｌ．，（２０１３）ＡＳＣＯ年次総会の議事録 ＭｃＤｏｎａｇｈ ＣＦ．ｅｔ ａｌ．，（２０１２），Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１１（３）：５８２－９３ Ｃａｌｖｏ Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ａｂｓｔｒａｃｔ ＣＴ０５０ ＡＡＣＲ，２０１６ Ｍｏｒｅｔｔｉ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，（２０１６），ｔｈｅ ＢＥＡＴ ＧＢＲ，１３０２ Ｖｏｇｅｌ ＣＬ．ｅｔ ａｌ．（２００２），２０（３）：７１９－２６ Ｔａｎ Ｘ．ｅｔ ａｌ．，（２０１３），Ｃａｎ．Ｒｅｓ．７３（８，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）：４６２９ Ｂａｒｏｋ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（２０１１），Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３（２）：Ｒ４６
本開示は、ドメインＩＩの立体構造的に柔軟な領域にてＨＥＲ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に結合する単離された特異的結合タンパク質を提供する。特に、結合タンパク質は、野生型ＨＥＲ２配列からのアミノ酸配列の変化または置換を示さず、且つＨＥＲ２の増幅または活性化に応答して細胞にて露出されるＨＥＲ２エピトープを認識する。立体構造上露出されたエピトープは、腫瘍形成性細胞、過剰増殖性細胞、または異常な細胞にのみ見られ、正常細胞または野生型細胞では検出できない。「野生型」とは、内在性ＨＥＲ２を発現する細胞を企図しているが、ＨＥＲ２遺伝子を過剰発現する細胞を特に除外する；「野生型」という用語は、異常な細胞または腫瘍形成性細胞ではなく正常な細胞に存在する遺伝子型または表現型または他の特徴を指す。
興味深いことに、本開示の結合タンパク質が、がん細胞上のＨＥＲ２へのペルツズマブまたはトラスツズマブ／ハーセプチンの結合を阻止しないということは、ドメインＩＩのこのエピトープ領域は立体構造上露出されると、これらの抗体の結合を阻止することなく本結合分子が結合することを可能し、二重療法アプローチを可能にする可能性があることを示唆している。
さらに具体的には、本発明者らは、本結合分子ががん細胞表面上のＨＥＲ２のさらに少ない割合に結合する（例えば、ペルツズマブまたはトラスツズマブと比較した場合）一方で、結合する受容体が少ないにもかかわらず、ペルツズマブまたはトラスツズマブと同等の濃度にて生体内で同様に強力であることを見いだした。本開示の結合分子は内部移行し、腫瘍細胞特異的であるので、それらは、他のＨＥＲ２抗体との二重療法アプローチにおける薬物複合体または薬剤として理想的に適している。
抗体またはその免疫原性断片のようなその断片であってもよい本開示の特異的結合タンパク質は、異常な発現の非存在下、且つ正常なＨＥＲ２翻訳後修飾の存在下にて正常なまたは野生型のＨＥＲ２エピトープを含有する正常細胞または野生型細胞に結合しない、またはそれを認識しない。さらに具体的には、本発明の特異的結合タンパク質は、特に異常な翻訳後修飾の存在下にてＨＥＲ２を過剰発現する（例えば、ＨＥＲ２遺伝子が増幅される）細胞に存在する、且つ正常な条件下で、特に正常な翻訳後修飾の存在下にてＨＥＲ２を発現する細胞では検出できない、ＨＥＲ２エピトープを認識する抗体またはその断片であってもよい。
本発明者らは、異常に発現されたＨＥＲ２を特異的に認識する、ｍＡｂ１０４と称される抗体によって本明細書に例示される新規のモノクローナル抗体を発見した。特に、本開示の抗体は、腫瘍形成性細胞、過剰増殖性細胞または異常な細胞に見いだされ、正常細胞または野生型細胞では検出できないＨＥＲ２エピトープを認識する。本開示の抗体はさらに、本明細書に記載されている抗体ｍＡｂ１０５、ｍＡｂ１０６及びｍＡｂ１０７によって例示される。
本開示は、抗原結合ドメインを含むＨＥＲ２／ＥｒｂＢ結合タンパク質を提供し、その際、抗原結合ドメインは、ＨＥＲ２の増幅または活性化に応答して露出されるＨＥＲ２のドメインＩＩ内のエピトープに特異的に結合する。一例では、ＨＥＲ２結合タンパク質は、腫瘍形成性細胞、過剰増殖性細胞または異常な細胞では立体構造上露出されているが、正常細胞または野生型細胞では露出されていないＨＥＲ２の領域に結合する。
別の例では、結合タンパク質のそのエピトープへの結合はペルツズマブまたはトラスツズマブ／ハーセプチンの結合を阻止しない。一例では、結合タンパク質は、ペルツズマブまたはトラスツズマブではない。一例では、結合タンパク質は、図１（配列番号２７）に示されるような成熟した正常なまたは野生型のヒトＨＥＲ２配列の残基２９３から３０９を含む領域に結合する。この領域はＨＥＲ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）にてドメインＩＩの一部を形成する。特定の例では、エピトープはアミノ酸配列ＣＰＬＨＮＱＥＶＴＡＥＤＧＴＱＲＣ（配列番号１）を含む。このエピトープは太字で下線が引かれた配列として図１に示されている。このエピトープには、ペルツズマブが結合するエピトープにも存在するＰ２９４、Ｌ２９５、及びＨ２９６が含まれるが、現在説明されている結合タンパク質はペルツズマブ阻止ではなく、ペルツズマブがＨＥＲ２を同時に結合することを可能にする。エピトープは、当業者に知られている任意の従来のエピトープマッピング技術によって決定されてもよい。
一例では、結合タンパク質は、ヒトＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）またはＨＥＲ３またはＨＥＲ４に結合しない、または実質的に結合しない。
一例では、結合タンパク質は本発明者らが同定し、及び特徴付けた抗体の特徴を有するものであり、特に、増幅されたＨＥＲ２に見られるような異常に発現されたＨＥＲ２を認識するものである。別の例では、結合タンパク質は高レベルのＨＥＲ２を発現している腫瘍細胞株に結合する。一例では、ＨＥＲ２の過剰発現は免疫組織化学的分析を使用して決定される。特定の例では、染色パターンは、米国臨床腫瘍学会及び米国病理医協会（ＡＳＣＯ／ＣＡＰ）の乳癌におけるＨＥＲ２検査に関する推奨事項を使用して評価し、スコア化する（Ｗｏｌｆｆ ＡＣ．ｅｔ ａｌ．（２０１３），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，３１（３１）：３９９７－４０１３）。
別の例では、結合タンパク質は、乳癌、胃癌、扁平上皮癌、及び結腸癌から成る群から選択されるがん性細胞に結合する。別の例では、結合タンパク質は乳癌（例えば、ＢＴ４７４、ＳＫ－ＢＲ３、ＳＵＭ１５９ＰＴ、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３）、胃癌（例えば、ＮＣＩ－Ｎ８７、ＭＫ Ｎ７）、扁平上皮癌（例えば、Ａ４３１）及び結腸癌（ＣＯＬＯ２０５、ＬＩＭ１２１５）から成る群から選択される細胞株に結合する。
別の例では、結合タンパク質はペルツズマブ及び／またはトラスツズマブと比べて、がん細胞の細胞表面上のＨＥＲ２／ＥｒｂＢのさらに少ない割合を結合する。別の例では、結合タンパク質はフローサイトメトリーによって評価した場合、トラスツズマブまたはペルツズマブの結合より少なくとも１ログを下回る、少なくとも２ログを下回る、または少なくとも３ログを下回る桁違いでＨＥＲ２＋発現細胞に結合する。特定の例では、結合タンパク質はがん細胞の表面に発現される総ＨＥＲ２／ＥｒＢ２の３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満に結合する。一例では、結合タンパク質はがん細胞の表面に発現される総ＨＥＲ２／ＥｒＢ２の約０．３５～０．５％の間のＨＥＲ２／ＥｒＢ２の割合に結合する。
一例では、結合タンパク質は正常な胃粘膜に結合しない。別の例では、結合タンパク質は正常な乳腺細胞に結合しない。
別の例では、結合タンパク質は腫瘍細胞に内部移行することができる。特定の例では、結合タンパク質は、腫瘍細胞（例えば、胃細胞）に対して生体内で抗増殖効果を有する。他の例では、結合タンパク質はペルツズマブまたはトラスツズマブのものに匹敵する生体内での抗腫瘍効果を有する。さらに別の例では、結合タンパク質は、腫瘍細胞（例えば、乳腺腫瘍細胞）の壊死を引き起こす。
そのような結合特性を有する本明細書に記載されている例示的なＨＥＲ２結合タンパク質は、ｍＡｂ１０４またはｍＡｂ１０６と呼ばれる抗体の可変領域及び／またはＣＤＲを含む。
一例では、結合タンパク質は、配列番号１に示される配列を含む、またはそれから成るペプチドに結合する、あるいはｍＡｂ１０４もしくはｍＡｂ１０６と名付けられた抗体と類似するもしくは実質的に同じレベルで、またはそれと類似するもしくは実質的同じ親和性でヒトＨＥＲ２ ＥＣＤにおける配列に結合する。一例では、結合タンパク質は、図１に示されるような成熟した正常なまたは野生型のヒトＨＥＲ２配列の残基２９３～３０９を含むまたはそれらから成るアミノ酸の連続配列に結合する。
別の例では、ＨＥＲ２結合タンパク質はｍＡｂ１０４またはｍＡｂ１０６と名付けられた抗体のヒトＨＥＲ２への結合を競合して阻害する。さらなる例では、タンパク質は配列番号１に示される配列から成るペプチドへのｍＡｂ１０４またはｍＡｂ１０６と呼ばれる抗体の結合を競合して阻害する。
一例では、ＨＥＲ２結合タンパク質は、配列番号２または配列番号４に示す配列を含むＶＨと配列番号３または配列番号５に示す配列を含むＶＬとを含む抗体が結合する量の７５％以内の量で、配列番号１に示す配列を含む、またはそれから成るペプチドに結合する。
一例では、結合しているタンパク質または抗体の量は、配列番号１に示す配列から成るペプチドにＨＥＲ２結合タンパク質を接触させることによって、及びペプチドに接触させたＨＥＲ２結合タンパク質の量（例えば、１０μｇ／ｍｌ）によって評価される。次に、ペプチドに結合したＨＥＲ２結合タンパク質の量を決定し、ペプチドに結合した、それぞれ配列番号２または配列番号４に示す配列を含むＶＨと配列番号３または配列番号５に示す配列を含むＶＬとを含む抗体の量と比較する。一例では、ペプチドに結合しているＨＥＲ２結合タンパク質の量は結合している抗体の量の約８０％、または７０％、または６０％、または４０％以内である。
本開示はまた、以下の名称の抗体：
（ｉ）配列番号２に示す配列を含むＶＨと配列番号３に示す配列を含むＶＬとを含むｍＡｂ１０４前記抗体；または
（ｉｉ）配列番号４に示す配列を含むＶＨと配列番号５に示す配列を含むＶＬとを含むｍＡｂ１０６の配列番号１に示す配列を含むもしくはそれから成るペプチド、またはヒトＨＥＲ２のＥＣＤ（例えば、図１）に対する結合を競合して阻害するＨＥＲ２結合タンパク質も提供する。
一例では、ＨＥＲ２結合タンパク質は、例えば、図１に示されるような配列を有するＨＥＲ２のＥＣＤに２．９０～３．２０ｎＭの間の親和性解離定数（ＫＤ）で結合する。別の例では、ＫＤは約２．９０～約３ｎＭの間である。別の例では、ＫＤは約３ｎＭである。
一例では、ＫＤは、ストレプトアビジン（ＳＡ）チップを備えたバイオセンサーにて表面プラスモン共鳴を利用し、チップの表面上にビオチン結合ヒトＨＥＲ２ペプチド（例えば、配列番号１に係るペプチド）を捕捉し、それにＨＥＲ２結合タンパク質を通すことによって評価される。
本開示の例示的なＨＥＲ２結合タンパク質は、ＳＡチップビオチンペプチドＳＰＲによって評価した場合、約３ｎＭ（例えば、±０．２ｎＭ）のＫＤを有する。一例では、ＨＥＲ２結合タンパク質は、ｍＡｂ１０４またはｍＡｂ１０６について表７に示すようなＫＤを有する。
一例では、本開示のＨＥＲ２結合タンパク質はヒトＨＥＲ２に特異的に結合する。一例では、タンパク質の結合はＥＬＩＳＡによって評価される。
本開示のヒトＨＥＲ２結合タンパク質は、抗ＨＥＲ２組換え抗体もしくは合成抗体もしくはモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であってもよい。
一例では、ＨＥＲ２結合タンパク質は、ヒト重鎖及び軽鎖の定常領域配列を含むキメラ抗体である。別の例では、ＨＥＲ２結合タンパク質はヒト化抗体または完全ヒト抗体である。
一例では、ＨＥＲ２結合タンパク質は、ｍＡｂ１０４の重鎖可変領域配列（配列番号２）に対して少なくとも５５％の同一性を有する重鎖可変領域配列（ＶＨ）を含む。
一例では、ＨＥＲ２結合タンパク質は、ｍＡｂ１０４の軽鎖可変領域配列（配列番号３）に対して少なくとも５０％の同一性を有する軽鎖可変領域配列（ＶＬ）を含む。
一例では、結合タンパク質は以下を含む：
（ｉ）以下のように示される配列を有するＶＨ ＣＤＲ１：
Figure 2022529232000001
 配列中、Ｘ７はＳまたはＴであり；Ｘ８はＧまたはＤであり；Ｘ９はＦまたはＧであり；Ｘ１０はＨまたはＮである；
（ｉｉ）以下のように示される配列を有するＶＨ ＣＤＲ２：
Figure 2022529232000002
 配列中、Ｘ１９はＲまたはＷであり；Ｘ２０はＰまたはＴであり；Ｘ２１はＮまたはＴであり；Ｘ２２はＤまたはＫであり；Ｘ２３はＩまたはＰであり；Ｘ２４はＲまたはＴであり；Ｘ２５はＮまたはＤであり；Ｘ２６はＱまたはＤであり；Ｘ２７はＮまたはＤであり；及びＸ２８はＤまたはＧである；
（ｉｉｉ）以下のように示される配列を有するＶＨ ＣＤＲ３：
Figure 2022529232000003
 配列中、Ｘ５０は存在しない、またはＲであり；Ｘ５１は存在しない、またはＦであり；Ｘ５２は存在しない、またはＬであり；Ｘ５３は存在しない、またはＮであり；Ｘ５４は存在しない、またはＴであり；Ｘ５５は存在しない、またはＶであり；Ｘ５６は存在しない、またはＡであり；Ｘ５７は存在しない、またはＧであり；Ｘ５８は存在しない、またはＲであり；Ｘ５９は存在しない、またはＳであり；Ｘ６０はＬまたはＶであり；Ｘ６１はＮまたはＹであり；Ｘ６２はＡまたはＤである；
及び／または、
（ｉｖ）以下のように示される配列を有するＶＬ ＣＤＲ１：
Figure 2022529232000004
 配列中、Ｘ１４はＫまたはＳであり；Ｘ１５はＳまたはＶであり；Ｘ１６はＱまたはＳであり；Ｘ１７はＬまたは存在しない；Ｘ１８はＬまたは存在しない；Ｘ１９はＤまたは存在しない；Ｘ２０はＳまたは存在しない；Ｘ２１はＤまたは存在しない；Ｘ２２はＧまたは存在しない；Ｘ２３はＫまたはＶであり；Ｘ２４はＴまたはＧであり；Ｘ２５はＦまたはＳであり；Ｘ２６はＬまたはＭであり；Ｘ２７はＮまたはＹである；
（ｖ）以下のように示される配列を有するＶＬ ＣＤＲ２：
Figure 2022529232000005
 Ｘ３５はＤまたはＥであり；Ｘ３６はＫまたはＴであり；Ｘ３７はＳまたはＡである；及び
（ｖｉ）以下のように示される配列を有するＶＬ ＣＤＲ３：
Figure 2022529232000006
 配列中、Ｘ４９はＷまたはＱであり；Ｘ５０はＧまたはＷであり；Ｘ５１はＴまたはＳであり；Ｘ５２はＨまたはＳであり；Ｘ５３はＦまたはＮであり；Ｘ５４はＷまたはＰである。
一例では、ＨＥＲ２結合タンパク質は以下に示される重鎖可変領域配列（ＶＨ）配列を含む。
Figure 2022529232000007
 配列中、
Ｘ１はＥまたはＱであり；Ｘ２はＶまたはＩであり；Ｘ３はＱまたはＶであり；Ｘ４はＶまたはＫであり；Ｘ５はＡまたはＥであり；Ｘ６はＳまたはＴであり；Ｘ７はＳまたはＴであり；Ｘ８はＧまたはＤであり；Ｘ９はＦまたはＧであり；Ｘ１０はＨまたはＮであり；Ｘ１１はＲまたはＫであり；Ｘ１２はＳまたはＡであり；Ｘ１３はＨまたはＰであり；Ｘ１４はＶまたはＧであり；Ｘ１５はＲまたはＫであり；Ｘ１６はＳまたはＧであり；Ｘ１７はＥまたはＫであり；Ｘ１８はＩまたはＭであり；Ｘ１９はＲまたはＷであり；Ｘ２０はＰまたはＴであり；Ｘ２１はＮまたはＴであり；Ｘ２２はＤまたはＫであり；Ｘ２３はＩまたはＰであり；Ｘ２４はＲまたはＴであり；Ｘ２５はＮまたはＤであり；Ｘ２６はＱまたはＤであり；Ｘ２７はＮまたはＤであり；Ｘ２８はＤまたはＧであり；Ｘ２９はＫまたはＲであり；Ｘ３０はＡまたはＦであり；Ｘ３１はＳまたはＡであり；Ｘ３２はＬまたはＦであり；Ｘ３３はＴまたはＳであり；Ｘ３４はＶまたはＬであり；Ｘ３５はＤまたはＥであり；Ｘ３６はＫまたはＴであり；Ｘ３７はＳまたはＡであり；Ｘ３８はＭまたはＬであり；Ｘ３９はＥまたはＱであり；Ｘ４０はＬまたはＩであり；Ｘ４１はＨまたはＮであり；Ｘ４２はＲまたはＮであり；Ｘ４３はＴまたはＫであり；Ｘ４４はＳまたはＮであり；Ｘ４５はＳまたはＭであり；Ｘ４６はＶまたはＴであり；Ｘ４７はＦまたはＹであり；Ｘ４８はＹまたはＦであり；Ｘ４９はＳまたはＲであり；Ｘ５０は存在しない、またはＲであり；Ｘ５１は存在しない、またはＦであり；Ｘ５２は存在しない、またはＬであり；Ｘ５３は存在しない、またはＮであり；Ｘ５４は存在しない、またはＴであり；Ｘ５５は存在しない、またはＶであり；Ｘ５６は存在しない、またはＡであり；Ｘ５７は存在しない、またはＧであり；Ｘ５８は存在しない、またはＲであり；Ｘ５９は存在しない、またはＳであり；Ｘ６０はＬまたはＶであり；Ｘ６１はＮまたはＹであり；Ｘ６２はＡまたはＤであり；Ｘ６３はＰまたはＴであり；Ｘ６４はＶまたはＬであり；Ｘ６５はＡまたはＳである。
一例では、ＨＥＲ２結合タンパク質はさらに、以下に示す軽鎖可変領域配列（ＶＬ）配列を含む。
Figure 2022529232000008
 配列中、
Ｘ１はＤまたはＱであり；Ｘ２はＩまたはＬであり；Ｘ３はＬまたはＡであり；Ｘ４はＴまたはＬであり；Ｘ５はＬまたはＭであり；Ｘ６はＴまたはＳであり；Ｘ７はＦまたはＰであり；Ｘ８はＱまたはＥであり；Ｘ９はＰまたはＫであり；Ｘ１０はＡまたはＶであり；Ｘ１１はＳまたはＴであり；Ｘ１２はＩまたはＭであり；Ｘ１３はＳまたはＴであり；Ｘ１４はＫまたはＳであり；Ｘ１５はＳまたはＶであり；Ｘ１６はＱまたはＳであり；Ｘ１７はＬまたは存在しない；Ｘ１８はＬまたは存在しない；Ｘ１９はＤまたは存在しない；Ｘ２０はＳまたは存在しない；Ｘ２１はＤまたは存在しない；Ｘ２２はＧまたは存在しない；Ｘ２３はＫまたはＶであり；Ｘ２４はＴまたはＧであり；Ｘ２５はＦまたはＳであり；Ｘ２６はＬまたはＭであり；Ｘ２７はＮまたはＹであり；Ｘ２８はＬまたはＹであり；Ｘ２９はＬまたはＱであり；Ｘ３０はＲまたはＫであり；Ｘ３１はＧまたはＲであり；Ｘ３２はＱまたはＳであり；Ｘ３３はＲまたはＰであり；Ｘ３４はＬまたはＷであり；Ｘ３５はＶまたはＴであり；Ｘ３６はＫまたはＮであり；Ｘ３７はＤまたはＡであり；Ｘ３８はＤまたはＰであり；Ｘ３９はＴまたはＳであり；Ｘ４０はＤまたはＳであり；Ｘ４１はＦまたはＹであり；Ｘ４２はＴまたはＳであり；Ｘ４３はＫまたはＴであり；Ｘ４４はＲまたはＳであり；Ｘ４５はＶまたはＭであり；Ｘ４６はＬまたはＡであり；Ｘ４７はＧまたはＡであり；Ｘ４８はＶまたはＴであり；Ｘ４９はＷまたはＱであり；Ｘ５０はＧまたはＷであり；Ｘ５１はＴまたはＳであり；Ｘ５２はＨまたはＳであり；Ｘ５３はＦまたはＮであり；Ｘ５４はＷまたはＰであり；Ｘ５５はＧまたはＡであり；Ｘ５６はＩまたはＬである。
一例では、ＶＨはＧＹＳＦＴＧＹＦＭＨ（配列番号１４）またはＧＹＴＦＴＤＹＧＭＮ（配列番号１５）から選択されるＣＤＲ１配列を含む、またはそれから成る。
一例では、ＶＨはＲＩＮＰＹＮＧＤＩＲＹＮＱＮＦＫＤ（配列番号１６）またはＷＩＮＴＹＴＧＫＰＴＹＤＤＤＦＫＧ（配列番号１７）から選択されるＣＤＲ２配列を含む、またはそれから成る。
一例では、ＶＨはＬＮＦＡＹ（配列番号１８）またはＲＦＬＮＴＶＡＧＲＳＶＹＦＤＹ（配列番号１９）から選択されるＣＤＲ３配列を含む、またはそれから成る。
一例では、ＶＬはＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＦＬＮ（配列番号２０）またはＳＶＳＳＳＶＧＳＭＹ（配列番号２１）から選択されるＣＤＲ１配列を含む、またはそれから成る。
一例では、ＶＬはＬＶＳＫＬＤＳ（配列番号２２）またはＬＴＳＮＬＡＳ（配列番号２３）から選択されるＣＤＲ２配列を含む、またはそれから成る。
一例では、ＶＬはＷＱＧＴＨＦＰＷＴ（配列番号２４）またはＱＱＷＳＳＮＰＰＴ（配列番号２５）から選択されるＣＤＲ３配列を含む、またはそれから成る。
本開示はそれぞれ：
（ｉ）配列番号１４、配列番号１６及び配列番号１８；または
（ｉｉ）配列番号１５、配列番号１７、及び配列番号１９を含む、またはそれらから成るＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列を有する重鎖可変領域配列（ＶＨ）を含むＨＥＲ２結合タンパク質も提供する。
本開示はそれぞれ：
（ｉ）配列番号２０、配列番号２２及び配列番号２４；または
（ｉｉ）配列番号２１、配列番号２３、及び配列番号２５を含む、またはそれらから成るＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列を有する軽鎖可変領域配列（ＶＬ）を含むＨＥＲ２結合タンパク質も提供する。
一例では、ＨＥＲ２結合タンパク質は配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、及び／または配列番号２０、配列番号２２及び配列番号２４を含む、またはそれらから成る配列を有するＣＤＲを含む。
一例では、ＨＥＲ２結合タンパク質は配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、及び／または配列番号２１、配列番号２３及び配列番号２５を含む、またはそれらから成る配列を有するＣＤＲを含む。
一例では、ＨＥＲ２結合タンパク質は、配列番号２に示す配列と少なくとも５５％同一である配列を含むＶＨ、及び／または配列番号３に示す配列と少なくとも５０％同一である配列を含むＶＬまたはそのヒト化型、キメラ型もしくは脱免疫化型を含む。
一例では、ＨＥＲ２結合タンパク質は、配列番号４に示す配列と少なくとも５５％同一である配列を含むＶＨ、及び／または配列番号５に示す配列と少なくとも５０％同一である配列を含むＶＬまたはそのヒト化型、キメラ型もしくは脱免疫化型を含む。
一例では、ＶＨは配列番号２または配列番号４と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または９９．５％同一である配列を含む。
一例では、ＶＬは配列番号３または配列番号５と少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または９９．５％同一である配列を含む。
本開示は：
（ｉ）配列番号２に示すＶＨ及び配列番号３に示すＶＬ；または
（ｉｉ）配列番号４に示すＶＨ及び配列番号５に示すＶＬを含む、またはそれらから成るＨＥＲ２結合タンパク質も提供する。
一例では、ＨＥＲ２結合タンパク質は、
（ｉ）単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）；
（ｉｉ）二量体ｓｃＦｖ（ｄｉ－ｓｃＦｖ）；
（ｉｉｉ）重鎖定常領域またはＦｃまたは重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／またはＣＨ３に連結された（ｉ）及び／または（ｉｉ）のうちの少なくとも１つ；または
（ｉｖ）抗体の半減期を延長するタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））に連結された（ｉ）及び／または（ｉｉ）の少なくとも１つから選択される抗原結合断片である。
本開示の別の例では、ＶＬ及びＶＨは別々のポリペプチド鎖にある。例えば、ＨＥＲ２結合タンパク質は、
（ｉ）ダイアボディ；
（ｉｉ）トリアボディ；
（ｉｉｉ）テトラボディ；
（ｉｖ）Ｆａｂ；
（ｖ）Ｆ（ａｂ’）２；
（ｖｉ）Ｆｖ；または
（ｖｉｉ）重鎖定常領域またはＦｃまたは重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／またはＣＨ３に連結された（ｉ）～（ｖｉ）のうちの少なくとも１つ；または
（ｖｉｉｉ）抗体の半減期を延長するタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））に連結された（ｉ）～（ｖｉ）の少なくとも１つである。
本開示はまた、本明細書に記載されているＶＨ及びＶＬを含むキメラ抗体も提供し、その際、ＶＨは重鎖定常領域に連結され、ＶＬは軽鎖定常領域に連結される。
本開示は、本明細書に記載されているＶＨ及びＶＬを含むキメラ抗体も提供し、その際、ＶＨはヒト重鎖定常領域に連結され、ＶＬはヒト軽鎖定常領域に連結される。
本明細書の本開示に基づいて、本開示のＨＥＲ２結合タンパク質がヒト、ヒト化、合成ヒト化（ｓｙｎｈｕｍａｎｉｚｅｄ）、キメラ、及び霊長類化のタンパク質を包含することは当業者には明らかであろう。
本開示の抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはサブクラスを含めた任意のクラスに属してもよい。ＩｇＧの例示的なサブクラスはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４である。
一例では、ＨＥＲ２結合タンパク質は組換え型である。一例では、ＨＥＲ２結合タンパク質は合成型である。
本開示はまた、ｍＡｂ１０４またはｍＡｂ１０６に結合することができる抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片も提供する。
一例では、本開示のＨＥＲ２結合タンパク質またはＨＥＲ２結合抗体はある部分と複合体化される。該部分は検出可能な部分または機能的な部分であってもよい。例えば、該部分は、放射性同位元素、検出可能な標識、治療用化合物、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、薬物、対象にてＨＥＲ２結合タンパク質の半減期を増やす化合物、及びこれらの混合物から成る群から選択される。特定の例では、該部分は免疫グロブリン、または免疫グロブリンの断片もしくは一部、治療用化合物（例えば、化学療法）、薬物または生物活性剤、毒素または放射性核種から選択されてもよい。あるいは、該部分は、ｓｉＲＮＡ、デオキシリボザイムまたはリボザイムを含んでもよい。前述の部分のいずれかの組み合わせもまた、本開示に含まれる。一例では、ＨＥＲ２結合タンパク質は抗体薬物複合体である。別の例では、抗体薬物複合体は、モノエチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノエチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）またはエムタンシン（ＤＭ１）に連結された本開示のＨＥＲ２結合タンパク質を含む。特定の例では、結合は結合化学を介して達成される。一例では、薬物はＨＥＲ２結合タンパク質に存在するシステイン残基またはリジン残基を介してＨＥＲ２結合タンパク質に結合される。他の例では、結合は、当該技術分野で知られているようなリンカー（例えば、Ｇ－Ｓリンカー）を介する。別の例では、抗体薬物複合体は、腫瘍細胞上のＨＥＲ２受容体に結合すると内部移行することができる。本開示はまた、本明細書に記載されているような複合体を含む組成物にも及ぶ。
結合タンパク質または抗体の血清半減期は、例えば、ＵＳ５，７３９，２７７に記載されているもののような抗体にサルベージ受容体結合エピトープを組み込むことによって増やしてもよい。本明細書で使用されるとき、「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）の生体内血清半減期を増やすのに関与するＩｇＧ分子のＦｃ領域のエピトープを指す。別の例では、半減期はペグ化によって増加する。
本開示はまた、本開示のＨＥＲ２結合タンパク質またはＨＥＲ２結合抗体をコードする単離された核酸も提供する。
本開示は追加的に、プロモーターに対し操作可能に連結された本開示の核酸を含む発現構築物を提供する。そのような発現構築物は、ベクター内、例えばプラスミド内にあることができる。
単一のポリペプチドＨＥＲ２結合タンパク質を対象とする本開示の例では、発現構築物は、そのポリペプチド鎖をコードする核酸に連結されたプロモーターを含んでもよい。
ＨＥＲ２結合タンパク質を形成する複数のポリペプチドを対象とする例では、本開示の発現構築物は、プロモーターに対し操作可能に連結されたポリペプチド（例えば、ＶＨを含む）のうちの１つをコードする核酸と、別のプロモーターに対し操作可能に連結されたポリペプチド（例えば、ＶＬを含む）のうちの別の１つをコードする核酸とを含む。
別の例では、発現構築物は、例えば、以下：
（ｉ）プロモーター；
（ｉｉ）第１のポリペプチドをコードする核酸；
（ｉｉｉ）内部リボソーム進入部位；及び
（ｉｖ）第２のポリペプチドをコードする核酸の５’から３’の順で操作可能に連結した構成要素を含む、バイシストロン性発現構築物である。
例えば、第１のポリペプチドはＶＨを含み、第２のポリペプチドはＶＬを含む、または第１のポリペプチドはＶＬを含み、第２のポリペプチドはＶＨを含む。
本開示はまた、その一方が（例えば、ＶＨと、任意で重鎖定常領域またはその一部とを含む）第１のポリペプチドをコードし、もう一方が（例えば、ＶＬと、任意で軽鎖定常領域とを含む）第２のポリペプチドをコードする、別々の発現構築物も企図する。例えば、本開示は、
（ｉ）（例えば、プロモーターに対し操作可能に連結されたＶＨを含む）ポリペプチドをコードする核酸を含む第１の発現構築物；と
（ｉｉ）（例えば、プロモーターに対し操作可能に連結されたＶＬを含む）ポリペプチドをコードする核酸を含む第２の発現構築物と
を含み、第１及び第２のポリペプチドが会合して本開示のＨＥＲ２結合タンパク質を形成する、組成物も提供する。
本開示は追加的に、本開示のＨＥＲ２結合タンパク質もしくはＨＥＲ２結合抗体を発現する単離された細胞、または本開示のＨＥＲ２結合タンパク質もしくはＨＥＲ２結合抗体を発現するように遺伝子操作された組換え細胞を提供する。一例では、細胞は単離されたハイブリドーマである。別の例では、細胞は、本開示の核酸もしくは発現構築物を含み、または：
（ｉ）プロモーターに対し操作可能に連結された（例えば、ＶＨを含む）ポリペプチドをコードする核酸を含む第１の発現構築物；と
（ｉｉ）プロモーターに対し操作可能に連結された（例えば、ＶＬを含む）ポリペプチドをコードする核酸を含む第２の発現構築物とを含み、
その際、第１及び第２のポリペプチドが会合して本開示のＨＥＲ２結合タンパク質またはＨＥＲ２結合抗体を形成する。
本開示は追加的に、本開示のＨＥＲ２結合タンパク質または核酸または発現構築物または細胞と、好適な担体とを含む組成物を提供する。一例では、組成物は本開示のＨＥＲ２結合タンパク質を含む。
一例では、担体は薬学的に許容される。
本開示の組成物は、単独で投与されてもよく、または他の治療、治療剤、もしくは薬剤と併用して、同時に／並行してもしくは順次のいずれかで投与されてもよい。一例では、本開示のＨＥＲ２結合タンパク質または組成物はペルツズマブまたはトラスツズマブと併用で投与される。一例では、本開示のＨＥＲ２結合タンパク質または組成物はチロシンキナーゼ阻害剤（例えば、ラパチニブ）と併用で投与される。本明細書に記載されているようなＨＥＲ２結合タンパク質または組成物は、抗がん療法、例えば、化学療法または放射線療法と同時にまたは連続して投与されることも企図される。さらなる例では、本明細書に記載されているようなＨＥＲ２結合タンパク質または組成物は、免疫療法剤または免疫調節剤と同時にまたは連続して投与される。
本開示のＨＥＲ２結合タンパク質は、治療、診断または検出に使用されてもよい。いくつかの例では、ＨＥＲ２結合タンパク質はセラノスティクスとして使用するために化学療法剤に連結される。
本開示はまた、検出可能な標識に結合された、本明細書に記載されているようなＨＥＲ２結合タンパク質を含む診断剤も提供する。一例では、診断剤は生体内でまたは試験管内でＨＥＲ２発現腫瘍細胞を検出するために使用される。
一例では、診断剤を使用して、対象にて、またはＨＥＲ２陽性腫瘍を有する、もしくはＨＥＲ２陽性腫瘍を有する疑いのある対象から得られた生体試料にてＨＥＲ２を発現している腫瘍細胞の存在を検出することができる。検出可能な標識の例には、種々の酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、電子密度の高い標識、ＭＲＩ用の標識及び放射性材料が挙げられる。
本開示はまた、生体試料の組織学的検査で使用するための、本明細書に記載されているようなＨＥＲ２結合タンパク質または診断剤も提供する。組織学的試料を調製するための方法は当業者によく知られているであろう。
本開示は追加的に、対象におけるＨＥＲ２を発現しているがんを治療するまたは予防する方法を提供し、該方法は本開示のＨＥＲ２に結合するタンパク質または核酸または発現構築物または細胞または組成物を対象に投与することを含む。一例では、対象は、例えば、乳癌のようながんを有する者である。
一例では、方法は、配列番号２に示す配列を含むＶＨ及び／または配列番号３に示す配列を含むＶＬまたはそのヒト化型もしくは脱免疫化型を含む抗体を対象に投与することを含む。
一例では、方法は、配列番号４に示す配列を含むＶＨ及び／または配列番号５に示す配列を含むＶＬまたはそのヒト化型もしくは脱免疫化型を含む抗体を対象に投与することを含む。
本開示は追加的に、医学分野で使用するために本開示のＨＥＲ２に結合するタンパク質または核酸または発現構築物または細胞または組成物を提供する。
本開示は追加的に、ＨＥＲ２を発現している細胞の増殖性障害の治療で使用するために本開示のＨＥＲ２に結合するタンパク質または核酸または発現構築物または細胞または組成物を提供する。
一例では、本開示は、それを必要とする対象に本開示のＨＥＲ２に結合するタンパク質または核酸または発現構築物または細胞または組成物を投与することを含む、ＨＥＲ２を発現している増殖性障害を治療する方法を提供する。一例では、がんは、乳癌、胃癌、胃食道癌、結腸癌、及び扁平上皮癌から成る群から選択される。
一例では、ＨＥＲ２結合タンパク質は治療有効量で対象に投与される。
好ましくは、対象はヒトである。
本開示は追加的に、ＨＥＲ２を発現しているがんの治療のための薬物の製造における、本開示のＨＥＲ２に結合するタンパク質または核酸または発現構築物または細胞の使用を提供する。
本開示は追加的に、生体試料にてＨＥＲ２を検出する方法を提供し、該方法は、抗原タンパク質複合体を形成するように本開示のＨＥＲ２結合タンパク質またはＨＥＲ２結合抗体に試料を接触させることと、複合体を検出することとを含み、その際、複合体を検出することが試料におけるＨＥＲ２発現を示す。
本開示はまた、ヒトＨＥＲ２の抗体を生成するための、薬学的に許容される担体とともに配列番号１に係る配列を含む、またはそれから成るワクチン抗原も提供する。
本開示はまた、配列Ｈ－ＧＣＰＬＨＮＱＥＶＴＡＥＤＧＴＱＲＣ－ＮＨ２（配列番号２６）を含む環状ペプチドで齧歯類を免疫することと、免疫した齧歯類のＢ細胞からハイブリドーマ細胞株を導出することと、ハイブリドーマ細胞株から抗体を精製することとを含む、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２結合タンパク質を生成する方法も提供する。一例では、ペプチドはジスルフィド結合を介して環化される。一例では、ペプチドは側鎖のＣｙｓ２とＣｙｓ１８との間のジスルフィド結合を介して環化される。別の例では、ペプチドはスカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）タンパク質に連結される。
２２アミノ酸のリーダー配列を含むヒト受容体型チロシン・プロテインキナーゼＨＥＲ２の完全長タンパク質配列を示す図である。システインリッチドメインＩＩ内のｍＡｂ１０４が結合するペプチドエピトープを下線付きの太字で示す。 ＥＬＩＳＡに基づくアッセイを使用した１０μｇ／ｍｌの（Ａ）ｍＡｂ１０４、（Ｂ）ｍＡｂ１０５、（Ｃ）ｍＡｂ１０６、及び（Ｄ）ｍＡｂ１０７のＨＥＲ２細胞外ドメイン、抗体が生成されたスカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合した環状及び線状ペプチド免疫原またはＫＬＨに結合した無関係な対照ペプチドへの結合の比較を示す図である。３つ組試料の結合活性は、Ｓｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏ４．８ソフトウェアを備えたＶＥＲｓａｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して４０５ｎｍでの光学密度吸光度の読み取り値で測定し、平均±ＳＤを決定した。ｍＡｂ１０４（Ａ）及びｍＡｂ１０６（Ｃ）は、不動化したＨＥＲ２フォーマットすべてについて最も強い結合活性を示し、ｍＡｂ１０５（Ｂ）は最も弱い結合を示した。対照ペプチドへの結合の欠如によって特異性を確認した。結果は２つの独立した実験の代表である。 ウエスタンブロットによる細胞溶解物への抗体の結合を示す図である。ＳＫ－ＢＲ－３細胞、ＢＴ－４７４細胞、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３細胞、及びＮＣＩ－Ｎ８７細胞を洗浄し、溶解し、内在性ＨＥＲ２（市販の陽性対照抗体２２４２、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、ｍＡｂ１０４、ｍＡｂ１０５、ｍＡｂ１０６、ｍＡｂ１０７について免疫ブロットした。結果は２つの独立した実験の代表である。 ｍＡｂ１０４（Ａ及びＢ）及びｍＡｂ１０６（Ｃ及びＤ）のそれぞれの重鎖及び軽鎖のＣＤＲの指定（太字及び下線で示す）を示す図である。Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの番号付けによるＣＤＲの指定。 ＨＥＲ２抗体（Ａ）トラスツズマブ、（Ｂ）ｍＡｂ１０６及び（Ｃ）ｍＡｂ１０４のＨＥＲ２ ＥＣＤへの結合の比較を、３２０μｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌ（２１３３～６６ｎＭ）の抗体濃度にわたってＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサーを使用した表面プラズモン共鳴によって調べた。トレースは、不動化した組換えＨＥＲ２ ＥＣＤへの溶液中の抗体の結合及び解離を表す。結果は２以上の実験の代表である。 ＥＬＩＳＡに基づいたＨＥＲ２－ＥＣＤ結合競合アッセイを示す図である。ＥＬＩＳＡプレート結合させた組換えＨＥＲ２ ＥＣＤへの（Ａ）トラスツズマブ及びペルツズマブはｍＡｂ１０４の結合に影響を与えず、（Ｂ）ｍＡｂ１０４はトラスツズマブの結合に影響を与えず、（Ｃ）ｍＡｂ１０４はペルツズマブの結合に部分的に影響する。（データ；平均値±ＳＥ；ｎ＝３）結果は２つの実験の代表である。 ＦＡＣＳに基づく競合アッセイを示す図である。１０倍過剰のｍＡｂ１０４（１００μｇ／ｍｌ）との予備インキュベートは、ＢＴ－４７４細胞（Ａ及びＢ）、ＳＫ－ＢＲ－３細胞（Ｃ及びＤ）、ＮＣＩ－Ｎ８７細胞（Ｅ及びＦ）またはＯＥ－１９細胞（Ｇ及びＨ）上のがん細胞表面ＨＥＲ２への１０μｇ／ｍｌのトラスツズマブまたはペルツズマブの結合に影響を及ぼさなかった。結果は２以上の実験の代表である。 ＦＡＣＳに基づく競合アッセイを示す図である。１０倍過剰のｍＡｂ１０４（１００μｇ／ｍｌ）との予備インキュベートは、ＢＴ－４７４細胞（Ａ及びＢ）、ＳＫ－ＢＲ－３細胞（Ｃ及びＤ）、ＮＣＩ－Ｎ８７細胞（Ｅ及びＦ）またはＯＥ－１９細胞（Ｇ及びＨ）上のがん細胞表面ＨＥＲ２への１０μｇ／ｍｌのトラスツズマブまたはペルツズマブの結合に影響を及ぼさなかった。結果は２以上の実験の代表である。 ＦＡＣＳに基づく競合アッセイを示す図である。１０倍過剰のｍＡｂ１０４（１００μｇ／ｍｌ）との予備インキュベートは、ＢＴ－４７４細胞（Ａ及びＢ）、ＳＫ－ＢＲ－３細胞（Ｃ及びＤ）、ＮＣＩ－Ｎ８７細胞（Ｅ及びＦ）またはＯＥ－１９細胞（Ｇ及びＨ）上のがん細胞表面ＨＥＲ２への１０μｇ／ｍｌのトラスツズマブまたはペルツズマブの結合に影響を及ぼさなかった。結果は２以上の実験の代表である。 ＦＡＣＳに基づく競合アッセイを示す図である。１０倍過剰のｍＡｂ１０４（１００μｇ／ｍｌ）との予備インキュベートは、ＢＴ－４７４細胞（Ａ及びＢ）、ＳＫ－ＢＲ－３細胞（Ｃ及びＤ）、ＮＣＩ－Ｎ８７細胞（Ｅ及びＦ）またはＯＥ－１９細胞（Ｇ及びＨ）上のがん細胞表面ＨＥＲ２への１０μｇ／ｍｌのトラスツズマブまたはペルツズマブの結合に影響を及ぼさなかった。結果は２以上の実験の代表である。 がん細胞株の溶解物を４％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、（Ａ）ｍＡｂ１０４、（Ｂ）抗ＨＥＲ２、及び（Ｃ）抗ＨＥＲ３でブロットした。ＧＡＰＤＨはタンパク質基準化の添加対照として使用した。レーン１：分子量マーカー。データは３つの実験の代表である。 ＥＬＩＳＡ分析を示す図である。組換えｓＥＧＦＲ外部ドメインまたはＨＥＲ２、ＨＥＲ３、もしくはＨＥＲ４のＥＣＤでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートへのｍＡｂ１０４（３～１０，０００ｎｇ／ｍＬ）結合の特異性を示す図である。ｐＮＰＰ基質及び二次抗マウス抗体アルカリホスファターゼ複合体のみの対照が含まれた。（データ；平均値±ＳＥ；ｎ＝３）。 ＭＴＳアッセイによって測定した試験管内でのＳＫ－ＢＲ－３細胞（Ａ、Ｃ及びＥ）またはＢＴ－４７４細胞（Ｂ、Ｄ及びＦ）の増殖に対するｍＡｂ１０４単独（Ａ及びＢ）またはトラスツズマブ（Ｃ及びＤ）もしくはペルツズマブ（Ｅ及びＦ）との併用でのｍＡｂ１０４の効果を示す図である。細胞を、ｍＡｂ１０４、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アイソタイプ対照とともに単剤療法として、またはトラスツズマブ＋ペルツズマブ、トラスツズマブ＋ｍＡｂ１０４もしくはペルツズマブ＋ｍＡｂ１０４の併用で血清枯渇培地にて５～７日間インキュベートした。ベースライン時及び実験終了時に測定した生細胞の数。結果は平均値±ＳＤ；ｎ＝３として表される。データは２以上の独立した実験の代表である。＊ｍＡｂ１０４、ペルツズマブ、アイソタイプ対照抗体は抗増殖作用を有さず、互いに重なり合う。 ＭＴＳアッセイによって測定した試験管内でのＳＫ－ＢＲ－３細胞（Ａ、Ｃ及びＥ）またはＢＴ－４７４細胞（Ｂ、Ｄ及びＦ）の増殖に対するｍＡｂ１０４単独（Ａ及びＢ）またはトラスツズマブ（Ｃ及びＤ）もしくはペルツズマブ（Ｅ及びＦ）との併用でのｍＡｂ１０４の効果を示す図である。細胞を、ｍＡｂ１０４、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アイソタイプ対照とともに単剤療法として、またはトラスツズマブ＋ペルツズマブ、トラスツズマブ＋ｍＡｂ１０４もしくはペルツズマブ＋ｍＡｂ１０４の併用で血清枯渇培地にて５～７日間インキュベートした。ベースライン時及び実験終了時に測定した生細胞の数。結果は平均値±ＳＤ；ｎ＝３として表される。データは２以上の独立した実験の代表である。＊ｍＡｂ１０４、ペルツズマブ、アイソタイプ対照抗体は抗増殖作用を有さず、互いに重なり合う。 ＭＴＳアッセイによって測定した試験管内でのＳＫ－ＢＲ－３細胞（Ａ、Ｃ及びＥ）またはＢＴ－４７４細胞（Ｂ、Ｄ及びＦ）の増殖に対するｍＡｂ１０４単独（Ａ及びＢ）またはトラスツズマブ（Ｃ及びＤ）もしくはペルツズマブ（Ｅ及びＦ）との併用でのｍＡｂ１０４の効果を示す図である。細胞を、ｍＡｂ１０４、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アイソタイプ対照とともに単剤療法として、またはトラスツズマブ＋ペルツズマブ、トラスツズマブ＋ｍＡｂ１０４またはペルツズマブ＋ｍＡｂ１０４の併用で血清枯渇培地にて５～７日間インキュベートした。ベースライン時及び実験終了時に測定した生細胞の数。結果は平均値±ＳＤ；ｎ＝３として表される。データは２以上の独立した実験の代表である。＊ｍＡｂ１０４、ペルツズマブ、アイソタイプ対照抗体は抗増殖作用を有さず、互いに重なり合う。 ｍＡｂ１０４は単剤療法（Ａ及びＢ）として、またはトラスツズマブもしくはペルツズマブ（Ｃ及びＤ）と併用したとき、試験管内で（Ａ）ＳＫ－ＢＲ－３細胞及び（Ｂ）ＢＴ４７４細胞にてＭＡＰＫ経路及びＡｋｔの下流のシグナル伝達に影響を及ぼさない。細胞を血清枯渇培地でインキュベートし、１００μｇ／ｍｌのｍＡｂ１０４、トラスツズマブ、ペルツズマブの単独で、または組み合わせて２４時間処理した後、全細胞を溶解した。次に、等量の溶解物を添加し、４～１２％ゲルにて分解した後、ニトロセルロース膜に移した。示されているように、膜を免疫ブロットした。データは２つの実験の代表である。 ｍＡｂ１０４は単剤療法（Ａ及びＢ）として、またはトラスツズマブもしくはペルツズマブ（Ｃ及びＤ）と併用したとき、試験管内で（Ａ）ＳＫ－ＢＲ－３細胞及び（Ｂ）ＢＴ４７４細胞にてＭＡＰＫ経路及びＡｋｔの下流のシグナル伝達に影響を及ぼさない。細胞を血清枯渇培地でインキュベートし、１００μｇ／ｍｌのｍＡｂ１０４、トラスツズマブ、ペルツズマブの単独で、または組み合わせて２４時間処理した後、全細胞を溶解した。次に、等量の溶解物を添加し、４～１２％ゲルにて分解した後、ニトロセルロース膜に移した。示されているように、膜を免疫ブロットした。データは２つの実験の代表である。 ｍＡｂ１０４は単剤療法（Ａ及びＢ）として、またはトラスツズマブもしくはペルツズマブ（Ｃ及びＤ）と併用したとき、試験管内で（Ａ）ＳＫ－ＢＲ－３細胞及び（Ｂ）ＢＴ４７４細胞にてＭＡＰＫ経路及びＡｋｔのリガンド依存性のリン酸化に影響を及ぼさない。細胞を血清枯渇培地でインキュベートし、１００μｇ／ｍｌのｍＡｂ１０４、トラスツズマブ、ペルツズマブを単独で、または併用して２４時間処理した後、１００ｎｇのＥＧＦを１０分間加えた。全細胞を溶解した後、次に等量の溶解物を添加し、４～１２％ゲルにて分解した後、ニトロセルロース膜に移した。示されているように、膜を免疫ブロットした。データは２つの実験の代表である。 ｍＡｂ１０４は単剤療法（Ａ及びＢ）として、またはトラスツズマブもしくはペルツズマブ（Ｃ及びＤ）と併用したとき、試験管内で（Ａ）ＳＫ－ＢＲ－３細胞及び（Ｂ）ＢＴ４７４細胞にてＭＡＰＫ経路及びＡｋｔのリガンド依存性のリン酸化に影響を及ぼさない。細胞を血清枯渇培地でインキュベートし、１００μｇ／ｍｌのｍＡｂ１０４、トラスツズマブ、ペルツズマブを単独で、または併用して２４時間処理した後、１００ｎｇのＥＧＦを１０分間加えた。全細胞を溶解した後、次に等量の溶解物を添加し、４～１２％ゲルにて分解した後、ニトロセルロース膜に移した。示されているように、膜を免疫ブロットした。データは２つの実験の代表である。 （Ａ～Ｈ）ＢＴ４７４細胞及び（Ｉ～Ｐ）ＳＫ－ＢＲ－３細胞にてトラスツズマブ、ペルツズマブ、及びｍＡｂ１０４によって単剤療法として及び併用して（すべての群の総抗体０．１ｍｇ／ｍＬ）４時間処理した後、アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色のフローサイトメトリー分析によって評価した乳癌細胞の生存率及びアポトーシスに対する処理の効果を示す図である。 （Ａ～Ｈ）ＢＴ４７４細胞及び（Ｉ～Ｐ）ＳＫ－ＢＲ－３細胞にてトラスツズマブ、ペルツズマブ、及びｍＡｂ１０４によって単剤療法として及び併用して（すべての群の総抗体０．１ｍｇ／ｍＬ）４時間処理した後、アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色のフローサイトメトリー分析によって評価した乳癌細胞の生存率及びアポトーシスに対する処理の効果を示す図である。 （Ａ～Ｈ）ＢＴ４７４細胞及び（Ｉ～Ｐ）ＳＫ－ＢＲ－３細胞にてトラスツズマブ、ペルツズマブ、及びｍＡｂ１０４によって単剤療法として及び併用して（すべての群の総抗体０．１ｍｇ／ｍＬ）４時間処理した後、アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色のフローサイトメトリー分析によって評価した乳癌細胞の生存率及びアポトーシスに対する処理の効果を示す図である。 （Ａ～Ｈ）ＢＴ４７４細胞及び（Ｉ～Ｐ）ＳＫ－ＢＲ－３細胞にてトラスツズマブ、ペルツズマブ、及びｍＡｂ１０４によって単剤療法として及び併用して（すべての群の総抗体０．１ｍｇ／ｍＬ）４時間処理した後、アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色のフローサイトメトリー分析によって評価した乳癌細胞の生存率及びアポトーシスに対する処理の効果を示す図である。 ＢＴ－４７４乳癌異種移植片におけるｍＡｂ１０４の抗腫瘍効果を示す図である。マウス（ｎ＝５）を１ｍｇのｍＡｂ１０４、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アイソタイプ対照で処理した。処理開始時の腫瘍体積は１００～１２０ｍｍ３だった。増殖曲線に示されているデータは平均腫瘍体積±ＳＥを表す。個々の処理群の腫瘍は対照群よりも有意に小さかった＊ｐ＜０．００１対照対ｍＡｂ１０４；＊＊ｐ＜０．０００１対照対トラスツズマブ及びペルツズマブ。 ＢＴ－４７４異種移植片におけるｍＡｂ１０４の抗腫瘍効果を示す図である。マウス（ｎ＝５／群）を０．５ｍｇのｍＡｂ１０４、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アイソタイプ対照で処理した。処理開始時の腫瘍体積は１２０～１５０ｍｍ３だった。増殖曲線に示されているデータは平均腫瘍体積±ＳＥを表す。＊ｐ＜０．０１、対照対ｍＡｂ１０４処理群。 （Ａ）ＨＥＲ２陽性乳房ＰＤＸモデルにおけるｍＡｂ１０４の抗腫瘍効果を示す図である。マウス（ｎ＝５／群）を０．５ｍｇのｍＡｂ１０４、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アイソタイプ対照で処理した。処理開始時の腫瘍体積は１００～１２０ｍｍ３だった。 （Ｂ）ＢＴ－４７４異種移植片におけるトラスツズマブと併用したｍＡｂ１０４の抗腫瘍効果を示す図である。マウス（ｎ＝５）を総用量０．５ｍｇのｍＡｂ１０４＋トラスツズマブ、トラスツズマブ＋ペルツズマブ、またはアイソタイプ対照で処理した。処理開始時の腫瘍体積は１００～１２０ｍｍ３だった。＊ｐ＜０．０００１対照群対トラスツズマブ／ｍＡｂ１０４。 （Ｃ）ＨＥＲ２陽性乳房ＰＤＸモデルにおけるトラスツズマブと併用したｍＡｂ１０４の抗腫瘍効果を示す図である。マウス（ｎ＝５）を総用量０．５ｍｇのｍＡｂ１０４＋トラスツズマブ、トラスツズマブ＋ペルツズマブ、またはアイソタイプ対照で処理した。処理開始時の腫瘍体積は１２０～１５０ｍｍ３だった。＊ｐ＜０．０００１対照群対ｍＡｂ１０４；＊＊ｐ＜０．００１トラスツズマブ対トラスツズマブ／ｍＡｂ１０４。パネルＡ～Ｃの増殖曲線に示されているデータは平均腫瘍体積±ＳＥを表す。 ＢＴ－４７４異種移植腫瘍は免疫組織化学法によって：（Ａ）Ｋｉ６７による増殖（Ｂ）ホスホ－Ａｋｔの染色による下流シグナル伝達、（Ｃ）ポドカリキシンの染色による血管系に対する影響に対する抗ＨＥＲ２単剤療法（０．５ｍｇ用量）の効果；または、（Ｄ）Ｋｉ６７による増殖（Ｅ）ホスホ－Ａｋｔの染色による下流シグナル伝達（Ｆ）ポドカリキシンの染色による血管系への影響に対するトラスツズマブとの併用でのｍＡｂ１０４（０．５ｍｇの総タンパク質用量）の効果について評価した。＊ｐ＜０．００１対照群対トラスツズマブ。 ＢＴ－４７４異種移植腫瘍は免疫組織化学法によって：（Ａ）Ｋｉ６７による増殖（Ｂ）ホスホ－Ａｋｔの染色による下流シグナル伝達、（Ｃ）ポドカリキシンの染色による血管系に対する影響に対する抗ＨＥＲ２単剤療法（０．５ｍｇ用量）の効果；または、（Ｄ）Ｋｉ６７による増殖（Ｅ）ホスホ－Ａｋｔの染色による下流シグナル伝達（Ｆ）ポドカリキシンの染色による血管系への影響に対するトラスツズマブとの併用でのｍＡｂ１０４（０．５ｍｇの総タンパク質用量）の効果について評価した。＊ｐ＜０．００１対照群対トラスツズマブ。 