BRPI0714728A2 - agente de ligaÇço alvejado, anticorpo, composiÇço, linhagem de cÉlula isolada molÉcula de Ácido nucleico isolada, vetor, cÉlula hospedeira, mÉtodos para produzir um agente de ligaÇço alvejado, para isolar um anticorpo ou porÇço de ligaÇço de antÍgeno do mesmo, para fabricar um anticorpo monoclonal humano, para tratar, prevenir ou aliviar os sintomas de um distérbio, para inibir a proliferaÇço de uma cÉlula cancerosa, para inibir uma atividade de erbb2 em uma cÉlula que expressa erbb2, e para modular uma atividade de erbb2 em uma cÉlula que expressa erbb2, e, animal transgÊnico nço humano ou planta transgÊnica - Google Patents

Abstract

AGENTE DE LIGAÇçO ALVEJADO, ANTICORPO, COMPOSIÇçO, LINHAGEM DE CÉLULA ISOLADA, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADA, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM AGENTE DE LIGAÇçO ALVEJADO, PARA ISOLAR UM ANTICORPO OU PORÇçO DE LIGAÇçO DE ANTÍGENO DO MESMO, PARA FABRICAR UM ANTICORPO MONOCLONAL HUMANO, PARA TRATAR, PREVENIR OU ALIVIAR OS SINTOMAS DE UM DISTéRBIO, PARA INIBIR A PROLIFERAÇçO DE UMA CÉLULA CANCEROSA, PARA INIBIR UMA ATIVIDADE DE ERBB2 EM UMA CÉLULA QUE EXPRESSA ERBB2, E PARA MODULAR UMA ATIVIDADE DE ERBB2 EM UMA CÉLULA QUE EXPRESSA ERBB2, E, ANIMAL TRANSGÊNICO NçO HUMANO OU PLANTA TRANSGÊNICA. A presente invenção diz respeito a anticorpos incluindo anticorpos humanos e porções de ligação de antígeno do mesmos que especificamente se ligam a ErbB2, preferivelmente ErbB2 humano. Em uma outra forma de realização, os anticorpos ou porções de ligação de antígeno do mesmos inibem ErbB2. A invenção também diz respeito a anticorpos que são anticorpos de cadeia única quimérica, biespecífica, derivatizada, ou porções de proteínas de fusão. A invenção também diz respeito a imunoglobulinas de cadeia pesada e leve isoladas ou porções destas derivadas de anticorpos anti-ErbB2 humanos e moléculas de ácido nucleico que codificam tais imunoglobulinas. A presente invenção também diz respeito a métodos de usar os anticorpos e composições para diagnóstico e tratamento. A invenção também fornece métodos de terapia de gene usando as moléculas de ácido nucleico que codificam as moléculas de imunoglobulina de cadeia pesada e/ou leve que compreendem os anticorpos anti-ErbB2 humanos. A invenção também diz respeito a animais ou plantas transgênicas que compreendem as moléculas de ácido nucleico da presente invenção.

Description

"AGENTE DE LIGAÇÃO ALVEJADO, ANTICORPO, COMPOSIÇÃO, LINHAGEM DE CÉLULA ISOLADA, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADA, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM AGENTE DE LIGAÇÃO ALVEJADO, PARA ISOLAR UM ANTICORPO OU PORÇÃO DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO DO MESMO, PARA FABRICAR UM ANTICORPO MONOCLONAL HUMANO, PARA TRATAR, PREVENIR OU ALIVIAR OS SINTOMAS DE UM DISTÚRBIO, PARA INIBIR A PROLIFERAÇÃO DE UMA CÉLULA CANCEROSA, PARA INIBIR UMA ATIVIDADE DE ERBB2 EM UMA CÉLULA QUE EXPRESSA ERBB2, E PARA MODULAR UMA ATIVIDADE DE ERBB2 EM UMA CÉLULA QUE EXPRESSA ERBB2, E, ANIMAL TRANSGÊNICO NÃO HUMANO OU PLANTA TRANS GÊNIC A"

Referência Cruzada aos Pedidos Relacionados

Este pedido reivindica prioridade sob 35 U.S.C. § 119 para o Pedido Provisório U.S. Serial N2 60/835.514, depositado em 4 de agosto de 2006, a totalidade do qual é por meio deste incorporada por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito aos anticorpos anti-ErbB2 particularmente anticorpos humanos e métodos para fabricar e usar anticorpos anti-ErbB2, por exemplo para tratar câncer.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A família ErbB de tirosina quinases receptoras são mediadores importantes do crescimento, diferenciação e sobrevivência da célula. A família de receptor inclui quatro membros distintos incluindo receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR ou ErbB 1), HER2 (ErbB2 ou pl85neu), HER3 (ErbB3) e HER4 (ErbB4).

EGFR, codificado pelo gene erbBl, foi de forma casual implicado na malignidade humana. Em particular, a expressão aumentada de EGFR foi observada no câncer mamário, da bexiga, pulmonar, da cabeça, pescoço e estômago assim como glioblastomas. A expressão do receptor de EGFR aumentada está freqüentemente associada com a produção aumentada do ligando de EGFR, fator de crescimento transformado alfa (TGF-α), pelas mesmas células de tumor resultando na ativação de receptor por um caminho estimulador autócrino (Baselga e Mendelsohn, Pharmac. Ther. 64: 127-154 (1994)). Anticorpos monoclonais direcionados contra o EGFR ou seus ligandos, TGF-α e EGF, forram avaliados como agentes terapêuticos no tratamento de tais malignidades. Ver, por exemplo, Baselga e Mendelsohn, supra; Masui et al. Câncer Research 44: 1002-1007 (1984); e Wu et al. J. Clin. Invest. 95: 1897-1905 (1995).

O segundo membro da família ErbB, pl85neu, foi originalmente identificado como o produto do gene transformador de neuroblastomas de ratos quimicamente tratados. A forma ativada do neu proto-oncogene resulta de uma mutação pontual (valina para ácido glutâmico) na região de transmembrana da proteína codificada. A amplificação do homólogo humano de neu é observada nos cânceres mamários e ovarianos e correlaciona-se com um prognóstico deficiente (Slamon et al., Science, 235: 177-182 (1987); Slamon et al., Science, 244: 707-712 (1989); e Pat. U.S. N- 4.968.603). Até agora, nenhuma mutação pontual análoga àquela no neu proto-oncogene foi relatada para tumores humanos. A superexpressão de ErbB2 (freqüentemente mas não uniformemente devido à amplificação de gene) também foi observada em outros carcinomas incluindo carcinomas do estômago, endométrio, glândula salivar, pulmão, rim, cólon, tireóide, pâncreas e bexiga. Ver, entre outros, King et al., Science, 229: 974 (1985); Yokota et al., Lancet: 1: 765-767 (1986); Fukushige et al., Mol Cell Biol., 6: 955-958 (1986); Guerin et al., Oncogene Res., 3: 21-31 (1988); Cohen et al., Oncogene, 4: 81-88 (1989); Yonemura et al., Câncer Res., 51: 1034 (1991); Borst et al., Gynecol. Oncol., 38: 364 (1990); Weiner et al., Câncer Res., 50: 421-425 (1990); Kern et al, Câncer Res., 50: 5184 (1990); Park et al., Câncer Res., 49: 6605 (1989); Zhau et al, Mol. Carcinog., 3: 254-257 (1990); Aasland et al. Br. J. Câncer 57: 358-363 (1988); Williams et ai. Pathobiology 59: 46-52 (1991); e McCann et al., Câncer, 65: 88-92 (1990).

ErbB2 pode ser superexpressado no câncer da próstata (Gu et al. Câncer Lett. 99: 185-9 (1996); Ross et al. Hum. Pathol. 28: 827-33 (1997); Ross et al. Câncer 79: 2162-70 (1997); e Sadasivan et al. J. Urol. 150: 126-31 (1993)).

Anticorpos direcionados contra o pl85neu de rato e produtos da proteína ErbB2 humana foram descritos. Drebin e colegas incitaram anticorpos contra o produto de gene neu de rato, pl85neu. Ver, por exemplo, Drebin et al, Cell 41: 695-706 (1985); Myers et al., Met. Enzym. 198: 277- 290 (1991); e W094122478. Drebin et al. Oncogene 2: 273-277 (1988) relatam que as misturas de anticorpos reativos com duas regiões distintas de pl85neu resultam em efeitos anti-tumor sinergísticos nas células ΝΊΉ-3Τ3 transformadas com neu implantadas em camundongos nus. Ver também a Pat. U.S. N- 5.824.311 concedida em 20 de out. de 1998.

Hudziak et al., Mol. Cell. Biol. 9(3): 1165-1172 (1989) descrevem a geração de um painel de anticorpos anti-ErbB2 que foram caracterizados usando a linhagem de célula de tumor mamário humano SK- BR-3. A proliferação celular relativa das células SK-BR-3 a seguir da exposição aos anticorpos foi determinada pelo tingimento com violeta cristal das monocamadas depois de 72 horas. Usando este ensaio, a inibição máxima foi obtida com o anticorpo chamado 4D5 que inibe a proliferação celular em 56 %. Outros anticorpos no painel reduziram a proliferação celular a um grau menor neste ensaio. O anticorpo 4D5 foi descoberto ainda sensibilizar as linhagens de célula de tumor que super expressa ErbB2 aos efeitos citotóxico de TNF-a. Ver também a Pat. U.S. N2 5.677.171 concedida em 14 de out de 1997. Os anticorpos anti-ErbB2 debatidos em Hudziak et al. são ainda caracterizados em Fendly et al. Câncer Research 50: 1550-1558 (1990); Kotts et al. In vitro 26(3): 59A (1990); Sarup et al. Growth Regulation 1: 72-82 (1991); Shepard et al. J. Clin. Immunol. 11(3): 117-127 (1991); Kumar et al. Mol. Cell. Biol. 11(2): 979-986 (1991); Lewis et al. Câncer Immunol.

Immunother. 37: 255-263 (1993); Pietras et al. Oncogene 9: 1829-1838 (1994); Vitetta et al. Câncer Research 54: 5301-5309 (1994); Sliwkowski et al. J. Biol. Chem. 269(20): 14661-14665 (1994); Scott et al. J. Biol. Chem. 266: 14300-5 (1991); D'souza et al. Proc. Natl. Acad. Sei. 91: 7202-7206 (1994); Lewis et al. Câncer Research 56: 1457-1465 (1996); e Schaefer et al. Oncogene 15: 1385-1394 (1997).

Uma versão humanizada recombinante do anticorpo anti- ErbB2 de murino 4D5 (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2 ou HERCEPTIN®; Pat. U.S. N- 5.821.337) é clinicamente ativa em pacientes com cânceres de mama metastáticos que superexpressam ErbB2 que receberam terapia anticâncer anterior extensiva (Baselga et al., J. Clin. Oncol. 14: 737-744 (1996)). HERCEPTIN® recebeu aprovação de comercialização do Food and Drug Administration em 25 de set. de 1998 para o tratamento de pacientes com câncer de mama metastático cujos tumores que super expressam a proteína de ErbB2.

Outros anticorpos anti-ErbB2 com várias propriedades foram

descritas em Tagliabue et al. Int. J. Câncer 47: 933-937 (1991); McKenzie et al. Oncogene 4: 543-548 (1989); Maier et al. Câncer Res. 51: 5361-5369 (1991); Bacus et al. Molecular Carcinogenesis 3: 350-362 (1990); Stancovski et al. PNAS (USA) 88: 8691-8695 (1991); Bacus et al. Câncer Research 52: 2580-2589 (1992); Xu et al. Int. J. Câncer 53: 401-408 (1993); W094/00136; Kasprzyk et al. Câncer Research 52: 2771-2776 (1992); Hancock et al. CancerRes. 51: 4575-4580 (1991); Shawvereitf/. CancerRes. 54: 1367-1373 (1994); Arteaga et al. Câncer Res. 54: 3758-3765 (1994); Harwerth et al. J. Biol. Chem. 267: 15160-15167 (1992); Pat. U.S. N2 5.783.186; e Klapper et al. Oncogene 14: 2099-2109 (1997).

A triagem de homologia resultou na identificação de dois outros membros da família do receptor de ErbB; ErbB3 (Pat. U.S. N- 5.183.884 e 5.480.968 assim como Kraus et al. PNAS (USA) 86: 9193-9197 (1989)) e ErbB4 (Pedido de Pat EP N2 599.274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 1746-1750 (1993); e Plowman et al., Nature, 366: 473- 475 (1993)). Ambos destes receptores demonstram expressão aumentada em pelo menos algumas linhagens de célula do câncer mamário.

Os receptores de ErbB são no geral encontrados em várias combinações em células e a heterodimerização é considerada aumentar a diversidade de respostas celulares a uma variedade de ligandos de ErbB (Earp et al. Breast Câncer Research and Treatment 35: 115-132 (1995)). EGFR é ligado por pelo menos seis ligandos diferentes; fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento transformado alfa (TGF-a), anfirregulina, fator de crescimento epidérmico de ligação de heparina (HB- EGF), betacelulina e epirregulina (Groenen et al. Growth Factors 11: 235-257 (1994)). Uma família de proteínas de heregulina que resulta da união alternativa de um gene único são ligandos para ErbB3 e ErbB4. A família da heregulina inclui alfa, beta e gama heregulinas (Holmes et al., Science, 256: 1205-1210 (1992); Pat. U.S. N2 5.641.869; e Schaefer et al. Oncogene 15: 1385-1394 (1997)); os fatores de diferenciação de neu (NDFs), fatores de crescimento glial (GGFs); atividade indutora do receptor de acetilcolina (ARIA); e fator derivado de neurônio sensorial e motor (SMDF). Para uma revisão, ver Groenen et al. Growth Factors 11: 235-257 (1994); Lemke, G. Molec. & Cell. Neurosci. 7: 247-262 (1996) e Lee et al. Pharm. Rev. 47: 51- 85 (1995). Recentemente três ligandos ErbB adicionais foram identificados; neuregulina-2 (NRG-2) que é relatada ligar ErbB3 ou ErbB4 (Chang et al. Nature 387 509-512 (1997); e Carraway et al Nature 387: 512-516 (1997)); neuregulina-3 que liga ErbB4 (Zhang et al. PNAS (USA) 94(18): 9562-7 (1997)); e neuregulina-4 que liga ErbB4 (Harari et al. Oncogene 18: 2681-89 (1999)) HB-EGF, betacelulina e epirregulina também se ligam a ErbB4. Enquanto EGF e TGFa não ligam ErbB2, EGF estimula EGFR e ErbB2 para formar um heterodímero, que ativa EGFR e resulta na transfosforilação de ErbB2 no heterodímero. A dimerização e/ou transfosforilação parece ativar a tirosina quinase de ErbB2. Ver Earp et al, supra, igualmente, quando ErbB3 é co-expressado com ErbB2, um complexo de sinalização ativo é formado e anticorpos direcionados contra ErbB2 são capazes de romper este complexo (Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994)). Adicionalmente, a afinidade de ErbB3 para heregulina (HRG) é aumentada a um estado de afinidade mais alto quando co-expressado com ErbB2. Ver também, Levi et al, Journal of Neuroscience 15: 1329-1340 (1995); Morrissey et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92: 1431-1435 (1995); e Lewis et al, Câncer Res., 56: 1457-1465 (1996) com respeito ao complexo de proteína ErbB2-ErbB3. ErbB4, como ErbB3, forma um complexo de sinalização ativo com ErbB2 (Carraway e Cantley, Cell 78: 5-8 (1994)).

O produto do proto-oncogene HER-2/neu, HER2, é o segundo membro da família do receptor do fator de crescimento epidérmico humano (HER) de receptores da tirosina quinase e foi sugerido ser um receptor órfão de ligando, a heterodimerização dependente de ligando entre HER2 e um outro membro da família HER, HERl, HER3 ou HER4, ativa o caminho da sinalização de HER2. O caminho da sinalização intracelular de HER2 é considerado envolver os caminhos de ras-MAPK e PI3K, assim como os caminhos da sinalização da quinase S6 independente de MAPK e fosfolipase C-gama (Graus-Porta et al., Mol Cell Biol. Março de 1995; 15(3): 1182-1191; Grant et al., Front Biosci. 1 de fevereiro de 2002; 7: d376-89).

A sinalização de HER2 também afeta os fatores pró angiogênicos, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e interleucina- 8 (IL-8) e um fator antiangiogênico, trombospondina-1 (TSP-1). Re-expressão de HER2 em células do câncer de mama MCF-7 e T-47D que endogenamente expressa níveis baixos de HER2 resulta na expressão elevada de VEGF e IL-8 e a expressão diminuída de TSP-1. A inibição de HER2 com um anticorpo anti-HER2 humanizado (trastuzumab ou Herceptina R) ou um RNA interferente pequeno mediado com retrovírus contra HER2 (siHER2) diminui a expressão de VEGF e IL-8, mas expressão de TSP-I aumentada em células do câncer de mama BT474 que expressa altos níveis de HER2. A sinalização de HER2 influencia portanto o equilíbrio entre os fatores pro- e anti- angiogênicos por intermédio de caminhos de sinalização distintos. Trastuzumab inibe a angiogênese e o crescimento de tumor, pelo menos em parte, através da ativação do caminho de HER2-p38-TSP-l e inibição do caminho HER2-PI3K-AKT-VEGF/IL-8 (Wen et ai., Oncogene. 22 de maio de 2006; Epub). Adicionalmente, a membrana de ErbB2 RTK pode conferir resistência à apoptose induzida por taxol pela fosforilação direta de Cdc2 (Tan et al., Mol Cell. Maio de 2002; 9 (5): 993-1004).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Certas formas de realização da invenção são descritas abaixo.

Em uma forma de realização, a invenção compreende um agente de ligação alvejado, por exemplo um anticorpo monoclonal humano ou uma porção de ligação de antígeno deste, que especificamente se liga a ErbB2. o agente de ligação alvejado pode possuir pelo menos uma das seguintes propriedades:

(a) se liga às células humanas;

(b) se liga às células que expressam ErbB2 de cinomolgo;

(c) compete parcialmente com Herceptina® mas não compete

com 2C4;

(d) inibe a fosforilação de ErbB2 em células MCF7 com um EC50 de menos do que 50 ng/ml;

(e) inibe a proliferação de célula com um EC50 de menos do que 50 ng/ml em celulas SKBR3; (f) se Iiga a ErbB2 com um KD de 13,5 nM ou menos; ou

(g) tem um indice de dissocia9ao (Icoff) para ErbB2 de 2,14 x 10"4 s"1 ou menor.

Em uma outra forma de realiza^So, ο agente de IigagSo alvejado Iiga ErbB2 com um KD de 13,5 nM ou menos e inibe a ativa?ao de ErbB. Em uma outra forma de realiza9ao, ο dito agente de liga^ao alvejado e um anticorpo. Em uma forma de realizagao，ο dito anticorpo e um anticorpo monoclonal humanizado, quimerico ou humano ou porpSo de ligagao de antigeno deste.

Em uma outra forma de realizagSo, a ίηνεηφδο compreende um agente de liga?So alvejado, por exemplo um anticorpo monoclonal humanizado, quimerico ou humano ou ροΓφδο de ligafao de antigeno deste, que se Iiga especificamente a e inibe ErbB2 humano, em que ο agente de ligagao alvejado tem pelo menos uma propriedade selecionada do grupo que consiste de:

(a) compete quanto a IigaySo a ErbB2 com um anticorpo selecionado do grupo que consiste de: 1.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96，1.18.1, 1.20，1.39, 1.24 e 1.71.31.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1，1.100.1， 1.96’ 1.18.1，1.20, 1.39，1.24 e 1.71.3;

(b) compete quanto a liga9ao a ErbB2 com um anticorpo selecionado do grupo que consiste de: 1.44.1, 1.140，1.43，1.14.1，1.100.1， 1.96，1.18.1, 1.20，1.39, 1.24 e 1.71.31.44.1, 1.140, 1.43，1.14.1, 1.100.1， 1.96，1.18.1，1.20，1.39，1.24 e 1.71.3;

(c) se Iiga ao mesmo epitopo de ErbB2 como um anticorpo selecionado do grupo que consiste de: 1.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1，1.100.1， 1.96, 1.18.1，1.20, 1.39，1.24 e 1.71.31.44.1，1.140’ 1.43’ 1.14.1, 1.100.1’ 1.96, 1.18.1，1.20，1.39，1.24 e 1.71.3;

(d) se Iiga a ErbB2 com substancialmente ο mesmo KD como um anticorpo selecionado do grupo que consiste de: 1.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1’ 1.96, 1.18.1，1.20，1.39, 1.24 e 1.71.31.44.1, 1.140，1.43, 1.14.1，1.100.1，1.96, 1.18.1’ 1.20’ 1.39，1.24 e 1.71.3; e

(e) se Iiga a ErbB2 com substancialmente ο mesmo indice de dissocia^So como um anticorpo selecionado do grupo que consiste de: 1.44.1, 1.140, 1.43，1.14.1, 1.100.1，1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.31.44.1， 1.140, 1.43, 1.14.1’ 1.100.1，1.96, 1.18.1, 1.20，1.39，1.24 e 1.71.3.

Em uma outra forma de realizayao，ο dito agente de liga^ao alvejado e um anticorpo. Em uma outra forma de realizagSo, ο dito anticorpo e um anticorpo monoclonal humanizado, quimerico ou humano ou porgao de liga9ao de antigeno deste.

Em uma outra forma de realiza^ao，a invengSo compreende um agente de liga^o alvejado, por exemplo um anticorpo monoclonal ou uma por9ao de liga9ao de antigeno deste, que especificamente Iiga ErbB2, em que:

(a) ο agente de IigaySo alvejado compreende as sequencias de aminoacido da CDRl，CDR2 e CDR3 de cadeia pesada de um anticorpo selecionado do grupo que consiste de: 1.44.1, 1.140，1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.31.44.1, 1.140，1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96，1.18.1’ 1.20，1.39, 1.24 e 1.71.3;

(b) ο agente de liga^ao alvejado compreende as sequencias de aminoacido da CDRl, CDR2 e CDR3 de cadeia Ieve de um anticorpo selecionado do grupo que consiste de 1.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96，1.18.1, 1.20，1.39’ 1.24 e 1.71.31.44.1’ 1.140, 1.43, 1.14.1，1.100.1, 1.96，1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.3; e

(c) ο agente de IigagSo alvejado compreende uma cadeia pesada de (a) e uma cadeia Ieve de (b); ou ο agente de liga?ao alvejado de (c) em que as sequencias de aminoacido de CDR de cadeia pesada e cadeia Ieve sao selecionadas do mesmo anticorpo.

Em uma outra forma de realiza9ao, ο dito agente de IigaQSo alvejado e um anticorpo. Em uma outra forma de realizagao, ο dito anticorpo e um anticorpo monoclonal humanizado，quimerico ou humano ou ροΓςδο de IigagSo de antigeno deste. Em uma outra forma de realizagSo, ο anticorpo monoclonal ou uma poi^ao de liga9ao de antigeno deste inclui ainda a sequencia de aminoacido da cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 46, a sequencia de aminoacido da cadeia Ieve apresentada na SEQ ID NO: 47 ou ambas.

Em uma outra forma de realiza^o, ο anticorpo monoclonal ou uma por9ao de IigapSo de antigeno deste da invengao pode ser de qualquer isotipo.

Em uma outra forma de realiza9ao, ο anticorpo monoclonal humano ou porfao de Iiga^So de antigeno deste da invenpSo inclui uma cadeia pesada que utiliza um gene de VH 3-21 humano, um gene de VH 3-7 humano, um gene de VH 4-31 humano ou um gene de VH 3-13 humano. Em uma outra forma de realizafao, ο anticorpo monoclonal

humano ou por^ao de ligafao de antigeno deste da invengao inclui uma cadeia pesada que utiliza um gene VH 3-21 humano, um gene VH 3-7 humano, um gene VH 4-31 humano ou um gene VH 3-13 humano.

Em uma outra forma de realiza9ao, ο anticorpo monoclonal humano ou ροΓςδο de ligagao de antigeno deste da invengSo inclui uma cadeia Ieve que utiliza um gene VK B3 humano, um gene VK Ll humano, um gene VK A2 humano ou um gene VK Al humano.

Em uma outra forma de realiza^ao, ο anticorpo monoclonal humano ou por?ao de ligafao de antigeno deste da invengao inclui um anticorpo ou a ροΓςδο compreende ainda uma cadeia Ieve que utiliza um gene VK B3 humano, um gene VK Ll humano, um gene VK A2 humano ou um gene VK Al humano.

Em uma outra forma de realiza^ao, ο dominio VL, ο dominio VH ou ambos do anticorpo monoclonal humano ou porpao de ligagao de antigeno deste da inven^ao sao pelo menos 90 % identicos na sequencia de aminoacido ao dominio VL, dominio VH ou ambos, respectivamente, dos anticorpos monoclonais 1.44.1，1.140, 1.43，1.14.1，1.100.1, 1.96, 1.18.1， 1.20, 1.39，1.24 e 1.71.31.44.1，1.140, 1.43’ 1.14.1，1.100.1, 1.96, 1.18.1， 1,20, 1.3 9，1.24 e 1.71.3.

Em uma outra forma de realiza^o，a inven9ao inclui um anticorpo monoclonal ou uma porfao de ligagao de antigeno deste que especificamente Iiga ErbB2, em que ο anticorpo compreende um ou mais de uma sequencia de aminoacido FRl, FR2, FR3 ou FR4 de um anticorpo selecionado do grupo que consiste de: 1.44.1，1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39，1.24 e 1.71.31.44.1，1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96，1.18.1, 1.20，1.39，1.24 e 1.71.3.

Em uma outra forma de realiza^ao, a inven?ao inclui um anticorpo monoclonal humano ou uma por?ao de Iiga^So de antigeno, em que ο anticorpo inclui

(a) uma sequencia de aminoacido de cadeia pesada que e pelo menos 90 % identica a sequencia de aminoacido de cadeia pesada do anticorpo monoclonal 1.44.1，1.140，1.43, 1.14.1, 1.100.1，1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.31.44.1，1.140, 1.43, 1.14.1，1.100.1，1.96，1.18.1, 1.20,

1.39’ 1.24 e 1.71.3;

(b) uma sequencia de aminoacido de cadeia Ieve que e pelo menos 90 % identica a sequencia de aminoacido da cadeia Ieve do anticorpo monoclonal 1.44.1，1.140’ 1.43, 1.14.1，1.100.1, 1.96，1.18.1, 1.20，1.39，1.24 e 1.71.31.44.1，1.140’ 1.43, 1.14.1’ 1.100.1, 1.96’ 1.18.1，1.20, 1.39，1.24 e

1.71.3; ou tanto (a) quanto (b).

Em uma outra forma de realiza^So，a inven?ao inclui um anticorpo monoclonal humano ou uma porgSo de ligafao de antigeno aqui descrito, em que a dita porgSo de liga^ao de antigeno e selecionada do grupo

que consiste de: Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb e fragmentos da regiao determinadora de complementaridade (CDR), anticorpos de cadeia iinica (scFv ou scFv2), anticorpos quimericos, diacorpos, anticorpos biespecificos e polipeptideos que contem pelo menos uma ροΓςδο de um anticorpo que e suficiente para conferir liga?So de antigeno especifica ao polipeptideo.

ja em uma outra forma de realiza^So, a inver^o inclui uma composi9ao que compreende ο agente de IigaySo alvejado, por exemplo um anticorpo ou por9ao de IigagSo de antigeno aqui descritos e um carreador farmaceuticamente aceitavel. A composi^ao pode incluir ainda um agente terapeutico ou de diagnostico adicional. Em uma forma de realizagSo, a composi9ao inclui ainda um segundo anticorpo que especificamente Iiga ErbB2 em que ο dito segundo anticorpo nao compete quanto a ligagao a ErbB2 com um anticorpo selecionado do grupo que consiste de: 1.14.1’ 1.18.1, 1.20.1, 1.24.3，1.39.1, 1.71.3, 1.96.2, 1.100.1 e 1.140.1.

Ja em uma outra forma de realizagao, a invenfao inclui uma linhagem de celula isolada que produz ο agente de ligafao alvejado, anticorpo ou ροΓςδο de liga^ao de antigeno aqui descritos ou a cadeia pesada ou cadeia Ieve do dito anticorpo ou da dita porfao.

Ja em uma outra forma de realiza?§o, a ΐηνεηςδο inclui uma molecula de acido nucleico isolada que compreende uma sequencia de nucleotideo que codifica a cadeia pesada ou uma porgao de ligayao de antigeno desta, a cadeia Ieve ou uma porpao de liga^ao de antigeno desta ou ambas.

O acido nucleico isolado pode incluir uma sequencia de nucleotideo selecionada do grupo que consiste de:

(a) a sequencia de nucleotideo da SEQ ID NO: 1;

(b) a sequencia de nucleotideo que codifica a SEQ ID NO: 2;

(c) a sequencia de nucleotideo da SEQ ID NO: 3;

(d) a sequencia de nucleotideo que codifica a SEQ ID NO: 4;

(e) a sequencia de nucleotideo da SEQ ID NO: 5; (f) a sequencia de nucleotideo que codifica a SEQ ID NO: 6; (g) a sequencia de nucleotideo da SEQ ID NO: 7;

(h) a sequencia de nucleotideo que codifica a SEQ ID NO: 8;

(i) a sequencia de nucleotideo da SEQ ID NO: 9;

(j) a sequencia de nucleotideo que codifica a SEQ ID NO: 10;

(k) a sequencia de nucleotideo da SEQ ID NO: 11;

(1) a sequencia de nucleotideo que codifica a SEQ ID NO: 12;

(m) a sequencia de nucleotideo da SEQ ID NO: 13;

(n) a sequencia de nucleotideo que codifica a SEQ ID NO: 14;

(o) a sequencia de nucleotideo da SEQ ID NO: 15;

(p) a sequencia de nucleotideo que codifica a SEQ ID NO: 16;

(q) a sequencia de nucleotideo da SEQ ID NO: 17:

(r) a sequencia de nucleotideo que codifica a SEQ ID NO: 18;

(s) a sequencia de nucleotideo da SEQ ID NO: 19;

(t) a sequencia de nucleotideo que codifica a SEQ ID NO: 20;

(u) a sequencia de nucleotideo da SEQ ID NO: 21;

(ν) a sequencia de nucleotideo que codifica a SEQ ID NO: 22;

(w) a sequencia de nucleotideo da SEQ ID NO: 23;

(χ) a sequencia de nucleotideo que codifica a SEQ ID NO: 24;

(y) a sequencia de nucleotideo da SEQ ID NO: 25;

(z) a sequencia de nucleotideo que codifica a SEQ ID NO: 26;

(aa) a sequencia de nucleotideo da SEQ ID NO: 27;

(bb) a sequencia de nucleotideo que codifica a SEQ ID NO

(cc) a sequencia de nucleotideo da SEQ ID NO: 29;

(dd) a sequencia de nucleotideo que codifica a SEQ ID NO

(ee) a sequencia de nucleotideo da SEQ ID NO: 31 ；

(ff) a sequencia de nucleotideo que codifica a SEQ ID NO: 32; 5

15

20

25

34；

40:

(gg) a sequencia de nucleotideo da SEQ ID NO: 33;

(hh) a sequencia de nucleotideo que codifica a SEQ ID NO:

(ii) a sequencia de nucleotideo da SEQ ID NO: 35;

(jj) a sequencia de nucleotideo que codifica a SEQ ID NO: 36;

(kk) a sequencia de nucleotideo da SEQ ID NO: 37;

(11) a sequencia de nucleotideo que codifica a SEQ ID NO: 38;

(mm) a sequencia de nucleotideo da SEQ ID NO: 39;

(nn) a sequencia de nucleotideo que codifica a SEQ ID NO:

(oo) a sequencia de nucleotideo da SEQ ID NO: 41;

(pp) a sequencia de nucleotideo que codifica a SEQ ID NO:

42:

(qq) a sequencia de nucleotideo da SEQ ID NO: 43; e (rr) a sequencia de nucleotideo que codifica a SEQ ID NO: 44. A ΐηνεηςδο compreende ainda um vetor que compreende a molecula de acido nucleico aqui descrita, em que ο vetor opcionalmente compreende uma sequencia de controle de expressao operavelmente ligada a molecula de acido nucleico. Em uma outra forma de realizaqSo, a inven^ao inclui uma celula hospedeira que compreende ο vetor ou a molecula de acido nucleico aqui descrita.

Em uma outra forma de realiza9ao, a invengao inclui um metodo para produzir ο agente de ligafao alvejado, anticorpo monoclonal ou por9ao de liga9ao de antigeno aqui descritos que compreendem as etapas de cultivar a celula hospedeira ou a linhagem de celula aqui descrita sob condi9oes adequadas e recuperar ο dito anticorpo ou ροΓςδο de IigagSo de antigeno.

A ίηνεηςδο compreende ainda um animal transgenico nao humano ou planta transgenica que compreendem ο acido nucleico aqui descrito, em que ο animal transgenico nao humano ou planta transgenica expressam ο dito acido nucleico. A invengSo tambem inclui um metodo para isolar um anticorpo ou ροΓςδο de liga?3o de antigeno deste que especificamente se ligam a ErbB2 humano. O metodo inclui a etapa de isolar ο anticorpo do animal transgenico nao humano ou planta transgenica.

Em uma outra forma de realiza9ao, a invengao inclui um metodo para fabricar um anticorpo monoclonal humano que especificamente se Iiga a ErbB2, que compreende as etapas de:

(i) imunizar um animal transgenico nao humano que seja capaz de produzir anticorpos humanos com ErbB2, uma por^ao imunogenica de ErbB2 ou uma celula ou tecido que expresse ErbB2;

(ii) deixar ο animal transgenico montar uma resposta imune ao

ErbB2; e

(iii) recuperar ο anticorpo.

Em uma outra forma de realizapao, a invenfao inclui um metodo para tratar, prevenir ou aliviar os sintomas de um disturbio mediado por ErbB2 em um paciente em necessidade deste, que compreende a etapa de administrar ao dito paciente um agente de ligapao alvejado, um anticorpo ou por9ao de IigagSo de antigeno ou a composifao aqui descrita, em que ο dito agente de IigapSo alvejado, anticorpo ou ροΓςδο de liga^ao de antigeno inibem ErbB2.

Ja em um outro aspecto, a invenfao inclui um metodo para tratar, prevenir ou aliviar os sintomas de um distiirbio mediado por ErbB2 tal como cancer em um paciente em necessidade deste com um agente de liga^So alvejado, por exemplo um anticorpo ou por^So de IigagSo de antigeno deste, que especificamente se Iiga a ErbB2 que compreende as etapas de:

(i) administrar uma quantidade eficaz de uma molecula de acido nucleico isolada que codifica a cadeia pesada ou a porfao de liga9ao de

antigeno deste, uma molecula de acido nucleico isolada que codifica ο agente de ligagao alvejado, por exemplo a cadeia Ieve ou a por9ao de ligagao de antigeno desta ou as moleculas de acido nucleico que codificam tanto a cadeia Ieve quanto a cadeia pesada ou por?5es de liga?2o antigeno desta de um anticorpo; e,

(ii) expressar a molecula de acido nucleico.

Um distiirbio mediado por ErbB2 pode ser selecionado do grupo que consiste de cancer e glioblastomas da mama, bexiga, pulmao, cabe^a, pesco^o，prostata, estomago, endometrio, glandula salivar, pulmao, rim, colon, tireoide, pancreatico. Em uma outra forma de realizagao，a inven^So inclui um

metodo de inibir a prolifera^ao de uma celula cancerosa que expresse ErbB2 em um paciente em necessidade deste, ο metodo compreendendo a etapa de administrar ao dito paciente um agente de ligafao alvejador, por exemplo um anticorpo ou porpSo de liga^ao de antigeno ou a composifao aqui descrita, em que ο dito agente de ligafao alvejado inibe ErbB2. Em uma outra forma de realiza9ao, ο dito agente de liga^o alvejado e um anticorpo.

Em uma outra forma de realizago，ο dito anticorpo e um anticorpo monoclonal humanizado, quimerico ou humano ou porgao de IigagSo de antigeno deste. Em uma outra forma de realizafao, a invenpSo inclui um

metodo para inibir uma atividade de ErbB2 em uma celula, por exemplo, de um paciente ou celula cancerosa, que expresse ErbB2, que compreende contatar a celula com um agente de liga^o alvejado ou com a composiySo aqui descrita, em que a atividade de ErbB2 na celula e selecionada do grupo que consiste de:

(a) fosforila9ao de ErbB2;

(b) ativa9ao do caminho de MAPK;

(c) ativa9§o do caminho de PI3K;

(d) inibifao de CDC2; e (e) combinagoes destes. Em uma forma de realizaySo, a fosforilagSo de ErbB2 e mibida em 48 horas. Em uma outra forma de realizagao, ο dito agente de liga9ao alvejado e um anticorpo. Em uma outra forma de realiza9ao, ο dito anticorpo e um anticorpo monoclonal humanizado, quimerico ou humano ou ροΓφδο de IigagSo de antigeno deste.

Em uma outra forma de realizagSo, a inven?ao inclui um metodo para modular uma atividade de ErbB2 em uma celula que expresse ErbB2, incluindo contatar a celula com um anticorpo ou por?2o de liga^ao de antigeno ou com a composifao aqui descrita em que a atividade de ErbB2 na celula e a ativa^o do caminho de p38-TSP-l.

Em uma forma de realiza?3o um sitio de IigagSo de antigeno pode compreender uma cadeia pesada CDRl, CDR2 e CDR3 e uma cadeia Ieve CDRl，CDR2 e CDR3 de qualquer um dos anticorpos 1.44.1, 1.140, 1.43’ 1.14.1，1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.31.44.1，1.140, 1.43，1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.3 tanto quanto vinte, dezesseis, dez, nove ou menos, por exemplo uma, duas, tres, quatro ou cinco, adi?5es, substitui9oes, dele9oes e/ou inserpSes de aminoacido dentro das CDRs divulgados. Tais modificaydes podem ser potencialmente feitas em qualquer residuo dentro das CDRs.

Em uma outra forma de realizagSo ο agente de IigagSo alvejado ou anticorpo podem compreender uma sequencia que compreenda qualquer uma, duas, tres, quatro, cinco ou seis das sequencias de CDRl, CDR2 ou CDR3 como mostradas na Tabela 4, 4(a) e/ou Tabela 5. Em uma outra forma de realizafao ο agente de ligafao alvejado ou anticorpo podem compreender uma sequencia que compreenda uma sequencia de CDRl， CDR2 e CDR3 como mostrada na Tabela 4 e/ou 4(a). Em uma outra forma de realizagao ο agente de ligagao alvejado ou anticorpo podem compreender uma

sequencia que compreenda uma sequencia de CDRl ’ CDR2 e CDR3 como mostrada na Tabela 5. Em uma outra forma de realiza^ao ο agente de ligagao alvejado ou anticorpo podem compreender uma sequencia que compreenda uma sequencia de CDRl, CDR2 e CDR3 como mostrada na Tabela 4 ou 3(a) e uma sequencia de CDRl，CDR2 e CDR3 como mostrada na Tabela 5. e mencionado que aqueles de habilidade comum na tecnica podem facilmente realizar determinagSes de CDR. Ver por exemplo, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Εάίςείο, Publicagao NIH 91-3242, Betesda MD (1991), vols. 1 a 3 ou como aqui definido.

