ES2613957T3

ES2613957T3 - Anticuerpos contra ERBB2

Info

Publication number: ES2613957T3
Application number: ES07813707.2T
Authority: ES
Inventors: Susan Ann Cartlidge; Jianying Dong; Mark Hickinson; Jaspal Singh Kang; Ian Foltz
Original assignee: MedImmune Ltd
Current assignee: MedImmune Ltd
Priority date: 2006-08-04
Filing date: 2007-08-02
Publication date: 2017-05-29
Anticipated expiration: 2027-08-02
Also published as: JP5638804B2; US20130089544A1; EP2511301A2; BRPI0714728A2; EP2511301B1; AU2007281774A1; HUE038454T2; ZA200900753B; WO2008019290A3; MX2009001291A; KR20090058512A; EP2511301A3; JP2009545325A; LT2511301T; US8858942B2; ES2661952T3; US20100158926A1; RU2009107494A; CA2659631A1; PL2511301T3

Abstract

Un anticuerpo humano, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une específicamente a ErbB2 humana, e inhibe la fosforilación de ErbB2 inducida por heregulina en células MCF7 con una CE50 inferior a 50 ng/ml, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende las tres secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y las tres secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera, en el que las tres CDRs de cadena pesada y las tres CDRs de cadena ligera están seleccionadas del grupo que consiste en: (i) las tres CDRs de una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 6, y las tres CDRs de una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 8; (ii) las tres CDRs de una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 14, y las tres CDRs de una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 16; (iii) las tres CDRs de una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 18, y las tres CDRs de una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 20; (iv) las tres CDRs de una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 22, y las tres CDRs de una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 24; (v) las tres CDRs de una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 26, y las tres CDRs de una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 28; (vi) las tres CDRs de una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 30, y las tres CDRs de una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 32; o (vii)las tres CDRs de una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 34, y las tres CDRs de una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 36, en el que las CDRs son como se definen por Kabat.

Description

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Los presentes inventores también describen una línea celular aislada que produce el agente de unión dirigido, anticuerpo o porción de unión al antígeno descritos en el presente documento o la cadena pesada o cadena ligera de dicho anticuerpo o dicha porción.

Además, los presentes inventores describen una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada o una porción de unión al antígeno del mismo, la cadena ligera o una porción de unión al antígeno del mismo, o ambas. El ácido nucleico aislado puede incluir una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a): la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1;

(b): la secuencia de nucleótidos que codifica SEQ ID NO:2;

(c): la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3;

(d): la secuencia de nucleótidos que codifica SEQ ID NO:4;

(e): la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:5;

(f): la secuencia de nucleótidos que codifica SEQ ID NO:6;

(g): la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:7;

(h): la secuencia de nucleótidos que codifica SEQ ID NO:8;

(i): la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:9;

(j): la secuencia de nucleótidos que codifica SEQ ID NO:10;

(k): la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:11;

(1): la secuencia de nucleótidos que codifica SEQ ID NO:12;

(m): la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:13;

(n): la secuencia de nucleótidos que codifica SEQ ID NO:14;

(o): la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:15;

(p): la secuencia de nucleótidos que codifica SEQ ID NO:16;

(q): la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:17;

(r): la secuencia de nucleótidos que codifica SEQ ID NO:18;

(s): la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:19;

(t): la secuencia de nucleótidos que codifica SEQ ID NO:20;

(u): la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:21;

(v): la secuencia de nucleótidos que codifica SEQ ID NO:22;

(w): la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:23;

(x): la secuencia de nucleótidos que codifica SEQ ID NO:24;

(y): la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:25;

(z): la secuencia de nucleótidos que codifica SEQ ID NO:26; (aa) la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:27; (bb) la secuencia de nucleótidos que codifica SEQ ID NO:28;

(cc): la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:29; (dd) la secuencia de nucleótidos que codifica SEQ ID NO:30; (ce) la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:31; (ff) la secuencia de nucleótidos que codifica SEQ ID NO:32; (gg) la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:33; (hh) la secuencia de nucleótidos que codifica SEQ ID NO:34;

(ii): la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:35; (jj) la secuencia de nucleótidos que codifica SEQ ID NO:36; (kk) la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:37; (ll) la secuencia de nucleótidos que codifica SEQ ID NO:38; (mm) la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:39; (nn) la secuencia de nucleótidos que codifica SEQ ID NO:40; (oo) la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:41; (pp) la secuencia de nucleótidos que codifica SEQ ID NO:42; (qq) la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:43; y (rr) la secuencia de nucleótidos que codifica SEQ ID NO:44.

Los presentes inventores también describen un vector que comprende la molécula de ácido nucleico descrita en el presente documento, en el que el vector opcionalmente comprende una secuencia de control de la expresión operativamente unida a la molécula de ácido nucleico. También se describe una célula hospedadora que comprende el vector o la molécula de ácido nucleico descritos en el presente documento.

Los presentes inventores desvelan un método de producción del agente de unión dirigido, anticuerpo monoclonal o porción de unión al antígeno descritos en el presente documento, que comprende las etapas de cultivar la célula hospedadora o la línea celular descritas en el presente documento bajo condiciones adecuadas y recuperar dicho anticuerpo o porción de unión al antígeno.

Además, los presentes inventores describen un animal transgénico no humano o planta transgénica que comprende el ácido nucleico descrito en el presente documento, en el que el animal transgénico no humano o planta

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transgénica expresa dicho ácido nucleico. Los presentes inventores también describen un método de aislamiento de un anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a ErbB2 humana. El método incluye la etapa de aislar el anticuerpo del animal transgénico no humano o planta transgénica.

En el presente documento se describe un método de preparación de un anticuerpo monoclonal humano que se une específicamente a ErbB2, que comprende las etapas de:

(i): inmunizar un animal transgénico no humano que es capaz de producir anticuerpos humanos con ErbB2, una porción inmunogénica de ErbB2 en una célula o tejido que expresa ErbB2;

(ii): permitir que el animal transgénico genere una respuesta inmunitaria a ErbB2; y

(iii) recuperar el anticuerpo.