ｍＡｂ１０４は、ＭＴＳアッセイで測定したとき、試験管内で（Ａ）ＮＣＩ－Ｎ８７胃癌細胞及び（Ｂ）ＯＥ１９胃癌細胞の増殖を阻害しない。細胞をｍＡｂ１０４、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アイソタイプ対照とともに単剤療法（Ａ及びＢ）として血清枯渇培地で５～７日間インキュベートした。ベースライン時及び実験終了時に測定した生細胞の数。結果は平均値±ＳＤ；ｎ＝３として表される。データは２以上の独立した実験の代表である。＊ｐ＜０．０００１、対照対トラスツズマブ。 ｍＡｂ１０４は、ＭＴＳアッセイで測定したとき、試験管内で（Ａ）ＮＣＩ－Ｎ８７胃癌細胞及び（Ｂ）ＯＥ１９胃癌細胞の増殖を阻害しない。細胞をトラスツズマブ＋ペルツズマブ、トラスツズマブ＋ｍＡｂ１０４またはペルツズマブ＋ｍＡｂ１０４と併用してｍＡｂ１０４とともに血清枯渇培地で５～７日間インキュベートした。ベースライン時及び実験終了時に測定した生細胞の数。結果は平均値±ＳＤ；ｎ＝３として表される。データは２以上の独立した実験の代表である。＊ｐ≦０．００５、対照と比べて。 ｍＡｂ１０４は、単剤療法（Ａ及びＢ）として、またはトラスツズマブもしくはペルツズマブと併用したとき（Ｃ及びＤ）、試験管内で（Ａ）ＮＣＩ－Ｎ８７細胞及び（Ｂ）ＯＥ－１９細胞にてＭＡＰＫ経路及びＡｋｔの下流のシグナル伝達に影響を及ぼさない。細胞を血清枯渇培地でインキュベートし、１００μｇ／ｍｌのｍＡｂ１０４、トラスツズマブ、ペルツズマブの単独で、またはトラスツズマブもしくはペルツズマブと併用で２４時間処理した後、全細胞を溶解した。次に、等量の溶解物を添加し、４～１２％ゲルにて分解した後、ニトロセルロース膜に移した。示されているように、膜を免疫ブロットした。結果は２つの実験の代表である。 ｍＡｂ１０４は、単剤療法（Ａ及びＢ）として、またはトラスツズマブもしくはペルツズマブと併用したとき（Ｃ及びＤ）、試験管内で（Ａ）ＮＣＩ－Ｎ８７細胞及び（Ｂ）ＯＥ－１９細胞にてＭＡＰＫ経路及びＡｋｔの下流のシグナル伝達に影響を及ぼさない。細胞を血清枯渇培地でインキュベートし、１００μｇ／ｍｌのｍＡｂ１０４、トラスツズマブ、ペルツズマブの単独で、またはトラスツズマブもしくはペルツズマブと併用で２４時間処理した後、全細胞を溶解した。次に、等量の溶解物を添加し、４～１２％ゲルにて分解した後、ニトロセルロース膜に移した。示されているように、膜を免疫ブロットした。結果は２つの実験の代表である。 ｍＡｂ１０４は単剤療法（Ａ及びＢ）として、またはトラスツズマブもしくはペルツズマブ（Ｃ及びＤ）と併用したとき、試験管内で（Ａ）ＮＣ－Ｎ８７細胞及び（Ｂ）ＯＥ－１９細胞にてＭＡＰＫ経路及びＡｋｔのリガンド依存性のリン酸化に影響を及ぼさない。細胞を血清枯渇培地でインキュベートし、１００μｇ／ｍｌのｍＡｂ１０４、トラスツズマブ、ペルツズマブの単独で、または併用で２４時間処理した後、１００ｎｇのＥＧＦを１０分間加えた。全細胞を溶解した後、次に等量の溶解物を添加し、４～１２％ゲルにて分解した後、ニトロセルロース膜に移した。示されているように、膜を免疫ブロットした。結果は２つの実験の代表である。 ｍＡｂ１０４は単剤療法（Ａ及びＢ）として、またはトラスツズマブもしくはペルツズマブ（Ｃ及びＤ）と併用したとき、試験管内で（Ａ）ＮＣ－Ｎ８７細胞及び（Ｂ）ＯＥ－１９細胞にてＭＡＰＫ経路及びＡｋｔのリガンド依存性のリン酸化に影響を及ぼさない。細胞を血清枯渇培地でインキュベートし、１００μｇ／ｍｌのｍＡｂ１０４、トラスツズマブ、ペルツズマブの単独で、または併用で２４時間処理した後、１００ｎｇのＥＧＦを１０分間加えた。全細胞を溶解した後、次に等量の溶解物を添加し、４～１２％ゲルにて分解した後、ニトロセルロース膜に移した。示されているように、膜を免疫ブロットした。結果は２つの実験の代表である。 （Ａ及びＢ）ＮＣＩ－Ｎ８７胃癌細胞及び（Ｃ）ＯＥ－１９食道癌細胞にて単剤療法として、または併用でトラスツズマブ、ペルツズマブ、及びｍＡｂ１０４によって４時間処理した後、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色によって評価したがん細胞の生存率及びアポトーシスに対する処理の効果を示す図である。 （Ａ及びＢ）ＮＣＩ－Ｎ８７胃癌細胞及び（Ｃ）ＯＥ－１９食道癌細胞にて単剤療法として、または併用でトラスツズマブ、ペルツズマブ、及びｍＡｂ１０４によって４時間処理した後、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色によって評価したがん細胞の生存率及びアポトーシスに対する処理の効果を示す図である。 遊走アッセイに利用した集密なＯＥ－１９細胞を示す。０または１００μｇ／ｍｌの抗体インキュベートの０時間及び９０時間で収集した画像。抗体は、処理後９０時間で１００μｇ／ｍＬの用量での対照抗体と比べてＯＥ－１９細胞の遊走を遅延させなかった。 ＮＣＩ－Ｎ８７異種移植片におけるｍＡｂ１０４の抗腫瘍効果を示す図である。マウス（ｎ＝５）を１ｍｇのｍＡｂ１０４、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アイソタイプ対照で処理した、または処理しなかった。処理開始時の腫瘍体積は１００～１２０ｍｍ３だった。増殖曲線に示されているデータは平均腫瘍体積±ＳＥを表す。＊ｐ≦０．０１、対照対ｍＡｂ１０４。 ＮＣＩ－Ｎ８７異種移植片におけるｍＡｂ１０４の抗腫瘍効果を示す図である。マウス（ｎ＝５）を０．５ｍｇのｍＡｂ１０４、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アイソタイプ対照で処理した、または処理しなかった。処理開始時の腫瘍体積は１００～１２０ｍｍ３だった。増殖曲線（Ａ）及び生存曲線（Ｂ）が示されている。増殖曲線に示されるデータは平均腫瘍体積±ＳＥを表す。生存分析のための終点は腫瘍体積＞１０００ｍｍ３または瀕死の状態だった。＊ｐ＜０．００１、対照対ｍＡｂ１０４；＊＊ｐ＜０．０００１対照群対処理群。 ＮＣＩ－Ｎ８７異種移植片におけるｍＡｂ１０４の抗腫瘍効果を示す図である。マウス（ｎ＝５）を０．１ｍｇのｍＡｂ１０４、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アイソタイプ対照で処理した、または処理しなかった。処理開始時の腫瘍体積は１００～１２０ｍｍ３だった。増殖曲線（Ａ）及び生存曲線（Ｂ）が示されている。増殖曲線に示されるデータは平均腫瘍体積±ＳＥを表す。生存分析のための終点は腫瘍体積＞１０００ｍｍ３または瀕死の状態だった。＊ｐ≦０．００１、対照対ｍＡｂ１０４；＊＊ｐ＜０．０００２対照対処理群。 ＯＥ－１９異種移植片におけるｍＡｂ１０４の抗腫瘍効果を示す図である。マウス（ｎ＝５）を１ｍｇのｍＡｂ１０４、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アイソタイプ対照で処理した、または処理しなかった。処理開始時の腫瘍体積は１００～１２０ｍｍ３だった。増殖曲線に示されているデータは平均腫瘍体積±ＳＥを表す。＊ｐ≦０．０００１、対照対ｍＡｂ１０４。 ＯＥ－１９異種移植片におけるｍＡｂ１０４の抗腫瘍効果を示す図である。マウス（ｎ＝５）を０．５ｍｇのｍＡｂ１０４、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アイソタイプ対照で処理した。処理開始時の腫瘍体積は１００～１２０ｍｍ３だった。増殖曲線（Ａ）及び生存曲線（Ｂ）が示されている。増殖曲線に示されるデータは平均腫瘍体積±ＳＥを表す。生存分析のための終点は腫瘍体積＞１０００ｍｍ３または瀕死の状態だった。＊ｐ＜０．００１、対照対トラスツズマブ；＊＊ｐ＜０．００６対照対処理群。 ＮＣＩ－Ｎ８７異種移植片におけるトラスツズマブと併用したｍＡｂ１０４の抗腫瘍効果を示す図である。マウス（ｎ＝５）を総用量０．５ｍｇのｍＡｂ１０４＋トラスツズマブ、トラスツズマブ＋ペルツズマブ、またはアイソタイプ対照で処理した。処理開始時の腫瘍体積は１００～１２０ｍｍ３だった。増殖曲線に示されているデータは平均腫瘍体積±ＳＥを表す。＊ｐ＜０．０００１、対照群対ｍＡｂ１０４；＊＊ｐ＜０．００１、トラスツズマブ対トラスツズマブ／ｍＡｂ１０４。 ＯＥ－１９異種移植片におけるトラスツズマブと併用したｍＡｂ１０４の抗腫瘍効果を示す図である。マウス（ｎ＝５）を総用量０．５ｍｇのｍＡｂ１０４＋トラスツズマブ、トラスツズマブ＋ペルツズマブ、またはアイソタイプ対照で処理した。処理開始時の腫瘍体積は１００～１２０ｍｍ３だった。増殖曲線（Ａ）及び生存曲線（Ｂ）が示されている。増殖曲線に示されるデータは平均腫瘍体積±ＳＥを表す。生存分析のための終点は腫瘍体積＞１０００ｍｍ３または瀕死の状態だった。＊ｐ＜０．０００１、対照群対トラスツズマブ／ｍＡｂ１０４；＊＊ｐ＜０．０００１、対照対トラスツズマブ／ペルツズマブ；＊＊＊ｐ＜０．０００１、トラスツズマブ対トラスツズマ／ｍＡｂ１０４；±ｐ＜０．０００５、対照対処理群。 ＮＣＩ－Ｎ８７異種移植腫瘍は、（Ａ及びＤ）Ｋｉ６７による増殖；（Ｂ及びＥ）ホスホル－Ａｋｔの染色による下流シグナル伝達及び（Ｃ及びＦ）ポドカリキシンの染色による血管系への影響に対する抗ＨＥＲ２の単剤療法（０．５ｍｇ用量）（Ａ～Ｃ）またはトラスツズマブとの併用（Ｄ～Ｆ）の効果についての免疫組織化学法によって評価した。 ＮＣＩ－Ｎ８７異種移植腫瘍は、（Ａ及びＤ）Ｋｉ６７による増殖；（Ｂ及びＥ）ホスホル－Ａｋｔの染色による下流シグナル伝達及び（Ｃ及びＦ）ポドカリキシンの染色による血管系への影響に対する抗ＨＥＲ２の単剤療法（０．５ｍｇ用量）（Ａ～Ｃ）またはトラスツズマブとの併用（Ｄ～Ｆ）の効果についての免疫組織化学法によって評価した。 ＯＥ－１９異種移植腫瘍は、（Ａ及びＤ）Ｋｉ６７による増殖；（Ｂ及びＥ）ホスホル－Ａｋｔの染色による下流シグナル伝達及び（Ｃ及びＦ）ポドカリキシンの染色による血管系への影響に対する抗ＨＥＲ２単剤療法（０．５ｍｇ用量）（Ａ～Ｃ）またはトラスツズマブとの併用（Ｄ～Ｆ）の効果についての免疫組織化学法によって評価した。 ＯＥ－１９異種移植腫瘍は、（Ａ及びＤ）Ｋｉ６７による増殖；（Ｂ及びＥ）ホスホル－Ａｋｔの染色による下流シグナル伝達及び（Ｃ及びＦ）ポドカリキシンの染色による血管系への影響に対する抗ＨＥＲ２単剤療法（０．５ｍｇ用量）（Ａ～Ｃ）またはトラスツズマブとの併用（Ｄ～Ｆ）の効果についての免疫組織化学法によって評価した。 ８９Ｚｒ標識した抗ＨＥＲ抗体の免疫反応性画分の決定のための結合アッセイを示す図である。Ａ）は、細胞濃度の増加の関数として、適用された総放射活性に対する特異的結合の従来のプロットを示す。Ｂ）及びＣ）は、Ａと同じデータの二重逆プロットであり、無限の抗原過剰を表す条件に対して免疫反応性画分が決定されるのを可能にする。 ＮＣＩ－Ｎ８７胃癌細胞に対するＡ）８９Ｚｒ標識ｍＡｂ１０４の結合及びＢ）８９Ｚｒ標識ハーセプチン／トラスツズマブの結合のＳｃａｔｃｈａｒｄプロットを示す図である。横軸は特異的に結合した抗体の濃度を示し、縦軸は反応性の遊離抗体に対する特異的に結合した濃度の比率である。横軸での切片値から細胞あたりの結合容量を決定し、直線の傾きから結合定数を決定した。 Ａ）ＨＥＲ２を過剰発現するＮＣＩ－Ｎ８７胃癌異種移植片を担うマウスにおけるジルコニウム－８９標識ｍＡｂ１０４の生体内分布。Ｂ）ＮＣＩ－Ｎ８７異種移植片を担うマウスの血液及び腫瘍におけるジルコニウム－８９標識ｍＡｂ１０４及びアイソタイプ対照の生体内分布。ｍＡｂ１０４で示された高い特異的腫瘍取り込み。（データ：平均±ＳＥＭ、ｎ＝５）。
配列表の解説
配列番号１：ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２のエピトープ配列
配列番号２：ｍＡｂ１０４のＶＨ
配列番号３：ｍＡｂ１０４のＶＬ
配列番号４：ｍＡｂ１０６のＶＨ
配列番号５：ｍＡｂ１０６のＶＬ
配列番号６：ＶＨ ＣＤＲ１のコンセンサス配列
配列番号７：ＶＨ ＣＤＲ２のコンセンサス配列
配列番号８：ＶＨ ＣＤＲ３のコンセンサス配列
配列番号９：ＶＬ ＣＤＲ１のコンセンサス配列
配列番号１０：ＶＬ ＣＤＲ２のコンセンサス配列
配列番号１１：ＶＬ ＣＤＲ３のコンセンサス配列
配列番号１２：ＶＨのコンセンサス配列
配列番号１３：ＶＬのコンセンサス配列
配列番号１４：ｍＡｂ１０４のＶＨ ＣＤＲ１
配列番号１５：ｍＡｂ１０６のＶＨ ＣＤＲ１
配列番号１６：ｍＡｂ１０４のＶＨ ＣＤＲ２
配列番号１７：ｍＡｂ１０６のＶＨ ＣＤＲ２
配列番号１８：ｍＡｂ１０４のＶＨ ＣＤＲ３
配列番号１９：ｍＡｂ１０６のＶＨ ＣＤＲ３
配列番号２０：ｍＡｂ１０４のＶＬ ＣＤＲ１
配列番号２１：ｍＡｂ１０６のＶＬ ＣＤＲ１
配列番号２２：ｍＡｂ１０４のＶＬ ＣＤＲ２
配列番号２３：ｍＡｂ１０６のＶＬ ＣＤＲ２
配列番号２４：ｍＡｂ１０４のＶＬ ＣＤＲ３
配列番号２５：ｍＡｂ１０６のＶＬ ＣＤＲ３
配列番号２６：免疫化に使用される環化ペプチドの配列
配列番号２７：ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２の配列
配列番号２８：軽鎖プライマー配列
配列番号２９：軽鎖プライマー配列
配列番号３０：軽鎖プライマー配列
配列番号３１：軽鎖プライマー配列
配列番号３２：軽鎖プライマー配列
配列番号３３：軽鎖プライマー配列
配列番号３４：軽鎖プライマー配列
配列番号３５：軽鎖プライマー配列
配列番号３６：軽鎖プライマー配列
配列番号３７：軽鎖プライマー配列
配列番号３８：軽鎖プライマー配列
配列番号３９：軽鎖プライマー配列
配列番号４０：軽鎖プライマー配列
配列番号４１：重鎖プライマー配列
配列番号４２：重鎖プライマー配列
配列番号４３：重鎖プライマー配列
配列番号４４：重鎖プライマー配列
配列番号４５：重鎖プライマー配列
配列番号４６：重鎖プライマー配列
配列番号４７：重鎖プライマー配列
配列番号４８：重鎖プライマー配列
配列番号４９：重鎖プライマー配列
配列番号５０：重鎖プライマー配列
配列番号５１：重鎖プライマー配列
配列番号５２：重鎖プライマー配列
配列番号５３：重鎖プライマー配列
配列番号５４：軽鎖プライマー配列
配列番号５５：軽鎖プライマー配列
概要
本明細書全体において、別段の明記がない限り、または文脈上他の意味が要求されない限り、単一の工程、物質の組成物、工程の群、または物質の組成物の群への言及は、これらの工程、物質の組成物、工程の群、または物質の組成物の群のうちの１つ及び複数（すなわち１以上）を包含するように解釈するものとする。
当業者は、本開示が、具体的に記載されているものの他にも変形形態及び変更形態が生じやすいことを理解するであろう。開示がすべてのかかる変形形態及び変更形態を含むことを理解すべきである。開示は、本明細書中で個別にまたは集合的に参照されるか、または示される工程、特徴、組成物、及び化合物のすべて、ならびに当該工程または特徴のすべての組み合わせまたは任意の２つ以上も含む。
本開示は、本明細書に記載されている特定の例によって範囲を限定されないものとする。そのような特定の例は、例示のために意図されているに過ぎない。機能的に等価の産物、組成物、及び方法は、明らかに本開示の範囲内にある。
本開示の任意の例は、別段の明記がない限り、本開示の任意の他の例に準用するように解釈するものとする。
別段の具体的な定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当該技術分野の（例えば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、及び生化学における）当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有するように解釈するものとする。
別途指定されない限り、本開示で利用される組換えタンパク質、組換えＤＮＡ技術、分子生物学、微生物学、細胞培養、及び免疫学的技法は、当業者に周知の標準手順である。そのような技法は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８４），Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９），Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（ｅｄｉｔｏｒ），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ ２，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１），Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（ｅｄｉｔｏｒｓ），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １－４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９５及び１９９６），及びＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８，現在までのすべての改訂を含む），Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８），及びＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（現在までのすべての改訂を含む）のような情報源において文献全体を通して記載され、且つ説明されている。
本明細書における可変領域及びその一部、免疫グロブリン、抗体及びその断片の記載及び定義は、Ｋａｂａｔ，１９８７及び／または１９９１，Ｂｏｒｋ ｅｔ ａｌ．，１９９４及び／またはＣｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８７及び／または１９８９またはＡｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７またはｔｈｅ ＩＭＧＴ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ．－Ｐ．，（１９９７），Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５，Ｔｏｄａｙ，１８，５０９における考察によってさらに明らかにされてもよい。
本明細書の全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変形は、述べられた要素、整数、もしくは工程、または要素、整数、もしくは工程の群を含むが、任意の他の要素、整数、もしくは工程、または要素、整数、もしくは工程の群を除外しないように理解されるであろう。
本明細書で使用されるとき、「～に由来する」という用語は、指定の完全体が、特定の供給源から得られてもよいこと、ただし、必ずしもその供給源から直接得られるわけではないことを示すと解釈されるものとする。
ペプチド配列の文脈における「から成る」または「本質的にから成る」という用語は、さらに大きな生成物に共有結合していない、定義された数の残基のペプチド配列を指す。
本明細書の任意の例は、特に明記されていない限り、任意の他の例に準用するように解釈されるものとする。
選択された定義
本明細書で使用されるとき、文脈による明確な別段の定めがない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には複数の指示対象が含まれる。「ａ」（または「ａｎ」）、ならびに「１以上」及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では相互交換可能に使用され得る。
さらに、本明細書で使用されるときの「及び／または」は、他方の有無にかかわらず２つの指定された特徴または構成要素を具体的に開示すると解釈されるものとする。したがって、本明細書で「Ａ及び／またはＢ」のような表現で使用されるときの「及び／または」という用語は、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、ならびに「Ｂ」（単独）を含むように意図されている。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」のような表現で使用されるときの「及び／または」という用語は、以下の実施形態：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）の各々を包含するように意図されている。
「約」という用語は、本明細書では、およそ、大まかに、～前後、または～の領域内を意味するように使用される。「約」という用語が数値範囲とともに使用される場合、「約」は、記載値の上方及び下方に境界を広げることによってその範囲を変更する。一般に、「約」という用語は、１０パーセント（％）上または下（高いまたは低い）の変化量によって記載値を上回る及び下回るようにある数値を修正するのに本明細書で使用される。
本明細書に記載されているＨＥＲ２結合タンパク質及び抗体、核酸、細胞、及びベクターは単離された形態であることが理解されるであろう。「単離された」とは、天然に見いだされない形態であるポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞を意味する。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞には、もはや天然に見いだされる形態ではない程度まで精製されたものが含まれる。いくつかの態様では、単離された抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞は実質的に純粋である。いくつかの態様では、単離されている抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞は「組換え型」である。
本明細書で使用されるとき「ＨＥＲ２」という用語は、図１に示されるようなヒトＨＥＲ２受容体、特に野生型ＨＥＲ２配列（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９８５），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０（４７３０）：１１３２－９）のアミノ酸残基１９０～２６９によって表されるようなＨＥＲ２受容体のドメインＩＩを指すと理解される。ＨＥＲ２という用語はＥｒｂＢ２と相互交換可能に使用することができる。
「異常な発現」または「異常に発現された」という用語は、その異常な量またはレベルの効率的な原因に関係なく、タンパク質の異常な（普通、増加した）量／レベルが存在する状態を包含するように意図される。異常な発現は、配列の変化、欠失もしくは挿入、または変更された折り畳みに起因する変異したタンパク質または変異体にあるような変化したタンパク質が発現される場合を含めて、増加した発現または増加したレベルもしくは量のタンパク質に起因して細胞内のタンパク質発現または翻訳後修飾機構が重い負担をかけられる、またはさもなければ破壊される状況または変化を含み、且つ企図する。現在の状況では、異常な発現は、腫瘍形成性細胞、過剰増殖性細胞、または異常な細胞で見られるが、野生型細胞または正常な細胞では見られないＨＥＲ２発現と関連している。
本明細書で使用されるとき、「親和性」という用語は、単一分子のそのリガンドへの結合の強さを指し、通常、２つの薬剤の可逆的結合についての平衡解離定数（ＫＤ）として表される。それは、ＨＥＲ２結合タンパク質とＨＥＲ２の間のＫｏｆｆ／Ｋｏｎの比率によって決定される。ＫＤと親和性は反比例する。ＫＤ値はＨＥＲ２結合タンパク質の濃度に関連しているので、ＫＤ値が低ければ低いほど（濃度が低いほど）、結合タンパク質の親和性は高い。本開示のＨＥＲ２結合タンパク質のＨＥＲ２に対する親和性は、例えば、約１００ナノモル（ｎＭ）～約０．１ｎＭ、約１００ｎＭ～約１ピコモル（ｐＭ）、または約１００ｎＭ～約１フェムトモル（ｆＭ）以上であることができる。
本明細書で使用されるとき、ＨＥＲ２結合タンパク質の標的との相互作用に関する「結合」という用語は、相互作用が標的上の特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味する。例えば、ＨＥＲ２結合タンパク質は、一般にタンパク質ではなく、特定のタンパク質構造を認識してそれに結合する。
本明細書で使用される「結合タンパク質」という用語は、互いに結合特異性を有する一対の分子のメンバーを説明することを意図している。特異的結合対のメンバーは、天然に由来してもよく、または全体的にもしくは部分的に合成で製造されてもよい。分子の対の一方のメンバーはその表面または空洞に領域を有し、それは、分子の対の他方のメンバーの特定の空間的な及び極性の組織に特異的に結合するので、それに相補性である。したがって、対のメンバーは互いに特異的に結合する特性を有する。特異的結合対の種類の例は、抗原－抗体、ビオチン－アビジン、ホルモン－ホルモン受容体、受容体－リガンド、酵素－基質である。本出願は抗原－抗体型の反応に関係する。
「抗体」という用語は、天然の、または部分的にもしくは完全に合成で作り出された免疫グロブリンを説明する。該用語はまた、抗体結合ドメインである、または抗体結合ドメインに相同である結合ドメインを有する任意のポリペプチドまたはタンパク質も網羅する。ＣＤＲ移植抗体もこの用語によって企図されている。「抗体」とは、特定のエピトープを結合する抗体及びその断片を含む任意の免疫グロブリンである。該用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及びキメラ抗体を包含し、最近言及されたものは米国特許第４，８１６，３９７号及び第４，８１６，５６７号にてさらに詳細に記載されている。「抗体（複数可）」という用語は、野生型免疫グロブリン（Ｉｇ）分子を含み、一般に、４つの完全長ポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖、またはそれらの同等のＩｇ相同体（例えば、重鎖のみを含むラクダ科のナノボディ）を含み；Ｉｇ分子の本質的なエピトープ結合特性を保持する完全長の機能的なその突然変異体、変異形、または誘導体を含み；且つ二重の特異性、二重特異性、多重特異性、及び二重可変のドメイン抗体を含み；免疫グロブリン分子は、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）であることができる。抗体は多くの方法で修飾することができるので、「抗体」という用語は、必要な特異性を持つ結合ドメインを有する任意の特異的結合のメンバーまたは物質を包含すると解釈されるべきである。したがって、この用語は、天然であれ、または全体的にもしくは部分的に合成であれ、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含む、抗体の抗体断片、誘導体、機能的同等物及び相同体を包含する。したがって、別のポリペプチドに融合した免疫グロブリン結合ドメインまたは同等物を含むキメラ分子が含まれる。キメラ抗体のクローニング及び発現は、ＥＰ－Ａ－０１２０６９４及びＥＰ－Ａ－０１２５０２３ならびに米国特許第４，８１６，３９７号及び第４，８１６，５６７号に記載されている。任意の「抗原結合断片」も「抗体」という用語の意味の範囲内に含まれる。
「抗体断片」とは、完全長ではない少なくとも１本のポリペプチド鎖を含む分子を意味し、（ｉ）可変軽鎖（ＶＬ）、可変重鎖（ＶＨ）、定常軽鎖（ＣＬ）及び定常重鎖１（ＣＨ１）のドメインから成る一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１のドメインから成るＦａｂ（Ｆｄ）断片の重鎖部分；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨのドメインから成る可変断片（Ｆｖ）断片；（ｖ）単一の可変ドメインを含むドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４１，５４４－５４６（１９８９））；（ｖｉ）ラクダ抗体；（ｖｉｉ）単離した相補性決定領域（ＣＤＲ）；（ｖｉｉｉ）２つのドメインが結合して抗原結合部位を形成することを可能にするペプチドリンカーによってＶＨドメインとＶＬドメインが連結される単鎖Ｆｖ断片（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３－４２６，１９８８；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，８５，５８７９－５８８３，１９８８）；（ｉｘ）ＶＨドメイン及びＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖で発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用し、それによってドメインを別の鎖の相補性ドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を作り出す二価の二重特異性抗体であるダイアボディ（ＷＯ９４／１３８０４；Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０６４４４－６４４８，（１９９３））；ならびに（ｘ）相補軽鎖ポリペプチドと一緒に抗原結合領域の対を形成するタンデムのＦｖセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）の対を含む線形抗体；（ｘｉ）多価抗体断片（ｓｃＦｖ二量体、三量体及び／または四量体（Ｐｏｗｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４２：１９３－２０４，９（２０００））；ならびに（ｘｉｉ）重鎖及び／または軽鎖の他の非完全長部分、またはそれらの突然変異体、変異形、または誘導体を単独でまたは任意の組み合わせで含む。
本明細書で使用されるとき、「抗原結合断片」という用語は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬ及びＶＨドメイン断片、ドメイン抗体、三重特異性（Ｆａｂ３）、二重特異性（Ｆａｂ２）、ダイアボディ（（ＶＬ－ＶＨ）２または（ＶＨ－ＶＬ）２）、トリアボディ（３価）、テトラボディ（４価）、ミニボディ（（ｓｃＦｖ－ＣＨ３）２）、二重特異性単鎖Ｆｖ（Ｂｉｓ－ｓｃＦｖ）、ＩｇＧデルタＣＨ２、ｓｃＦｖ－Ｆｃ及び（ｓｃＦｖ）２－Ｆｃを含むように解釈される。「Ｆａｂ断片」は、抗体分子の一価の抗原結合断片から成り、抗体分子全体を酵素パパインで消化することによって生成され、インタクトの軽鎖及び重鎖の一部から成る断片を生じることができる。抗体分子の「Ｆａｂ」断片は、抗体分子全体をペプシンで処理した後、還元して、インタクトの軽鎖及び重鎖の一部から成る分子を生成することによって得ることができる。この方法で処理された抗体分子ごとに２つのＦａｂ’断片が得られる。抗体の「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２つのジスルフィド結合によって結合された２つのＦａｂ’断片の二量体から成り、その後の還元を行わずに抗体全体を酵素ペプシンで処理することによって得られる。「Ｆｖ断片」は、２本の鎖として表される軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含有する遺伝子操作された断片である。「単鎖抗体」（ＳＣＡ）は、好適で柔軟なポリペプチドリンカーによって連結された、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含有する遺伝子操作された単鎖分子である。
本明細書で使用されるとき、「抗体可変領域」とは、相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）及びフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む抗体分子の軽鎖及び重鎖の一部を指す。ＶＨとは重鎖の可変領域を指す。ＶＬとは軽鎖の可変領域を指す。本発明で使用される方法によれば、ＣＤＲ及びＦＲに割り当てられるアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７ ａｎｄ １９９１））またはＣｈｏｔｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ（１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７）に従って定義されてもよい。抗体または抗原結合断片のアミノ酸番号付けもＫａｂａｔのアミノ酸番号付けに従う。
本明細書で使用されるとき「定常領域」（ＣＲ）という用語は、エフェクター機能を付与する抗体分子の一部を指す。主題のヒト化抗体の定常領域はヒト免疫グロブリンに由来する。重鎖定常領域は、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、またはミューの５つのアイソタイプのいずれかから選択することができる。さらに、種々のサブクラスの重鎖（例えば、重鎖のＩｇＧサブクラス）はさまざまなエフェクター機能に関与し、したがって、所望の重鎖定常領域を選択することによって、所望のエフェクター機能を持つ抗体を作り出すことができる。好ましい重鎖定常領域はガンマ１（ＩｇＧ１）、ガンマ２（ＩｇＧ２）、ガンマ３（ＩｇＧ３）及びガンマ４（ＩｇＧ４）である。軽鎖定常領域は、カッパ型またはラムダ型、好ましくはカッパ型であることができる。
「フレームワーク領域」（以下、ＦＲ）はＣＤＲ残基以外のそれらの可変ドメイン残基である。天然に存在する抗体の各可変ドメインは通常、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４として識別される４つのＦＲを有する。
本明細書で使用されるとき、「相補性決定領域」（同義ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）という用語は、その存在が抗原結合に必要である抗体可変ドメインのアミノ酸残基を指す。各可変ドメインは通常、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３として識別される３つのＣＤＲ領域を有する。各相補性決定領域は、Ｋａｂａｔによって定義されたようなＣＤＲ領域に由来するアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインでは、ほぼ、残基２４～３４または２４～３９（Ｌ１）、５０～５６または５５～６１（Ｌ２）、及び８９～９７または９３～１０２（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインでは、３１～３５または２６～３５（Ｈ１）、５０～６５または５０～６６（Ｈ２）、及び９５～１０２または９７～１０８（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））、及び／または「超可変ル－プ」、すなわち、軽鎖可変ドメインでは、ほぼ残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、及び９１～９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインでは、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、及び９６～１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７）を含んでもよい。場合によっては、相補性決定領域は、Ｋａｂａｔに従って定義されたＣＤＲ領域と超可変ループの双方に由来するアミノ酸を含むことができる。当業者は、例えば、突然変異（例えば、欠失及び／または挿入）の結果として、例えば、最大５残基の変異、または４残基の変異、または２残基の変異または１残基変異（例えば、本明細書で例示される抗体として）の結果として、ＦＲの配置におけるいくらかの変異に気付くであろう。
本明細書で使用されるとき、「モノクローナル抗体」という用語は単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体は特定のエピトープに対する単一結合特異性及び親和性を示す。モノクローナル抗体は、任意の動物から、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタなどから生成することができ、または合成で生成することができ、部分的にもしくは完全にヒト配列とすることができる。
「キメラ抗体」という用語は、重鎖及び／または軽鎖の一部が、特定の種（例えば、マウス）に由来するまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体にて対応する配列と同一または相同である一方で、鎖（複数可）の残りの部分は別の種（例えば、霊長類）に由来するまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体にて対応する配列と同一または相同である抗体を指し、同様に、所望の生物活性を示す限り、そのような抗体の断片も指す。
「ヒト化抗体」という用語は、一般に組換え技法を用いて調製され、非ヒト種由来の免疫グロブリンに由来するエピトープ結合部位を有し、分子の残りの免疫グロブリン構造がヒト免疫グロブリンの構造及び／または配列に基づく、キメラ分子を指すように理解するものとする。抗原結合部位は好ましくは、ヒト抗体の可変ドメイン内の適切なフレームワーク領域に移植した非ヒト抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体由来の残りの領域とを含む。
「ヒト抗体」という用語は、本明細書で抗体分子及び結合タンパク質とともに使用されるとき、可変抗体領域（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ、及びＦＲ領域）と、ヒトに、例えば、ヒトの生殖細胞または体細胞に見いだされる配列に由来するまたは対応する定常抗体領域とを有する抗体を指す。
本明細書で使用されるとき、「特異的に結合する」という用語は、結合タンパク質または抗体が、代わりの細胞または物質よりも高頻度に、迅速に、長い持続期間で、及び／または高い親和性で、特定の細胞または物質と反応するまたは会合することを意味するように解釈されるものとする。また、この定義を読み取ることによって、例えば、第１の標的に対し特異的に結合する抗体は第２の標的に対し特異的に結合してもよいし、または結合しなくてもよいことも理解される。そのため、「特異的な結合」は必ずしも別の分子の排他的結合または検出できない結合を必要とせず、これは「選択的結合」という用語に包含される。必ずしもそうとは限らないが、一般に、結合への言及は特異的結合を意味する。
本明細書で使用されるとき、「細胞増殖性障害」及びその文法上の変形は、細胞、組織または臓器に関連して使用される場合、任意の望ましくない、過剰なまたは異常な細胞、組織または臓器の成長、増殖、分化または生存を指す。望ましくない細胞増殖性障害には、双方とも、対象における望ましくない、過剰なまたは異常な細胞数、細胞成長、細胞増殖、細胞の生存または分化を特徴とする良性過形成状態である疾患及び生理学的状態が含まれる。そのような障害の特定の例には、転移性及び非転移性の新生物、腫瘍及びがん（悪性腫瘍）が挙げられる。
「同一性」という用語及びその文法上の変形は、言及された２つ以上の実体が同じであることを意味する。したがって、２つの抗体配列が同一である場合、それらは少なくとも参照された領域または部分の範囲内で同じアミノ酸配列を有する。２つの核酸配列が同一である場合、それらは少なくとも参照された領域または部分の範囲内で同じポリヌクレオチド配列を有する。同一性は、配列の定義された領域（領域またはドメイン）にわたることができる。ポリヌクレオチドの同一性％は、ギャップ作成ペナルティー＝５及びギャップ延長ペナルティー＝０．３とするＧＡＰ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４－４５３．１９７０）分析（ＧＣＧプログラム）によって測定される。特に述べられていない限り、クエリ配列は少なくとも４５ヌクレオチド長であり、ＧＡＰ分析は２つの配列を少なくとも４５ヌクレオチドの領域にわたって並べる。好ましくは、クエリ配列は少なくとも１００ヌクレオチド長であり、ＧＡＰ分析は少なくとも１００ヌクレオチドの領域にわたって２つの配列を並べる。最も好ましくは、２つの配列はその全長にわたって並べられる。
ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質を含む「単離された」という用語は、それがそのネイティブな状態で会合されているまたは連結されているポリヌクレオチド／ポリペプチドの配列から少なくとも部分的に分離されているポリヌクレオチド／ポリペプチドを意味する。好ましくは、単離されたポリヌクレオチド／ポリペプチドは、それらが天然に会合されている他の成分を少なくとも６０％含まない、好ましくは少なくとも７５％含まない、最も好ましくは少なくとも９０％含まない。
本明細書で使用されるとき「核酸」という用語は、「ポリヌクレオチド」という用語と相互交換可能に使用される。
本明細書で使用されるとき、「医薬組成物」という用語は少なくとも１つの治療上または生物学的に活性がある薬剤を含有し、患者への投与に好適である任意の組成物を意味する。そのような製剤はいずれも当該技術分野で周知され、容認されている方法によって調製することができる。例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．，ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（２０００）を参照のこと。
「薬学的に許容される」という表現は、妥当な医学的判断の範囲内であり、過度な毒性、刺激、アレルギー応答、及び／または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、ヒト及び動物の組織と接触して使用するのに好適であり、合理的な利益／リスク比に見合った化合物、材料、組成物、及び／または剤形を指すのに本明細書で採用される。
「対象」とは、診断、予後判定、または治療法が所望される任意の対象、特に哺乳類対象を意味する。本明細書で使用されるとき、「対象」という用語には任意のヒトまたは非ヒト動物が含まれる。「非ヒト動物」という用語は、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、クマ、ニワトリ、両生類、爬虫類などのような哺乳動物及び非哺乳動物を含み、適切な場合には、「患者」という用語と相互交換可能に使用されてもよい。好ましくは、対象は霊長類である。特に、対象はヒトである。
本明細書で使用されるとき、「類似の」レベルの結合という言及は、抗体が抗原に対し、別の抗原に結合するレベルの約３０％または２５％または２０％以内のレベルで結合することを意味すると理解されるであろう。この用語は、ある抗体が抗原に対し、別の抗体が同じ抗原に結合するレベルの約３０％または２５％または２０％以内のレベルで結合することも意味することができる。
本明細書で使用されるとき、「実質的に同じレベル」の結合という言及は、抗体が抗原に対し、別の抗原に結合するレベルの約１５％または１０％または５％以内のレベルで結合することを意味すると理解されるであろう。この用語は、ある抗体が抗原に対し、別の抗体が同じ抗原に結合するレベルの約５％または４％または３％以内のレベルで結合することも意味することができる。
「競合して阻害する」という用語は、本開示のタンパク質が、列挙された産生された抗体（例えば、ｍＡｂ１０４）のＨＥＲ２のドメインＩＩまたはその断片への結合を減らす、または防止することを意味するように理解されるものとする。上記のことから、該タンパク質は抗体の結合を完全に阻害する必要はなく、むしろ結合をただ統計的に有意な量で、例えば、少なくとも約１０％、または２０％、または３０％、または４０％、または５０％、または６０％、または７０％、または８０％、または９０％、または９５％減らす必要があることが明らかであろう。結合の競合的阻害を測定するための方法は当該技術分野で知られており、及び／または本明細書に記載されている。例えば、抗体は、タンパク質の存在下または非存在下のいずれかでＨＥＲ２またはその断片に対し曝露される。抗体の結合がタンパク質の非存在下よりもタンパク質の存在下で少ない場合、そのタンパク質は抗体の結合を競合して阻害すると見なされる。一例では、タンパク質及び抗体は実質的に同時にＨＥＲ２に対し曝露される。結合の競合的阻害を測定するためのさらなる方法は、当業者には明らかであり、及び／または本明細書に記載されている。一例では、タンパク質の抗原結合ドメインは抗体の結合を競合して阻害する。
２つのエピトープの文脈での「重複」は、２つのエピトープが十分な数のアミノ酸残基を共有し、一方のエピトープに結合する抗体が他方のエピトープに結合する抗体の結合を競合して阻害することを可能にすることを意味するように解釈されるものとする。例えば、エピトープは少なくとも１、または２、または３、または４、または５、または６、または７、または８、または９、または１０のアミノ酸を共有する。
本明細書で使用されるとき、「実質的に結合しない」という用語は、タンパク質、例えば、抗体が候補抗原に対し、バックグラウンドを１０％未満、または８％未満、または６％未満、または５％未満上回るレベルで結合することを意味するように理解されるものとする。バックグラウンドは、タンパク質の非存在下及び／または陰性対照タンパク質（例えば、アイソタイプ対照抗体）の存在下で検出される結合シグナルのレベル、及び／または陰性対照抗原の存在下で検出される結合のレベルであることができる。結合のレベルはタンパク質を不動化し、抗原に接触させるバイオセンサー分析（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて検出される。
「治療有効量」という用語は、細胞増殖性障害の１以上の症状を、その障害の臨床的に特有なものとして観察され、且つ容認されるレベルを下回るレベルまで低減する、または抑制するのに十分な抗体または抗原結合断片の量を意味すると解釈されるものとする。当業者は、そのような量は特定の抗体、断片、及び／または特定の対象、及び／または疾患の種類もしくは重症度もしくレベルに応じて異なることに気付くであろう。したがって、この用語は本発明を特定の量に限定すると解釈されるべきではない。
本明細書で使用されるとき、「治療する」、「治療すること」、「治療」という用語及びそれらの文法的変形は、個々の患者をプロトコール、投薬計画、プロセスまたは療法に供することを意味し、その際、その患者にて生理学的な応答または結果を得ることが望ましい。治療されるあらゆる患者が特定の治療プロトコール、投薬計画、プロセス、または療法に応答するわけではない可能性があるので、治療することは、あらゆる患者または患者集団において所望の生理学的な応答または結果が達成されることを必要としない。したがって、所与の患者または患者集団は治療に応答できなくてもよく、または不十分に応答してもよい。
「腫瘍」または「がん」という用語は相互交換可能に使用され、その成長、増殖または生存が正常な対応する細胞の成長、増殖または生存よりも多い細胞または細胞の集団、例えば、細胞増殖性障害または分化性障害を指す。通常、成長は制御されない。
「１０４抗体」または「ｍＡｂ１０４」という用語、及び具体的に列挙されていない任意の変異形は、本明細書で相互交換可能に使用されてもよく、本出願及びクレーム全体で使用されるとき、単一または複数のタンパク質を含むタンパク質性材料を指し、且つ本明細書に記載されているアミノ酸配列データ、ならびに本明細書及びクレームに記述されている活性のプロファイルを有するそれらタンパク質にまで及ぶ。したがって、実質的に同等または変化した活性を示すタンパク質も同様に企図される。これらの修飾は、例えば、部位特異的変異誘発を介して得られる修飾のように、計画的であってもよく、または、複合体もしくはその指名されたサブユニットの生産者である宿主における突然変異を介して得られるもののように、偶発的であってもよい。また、「１０４抗体」または「ｍＡｂ１０４」という用語は、本明細書に具体的に列挙されているタンパク質、と同様にすべての実質的に相同な類似体及び対立遺伝子変異をそれらの範囲内に含めることが意図される。
実施形態の詳細な説明
本発明は、本明細書に記載されている具体的な実施形態によって範囲を制限されることはなく、それらの実施形態は例示の目的のみを意図している。
抗体生成
ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を作製するための一般的な方法論は周知である。不死の抗体産生細胞株は、発がん性ＤＮＡによるＢリンパ球の直接形質転換、またはエプスタインバーウイルスによる形質移入のような融合以外の技術によっても作り出すことができる。例えば、Ｍ．Ｓｃｈｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”（１９８０）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ”（１９８１）；Ｋｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”（１９８０）を参照のこと；また米国特許第４，３４１，７６１号；同第４，３９９，１２１号；同第４，４２７，７８３号；同第４，４４４，８８７号；同第４，４５１，５７０号；同第４，４６６，９１７号；同第４，４７２，５００号；同第４，４９１，６３２号；同第４，４９３，８９０号も参照のこと。ＨＥＲ２に対して産生されたモノクローナル抗体のパネルは、種々の特性、すなわち、本明細書に記載されているようなアイソタイプ、エピトープ、親和性などについてスクリーニングすることができる。特に興味深いのは、異常に発現したＨＥＲ２のドメインＩＩに結合するモノクローナル抗体である。そのようなモノクローナル抗体は、特異的結合メンバー活性アッセイで容易に同定することができる。ネイティブまたは組換えの特異的結合メンバーの免疫親和性精製が可能である場合には高親和性抗体も有用である。本発明の実践に有用なモノクローナル抗体は、適切な抗原特異性の抗体分子を分泌するハイブリドーマを含有する栄養培地を含むモノクローナルハイブリドーマ培養を開始することによって産生させることができる。培養物は、ハイブリドーマが抗体分子を培地に分泌するのに十分な条件下及び期間で維持される。次に、抗体含有培地を回収する。次に、抗体分子を周知の技術によってさらに単離することができる。
本開示の抗体はまた、正常のまたは野生型の成熟ヒトＨＥＲ２の残基２７７～３１２または残基２９３～３０９を含む環状ペプチドに相当する精製された抗原で動物を免疫することによって作り出すこともできる。
本開示のＨＥＲ２結合タンパク質はまた、例えば、固相ペプチド合成及び／またはネイティブタンパク質ライゲーションのような標準的な技術によって合成されてもよい。
抗体法でさらに採用されてもよい好適な技法には、アフィニティー精製、非変性ゲル精製、ＨＰＬＣもしくはＲＰ－ＨＰＬＣ、サイズ排除、プロテインＡカラムでの精製、またはこれらの技法の任意の組み合わせが挙げられる。抗体アイソタイプはＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定することができ、例えば、ヒトＩｇは、マウスＩｇ吸収抗ヒトＩｇを使用して同定することができる。
組換え抗体の作製
本発明の抗体及び抗原結合断片はまた、当業者が容易に入手可能な技術及び材料を使用して組換えで作製することもできる。