Em uma outra forma de realizafao ο agente de liga^So alvejado ou anticorpo podem compreender uma sequencia que compreenda qualquer uma, duas, tres, quatro, cinco ou seis das sequencias de CDRl, CDR2 e CDR3 de qualquer um do anticorpos monoclonais totalmente humanos 1.44.1, 1.140’ 1.43’ 1.14.1，1.100.1, 1.96，1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.31.44.1’ 1.140，1.43，1.14.1, 1.100.1，1.96，1.18.1，1.20，1.39, 1.24 e 1.71.3，como mostrado na Tabela 4, 4(a) ou na Tabela 5. Em uma forma de realiza?ao ο agente de liga?ao alvejado ou anticorpo podem compreender uma sequencia que compreenda uma sequencia de CDRl ’ CDR2 e CDR3 de anticorpo monoclonal totalmente humano. 1.44.1, 1.140，1.43，1.14.1, 1.100.1，1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39，1.24 e 1.71.31.44.1，1.140，1.43，1.14.1， 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39，1.24 e 1.71.3 como mostrado na Tabela 4 e 4(a). Em uma outra forma de realiza^o ο agente de liga^ao alvejado ou anticorpo podem compreender uma sequencia que compreenda uma sequencia de CDRl, CDR2 e CDR3 de anticorpo monoclonal totalmente humano. 1.44.1，1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1，1.96, 1.18.1, 1.20，1.39，1.24 e 1.71.31.44.1，1.140, 1.43，1.14.1，1.100.1，1.96，1.18.1，1.20, 1.39’ 1.24 e 1.71.3, como mostrado na Tabela 5. Em uma outra forma de realizagao ο agente de IigagSo alvejado ou anticorpo podem compreender uma sequencia que compreenda uma sequencia de CDRl, CDR2 e CDR3 de anticorpo monoclonal totalmente humano. 1.44.1，1.140，1.43，1.14.1，1.100.1, 1.96, 1.18.1，1.20，1.39，1.24 e 1.71.31.44.1, 1.140, 1.43，1.14.1，1.100.1，1.96’ 1.18.1’ 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.3 como mostrado na Tabela 4 e 4(a) e uma sequencia de CDRl，CDR2 e CDR3 de anticorpo monoclonal totalmente humano 1.44.1, 1.140’ 1.43，1.14.1，1.100.1, 1.96，1.18.1, 1.20，1.39, 1.24 e 1.71.31.44.1’ 1.140’ 1.43, 1.14.1，1.100.1’ 1.96，1.18.1，1.20, 1.39，1.24 e 1.71.3 como mostrado na Tabela 5.

DESCRigAO RESUMIDA DOS DESENHOS

A Figura 1 e um graflco que representa a correlayao dos efeitos de 152 sobrenadantes de hibridoma na fosforilag^o de ErbB2 induzida pela Heregulina em celulas MCF7 depois de 1 hora de pre-incuba9ao (eixo Y) e 24 horas (eixo X).

A Figura 2 e uma plotagem de dados da analise de ELISA de LA/HA. O eixo Y indica ο sinal de liga^o em valor OD quando 31 ng/ml de hErbB2(ECD)/cMyc-His foram revestidos em placa de ELISA. O eixo X indica a concentragao de anticorpos especificos de ErbB2 em sobrenadantes de hibridoma derivados de ELISA de HA quando 10 pg/ml de ErbB2(ECD)/cMyc-His foram revestidos na placa de ELISA.

As Figuras 3A-3C mostram curvas de resposta de dose para 10 anticorpos monoclonais anti-ErbB2 da inver^ao (B e C) e anticorpos de controle (A) na fosforilayao de ErbB2 induzida pela Heregulina em celulas MCF7.

As Figuras 4A-4C mostram curvas de resposta de dose para 10 anticorpos monoclonais anti-ErbB2 da inver^So (B e C) e anticorpos de controle (A) na proliferagSo induzida pela Heregulina de celulas MCF7. As Figuras 5A e 5B mostram curvas de resposta de dose para 8

anticorpos monoclonais anti-ErbB2 da inven9ao (B) e anticorpos de controle (A) em um ensaio de prolifera9ao de celula BT474.

As Figuras 6A e 6B mostram curvas de resposta de dose para 8 anticorpos monoclonais anti-ErbB2 da inven9ao (B) e anticorpos de controle (A) em um ensaio de prolifera^ao de celula SKBR3. As Figuras 7A-7C mostram resposta dependente de dose da fosforila9ao de ErbB2 total para mAb 1.18.1 (A), Herceptina O (B) e 2C4 (C) depois de incubar as celulas com mAbs por 24, 48，72 ou 96 horas.

As Figuras 8A-8C mostram resposta dependente de dose da fosforila9ao de ErbB2 normalizada para mAb 1.18.1 (A), Herceptina R (B) e 2C4 (C) depois de incubar as celulas com mAbs por 24，48, 72 ou 96 horas

As Figuras 9A e 9B mostram os resultados de competipao binning indicando que os anticorpos testados da inverts。nao competem com 2C4 (B) ou Herceptina® (A) quanto a liga^ao a ErbB2 em um ELISA . DESCRigAo DETALHADA DAINVENCAO

Definifdes e Tecnicas Gerais

A menos que de outro modo aqui deflnido, os termos cientificos e tecnicos usados em conexao com a presente inven9ao devem ter os significados que sao habitualmente entendidos por aqueles de habilidade comum na tecnica. Alem disso, a menos que de outro modo requerido pelo contexto, os termos singulares devem incluir pluralidades e os termos plurais devem incluir ο singular. No geral, as nomenclaturas usadas em conexao com e tecnicas de, cultura de celula e tecido, biologia molecular, imunologia, microbiologia, geneticas e a quimica de proteina e acido nucleico e hibridiza9ao aqui descritos sao aqueles bem conhecidos e habitualmente usados na tecnica.

Os metodos e tecnicas da presente ίηνεηςδο sao no geral realizados de acordo com metodos convencionais bem conhecidos na tecnica e como descrito em varias referencias gerais e mais especificas que sao citadas e debatidas por todo ο presente relatorio descritivo a menos que de outro modo indicado. Ver, por exemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) e Ausubel et al·, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992) e Harlow e Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), aqui incorporados por referenda. As reagdes enzimaticas e tecnicas de purificagSo sao realizadas de acordo com as especifica9oes do fabricante, como habitualmente realizado na tecnica ou como aqui descrito. A nomenclatura usada em conexao com e os procedimentos de laboratorio e tecnicas de, quimica analitica, quimica organica sintetica e quimica medicinal e farmaceutica aqui descritos sao aqueles bem conhecidos e habitualmente usados na tecnica. As tecnicas padrao sao usadas para a sintese quimica, analise quimica, preparagSo, formula9ao e liberafao farmaceuticas e tratamento de pacientes.

A cada anticorpo foi dado um niimero de identificafao que inclui dois ou tres niimeros separados por um ou dois pontos decimals. Em alguns casos, diversos clones de um anticorpo foram preparados. Varios clones tem numeros de identificagao diferentes embora eles tenham as sequencias de acido nucleico e aminoacido identicas como a sequencia precursora, eles tambem podem ser listados separadamente. Assim, por exemplo，ο acido nucleico e as sequencias de aminoacido para:

1.44.1=1.44.2=1.44.3=1.44;

1.124=1.148=1.140=1.140.1;

1.41=1.43=143.1=143.2=1.22.1;

1.14.1=1.14.2=1.14.3=1.14;

1.100.1=1.100.2=1.100.3=1.100;

1.107=1.104=1.128=1.96=1.99=1.96.2;

1.18.1=1.18.2=1.18.3 二 1.18; 1.20=1.19=1.20.1;

1.39=1.39.1=1.39.2=1.39.3;

1.24=1.22.2=1.71.1=1.24.3;

1.71.2=1.71.3;

sao identicos. Os seguintes termos, a menos que de outro modo indicado, devem ser entendidos ter os seguintes significados:

O termo "polipeptideo" abrange proteinas nativas ou artificials, fragmentos de proteina e analogos de polipeptideo de uma sequencia de proteina. Um polipeptideo pode ser monomerico ou polimerico.

Os termos "proteina isolada", "polipeptideo isolado" ou "anticorpo isolado" sao uma proteina, polipeptideo ou anticorpo que em virtude da sua origem ou fonte de derivagao (1) nao estao associados com componentes naturalmente associados que ο acompanham no seu estado natural, (2) sao livres de outras proteinas da mesma especie, (3) e expressado por uma celula de uma especie diferente ou (4) nao ocorrem na natureza. Assim, um polipeptideo que e quimicamente sintetizado ou sintetizado em um sistema celular diferente da celula a partir da qual ο mesmo naturalmente se origina sera "isolado" dos seus componentes naturalmente associados. Uma proteina tambem pode ser tornada substancialmente livre de componentes naturalmente associados pela isola^So，usando tecnicas de purifica9ao de proteina bem conhecidas no ramo.

Os exemplos de anticorpos isolados incluem um anticorpo anti-ErbB2 que foi purificado por afinidade usando ErbB2, um anticorpo anti- ErbB2 que foi sintetizado por um hibridoma ou outra linhagem de celula in vitro e um anticorpo anti-ErbB2 humano derivado de um camundongo transgenico. Os agentes de liga^ao alvejados tambem podem ser purificados usando tecnicas similares aqui descritas.

O termo "fragmento de polipeptideo" como aqui usado refere- se a um polipeptideo que tenha uma dele^So no terminal amino e/ou terminal carboxi, mas onde a sequencia de aminoacido remanescente e identica as posifoes correspondentes na sequencia que ocorre naturalmente. Em algumas formas de realiza9ao, os fragmentos tem pelo menos 5, 6, 8 ou 10

aminoacidos de comprimento. Em outras formas de realizagSo，os fragmentos tern pelo menos 14，pelo menos 20, pelo menos 50 ou pelo menos 70, 80，90， 100, 150 ou 200 aminoacidos de comprimento.

O termo "modular" como aqui usado refere-se a qualquer quantidade de inibi^ao ou ativa9ao de um caminho.

Em certas formas de realizagao， as substitui^Ses de aminoacido a um anticorpo anti-ErbB2 ou por9ao de Iiga^So de antigeno deste sao aquelas que: (1) reduzem a suscetibilidade para a proteolise, (2) reduzem a suscetibilidade a oxida9ao, (3) alteram a afmidade de IigagSo para formar complexos de proteina e (4) conferem ou modificam outras propriedades fisico-quimicas ou funcionais de tais analogos, mas ainda retem a liga^So especifica ao ErbB2. Analogos podem incluir varias muteinas de uma sequencia outra que nao a sequencia de peptideo que ocorre normalmente. Por exemplo, substitui^des de aminoacido iinicas ou miiltiplas, preferivelmente substitui90es de aminoacido conservativas, podem ser feitas na sequencia que ocorre normalmente, preferivelmente na porfao do polipeptideo fora do(s) dominio(s) que forma(m) contatos intermoleculares. Uma substituigSo de aminoacido conservativa nao deve mudar substancialmente as caracteristicas estruturais da sequencia precursora; por exemplo, um aminoacido de substitni9ao nao deve alterar a folha β anti-paralela que constitui ο dominio de IigagSo da imunoglobulina que ocorre na sequencia precursora ou rompe outros tipos de estrutura secundaria que caracteriza a sequencia precursora. No geral, glicina e prolina nao podem ser usadas em uma folha β anti- paralela. Os exemplos de estruturas secundarias e terciarias de polipeptideo reconhecidas na tecnica sao descritos em Proteins, Structures and Molecular Principles (Croitoon, Ed., W. H. Freeman and Company, Nova Iorque (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden e J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nova Iorque, N.Y. (1991)); e Thornton et al., Nature 354: 105 (1991), aqui incorporadas por referencia.

Analogos nao peptidicos sao habitualmente usados na indiistria farmaceutica como medicamentos com propriedades analogas aquelas do peptideo padrao. Estes tipos de composto nao peptidico sao chamados de

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mimeticos de peptideo ou peptidomimeticos." Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29 (1986); Veber e Freidinger, TINS p. 392 (1985); e Evans et al., J. Med. Chem. 30: 1229 (1987), aqui incorporados por referencia. Tais compostos sao frequentemente desenvolvidos com a ajuda de modelagem molecular computadorizada. Mimeticos de peptideo que sao estruturalmente similares aos peptideos terapeuticamente iiteis podem ser usados para produzir um efeito terapeutico ou profllatico equivalence. No geral, peptidomimeticos sao estruturalmente similares a um polipeptideo paradigma (isto e, um polipeptideo que tem uma propriedade bioquimica ou atividade farmacologica desejadas), tais como um anticorpo humano., mas tem uma ou mais ligafoes peptidicas opcionalmente substituidas por uma liga?So selecionada do grupo que consiste de: --CH2NH--, -CH2S--, -CH2-CH2-, --CH=CH- (cis e trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- e -CH2SO--, pelos metodos bem conhecidas na tecnica. A substitui?§o sistematica de um ou mais aminoacidos de uma sequencia de consenso com um D-aminoacido do mesmo tipo (por exemplo, D-Iisina no lugar de L-lisina) tambem pode ser usada para gerar peptideos mais estaveis. Alem disso, peptideos constrangidos que compreendem uma sequencia de consenso ou uma varia^So de sequencia de consenso substancialmente identica podem ser gerados pelos metodos conhecidos na tecnica (Rizo e Gierasch, Ann. Rev. Biochem. 61: 387 (1992), aqui incorporados por referencia); por exemplo, pela adi9ao de residuos de cisteina internos capazes de formar pontes de dissulfeto intramoleculares que ciclizam ο peptideo.

Onde um "anticorpo" e aqui aludido com respeito a ίηνεηφδο, e normalmente entendido que uma porgao de liga9ao de antigeno deste tambem pode ser usada. Uma por9ao de ligafao de antigeno compete com ο anticorpo intacto quanto a ligafao especifica. Ver no geral, Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed.，2a ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (incorporados por referencia em sua totalidade para todos os propositos). As porfoes de IigagSo de antigeno podem ser produzidas pelas tecnicas de DNA recombinante ou pela clivagem enzimatica ou quimica de anticorpos intactos. Em algumas formas de realiza^So, as por9oes de liga?ao de antigeno incluem Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb e fragmentos da regiao determinadora de complementaridade (CDR), anticorpos de cadeia iinica (scFv ou scFv2), anticorpos quimericos, diacorpos e polipeptideos que contem pelo menos uma por9ao de um anticorpo que seja suficiente para conferir liga9ao de antigeno especiflca ao polipeptideo.

Do terminal N para ο terminal C, as variaveis de dominio tanto de cadeia Ieve quanto pesada maduras compreendem as regiSes FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A designafao de aminoacidos para cada dominio aqui esta de acordo com as defini?5es de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Betesda， Md. (1987 e 1991)), Chothia & Lesk，J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987) ou Chothia et al, Nature 342: 878-883 (1989).

Como aqui usado, um anticorpo que e aludido pelo niimero e ο mesmo como um anticorpo monoclonal que e obtido a partir do hibridoma do mesmo niimero. Por exemplo, anticorpo monoclonal 1.18 e ο mesmo anticorpo como um obtido do hibridoma 1*18 ou um subclone deste. Subclones sao identificados com mais um decimal, por exemplo 1.18.1.

Como aqui usado, um fragmento Fd significa um fragmento de anticorpo que consiste dos dominios VH e CHI; um fragmento Fv consiste dos dominios VL e VH de um ramo iinico de um anticorpo; e um fragmento dAb (Ward et al, Nature 341: 544-546 (1989)) consiste de um dominio VH.

Em algumas formas de realiza9§o，ο anticorpo e um anticorpo de cadeia iinica (scFv) em que um dominio VL e VH sao emparelhados para formar uma molecula monovalente por intermedio de um ligador sintetico que os possibilite serem criados como uma cadeia de proteina iinica. (Bird et al., Science 242: 423-426 (1988) e Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988)). Em algumas formas de realiza^So，os anticorpos sao diacorpos, isto e，sao anticorpos bivalentes em que dominios VH e VL sao expressados em uma cadeia de polipeptideo unica, mas usando um ligador que seja muito curto para permitir ο emparelhamento entre os dois dominios na mesma cadeia, forpando deste modo que os dominios se emparelhem com dominios complementares de uma outra cadeia e criando dois sitios de liga9ao de antigeno. (Ver por exemplo, Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) e Poljak R. J. et al, Structure 2: 1121-1123 (1994)). Em algumas formas de realiza9ao, uma ou mais CDRs de um anticorpo da invengSo podem ser incorporadas em uma molecula covalente ou nao covalentemente para torna-la uma imunoadesina que especificamente se Iiga a ErbB2. Em tais formas de realizagSo, a(s) CDR(S) pode(m) ser incorporada(s) como parte de uma cadeia de polipeptideo maior, pode(m) ser covalentemente ligada(s) a uma outra cadeia de polipeptideo ou pode(m) ser incorporada(s) de modo nao covalente.

Em formas de realizayao tendo um ou mais sitios de liga9ao, os sitios de IigagSo podem ser identicos a um outro ou podem ser diferentes. Como aqui usado, ο termo "anticorpo humano." significa

qualquer anticorpo em que as sequencias de dominio variavel e constante sao sequencias humanas. O termo abrange anticorpos com sequencias derivadas de genes humanos, mas que foram mudados, por exemplo para diminuir a imunogenicidade possivel, aumentar a afinidade, eliminar cisteinas que poderiam causar a dobra indesejavel, etc. O termo abrange tais anticorpos produzidos de modo recombinante em celulas nao humanas, ο que comunicaria glicosila^So nao tipica de celulas humanas. estes anticorpos podem ser preparados em uma variedade de modos, como descrito abaixo.

O termo "anticorpo quimerico" como aqui usado significa um anticorpo que compreende regides de dois ou mais anticorpos diferentes. Em uma forma de realiza9ao, uma ou mais das CDRs do anticorpo quimerico sao derivadas de um anticorpo anti-ErbB2 humano. Em uma outra forma de realiza9ao, todas as CDRs sao derivadas de um anticorpo anti-ErbB2 humano. Em uma outra forma de realiza^So, as CDRs de mais do que um anticorpo anti-ErbB2 humanos sao combinadas em um anticorpo quimerico. Por exemplo, um anticorpo quimerico pode compreender uma CDRl da cadeia Ieve de um primeiro anticorpo anti-ErbB2 humano, uma CDR2 da cadeia Ieve de um segundo anticorpo anti-ErbB2 humano e uma CDR3 da cadeia Ieve de um terceiro anticorpo anti-ErbB2 humano e CDRs da cadeia pesada podem ser derivadas de um ou mais outros anticorpos anti-ErbB2. Alem disso, as regioes de matriz podem ser derivadas de um dos anticorpos anti-ErbB2 a partir do qual uma ou mais das CDRs sao tomadas ou de um ou mais anticorpos humanos diferentes.

Em algumas formas de realiza9ao, um anticorpo quimerico da inven9ao e um anticorpo anti-ErbB2 humanizado. Um anticorpo anti-ErbB2 humanizado da ΐηνεηςδο compreende a sequencia de aminoacido de uma ou mais regioes de matriz e/ou a sequencia de aminoacido de pelo menos uma por9ao da regiao constante de um ou mais anticorpos anti-ErbB2 humanos da invenfao e CDRs derivadas de um anticorpo anti-ErbB2 nao humano.

Um "anticorpo mibidof (tambem aqui aludido como um "anticorpo antagonista") como aqui usado significa um anticorpo que inibe uma ou mais atividades de ErbB2 em pelo menos cerca de 30 % quando adicionado a uma celula, tecido ou organismo que expressem ErbB2. Em algumas formas de realiza9ao, ο anticorpo inibe a atividade de ErbB2 em pelo menos 40 %，50 %，60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 % ou mais do que 100 %. Em algumas formas de realizag^o，ο anticorpo inibidor e adicionado na preser^a de ligando tal como heregulina. Em algumas formas de realiza?ao, um anticorpo antagonista da inven^So diminui pelo menos uma atividade de ErbB2 em 5 vezes. "Fragmentos de ligafao" de um anticorpo sao produzidos pelas tecnicas de DNA recombinante ou pela clivagem enzimatica ou quimica de anticorpos intactos. Os fragmentos de Iiga^So incluem Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dAb e anticorpos de cadeia iinica. Um anticorpo outro que nao um anticorpo "biespecifico" ou "bifuncional" e entendido ter cada um de seus sitios de IigapSo identicos. Um anticorpo substancialmente inibe a adesao de um receptor a um contra-receptor quando um excess。de anticorpo reduz a quantidade de receptor ligado ao contra-receptor em pelo menos cerca de %, 40 %, 60 % ou 80 % e mais usualmente maior do que cerca de 85 % (como medido em um ensaio de IigagSo competitivo in vitro).

Fragmentos ou analogos de anticorpos ou moleculas de imunoglobulina podem ser facilmente preparados por aqueles de habilidade comum na tecnica seguindo as divulgafoes deste relatorio descritivo. Os terminals amino e carboxi preferidos de fragmentos ou analogos ocorrem proximo ao limites dos dominios funcionais. Os dominios estruturais e funcionais podem ser identificados pela comparafao dos dados de sequencia de nucleotideo e/ou aminoacido com as bases de dados de sequencia piiblicas ou patenteadas. Preferivelmente, metodos de compara9ao computadorizadas sao usados para identiflcar motivos de sequencia ou dominios de conforma9ao de proteina prognosticados que ocorrem em outras proteinas de estrutura e/ou funfao conhecidas. Metodos para identiflcar sequencias de proteina que dobram em uma estrutura tri-dimensional conhecida sao conhecidos. Ver Bowie et al., Science 253: 164 (1991).

Foi mostrado que fragmentos de um anticorpo inteiro podem realizar a fun9ao de antigenos de ligafao. Os exemplos de fragmentos de ligafao sao (Ward, E. S. et al., (1989) Nature 341, 544-546) ο fragmento Fab que consiste dos dominios VL, VH, CL e CHI; (McCafferty et al (1990) Nature, 348, 552-554) ο fragmento Fd que consiste dos dominios VH e CHI; (Holt et al (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490) ο fragmento Fv que consiste dos dominios VL e VH de um iinico anticorpo; (iv) ο fragmento dAb (Ward, E. S. et al, Nature 341, 544-546 (1989)，McCafferty et al (1990) Nature, 348, 552-554, Holt et al (2003) Trends in Biotechnology 21, 484- 490], que consiste de um dominio VH ou um VL; (v) regides CDR isoladas; (vi) fragmentos F(ab')2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos de Fab ligados (vii) moleculas Fv de cadeia iinica (scFv), em que um dominio VH e um dominio VL sao ligados por um peptideo ligador que permite que os dois dominios associem-se para formar um sitio de ligafao de antigeno. (Bird et al, (1988) Science, 242, 423-426, , Huston et al, (1988) PNAS USA, 85，5879-5883); (viii) dimeros de Fv de cadeia iinica biespecificos (PCT/US92/09965) e (ix) "diacorpos”，fragmentos multivalentes ou multiespecificos construidos pela fusao de gene (W094/13804; Holliger, P. (1993) et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448,). Fv, scFv ou moleculas de diacorpo podem ser estabilizadas pela incorpora^So de pontes de dissulfeto ligando os dominios de VH e VL (Reiter, Y. et al, Nature Biotech, 14，1239-1245, 1996). Minicorpos que compreendem um scFv unido a um dominio CH3 tambem podem ser fabricados (Hu, S. et al, (1996) Cancer Res., 56，3055-3061). Outros exemplos de fragmentos de liga9ao sao Fab', que difere dos fragmentos de Fab pela adi9ao de uns poucos residuos no terminal carboxila do dominio de cadeia pesada CHl，incluindo uma ou mais cisteinas da regiao de dobradifa do anticorpo e Fab'-SH, que e um fragmento Fab' em que o(s) residuo(s) de cisteina dos dominios constantes carregam um grupo tiol livre.

Um "agente de liga?So alvejado 'mibidor” como aqui usado significa um agente de ligagao alvejado que inibe uma ou mais atividades de ErbB2 em pelo menos cerca de 30 % quando adicionado a uma celula, tecido ou organismo que expresse ErbB2. Em algumas formas de realizafao, ο agente de liga^o alvejado inibe a atividade de ErbB2 em pelo menos cerca de 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 % ou maior do que 100 %. Em algumas formas de realiza^So, ο agente de liga?So alvejado mibidov e adicionado na presen^a de ligando tal como heregulina. Em algumas formas de realizagao, ο agente de liga9§o alvejado da ίηνεηςδο diminui pelo menos uma atividade de ErbB2 em 5 vezes.

O termo "ressonancia de plasma de superficie", como aqui usado, refere-se a um fenomeno optico que possibilita a analise de intera9oes bioespecificas em tempo real pela detec9ao de alteragdes nas concentra9oes de proteina dentro de uma matriz de biossensor, por exemplo usando ο sistema BIACORE® (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia e Piscataway, N.J.)· Para descrifdes adicionais, ver Jonsson U. et al., Ann. Biol. Clin. 51: 19-26 (1993); Jonsson U. et al., Biotechniques 11: 620-627 (1991); Jonsson B. et al., J. Mol. Recognit. 8: 125-131 (1995); e Johnsson B. et al； Anal. Biochem. 198: 268-277 (1991).

O termo "KD" refere-se a constante de dissocia9ao em equilibrio de uma interagao de anticorpo-antigeno particular.

O termo "epitopo" inclui qualquer determinante de proteina capaz de liga?a。especifica a uma imunoglobulina ou receptor de celula T ou de outro modo interagir com uma molecula. Os determinantes epitopicos no geral consistem de agrupamentos de superficie quimicamente ativos de moleculas tais como aminoacidos ou carboidrato ou cadeias laterals de agiicar e no geral tem caracteristicas estruturais tridimensionals especificas, assim como caracteristicas de carga especificas. Um epitopo pode ser "linear" ou "conformacional." Em um epitopo linear, todos os pontos de interafao entre a proteina e a molecula interventora (tal como um anticorpo) ocorrem linearmente ao longo da sequencia de aminoacido primaria da proteina. Em um epitopo conformacional, os pontos de intera^ao ocorrem atraves dos residuos de aminoacido na proteina que sao separados um do outro. Um anticorpo e dito ligar especificamente um antigeno quando a constante de dissocia9ao e < 1 mM, preferivelmente < 100 nM e ο mais preferivelmente < IOnM. Em certas formas de realiza^o, ο KD e de 1 pM a 500 pM. Em outras formas de realiza?So, ο KD esta entre 500 pM a 1 μΜ. Em outras formas de realizafao, ο KD esta entre 1 μΜ a 100 nM. Em outras formas de realiza^So， ο KD esta entre 100 mM a 10 nM. Uma vez que um epitopo desejado em um antigeno e determinado, e possivel gerar anticorpos para este epitopo, por exemplo, usando as tecnicas descritos na presente ίηνεηςδο. Alternativamente, durante ο processo de descoberta, a gera9ao e caracteriza9ao de anticorpos podem elucidar informaQao a cerca dos epitopos desejaveis. A partir desta informa9ao, e entao possivel triar competitivamente anticorpos quanto a ligafao ao mesmo epitopo. Um metodo para se obter isto e conduzir estudos de competi^So cruzada para encontrar anticorpos que competitivamente se ligam entre si, por exemplo, os anticorpos competem quanto a IigaqSo ao antigeno. Um processo de alto rendimento para “binning” anticorpos com base na sua competigao cruzada e descrito no Pedido de Patente Internacional Ns WO 03/48731.

Como aqui usado, os vinte aminoacidos convencionais e suas abrevia9des seguem ο uso convencional. Ver Immunology - A Synthesis (2a Εάίςδο, E. S. Golub e D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), aqui incorporada por referencia.

O termo "polinucleotideo" como aqui aludido significa uma forma polimerica de nucleotideos de pelo menos 10 bases no comprimento, ribonucleotideos ou desoxinucleotideos ou uma forma modificada de cada tipo de nucleotideo. O termo inclui as formas de filamento unico e duplo.

O termo "polinucleotideo isolado" como aqui usado significa um polinucleotideo de origem genomica, cDNA ou sintetica ou alguma combina9ao destes, que em virtude da sua origem ο "polinucleotideo isolado" (1) nao esta associado com todo ou uma por9ao de um polinucleotideo com que ο "polinucleotideo isolado" e encontrado na natureza, (2) esta operavelmente ligado a um polinucleotideo ao qual ο mesmo nao esta ligado na natureza ou (3) nao ocorre na natureza como parte de uma sequencia maior.

O termo "nucleotideos que ocorrem naturalmente" como aqui usado inclui desoxirribonucleotideos e ribonucleotideos. O termo "nucleotideos modificados" como aqui usado inclui nucleotideos com grupos de agiicar modificados ou substituidos e outros. O termo "liga9oes de oligonucleotideo" aqui aludido inclui liga9oes de oligonucleotideos tais como fosforotioato, fosforoditioato, fosforo-selenoato, fosforodisselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato e outros. Ver por exemplo, LaPlanche et al., Nucl. Acids Res. 14: 9081 (1986); Stec et al., J. Am. Chem. Soc. 106: 6077 (1984); Stein et al, Nucl. Acids Res. 16: 3209 (1988); Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6: 539 (1991); Zon et al., Oligonucleotides and Analogs: A Practical Method, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Patente U.S. N2 5.151.510; Uhlmann e Peyman, Chemical Reviews 90: 543 (1990), as divulga90es dos quais sao por meio deste incorporados por referencia. Um oligonucleotideo pode incluir um rotulo para detec9ao, se desejado.

As sequencias "operavelmente ligadas" incluem tanto as sequencias de controle de expressao que sao contiguas com ο gene de interesse quanto as sequencias de controle de expressao que atuam em trans ou em uma distancia para controlar ο gene de interesse. O termo "sequencia de controle de expressao" como aqui usado significa sequencias de polinucleotideos que sao necessarias para efetuar a expressao e processamento das sequencias codificadoras as quais elas estao ligadas. Sequencias de controle de expressao incluem as sequencias de inicia9ao, termina9ao, promotoras e realfadoras de transcripao apropriadas; os sinais de processamento de RNA eficientes tais como os sinais de uniao e

poliadenila9ao; as sequencias que estabilizam ο mRNA citoplasmico; as sequencias que realgam a eficiencia de tradugao (isto e, sequencia de consenso de Kozak); as sequencias que realpam a estabilidade da proteina; e quando desejado, as sequencias que realgam a secregSo da proteina. A natureza de tais sequencias de controle difere dependendo do organismo hospedeiro; em procariotas, tais sequencias de controle no geral incluem promotor, sitio de ligafao de ribossoma e sequencia de terminafao de transcri^ao; em eucariotas, no geral, tais sequencias de controle incluem promotores e sequencia de terminagao de transcri9ao. O termo "sequencias de controle" e intencionado a incluir, em um minimo, todos os componentes cuja presenpa e essencial para a expressao e processamento e tambem podem incluir componentes adicionais cuja presen?a e vantajosa, por exemplo, sequencias lider e sequencias parceiras de fusao.

O termo "vetor", como aqui usado, significa uma molecula de acido nucleico capaz de transportar um outro acido nucleico ao qual ο mesmo foi ligado. Em algumas formas de realiza^ao, ο vetor e um plasmideo，isto e, um peda^o de filamento duplo circular de DNA no qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Em algumas formas de realizagSo，ο vetor e um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Em algumas formas de realiza^o，os vetores sao capazes de replicagSo autonoma em uma celula hospedeira na qual eles sao introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem bacteriana de replicafao e vetores mamiferos epissomicos). Em outras formas de realiza^o, os vetores (por exemplo, vetores de mamifero nao epissomicos) podem ser integrados no genoma de uma celula hospedeira na introdu9ao na celula hospedeira e por meio desta sao replicados junto com ο genoma hospedeiro. Alem disso, certos vetores sao capazes de direcionar a expressao de genes aos quais eles sao operativamente ligados. Tais vetores sao aqui aludidos como "vetores de expressao recombinantes" (ou simplesmente, "vetores de expressao").

O termo "celula hospedeira recombinante" (ou simplesmente "celula hospedeira"), como aqui usado, significa uma celula na qual um vetor de expressao recombinante foi introduzido. Deve ser entendido que "celula hospedeira recombinante" e "celula hospedeira" significam nao apenas a celula do paciente particular mas tambem a progenie de uma tal celula. Porque certas modifica9oes podem ocorrer em gera9oes sucessivas devido a muta9ao ou influencias ambientais, tal progenie, de fato, pode nao ser identica a celula precursora, mas sao ainda incluidas dentro do escopo do termo "celula hospedeira" como aqui usado.

O termo "hibridiza seletivamente" aqui aludido significa ligar detectavel e especificamente. Polinucleotideos, oligonucleotideos e fragmentos destes de acordo com a ίηνεηςδο seletivamente hibridizam aos filamentos de acido nucleico sob condisSes de hibridiza?So e lavagem que minimizem quantidades apreciaveis de ligagao detectavel aos acidos nucleicos nao especificos. Condi0es de "severidade alta" ou "altamente severo" podem ser usadas para se obter condi?5es de hibridiza9ao seletiva como conhecido na tecnica e aqui debatidas. Um exemplo de condi9oes de "severidade alta" ou "altamente severas" e a incubagao de um polinucleotideo com um outro polinucleotideo, em que um polinucleotideo pode ser fixado a uma superficie solida tal como uma membrana, em um tampao de hibridizafao de 6X SS PE ou SSC, 50 % de formamida, 5X reagente de Denhardt, 0,5 % de SDS, 100 pg/ml de DNA de esperma de salmao desnaturado, fragmentado a uma temperatura de hibridizagao de 42 0C por 12 a 16 horas, seguido por duas vezes lavagem a 55 0C usando um tampao de lavagem de IX SSC, 0,5 % de SDS. Ver tambem Sambrook et al., supra, pp. 9.50-9.55.

O termo "Regiao de CDR" ou "CDR" e intencionado a indicar as regioes hipervariaveis das cadeias pesada e Ieve da imunoglobulina como definido por Kabat et al. 1991 (Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Edigao. US Department of Health and Human Services, Public Service, NIH, Washington) e edi?5es posteriores ou como aqui definido. Um anticorpo tipicamente contem 3 CDRs de cadeia pesada e 3 CDRs de cadeia leve. Os termos CDR ou CDRs sao aqui usados de modo a indicar, de acordo com ο caso, uma destas regioes ou varias ou ainda ο todo, destas regioes que contem a maioria dos residuos de aminoacido responsaveis pela IigaySo pela afinidade do anticorpo ao antigeno ou ο epitopo que ο mesmo reconhece.

Entre as seis sequencias de CDR curtas, a terceira CDR da cadeia pesada (HCDR3) tem uma variabilidade de tamanho maior (maior diversidade essencialmente devido aos mecanismos de arranjo dos genes que dao origem a mesma). Esta pode ser tao curta quanto 2 aminoacidos embora ο tamanho mais longo conhecido seja 26. O comprimento da CDR tambem pode variar de acordo com ο comprimento que pode ser acomodado pela matriz subjacente particular. Funcionalmente, a HCDR3 desempenha um papel em parte na determinafao da especificidade do anticorpo (Segal et al., PNAS, 71: 4298-4302’ 1974, Amit et al., Science, 233: 747-753, 1986, Chothia et al, J. Mol. Biol., 196: 901-917, 1987, Chothia et al, Nature, 342: 877- 883, 1989, Caton et al, J. Immunol., 144: 1965-1968, 1990，Sharon et al, PNAS, 87: 4814-4817, 1990，Sharon et al., J. Immunol., 144: 4863-4869, 1990, Kabat et al, J. Immunol., 147: 1709-1719，1991).

O termo um "conjunto de CDRs" aqui aludido compreende a CDRl, CDR2 e CDR3. Assim, um conjunto de HCDRs refere-se a HCDRl， HCDR2 e HCDR3 e um conjunto de LCDRs refere-se a LCDRl, LCDR2 e LCDR3. A menos que de outro modo estabelecido, um "conjunto de CDRs" inclui HCDRs e LCDRs.

O termo "identidade de sequencia percentual" no contexto das sequencias de nucleotideo significa que os residuos em duas sequencias que sao os mesmos quando alinhadas para correspondencia maxima. O comprimento da comparafao de identidade de sequencia pode ser acima de um trecho de pelo menos cerca de nove nucleotideos, usualmente pelo menos cerca de 18 nucleotideos, mais usualmente pelo menos cerca de 24 nucleotideos, tipicamente pelo menos cerca de 28 nucleotideos, mais tipicamente pelo menos cerca de 32 nucleotideos e preferivelmente pelo menos cerca de 36, 48 ou mais nucleotideos. Existem varios algoritmos diferentes conhecidos na tecnica que podem ser usados para medir a identidade da sequencia de nucleotide。. Por exemplo, as sequencias de polinucleotideo podem ser comparadas usando FASTA, Gap ou Bestfit, que sao programas no Pacote Wisconsin Versao 10.0，Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA, que inclui, por exemplo, os programas FASTA2 e FASTA3, fornece alinhamentos e identidade de sequencia percentual das regioes da melhor sobreposi^ao entre as sequencias diivida e pesquisa (Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266: 227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276: 71-84 (1998); aqui incorporados por referencia). A menos que de outro modo especificado, parametros de default para um programa ou algoritmo particular sao usados. Por exemplo, a identidade de sequencia percentual entre as sequencias de nucleotideo pode ser determinada usando FASTA com seus parametros de default (um tamanho de palavra de 6 e ο fator NOPAM para a matriz de contagem) ou usando Gap com seus parametros de default como fornecidos no GCG Versao 6.1，aqui incorporados por referencia.

Uma referencia a uma sequencia de nucleotideo abrange ο seu complemento a menos que de outro modo especificado. Assim, uma referencia a um acido nucleico tendo uma sequencia particular deve ser entendida abranger ο seu filamento complementar, com a sua sequencia complementar.

Como aqui usado, os termos "identidade de sequencia percentual" e "homologia de sequencia percentual" sao usados

intercambiavelmente. O termo "similaridade substancial" ou "similaridade de sequencia substancial," quando referindo a um acido nucleico ou fragmento deste, significa que quando otimamente alinhados com insei^des ou delegoes de nucleotide。apropriadas com um outro acido nucleico (ou seu filamento complementar), existe identidade de sequencia de nucleotideo em pelo menos cerca de 85 %, preferivelmente pelo menos cerca de 90 % e mais preferivelmente pelo menos cerca de 95 %, 96 %, 97 %，98 % ou 99 % das bases de nucleotideo, como medido por qualquer algoritmo de identidade de sequencia bem conhecido, tal como FASTA, BLAST ou Gap, como debatido acima.