También se describe un método de tratamiento, prevención o alivio de los síntomas de un trastorno mediado por ErbB2 en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende la etapa de administrar a dicho sujeto un agente de unión dirigido, un anticuerpo o porción de unión al antígeno o la composición descrita en el presente documento, en el que dicho agente de unión dirigido, anticuerpo o porción de unión al antígeno inhibe ErbB2.

En otro aspecto más, los presentes inventores describen un método de tratamiento, prevención o alivio de los síntomas de un trastorno mediado por ErbB2 tal como cáncer en un sujeto en necesidad del mismo con un agente de unión dirigido, por ejemplo un anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo, que se une específicamente a ErbB2 que comprende las etapas de:

(i): administrar una cantidad eficaz de una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la cadena pesada o la porción de unión al antígeno del mismo, una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el agente de unión dirigido, por ejemplo la cadena ligera o la porción de unión al antígeno de la misma, o ambos, las moléculas de ácidos nucleicos que codifican la cadena ligera y la cadena pesada o porciones de unión al antígeno de las mismas de un anticuerpo; y,

(ii): expresar la molécula de ácido nucleico.

Un trastorno mediado por ErbB2 puede seleccionarse del grupo que consiste en cáncer de mama, vejiga, pulmón, cabeza, cuello, próstata, estómago, endometrio, glándula salival, pulmón, riñón, colon, tiroides, pancreático y glioblastomas

Los presentes inventores desvelan en el presente documento un método de inhibición de la proliferación de una célula cancerosa que expresa ErbB2 en un sujeto en necesidad del mismo, comprendiendo el método la etapa de administrar a dicho sujeto un agente de unión dirigido, por ejemplo un anticuerpo o porción de unión al antígeno o la composición descrita en el presente documento, en el que dicho agente de unión dirigido inhibe ErbB2.

Un anticuerpo descrito en el presente documento puede ser un anticuerpo monoclonal humanizado, quimérico o humano o porción de unión al antígeno del mismo.

Los presentes inventores describen un método de inhibición de una actividad de ErbB2 en una célula, por ejemplo, de un sujeto o célula cancerosa, que expresa ErbB2, que comprende poner en contacto la célula con un agente de unión dirigido o con la composición descrita en el presente documento, en el que la actividad de ErbB2 en la célula está seleccionada del grupo que consiste en:

(a): fosforilación de ErbB2;

(b): activación de la vía MAPK;

(c): activación de la vía PI3K;

(d): inhibición de CDC2; y

(e): combinaciones de las mismas.

La fosforilación de ErbB2 puede inhibirse 48 horas.

Los presentes inventores describen un método de modulación de una actividad de ErbB2 en una célula que expresa ErbB2, que incluye poner en contacto la célula con un anticuerpo o porción de unión al antígeno o con la composición descrita en el presente documento en el que la actividad de ErbB2 en la célula es activación de la vía p38-TSP-1.

Un sitio de unión al antígeno puede comprender una CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y una CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera de cualquiera de los anticuerpos 1.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 y 1.71.31.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 y 1.71.3 con nada menos que veinte, dieciséis, diez, nueve o menos, por ejemplo uno, dos, tres, cuatro o cinco, adiciones, sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos dentro de las CDRs desveladas. Tales modificaciones pueden hacerse posiblemente en cualquier resto dentro de las CDRs.

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convencionales muy conocidos en la técnica y como se describen en diversas referencias generales y más específicas que se citan y tratan en toda la presente memoria descriptiva, a menos que se indique lo contrario. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), y Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990). Se realizan reacciones enzimáticas y técnicas de purificación según especificaciones del fabricante, como comúnmente se realiza en la materia o como se describe en el presente documento. La nomenclatura usada a propósito de, y los procedimientos de laboratorio y técnicas de, química analítica, química orgánica sintética, y química medicinal y farmacéutica descritos en el presente documento son aquellos muy conocidos y comúnmente usados en la materia. Se usan técnicas convencionales para síntesis químicas, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación y administración, y tratamiento de sujetos.

A cada anticuerpo se le ha dado un número de identificación que incluye dos o tres números cualesquiera separados por uno o dos puntos decimales. En algunos casos, se prepararon varios clones de un anticuerpo. Varios clones tienen diferentes números de identificación, aunque tienen las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos idénticas a la secuencia de origen, también pueden enumerarse por separado. Así, por ejemplo, las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos para:

1.44.1=1.44.2=1.44.3=1.44;

1.124=1.148=1.140=1.140.1;

1.41=1.43=143.1=143.2=1.22.1;

1.14.1=1.14.2=1.14.3=1.14;

1.100.1=1.100.2=1.100.3=1.100;

1.107=1.104=1.128=1.96=1.99=1.96.2;

1.18.1=1.18.2=1.18.3=1.18;

1.20=1.19=1.20.1;

1.39=1.39.1=1.39.2=1.39.3;

1.24=1.22.2=1.71.1=1.24.3;

1.71.2=1.71.3;

son idénticas.

Debe entenderse que los siguientes términos, a menos que se indique lo contrario, tienen los siguientes significados:

El término "polipéptido" engloba proteínas nativas o artificiales, fragmentos de proteínas y análogos de polipéptidos de una secuencia de proteínas. Un polipéptido puede ser monomérico o polimérico.

El término "proteína aislada", "polipéptido aislado" o "anticuerpo aislado" es una proteína, polipéptido o anticuerpo que, en virtud de su origen o fuente de derivación, (1) no está asociado a componentes naturalmente asociados que la acompañan en su estado nativo, (2) está libre de otras proteínas de la misma especie, (3) se expresa por una célula de una especie diferente, o (4) no se produce en la naturaleza. Así, un polipéptido que se sintetiza químicamente o se sintetiza en un sistema celular diferente de la célula de la que se origina naturalmente estará "aislado" de sus componentes naturalmente asociados. Una proteína también puede convertirse en sustancialmente libre de componentes naturalmente asociados por aislamiento, usando técnicas de purificación de proteínas muy conocidas en la técnica.