可変ドメインは任意の生殖細胞系列もしくは再構成されたヒト可変ドメインに由来してもよく、または既知のヒト可変ドメインのコンセンサス配列に基づく合成可変ドメインであってもよい。本発明のＣＤＲ由来の配列は、組換えＤＮＡ技術を使用してＣＤＲ領域を欠く可変ドメインのレパトアに導入されてもよい。例えば、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９２，１０：７７９－７８３）は、可変ドメイン領域の５’末端に向けられた、またはそれに隣接するコンセンサスプライマーがヒトＶＨ遺伝子の第３フレームワーク領域へのコンセンサスプライマーと併せて使用されて１以上のＣＤＲを欠くＶＨ可変ドメインのレパトアを提供する抗体可変ドメインのレパトアを生成する方法を記載している。Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌはさらに、このレパトアを特定の抗体のＣＤＲとどのように組み合わせるかを説明している。類似の技法を使用して、本発明のＣＤＲ由来配列は、１以上のＣＤＲを欠くＶＨドメインまたはＶＬドメインのレパトアと混ぜ合わせてもよく、混ぜ合わせた完全なＶＨドメインまたはＶＬドメインを同族のＶＬドメインまたはＶＨドメインと組み合わせて発明の抗体を提供してもよい。次に、レパトアは、好適な特異的結合メンバーが選択されてもよいように、ＷＯ９２／０１０４７のファージディスプレイシステムのような好適な宿主システムにて表示されてもよい。レパトアは１０４の個々のメンバーから上向きに、例えば、１０６～１０８または１０１０までのメンバーから成ってもよい。類似の混ぜ合わせ技術またはコンビナトリアル技術もまた、β－ラクタマーゼ遺伝子に関連する技術を説明しているが、このアプローチが抗体の生成に使用されてもよいことを観察しているＳｔｅｍｍｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ，１９９４，３７０：３８９－３９１）によって開示されている。
抗体はまた、既知の選択法及び／または当該技術分野で知られるような突然変異誘発法を用いて親和性成熟させてもよい。
本発明の組換え抗体はまた、ＵＳ５，９６９，１０８に開示されているようなファージディスプレイ法によって作り出すこともできる。
本発明の抗体はさらに、抗体定常領域またはその一部を含んでもよい。例えば、配列番号３または５に基づく抗体はそのＣ末端で、ヒトＣκ鎖またはＣλ鎖を含む抗体軽鎖定常ドメインに結合されてもよい。同様に、配列番号２または４に基づく抗体はそのＣ末端で、任意の抗体アイソタイプ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ及びＩｇＭならびにアイソタイプサブクラス、特にＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ４のいずれかに由来する免疫グロブリン重鎖の全部または一部に結合されてもよい。
組換え産生については、本発明の抗体をコードする核酸が好ましくは単離され、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために複製可能なベクターに挿入される。該抗体をコードするＤＮＡは容易に単離され、または従来の手順（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡに特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用して）を用いて合成される。多くのベクターが利用可能である。一般に、ベクター構成要素には、以下：シグナル配列、本発明の抗体またはその断片をコードする配列（例えば、本明細書で提供される情報に由来する）、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列のうちの１以上が挙げられるが、これらに限定されない。
（ｉ）シグナル配列成分：本発明の抗体は、直接のみならず、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても組換えで作り出されてもよく、この異種ポリペプチドは好ましくは、成熟タンパク質または成熟ポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドである。選択された異種シグナル配列は好ましくは、宿主細胞によって認識され、且つプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。ネイティブの抗体シグナル配列を認識せず、且つプロセシングしない原核宿主細胞については、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核シグナル配列によって置換される。酵母分泌については、ネイティブのシグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー、または酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼリーダー、またはＷＯ９０／１３６４６に記載のシグナルによって置換されてもよい。哺乳動物細胞での発現では、哺乳動物のシグナル配列、と同様にウイルスの分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。そのような前駆体領域についてのＤＮＡは読み取りフレームにて抗体をコードするＤＮＡにライゲーションされる。
（ｉｉ）プロモーター成分：発現ベクター及びクローニングベクターはふつう、宿主生物によって認識され、且つ抗体核酸に操作可能に連結されるプロモーターを含有する。原核宿主との使用に好適なプロモーターには、ｐｈｏＡプロモーター、β－ラクタマーゼ及びラクトースのプロモーター系、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ならびにハイブリッドプロモーター、例えば、ｔａｃプロモーターが挙げられる。しかしながら、他の既知の細菌プロモーターも好適である。細菌系で使用するためのプロモーターは、抗体をコードするＤＮＡに操作可能に連結されるシャイン・ダルガノ（Ｓ．Ｄ．）配列も含有するであろう。
真核生物のためのプロモーターが知られている。実質的にすべての真核生物遺伝子が、転写が開始される部位からおよそ２５～３０塩基上流に位置するＡＴに富んだ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始から７０～８０塩基上流に見られる別の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであってもよいＣＮＣＡＡＴ領域である。大半の真核生物遺伝子の３’末端では、コード配列の３’末端へのポリＡ尾部の付加のためのシグナルであってもよいＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列はすべて真核細胞発現ベクターに好適に挿入される。酵母宿主との使用に好適なプロモーター配列の例には、３－ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース－６－リン酸イソメラーゼ、３－ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼのプロモーターが挙げられる。増殖条件によって制御される転写のさらなる利点を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトース及びガラクトース利用に関与する酵素についてのプロモーター領域である。酵母発現での使用に好適なベクター及びプロモーターは、ＥＰ７３，６５７にさらに記載されている。酵母エンハンサーも酵母プロモーターとともに有利に使用される。
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの抗体の転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ＣＭＶ、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及び最も好ましくはサルウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから、異種哺乳類プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから得られるプロモーターによって制御されるが、但し、そのようなプロモーターが宿主細胞系と適合性であることを条件とする。
（ｉｉｉ）エンハンサー要素成分：さらに高次の真核生物による本発明の抗体をコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増加することが多い。哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α－フェトプロテイン、及びインスリン）由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている。しかしながら、通常、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用されるであろう。例には、複製開始点の後半側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００～２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後半側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素に関しては、Ｙａｎｉｖ，（１９８２），Ｎａｔｕｒｅ，２９７：１７－１８も参照のこと。エンハンサーは、抗体コード配列に対して５’位または３’位でベクターにスプライスされてもよいが、好ましくは、プロモーターから５’位に位置する。
（ｉｖ）転写終結成分：真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物由来の有核細胞）で使用される発現ベクターは、転写終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有するであろう。そのような配列は一般に、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’非翻訳領域、時折、３’非翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にてポリアデニル化断片として転写されたヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写終結構成成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６及びそれらで開示されている発現ベクターを参照のこと。
（ｖ）宿主細胞の選択及び形質転換：本明細書のベクターにおけるＤＮＡのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞は上述の原核生物、酵母、またはさらに高次の真核生物の細胞である。この目的に好適な原核生物には、真正細菌、例えば、グラム陰性またはグラム陽性の生物、例えば、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、及びＳｈｉｇｅｌｌａ、と同様にＢａｃｉｌｌｉ、例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが挙げられる。１つの好ましいＥ．ｃｏｌｉクローニング宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）、及びＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）のような他の菌株も好適である。これらの例は、限定するものではなく、例証するものである。
原核生物に加えて、糸状真菌または酵母のような真核微生物は、抗体コードベクターに好適なクローニング宿主または発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、または一般的なパン酵母は下等真核宿主微生物の中で最も一般的に使用されている。しかしながら、例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主、例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、及びＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ１８３，０７０）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、例えば、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ；及び糸状真菌、例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主、例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ及びＡ．ｎｉｇｅｒのような多数の他の属、種、及び菌株が本明細書において一般的に利用可能であり、有用である。
グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞は多細胞生物に由来する。無脊椎生物細胞の例には植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス菌株及び変異形、ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（毛虫）、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ミバエ）、及びＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉのような宿主由来の対応する許容状態の昆虫宿主細胞が特定されている。形質移入のための種々のウイルス株、例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ＮＰＶのＬ－１変異形、及びＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ＮＰＶのＢｍ－５株が公的に入手可能であり、そのようなウイルスは本発明に係る本明細書におけるウイルスとして、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞の形質移入のために使用されてもよい。
有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胎児腎臓株（浮遊培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７７），Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９）；幼若ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．（１９８０），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，（１９８０），Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１）；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８２），Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びＰＥＲ．Ｃ６（商標）（Ｃｒｕｃｅｌｌ ＮＶ）である。
機能的に等価の抗体
本開示はまた、本発明の抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域配列にて１以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換を伴うが、本発明の抗体の機能を依然として保持する抗体またはその抗原結合断片も企図している。これらの修飾は、例えば、部位特異的変異誘発を介してなど、計画的であってもよく、または、抗体を発現する宿主における突然変異を介して得られるもののように、偶発的であってもよい。
突然変異体（改変された）ポリペプチドは、当該技術分野で知られている任意の技法を用いて調製することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは試験管内での変異誘発に供することができる。そのような試験管内での変異誘発技法は、ポリヌクレオチドを好適なベクターにてサブクローニングすることと、ベクターで「変異誘発因子」株、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ－１ ｒｅｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換することと、形質転換された細菌を好適な世代数増殖させることとを含む。変異させた／改変したＤＮＡに由来する産物を、本明細書に記載されている技法を用いて容易にスクリーニングして、受容体－結合活性及び／または－阻害活性を有するかどうかを決定することができる。
アミノ酸配列突然変異体を設計する際、変異部位の位置及び変異の性質は、修飾される特徴（複数可）に依存するであろう。突然変異のための部位は、例えば、（１）最初に保存的アミノ酸選択物で置換し、次いで達成される結果に応じてさらに根本的な選択物で置換すること、（２）標的残基を欠失させること、または（３）配置された部位に隣接して他の残基を挿入することによって、個別にまたは連続して修飾することができる。
アミノ酸配列欠失は一般に、約１～１５の残基、さらに好ましくは約１～１０の残基、及び通常、約１～５の連続した残基に及ぶ。
置換突然変異体は、可変領域を含めた抗体及び／または免疫グロブリン鎖の分子にて少なくとも１つのアミノ酸残基を除去させ、その位置に異なる残基を挿入させる。置換変異誘発における最も関心対象となる部位には抗原結合に重要であると同定された部位が含まれる。それらの部位、特に、ヒトの抗体及び／または免疫グロブリン鎖の少なくとも３つの他の完全に同じように保存された部位の配列内に収まる部位は、好ましくは比較的保存的な方式で置換される。そのような保存的置換は「例示的な置換」という表題のもと以下の表１に示される。
保存的アミノ酸置換も本発明で企図されている。これらは、以下の表に示されるアミノ酸置換を意味すると解釈される。
Figure 2022529232000009
本明細書に記載されているアミノ酸は好ましくは「Ｌ」異性体形態である。しかしながら、免疫グロブリン結合の所望の機能的特性がポリペプチドによって保持される限り、Ｄ異性体形態の残基が任意のＬ－アミノ酸残基に対し置換され得る。修飾には、構造的な及び機能的な類似体、例えば、合成アミノ酸または非天然アミノ酸またはアミノ酸類似体及び誘導体化形態を有するペプチド模倣体も含まれる。
キメラ抗体
キメラ抗体は、ある種の抗体産生細胞から得られた可変軽鎖及び重鎖領域（ＶＬ及びＶＨ）を別の種由来の定常軽鎖及び重鎖の領域と組み合わせることによる組換え手段によって作製される。通常、キメラ抗体は、主としてヒトのドメインを持つ抗体を作製するために、齧歯類またはウサギの可変領域及びヒトの定常領域を利用する。例えば、キメラ抗体は、ヒト定常領域に融合された任意の実施形態に係る、本明細書に記載されているようなマウス抗体由来の可変領域を含む。そのようなキメラ抗体の作製は当該技術分野で知られており、標準的な手段（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉ ｅｔ ａｌ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ，（１９８９），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２５：１９１－２０２；米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；及び同第４，８１６，３９７号に記載されたような）によって達成されてもよい。さらに、本発明のキメラ抗体のヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５、ＩｇＧ６、ＩｇＧ７、ＩｇＧ８、ＩｇＧ９、ＩｇＧ１０、ＩｇＧ１１、ＩｇＧ１２、ＩｇＧ１３、ＩｇＧ１４、ＩｇＧ１５、ＩｇＧ１６、ＩｇＧ１７、ＩｇＧ１８、またはＩｇＧ１９の定常領域から選択されてもよいことが企図される。
ヒト化抗体及びヒト抗体
本開示の抗体はヒト化抗体またはヒト抗体であってもよい。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有する、キメラの免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそれらの断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合部分配列）である。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、またはウサギのような非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基で置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が含まれる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は対応する非ヒト残基によって置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見いだされない残基も含んでもよい。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、その際、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべては非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、通常、ヒト免疫グロブリンのそれも含むであろう（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６），Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２－５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８），Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３－３２９；及びＰｒｅｓｔａ，（１９９２），Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ，２：５９３－５９）。
非ヒト抗体をヒト化する方法は当該技術分野で既知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそれに導入される１以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、通常「移入」可変ドメインから取り込まれる「移入」残基と呼ばれることが多い。ヒト化は、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，上記；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，上記；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４－１５３６（１９８８）の方法に従って、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに使用することによって本質的に行うことができる。したがって、そのような「ヒト化」抗体はキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）であり、その際、インタクトなヒト可変ドメインに実質的に満たないものが非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。実際に、ヒト化抗体は通常、ヒト抗体であり、その際、いくつかのＣＤＲ残基及び恐らくいくつかのＦＲ残基は齧歯類抗体における類似部位由来の残基によって置換される。
ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーを含む、当該技術分野で既知の種々の技法を使用して作製することもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，（１９９１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２７：３８１；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１）。Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．及びＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．の技法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に好適である（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）、及びＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６－９５）。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物に、例えば、内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活性化されているマウスに導入することによって作製することができる。抗原投与の際に、遺伝子再配置、アセンブリ、及び抗体レパトアを含むすべての点でヒトにおいて見られるものと非常に類似するヒト抗体産生が観察される。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号に記載されている。
選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導選択」と呼ばれる技法を用いて生成することもできる。このアプローチでは、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体を使用して、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を誘導する（Ｊｅｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：８９９－９０３（１９８８））。
抗体は既知の選択及び／または当該技術分野で知られるような変異誘発法を用いて親和性成熟させてもよい。好ましい親和性成熟抗体は、成熟抗体が調製される出発抗体（一般にマウス、ヒト化、またはヒト）よりも５倍、さらに好ましくは１０倍、一層さらに好ましくは２０または３０倍大きな親和性を有する。
合成ヒト化タンパク質及び霊長類化タンパク質
本開示のＨＥＲ２結合タンパク質は合成ヒト化タンパク質であってもよい。「合成ヒト化タンパク質」という用語はＷＯ２００７／０１９６２０に記載されている方法によって調製されるタンパク質を指す。合成ヒト化ＨＥＲ２結合タンパク質は抗体の可変領域を含み、その際、可変領域は新世界霊長類抗体可変領域由来のＦＲと非新世界霊長類抗体可変領域由来のＣＤＲとを含む。例えば、合成ヒト化ＨＥＲ２結合タンパク質は抗体の可変領域を含み、その際、可変領域は新世界霊長類抗体可変領域由来のＦＷＲと、例えば、本明細書に記載されているようなマウス抗体由来のＣＤＲとを含む。一例では、合成ヒト化ＨＥＲ２結合タンパク質は、可変領域の一方または双方が合成ヒト化されているＨＥＲ２結合抗体である。
本開示のＨＥＲ２結合タンパク質は霊長類化タンパク質であってもよい。「霊長類化タンパク質」は、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）の免疫化の後に生成される抗体由来の可変領域（複数可）を含む。任意で、非ヒト霊長類抗体の可変領域はヒト定常領域と連結されて霊長類化抗体を作り出す。霊長類化抗体を作製するための例示的な方法はＵＳ６１１３８９８に記載されている。
脱免疫化された抗体及びタンパク質
本開示は、脱免疫化された抗体またはＨＥＲ２結合タンパク質も企図している。脱免疫化抗体は、１以上のエピトープ、例えば、Ｂ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープを除去させ（すなわち、変異させ）、それによって、対象が抗体またはタンパク質に対する免疫応答を引き起こす可能性を低減する。脱免疫化された抗体及びタンパク質を作製するための方法は当該技術分野で知られており、例えば、ＷＯ００／３４３１７、ＷＯ２００４／１０８１５８、及びＷＯ２００４／０６４７２４に記載されている。
好適な突然変異を導入し、得られたタンパク質を発現させアッセイするための方法は本明細書の記載に基づけば当業者には明らかであろう。
抗体可変領域を含有するタンパク質。
単一ドメイン抗体
いくつかの例では、本開示のＨＥＲ２結合タンパク質は単一ドメイン抗体（「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」という用語と相互交換可能に使用される）である。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変領域のすべてまたは一部を含む単一のポリペプチド鎖である。特定の例では、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、ＵＳ６２４８５１６；ＷＯ９０／０５１４４；及び／またはＷＯ２００４／０５８８２０を参照のこと）。
ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ
抗体抗原結合ドメインを含む例示的なＨＥＲ２結合タンパク質は、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ならびに例えばＷＯ９８／０４４００１及びＷＯ９４／００７９２１に記載されているもののようなさらに高次のタンパク質複合体である。
例えば、ダイアボディは、２つの会合したポリペプチド鎖を含むタンパク質であり、各ポリペプチド鎖は構造ＶＬ－Ｘ－ＶＨまたはＶＨ－Ｘ－ＶＬを含み、その際、ＶＬは抗体軽鎖可変領域であり、ＶＨは抗体重鎖可変領域であり、Ｘは単一ポリペプチド鎖内のＶＨ及びＶＬが会合する（もしくはＦｖを形成する）のを可能にするには不十分な残基を含むリンカーである、または存在せず、一方のポリペプチド鎖のＶＨは他方のポリペプチド鎖のＶＬに結合して、抗原結合部位を形成する、すなわち、１以上の抗原に対し特異的に結合可能なＦｖ分子を形成する。ＶＬ及びＶＨは、各ポリペプチド鎖で同じであってもよく、またはＶＬ及びＶＨは、二重特異的なダイアボディを形成する（すなわち、異なる特異性を有する２つのＦｖを含む）ように各ポリペプチド鎖で異なっていてもよい。
単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片
当業者は、ｓｃＦｖが単一ポリペプチド鎖にてＶＨ領域及びＶＬ領域を含むことを認識しているであろう。ポリペプチド鎖はさらに、ＶＨとＶＬとの間に、ｓｃＦｖが抗原結合に（すなわち、単一ポリペプチド鎖のＶＨ及びＶＬが互いに会合してＦｖを形成するのに）所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーを含む。例えば、リンカーはｓｃＦｖにとってさらに好ましいリンカーの１つである（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３の１２を上回るアミノ酸残基を含む。
本開示はまたジスルフィドが安定化するＦｖ（またはジＦｖもしくはｄｓＦｖ）も企図し、その際、単一のシステイン残基がＶＨのＦＲ及びＶＬのＦＲに導入され、システイン残基がジスルフィド結合によって連結されて安定したＦｖをもたらす（例えば、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ｅｔ ａｔ，（１９９３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５４７－５５１を参照のこと）。
代わりにまたはさらに、本開示は、二量体ｓｃＦｖ、すなわち、非共有結合または共有結合によって、例えば、ロイシンジッパードメイン（例えば、ＦｏｓまたはＪｕｎ由来）によって連結した２つのｓｃＦｖ分子を含むタンパク質を提供する（例えば、Ｋｒｕｉｆ ａｎｄ ＬｏｇｔｅｎｂＥＲｇ，１９９６を参照のこと）。代わりに、２つのｓｃＦｖは、例えば、ＵＳ２００６０２６３３６７に記載されているように双方のｓｃＦｖが形を成し、抗原に結合するのを可能にするのに十分な長さのペプチドリンカーによって連結される。
ｓｃＦｖの概説については、Ａｈｍａｄ ＺＡ．ｅｔ ａｌ．，（２０１２），Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１２／９８０２５０を参照のこと。
ミニボディ
当業者は、ミニボディが、抗体の（ＣＨ２ドメイン及び／または（ＣＨ３ドメインと融合した抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含むことを承知しているであろう。任意で、ミニボディはＶＨとＶＬとの間にヒンジ領域を含み、この立体構造はＦｌｅｘミニボディと呼ばれることもある。ミニボディはＣＨ１またはＣＬを含まない。一例では、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは抗体のヒンジ領域及びＣＨ３ドメインと融合している。当該ミニボディの可変領域の少なくとも１つが本開示の方式でＨＥＲ２に結合する。例示的なミニボディ及びその生成方法は、例えば、ＷＯ９４／０９８１７に記載されている。
他の抗体可変領域を含有するタンパク質
本開示は、例えば：
（ｉ）ＵＳ５，７３１，１６８に記載されている「鍵と鍵穴」の二重特異性タンパク質；
（ｉｉ）例えば、ＵＳ４，６７６，９８０に記載されているようなヘテロ複合体タンパク質；
（ｉｉｉ）例えば、ＵＳ４，６７６，９８０に記載されているような化学的架橋剤を用いて作り出されるヘテロ複合体タンパク質；
（ｉｖ）例えば、Ｓｈａｌａｂｙ，（１９９２），．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１；１７５（１）：２１７－２５に記載されているようなＦａｂ’－ＳＨ断片；
（ｖ）単鎖Ｆａｂ；または
（ｖｉ）（例えば、ＥＰ１９９３０３０２８９４に記載されているような）Ｆａｂ３のような他の可変領域を含有するＨＥＲ２結合タンパク質も企図する。
抗体に基づかない抗原結合ドメインを含有するタンパク質
免疫グロブリン及び免疫グロブリン断片
本開示の化合物の一例は、免疫グロブリンの可変領域を含むタンパク質であり、例えば、Ｔ細胞受容体または重鎖免疫グロブリン（例えば、ＩｇＮＡ、ラクダ科動物抗体）である。
「免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリンドメインを含む任意の抗原結合タンパク質を含むように理解されるであろう。例示的な免疫グロブリンは抗体である。「免疫グロブリン」という用語が包含する追加のタンパク質には、ドメイン抗体、ラクダ科動物抗体、及び軟骨魚類からの抗体（すなわち、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ））が挙げられる。一般に、ラクダ科動物抗体及びＩｇＮＡＲはＶＨを含むが、ＶＬが欠如しており、重鎖免疫グロブリンと呼ばれることが多い。他の「免疫グロブリン」にはＴ細胞受容体が挙げられる。
重鎖免疫グロブリン
重鎖免疫グロブリンは、重鎖を含むが軽鎖を含まない限りにおいて、多くの他の免疫グロブリン形態（例えば、抗体）と構造的に異なる。したがって、そのような免疫グロブリンは「重鎖のみの抗体」とも呼ばれる。重鎖免疫グロブリンは、例えば、ラクダ科動物及び軟骨魚類（ＩｇＮＡＲとも呼ばれる）に見いだされる。
天然に存在する重鎖免疫グロブリン内に存在する可変領域は、従来の４本鎖抗体に存在する重鎖可変領域（「ＶＨドメイン」と呼ばれる）及び従来の４本鎖抗体に存在する軽鎖可変領域（「ＶＬドメイン」と呼ばれる）から区別するため、一般にラクダ科動物Ｉｇにおける「ＶＨＨドメイン」及びＩｇＮＡＲにおけるＶ－ＮＡＲと呼ばれる。
重鎖免疫グロブリンは、関連する抗原に高親和性及び高特異性で結合するのに軽鎖の存在を必要としない。このことは、単一ドメイン結合断片が、容易に発現し、かつ一般に安定し可溶性である重鎖免疫グロブリンに由来し得ることを意味する。ラクダ科動物由来の重鎖免疫グロブリン及びその可変領域についての一般的な説明ならびにその作製及び／または単離及び／または使用の方法は、とりわけ、以下の参考文献：ＷＯ９４／０４６７８、ＷＯ９７／４９８０５、及びＷＯ９７／４９８０５に見いだされる。
軟骨魚類由来の重鎖免疫グロブリン及びその可変領域についての一般的な説明ならびにその作製及び／または単離及び／または使用の方法は、とりわけ、ＷＯ２００５／１１８６２９に見いだされる。
Ｖ様タンパク質
本開示のＨＥＲ２結合タンパク質の一例はＴ細胞受容体である。Ｔ細胞受容体は抗体のＦｖモジュールに類似した構造に統合する２つのＶドメインを有する。Ｎｏｖｏｔｎｙ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８６４６－８６５０，１９９１は、Ｔ細胞受容体の２つのＶドメイン（アルファ及びベータと称される）がどのように融合し単鎖ポリペプチドとして発現することができるか、さらに、どのように表面残基を改変して抗体ｓｃＦｖに直接的に類似する疎水性を低減するかについて記載している。２つのＶ－アルファ及びＶ－ベータのドメインを含む単鎖Ｔ細胞受容体または多量体Ｔ細胞受容体の作製について記載している他の刊行物には、ＷＯ１９９９／０４５１１０またはＷＯ２０１１／１０７５９５が挙げられる。
抗原結合ドメインを含む他の非抗体タンパク質にはＶ様ドメインを伴うタンパク質が挙げられ、それらは一般に単量体である。そのようなＶ様ドメインを含むタンパク質の例にはＣＴＬＡ－４、ＣＤ２８、及びＩＣＯＳが挙げられる。そのようなＶ様ドメインを含むタンパク質のさらなる開示はＷＯ１９９９／０４５１１０に含まれている。
アドネクチン
一例では、本開示のＨＥＲ２結合タンパク質はアドネクチンである。
アドネクチンは、ループ領域が抗原結合を付与するように改変されているヒトフィブロネクチンの第１０フィブロネクチンＩＩＩ型（１０Ｆｎ３）ドメインに基づく。例えば、１０Ｆｎ３のβサンドイッチの一方の端部における３つのループは、アドネクチンが抗原を特異的に認識できるように操作することができる。さらなる詳細については、ＵＳ２００８０１３９７９１またはＷＯ２００５／０５６７６４を参照のこと。
アンチカリン
さらなる例では、本開示のＨＥＲ２結合タンパク質はアンチカリンである。アンチカリンは、例えば、ステロイド、ビリン、レチノイド、及び脂質のような疎水性小分子を輸送する細胞外タンパク質のファミリーであるリポカリンに由来する。リポカリンは、抗原に結合するように操作することができる円錐状構造の開放端部に複数のループを持つ剛性のβシート二次構造を有する。そのような操作されたリポカリンはアンチカリンとして知られている。アンチカリンのさらなる説明については、ＵＳ７２５０２９７Ｂ１またはＵＳ２００７０２２４６３３を参照のこと。
アフィボディ
さらなる例では、本開示のＨＥＲ２結合タンパク質はアフィボディである。アフィボディは、抗原に結合するように操作することができるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのプロテインＡのＺドメイン（抗原結合ドメイン）に由来する足場である。Ｚドメインはおよそ５８アミノ酸の３本らせん束から成る。ライブラリは表面残基の無作為化によって生成されている。さらなる詳細についてはＥＰ１６４１８１８を参照のこと。
アビマー
さらなる例では、本開示のＨＥＲ２結合タンパク質はアビマーである。アビマーは、Ａドメイン足場ファミリーに由来する多重ドメインタンパク質である。およそ３５アミノ酸のネイティブのドメインは定義されたジスルフィド結合構造を採用する。多様性は、Ａドメインのファミリーによって示される天然の変異の混ぜ合わせによって生成される。さらなる詳細についてはＷＯ２００２０８８１７１を参照のこと。
ＤＡＲＰｉｎ
さらなる例では、本開示のＨＥＲ２結合タンパク質は、設計されたアンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）である。ＤＡＲＰｉｎは、複合膜タンパク質が細胞骨格に付着するのに介在するタンパク質のファミリーであるアンキリンに由来する。単一のアンキリン反復は２つのαらせん及び１つのβターンから成る３３残基のモチーフである。ＤＡＲＰｉｎは、各反復の第１のαらせん及びβターン内の残基を無作為化することによって異なる標的抗原を結合するように操作することができる。モジュールの数を増やすことによってその結合界面を増やすことができる（親和性成熟法）。さらなる詳細についてはＵＳ２００４０１３２０２８を参照のこと。
他の非抗体ポリペプチド
結合ドメインを含む他の非抗体タンパク質には、ヒトγクリスタリン及びヒトユビキチン（アフィリン）、ヒトプロテアーゼ阻害物質のクニッツ型ドメイン、Ｒａｓ結合タンパク質ＡＦ－６のＰＤＺドメイン、サソリ毒（カリブドトキシン）、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン）に基づくものが挙げられる。
定常領域
本開示は、可変領域及び定常領域またはそのドメイン（複数可）、例えば、Ｆｃ、ＣＨ２及び／またはＣＨ３のドメインを含むＨＥＲ２結合タンパク質を包含する。当業者は、本明細書の開示及び本明細書で論じられている参考文献に基づいて定常領域及び定常ドメインという用語の意味を認識しているであろう。
本開示のＨＥＲ２結合タンパク質の作製に有用な定常領域配列は多数の異なる供給源から得られてもよい。いくつかの例では、ＨＥＲ２結合タンパク質の定常領域またはその一部はヒト抗体に由来する。さらに、定常ドメインまたはその一部は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＥを含む任意の抗体クラス、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む任意の抗体アイソタイプに由来してもよい。一例では、ヒトアイソタイプＩｇＧ１が使用される。
種々の定常領域遺伝子配列は公的にアクセス可能な寄託の形態で入手可能であり、またはその配列は公的に利用可能なデータベースから入手可能である。特定のエフェクター機能を有する（もしくは特定のエフェクター機能が欠如する）または免疫原性を減らすために特定の修飾を伴う定常領域を選択することができる。
一例では、本開示のタンパク質は、ＨＥＲ２を発現する細胞の少なくとも部分的な枯渇、実質的な枯渇、または消失を推進するまたは可能にするエフェクター機能を有するまたは示す。そのようなエフェクター機能は、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の強化、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞介在性食作用（ＡＤＣＰ）、及び／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）であってもよい。
一例では、ＨＥＲ２結合タンパク質はエフェクター機能のレベル強化を誘導することができる。
一例では、定常領域によって誘導されるエフェクター機能のレベルは、ＩｇＧ１抗体の野生型Ｆｃ領域と比べて、またはＩｇＧ３抗体の野生型Ｆｃ領域と比べて強化されている。
別の例では、定常領域は修飾を伴わない定常領域に比べて、それが誘導可能であるエフェクター機能のレベルを高めるように修飾される。そのような修飾は、アミノ酸レベル及び／または二次構造レベル及び／または三次構造レベルにおけるもの、及び／またはＦｃ領域のグリコシル化に対するものであることができる。
当業者は、さらに大きなエフェクター機能が、複数のやり方で、例えば、さらに大きなレベルの効果として、さらに持続的な効果として、またはさらに高速な効果として明らかにされてもよいことを理解するであろう。例示的な定常領域修飾には、アミノ酸置換、例えば、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従った番号付けでＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、またはＫａｂａｔのＥＵインデックスに従った番号付けでＳ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅが挙げられる。
Ｆｃ領域のエフェクター機能を誘導する能力を高めるさらなるアミノ酸置換は当該技術分野で知られており、及び／または例えば、ＵＳ６７３７０５６もしくはＵＳ７３１７０９１に記載されている。
一例では、定常領域のグリコシル化はエフェクター機能の強化を誘導する能力を高めるように改変される。いくつかの例では、本開示に係るＦｃ領域は、Ｆｃ領域に（直接的または間接的に）結合するするフコースを欠く、すなわち、Ｆｃ領域が「非フコシル化」されている炭水化物構造を含む。そのような変異形はＡＤＣＣを誘導する改善された能力を有してもよい。非フコシル化抗体を作製する方法は、ａ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）を発現できない細胞株にてＨＥＲ２結合タンパク質を発現させることを含む（例えば、Ｙｕｍａｎｅ－ Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｈ，２００４に記載されているように）。他の方法は、エフェクター機能強化を誘導することができる抗体をもともと産生する細胞株の使用を含む（例えば、ウイルスワクチン産生のためのアヒル胚由来幹細胞（ＷＯ２００８／１２９０５８）；トリＥＢＸ（登録商標）細胞での組換えタンパク質の産生（ＷＯ２００８／１４２１２４））。
ＨＥＲ２結合タンパク質はまた、ＣＤＣのレベル強化を誘導することができるＦｃ領域も含むことができる。例えば、ＩｇＧ１とＩｇＧ３のハイブリッドはＣＤＣ活性が強化された抗体を作り出す（Ｎａｔｓｕｍｅ ｅｔ ａｌ，２００８）。
抗体またはその抗原結合断片のエフェクター機能を誘導する能力を測定する方法は当該技術分野で知られており、及び／または本明細書に記載されている。
別の例では、タンパク質はＨＥＲ２結合タンパク質の半減期を増やす１以上のアミノ酸置換を含む。例えば、ＨＥＲ２結合タンパク質は、新生児Ｆｃ領域（ＦｃＲｎ）に対する定常領域の親和性を高める１以上のアミノ酸置換を含む定常領域を含む。例えば、定常領域は、さらに低いｐＨ、例えば、約ｐＨ６．０におけるＦｃＲｎに対する親和性が高く、エンドソームにてＦｃ／ＦｃＲｎ結合を円滑にする。一例では、定常領域は、約ｐＨ７．４における親和性と比べて約ｐＨ６におけるＦｃＲｎに対する高い親和性を有し、それは細胞再利用後の血中へのＦｃ再放出を促進する。それらのアミノ酸置換は、血液からのクリアランスを減らすことによってタンパク質の半減期を延長するのに有用である。
例示的なアミノ酸置換には、ＥＵ番号付けシステムに従ってＴ２５０Ｑ及び／またはＭ４２８ＬまたはＴ２５２Ａ、Ｔ２５４Ｓ及びＴ２６６ＦまたはＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６ＥまたはＨ４３３Ｋ及びＮ４３４Ｆが挙げられる。追加的または代替的なアミノ酸置換は、例えば、ＵＳ２００７０１３５６２０またはＵＳ７０８３７８４に記載されている。
本開示のＨＥＲ２結合タンパク質は、ＩｇＧ４定常領域または安定化したＩｇＧ４定常領域を含むことができる。「安定化したＩｇＧ４定常領域」という用語は、Ｆａｂアーム交換、またはＦａｂアーム交換を受ける傾向、または半抗体の形成、または半抗体を形成する傾向を減らすように修飾されているＩｇＧ４定常領域を意味すると理解されるであろう。「Ｆａｂアーム交換」とは、１つのＩｇＧ４重鎖及び結合している軽鎖（半分の分子）が別のＩｇＧ４分子由来の重鎖軽鎖対と交換される、ヒトＩｇＧ４についてのタンパク質修飾の１つの型を指す。したがって、ＩｇＧ４分子は、２つの異なる抗原を認識する２つの異なるＦａｂアームを獲得してもよい（その結果、二重特異性分子がもたらされる）。Ｆａｂアーム交換は生体内で自然に生じ、精製された血液細胞または還元型グルタチオンのような還元剤によって試験管内で誘導することができる。「半抗体」は、ＩｇＧ４抗体が解離して各々が単一の重鎖と単一の軽鎖とを含む２つの分子を形成するときに生じる。
一例では、安定化したＩｇＧ４定常領域は、Ｋａｂａｔのシステムに従ってヒンジ領域の２４１位にプロリンを含む。この位置はＥＵ番号付けシステムに従ってヒンジ領域の２２８位に相当する。ヒトＩｇＧ４においてこの残基は一般にセリンである。プロリンに代わるセリンの置換に続いて、ＩｇＧ４ヒンジ領域は配列ＣＰＰＣを含む。この点で、当業者は、「ヒンジ領域」が、抗体の２つのＦａｂアームに移動性を付与するＦｃ領域及びＦａｂ領域を連結する抗体重鎖定常領域のプロリンリッチ部分であることを認識するであろう。ヒンジ領域は重鎖間のジスルフィド結合に関与するシステイン残基を含む。ヒンジ領域は、Ｋａｂａｔの番号付けシステムに従ってヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２２６からＰｒｏ２４３までの区間として一般に定義されている。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間ジスルフィド（Ｓ－Ｓ）結合を形成する最初及び最後のシステイン残基を同じ位置に置くことによって、ＩｇＧ１配列と並べてもよい（例えば、ＷＯ２０１０／０８０５３８を参照のこと）。
修飾タンパク質
本開示は、本開示の配列に対し少なくとも８０％の同一性を有し、且つ本明細書で記載されているまたは特許請求されている同じ機能的特徴を有するＨＥＲ２結合タンパク質を提供する。
一例では、本開示のＨＥＲ２結合タンパク質は、本明細書で開示されているＶＬ配列、例えば、配列番号３に対して少なくとも９０％、または９１％、または９２％、または９３％、または９４％、または９５％、または９６％、または９７％、または９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。
別の例では、本開示のＨＥＲ２結合タンパク質は、本明細書で開示されているＶＨ、例えば、配列番号２に対して少なくとも９０％、または９１％、または９２％、または９３％、または９４％、または９５％、または９６％、または９７％、または９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。
本開示はまた、前述のタンパク質をコードする核酸、または中～高ストリンジェントな条件下でそれとハイブリッド形成する核酸も提供する。
本開示はまた、配列番号２及び配列番号３に示す配列を含むタンパク質をコードする核酸も包含するが、それは遺伝子コードの縮重の結果、本明細書で例示されている配列とは異なる。
本開示はまた、配列番号４及び配列番号５に示す配列を含むタンパク質をコードする核酸も包含するが、それは遺伝子コードの縮重の結果、本明細書で例示されている配列とは異なる。