Como aplicado aos polipeptideos, ο termo "identidade substancial" significa que duas sequencias de peptide。，quando otimamente alinhadas, tais como pelos programas GAP ou BESTFIT usando pesos de intervalo de default como fornecido com os programas, compartilham pelo menos 70 %, 75 % ou 80 % de identidade de sequencia, preferivelmente pelo menos 90 % ou 95 % de identidade de sequencia e mais preferivelmente pelo menos 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequencia. Em certas formas de realiza^ao，as posifoes de residuo que nao sao identicas diferem pelas substitui95es de aminoacido conservativas. Uma "substitui9ao de aminoacido conservativa" e uma em que um residuo de aminoacido e substituida por um outro residuo de aminoacido tendo um grapo de cadeia lateral R com propriedades quimicas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). No geral， uma substituipao de aminoacido conservativa nao mudara substancialmente as propriedades funcionais de uma proteina. Em casos onde duas ou mais sequencias de aminoacido diferem entre si pelas substitui^Ses conservativas, a identidade de sequencia percentual pode ser ajustada para cima para corrigir quanto a natureza conservativa da substitui9ao. Meios para fazer este ajuste sao bem conhecidos por aqueles de habilidade na tecnica. Ver, por exemplo, Pearson, Methods Mol. Biol. 243: 307-31 (1994). Os exemplos de grupos de aminoacidos que tem cadeias laterals com propriedades quimicas similares incluem 1) cadeias laterals alifaticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadeias laterals alifatica-hidroxilicas: senna e treonina; 3) cadeias laterals contendo amida: asparagina e glutamina; 4) cadeias laterals aromaticas: fenilalanina, tirosina e triptofano; 5) cadeias laterals basicas: lisina，arginina e histidina; 6) cadeias laterals acidas: acido aspartico e acido glutamico; e 7) cadeias laterals contendo enxofre: cisteina e metionina. Os grupos de substituifao de aminoacido conservativos sao: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina， glutamato-aspartato e asparagina-glutamina.

Alternativamente, uma substitui9ao conservativa e qualquer mudanfa tendo um valor positivo na matriz de probabilidade PAM2501og divulgada em Gonnet et al, Science 256: 1443-45 (1992)，aqui incorporados por referencia. Uma substitui^ao "moderadamente conservativa" e qualquer mudanga tendo um valor nao negativo na matriz de probabilidade PAM250 log.

A identidade de sequencia para polipeptideos e tipicamente medida usando ο software de analise de sequencia. O software de analise de proteina emparelha sequencias usando medidas de similaridade designadas as varias substituifSes, delepdes e outras modificafdes, incluindo substitui9oes de aminoacido conservativas. Por exemplo, GCG contem programas tais como "Gap" e "Bestfit" que podem ser usados com parametros de default como especificado pelos programas para determinar a homologia de sequencia ou identidade de sequencia entre polipeptideos intimamente relacionados, tais como polipeptideos homologos de especies diferentes de organismos ou entre uma proteina do tipo selvagem e uma muteina desta. Ver, por exemplo, GCG Versao 6.1 (University of Wisconsin, WI). As sequencias de polipeptideo tambem podem ser comparadas usando FASTA usando parametros default ou recomendados, ver GCG Versao 6.1. FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) fornece alinhamentos e identidade de sequencia percentual das regioes da melhor sobreposi9ao entre as sequencias diivida e pesquisa (Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185-219 (2000)). Um outro algoritmo preferido quando da comparaySo de uma sequencia da inven^So a uma base de dados contendo um grande niimero da sequencias de organismos diferentes e ο programa de computador BLAST, especialmente blastp ou tblastn, usando parametros de default como fornecidos com os programas. Ver, por exemplo, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-402 (1997).

O comprimento de sequencias de polipeptideo comparadas quanto a homologia no geral serao de pelo menos cerca de 16 residuos de aminoacido, usualmente pelo menos cerca de 20 residuos, mais usualmente pelo menos cerca de 24 residuos, tipicamente pelo menos cerca de 28 residuos e preferivelmente mais do que cerca de 35 residuos. Quando da pesquisa de uma base de dados contendo sequencias de um grande numero de organismos diferentes, e preferivel comparar sequencias de aminoacido.

Como aqui debatido, variapdes menores nas sequencias de aminoacido de anticorpos ou moleculas de imunoglobulina sao considerados como sendo abrangidos pela presente inver^So, contanto que as varia9oes na sequencia de aminoacido mantenham pelo menos 75 %, mais preferivelmente pelo menos 80 %, 90 %, 95 % e ο mais preferivelmente 99 % de identidade de sequencia aos anticorpos ou moleculas de imunoglobulina aqui descritas. Em particular, a substituifao de aminoacido conservativas sao consideradas. As substitui^oes conservativas sao aquelas que ocorrem dentro de uma familia de aminoacidos que tem cadeias laterals relacionadas. Os aminoacidos geneticamente codificados sao no geral divididos nas familias: (1) acida 二 aspartato, glutamato; (2) basica = lisina, arginina, histidina; (3) nao polar = alanina, valina, leucina，isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; e (4) polar nao carregada == glicina, asparagina，glutamina, cisteina, senna, treonina, tirosina. Mais preferido as familias sao: serina e treonina sao uma familia alifatica-hidroxilica; asparagina e glutamina sao uma familia contendo amida; alanina, valina, leucina e isoleucina sao uma familia alifatica; e fenilalanina, triptofano e tirosina sao uma familia aromatica. Por exemplo’ e razoavel esperar que uma substitui9ao isolada de uma leucina com uma isoleucina ou valina, um aspartate» com um glutamato, uma treonina com uma serina ou uma substitui9§io similar de um aminoacido com um aminoacido estruturalmente relacionado nao tera um efeito maior na fUn^So de liga^ao ou propriedades da molecula resultante, especialmente se a substitui9ao nao envoive um aminoacido dentro de um sitio de matriz. Se uma mudanfa de aminoacido resulta em um peptideo funcional pode ser facilmente determinada ensaiando-se a atividade especifica do derivado de polipeptideo. Os ensaios sao descritos aqui em detalhes. Fragmentos ou analogos de anticorpos ou moleculas de imunoglobulina podem ser facilmente preparados por aqueles de habilidade comum na tecnica. Os terminals amino e carboxi preferidos de fragmentos ou analogos ocorrem proximo dos limites de dominios funcionais. Os dominios estruturais e funcionais podem ser identificados pela comparafao dos dados da sequencia de nucleotideo e/ou aminoacido com sequencia das bases de dados publicas ou patenteadas. Preferivelmente, os metodos de comparafao computadorizados sao usados para identificar motivos de sequencia ou dominios de conforma9ao de proteina prognosticados que ocorrem em outras proteinas de estrutura e/ou fungao conhecidas. Metodos para identificar sequencias de proteina que dobram em uma estrutura tri-dimensional conhecida sao conhecidos. Bowie et al., Science 253: 164 (1991). Assim, os exemplos precedentes demonstram que aqueles de habilidade na tecnica podem reconhecer motivos de sequencia e conforma9oes estruturais que podem ser usadas para definir dominios estruturais e funcionais de acordo com os anticorpos aqui descritos. Um sitio de IigagSo de antigeno e no geral formado pelos dominios de imunoglobulina de variavel pesada (VH) e variavel Ieve (VL), com a interface antigeno-liga9ao formada pelas seis al?as de polipeptideo da superficie, chamadas de regides determinadoras de complementaridade (CDRs).

Existem tres CDRs em cada VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3) e em cada VL (LCDR1, LCDR2, LCDR3), junto com regi5es de matriz (FRs).

Tipicamente, um dominio VH e emparelhado com um dominio VL para fornecer um sitio de liga9ao de antigeno de anticorpo, embora um dominio VH ou VL sozinho possa ser usado para ligar antigeno. O dominio VH (ver Tabela 4) pode ser emparelhado com ο dominio VL (ver Tabela 5), de modo que um sitio de ligafao de antigeno de anticorpo seja formado que compreende tanto os dominios de VH quanto de VL. Formas de realiza9ao analogas sao fornecidas para os outros dominios VH e VL aqui divulgados. Em outras formas de realiza^ao，as cadeias VH na Tabela 4 sao emparelhadas com um dominio VL heterologo na Tabela 5. A promiscuidade da cadeia Ieve e bem estabelecida na tecnica. Mais uma vez, formas de realizafao analogas sao fornecidas pela ΐηνεηςδο para os outros dominios VH e VL aqui divulgados. Assim, ο VH do precursor ou de qualquer uma das cadeias de anticorpo na Tabela 4 podem ser emparelhadas com a VL do precursor ou de qualquer um dos anticorpos na Tabela 5 ou outro anticorpo.

Um sitio de liga?So de antigeno. pode compreender um conjunto de CDRs H e/ou L do anticorpo precursor ou qualquer um dos anticorpos na Tabela 1 tanto quanto vinte, dezesseis, dez, nove ou menos, por exemplo uma, duas, tres, quatro ou cinco，adigdes, substitui?5es, dele?5es e/ou inser9oes de aminoacido dentro do conjunto divulgado de CDRs H e/ou L. Alternativamente, um sitio de liga?ao de antigeno. pode compreender um conjunto de CDRs H e/ou L do anticorpo precursor ou qualquer um dos anticorpos da Tabela 1 tanto quanto vinte, dezesseis, dez, nove ou menos, por exemplo uma, duas, três, quatro ou cinco, substituições de aminoácido dentro do conjunto divulgado de CDRs H e/ou L. Tais modificações podem ser potencialmente feitas em qualquer resíduo dentro do conjunto de CDRs.

As substituições de aminoácido preferidas são aquelas que: (1) reduzem a suscetibilidade para a proteólise, (2) reduzem a suscetibilidade para a oxidação, (3) alteram a afinidade de ligação para formar complexos de proteína, (4) alteram as afinidades de ligação e (4) conferem ou modificam outras propriedades físico-químicas ou funcionais de tais análogos. Os análogos podem incluir várias muteínas de uma seqüência outra que não a seqüência de peptídeo que ocorrem naturalmente. Por exemplo, substituições de aminoácido únicas ou múltiplas (preferivelmente substituições de aminoácido conservativas) podem ser feitas na seqüência que ocorre naturalmente (preferivelmente na porção do polipeptídeo fora do(s) domínio(s) que formam contatos intermoleculares. Uma substituição de aminoácido conservativa não deve mudar substancialmente as características estruturais da seqüência precursora (por exemplo, um aminoácido de substituição não deve tender a quebrar uma hélice que ocorra na seqüência precursora ou romper outros tipos de estrutura secundária que caracteriza a seqüência precursora). Os exemplos de estruturas secundárias e terciárias de polipeptídeo reconhecidas na técnica são descritas em Proteins, Structures and Molecular Principies (Croitoon, Ed., W. H. Freeman and Company, Nova Iorque (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden e J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nova Iorque, N.Y. (1991)); e Thornton et al., Nature 354: 105 (1991), que são cada uma aqui incorporada por referência.

Um aspecto adicional da invenção é uma molécula de anticorpo que compreende um domínio VH que tem pelo menos cerca de 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 ou cerca de 99 % de identidade de seqüência de aminoácido com um domínio VH de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1, na listagem de seqüência anexa, um anticorpo aqui descrito ou com uma HCDR (por exemplo, HCDRl, HCDR2 ou HCDR3) mostrada na Tabela 4 ou Tabela 4(a). A molécula de anticorpo também pode opcionalmente compreender um domínio VL que tenha pelo menos cerca de 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 ou cerca de 99 % de identidade de seqüência de aminoácido com um domínio VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1, na listagem de seqüência anexa, um anticorpo aqui descrito ou com uma LCDR (por exemplo, LCDRl, LCDR2 ou LCDR3) mostrada na Tabela 5. Algoritmos que podem ser usados para calcular a % de identidade de duas seqüências de aminoácido compreendem por exemplo BLAST (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 405-410), FASTA (Pearson e Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448) ou o algoritmo de Smith-Waterman (Smith e Waterman (1981) J. Mol Biol. 147: 195-197), por exemplo utilizando parâmetros de default.

Além disso, variantes dos domínios de VH e VL e CDRs da

presente invenção, incluindo aqueles para as quais as seqüências de aminoácido são aqui apresentadas e que podem ser utilizadas em agentes de ligação alvejados e anticorpos para ERBB2 podem ser obtidos por meio de métodos de alteração ou mutação de seqüência e triagem quanto ao alvejamento de antígeno com as características desejadas. Os exemplos de características desejadas incluem mas não são limitados a: afinidade de ligação aumentada para o antígeno em relação aos anticorpos conhecidos que são específicos para o antígeno; neutralização aumentada de uma atividade de antígeno em relação a anticorpos conhecidos que são específicos para o antígeno se a atividade é conhecida; capacidade competitiva especificada com um anticorpo ou ligando conhecidos pelo antígeno em uma razão molar específica; capacidade para imunoprecipitar complexo; capacidade para se ligar a um epítopo especificado; epítopo linear, por exemplo seqüência de peptídeo identificada usando a varredura de ligação de peptídeo como aqui descrito, por exemplo usando peptídeos triados na conformação linear e/ou constrangida; epítopo conformacional, formado pelos resíduos não contínuos; capacidade para modular uma nova atividade biológica de ERBb2 ou molécula a jusante. Tais métodos também são aqui fornecidos.

As variantes de moléculas de anticorpo aqui divulgadas podem

ser produzidas e usadas na presente invenção. Seguindo a conduta da química computacional na aplicação de técnicas de análise de dados multivariadas às relações de estrutura/propriedade-atividade (Wold, et al. Multivariate data analysis in chemistry. Chemometrics -Mathematics and Statistics in Chemistry (Ed.: B. Kowalski), D. Reidel Publishing Company, Dordrecht, Holanda, 1984) as relações de atividada quantitativa-propriedade de anticorpos podem ser derivadas usando técnicas matemáticas bem conhecidas, tais como a regressão estatística, reconhecimento e classificação de padrão (Norman et al. Applied Regression Analysis. Wiley-Interscience; 3a edição (Abril 1998); Kandel, Abraham & Backer, Eric. Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis. Prentice Hall PTR, (11 de maio de 1995); Krzanowski, Wojtek. Principies of Multivariate Analysis: A User's Perspective (Oxford Statistical Science Series, No 22 (Paper)). Oxford University Press; (Dezembro de 2000); Witten, Ian H. & Frank, Eibe. Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations. Morgan Kaufmann; (11 de outubro de 1999); Denison David G. T. (Editor), Christopher C. Holmes, Bani K. Mallick, Adrian F. M. Smith. Bayesian Methods for Nonlinear Classification and Regression (Wiley Series in Probability and Statistics). John Wiley & Sons; (Julho de 2002); Ghose, Arup K. & Viswanadhan, Vellarkad N. Combinatorial Library Design and Evaluation Principies, Software, Tools and Applications in Drug Discovery). As propriedades de anticorpos podem ser derivadas a partir de modelos empíricos e teóricos (por exemplo, análise de resíduos de contato prováveis ou propriedades físico-químicas calculadas) de seqüência de anticorpo, estruturas funcionais e tridimensionais e estas propriedades podem ser consideradas isoladamente e em combinação.

Este estudo das relações de sequência-estrutura pode ser usado para o prognóstico destes resíduos em um anticorpo de seqüência conhecida, mas de uma estrutura tridimensional desconhecida, que são importantes em manter a estrutura tridimensional das suas alças de CDR e por este motivo manter a especificidade de ligação. Estes prognósticos podem ser auxiliados pela comparação dos prognósticos para a produção de experimentos de otimização precedentes. Em um método estrutural, um modelo pode ser criado da molécula de anticorpo usando qualquer pacote gratuitamente disponível ou comercial, tal como WAM. Um pacote de software de visualização e análise de proteína, tal como Insight II (Accelrys, Inc.) cm Deep View podem ser depois usados para avaliar substituições possíveis em cada posição na CDR. Esta informação pode ser depois usada para fazer substituições provavelmente para ter um efeito mínimo ou benéfico sobre a atividade.

As técnicas requeridas para realizar substituições dentro das seqüências de aminoácido de CDRs, domínios VH ou VL de anticorpo e/ou agentes de ligação alvejados no geral são disponíveis na técnica. Seqüências variantes podem ser feitas, com substituições que podem ser ou não prognosticadas para ter um efeito mínimo ou benéfico sobre a atividade e testado quanto a capacidade para ligar e/ou neutralizar um alvo e/ou para qualquer outra propriedade desejada.

As variantes de seqüência de aminoácido de domínio variável de qualquer um dos domínios de VH e VL cujas seqüências são especificamente aqui divulgadas podem ser utilizadas de acordo com a presente invenção, como debatido.

Como aqui usado, os termos "rótulo" ou "rotulada" referem-se à incorporação de uma outra molécula no anticorpo ou agente de ligação alvejados. Em uma forma de realização, o rótulo é um marcador detectável, por exemplo, a incorporação de um aminoácido radiorrotulado ou ligação a um polipeptídeo de porções de biotinila que pode ser detectado pela avidina marcada (por exemplo, estreptavidina contendo um marcador fluorescente ou atividade enzimática que pode ser detectado pelos métodos ópticos ou colorimétricos). Em uma outra forma de realização, o rótulo ou marcador podem ser terapêuticos, por exemplo, um conjugado de medicamento ou toxina. Vários métodos de rotular polipeptídeos e glicoproteínas são conhecidos na técnica e podem ser usados. Os exemplos de rótulos para polipeptídeos incluem, mas não são limitados aos seguintes: radioisótopos ou radionuclídeos (por exemplo, 3H, 14C, 15N, 32P, 33P, 35S, 90Y, 99Tc, lllln, 1251, 1311), rótulos fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, lantanídeo fosforoso), rótulos enzimáticos (por exemplo, rábano peroxidase, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), marcadores quimioluminescentes, grupos de biotinila, epítopos de polipeptídeo pré determinados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, seqüências de par de zíper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, rótulos de epítopo), agentes magnéticos, tais como quelatos de gadolínio, toxinas tais como toxina da coqueluche, taxol, citochalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, diidróxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glicocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol e puromicina e análogos ou homólogos destes. Em algumas formas de realização, rótulos são ligados pelos ramos espaçadores de vários comprimentos para reduzir o impedimento estérico potencial.

Como aqui usado, um "agente de ligação alvejado" é um agente, por exemplo anticorpo ou fragmento de ligação deste, que preferencialmente se liga a um sítio alvo. Em uma forma de realização, o agente de ligação alvejado é específico apenas para um sítio alvo. Em outras formas de realização, o agente de ligação alvejado é específico para mais do que um sítio alvo. Em uma forma de realização, o agente de ligação alvejado pode ser um anticorpo monoclonal e o sítio alvo pode ser um epítopo. Como descrito abaixo, um agente de ligação alvejado pode compreender pelo menos um domínio de ligação de antígeno. de um anticorpo, em que o dito domínio é fundido ou contido dentro de uma armação de proteína heteróloga, por exemplo uma armação de proteína que não anticorpo. Por todo este relatório descritivo e reivindicações, a palavra

"compreender," ou variações tais como "compreende" ou "que compreende," serão entendidos implicar a inclusão de um inteiro estabelecido ou grupo de inteiros mas não a exclusão de nenhum outro inteiro ou grupo de inteiros.

Anticorpos anti-ErbB2 humanos e Caracterização Destes Em uma forma de realização, a invenção fornece agente de

ligação alvejado anti-ErbB2. Em uma outra forma de realização, a invenção fornece anticorpos anti-ErbB2. Em algumas formas de realização, os anticorpos anti-ErbB2 são anticorpos humanos. Em algumas formas de realização, a invenção fornece anticorpos anti-ErbB2 que se ligam a ErbB2 humano sem a seqüência de sinal, aminoácidos 1-22 (Genbank ID: P04626) (SEQ ID NO: 45). Em algumas formas de realização, anticorpos anti-ErbB2 humanos são produzidos pela imunização de um animal transgênico não humano, por exemplo, um roedor, cujo genoma compreende genes da imunoglobulina humana de modo que o animal transgênico produza anticorpos humanos.

Um anticorpo anti-ErbB2 da invenção pode compreender uma cadeia leve capa humana ou uma lambda humana ou uma seqüência de aminoácido derivada destas. Em algumas formas de realização que compreendem uma cadeia leve capa, o domínio variável de cadeia leve (VL) é codificado em parte por um gene da família VK1, VK2 ou VK4 humana. Em certas formas de realização, a cadeia leve utiliza um gene VK Al, VK A2, VK B3 ou VK Ll humano.

Em várias formas de realização, o domínio variável de cadeia leve utiliza um gene A2 humano e um gene JKl humano; um gene Ll humano e um gene JK5 humano; um gene B3 humano e um gene JK3 humano; ou um gene Al humano e um gene JK4 humano.

Em algumas formas de realização, o VL do anticorpo ErbB2 compreende uma ou mais substituições de aminoácido em relação à seqüência de aminoácido da linha germinativa do gene humano. Em algumas formas de realização, o VL do anticorpo anti-ErbB2 compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 substituições de aminoácido em relação à seqüência de aminoácido da linha germinativa. Em algumas formas de realização, o VL do anticorpo anti-ErbB2 compreende 0, 1 ou 2 inserções de aminoácido em relação à seqüência de aminoácido da linha germinativa. Em algumas formas de realização, uma ou mais destas substituições da linha germinativa está nas Regiões de CDR da cadeia leve. Em algumas formas de realização, as substituições de aminoácido em relação a linha germinativa estão em uma ou mais das mesmas posições como as substituições em relação à linha germinativa em qualquer um ou mais dos anticorpos de VL 1.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.31.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.3. Por exemplo, o VL de um anticorpo anti-ErbB2 da invenção pode conter uma ou mais substituições de aminoácido comparadas com a linha germinativa encontrada no VL do anticorpo 1.14 ou pode haver uma ou mais das substituições de aminoácido comparadas com a linha germinativa encontrada no VL do anticorpo 1.18. Em algumas formas de realização, as mudanças de aminoácido estão em uma ou mais das mesmas posições, mas envolvem uma substituição diferente do que no anticorpo de referência. Em algumas formas de realização, as mudanças de aminoácido em relação à linha germinativa ocorrem em uma ou mais das mesmas posições como em qualquer um dos anticorpos de VL 1.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.31.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.3, mas as mudanças podem representar substituições de aminoácido conservativas em tal(is) posição(ões) em relação ao aminoácido no anticorpo de referência. Por exemplo, se uma posição particular em um destes anticorpos é mudada em relação à linha germinativa e é glutamato, pode-se substituir aspartato naquela posição. Similarmente, se uma substituição de aminoácido comparada com a linha germinativa é serina, pode-se substituir conservativamente a treonina no lugar da serina naquela posição. As substituições conservativas de aminoácido são debatidas acima.

Em algumas formas de realização, a cadeia leve do anticorpo anti-ErbB2 humano compreende a seqüência de aminoácido de VL do anticorpo 1.44.1 (SEQ ID NO: 4), 1.140 (SEQ ID NO: 8), 1.43.1 (SEQ ID NO: 12), 1.14.1 (SEQ ID NO: 16), 1.100.1 (SEQ ID NO: 20), 1.96.2 (SEQ ID NO: 24), 1.18.1 (SEQ ID NO: 28), 1.20.1 (SEQ ID NO: 32), 1.39.1 (SEQ ID NO: 36), 1.24.3 (SEQ ID NO: 40), 1.71.3 (SEQ ID NO: 44) ou a dita seqüência de aminoácido tendo até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 substituições de aminoácido conservativas e/ou um total de até 3 substituições de aminoácido não conservativas.

Em certas formas de realização, a cadeia leve do anticorpo anti-ErbB2 compreende as regiões de CDRl, CDR2 e CDR3 da cadeia leve de um anticorpo que compreendem a seqüência de aminoácido da região VL de um anticorpo selecionado dos anticorpos 1.44.1 (SEQ ID NO: 4), 1.140 (SEQ ID NO: 8), 1.43.1 (SEQ ID NO: 12), 1.14.1 (SEQ ID NO: 16), 1.100.1 (SEQ ID NO: 20), 1.96.2 (SEQ ID NO: 24), 1.18.1 (SEQ ID NO: 28), 1.20.1 (SEQ ID NO: 32), 1.39.1 (SEQ ID NO: 36), 1.24.3 (SEQ ID NO: 40), 1.71.3 (SEQ ID NO: 44) ou as ditas regiões de CDR cada uma tendo menos do que 4 ou menos do que 3 substituições de aminoácido conservativas e/ou um total de três ou menos substituições de aminoácido não conservativas.

Com respeito à cadeia pesada, em algumas formas de realização, o domínio variável (VH) é codificado em parte por um gene das famílias VH3 ou VH4 humanas. Em certas formas de realização, o VH de cadeia pesada utiliza um gene VH3-21, VH3-13, VH4-31 ou VH3-7 humano. Em várias formas de realização, o VH de cadeia pesada utiliza um gene VH3- 21 humano, um gene D5-24 humano e um gene JH4B humano. Em outras formas de realização, a cadeia pesada VH utiliza um gene VH3-7 humano e um JH6 humano; um gene VH4-31 humano, um gene D3-10 humano e um gene JH6B humano; ou um gene VH3-13 humano, um gene D6-19 humano e um gene JH6B humano. Em algumas formas de realização, a seqüência de VH do anticorpo anti-ErbB2 contém uma ou mais substituições, deleções ou inserções (adições) de aminoácido em relação à seqüência de aminoácido da linha germinativa.

Em algumas formas de realização, o domínio variável da cadeia pesada compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 mutações da seqüência de aminoácido da linha germinativa; 0, 1, 2 ou 3 das quais podem ser substituições. Em algumas formas de realização, o domínio variável da cadeia pesada compreende 0, 1, 2 ou 3 adições comparadas com a seqüência de aminoácido da linha germinativa. Em algumas formas de realização, a(s) mutação(ões) são substituições não conservativas comparadas com a seqüência de aminoácido da linha germinativa. Em algumas formas de realização, as mutações estão nas regiões de CDR da cadeia pesada. Em algumas formas de realização, as mudanças de aminoácido são feitas em uma ou mais das mesmas posições como as mutações da linha germinativa em qualquer um ou mais dos anticorpos de VH 1.14.1, 1.18.1, 1.19, 1.20rl, 1.22.1, 1.22.2, 1.24.3, 1.41, 1.43.1, 143.2, 1.44.1, 1.39.1, 1.71.1, 1.71.3, 1.96.2, 1.99, 1.100.1, 1.104, 1.107, 1.124, 1.128, 1.140.1 ou 1.148. Emoutras formas de realização, as mudanças de aminoácido estão em uma ou mais das mesmas posições mas envolvem uma mutação diferente do que no anticorpo de referência.

Em algumas formas de realização, a cadeia pesada

compreende a seqüência de aminoácido de VH de anticorpo 1.44.1 (SEQ ID NO: 2), 1.140.1 (SEQ ID NO: 6), 1.43.1 (SEQ ID NO: 10), 1.14.1 (SEQ ID NO: 14), 1.100.1 (SEQ ID NO: 18), 1.96.2 (SEQ ID NO: 22), 1.18.1 (SEQ ID NO: 26), 1.20.1 (SEQ ID NO: 30), 1.39.1 (SEQ ID NO: 34), 1.24.3 (SEQ ID NO: 38), 1.71.3 (SEQ ID NO: 42); ou a dita seqüência de aminoácido de VH tendo até 1, 2, 3, 4, 6, 8 ou 10 substituições de aminoácido conservativas e/ou um total de até 3 substituições de aminoácido não conservativas.

Em algumas formas de realização, a cadeia pesada compreende a regiões de anticorpo CDRl, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada 1.14.1, 1.18.1, 1.19, 1.20.1, 1.22.1, 1.22.2, 1.24.3, 1.41, 1.43.1, 143.2, 1.44.1, 1.39.1, 1.71.1, 1.71.3, 1.96.2, 1.99, 1.100.1, 1.104, 1.107, 1.124, 1.128, 1.140.1 ou 1.148 ou as ditas regiões de CDR cada uma tendo menos do que 5, menos do que 4, menos do que 3 ou menos do que 2 substituições de aminoácido conservativas e/ou um total of três ou menos substituições de aminoácido não conservativas.

Em uma outra forma de realização, o anticorpo compreende a cadeia leve como divulgada acima e uma cadeia pesada como divulgada acima. Em um outra forma de realização, as CDRs de cadeia leve e as CDRs de cadeia pesada são do mesmo anticorpo. Um tipo de substituição de aminoácido que pode ser feita é

mudar uma ou mais cisteínas no anticorpo, que pode ser quimicamente reativa, por um outro resíduo, tal como, sem limitação, alanina ou serina. Em uma forma de realização, existe uma substituição de uma cisteína não canônica. A substituição pode ser feita em uma CDR ou região de matriz de um domínio variável ou no domínio constante de um anticorpo. Em algumas formas de realização, a cisteína é canônica.

Um outro tipo de substituição de aminoácido que pode ser feita é mudar quaisquer sítios proteolíticos potenciais no anticorpo. Tais sítios podem ocorrer em uma CDR ou região de matriz de um domínio variável ou no domínio constante de um anticorpo. A substituição de resíduos de cisteína e a remoção de sítios proteolíticos pode diminuir o risco de qualquer heterogeneidade no produto de anticorpo e assim aumentar a sua homogeneidade. Um outro tipo de substituição de aminoácido é eliminar os pares de asparagina-glicina, que formam sítios de desamidação potenciais, pela alteração de um ou ambos dos resíduos. Ainda um outro tipo de substituição de aminoácido está nos resíduos de metionina para eliminar sítios de oxidação.

Em algumas formas de realização, a lisina de terminal C da cadeia pesada do anticorpo anti ErbB2 da invenção é clivada. Em várias formas de realização da invenção, as cadeias pesada e leve dos anticorpos anti-ErbB2 podem opcionalmente incluir uma seqüência de sinal.

Em um aspecto, a invenção diz respeito aos anticorpos monoclonais anti-ErbB2 humanos inibidores e as linhagens de célula de hibridoma que os produzem. A Tabela 1 lista os identificadores de seqüência (SEQ ID NO: ) dos ácidos nucléicos que codificam o domínio variável das cadeias pesada e leve e as seqüências de aminoácido deduzidas correspondentes. TABELA 1

ANTICORPOS ANTI-ErbB2 HUMANOS Anticorpo Monoclonal IDENTIFICADOR DE SEQÜÊNCIA (SEQ ID NO:) Porção Que Compreende O Domínio Variável PESADA LEVE DNA Proteína DNA Proteína 1.44.1 1 2 3 4 1.140 5 6 7 8 1.43 9 10 11 12 1.14.1 13 14 15 16 1.100.1 17 18 19 20 1.96 21 22 23 24 1.18.1 25 26 27 28 1.20 29 30 31 32 1.39 33 34 35 36 1.24 37 38 39 40 1.71.3 41 42 43 44

Classe e Subclasse de Anticorpos anti-ErbB2

A classe e subclasse de anticorpos anti-ErbB2 podem ser determinadas por qualquer método conhecido na técnica. No geral, a classe e subclasse de um anticorpo podem ser determinadas usando anticorpos que são específicos para uma classe e subclasse de anticorpo particulares. Tais anticorpos são comercialmente disponíveis. A classe e subclasse podem ser determinadas pelo ELISA ou Western Blot assim como outras técnicas. Alternativamente, a classe e subclasse podem ser determinadas pelo sequenciamento de toda ou uma porção dos domínios constantes das cadeias pesada e/ou leve dos anticorpos, comparando as suas seqüências de aminoácido com as seqüências de aminoácido conhecidas de várias classes e subclasses de imunoglobulinas e determinando a classe e subclasse dos anticorpos.

Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-ErbB2 é um anticorpo monoclonal. O anticorpo anti-ErbB2 pode ser uma molécula IgG, uma IgM, uma IgE, uma IgA ou uma IgD. Em uma outra forma de realização, o anticorpo anti-ErbB2 é uma IgG e é uma subclasse IgGl, IgG2, IgG3, IgG4. Em uma outra forma de realização preferida, o anticorpo é da subclasse IgG2 (ver Kabat et ai, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edn. US Department of Health and Human Services, Washington, DC).

Afinidade de Ligação de Agentes de Ligação Alvejada Anti- ErbB2 e Anticorpos para ErbB2

Em algumas formas de realização da invenção, agentes de ligação alvejados e/ou anticorpos anti-ErbB2 se ligam a ErbB2 com alta afinidade. Em algumas formas de realização, o agente de ligação alvejado e/ou anticorpo anti-ErbB2 se ligam a ErbB2 com um Kd de 13,5 1,0"9 M ou menos usando a análise biocore de alta resolução. Ainda em outras formas de realização, o agente de ligação alvejado e/ou anticorpo se ligam a ErbB2 com um Kd de 13. χ IO"9 Μ, 13. χ IO"9 M , 11.x IO"9 Μ, 12. χ IO"9 Μ, 10. χ IO"9 Μ, 5. χ IO"9 Μ, 3 χ IO"9, 2 χ IO"9, 1 χ IO"9 M ou 5 χ IO"10 M ou menos usando análise biocore de alta resolução . Em certas formas de realização, o agente de ligação alvejado e/ou anticorpo se liga a ErbB2 substancialmente com o mesmo Kp como um anticorpo selecionados de 1.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.31.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.3. Ainda em uma outra forma de realização preferida, o agente de ligação alvejado e/ou anticorpo se liga a ErbB2 com substancialmente o mesmo Kd como um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia pesada tendo a seqüência de aminoácido da região Vh encontrada na SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38 ou 42, um domínio variável de cadeia leve tendo a seqüência de aminoácido da região Vl encontrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 ou ambas. Em uma outra forma de realização preferida, o anticorpo se liga a ErbB2 substancialmente com o mesmo Kd como um agente de ligação alvejado e/ou um anticorpo que compreende as regiões de CDR de um domínio variável de cadeia leve tendo a seqüência de aminoácido da região Vl encontrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 ou que compreende as regiões de CDR de um domínio variável de cadeia pesada tendo a seqüência de aminoácido da região Vh encontrada na SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38 ou 42 ou ambas.

Em algumas formas de realização, o agente de ligação alvejado e/ou anticorpo anti-ErbB2 tem uma constante de taxa de dissociação baixa (Icoff) Em algumas formas de realização, o agente de ligação alvejados e/ou anticorpo anti-ErbB2 têm um Icoff de 1,0 χ IO"3 s"1 ou mais baixo ou um koffde 5,0 χ IO"4 s"1 ou mais baixo. Em outras formas de realização preferidas, o anticorpo se liga a ErbB2 com um Icoff de 2 χ IO"4 s"1 ou mais baixo. Em algumas formas de realização, o Icoff é substancialmente o mesmo como um anticorpo aqui descrito, incluindo um anticorpo selecionado de 1.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.31.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.3. Em algumas formas de realização, o agente de ligação alvejado e/ou anticorpo se ligam a ErbB2 com substancialmente o mesmo Icoff como um anticorpo que compreende as regiões de CDR de uma cadeia pesada ou as regiões de CDR de uma cadeia leve de um anticorpo selecionado de 1,44,1, 1,140, 1,43, 1,14,1, 1,100,1, 1,96. 1,18,1, 1,20, 1,39, 1,24 e 1,71,31.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.3 ou ambos. Em algumas formas de realização, os agentes de ligação alvejados e/ou anticorpo se ligam a ErbB2 com substancialmente o mesmo Ieoff como um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia pesada tendo a seqüência de aminoácido da região Vh encontrada na SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38 ou 42, um domínio variável de cadeia leve tendo a seqüência de aminoácido da região encontrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 ou ambos.

A afinidade de ligação e a taxa de dissociação de um agente de ligação alvejado e um anticorpo anti-ErbB2 ao ErbB2 podem ser determinadas pelos métodos conhecidos na técnica. A afinidade de ligação pode ser medida pelos ELISAs, RIAs, citometria de fluxo, ressonância de plasma de superfície, tais como BIACORE®. A taxa dissociada pode ser medida pela ressonância de plasma de superfície. Preferivelmente, a afinidade de ligação e a taxa de dissociação são medidas pela ressonância de plasma de superfície. Mais preferivelmente, a afinidade de ligação e a taxa de dissociação são medidas usando BIACORE®. Pode-se determinar se um anticorpo tem substancialmente o mesmo Kd como um anticorpo anti-ErbB2 pelo uso de métodos conhecidos na técnica. O Exemplo 12 exemplifica um método para determinar as constantes de afinidade de anticorpos monoclonais anti-ErbB2 pela citometria de fluxo.

Identificação de Epítopos de ErbB2 Reconhecidos pelos Anticorpos anti-ErbB2

A invenção fornece agentes de ligação alvejados e/ou anticorpos monoclonais anti-ErbB2 humanos que se ligam a ErbB2 e competem ou competem com e/ou ligam o mesmo epítopo como: (a) um anticorpo selecionado de 1.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.31.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.3; (b) um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia pesada tendo uma seqüência de aminoácido do domínio variável encontrado na SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38 ou 42, (c) um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia leve tendo uma seqüência de aminoácido do domínio variável da SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 ou (d) um anticorpo que compreende tanto um domínio variável de cadeia pesada como definido em (b) quanto um domínio variável de cadeia leve como definido em (c). Se dois anticorpos reciprocamente competem entre si quanto a ligação a ErbB2, estes são ditos competir.

Pode-se determinar se um agente de ligação alvejado e/ou um anticorpo se ligam ao mesmo epítopo ou competem quanto a ligação com um anticorpo anti-ErbB2 usando-se métodos conhecidos na técnica. Em uma forma de realização, pode-se permitir que o anticorpo anti-ErbB2 da invenção se ligue a ErbB2 sob condições de saturação e depois mede-se a capacidade do anticorpo de teste para se ligar a ErbB2. Se o anticorpo de teste é capaz de se ligar a ErbB2 ao mesmo tempo como o anticorpo anti-ErbB2, então o anticorpo de teste se liga a um epítopo diferente como o anticorpo anti-ErbB2. Entretanto, se o anticorpo de teste não é capaz de se ligar a ErbB2 ao mesmo tempo, então o anticorpo de teste se liga ao mesmo epítopo, um epítopo de sobreposição ou um epítopo que está em proximidade imediata ao epítopo ligado pelo anticorpo anti-ErbB2 humano. Este experimento pode ser realizado usando ELISA, RIA, BIACORE® ou citometria de fluxo.