Ejemplos de anticuerpos aislados incluyen un anticuerpo anti-ErbB2 que ha sido purificado por afinidad usando ErbB2, un anticuerpo anti-ErbB2 que ha sido sintetizado por un hibridoma u otra línea celular in vitro, y un anticuerpo anti-ErbB2 humano derivado de un ratón transgénico. Los agentes de unión elegidos como diana también pueden purificarse usando técnicas similares descritas en el presente documento.

El término "fragmento de polipéptido", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido que tiene una deleción del extremo amino y/o del extremo carboxi, pero donde la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia que existe de forma natural. En algunas realizaciones, los fragmentos tienen al menos 5, 6, 8 o 10 aminoácidos de longitud. En otras realizaciones, los fragmentos tienen al menos 14, al menos 20, al menos 50, o al menos 70, 80, 90, 100, 150 o 200 aminoácidos de longitud.

El término "modular", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier cantidad de inhibición o activación de una vía.

En ciertas realizaciones, sustituciones de aminoácidos a un anticuerpo anti-ErbB2 o porción de unión al antígeno del mismo son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación,

(3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteína, y (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de tales análogos, pero todavía retienen la unión específica a ErbB2. Los análogos pueden incluir diversas muteínas de una secuencia distinta de la secuencia de péptidos que se produce normalmente. Por ejemplo, pueden hacerse sustituciones únicas o múltiples de aminoácidos, preferentemente

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sustituciones de aminoácidos conservativas, en la secuencia que se produce normalmente, preferentemente en la porción del polipéptido fuera del (de los) dominio(s) que forman los contactos intermoleculares. Una sustitución de aminoácidos conservativa no debe sustancialmente cambiar las características estructurales de la secuencia de origen; por ejemplo, una sustitución de aminoácido no debe alterar la hoja β antiparalela que constituye el dominio de unión de inmunoglobulina que se produce en la secuencia de origen, o alterar otros tipos de estructura secundaria que caracteriza la secuencia de origen. En general, la glicina y prolina no se usarían en una hoja β antiparalela. Ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptido reconocidas en la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); y Thomton et al., Nature 354:105 (1991).

Se usan comúnmente análogos no de péptido en la industria farmacéutica como fármacos con propiedades análogas a aquellas del péptido molde. Estos tipos de compuesto no de péptido se llaman "miméticos de péptido" o "peptidomiméticos". Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber and Freidinger, TINS p.392 (1985); and Evans et al., J. Med. Chem. 30:1229 (1987). Tales compuestos se desarrollan frecuentemente con la ayuda de modelado molecular computerizado. Los miméticos de péptido que son estructuralmente similares a péptidos terapéuticamente útiles pueden usarse para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. Generalmente, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica deseadas), tal como un anticuerpo humano, pero tiene uno o más enlaces peptídicos opcionalmente sustituidos con un enlace seleccionado del grupo que consiste en: --CH2NH--, --CH2S--, --CH2-CH2--, --CH=CH--(cis y trans), --COCH2--, --CH(OH)CH2--y -CH2SO--, por métodos muy conocidos en la técnica. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso con un Daminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) también puede usarse para generar péptidos más estables. Además, pueden generarse péptidos limitados que comprenden una secuencia consenso o una variación de secuencia consenso sustancialmente idéntica por métodos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch, Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992); por ejemplo, añadiendo restos de cisteína internos capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclan el péptido.

Donde un "anticuerpo" se refiere en el presente documento, normalmente se entiende que una porción de unión al antígeno del mismo también puede usarse. Una porción de unión al antígeno compite con el anticuerpo intacto por la unión específica. Véase generalmente Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Pueden producirse porciones de unión al antígeno por técnicas de ADN recombinante o por escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Porciones de unión al antígeno incluyen Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb y fragmentos de la región determinante de la complementariedad (CDR), anticuerpos monocatenarios (scFv o scFv2), anticuerpos quiméricos, diacuerpos y polipéptidos que contienen al menos una porción de un anticuerpo que es suficiente para conferir unión de antígeno específica al polipéptido.

De extremo N a extremo C, tanto los dominios variables de cadena ligera como pesada maduros comprenden las regiones FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio en el presente documento es según las definiciones de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) o Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989).

Como se usa en el presente documento, un anticuerpo que se refiere por número es el mismo que un anticuerpo monoclonal que se obtiene del hibridoma del mismo número. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal 1.18 es el mismo anticuerpo que uno obtenido del hibridoma 1*18, o un subclon del mismo. Los subclones se identifican con otro decimal, por ejemplo 1.18.1.

Como se usa en el presente documento, un fragmento Fd significa un fragmento de anticuerpo que consiste en los dominios VH y CH1; un fragmento Fv consiste en los dominios VL y VH de un brazo único de un anticuerpo; y un fragmento dAb (Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)) consiste en un dominio VH.

El anticuerpo puede ser un anticuerpo monocatenario (scFv) en el que un dominio VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes mediante un conector sintético que les permite prepararse como una cadena de proteína única (Bird et al., Science 242:423-426 (1988) y Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)). Los anticuerpos pueden ser diacuerpos, es decir, anticuerpos bivalentes en los que los dominios VH y VL se expresan en una cadena de polipéptidos única, pero usando un conector que es demasiado corto como para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, forzando así a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión al antígeno (véase, por ejemplo, Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993), y Poljak R. J. et al., Structure 2:1121-1123 (1994).) Una o más CDRs de un anticuerpo pueden incorporarse en una molécula tanto covalentemente como no covalentemente para hacerla una inmunoadhesina que se une específicamente a ErbB2. La(s) CDR(s) puede(n) incorporarse como parte de una cadena de polipéptidos mayor, puede(n) unirse covalentemente a otra cadena de polipéptidos, o puede(n) incorporarse no covalentemente.

Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo humano" significa cualquier anticuerpo en el que las

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codificantes a las que se unen. Las secuencias de control de la expresión incluyen secuencias de iniciación de la transcripción, terminación, promotoras y potenciadoras apropiadas; señales de procesamiento de ARN eficaces tales como señales de corte y empalme y de poliadenilación; secuencias que estabilizan el ARNm citoplásmico; secuencias que potencian la eficiencia de traducción (es decir, secuencia consenso de Kozak); secuencias que potencian la estabilidad de proteínas; y cuando se desee, secuencias que potencian la secreción de proteínas. La naturaleza de tales secuencias de control se diferencia dependiendo del organismo hospedador; en procariotas, tales secuencias de control generalmente incluyen promotor, sitio de unión al ribosoma y secuencia de terminación de la transcripción; en eucariotas, generalmente, tales secuencias de control incluyen promotores y secuencia de terminación de la transcripción. El término "secuencias de control" pretende incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y también pueden incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias conductoras y secuencias de componentes de fusión.

El término "vector", como se usa en el presente documento, significa una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico con el que se ha unido. El vector puede ser un plásmido, es decir, un trozo de ADN circular bicatenario en el que pueden unirse segmentos de ADN adicionales. El vector puede ser un vector viral, en el que segmentos de ADN adicionales pueden unirse en el genoma viral. Los vectores pueden ser capaces de replicación autónoma en una célula hospedadora en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamífero episómicos). Alternativamente, los vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episómicos) pueden integrarse en el genoma de una célula hospedadora tras la introducción en la célula hospedadora, y así se replican juntos con el genoma del hospedador. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están operativamente unidos. Tales vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente "vectores de expresión").

El término "célula hospedadora recombinante" (o simplemente "célula hospedadora"), como se usa en el presente documento, significa una célula en la que un vector de expresión recombinante se ha introducido. Debe entenderse que "célula hospedadora recombinante" y "célula hospedadora" significan no solo la célula objeto particular, sino también la progenie de una célula tal. Debido a que pueden producirse ciertas modificaciones en las generaciones sucesivas debido a tanto mutación como a influencias ambientales, tal progenie puede , en realidad, no ser idéntica a la célula parental, pero está todavía incluida dentro del alcance del término "célula hospedadora" como se usa en el presente documento.

El término "hibridar selectivamente" referido en el presente documento significa unir detectablemente y específicamente. Polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de los mismos pueden hibridarse selectivamente con hebras de ácido nucleico bajo condiciones de hibridación y de lavado que minimizan cantidades apreciables de unión detectable a ácidos nucleicos no específicos. Pueden usarse condiciones de "alta rigurosidad" o "altamente rigurosas" para lograr condiciones de hibridación selectivas como se conoce en la técnica y se trata en el presente documento. Un ejemplo de condiciones de "alta rigurosidad" o "altamente rigurosas" es la incubación de un polinucleótido con otro polinucleótido, en el que un polinucleótido puede fijarse a una superficie sólida tal como una membrana, en un tampón de hibridación de 6X SSPE o SSC, 50 % de formamida, 5X reactivo de Denhardt, 0,5 % de SDS, 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado a una temperatura de hibridación de 42 ºC durante 12-16 horas, seguido de lavado doble a 55 ºC usando un tampón de lavado de 1X SSC, 0,5 % de SDS. Véase también Sambrook et al., arriba, pp. 9.50-9.55.

El término "región CDR" o "CDR" está previsto indicar las regiones hipervariables de las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina como se define por Kabat et al. 1991 (Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Edición. US Department of Health and Human Services, Public Service, NIH, Washington), y ediciones posteriores, o como se define en el presente documento. Un anticuerpo normalmente contiene 3 CDRs de cadena pesada y 3 CDRs de cadena ligera. El término CDR o CDRs se usa aquí con el fin de indicar, según el caso, una de estas regiones o varias, o incluso el total, de estas regiones que contienen la mayoría de los restos de aminoácidos responsables de la unión por afinidad del anticuerpo por el antígeno o el epítope que reconoce.

Entre las seis secuencias de CDR cortas, la tercera CDR de la cadena pesada (HCDR3) tiene una mayor variabilidad de tamaño (mayor diversidad, esencialmente debido a los mecanismos de disposición de los genes que dan lugar a ella). Puede ser tan corta como 2 aminoácidos, aunque el tamaño más largo conocido es 26. La longitud de CDR también puede variar según la longitud que pueda ser acomodada por la región estructural subyacente particular. Funcionalmente, HCDR3 desempeña una función en parte en la determinación de la especificidad del anticuerpo (Segal et al., PNAS, 71:4298-4302, 1974, Amit et al., Science, 233:747-753, 1986, Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901-917, 1987, Chothia et al., Nature, 342:877-883, 1989, Caton et al., J. Immunol., 144:1965-1968, 1990, Sharon et al., PNAS, 87:4814-4817, 1990, Sharon et al., J. Immunol., 144:4863-4869, 1990, Kabat et al., J. Immunol., 147:1709-1719, 1991).

El término un "conjunto de CDRs", referido en el presente documento, comprende CDR1, CDR2 y CDR3. Así, un conjunto de HCDRs se refiere a HCDR1, HCDR2 y HCDR3, y un conjunto de LCDRs se refiere a LCDR1, LCDR2 y

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o entre una proteína natural y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, GCG Versión 6.1 (Universidad de Wisconsin, WI). Las secuencias de polipéptidos también pueden compararse usando FASTA usando parámetros por defecto o recomendados, véase GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineamientos y porcentaje de identidad de secuencia de las regiones de la mejor superposición entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185219 (2000)). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene un gran número de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, especialmente blastp o tblastn, usando parámetros por defecto como se suministran con los programas. Véase, por ejemplo, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-402 (1997).

La longitud de secuencias de polipéptidos comparada para homología generalmente será al menos aproximadamente 16 restos de aminoácidos, normalmente al menos aproximadamente 20 restos, más normalmente al menos aproximadamente 24 restos, normalmente al menos aproximadamente 28 restos, y preferentemente superior a aproximadamente 35 restos. Cuando se busca en una base de datos que contiene secuencias de un gran número de organismos diferentes, es preferible comparar secuencias de aminoácidos.