核酸またはポリペプチドの同一性％は、ギャップ作成ペナルティー＝５及びギャップ延長ペナルティー＝０．３のＧＡＰ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ．１９７０）分析（ＧＣＧプログラム）によって測定される。クエリ配列は好ましくは少なくとも長さ５０残基であり、ＧＡＰ分析は少なくとも５０残基の領域にわたって２つの配列を並べる。例えば、クエリ配列は少なくとも長さ１００残基であり、ＧＡＰ分析は少なくとも１００残基の領域にわたって２つの配列を並べる。一例では、２つの配列はその長さ全体にわたって並べられる。
修飾されたグリコシル化
抗体のグリコシル化パターンは、参照抗体の元のグリコシル化パターンから変更されてもよい。変更とは、抗体に見いだされる１以上の炭水化物部分を欠失させること、及び／または抗体に存在しない１以上のグリコシル化部位を付加すること、及び／または参照抗体の元のグリコシル化パターンに１以上の炭水化物部分を付加することを意味する。抗体のグリコシル化は通常、Ｎ結合またはＯ結合のいずれかである。Ｎ結合型は、アスパラギン残基の側鎖に対する炭水化物部分の結合を指す。Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸であるトリペプチド配列、アスパラギン－Ｘ－セリン及びアスパラギン－Ｘ－スレオニンは、アスパラギン側鎖に対する炭水化物部分の酵素結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチドにおけるこれらトリペプチド配列のうちのいずれの存在は潜在的グリコシル化部位を作り出す。Ｏ結合型グリコシル化は、糖類Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの結合を指すが、５－ヒドロキシプロリンまたは５－ヒドロキシリジンも使用されてもよい。抗体へのグリコシル化部位の付加は好都合には、それが（Ｎ結合型グリコシル化部位のための）上述のトリペプチド配列の１以上を含有するようにアミノ酸配列を変更することによって達成される。変更は、（Ｏ結合型グリコシル化部位のための）元の抗体の配列に１以上のセリンまたはスレオニン残基を付加する、またはそれによって置換することによって行ってもよい。
本開示の抗体の修飾糖型は、エフェクター機能を高めることもしくは低下させること、及び／または抗体の半減期を改変すること（例えば、ＷＯ／２００７／０１０４０１を参照のこと）を含むが、これらに限定されない種々の目的に有用であってもよい。そのような変更は、Ｃ１ｑ結合及びＣＤＣの減少もしくは増加、またはＦｃγＲ結合及びＡＤＣＣの減少もしくは増加をもたらしてもよい。置換は、例えば、重鎖定常領域のアミノ酸残基の１以上で行うことができ、それによって修飾抗体に比べて抗原に結合する能力を保持しながらエフェクター機能の変化を生じる、ＵＳ５，６２４，８２１及びＵＳ５，６４８，２６０を参照。操作された糖型は、当業者に知られている任意の方法によって生成されてもよく、例えば、操作された株もしくは変異形発現株を使用することによって、１以上の酵素、例えば、β（１，４）－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩ １）との共発現によって、種々の生物もしくは種々の生物由来の細胞株にて抗体もしくはその断片を発現させることによって、または抗体もしくは断片を発現させた後、炭水化物（複数可）を修飾することによって生成されてもよい。操作された糖型を精製する方法は当該技術分野で知られており、それらにはＵｍａｎａ ｅｔ ａｌ，１９９９，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６－１８０；Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７４：２８８－２９４；Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３－２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６－３４７３）米国特許第６，６０２，６８４号；Ｕ．Ｓ出願番号１０／２７７，３７０；Ｕ．Ｓ．出願番号１０／１１３，９２９；ＰＣＴ ＷＯ００／６１７３９Ａ１；ＰＣＴ ＷＯ０１／２９２２４６Ａ１；ＰＣＴ ＷＯ０２／３１１１４０Ａｌ；ＰＣＴ ＷＯ０２／３０９５４Ａ１；Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）技術（Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）；ＧｌｙｃｏＭＡｂ（商標）グリコシル化操作技術（ＧＬＹＣＡＲＴ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＷＯ０００６１７３９；ＥＡ０１２２９１２５；ＵＳ２００３０１１５６１４；Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，ＪＭＢ，３３６：１２３９－４９を参照のこと。
エフェクター機能
エフェクター機能に関して本開示の抗体を修飾することは、例えば、抗体の抗原依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を強化するために望ましい場合がある。これは、抗体のＦｃ領域に１以上のアミノ酸置換を導入することによって達成されてもよい。代わりにまたはさらに、システイン残基（複数可）をＦｃ領域に導入し、それによってこの領域にて鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にしてもよい。このように生成されたホモ二量体抗体は、改善された内部移行能力、及び／またはさらに高い補体介在性細胞殺傷及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有してもよい。Ｃａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１ １９１－１ １９５（１９９２）及びＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８－２９２２（１９９２）を参照のこと。抗腫瘍活性が強化されたホモ二量体抗体は、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３：２５６０－２５６５（１９９３）に記載されているようなヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製されてもよい。あるいは、二重Ｆｃ領域を有し、それによって強化された補体溶解能力及びＡＤＣＣ能力を有し得る抗体を操作することができる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，３：２１９－２３０（１９８９）を参照のこと。
半減期
抗体の血清半減期を増やすために、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号に記載されているように抗体（特に、抗体断片）にサルベージ受容体結合エピトープを組み込んでもよい。本明細書で使用されるとき、「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）の生体内血清半減期を増やすのに関与するＩｇＧ分子のＦｃ領域のエピトープを指す。あるいは、抗体半減期はペグ化によって増やしてもよい。
本開示の結合タンパク質の活性をアッセイすること
結合アッセイ
そのようなアッセイの１つの形態は、例えば、Ｓｃｏｐｅｓ（１９９４），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇに記載されているような抗原結合アッセイである。そのような方法は一般に、ＨＥＲ２結合タンパク質を標識することと、不動化した抗原またはその断片、例えば、図１に示すような成熟した正常なまたは野生型のヒトＨＥＲ２の残基２９３～３０９を含むタンパク質とそれを接触させることとを含む。非特異的結合タンパク質を取り除くための洗浄に続いて、標識の量、及び結果としての結合タンパク質が検出される。当然ながら、ＨＥＲ２結合タンパク質を不動化し、抗原を標識することができる。パニング型アッセイも使用することができる。本明細書の実施例はフローサイトメトリーに基づく結合アッセイを記載している。
エピトープに対する結合について本発明のＨＥＲ２抗体を競合して阻害するＨＥＲ２結合タンパク質は、当該技術分野で知られている従来の競合結合アッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いてスクリーニングする及び同定することができる。
競合結合アッセイ
本開示の抗体（例えば、ｍＡｂ１０４）の結合を競合して阻害するＨＥＲ２結合タンパク質を測定するためのアッセイは当業者には明らかであろう。例えば、本開示の抗体を検出可能な標識、例えば、蛍光標識または放射性標識と結合させる。次に、標識抗体及び試験ＨＥＲ２結合タンパク質を混合し、ＨＥＲ２またはそのエピトープを含むペプチド（例えば、ヒトＨＥＲ２のドメインＩＩの残基２９３から３０９に対応する）と接触させる。次いで、標識抗体のレベルを測定し、ＨＥＲ２結合タンパク質の非存在下でＨＥＲ２またはそのエピトープを含むペプチドと標識抗体を接触させたときに測定したレベルと比較する。ＨＥＲ２結合タンパク質の非存在下と比べて試験ＨＥＲ２結合タンパク質の存在下での標識抗体のレベルが低下するならば、そのＨＥＲ２結合タンパク質はその抗体の結合を競合して阻害する。
任意で、試験ＨＥＲ２結合タンパク質を抗体とは異なる標識と結合させる。これによって、試験ＨＥＲ２結合タンパク質のタンパク質またはエピトープに対する結合のレベルを検出できるようになる。
別の例では、ＨＥＲ２またはそのエピトープを含むペプチドを本明細書に記載されている抗体に接触させるのに先立って、試験ＨＥＲ２結合タンパク質をＨＥＲ２またはそのエピトープを含むペプチドに結合させてもよい。ＨＥＲ２結合タンパク質の非存在下と比べて、ＨＥＲ２結合タンパク質の存在下での結合抗体の量の低下は、そのＨＥＲ２結合タンパク質が抗体のＨＥＲ２に対する結合を競合して阻害することを示す。また、標識ＨＥＲ２結合タンパク質を用いて、先ず抗体がＨＥＲ２またはそのエピトープを含むペプチドに結合できるようにして相互アッセイを実施することもできる。この場合、抗体の非存在下と比べて、抗体の存在下でのＨＥＲ２またはそのエピトープを含むペプチドに結合した標識ＨＥＲ２結合タンパク質の量の低下は、そのＨＥＲ２結合タンパク質が抗体のＨＥＲ２に対する結合を競合して阻害することを示す。
親和性アッセイ
任意で、ＨＥＲ２またはそのエピトープ含有ペプチドに対するＨＥＲ２結合タンパク質の解離定数（Ｋｄ）または会合定数（Ｋａ）または結合定数（ＫＤ、すなわち、Ｋａ／Ｋｄ）が測定される。ＨＥＲ２結合タンパク質についてのこれらの定数は、放射性標識または蛍光標識したＨＥＲ２結合アッセイによって測定される一例である。このアッセイは、用量設定系列の非標識ＨＥＲ２の存在下にて最小濃度の標識ＨＥＲ２によってＨＥＲ２結合タンパク質を平衡化する。結合していないＨＥＲ２を除去するために洗浄した後、標識の量を測定する。別の例によれば、定数は、表面プラズモン共鳴アッセイを使用することによって、例えば、不動化したＨＥＲ２またはその領域とともにＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用することによって測定される。
タンパク質検出アッセイ
本開示の一例は、ＨＥＲ２またはＨＥＲ２を発現している細胞（例えば、乳癌細胞）の存在を検出する。タンパク質または細胞の量、レベル、または存在は、当業者に知られている種々の技法のいずれかを用いて、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学検査、免疫蛍光法、免疫ブロット、ウェスタンブロット、ドットブロット、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、質量分光法（タンデム質量分光法、ＬＣ ＭＳ／ＭＳを含む）、バイオセンサー技術、エバネッセント光ファイバー技術、またはタンパク質チップ技術から成る群から選択される技法を用いて測定される。
一例では、タンパク質の量またはレベルの測定に使用されるアッセイは半定量的アッセイである。別の例では、タンパク質の量またはレベルの測定に使用されるアッセイは定量的アッセイである。
例えば、タンパク質は、免疫アッセイによって、例えば、免疫組織化学検査、免疫蛍光法、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光結合免疫吸着測定法（ＦＬＩＳＡ）、ウェスタンブロッティング、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、バイオセンサーアッセイ、タンパク質チップアッセイ、及び免疫染色アッセイ（例えば、免疫蛍光法）から成る群から選択されるアッセイを用いて検出される。
標準的な固相ＥＬＩＳＡまたはＦＬＩＳＡの形式は種々の試料からタンパク質の濃度を測定するのに特に有用である。
一形態では、ＥＬＩＳＡまたはＦＬＩＳＡは、本開示のＨＥＲ２結合タンパク質またはＨＥＲ２の異なるエピトープに結合するタンパク質を固体マトリックス上に、例えば、膜、ポリスチレンもしくはポリカーボネートマイクロウェル、ポリスチレンもしくはポリカーボネートディップスティック、またはガラス支持体上に不動化することを含む。次いで、試料を不動化したタンパク質との物理的関係に供し、ＨＥＲ２が結合される、または「捕捉」される。次いで、結合したＨＥＲ２は、ＨＥＲ２の異なるエピトープに結合する第２の標識化合物を用いて検出される。代わりに、第２の（検出）抗体を結合する第３の標識抗体を使用することができる。本明細書に記載されているアッセイ形式が高スループット形式、例えば、スクリーニングプロセスの自動化またはマイクロアレイ形式に適していることは当業者には明らかであろう。さらに、上述のアッセイの変形、例えば、競合ＥＬＩＳＡは当業者には明らかであろう。
代替的な例では、ポリペプチドは、当該技術分野で知られている方法、例えば、免疫組織化学検査または免疫蛍光法を用いて、細胞内または細胞上で検出される。免疫蛍光法を用いた方法は、定量的または少なくとも半定量的であるので例示的である。染色された細胞の蛍光の程度を定量化する方法は当該技術分野で知られており、例えば、Ｃｕｅｌｌｏ，１９８４に記載されている。
バイオセンサー装置は一般に、電流またはインピーダンスの測定要素と合わせて電極表面を用いて、（例えば、ＵＳ５５６７３０１に記載されているような）アッセイ基質と組み合わせて装置に統合される。本開示のＨＥＲ２結合タンパク質はバイオセンサー装置の表面上に組み込まれ、生体試料を当該装置に接触させる。バイオセンサー装置によって検出された電流またはインピーダンスの変化は、当該ＨＥＲ２結合タンパク質に対するタンパク質結合を示す。当該技術分野で知られているバイオセンサーのいくつかの形態はまた、タンパク質相互作用を検出するための表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）にも依存しており、それによって表面プラズモン共鳴における表面反射の変化は、リガンドまたは抗体に対するタンパク質結合を示す（ＵＳ５４８５２７７及びＵＳ５４９２８４０）。
バイオセンサーは、そのようなシステムをマイクロ尺度またはナノ尺度に適合させることが容易であるため、高スループット分析で特に使用される。さらに、そのようなシステムはいくつかの検出試薬を組み込むように好都合に適合され、単一バイオセンサー単位における診断試薬の多重化を可能にする。これによって、少量の体液にていくつかのタンパク質またはペプチドを同時に検出することが可能になる。
タンパク質のＨＥＲ２に対する結合は、実施例にて本明細書に記載されているようにフローサイトメトリーを用いて検出することもできる。
本開示の結合タンパク質によって結合されたエピトープ
本発明者らは、腫瘍形成性細胞、過剰増殖性細胞または異常な細胞に存在するが、野生型細胞または正常細胞には存在しないヒトＨＥＲ２のドメインＩＩにて立体構造上露出したエピトープに特異的な結合分子を生成している。この立体構造上露出したエピトープはドメインＩＩの遠位部分にあり、ジスルフィド結合が隣接し、この領域での柔軟な変化とｍＡｂ１０４結合のためのエピトープの露出とを可能にする。特に、エピトープは、ＨＥＲ２の増幅または活性化に応答して細胞にて露出されると思われる。本抗体について特に驚くべきことは、本抗体が、ＨＥＲ２の細胞外ドメインへのペルツズマブまたはトラスツズマブの結合を阻止しないということは、ドメインＩＩのこのエピトープ領域が立体構造上露出されると、これらの抗体の結合を阻止することなく本抗体が結合することを可能し、二重療法アプローチを可能にする可能性があることを示していることである。
ＨＥＲ２に結合しているペルツズマブの結晶構造が決定されている（Ｆｒａｎｋｌｉｎ ＭＣ．ｅｔ ａｌ．，（２００４），Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．５：３１７－３２８を参照のこと）。ペルツズマブはドメインＩＩの中心近くでＨＥＲ２に結合し、受容体の二量体化及びシグナル伝達に必要な結合ポケットを立体的に遮断する。ペルツズマブのＣＤＲ Ｈ３はＨＥＲ２の残基Ｌｙｓ３１１及びＨｉｓ２９６と疎水性接触及び水素結合接触を行うことが理解されている。Ｈｉｓ２９６はペルツズマブの結合時に完全に隠される。理論に束縛されることを望まないで、ペルツズマブはヘテロ二量体受容体パートナーの二量体化ループを受け入れるＨＥＲ２のポケットを閉塞することによってＨＥＲ２のヘテロ二量体化を特異的に阻害するので、本発明者らは、本発明の結合分子（例えば、ｍＡｂ１０４）がＨＥＲ２のエピトープループの別の面に結合することが立体的に可能であると仮定している。本発明者らは、受容体ががんにおけるＨＥＲ２過剰発現もしくは低酸素の状態でのレドックスジスルフィド結合切り替えもしくは異常発現による立体構造変化を受けるとき、またはＨＥＲ２が二量体化パートナーと結合し、立体構造変化を受けて、現在の結合分子によって結合されたループを見せて、それをさらにアクセスしやすくするとき、このエピトープはがん細胞表面上の受容体のサブセットに現れ得るという仮説を立てている。さらに、エピトープ領域内では、抗体はその領域内のすべてのアミノ酸に結合するわけではなく、ｍＡｂ１０４エピトープの立体構造の性質に起因して、これは、身近に対向するエピトープが双方の抗体の結合に影響を与えない理由を説明し得ることが知られている。
一例では、ＨＥＲ２結合タンパク質はＨＥＲ２のヘテロ二量体化を阻害する。
抗体複合体
本発明はまた、ある部分に複合体化された本明細書に記載されているＨＥＲ２結合タンパク質も提供する。ある部分は検出可能な標識または機能的な標識を含むことができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、該部分は、放射性同位元素、検出可能な標識、治療用化合物、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、対象にてＨＥＲ２結合タンパク質の半減期を増やす化合物、及びこれらの混合物から成る群から選択される。当業者によって理解されるように、該部分は上記のリストの１以上として分類することができる。例えば、該部分は治療用化合物及び毒素の双方として分類することができる。
いくつかの実施形態では、該部分は放射性同位元素である。好適な放射性同位元素には、同位体３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、４７Ｓｃ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、１２１Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔ、１９８Ａｕ、６７Ｃｕ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、２１３Ｂｉ、９９Ｔｃ、及び１８６Ｒｅが挙げられ、それらは抗体イメージングの技術分野で知られている従来の化学を用いて本発明の抗体に連結されてもよい。
いくつかの実施形態では、該部分は検出可能な標識である。好適な検出可能な標識には、例えば、同位体３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、４７Ｓｃ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、１２１Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔ、１９８Ａｕ、６７Ｃｕ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、２１３Ｂｉ、９９Ｔｃ、及び１８６Ｒｅのような放射性標識が挙げられるが、これらに限定されず、それらは抗体イメージングの技術分野で知られている従来の化学を用いて本発明の抗体に連結されてもよい。標識にはまた、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリトリン）、及び当該技術分野で従来通りにＭＲＩ－ＣＴイメージングに使用されている標識も挙げられる。それらには、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β－グルコロニダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、アルカリホスファターゼ、及びクロラムフェニコールトランスフェラーゼのような酵素標識も含まれる。標識にはまた、Ｔ７－、Ｈｉｓ－、ｍｙｃ－、ＨＡ－、ＦＬＡＧ－タグのようなペプチドタグも含まれる。標識にはさらに、特異的な同族の検出可能な部分、例えば、標識されたアビジンへの結合を介して検出されてもよいビオチンのような化学部分が含まれる。標識には電子密度の高い試薬；エネルギー伝達分子；常磁性標識、化学発光（イミダゾール、ルシフェラーゼ）；及び生物発光剤も含まれる。
いくつかの実施形態では、該部分は核酸である。好適な核酸には、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、デオキシリボザイムまたはリボザイムが挙げられる。
いくつかの実施形態では、該部分は治療用化合物である。好適な治療用化合物には、生物学的応答を改変することができる（例えば、限定しないで、細胞の発現活性を阻害するもしくは防止する、細胞の破壊を引き起こす、または他の方法で細胞の機能に影響を与える）化合物が挙げられる。そのような治療用化合物には、例えば、限定しないで、化学的切除剤、毒素、免疫調節剤、サイトカイン、細胞傷害剤、化学療法剤及び／または薬物が含まれ、以下の４－デスアセチルビンブラスチン－３－カルボヒジアジド；５－フルオロ－２’－デオキシウリジン；５－フルオロウラシル；５－フルオロウラシルデカルボナイズ；６－メルカプトプリン；６－チオグアニン；アブリン；アブリンＡ鎖；アクチノマイシンＤ；１－デヒドロテストステロン；アドリアマイシン；Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質；アルキル化剤；アルキルホスホコリン；アミノプテリン；アンギオゲニン；アンギオスタチン；アントラサイクリン；アントラマイシン；抗血管新生剤；葉酸拮抗剤；代謝拮抗剤；抗有糸分裂剤；抗生物質；ａｒａ－Ｃ；アスパラギナーゼオーリスタチン誘導体（例えば、限定しないで、そのそれぞれは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００８／０３００１９２号、２００９／００１８０８６号、２００９／００１８０８６号、及び２００９／０１１１７５６号を参照のこと）；オーリスタチンＥ（例えば、限定しないで、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，６３５，４８３号を参照のこと）；オーリスタチンＥバレリルベンジルヒドラゾン；オーリスタチンＦフェニレンジアミン；オーリスタチン；オーロマイシン；ビスヨードフェノールマスタード；ビスマス；ブレオマイシン；ブスルファン；カリケアマイシン；カルボプラチン；カルミノマイシン；カルムスチン；ｃｃ－１０６５化合物（例えば、限定しないで、そのそれぞれはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，４７５，０９２号、第５，５８５，４９９号、第５，８４６，５４５号、第６，５３４，６６０号、第６，５８６，６１８号、第６，７５６，３９７号、第７，０４９，３１６号、第７，３２９，７６０号、第７，３８８，０２６号、第７，６５５，６６０号及び第７，６５５，６６１号、米国特許公開第２００７／０１３５３４６号、２００８／０２６０６８５号、２００９／０２８１１５８号、及び２００９／０３１８６６８号、ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ２００９／０１７３９４を参照のこと）；クロラムブシル；シス－ジクロロジアミン白金（シスプラチン）；クラドリビン；コルヒチン（コルヒチン）；コンブレスタチン；クロチン；キュリシン；シクロホスファミド；シタラビン；サイトカラシンＢ；シトシンアラビノシド；サイトキシン；ダカルバジン；ダクチノマイシン（アクチノマイシン）；ダウノルビシン（ダウノマイシン）；ジアンチンタンパク質；ジブロモマンニトール；ジヒドロキシアントラセンジオン；ジフテリア毒素；ドラスタチン－１０；ドキセタキセル；ドキソルビシン；ドキソルビシンヒドラジド；デュオカルマイシン（例えば、限定しないで、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，２１４，６８５号を参照のこと）；エメチン；エンドスタチン；エンジイン；エノマイシン；エピルビシン；エスペラミシン化合物（例えば、限定しないで、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第４，６７５，１８７号を参照のこと）；臭化エチジウム；エトポシド；フルダラビンジェロニン；ゲフィチニブ、ゲムシタビン；グルココルチコイド；グラミシジンＤ；顆粒球コロニー刺激因子；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；イダルビシン；挿入剤；インターロイキン－１；インターロイキン－２；インターロイキン－６；リドカイン；ロムスチン；リンホカイン；メイタンシノール（例えば、限定しないで、そのそれぞれはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第４，１３７，２３０号、第４，１５１，０４２号、第４，１６２，９４０号、第４，１９０，５８０号、第４，２２５，４９４号、第４，２２８，２３９号、第４，２４８，８７０号、第４，２５６，７４６号、第４，２６０，６０８号、第４，２６３，２９４号、第４，２６４，５９６号、第４，２６５，８１４号、第４，２９４，７５７号、第４，３０７，０１６号、第４，３０８，２６８号、第４，３０８，２６９号、第４，３０９，４２８号、第４，３１７，８２１号、第４，３２０，２００号、第４，３２２，３４８号、第４，３３１，５９８号、第４，３６０，４６２号、第４，３６１，６５０号、第４，３６２，６６３号、第４，３６４，８６６号、第４，３７１，５３３号、第４，４２４，２１９号、第４，４５０，２３４号、第５，１４１，７３６号、及び第５，２１７，７１３号を参照のこと）；メクロレタミン；メルファラン（及び他の関連するナイトロジェンマスタード）；メソトレキセート；マイナーグルーブバインダー；ミトラマイシン；ミトゲリン；マイトマイシンＣ；マイトマイシン；ミトキサントロン；ＭＭＡＦ－ジメチルアミノエチルアミン；ＭＭＡＦ－Ｎｔ－ブチル；ＭＭＡＦ－テトラエチレングリコール；モデシンＡ鎖；ツルレイシ阻害剤；モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）（例えば、限定しないで、そのそれぞれは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，８８４，８６９号、第７，０９８，３０８号、第７，２５６，２５７号、及び第７，４２３，１１６号、ならびに米国特許公開第２００３／００８３２６３号、２００４／０１５７７８２号、２００５／０００９７５１号、２００５／０１１３３０８号、及び２００６／０２２９２５３号を参照のこと）；モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）（例えば、限定しないで、そのそれぞれはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，４９８，２９８号、ならびに米国特許公開第２００８／０２２６６５７号、２００８／０２４８０５１号、２００８／０２４８０５３号、及び２００９／００４７２９６号を参照のこと）；モルホリノドキソルビシン；Ｎ２’－デアセチル－Ｎ２’－（ｃ－メルカプト－１オキソプロピル）－メイタンシン（ＤＭ１）（例えば、限定しないで、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，２０８，０２０号を参照のこと）；Ｎ２’－デアセチル－Ｎ２’－（４－メルカプト－４－メチル－１－オキソペンチル）－メイタンシン（ＤＭ４）（例えば、限定しないで、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，２７６，４９７号を参照のこと）；ネオカルジノスタチン；神経成長因子（及び他の成長因子）；オナプリストーン；パクリタキセル；ＰＥ４０；フェノマイシン；ｐＨｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ－Ｓ）；血小板由来成長因子；プリカマイシン；プレドニゾン；プロカイン；プロカルバジン；プロプラノロール；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ；ピューロマイシン；ピロロベンゾジアゼピン、放射性同位元素（例えば、限定しないでＡｔ２１１、Ｂｉ２１２、Ｂｉ２１３、Ｃｆ２５２、Ｉ１２５、Ｉ１３１、Ｉｎ１１１、Ｉｒ１９２、Ｌｕ１７７、Ｐ３２、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｙ９０、及びＷ１８８）；レトストリクトシン；レストリクトシン；リシンＡ；リシン；Ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤；サポリン；ストレプトゾトシン；スラミン；タモキシフェン；タキサン；タキソイド；タキソール；テニポシド；テトラカイン；チオエパクロラムブシル；チオテパ；血栓剤；組織プラスミノーゲン活性化因子；トポイソメラーゼＩ阻害剤；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤；トキソテレ；トリコテセン；腫瘍壊死因子；ビンブラスチン；ビンカアルカロイド；ビンカ；ビンクリスチン；ビンデシン；ビノレルビン；イットリウム；α－インターフェロン；α－サルシン；及びβ－インターフェロン、ならびにそれらの類似体、同族体、断片、変異形、及び誘導体（参照によってその全体が本明細書に組み込まれるＧａｒｎｅｔｔ，（２００１），Ａｄｖａｎｃｅｄ ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，５３：１７１－２１６も参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましい実施形態では、治療用化合物は、オーリスタチンもしくはその誘導体、メイタンシンもしくはその誘導体（メイタンシノイドとも呼ばれる）またはピロロベンゾジアゼピンまたはその誘導体から成る群から選択される。一例では、治療剤は、Ｎ２’－デアセチル－Ｎ２’－（ｃ－メルカプト－１オキソプロピル）－メイタンシン（ＤＭ１）である。別の例では、治療剤はモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。別の例では、治療剤はピロロベンゾジアゼピンである。
本開示はまた、例えば、ＷＯ９３／２１２３２に記載されているような免疫毒素複合体も企図する。
好適なコロイドには、金コロイド及び金ナノ粒子が挙げられる。ＨＥＲ２結合タンパク質は、当業者に既知の技術によってコロイドに結合させてもよい（Ｊａｚａｙｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（２０１６），Ｓｅｎｓｉｎｇ ａｎｄ Ｂｉｏ－Ｓｅｎｓｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９：１７－２２を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、該部分は毒素である。好適な毒素には、細菌、真菌、植物もしくは動物が起源の酵素的に活性がある毒素、またはそのような毒素の酵素的に活性がある断片が挙げられるが、これらに限定されない。使用される酵素的に活性がある毒素及びそれらの断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ－サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンシンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ－Ｓ）、ツルレイシ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンである。
いくつかの実施形態では、該部分は、対象におけるＨＥＲ２結合タンパク質の半減期を増やす化合物である。対象にてＨＥＲ２結合タンパク質の半減期を増やす好適な化合物には、ＰＥＧ、組換えＰＥＧ模倣物（ＸＴＥＮ、エラスチン様ポリペプチド、ゼラチン様ポリペプチド及び（Ｐｒｏ－Ａｌａ－ＳＥＲ）ｎのような柔軟なポリペプチドを含む）、炭水化物（例えば、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、ポリシアル酸、ヒアルロン酸）及びペプチド／ポリペプチド（例えば、アルブミン及びＩｇＧのＦｃポルチン）が挙げられる。
さらに、本開示のＨＥＲ２結合タンパク質、特に抗体及びその断片は、二次抗体に結合されて抗体ヘテロ複合体を形成してもよく（例えば、限定しないで、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第４，６７６，９８０号を参照のこと）、単独で、または別の薬剤（例えば、限定しないで、上記の薬剤）との併用で（それに連結させたまたは結合させた薬剤の有無にかかわらず）投与されてもよく、及び／またはプロドラッグをその活性型に変換することができる抗がんプロドラッグ活性化酵素に結合させてもよい。
当業者によって理解されるように、上記の部分、と同様に他の好適な部分は任意の好適な方法で本開示のＨＥＲ２結合タンパク質、特に抗体及びその断片に結合されてまたは連結されて抗体複合体を作り出してもよい。例えば、限定しないで、本発明の種々の実施形態では、ＨＥＲ２結合タンパク質（複数可）及び部分はリンカー、スペーサー及び／またはストレッチャー化合物を使用して共有結合されてもよく、及び／または複合体化されてもよく、本発明の種々の実施形態では、切断可能であり、切断不可能であり、その結果、薬剤（複数可）が標的細胞によって内部移行される。
例えば、そのようなリンカー、スペーサー及び／またはストレッチャー化合物には、以下：アミノ安息香酸スペーサー（例えば、限定しないで、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，０９１，１８６号及び第７，５５３，８１６号を参照のこと）；マレイミドカプロイル；ｐ－アミノベンジルカルバモイル（ＰＡＢ）；リソソーム酵素切断可能リンカー（例えば、限定しないで、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，２１４，３４５号を参照のこと）；マレイミドカプロイル－ポリエチレングリコール（ＭＣ（ＰＥＧ）６－ＯＨ）；Ｎ－メチル－バリンシトルリン；４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸Ｎ－スクシンイミジル（ＳＭＣＣ）（例えば、限定しないで、参照によってその全体が本明細書に組み込まれるＹｏｓｈｉｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，３９５－３９９を参照のこと）；４－（２－ピリジルジチオ）ブタン酸Ｎ－スクシンイミジル（ＳＰＤＢ）（例えば、限定しないで、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第４，５６３，３０４号を参照のこと）；４－（２－ピリジルチオ）ペンタン酸Ｎ－スクシンイミジル（ＳＰＰ）；バリン－シトルリン；及び他のリンカー、スペーサー、及び／またはストレッチャー化合物（例えば、限定しないで、これらのそれぞれは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，０９０，８４３号、第７，２２３，８３７号、及び第７，６５９，２４１号、ならびに米国特許公開第２００４／００１８１９４号、第２００４／０１２１９４０号、第２００６／０１１６４２２号、２００７／０２５８９８７号、２００８／０２１３２８９号、２００８／０２４１１２８号、２００８／０３１１１３６号、２００８／０３１７７４７号、及び２００９／００１０９４５号を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。
一般的に言えば、上記の部分、と同様に他の部分を本開示のＨＥＲ２結合タンパク質、特に抗体及びその断片に結合する及び／またはそれと複合体化する技法は当該技術分野で知られている。本発明の種々の実施形態では、ＨＥＲ２結合タンパク質及（複数可）及び部分はＨＥＲ２結合タンパク質に存在するリジン残基またはシステイン残基を介して共有結合されてもよいし、及び／または複合体化されてもよい。一実施形態では、該部分、ＭＭＡＥはシステイン残基との複合体化によって結合される。一実施形態では、該部分、ＤＭ１はシステイン残基との複合体化によって結合される。一実施形態では、該部分、ＰＢＤ（ピロロベンゾジアゼピン）はシステイン残基との複合体化によって結合される。好適な複合体化化学はＪａｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３２：３５２６にて概説されている。例えば、限定しないで、そのそれぞれは参照によってその全体が本明細書に組み込まれるＡｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３－５６（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．６２３－５３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５－５０６（１９８５）；“Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．３０３－１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５），及びＴｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９－５８，（１９８２），Ｐａｒｓｌｏｗ ｅｔ ａｌ．（２０１６），Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ，４，１４も参照のこと。
結合部分がペプチドまたはポリペプチドである実施形態では、複合体は、ＨＥＲ２結合タンパク質とペプチドまたはポリペプチドとが単一の連続ポリペプチド鎖を形成する融合タンパク質であってもよい。そのような融合タンパク質は、組換え技術または合成技術を含む、当該技術分野で知られている技術を使用して作製されてもよい。
また、その断片を含む抗体、及び特異的結合メンバー、抗体及び／またはそれらのサブユニットの産生または活性を調節する薬物は特定の診断応用を持ってもよく、且つ、例えば、過剰増殖性細胞増殖などに関連する、またはそれに起因するがん、前がん病変、状態のような状態を検出する及び／または測定する目的で利用されてもよい。例えば、特異的結合メンバー、抗体またはそれらのサブユニットを使用して、例えば、融合マウス脾臓リンパ球及び骨髄腫細胞を利用するハイブリドーマ技術のような既知の技術によって、種々の細胞培地にてそれ自体に対するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の双方を作り出してもよい。同様に、本発明の特異的結合メンバーの活性（複数可）を模倣するまたはそれに拮抗する小分子が発見されてもよいし、または合成されてもよく、且つそれは診断プロトコール及び／または治療プロトコールで使用されてもよい。
放射性標識された特異的結合メンバー、特に抗体及びその断片は、試験管内診断技術及び生体内放射性イメージング技術及び放射性免疫療法にて有用である。生体内イメージングの場合、本発明の特異的結合メンバーは、磁気共鳴画像増強剤を含むが、これに限定されない、放射性同位元素ではなくイメージング剤と複合体化されてもよく、その際、例えば、抗体分子はキレート基を介して多数の常磁性イオンで満たされる。キレート基の例には、ＥＤＴＡ、ポルフィリン、ポリアミンクラウンエーテル、及びポリオキシムが挙げられる。常磁性イオンの例には、ガドリニウム、鉄、マンガン、レニウム、ユーロピウム、ランタン、ホルミウム、及びフェルビウムが挙げられる。本発明のさらなる態様では、放射性標識された特異的結合メンバー、特に抗体及びその断片、特に放射性免疫複合体は、特にがん治療のための放射性標識抗体として放射性免疫療法において有用である。その上さらなる態様では、放射性標識された特異的結合メンバー、特に抗体及びその断片は放射性免疫誘導手術技術において有用であり、その際、それらはがん細胞、前がん細胞、腫瘍細胞、及び／または過剰増殖細胞の存在及び／または位置を、そのような細胞を除去するための手術前、手術中、または手術後に識別することができ、示すことができる。
競合的阻害
本発明のＨＥＲ２抗体のエピトープに対する結合を競合して阻害する抗体は、当該技術分野で既知の従来の競合結合アッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いてスクリーニングする及び同定することができる。
本発明の組成物
本開示に係るその複合体を含むＨＥＲ２結合タンパク質はふつう、医薬組成物の形態で投与され、それはＨＥＲ２結合タンパク質、ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片に加えて少なくとも１つの成分を含んでもよい。したがって、本開示に係る、且つ本発明に従って使用するための医薬組成物は有効成分に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定剤、または当業者に周知の他の材料を含んでもよい。そのような材料は無毒でなければならず、且つ有効成分の有効性を妨げてはならない。担体または他の材料の正確な性質は、経口であってもよい、または注射、例えば静脈内注射であってもよい投与経路に依存するであろう。
経口投与用の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、粉末または液体の形態であってもよい。錠剤はゼラチンまたはアジュバントのような固形担体を含んでもよい。液体医薬組成物は一般に、水、石油、動物油または植物油、鉱油または合成油のような液状担体を含む。生理食塩水、デキストロースもしくは他の糖類溶液、または例えば、エチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールのようなグリコールが含まれてもよい。
静脈内注射、または苦痛の部位での注射については、有効成分は、発熱物質を含まず、好適なｐＨ、等張性及び安定性を有する非経口で許容される水溶液の形態であろう。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射、リンガー注射、乳酸リンガー注射のような等張性ビヒクルを使用して好適な溶液を上手く調製することができる。必要に応じて、防腐剤、安定剤、緩衝液、酸化防止剤及び／または他の添加剤を含めてもよい。
いくつかの実施形態では、リポソーム及び／またはナノ粒子はまた、有効成分とともに採用されてもよい。リポソームの形成及び使用は当業者に一般に知られている。リポソームは水性媒体に分散させているリン脂質から形成することができ、多重膜同心円二重層小胞（多重膜小胞（ＭＬＶ）とも称される）を自発的に形成する。ＭＬＶは一般に２５ｎｍ～４μｍの直径を有することができる。ＭＬＶの超音波処理は、コアに水溶液を含有する２００～５００オングストロームの範囲の直径を持つ小さな単層小胞（ＳＵＶ）の形成をもたらす。リン脂質は、水に分散させると、脂質の水に対するモル比に応じてリポソーム以外の様々な構造を形成することができる。低い比ではリポソームが好ましい構造である。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度、及び二価カチオンの存在に依存する。リポソームは、イオン性及び極性の物質に対し低い透過性を示すことができるが、高温では透過性を顕著に変化させる相転移を受ける。相転移は、ゲル状態として知られる密に充填された秩序構造から、流体状態として知られる疎に充填された低秩序構造への変化を伴う。
ＨＥＲ２結合タンパク質またはそれを含む組成物は、単独で投与されてもよく、または他の治療、治療薬もしくは薬剤と併用して、治療される状態に応じて同時にもしくは順次のいずれかで投与されてもよい。加えて、本開示は、本明細書に記載されているＨＥＲ２結合タンパク質と、例えば、抗がん剤もしくは治療薬、ホルモン、他の抗ＨＥＲ２剤もしくは抗体、または抗ＥＧＦＲ剤もしくは抗体のような他の薬剤または治療薬とを含む組成物を企図し、且つ含む。さらに一般的には、これらの抗がん剤は、チロシンキナーゼ阻害剤もしくはリン酸化カスケード阻害剤、翻訳後モジュレーター、細胞増殖もしくは分裂の阻害剤（例えば、抗有糸分裂剤）、またはシグナル伝達阻害剤であってもよい。他の治療または治療薬には、例えば、非ステロイド性抗炎症薬（例えば、アスピリン、パラセタモール、イブプロフェンまたはケトプロフェン）のような好適な用量の鎮痛薬またはモルヒネのようなアヘン剤、または制吐剤の投与が含まれてもよい。組成物は、チロシンキナーゼ阻害剤（ＡＧ１４７８及びＺＤ１８３９、ＳＴＩ５７１、ＯＳＩ－７７４、ＳＵ－６６６８を含むが、これらに限定されない）、ドキソルビシン、テモゾロミド、シスプラチン、カルボプラチン、ニトロソウレア、プロカルバジン、ビンクリスチン、ヒドロキシ尿素、５－フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、エピポドフィロトキシン、カルムスチン、ロムスチン、及び／または他の化学療法剤と併用して（順次（すなわち、前または後に）または同時に）投与することができる。したがって、これらの薬剤は、抗ＨＥＲ２特異的薬剤、またはラパチニブ、アファチニブ、ＡＧ１４７８、ＺＤ１８３９、ＳＴＩ５７１、ＯＳＩ－７７４、もしくはＳＵ－６６６８のようなチロシンキナーゼ阻害剤であってもよい、あるいはさらに一般的な抗がん剤及び抗腫瘍剤、例えば、ドキソルビシン、シスプラチン、テモゾロミド、ニトロソウレア、プロカルバジン、ビンクリスチン、ヒドロキシ尿素、５－フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、エピポドフィロトキシン、カルムスチン、またはロムスチンであってもよい。加えて、組成物は、デキサメタゾンのようなホルモン、インターロイキンのような免疫調節因子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）または免疫応答及びがん細胞もしくは腫瘍の減少もしくは排除を刺激する他の成長因子もしくはサイトカイン、または血管新生阻害剤とともに投与されてもよい。
いくつかの例では、ＨＥＲ２結合タンパク質またはそれを含む組成物は、化学療法剤、放射性免疫療法剤または免疫療法剤と併用される。一例では、免疫療法剤はチェックポイント阻害剤である。さらなる例では、チェックポイント阻害剤はイピリムマブ（ＣＴＬＡ４）、ニボルマブ（ＰＤ－１）、ペンブロリズマブ（ＰＤ－１）、アテゾリズマブ（ＰＤ－Ｌ１）、アベルマブ（ＰＤ－Ｌ１）、デュルバルマブ（ＰＤ－Ｌ１）及びセミプリマブ（ＰＤ－１）から選択される。
いくつかの例では、ＨＥＲ２結合タンパク質またはそれを含む組成物は免疫抑制薬とともに投与される。
いくつかの例では、ＨＥＲ２結合タンパク質またはそれを含む組成物は免疫調節剤とともに投与される。好適な免疫調節剤の例には、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２）、サイトカイン（例えば、インターフェロン、Ｇ－ＣＳＦ）、ケモカイン（例えば、ＣＣＬ３、ＣＣＬ２６及びＣＸＣＬ７）、及び免疫調節イミド薬（例えば、サリドマイド）が挙げられる。
本開示のＨＥＲ２結合タンパク質は、任意の好適な経路を介してふつう血流もしくはＣＳＦへの注射によって、または腫瘍の部位に直接、治療を必要とする患者に投与されてもよい。正確な用量は、抗体が診断用か治療用か、腫瘍のサイズ及び位置、ＨＥＲ２結合タンパク質の正確な性質（抗体全体、断片、ダイアボディなどのいずれか）、ならびに抗体に結合させた検出可能なまたは機能的な標識の性質を含む多数の因子に左右されるであろう。放射性核種が治療法に使用される場合、好適な最小の単回用量は約４５ｍＣｉ／ｍ２で、最大約２５０ｍＣｉ／ｍ２までである。好ましい投与量は１５～４０ｍＣｉの範囲であり、さらに好ましい投与量範囲は２０～３０ｍＣｉ、または１０～３０ｍＣｉである。そのような治療法は骨髄または幹細胞の置換を必要としてもよい。腫瘍イメージングまたは腫瘍治療のいずれかのための典型的な抗体用量は０．５～４０ｍｇの範囲であり、好ましくは、Ｆ（ａｂ’）２形態の抗体の１～４ｍｇであろう。裸の抗体は、用量あたり２０～１０００ｍｇのタンパク質、または用量あたり２０～５００ｍｇのタンパク質、または用量あたり２０～１００ｍｇのタンパク質の用量で投与することが好ましい。これは、成人患者の単回治療の用量であり、それは小児及び乳児については比例して調整されてもよく、分子量に比例して他の抗体型式についても調整されてもよい。治療は、医師の裁量によって毎日、週に２回、毎週、または毎月の間隔で繰り返されてもよい。