Para testar se um agente de ligação alvejado e/ou um anticorpo anti-ErbB2 compete com um outro anticorpo anti-ErbB2, pode-se usar o método de competição descrito acima em duas direções isto é determinando se o anticorpo de referência bloqueia o anticorpo de teste e vice versa. Em uma outra forma de realização, o experimento é realizado usando ELISA. Métodos de determinar Kd são debatidos mais abaixo.

Inibicão da Atividade de ErbB2 pelo Anticorpo Anti-ErbB2

Em várias formas de realização, a invenção fornece agentes de ligação alvejados e/ou anticorpos anti-ErbB2 que inibem a sinalização por intermédio de ErbB2. Em uma forma de realização, o agente de ligação alvejado e/ou um anticorpo anti-ErbB2 inibe a sinalização induzida por ligando de ErbB2. Em uma forma de realização, o agente de ligação alvejado e/ou um anticorpo anti-ErbB2 inibe a sinalização induzida por ligando de ErbB2 sem bloquear a ligação do ligando ao ErbB2. Em uma outra forma de realização, o ErbB2 é humano. Em uma outra forma de realização, o anticorpo anti-ErbB2 é um anticorpo humano. Em algumas formas de realização o ligando é Heregulina-β. A EC50 do agente de ligação alvejado e/ou anticorpo anti-ErbB2 pode ser medida detectando-se a ligação do anticorpo ao antígeno. Em um ensaio de ligação direta monitorado pelo ELISA ou RIA ou por intermédio de ensaios com base em célula tal como aqueles descritos abaixo. Em uma forma de realização, o agente de ligação alvejado e/ou anticorpo ou porção deste inibem a sinalização induzida por ligando por intermédio do receptor de ErbB2 com uma EC50 de não mais do que 50 ng/ml, preferivelmente não mais do que 25 ng/ml, mais preferivelmente não mais do que 10 ng/ml, ainda mais preferivelmente não mais do que 5 ng/ml. Em algumas formas de realização, o agente de ligação alvejado e/ou anticorpo anti-ErbB2 inibem a sinalização induzida por ligando de ErbB2 em pelo menos 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 100 %. A medição da inibição pode ser realizada por qualquer meio conhecido na técnica.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece um agente de ligação alvejado e/ou um anticorpo anti-ErbB2 que inibe a fosforilação de ErbB2. Em várias formas de realização, a EC50 do agente de ligação alvejado e/ou anticorpo não é maior do que 50 ng/ml, preferivelmente não mais do que 25 ng/ml, mais preferivelmente não mais do que 10 ng/ml, ainda mais preferivelmente não mais do que 5 ng/ml. Em algumas formas de realização, os agentes de ligação alvejados e/ou anticorpo anti-ErbB2 inibem a fosforilação de ErbB2 em pelo menos 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 100 %. Os exemplos 4, 9 e 11 exemplificam um ensaio de fosforilação de ErbB2.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece um agente de ligação alvejado e/ou um anticorpo anti-ErbB2 que inibem a ativação do caminho MAPK. Em várias formas de realização, o EC50 do agente de ligação alvejado e/ou anticorpo não é maior do que 50 ng/ml, preferivelmente não mais do que 25 ng/ml, mais preferivelmente não mais do que 10 ng/ml, ainda mais preferivelmente não mais do que 5 ng/ml. Em algumas formas de realização, o agente de ligação alvejado e/ou anticorpo anti-ErbB2 inibem a fosforilação de ErbB2 em pelo menos 20 %, 25 %, 30 %, %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 100 %. Ensaios para monitorar a ativação do caminho de MAPK em uma célula são conhecidos na técnica (ver os Pedidos de Patente U.S. N— 20030186382 e 20030096333, aqui incorporados por referência em suas totalidades para todos os propósitos).

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece um agente de ligação alvejado e/ou um anticorpo anti-ErbB2 que modula a atividade do caminho de p38-TSP-l. Em algumas formas de realização, o agente de ligação alvejado e/ou anticorpo ativam o caminho de p38-TSP-l. Em outras formas de realização, o agente de ligação alvejado e/ou anticorpo inibem o caminho de p38-TSP-l. Em várias formas de realização, a EC5O do agente de ligação alvejado e/ou anticorpo não é maior do que 50 ng/ml, preferivelmente não mais do que 25 ng/ml, mais preferivelmente não mais do que 10 ng/ml, ainda mais preferivelmente não mais do que 5 ng/ml. Em algumas formas de realização, o agente de ligação alvejado e/ou anticorpo anti-ErbB2 inibem a fosforilação de ErbB2 em pelo menos 20 %, 25 %, 30 %, %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 100 %. Ensaios para monitorar a ativação do caminho de p38-TSP-l em uma célula são conhecidos na técnica (ver os Pedido de Patente U.S. N~ 20060089393 e 20020103253, aqui incorporados por referência em suas totalidades para todos os propósitos).

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece um agente de ligação alvejado e/ou um anticorpo anti-ErbB2 que inibem a ativação do caminho de P13K. Em várias formas de realização, a EC50 do agente de ligação alvejado e/ou anticorpo não é maior do que 50 ng/ml, preferivelmente não mais do que 25 ng/ml, mais preferivelmente não mais do que 10 ng/ml, ainda mais preferivelmente não mais do que 5 ng/ml. Em algumas formas de realização, o agente de ligação alvejado e/ou anticorpo anti-ErbB2 inibem a fosforilação de ErbB2 em pelo menos 20 %, 25 %, 30 %, %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 100 %. Ensaios para monitorar a ativação do caminho de PI3K em uma célula são conhecidos na técnica (ver Pedidos de Patente U.S. N21 20020037276 e 20040176385, aqui incorporados por referência em suas totalidades para todos os propósitos).

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece um agente de ligação alvejado e/ou um anticorpo anti-ErbB2 que inibe a inibição de CDC2. Em várias formas de realização, a EC50 do agente de ligação alvejado e/ou do anticorpo não é maior do que 50 ng/ml, preferivelmente não mais do que 25 ng/ml, mais preferivelmente não mais do que 10 ng/ml, ainda mais preferivelmente não mais do que 5 ng/ml. Em algumas formas de realização, o agente de ligação alvejado e/ou anticorpo anti-ErbB2 inibe a fosforilação de ErbB2 em pelo menos 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 100 %. Ensaios para monitorar a inibição de CDC2 em uma célula são conhecidos na técnica (ver os Pedidos de Patente U.S. Nas 20030225098 e 20040110775, aqui incorporados por referência em suas totalidades para todos os propósitos).

Inibição da Proliferação de Célula com Anticorpos anti-ErbB2

De acordo com algumas formas de realização, a invenção fornece um agente de ligação alvejado e/ou um anticorpo anti-ErbB2 que inibem a proliferação de células cancerosas ou transformadas in vivo ou in vitro ou ambos. Em uma outra forma de realização, o agente de ligação alvejado e/ou anticorpo anti-ErbB2 inibem a proliferação em pelo menos 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 100 %. Em uma forma de realização, a fosforilação é medida pelo menos 1 dia depois dos animais terem começado o tratamento com o anticorpo e a proliferação é medida 3 dias depois dos animais terem começado o tratamento com o anticorpo. Em uma outra forma de realização, a inibição é medida pelo menos um hora depois dos animais terem começado o tratamento com o anticorpo. Em várias formas de realização, a EC5O do agente de ligação alvejado e/ou anticorpo, como medida pelo título de célula ou um marcador de proliferação, não é maior do que 3,5 μg/ml, preferivelmente não mais do que 300 ng/ml, mais preferivelmente não mais do que 100 ng/ml, ainda mais preferivelmente não mais do que 50 ng/ml. Os exemplos 9 e 10 exemplificam os ensaios de proliferação.

Espécies e Seletividade Molecular

Em um outro aspecto da invenção, os agentes de ligação alvejados e/ou anticorpo anti-ErbB2s demonstram tanto seletividade de espécies quanto molecular. Em algumas formas de realização, o agente de ligação alvejado e/ou anticorpo anti-ErbB2 se ligam ao ErbB2 humano (SEQ ID NO: 45) e de cinomolgo. Seguindo as divulgações do relatório descritivo, pode-se determinar a seletividade de espécie para o agente de ligação alvejado e/ou anticorpo anti-ErbB2 usando métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, pode-se determinar a seletividade de espécie usando Western blot, citometria de fluxo, ELISA, imunoprecipitação ou RIA. Em uma outra forma de realização, pode-se determinar a seletividade de espécie usando citometria de fluxo.

Em algumas formas de realização, o agente de ligação alvejado e/ou anticorpo anti-ErbB2 não exibem nenhuma ligação específica apreciável a qualquer outra proteína outra que não ErbB2. Pode-se determinar a seletividade do agente de ligação alvejado e/ou anticorpo anti-ErbB2 para ErbB2 usando métodos bem conhecidos na técnica seguindo as divulgações do relatório descritivo. Por exemplo pode-se determinar a seletividade usando Western blot, citometria de fluxo, ELISA, imunoprecipitação ou RIA.

Métodos de Produzir Anticorpos e Linhagens de Célula que Produzem Anticorpo Em algumas formas de realização, os anticorpos humanos são produzidos pela imunização de um animal transgênico não humano que compreende dentro do seu genoma alguns ou todos os locais de cadeia pesada e cadeia leve da imunoglobulina humana com um antígeno de ErbB2. Em uma outra forma de realização, o animal não humano é um animal XENOMOUSE®. (Amgen Fremont, Inc., Fremont, CA).

Os camundongos XENOMOUSE® são cepas de camundongo engendradas que compreendem fragmentos grandes de locais de cadeia pesada e cadeia leve da imunoglobulina humana e são deficientes na produção de anticorpo de camundongo. Ver, por exemplo, Green et ah, Nature Genetics 7: 13-21 (1994) e Patentes U.S. 5.916.771, 5.939.598, 5.985.615, 5.998.209, 6.075.181, 6.091.001, 6.114.598, 6.130.364, 6.162.963 e 6.150.584. Ver também a WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096, WO 96/33735, WO 98/16654, WO 98/24893, WO 98/50433, WO 99/45031, WO 99/53049, WO 00/09560 e WO 00/037504.

Em um outro aspecto, a invenção fornece um método para fabricar anticorpos anti-ErbB2 a partir de animais não humanos, não camundongos pela imunização de animais transgênicos não humanos que compreendem locais da imunoglobulina humana com um antígeno de ErbB2. Pode-se produzir tais animais usando os métodos descritos nos documentos citados acima. Os métodos divulgados nestes documentos podem ser modificados como descrito na Patente U.S. 5.994.619, que é por meio deste incorporada por referência. A Patente U.S. 5.994.619 descreve métodos para produzir novas células e linhagens de células de massa de célula interna cultivada (CICM), derivada de porcos e vacas e as células CICM transgênicas nas quais DNA heterólogo foi inserido. As células CICM transgênicas podem ser usadas para produzir embriões, fetos e descendência transgênicos clonados. A patente 5.994.619 também descreve métodos de produzir animais transgênicos que são capazes de transmitir o DNA heterólogo à sua progênie. Em formas de realização preferidas da corrente invenção, os animais não humanos são mamíferos, particularmente ratos, ovelhas, porcos, cabras, gado ou cavalos.

Os camundongos XENOMOUSE® produzem um repertório de anticorpos totalmente humanos equivalente a adulto e gerar anticorpos humanos específicos antígenos. Em algumas formas de realização, os camundongos XENOMOUSE® contêm aproximadamente 80 % do repertório do gene V de anticorpo humano através da introdução de fragmentos de configuração da linha germinativa dos locais de cadeia pesada humana e locais de cadeia leve capa no cromossoma artificial de levedura (YAC). Em outras formas de realização, os camundongos XENOMOUSE® contêm ainda aproximadamente todos os locais de cadeia leve lambda humana. Ver Mendez et al., Nature Genetics 15: 146-156 (1997), Green e Jakobovits, J. Exp. Med. 188: 483-495 (1998) e WO 98/24893, as divulgações das quais são por meio deste incorporadas por referência. Em outras formas de realização, os anticorpos são produzidos em camundongos trans-cromossômicos humanos (ver WO 02/43478 e WO 02/092812, por meio deste incorporados por referência).

Em algumas formas de realização, o animal não humano que compreende genes da imunoglobulina humana são animais que têm um "minilocal" da imunoglobulina humana. No método de minilocal, um local Ig exógeno é imitado através da inclusão de genes individuais do local Ig. Assim, um ou mais genes VH, um ou mais genes Dh, um ou mais genes JH, um domínio constante mu e um segundo domínio constante (preferivelmente um domínio constante gama) são formados em uma construção para a inserção em um animal. Este método é descrito, inter alia, nas Patentes U.S. Ne5 5.545.807, 5.545.806, 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.429, 5.789.650, 5.814.318, 5.591.669, 5.612.205, 5.721.367, 5.789.215 e 5.643.763, por meio deste incorporados por referência. Em um outro aspecto, a invenção fornece um método para fabricar anticorpos anti-ErbB2 humanizados. Em algumas formas de realização, animais não humanos são imunizados com um antígeno de ErbB2. como descrito abaixo sob condições que permitam a produção do anticorpo. As células que produzem anticorpo são isoladas dos animais, fundidas com mielomas para produzir hibridomas e ácidos nucléicos que codificam as cadeias pesada e leve de um anticorpo anti-ErbB2 de interesse são isolados. Estes ácidos nucléicos são subseqüentemente engendrados usando técnicas conhecidas por aqueles de habilidade no ramo e como descrito mais abaixo para reduzir a quantidade de seqüência não humana, isto é, humanizar o anticorpo para reduzir a resposta imune em seres humanos.

Em algumas formas de realização, o antígeno de ErbB2 é ErbB2 isolado e/ou purificado. Em uma outra forma de realização, o antígeno de ErbB2 é ErbB2 humano. Em algumas formas de realização, o antígeno de ErbB2 é um fragmento de ErbB2. Em algumas formas de realização, o fragmento de ErbB2 é um domínio extracelular de ErbB2. Em algumas formas de realização, o fragmento de ErbB2 é uma alça extracelular de ErbB2 (ver Cho et al., Nature. 13 de fev de 2003; 421(6924): 756-60, por meio deste incorporado por referência). Em algumas formas de realização, o fragmento de ErbB2 compreende pelo menos um epítopo de ErbB2. Em outras formas de realização, o antígeno de ErbB2 é uma célula que expressa ou superexpressa ErbB2 ou um fragmento imunogênico deste, na sua superfície.

Em algumas formas de realização, o antígeno de ErbB2 é uma proteína de fusão de ErbB2. Em algumas formas de realização, o ErbB2 é um imunógeno de peptídeo sintético.

A imunização de animais pode ser por qualquer método conhecido na técnica. Ver, por exemplo, Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Nova Iorque: Cold Spring Harbor Press, 1990. Métodos para imunizar animais não humanos tais como camundongos, ratos, ovelhas, cabras, porcos, gado e cavalos são bem conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Harlow e Lane, supra e Patente U.S. 5.994.619. Em uma outra forma de realização, o antígeno de ErbB2 é administrado com um adjuvante para estimular a resposta imune. Os adjuvantes exemplares incluem adjuvante de Freund complete ou incompleto, RIBI (dipeptídeos de muramila) ou ISCOM (complexos imunoestimuladores). Tais adjuvantes podem proteger o polipeptídeo da dispersão rápida sequestrando-o em um depósito local ou eles podem conter substâncias que estimulam o hospedeiro a secretar fatores que sejam quimiotáticos para macrófagos e outros componentes do sistema imune. Preferivelmente, se um polipeptídeo está sendo administrado, o programa de imunização envolverá duas ou mais administrações do polipeptídeo,

separadas em várias semanas. O Exemplo 1 exemplifica um método para

®

produzir anticorpos monoclonais anti-ErbB2 em camundongos Xenomouse .

Produção de Anticorpos e Linhagens de Célula que Produzem

Anticorpo

Depois da imunização de um animal com um antígeno de ErbB2, os anticorpos e/ou as células que produzem anticorpo podem ser obtidos do animal. Em algumas formas de realização, o soro contendo o anticorpo anti-ErbB2 é obtido do animal pela sangria ou sacrificando o animal. O soro pode ser usado como é obtido do animal, uma fração de imunoglobulina pode ser obtida do soro ou os anticorpos anti-ErbB2 podem ser purificado a partir do soro.

Em algumas formas de realização, as linhagens de célula imortalizadas que produzem anticorpo são preparadas a partir de células isoladas do animal imunizado. Depois da imunização, o animal é sacrificado e os linfônodos e/ou células B esplênicas são imortalizadas por qualquer meio conhecido na técnica. Métodos de imortalizar células incluem, mas não são limitados a, transfectá-las com oncogenes, infectando-as com um vírus oncogênico e cultivando-as sob condições que selecionam células imortalizadas, submetendo-as a compostos carcinogênicos ou que causam uma mutação, fundindo-as com uma célula imortalizada, por exemplo, uma célula de mieloma e inativando um gene supressor de tumor. Ver, por exemplo, Harlow e Lane, supra. Se a fusão com células de mieloma é usada, as células de mieloma preferivelmente não secretam polipeptídeos de imunoglobulina (uma linhagem de célula não secretora). As células imortalizadas são triadas usando ErbB2, uma porção deste ou uma célula que expresse ErbB2. em uma outra forma de realização, a triagem inicial é realizada usando um imunoensaio ligado à enzima (ELISA) ou um radioimunoensaio. Um exemplo de triagem pelo ELISA é fornecido na WO 00/37504, aqui incorporada por referência.

As células que produzem anticorpo anti-ErbB2, por exemplo, hibridomas, são selecionadas, clonadas e ainda triadas quanto as características desejáveis, incluindo crescimento robusto, produção de anticorpo alta e características de anticorpo desejáveis, como debatidas mais abaixo. Hibridomas podem ser expandidos in vivo em animais singênicos, em animais que carecem de um sistema imune, por exemplo, camundongos nus ou em cultura de célula in vitro. Métodos de selecionar, clonar e expandir hibridomas são bem conhecidas por aqueles de habilidade comum na técnica.

Em uma forma de realização, o animal imunizado é um animal não humano que expressa genes da imunoglobulina humana e as células B esplênicas são fundidas a uma linhagem de célula de mieloma da mesma espécie como a do animal não humano. Em uma forma de realização mais preferida, o animal imunizado é um camundongo XENOMOUSE e a linhagem de célula de mieloma é um mieloma de camundongo não secretor. Em uma forma de realização ainda mais preferida, a linhagem de célula de mieloma é P3-X63-Ag8.653 (American Type Culture Collection). Ver, por exemplo, o Exemplo 2.

Assim, em uma forma de realização, a invenção fornece métodos para produzir uma linhagem de célula que produz um anticorpo monoclonal humano ou um fragmento deste direcionados a ErbB2 que compreendem (a) imunizar um animal transgênico não humano aqui descrito com ErbB2, uma porção de ErbB2 ou uma célula ou tecido que expresse ErbB2; (b) deixar o animal transgênico montar uma resposta imune ao ErbB2; (c) isolar as células que produzem anticorpo do animal transgênico; (d) imortalizar as células que produzem anticorpo; (e) criar populações monoclonais individuais das células imortalizadas que produzem anticorpo; e (f) triar as células imortalizadas que produzem anticorpo para identificar um anticorpo direcionado ao ErbB2.

Em um outro aspecto, a invenção fornece hibridomas que produzem um anticorpo anti-ErbB2 humano. Em uma outra forma de realização, os hibridomas são hibridomas de camundongo, como descrito acima. Em outras formas de realização, os hibridomas são produzidos em uma espécie não humana, não camundongo tal como ratos, ovelhas, porcos, cabras, gado ou cavalos. Em uma outra forma de realização, os hibridomas são hibridomas humanos.

Em uma forma de realização da invenção, as células que produzem anticorpo são isoladas e expressadas em uma célula hospedeira, por exemplo células de mieloma. Em uma outra forma de realização preferida, um animal transgênico é imunizado com ErbB2, as células primárias, por exemplo, células do baço ou de sangue periférico, são isoladas de um animal transgênico imunizado e as células individuais que produzem anticorpos específicos para o antígeno desejado são identificadas. O mRNA poliadenilado de cada célula individual é isolada e a reação da cadeia da polimerase de transcrição reversa (RT-PCR) é realizada usando iniciadores de sentido que recozem às seqüências de região variável, por exemplo, iniciadores degenerados que reconhecem a maior parte ou todas das regiões FRl de genes da região variável da cadeia pesada e leve humana e iniciadores de anti-sentido que recozem às seqüências da região constante ou de união. Os cDNAs dos domínios variáveis da cadeia pesada e leve são depois clonados e expressados em qualquer célula hospedeira adequada como anticorpos quiméricos com as respectivas regiões constantes de imunoglobulina, tais como os domínios constantes de cadeia pesada e cadeia leve κ ou λ. Ver Babcook, J. S. et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 7843- 48, 1996, aqui incorporada por referência. Os anticorpos anti-ErbB2 podem ser depois identificados e isolados como aqui descrito.

Em uma outra forma de realização, as técnicas de demonstração de fago podem ser usadas para fornecer bibliotecas contendo um repertório de anticorpos com afinidades variáveis para ErbB2. Para a produção de tais repertórios, é desnecessário imortalizar as células B do animal imunizado. Ao invés, as células B primárias podem ser usadas diretamente como uma fonte de DNA. A mistura de cDNAs obtida a partir da célula B, por exemplo, derivada de sangue ou baços, é usada para preparar uma biblioteca de expressão, por exemplo, uma biblioteca de demonstração de fago humana transfectada na E. coli. As células resultantes são testadas quanto a imunorreatividade ao ErbB2. As técnicas para a identificação de anticorpos humanos de alta afinidade a partir de tais bibliotecas são descritas por Griffiths et al, EMBO J., 13: 3245-3260 (1994); Nissim et al, ibid, pp. 692-698 e por Griffiths et al, ibid, 12: 725-734, que são incorporadas por referência. Enfim, clones da biblioteca são identificados que produzem afinidades de ligação de uma magnitude desejada para o antígeno e o DNA que codifica o produto responsável por tal ligação é recuperado e manipulado para a expressão recombinante padrão. As bibliotecas de demonstração de fago também podem ser construídas usando seqüências de nucleotídeo previamente manipuladas e tríadas em uma maneira similar. No geral, os cDNAs que codificam as cadeias pesada e leve são independentemente fornecidos ou ligados para formar análogos de Fv para a produção na biblioteca de fago. Em certas formas de realização, o embaralhamento de cadeia pode ser utilizado (ver Lang et ai, PNAS (1991) 15 de dez; 88(24): 11120-3, por meio deste incorporada por referência).

A biblioteca de fago é depois tríada quanto aos anticorpos com as afinidades mais altas para ErbB2 e o material genético recuperado do clone apropriado. Além disso, rodadas de triagem podem aumentar a afinidade dos anticorpos isolados originais.

Ácidos nucléicos. Vetores. Células Hospedeiras e Métodos Recombinantes de Fabricar Anticorpos

Ácidos Nucléicos

A presente invenção também abrange moléculas de ácido nucléico que codificam anticorpos anti-ErbB2 ou porções de ligação de antígeno destes. Em algumas formas de realização, moléculas de ácido nucléico diferentes codificam uma cadeia pesada e uma cadeia leve de uma imunoglobulina anti-ErbB2. Em outras formas de realização, a mesma molécula de ácido nucléico codifica uma cadeia pesada e uma cadeia leve de uma imunoglobulina anti-ErbB2. Em uma forma de realização, o ácido nucléico codifica um anticorpo de ErbB2 da invenção.

Em algumas formas de realização, a molécula de ácido nucléico que codifica o domínio variável da cadeia leve (Vl) utiliza um gene Vk B3, Vk LI, Vk A2 ou Vk Al humano e um gene Jk 1, Jk3, Jk4 ou Jk5 com ou sem mutação da linha germinativa.

Em algumas formas de realização, a molécula de ácido nucléico que codifica a cadeia leve, codifica uma seqüência de aminoácido que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 substituições e/ou 0, 1 ou 2 inserções em relação à(s) sequência(s) de aminoácido da linha germinativa. Em algumas formas de realização, a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma seqüência de aminoácido Vl que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 substituições de aminoácido conservativas e/ou um total de até 3 substituições não conservativa comparada com as seqüências Vk e Jk da linha germinativa. As substituições podem ser nas regiões de CDR, nas regiões de matriz ou no domínio constante.

Em algumas formas de realização, a molécula de ácido

nucléico codifica uma seqüência de aminoácido Vl que compreende uma ou mais variantes comparadas com a seqüência da linha germinativa que são idênticas às variações encontradas na Vl de qualquer um dos anticorpos 1.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.31.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.3.

Em algumas formas de realização, a molécula de ácido nucléico codifica pelo menos três substituições de aminoácido comparadas com a seqüência da linha germinativa encontrada na Vl de um dos anticorpos 1.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 196, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.31.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.3.

Em algumas formas de realização, a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácido Vl do anticorpo monoclonal 1.44.1 (SEQ ID NO: 4), 1.140 (SEQ ID NO: 8), 1.43.1 (SEQ ID NO: 12), 1.14.1 (SEQ ID NO: 16), 1.100.1 (SEQ ID NO: 20), 1.96.2 (SEQ ID NO: 24), 1.18.1 (SEQ ID NO: 28), 1.20.1 (SEQ ID NO: 32), 1.39.1 (SEQ ID NO: 36), 1.24.3 (SEQ ID NO: 40), 1.71.3 (SEQ ID NO: 44) ou um variante ou porção deste. Em algumas formas de realização, o ácido nucléico codifica uma seqüência de aminoácido que compreende as CDRs de cadeia leve de um dos ditos anticorpos listados acima.

Em algumas formas de realização, a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácido de uma das SEQ ID NOs: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40 ou 44. Em algumas formas de realização preferidas, a molécula de ácido nucléico compreende a seqüência de nucleotídeo das SEQ ID NOs: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43 ou uma porção destas.

Em algumas formas de realização, o ácido nucléico codifica a

seqüência de aminoácido das CDRs de cadeia leve do dito anticorpo.

Em algumas formas de realização, a molécula de ácido nucléico codifica uma seqüência de aminoácido Vl que é pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica a uma seqüência de aminoácido Vl de uma região Vl de qualquer um dos anticorpos 1.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.31.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.3 ou uma seqüência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40 ou 44. As moléculas de ácido nucléico da invenção incluem ácidos nucléicos que hibridizam sob condições altamente severas, tais como aquelas descritas acima, a uma seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácido de uma região Vl encontrada nas SEQ ID NOs: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 ou que tenha a seqüência de nucleotídeo de uma molécula de ácido nucléico que codifica a região Vl encontrada nas SEQ ID NOs: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39 ou 43.

Em uma outra forma de realização, o ácido nucléico codifica uma cadeia leve de tamanho natural de um anticorpo selecionado de 1.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.31.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.3. Em uma outra forma de realização preferida, a molécula de

ácido nucléico codifica o domínio variável de uma cadeia pesada (Vh) que compreende uma seqüência de gene Vh 3-21 humana, uma Vh 3-7 humana, uma Vh 4-31 humana ou uma Vh 3-13 humana ou uma seqüência derivada destas. Em várias formas de realização, a molécula de ácido nucléico utiliza um gene Vh3-7 humano e um JH6 humano; um gene VH4-31 humano, um gene D3-10 humano e um gene JH6B humano; ou um gene VH3-13 humano, um gene D6-19 humano e um gene JH6B humano.

Em algumas formas de realização, a molécula de ácido nucléico codifica uma seqüência de aminoácido que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 mutações comparadas com a seqüência de aminoácido da linha germinativa dos genes V, D e J humanos; O, 1, 2 ou 3 dos quais podem ser substituições. Em algumas formas de realização, as ditas mutações estão na região VH. Em algumas formas de realização, as ditas mutações estão nas regiões de CDR.

Em algumas formas de realização, a molécula de ácido nucléico codifica uma ou mais mutações de aminoácido comparadas com a seqüência da linha germinativa que são idênticas às mutações de aminoácido encontradas no Vh do anticorpo monoclonal 1.14.1, 1.18.1, 1.19, 1.20.1, 1.22.1, 1.22.2, 1.24.3, 1.41, 1.43.1, 143.2, 1.44.1, 1.39.1, 1.71.1, 1.71.3, 1.96.2, 1.99, 1.100.1, 1.104, 1.107, 1.124, 1.128, 1.140.1 ou 1.148. Em algumas formas de realização, o ácido nucléico codifica pelo menos três mutações de aminoácido comparadas com as seqüências da linha germinativa que são idênticas a pelo menos três mutações de aminoácido encontradas em um dos anticorpos monoclonais listados acima.

Em algumas formas de realização, a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica pelo menos uma porção da seqüência de aminoácido de VH de um anticorpo selecionado de 1.44.1 (SEQ ID NO: 2), 1.140.1 (SEQ ID NO: 6), 1.43.1 (SEQ ID NO: 10), 1.14.1 (SEQ ID NO: 14), 1.100.1 (SEQ ID NO: 18), 1.96.2 (SEQ ID NO: 22), 1.18.1 (SEQ ID NO: 26), 1.20.1 (SEQ ID NO: 30), 1.39.1 (SEQ ID NO: 34), 1.24.3 (SEQ ID NO: 38), 1.71.3 (SEQ ID NO: 42), uma variante destes ou a dita seqüência tendo mutações de aminoácido conservativas e/ou um total de três ou menos substituições de aminoácido não conservativas. Em várias formas de realização a seqüência codifica uma ou mais regiões de CDR, preferivelmente uma região de CDR3, todas as três regiões de CDR ou a região de Vh inteira.

Em algumas formas de realização, a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácido de uma das SEQ ID NOs: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38 e 42. Em algumas formas de realização preferidas, a molécula de ácido nucléico compreende pelo menos uma porção da seqüência de nucleotídeo das SEQ ID NOs: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33 ou 41. Em algumas formas de realização, a dita porção codifica a região VH, uma região CDR3 ou todas as três regiões de CDR.

Em algumas formas de realização, a molécula de ácido nucléico codifica uma seqüência de aminoácido de VH que é pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica à seqüência de aminoácido de VH de qualquer um da SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 37 ou 42. As moléculas de ácido nucléico da invenção incluem ácidos nucléicos que hibridizam sob condições altamente severas, tais como aquelas descritas acima, a uma seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácido das SEQ ID NOs: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37 ou 41 ou a uma região Vh destas ou que tem a seqüência de nucleotídeo das SEQ ID NOs: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37 ou 41 ou que codifica uma região Vh destas.

Em uma outra forma de realização, o ácido nucléico codifica uma cadeia pesada de tamanho natural de um anticorpo selecionado de 1.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.3.

Uma molécula de ácido nucléico que codifica a cadeia pesada ou leve de um anticorpo anti-ErbB2 ou porções deste pode ser isolada de qualquer fonte que produza tal anticorpo.

Em várias formas de realização, as moléculas de ácido nucléico são isoladas de uma célula B isolada de um animal imunizado com ErbB2, a partir de uma célula imortalizada derivada de uma tal célula B que expressa um anticorpo anti-ErbB2 ou de um bacteriófago. Métodos de isolar mRNA que codificam um anticorpo são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Sambrook et al. O mRNA pode ser usado para produzir cDNA para o uso na reação da cadeia da polimerase (PCR) ou clonagem de cDNA de genes de anticorpo. Em uma forma de realização, a molécula de ácido nucléico é isolada de um hibridoma que tem como um de seus parceiros de fusão uma célula que produz imunoglobulina humana a partir de um animal

transgênico não humano. Em uma outra forma de realização, a célula que

®

produz imunoglobulina humana é isolada de um animal XENOMOUSE . Em uma outra forma de realização, a célula que produz imunoglobulina humana é de um animal transgênico não humano, não camundongo, como descrito acima. Em uma outra forma de realização, o ácido nucléico é isolado de um animal não humano, não transgênico. As moléculas de ácido nucléico isoladas de um animal não humano, não transgênico podem ser usadas, por exemplo, para anticorpos humanizados. Em uma outra forma de realização, o ácido nucléico é isolado de bactérias ou fago.

Em algumas formas de realização, um ácido nucléico que codifica uma cadeia pesada de um anticorpo anti-ErbB2 da invenção pode compreender uma seqüência de nucleotídeo que codifica um domínio VH da invenção unido na matriz a uma seqüência de nucleotídeo que codifica um domínio constante de cadeia pesada de qualquer fonte. Similarmente, uma molécula de ácido nucléico que codifica uma cadeia leve de um anticorpo anti-ErbB2 da invenção pode compreender uma seqüência de nucleotídeo que codifica um domínio VL da invenção unido na matriz a uma seqüência de nucleotídeo que codifica um domínio constante de cadeia leve de qualquer fonte.

Em um outro aspecto da invenção, as moléculas de ácido nucléico que codificam o domínio variável das cadeias pesada (Vh) e/ou leve (Vl) são "convertidas" aos genes de anticorpo de tamanho natural. Em uma forma de realização, as moléculas de ácido nucléico que codificam os domínios Vh ou Vl são convertidas aos genes de anticorpo de tamanho natural pela inserção em um vetor de expressão que já codifica os domínios constante de cadeia pesada (Ch) ou constante de cadeia leve (Cl), respectivamente, tal que o segmento Vh é operativamente ligado ao(s) segmento(s) Ch dentro do vetor e/ou o segmento Vl está operativamente ligado ao segmento Cl dentro do vetor. Em uma outra forma de realização, as moléculas de ácido nucléico que codificam os domínios VH e/ou VL são convertidos nos genes de anticorpo de tamanho natural pela ligação, por exemplo, ligando, uma molécula de ácido nucléico que codifica um domínio VH e/ou VL a uma molécula de ácido nucléico que codifica um domínio Ch e/ou Cl usando técnicas biológicas moleculares padrão. As seqüências de nucleotídeo de genes de domínio constante da cadeia pesada e leve da imunoglobulina humana são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., NTH Publ. N2 91-3242, 1991. As moléculas de ácido nucléico que codificam as cadeias pesada e/ou leve de tamanho natural podem ser depois expressadas a partir de uma célula na qual elas foram introduzidas e o anticorpo anti-ErbB2s isolado.

As moléculas de ácido nucléico podem ser usadas para expressar recombinantemente quantidades grandes de anticorpos anti-ErbB2. As moléculas de ácido nucléico também podem ser usadas para produzir anticorpos quiméricos, anticorpos biespecíficos, anticorpos de cadeia única, imunoadesinas, diacorpos, anticorpos mutados e derivados de anticorpos, como descrito mais abaixo. Se as moléculas de ácido nucléico são derivadas de um animal não humano, não transgênico, as moléculas de ácido nucléico podem ser usadas para a humanização de anticorpo, também como descrito abaixo. Em uma outra forma de realização, uma molécula de ácido nucléico da invenção é usada como uma sonda ou iniciador de PCR para uma seqüência de anticorpo específica. Por exemplo, o ácido nucléico pode ser usado como uma sonda em métodos de diagnóstico ou como um iniciador da PCR para amplificar regiões de DNA que seriam usadas, inter alia, para isolar moléculas de ácido nucléico adicionais que codificam domínios variáveis de anticorpos anti-ErbB2. Em algumas formas de realização, as moléculas de ácido nucléico são oligonucleotídeos. Em algumas formas de realização, os oligonucleotídeos são de domínios altamente variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo de interesse. Em algumas formas de realização, os oligonucleotídeos codificam todo ou uma parte de uma ou mais das CDRs dos anticorpos 1.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.3 (ou variantes destes como aqui descrito).

Vetores

A invenção fornece vetores que compreendem moléculas de ácido nucléico que codificam a cadeia pesada de um anticorpo anti-ErbB2 da invenção ou uma porção de ligação de antígeno deste, moléculas de ácido nucléico que codificam a cadeia leve de tais anticorpos ou porção de ligação de antígeno destes ou ambos ou um agente de ligação alvejado. A invenção fornece ainda vetores que compreendem moléculas de ácido nucléico que codificam proteínas de fusão, anticorpos modificados, fragmentos de anticorpo e sondas destes.

Em algumas formas de realização, os anticorpos anti-ErbB2 ou porções de ligação de antígeno da invenção são expressados pela inserção de DNAs que codificam cadeias leves e/ou pesadas parciais ou de tamanho natural, obtidos como descrito acima, em vetores de expressão tal que os genes sejam operativamente ligados às seqüências de controle de expressão necessárias tais como as seqüências de controle transcricional e traducional. Os vetores de expressão incluem plasmídeos, retrovírus, adenovírus, vírus adeno-associados (AAV), vírus vegetais tais como o vírus mosaico da couve- flor, vírus mosaico do tabaco, cosmídeos, YACs, epissomas derivados de EBV e outros. O gene de anticorpo está ligado em um vetor tal que as seqüências de controle transcricionais e traducionais dentro do vetor servem para a sua função intencionada de regular a transcrição e tradução do gene de anticorpo. O vetor de expressão e seqüências de controle de expressão são escolhidos para serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão usada. O gene de cadeia leve do anticorpo e o gene de cadeia pesada do anticorpo podem ser inseridos em vetores separados. Em algumas formas de realização, ambos os genes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes de anticorpo são inseridos no vetor de expressão pelos métodos padrão (por exemplo, ligação de sítios de expressão complementares no fragmento de gene e vetor do anticorpo ou ligação de extremidade abrupta se nenhum sítio de restrição estiver presente).

Um vetor conveniente é um que codifica uma seqüência de imunoglobulina Ch ou Cl funcionalmente completa humana com sítios de restrição apropriados engendrados de modo que qualquer seqüência Vh ou Vl possa ser facilmente inserida e expressada, como descrito acima. Em tais vetores, a união usualmente ocorre entre o sítio doador de junção na região J inserida e sítio aceitador de junção que precede o domínio C humano e também nas regiões de junção que ocorrem dentro dos exons Ch humanos. A terminação de poliadenilação e transcrição que ocorre nos sítios cromossômicos nativos a jusante das regiões codificadoras. O vetor de expressão recombinante também pode codificar um peptídeo de sinal que facilita a secreção da cadeia de anticorpo de uma célula hospedeira. O gene da cadeia de anticorpo pode ser clonado no vetor tal que o peptídeo de sinal esteja ligado na matriz ao terminal amino da cadeia de imunoglobulina. O peptídeo de sinal pode ser um peptídeo de sinal de imunoglobulina ou um peptídeo de sinal heterólogo (isto é, um peptídeo de sinal de uma proteína que não imunoglobulina).