Como se trata en el presente documento, se contemplan variaciones menores en las secuencias de aminoácidos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina, proporcionando que las variaciones en la secuencia de aminoácidos mantengan al menos el 75 %, más preferentemente al menos el 80 %, 90 %, 95 %, y lo más preferentemente el 99 % de identidad de secuencia con los anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina descritos en el presente documento. En particular, se contemplan sustituciones de aminoácidos conservativas. Las sustituciones conservativas son aquellas que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que tienen cadenas laterales relacionadas. Los aminoácidos genéticamente codificados se dividen generalmente en familias: (1) ácidos=aspartato, glutamato; (2) básicos=lisina, arginina, histidina; (3) no polares=alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares sin carga=glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Familias más preferidas son: serina y treonina son una familia hidroxi alifática; asparagina y glutamina son una familia que contiene amida; alanina, valina, leucina e isoleucina son una familia alifática; y fenilalanina, triptófano y tirosina son una familia aromática. Por ejemplo, es razonable esperar que una sustitución aislada de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o una sustitución similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado no tenga un efecto importante sobre la función de unión o propiedades de la molécula resultante, especialmente si la sustitución no implica un aminoácido dentro de un sitio estructural. Si un cambio de aminoácido produce o no un péptido funcional puede determinarse fácilmente ensayando la actividad específica del polipéptido derivado. Ensayos se describen en detalle en el presente documento. Fragmentos o análogos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina pueden ser fácilmente preparados por aquellos expertos habituales en la materia. Extremos amino y carboxi preferidos de fragmentos o análogos se producen cerca de los límites de dominios funcionales. Pueden identificarse dominios estructurales y funcionales por comparación de datos de secuencias de nucleótidos y/o de aminoácidos con bases de datos de secuencias públicas o patentadas. Preferentemente, se usan métodos de comparación computerizada para identificar motivos de secuencia o dominios de conformación de proteínas predichos que se producen en otras proteínas de estructura y/o función conocidas. Se conocen métodos de identificación de secuencias de proteínas que se pliegan en una estructura tridimensional conocida. Bowie et al., Science 253:164 (1991). Así, los ejemplos anteriores demuestran que aquellos expertos en la materia pueden reconocer motivos de secuencia y conformaciones estructurales que pueden usarse para definir dominios estructurales y funcionales según los anticuerpos descritos en el presente documento.

Un sitio de unión al antígeno está generalmente formado por los dominios de inmunoglobulina pesados variables (VH) y ligeros variables (VL), con la interfase de unión al antígeno formada por seis bucles de polipéptido de superficie, llamados regiones determinantes de la complementariedad (CDRs). Hay tres CDRs en cada VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3) y en cada VL (LCDR1, LCDR2, LCDR3), junto con regiones estructurales (FRs).

Normalmente, un dominio VH se empareja con un dominio VL para proporcionar un sitio de unión al antígeno de anticuerpo, aunque un dominio VH o VL solo puede usarse para unir el antígeno. El dominio VH (véase la Tabla 4) puede emparejarse con el dominio VL (véase la Tabla 5), de manera que se forme un sitio de unión al antígeno de anticuerpo que comprende tanto los dominios VH como VL. Las cadenas VH en la Tabla 4 pueden emparejarse con un dominio VL heterólogo en la Tabla 5. La promiscuidad de la cadena ligera está bien establecida en la materia. Así, la cadena de VH de origen o de cualquiera de los anticuerpos en la Tabla 4 puede emparejarse con la cadena VL de origen o de cualquiera de los anticuerpos en la Tabla 5 u otro anticuerpo.

Un sitio de unión al antígeno puede comprender un conjunto de CDRs de H y/o L del anticuerpo de origen o cualquiera de los anticuerpos en la Tabla 1 con tantas como veinte, dieciséis, diez, nueve o menos, por ejemplo una, dos, tres, cuatro o cinco, adiciones, sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos dentro del conjunto desvelado de CDRs de H y/o L. Alternativamente, un sitio de unión al antígeno puede comprender un conjunto de CDRs de H y/o L del anticuerpo de origen o cualquiera de los anticuerpos de la Tabla 1 con hasta veinte, dieciséis, diez, nueve o menos, por ejemplo uno, dos, tres, cuatro o cinco, sustituciones de aminoácidos dentro del conjunto desvelado de CDRs de H y/o L. Tales modificaciones pueden hacerse posiblemente en cualquier resto dentro del conjunto de CDRs.

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Sustituciones de aminoácidos preferidas son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteína, (4) alteran las afinidades de unión, y (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de tales análogos. Los análogos pueden incluir diversas muteínas de una secuencia distinta de la secuencia de péptidos que existe de forma natural. Por ejemplo, pueden hacerse sustituciones de aminoácidos únicas o múltiples (preferentemente sustituciones de aminoácidos conservativas) en la secuencia que existe de forma natural (preferentemente en la porción del polipéptido fuera del (de los) dominio(s) que forma(n) contactos intermoleculares. Una sustitución de aminoácidos conservativa no debe cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia de origen (por ejemplo, un aminoácido de sustitución no debe tender a romper una hélice que se produce en la secuencia de origen, o alterar otros tipos de estructura secundaria que caracteriza la secuencia de origen). Ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidas en la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); y Thornton et al., Nature 354:105 (1991).

Un aspecto adicional descrito en el presente documento es una molécula de anticuerpo que comprende un dominio VH que tiene al menos aproximadamente el 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o aproximadamente el 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio VH de cualquiera de los anticuerpos enumerados en la Tabla 1, el listado de secuencias adjunto, un anticuerpo descrito en el presente documento o con una HCDR (por ejemplo, HCDR1, HCDR2 o HCDR3) mostrada en la Tabla 4 o Tabla 4(a). La molécula de anticuerpo puede también comprender opcionalmente un dominio VL que tiene al menos aproximadamente el 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o aproximadamente el 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio VL de cualquiera de los anticuerpos enumerados en la Tabla 1, el listado de secuencias adjunto, un anticuerpo descrito en el presente documento o con una LCDR (por ejemplo, LCDR1, LCDR2, o LCDR3) mostrada en la Tabla 5. Algoritmos que pueden usarse para calcular el % de identidad de dos secuencias de aminoácidos comprenden, por ejemplo, BLAST (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol.