好適な血管新生阻害剤（抗血管新生剤）の例には、ウロキナーゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤（例えば、マリマスタット、ネオバスタット、ＢＡＹ１２９５６６、ＡＧ３３４０、ＢＭＳ２７５２９１及び同様の薬剤）、内皮細胞遊走及び増殖の阻害剤（例えば、ＴＮＰ４７０、スクアラミン、２メトキシエストラジオール、コンブレタスタチン、エンドスタチン、アンギオスタチン、ペニシラミン、ＳＣＨ６６３３６（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ－Ｐｌｏｕｇｈ Ｃｏｒｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＮＪ）、Ｒ１１５７７７（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ，Ｉｎｃ，Ｔｉｔｕｓｖｉｌｌｅ，ＮＪ）及び類似の薬剤）、血管新生成長因子のアンタゴニスト（例えば、ＺＤ６４７４、ＳＵ６６６８、血管新生剤及び／またはそれらの受容体（例えば、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、及びアンギオポエチン１）に対する抗体、サリドマイド、サリドマイド類似体（例えば、ＣＣ５０１３）、Ｓｕｇｅｎ５４１６、ＳＵ５４０２、抗血管新生リボザイム（例えば、アンギオザイム）、インターフェロンα（例えば、インターフェロンα２ａ）、スラミン及び類似の薬剤）、ＶＥＧＦ－Ｒキナーゼ阻害剤及び他の抗血管新生チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、ＳＵ０１１２４８）、内皮特異的インテグリン／サバイバルシグナル伝達の阻害剤（例えば、ビタキシン及び類似の薬剤）、銅アンタゴニスト／キレート剤（例えば、テトラチオモリブデート、カプトプリル及び類似の薬剤）、カルボキシアミドトリアゾール（ＣＡＩ）、ＡＢＴ６２７、ＣＭ１０１、インターロイキン１２（ＩＬ１２）、ＩＭ８６２、ＰＮＵ１４５１５６Ｅと同様に血管新生を阻害するヌクレオチド分子（例えば、アンチセンス－ＶＥＧＦ－ｃＤＮＡ、アンギオスタチンをコードするｃＤＮＡ、ｐ５３をコードするｃＤＮＡ、及びＶＥＧＦ受容体２の欠損をコードするｃＤＮＡ）及び同様の薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。血管新生、新血管形成、及び／または他の血管形成の阻害剤の他の例は、抗血管新生ヘパリン誘導体及び関連分子（例えば、ヘペリナーゼＩＩＩ）、テモゾロミド、ＮＫ４、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、シクロオキシゲナーゼ２阻害剤、低酸素誘導性因子１の阻害剤、抗血管新生ダイズイソフラボン、オルチプラズ、フマギリン及びその類似体、ソマトスタチン類似体、ポリ硫酸ペントサン、テコガランナトリウム、ダルテパリン、タムスタチン、トロンボスポンジン、ＮＭ３、コンブレスタチン、カンスタチン、アバスタチン、他の関連標的に対する抗体（例えば、抗アルファ－ｖ／ベータ－３インテグリン及び抗キニノスタチンｍＡｂ）ならびに同様の薬剤である。
細胞の生存率及び増殖の測定
細胞傷害及び生存率（細胞アポトーシス、溶解、増殖増殖など）は、当該技術分野で知られ、本明細書の実施例に記載されているように、熱量測定、発光、放射性測定、または蛍光測定のアッセイに基づいて種々の方法で測定することができる。細胞生存率を決定するための比色技術には、例えば、トリパンブルー排除が挙げられる。簡単に説明すると、細胞をトリパンブルーで染色し、血球計算盤を使用してカウントする。生細胞は色素を排除するのに対して、死細胞及び死にかけている細胞は青色の色素を取り込み、光学顕微鏡で容易に区別される。ニュートラルレッドは生細胞に吸着され、細胞リソソームに濃縮される；ニュートラルレッドで染色された細胞の数を定量化することによって、光学顕微鏡で生細胞を決定することができる。
細胞生存率を決定するための蛍光測定技術には、例えば、蛍光ＤＮＡ挿入剤であるヨウ化プロピジウムが含まれる。ヨウ化プロピジウムは生細胞から排除されるが、死細胞の核を染色する。次に、ヨウ化プロピジウム標識細胞のフローサイトメトリーを使用して、生細胞及び死細胞を定量化することができる。乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出は、細胞の構造的損傷及び死を示し、分光光度酵素アッセイで測定することができる。ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）は、新しく合成されたＤＮＡに組み込まれており、蛍光色素標識抗体で検出することができる。蛍光色素Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８はＤＮＡを標識し、細胞の増殖を定量化するのに使用することができる（例えば、フローサイトメトリー）。蛍光色素カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥまたはＣＦＤＡ－ＳＥ）の定量的な組み込みは、細胞分裂分析（例えば、フローサイトメトリー）を提供することができる。この技法は、試験管内または生体内のいずれかで使用することができる。７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）は、ＤＮＡと結合するとスペクトルシフトを受ける蛍光インターカレーターであり、細胞分裂分析（例えば、フローサイトメトリー）を提供することができる。
細胞増殖を測定するための放射性測定技法には、例えば、生細胞の新しく合成されたＤＮＡに組み込まれ、細胞の増殖を測定するのに使用されることが多い［３Ｈ］－チミジンが含まれる。死細胞からのクロム（５１Ｃｒ）放出は細胞の生存率を定量化するためにシンチレーションカウンティングによって定量化することができる。
細胞生存率を測定するための発光技法には、例えば、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）が含まれる。この技法は、存在するＡＴＰの量を定量化して生細胞の数を決定する。
細胞生存率及び細胞増殖を測定するための市販のキットには、例えば、細胞増殖Ｂｉｏｔｒａｋ ＥＬＩＳＡ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）；蛍光試薬の差次取り込みに基づいた迅速な細胞数及び生存率の決定を提供するＧｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔアッセイ（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，Ｃａｌｉｆ．）；ＣｙＱＵＡＮＴ細胞増殖アッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）；及びＣｙｔｏＬｕｘアッセイキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）が挙げられる。ＤＥＬＦＩＡアッセイキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）は時間分解蛍光測定法を使用して細胞増殖及び生存率を測定することができる。Ｑｕａｎｔｏｓ細胞増殖アッセイは溶解した細胞からのＤＮＡ色素複合体の蛍光を測定する蛍光系のアッセイである（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存率アッセイは細胞生存率を測定するための発光アッセイである（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）。
使用
（ｉ）診断及び治療の応用
それによって、結合タンパク質（複数可）が、腫瘍形成性細胞、過剰増殖性細胞または異常な細胞に見いだされ、正常なまたは野生型の細胞では検出できないＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２エピトープを認識する、且つ該タンパク質（複数可）が増幅されたＥＧＦＲに結合するが、野生型ＨＥＲ２には結合しない、本開示のＨＥＲ２結合タンパク質、特に抗体またはその断片の独特の特異性は、多数の腫瘍形成性細胞の種類及び腫瘍の種類、例えば、頭頸部、乳房、肺、膀胱または前立腺の腫瘍及び神経膠腫を特定する、特徴付ける、標的化する及び治療する、軽減するまたは排除するための診断応用及び治療応用を提供するが、これまでに知られているＨＥＲ２抗体で見られ得る正常な組織取り込みに関連する問題はない。
したがって、（例えば、増幅によって）ＨＥＲ２を過剰発現する細胞は、本開示の結合タンパク質（複数可）、特に抗体（複数可）またはその断片を利用して認識され、単離され、特徴付けられ、標的化され、そして治療されまたは排除されてもよい。
したがって、本開示のＨＥＲ２結合タンパク質（例えば、抗体）は、ＨＥＲ２過剰発現が存在する腫瘍または細胞を染色するまたは他の方法で認識することによって、ＨＥＲ２腫瘍または腫瘍形成性細胞の性質を特異的に分類することができる。さらに、ｍＡｂ１０４によって例示されるような本発明の抗体は、増幅されたＨＥＲ２及びＨＥＲ２陽性異種移植片を含有する腫瘍に対して有意な生体内抗腫瘍活性を示す。
上で概説したように、本発明者らは、本開示のＨＥＲ２結合タンパク質が、腫瘍関連形態のＨＥＲ２を認識するが、正常細胞で発現された場合、正常な野生型受容体を認識しないことを見いだした。抗体認識は、結合のために立体構造上露出したエピトープを利用できるようにするＨＥＲ２の増幅または活性化に応答する立体構造に依存すると考えられている。
ｍＡｂ１０４は、ヒト腫瘍の過剰発現された（例えば、増幅された）ＨＥＲ２異種移植片の増殖を阻害し、そのような腫瘍内で壊死を誘導することが示された。
（ｉｉ）治療用ＨＥＲ２結合タンパク質及び使用
本開示のＨＥＲ２結合タンパク質の、特に腫瘍：血液の比及びクリアランスの速度に関する生体内特性は少なくともｍＡｂ１０４に匹敵するであろう。ヒトまたは動物の対象への投与後、そのような特異的結合メンバーは、＞１：１の腫瘍の血液に対するピーク比を示すであろう。好ましくは、そのような比で、特異的結合メンバーはまた、１：１より大きい、好ましくは２：１より大きい、さらに好ましくは５：１より大きい腫瘍の臓器に対する比も有するであろう。好ましくは、そのような比で、結合タンパク質はまた、腫瘍の部位から離れた臓器において＜１：１の臓器の血液に対する比も有するであろう。これらの比率は、異化作用の臓器及び投与された結合タンパク質の分泌を除外する。したがって、ｓｃＦｖ及びＦａｂの場合、結合メンバーは腎臓を介して分泌されるであろう。ＩｇＧ全体の場合、クリアランスは少なくとも部分的に肝臓を介するであろう。インタクトな抗体のピーク局在比はふつう、ＨＥＲ２結合タンパク質の投与後１０～２００時間の間で達成されるであろう。さらに具体的には、該比率は、無胸腺ヌードマウスの片側の脇腹に皮下で形成された約０．２～１．０ｇの腫瘍異種移植片で測定されてもよい。
本開示のＨＥＲ２結合タンパク質（例えば、抗体）は、検出可能なまたは機能的な標識または部分で標識されてもよい。当業者によって理解されるように、標識は１を超えるカテゴリーのもとで定義され得る。検出可能な標識には、例えば、同位体３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２１Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１５Ｉｎ、２１１Ａｔ、１９８Ａｕ、６７Ｃｕ、２２５Ａｃ、２１３Ｂｉ、９９Ｔｃ、１８６Ｒｅような放射性標識が挙げられるが、これらに限定されず、それらは抗体イメージングの技術分野で知られている従来の化学を用いて本開示の抗体に連結されてもよい。標識にはまた、蛍光標識、及び当該技術分野で従来通りにＭＲＩ－ＣＴイメージングに使用されている標識も含まれる。それらにはまた、西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素標識も含まれる。標識にはさらに、特異的な同族の検出可能な部分、例えば、標識されたアビジンへの結合を介して検出され得るビオチンのような化学部分が含まれる。
機能的な標識には、腫瘍の部位を標的にして腫瘍組織の破壊を引き起こすように設計されている物質が含まれる。そのような機能的な標識には、腫瘍の部位でプロドラッグを活性薬物に変換することができる、５－フルオロウラシルまたはリシンのような細胞傷害薬及び細菌のカルボキシペプチダーゼまたはニトロレダクターゼのような酵素が含まれる。
また、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の双方を含む抗体ならびに結合タンパク質、抗体及び／またはそのサブユニットの生産または活性を調節する薬物は、特定の診断応用を持ってもよく、且つ、例えば、過剰増殖性細胞の増殖などに関連する、またはそれに起因するがん、前がん病変、状態のような状態を検出する及び／または測定する目的で利用されてもよい。例えば、ＨＥＲ２結合タンパク質、抗体またはそれらのサブユニットを使用して、例えば、融合マウス脾臓リンパ球及び骨髄腫細胞を利用するハイブリドーマ技術のような既知の技術によって、種々の細胞培地にてそれ自体に対するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の双方を作り出してもよい。同様に、本開示のＨＥＲ２結合タンパク質の活性（複数可）を模倣するまたはそれに拮抗する小分子が発見されてもよいし、または合成されてもよく、且つそれは診断プロトコール及び／または治療プロトコールで使用されてもよい。
放射性標識されたＨＥＲ２結合タンパク質、特に抗体及びその断片は、試験管内診断技術及び生体内放射性イメージング技術及び放射性免疫療法にて有用である。生体内イメージングの場合、本発明のＨＥＲ２結合タンパク質は、磁気共鳴画像増強剤を含むが、これに限定されない、放射性同位元素（複数可）ではなくイメージング剤と複合体化されてもよく、その際、例えば、抗体分子はキレート基を介して多数の常磁性イオンで満たされる。キレート基の例には、ＥＤＴＡ、ポルフィリン、ポリアミンクラウンエーテル、及びポリオキシムが挙げられる。常磁性イオンの例には、ガドリニウム、鉄、マンガン、レニウム、ユーロピウム、ランタン、ホルミウム、及びフェルビウムが挙げられる。本開示のさらなる例では、放射性標識されたＨＥＲ２結合タンパク質、特に抗体及びその断片、特に放射性免疫複合体は、特にがん治療のための放射性標識抗体として放射性免疫療法において有用である。その上さらなる例では、放射性標識されたＨＥＲ２結合タンパク質、特に抗体及びその断片は放射性免疫誘導手術技術において有用であり、その際、それらはがん細胞、前がん細胞、腫瘍細胞、及びまたは過剰増殖細胞の存在及び／または位置を、そのような細胞を除去するための手術前、手術中、または手術後に識別することができ、示すことができる。
本開示のＨＥＲ２結合タンパク質、特に抗体及びその断片が他の分子または薬剤に複合体化されるまたは連結される、本開示の免疫複合体または抗体融合タンパク質にはさらに、化学的切除剤、毒素、免疫調節剤、サイトカイン、細胞傷害剤、化学療法剤または化学療法薬に複合体化された結合タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
すでに始まっている放射性免疫療法（ＲＡＦＴ）は種々の抗体免疫複合体を使用した有効性を実証している。１３１Ｉ標識したヒト化抗がん胎児性抗原（抗ＣＥＡ）抗体ｈＭＮ－１４は結腸直腸癌において評価されており（Ｂｅｈｒ ＴＭ．ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｃａｎｃｅｒ，９４（４ Ｓｕｐｐｌ）：１３７３－８１）、９０Ｙ標識した同じ抗体は髄質甲状腺癌で評価されている（Ｓｔｅｉｎ Ｒ．ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｃａｎｃｅｒ，９４（１）：５１－６１）。非ホジキンリンパ腫及び膵臓癌についても、モノクローナル抗体を使用した放射性免疫療法が評価され、及び報告されている（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ＤＭ．（２００１），Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３９（１－２）：１９５－２０１；Ｇｏｌｄ ＤＶ．ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３９，（１－２）１４７－５４）。特定の抗体による放射性免疫療法の方法は米国特許第６，３０６，３９３号及び第６，３３１，１７５号にも記載されている。
抗ＣＥＡ抗体と腫瘍関連抗原に対する抗体との使用を含む放射線免疫誘導手術（ＲＩＧＳ）は有効性及び有用性を実証している（Ｋｉｍ ＪＣ．ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，９７（４）：５４２－７；Ｓｃｈｎｅｅｂａｕｍ Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｓｕｒｇ．２５（１２）：１４９５－８；Ａｖｉｔａｌ Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｃａｎｃｅｒ，８９（８）：ｌ０９２－８；Ｍｃ Ｌｏｓｈ ＤＧｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｃｒ Ｒａｄｉｏｐｈａｒａｉ．１２（４）：２Ｓ７－９４）。
本開示のＨＥＲ２結合タンパク質（例えば、抗体）は、任意の好適な経路を介してふつう血流もしくはＣＳＦへの注射によって、または腫瘍の部位に直接、治療を必要とする患者に投与されてもよい。正確な用量は、抗体が診断用か治療用か、腫瘍のサイズ及び位置、抗体の正確な性質（抗体全体、断片、ダイアボディなどのいずれか）、ならびに抗体に結合させた検出可能なまたは機能的な標識の性質を含む多数の因子に左右されるであろう。放射性核種が治療法に使用される場合、好適な最大の単回用量は約４５ｍＣｉ／ｍ２で、最大約２５０ｍＣｉ／ｍ２までである。好ましい投与量は１５～４０ｍＣｉの範囲であり、さらに好ましい投与量範囲は２０～３０ｍＣｉ、または１０～３０ｍＣｉである。そのような治療法は骨髄または幹細胞の置換を必要としてもよい。腫瘍イメージングまたは腫瘍治療のいずれかの典型的な抗体用量は、０．５～４０ｍｇの範囲であり、好ましくは、Ｆ（ａｂ’）２形態の抗体の１～４ｍｇである。裸の抗体は、用量あたり２０～１０００ｍｇのタンパク質、または用量あたり２０～５００ｍｇのタンパク質、または用量あたり２０～１００ｍｇのタンパク質の用量で投与することが好ましい。これは、成人患者の単回治療の用量であり、それは小児及び乳児については比例して調整されてもよく、分子量に比例して他の抗体型式についても調整されてもよい。治療は、医師の裁量によって毎日、週に２回、毎週、または毎月の間隔で繰り返されてもよい。
これらの製剤は、本明細書に記載されているＥＧＦＲ結合タンパク質またはＨＥＲ２結合タンパク質のような第２の結合タンパク質を含んでもよい。特に好ましい形態では、この第２の結合タンパク質はトラスツズマブである。
（ｉｉｉ）抗がん療法
本開示のＨＥＲ２結合タンパク質（例えば、抗体）は研究、診断及び治療の応用を含む種々の応用において有用である。一例では、本開示は対象にて障害を治療するまたは予防する方法を提供する。本明細書で使用されるとき、「障害」は正常な機能の混乱または妨害である。
（ｉｖ）診断アッセイ
本開示はまた、本発明のＨＥＲ２結合タンパク質（例えば、抗体）によって認識される能力を参照することによって異常に発現されたＨＥＲ２の存在を検出する方法を含む、種々の試験管内または生体内での診断応用にも関する。本発明の抗体（複数可）の診断応用には、当業者に周知であり、標準的であり、且つ本記載に基づく試験管内及び生体内の応用が挙げられる。特にＨＥＲ２の異常な発現に関してＨＥＲ２の状態を試験管内で査定する及び評価するための診断用のアッセイ及びキットを利用して、がん、前がん状態、過剰増殖性細胞増殖に関連する状態を有するもしくは有すると疑われることが知られるものを含む、または腫瘍試料に由来する患者試料を診断してもよく、評価してもよく、及びモニターしてもよい。ＨＥＲ２状態の査定及び評価はまた、薬物の臨床試験について、または異なる薬剤もしくは抗体と対比して、特定の化学療法剤もしくは、その組み合わせを含む、本開示の特異的結合メンバー、特に抗体の投与について患者の好適性を決定するのにも有用である。この種の診断のモニタリング及び評価は、乳癌におけるＨＥＲ２タンパク質に対する抗体を利用してすでに実践されており（Ｈｅｒｃｅｐ Ｔｅｓｔ、Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、このアッセイは、ハーセプチンを使用した抗体療法の患者を評価するのにも使用される。生体内応用には、腫瘍のイメージング、または放射線イメージングを含む個人のがん状態の評価が含まれる。
細胞におけるＨＥＲ２の存在は、当業者に知られている試験管内または生体内の免疫学的手順で確認することができる。例えば、ＨＥＲ２受容体は、１以上の抗体（複数可）と複合体を形成し、複合体の１つのメンバーは検出可能な標識で標識される。これらの試験に最も一般的に採用されている標識は、放射性元素、酵素、紫外線にさらされると蛍光を発する化学物質などである。多くの蛍光物質が知られており、標識として利用することができる。これらには、例えば、フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、テキサスレッド、ＡＭＣＡブルー及びルシファーイエローが挙げられる。抗ＨＥＲ２抗体はまた、放射性元素または酵素で標識することもできる。放射性標識は、現在利用可能なカウント手順のいずれかによって検出することができる。好ましい同位体は３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２１Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ５、１１１Ｉｎ、２１１Ａｔ、１９８Ａｕ、６７Ｃｕ、２２５Ａｃ、２１３Ｂｉ、９９Ｔｃ、及び１８６Ｒｅから選択されてもよい。酵素標識も同様に有用であり、現在利用されている比色、分光光度、蛍光分光光度、アンペロメトリー、またはガス測定の技法のいずれかによって検出することができる。酵素は、例えば、カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒドなどのような架橋分子との反応によって、選択された粒子に結合される。これらの手順で使用することができる多くの酵素が知られており、利用することができる。好ましいものは、ペルオキシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、β－Ｄ－グルコシダーゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼとペルオキシダーゼ、及びアルカリホスファターゼである。米国特許第３，６５４，０９０号；第３，８５０，７５２号；及び第４，０１６，０４３号は代替の標識の材料及び方法の開示のために例として参照される。
キット
本開示はまた、本発明の治療方法で使用するための本開示のＨＥＲ２結合タンパク質を含む治療用キットまたは診断用キットの使用も企図する。そのようなキットは一般に、好適な容器手段にて、本開示の少なくとも１つのＨＥＲ２結合タンパク質（例えば、抗体または断片）の薬学的に許容される製剤を含有するであろう。キットは、生体試料にてＨＥＲ２受容体の存在を検出することに使用することができる。本開示の抗体組成物は、単独で、または他のエピトープに特異的な追加の抗体との併用で、液体形態または凍結乾燥形態にて提供され得る。標識することができるまたは非標識であることができる抗体は、補助成分（例えば、Ｔｒｉｓ、リン酸塩及び炭酸塩のような緩衝液、安定剤、賦形剤、殺生物剤及び／または不活性タンパク質、例えばウシ血清アルブミン）とともにキットに含めることができる。例えば、抗体は、補助成分との凍結乾燥混合物として提供することができ、または補助成分は、ユーザーによる組み合わせのために別個に提供することができる。一般に、これらの補助物質は、活性抗体の量に基づいて約５重量％未満で存在し、ふつう、抗体濃度に基づいて少なくとも約０．００１重量％の総量で存在するであろう。抗体に結合することができる第２の抗体が採用される場合、そのような抗体は、キットにて、例えば、別個のバイアルまたは容器にて提供され得る。第２の抗体は、存在するならば、通常、標識されており、本明細書に記載されている抗体製剤と類似の方法で製剤化することができる。
医療専門家による使用に好適な市販の検査キットを調製して、疑わしい標的細胞にて増幅されたＨＥＲ２を含むが、これに限定されないＨＥＲ２の異常な発現の存在または非存在を決定してもよい。上記で議論した試験技術によれば、そのようなキットの１つのクラスは少なくとも、標識されたＨＥＲ２またはその結合パートナー、例えば、それに特異的な抗体と、当然、選択された方法、例えば、「競合的」、「サンドイッチ」、「ＤＡＳＰ」などに応じた指示書とを含有するであろう。キットは、例えば、緩衝液、安定剤などのような周辺試薬も含有してもよい。
したがって、
（ａ）本明細書に記載されているＨＥＲ２結合タンパク質またはその特異的結合パートナーの検出可能な標識への直接的または間接的な連結によって得られる所定量の少なくとも１つの標識された免疫化学反応性成分と；
（ｂ）他の試薬と；
（ｃ）当該キットの使用のための指示書とを含む、ＨＥＲ２の異常な発現について細胞の存在または能力を実証するための検査キットが調製されてもよい。
さらに具体的には、診断検査キットは、
（ａ）一般に固相に結合して免疫吸着剤を形成する、もしくは代わりに、好適なタグに結合する上記のような既知量のＨＥＲ２結合タンパク質（または結合パートナー）、または複数のそのような最終産物など（またはそれらの結合パートナー）、それぞれの１つと；
（ｂ）必要に応じて他の試薬と；
（ｃ）当該検査キットの使用のための指示書とを含んでもよい。
さらなる例では、所定のプロトコール（例えば、「競合的」、「サンドイッチ」、「二重抗体」など）に従って作動する検査キットが上記の目的のために調製されてもよく、且つ使用されてもよく、それは以下を含む：
（ａ）ＨＥＲ２結合タンパク質を検出可能な標識にカップリングすることによって得られている標識成分；
（ｂ）リガンドは、以下から成る群から選択される、少なくとも１つの試薬がリガンドまたは不動化リガンドである１以上の追加の免疫化学試薬：
（ｉ）標識された成分（ａ）と結合することができるリガンド；
（ｉｉ）標識された成分（ａ）の結合パートナーと結合することができるリガンド；
（ｉｉｉ）決定される成分（複数可）の少なくとも１つと結合することができるリガンド；及び
（ｉｖ）決定される成分（複数可）の少なくとも１つの結合パートナーの少なくとも１つと結合することができるリガンド；ならびに
（ｃ）ＨＥＲ２、ＨＥＲ２結合タンパク質、及びそれらに対する特異的結合パートナーの間での免疫化学反応の１以上の成分の検出及び／または決定についてのプロトコールの実行のための指示書。
上記に従って、ＨＥＲ２の活性、ＨＥＲ２の異常な発現、及び／またはＨＥＲ２結合タンパク質の活性もしくは結合を調節するのに有効な潜在的な薬物をスクリーニングするためのアッセイシステムが調製されてもよい。受容体または結合タンパク質は試験システムに導入されてもよく、候補薬物を得られた細胞培養物に導入してもよく、その後、培養物を調べて、候補薬物の添加のみに起因する、または既知の薬剤（複数可）の追加量の効果に起因する細胞のＳ相活性の変化を観察してもよい。
当業者は、多数の変形形態及び／または変更形態が、広範に記載されている本発明の範囲から逸脱することなく、具体的な実施形態に示されるような本発明に対し施されてもよいことを理解するであろう。従って、本実施形態はすべての点で例示的であり、限定的ではないと見なされるべきである。
本発明は、以下の非限定的な実施例でさらに説明される。
当業者は、多数の変形形態及び／または変更形態が、広範に記載されている本発明の範囲から逸脱することなく、上述の実施形態に示されるような本発明に対し施されてもよいことを理解するであろう。従って、本実施形態は、すべての点で例示的であり、限定的ではないと見なされるべきである。
材料及び方法
細胞株及び培養条件
親株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，ＵＳＡ）、Ａｓｔｅｒａｎｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＳＡ），Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、またはＣｅｌｌ Ｂａｎｋ Ａｕｓｔｒａｌｉａ（Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から入手した。供給業者が推奨した培地にて５％ＣＯ２の３７℃のインキュベーターで細胞を培養した。培地はすべて、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（ＣＳＬ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、２ｍＭグルタミン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、及び２ｍＭペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）で補完した。細胞を継代し、８０％の集密で培地を交換した。指数増殖期で細胞を実験に利用した。付着細胞を継代するために、培地を取り除き、２ｍＭのＥＤＴＡ及びトリプシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を含む適量（増殖表面積に基づく）のＰＢＳ溶液を加えた。細胞株を表１に示す。
Figure 2022529232000010
抗体及び抗原
一次抗体は、以下の表２に列挙されている市販の供給元から購入した、またはプロテイン－Ｇアフィニティークロマトグラフィーを使用してハイブリドーマ上清から精製した。
Figure 2022529232000011
Figure 2022529232000012
抗原
線状ペプチド免疫原及び環化ペプチド免疫原及び無関係な対照ペプチドを化学的に合成し、Ｍｉｍｉｔｏｐｅｓ Ｐｔｙ Ｌｔｄ（Ｃｌａｙｔｏｎ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）によってスカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合させた。線状ペプチド配列はＨ－ＣＰＬＨＮＱＥＶＴＡＥＤＧＴＱＲ－ＮＨ２であり、環状ペプチド配列はＨ－ＧＣＰＬＨＮＱＥＶＴＡＥＤＧＴＱＲＣ－ＮＨ２であり、その際、Ｎ末端のＨ－は遊離アミンを意味する。ＫＬＨに結合した対照の無関係なペプチドＨ－ＬＥＥＫＫＧＮＹＶＶＴＤＨＣ－ＮＨ２も調製した。
ＨＥＲ２細胞外ドメイン（ＨＥＲ２－ＥＣＤ）は、以前に公開された方法（Ｘｕ Ｙ，Ｓｏｏ Ｐ，Ｗａｌｋｅｒ Ｆ，Ｚｈａｎｇ ＨＨ，Ｒｅｄｐａｔｈ Ｎ，Ｔａｎ ＣＷ，ｅｔ ａｌ．ＬＲＩＧ１ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１５；４２７（１０）：１９３４－４８．）に基づいて大学の共同研究者であるＰｒｏｆ．Ａ．Ｗ．Ｂｕｒｇｅｓｓ（Ｔｈｅ Ｗａｌｔｅｒ ａｎｄ Ｅｌｉｚａ Ｈａｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）の研究室で生成された。簡単に説明すると、ヒトＨＥＲ２－ＥＣＤに対応する合成ＤＮＡ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（登録商標））を発現ベクターにクローニングし、Ｈｉ５昆虫細胞で発現させ、抗ＦＬＡＧ Ｍ２ビーズ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）によって精製した。タンパク質は２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）及び１００ｍＭのＮａＣｌでのゲル濾過によってさらに精製した。
細胞生物学試薬及び供給元
試薬の詳細を以下の表に提供する。
Figure 2022529232000013
培地及び溶液
アガロース（１～１．５％）：１～１．５％ｗ／ｖの最終濃度まで１×ＴＡＥに溶解したアガロース
アガロース緩衝液１×：１０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．５；０．２ｍＭのＥＤＴＡ；１００ｍＭのＮａＣｌ
ブロッキング緩衝液：５％ｗ／ｖのスキムミルク粉末（Ｆｏｎｔｅｒｒａ，Ｍｏｕｎｔ Ｗａｖｅｒｌｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、０．１％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ２０（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ；２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ）
ジエタノールアミン－ＨＣｌ緩衝液：ジエタノールアミン（１０％または０．１Ｍ）、ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ（１ｍＭ）、ＮａＮ３
ＤＭＥＭ－１０：１０％ＦＣＳ、２ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンで補完したダルベッコ改変イーグル培地
ＥＤＴＡ－ＰＢＳ：Ｃａ２＋またはＭｇ２＋を含まないＰＢＳ中の２ｍＭのＥＤＴＡ
ＥＤＴＡ－ＰＢＳ－３％ＦＣＳ：３％ＦＣＳで補完したＥＤＴＡ－ＰＢＳ
ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）マトリックス：
組成物ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）マトリックス（製品情報）
Figure 2022529232000014
ＲＩＰＡ緩衝液：５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１０ｍＭのＮａＦ及びプロテアーゼ阻害剤（ｐＨ７．５）
ＲＰＭＩ－１０培地：１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミン（ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標））、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ－１６４０
ランニング緩衝液（ウエスタンブロット）：ｍｉｌｌｉｑＨ２Ｏで１×ランニング緩衝液に希釈される２０×ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＳＤＳランニング緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
ＴＢＳ（１０×）：２４．２ｇのＴｒｉｚｍａ（登録商標）ベース；８０ｇの塩化ナトリウム；９７０ｍｌのＨ２Ｏ、ＨＣＬを使用してｐＨを７．５に合わせ、総量１０００ｍｌにする
ＴＢＳ－Ｔ：０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で補完した１×ＴＢＳ
細胞生物学機器
細胞生物学機器の詳細を以下の表に提供する。
Figure 2022529232000015
マウスの免疫化及びモノクローナル抗体の産生
構造モデリングによって決定されたような、環状ペプチドとして合成された配列Ｈ－ＧＣＰＬＨＮＱＥＶＴＡＥＤＧＴＱＲＣ－ＮＨ２（配列番号２６）を持ち、キャリアタンパク質としてのスカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合させた、ＨＥＲ２細胞外ドメインの立体構造上露出された領域を含む３０μｇのペプチドでメスＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した。注射は４週間間隔で腹膜に投与された。抗原はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）で調製し、次いで、初回注射についてはフロイント完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（Ｆｌｉｅｓ ＤＢ，Ｃｈｅｎ Ｌ．Ａ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｖｏｒｔｅｘ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ／ａｄｊｕｖａｎｔ ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ．２００３；２７６（１）：２３９－４２）と、２回目の注射についてはフロイント不完全アジュバントと混合した。その後、ペプチド免疫原のみの２回の追加免疫注射が続いた。最後の免疫化から３日後、マウスを屠殺し、過免疫マウスの脾細胞を採取し、マウス骨髄腫細胞株ＳＰ２／０と１：５０の比率で融合させてハイブリドーマを作製した（Ｙｏｋｏｙａｍａ ＷＭ，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ Ｍ，Ｓａｎｔｏｓ ＧＤ，Ｍｉｌｌｅｒ Ｄ，Ｈｏ Ｊ，Ｗｕ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００６：２．５．１－２．５．２９）。融合細胞は１０％ＦＣＳ及び添加剤で補完した完全ＲＰＭＩ培地で増殖させた。増殖中の細胞の上清を間接ＥＬＩＳＡを使用してスクリーニングした。
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）
線状または環状のペプチドのいずれかとして３μｇ／ｍｌのＨＥＲ２－ＥＣＤペプチド－ＫＬＨ抗原、陰性対照－ＫＬＨ結合ペプチド、または組換えＨＥＲ２－ＥＣＤによってＰＢＳにて４℃でポリスチレン９６ウェルプレートを一晩コーティングした。ＰＢＳ中の３％ＦＣＳで室温（ＲＴ）にて１時間プレートをブロックした。適切な対照とともに１：５０の希釈で出発する連続希釈したハイブリドーマ上清とともにプレートを１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ（１：２０００希釈）とともにＲＴで１時間プレートをインキュベートした。さらに３回洗浄した後、Ｓｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏ４．８ソフトウェアを備えたＶｅｒｓａｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、４０５ｎｍでの吸光度（ＯＤ）を読み取るｐＮＰＰ基質を使用してホスファターゼ活性を測定した。
陽性ハイブリドーマの同定に続いて、４つの候補クローン（本明細書ではｍＡｂ１０４、ｍＡｂ１０５、ｍＡｂ１０６またはｍＡｂ１０７と呼ばれる）から精製した抗体をＥＬＩＳＡによって評価した。ポリスチレンの９６ウェルプレートをＰＢＳ中の３％ＦＣＳによってＲＴで１時間コーティングした。ペプチドを０．１％酢酸で希釈することによって１ｍｇ／ｍｌの最終ペプチド濃度が達成された。このペプチド溶液をさらに３％ＦＣＳ－ＰＢＳで３０μｇ／ｍｌに希釈した。希釈緩衝液（３％ＦＣＳ－ＰＢＳ）中のＫＬＨに結合した線状もしくは環状ペプチド免疫原、ＨＥＲ２－ＥＣＤまたは陰性対照ペプチド－ＫＬＨとともにＲＴで１時間プレートをインキュベートした。プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳで３回洗浄した後、ウェルを１０μｇ／ｍｌのｍＡｂ１０４、ｍＡｂ１０５、ｍＡｂ１０６、またはｍＡｂ１０７とともにＲＴでさらに１時間インキュベートした。洗浄後、次いで抗マウスＩｇ－アルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ Ａ－３６８８）（１：３０００希釈）とともにＲＴで１時間プレートをインキュベートした。さらに３回洗浄した後、Ｓｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏ４．８ソフトウェアを備えたＶｅｒｓａｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、４０５ｎｍでの光学密度吸光度を読み取るｐＮＰＰ基質を使用してホスファターゼ活性を測定した。
ＰＢＳ中の３μｇ／ｍｌの組換えのＥｒｂＢ２のＥＣＤ、ＥｒｂＢ３のＥＣＤ、ＥｒｂＢ４のＥＣＤまたはＥＧＦＲ５０１の５０ｍｌ／ウェルで４℃にて一晩ポリスチレン９６ウェルプレートをコーティングした。室温（ＲＴ）にて１時間ＰＢＳ中３％ＦＣＳでプレートをブロックした。適切な対照と一緒に１０μｇ／ｍｌの連続希釈精製抗体とともにＲＴで１時間プレートをインキュベートした。３回洗浄した後、ＡＰ結合抗マウスＩｇＧ（１：２０００希釈）とともにＲＴで１時間プレートをインキュベートした。さらに３回洗浄した後、ＳＰＥＣＴＲＯｓｔａｒマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用して、４０５ｎｍでの吸光度（ＯＤ）を読み取るｐＮＰＰ基質を使用してホスファターゼ活性を測定した。
ＦＡＣＳ分析
９６ウェルプレートに播種した細胞（１×１０４）を１０μｇ／ｍｌの抗ＨＥＲ２抗体またはＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体とともに４℃で１時間インキュベートした。ヒト化抗体トラスツズマブ及びペルツズマブはＡｌｅｘａ－４８８結合抗ヒトＩｇＧ抗体を使用して検出した。Ａｌｅｘａ－４８８結合抗マウスＩｇＧ抗体を使用して、結合したｍＡｂ１０４、ｍＡｂ１０５、ｍＡｂ１０６、ｍＡｂ１０７、またはマウスアイソタイプ対照ＬＭＨ－３を検出し、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎ（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔＰｒｏバージョン４．０．２）で蛍光を読み取った。陰性対照には二次抗体のみ及び細胞のみのバックグラウンド蛍光が含まれた。
バイオセンサー分析
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の動態解析は、カルボキシメチルデキストランでコーティングしたセンサーチップ（ＣＭ５－Ｓ、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＢＩＡｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００システムで実施した。試験チャネルは、標準的なアミンカップリングの化学的性質（０．０５ＭのＮＨＳ／０．２ＭのＥＤＣ）を使用した２００の応答ユニット（ＲＵ）に対する誘導体化したＨＥＲ２－ＥＣＤだった。屈折率効果を補正するためのブランク対照チャネルはエタノールアミンで誘導体化した。
ｍＡｂ１０４、ｍＡｂ１０６、ペルツズマブまたはトラスツズマブの抗ＨＥＲ２抗体の試料をＰＢＳ／０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０緩衝液で２倍希釈（２１３３～０ｎｍ）にて３２０μｇ／ｍｌ～０μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。ＰＢＳ／０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０をランニング緩衝液として使用して、不動化されたＨＥＲ２－ＥＣＤ上に０．００５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳ緩衝液にて４５ｕＬ／分で試料を２００秒間注入した（１０μＬ／分で３０μＬ）。注入段階の後、６００秒間チップ表面上にランニング緩衝液を流すことによって解離をモニターした。結合した抗体が溶出され、３０μｌの５０ｍＭのＮａＯＨを３０ｕＬ／分で３０秒間注入することによって試料間でチップ表面を再生した。
ウエスタンブロット分析
ウエスタンブロットを使用してネイティブＨＥＲ２に対する抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体の反応性を測定した。トリプシン処理した細胞をＲＩＰＡ緩衝液［５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのＮａ３ＶＯ４、０．５％デオキシコール酸、０．０５％ＳＤＳ、１０ｍＭのＮａＦ及びプロテアーゼ阻害剤カクテルセット１ｍ、ＣＡ、ＵＳＡ）］にて２０分間溶解し、１７，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。１０μｇの細胞溶解タンパク質を４～１２％勾配のＮｕ－ＰＡＧＥゲルで泳動し、ｉＢｌｏｔ（登録商標）２ゲル転写装置（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してニトロセルロース膜に電気泳動転写した。市販の抗体とｍＡｂ１０４が結合したＨＥＲ２とを使用したＥＧＦＲ及びＨＥＲ２の存在は、それぞれの抗体でブロットを調べることによって評価した。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ画像分析ソフトウェア（バージョン２００５）を使用した分析用のＳｔｏｒｍ ８０４ Ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でブロットを観察した。
免疫組織化学
ｍＡｂ１０４の腫瘍選択性を確認するために免疫組織化学法が開発され、ｍＡｂ１０４の反応性についてさまざまな正常組織及び腫瘍組織型をスクリーニングするのに使用された。記載されているように条件を最適化するのに先立って、抗原賦活化、一次抗体濃度、及びインキュベート時間の変動を評価した。以下では、最終的なプロトコールについてのみ簡単に説明する。スライドを６０℃のオーブンに３０分間入れ、１０分後に槽交換してキシレン槽に移した。次に、１００％エタノールを２回交換してそれぞれ１０分間、次に７０％エタノール槽にて１０分間スライドを再水和した。スライドを２回蒸留（ｄｄ）したＨ２Ｏで３回すすぎ、各洗浄は約２分間続いた。次いで、スライドを３％Ｈ２Ｏ２にて２０分間クエンチした。スライドを１０％（ｖ／ｖ）ＥＤＴＡ緩衝液槽にて１００℃３０分間処理することによって抗原賦活化を達成した。冷却し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、スライドをタンパク質ブロッキング試薬（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（商標）Ｔ２０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標））で６０分間予備インキュベートした。次に、スライドをｍＡｂ１０４一次抗体（２．５μｇ／ｍｌ）とともに室温で６０分間インキュベートした。一次抗体で染色した後、ストレプトアビジン－西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウス二次抗体（Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して結合抗体を検出した。結合した抗体を、３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）基質で検出し、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）（ＢＤＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）で対比染色し、エタノール及びキシレンで脱水し、標本にした。
この方法を使用して、これらのタンパク質の発現を１１の正常なヒト組織及び１０の一般的な腫瘍型（組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を使用した９～２７人の異なるヒトドナーからの乳管内癌、中皮腫、結腸直腸腺癌及び胃腺癌、腎細胞癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、肝細胞癌、前立腺腺癌、ならびに多形性脳神経膠芽細胞腫）にて調べた。腫瘍組織及び正常組織は同じ患者に由来するものはなかった（すなわち、非対応）。ヒト組織はＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎａｔｏｍｉｃａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｔｉｎ Ｈｅａｌｔｈ（Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から入手した。この試験はＡｕｓｔｉｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。
Ｋｉ－６７：ヒトタンパク質Ｋｉ－６７タンパク質の発現は細胞増殖と厳密に関連しており、細胞周期のすべての活性期に存在する（Ｇｅｒｄｅｓ Ｊ，ｅｄｉｔｏｒ Ｋｉ－６７ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒｓ ｕｓｅｆｕｌ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９０））。抗原は、１００℃の１０％（ｖ／ｖ）クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）水溶液で２０分間賦活化した。冷却後、非特異的結合部位をタンパク質ブロッキング試薬（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（商標）Ｔ２０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標））によって室温で２０分間ブロックした。ブロッキング緩衝液で１：１００に希釈したウサギ抗ヒトＫｉ－６７一次抗体（ＲＭ－９１０６－Ｓ１、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標））を室温で２時間インキュベートした。過剰な抗体を洗い流した後、結合した抗体を、種に適した二次抗体（Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して室温で３０分間検出した。結合した抗体を３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）基質で検出した。スライドをヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）（ＢＤＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）で対比染色し、エタノール及びキシレンで脱水し、標本にした。
アポトーシス：アポトーシス細胞は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイを使用して、原位置細胞死検出キット、フルオレセイン（１１６８４７９５９１０ Ｒｏｃｈｅ、ＵＳＡ）によって検出した。パラフィン包埋組織から生成したスライドを上記のように脱蝋し、且つ再水和し、ｄｄＨ２Ｏで３回すすぎ、各洗浄は約２分間続いた。組織切片を希釈標準溶液中のプロテイナーゼＫにて室温で２０分間インキュベートし、次にＰＢＳリンスで２回すすいだ。陽性対照及び陰性対照を製品仕様に従って調製した。１００μｌのＴＵＮＥＬ反応混合物または陰性対照用の１００μｌの対照標識溶液を各スライドに加え、加湿チャンバー内にて３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベートの期間に続いて、スライドをＰＢＳで３回洗浄した。適用した後のカバースリップ付きのスライドに５０μｌのＣｏｖｅｒｔｏｒ－ＰＯＤを適用して蒸発損失を回避し、加湿チャンバー内にて３７℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、５０～１００μｌのＤＡＢ基質をスライドに適用し、ＲＴで１０分間インキュベートした。スライドをＰＢＳで洗浄し、光学顕微鏡で分析した。