Além dos genes da cadeia de anticorpo, os vetores de expressão recombinantes da invenção carregam seqüências reguladoras que controlam a expressão dos genes da cadeia de anticorpo em uma célula hospedeira. Será avaliado por aqueles habilitados na técnica que o planejamento do vetor de expressão, incluindo a seleção de seqüências reguladoras pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão da proteína desejada, etc. As seqüências reguladoras preferidas para a expressão de célula hospedeira de mamífero incluem elementos virais que direcionam níveis altos de expressão de proteína em células de mamífero, tais como promotores e/ou realçadores derivados de LTRs retrovirais, citomegalovírus (CMV) (tais como o promotor/realçador de CMV), Vírus Símio 40 (SV40) (tal como o promotor/realçador de SV40), adenovírus, (por exemplo, o promotor tardio maior de adenovírus (AdMLP)), polioma e promotores de mamífero fortes tais como promotores da imunoglobulina e actina nativa. Para descrição adicional de elementos regulatórios virais e seqüências destes, ver por exemplo, a Patente U.S. N2 5.168.062, Patente U.S. N° 4.510.245 e Patente U.S. N2

4.968.615. Métodos para expressar anticorpos em plantas, incluindo uma descrição de promotores e vetores, assim como transformação de plantas é conhecido na técnica. Ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos 6.517.529, aqui incorporada por referência. Métodos de expressar polipeptídeos em células bacterianas ou células fungicas, por exemplo, células de levedura, também são bem conhecidos na técnica.

Além dos genes da cadeia de anticorpo e seqüências reguladoras, os vetores de expressão recombinantes da invenção podem carregar seqüências adicionais, tais como seqüências que regulam a replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita a seleção de células hospedeiras nas quais o vetor foi introduzido (ver por exemplo, Patentes U.S. N- 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017, aqui incorporadas por referência). Por exemplo, tipicamente o gene marcador selecionável confere resistência a medicamentos, tais como G418, higromicina ou metotrexato, em uma célula hospedeira na qual o vetor foi introduzido. Os genes marcadores selecionáveis preferidos incluem o gene da diidrofoliato redutase (DHFR) (para o uso em dhfr-células hospedeiras com seleção pelo metotrexato/ amplificação), o gene neo (para a seleção de G418) e o gene da glutamato sintetase.

Células Hospedeiras Que Não de Hibridoma e Métodos de Produzir Proteína Recombinantemente

Moléculas de ácido nucléico que codificam agente de ligação alvejado e/ou anticorpos anti-ErbB2 e vetores que compreendem estas moléculas de ácido nucléico podem ser usados para a transfecção de uma célula hospedeira de mamífero, planta, bacteriana ou de levedura adequada. A transformação pode ser por qualquer método conhecido para introduzir polinucleotídeos em uma célula hospedeira. Os métodos para a introdução de polinucleotídeos heterólogos em células de mamífero são bem conhecidos na técnica e incluem transfecção mediada com dextrano, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplasto, eletroporação, encapsulação do(s) polinucleotídeo(s) em lipossomas e microinjeção direta do DNA nos núcleos. Além disso, moléculas de ácido nucléico podem ser introduzidas em células de mamífero pelos vetores virais. Os métodos de transformar células são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, as Patentes U.S. N- 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461 e 4.959.455, aqui incorporadas por referência). Os métodos de transformar células vegetais são bem conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, transformação mediada por Agrobacterium, transformação biolística, injeção direta, eletroporação e transformação viral. Os métodos de transformar células bacterianas e de levedura também são bem conhecidas na técnica.

As linhagens de células de mamífero disponíveis como hospedeiros para a expressão são bem conhecidas na técnica e incluem muitas linhagens célula imortalizadas disponíveis da American Type Culture Collection (ATCC). Estas incluem, inter alia, células do ovário do hamster Chinese (CHO), células N50, células SP2, células T HEK-293, células NIH- 3T3, células HeLa5 células renais do hamster bebê (BHK), células renais do macaco verde africano (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por exemplo, Hep G2), células A549 e várias outras linhagens de célula. As linhagens de célula de preferência particular são selecionadas através da determinação de quais linhagens de célula têm altos níveis de expressão. Outras linhagens de célula que podem ser usadas são linhagens de célula de inseto, tais como células Sf9 ou Sf21. Quando vetores de expressão recombinantes que codificam genes de anticorpo são introduzidos em células hospedeiras de mamífero, os anticorpos são produzidos cultivando-se as células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferivelmente, secreção do anticorpo no meio de cultura em que as células hospedeiras são cultivadas. Os anticorpos podem ser recuperados do meio de cultura usando métodos de purificação de proteína padrão. As células hospedeiras vegetais incluem, por exemplo, Nieotiana, Arabidopsis, lentilha d'água, milho, trigo, batata, etc. As células hospedeiras bacterianas incluem E. coli e espécies de Streptomyces. As células hospedeiras de levedura incluem Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyees eerevisiae e Piehia pastoris.

Além disso, a expressão de anticorpos da invenção a partir de linhagens de célula de produção pode ser realçada usando várias técnicas conhecidas. Por exemplo, o sistema de expressão do gene da glutamina sintetase (o sistema GS) é um método comum para realçar a expressão sob certas condições. O sistema GS é debatido no todo ou parte em conexão com as Patentes Européias Nes 0 216 846, 0 256 055, 0 323 997 e 0 338 841.

É provável que os anticorpos expressados pelas linhagens de célula diferentes ou em animais transgênicos terão glicosilação diferente entre si. Entretanto, todos os anticorpos codificados pelas moléculas de ácido nucléico aqui fornecidas ou que compreendem as seqüências de aminoácido são aqui fornecidos parte da presente invenção, independente da glicosilação dos anticorpos.

Animais e Plantas Transgênicas

Os anticorpos anti-ErbB2 da invenção também podem ser produzidos transgenicamente através da geração de um mamífero ou planta que sejam transgênicos para as seqüências de cadeias pesada e leve de imunoglobulina de interesse e produção do anticorpo em uma forma recuperável a partir destas. Em conexão com a produção transgênica em mamíferos, os anticorpos anti-ErbB2 podem ser produzidos e recuperado do leite de cabras, vacas ou outros mamíferos. Ver, por exemplo, as Patentes U.S. N25 5.827.690, 5.756.687, 5.750.172 e 5.741.957, aqui incorporadas por referência. Em algumas formas de realização, animais não humanos transgênicos que compreendem locais da imunoglobulina humana são imunizados com ErbB2 ou uma porção imunogênica deste, como descrito acima. Os métodos para fabricar anticorpos em plantas são descritos, por exemplo, nas patentes U.S. 6.046.037 e 5.959.177, aqui incorporadas por referência.

Em algumas formas de realização, animais não humanos ou plantas transgênicos são produzidos pela introdução de uma ou mais moléculas de ácido nucléico que codificam um anticorpo anti-ErbB2 da invenção no animal ou planta pelas técnicas transgênicas padrão. Ver Hogan e Patente dos Estados Unidos 6.417.429, supra. As células transgênicas usadas para fabricar o animal transgênico podem ser células tronco embrionárias ou células somáticas ou um ovo fertilizado. Os organismos não humanos transgênicos podem ser quiméricos, heterozigotos não quiméricos e homozigotos não quiméricos. Ver, por exemplo, Hogan et ai., Manipulating the Mouse Embrvo: A Laboratory Manual 2a ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson et al., Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Method, Oxford University Press (2000); e Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999), todas aqui incorporadas por referência. Em algumas formas de realização, os animais não humanos transgênicos têm um rompimento e substituição alvejados por uma construção de alvejamento que codifica uma cadeia pesada e/ou uma cadeia leve de interesse. Em uma outra forma de realização, os animais transgênicos compreendem e expressam moléculas de ácido nucléico que codificam cadeias pesadas e leves que especificamente se ligam a ErbB2, preferivelmente ErbB2 humano. Em algumas formas de realização, os animais transgênicos compreendem moléculas de ácido nucléico que codificam um anticorpo modificado tal como um anticorpo de cadeia única, um anticorpo quimérico ou um anticorpo humanizado. Os anticorpos anti- ErbB2 podem ser fabricados em qualquer animal transgênico. Em uma outra forma de realização, os animais não humanos são camundongos, ratos, ovelhas, porcos, cabras, gado ou cavalos. O animal transgênico não humano expressa os ditos polipeptídeos codificados no sangue, leite, urina, saliva, lágrimas, muco e outros fluidos corporais.

Bibliotecas de demonstração de fago

A invenção fornece um método para produzir um anticorpo anti-ErbB2 ou uma porção de ligação de antígeno deste que compreende as etapas de sintetizar uma biblioteca de anticorpos humanos em fago, triar a biblioteca com ErbB2 ou uma porção deste, isolar o fago que liga ErbB2 e obter o anticorpo a partir do fago. Por via de exemplo, um método para preparar a biblioteca de anticorpos para o uso nas técnicas de demonstração de fago compreende as etapas de imunizar um animal não humano que compreende locais de imunoglobulina humana com ErbB2 ou uma porção antigênica deste para criar uma resposta imune, extrair células que produzem anticorpo do animal imunizados; isolar o RNA que codifica as cadeias pesada e leve de anticorpos da invenção das células extraídas, transcrever de modo reverso O RNA para produzir cDNA, amplificar o cDNA usando iniciadores e inserir o cDNA em um vetor de demonstração de fago tal que os anticorpos sejam expressados no fago. Os anticorpos anti-ErbB2 recombinantes da invenção podem ser obtidos deste modo. Os anticorpos anti-ErbB2 humanos recombinantes da invenção

podem ser isolados pela triagem de uma biblioteca de anticorpo combinatório recombinante. Preferivelmente a biblioteca é uma biblioteca de demonstração de fago de scFv, gerada usando cDNAs de Vl e Vh humanos preparados a partir do mRNA isolado das células B. Métodos para preparar e triar tais bibliotecas são conhecidos na técnica. Kits para gerar as bibliotecas de demonstração de fago estão comercialmente disponíveis (por exemplo, the Pharmacia Recombinant Phago Antibody System, catálogo Na 27-9400-01; e o kit de demonstração de fago SurfZAP® da Stratagene, catálogo N° 240612). Existem também outros métodos e reagentes que podem ser usados na geração e triagem de bibliotecas de demonstração de anticorpo (ver, por exemplo, a Patente U.S. N- 5.223.409; Publicações PCT N- WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; Fuchs et al., Bio/Technology 9: 1370-1372 (1991); Hay et al, Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81-85 (1992); Huse et al, Science 246: 1275- 1281 (1989); McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990); Griffiths et al, EMBO J. 12: 725-734 (1993); Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226: 889-896 (1992); Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 3576-3580 (1992); Garrad et al, Bio/Technology 9: 1373-1377 (1991); Hoogenboom et al., Nucl. Acid Res. 19: 4133-4137 (1991); e Barbas et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 7978-7982 (1991), todas aqui incorporadas por referência.

Em uma forma de realização, para isolar e produzir anticorpos anti-ErbB2 humanos com as características desejadas, um anticorpo anti- ErbB2 humano como aqui descrito é primeiro usado para selecionar seqüências de cadeia pesada e leve humanas tendo atividade de ligação similar contra ErbB2, usando os métodos de impressão de epítopo descritos na Publicação PCT IsP WO 93/06213, aqui incorporada por referência. As bibliotecas usadas neste método são preferivelmente bibliotecas scFv preparadas e tríadas como descrito na Publicação PCT N3 WO 92/01047, McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990); e Griffiths et ai, EMBO J. 12: 725-734 (1993), todas aqui incorporadas por referência. As bibliotecas de anticorpo scFv preferivelmente são tríadas usando ErbB2 humano como o antígeno.

Uma vez que domínios Vl e Vh humanos iniciais são selecionados, experimentos de "mistura e emparelhamento" são realizados, em que pares diferentes dos segmentos Vl e Vh inicialmente selecionados são triados quanto a ligação de ErbB2 para selecionar combinações de pares Vi/Vh preferidas. Adicionalmente, para melhorar ainda mais a qualidade do anticorpo, os segmentos Vl e Vh do(s) par(es) Vi/Vh preferido(s) pode(m) ser aleatoriamente mutados, preferivelmente dentro da região CDR3 de Vh e/ou VL, em um processo análogo ao processo da mutação somática in vivo responsável pela maturação de anticorpos de afinidade durante uma resposta imune natural. Esta maturação de afinidade in vitro pode ser realizada amplificando-se os domínios Vh e Vl usando iniciadores de PCR complementares à CDR3 de VH ou CDR3 de VL, respectivamente, iniciadores estes que foram "reforçados" com uma mistura aleatória das quatro bases de nucleotídeo em certas posições tal que os produtos de PCR resultantes codificam segmentos Vh e Vl em que mutações aleatórias foram introduzidas nas regiões de CDR3 Vh e/ou VL. Estes segmentos de Vh e Vl aleatoriamente mutados podem ser re-triados quanto a ligação a ErbB2.

A seguir de triagem e isolação de um anticorpo anti-ErbB2 da invenção a partir de uma biblioteca de demonstração de imunoglobulina recombinante, ácidos nucléicos que codificam o anticorpo selecionado podem ser recuperados do pacote de demonstração (por exemplo, do genoma de fago) e subclonados em outros vetores de expressão pelas técnicas de DNA recombinante padrão. Se desejado, o ácido nucléico pode ser manipulado ainda para criar outras formas de anticorpo da invenção, como descrito abaixo. Para expressar um anticorpo humano recombinante isolado pela triagem de uma biblioteca combinatória, o DNA que codificam o anticorpo é clonado em um vetor de expressão recombinante e introduzido em uma célula hospedeira de mamífero, como descrito acima.

Comutação de classe

Um outro aspecto da invenção fornece um método para converter a classe ou subclasse de um anticorpo anti-ErbB2 em uma outra classe ou subclasse. Em algumas formas de realização, uma molécula de ácido nucléico que codifica um Vl ou Vh que não incluem seqüências que codificam Cl ou Ch é isolada usando métodos bem conhecidos na técnica. A molécula de ácido nucléico é depois operativamente ligada a uma seqüência de nucleotídeo que codifica um Cl ou Ch de uma classe ou subclasse de imunoglobulina desejadas. Isto pode ser obtido usando um vetor ou molécula de ácido nucléico que compreenda uma cadeia Cl ou Ch, como descrita acima. Por exemplo, um anticorpo anti-ErbB2 que foi originalmente IgM pode ser comutado de classe para uma IgG. Além disso, a comutação de classe pode ser usada para converter uma subclasse de IgG em uma outra, por exemplo, de IgGl para IgG2. Um outro método para produzir um anticorpo da invenção que compreende um isótipo desejado compreende as etapas de isolar um ácido nucléico que codifica uma cadeia pesada de um anticorpo anti-ErbB2 e um ácido nucléico que codifica uma cadeia leve de um anticorpo anti-ErbB2, isolar a seqüência que codifica a região VH, ligando a seqüência de Vh a uma seqüência que codifica um domínio constante de cadeia pesada do isótipo desejado, que expresse o gene de cadeia leve e a construção de cadeia pesada em uma célula e coletar o anticorpo anti-ErbB2 com o isótipo desejado.

Anticorpos Desimunizados

Em um outro aspecto da invenção, o anticorpo pode ser desimunizados para reduzir a sua imunogenicidade usando as técnicas descritas, por exemplo, nas Publicações PCT N^ W098/52976 e WOOO/34317 (aqui incorporadas por referência).

Anticorpos Mutados

Em uma outra forma de realização, as moléculas de ácido nucléico, vetores e células hospedeiras podem ser usados para fabricar anticorpos anti-ErbB2 mutados. Os anticorpos podem ser mutados nos domínios variáveis das cadeias pesada e/ou leve, por exemplo, para alterar uma propriedade de ligação do anticorpo. Por exemplo, uma mutação pode ser feita em uma ou mais das regiões de CDR para aumentar ou diminuir o Kp do anticorpo para ErbB2, para aumentar ou diminuir Icoff ou para alterar a especificidade de ligação do anticorpo. As técnicas em mutagênese direcionada ao sítio são bem conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Sambrook et ai. e Ausubel et ai, supra. Em uma outra forma de realização, uma ou mais mutações são fabricadas em um resíduo de aminoácido que é conhecido ser mudado comparado com a linha germinativa no anticorpo 1.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.3. As mutações podem ser feitas em uma região de CDR ou região de matriz de um domínio variável ou em um domínio constante. Em uma outra forma de realização, as mutações são feitas em um domínio variável. Em algumas formas de realização, uma ou mais mutações são feitas nos resíduos de aminoácido que são conhecidos serem mudados comparados com a linha germinativa em uma região de CDR ou região de matriz de um domínio variável de uma seqüência de aminoácido selecionada das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 e 44 ou cuja seqüência de nucleotídeo é apresentada nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17,19,21,23,25,27, 29,31,33,35,37,39,41 ou 43.

Em uma outra forma de realização, a região de matriz é mutada de modo que a(s) região(ões) de matriz resultante(s) tenha(m) a seqüência de aminoácido do gene da linha germinativa correspondente. Uma mutação pode ser feita em uma região de matriz ou domínio constante para aumentar a meia vida do anticorpo anti-ErbB2. Ver, por exemplo, a Publicação PCT N2 WO 00/09560, aqui incorporada por referência. Uma mutação em uma região de matriz ou domínio constante também pode ser feita para alterar a imunogenicidade do anticorpo, fornecer um sítio para a ligação covalente ou não covalente a uma outra molécula ou para alterar propriedades tais como fixação de complemento, ligação de FcR e citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC). De acordo com a invenção, um único anticorpo pode ter mutações em qualquer uma ou mais das CDRs ou regiões de matriz do domínio variável ou no domínio constante.

Em algumas formas de realização, existem de 1 a 8, incluindo qualquer número entre esses, mutações de aminoácido nos domínios Vh ou Vl do anticorpo anti-ErbB2 mutado comparado com o anticorpo anti-ErbB2 antes da mutação. Em qualquer um dos acima, as mutações podem ocorrer em uma ou mais regiões de CDR. Além disso, qualquer uma das mutações podem ser substituições de aminoácido conservativas. Em algumas formas de realização, existem não mais do que 5, 4, 3, 2 ou 1 mudanças de aminoácido nos domínios constantes. Anticorpos Modificados

Em uma outra forma de realização, um anticorpo de fusão ou imunoadesina podem ser feitos compreendendo todo ou uma porção de um anticorpo anti-ErbB2 da invenção ligado a um outro polipeptídeo. Em uma outra forma de realização, apenas os domínios variáveis do anticorpo anti- ErbB2 são ligados ao polipeptídeo. Em uma outra forma de realização preferida, o domínio VH de um anticorpo anti-ErbB2 é ligado a um primeiro polipeptídeo, enquanto que o domínio VL de um anticorpo anti-ErbB2 é ligado a um segundo polipeptídeo que se associa com o primeiro polipeptídeo em uma maneira tal que os domínios de VH e VL possam interagir entre si para formar um sítio de ligação de antígeno. Em uma outra forma de realização preferida, o domínio Vh é separado do domínio Vl por um ligador tal que os domínios de VH e VL possam interagir um com o outro (ver abaixo sob Anticorpos de Cadeia Única). O anticorpo VH-ligador-VL é depois ligado ao polipeptídeo de interesse. O anticorpo de fusão é útil para direcionar um polipeptídeo a uma célula ou tecido que expressa ErbB2. O polipeptídeo pode ser um agente terapêutico, tal como uma toxina, fator de crescimento ou outra proteína reguladora ou pode ser um agente de diagnóstico, tal como uma enzima que possa ser facilmente visualizada, tal como rábano peroxidase. Além disso, anticorpos de fusão podem ser criados em que dois (ou mais) anticorpos de cadeia única são ligados entre si. Isto é útil se deseja-se criar um anticorpo bivalente ou polivalente em uma cadeia de polipeptídeo única ou se deseja-se criar um anticorpo biespecífico.

Para criar um anticorpo de cadeia única, (scFv) os fragmentos de DNA que codificam Vh e VL são operativamente ligados a um outro fragmento que codifica um ligador flexível, por exemplo, que codifica a seqüência de aminoácido (Gly4-Ser)3, tal que as seqüências de Vh e Vl possam ser expressadas como uma proteína de cadeia única contígua, com os domínios Vl e Vh unidos pelo ligador flexível. Ver, por exemplo, Bird et al., Science 242: 423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5879-5883 (1988); McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990). O anticorpo de cadeia única pode ser monovalente, se apenas uma única Vh e Vl é usada, bivalente, se duas Vh e Vl são usadas ou polivalente, se mais do que duas Vh e Vl são usadas, os anticorpos biespecíficos ou polivalentes podem ser gerados que se ligam especificamente a ErbB2 e a uma outra molécula.

Em outras formas de realização, outros anticorpos modificados podem ser preparados usando moléculas de ácido nucléico que codificam o anticorpo anti-ErbB2. Por exemplo, "Corpos Capa" (111 et al., Protein Eng. 10: 949-57 (1997)), "Minibodies" (Martin et al., EMBO J. 13: 5303-9 (1994)), "Diabodies" (Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6444-6448 (1993)) ou iiJanusins" (Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655-3659 (1991) e Traunecker et al., Int. J. Câncer (Supl.) 7: 51-52 (1992)) podem ser preparados usando técnicas biológicas moleculares padrão seguindo as divulgações do relatório descritivo.

Os anticorpos biespecíficos ou fragmentos de ligação de antígenos podem ser produzidos por uma variedade de métodos incluindo fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab'. Ver, por exemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny et al., J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992). Além disso, anticorpos biespecíficos podem ser formados como "diacorpos" ou iiJanusins." Em algumas formas de realização, o anticorpo biespecífico se liga a dois epítopos diferentes de ErbB2. Em algumas formas de realização, o anticorpo biespecífico tem uma primeira cadeia pesada e uma primeiro cadeia leve dos anticorpos 1.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.3 e uma cadeia pesada e cadeia leve de anticorpo adicionais. Em algumas formas de realização, a cadeia leve e cadeia pesada adicionais também são de um dos anticorpos monoclonais identificados acima, mas são diferentes das primeiras cadeias pesada e leve.

Em algumas formas de realização, os anticorpos modificados descritos acima são preparados usando um ou mais dos domínios variáveis ou regiões de CDR de um anticorpo anti-ErbB2 humano monoclonal aqui fornecido.

Os anticorpos da invenção também abrangem anticorpos que têm meias vidas (por exemplo, meias vidas séricas) em um mamífero, preferivelmente um ser humano., maior do que aquela de um anticorpo não modificado. Em uma forma de realização, a dita meia vida do anticorpo é maior do que cerca de 15 dias, maior do que cerca de 20 dias, maior do que cerca de 25 dias, maior do que cerca de 30 dias, maior do que cerca de 35 dias, maior do que cerca de 40 dias, maior do que cerca de 45 dias, maior do que cerca de 2 meses, maior do que cerca de 3 meses, maior do que cerca de 4 meses ou maior do que cerca de 5 meses. As meias vidas aumentadas dos anticorpos da presente invenção ou fragmentos deste em um mamífero, preferivelmente um ser humano, resulta em um título sérico mais alto dos ditos anticorpos ou fragmentos de anticorpo no mamífero e assim, reduzem a freqüência da administração dos ditos anticorpos ou fragmentos de anticorpo e/ou reduzem a concentração dos ditos anticorpos ou fragmentos de anticorpo a serem administradas. Anticorpos ou fragmentos deste tendo meias vidas in vivo aumentadas podem ser gerados pelas técnicas conhecidas por aqueles de habilidade no ramo. Por exemplo, anticorpos ou fragmentos destes com meias vidas in vivo aumentadas podem ser gerados pela modificação (por exemplo, substituição, deleção ou adição) de resíduos de aminoácido identificados como envolvidos na interação entre o domínio Fc e o receptor FcRn (ver, por exemplo, as Publicações Internacionais N- WO 97/34631 e WO 02/060919, que são aqui incorporadas por referência em suas totalidades). Anticorpos ou fragmentos destes com meias vidas in vivo aumentadas podem ser gerados pela ligação aos ditos anticorpos ou fragmentos de anticorpo de moléculas poliméricas tais como polietileno glicol (PEG) de peso molecular alto. PEG pode ser ligado aos ditos anticorpos ou fragmentos de anticorpo com ou sem um ligador multifuncional através da conjugação específica de sítio do PEG ao terminal N ou C dos ditos anticorpos ou fragmentos de anticorpo ou por intermédio de grupos épsilon-amino presentes nos resíduos de lisina. A derivatização de polímero linear ou ramificado que resulte em perda mínima de atividade biológica será usada. O grau de conjugação será intimamente monitorado pela SDS-PAGE e espectrometria de massa para garantir a conjugação apropriada de moléculas de PEG aos anticorpos. PEG não reagido pode ser separado de conjugados de anticorpo-PEG, por exemplo, pela cromatografia de exclusão de tamanho ou troca iônica.

Um sítio de ligação de antígeno. pode ser fornecido por meio de arranjo de CDRs em armações de proteína que não anticorpo, tais como fibronectina ou citocromo B etc. (Haan & Maggos (2004) BioCentury, 12(5): A1-A6; Koide et al. (1998) Journal of Molecular Biology, 284: 1141-1151; Nygren et al. (1997) Current Opinion in Structural Biology, 7: 463-469) ou pela randomização ou mutação de resíduos de aminoácido de uma alça dentro de uma armação de proteína para conferir especificidade de ligação para um alvo desejado. As armações para engendrar novos sítios de ligação em proteínas foram revisadas em detalhes por Nygren et al. (Nygren et al. (1997) Current Opinion in Structural Biology, 7: 463-469). As armações de proteína para imitações de anticorpo são divulgadas na W0/0034784, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade, em que os inventores descrevem proteínas (imitações de anticorpo) que incluem um domínio de fibronectina tipo III tendo pelo menos uma alça randomizada. Uma armação adequada na qual enxertar uma ou mais CDRs, por exemplo um conjunto de HCDRs, pode ser fornecida por qualquer membro de domínio da superfamília o gene da imunoglobulina. A armação pode ser uma proteína humana ou não humana. Uma vantagem de uma armação de proteína que não anticorpo é que a mesma pode fornecer um sítio de ligação de antígeno em uma molécula da armação que é menor e/ou mais fácil de fabricar do que pelo menos algumas moléculas de anticorpo. O tamanho pequeno de um membro de ligação pode conferir propriedades fisiológicas úteis, tais como uma capacidade para entrara nas células, penetrar profundamente em tecidos ou atingir alvos dentro de outras estruturas ou para ligar dentro de cavidades da proteína do antígeno alvo. O uso de sítios de ligação de antígeno em armações de proteína que não anticorpo é revisado em Wess, 2004 (Wess, L. Em: BioCentury, The Bernstein Report on BioBusiness, 12(42), A1-A7, 2004). Típicas são as proteínas tendo uma cadeia principal estável e uma ou mais alças variáveis, em que a seqüência de aminoácido da alça ou alças é especificamente ou aleatoriamente mutada para criar um sítio de ligação de antígeno que liga o antígeno alvo. Tais proteínas incluem os domínios de ligação de IgG da proteína A de S. aureus, transferrina, albumina, tetranectina, fibronectina (por exemplo 10° domínio de fibronectina tipo III), lipocalinas assim como armações gama-cristalinas e outras Affilin® (Scil Proteins). Os exemplos de outros métodos incluem "Microcorpos" sintéticos com base em ciclotídeos - proteínas pequenas tendo ligações de dissulfeto intra-moleculares, Microproteínas (Versabodies®, Amunix) e proteínas de repetição de anquirina (DARPins, Molecular Partners).

Além das seqüências de anticorpo e/ou um sítio de ligação de antígeno, um agente de ligação alvejado de acordo com a presente invenção pode compreender outros aminoácidos, por exemplo que formam um peptídeo ou polipeptídeo, tal como um domínio dobrado ou para comunicar à molécula uma outra característica funcional além da capacidade para ligar antígeno. Agentes de ligação alvejados da invenção podem carregar um rótulo detectável ou podem ser conjugados a uma toxina ou uma porção de alvejamento ou enzima (por exemplo por intermédio de uma ligação ou ligador de peptidila). Por exemplo, um agente de ligação alvejado pode compreender um sítio catalítico (por exemplo em um domínio de enzima) assim como um sítio de ligação de antígeno, em que o sítio de ligação de antígeno se liga ao antígeno e assim alveja o sítio catalítico para o antígeno. O sítio catalítico pode inibir a função biológica do antígeno, por exemplo pela clivagem.

Anticorpos Derivatizados e Rotulados

Um anticorpo anti-ErbB2 ou porção de ligação de antígeno da invenção podem ser derivatizados ou ligados a uma outra molécula (por exemplo, um outro peptídeo ou proteína). No geral, os anticorpos ou porção destes são derivatizados tal que a ligação de ErbB2 não é afetada adversamente pela derivatização ou rotulação. Consequentemente, os anticorpos e porções de anticorpo da invenção são intencionados a incluir as formas tanto intacta quanto modificada do anticorpo anti-ErbB2 humanos aqui descrito. Por exemplo, um anticorpo ou porção de anticorpo da invenção podem ser funcionalmente ligados (pela ligação química, fusão genética, associação não covalente ou de outro modo) a uma ou mais outras entidades moleculares, tais como um outro anticorpo (por exemplo, um anticorpo biespecífico ou um diacorpo), um agente de detecção, um agente citotóxico, um agente farmacêutico e/ou uma proteína ou peptídeo que pode mediar a associação do anticorpo ou porção de anticorpo com uma outra molécula (tal como uma região de núcleo de estreptavidina ou um rótulo de poliistidina).

Um tipo de anticorpo derivatizado é produzido pela reticulação de dois ou mais anticorpos (do mesmo tipo ou de tipos diferentes, por exemplo, para criar anticorpos biespecíficos). Os reticuladores adequados incluem aqueles que são heterobifuncionais, tendo dois grupos distintamente reativos separados por um espaçador apropriado (por exemplo, éster de m- maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimida) ou homobifuncional (por exemplo, suberato de dissuccinimidila). Tais ligadores são disponível da Pierce Chemical Company, Rockford, II. Um outro tipo de anticorpo derivatizado é um anticorpo rotulado. Os agentes de detecção úteis com que um anticorpo ou porção de ligação de antígeno da invenção podem ser derivatizados incluem compostos fluorescentes, incluindo fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloreto de 5-dimetilamina-l-naftalenossulfonila, ficoeritrina, lantanídeo fosfórico e outros. Um anticorpo também pode ser rotulado com enzimas que são úteis para a detecção, tais como rábano peroxidase, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina, glicose oxidase e outros. Quando um anticorpo é rotulado com uma enzima detectável, o mesmo é detectado pela adição de reagentes adicionais que a enzima usa para produzir um produto de reação que pode ser discernido. Por exemplo, quando o agente rábano peroxidase está presente, a adição de peróxido de hidrogênio e diaminobenzidina leva a um produto de reação colorido, que é detectável. Um anticorpo também pode ser rotulado com biotina e detectado através da medição indireta da ligação de avidina ou estreptavidina. Um anticorpo também pode ser rotulado com um epítopo de polipeptídeo pré determinado reconhecido por um repórter secundário (por exemplo, seqüências de par de zíper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, rótulos de epítopo). Em algumas formas de realização, os rótulos são ligados pelos ramos espaçadores de vários comprimentos para reduzir o impedimento estérico potencial.

Um anticorpo anti-ErbB2 também pode ser rotulado com um aminoácido radiorrotulado. O radiorrótulo pode ser usado para propósitos tanto de diagnóstico quanto terapêuticos. Por exemplo, o radiorrótulo pode ser usado para detectar células que expressam ErbB2 por raio χ ou outras técnicas de diagnóstico. Além disso, o radiorrótulo pode ser usado terapeuticamente como uma toxina para as células que expressam ErbB2, tais como aquelas que causam resposta imune não desejada. Os exemplos de rótulos para polipeptídeos incluem, mas não são limitados aos seguintes radioisótopos ou radionuclídeos: 3H, 14C, 15N35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125Ie 131I.

Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-ErbB2 pode ser rotulado com um íon paramagnético, radioativo ou fluorogênico que é detectável na formação de imagem. Em algumas formas de realização, o íon paramagnético é cromo (III), manganês (II), ferro (III), ferro (II), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), neodímio (III), samário (III), itérbio (III), gadolínio (III), vanádio (II), térbio (III), disprósio (III), hólmio (III) ou érbio (III). Em outras formas de realização, o íon radioativo é iodol23, tecnécio99, índio 111, rêniol88, rêniol86, cobre67, iodol31, ítrio90, iodol25, astatino211 e gálio67. Em outras formas de realização, o anticorpo anti-ErbB2 é rotulado com um agente de formação de imagem por raio X tal como lantânio (III), ouro (IH)? chumbo (II) e bismuto (III).

Um anticorpo anti-ErbB2 também pode ser derivatizado com um grupo químico tal como polietileno glicol (PEG), um grupo metila ou etila ou um grupo carboidrato. estes grupos são úteis para melhorar as características biológicas do anticorpo, por exemplo, para aumentar a meia vida sérica ou para aumentar a ligação de tecido.

Composições Farmacêuticas e Kits

A invenção diz respeito a composições que compreendem um agente de ligação alvejado e/ou anticorpo anti-ErbB2 humano com propriedades antagonistas para o tratamento de pacientes em necessidade de um procedimento terapêutico incluindo, mas não limitados àqueles afligidos com câncer. Em algumas formas de realização, o paciente do tratamento é um ser humano. Em outras formas de realização, o paciente é um paciente veterinário.

O tratamento pode envolver a administração de um ou mais anticorpos monoclonais anti-ErbB2 inibidores da invenção ou fragmentos de ligação de antígeno destes, sozinhos ou com um carreador farmaceuticamente aceitável. Os anticorpos anti-ErbB2 inibidores da invenção e composições que os compreendem, podem ser administrados em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos, de diagnóstico ou profiláticos.

Em certas formas de realização, os agentes terapêuticos da divulgação podem incluir agentes antineoplásticos. Os agentes antineoplásticos incluem, sem limitação, agentes com base em platina, tais como carboplatina e cisplatina; agentes alquiladores de mostarda nitrogenada; agentes alquiladores de nitrosouréia, tais como canustina (BCNU) e outros agentes alquiladores; antimetabólitos, tais como metotrexato; antimetabólitos análogos de purina; antimetabólitos análogos de pirimidina, tais como fluorouracila (5-FU) e gencitabina; antineoplásticos hormonais, tais como goserelina, leuprolida e tamoxifeno; antineoplásticos naturais, tais como taxanos (por exemplo, docetaxel e paclitaxel), aldesleucina, interleucina-2, etoposida (VP-16), interferon alfa e tretinoína (ATRA); antineoplásticos naturais antibióticos, tais como bleomicina, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina e mitomicina; e antineoplásticos naturais de alcalóide vinca, tais como vinblastina e vincristina.

Em várias formas de realização, o agente antineoplástico é 5- Fluoruracila, 6-mercatopurina, Actinomicina, Adriamicina®, Adrucil®, Aminoglutetimida, Anastrozol, Aredia®, Arimidex®, Aromasin®, Bonefos®, Bleomicina, carboplatina, Cactinomicina, Capecitabina, Cisplatina, Clodronato, Ciclofosfamida, Cytadren®, Cytoxan®, Dactinomicina, Docetaxel, Doxil®, Doxorrubicina, Epirrubicina, Etoposida, Exemestano, Ferrara®, Fluorouracila, Fluoximesterona, Halotestin®, Herceptin®, Letrozol, Leucovorin cálcico, Megace®, acetato de Megestrol, Metotrexato, Mitomicina, Mitoxantrona, Mutamicina®, Navelbine®, Nolvadex®, Novantrone®, Oncovin®, Ostac®, Paclitaxel, Pamidronato, Pharmorubicin®, Platinol®, prednisona, Procytox®, Tamofen®, Tamone®, Tamoplex®, Tamoxifeno, Taxol®, Taxotere®, Trastuzumab, Tiotepa, Velbe® e Vepesid®, Vinblastina, Vincristina, Vinorelbina, Xeloda® ou uma combinação deste. Em algumas formas de realização, o agente antineoplástico compreende um anticorpo monoclonal, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo de cadeia única ou um fragmento de um anticorpo. Os anticorpos exemplares incluem, mas não são limitados a, Rituxan, IDEC-C2B8, anti-CD20 Mab, Panorex, 3622W94, anti-EGP40 (Π- Ι A) antígeno de pancarcinoma em adenocarcinomas Herceptin®, Erbitux, anti-Her2, Anti-EGFr, BEC2, epítopo GD3 anti-idiotípico, Ovarex, B43.13, CA125 anti-idiotípico, 4B5, Anti-VEGF, RhuMAb, MDX-210, anti-HER2, MDX-22, MDX-220, MDX-447, MDX-260, anti-GD-2, Quadramet, CYT- 424, IDEC-Y2B8, Oncolym, Lynn-1, SMART M195, ATRAGEN, LDP-03, anti-CAMPATH, ior t6, anti CD6, MDX-11, OV103, Zenapax, Anti-Tac, receptor anti-IL-2, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, Prealvo, NovoMAb-G2, TNT, antihistona, Gliomab-H, GNI-250, EMD-72000, LymphoCide, CMA 676, Monopharm-C, anti-FLK-2, SMART ID 10, SMART ABL 364, ImmuRAIT-CEA ou combinações destes.

Já em uma outra forma de realização, o agente antineoplástico compreende um tipo adicional de célula de tumor. Em uma forma de realização específica, o tipo adicional de célula de tumor é uma célula MCF- 10A, MCF-IOF, MCF-10-2A, MCF-12A, MCF-12F, ZR-75-1, ZR-75-30, UACC-812, UACC-893, HCC38, HCC70, HCC202, HCC1007 BL, HCC1008, HCCl 143, HCC1187, HCC1187 BL, HCC1395, HCC1569, HCC1599, HCC1599 BL, HCC1806, HCC1937, HCC1937 BL, HCC1954, HCC1954 BL, HCC2157 , Hs 274.T, Hs 281.T, Hs 343.T, Hs 362.T, Hs 574.T, Hs 579.Mg, Hs 605.T, Hs 742.T, Hs 748.T, Hs 875.T, MB 157, SW527, 184A1, 184B5, MDA-MB-330, MDA-MB-415, MDA-MB-435S, MDA-MB-436, MDAMB-453, MDA-MB-468 RT4, BT-474, CAMA-1, MCF7[MCF-7], MDA-MB-134-VI, MDA-MB-157, MDA-MB-175-VII HTB-27 MDA-MB-361, SK-BR-3 ou ME-180, todas as quais são disponíveis da ATTC. Ainda em outras formas de realização, o agente antineoplástico compreende um reagente de anti-sentido, tal como um siRNA ou uma molécula de RNA de grampo de cabelo, que reduz a expressão ou função de um gene que é expressado em uma célula cancerosa. Os reagentes anti-sentido exemplares que podem ser usados incluem aqueles direcionados a mucina, Ha-ras, VEGFRl ou BRCAl. Tais reagentes são descritos nas Patentes U.S. N25 6.716.627 (mucina), 6.723.706 (Ha-ras), 6.710.174 (VEGFRl) e na Publicação de Patente U.S. Ns 2004/0014051 (BRCA1).