215: 405-410), FASTA (Pearson and Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448), o el algoritmo de Smith-Waterman (Smith and Waterman (1981) J. Mol Biol. 147: 195-197), por ejemplo, empleando parámetros por defecto.

Además, variantes de los dominios VH y VL y CDRs, que incluyen aquellos para las que se exponen las secuencias de aminoácidos en el presente documento, y que pueden emplearse en los agentes de unión elegidos como diana y anticuerpos para ERBB2, pueden obtenerse por medio de métodos de alteración o mutación de secuencias y cribado para la elección como diana de antígeno con características deseadas. Ejemplos de características deseadas incluyen, pero no se limitan a: elevada afinidad de unión por el antígeno con respecto a anticuerpos conocidos que son específicos para el antígeno; elevada neutralización de una actividad de antígeno con respecto a anticuerpos conocidos que son específicos para el antígeno si la actividad es conocida; capacidad competitiva especificada con un anticuerpo o ligando conocido con respecto al antígeno a una relación molar específica; capacidad para inmunoprecipitar complejo; capacidad para unirse a un epítope especificado; epítope lineal, por ejemplo, secuencia de péptidos identificada usando barrido de unión a péptido como se describe en el presente documento, por ejemplo, usando péptidos cribados en conformación lineal y/o restringida; epítope conformacional, formado por restos no continuos; capacidad para modular una nueva actividad biológica de ERBb2, o molécula en la dirección 3'. Tales métodos también se proporcionan en el presente documento.

Pueden producirse y usarse variantes de moléculas de anticuerpo desveladas en el presente documento. Siguiendo el ejemplo de química computacional en aplicar técnicas de análisis multifactorial de datos a las relaciones estructura/propiedad-actividad (Wold, et al. Multivariate data analysis in chemistry. Chemometrics -Mathematics and Statistics in Chemistry (Ed.: B. Kowalski), D. Reidel Publishing Company, Dordrecht, Holland, 1984) pueden derivarse relaciones cuantitativas de actividad-propiedad de anticuerpos usando técnicas matemáticas muy conocidas, tales como regresión estadística, reconocimiento y clasificación de patrones (Norman et al. Applied Regression Analysis. Wiley-Interscience; 3ª edición (abril de 1998); Kandel, Abraham & Backer, Eric. Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis. Prentice Hall PTR, (11 de mayo de 1995); Krzanowski, Wojtek. Principles of Multivariate Analysis: A User's Perspective (Oxford Statistical Science Series, No 22 (Paper)). Oxford University Press; (diciembre de 2000); Witten, Ian H. & Frank, Eibe. Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations. Morgan Kaufmann; (11 de octubre de 1999); Denison David G. T. (Editor), Christopher C. Holmes, Bani K. Mallick, Adrian F. M. Smith. Bayesian Methods for Nonlinear Classification and Regression (Wiley Series in Probability and Statistics). John Wiley & Sons; (julio de 2002); Ghose, Arup K. & Viswamdhan, Vellarkad N. Combinatorial Library Design and Evaluation Principles, Software, Tools, and Applications in Drug Discovery). Las propiedades de anticuerpos pueden derivar de modelos empíricos y teóricos (por ejemplo, análisis de restos de contacto probables o propiedad fisicoquímica calculada) de secuencia de anticuerpos, estructuras funcionales y tridimensionales, y estas propiedades pueden considerarse individualmente y en combinación.

Este estudio de relación secuencia-estructura puede usarse para la predicción de aquellos restos en un anticuerpo de secuencia conocida, pero de una estructura tridimensional desconocida, que son importantes en el mantenimiento de la estructura tridimensional de sus bucles de CDR y, por lo tanto, mantienen la especificidad de unión. Estas predicciones pueden ser respaldadas por comparación de las predicciones con la salida de los experimentos de optimización de ejemplo. En un enfoque estructural, puede crearse un modelo de la molécula de

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anticuerpo usando cualquier paquete libremente disponible o comercial, tal como WAM. Un paquete de software de visualización y análisis de proteínas, tal como Insight II (Accelrys, Inc.) o Deep View puede entonces usarse para evaluar posibles sustituciones en cada posición en la CDR. Esta información puede entonces usarse para hacer sustituciones que probablemente tienen un efecto mínimo o beneficioso sobre la actividad.

Las técnicas requeridas para hacer sustituciones dentro de secuencias de aminoácidos de CDRs, dominios VH o VL de anticuerpos y/o agentes de unión elegidos como diana generalmente están disponibles en la materia. Pueden hacerse secuencias de variante, con sustituciones que puede o puede no predecirse que tengan un efecto mínimo o beneficioso sobre la actividad, y probarse para la capacidad para unirse a y/o neutralizar una diana y/o para cualquier propiedad deseada.

Como se usa en el presente documento, los términos "marca" o "marcado" se refieren a la incorporación de otra molécula en el anticuerpo o agente de unión dirigido. La marca puede ser un marcador detectable, por ejemplo, incorporación de un aminoácido radiomarcado o unión a un polipéptido de restos biotinilo que pueden detectarse por avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse por métodos ópticos o colorimétricos). La marca o marcador pueden ser terapéuticos, por ejemplo, un fármaco conjugado o toxina. Se conocen en la técnica diversos métodos de marcado de polipéptidos y glucoproteínas y pueden usarse. Ejemplos de marcas para polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, las siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 32P, 33P, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), marcas fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánido), marcas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, β-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), marcadores quimioluminiscentes, grupos biotinilo, epítopes de polipéptido predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metal, marcas de epítopes), agentes magnéticos, tales como quelatos de gadolinio, toxinas tales como toxina de pertussis, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina, y análogos u homólogos de los mismos. La marca puede unirse por brazos de espaciador de diversas longitudes para reducir el posible impedimento estérico.