ポドカリキシン：パラフィン包埋組織から生成したスライドを以前のように脱蝋し、且つ再水和した。スライドを３％Ｈ２Ｏ２にて室温で２０分間クエンチした後、スライドを１００℃の水浴にて１０％（ｖ／ｖ）クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で２０分間インキュベートすることによって抗原を賦活化した。１５μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスポドカリキシン一次抗体（カタログ番号ＡＦ１５５６、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ（登録商標））を各スライドに添加し、室温で２時間インキュベートした。次いで、切片を洗浄し、結合した抗体を抗ヤギＨＲＰを用いて検出し、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）（ＢＤＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）で対比染色し、エタノール及びキシレンで脱水し、標本にした。
ｐ－Ａｋｔ：パラフィン包埋組織から生成したスライドを６０℃に加熱することによって脱蝋し、キシレン及び段階的アルコールで再水和した。ｄｄＨ２Ｏでスライドを３回すすいだ後、スライドを９５％水浴で０．０１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）にて２０分間インキュベートすることによって抗原賦活化を実施した。スライドを冷却したら、スライドをＰＢＳ及び５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％；ＴＢＳ－Ｔ）で順次すすいだ。３％過酸化水素を含有するＴＢＳ－Ｔにて室温で１５分間インキュベートすることによって内在性ペルオキシダーゼ活性を除いた。次に、ＴＢＳ－Ｔにて１：１００希釈で希釈した一次抗体（ウサギポリクローナルホスホ－Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，Ｃａｔ．Ｎｏ９２７７，ＩＨＣ特異的）にて切片を４℃で一晩インキュベートした。スライドをＴＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、各洗浄は約２分間続いたが、１：２００希釈でのウサギビオチン化二次抗体にてスライドを１時間インキュベートした。ＤＡＢ基質を用いて、結合した抗体を検出し、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）（ＢＤＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）で対比染色し、エタノール及びキシレンで脱水し、標本にした。
細胞増殖アッセイ
血清枯渇培地における細胞（１×１０４）を９６ウェルマイクロタイタープレートに播種し、一晩接着させた。翌日、適切な対照を伴った抗体を連続希釈で加え、時間０（Ｔ＝０）の測定のために１枚のプレートを回収した。残りの細胞プレートを３～５日間インキュベートした。細胞生存率は、基質として３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム（ＭＴＳ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いたＭＴＳ比色生存率アッセイを使用して評価した。ＶｅｒｓａＭａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ）及びＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ５．４．１ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ）を使用して４９０ｎｍで吸光度を評価した。６３０ｎｍでの吸光度もバックグラウンドとして測定し、その値を４９０ｎｍの読み取り値から差し引いた。実験は３つ組で行い、２～３回の独立した実行について繰り返した。データはすべて、化合物添加時のシグナル（Ｔ＝０）に対して基準化した。ＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍ ４．０３（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて用量反応曲線を分析した。
下流のシグナル伝達
細胞（１×１０６個）を６ウェルプレートに２つ組で播種し、一晩置いた。各ウェルの培地を捨て、総濃度１０ｍｇ／ｍｌの所望の抗体を含有する無血清培地と交換した。指定された時点（２４時間）で、ウェルの半分を１００ｎｇのＥＧＦで室温にて１０分間処理した。氷冷ＰＢＳで洗浄することによって反応を止め、ＲＩＰＡ緩衝液［５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのＮａ３ＶＯ４、０．５％デオキシコール酸、０．０５％ＳＤＳ、１０ｍＭのＮａＦ及びプロテアーゼ阻害剤カクテルセット１ｍ、ＣＡ、ＵＳＡ）］によって３０分間溶解した。これに、１７，０００ｒｐｍでの１５分間の遠心分離が続いた。総タンパク質濃度はＢｉｏ－Ｒａｄタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｍｅｌ Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ，ＵＫ）を使用して測定した。ＭＡＰＫ活性化は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入したＨＥＲ２（＃４２９０）、ｐＨＥＲ２（＃２２４３）、ＨＥＲ３（＃１２７０８）、ｐＨＥＲ３（＃４７９１）、ＥＧＦＲ（＃４２６７）、ｐＥＧＦＲ（＃３７７７）、ＡＫＴ（＃４６９１）、ｐＡＫＴ（＃４０６０）、ＥＲＫ（＃４６９５）、及びｐＥＲＫ（＃４３７０）に対する市販の抗体を用いたウエスタンブロットによって評価した。抗ＧＡＰＤＨ（ＡｂＣ－１００１）抗体はＡｂＣｌｏｎから購入した。バンドはＡｂＳｉｇｎａｌ（ＡｂＣｌｏｎ，ＡｂＣ－３００１）を使用して視覚化した。
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）による細胞死の検出
細胞死及びアポトーシスは、製造元の指示書に従ってＥＬＩＳＡアッセイ（細胞死検出ＥＬＩＳＡＰｌｕｓキット；Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用して評価した（Ｈｏｌｄｅｎｒｉｅｄｅｒ Ｓ，Ｓｔｉｅｂｅｒ Ｐ，Ｂｏｄｅｎｍｕｌｌｅｒ Ｈ，Ｆｅｒｔｉｇ Ｇ，Ｆｕｒｓｔ Ｈ，Ｓｃｈｍｅｌｌｅｒ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ａｓ ａ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００１；３９（７）：５９６－６０５）。簡単に言えば、細胞を９６ウェルプレートで培養し、一晩置いた。細胞を血清枯渇（１％）増殖培地にて単剤療法として、及び併用でトラスツズマブ、ペルツズマブ、及びｍＡｂ１０４によって２４時間処理した。プレートを２００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。上清を慎重に取り除き、２００μｌの製造元の溶解緩衝液を加え、室温にて３０分間インキュベートした。インキュベートに続いて、プレートを遠心分離し、２０μｌの上清と細胞溶解溶液とをストレプトアビジンでコーティングしたマイクロプレートに３つ組で入れた。抗ヒストン－ビオチンと抗ＤＮＡ－ＰＯＤの混合物を含有する免疫試薬のさらなる８０μＬを上清に加えた。振盪インキュベーターで室温にてプレートを２時間インキュベートした。アポトーシスの程度は、波長４０５ｎｍでのマイクロプレートリーダー及びＳｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏ４．８ソフトウェアを実行するＶｅｒｓａｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用した４９０ｎｍの参照波長を使用して、基質としてのＡＢＴＳ（２，２’－アジノビス－３－エチル－ベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）によって測光的に定量的に測定した。
アポトーシスアッセイ
ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の取り込み及びアネキシンＶの結合を使用して細胞の生存率を測定した。簡単に言えば、細胞（５×１０４個）を２４ウェルプレートで培養し、一晩置いた。適切な対照とともに単剤療法として、及び併用で、または培地にて抗体で細胞を２４時間処理した。細胞を９６ウェルプレートに移し、冷ＰＢＳで３回洗浄した後、２．５μｌのＦＩＴＣアネキシンＶ及び２．５μｌのＰＩを伴った結合緩衝液にて室温で穏やかに攪拌しながら暗所で１５分間再浮遊させた。フローサイトメトリー分析の前に、インキュベート後にさらに１５０μｌの結合緩衝液を加えた。
遊走（創傷治癒）アッセイ
細胞遊走に対するｍＡｂ０１４の効果を評価するために、ＯＥ－１９細胞（１×１０５個）を６ウェルプレートに播種し、８０％集密まで増殖させた。１００μｌのピペットチップを使用して各ウェルにて３つの平行な引っかき傷を付けた。１００μｇ／ｍｌの所望の抗体またはアイソタイプ対照で細胞を処理した。７２時間の処理直後（Ｔ０と指定）から開始して位相制御顕微鏡写真を撮った。
ＥｒｂＢ受容体の二量体化に対するｍＡｂ１０４の効果
血清枯渇培地中の細胞を１２ウェルプレートに播種し、一晩接着させた。２つ組にて１０μｇ／ｍｌの関連抗体または対照によって細胞を１時間処理した。指定された時点で、ウェルの半分を１００ｎｇのＥＧＦによって室温にて１０分間処理した。氷冷ＰＢＳで洗浄することによって反応を止め、製造元の指示書のとおりに穏やかに揺り動かしながら細胞をＢＳ３（ビス（スルホスクシンイミジル）基質（（ＢＳ３），Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）とともに室温で２０分間インキュベートした（Ｓｔａｒｏｓ ＪＶ．Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ａｃｔｉｖｅ ｅｓｔｅｒｓ：ｂｉｓ（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）ｅｓｔｅｒｓ ｏｆ ｔｗｏ ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄｓ ａｒｅ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ，ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｉｍｐｅｒｍｅａｎｔ，ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｒｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９８２；２１（１７）：３９５０－５）。１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌを含有する緩衝液で架橋反応混合物の反応を止めた後、細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、ＲＩＰＡ緩衝液［５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのＮａ３ＶＯ４、０．５％デオキシコール酸、０．０５％ＳＤＳ、１０ｍＭのＮａＦ及びプロテアーゼ阻害剤カクテルセット１ｍ、ＣＡ、ＵＳＡ）］によって３０分間溶解した。細胞溶解物を関連抗体による免疫沈降に供し、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２について免疫ブロットした。
ＤＮＡのゲル電気泳動
ＤＮＡのゲル電気泳動は、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｓａｆｅ ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに１×Ｔｒｉｓ－酢酸ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で調製した１％（ｗ／ｖ）ＤＮＡ等級のアガロース（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を含有するゲルで実施した。ＤＮＡ試料はすべて、アガロースゲルに添加する前にＯｒａｎｇｅ Ｇ（Ｓｉｇｍａ）ゲル添加緩衝液の１０倍ストックで希釈した。電気泳動は７０～１５０Ｖで行い、１ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をサイズ推定の参照として使用した。トランスイルミネーター（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）にてＵＶ光のもとでＤＮＡバンドを視覚化し、写真撮影した。
ハイブリドーマｃＤＮＡ合成
２０μＬの反応サイズを用いた１０μＬ（約１～５μｇ）のＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写（ＲＴ）に高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を使用した。標準的な方法に従ってＴ１００（商標）（ＢＩＯ－ＲＡＤ、ＵＳＡ）またはＭａｓｔｅｒＣｙｃｌｅｒ（登録商標）（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ＵＳＡ）のサーマルサイクラーを使用して以下の反応及びサイクル条件で２００μＬの薄壁ポリプロピレンＰＣＲチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ＵＳＡ）にてｃＤＮＡ合成を実施した。
ｃＤＮＡ合成条件：
２５℃で１０分間
３７℃で１２０分間
８５℃で５分間
４℃で保持
マウス軽鎖可変領域のプライマー
（ｉ）ＡＴＧ ＡＡＧ ＴＴＧ ＣＣＴ ＧＴＴ ＡＧＧ ＣＴＧ ＴＴＧ ＧＴＧ ＣＴＧ（配列番号２８）
（ｉｉ）ＡＴＧ ＧＡＧ ＷＣＡ ＧＡＣ ＡＣＡ ＣＴＣ ＣＴＧ ＹＴＡ ＴＧＧ ＧＴ（配列番号２９）
（ｉｉｉ）ＡＴＧ ＡＧＴ ＧＴＧ ＣＴＣ ＡＣＴ ＣＡＧ ＧＴＣ ＣＴＧ ＧＳＧ ＴＴＧ（配列番号３０）
（ｉｖ）ＡＴＧ ＡＧＧ ＲＣＣ ＣＣＴ ＧＣＴ ＣＡＧ ＷＴＴ ＹＴＴ ＧＧＭ ＷＴＣ ＴＴＧ（配列番号３１）
（ｖ）ＡＴＧ ＧＡＴ ＴＴＷ ＣＡＧ ＧＴＧ ＣＡＧ ＡＴＴ ＷＴＣ ＡＧＣ ＴＴＣ（配列番号３２）
（ｖｉ）ＡＴＧ ＡＧＧ ＴＫＣ ＹＹＴ ＧＹＴ ＳＡＧ ＹＴＹ ＣＴＧ ＲＧＧ（配列番号３３）
（ｖｉｉ）ＡＴＧ ＧＧＣ ＷＴＣ ＡＡＧ ＡＴＧ ＧＡＧ ＴＣＡ ＣＡＫ ＷＹＹ ＣＷＧ Ｇ（配列番号３４）
（ｖｉｉｉ）ＡＴＧ ＴＧＧ ＧＧＡ ＹＣＴ ＫＴＴ ＴＹＣ ＭＭＴ ＴＴＴ ＴＣＡ ＡＴＴ Ｇ（配列番号３５）
（ｉｘ）ＡＴＧ ＧＴＲ ＴＣＣ ＷＣＡ ＳＣＴ ＣＡＧ ＴＴＣ ＣＴＴ Ｇ（配列番号３６）
（ｘ）ＡＴＧ ＴＡＴ ＡＴＡ ＴＧＴ ＴＴＧ ＴＴＧ ＴＣＴ ＡＴＴ ＴＣＴ（配列番号３７）
（ｘｉ）ＡＴＧ ＧＡＡ ＧＣＣ ＣＣＡ ＧＣＴ ＣＡＧ ＣＴＴ ＣＴＣ ＴＴＣ Ｃ（配列番号３８）
（ｘｉｉ）ＡＴＧ ＡＡＧ ＴＴＴ ＣＣＴ ＴＣＴ ＣＡＡ ＣＴＴ ＣＴＧ ＣＴＣ（配列番号３９）
マウス軽鎖可変領域の逆方向プライマー配列
ＭＫＣ：ＴＧＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＧＧＡ ＡＧＡ ＴＧ（配列番号４０）
マウス重鎖可変領域のプライマー
（ｉ）ＡＴＧ ＡＡＡ ＴＧＣ ＡＧＣ ＴＧＧ ＧＴＣ ＡＴＳ ＴＴＣ ＴＴＣ（配列番号４１）
（ｉｉ）ＡＴＧ ＧＧＡ ＴＧＧ ＡＧＣ ＴＲＡ ＴＣＡ ＴＳＹ ＴＣＴ Ｔ（配列番号４２）
（ｉｉｉ）ＡＴＧ ＡＡＧ ＷＴＧ ＴＧＧ ＴＴＡ ＡＡＣ ＴＧＧ ＧＴＴ ＴＴＴ（配列番号４３）
（ｉｖ）ＡＴＧ ＲＡＣ ＴＴＴ ＧＷＹ ＴＣＡ ＧＣＴ ＴＧＲ ＴＴＴ（配列番号４４）
（ｖ）ＡＴＧ ＧＡＣ ＴＣＣ ＡＧＧ ＣＴＣ ＡＡＭ ＡＧＴ ＴＴＴ ＣＣＴ Ｔ（配列番号４５）
（ｖｉ）ＡＴＧ ＧＣＴ ＧＴＣ ＹＴＲ ＧＳＧ ＣＴＲ ＣＴＣ ＴＴＣ ＴＧＣ（配列番号４６）
（ｖｉｉ）ＡＴＧ ＧＲＡ ＴＧＧ ＡＧＣ ＫＧＧ ＲＴＣ ＴＴＴ ＭＴＣ ＴＴ（配列番号４７）
（ｖｉｉｉ）ＡＴＧ ＡＧＡ ＧＴＧ ＣＴＧ ＡＴＴ ＣＴＴ ＴＴＧ ＴＧ（配列番号４８）
（ｉｘ）ＡＴＧ ＧＭＴ ＴＧＧ ＧＴＧ ＴＧＧ ＡＭＣ ＴＴＧ ＣＴＡ ＴＴＣ ＣＴＧ（配列番号４９）
（ｘ）ＡＴＧ ＧＧＣ ＡＧＡ ＣＴＴ ＡＣＡ ＴＴＣ ＴＣＡ ＴＴＣ ＣＴＧ（配列番号５０）
（ｘｉ）ＡＴＧ ＧＡＴ ＴＴＴ ＧＧＧ ＣＴＧ ＡＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＡＴＴ Ｇ（配列番号５１）
（ｘｉｉ）ＡＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＴＴＡ ＡＧＴ ＣＴＴ ＣＴＧ ＴＡＣ ＣＴＧ（配列番号５２）
マウス重鎖可変領域の逆方向プライマー配列
ＭＨＣ：ＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧ（配列番号５３）
マウス軽鎖可変領域の順方向及び逆方向の縮重プライマー
カッパＦ：ＧＣＣ ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＡＹ ＡＴＴ ＧＴＧ ＭＴＳ ＡＣＭ ＣＡＲ ＷＣＴ ＭＣＡ（配列番号５４）
カッパＲ：ＣＣＧ ＧＴＣ ＧＡＣ ＧＧＡ ＴＡＣ ＡＧＴ ＴＧＧ ＴＧＣ ＡＧＣ ＡＴＣ（配列番号５５）
記号の意味：
Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｍ＝ＡまたはＣ、Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｓ＝ＧまたはＣ、Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｈ＝ＡまたはＴまたはＣ
Ｂ＝ＧまたはＴまたはＣ、Ｄ＝ＧまたはＡまたはＴ、Ｎ＝ＡまたはＣまたはＧまたはＴ、Ｖ＝ＧまたはＡまたはＣ
ポリメラーゼ連鎖反応
クローニング用にＤＮＡ断片を増幅するために、製造元の指示に従ってＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。次に、標準的な方法に従ってＴ１００（商標）（ＢＩＯ－ＲＡＤ、ＵＳＡ）またはＭａｓｔｅｒＣｙｃｌｅｒ（登録商標）（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）のサーマルサイクラーを使用して２００μＬの薄壁ポリプロピレンＰＣＲチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）にて以下の反応及びサイクルの条件でＰＣＲ反応ミックスを実行した。
ＰＣＲの条件
９４℃で３分間
（９４℃で１分間→ｘ℃ａで５５～９０秒間ｂ→７２℃で２分間）を１５～２５サイクル
７２℃／１０分
４℃で保持
生体内試験
ＮＯＤ－ＳＣＩＤ－ＩＬ２Ｒ－／－マウス（４～６週齢、Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｐｅｒｔｈ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）に５×１０６個のＮＣＩ－Ｎ８７細胞または８×１０６個のＢＴ－４７４細胞をマトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて脇腹領域で皮下注射した。ＢＴ－４７４細胞を注射したマウスには２４時間前にエストロゲンペレットを埋め込んだ。腫瘍体積は式（Ｌ×Ｗ２）／２を使用して算出したが、その際、「Ｗ」は腫瘍の幅を表し、「Ｌ」は腫瘍の長さを表す。約１００ｍｍ３のサイズまで腫瘍を増殖させ、種々の処理群にマウスを無作為化した。生着できなかった腫瘍をさらなる分析から除外した。示した用量にて週３回腹腔内注射を介して３週間処理を行った。処理後に動物を観察し、平均腫瘍体積が＞１０００ｍｍ３になった、またはストレスの長期症状を示したときに屠殺した。死後の腫瘍を切除し、ホルマリン固定パラフィン包埋標本切片として処理し、逆相タンパク質アレイ（ＲＰＰＡ）用に回収し、過剰組織を－８０℃で保存した。処理終了時、腫瘍増殖阻害の割合（％ＴＧＩ）を次のように算出した：％ＴＧＩ＝［１－｛Ｔ／Ｔ０／Ｃ／Ｃ０｝／１－｛Ｃ０／Ｃ｝］×１００、その際、Ｔ＝終点での処理した平均腫瘍体積、Ｔ０＝時間０での処理した平均腫瘍体積、Ｃ＝終点での対照の平均腫瘍体積、及びＣ０＝時間０でのビヒクル対照の平均腫瘍体積。
すべての動物試験プロトコールは、Ａｕｓｔｉｎ Ｈｅａｌｔｈ Ａｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（プロトコール番号Ａ２０１５／０５２９７）によって承認され、科学的目的のための動物の世話及び使用に関するオーストラリアの行動規範（第８版２０１３）に従って実施された。
逆相タンパク質アレイ（ＲＰＰＡ）
ＨＥＲ２を過剰発現している乳房ＰＤＸ腫瘍からタンパク質を抽出し、以前記載されたようにＲＰＰＡを実施した（Ｈｅｎｎｅｓｓｙ ＢＴ，Ｌｕ Ｙ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ａｎｇｕｌｏ ＡＭ，Ｃａｒｅｙ ＭＳ，Ｍｙｈｒｅ Ｓ，Ｊｕ Ｚ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｕｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｈａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｒｒａｙｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｉｎ ｎｏｎ－ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２０１０；６（４）：１２９）。処理の最後に得られた腫瘍試料を、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号０５０５６４８９００１，Ｐｅｎｚｂｅｒｇ Ｇｅｒｍａｎｙ）で補完した溶解緩衝液（カタログ番号＃９８０３，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＢｅｖｅｒｌｙＭＡ，ＵＳＡ）を使用したホモジナイズによって溶解した。タンパク質濃度はＰｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキットを使用して決定し、１ｍｇ／ｍｌに基準化し、試料を２－メルカプトエタノール及びＳＤＳとともに煮沸した。処理したタンパク質溶解物は、以下に説明するように、ＲＰＰＡ分析のためにＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡに送付した。
溶解物を溶解緩衝液で５倍連続希釈にて連続希釈し、１：１６希釈を達成した。１１×１１フォーマットでニトロセルロースをコーティングしたスライド（Ｇｒａｃｅ Ｂｉｏｌａｂ）上に溶解物を配置した。チラミド系シグナル増幅アプローチによって２９７の検証済み一次抗体で試料を調べ、ＤＡＢ比色反応によって視覚化した。スライドは、Ａｒｒａｙ－Ｐｒｏ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｅｙｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＩＮＣ．Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）によって走査し、分析し、及び定量化してスポット強度を生成した。
ロジスティックモデル（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｔ ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡによって開発された「スーパーカーブフィッティング」）に各希釈曲線を適合させた。データはすべて、タンパク質負荷補正係数についての中央値分散分析によって基準化し、すべての抗体実験の中央値発現レベルを使用して線形値に変換した。ヒートマップの「赤」は中央値より上を意味し、「緑」は中央値より下を意味する。
統計的解析
解析はＰｒｉｓｍ（登録商標）バージョン５．０４を使用して実施した。ｐ値はすべて両側性であり、０．０５以下の値が有意であると見なした。
平均の比較のために、スチューデントｔ検定またはノンパラメトリックのＭａｎｎ ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定を採用し、２群のみが検討されていた。３以上の群間の比較のために、パラメトリックデータをＡＮＯＶＡによって解析し、ｐ≦０．０５であれば、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法を使用した事後検定を実施して、どの群（複数可）が有意に異なるかを判定した。複数の群に採用されたノンパラメトリック検定はＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定であり、ｐ≦０．０５であれば、事後検定を行ってどの群（複数可）が有意に異なるかを判定した。
群の生存率も比較し、すべての群にわたってログランク検定が有意に異なるのであれば（ｐ≦０．０５）、さらなるログランク検定による事後検定を行い、どの群（複数可）が有意に異なるかを判定した。
実施例１－試験管内での抗体の生成及び特性評価
免疫化抗原及び免疫化プロトコールは前述されている。ＨＥＲ２ペプチド、組換えタンパク質、及びＨＥＲ２発現細胞に基づくアッセイを含む一連の免疫化及びスクリーニングの戦略を通して、本発明者らは、ＨＥＲ２のドメインＩＩの立体構造上柔軟な領域に対する腫瘍特異的モノクローナル抗体の生成に最終的に成功した。
本発明者らは、ビオチン、ＧＳＴ、ＭＢＰ、及びＫＬＨキャリアタンパク質に連結された線状ペプチドと、ペプチドループを露出するシステイン変異を持つｅｒｂＢ２を発現するように形質移入されたＢａｆ／０３造血細胞（細胞表面にＨＥＲのメンバーを発現しない）とによって免疫化戦略を実施したが、クローンの生成には成功しなかった。突然変異体発現細胞と組換え突然変異体ＥＣＤ ＥｒｂＢ２とによる免疫化は、ペプチドを結合するが、ＥｒｂＢ２のＥＣＤ内の異なる位置に結合するｍＡｂを生成しなかった。本発明者らがペプチドを認識し、ｅｒｂＢ２発現細胞に結合するモノクローナル抗体クローンを得ることができたのは、本発明者らがＫＬＨに連結した環化ペプチドで免疫化した一度だけだった。これは以下の表（表５）に要約されている。
Figure 2022529232000016
免疫化プロトコールを使用して、本発明者らは、腫瘍細胞に見られる条件でのみ結合に利用可能であると考えられるＨＥＲ２細胞外ドメインの立体構造上露出された領域に対する新規モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を産生するハイドリドーマクローンを生成した。これらのモノクローナル抗体は、ＨＥＲ２細胞外ドメイン由来の、システイン（Ｃ）残基を介してループとして折り畳まれ、且つＫＬＨタンパク質に連結したペプチド免疫原：Ｈ－ＧＣＰＬＨＮＱＥＶＴＡＥＤＧＴＱＲＣ－ＮＨ２（配列番号１）でマウスを免疫することによって立体構造エピトープに対して生成された。この配列は図１に提供されているヒトＨＥＲ２配列で下線が引かれている。この配列は以下のリンクｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／ＮＰ＿００４４３９．２にあるｎｃｂｉデータベースに由来する。
この領域はドメインＩＩ内にあるが、ペルツズマブの既知のエピトープからは離れている（Ｆｒａｎｋｌｉｎ ＭＣ，ｅｔ ａｌ．，（２００４），Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ＥｒｂＢ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＥｒｂＢ２－Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ．５（４）：３１７－２）。
ハイブリドーマのスクリーニング
ＨＥＲ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）と同様に抗体がそれに対して生成された抗原のループ（環状）ペプチド及び線状ペプチドに対する反応性についてＥＬＩＳＡに基づくアッセイを使用してｍＡｂ１０４、ｍＡｂ１０５、ｍＡｂ１０６及びｍＡｂ１０７と名付けられたハイブリドーマ培養上清の特異性をスクリーニングした。プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーを使用して、ハイブリドーマ上清から精製抗体を抽出した。溶出された抗体の完全性は、還元条件下及び非還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって確認した。選択した抗体の免疫グロブリンアイソタイプを、モノクローナル抗体アイソタイピングキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，ＩＬ，ＵＳＡ）によって検出し、すべてＫ－軽鎖を持つＩｇＧ１であることがわかった。精製したｍＡｂによるＥＬＩＳＡ分析の結果を図２に示す。
モノクローナル抗体ｍＡｂ１０４及びｍＡｂ１０６は、すべてのペプチド構成について最も強い結合活性を示した一方で、ｍＡｂ１０５は最も低い結合を示した（図２Ｂを参照のこと）。最高の親和性を持つ抗体を産生するクローン、すなわちｍＡｂ１０４及びｍＡｂ１０６をさらなる開発のために選択し、それらの抗体をさらなる分析及び特徴付けのために選択した。
ＦＡＣＳによるハイブリドーマの結合分析
ＨＥＲ２を過剰発現している乳癌（ＢＴ４７４、ＳＫ－ＢＲ－３、及びＭＤＡ－ＭＢ－４５３）及び胃癌（ＮＣＩ－Ｎ８７）の細胞株にてフローサイトメトリーによって細胞のＨＥＲ２に対する１０ｕｇ／ｍｌの精製抗体（ｍＡｂ１０４、ｍＡｂ１０５、ｍＡｂ１０６、及びｍＡｂ１０７）の結合の程度を調べた。
結果を以下の表６に要約し、それは２以上の実験の代表である。
Figure 2022529232000017
評価したすべての細胞株において、ｍＡｂ１０４は他の抗体と比べて最も高い結合を示した。評価した細胞株のうち、ｍＡｂ１０４はＮＣＩ－Ｎ８７細胞株及びＳＫ－ＢＲ－３細胞株にて最も高いログシフトを示した。ｍＡｂ１０５の結合は評価したどの細胞株でも見られなかった。すべての抗体について、結合は市販のＨＥＲ２結合抗体に満たなかった。本発明者らがこれらの抗体は細胞表面上の受容体のほんの一部に結合することを提示しているということは、ＨＥＲ２受容体集団のごく一部のみでのエピトープの露出を示唆している。
ウエスタンブロットによる結合分析
これらの新規抗体のＨＥＲ２タンパク質に結合する能力は、ウエスタンブロット分析によってヒト乳癌（ＢＴ４７４、ＳＫ－ＢＲ－３、及びＭＤＡ－ＭＢ－４５３）及び胃癌（ＮＣＩ－Ｎ８７）の細胞株にてさらに評価された。トリプシン処理した細胞を洗浄し、溶解し、それぞれの精製抗体で免疫ブロットした。抗ＨＥＲ２抗体、２２４２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を陽性対照として使用した。
以前のＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳのデータと一致して、ｍＡｂ１０４はすべての細胞株で最も強い結合を示し（ｍＡｂ１０４＞ｍＡｂ１０６＞ｍＡｂ１０７＞ｍＡｂ１０５）（図３）、調べた４つの細胞株すべてに結合した。
ｍＡｂ１０４及びｍＡｂ１０６の配列
ＢｉｏＬｉｎｅ Ｉｓｏｌａｔｅ ＩＩ ＰＣＲ及びゲル抽出キット（ＢＩＯ－５２０５９）を使用してＰＣＲ反応物を精製した。精製した増幅産物は、その産物を増幅する、配列決定プライマーと同じプライマーを使用する、Ｍｏｎａｓｈ ＭｉｃｒｏｍｏｎＤＮＡ配列決定施設でのＳａｎｇｅｒ ＤＮＡ配列決定に送った。
ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａｎ及びＫａｂａｔの双方の番号付けシステムと、双方に該当するＣＤＲのアミノ酸とに従って定義される。重鎖及び軽鎖の可変領域配列を図４に示す。
各抗体の相補性決定領域の配列を以下に提供する。
ｍＡｂ１０４のＶＨ鎖
ＣＤＲ１：ＧＹＳＦＴＧＹＦＭＨ（配列番号１４）
ＣＤＲ２：ＲＩＮＰＹＮＧＤＩＲＹＮＱＮＦＫＤ（配列番号１６）
ＣＤＲ３：ＬＮＦＡＹ（配列番号１８）
ｍＡｂ１０４のＶＬ鎖
ＣＤＲ１：ＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＦＬＮ（配列番号２０）
ＣＤＲ２：ＬＶＳＫＬＤＳ（配列番号２２）
ＣＤＲ３：ＷＱＧＴＨＦＰＷＴ（配列番号２４）
ｍＡｂ１０６のＶＨ鎖
ＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＤＹＧＭＮ（配列番号１５）
ＣＤＲ２：ＷＩＮＴＹＴＧＫＰＴＹＤＤＤＦＫＧ（配列番号１７）
ＣＤＲ３：ＲＦＬＮＴＶＡＧＲＳＶＹＦＤＹ（配列番号１９）
ｍＡｂ１０６のＶＬ鎖
ＣＤＲ１：ＳＶＳＳＳＶＧＳＭＹ（配列番号２１）
ＣＤＲ２：ＬＴＳＮＬＡＳ（配列番号２３）
ＣＤＲ３：ＱＱＷＳＳＮＰＰＴ（配列番号２５）
ＢＩＡｃｏｒｅ分析
ｍＡｂ１０４が結合したエピトープがジスルフィド結合に隣接するということは、エピトープ部位の周囲の柔軟性と、特定の条件下または環境下でのｍＡｂ１０４による結合のためのエピトープの露出とを示唆している。
トラスツズマブと比較したＨＥＲ２に対する精製ｍＡｂ１０４及びｍＡｂ１０６の結合特性及び見かけの親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅＴ２００を使用した表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）によって調べた。組換えＨＥＲ２細胞外ドメインをＣＭ５センサーチップに不動化した後、種々の濃度のｍＡｂ１０４、ｍＡｂ１０６、及び市販の抗ＨＥＲ２ ｍＡｂをセンサーに通して、見かけの結合親和性を測定した。
図５Ｃに示すように、ｍＡｂ１０４は高い結合親和性を示し、ＫＤはナノモル範囲だった。ｍＡｂ１０４の結合親和性は、トラスツズマブで報告されているものよりも対数レベルで低く、ペルツズマブの結合親和性と類似する（表７）。
Figure 2022529232000018
要約すると、ｍＡｂ１０４、ｍＡｂ１０６、及びｍＡｂ１０７は、さまざまなＨＥＲ２を過剰発現している腫瘍細胞に結合する。ｍＡｂ１０４は、ｍＡｂ１０６よりも強い試験管内結合を一貫して示すと思われた。これらの初期スクリーニング検査の知見に基づいて、さらなる評価のためにｍＡｂ１０４を選択した。
実施例２：エピトープ分析及び競合アッセイ
ＨＥＲ２のドメインＩＩに位置する抗原エピトープを結合するｍＡｂ１０４抗体可変ドメインを、以前記載された方法（Ｚｈａｎｇ Ｗ，Ｚｅｎｇ Ｘ，Ｚｈａｎｇ Ｌ，Ｐｅｎｇ Ｈ，Ｊｉａｏ Ｙ，Ｚｅｎｇ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ （ＳＦＴＳ ｖｉｒｕｓ） ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ａ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＭＡｂ４－５）．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ－Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｓｉｇｎ．２０１３；２７（６）：５３９－５０）を用いて抗体Ｆｖドメインの相同性でモデル化した３Ｄ構造とヒトＨＥＲ２の既知のＸ線構造とからコンピューターで予測した。
ｍＡｂ１０４の予測されたＨＥＲ２結合を、ペルツズマブ及びトラスツズマブが結合したＨＥＲ２の既知の結晶構造と比較した（Ｈｕ Ｓ，Ｓｕｎ Ｙ，Ｍｅｎｇ Ｙ，Ｗａｎｇ Ｘ，Ｙａｎｇ Ｗ，Ｆｕ Ｗ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＥｒｂＢ２ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１５；６（３）：１６９５）。理論に束縛されることを望まないで、ｍＡｂ１０４のＨＥＲ２への結合には、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１について以前記載された（Ｇａｒｒｅｔｔ ＴＰ，Ｂｕｒｇｅｓｓ ＡＷ，Ｇａｎ ＨＫ，Ｌｕｗｏｒ ＲＢ，Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ Ｇ，Ｗａｌｋｅｒ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａ ｌｏｃａｌｌｙ ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｕｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＥＧＦＲ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．２００９；１０６（１３）：５０８２－７）ような受容体の活性化の際に発生する構造変化を必要とし、その際、ＨＥＲ２ ＥＣＤのドメインＩＩのジスルフィド結合は動的に形成され、且つ破壊されてもよいと考えられる。
他の既知のＨＥＲ２結合抗体と比べたｍＡｂ１０４が認識するエピトープ
抗体Ｈ２－１８（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．（２０１６），Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，７（４１））中国特許ＣＮ１０４４４７９９３）はＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２のドメインＩの範囲内のエピトープを認識する。Ｈ２－１８は生体内及び試験管内でトラスツズマブ耐性乳癌細胞の増殖を阻害することが示されており、トラスツズマブ感受性及び耐性の乳癌細胞株の双方でプログラム細胞死を誘導する。
抗体Ａ２１（Ｈｕ Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１５），Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，６（３）：１６９５－１７０６）は主にＥｒｂＢ２のＥＣドメインＩ由来の大領域を含む立体構造エピトープを認識すると思われる。Ａ２１の抗体二価性は、腫瘍細胞に対するその阻害活性、と同様にＥｒｂＢ２のリン酸化及び受容体の下方調節に必要であることが見いだされた。
トラスツズマブ／ハーセプチン（４Ｄ５）は、ＥｒｂＢ２のサブドメインＩＶの膜近傍領域に結合し、メタロプロテイナーゼ切断によるＥｒｂＢ２の活性化を妨害し得、ＥｒｂＢ２の二量体化も阻止し得る。
サブドメインＩＩ内またはその近傍でエピトープを持つペルツズマブ（２Ｃ４）はＥｒｂＢ２と他のＥｒｂＢ受容体との間の会合を直接破壊するので、腫瘍細胞の増殖を阻害することができる。
ペルツズマブとｍＡｂ１０４とによって認識されるエピトープは、Ｐ２９４、Ｌ２９５、Ｈ２９６の３つの共通のアミノ酸のみを共有するが、Ｈ２９６はペルツズマブの結合時に完全に隠されると理解されている（Ｆｒａｎｋｌｉｎ ＭＣ．ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，５：３１７）。ペルツズマブが結合するエピトープはＨ２４５、Ｙ２５２、Ｆ２５７、Ｄ２８５、Ｖ２８６、Ｓ２８８、Ｔ２９０、Ｐ２９４、Ｌ２９５、Ｈ２９６、Ｋ３１１、Ｋ３１４及びＰ３１５から成る。
対照的に、ｍＡｂ１０４が認識するエピトープは配列ＣＰＬＨＮＱＥＶＴＡＥＤＧＴＱＲＣ（配列番号１）である。
双方の抗体はＨＥＲ２のドメインＩＩ内のエピトープを認識する一方で、ペルツズマブとｍＡｂ１０４が結合するエピトープは明らかに異なる。
理論に束縛されることを望まないで、本発明者らはペルツズマブ及びｍＡｂ１０４がＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２のドメインＩＩの対向する面／側面に結合するので、接近して対向するエピトープにもかかわらずｍＡｂ１０４がペルツズマブの結合を阻止しない理由を説明すると仮定している。ドメインＩＩの立体構造変化は、例えば、活性化、低酸素状態、及び／または異常な発現の間に発生するので、双方の抗体がそのような立体構造変化を受けているＨＥＲ２受容体の小さな亜集団に結合するのを可能にし、ｍＡｂ１０４だけがドメインＩＩのＣＰＬＨＮＱＥＶＴＡＥＤＧＴＱＲＣに結合するのを可能にする。しかしながら、例えば、ｍＡｂ１０４エピトープ（Ｃ２９３／Ｃ３０９（リーダー配列を含まない番号付け））に先行するジスルフィド結合（Ｃ２７７／Ｃ２８９（リーダー配列を含まない番号付け））が一時的に壊された、またはｍＡｂ１０４エピトープを露出しているドメインＩＩの少なくとも一部の再配置を可能にするジスルフィド結合の切り替えを受けた場合、必要とされる立体構造変化が可能であり得る。ペルツズマブが結合するエピトープは再配置の間、ほとんど乱されないままであり得る。しかしながら、ＥＬＩＳＡ捕捉用に吸着された組換えＨＥＲ２－ＥＣＤによるコンピューター解析では、ドメインＩＩの構造的再配置は固定されるが、ｍＡｂ１０４の結合によるわずかな立体障害の結果、ペルツズマブ結合が低下し得る（例えば、以下に示すように）ことは可能である。結合親和性の喪失の可能性は２つの抗体間の相乗的相互作用によってバランスが保たれ得る。
競合アッセイ
ｍＡｂ１０４のエピトープをさらに明確に定義するために、ＥＬＩＳＡを使用して、ｍＡｂ１０４のＨＥＲ２－ＥＣＤへの結合、ならびにドメインＩＩ結合抗体ペルツズマブの結合及びトラスツズマブの空間的に離れたドメインＩＶエピトープの結合を妨害する能力を比較した（図６）。これらの実験では、本発明者らは、トラスツズマブ及びペルツズマブの結合に対するｍＡｂ０１４との事前インキュベートの効果を評価し（図６Ｂ及びＣ）、また、ｍＡｂ１０４結合に対するトラスツズマブ及びペルツズマブとの事前インキュベートの効果を判定した。
本発明者らは、トラスツズマブ及びｍＡｂ１０４がＨＥＲ２－ＥＣＤへの互いの結合に影響を及ぼさないことを示した（図６Ａ及びＢ）。本発明者らはまた、ペルツズマブとの事前インキュベートがｍＡｂ１０４の結合に影響を及ぼさないことも実証した（図６Ａ）。しかしながら、興味深いことに、ｍＡｂ１０４との事前のインキュベートがＨＥＲ２－ＥＣＤへのペルツズマブの結合を減らした（図６Ｃ）ということは、ｍＡｂ１０４のエピトープへの結合が特定の状況下でペルツズマブの立体障害を生じ得ることを示している。
内在性ＨＥＲ２に対するｍＡｂ１０４とペルツズマブ及びトラスツズマブの間の競合を、上記で議論された２つの連続したインキュベートアプローチを使用してＨＥＲ２過剰発現の乳癌細胞株（ＢＴ４７４及びＳＫ－ＢＲ－３；図７－１及び７－２）及び胃癌細胞株（ＮＣＩ－Ｎ８７及びＯＥ１９；図７－３及び７－４）におけるフローサイトメトリーによってさらに検討した。これらの一連の実験では、高用量（１００μｇ／ｍｌ）のｍＡｂ１０４の事前インキュベートを利用して、トラスツズマブ及びペルツズマブの結合に対する影響を確認する際の変化を最大化した。はるかに高用量のｍＡｂ１０４との事前インキュベートは、トラスツズマブにもペルツズマブにもその細胞表面ＨＥＲ２への結合に影響を与えなかった。フローサイトメトリー及びＥＬＩＳＡを用いたペルツズマブと競合するｍＡｂ１０４についての結果の不一致は、アッセイにおける抗原性調製物の間の差異、すなわち、ＨＥＲ２の存在はＥＬＩＳＡでは部分的に変性しているのに対してフローサイトメトリーによって分析するとその生理的立体構造にあること、ならびに結果的に生じるエピトープの提示及び利用性によって説明され得る。
実施例３：細胞表面ＨＥＲ２へのｍＡｂ１０４の結合
本発明者らは、差次的なＨＥＲ２発現を伴う細胞株のパネルを使用するＦＡＣＳ分析によってｍＡｂ１０４結合のパターン及び効率を調べた。
これらの結果を以下の表８に要約する。結果を二次抗体のみとの結合と比較する。
Figure 2022529232000019
 ＨＥＲ２発現細胞に結合するｍＡｂ１０４のＦＡＣＳ分析：ＢＴ４７４、ＳＫ－ＢＲ－３、ＮＣＩ－Ｎ８７、ＯＥ－１９、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、及びＭＣＦ７の細胞を１０μｇ／ｍｌのトラスツズマブ、ペルツズマブ、ｍＡｂ１０４、または二次抗体のみとともにインキュベートし、ＦＡＣＳ分析によって結合の程度を判定した。結果は２以上の実験の代表である。
ＨＥＲ２を過剰発現している細胞株では、ｍＡｂ１０４は胃癌細胞株ＮＣＩ－Ｎ８７のＨＥＲ２集団に最も強い結合を示し、ＨＥＲ２低発現細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＭＣＦ－７）ではごくわずかなＨＥＲ２結合しか見られなかった。
トラスツズマブ（ハーセプチン）及びペルツズマブのＦＡＣＳがさらに大きな蛍光を実証したということは、それらがｍＡｂ１０４と比較したとき評価されたすべての細胞株でさらに多数のＨＥＲ２受容体に結合したことを示し（表８）、さまざまな細胞株にわたってその２つのヒト化抗体の間で結合の程度に差異は認められなかった。本発明者らの知見は、ｍＡｂ１０４が細胞表面上の受容体のサブセットに結合するという仮説を支持し、そして抗体間の結合の程度に見られる差異を説明する。
ＨＥＲ２に対するｍＡｂ１０４の特異性
内在性に発現したＨＥＲ２及びＨＥＲ３に対するｍＡｂ１０４の特異性を確認するために、本発明者らは、還元条件下で調製したさまざまなＨＥＲ２陽性及び陰性のがん細胞株溶解物を使用してウエスタンブロットアッセイを行った（図８－１）。
細胞内ＨＥＲ２エピトープに対して産生されたＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから市販されている抗体である抗体２２４２をＨＥＲ２全体の陽性対照として使用した。図８Ａで実証されるように、ｍＡｂ１０４は、ＨＥＲ２を発現している種々のがん細胞株にわたって強い反応性を示し、種々の細胞株のＨＥＲ２過剰発現状態を表す陽性シグナルを提供する対照抗体に匹敵した。ｍＡｂ１０４と対照２２４２のＨＥＲ２結合の相関関係は、還元条件下で明らかにされているｍＡｂ１０４によって認識されるＨＥＲ２エピトープの反映である。ＨＥＲ３の発現レベルは、ＦＡＣＳ分析及び以前の他の研究（Ｂｒｏｃｋｈｏｆｆ Ｇ，Ｈｅｉｓｓ Ｐ，Ｓｃｈｌｅｇｅｌ Ｊ，Ｈｏｆｓｔａｅｄｔｅｒ Ｆ，Ｋｎｕｅｃｈｅｌ Ｒ．Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｃ－ｅｒｂＢ２ ａｎｄ ｃ－ｅｒｂＢ３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ＳＫ－ＢＲ－３ ａｎｄ ＢＴ４７４ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐａｒｔ．Ａ．２００１；４４（４）：３３８－４８．）によっても認められたように調べたがん細胞株では非常に低かった。
ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２の特異性もＥＬＩＳＡアッセイによって評価した。図８－２に示すように、ｍＡｂ１０４はＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２に特異的であり、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１の細胞外ドメイン、またはＥｒｂＢ３／ＨＥＲ３もしくはＥｒｂＢ４／ＨＥＲ４のＥＣＤを結合しなかった。
試験管内での乳癌におけるｍＡｂ１０４の有効性
実施例４：ｍＡｂ１０４の抗増殖効果
単剤療法としての、及びトラスツズマブまたはペルツズマブとの併用でのｍＡｂ１０４の、ＨＥＲ２過剰発現乳癌細胞株の増殖に対する効果を、ＭＴＳ細胞増殖アッセイによって血清枯渇状態（１％ＦＣＳ）にて最大濃度１００ｕｇ／ｍｌまで増加する濃度を使用して測定した（図９）。
トラスツズマブは、アイソタイプ対照抗体と比べてＢＴ－４７４（図９Ｂ）及びＳＫ－ＢＲ－３（図９Ａ）の増殖を有意に減少させた（それぞれｐ＝０．０００６及びｐ＝０．０００５；両側）一方で、ペルツズマブ単剤療法は評価した細胞株にて有意な抗増殖活性を有さなかった（それぞれｐ＝０．２２及びｐ＝０．１５、両側；図９Ａ及び９Ｂを参照のこと）。これらの知見は他の研究（Ｂｒｏｃｋｈｏｆｆ Ｇ，Ｈｅｃｋｅｌ Ｂ，Ｓｃｈｍｉｄｔ－Ｂｒｕｅｃｋｅｎ Ｅ，Ｐｌａｎｄｅｒ Ｍ，Ｈｏｆｓｔａｅｄｔｅｒ Ｆ，Ｖｏｌｌｍａｎｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ，Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ ａｎｄ Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｏｎ ＢＴ４７４ ａｎｄ ＳＫ－ＢＲ－３ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．２００７；４０（４）：４８８－５０７；Ｔｏｋｕｄａ Ｙ，Ｏｈｎｉｓｈｉ Ｙ，Ｓｈｉｍａｍｕｒａ Ｋ，Ｉｗａｓａｗａ Ｍ，Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ Ｍ，Ｕｅｙａｍａ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｕｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎｉｓｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｃ－ｅｒｂＢ－２ ｐｒｏｄｕｃｔ．Ｂｒｉｔｉｓｈ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ．１９９６；７３（１１）：１３６２；Ｙａｍａｓｈｉｔａ－Ｋａｓｈｉｍａ Ｙ，Ｉｉｊｉｍａ Ｓ，Ｙｏｒｏｚｕ Ｋ，Ｆｕｒｕｇａｋｉ Ｋ，Ｋｕｒａｓａｗａ Ｍ，Ｏｈｔａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｓｈｏｗｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｕｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ＨＥＲ２－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｈｕｍａｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１１；１７（１５）：５０６０－７０；Ｎａｈｔａ Ｒ，Ｈｕｎｇ Ｍ－Ｃ，Ｅｓｔｅｖａ ＦＪ．Ｔｈｅ ＨＥＲ－２－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ａｎｄ Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００４；６４（７）：２３４３－６；Ｇｏｎｇ ＳＪ，Ｊｉｎ ＣＪ，Ｒｈａ ＳＹ，Ｃｈｕｎｇ ＨＣ．Ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｄｒｕｇｓ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ ｌｅｔｔｅｒｓ．２００４；２１４（２）：２１５－２４；Ｋｏ Ｂ－Ｋ，Ｌｅｅ Ｓ－Ｙ，Ｌｅｅ Ｙ－Ｈ，Ｈｗａｎｇ Ｉ－Ｓ，Ｐｅｒｓｓｏｎ Ｈ，Ｒｏｃｋｂｅｒｇ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ＨＥＲ２－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ １Ｅ１１ ｗｉｔｈ Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｓｈｏｗｓ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ａｎｔｉｔｕｍｏｕｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ＨＥＲ２－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２０１５；９（２）：３９８－４０８；Ｔｏｍｉｏｋａ Ｈ，Ｍｕｋｏｈａｒａ Ｔ，Ｋａｔａｏｋａ Ｙ，Ｅｋｙａｌｏｎｇｏ ＲＣ，Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ Ｙ，Ｉｍａｉ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍＴＯＲ／Ｓ６Ｋ ｓｉｇｎａｌ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ＨＥＲ２ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２０１２；４１（２）：５５１－８）と一致している。