Em outras formas de realização, o agente antineoplástico compreende células autólogas ao paciente, tal como células do sistema imune tais como macrófagos, células T ou dendritos. Em algumas formas de realização, as células foram tratadas com um antígeno, tal como um peptídeo ou um antígeno do câncer ou foram incubados com células de tumor do paciente. Em uma forma de realização, linfócitos de sangue periférico autólogo podem ser misturados com células SV-BR-I e administrados ao paciente. Tais linfócitos podem ser isolados pela leucoforese. As células autólogas adequadas que podem ser usadas, os métodos para a sua isolação, métodos de modificar as ditas células para melhorar a sua eficácia e formulações que compreendem as ditas células são descritos nas Patentes U.S. Ne5 6.277.368, 6.451.316, 5.843.435, 5.928.639, 6.368.593 e 6.207.147 e nas Publicações PCT Internacionais N- W004/021995 e WO00/57705.

Em algumas formas de realização dos métodos aqui descritos direcionados ao tratamento de câncer, o paciente é tratado antes, concorrentemente com ou subseqüentemente ao tratamento com as células da presente invenção, com uma terapia complementar para o câncer, tal como cirurgia, quimioterapia, terapia de radiação ou terapia hormonal ou uma combinação destas.

Em uma forma de realização específica onde o câncer é câncer mamário, o tratamento complementar pode compreender a cirurgia conservadora da mama isto é uma operação para remover o câncer mas não a mama, também chamado cirurgia conservadora da mama, cirurgia conservante da mama, mastectomia, mastectomia segmentai ou mastectomia parcial. Em uma outra forma de realização, este compreende uma mastectomia. Uma mastectomia é uma operação para remover a mama ou tanto do tecido mamário quanto possível e em alguns casos também os linfônodos sob o braço. Já em uma outra forma de realização, a cirurgia compreende a biópsia dos linfônodos sentinela, onde apenas um ou um pouco dos linfônodos (o nodos sentinela) são removidos ao invés de remover um número muito maior de linfônodos debaixo do braço. A cirurgia também pode compreender a mastectomia radical modificada, onde um cirurgião remove a mama inteira, a maior parte ou todos os linfônodos sob o braço, e, freqüentemente, o revestimento sobre os músculos peitorais. O menor dos dois músculos peitorais também pode ser removido para tornar mais fácil

remover os linfônodos.

Em uma forma de realização específica, o tratamento complementar compreende a terapia de radiação. A terapia de radiação pode compreender radiação externa, onde a radiação vem de uma máquina ou de radiação interna (radiação de implante, em que a radiação origina-se de material radioativo colocado em tubos de plástico finos colocados diretamente na mama.

Em uma outra forma de realização específica, o tratamento complementar compreende a quimioterapia. Os agentes quimioterapêuticos descobertos serem de auxílio na supressão de tumores incluem mas não são limitados aos agentes alquiladores (por exemplo, mostardas nitrogenadas), antimetabólitos (por exemplo, análogos de pirimidina), isótopos radioativos (por exemplo, fósforo e iodo), agentes mistos (por exemplo, uréias substituídas) e produtos naturais (por exemplo, alcalóides vinca e antibióticos). Em uma forma de realização específica, o agente quimioterapêutico é selecionado do grupo que consiste de alopurinol sódico, mesilato de dolasetron, pamidronato dissódico, etidronato, fluconazol, epoetina alfa, levamisol HCl5 amifostina, granisetron HCl, leucovorin cálcico, sargramostim, dronabinol, mesna, filgrastim, pilocarpina HCl, acetato de octreotida, dexrazoxano, ondansetron HCl, ondansetron, busulfan, carboplatina, cisplatina, tiotepa, melfalan HCl, melfalan, ciclofosfamida, ifosfamida, clorambucila, mecloretamina HCl, carmustina, lomustina, polifeprosan 20 com implante de carmustina, estreptozocina, doxorrubicina HCl, sulfato de bleomicina, daunirrubicina HCl, dactinomicina, citrato de daunorrubicina, idarrubicina HCl, plimicina, mitomicina, pentostatina, mitoxantrona, valrubicina, citarabina, fosfato de fludarabina, floxuridina, cladribina, metotrexato, mercaptopurina, tioguanova, capecitabina, metiltestosterona, nilutamida, testolactona, bicalutamida, flutamida, anastrozol, citrato de toremifeno, fosfato de estramustina sódico, etinil estradiol, estradiol, estrogênios esterificados, estrogênios conjugados, acetato de leuprolida, acetato de goserelina, acetato de medroxiprogesterona, acetato de megestrol, levamisol HCl, aldesleucina, irinotecano HCl, dacarbazina, asparaginase, fosfato de etoposídeo, gencitabina HCl, altretamina, topotecano HCl, hidroxiuréia, interferon alfa-2b, mitotano, procarbazina HCl, tartarato de vinorelbina, L-asparaginase de E. coli, L-asparaginase de Erwinia, sulfato de vincristina, denileucina diftitox, aldesleucina, rituximab, interferon alfa-2a, paclitaxel, docetaxel, BCG vivo (intravesical), sulfato de vinblastina, etoposida, tretinoína, teniposida, porfímero sódico, fluorouracila, fosfato sódico de betametasona e acetato de betametasona, letrozol, etoposida citrororum factor, ácido folínico, leucouorina cálcica, 5-fluorouracila, adriamicina, citoxano e diamino dicloro platina, o dito agente de quimioterapia em combinação com timosina ai sendo administrados em uma quantidade eficaz para reduzir os ditos efeitos colaterais da quimioterapia no dito paciente. Em uma outra forma de realização específica, o tratamento complementar compreende a terapia hormonal. A terapia hormonal pode compreender o uso de um medicamento, tal como tamoxifeno, que pode bloquear os hormônios naturais como estrogênio ou pode compreender inibidores da aromatase que previnem a síntese de estradiol. Alternativamente, a terapia hormonal pode compreender a remoção dos ovários da paciente, especialmente se a paciente é uma mulher que não entrou ainda na menopausa.

Como aqui usado, "carreador farmaceuticamente aceitável" significa qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifungicos, agentes isotônicos e retardadores de absorção e outros que são fisiologicamente compatíveis. Alguns exemplos de carreadores farmaceuticamente aceitáveis são água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol e outros, assim como combinações destes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. Os exemplos adicionais de substâncias farmaceuticamente aceitáveis são agentes umectantes ou quantidades menores de substâncias auxiliares tais como agentes umectantes ou emulsificantes, conservantes ou tampões, que realçam a vida de prateleira ou eficácia do anticorpo.

As composições desta invenção podem estar em uma variedade de formas, por exemplo, formas de dosagem líquidas, semi-sólidas e sólidas, tais como soluções líquidas (por exemplo, soluções injetáveis e infusíveis), dispersões ou suspensões, tabletes, pílulas, pós, lipossomas e supositórios. A forma preferida depende do modo intencionado de administração e aplicação terapêutica. As composições preferidas típicas estão na forma de soluções injetáveis ou infusíveis, tais como composições similares àquelas usadas para a imunização passiva de seres humanos O modo preferido de administração é parenteral (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular). Em uma outra forma de realização, o anticorpo é administrado pela infusão ou injeção intravenosas. Em uma outra forma de realização preferida, o anticorpo é administrado pela injeção intramuscular ou subcutânea.

As composições terapêuticas tipicamente devem ser estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenagem. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, dispersão, lipossoma ou outra estrutura ordenada adequada para a concentração de medicamento alto. As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando-se o anticorpo anti-ErbB2 na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, como requerido, seguido pela esterilização filtrada. No geral, as dispersões são preparadas incorporando-se o composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma solução previamente filtrada estéril deste. A fluidez apropriada de uma solução pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. A absorção prolongada de composições injetáveis pode ser realizada pela inclusão na composição de um agente que retarde a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.

Os anticorpos da presente invenção podem ser administrados por uma variedade de métodos conhecidos na técnica, embora para muitas aplicações terapêuticas, a via/modo preferidos de administração é a infusão subcutânea, intramuscular ou intravenosa. Como será avaliado pelo técnico habilitado, a via e/ou modo de administração variará dependendo dos resultados desejados.

Em certas formas de realização, o composto ativo das composições de anticorpo pode ser preparado com um carreador que protegerá o anticorpo contra a liberação rápida, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, emplastros transdérmicos e sistemas de liberação microencapsulados. Os polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem ser usados, tais como etileno acetato de vinila, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, ácido poliláctico, quitosano e alginato. Muitos métodos para a preparação de tais formulações são patenteados ou no geral conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Ver, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Deliverv Systems (J. R. Robinson, ed., Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, 1978).

A invenção também fornece composições adequadas para a administração pela inalação, que compreendem os anticorpos anti-ErbB2 aqui descritos. Os anticorpos anti-ErbB2 podem ser convenientemente liberados a um paciente na forma de uma apresentação em pulverização de aerossol a partir de embalagens pressurizadas ou a partir de um nebulizador, com o uso de um propelente adequado, por exemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado a unidade de dosagem pode ser determinada fornecendo-se uma válvula para liberar uma quantidade medida. As cápsulas e cartuchos por exemplo, de gelatina para o uso em um inalador ou insuflador podem ser formuladas contendo uma mistura em pó do composto e uma base em pó adequada tal como lactose ou amido. Dellamary et al., (2004) J Control Release; 95(3): 489-500 descrevem formulações para

a liberação pulmonar de anticorpos.

A invenção também fornece composições, adequadas para a administração através da mucosa oral, que compreende o anticorpo anti- ErbB2 aqui descrito. A liberação transmucósica oral refere-se à liberação de um veículo de liberação através de uma membrana mucósica na cavidade oral, cavidade faríngica ou esofágica e pode ser contrastado, por exemplo, com a liberação oral tradicional, em que a absorção de um medicamento ocorre no intestino. Consequentemente, as vias de administração em que os anticorpos anti-ErbB2 são absorvidos através da mucosa bucal, sublingual, gengival, faríngea e/ou esofágica estão todas abrangidas dentro da "liberação transmucósica oral," como este termo é aqui usado. Para a administração através da mucosa transmucósica, o anticorpo anti-ErbB2 pode ser formulado, por exemplo, em gomas de mascar (ver a Pat U.S. Na 5.711.961) ou emplastros bucais (ver por exemplo a Patente U.S. N2 5.298.256).

A invenção também fornece composições adequadas para a administração através da mucosa vaginal, que compreende os anticorpos anti- ErbB2 aqui descritos. Os anticorpos anti-ErbB2 da invenção podem ser formulados em um supositório vaginal, espuma, creme, tablete, cápsula, pomada ou gel.

Em certas formas de realização, as composições farmacêuticas que compreendem os anticorpos anti-ErbB2 são formuladas com permeantes apropriados à barreira transmucósica a ser permeada. Tais penetrantes são no geral conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, para a administração transmucósica sais biliares e derivados do ácido fusídico.

Em certas formas de realização, um anticorpo anti-ErbB2 da invenção é oralmente administrado, por exemplo, com um diluente inerte ou um carreador comestível assimilável. O composto (e outros ingredientes, se desejado) também podem ser incluídos em uma cápsula de gelatina de casca dura ou mole, comprimidos em tabletes ou incorporados diretamente na dieta do paciente. Para a administração terapêutica oral, os anticorpos anti-ErbB2 podem ser incorporados com excipientes e usados na forma de tabletes ingeríveis, tabletes bucais, pastilhas, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, hóstias e outros. Para administrar um composto da invenção por outra que não a administração parenteral, pode ser necessário revestir o composto com ou co-administrar o composto com, um material para prevenir a sua inativação.

Compostos ativos adicionais também podem ser incorporados nas composições. Em certas formas de realização, um anticorpo anti-ErbB2 inibidor da invenção é co-formulado com e/ou co-administrado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, tais como aqueles listados supra. Tais terapias de combinação podem requerer dosagens mais baixas do anticorpo anti-ErbB2 inibidor assim como dos agentes co-administrados, evitando assim toxicidades ou complicações possíveis associadas com as várias monoterapias.

Os anticorpos anti-ErbB2 inibidores da invenção e as composições que os compreendem também podem ser administrados em combinação com outros regimes terapêuticos, em particular em combinação com tratamento cirúrgico, radiológico e/ou quimioterapia.

As composições da invenção podem incluir uma "quantidade terapeuticamente eficaz" ou uma "quantidade profilaticamente eficaz" de um anticorpo ou porção de ligação de antígeno da invenção. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para se obter o resultado terapêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou porção de anticorpo podem variar de acordo com fatores tais como o estado de doença, idade, sexo e peso do paciente e a capacidade do anticorpo ou porção de anticorpo para evocar uma resposta desejada no paciente. Uma quantidade terapeuticamente eficaz também é uma em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do anticorpo ou porção de anticorpo são superados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma "quantidade profilaticamente eficaz" refere- se a uma quantidade eficaz, nas dosagens e por períodos de tempo necessários, para se obter o resultado profilático desejado. Tipicamente, visto que uma dose profilática é usada em pacientes antes ou em qualquer estági*3 mais no início da doença, a quantidade profilaticamente eficaz pode ser menor do que a quantidade terapeuticamente eficaz.

Os regimes de dosagem podem ser ajustados para fornecer ^ resposta ótima desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica ovx profilática). Por exemplo, um único bolo pode ser administrado, várias dose^ divididas podem ser administradas com o tempo ou a dose pode seJ~ proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições· parenterais na forma de dosagem unitária para facilidade de administração & uniformidade de dosagem, a forma de unidade de dosagem como aqui usado refere-se a unidades fisicamente separadas adaptadas como dosagens unitárias para os pacientes mamíferos a serem tratados; cada unidade contendo uma quantidade pré determinada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o carreador farmacêutico requerido. O relatório descritivo para as formas unitárias de dosagem da invenção são ditadas e diretamente dependentes (a) das características únicas do anticorpo anti-ErbB2 ou porção deste e do efeito terapêutico ou profilático particular a ser obtido e (b) das limitações inerentes na técnica de combinação de um tal anticorpo para o tratamento de sensibilidade em pacientes.

Um faixa exemplar, não limitante para uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz de um anticorpo ou porção de anticorpo da invenção é de 0,025 a 50 mg/kg, mais preferivelmente de 0,1 a 50 mg/kg, mais preferivelmente de 0,1 a 25, 0,1 a 10 ou 0,1 a 3 mg/kg. Em algumas formas de realização, uma formulação contém 5 mg/ml de anticorpo em um tampão de 20 mM de citrato de sódio, pH 5,5, 140 mM de NaCl e 0,2 mg/ml de polissorbato 80. Deve ser mencionado que os valores de dosagem podem variar com o tipo e severidade da condição a ser aliviada. Deve ser entendido ainda que para qualquer paciente particular, os regimes de dosagem específicos devem ser ajustados com o tempo de acordo com a necessidade individual e o julgamento profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições e estas faixas de dosagem aqui apresentadas são apenas exemplares e não são intencionadas a limitar o escopo ou prática da composição reivindicada.

Um outro aspecto da presente invenção fornece kits que compreendem um anticorpo anti-ErbB2 ou porção de anticorpo da invenção ou uma composição que compreenda um tal anticorpo. Um kit pode incluir, além do anticorpo ou composição, agentes de diagnóstico ou terapêuticos. Um kit também pode incluir instruções para o uso em um método de diagnóstico ou terapêutico. Em uma outra forma de realização, o kit inclui o anticorpo ou uma composição que o compreenda e um agente de diagnóstico que pode ser usado em um método descrito abaixo. Em uma outra forma de realização preferida, o kit inclui o anticorpo ou uma composição que o compreenda e um ou mais agentes terapêuticos que podem ser usados em um método descrito abaixo.

Métodos de Diagnóstico de Uso

Em um outro aspecto, a invenção fornece métodos de diagnóstico. Os anticorpos anti-ErbB2 podem ser usados para detectar ErbB2 em uma amostra biológica in vitro ou in vivo. Em uma forma de realização, a invenção fornece um método para diagnosticar a presença ou localização de uma célula que expressa ErbB2 em um paciente em necessidade deste, que compreende as etapas de administrar o anticorpo ao paciente, determinar a expressão de ErbB2 no paciente localizando-se onde o anticorpo ligou-se, comparar a expressão no paciente com aquela de um paciente de referência normal ou padrão e diagnosticar a presença ou localização das células. Os anticorpos anti-ErbB2 também podem ser usados como um marcador de proliferação.

Os anticorpos anti-ErbB2 podem ser usados em um imunoensaio convencional, incluindo, sem limitação, um ELISA, um RIA, citometria de fluxo, imunoistoquímica de tecido, Western blot ou imunoprecipitação. Os anticorpos anti-ErbB2 da invenção podem ser usados para detectar ErbB2 de seres humanos Em uma outra forma de realização, os anticorpos anti-ErbB2 podem ser usados para detectar ErbB2 de macacos cinomolgos ou macacos rhesus. Em uma outra forma de realização, os anticorpos anti-ErbB2 podem ser usados para detectar ErbB2 de roedores, tais como camundongos e ratos.

A invenção fornece um método para detectar ErbB2 em uma amostra biológica que compreende contatar a amostra biológica com um anticorpo anti-ErbB2 da invenção e detectar o anticorpo ligado. Em uma forma de realização, o anticorpo anti-ErbB2 é diretamente rotulado com um rótulo detectável. Em uma outra forma de realização, o anticorpo anti-ErbB2 (o primeiro anticorpo) não é rotulado e um segundo anticorpo ou outra molécula que pode ligar o anticorpo anti-ErbB2 é rotulado. Como é bem conhecido a uma pessoa de habilidade na técnica, um segundo anticorpo é escolhido que é capaz de ligar especificamente as espécies particulares e classes do primeiro anticorpo. Por exemplo, se o anticorpo anti-ErbB2 é uma IgG humana, então o anticorpo secundário poderia ser um anti-IgG humano. Outras moléculas que podem se ligar a anticorpos incluem, sem limitação, Proteína A e Proteína G, ambas as quais são comercialmente disponíveis, por exemplo, da Pierce Chemical Co.

Os rótulos adequados para o anticorpo ou anticorpo secundário foram divulgados supra e incluem várias enzimas, grupos protéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes e materiais radioativos. Os exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, β- galactosidase ou acetilcolinesterase; os exemplos de complexos de grupos protéticos adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; os exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansila ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui luminol; e exemplos de materiais radioativos adequados incluem 125I, 131I535Se3H.

Em outras formas de realização, ErbB2 pode ser ensaiado em

uma amostra biológica por um imunoensaio de competição utilizando padrões de ErbB2 rotulados com uma substância detectável e um anticorpo anti-ErbB2 não rotulado. Neste ensaio, a amostra biológica, os padrões de ErbB2 rotulados e o anticorpo anti-ErbB2 são combinados e a quantidade de padrão de ErbB2 rotulado ligado ao anticorpo não rotulado é determinada. A quantidade de ErbB2 na amostra biológica é inversamente proporcional à quantidade de padrão de ErbB2 rotulado ligado ao anticorpo anti-ErbB2.

Pode-se usar os imunoensaios divulgados acima para vários propósitos. Por exemplo, os anticorpos anti-ErbB2 podem ser usados para detectar ErbB2 em células cultivadas. Em uma outra forma de realização, os anticorpos anti-ErbB2 são usados para determinar a quantidade de ErbB2 na superfície de células que foram tratadas com vários compostos. Este método pode ser usado para identificar compostos que modulam os níveis da proteína de ErbB2. De acordo com este método, uma amostra de células é tratada com um composto de teste por um período de tempo enquanto uma outra amostra é deixada sem tratar. Se o nível de ErbB2 total deva ser medido, as células são lisadas e o nível de ErbB2 total é medido usando um dos imunoensaios descritos acima. O nível total de ErbB2 nas células tratadas versus as não tratadas é comparado para determinar o efeito do composto de teste. Um imunoensaio preferido para medir os níveis de ErbB2

totais é a citometria de fluxo ou imunoistoquímica. Se o nível de ErbB2 na superfície da célula deva ser medido, as células não são lisadas e os níveis de ErbB2 na superfície da célula são medidos usando um dos imunoensaios descritos acima. Um imunoensaio preferido para determinar os níveis de ErbB2 na superfície da célula inclui as etapas de rotular as proteínas da

125

superfície da célula com um rótulo detectável, tal como biotina ou I, imunoprecipitação do ErbB2 com um anticorpo anti-ErbB2 e depois detectar o ErbB2 rotulado.

Um outro imunoensaio preferido para determinar a localização de ErbB2, por exemplo, níveis na superfície da célula, é pelo uso da imunoistoquímica. Um imunoensaio preferido para detectar níveis de ErbB2 na superfície da célula inclui a ligação de um anticorpo anti-ErbB2 rotulado com um fluoróforo apropriado, tal como fluoresceína ou ficoeritrina e detectando o anticorpo primário usando citometria de fluxo. Em uma outra forma de realização, o anticorpo anti-ErbB2 não é rotulado e um segundo anticorpo ou outra molécula que pode ligar o anticorpo anti-ErbB2 é rotulada. Métodos tais como ELISA, RIA, citometria de fluxo, Western blot, imunoistoquímica, rotulação da superfície da célula de proteínas de membrana integrais e imunoprecipitação são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Harlow e Lane, supra. Além disso, os imunoensaios podem ser dimensionados para a triagem de alto rendimento de modo a testar um número grande de compostos quanto a ativação ou inibição de ErbB2.

Os anticorpos anti-ErbB2 da invenção também podem ser usados para determinar os níveis de ErbB2 em um tecido ou em células derivadas do tecido. Em uma forma de realização, os anticorpos anti-ErbB2 são usados para determinar a infiltração de células que expressam ErbB2 em tecidos que não expressam ErbB2 ou que o expressam em níveis reduzidos comparados com as células de infiltração. Em algumas formas de realização, o tecido é um tecido doente. Em algumas formas de realização, o tecido é uma biópsia de tecido. Em algumas formas de realização do método, um tecido ou uma biópsia deste são excisados de um paciente. O tecido ou biópsia são depois usados em um imunoensaio para determinar, por exemplo, os níveis de ErbB2 totais, níveis de ErbB2 na superfície da célula ou localização de ErbB2 pelos métodos debatidos acima. Tais métodos podem ser usados para determinar se um tecido expressa níveis altos de ErbB2, que seria indicativo de que o tecido é um alvo para o tratamento com o anticorpo anti-ErbB2.

Os anticorpos da presente invenção também podem ser usados in vivo para identificar tecidos e órgãos que expressam ErbB2. Em algumas formas de realização, os anticorpos anti-ErbB2 são usados para identificar células que expressam ErbB2. Uma vantagem de usar os anticorpos anti- ErbB2 humanos da presente invenção é que eles podem ser usados com segurança in vivo sem evocar uma resposta imune substancial para o anticorpo na administração, diferente dos anticorpos de origem não humana ou com anticorpos humanizados ou quiméricos. O método compreende as etapas de administrar um anticorpo anti-ErbB2 detectavelmente rotulado ou uma composição que os compreendam a um paciente em necessidade de um tal teste de diagnóstico e submeter o paciente à análise de formação de imagem para determinar a localização dos tecidos que expressam ErbB2. A análise de formação de imagem é bem conhecida na técnica médica e inclui, sem limitação, análise de raio X, formação de imagem pela ressonância magnética (MRI) ou tomografia computadorizada (CT). O anticorpo pode ser rotulado com qualquer agente adequado para a formação de imagem in vivo, por exemplo um agente de contraste, tal como bário, que pode ser usado para a análise de raio X ou um agente de contraste magnético, tal como um quelato de gadolínio, que pode ser usado para MRI ou CT. Outros agentes de rotulação incluem, sem limitação, radioisótopos, tais como 99Tc. Em uma outra forma de realização, o anticorpo anti-ErbB2 será não rotulado e será formado em imagem pela administração de um segundo anticorpo ou outra molécula que seja detectável e que possa ligar-se ao anticorpo anti-ErbB2. Em uma outra forma de realização, uma biópsia é obtida do paciente para determinar se o tecido de interesse expressa ErbB2.

Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-ErbB2 detectavelmente rotulado compreende um fluoróforo. Em certas formas de realização, o fluoróforo é selecionado de um corante fluorescente próximo ao infravermelho, dinitrofenila, fluoresceína e derivados desta, rodamina, derivados de rodamina, ficoeritrina, ficocianina, alofícocianina, o-ftaldeído e

r

fluorescamina, Vermelho do Texas, Verde de Rodamina, verde de Oregon, azul cascata, ficoeritrina, CY3, CY5, CY2, CY7, coumarina, infravermelho 40, MR 200, IRD 40, Alexa Flúor, Azul Cascata, Tetrametilrodamina, Azul Pacífico, SYBR e BODIPY. Em uma outra forma de realização, o fluoróforo inclui um dos seguintes compostos com a sua máxima de emissão indicada em nm em parênteses, Cy2® (506), GFP (Mudado para Vermelho) (507), YO- PRO®-l (509), YOYO ®-l (509), Calceína (517), FITC (518), FluorX® (519), Alexa® (520), Rodamina 110 (520), 5-FAM (522), Verde Óregon® 500 (522), Verde Óregon® 488 (524), RiboGreen® (525), Verde de Rodamina® (527), Rodamina 123 (529), Verde de Magnésio® (531), Verde de Cálcio® (533), TO-PRO®-l (533), TOTO®-l (533), JOE (548), BODIPY® 530/550 (550), Dil (565), BODIPY® (568), BODIPY® 558/568 (568), BODIPY® 564/570 (570), Cy3® (570), Alexa® 546 (570), TRITC (572), Laranja de Magnésio®

(575), Ficoeritrina R&B (575), Rodamin Faloidina (575), Laranja de Cálcio®

(576), Pironina Y (580), Rodamina B (580), TAMRA (582), Vermelho de Rodamina® (590), Cy3,5® (596), ROX (608), Cálcio Crimson® (615), Alexa®

594 (615), Vermelho Texas® (615), Vermelho do Nilo (628), YO-PRO®-3 (631), YOYO®-3 (631), R-ficocianina (642), C-Ficocianina (648), TO- PRO®-3 (660), TOTO®-3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5® (670), Tiadicarbocianina (671) e Cy5,5 (694). Métodos Terapêuticos de Uso

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece um método para inibir a atividade de ErbB2 pela administração de um agente de ligação alvejado e/ou um anticorpo anti-ErbB2 a um paciente em necessidade deste. Em uma outra forma de realização, o anticorpo anti-ErbB2 é um anticorpo quimérico humano ou humanizado. Em uma outra forma de realização preferida, o ErbB2 é humano e o paciente é um paciente humano. Alternativamente, o paciente pode ser um mamífero que expresse um ErbB2 com que o agente de ligação alvejado e/ou anticorpo anti-ErbB2 reagem cruzado. O agente de ligação alvejado e/ou o anticorpo podem ser administrados a um mamífero não humano que expresse ErbB2 com que o anticorpo reage cruzado (isto é um macaco cinomolgo) para propósitos veterinários ou como um modelo de animal de doença humana. Tais modelos de animal podem ser úteis para avaliar a eficácia terapêutica de anticorpos desta invenção.

Em uma forma de realização, a invenção fornece métodos de tratar ou prevenir um distúrbio mediado por ErbB2 em um paciente pela administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de ligação alvejado e/ou um anticorpo anti-ErbB2 da invenção. Como aqui usado, o termo "um distúrbio mediado por ErbB2" é intencionado a incluir doenças e outros distúrbios em que a presença de níveis de expressão ou atividade de ErbB2 alta ou aumentada em um paciente que sofre do distúrbio mostraram ser ou são suspeitos de serem, responsáveis pela fisiopatologia do distúrbio ou um fator que contribui para uma piora do distúrbio. Tais distúrbios podem ser evidenciados, por exemplo, por um aumento na expressão ou nos níveis de ErbB2 na superfície da célula nas células ou tecidos afetados de um paciente que sofre do distúrbio ou por um aumento em uma atividade mediada por ErbB2 em um tipo de célula, tal como em uma célula cancerosa, que contribui para a patologia do distúrbio ou que contribui para a piora do distúrbio. O aumento nos níveis de ErbB2 pode ser detectado, por exemplo, usando um anticorpo anti-ErbB2. Um aumento na atividade de ErbB2 pode ser detectado pelo aumento da fosforilação de ErbB2, ativação do caminho de MAPK, ativação do caminho de p38-TSP-l, ativação do caminho de P13K, inibição de CDC2 e combinações destes. Um outro aspecto da invenção fornece um método para inibir a proliferação de uma célula cancerosa, que expresse ErbB2, em um paciente em necessidade deste, o método compreendendo a etapa de administrar ao dito paciente um agente de ligação alvejado e/ou um anticorpo anti-ErbB2 ou porção de ligação de antígeno deste, em que o dito agente de ligação alvejado ou anticorpo ou porção inibe ErbB2. Um outro aspecto fornece um método para inibir uma atividade de ErbB2 em uma célula que expresse ErbB2, que compreende contatar a célula com um agente de ligação alvejado, um anticorpo anti-ErbB2 ou porção de ligação de antígeno deste, em que a atividade de ErbB2 na célula é selecionada do grupo que consiste de (a) fosforilação de ErbB2; (b) ativação do caminho de MAPK; (c) ativação do caminho de p38-TSP-l; (d) ativação do caminho de P13K; (e) inibição de CDC2; e (f) combinações destes. Em uma outra forma de realização, a célula está em um paciente.

O agente de ligação alvejado e/ou o anticorpo podem ser administrados uma vez, mas mais preferivelmente são administrados múltiplas vezes. O agente de ligação alvejado e/ou o anticorpo podem ser administrados de três vezes diárias a uma vez a cada seis meses ou mais longo. A administração pode ser em um programa tal como de três vezes ao dia, duas vezes ao dia, uma vez ao dia, uma vez a cada dois dias, uma vez a cada três dias, uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada mês, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada três meses e uma vez a cada seis meses. O agente de ligação alvejado e/ou anticorpo também podem ser administrados continuamente por intermédio de uma minibomba. O agente de ligação alvejado e/ou anticorpo pode ser administrado por intermédio de uma via oral, mucósica, bucal, intranasal, inalável, intravenosa, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intraocular, intraespinhal, parenteral, intramucósica ou tópica. O agente de ligação e/ou anticorpo alvejados podem ser administrados local ou sistemicamente. As composições terapêuticas que compreendem um agente de ligação alvejado e/ou um anticorpo anti-ErbB2 podem ser administradas ao paciente, por exemplo, oral, nasal, vaginal, bucal, retalmente, por intermédio dos olhos ou por intermédio da via pulmonar, em um variedade de formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis, que será familiar para aqueles habilitados na técnica.

Por exemplo, os anticorpos anti-ErbB2 podem ser administrados por intermédio da via nasal usando um dispositivo insuflador nasal. O exemplo destes já são facilmente utilizados para sistemas de pó comerciais intencionados para a aplicação nasal (por exemplo Fisons Lomudal System). Os detalhes de outros dispositivos podem ser encontrado na literatura farmacêutica (ver por exemplo Bell, A. Intranasal Delivery devices, em Drug Delivery Devices Fundamentais and Applications, Tile P. (ed), Dekker, Nova Iorque, 1988). Os anticorpos anti-ErbB2 podem ser administrados à vagina

em uma formulação em pó seco por congelamento. Os anticorpos anti-ErbB2 podem ser administrados em um aplicador vaginal e uma vez que na vagina, a formulação que compreende os anticorpos anti-ErbB2 são liberados pressionando-se um pistão tipo seringa ou mecanismo de liberação similar no aplicador. Alternativamente, os anticorpos anti-ErbB2 podem ser formulados como um pó usando um dispositivo de pó, formulado em um supositório vaginal ou pessário ou tablete vaginal ou gel vaginal.

Os anticorpos anti-ErbB2 também podem ser administrados ao olho em uma formulação em gel. Por exemplo, antes da administração, uma formulação contendo os anticorpos anti-ErbB2 podem ser convenientemente contidos em um recipiente de dose unitária de dois compartimentos, um compartimento contendo uma preparação de anticorpo anti-ErbB2 seca por congelamento e o outro compartimento contendo solução salina normal. Antes da aplicação, os dois compartimentos são misturados e um gel é formado, que é depois administrado ao olho.

Outras vias de liberação para os anticorpos anti-ErbB2 incluem por intermédio da via pulmonar usando um inalador de pó ou inalador de dose medida, por intermédio da via bucal formulada em um tablete ou um emplastro bucal, por intermédio da via retal formulados em supositórios; e por intermédio da via oral na forma de um tablete, uma cápsula ou uma pelota (composições estas que podem administrar agente por intermédio do estômago, do intestino delgado ou do cólon), todos os quais podem ser formulados de acordo com técnicas que são bem conhecidas por aqueles habilitados no ramo.

O anticorpo no geral será administrado como parte de uma composição farmacêutica como descrita supra. A dosagem de anticorpo no geral estará na faixa de 0,1 a 100 mg/kg, mais preferivelmente de 0,5 a 50 mg/kg, mais preferivelmente de 1 a 20 mg/kg e ainda mais preferivelmente de 1 a 10 mg/kg. A concentração sérica do anticorpo pode ser medida por qualquer método conhecido na técnica.

A co-administração do anticorpo com um agente terapêutico adicional (terapia de combinação) abrange administrar uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo anti-ErbB2 e o agente terapêutico adicional assim como administrar duas ou mais composições farmacêuticas separadas, uma que compreenda o anticorpo anti-ErbB2 e a(s) outra(s) que compreenda(m) o(s) agente(s) terapêutico(s) adicional(is). Além disso, embora a co-administração ou terapia de combinação no geral signifique que o anticorpo e agentes terapêuticos adicionais são administrados ao mesmo tempo como um outro, isto também abrange casos em que o anticorpo e agentes terapêuticos adicionais são administrados em tempos diferentes. Por exemplo, o anticorpo pode ser administrado uma vez a cada três dias, enquanto o agente terapêutico adicional é administrado uma vez ao dia. Alternativamente, o anticorpo pode ser administrado antes ou subsequente ao tratamento do distúrbio com o agente terapêutico adicional, por exemplo depois de um paciente ter falhado na terapia com o agente adicional. Similarmente, a administração do anticorpo anti-ErbB2 pode ser administrada antes ou subsequente a outra terapia, tal como imunoterapia.

O anticorpo e um ou mais agentes terapêuticos adicionais (a

terapia de combinação) podem ser administrados uma vez, duas vezes ou pelo menos o período de tempo até que a condição seja tratada, aliviada ou curada. Preferivelmente, a terapia de combinação é administrada múltipla vezes. A terapia de combinação pode ser administrada de três vezes ao dia a uma vez a cada seis meses. A administração pode ser em um programa tal como três vezes ao dia, duas vezes ao dia, uma vez ao dia, uma vez a cada dois dias, uma vez a cada três dias, uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada mês, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada três meses e uma vez a cada seis meses ou pode ser administrada continuamente por intermédio de uma minibomba. A terapia de combinação pode ser administrada por intermédio de uma via oral, mucósica, bucal, intranasal, inalável, intravenosa, subcutânea, intraocular, intraespinhal, intraperitoneal, intramuscular, parenteral, intratumoral ou tópica.

Ainda em uma outra forma de realização, o anticorpo anti- ErbB2 é rotulado com um radiorrótulo, uma imunotoxina ou uma toxina ou é uma proteína de fusão que compreenda um peptídeo tóxico. O anticorpo anti- ErbB2 ou proteína de fusão de anticorpo anti-ErbB2 direciona o radiorrótulo, imunotoxina, toxina ou peptídeo tóxico à célula que expressa ErbB2. Em uma outra forma de realização, o radiorrótulo, imunotoxina, toxina ou peptídeo tóxico são internalizados depois que o anticorpo anti-ErbB2 se liga ao ErbB2 na superfície da célula.

Terapia de gene

As moléculas de ácido nucléico da presente invenção podem ser administradas a um paciente em necessidade deste por intermédio da terapia de gene. A terapia pode ser in vivo ou ex vivo. Em uma outra forma de realização, as moléculas de ácido nucléico que codificam tanto uma cadeia pesada quanto uma cadeia leve são administradas a um paciente. Em uma forma de realização mais preferida, as moléculas de ácido nucléico são administradas tal que elas sejam estavelmente integradas em cromossomas das células B porque estas células são especializadas para produzir anticorpos. Em uma outra forma de realização, as células B precursoras são transfectadas ou infectadas ex vivo e re-transplantadas em um paciente em necessidade deste. Em uma outra forma de realização, as células B precursoras ou outras células são infectadas in vivo usando um vírus conhecido por infectar o tipo de célula de interesse. Os vetores típicos usados para a terapia de gene incluem lipossomas, plasmídeos e vetores virais. Os vetores virais exemplares são retrovírus, adenovírus e vírus adeno-associados. Depois da infecção in vivo ou ex vivo, os níveis de expressão de anticorpo podem ser monitorados tomando-se uma amostra do paciente tratado e usando qualquer imunoensaio conhecido na técnica ou aqui debatido.

Em uma outra forma de realização, o método da terapia de gene compreende as etapas de administrar uma molécula de ácido nucléico isolada que codifica a cadeia pesada ou uma porção de ligação de antígeno desta de um anticorpo anti-ErbB2 e que expressa a molécula de ácido nucléico. Em uma outra forma de realização, o método de terapia de gene compreende as etapas de administrar uma molécula de ácido nucléico isolada que codifica a cadeia leve ou uma porção de ligação de antígeno desta de um anticorpo anti-ErbB2 e que expressa a molécula de ácido nucléico. Em um método mais preferido, o método da terapia de gene compreende as etapas de administrar uma molécula de ácido nucléico isolada que codifica a cadeia pesada ou uma porção de ligação de antígeno desta e uma molécula de ácido nucléico isolada que codifica a cadeia leve ou a porção de ligação de antígeno desta de um anticorpo anti-ErbB2 da invenção e que expressa as moléculas de ácido nucléico. O método da terapia de gene também pode compreender a etapa de administrar um outro agente terapêutico, tal como um agente anticâncer.

A fim de que esta invenção possa ser melhor entendida, os seguintes exemplos são apresentados. Estes exemplos são apenas com propósitos de ilustração e não devem ser interpretados como limitando o escopo da invenção de nenhuma maneira.

EXEMPLO 1

IMUNIZAÇÃO E TITULAÇÃO

Imunização

A proteína de fusão ErbB2 humano-ECD/Fcy 1 recombinante contendo o domínio extracelular de ErbB2 humano e a região Fc da IgGl humana foi obtida da R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN catálogo #1129- ER/CF) para o uso como imunógeno. Anticorpos monoclonais contra ErbB2 foram desenvolvidos imunizando-se seqüencialmente camundongos Xenomouse® (Xenomouse cepa XM3B-3, Abgenix, Inc. Fremont, CA) por intermédio de injeções na almofada da pata. A primeira injeção foi com 10 μg de ErbB2 humano-ECD/Fcy 1 recombinante em Titermax Gold (Sigma, catálogo # T2684, lote # Kl599) por camundongo. Os 10 reforços seguintes foram com 10 μg de ErbB2 humano-ECD/Fcy 1 recombinante em 15 μΐ de qCpG (ImmunEasy Mouse Adjuvant, catálogo #303101; Qiagen), misturados com 5 μΐ de Adju-Phos (gel de fosfato de alumínio, Catálogo # 1452-250, HCI Biosector) por camundongo. O volume total de cada injeção foi de 50 μΐ por camundongo, 25 μΐ por almofada de pata. Os camundongos foram imunizados duas vezes semanalmente por 5 semanas e a fusão foi realizada no dia 39.