Como se usa en el presente documento, un "agente de unión dirigido" es un agente, por ejemplo, anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, que se une preferencialmente a un sitio diana. El agente de unión dirigido puede ser específico para solo un sitio diana. Alternativamente, un agente de unión dirigido puede ser específico para más de un sitio diana. El agente de unión dirigido puede ser un anticuerpo monoclonal y el sitio diana puede ser un epítope. Como se describe a continuación, un agente de unión dirigido puede comprender al menos un dominio de unión al antígeno de un anticuerpo, en el que dicho dominio está fusionado o contenido dentro de un armazón de proteína heterólogo, por ejemplo, un armazón de proteína no de anticuerpo.

En toda esta memoria descriptiva y las reivindicaciones, la palabra "comprender" o variaciones tales como "comprende" o "que comprende" se entenderá que implica la inclusión de un número entero establecido o grupo de números enteros, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o grupo de números enteros.

Anticuerpos anti-ErbB2 humanos y caracterización de los mismos

Los presentes inventores describen agentes de unión dirigidos a anti-ErbB2, por ejemplo, anticuerpos anti-ErbB2, por ejemplos anticuerpos humanos. Los anticuerpos anti-ErbB2 pueden unirse a ErbB2 humana sin la secuencia señal, aminoácidos 1-22 (Genbank ID: P04626) (SEQ ID NO:45). Los anticuerpos anti-ErbB2 humanos pueden producirse inmunizando un animal transgénico no humano, por ejemplo, un roedor, cuyo genoma comprende genes de la inmunoglobulina humana de manera que el animal transgénico produzca anticuerpos humanos.

Un anticuerpo anti-ErbB2 descrito en el presente documento puede comprender una cadena ligera kappa humana o una lambda humana, o una secuencia de aminoácidos derivada de las mismas. En algunos anticuerpos que comprenden una cadena ligera kappa, el dominio variable de la cadena ligera (VL) está codificado en parte por un gen de la familia VK1, VK2 o VK4 humano. La cadena ligera puede utilizar un gen A1 de VK, A2 de VK, B3 de VK o L1 de VK humano.

El dominio variable de la cadena ligera puede utilizar un gen A2 humano y un gen JK1 humano; un gen L1 humano y un gen JK5 humano; un gen B3 humano y un gen JK3 humano; o un gen A1 humano y un gen JK4 humano.

VL del anticuerpo contra ErbB2 puede comprender una o más sustituciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de la línea germinal del gen humano. VL del anticuerpo anti-ErbB2 puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 sustituciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de la línea germinal. VL del anticuerpo anti-ErbB2 puede comprender 0, 1 o 2 inserciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de la línea germinal. Una o más de aquellas sustituciones de la línea germinal pueden estar en las regiones CDRs de la cadena ligera. Las sustituciones de aminoácidos con respecto a la línea germinal pueden ser en una o más de las mismas posiciones como sustituciones con respecto a la línea germinal en uno

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de expresión contuvo un inserto de 3768 pb que codificaba la ErbB2 humana de longitud completa. El plásmido anterior se transfectó en células B300.19 usando el método de electroporación. Se seleccionaron clones B300.19 estables que expresaban la proteína hErbB2 en presencia de puromicina (2,5 ug/ml) y entonces se cribaron por FACS con un anticuerpo anti-hErbB2 quimérico (denominado en el presente documento 2C4, producido como se detalla en Cancer Immunol. Immunotherapy (2006) 55:717-727 titulado "Humanization of a recombinant monoclonal antibody to produce a therapeutic HER dimerization inhibitor, pertuzumab") seguido de anti-IgG de ratón de cabra-PE (Caltag, catálogo N.º M30004-4). Se seleccionó el clon B300.19/hErbB2 N.º 44, que da la mayor media geométrica en FACS, para la determinación de títulos en suero.

Se valoraron sueros de ratones inmunizados y sangrados en tampón FACS (PBS con 2 % de FBS) a diluciones 1:50, 1:250 o 1:1250. Se incubaron células del clon B300.19/hErbB2 N.º 44 (células positivas) y células parentales B300.19 (células negativas) con sueros sucesivamente diluidos durante 1 hora, y luego con anti-IgG humana de cabra conjugada con Cy5 (Jackson ImmunoResearch Labs/JIR, catálogo N.º 109-176-098) durante otros 30 minutos. Se usó el mAb anti-ErbB2 2C4 como control positivo mientras que un anticuerpo anti-KLH G1 generado en casa (Gmix) se usó como control de isotipo de G1. Después de un amplio lavado, las células se resuspendieron en tampón FACS y se analizaron en un instrumento BD FACS. Se determinó la media geométrica de cada muestra después del análisis de datos y se muestra en la Tabla 2 a continuación. La relación de la media geométrica en células positivas para ErbB2 con respecto a la media geométrica en células negativas para ErbB2 se correlaciona con la capacidad de unión específica a ErbB2. Los controles negativos, que incluyen control de isotipo G1 anti-KLH Gmix, anticuerpos secundarios de control anti-IgG de ratón de cabra-Cy5 (JIR, catálogo N.º 115-176-071) y anti-IgG humana de cabra-PE solos, dio una relación de media geométrica de por debajo de 1. Aunque el mAb de control positivo 2C4 y los sueros de los 10 ratones inmunizados dieron relaciones entre 2,98 y 7,55, por tanto todos los ratones desarrollaron respuesta inmunitaria humoral a ErbB2 humana.