ｍＡｂ１０４は、細胞株ＳＫ－ＢＲ－３及びＢＴ－４７４のいずれにおいてもアイソタイプ対照抗体と比べて有意な増殖阻害を示さなかった（それぞれｐ＝０．３３及びｐ＝０．２；両側）（図９Ａ及び９Ｂ）。
図９Ｃ及び９Ｄに示すように、トラスツズマブとペルツズマブの併用は、評価した細胞株の増殖を有意に阻害した（ＢＴ４７４、ｐ＝０．０００８及びＳＫ－ＢＲ－３、ｐ＝０．０００７；両側）；しかしながら、トラスツズマブ単剤療法と比べて統計的有意差はなかった（それぞれＢＴ－４７４、ｐ＝０．５９及びＳＫ－ＢＲ－３、ｐ＝０．５１；両側）。
トラスツズマブまたはペルツズマブへのｍＡｂ１０４の添加は、トラスツズマブ及びペルツズマブの個別の抗細胞増殖活性に影響を与えなかった（図９Ｃ～Ｆ）。評価した細胞株においてトラスツズマブと併用したｍＡｂ１０４の抗増殖効果は、ペルツズマブと併用したトラスツズマブのそれと統計的に差異はなかった（ＢＴ－４７４、ｐ＝０．６６；ＳＫ－ＢＲ－３、ｐ＝０．４７）。
したがって、トラスツズマブ及びペルツズマブとは異なって、ｍＡｂ１０４はＨＥＲ２陽性細胞株に対して検出可能な抗増殖効果を有さなかった。生体内で発生する複数の受容体キナーゼとシグナル伝達経路の複雑な相互作用は常に試験管内で完全に再現できるとは限らず、立体構造変化を受けている活性化受容体を必要とする治療剤の効果を捉えることは試験管内では測定できない可能性がある。活性化ＥＧＦＲにて立体構造上露出されたエピトープを標的とする抗体は、試験管内での任意の増殖阻害または改変されたシグナル伝達を示すことができないにもかかわらず生体内で有意な抗腫瘍活性を示している［Ｊｏｈｎｓ ＴＧ，Ｐｅｒｅｒａ ＲＭ，Ｖｅｒｎｅｓ ＳＣ，Ｖｉｔａｌｉ ＡＡ，Ｃａｏ ＤＸ，Ｃａｖｅｎｅｅ ＷＫ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｇｌｉｏｍａ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｉｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ ｂｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｅｖｅｌｓ， ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ，ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００７；１３（６）：１９１１－２５］。
実施例５：ＥｒｂＢ受容体及び下流のシグナル伝達経路に対するｍＡｂ１０４の効果
増殖アッセイで見られたｍＡｂ１０４で観察された機能の差異を考慮して。本発明者らは、血清飢餓状態でのＳＫ－ＢＲ－３及びＢＴ－４７４乳癌細胞株におけるＭＡＰＫ及びＡｋｔリガンド非依存性経路に対するｍＡｂ１０４よる２４時間の処理後の効果を調べようとした。リガンド依存性シグナル伝達経路に対するｍＡｂ１０４の効果を評価するために、細胞株を抗ＨＥＲ２抗体で２４時間処理した後、１００ｎｇのＥＧＦを１０分間添加した。
リガンド非依存性及び依存性効果の結果をそれぞれ図１０及び１１に示す。他の研究（Ｂｒｏｃｋｈｏｆｆ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｃ－ｅｒｂＢ２ ａｎｄ ｃ－ｅｒｂＢ３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ＳＫ－ＢＲ－３ ａｎｄ ＢＴ４７４ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓＣｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐａｒｔ Ａ．２００１；４４（４）：３３８－４８）と一致して、図８に明らかなように、ＨＥＲ３の発現レベルはがん細胞株では非常に低かったので、本発明者らはＥＧＦＲ－ＨＥＲ２シグナル伝達に焦点を当てた。
この一連の実験（図１０及び１１）では、本発明者らはトラスツズマブ及びペルツズマブによる２４時間の処理が、他者によって以前実証された（Ｍｏｌｉｎａ ＭＡ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ．６１（１２）：４７４４－９；Ｌｕ Ｑ，ｅｔ ａｌ．（２０１６），Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６；７（４１）：６７１２９）ように、ＨＥＲ２陽性乳癌細胞株、ＢＴ－４７４及びＳＫ－ＢＲ－３にてＨＥＲ２全体の発現を有意に低下させないことを実証した。
抗ＨＥＲ２抗体の効果は、リン酸化部位特異的抗体を使用してＡｋｔ経路及びＭＡＰＫ経路でも評価した。双方の乳癌細胞株細胞（ＢＴ－４７４及びＳＫ－ＢＲ－３）では、トラスツズマブ処理がＡｋｔタンパク質全体のレベルを変化させることなくＡｋｔリン酸化の低下を生じるということは、Ａｋｔタンパク質の下方調節ではなくリン酸化活性の低下を表している。これらの知見は他の研究（Ｌｕ Ｑ，ｅｔ ａｌ．ｓｕｐｒａ；Ｙａｋｅｓ ＦＭ，ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ．６２（１４）：４１３２－４１）とも一致している。
ＢＴ－４７４細胞では、トラスツズマブ処理はホスホ－ＭＡＰＫの減少によって示されるようにＭＡＰＫ活性の低下を生じた（図１０Ｃ及びＤ）。対照的に、他の研究（Ｃｕｅｌｌｏ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ．６１（１２）：４８９２－９００）と一致してＭＡＰＫ活性の変化はＳＫ－ＢＲ－３細胞（図１０Ａ及びＢ）では示されなかった。
図１０Ａ及びＢに示すように、単剤療法としてのｍＡｂ１０４による処理は、評価した細胞株の総タンパク質またはリン酸化タンパク質の量に検出可能な変化を生じなかった。
ＢＴ－４７４細胞では、トラスツズマブとペルツズマブの併用は、いずれかの薬剤の単独使用と比べてホスホ－Ａｋｔ及びリン酸化ｐ４４／ｐ４２ ＭＡＰＫのレベルを大幅に低下させたが、ＡｋｔまたはＭＡＰＫ全体対する効果は見られなかった（図１０Ｄ）。対照的に、ＳＫ－ＢＲ－３では、ＭＡＰＫカスケードを介したシグナル伝達は、以前に記載された（Ｎａｈｔａ Ｒ，ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ．６４（７）：２３４３－６）ように、リン酸化ｐ４４／ｐ４２ ＭＡＰＫのレベルが変化しないことで示されるように薬物の併用によって阻害されなかった。Ａｋｔ及びＭＡＰＫのシグナル伝達カスケードにおける同様の変化はトラスツズマブとｍＡｂ１０４、及びトラスツズマブとペルツズマブの併用で見られた。２つの薬物の併用の間で下方調節の程度に有意差はなかった（図１０Ｃ及びＤ）。
リガンド刺激条件（図１１）では、トラスツズマブ及びペルツズマブはＢＴ－４７４におけるＭＡＰＫまたはＡｋｔのシグナル伝達経路に影響を与えなかった（図１１Ａ及びＢ）。ＳＫ－ＢＲ－３細胞株では、ＥＧＦ刺激の１０分後、ペルツズマブによる事前処理はＡｋｔリン酸化の低下を生じたが、Ａｋｔ全体に変化はなかった（図１１Ａ）。これらの知見は他の報告（Ｈｅｎｊｅｓ Ｆ，ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ，１（７）：ｅ１６）と一致している。トラスツズマブは、リガンド非依存性シグナル伝達の抑止に起因してＡｋｔが介在するシグナル伝達を阻害するのに対して、ペルツズマブはリガンド誘導性シグナル伝達を阻止する。ｍＡｂ１０４で処理された細胞へのＥＧＦの添加は、評価された乳癌細胞株にてＭＡＰＫ及びＡｋｔ経路のタンパク質の全体またはリン酸化されたものの量の変化を生じなかった。双方の細胞株では、種々のｍＡｂ１０４の併用で処理した場合、対照抗体と比較してＭＡＰＫまたはＡｋｔのシグナル伝達に対する効果はなかった（図１１Ｃ及びＤ）。
実施例６：試験管内でのアポトーシスに対するｍＡｂ１０４の効果
フローサイトメトリーを使用し、Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｖ１３２４１）を使用して、ＢＴ－４７４細胞及びＳＫ－ＢＲ－３細胞にてｍＡｂ１０４のアポトーシス誘導活性を測定した。初期及び後期アポトーシス細胞画分は象限分析によって定量化した。細胞のみと比べて、トラスツズマブまたはペルツズマブによる処理は、以前の研究（Ｒｏｃｋｈｏｆｆ Ｇ，ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．４０（４）：４８８－５０７；Ｎａｈｔａ Ｒｅｔ ａｌ．（２００４），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６４（７）：２３４３－６；Ｌｕ Ｑ，ｅｔ ａｌ．ｓｕｐｒａ）と一致するアポトーシスを誘導しなかった（図１２）。ＢＴ－４７４（図１２Ａ～Ｇ）と比べて、トラスツズマブによるＳＫ－ＢＲ－３細胞の処理は多数のアポトーシス細胞を生じたが、これは統計的に有意ではなかった（図１２Ｉ～Ｏ）。同様に、細胞のみと比べて、ｍＡｂ１０４は評価された細胞株で有意なアポトーシスを誘導しなかった（ｐ＝０．４９４）。抗体間でアポトーシス活性に差異は見られなかった（ｐ＝０．７２６）。
単剤処理と比べて、トラスツズマブ及びペルツズマブまたはｍＡｂ１０４との併用処理にさらされた細胞ではアポトーシス活性の増加は見られなかった。ＢＴ－４７４では、トラスツズマブ単剤療法による処理後、細胞の８９．９％が生存していたのに対し、トラスツズマブとｍＡｂ１０４による処理後は９１．８％だった（図１２Ａ～Ｇ）。トラスツズマブとペルツズマブまたはｍＡｂ１０４の併用の間でアポトーシス活性に差異は見られなかった（図１２Ａ～Ｆ及びＧ）。
興味深い知見は、トラスツズマブ及びペルツズマブと同様に細胞のみと比べてｍＡｂ１０４による処理後に見られた多数の壊死細胞であった（図１２Ｈ及びＰ）が、この差異は統計的に有意ではなかった。ＢＴ－４７４細胞では、他のすべての群の＜０．５％の細胞と比べて１．８％の細胞が壊死した；同様に、ｍＡｂ１０４による処理後、他の処理群よりも多数のＳＫ－ＢＲ－３細胞が壊死した（図１２Ｐ）が、この差異は統計的に有意ではなかった。興味深いことに、トラスツズマブとの併用でｍＡｂ１０４によって処理された細胞は壊死を起こしている細胞の数の増加をもたらさなかった。
生体内で発生する複数の受容体キナーゼとシグナル伝達経路の複雑な相互作用は、常に試験管内で完全に再現できるとは限らず、ＨＥＲ２のプロセシング及び機能の差異を反映し得、腫瘍の微小環境がＨＥＲ２の機能または生体内の他の要因に及ぼす影響は、ＨＥＲ２にて立体構造上露出されたエピトープを標的とするｍＡｂ１０４の機能的効果が実証されるのに必要とされる。活性化ＥＧＦＲにて立体構造上露出されたエピトープを標的とする抗体は、試験管内での任意の増殖阻害または改変されたシグナル伝達を示すことができないにもかかわらず生体内で有意な抗腫瘍活性を示している（Ｊｏｈｎｓ ＴＧ，Ｐｅｒｅｒａ ＲＭ，Ｖｅｒｎｅｓ ＳＣ，Ｖｉｔａｌｉ ＡＡ，Ｃａｏ ＤＸ，Ｃａｖｅｎｅｅ ＷＫ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｇｌｉｏｍａ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｉｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ ｂｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｅｖｅｌｓ，ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ，ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００７；１３（６）：１９１１－２５）。
ｍＡｂ１０４で見られる検出可能な試験管内活性の欠如にもかかわらず、本発明者らはＨＥＲ２を過剰発現しているがん異種移植片モデルにおける生体内でのその効果の調査を進めた。
ｍＡｂ１０４の生体内での有効性
実施例７：ＨＥＲ２を過剰発現している／が増幅されたＥＲ陽性乳癌異種移植片におけるｍＡｂ１０４単剤療法の有効性
本発明者らは、ＥＲ陽性、ＨＥＲ２過剰発現乳癌細胞株、ＢＴ－４７４の確立された腫瘍異種移植片を担うマウスにてｍＡｂ１０４の有効性を評価した。腫瘍の体積が１００～１２０ｍｍ３に達したら、ｍＡｂ１０４、トラスツズマブ、ペルツズマブ、または対照抗体の１ｍｇ／抗体処理の用量を週３回３週間投与した。
結果を図１３に提示する。処理終了時（３２日目）、処理群のすべての腫瘍は対照群よりも有意に小さかった（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０００６）。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法を使用した事後検定は、対照群と比べてすべての処理群が有意に小さい（ｐ≦０．００１）ことを示した。３２日目での平均腫瘍体積は、３３７．２ｍｍ３（対照群）、４．８ｍｍ３（トラスツズマブ）、６．７ｍｍ３（ペルツズマブ）、及び４８．７ｍｍ３（ｍＡｂ１０４）だった。トラスツズマブ及びペルツズマブの処理群では、処理停止から１週間後の試験終了時（３９日目）まで、顕著な抗腫瘍反応が持続した。しかしながら、ｍＡｂ１０４については、処理を停止すると腫瘍の増殖が再開した。試験終了時（３９日目）、処理群間で増殖阻害に有意差は見られなかった（ｐ＝０．１４）。
本発明者らはまた、確立されたＢＴ－４７４腫瘍異種移植片（１２０～１５０ｍｍ３）に３週間にわたって週３回投与されるｍＡｂ１０４、トラスツズマブ、ペルツズマブ及び対照ＩｇＧの低用量０．５ｍｇ／抗体処理の有効性を評価した。
結果を図１４に表す。トラスツズマブ処理はさらなる腫瘍増殖を抑止した；ペルツズマブ及びｍＡｂ１０４は、対照群と比べて腫瘍増殖速度を低下させた。試験の終了時（５２日目）、処理群すべての腫瘍は対照群よりも有意に小さかった（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０３８）。平均腫瘍体積は９２７．５ｍｍ３（対照）、１８２．４ｍｍ３（トラスツズマブ）、４１５．０ｍｍ３（ペルツズマブ）及び４６９．１ｍｍ３（ｍＡｂ１０４）であった。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法を使用した事後検定は、処理群のマウスが対照群と比べて有意に小さい腫瘍を有することが示した（トラスツズマブ、ｐ＝０．００３５、ペルツズマブ、ｐ＝０．０２、及びｍＡｂ０１４、ｐ＝０．００８）。０．５ｍｇ／ｍｌにて、ｍＡｂ１０４はこのモデルでペルツズマブと同様の抗腫瘍効果を示した（ｐ＝０．９７、両側）。トラスツズマブによる処理は数値的に大きな腫瘍増殖阻害をもたらした一方で、試験終了時（５１日目）でのトラスツズマブとペルツズマブ（ｐ＝０．２２、両側）またはｍＡｂ１０４（ｐ＝０．１５、両側）の間に有意差はなかった。
ログランク分析による生存分析は、抗ＨＥＲ２抗体で処理したマウスは対照群が倫理的配慮（すなわち、腫瘍サイズ≦１０００ｍｍ３）のために処分された時点での対照群よりも有意に（ｐ＜０．００２）高い生存率を有していることを示した。対照群のマウスの生存期間中央値は４１日だった一方で、実験が終了した時点（５２日目）では、処理群のマウスについては生存期間中央値には達していなかった。
実施例８：ＨＥＲ２過剰発現／増幅乳癌ＰＤＸモデルにおけるｍＡｂ１０４単剤療法の有効性
本発明者らは、ＨＥＲ２を過剰発現している／が増幅された乳癌患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）モデルにおけるｍＡｂ１０４の効果を評価した。ドナー試料は未治療であったので、抗ＨＥＲ２療法に対する腫瘍の感受性は１００％であると想定された。６４日目に確立された腫瘍体積が１００～１２０ｍｍ３の間にあれば、マウスを総用量０．５ｍｇのｍＡｂ１０４、トラスツズマブ、ペルツズマブ、または対照ＩｇＧで週３回３週間処理した。腫瘍増殖曲線の結果を図１５Ａに表す。
抗ＨＥＲ２療法はＰＤＸの増殖速度に対して即効を有した。８６日目の処理の停止に続いて、すべての抗ＨＥＲ２処理によって同等の抗腫瘍効果が示され、腫瘍増殖曲線が対照群の増殖速度と平行になり始める約１２５日目まで腫瘍増殖速度の遅延が継続した。試験終了時、１４５日目に、倫理的配慮のために対照群を処分した。１４５日目に、処理群すべては対照群よりも有意に小さかった（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０４）（図１５Ａ）。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法を使用した事後検定は、処理群のマウスが対照群と比べて有意に小さい腫瘍を有することが示した（トラスツズマブ、ｐ＝０．０２、ペルツズマブ、ｐ＝０．０２、ｍＡｂ０１４、ｐ＝０．０３８）。平均腫瘍体積は１０９９．２ｍｍ３（対照）、７６１．２ｍｍ３（ｍＡｂ１０４）、６３２．８ｍｍ３（トラスツズマブ）及び６９１．３ｍｍ３（ペルツズマブ）だった。ｍＡｂ１０４は、このモデルにおいて、承認されたＨＥＲ２標的療法と同等の強力な抗腫瘍活性を示したが、抗ＨＥＲ２療法の間に有意差はなかった（ｐ＝０．５４７（両側）トラスツズマブ対ｍＡｂ１０４及びｐ＝０．７５４（両側）ペルツズマブ対ｍＡｂ１０４）。
生存分析では、処理群のマウスは対照群よりも有意に長い生存期間を有し（ｐ＜０．０００５）、事後検定は抗ＨＥＲ２抗体で処理したすべての群が対照マウスと比べて有意に長く生存したことを示した（ｐ＜０．００１）。対照群のマウスの生存期間中央値は１４５日だった一方で、実験が終了した時点では、処理群のマウスについては生存期間中央値には達していなかった。
実施例９：ＨＥＲ２を過剰発現している／が増幅されたＥＲ陽性乳癌異種移植片におけるトラスツズマブと併用したｍＡｂ１０４の有効性
トラスツズマブとペルツズマブの併用は、ＨＥＲ２発現とは無関係に、いずれかの抗体単独と比べてさらに効果的な抗腫瘍活性及び転移性腫瘍の広がりの防止を文献で実証している。トラスツズマブ及びペルツズマブと比較したｍＡｂ１０４の異なるドメインＩＩのエピトープ結合部位、ならびに生体内での単剤療法としてのｍＡｂ１０４の強力な抗腫瘍活性の本発明者の観察を考慮して、本発明者らは、トラスツズマブ単独またはペルツズマブと併用したｍＡｂと比べてトラスツズマブと併用したｍＡｂ１０４の評価を進めた。
本発明者らは、確立されたＢＴ－４７４乳癌異種移植腫瘍モデルにてトラスツズマブと併用したｍＡｂ１０４の効果を評価した。各マウスは、０．２５ｍｇのトラスツズマブ及び０．２５ｍｇのｍＡｂ１０４またはペルツズマブを受け入れ、３週間にわたる週に３回の総用量０．５ｍｇ／処理または同等の対照抗体を達成した。平均腫瘍体積が１００～１２０ｍｍ３になったら処理を開始した。
結果を図１５Ｂに表す。抗腫瘍効果は、処理開始から１０日以内に明らかであり、処理停止後も継続した。試験期間の５０日目の終了時、腫瘍組織量のために倫理的な理由で対照群を処分した。トラスツズマブの単独群及び併用群の平均±ＳＤ腫瘍体積は対照群よりも有意に小さかった（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０００１）。その後、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法とともに事後検定を実施した。併用療法で処理した腫瘍は、対照群よりも有意に小さく（ｐ＜０．０００１）、８８．９ｍｍ３（ｍＡｂ１０４＋トラスツズマブ）及び４３．６ｍｍ３（トラスツズマブ＋ペルツズマブ）だった。どの処理群でも腫瘍の完全な退行は見られなかった（図１５Ｂ）。ｍＡｂ１０４とトラスツズマブの併用処理は、トラスツズマブ単独と比べてさらに大きな腫瘍縮小をもたらしたが、腫瘍サイズの差異は、併用療法群と単剤療法群の間で統計的に有意ではなかった（ＡＮＯＶＡによるｐ＝０．０９）。
生存分析は、双方の併用群のマウスが対照群と比べて有意に長い生存期間を有することを示した（ｐ＜０．００２）。対照群の生存期間中央値は４４日だった一方で、併用処理群のマウスについては生存期間中央値には達していなかった。ログランク分析は、２つの併用群間で統計的な差異を示さなかった（ｐ＝０．２１、両側）；ｍＡｂ１０４とトラスツズマブによる処理は、ｍＡｂ１０４単独療法と比べて腫瘍増殖を有意に阻害した（ｐ０．０４、両側）（図１５Ａ）。
したがって、これは、トラスツズマブと併用したｍＡｂ１０４が、いずれかの単剤療法単独と比べて増強された抗腫瘍活性を提供することを示唆している。
実施例１０：ＨＥＲ２を過剰発現している／が増幅されたＥＲ陽性乳癌ＰＤＸモデルにおけるトラスツズマブと併用したｍＡｂ１０４の有効性
本発明者らは、ＨＥＲ２を過剰発現している／が増幅された乳癌ＰＤＸモデルにおける同時抗体処理の効果を評価した。ドナー試料は抗ＨＥＲ２未処理であったので、処理に対する腫瘍の感受性は１００％であると想定された。確立された腫瘍体積が１００～１２０ｍｍ３の間にあれば、総処理用量０．５ｍｇのトラスツズマブもしくはアイソタイプ対照のみ、または併用したｍＡｂ１０４とトラスツズマブ、またはトラスツズマブ＋ペルツズマブでマウスを週３回３週間処理した。
８５日目の処理の完了時に、対照群と比べたすべての処理群の間に有意差が観察された（ｐ＜０．０００１）（図１５Ｃ）。さらに、併用群はトラスツズマブ単独よりも効果的だった（ｐ＝０．００１）。併用群のさらに大きな抗腫瘍効果は、腫瘍組織量のために倫理的な理由で対照群が処分された１４５日目に試験が終了するまで継続した。１４５日目で、すべての処理群の腫瘍は対照群よりも有意に小さいままだった（ｐ＜０．０００１）。平均腫瘍体積は１６４．４ｍｍ３（ｍＡｂ１０４＋トラスツズマブ）及び８４．２ｍｍ３（トラスツズマブ＋ペルツズマブ）であった（図１５Ｃ）。２つの併用群間の腫瘍体積の差異は統計的有意性に達しなかった（ｐ＝０．４６、両側）。どの処理群でも腫瘍の完全な退行は見られなかった。
トラスツズマブ単剤療法と比べて、ｍＡｂ１０４とトラスツズマブの同時処理は有意に大きな腫瘍体積縮小をもたらした（ＡＮＯＶＡによるｐ＜０．０００１）。その後、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法とともに事後検定を実施した。併用群の腫瘍は単剤トラスツズマブと比べて有意に小さかった（ｐ＜０．００４９）。
生存分析は、双方の併用群のマウスが対照群と比べて（ｐ＜０．０００５）と同様に単独処理群のマウスと比べて（ｐ＜０．００１４）有意に長い生存期間を有することを示した。対照群の生存期間中央値は１４５日だったが、併用処理群のマウスについては生存期間中央値には達していなかった。
図１５Ａ及びＣの結果は、１４５日目の後、トラスツズマブ単独の平均腫瘍サイズは６３２．８ｍｍ３及びｍＡｂ１０４について７６１．２ｍｍ３であることを示した。ｍＡｂ１０４をトラスツズマブと併用すると、腫瘍サイズは実質的に１６４．４ｍｍ３に減少した。腫瘍サイズのこの減少は、ｍＡｂ１０４のトラスツズマブとの併用がトラスツズマブまたはｍＡｂ１０４単独の単剤療法と比べて抗腫瘍活性の増強をもたらしたことを示唆している。
実施例１１：逆相タンパク質アレイ（ＲＰＰＡ）分析
ＨＥＲ２－乳房ＰＤＸ腫瘍（ｎ＝２／群）から得られた溶解物を８５日目の処理の完了時に採取し、ＲＰＰＡによって分析した。このＲＰＰＡ分析には、総タンパク質及び／またはその活性化型を検出する３００を超える抗体のパネルが含まれていた。重要なタンパク質は決定的なシグナル伝達経路に関与しており、それらにはホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔ経路、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）／マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）／シグナルトランスデューサー及び転写の活性化因子（ＳＴＡＴ）の経路、アポトーシス経路、細胞死及び生存を含む細胞サイクルが含まれる。回収されたデータをタンパク質負荷に対して基準化し、分析のために線形値に変換した。倍数変化の割合は、対照群と、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ｍＡ１０４、またはそれらの併用のいずれかで処理された腫瘍試料との間のタンパク質発現の差異の比率として算出された。
ｍＡｂ１０４がＨＥＲ２乳癌ＰＤＸモデルで有意な抗腫瘍活性を示すにもかかわらず、評価した他の抗体と比べてタンパク質レベルに有意な変化は見られなかった（表９）。
Figure 2022529232000020
Figure 2022529232000021
実施例１２：確立された腫瘍の免疫組織化学的分析
単剤療法群及び併用処理群のそれぞれからの確立されたＢＴ－４７４乳癌異種移植片を担うマウス（ｎ＝２）を最後の処理の１日後に屠殺し、異種移植片組織試料を取得し、腫瘍増殖、下流のシグナル伝達及び血管新生のＩＨＣ分析のために調製した。
腫瘍増殖に対するｍＡｂ１０４単剤療法の効果をＫｉ６７染色によって調べたが、その結果を図１６Ａに提示する。ＢＴ－４７４異種移植腫瘍では、抗ＨＥＲ２抗体による処理は、対照群と比べて増殖を有意に低下させなかった（ＡＮＯＶＡによるｐ＝０．６２５、事後分析は異なる処理群間で差がないことを示した）。平均Ｈスコアは１０２．６（対照）、８３．９（トラスツズマブ）、９１．１（ペルツズマブ）、及び９９．７（ｍＡｂ１０４）だった。
抗増殖効果にＡｋｔ経路の下方調節が介在したかどうかを判定するために、Ａｋｔをリンタンパク質アッセイによって評価した（図１６Ｂ）。ＢＴ－４７４では、ホスホ－ＡｋｔのＨスコアには処理群と対照群の間では有意差は見られなかった（ＡＮＯＶＡによるｐ＝０．９５８、事後分析では処理群に差異はなかった）。平均Ｈスコアは１２９．６（対照）、１２４．３（トラスツズマブ）、１１４．６（ペルツズマブ）、及び１３２．５（ｍＡｂ１０４）だった。
トラスツズマブは抗血管新生効果を有することが示されている（Ｐａｒａｋｈ Ｓ，（２０１７），Ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｒｅｖｉｅｗｓ．５９：１－２１）ので、本発明者らは、ポドカリキシンを染色することによって腫瘍組織の微小血管密度に対するｍＡｂ１０４の効果を調べた（図１６Ｃ）。免疫組織化学的染色は以前に記載されたように実施した。微小血管密度（％）は、生存領域における陽性染色領域の全観察領域に対する比率から算出した。ＢＴ－４７４異種移植腫瘍では、有意なトラスツズマブの抗血管新生活性が観察された（ｐ＜０．００１）一方で、ｍＡｂ１０４及びペルツズマブは対照抗体と比べて腫瘍血管系に有意な効果を有さなかった（ｐ＝０．９８７）。
トラスツズマブ及びペルツズマブの併用は対照と比べて（ｐ＜０．０５）、ならびにトラスツズマブ及びｍＡｂ１０４と比べて（ｐ＝０．０１７、両側）増殖を有意に減少させた。平均Ｈスコアは１２９．６（対照）、７．４（トラスツズマブ＋ペルツズマブ）、及び９７．６（トラスツズマブ＋ｍＡｂ１０４）だった（図１６Ｄ）。これらの知見は以前の報告（Ｂｒｏｃｋｈｏｆｆ Ｇ，（２００７），Ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．４０（４）：４８８－５０７）と同様である。
対照抗体と比較した場合、トラスツズマブ＋ペルツズマブまたはトラスツズマブ＋ｍＡｂ１０４で処理したＢＴ－４７４腫瘍試料では、ｐＡｋｔ（図１６Ｅ）または血管新生（図１６Ｆ）に対する効果は観察されなかった。
胃癌
実施例１３：試験管内でのｍＡｂ１０４の抗増殖効果
試験管内では、トラスツズマブは、以前の報告（Ｇｒａｖａｌｏｓ Ｃ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｏｎｃｏｌｏｇｙ．１９（９）：１５２３－９）と一致して、ＮＣＩ－Ｎ８７の増殖を有意に（ｐ＜０．０００１）阻害し、ＯＥ－１９胃癌細胞の増殖に影響を与えた（図１７）。単剤療法としてのペルツズマブは、評価した細胞株にて対照抗体と比べて有意な抗増殖活性を有さなかった（ＮＣＩ－Ｎ８７、ｐ＝０．０２；及びＯＥ１９、ｐ＝０．９６）。これらの知見はインキュベート時間及び用量の差異にもかかわらず、他の研究（Ｂｒｏｃｋｈｏｆｆ Ｇ，ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．４０（４）：４８８－５０７；Ｔｏｋｕｄａ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｂｒｉｔｉｓｈ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ．７３（１１）：１３６２；Ｙａｍａｓｈｉｔａ－Ｋａｓｈｉｍａ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２０１１），Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１７（１５）：５０６０－７０；Ｎａｈｔａ Ｒ，ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ．６４（７）：２３４３－６；Ｇｏｎｇ ＳＪ，ｅｔ ａｌ（２００４），Ｃａｎｃｅｒ ｌｅｔｔｅｒｓ．２１４（２）：２１５－２４；Ｋｏ Ｂ－Ｋ，ｅｔ ａｌ．（２０１５），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｏｎｃｏｌｏｇｙ．９（２）：３９８－４０８；Ｔｏｍｉｏｋａ Ｈ，ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｏｎｃｏｌｏｇｙ．４１（２）：５５１－８）と一致している。
モノクローナル抗体ｍＡｂ１０４もアイソタイプ対照抗体と比べて試験管内で有意な増殖阻害を示さなかった（ＮＣＩ－Ｎ８７、ｐ＝０．３４；及びＯＥ１９、ｐ＝０．１２）（図１７）。これは、ＥＧＦＲ受容体上で立体構造上露出されたエピトープを標的とする抗体を評価する他の試験管内研究（Ｊｏｈｎｓ ＴＧ，ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．１００（２６）：１５８７１－６；Ｊｏｈｎｓ ＴＧ，ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１３（６）：１９１１－２５）と一致している。
トラスツズマブとペルツズマブの併用は評価された胃癌／ＧＥＪ細胞株の増殖を有意に阻害した（図１８）。しかしながら、トラスツズマブ単剤療法と比べて統計的差異はなかった。トラスツズマブまたはペルツズマブと併用したｍＡｂ１０４の増殖に対する効果を評価した；ｍＡｂ１０４の添加は個々の抗体単独と比べて抗増殖効果を追加しなかった。重要なことに、ｍＡｂ１０４とトラスツズマブの併用は、トラスツズマブとペルツズマブの併用と統計的に差異はなかった（ＮＣＩ－Ｎ８７、ｐ＝０．２９；及びＯＥ１９、ｐ＝０．１４）。
実施例１４：ＥｒｂＢ受容体及び下流のシグナル伝達経路に対するｍＡｂ１０４の効果
ＨＥＲ２過剰発現胃癌細胞株、ＮＣＩ－Ｎ８７及びＯＥ１９では、単剤療法としての抗ＨＥＲ２抗体による処理は、以前の報告（Ｋｏ Ｂ－Ｋｅｔ ａｌ．（２０１５），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｏｎｃｏｌｏｇｙ．９（２）：３９８－４０８；Ｔｏｍｉｏｋａ Ｈ，ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｏｎｃｏｌｏｇｙ．４１（２）：５５１－８）と一致して、ＭＡＰＫ及びＡｋｔのシグナル伝達経路における総タンパク質またはリン酸化タンパク質に影響を及ぼさなかった（図１９Ａ及びＢ）。
ＮＣＩ－Ｎ８７胃癌細胞株におけるトラスツズマブとペルツズマブまたはｍＡｂ１０４の併用処理は、総タンパク質レベルを変化させないままで、ホスホ－Ａｋｔ及びリン酸化ｐ４４／ｐ４２ ＭＡＰＫの下方調節をもたらした（図１９Ｃ及びＤ）。
リガンド刺激条件（図２０Ａ及びＢならびに２０Ｃ及びＤ）では、ｍＡｂ１０４は評価した細胞株におけるＭＡＰＫまたはＡｋｔのシグナル伝達経路に影響を及ぼさなかった。この効果の欠如は、ｍＡｂ０１４をトラスツズマブ及びペルツズマブと組み合わせて使用した場合にも観察された（図２０Ｃ及びＤ）。
この細胞株におけるトラスツズマブとペルツズマブの併用処理によるシグナル伝達で説明されている変化は、他の研究（Ｙａｍａｓｈｉｔａ－Ｋａｓｈｉｍａ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２０１１），Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１７（１５）：５０６０－７０；Ｋｏ Ｂ－Ｋ，ｅｔ ａｌ．（２０１５），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｏｎｃｏｌｏｇｙ．９（２）：３９８－４０８；Ｔｏｍｉｏｋａ Ｈ，ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｏｎｃｏｌｏｇｙ．４１（２）：５５１－８）と一致しており、トラスツズマブとｍＡｂ１０４で観察されたものと類似している。これらの結果は、トラスツズマブと併用したｍＡｂ１０４がＥｒｂＢファミリータンパク質の活性を阻害し、下流のシグナル伝達を抑制することを示唆している。対照的に、トラスツズマブとペルツズマブまたはｍＡｂ１０４の併用処理で処理した場合、ＯＥ１９ではＥｒｂＢファミリーの総タンパク質もしくは活性化タンパク質またはＭＡＰＫ及びＡｋｔシグナル伝達カスケードの変化は見られなかった。双方の胃癌細胞株において、ペルツズマブとｍＡｂ１０４の併用処理は、シグナル伝達カスケードだけでなく、ＥｒｂＢ総タンパク質またはリン酸化タンパク質のレベルにも効果を有さなかった。
実施例１５：胃癌細胞のアポトーシスに対するｍＡｂ１０４の効果
フローサイトメトリーを使用して、ＮＣＩ－Ｎ８７（図２１Ａ及びＢ）及びＯＥ－１９細胞株（図２１Ｃ）におけるｍＡｂ１０４のアポトーシス誘導活性を測定し、象限分析（図２１）によって初期及び後期のアポトーシス細胞画分を定量した。トラスツズマブで処理した細胞は対照抗体と比べてアポトーシスを誘導せず；比較すると、ペルツズマブによる処理はアポトーシスの後期にてさらに多くの細胞をもたらした。これらの知見は他の公開された研究と一致している。ｍＡｂ１０４は、トラスツズマブまたはペルツズマブの単剤処理と比べて、後期アポトーシス細胞集団を増加させた。ＯＥ－１９では、対照抗体と比べて、単剤療法または併用療法としてアポトーシスを誘導する抗体はなかった（図２１Ｃ）。
トラスツズマブとペルツズマブの併用での処理は、トラスツズマブとｍＡｂ１０４の併用よりも有意に多くのアポトーシス細胞をもたらした。トラスツズマブ及びペルツズマブによる処理後、細胞の６１．４％が生存可能であったのに対し、ｍＡｂ１０４を伴ったトラスツズマブ後は９０．５％だった（図２１Ａ）。トラスツズマブとｍＡｂ１０４の併用は、対照抗体または他の単剤療法処理と比べてアポトーシスを誘導しなかった。
重要な知見は、対照抗体及びトラスツズマブ及びペルツズマブと比べてｍＡｂ１０４による処理後に多数の壊死細胞が見られることだった（図２１Ｃ）。評価した双方の細胞株では、ｍＡｂ０１４処理後の壊死細胞は他の処理群と比べて２倍に増加した。興味深いことに、トラスツズマブとの併用でｍＡｂ１０４によって処理した細胞は壊死を起こしている細胞の数の増加をもたらさなかった。
実施例１６：遊走（創傷治癒）アッセイに対するｍＡｂ１０４の効果
その形態及び増殖パターンのために、ＯＥ－１９細胞株を使用して遊走に対するｍＡｂ１０４の効果を評価した。ＮＣＩ－Ｎ８７細胞は通常、最初は小さな島に付着し、その後密集したパッチに増殖するので、集密度を正しく推定することが困難になるため、使用しなかった。抗体の添加は、処理後７２時間で１００μｇ／ｍｌの用量にて対照抗体と比べてＯＥ－１９細胞の遊走を遅延させなかった（図２２）。
乳癌細胞株であるＢＴ－４７４は通常、稀にしか集密にならない緻密な多層コロニーである付着パッチを形成するので、このアッセイには適していない。
実施例１７：ＨＥＲ２を過剰発現している／が増幅された胃癌異種移植片におけるｍＡｂ１０４単剤療法の有効性
本発明者らは、ＨＥＲ２過剰発現胃癌細胞株、ＮＣＩ－Ｎ８７の異種移植片を担うマウスにてｍＡｂ１０４の抗腫瘍活性を調べた。ｍＡｂ１０４、トラスツズマブ、ペルツズマブ及び対照ＩｇＧの週３回３週間の注射によってマウスを処理した。すべての実験にて平均腫瘍体積が１００～１２０ｍｍ３になったら処理を開始した。ＮＣＩ－Ｎ８７異種移植モデルを含む予備実験では、腫瘍モデルにおけるｍＡｂ１０４の有効性を確認するためにさまざまな処理投与量を利用した。
１ｍｇ／処理の初期用量を利用したが、結果を図２３に示す。処理終了時（２８日目）、処理群のすべての腫瘍は対照群よりも有意に小さかった（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０００１）。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法とともに事後検定を実施した。すべての処理群の腫瘍は有意に小さく、ｐ＜０．０００１）；平均腫瘍体積は３３３．９ｍｍ３（対照）、５６．１ｍｍ３（トラスツズマブ）、７７．９ｍｍ３（ペルツズマブ）、及び６６．１ｍｍ３（ｍＡｂ１０４）であり、種々の処理群間で増殖阻害に統計的差異は見られなかった（ｐ＞０．０５）。
１ｍｇの用量で見られた有効性に基づいて、０．５ｍｇ／処理のさらに低い用量を使用して実験を繰り返した。腫瘍増殖曲線を図２４に示す。処理終了時（３２日目）、処理群のすべての腫瘍は対照群よりも有意に小さかった（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０００１）。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法による事後検定は、対照群と比べてすべての処理群が有意に小さい（ｐ＜０．０００１）ことを示した。平均腫瘍体積はそれぞれ、２８０．８ｍｍ３（対照群）、１０４．０ｍｍ３（トラスツズマブ）、１５２．２ｍｍ３（ペルツズマブ）、及び１０５．７ｍｍ３（ｍＡｂ１０４）だった。処理群間で増殖阻害に統計的差異は見られなかった。腫瘍増殖の休止は、すべての抗体群での処理の開始から処理停止の２２日後である５０日目まで明らかだった。
抗ＨＥＲ２抗体で処理したマウスは対照群と比べて有意に長い生存期間を有した（ＡＮＯＶＡ，ｐ＜０．０００２、事後検定は処理群すべてが対照マウスと比べて有意に長く生存したことを示した、ｐ＜０．０００１）。試験終了の１００日目に、ｍＡｂ１０４はトラスツズマブの２０％と比べて６０％の動物が生存するという顕著な生存の利点を示し、他の群ではそのようなことはなかった。群の生存期間中央値は５９日（対照）、９１日（トラスツズマブ）、８３日（ペルツズマブ）であり、実験が終了した時点（１００日目）でｍＡｂ１０４によって処理したマウスでは生存期間中央値には達しなかった。この観察は、ヒト化された構築物と比べてマウスの循環にて予想されるさらに長い半減期を有するマウスｍＡｂ１０４に起因し得る。
同様の強力な生体内有効性は、０．１ｍｇ／処理の用量を使用して確立されたＮＣＩ－Ｎ８７胃癌異種移植片で実験が繰り返されたときに見られた（図２５）。処理終了時（２８日目）、処理群のすべての腫瘍は対照群よりも有意に小さかった（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０００１）。平均腫瘍体積は、３４０．４ｍｍ３（対照群）、１３６．３ｍｍ３（トラスツズマブ）、１４７．５ｍｍ３（ペルツズマブ）、及び１０４．４ｍｍ３（ｍＡｂ１０４）だった。処理群間で増殖阻害に統計的差異は見られなかった（図２５Ａ）。
０．１ｍｇ／用量の抗ＨＥＲ２抗体で処理したマウスはログランク分析によって対照群と比べて有意に長い生存期間を有した（ｐ＜０．０００１、事後検定は処理群すべてが対照マウスと比べて有意に長く生存したことを示した、ｐ＜０．０００２）（図２５Ｂ）。群の生存期間中央値は、６２日（対照）、８３日（トラスツズマブ）、７９日（ペルツズマブ）及びｍＡｂ１０４で処理したマウスについて８３日だった。
実施例１８：ＨＥＲ２を過剰発現している／が増幅された胃食道癌異種移植片におけるｍＡｂ１０４単剤療法の有効性
本発明者らは、ＯＥ－１９異種移植片を担うマウスにおけるｍＡｂ１０４の生体内抗腫瘍活性を調べた。マウスはｍＡｂ１０４、トラスツズマブ、ペルツズマブ及び対照ＩｇＧの１ｍｇ／抗体処理の用量を週３回３週間受けた。平均腫瘍体積が１００～１２０ｍｍ３になったら処理を開始した。この急速に増殖する腫瘍モデルでは、腫瘍体積が倫理的に承認された１０００ｍｍ３を超えたので、アイソタイプ対照抗体で処理したマウスは処理スケジュールが完了する前（１９日目；抗体の投与量－５）に処分された。
結果を図２６に示す。１９日目では、処理群のすべての腫瘍は対照群よりも有意に小さかった（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０００１）。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法とともに事後検定を実施した。個々の処理群での腫瘍は対照群よりも有意に小さかった（ｐ＜０．０００１）。試験の終了時、トラスツズマブ、ペルツズマブ、またはｍＡｂ１０４の間で腫瘍増殖阻害に統計的差異はなかった（ｐ＝０．１６）。
本発明者らはさらに低い用量の０．５ｍｇ／処理を使用してこの実験を繰り返したが、腫瘍増殖曲線を図２７に示す。平均腫瘍体積が１００～１２０ｍｍ３になったら処理を開始した。試験終了時（２５日目）の処理群の平均腫瘍体積は、９７４．８ｍｍ３（対照）、７８２．０ｍｍ３（ｍＡｂ１０４）、４７４．５ｍｍ３（トラスツズマブ）、８３２．０ｍｍ３（ペルツズマブ）だった。トラスツズマブ群で処理した腫瘍は対照群よりも有意に小さかった（ｐ＜０．００１）。ｍＡｂ１０４群及びペルツズマブ群の腫瘍は数値的に小さいにもかかわらず、増殖阻害のこの差異は事後Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法では統計的差異に達しなかった。ペルツズマブとｍＡｂ１０４の間に増殖阻害の統計的差異は見られなかった（ｐ＝０．３９、双方の比較で両側）。トラスツズマブは、ペルツズマブ（ｐ＝０．０２４；両側）及びｍＡｂ１０４（ｐ＝０．００４；両側）の双方よりも効果的だった（図２７Ａ）。
抗ＨＥＲ２抗体で処理したマウスはログランク分析によって対照群と比べて有意に長い生存期間を有した（ｐ＜０．０００５、事後検定は処理群すべてが対照マウスと比べて有意に長く生存するとを示した、ｐ＜０．００６）。群の生存期間中央値は２５日（対照）、３０日（ペルツズマブ）、３０日（ｍＡｂ１０４）及び３５日（トラスツズマブ）だった（図２７Ｂ）。
実施例１９：ＮＣＩ－Ｎ８７胃癌異種移植片におけるトラスツズマブと併用したｍＡｂ１０４の有効性
本発明者らは、ＮＣＩ－Ｎ８７異種移植モデルにてトラスツズマブと併用したｍＡｂ１０４の有効性を評価した。マウスを総用量０．５ｍｇの併用のｍＡｂ１０４とトラスツズマブ、トラスツズマブとペルツズマブ、または対照ＩｇＧのみで処理した。各マウスは、０．２５ｍｇのトラスツズマブ及び０．２５ｍｇのｍＡｂ１０４またはペルツズマブを受け、０．５ｍｇ／処理の総用量を達成した。平均腫瘍体積が１００～１２０ｍｍ３であった９日目に処理を開始したが、腫瘍増殖曲線を図２８に提示する。
処理の開始とともに、すべての抗体処理で即時の抗腫瘍効果が観察され、２４日目の処理停止後も腫瘍増殖の抑止が続き、併用処理群ではさらに長期の抗腫瘍効果が観察された。５７日目に、対照群の平均体積が倫理的に承認された１０００ｍｍ３に達したとき、対照群のマウスを処分した。この時点で、併用処理群の腫瘍は対照群よりも有意に小さいままだった（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０００１）（図２８）。
併用群の平均腫瘍体積は１０４．９ｍｍ３（ｍＡｂ１０４＋トラスツズマブ群）及び３１．９ｍｍ３（トラスツズマブ＋ペルツズマブ群）だった。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法を使用した事後検定は、対照群と比べて双方の処理群が有意に小さい（ｐ＜０．０５）ことを示した。２つの併用群の間に統計的差異は見られなかった（ｐ＝０．２７）。どの処理群でも腫瘍の完全な退行は見られなかった。
試験の終了時、トラスツズマブ／ペルツズマブ及びトラスツズマブ／ｍＡｂ１０４の双方の併用は、ＡＮＯＶＡによって単剤処理群と比べて有意に小さい腫瘍体積（ｐ＝０．００５）をもたらし、事後検定はｍＡｂ１０４とトラスツズマブについて単剤トラスツズマブと比べてｐ＜０．００５を示した。
実験が終了した時点では抗ＨＥＲ２抗体の併用で処理したマウスについては生存期間中央値には到達していなかった。
実施例２０：ＯＥ１９胃食道癌異種移植片におけるトラスツズマブと併用したｍＡｂ１０４の有効性
ＯＥ１９異種移植腫瘍モデルにてトラスツズマブと併用したｍＡｂ１０４の有効性を評価した。前の実験と同様に、マウスを総用量０．５ｍｇの併用のｍＡｂ１０４とトラスツズマブ、またはトラスツズマブとペルツズマブ、０．５ｍｇのトラスツズマブのみまたは対照ＩｇＧ単独によって処理し、平均腫瘍体積が１００～１２０ｍｍ３になったら処理を開始した。腫瘍増殖曲線の結果を図２９に示す。
対照群の平均体積が倫理的に承認された１０００ｍｍ３達した２５日目に試験を終了した。この時点で、処理群の平均腫瘍体積は９７４．８ｍｍ３（対照）、８８．８ｍｍ３（ｍＡｂ１０４＋トラスツズマブ）、及び９９．８ｍｍ３（トラスツズマブ＋ペルツズマブ）だった（図２９Ａ）。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法を使用した事後検定は対照群と比べて双方の処理群が有意に小さい（ｐ＜０．０００１）ことを示した。どの処理群でも腫瘍の完全な退行は見られなかった。
単剤処理群と比べて、ｍＡｂ１０４とトラスツズマブによる併用処理は有意に大きな腫瘍体積縮小をもたらした（ＡＮＯＶＡによるｐ＜０．０００１、事後検定は単剤処理群と比べて併用群でｐ＜０．０００１を示した）。
生存分析は、双方の併用群のマウスが対照群と比べて（ｐ＜０．０００５）、同様に単独処理群のマウスと比べて（ｐ＜０．００５）有意に長い生存期間を有することを示した（図２９Ｂ）。対照群の生存期間中央値は２５日だった一方で、併用処理群のマウスについては生存期間中央値には達していなかった。ログランク分析では２つの併用処理群の間に統計的差異は見られなかった（ｐ＝０．１１、両側）。
実施例２１：確立された腫瘍の免疫組織化学的分析
胃癌及び食道癌の単剤療法群及び併用処理群のそれぞれからのマウスのサブセット（ｎ＝２）を最後の処理の１日後に屠殺し、異種移植片組織を取得し、腫瘍増殖、下流のシグナル伝達及び血管新生のＩＨＣ分析のために調製した。ＮＣＩ－Ｎ８７異種移植片の抗ＨＥＲ２単剤療法後の結果を図３０Ａ～Ｃに、併用療法を図３０Ｄ～Ｆに提示する。ＯＥ－１９食道癌異種移植片の抗ＨＥＲ２単剤療法後の結果を図３１Ａ～Ｃに、併用療法を図３１Ｄ～Ｆに提示する。
増殖：腫瘍増殖に対するｍＡｂ１０４の効果をＫｉ－６７染色によって調べたが、その結果を図３０、パネルＡに提示する。単剤としての抗ＨＥＲ２抗体で処理したＮＣＩ－Ｎ８７腫瘍では、すべての抗体が対照群と比べて増殖を有意に減少させた（ＡＮＯＶＡによるｐ＝０．０２）。平均Ｈスコアは１３４．８（対照）、１２６．８（トラスツズマブ）、１０６．６（ペルツズマブ）、及び９８．１（ｍＡｂ１０４）だった。図３０、パネルＤに示すように、トラスツズマブとペルツズマブまたはｍＡｂ１０４の併用は、対照と比べて増殖を有意に減少させず（ｐ＝０．１９３）、図３０Ｄ～Ｆに提示するように２つの併用間で抗増殖効果における差異は見られなかった（ｐ＝０．７２６）。
急速に増殖しているＯＥ－１９腫瘍の分析（図３１Ａ）は、抗ＨＥＲ２単剤療法について対照抗体と比べて増殖の有意な減少を示さなかった（ＡＮＯＶＡによるｐ＝０．７９）。平均Ｈスコアは１５３．４（対照）、１２７．５（トラスツズマブ）、１４６．０（ペルツズマブ）、及び１３８．６（ｍＡｂ１０４）だった。同様に、ペルツズマブ（ｐ＝０．４３２０、両側）またはｍＡｂ１０４（ｐ＝０．５５４、両側）とのトラスツズマブの併用は、図３１Ａ～Ｃに提示するように対照抗体と比べて増殖を有意に減少させなかった。
下流のシグナル伝達：生体内で観察された抗腫瘍効果にＡｋｔ経路の下方調節が介在するかどうかを判定するために、ｐＡｋｔをリンタンパク質アッセイによって評価した（図３０Ｂ、ＮＣＩ－Ｎ８７；図３１Ｂ、ＯＥ１９）。ＮＣＩ－Ｎ８７では、処理群と対照群の間でのホスホ－ＡｋｔのＨスコアには有意差は見られなかった（ＡＮＯＶＡによるｐ＝０．５３２）。平均Ｈスコアは８７．７（対照）、８７．６（トラスツズマブ）、７８（ペルツズマブ）、及び７８．５（ｍＡｂ１０４）だった。同様の知見はＯＥ１９異種移植片でも見られ；ｍＡｂ１０４は、対照と比べてＡｋｔ経路に有意な影響を与えなかった（ｐ＝０．１９２）。