Seleção de Animais para Colheita por Titragem Os camundongos Xenomouse imunizados foram sangrados depois do 8o reforço e os títulos de anticorpo anti-ErbB2 nos soros foram determinados pela análise de FACS (Separador de Célula Ativado pela Fluorescência).

Para este propósito, um Vetor de expressão de ErbB2 humano foi construído e células pré-B B300.19 de camundongo foram transfectadas para expressar a proteína de ErbB2 humana. O cDNA de ErbB2 humano foi derivado pela RT-PCR a partir de células A431 de carcinoma epidermóide humano (ATCC, catálogo #CRL-1555) e clonado no vetor de expressão pCR3.1 (Invitrogen, catálogo #K3000) através dos sítios de clivagem de restrição de endonuclease HindIII e NotI. O vetor de expressão conteve um inserto de 3768 pares de base que codifica o ErbB2 humano de tamanho natural. O plasmídeo acima foi transfectado em células B300.19 usando o método da eletroporação. Os clones B300.19 estáveis que expressam a proteína hErbB2 foram selecionados na presença de puromicina (2,5 μg/ml) e depois triados por FACS com um anticorpo anti-hErbB2 quimérico (aqui aludido como 2C4, fabricado como detalhado em Câncer Immunol. Imunotherapy (2006) 55: 717-727 intitulado "Humanization of a recombinant monoclonal antibody to produce a therapeutic HER dimerization inhibitor, pertuzumab") seguido pela IgG anti-camundongo de cabra PE (Caltag, catálogo #M30004-4). B300.19/hErbB2 clone #44, dando a média geométrica mais alta em FAC S, foi selecionada para a determinação do título sérico.

Os soros de camundongos imunizados e sangrados foram titulados em tampão FACS (PBS com 2 % de FBS) em diluições a 1:50, 1:250 ou 1:1250. As células B300.19/hErbB2 clone #44 (células positivas) e as células precursoras B300.19 (células negativas) foram incubadas com soros diluídos em série por 1 hora e depois com IgG anti-humana de cabra conjugada com Cy5 (Jackson ImmunoResearch Labs/JIR, catálogo #109-176- 098) por mais 30 minutos. mAb Anti-ErbB2 2C4 foi usado como um controle positivo enquanto um anticorpo anti-KLH Gl gerado em casa (Gmix) foi usado como um controle de isótipo Gl. Depois de lavagem extensiva, as células foram re-colocadas em suspensão em tampão FACS e analisada em um instrumento BD FACS. A média geométrica de cada amostra foi determinada depois da análise de dados e é mostrada na Tabela 2 abaixo. A razão da média geométrica nas células ErbB2 positivas em relação à média geométrica em células ErbB2 negativas correlaciona-se com a capacidade de ligação específica ao ErbB2. Os controles negativos, incluindo o Gmix anti- KLH de controle de isótipo Gl, os anticorpos secundários de IgG Cy5 de anti- camundongo de cabra de controle (JIR, catálogo #115-176-071) e IgG PE anti-humano de cabra sozinho, deram uma razão de média geométrica abaixo de 1. Enquanto que o mAb de controle positivo 2C4 e os soros de todos os 10 camundongos imunizados deram razões entre 2,98 e 7,55, portanto todos os camundongos desenvolveram resposta imune humoral ao ErbB2 humano. Tabela 2. Títulos séricos: 10 camundongos ícepa XM3B-3)

Amostras Médias Geométricas Média Média Geométrica de Razão da Diluição Geométrica de Células Média Camundongo ID de ensaio Células Positivas Negativas Geométrica 5152-1 1:50 324 62,2 5,21 1:250 251 45,1 5,57 1:1250 177 26,5 6,68 5152-2 1:50 308 75 4,11 1:250 209 39,9 5,24 1:1250 146 23,4 6,24 5152-3 1:50 304 85,3 3,56 1:250 199 40,1 4,96 1:1250 157 21,1 7,44 5152-4 1:50 331 111 2,98 1:250 227 42,8 5,30 1:1250 166 22 7,55 5152-5 1:50 196 55,1 3,56 1:250 142 26,4 5,38 1:1250 91.7 16,2 5,66 5152-6 1:50 214 66,9 3,20 1:250 129 33,1 3,90 1:1250 92,4 17,5 5,28 5152-7 1:50 278 88,1 3,16 1:250 157 38,1 4,12 _ 1:1250 122 20,5 5,95 5152-8 1:50 240 58,3 4,12 1:250 168 27,2 6,18 1:1250 94,3 16 5,89 5152-9 1:50 208 46,2 4,50 1:250 137 24,1 5,68 1:1250 89,9 15,9 5.65 5152-10 1:50 256 82,9 3,09 1:250 157 40,5 3.88 __ 1:1250 131 22,7 5,77

EXEMPLO 2

RECUPERAÇÃO DE LINFÓCITOS. ISOLACÕES DE CÉLULA B. FUSÕES E GERAÇÃO DE H1BRIDOMAS

Os linfônodos (LN) foram colhidos dos camundongos imunizados e processados em 3 ml de tampão FASC estéril (PBS, 2 % de FBS). As células LN foram filtradas através de um filtro de célula de 40 μπι, girados a 400g por 3 minutos e recolocadas em suspensão em 3 ml de tampão FACS fresco. As células foram contadas e depois anticorpos biotinilados contra CD90 (Pharmingen, catálogo #553002), CD4 (Pharmingen, catálogo #553728), CD8 (Pharmingen, catálogo #553029) e IgM (Pharmingen, catálogo #555781) foram adicionados. As células e os anticorpos acima foram misturados suavemente e incubados por 10 minutos em gelo. As células foram mais uma vez giradas e lavadas uma vez com tampão FACS. Pérolas SA Dynal (M-280) foram adicionadas às células a uma razão de 4:1 de pérolas para células alvo e incubadas na temperatura ambiente por 12 minutos com rotação. As células/pérolas em tubos de 15 ml foram colocadas no campo magnético do magneto Dynal por 2 minutos. O sobrenadante contendo a fração IgM foi transferida a um tubo fresco e a etapa do magneto foi repetida mais uma vez. O sobrenadante de célula foi transferido a um tubo final e as células IgM foram contadas e aliquotadas para fusão.

A fusão foi realizada misturando-se células B enriquecidas lavadas do acima e não células P3X63Ag8.653 de mieloma secretor adquirido da ATCC (catálogo # CRL 1580) (Kearney et al, J. Immunol. 123, 1979, 1548-1550) a uma razão de 1:1. A mistura de célula foi levemente pelotizada pela centrifugação a 800 χ g. Depois da remoção completa do sobrenadante, as células foram tratadas com 2 a 4 ml de solução de Pronase (CalBiochem, cat. # 53702; 0,5 mg/ml em PBS) por não mais do que 2 minutos. Depois 3 a ml de FBS foram adicionados para interromper a atividade de enzima e a suspensão foi ajustada ao volume total de 40 ml usando solução de eletro fusão de célula (ECFS: 0,3 M de Sacarose, 0,1 mM de Acetato de Magnésio, 0,1 mM de Acetato de Cálcio, todos da Sigma). O sobrenadante foi removido depois da centrifugação e as células foram recolocadas em suspensão em 40 ml de ECFS. Esta etapa de lavagem foi repetida e as células mais uma vez foram recolocadas em suspensão em ECFS a uma concentração de 2 χ IO6 células/ml.

A eletro-füsão de célula foi realizada usando um gerador de fusão (modelo ECM2001, Genetronic, Inc., San Diego, CA), de acordo com os ajustes de instrumento padrão. Depois da ECF, as suspensões de célula foram cuidadosamente removidas da câmara de fusão e transferidas em um tubo estéril contendo o mesmo volume de Meio de Cultura de Hibridoma contendo DMEM (JRH Biosciences), 15 % de FBS (Hyclone), suplementado com L-glutamina, Penicilina/ Estreptomicina, OPI (oxaloacetato, piruvato, insulina bovina) (todos da Sigma) e IL-6 (Boehringer Mannheim). As células foram incubadas por 15 a 30 minutos a 37 0C e depois centrifugadas a 400 χ g (1000 rpm) por cinco minutos. As células foram suavemente recolocadas em suspensão em Meio de Seleção de Hibridoma (Meio de Cultura de Hibridoma suplementado com 0,5x HA (Sigma, cat. # A9666)), com base em um plaqueamento final de 2 χ IO5 células B total por placa de 96 reservatórios e 200 μΐ por reservatório. As células foram ligeiramente misturadas e pipetadas em placas de 96 reservatórios e deixadas crescer. No dia 7 ou 10, metade do meio foi removido e as células foram re-alimentadas com Meio de Seleção de Hibridoma.

EXEMPLO 3

TRIAGEM DE ANTICORPOS POR FMAT/FACS

Depois de 14 dias de cultura, os sobrenadantes de hibridoma foram triados quanto aos anticorpos específicos de ErbB2 pela FMAT (Tecnologia de Ensaio de Microvolume Fluorométrico). Em resumo, 4275 células de B300.19/hErbB2 (células positivas) ou B300.19 (células negativas em ErbB2) foram misturadas com 400 ng/ml de Cy5 IgG anti-humana de cabra (JIR, catálogo # 109-176-098) em 15 μΐ de tampão de FACS e depois incubadas com 15 μΐ de sobrenadante de hibridoma por 3 horas na temperatura ambiente. O anticorpo de controle positivo foi anti-hErbB2 (2C4), que foi detectado com Cy5 IgG gama anti-camundongo de cabra (JIR, catálogo #115-176-071) ou IgG-Biot anti-camundongo de cabra (Southern Biotechnology/SB catálogo # 1030-08, 400 ng/ml) em combinação com SA- Cy5 (JIR catálogo #016-170-084, 350 ng/ml). Um anticorpo GI anti-KLH (Gmix, caseiro) foi usado como um controle de isótipo. As placas foram lidas em FMAT 8100 HTS systems da Applied Biosystems. Tanto os sinais de fluorescência quanto as contagens foram determinados depois da análise de dados e 362 hibridomas positivos que mostraram ligação às células positivas em ErbB2 mas não às células negativas foram identificados.

Os 362 sobrenadantes positivos na triagem de FMAT foram triados ainda pelo FACS em dois conjuntos, um para a detecção da cadeia pesada de hlgG e o outro para a detecção de Ig da cadeia leve capa humana, para demonstrar composição totalmente humana tanto para a cadeia Ig gama quanto a Ig capa. 2,5 χ IO5 de células B300.19/hErbB2 ou células precursoras B300.19 foram incubadas com sobrenadantes de hibridoma diluídos a 1:2 em tampão de FACS por 1 hora a 4 0C e depois lavadas com PBS. As células foram depois incubadas com Cy5 gama anti-humano de cabra por 1 hora a 4 0C para a detecção de Ig gama ou com PE capa anti-humano de cabra (SB catálogo #2063-09) por 1 hora a 4 0C para a detecção de Ig capa. Depois da lavagem, as células foram fixadas em 1 % de paraformaldeído/PBS antes da análise de FACS. Os soros reunidos na diluição de 1:50 foram usados como um controle positivo enquanto Gmix diluído 1:10 (IgG anti-KLH) foi usado como um controle de isótipo negativo no ensaio. A razão dos valores da média geométrica entre células positivas e negativas foi tabulada e hibridomas dando razões acima de 1,95 foram considerados acertos. Um total de 152 anticorpos IgG/capa anti-hErbB2 totalmente humanos foram confirmados nesta triagem.

EXEMPLO 4

INIBICÃO DA FOSFORILACÃO DE ERBB2 INDUZIDA POR HEREGULINA-β EM CÉLULAS MCF7

ErbB2 é tirosina fosforilada na ativação através da dimerização com outros membros da família ErbB, tais como ErbB3. A ligação de Heregulina-β ao ErbB3 pode induzir a fosforilação da tirosina de ErbB2 em células MCF7 de adenocarcinoma de mama humano, que expressam tanto ErbB2 quanto ErbB3. Para identificar anticorpos que bloqueiam a ativação de ErbB2, nós triamos 152 anticorpos de ligação ao ErbB2 humano em ensaios de fosforilação de ErbB2 com base em célula.

As células MCF7 foram semeadas a 25.000 células/ reservatórios em placas de 96 reservatórios e cultivadas em meios de crescimento completos (10 % de FCS) durante a noite. No dia seguinte, as placas de cultura de célula foram lavadas uma vez com PBS e os meios de cultura foram substituídos com meios isentos de vermelho de fenol e isentos de soro. As células foram privadas de soro durante a noite e depois incubadas com 25 μΐ de sobrenadantes de hibridoma misturados com 25 μΐ de meio isento de vermelho de fenol por 1 hora antes de serem tratadas com 10 nM de Heregulina-β por 10 minutos. Alternativamente, as células não foram privadas de soro mas incubadas com sobrenadantes de hibridoma durante a noite (-24 horas) antes do tratamento com Heregulina-β.

Para preparar lisados de célula, as células foram lavadas em PBS gelado duas vezes e incubadas com 100 μΐ/reservatório de tampão de Iise (50 mM de Tris-HCl pH 7,7, 1 % de Trixton X-100, 10 % de glicerol, 100 mM de NaCl, 2,5 mM de EDTA, 10 mM de NaF, 40 μ^πιΐ de PMSF, 1 μΜ de Pepstatina, 0,5 μg/ml de Leupeptina, 10 μg/ml de inibidor de Tripsina de soja, 0,2 mM de NaVO4, 1 mM de NaMoO4, 5 mM de b-glicerofosfato) a 4 0C por 30 minutos. O nível de Fosfor-ErbB2 foi medido usando um kit de ELISA fosfor-ErbB2 humano da R&D Systems (human Fosfo-ErbB2 DuoSet IC, Catálogo # DYC1768), de acordo com o protocolo fornecido. A porcentagem de inibição foi calculada com base no nível de pErbB2 em células não estimuladas e células estimuladas em Heregulina na ausência de anticorpos.

A Figura 1 ilustra a correlação das atividades de neutralização dos 152 anticorpos testados quando eles foram pré-incubados com células MCF7 por 1 hora vs. 24 horas durante a noite. 51 dos 152 anticorpos deram mais do que 30 % de inibição quando as células foram pré-incubadas com sobrenadantes por 1 hora. Estes anticorpos provavelmente inibem a fosforilação de ErbB2 pela dimerização de bloqueio de ErbB2 com ErbB3. Mais significantemente os anticorpos demonstraram mais do que 30 % de inibição quando as células foram pré-incubadas com sobrenadantes de hibridoma durante a noite. Algumas destas podem assim fazê-lo por outros mecanismos tais como a indução da infra-regulagem de ErbB2. EXEMPLO 5

DETERMINAÇÃO DA REATIVIDADE CRUZADA AO

ERBB2 CINO

Para determinar a reatividade cruzada entre as espécies destes anticorpos ao ErbB2 não humano de primata cinomolgo, células CHO-Kl que expressam ErbB2 de cinomolgo foram geradas. Em resumo, o cDNA de ErbB2 cino foi derivado de tecidos ovarianos de cinomolgo e clonados no vetor de expressão pCR3.1 através dos sítios de endonuclease de restrição HindIII e XbaI. O vetor de expressão, cino-ErbB2(FL)/pCr3.1 contendo um inserto de 3767 pares de base, foi transfectado em célula CHO-kl usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, catálogo #11668) de acordo com os protocolos fornecidos. Os clones estáveis de CHO-Kl que expressam cino- ErbB2 foram selecionados na presença de G418 a 1 mg/ml. A expressão foi confirmada pela FACS usando c-ErbB2/c-neu anti-humano de camundongo (Ab-2) (Oncogene, catálogo #OP 14) e IgG-PE anti-camundongo de cabra (Caltag, catálogo #M30004-4).

O clone CHO-Kl/cino E4rbB2 #4 foi usado para medir a reatividade cruzada dos anticorpos de ligação de ErbB2 humano. 200.000 células do clone CHO-Kl/cino ErbB2 #4 ou CHO-Kl precursoras foram incubadas com sobrenadantes de hibridoma diluídos 1:2 ou 2 μg/ml de anticorpo Ab-2 de controle positivo (Oncogene, catálogo #OP 14) por 1 hora a 4 °C. As células foram lavadas uma vez com PBS e depois incubadas com anticorpo de detecção secundário 5 μg/ml de IgG Cy5 anti-humano de cabra ou IgG Cy5 anti-camundongo de cabra por 1 hora a 4 °C. As células foram lavadas três vezes com PBS, fixadas em 1 % de paraformaldeído/PBS e depois analisada pelo FACS. Para cada tingimento, a razão dos valores da média geométrica entre células positivas e negativas foi tabulada e uma razão acima de 1,95 foi considerada positiva. Oito anticorpos foram descobertos não reagir cruzado com cino ErbB2 e foram excluídas da análise posterior.

EXEMPLO 6

ELISAS DE ANTÍGENO ALTO E ANTÍGENO LIMITADO

113 anticorpos anti-ErbB2 que demonstraram reatividade cruzada com cino ErbB2 e também mostraram >30 % de inibição da fosforilação de ErbB2 quando incubados com células por 1 hora ou durante a noite, foram caracterizados ainda pelos ELISAs de antígeno alto (HA) e antígeno limitado (LA).

ELISA de HA é realizado com concentrações altas de antígeno revestidos na placa e é uma reação dependente de concentração; enquanto o ELISA LA é conduzido com quantidade limitada de antígeno revestido na placa e assim é uma reação dependente da afinidade. A classificação de afinidade relativa de anticorpos pode ser obtida a partir da análise de HA/LA.

Visto que a proteína de fusão ErbB2 humano recombinante ECD-Fcyl não pode ser usada para este propósito, uma proteína de fusão de ErbB2 humano ECD-myc/His foi gerada em casa. O cDNA de ErbB2 humano/ECD foi derivado de células A431 e clonado no vetor de expressão pSecTag2Hygro (Invitrogen, catálogo #V910-20) através dos sítios de clivagem de endonuclease de restrição NheI e XhoI. O vetor de expressão, huErbB2 (ECD)/pSecTag2BHygro, conteve um tamanho de inserto de 1956 pares de base apenas para o ErbB2 (ECD) e 2034 pares de base para o hErbB2 (ECD) mais o rótulo c-myc/His. O plasmídeo foi transitoriamente transfectado em células 293T em suspensão usando 293fectina (Invitrogen catálogo #12347-019). A células foram tratadas com butirato de sódio um dia após a transfecção para reforçar os níveis de expressão. 4 dias depois da transfecção, o sobrenadante foi testado quanto a expressão de ErbB2 (ECD) antes da purificação. Para a detecção de ELISA, 1 μ§/πι1 de anti-ErbB2 de cabra (R&D Systems, catálogo #AF1129) foi usado para revestir as placas, 1 μg/ml de camundongo anti-ErbB2 (R&D Systems, catálogo # MAB 1129) foi o anticorpo de detecção primário e o anticorpo secundário foi IgG-HRP anti- camundongo de cabra (Caltag, catálogo # M30107). O sobrenadante foi colhido e concentrado 5 vezes e depois dialisados em tampão de diálise (50 mM de NaH2PO4, pH 8, 200 mM de NaCl) durante a noite. Imidazol foi adicionado aos sobrenadantes a uma concentração final de 5 mM e os sobrenadantes foram incubados com volume de 1/100° de mistura de resina de super fluxo Ni-NTA (Qiagen, Cat# 30430) por 3 horas na temperatura ambiente. A resina foi lavada com um tampão contendo 50 mM de NaHPO4, 300 mM de NaCl e 20 mM de imidazol e depois com o tampão de eluição contendo 250 mM de Imidazol, 50 mM de NaHPO4 e 300 mM de NaCl. A proteína purificada foi finalmente dialisada em PBS para preservar a atividade. A proteína huErbB2 (ECD)/c-myc-His purificada tem 655 aminoácidos, com um PM teórico de 72,2 kDa, gira em torno de 100 kDa em um gel de SDS-PAGE com 4 a 20 % de Tris-Glicina. A identidade da proteína foi confirmada pela western blot usando um anti-ErbB2 monoclonal de camundongo (R&D Systems, Cat# MAB 1129) seguido por um IgG-HRP anti-camundongo de cabra secundário (Caltag, cat# M30107).

Para HA, 10 μ^πιΐ de ErbB2 humano ECD-myc/His em PBS foram revestidos às placas de ELISA durante a noite a 4 °C. Para LA, 100, 500, 250, 125, 62 e 31 ng/ml de ErbB2 humano ECD-myc/His foram revestidos. As placas revestidas com antígeno foram lavadas três vezes, bloqueadas com 1 % de leite desnatado/PBS por pelo menos 30 minutos na temperatura ambiente e depois lavadas novamente três vezes. Cada amostra de linhagem de hibridoma foi titulada em 1 % de leite desnatado/PBS 1:3 para 7 pontos de partida de uma diluição a 1:25. As amostras de hibridoma diluídas em série ou controles (Herceptina®) foram transferidas para as placas revestidas com HA e as amostras de hibridoma diluídas 1:25 foram transferidas para placas revestidas com LA. As amostras foram incubadas em placas na temperatura ambiente durante a noite por 18,5 horas. No dia seguinte, as placas foram lavadas três vezes e incubadas com 50 μΐ de 400 ng/ml de IgG anti-humana de cabra (Fc)-HRP imunopura (Pierce catálogo# 31416) por 1 hora na temperatura ambiente. Depois, as placas foram extensivamente lavadas e secadas sobre toalha de papel para remover o HRP residual nos reservatórios. O substrato de HRP TMB (K-blue TMB realçado, Neogen catálogo #308177) foi adicionado a cada reservatórios e incubados por 30 min. A reação foi interrompida pela adição de HCl 1 N. a densidade óptica a 450 nm foi lida em uma leitora de microplaca (Titerteck Multiskan Ascent).

A concentração de anticorpos específicos de ErbB2 em sobrenadantes de hibridoma foi derivada de uma curva padrão gerada com concentrações conhecidas de Herceptina® em ELISA HA. O sinal LA OD a 31 ng/ml de antígeno foi plotado contra a concentração de anticorpo de HA para cada amostra de hibridoma, como mostrado na Figura 2. Os anticorpos no canto esquerdo superior têm afinidades relativamente altas comparadas com os anticorpos no canto direito mais baixo nesta plotagem. EXEMPLO 7

CLONAGEM DE HIBRIDOMA

Com base nos dados do teste de reatividade cruzada em cino, os ensaios de inibição da fosforilação de ErbB2 e ELISAs de LA/HA, 31 linhagens de hibridoma foram selecionadas para clonagem. As suas atividades são resumidas na Tabela 3.

Tabela 3. Dados de caracterização preliminar de linhagens de hibridoma

selecionadas para clonagem

% de % de Reatividade Média Linhagem inibição de inibição de cruzada de HA LAa ID Ih pTyr 24h pTyr cino (ug/ml) 31ng/ml 1*14 103 100 SIM 7,27 3,99 1*15 86 100 SIM 0,61 2,31 1*18 85 96 SIM 1,22 3,03 1*20 91 96 SIM 1,5 2,84 1*22 84 95 SIM 1,06 1,61 1*37 96 96 SIM 1,3 3,33 1*39 82 99 SIM 0,68 2,57 1*62 82 98 SIM 0,51 2,8 1*96 97 99 SIM 6,48 4,6 1*99 97 99 SIM 6,18 4,05 1*100 95 95 SIM 2,85 3,54 1*108 90 100 SIM 4,41 2,64 1*124 94 97 SIM 2,86 3,42 1*128 96 98 SIM 5,86 3,83 1*140 97 97 SIM 4,39 3,54 1*148 96 97 SIM 3,29 3,35 1*149 83 89 SIM 0,43 J 1,54 1*19 73 97 SIM 0,4 1,77 1*24 77 99 SIM 1,77 2,35 1*33 73 101 SIM 0,9 2,07 1*41 26 86 SIM 1,3 3,2 1*43 43 82 SIM 1,3 3,57 1*44 78 98 SIM 3,64 2,38 1*69 57 72 SIM 0,34 1,6 1*71 27 65 SIM 3,1 2,62 1*74 66 90 SIM 0,20 1,22 1*79 71 93 SIM 0,26 1,77 1*95 58 95 SIM 0,23 1,14 1*104 21 73 SIM 1,7 2,36 1*107 57 82 SIM 0,25 1,15 1*111 78 98 SIM 0,77 1,97

As células em cada linhagem de hibridoma foram classificadas

em FACS Aria (BD) em placas de 96 reservatórios a 1 célula/reservatório e cultivadas por cerca de 2 semanas. Os sobrenadantes de clones únicos foram triados quanto a atividade de ligação de ErbB2 pelo FMAT em células BT474 que expressam nível alto de ErbB2 e também para a composição de cadeia gama e capa de Ig humana, assim como a presença de IgM humana e IgM de camundongo pelo ELISA.

Para FMAT, 6000 células BT474 (ATCC) em 40 μΐ de tampão de FACS em placas FMAT de 384 reservatórios foram incubadas com 15 μΐ de sobrenadantes por 2 horas na temperatura ambiente e depois com 10 μΐ de IgG Cy5 anti-humana de cabra a 4,5 μ§/ηι1 por 6 horas na temperatura ambiente antes de ler em máquina FMAT 8200. Tanto os dados de fluorescência quanto de contagem foram analisados. Herceptina® foi usada como um controle positivo na triagem.

Para a análise da composição da cadeia de anticorpo humano, placas de 96 reservatórios de ligação de meio (Coastar 3368) foram revestidas com 2 μ g/ml de IgG Fc anti-humana de cabra em PBS durante a noite a 4 0C e bloqueadas com 1 % de leite/PBS por 30 minutos na temperatura ambiente. Os sobrenadantes foram diluídos 1:5 em 1 % de leite/PBS e adicionado a duas placas de ELISA revestidas e incubadas na temperatura ambiente por 1 hora. Capa anti-humano de cabra biotinilado (Vetor catálogo #BA3060) a 250 ng/ml em 1 % de leite/PBS ou Lambda anti-humano de cabra biotinilado (Southern Biotech catálogo #2070-08) a 250 ng/ml em 1 % de leite/PBS foram depois adicionados e incubados por 1 hora na temperatura ambiente seguido pela incubação com conjugado de Estreptavidina Peroxidase ali μg/ml em 1 % de leite/PBS por 1 hora na temperatura ambiente. As placas foram extensivamente lavadas entre as etapas de incubação. 50 μΐ de substrato de peroxidase TMB foram adicionados e incubados por 30 minutos na temperatura ambiente e a reação enzimática foi extinta com 50 μΐ de HCl 1 Μ. A densidade óptica foi lida a 450 nm em uma leitora de microplaca (Titerteck Multiskan Ascent).

Nós confirmamos a ausência de IgM humana como segue, placas de 96 reservatórios de ligação de meio (Coastar 3368) foram revestidas com 1 μ g/ml de IgM anti-humana de cabra em PBS durante a noite a 4 0C e bloqueadas com 1 % de leite/PBS por 30 minutos na temperatura ambiente. Os sobrenadantes foram diluídos 1:5 em 1 % de leite/PBS e adicionados às placas de ELISA revestidas e incubadas na temperatura ambiente por 1 hora. IgM anti-humano de burro POD (Accurate Chemical catálogo # JNH035043) a 666 ng/ml em 1 % de leite/PBS foi depois adicionada e incubada por 1 hora na temperatura ambiente. As placas foram desenvolvidas pela adição de substrato de POD como descrito acima.

Nós confirmamos a ausência de IgM humana como segue. As placas de 96 reservatórios de ligação de meio foram revestidas com 1 μg/ml de Lambda anti-camundongo de cabra (Southern Biotech 1060-01) em PBS durante a noite a 4 0C e bloqueado com 1 % de leite/PBS por 30 minutos na temperatura ambiente. Os sobrenadantes foram diluídos 1:5 em 1 % de leite/PBS e adicionado às placas de ELISA revestidas e incubadas na temperatura ambiente por 1 hora. IgG anti-humana de cabra (Fe) POD (Pierce catálogo #31413) a 400 ng/ml em 1 % de leite/PBS foi depois adicionada e incubada por 1 hora na temperatura ambiente. As placas foram desenvolvidas pela adição de substrato de POD como descrito antes.

Nos ELISAs descritos acima, o sinal de reservatórios sem nenhum anticorpo primário foi usado como fundo e as amostras dando sinais que foram 3 vezes acima do fundo foram consideradas positivas.

Os anticorpos monoclonais que demonstraram ligação nativa ao ErbB2 pelo FMAT e que foram positivos para a cadeia gama e cadeia capa humanas pelos ELISAs foram derivados de 20 linhagens de hibridoma depois da clonagem. Três subclones de cada linhagem precursora foram sequenciados. A menos que de outro modo indicado todos os três subclones foram idênticos. Por exemplo, subclones 1.14.1, 1.14.2 e 1.14.3 do clone precursor 1.14 todos tiveram a mesma seqüência e são aludidos intercambiavelmente pelo nome do precursor de dois números ou o nome do subclone de três números. Onze anticorpos monoclonais únicos foram identificados e ainda caracterizados em ensaios funcionais com base em célula.

EXEMPLO 8

ANÁLISE ESTRUTURAL DE ANTICORPOS MONOCLONAIS ERBB2

A cadeia pesada e os domínios variáveis de cadeia leve dos anticorpos foram sequenciados. A informação de seqüência completa para os anticorpos anti-ErbB2 é fornecida na Listagem de Seqüência com seqüências de nucleotídeo e aminoácido para cada combinação de cadeia gama e capa. As regiões variáveis (V) de cadeias da imunoglobulina são codificadas pelos segmentos de DNA da linha germinativa múltipla, que são unidos nas regiões variáveis funcionais (VhDJh ou VkJk) durante a ontogenia de célula B. As seqüências pesadas variáveis foram analisadas para determinar a família VH, a seqüência da região Dea seqüência da região J. As seqüências foram depois traduzidas para determinar a seqüência de aminoácido primária e comparadas com a seqüências das regiões VH, D e J da linha germinativa para avaliar as hipermutações somáticas. As seqüências de cadeia leve da variável pesada foram similarmente analisadas.

A Tabela 4 e Tabela 4(a) são Tabelas que comparam as regiões de cadeia pesada do anticorpo com a sua região de cadeia pesada da linha germinativa cognata. A Tabela 5 é uma Tabela que compara as regiões de cadeia leve capa do anticorpo com a sua região de cadeia leve da linha germinativa cognata. A diferença entre as Tabelas 4 e 4(a) é a definição usada para definir as CDRls de cadeia pesada. As CDRls de cadeia pesada divulgadas na Tabela 4(a) são da definição de Kabat. Alternativamente, as CDRls podem ser definidas usando uma definição alternativa de modo a incluir os últimos quatro resíduos da seqüência FRI como mostrado na Tabela 4.

A análise de 20 anticorpos específicos individuais para ErbB2 indicaram que alguns deles são idênticos e apenas 11 anticorpos monoclonais únicos foram resultados da clonagem 8 dos 11 anticorpos são muito similares na seqüência e foram derivados dos mesmos genes VH e Vk da linha germinativa.

Também deve ser avaliado que onde um anticorpo particular difere das sua respectiva seqüência da linha germinativa ao nível de aminoácido, a seqüência de anticorpo pode ser mutada de volta para a seqüência da linha germinativa. Tais mutações corretivas podem ocorrer em uma, duas, três ou mais posições ou uma combinação de qualquer uma das posições mutadas, usando técnicas biológicas moleculares padrão. Por via de um exemplo não limitante, a Tabela 4 mostra que a seqüência da cadeia pesada de 1.24.3 difere da seqüência da linha germinativa correspondente no aminoácido 33 de um T para um S na região CDRl. Assim, a seqüência de aminoácido ou nucleotídeo que codifica a cadeia pesada de 1.24.3 pode ser modificada mudando o T para um S para produzir a seqüência da linha germinativa no sítio da mutação. Em um outro exemplo, a seqüência da cadeia pesada de 1.140.1 difere da seqüência da linha germinativa correspondente no aminoácido 42 de um R para um G na região FR2. Assim, a seqüência de aminoácido ou nucleotídeo que codifica a cadeia pesada de 1.140.1 pode ser modificada mudando o R para um G para produzir a seqüência da linha germinativa no sítio da mutação.

Por via de um outro exemplo não limitante, a Tabela 5 mostra que a seqüência da cadeia leve de 1.140.1 difere da seqüência da linha germinativa correspondente por uma mutação de T para N (mutação 1) na região FRl, por um F para L, F para YeC para Y (mutações 2, 3 e 4) na região CDRl, por um R para KeN para K na região FR2 (mutações 5 e 6) e por um F para Y, G para SeS para T na região de CDR3. Assim, a seqüência de aminoácido ou nucleotídeo que codifica a cadeia leve de 1.140.1 pode ser modificada mudando a mutação 1 para produzir a seqüência da linha germinativa no sítio de mutação 1. Além disso, a seqüência de aminoácido ou nucleotídeo que codifica a cadeia leve de 1.140.1 pode ser modificada mudando a mutação 2 para produzir a seqüência da linha germinativa no sítio de mutação 2. Além disso ainda, a seqüência de aminoácido ou nucleotídeo que codifica a cadeia leve de 1.1.40.1 pode ser modificada mudando a mutação 3 para produzir a seqüência da linha germinativa no sítio de mutação 3. Mais uma vez ainda, a seqüência de aminoácido ou nucleotídeo que codifica a cadeia leve de 1.140.1 pode ser modificada mudando a mutação 1, mutação 2, mutação 3, mutação 4, mutação 5 e mutação 6 para produzir a seqüência da linha germinativa nesta. A Tabela 6 abaixo ilustra a posição de tais variações da linha germinativa para 1.140. Cada linha representa uma única combinação da linha germinativa e resíduos que não da linha germinativa na posição indicada em negrito. A Tabela 6 também se aplica ao anticorpo 1.39 visto que a análise da cadeia leve para o anticorpo 1.39 é idêntica ao 1.140 com respeito às mutações da linha germinativa. Além disso, a análise da cadeia leve para o anticorpo 1.96 é idêntica ao 1.140 com respeito às mutações da linha germinativa exceto que o anticorpo 1.96 tem uma diferença entre a seqüência de anticorpo e a seqüência da linha germinativa em FR4. Neste exemplo, o L da seqüência de anticorpo pode ser mutado de volta para a seqüência da linha germinativa de um F e esta mutação pode ser combinada com qualquer uma das combinações mostradas na Tabela 6.

Em uma forma de realização, a invenção retrata a modificação de um ou mais dos aminoácidos nas regiões de CDR, isto é, CDRl, CDR2 e/ou CDR3. Em um exemplo, a CDR3 da cadeia pesada, leve ou de ambas as cadeias de um anticorpo aqui descrito é modificada. Tipicamente, o aminoácido é substituído com um aminoácido tendo uma cadeia lateral similar (uma substituição de aminoácido conservativa), de volta para a linha germinativa ou pode ser substituída com qualquer aminoácido apropriado tal como uma alanina ou uma leucina. Em uma forma de realização, a CDR3 de 1.24.3, QQYSSPFT (SEQ I.D NO: 48) pode ser modificada em um ou mais aminoácidos de volta por exemplo pela mutação da seqüência de CDR3 para QQYYSPFT (SEQID NO: 49).