Tabla 2. Títulos del suero: 10 ratones (cepa XM3B-3)

Muestras: Medias geométricas

ID de ratón: Dilución del ensayo Media geométrica de células pos Media geométrica de células neg Relación de medias geométricas

5152-1: 1:50 324 62,2 5,21

1:250: 251 45,1 5,57

1:1250: 177 26,5 6,68

5152-2: 1:50 308 75 4,11

1:250: 209 39,9 5,24

1:1250: 146 23,4 6,24

5152-3: 1:50 304 85,3 3,56

1:250: 199 40,1 4,96

1:1250: 157 21,1 7,44

5152-4: 1:50 331 111 2,98

1:250: 227 42,8 5,30

1:1250: 166 22 7,55

5152-5: 1:50 196 55,1 3,56

1:250: 142 26,4 5,38

1:1250: 91,7 16,2 5,66

5152-6: 1:50 214 66,9 3,20

1:250: 129 33,1 3,90

1:1250: 92,4 17,5 5,28

5152-7: 1:50 278 88,1 3,16

1:250: 157 38,1 4,12

1:1250: 122 20,5 5,95

5152-8: 1:50 240 58,3 4,12

1:250: 168 27,2 6,18

1:1250: 94,3 16 5,89

5152-9: 1:50 208 46,2 4,50

1:250: 137 24,1 5,68

1:1250: 89,9 15,9 5,65

5152-10: 1:50 256 82,9 3,09

1:250: 157 40,5 3,88

1:1250: 131 22,7 5,77

EJEMPLO 2

RECUPERACIÓN DE LINFOCITOS, AISLAMIENTO DE LINFOCITOS B, FUSIONES Y GENERACIÓN DE HIBRIDOMAS

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ID DE LÍNEA: % de inhibición de pTyr en 1 h % de inhibición de pTyr en 24 h Reactividad cruzada de cino HA promedio (ug/ml) LA a 31 ng/ml

1*96: 97 99 SÍ 6,48 4,6

1*99: 97 99 SÍ 6,18 4,05

1*100: 95 95 SÍ 2,85 3,54

1*108: 90 100 SÍ 4,41 2,64

1*124: 94 97 SÍ 2,86 3,42

1*128: 96 98 SÍ 5,86 3,83

1*140: 97 97 SÍ 4,39 3,54

1*148: 96 97 SÍ 3,29 3,35

1*149: 83 89 SÍ 0,43 1,54

1*19: 73 97 SÍ 0,4 1,77

1*24: 77 99 SÍ 1,77 2,35

1*33: 73 101 SÍ 0,9 2,07

1*41: 26 86 SÍ 1,3 3,2

1*43: 43 82 SÍ 1,3 3,57

1*44: 78 98 SÍ 3,64 2,38

1*69: 57 72 SÍ 0,34 1,6

1*71: 27 65 SÍ 3,1 2,62

1*74: 66 90 SÍ 0,20 1,22

1*79: 71 93 SÍ 0,26 1,77

1*95: 58 95 SÍ 0,23 1,14

1*104: 21 73 SÍ 1,7 2,36

1*107: 57 82 SÍ 0,25 1,15

1*111: 78 98 SÍ 0,77 1,97

Se clasificaron células en cada línea de hibridoma en FACS Aria (BD) en placas de 96 pocillos a 1 célula/pocillo y se cultivaron durante aproximadamente 2 semanas. Se cribaron sobrenadantes de clones individuales para actividad de unión de ErbB2 por FMAT en células BT474 que expresan nivel alto de ErbB2, y también para la composición de cadena gamma y kappa de Ig humana, además de la presencia de IgM humana e IgM de ratón por ELISA.

Para FMAT, se incubaron 6000 células BT474 (ATCC) en 40 µl de tampón FACS en placas FMAT de 384 pocillos con 15 µl de sobrenadantes durante 2 horas a temperatura ambiente y luego con 10 µl de 4,5 µg/ml de anti-IgG humana de cabra-Cy5 durante 6 horas a temperatura ambiente antes de leer en la máquina de FMAT 8200. Se analizaron tanto datos de fluorescencia como de recuentos. Se usó Herceptin® como control positivo en el cribado.

Para el análisis de la composición de la cadena del anticuerpo humano, se recubrieron placas de 96 pocillos de unión a medio (Coastar 3368) con 2 µg/ml de anti-IgG humana de cabra-Fc en PBS durante la noche a 4 ºC, y se bloquearon con 1 % de leche/PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los sobrenadantes se diluyeron 1:5 en 1 % de leche/PBS y se añadieron a dos placas de ELISA recubiertas, y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Entonces se añadieron anti-kappa humana de cabra biotinilado (catálogo de Vector N.º BA3060) a 250 ng/ml en 1 % de leche/PBS o anti-lambda humana de cabra biotinilado (catálogo de Southern Biotech N.º 207008) a 250 ng/ml en 1 % de leche/PBS y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de incubación con conjugado estreptavidina-peroxidasa a 1 µg/ml en 1 % de leche/PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron ampliamente entre etapas de incubación. Se añadieron 50 µl de sustrato de peroxidasa TMB y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente, y la reacción enzimática se inactivó con 50 µl de HCl 1 M. La densidad óptica se leyó a 450 nm en un lector de microplacas (Titerteck Multiskan Ascent).

Los presentes inventores confirmaron la ausencia de IgM humana del siguiente modo. Se recubrieron placas de 96 pocillos de unión a medio (Coastar 3368) con 1 µg/ml de anti-IgM humana de cabra en PBS durante la noche a 4 ºC, y se bloquearon con 1 % de leche/PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los sobrenadantes se diluyeron

1:5 en 1 % de leche/PBS y se añadieron a las placas de ELISA recubiertas, y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Entonces se añadió anti-IgM humana de burro-POD (catálogo de Accurate Chemical N.º JNH035043) a 666 ng/ml en 1 % de leche/PBS y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se desarrollaron mediante la adición de sustrato POD como se ha descrito anteriormente.

Los presentes inventores confirmaron la ausencia de IgM humana del siguiente modo. Se recubrieron placas de 96 pocillos de unión a medio con 1 µg/ml de anti-lambda de ratón de cabra (Southern Biotech 1060-01) en PBS durante la noche a 4 ºC, y se bloquearon con 1 % de leche/PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los sobrenadantes se diluyeron 1:5 en 1 % de leche/PBS y se añadieron a las placas de ELISA recubiertas, y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Entonces se añadió anti-IgG humana de cabra (Fc)-POD (catálogo de Pierce N.º 31413) a 400 ng/ml en 1 % de leche/PBS y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se desarrollaron mediante la adición de sustrato POD como se ha descrito antes.

En los ELISAs descritos anteriormente, se usó la señal de pocillos sin anticuerpos primarios como referencia y se

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Tabla 6: Mutaciones a modo de ejemplo de 1.140 (SEQ ID NO: 8) Cadena ligera a línea germinal en el número de resto indicado

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