血管系：本発明者らは、ポドカリキシンを染色することによって腫瘍組織における微小血管密度に対するｍＡｂ１０４の効果を調べた。結果をＮＣＩ－Ｎ８７については図３０Ｃにて；ＯＥ－１９異種移植片については図３１Ｆにて提示する。微小血管密度（％）は、生存領域における陽性染色領域の全観察領域に対する比率から算出した。ＮＣＩ－Ｎ８７及びＯＥ－１９異種移植腫瘍では、ｍＡｂ１０４及び陽性対照のトラスツズマブは、アイソタイプ対照抗体と比較した場合、腫瘍血管系に有意な効果を有さなかった（ｐ＝１．００、ＮＣＩ－Ｎ８７及びｐ＝０．０５４、ＯＥ－１９）。
実施例２２：免疫組織化学によって判定された腫瘍及び正常組織におけるｍＡｂ１０４結合の特異性
ｍＡｂ１０４の染色パターンを正常なヒト組織及び腫瘍組織の範囲で定性的に評価し、ＨＥＲ２の臨床検査に利用されるウサギ抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体Ｖｅｎｔａｎａ４Ｂ５（Ｔｕｃｓｏｎ、Ａｒｉｚｏｎａ）を使用したＨＥＲ２染色パターンと比較した。乳癌のＨＥＲ２検査に関するＡｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ及びＣｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ（ＡＳＣＯ／ＣＡＰ）の推奨事項を使用して、染色パターンを評価し（Ｗｏｌｆｆ ＡＣ，Ｈａｍｍｏｎｄ ＭＥＨ，Ｈｉｃｋｓ ＤＧ，Ｄｏｗｓｅｔｔ Ｍ，ＭｃＳｈａｎｅ ＬＭ，Ａｌｌｉｓｏｎ ＫＨ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２ ｔｅｓｔｉｎｇ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｕｐｄａｔｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２０１３；３１（３１）：３９９７－４０１３）、以下のようにスコア化した：３＋、均一な強い膜染色を伴う浸潤性腫瘍細胞が＞１０％；２＋、膜染色が不完全なもしくは弱い浸潤性腫瘍細胞が＞１０％、または強い膜染色を伴う浸潤性腫瘍細胞が≦１０％；１＋、わずかに不完全な膜染色を伴う浸潤性腫瘍が＞１０％；０、染色がない場合またはわずかな染色で浸潤性腫瘍細胞が≦１０％。ＨＥＲ２染色は、ＩＨＣが３＋であれば陽性、２＋であれば曖昧、１＋及び０であれば陰性と報告された。胃／ＧＯＪ組織の染色パターンはＴｏＧＡ試験（Ｂａｎｇ Ｙ－Ｊ，ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｒｓｕｓ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｌｏｎｅ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ＨＥＲ２－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｄｖａｎｃｅｄ ｇａｓｔｒｉｃ ｏｒ ｇａｓｔｒｏ－ｏｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｃａｎｃｅｒ（ＴｏＧＡ）：ａ ｐｈａｓｅ ３，ｏｐｅｎ－ｌａｂｅｌ，ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ．Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ．２０１０；３７６（９７４２）：６８７－９７）及びＲｕｓｃｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（Ｒｕｓｃｈｏｆｆ Ｊ，Ｄｉｅｔｅｌ Ｍ，Ｂａｒｅｔｔｏｎ Ｇ，Ａｒｂｏｇａｓｔ Ｓ，Ｗａｌｃｈ Ａ，Ｍｏｎｇｅｓ Ｇ，ｅｔ ａｌ．ＨＥＲ２ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ－ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｅｓｔｉｎｇ．Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈｉｖ．２０１０；４５７（３）：２９９－３０７）に記載された、Ｈｏｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（Ｈｏｆｍａｎｎ Ｍ，Ｓｔｏｓｓ Ｏ，Ｓｈｉ Ｄ，Ｂｕｔｔｎｅｒ Ｒ，Ｖａｎ Ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒ Ｍ，Ｋｉｍ Ｗ，ｅｔ ａｌ．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ａ ＨＥＲ２ ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ：ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ａ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ．２００８；５２（７）：７９７－８０５）によって提案されたスコア化スキームを用いてスコア化した：０、腫瘍細胞の＜１０％で染色または膜反応性なし；１＋、腫瘍細胞の≧１０％で弱い膜反応性；２＋、細胞≧１０％で中程度の／弱い完全または基底外側の膜染色、及び３＋、腫瘍性細胞の≧１０％で強い完全なまたは基底外側の膜染色。０及び１＋のスコアは陰性と見なされ、２＋以上のスコアは陽性と報告された。乳癌と同様に、細胞質染色ではなく膜染色のみがＨＥＲ２スコア化に考慮された（データは示さず）。
正常組織
正常組織におけるＨＥＲ２発現の報告は非常に限られる。さらに、ＨＥＲ２の発現は限られた数の細胞型でのみ見られ、異種間及び異種内の組織発現が見られる（Ｍａｒｇａｎ ＭＭ，Ｊｉｔａｒｉｕ ＡＡ，Ｃｉｍｐｅａｎ ＡＭ，Ｎｉｃａ Ｃ，Ｒａｉｃａ Ｍ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｏｒｔｒａｉｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｏｒｍａｌ Ｈｕｍａｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．２０１６；１９（２）：９９－１１１）。
１）脳
反応性星状細胞、ニューロン、髄膜細胞におけるＨＥＲ２の発現は不均一であり、発現の程度はさまざまであり、発現の頻度は一般的に報告されていない（Ｗｏｌｆｆ ＡＣ，Ｈａｍｍｏｎｄ ＭＥＨ，Ｈｉｃｋｓ ＤＧ，Ｄｏｗｓｅｔｔ Ｍ，ＭｃＳｈａｎｅ ＬＭ，Ａｌｌｉｓｏｎ ＫＨ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２ ｔｅｓｔｉｎｇ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｕｐｄａｔｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２０１３；３１（３１）：３９９７－４０１３）。我々の手の内では、正常な脳組織にはｍＡｂ１０４または対照抗ＨＥＲ２抗体４Ｂ５によって検出されるＨＥＲ２染色はなかった。
２）乳房組織
ＨＥＲ２は正常なヒト乳房組織ではあまり発現せず、胎児組織及び悪性乳腺組織ではかなり高いレベルで発現される（Ｆｌａｇｅｎｇ ＭＨ，Ｋｎａｐｐｓｋｏｇ Ｓ，Ｈａｙｎｅｓ ＢＰ，Ｌｏｎｎｉｎｇ ＰＥ，Ｍｅｌｌｇｒｅｎ Ｇ．Ｉｎｖｅｒｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１ ａｎｄ ＨＥＲ２－４ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｔｉｓｓｕｅ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ．２０１３；８（８）：ｅ７４６１８）。評価された８つの正常な乳房組織試料のうち、ｍＡｂ１０４または４Ｂ５のいずれでもＨＥＲ２染色は見られなかった。
３）大腸
大腸組織では、ほぼすべて（２０／２１試料）で抗ＨＥＲ２抗体によってＨＥＲ２タンパク質が結腸上皮の基底膜で弱く（１＋）染色されたが；この知見は文献（Ｓｅｏ ＡＮ，Ｋｗａｋ Ｙ，Ｋｉｍ Ｄ－Ｗ，Ｋａｎｇ Ｓ－Ｂ，Ｃｈｏｅ Ｇ，Ｋｉｍ ＷＨ，ｅｔ ａｌ．ＨＥＲ２ ｓｔａｔｕｓ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ：ｉｔｓ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ＨＥＲ２ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ．２０１４；９（５）：ｅ９８５２８）と一致する。ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔのスコア化基準を使用すると、これらの知見はＨＥＲ２結合について陰性である。対照的に、ｍＡｂ１０４は調べた試料すべてで正常な大腸組織に対して反応性を示さなかった。
４）心臓組織
ヒト心筋におけるＨＥＲ２の発現を評価する研究では、肥大または心筋炎の心臓異常を伴う６０症例のうち６症例で弱い不連続膜染色が検出された（Ｆｕｃｈｓ ＩＢ，Ｌａｎｄｔ Ｓ，Ｂｕｅｌｅｒ Ｈ，Ｋｕｅｈｌ Ｕ，Ｃｏｕｐｌａｎｄ Ｓ，Ｋｌｅｉｎｅ－Ｔｅｂｂｅ Ａｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＨＥＲ２ ａｎｄ ＨＥＲ４ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ ｔｏ ｃｌａｒｉｆｙ ｔｈｅ ｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉ（商標））．Ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．２００３；８２（１）：２３－８）。重要なことに、ｍＡｂ１０４は正常な心臓組織で膜または細胞質の結合を示さなかったので、抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブで見られるようにｍＡｂ１０４による治療が心臓毒性を引き起こす可能性は低いと我々は考えている。
５）腎臓組織
正常な腎組織では、ｍＡｂ１０４は調べた２３検体中４検体（１７％）の集合管で弱く（１＋）染色された。ウサギモノクローナル４Ｂ５抗体を使用すると、５０％を超える試料（２３試料中１２試料）がＨＥＲ２タンパク質（２＋／３＋）を過剰発現した。染色は集合管及び遠位ネフロンに限定され、他の研究（Ｗａｎｇ Ｈ，Ｌｉｕ Ｃ，Ｈａｎ Ｊ，Ｚｈｅｎ Ｌ，Ｚｈａｎｇ Ｔ，Ｈｅ Ｘ，ｅｔ ａｌ．ＨＥＲ２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｓ ｒａｒｅ ａｎｄ ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｒｅｎａｌ ｔｉｓｓｕｅ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ｌｅｔｔｅｒｓ．２０１２；４（２）：１９４－８；Ｌａｔｉｆ Ｚ，Ｗａｔｔｅｒｓ Ａ，Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｊ，Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ Ｍ，Ａｉｔｃｈｉｓｏｎ Ｍ．Ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＨＥＲ２ ｉｎ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．ＢＪＵ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．２００２；８９（１）：５－９）と一致していた。
６）肝臓
我々の分析では、ｍＡｂ１０４及び４Ｂ５によるＨＥＲ２染色について調べた１３の試料すべてが陰性だった。同様の知見はＬｉｕ ｅｔ ａｌ．（Ｌｉｕ Ｊ，Ａｈｉｅｋｐｏｒ Ａ，Ｌｉ Ｌ，Ｌｉ Ｘ，Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ Ｐ，Ｋｅｗ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＥｒｂＢ－２ ｉｎ ｌｉｖｅｒ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ× ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ ｓｈｏｒｔｅｒ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ．２００９；１２５（８）：１８９４－９０１）によって報告されたが、彼らは正常なヒト肝臓ではＨＥＲ２染色はわずかである、またはないことを報告した。
７）肺
評価された正常な肺組織の１３の試料はすべて、ｍＡｂ１０４及び４Ｂ５によってＨＥＲ２を染色しなかったが、以前に公開されたデータ（Ｔａｋｅｎａｋａ Ｍ，Ｈａｎａｇｉｒｉ Ｔ，Ｓｈｉｎｏｈａｒａ Ｓ，Ｋｕｗａｔａ Ｔ，Ｃｈｉｋａｉｓｈｉ Ｙ，Ｏｋａ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ＨＥＲ２ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１１；３１（１２）：４６３１－６．）と一致している。
８）胃
正常な胃粘膜におけるＨＥＲ２発現を調べた研究はほとんどない。我々の手の内では、４Ｂ５は８１％の頻度で分泌上皮の中程度から強い（２＋／３＋）細胞質及び膜のＨＥＲ２染色を示す。逆に、１０４抗体を使用した我々の知見は、胃（頭頂）腺の弱い細胞質染色を示しており、それはＴｏＧＡスコア化基準を使用すると０％の頻度に変換される。
９）膀胱
正常な尿路上皮組織では、ｍＡｂ１０４及びｍＡｂ４Ｂ５は、評価された１１の試料すべてでＨＥＲ２発現を検出しなかった。双方の抗体で非特異的な弱い（１＋）染色が細胞質に見られた。Ｈａｍｍａｍらによる研究（Ｈａｍｍａｍ Ｏ，Ｎｏｕｒ ＨＨ，Ｍｏｓａａｄ Ｍ，Ａｋｌ Ｍ，Ｋｈａｌｉｌ Ｈ，ａｌ Ｇａｎｚｏｒｙ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ＨＥＲ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ／ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｕｒｉｎａｒｙ ｂｌａｄｄｅｒ ｌｅｓｉｏｎ．Ａｒａｂ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｕｒｏｌｏｇｙ．２０１５；１３（２）：１４６－５２）では、ＨＥＲ２タンパク質は正常な尿路上皮組織または炎症性膀胱病変では発現されていなかった。
１０）頭頸部
正常な口腔咽頭組織の１０の試料がｍＡｂ１０４で染色され；非特異的染色（１＋）は８の試料（８０％）で観察され、主に筋肉と膜で見られた。ある研究では、正常な口腔上皮におけるＨＥＲ２の発現を評価し、試料はすべて、膜及び細胞質のＨＥＲ２について陽性に染色され、細胞質染色は正常上皮における基底層及び傍基底層に限定されていた（Ｐａｒｄｉｓ Ｓ，Ｓａｒｄａｒｉ Ｙ，Ａｓｈｒａｆ ＭＪ，Ｔａｄｂｉｒ ＡＡ，Ｅｂｒａｈｉｍｉ Ｈ，Ｐｕｒｓｈａｈｉｄｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓａｌｉｖａｒｙ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＨＥＲ２／ｎｅｕ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｉｒａｎｉａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ．２０１２；２４（６９）：１６１）。
Figure 2022529232000022
腫瘍組織
腫瘍組織では、本発明者らは、調べた一連の腫瘍組織にわたって、ｍＡｂ１０４結合とＨＥＲ２結合との間の高い一致を示している。重要なことに、ｍＡｂ１０４及び対照抗体はＨＥＲ２陽性の浸潤性乳管癌及び胃癌で同様の結合を有した。２つの抗体の主な差異は、一部の腫瘍組織におけるｍＡｂ１０４で見られる細胞質染色の頻度の増加である（データは示さず）。
１．乳房腫瘍
１０の浸潤性乳管癌検体をＨＥＲ２染色について評価し、ｍＡｂ１０４の染色パターンと比較した。４Ｂ５抗体を使用すると、２つの試料（２０％）がＨＥＲ２陽性（すなわち３＋）であることが分かった。これらの試料では、ｍＡｂ１０４は１つの試料で陽性染色（ＩＨＣ ３＋）を示し、もう１つの試料は腫瘍を介したかすかな不完全な膜染色（１＋）を示した。２つの試料は、双方の抗体で染色すると曖昧な染色（２＋）を示し、ＦＩＳＨによるさらなる評価は非増幅を示した。残りの６つの試料は双方の抗体について陰性だった。どちらの抗体でも細胞質染色は見られなかった。これらの結果は、２つの抗体間の高い一致率を示しており、ｍＡｂ１０４で偽陽性の結果は実証されていない。
２．胃／ＧＯＪ腫瘍
本発明者らは、胃／胃食道腫瘍検体におけるｍＡｂ１０４結合を評価し、それを対照抗体４Ｂ５の染色パターンと比較した。以前の研究と一致して、我々は腸型胃癌にて優勢に過剰発現している膜性ＨＥＲ２を観察した一方で、びまん型胃癌では、ＨＥＲ２の発現は主として細胞質染色で見られた（Ｊｉｎｄａｌ Ｙ，Ｖａｒｍａ Ｋ，Ｍｉｓｒａ Ｖ，Ｋｕｍａｒ Ｒ，Ｓｉｎｇｈ Ａ，Ｍｉｓｒａ ＳＰｌ．Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＨＥＲ２ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ：ａｎ ｕｎｕｓｕａｌ ｆｉｎｄｉｎｇ．ＩＪＭＲＰＳ．２０１６，３（８）：６７－７７）。合計で、腸組織学の５１の胃腫瘍試料が評価され；４Ｂ５抗体では２％未満であったことと比べて、試料のほぼ２７％がｍＡｂ１０４による弱い細胞質染色を有した。ｍＡｂ１０４による陽性の膜染色が２つの試料（約４％）で見られ、それぞれ２＋及び３＋のスコアだった。同様に、４Ｂ５による陽性の膜染色が３つの腫瘍（約６％）で見られ、２つの試料が強い３＋染色を示し、１つの試料は２＋と評価された。弱い膜染色（すなわち、１＋）が症例のほぼ１４％で見られたが、これらは上記で概略を述べたスコア化基準に従って陰性として報告されている。これらの知見は、ＩＨＣ３＋／ＦＩＳＨ陰性腫瘍の患者で２～３％の陽性率を報告したＴＯＧＡ試験（Ｂａｎｇ Ｙ－Ｊ，Ｖａｎ Ｃｕｔｓｅｍ Ｅ，Ｆｅｙｅｒｅｉｓｌｏｖａ Ａ，Ｃｈｕｎｇ ＨＣ，Ｓｈｅｎ Ｌ，Ｓａｗａｋｉ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｒｓｕｓ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｌｏｎｅ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ＨＥＲ２－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｄｖａｎｃｅｄ ｇａｓｔｒｉｃ ｏｒ ｇａｓｔｒｏ－ｏｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｃａｎｃｅｒ（ＴｏＧＡ）：ａ ｐｈａｓｅ ３，ｏｐｅｎ－ｌａｂｅｌ， ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ． Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ．２０１０；３７６（９７４２）：６８７－９７）と一致している。ＧＯＪ腫瘍の合計２３の患者試料も、ｍＡｂ１０４及び４Ｂ５で観察された同様の膜結合パターンで染色されたが、ｍＡｂ１０４はさらに高い細胞質染色を示した。膜染色が弱かった（すなわち、１＋）ので、膜染色と細胞質染色の双方が陰性として報告された。文献で報告されている胃癌／ＧＥＪ癌におけるＨＥＲ２過剰発現の変動性は、いくつかの研究での膜染色と同様に細胞質染色の報告によって説明されてもよい。
３．結腸直腸
評価された原発性結腸直腸腫瘍の２５症例のうち、１５症例（６０％）は中程度に分化し、４症例（１６％）は中程度から不十分に分化し、６症例（２４％）は不十分に分化していた。ｍＡｂ１０４は、膜結合が見られなかったほぼ４０％の症例で弱く拡散した細胞質染色を示した。対照的に、４Ｂ５による腫瘍の限局性領域への弱い（１＋）膜染色は症例の約１５％で見られ、最小限の細胞質染色が観察された。ＨＥＲ２の細胞質局在は、膜性と比べて結腸直腸癌でさらに頻繁に発生し、症例の最大６３％で報告されている（Ｓｅｏ ＡＮ，Ｋｗａｋ Ｙ，Ｋｉｍ Ｄ－Ｗ，Ｋａｎｇ Ｓ－Ｂ，Ｃｈｏｅ Ｇ，Ｋｉｍ ＷＨ，ｅｔ ａｌ．ＨＥＲ２ ｓｔａｔｕｓ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ：ｉｔｓ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ＨＥＲ２ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ．２０１４；９（５）：ｅ９８５２８，Ｂｌｏｋ ＥＪ，Ｋｕｐｐｅｎ ＰＪ，ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎ ＪＥ，Ｓｉｅｒ ＣＦ．Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＨＥＲ２： ａ ｋｅｙ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２０１３；７：４１）。
４．膀胱
移行上皮癌の７症例を調べたが、そのうち４症例は高悪性度であった。ｍＡｂ１０４と４Ｂ５の双方が同様の結合パターンを示した；１＋のスコアの領域とは別の２＋のスコアの領域を特徴とする不均一な染色が双方の抗体で観察された。不完全な膜染色が３症例で観察され、残りの３症例はＨＥＲ２染色が陰性だった。非特異的な細胞質染色は症例のうち３症例にてｍＡｂ１０４で観察された。一部の著者は２＋及び３＋のスコアを陽性と見なし、他の著者は３＋のスコアのみを陽性と見なしているので、ＨＥＲ２発現の報告には矛盾がある。さらに、腫瘍内の不均一性が症例の３５％で報告されており、同一検体内で見られる不均一な染色パターンを説明し得る（Ｌａｅ Ｍ，Ｃｏｕｔｕｒｉｅｒ Ｊ，Ｏｕｄａｒｄ Ｓ，Ｒａｄｖａｎｙｉ Ｆ，Ｂｅｕｚｅｂｏｃ Ｐ，Ｖｉｅｉｌｌｅｆｏｎｄ Ａ．Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ＨＥＲ２ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ ｗｉｔｈ ａ ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ：ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ １００５ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２００９；２１（４）：８１５－９）。
５．肺
評価された３２のＮＳＣＬＣ症例のうち、１３（４０％）は腺癌であり、１９（６０％）は扁平上皮癌（ＳＣＣ）だった。ＳＣＣ症例では、気管支上皮のかすかな細胞質染色及び中程度の染色（１＋）がｍＡｂ１０４で見られ；４Ｂ５は膜結合を伴わずにさらに高い強度の細胞質染色を示した。腺癌では、双方の抗体は細胞質染色が弱い不完全な膜結合（１＋）を示した。ＨＥＲ２細胞質染色は、症例の最大１１％で報告されており、一部の報告では、患者の組織と細胞株の双方で、膜よりも頻繁に観察されている（Ｃｈｅｎｇ Ｃ－Ｍ，Ｔｓｕｎｅｙａｍａ Ｋ，Ｍａｔｓｕｉ Ｋ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｈ，Ｉｓｈｉｚａｗａ Ｓ，Ｔａｋａｎｏ Ｙ．Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃ－ｅｒｂＢ２ ｉｎ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒｓ．Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈｉｖ．２００５；４４６（６）：５９６－６０３）。
６．脳及び頭頸部
多形性膠芽腫の１０症例すべて及びＨＮＳＣＣの２８症例では、ｍＡｂ１０４及び４Ｂ５の染色は陰性だった。
７．腎細胞癌
２４の腫瘍を評価し、そのうち２３は明細胞型であり、１つは限局性肉腫増殖を伴う混合組織型を有した；７（２９％）は悪性度３であり；１１（４６％）は悪性度２であり、及び６（２５％）は悪性度１だった。ｍＡｂ１０４による染色は観察されなかった。４Ｂ５で染色した場合、１つの試料の細胞の５％未満で弱い膜染色が観察された。双方の抗体で非特異的な弱い細胞質染色が見られた。
８．肝臓
評価された１４の肝細胞腫瘍のうち、ｍＡｂ１０４及び４Ｂ５は膜染色を示さなかったが、双方の抗体で弱い細胞質染色が見られた。ｍＡｂ１０４による細胞質染色は４Ｂ５よりも拡散していた。
Figure 2022529232000023
実施例２３：ｍＡｂ１０４結合のＬｉｎｄｍｏ分析及びＳｃａｔｃｈａｒｄ分析
放射性標識した抗ＨＥＲ２抗体のＥｒｂＢ２過剰発現ＮＣＩ－Ｎ８７細胞との免疫反応性画分は、以前に記載されたように（Ｌｅｅ ＦＴ．ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１：４４７４－４４８２）Ｌｉｎｄｍｏアッセイ（Ｌｉｎｄｍｏ ｅｔ ａｌ．（１９８４），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，７２：７７－８９）を使用して無限抗原過剰での結合への線形外挿によって決定した。この抗体－抗原システムについては、２億個の細胞が抗原過剰の条件下での結合アッセイに使用された。Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析を使用して、見かけの会合定数（Ｋａ）及び細胞あたりの結合した抗体分子の数を算出した（Ｌｉｎｄｍｏ ｅｔ ａｌ．上記）。Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析は、８９Ｚｒ－ハーセプチンがＫａ＝２．９３×１０８Ｍ－１を有し、細胞あたり約２００倍以上（９１３，９９０）の結合部位に結合する一方で、８９Ｚｒ－ｍＡｂ１０４は４．０×１０８Ｍ－１の見かけのＫａを有し、結合能は細胞あたりで結合された約４，２０３抗体であることを示した（図３２及び３３）。
実施例２４：担がんヌードマウスにおけるｍＡｂ１０４の生体内分布
ＨＥＲ２を過剰発現するＮＣＩ－Ｎ８７異種移植片を担うヌードマウスにてｍＡｂ１０４及びアイソタイプ対照抗体の生体内分布を比較した。結果を図３４に提示する。８９Ｚｒ標識したｍＡｂ１０４は９日間の試験にわたって高い特異的腫瘍取り込みを示し、正常組織は放射性標識したインタクトな抗体に特有のクリアランスパターンを示した。対照的に、アイソタイプ対照腫瘍では腫瘍取り込みは観察されなかった。
療法試験で観察されたｍＡｂ１０４の高い特異的取り込み及び抗腫瘍効果は、例えば、ＦＡＣＳまたはＳｃａｔｃｈａｒｄ分析のような任意の単一時点で、ｍＡｂ１０４ががん細胞表面のＨＥＲ２の亜集団に結合するが、生体内でのエピトープ利用能は、強力ながん特異的標的指向化を可能にし、且つ正常組織に結合し、臨床現場で関連する毒性を有する他のＨＥＲ２抗体よりもはるかに高い治療可能比を提案することを示している。

Claims (20)

  1. 抗原結合ドメインを含むＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２結合タンパク質であって、前記抗原結合ドメインは、図１（配列番号２７）に係る成熟した正常型または野生型のヒトＨＥＲ２配列の残基２９３～３０９を含み、且つＨＥＲ２の増幅または活性化に応答してそのエピトープが露出されるＨＥＲ２のドメインＩＩ内のエピトープに特異的に結合し、前記エピトープは腫瘍形成性細胞、過剰増殖性細胞、または異常な細胞で発現されるが、正常細胞または野生型細胞では発現されない、前記ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２結合タンパク質。
  2. 前記エピトープがアミノ酸配列ＣＰＬＨＮＱＥＶＴＡＥＤＧＴＱＲＣ（配列番号１）を含む、請求項１に記載のＨＥＲ２結合タンパク質。
  3. 前記ＨＥＲ２結合タンパク質が、
    （ｉ）ｍＡｂ１０４の重鎖可変領域配列（配列番号２）に対して少なくとも５５％の同一性を有する重鎖可変領域配列（ＶＨ）；及び／または
    （ｉｉ）ｍＡｂ１０４の軽鎖可変領域配列（配列番号３）に対して少なくとも５０％の同一性を有する軽鎖可変領域配列（ＶＬ）を含む抗体またはその抗原結合断片である、請求項１または２に記載のＨＥＲ２結合タンパク質。
  4. 前記結合タンパク質が、
    （ｉ）以下のように示される配列を有するＶＨ ＣＤＲ１：
    Figure 2022529232000024
     配列中、Ｘ７は、ＳまたはＴであり；Ｘ８はＧまたはＤであり；Ｘ９はＦまたはＧであり；Ｘ１０はＨまたはＮである；
    （ｉｉ）以下のように示される配列を有するＶＨ ＣＤＲ２：
    Figure 2022529232000025
     配列中、Ｘ１９はＲまたはＷであり；Ｘ２０はＰまたはＴであり；Ｘ２１はＮまたはＴであり；Ｘ２２はＤまたはＫであり；Ｘ２３はＩまたはＰであり；Ｘ２４はＲまたはＴであり；Ｘ２５はＮまたはＤであり；Ｘ２６はＱまたはＤであり；Ｘ２７はＮまたはＤであり；Ｘ２８はＤまたはＧである；
    （ｉｉｉ）以下のように示される配列を有するＶＨ ＣＤＲ３：
    Figure 2022529232000026
     配列中、Ｘ５０は存在しない、またはＲであり；Ｘ５１は存在しない、またはＦであり；Ｘ５２は存在しない、またはＬであり；Ｘ５３は存在しない、またはＮであり；Ｘ５４は存在しない、またはＴであり；Ｘ５５は存在しない、またはＶであり；Ｘ５６は存在しない、またはＡであり；Ｘ５７は存在しない、またはＧであり；Ｘ５８は存在しない、またはＲであり；Ｘ５９は存在しない、またはＳであり；Ｘ６０はＬまたはＶであり；Ｘ６１はＮまたはＹであり；Ｘ６２はＡまたはＤである；
    及び／または、
    （ｉｖ）以下のように示される配列を有するＶＬ ＣＤＲ１：
    Figure 2022529232000027
     配列中、Ｘ１４はＫまたはＳであり；Ｘ１５はＳまたはＶであり；Ｘ１６はＱまたはＳであり；Ｘ１７はＬまたは存在しない；Ｘ１８はＬまたは存在しない；Ｘ１９はＤまたは存在しない；Ｘ２０はＳまたは存在しない；Ｘ２１はＤまたは存在しない；Ｘ２２はＧまたは存在しない；Ｘ２３はＫまたはＶであり；Ｘ２４はＴまたはＧであり；Ｘ２５はＦまたはＳであり；Ｘ２６はＬまたはＭであり；Ｘ２７はＮまたはＹである；
    （ｖ）以下のように示される配列を有するＶＬ ＣＤＲ２：
    Figure 2022529232000028
     Ｘ３５はＤまたはＥであり；Ｘ３６はＫまたはＴであり；Ｘ３７はＳまたはＡである；
    （ｖｉ）以下のように示される配列を有するＶＬ ＣＤＲ３：
    Figure 2022529232000029
     配列中、Ｘ４９はＷまたはＱであり；Ｘ５０はＧまたはＷであり；Ｘ５１はＴまたはＳであり；Ｘ５２はＨまたはＳであり；Ｘ５３はＦまたはＮであり；Ｘ５４はＷまたはＰである；を含む、先行請求項のいずれかに記載のＨＲＥ２結合タンパク質。
  5. 前記結合タンパク質が、
    Figure 2022529232000030
     （配列中、
    Ｘ１はＥまたはＱであり；Ｘ２はＶまたはＩであり；Ｘ３はＱまたはＶであり；Ｘ４はＶまたはＫであり；Ｘ５はＡまたはＥであり；Ｘ６はＳまたはＴであり；Ｘ７はＳまたはＴであり；Ｘ８はＧまたはＤであり；Ｘ９はＦまたはＧであり；Ｘ１０はＨまたはＮであり；Ｘ１１はＲまたはＫであり；Ｘ１２はＳまたはＡであり；Ｘ１３はＨまたはＰであり；Ｘ１４はＶまたはＧであり；Ｘ１５はＲまたはＫであり；Ｘ１６はＳまたはＧであり；Ｘ１７はＥまたはＫであり；Ｘ１８はＩまたはＭであり；Ｘ１９はＲまたはＷであり；Ｘ２０はＰまたはＴであり；Ｘ２１はＮまたはＴであり；Ｘ２２はＤまたはＫであり；Ｘ２３はＩまたはＰであり；Ｘ２４はＲまたはＴであり；Ｘ２５はＮまたはＤであり；Ｘ２６はＱまたはＤであり；Ｘ２７はＮまたはＤであり；Ｘ２８はＤまたはＧであり；Ｘ２９はＫまたはＲであり；Ｘ３０はＡまたはＦであり；Ｘ３１はＳまたはＡであり；Ｘ３２はＬまたはＦであり；Ｘ３３はＴまたはＳであり；Ｘ３４はＶまたはＬであり；Ｘ３５はＤまたはＥであり；Ｘ３６はＫまたはＴであり；Ｘ３７はＳまたはＡであり；Ｘ３８はＭまたはＬであり；Ｘ３９はＥまたはＱであり；Ｘ４０はＬまたはＩであり；Ｘ４１はＨまたはＮであり；Ｘ４２はＲまたはＮであり；Ｘ４３はＴまたはＫであり；Ｘ４４はＳまたはＮであり；Ｘ４５はＳまたはＭであり；Ｘ４６はＶまたはＴであり；Ｘ４７はＦまたはＹであり；Ｘ４８はＹまたはＦであり；Ｘ４９はＳまたはＲであり；Ｘ５０は存在しない、またはＲであり；Ｘ５１は存在しない、またはＦであり；Ｘ５２は存在しない、またはＬであり；Ｘ５３は存在しない、またはＮであり；Ｘ５４は存在しない、またはＴであり；Ｘ５５は存在しない、またはＶであり；Ｘ５６は存在しない、またはＡであり；Ｘ５７は存在しない、またはＧであり；Ｘ５８は存在しなまたはＲであり；Ｘ５９は存在しない、またはＳであり；Ｘ６０はＬまたはＶであり；Ｘ６１はＮまたはＹであり；Ｘ６２はＡまたはＤであり；Ｘ６３はＰまたはＴであり；Ｘ６４はＶまたはＬであり；Ｘ６５はＡまたはＳである）に示されている重鎖可変領域配列（ＶＨ）；
    及び／または、
    Figure 2022529232000031
     （配列中、
    Ｘ１はＤまたはＱであり；Ｘ２はＩまたはＬであり；Ｘ３はＬまたはＡであり；Ｘ４はＴまたはＬであり；Ｘ５はＬまたはＭであり；Ｘ６はＴまたはＳであり；Ｘ７はＦまたはＰであり；Ｘ８はＱまたはＥであり；Ｘ９はＰまたはＫであり；Ｘ１０はＡまたはＶであり；Ｘ１１はＳまたはＴであり；Ｘ１２はＩまたはＭであり；Ｘ１３はＳまたはＴであり；Ｘ１４はＫまたはＳであり；Ｘ１５はＳまたはＶであり；Ｘ１６はＱまたはＳであり；Ｘ１７はＬまたは存在しない；Ｘ１８はＬまたは存在しない；Ｘ１９はＤまたは存在しない；Ｘ２０はＳまたは存在しない；Ｘ２１はＤまたは存在しない；Ｘ２２はＧまたは存在しない；Ｘ２３はＫまたはＶであり；Ｘ２４はＴまたはＧであり；Ｘ２５はＦまたはＳであり；Ｘ２６はＬまたはＭであり；Ｘ２７はＮまたはＹであり；Ｘ２８はＬまたはＹであり；Ｘ２９はＬまたはＱであり；Ｘ３０はＲまたはＫであり；Ｘ３１はＧまたはＲであり；Ｘ３２はＱまたはＳであり；Ｘ３３はＲまたはＰであり；Ｘ３４はＬまたはＷであり；Ｘ３５はＶまたはＴであり；Ｘ３６はＫまたはＮであり；Ｘ３７はＤまたはＡであり；Ｘ３８はＤまたはＰであり；Ｘ３９はＴまたはＳであり；Ｘ４０はＤまたはＳであり；Ｘ４１はＦまたはＹであり；Ｘ４２はＴまたはＳであり；Ｘ４３はＫまたはＴであり；Ｘ４４はＲまたはＳであり；Ｘ４５はＶまたはＭであり；Ｘ４６はＬまたはＡであり；Ｘ４７はＧまたはＡであり；Ｘ４８はＶまたはＴであり；Ｘ４９はＷまたはＱであり；Ｘ５０はＧまたはＷであり；Ｘ５１はＴまたはＳであり；Ｘ５２はＨまたはＳであり；Ｘ５３はＦまたはＮであり；Ｘ５４はＷまたはＰであり；Ｘ５５はＧまたはＡであり；Ｘ５６はＩまたはＬである）に示されている軽鎖可変領域配列（ＶＬ）を含む、先行請求項のいずれかに記載のＨＥＲ２結合タンパク質。
  6. 前記ＶＨが
    （ｉ）ＧＹＳＦＴＧＹＦＭＨ（配列番号１４）またはＧＹＴＦＴＤＹＧＭＮ（配列番号１５）から選択されるＣＤＲ１配列；と
    （ｉｉ）ＲＩＮＰＹＮＧＤＩＲＹＮＱＮＦＫＤ（配列番号１６）またはＷＩＮＴＹＴＧＫＰＴＹＤＤＤＦＫＧ（配列番号１７）から選択されるＣＤＲ２配列；と
    （ｉｉｉ）ＬＮＦＡＹ（配列番号１８）またはＲＦＬＮＴＶＡＧＲＳＶＹＦＤＹ（配列番号１９）から選択されるＣＤＲ３；とを含み、且つ
    前記ＶＬが
    （ｉｖ）ＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＦＬＮ（配列番号２０）またはＳＶＳＳＳＶＧＳＭＹ（配列番号２１）から選択されるＣＤＲ１；と
    （ｖ）ＬＶＳＫＬＤＳ（配列番号２２）またはＬＴＳＮＬＡＳ（配列番号２３）から選択されるＣＤＲ２配列；と
    （ｖｉ）ＷＱＧＴＨＦＰＷＴ（配列番号２４）またはＱＱＷＳＳＮＰＰＴ（配列番号２５）から選択されるＣＤＲ３；とを含む、先行請求項のいずれかに記載のＨＥＲ２結合タンパク質。
  7. 前記ＨＥＲ２結合タンパク質が、
    それぞれ、
    （ｉ）配列番号１４、配列番号１６及び配列番号１８；または
    （ｉｉ）配列番号１５、配列番号１７、及び配列番号１９を含む、またはそれらから成るＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を有する重鎖可変領域配列（ＶＨ）；
    及び／または、
    それぞれ、
    （ｉ）配列番号２０、配列番号２２及び配列番号２４；または
    （ｉｉ）配列番号２１、配列番号２３及び配列番号２５を含む、またはそれらから成るＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列を有する軽鎖可変領域配列（ＶＬ）を含む、先行請求項のいずれかに記載のＨＥＲ２結合タンパク質。
  8. 前記ＨＥＲ２結合タンパク質が、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、ならびに配列番号２０、配列番号２２及び配列番号２４を含む配列を有するＣＤＲを含む、先行請求項のいずれかに記載のＨＥＲ２結合タンパク質。
  9. 前記ＨＥＲ２結合タンパク質が、配列番号１５、配列番号１７及び配列番号１９、ならびに配列番号２１、配列番号２３及び配列番号２５を含む配列を有するＣＤＲを含む、先行請求項のいずれかに記載のＨＥＲ２結合タンパク質。
  10. 前記ＨＥＲ２結合タンパク質が、配列番号２に示す配列と少なくとも５５％同一である配列を含むＶＨ、及び／または配列番号３に示す配列と少なくとも５０％同一である配列を含むＶＬまたはそのヒト化型、キメラ型もしくは脱免疫化型を含む、先行請求項のいずれかに記載のＨＥＲ２結合タンパク質。
  11. 前記ＨＥＲ２結合タンパク質が、配列番号４に示す配列と少なくとも５５％同一である配列を含むＶＨ、及び／または配列番号５に示す配列と少なくとも５０％同一である配列を含むＶＬまたはそのヒト化型、キメラ型もしくは脱免疫化型を含む、先行請求項のいずれかに記載のＨＥＲ２結合タンパク質。
  12. 前記ＨＥＲ２結合タンパク質が、
    （ｉ）配列番号２に示されるＶＨ及び配列番号３に示されるＶＬ；または
    （ｉｉ）配列番号４に示されるＶＨ及び配列番号５に示されるＶＬを含む、先行請求項のいずれかに記載のＨＥＲ２結合タンパク質。
  13. 前記抗原結合断片が、
    （ｉ）単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）；
    （ｉｉ）二量体ｓｃＦｖ（ｄｉ－ｓｃＦｖ）；
    （ｉｉｉ）重鎖定常領域またはＦｃまたは重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／またはＣＨ３に連結された（ｉ）及び／または（ｉｉ）のうちの少なくとも１つ；または
    （ｉｖ）抗体の半減期を延長するタンパク質に連結された（ｉ）及び／または（ｉｉ）の少なくとも１つである、請求項３～１２のいずれか１項に記載のＨＥＲ２結合タンパク質。
  14. 前記抗原結合断片が、
    （ｉ）ダイアボディ；
    （ｉｉ）トリアボディ；
    （ｉｉｉ）テトラボディ；
    （ｉｖ）Ｆａｂ；
    （ｖ）Ｆ（ａｂ’）２；
    （ｖｉ）Ｆｖ；または
    （ｖｉｉ）重鎖定常領域またはＦｃまたは重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／またはＣＨ３に連結された（ｉ）～（ｖｉ）のうちの少なくとも１つ；または
    （ｖｉｉｉ）抗体の半減期を延長するタンパク質に連結された（ｉ）～（ｖｉ）の少なくとも１つである、先行請求項のいずれかに記載のＨＥＲ２結合タンパク質。
  15. 検出可能な部分または機能的な部分と複合体化される、先行請求項のいずれかに記載のＨＥＲ２結合タンパク質。
  16. 薬物と複合体化される、請求項１～１４のいずれか１項に記載のＨＥＲ２結合タンパク質。
  17. （ｉ）請求項１～１４のいずれか１項に記載のＨＥＲ２結合タンパク質と、（ｉｉ）抗ＨＥＲ２抗体、化学療法剤、放射性免疫療法剤もしくは免疫療法剤またはそれらの組み合わせとを含む併用組成物。
  18. 請求項１～１６のいずれか１項に記載のＨＥＲ２結合タンパク質と好適な担体とを含む、組成物。
  19. 対象にてＨＥＲ２を発現しているがんを治療する方法であって、それを必要とする対象に請求項１～１６のいずれか１項に記載のＨＥＲ２結合タンパク質、または請求項１７に記載の併用、または請求項１８に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
  20. 生体試料にてＨＥＲ２を検出する方法であって、前記方法が請求項１～１６のいずれか１項に記載のＨＥＲ２結合タンパク質またはＨＥＲ２結合抗体に試料を接触させることと、複合体を検出することとを含み、前記複合体を検出することが前記試料におけるＨＥＲ２発現を示す、前記方法。
JP2021559509A 2019-03-22 2020-03-20 抗ｈｅｒ２結合分子 Pending JP2022529232A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2019900973 2019-03-22
AU2019900973A AU2019900973A0 (en) 2019-03-22 Anti HER2 binding molecules
PCT/AU2020/050274 WO2020191434A1 (en) 2019-03-22 2020-03-20 Anti-her2 binding molecules

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2022529232A true JP2022529232A (ja) 2022-06-20

Family

ID=72608374

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021559509A Pending JP2022529232A (ja) 2019-03-22 2020-03-20 抗ｈｅｒ２結合分子

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20220169747A1 (ja)
EP (1) EP3941947A4 (ja)
JP (1) JP2022529232A (ja)
CN (1) CN113993902A (ja)
AU (1) AU2020247828A1 (ja)
CA (1) CA3134363A1 (ja)
WO (1) WO2020191434A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2024515919A (ja) * 2022-04-08 2024-04-11 フェイト セラピューティクス，インコーポレイティド 腫瘍標的化のためのキメラ抗原受容体

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR9712410A (pt) * 1996-10-18 1999-10-19 Genentech Inc Anticorpo isolado, composição, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, método para fazer um anticorpo anti-erbb2, método para a determinação da presença de erbb2, kit, método paa a indução da morte celular e artigo manufaturado
US20100056762A1 (en) * 2001-05-11 2010-03-04 Old Lloyd J Specific binding proteins and uses thereof
US7767792B2 (en) * 2004-02-20 2010-08-03 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Antibodies to EGF receptor epitope peptides
CA2612394C (en) * 2005-06-15 2017-02-21 The Ohio State University Research Foundation Her-2 peptides
WO2008033495A2 (en) * 2006-09-15 2008-03-20 Life Science Pharmaceuticals Method for detecting and treating skin disorders
WO2009023266A1 (en) * 2007-08-14 2009-02-19 Ludwig Institute For Cancer Research Generation of antibodies to cell-surface receptors and cancer-associated proteins including egfr family members
JP5532486B2 (ja) * 2007-08-14 2014-06-25 ルードヴィッヒ インスティテュート フォー キャンサー リサーチ Ｅｇｆ受容体を標的とするモノクローナル抗体１７５ならびにその誘導体および用途
CN102884084B (zh) * 2010-03-04 2016-12-07 西福根有限公司 抗her2抗体及组合物
US10221230B2 (en) * 2013-02-25 2019-03-05 Ohio State Innovation Foundation HER-1, HER-3 and IGF-1R compositions and uses thereof
AU2014348552A1 (en) * 2013-11-13 2016-06-02 Zymeworks Inc. Monovalent antigen binding constructs targeting EGFR and/or HER2 and uses thereof
JP6817064B2 (ja) * 2013-11-27 2021-01-20 ザイムワークス，インコーポレイテッド Ｈｅｒ２を標的とする二重特異性抗原結合性コンストラクト
JP2017512765A (ja) * 2014-04-11 2017-05-25 メディミューン，エルエルシー 二重特異性ｈｅｒ２抗体
CN105985435B (zh) * 2015-01-30 2019-10-15 嘉和生物药业有限公司 全人源her2抗体的突变抗体及其编码基因和应用
EP3241847A1 (en) * 2016-05-06 2017-11-08 MAB Discovery GmbH Her-2 binding antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
EP3941947A1 (en) 2022-01-26
CA3134363A1 (en) 2020-10-01
WO2020191434A1 (en) 2020-10-01
EP3941947A4 (en) 2022-12-14
CN113993902A (zh) 2022-01-28
AU2020247828A1 (en) 2021-11-18
US20220169747A1 (en) 2022-06-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA3027417C (en) Anti-human trop-2 antibody having an antitumor activity in vivo
JP2021008487A (ja) 抗ｎｋｇ２ａ抗体を使用した治療計画
KR102453227B1 (ko) 항-axl 길항성 항체
KR102048718B1 (ko) 항-cxcr4 항체 및 항체-약물 접합체
CN108341873B (zh) 表皮生长因子受体3(her3)的抗体
AU2011255870B2 (en) Anti-human TROP-2 antibody having antitumor activity in vivo
CA2741127C (en) Fibroblast growth factor receptor-3 (fgfr-3) inhibitors and methods of treatment
US9169329B2 (en) Antibodies directed to the receptor tyrosine kinase c-Met
JP2021517888A (ja) 抗クローディン１８．２抗体およびその使用
CN116410316A (zh) 抗cd47抗体及其用途
EP3122775B1 (en) Monoclonal antibodies to growth and differentiation factor 15 (gdf-15), and uses thereof for treating cancer cachexia and cancer
CN109311997B (zh) 抗axl拮抗抗体
ES2469369T3 (es) Anticuerpos anti-CXCR4 humanizados para el tratamiento del cáncer
JP2013507378A (ja) 抗ｈｅｒ３抗体の製造、特徴づけ及びその用途
KR20140113912A (ko) Her3에 특이적인 결합 분자 및 이의 용도
JP2015501639A (ja) 抗ｃｄ９８抗体およびその使用方法
US20210246223A1 (en) ANTI-HER3 Antibody and uses thereof
CN114040926A (zh) 结合cd123的多肽及其用途
JP2023540526A (ja) ネクチン－４抗体およびそれの使用
JP2014504850A (ja) 抗ｈｅｒ３抗体の製造、特徴づけ及びその用途
JP2022529232A (ja) 抗ｈｅｒ２結合分子
TWI782000B (zh) 抗ｇｐｒ２０抗體、其製造方法及其應用
CN116940597A (zh) 多特异性抗体及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230317

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20240213

A711 Notification of change in applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711

Effective date: 20240424