Em uma outra forma de realização, a invenção retrata a modificação do anticorpo para remover cisternas desemparelhadas. Os exemplos de cisteínas desemparelhadas aparecem no anticorpo 1.39.1 no aminoácido 38, no anticorpo 1.96.1 no aminoácido 38 e para o anticorpo 1.140.1 no aminoácido 38. Estas cisteínas podem ser mutadas de volta para a linha germinativa, por exemplo, causando uma mutação do C para Y ou causando uma mutação do C para qualquer aminoácido apropriado tal como uma serina. J ι-3 J ,-3 h3 Eh CO Eh CO Eh CO Eh CO EH CO Eh CO Eh CO Eh CO O CO CJ CO CJ CO CJ CO O CO CJ CO CJ CO CJ CO O > α > Ol > O > Ο > O > CH > Ol > CJ CJ Eh CJ Eh CJ Eh CJ CJ EH CJ Eh CJ Eh S > S > S > S > S > S > S > S > >Η >Η X >η >-Ι >h X >h 2 2 2 2 2 2 2 2 >π >Η >Η >Η >Η X >Η >Η >H >h >H X >H >H Ο Q CJ Q CJ Q CJ Q CJ α CJ Q CJ Q CJ Q Q tu Q tu Q tu Q Uj Q tu Q tu Q Uj Q tu CJ >Η e> X CJ CJ >Η CJ >H CJ X CJ >H U X CJ >Η CJ XI CJ >Η CJ >Η CJ >H CJ X CJ >H CJ X 2 2 S 2 2 2 2 2 CH σ α α Ο α CX CH J OS OS OS 1-3 OS ►3 OS DS J OS i-3 OS >Η tf >Η tf >Η tf >Η tf >Η tf >H tf >h tf >H tf J O J υ CJ 1-3 U ι-3 U h3 O h3 O i-3 CJ CO >Η CO CO CO CO CO CO >n CO >H CO >H CO >H S 2 >Η 2 X 2 >Η 2 >H 2 >H 2 >H Z >H tf > tf > tf > tf > tf > tf > tf > tf > tf tf tf tf tf tf C tf tf tf tf tf tf tf tf tf 2 EH 2 Η 2 H 2 Eh 2 Eh 2 EH 2 H 2 Eh Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q QS ω OS ω PS ω CS ω OS ω OS ω OS ω OS ω CO CO tf CO tf CO CO CO tf CO tf CO tf M Cu Μ CO M CO M 2 M oS M Pd M O^ IH DJ H ι-3 EH J Eh J H j EH 1-3 Eh H3 EH i-3 Eh K3 tu CO tu CO tu CO tu CO tu CO Cxj CO tu CO Uj CO OS 2 OS 2 OS 2 OS 2 OS 2 OS 2 OS 2 OS 2 >Η >Η >Η >Η X >H >H >h M M M M M M M M >Η X X X >Η >J >h >H CO CJ CO CJ CO CJ CO CJ CO CJ CO CJ CO CJ CO CJ CO tf CO tf CO tf CO tf CO tf CO tf CO tf CO tf CO > CO > CO > CO > CO > CO > CO > CO > CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO Q CO Q CO Q CO Q CO Q CO Q CO Q CO Q M tf M tf M tf HH tf M tf H tf M tf IH tf CO X CO >Η CO X CO X CO CO >H CO >H CO >H CJ CO CJ CO O CO CJ CO CJ CO U CO CJ CO OS CO Dj > Dj > Oj > CLj > Dj > Dj > Dj > CLj > tf S tf S tf tf S tf S tf S tf S tf S O ω CH ω α ω α ω α ω Ol ω Ol ω Ol ω OS 1-3 OS J os j OS 1-3 OS H3 OS H3 OS i-3 OS j > CJ > CJ > CJ > CJ > CJ > CJ > CJ > CJ S tf tf S tf S tf S tf tf S tf S tf CO 2 CO 2 CO 2 co g CO 2 CO 2 CO 2 CO 2 tu 2 tu 2 Uj 2 fa tu 2 tu 2 Eu 2 tu 2 EH CO Eh CO Eh CO H CO CO Eh CO Eh 00 Exi >Η tu X Uj X Eu (Η tu >H tu >H tu >H Uj X CJ CO CJ CO α CO O co CJ CO CJ CO CJ CO CJ CO tf tf tf tf tf tf tf tf > CO > CO > CO > CO > CO > CO > CO > CO 1-3 tf J α· J tf J fd* J tf h3 ^ H3 tf J tf CJ CJ CJ tf CJ CJ CJ tf O tf CJ tf CJ U CJ U CJ υ CJ υ CJ O CJ O O O CJ O CJ CO CJ CO CJ CO ο CO CJ CO CJ CO CJ CO CJ CO CO J CO J CO J CO Η3 CO 1-3 CO t-3 CO 1-3 CO H3 ω os ω OS ω OS ω OS ω OS ω OS ω OS ω OS > 1-3 > J > J > ►-3 > 1-3 > H3 > i-3 > J CO CO CO Η3 CO CO H3 CO CO t-3 CO α CJ α CJ α ο CH CJ CH CJ CH CJ οι CJ O CJ > CJ > CJ > CJ > ο > CJ > CJ > CJ > CJ ω α. ω CLj ω Qj ω CLi ω Oj ω Dj ω Dj ω Dj JH4B _ r = CNi ιη Q = = - = - - 1—ι CM I Γ0 K > — Ε = = = - - ^J1 ο 00 CNl CO ι-Η CNJ Γ0 γο Γ0 CM ιΗ CD CNl ΓΗ 1-1 ι—I I-H τ- 1-1 γο T— [— CD • • ·3< CO . σι • CN γΗ • CTl O O CM O O CN 00 O I-I CN Γ- σ\ CD CTl r- ι—t tH O H H Γ- Γ- CN • CNl ro CTi • • t- ι—I • • ι—I H !-H rH rH i-l iH • iH rH Ι— >Η Il <—I Il iH Il I Il Il M I Il

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INIBICÂO DA FOSFORILACÂO DE ERBB2 INDUZIDA PELA HEREGULΙΝΑ-β E PROLIFERAÇÃO DE CÉLULA EM CÉLULAS MCF7 OUE EXPRESSAM ERBB2 BAIXO

Como descrito no Exemplo 4, os sobrenadantes de hibridoma podem inibir a fosforilação de ErbB2 induzida pela Heregulina em células MCF7. Usando anticorpos monoclonais purificados, a potência dos anticorpos ErbB2 foi determinada, também comparada com dois anticorpos inibidores 2C4 e Herceptina®. Em resumo, células MCF7 foram semeadas a 20.000 células /reservatório em placas de 96 reservatórios e cultivadas em meio de crescimento completo (10 % de FCS) durante a noite. No dia seguinte, as placas de cultura de célula foram lavadas uma vez com PBS e o meio de cultura foi substituído com meio isento de vermelho de fenol e isento de soro. As células foram privadas de soro durante a noite e depois foram incubadas com mAbs, Herceptina® ou 2C4 titulando 1:5 a partir de 10 μg/ml em meio isento de soro por 1 hora antes de serem tratadas com 10 nM de Heregulina-β por 10 minutos, os lisados de célula foram preparados como descrito no Exemplo 4 e o nível de Fosfor-ErbB2 foi medido usando um kit de ELISA da R&D systems (human Fosfo-ErbB2 DuoSet IC, Cat # DYC1768), de acordo com o protocolo fornecido. A porcentagem de inibição foi calculada com base no nível de pErbB2 em células não estimuladas e células estimuladas com Heregulina na ausência de anticorpos. Uma curva de resposta de dose foi plotada para cada anticorpo usando o software PrismGraphpad.

A Figura 3 ilustra as curvas de resposta de dose de um experimento representativo. Os valores de EC50 foram derivados da análise de regressão não linear e mostrados na Tabela 7. 2C4 inibiu a fosforilação de ErbB2 enquanto que a Herceptina® teve pouco efeito. Oito dos 11 anticorpos monoclonais da invenção testados mostraram atividade inibidora na fosforilação de ErbB2 em células MCF7. 1.18.1 parece ter melhor potência do que 2C4.

Tabela 7. Potência de 10 mAbs purificados da invenção na inibicão da

fosforilação de ErbB2 induzida por Heregulina em células MCF7.

mAbs EC50 (ng/ml) nl EC50 (na/ml) n2 2C4 43.6 14.6 Herceptin® >10.000 >10.000 1.18.1 4,2 10,8 1.20.1 15,5 17,4 1.140.1 14,65 22,9 1.96.2 28,8 34 1.100.1 39,9 33,7 1.14.1 33,7 22,9 1.39.1 46,9 26,3 1.24.3 42,9 20,4 1.43.1 >10.000 >10,000 1.44.1 >10.000 >10,000 1.71.3 >10.000 nd

O efeito dos anticorpos monoclonais sobre a proliferação de

célula induzida por Heregulina também foi examinada. As células MCF 7 foram semeadas a 6000 células/reservatório em placas de 96 reservatórios em meio DMEM isento de vermelho de fenol com 10 % de FCS, NaPiruvato, L- Glutamina e deixadas cultivar durante a noite a 37 °C. No dia seguinte, as células foram lavadas uma vez com PBS frio e o meio de cultura foi substituído com 100 μΐ de meio isento de FCS/vermelho de fenol mais NaPiruvato e incubadas por 4 horas a 37 °C. Depois, o meio isento de FCS foi removido e 50 μΐ de mAbs titulados e 50 μΐ de Heregulina-β 2 nM foram adicionados às células. Depois de incubar as células com anticorpos e Heregulina por três dias a 37 °C, 25 μΐ de reagente luminescente (Promega, catálogo #G7570) foi adicionado a cada reservatório. As placas foram agitadas por 5 minutos e depois incubadas por 10 minutos na temperatura ambiente. A luminescência foi lida em um luminômetro de placa de microtituladora (Tecan GENios Pro). A porcentagem de inibição foi calculada com base no nível de luminescência em células não estimuladas e células estimuladas com Heregulina na ausência de anticorpos.

Como mostrado na Figura 4, uma curva de resposta de dose foi plotada para cada anticorpo usando o software PrismGraphpad. Os valores de EC50 foram derivados da análise de regressão não linear e listadas na Tabela 8. Como exibido no ensaio de fosforilação de ErbB2, 2C4 e os mesmos 8 anticorpos da invenção que foram eficazes em inibir a fosforilação de ErbB2 mostrou inibição dependente da dose da proliferação de célula MCF7 induzida pela Heregulina enquanto que a Herceptina® e os 3 anticorpos ineficazes em bloquear a fosforilação de ErbB2 não.

Tabela 8. Potência e eficácia de 10 mAbs purificados da invenção na inibição da proliferação de célula MCF7 induzida pela Heregulina

mAbs EC50 (ng/ml) % de inibição @10μβ/ιηΙ 2C4 404,5 90 Herceptin® >10.000 39 1.18.1 414,8 94 1.20.1 770,1 100 1.140.1 633,3 91 1.96.2 2832 98 1.100.1 2043 95 1.14.1 640 96 1.39.1 479,3 89 1.24.3 3017 81 1.43.1 -10.000 53 1.44.1 >10.000 18 1.71.3 >10.000 nd

EXEMPLO 10

INIBIÇÃO DA PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS BT474 E

SKBR3

Os 8 anticorpos neutralizadores eficazes nas células que expressam ErbB2 baixo (MCF7) também foram examinados quanto a sua capacidade para inibir células que expressam ErbB2 alto em um ensaio de proliferação de célula de 4 dias. Cinco mil células (BT474 ou SKBR3) em 50 μΐ de meio de crescimento com 10 % de FCS foram semeadas em placas de 96 reservatórios e incubadas a 37 0C por 4 horas de modo a ligar às placas. Os anticorpos monoclonais foram titulados 1:5 em meio de crescimento em concentrações de partida finais de 2X de 40 μg/ml. Cinqüenta (50) μΐ de 2C4, Herceptina® e 8 mAbs anti-ErbB2 da invenção foram adicionados às placas e as células foram cultivadas com anticorpos por 4 dias. Vinte e cinco (25) μΐ de reagente CellTiter-glo foram adicionados a cada reservatório. As placas foram agitadas por 5 minutos e incubadas por 10 minutos na temperatura ambiente. A luminescência foi lida em um luminômetro de placa microtituladora (Tecan GENios Pro). A porcentagem de inibição foi calculada com base no nível de sinal de luminescência no dia 4 e dia 0 na ausência de anticorpos. Uma curva de resposta de dose foi plotada para cada anticorpo usando o software PrismGraphpad e os valores de EC50 foram derivados da análise de regressão não linear. As Figuras 5 e 6 ilustram dados de um experimento

representativo. Tanto a EC50 quanto a porcentagem máxima de inibição estão listadas nas Tabelas 9 e 10. Como relatado, a Herceptina® mostrou a inibição dependente da dose da proliferação tanto da célula BT474 quanto da SKBR3 enquanto 2C4 teve pouco efeito. Todos os anticorpos monoclonais da invenção testados exibiram inibição dependente da dose da proliferação de

• (E)

célula BT474 e SKBR3 com potência comparável à Herceptina .

Tabela 9. Potência e eficácia de 8 anticorpos da invenção na inibição da

proliferação de célula BT474

Abs Nl EC50 Nl %Inhibition N2 EC50 N2 % de inibição (ng/ml) (ng/ml) Herceptin® 144,8 61 81,8 57 2C4 >40.000 -9 4750,0 18 hlgGl >40.000 -2 >40.000 10 1.96.2 131,3 35 66,3 29 1.20.1 85,3 40 12,8 37 1.140.1 299,8 39 70,9 45 1.18.1 38,1 34 28,2 39 1.100.1 169,4 35 91,1 32 1.24.3 198,3 24 74,4 29 1.14.1 135,7 38 63,0 39 1.39.1 156,4 29 42,3 40 Tabela 10. Potencia e eficacia de 8 anticorpos da invenpao na inibicao da proliferagao de celula SKBR3

Abs EC50 (ng/ml) % de inibicao @36pg/ml Herceptin® 54,5 59 2C4 >36.000 18 hlgGl >36.000 2 1.96.2 41,7 43 1.20.1 25,2 49 1.140.1 42,7 44 1.18.1 26,3 46 1.100.1 61,3 54 1.24.3 48,5 37 1.14.1 35,7 52 1.39.1 68,9 41

EXEMPLO 11

INIBICAO Da FOSFORILACAO DE ERBB2 EM CELULAS

BT474

Para identificar ο mecanismo de agao destes anticorpos nas linhagens de celula que expressam ErbB2 alto, um anticorpo da inven9ao 1.18.1，foi testado quanto ao efeito sobre a fosforilagSo de ErbB2 constitutiva em celulas BT474 junto com Herceptina® e 2C4. As celulas BT474 foram semeadas em placas de cultura de 96 reservatorios em meio de cultura completo a 5000 celulas/reservatorio no dia 1, 10000 celulas/reservatorio no dia 2 e dia 3 ou a 20000 celulas/reservatorio no dia 4. As celulas foram incubadas a 37 0C por 3 a 4 horas e deixadas ligar as placas. Os anticorpos monoclonais foram titulados 1:5 em meio de partida completo de 10 pg/ml para 6 pontos e depois adicionados as celulas. As celulas foram incubadas com anticorpos monoclonais por 1 a 4 dias. No dia 5, as celulas foram lisadas em tampao suplementado com inibidores de protease e fosfatase como previamente descrito. Os niveis de Fosfo-ErbB2 em lisados de celula foram determinados pelo ELISA. A prolifera^ao de celula foi medida pelo CyQuant (Invitrogen). A porcentagem de inibigSo foi calculada de acordo com ο nivel de pErB2 na ausencia de anticorpos. Fosfor-ErbB2/celula tambem foi calculado pela normaliza9ao dos niveis de fosfor-ErbB2 aos numeros de celula. Uma curva de resposta de dose foi plotada para cada anticorpo usando ο software PrismGraphpad e os valores de EC50 foram derivados da analise de regressao nao linear.

As Figuras 7 e 8 ilustram a resposta de dose em pontos de tempo diferentes. Tanto EC50 quanto a porcentagem maxima de inibi9ao foram listadas na Tabela 11. Ab 1.18.1 monoclonal come^ou a mostrar inibi9ao de pErB2 em 48 horas e atingiu a inibi9ao maxima em 72 horas. Entretanto, Herceptina® nao mostrou um efeito significante ate 72 horas enquanto 2C4 teve pouco efeito. De maneira interessante, quando os niveis de fosfor-ErbB2 foram normalizados pelo niimero de celula, a inibi9ao da fosforilafao de ErbB2 pelo 1.18.1 atingiu ο maximo em 48 horas; enquanto que a Herceptina® nSo pareceu inibir a fosforila^So de ErbB2, como previamente publicado.

Em seguida, ο efeito de 7 dos anticorpos sobre a fosforila9ao de ErbB2 constitutiva em celulas BT474 depois de 48 horas foi investigado. Em resumo, 10.000 celulas BT474 em 50 μΐ de meio de cultura completo foram semeadas em placas de 96 reservatorios e cultivadas por 3 a 4 horas a 37 0C para ligar as placas. Depois 50 μΐ de 2C4 a pg/ml，Herceptina® e anticorpos monoclonais anti-ErbB2 da invenfao, preparados nas concentra^Ses finais em 2X em meio de cultura completo, foram adicionados as placas e incubados com celulas por 48 horas. Os lisados de celula foram preparados e os niveis de fosfor-ErbB2 foram medidos pelo ELISA como descrito no Exemplo 4. A porcentagem de inibiQao foi calculada de acordo com ο nivel de pErB2 na ausencia de anticorpos. Como listado na Tabela 11, todas as 7 mAbs da inven9ao exibiram inibi9ao da fosforila9ao de ErbB2 dependente da dose em celulas BT474 em 48 horas. Em compara^ao, Herceptina® e 2C4 tiveram pouco efeito.

Tabela 11. Potencia de 7 anticorpos da invencao na inibigao da fosforilacao de ErbB2 em celula BT474 em 48 horas

Abs %Inhibition @10μβ/πι1 (nl) %Inhibition ®10με/ηι1 (n2) Herceptin® 5 10 2C4 10 7 1.96.2 37 30 1.20.1 21 28 1.140.1 31 33 1.18.1 24 33 1.100.1 37 26 1.14.1 37 45 1.39.1 37 26

exemplo 12

determinacao de anti-erbb2 usando a

AFINIDADE DE ANTICORPO (a) anAlise de biacore de resolucao de meio

A afinidade de ligagao de oito dos anticorpos anti-ErbB2 foi medida pelo Biacore de resolugao de meio. Todos os experimentos foram realizados usando um instrumento Biacore 2000.

Primeiro, 12 superficies de anticorpo de IgG α humana de cabra de alta densidade em tres lascas CM5 Biacore foram preparados usando liga^ao de amina de rotina. Depois, mAbs foram diluidos em tampao de condu9ao HBS-P contendo 100 pg/ml de albumina serica bovina (BSA), especificamente mAb 1.18.1 a 11 pg/ml, mAb 1.20.1 a 9,9 pg/ml, mAb 1.100.1 a 11 Hg/ml, mAb 1.96.2 a 9,3 μ^ιηΐ, mAb 1.140.1 a 9,2 μ^πύ, mAb 1.14.1 a 9,3 pg/ml, mAb 1.39.1 a 10 pg/ml e mAb 1.24.3 a 10 pg/ml. Antes de cada ciclo de inje^ao de antigeno, cada mAb foi capturado por seis a nove segundos em uma taxa de fluxo de 100 μΐ/min. Uma etapa de lavagem de 2 minutos seguiu cada inje^So de captura para estabilizar cada linha de base de mAb. ErbB2 humano (ECD)-cMyc/His purificado foi injetado por 90 segundos a uma faixa de concentrayao de 307 a 4,80 nM (dilui^ao em serie) para todos mAbs, seguido por uma dissociagao de 15 minutos exceto para mAbs 1.39.1 e 1.24.3 onde a dissocia9ao foi seguida por 20 mins. Todas as

amostras foram aleatoriamente injetadas com varios ciclos de inje?5o de captura de mAb/tampao intercalados para referencia dupla. As superficies de anticorpo α-humano de cabra de alta densidade foram regeneradas com um pulso de 12 segundos de acido fosforico a 146 mM (pH 1,5) depois de cada ciclo. Uma taxa de fluxo de 100 μΐ/min. foi usada para todos os ciclos de inje9ao. Os dados foram ajustados a um modelo de intera^So de 1:1 usando CLAMP. As constantes de ligasao resultantes sao listadas na Tabela abaixo. MAbs sao listados na ordem da afinidade mais alta para a mais baixa.

Tabela 12(a). Afinidades de ligayao de 8 anticorpos da inven9ao contra ErbB2 humano pela analise Biacore de resolugao de meio

mAbs Rinax ka (Μ·、·1) kd (s1) Kd (nM) 1.39.1 57 1,15 X 10s 2,36 X KT4 2,0 1.14.1 70 1,02 X IO3 2,56 X IO"4 2,5 1.96.2 51 1,03 X IO5 2,73 X IO"4 2,6 1.100.1 100 1,04 X IO5 3,01 X ΙΟ-4 2,9 1.18.1 157 1,00 X IO5 3,02 X KT4 3,0 1.140.1 66 0,94 X IO5 3,33 X IO"4 3,5 1.20.1 56 0,95 X IOi 3,44 X 10"4 3,6 1.24.3 65 1,28 X IO3 6,55X 10"4 5,1

(b) anAlise de biacore de alta resolucao

Todos os experimentos foram realizados usando um instrumento Biacore Tl00. Primeiro, uma superficie de anticorpo de IgG α humano de cabra de alta densidade (Caltag H 10500) foi preparada em duas lascas CM5 Biacore usando a ligagao de amina de rotina. Cada mAb foi diluido em tampao de condu^So HBS-P contendo 100 pg/ml de albumina serica bovina (BSA). O MAb 1.140 foi diluido a 5 pg/ml, ο mAb 1.96.2 a 5,9 pg/ml，ο mAb 1.39.1 a 8,7 pg/ml, ο mAb 2C4 a 2pg/ml e a herceptina a 4 pg/ml.

Um protocolo de nivel de captura foi desenvolvido para todos os cinco mAbs. Antes de cada ciclo de inje9ao de antigeno, cada mAb foi capturado por 15 a 30 segundos em uma taxa de fluxo de 20 μΐ/min. Uma etapa de lavagem de 5 minutos seguiu cada inje^ao de captura para estabilizar cada linha de base de mAb. Antigeno hHer-2(ECD)cMyc (Lote #452) foi

injetado por 4 minutos a uma faixa de concentrayao de 369 a 5,76 nM (dilui^ao em serie de 2x) para os mAbs 1.140, 1.96.2 e 1.39.1 seguido por uma dissocia^ao de 15 minutos e uma faixa de concentragSo de 650 a 10,2 nM (dilui9ao em serie de 2x) para ο mAb 2C4 e herceptina seguido por uma dissociagao de 25 minutos. As amostras foram preparadas no tampao de condu9ao descrito acima. Todas as amostras foram aleatoriamente injetadas com varios ciclos de inje?ao de capture de mAb/tampao intercalados para referencia dupla. As superficies de anticorpo α-humano de cabra de alta densidade foram regeneradas com um pulso de 15 segundos de acido fosforico a 146 mM (pH 1,5) depois de cada ciclo. Uma taxa de fluxo de 50 μΐ/min foi usado para todos os ciclos de injegao.

Todos os dados de sensogramas foram ajustados a um modelo de interagao de 1:1 usando CLAMP. As constantes de liga9ao resultantes sao listadas na Tabela abaixo. Os mAbs sao listados na ordem da afinidade mais alta para a amais baixa. Tabela 12(b). Afmidades de ligayao de 3 anticorpos da invengao contra ErbB2 humano pela analise de Biacore de alta resolupao

Amostra Rmax ka (M-'s"1) kdis"1) Kd (nM) 2C4 105, 88 1,21 X IO4 3,91 X IO"5 3,2 herceptina 60 2,34 X IO4 9,80 X IO"3 4,2 1.140 110 1,64 X IO4 1,73 X IO"4 10,6 1.96.2 93 1,68 X IO4 1,94 X IO"4 11,6 1.39.1 120 1,60 X IO4 2,14 X IO"4 13,4

EXEMPLO 13

BINNING DE COMPETICAO DE ANTICORPOS Segundo noticias 2C4 se Iiga ao dominio de dimeriza?ao no ErbB2 enquanto Herceptina® se Iiga ao dominio de terminal C na regiao extracelular de ErbB2 (ver Franklin et al., Cancer Cell. Abril de 2004; 5(4): 317-28 e Cho et al., Nature. 13 de fevereiro de 2003; 421 (6924): 756-60, por meio deste incorporadas por referencia). Para determinar se os epitopos de liga9ao de 8 dos anticorpos se envolvem com os epitopos para 2C4 ou Herceptina®, ELISA de binning competitivo foi realizado.

Placas Costar 3695 de 96 reservatorios de liga?ao de meio foram revestidas com 0,4 pg/ml de Herceptina® ou 2 pg/ml de 2C4 em PBS durante a noite a 4 °C. As placas revestidas foram lavadas e depois bloqueadas com 1 % de leite/PBS por 30 minutos na temperatura ambiente (RT). Os anticorpos foram titulados a 1000 ng/ml, 100 ng/ml e 10 ng/ml e pre-incubados com 30 ng/ml de hErbB2 (ECD) por 2 horas. A mistura de anticorpo/ErbB2 foi transferida para as placas bloqueadas e incubada por 1 hora na temperatura ambiente. Para detectar ErbB2 ligado, as placas foram e lavadas e incubadas com 1 pg/ml de anti-ErbB2 de cabra (R&D Systems, catalogo #AF1129) por 1 hora na temperatura ambiente. O anticorpo secundario de IgG Fc POD anti-cabra de coelho (Pierce catalogo #31433, 400 ng/ml) foi adicionado as placas e incubados por 1 hora na temperatura ambiente. Depois de lavagem extensiva, ο substrato TMB (Neogen) foi adicionado e incubado com as placas por 10 a 18 minutos na temperatura ambiente. A rea?So enzimatica foi interrompida pela adigSo de HCl INea densidade optica a 450 nm foi Iida em uma leitora de microplaca. A Figura 9 ilustra a capacidade de IigagSo de ErbB2 a Herceptina® (A) e 2C4 (B) na presenya de 8 anticorpos anti-ErbB2 da invengao, mAb 1.71.3 ou um mAb de controle de isotopo irrelevante gerado em casa. Nenhum dos anticorpos anti- ErbB2 da inverts。bloqueiam a ligagao de ErbB2 ao 2C4 ou Herceptina , sugerindo que os anticorpos pertencem a um bin diferente do que 2C4 ou Herceptin®.

Todas as publicaf5es, patentes e pedidos de patente neste sao incorporados por referencia no mesmo grau como se cada publica?So ou pedido de patente individuals fossem especifica e individualmente indicado como sendo incorporados por referencia. A descri^ao detalhada precedente foi dada apenas para clareza de entendimento e nenhuma limitayao desnecessaria deve ser entendida a partir desta visto que modifica9oes serao obvias para aqueles habilitados na tecnica. Isto nao e uma admissao de que qualquer uma

das informapao que e aqui fornecida sejam tecnica anterior ou relevante para as inverses presentemente reivindicadas ou que qualquer publica9ao especiflca ou implicitamente aludida seja tecnica anterior. A menos que de outro modo definido, todos os termos tecnicos e cientificos aqui usados tem ο mesmo significado como habitualmente entendido por uma pessoa de habilidade comum na tecnica a qual esta inver^o pertence.

Embora a inven^ao tenha sido descrita em conexao com as formas de realiza9ao especificas desta, sera entendido que a mesma e capaz de modificafoes adicionais e este pedido e intencionado a abranger quaisquer varia9oes, usos ou adapta9oes da inven?§o seguindo, no geral, os principios da invengao e incluindo tais afastamentos da presente divulga^ao como estando dentro da pratica conhecida ou habitual dentro da tecnica a qual a ίηνεηςδο pertence e como pode ser aplicado as caracteristicas essenciais mais acima apresentadas e como seguem no escopo das reivindica9oes anexas. Ser Gly Ser Thr

Tyr

60

Tyr Asn Pro Ser

Trp lie GIy 50

Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp lie Arg Gln His

40

Leu Lys Ser Arg Val Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

LISTAGEM DE SEQUENCIA

<110> Astrazeneca AB

<120> ANTICORPOS PARA ERBB2

<130〉 ASTR-006/01WO

<150> US 60/835,514 <151> 2006-08-04

<160> 59

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 387

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60

acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actactggag ctggatccgc 120

cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt ggatacatct attacagtgg gagcacctac 180

tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240

tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagag 300

ggcccgatta ctattgttcg gggagtttac tactacttct acggtatgga cgtctggggc 360

caagggacca cggtcaccgt ctcctca 387

<210> 2

<211> 129

<212> PRT

<213> Homo

<400〉 2

sapiens

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser lie Ser Ser Gly 25 30

Pro Gly Lys Gly Leu Glu 45 Thr Tyr Leu Tyr

Trp

40

Tyr Leu Gln Lys

Pro Gly Gln 4 5

Pro

Asp Val Trp

Gly 120

Gln Gly

Thr Thr Val 125

Thr Val Ser

Ser Leu Lys Leu

Ser Ser Val Thr Ala Ala 85 90

Asp Thr Ala Val

Pro Gln Pro Leu lie Tyr Glu Val 50 55

Ser Asn Arg Phe 60

Ser Gly Val Pro

Ser

<210> 3

<211> 336

<212> DNA

<213〉 Homo sapiens

<400> 3

gatattgtga tgacccagac tccactctct ctgtccgtca cccctggaca gccggcctcc 60

atctcctgca agtctagtca gagcctcctg catagtgatg gaaagaccta tttgtattgg 120

tacctgcaga agccaggcca gcctccacag cccctgatct atgaagtttc caaccggttc 180

tctggagtgc cagataggtt cagtggcagc gggtcaggga cagatttcac actgaaaatc 240

agccgagtgg aggctgagga tgttgggatt tattactgca tgcaaagtaa acagcttcct 300

cggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaa 336

<210> 4

<211> 112

<212> PRT

<213〉 Homo sapiens

<400> 4

Asp lie Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser lie Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 25 30

Cys Ala Arg

Glu 100

Gly Pro lie Thr

lie Val 105

Arg Gly Val

Tyr Tyr Tyr 110

Asp Gly Lys

‘ 35

Phe Tyr Gly Met 115

Asp Arg

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65

70

75

80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly lie Tyr Tyr Cys Met Gln Ser 85 90 95

Lys Gln Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 110

<210> <211> <212> <213>

5

363 DNA Homo

sapiens

<400> 5

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatagca tgaactgggt ccgccaggct 120

ccacggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attagtagta gtagtagtta catatactac 180

gcagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagaggagga 300

gatggctaca attactacta ctttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360

tca 363

<210> 6

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45

Ser Ser 工Ie Ser Ser Ser Ser Ser Tyr lie Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Ac1 Qn

Tyr Tyr Cys

QR Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 60

Pro Pro Asn Leu Leu lie 50

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80

He Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Gly Tyr Asn Tyr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 7

<211> 339

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 7

gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60

atcacctgca agtccagcca gagtgtcttt ttccgctcca acaataagaa ctgcttagct 120

tggtaccagc agagaccagg acagcctcct aatttgctca tttactgggc atctacccgg 180

gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240

atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttttggttct 300

ccattcactt tcggccctgg gaccaaagtg gatatcaaa 33 9

<210> 8

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

Asp lie Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr lie Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Phe Arg 25 30

Ser Asn Asn Lys Asn Cys Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln 40 45

r

y 5 T 5

Tyr Phe Gly Ser Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp lie 100 105 110

Lys

<210> .9

<211> 351

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 9

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agctattgga tgcactgggt ccgccagact 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaagcagg atggaagtga gaaatactat 180

gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgcat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgcgt attactgtgc gagtttccgg 300

gactacggta tggacgtctg gggccaaggg accacggtca ccgtctcctc a 351

<210〉 <211> <212> <213>

10 117 PRT Homo

sapiens

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45

Ala Asn lie Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu His 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ala Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Ser Phe Arg Asp Tyr Gly Met Asp Val 100 105

Trp Gly Gln

Gly Thr Thr 110 Ser Leu lie

Leu

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly 50 55 60 "

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Lys Gly Tyr Pro lie 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu lie Lys 100 105

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 11

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 11

gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgtc gggcgagtca gggcattagc aatcatttag cctggtttca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagtccct gatctatggt gcatccagtt tgcaaaccgg ggtcccatca 180

aagttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagattttg caagttattt ctgccaacag tataaaggtt acccgatcac cttcggccaa 300

gggacacgac tggagattaa a 321

<210> 12

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly lie Ser Asn His 25 30

<210> 13 <211〉 363 <212> DNA Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala

Ala Arg Gly Gly Asp Gly Tyr Asn Tyr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 15

<211> 339

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<213> Homo sapiens <400> 13

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatagca tgaactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attagtagta gtagtagtta catatactac 180

gcagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagaggagga 300

gatggctaca attactacta ctttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360

tea 363

<210> 14

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45

Ser Ser lie Ser Ser Ser Ser Ser Tyr lie Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Pro Gly Thr Lys Val Asp lie 110

<210> 17

<211> 363

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 15 gacatcgtga

atcacctgca

tggtaccagc

tgacccagtc agtccagcca agagaccggg

gaatccgggg tccctgaccg

tccagactcc ctggctgtgt gagtgttttt ttccgctcca acagcctcct aacctgctca attcagtggc agcgggtctg

atcaacaacc tgcaggctga agatgtggca gtttattact ccattcactt tcggccctgg gaccaaagtg gatatcaaa

ctctgggcga gagggccacc acaataagaa ctgcttaact tttactgggc atctacccgg ggacagattt cactctcacc gtcagcaata ttttggttct

<210> 16

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

Asp lie Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 10 15

Glu Arg Ala Thr lie Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Phe Arg 25 30

Ser Asn Asn Lys Asn Cys Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln 40 45

Pro Pro Asn Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80

lie Asn Asn Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95

60 120 180 240 300 339

<400> 17

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatagca tgaactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attagtagta gtagtagtta catatactac 180

gcagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagaggagga 300

gatggctaca attactacta ctttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360

tca 363

<210> 18

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 18

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Gly Tyr Asn Tyr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 19

<211> 339

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<4 00> 19

gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcacctgca agtccagcca gagtgttttt ttccgctcca acaataagaa ctgcttagct 120 tggtaccagc agagaccagg acagcctcct aacctgctca tttactgggc atctacccgg 180 gagtccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtgtg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttttggttct 300 ccattcactt tcggccctgg gaccaaagtg gatatcaaa 339

<210> 20

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 20

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Phe Arg 25 30

Ser Asn Asn Lys Asn Cys Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln 40 45

Pro Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Cys Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95

Tyr Phe Gly Ser Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile 100 105 110

Lys

<210> 21

<211> 363

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<4 00> 21

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatagca tgaactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attagtagta gtagtagtta catatactac 180 gcagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagaggagga 300

gatggctaca attactacta ctttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360

tca 363

<210> 22

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 22

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90* 95

Ala Arg Gly Gly Asp Gly Tyr Asn Tyr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 23

<211> 339

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<4 00> 23

gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60

atcacctgca agtccagcca gagtgttttt ttccgctcca acaataagaa ctgcttagct 12 0

tggtaccagc agagaccagg acagcctcct aacctcetet tttactgggc atctacccgg 180 339

<210> 24

<211> 113

<212> PRT

<213> Horno sapiens

<4 00> 24

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Phe Arg 25 30

Ser Asn Asn Lys Asn Cys Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln 40 45

Pro Pro Asn Leu Leu Phe Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95

gaatccgggg tccctgaccg atcagcagcc tgcaggctga ccattcactc tcggccctgg

12

attcagtggc agcgggtctg agatgtggca gtttattact gaccaaagtg gatatcaaa

ggacagattt cactctcacc gtcagcaata ttttggttct

Tyr Phe Gly Ser Pro Phe Thr Leu Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile 100 105 110

Lys

<210> 25

<211> 363

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<4 00> 25

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatagca tgaactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attagtagta gtagtagtta catttactac 180

gcagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcacrgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag cgccgaggac acggctgtgt attcctgtgc gagaggagga 300 gatggctaca attactacta ctttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360 tca 363

<210> 26

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 26

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Ser Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ser Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Gly Tyr Asn Tyr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 27

<211> 339

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<4 00> 27

gacatcgtga tgacccagtc tccaggctcc ctggttgtgt ctctgggcga çagggccacc 60

atcacctgca agtccagcca gagtgttttt ttccgctcca acaataagaa ctgcttagct 120

tggtaccagc agagaccagg acagtctcct aacctgctca tttactgggc atctacccgg 180

gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240

atcagcagcc tgcaggctga agatatggca gtttattact gtcagcaata ttttggttct 300 ccattcactt tcggccctgg gaccaaagtg

<210> 28

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 28

gatatcaaa

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Val Val Ser Leu Gly 10 I5

Glu Arg Ala Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Phe Arg 25 30

Ser Asn Asn Lys Asn Cys Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln 40 45

Ser Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95

Tyr Phe Gly Ser Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile

100 105 I10

Lys

<210> 29

<211> 363

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<4 00> 29

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatacca tgaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attagtagta gtagtagtta catttactac 180 gcagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag cgccgaggac acggctgrgt attcctgtgc gagaggagga 300 gatggctaca attactacta ctttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 30

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 30

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30

Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Ser Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ser Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Gly Tyr Asn Tyr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 31

<211> 339

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 31 gacatcgtga tgacccagtc tccaggctcc ctggttgtgt ctctgggcga gagggccacc atcacctgca agtccagcca gagtgttttt ttccgctcca acaataagaa ctgcttagct tggtaccagc agagaccagg acagtctcct aacctgctca tttactaggc atctacccgg gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttttggttct ccattcactt tcggccctgg gaccaaagtg gatatcaaa

60 120 180 240 300 339

<210> 32 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens

<4 00> 32

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Val Val Ser Leu Gly 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Phe Arg 25 30

Ser Asn Asn Lys Asn Cys Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln 40 45

Ser Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95

Tyr Phe Gly Ser Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile 100 105 110

Lys

<210> 33

<211> 363

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<4 00> 33

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatagca tgaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attagtagta gtagtagtta catatactac 180 gcagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagaggagga 300 gatggctaca attactacta ctitgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360 tca 363

<210> 34 <211> 121 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 34

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Gly Tyr Asn Tyr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 35

<211> 339

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<4 00> 35

gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60

atcacctgca agtccagcca gagtgttttt ttccgctcca acaataagaa ctgcttagct 120

tggtaccagc agagaccagg acagcctcct aacctactca tttactgggc atcttcccgg 180

gaatccgggg tccctgaccg gttcagtggc agcgggtctg ggacagattt cgctctcacc 240

atcagcagcc tgcagactga ggatgtggca gtttattact gtcagcaata ttttggttct 300

ccattcactt tcggccctgg gaccaaagtg gatatcaaa 339

<210> 36

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens <4 00> 36

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Phe Arg 25 30

Ser Asn Asn Lys Asn Cys Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln 40 45

Pro Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ser Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ala Leu Thr 65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Thr Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95

Tyr Phe Gly Ser Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile 100 105 110

Lys

<210> 37

<211> 363

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<4 00> 37

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctagggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatagca tgaactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attagtagta gtagtagtta catatactac 180

gcagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagaggagga 300

gatggctaca attactacta ctttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360

tca 363

<210> 38

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 38 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Gly Tyr Asn Tyr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 39

<211> 339

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 39 gacatcgtga tgacccagtt tccagactcc ctggctgtgt ctctggacga aagggccacc atcaactgca agtccagtca gagtgttttt ttccgctcca acaataagaa ctgcttagct tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aatctgctca tttactgggc atctacccgg gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc atcagcagcc tgcaggctga agatgtggct ttttattact gtcagcaata ttatagttct ccattcactt tcggccctgg gaccaaagtg gatatcaaa

<210> 40

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 40

Asp Ile Val Met Thr Gln Phe Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Asp 10 15

60 120 180 240 300 339 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Phe Arg 25 30

Ser Asn Asn Lys Asn Cys Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 40 45

Pro Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Phe Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95

Tyr Tyr Ser Ser Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile 100 105 110

Lys

<210> 41

<211> 369

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<4 00> 41

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggttcagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtacag cctctggatt ccccttcagt agctacgaca tgcactgggt ccgccaagct 120

acaggaaaag gtctggagtg ggtctcagct attggtactg ctggtgacac attctatcca 180

ggctccgtga agggccgatt caccatctcc agagaaaatg ccaagaactc cttgtatctt 240

caaatgaaca gcctgagagc cggggacacg gctgtgtatt actgtgcaag agaggggtat 300

agcagtgggc gctacttcta ctacggtatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc 360

gtctcctca 369

<210> 42

<211> 123

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 42

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Pro Phe Ser Ser Tyr 25 30

Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45

Ser Ala Ile Gly Thr Ala Gly Asp Thr Phe Tyr Pro Gly Ser Val Lys 50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Arg Glu Gly Tyr Ser Ser Gly Arg Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val 100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 43

<211> 336

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<4 00> 43

gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca gccggcctcc 60

atatcctgca ggtctagtca aagcctcgta tacagtgatg gaaacaccta cttgaattgg 120

tttcagcaga ggccaggcca atctccaagg cgcctaattt ataaggtttc taactgggac 180

tctggggtcc cagacagatt cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240

agcagggtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaaggtac acactggccg 300

ctcactttcg gcggagggac caaggtggag atcaaa 336

<210> 44

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 44

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Trp Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly 85 90 95

Thr His Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 45

<211> 1255

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 45

Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu 10 15

Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys 25 30

Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His 40 45

Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr 50 55 60

Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val 65 70 75 80

Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu 85 90 95

Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr 100 105 110

Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro 115 120 125 Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser 130 135 140

Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln 145 150 155 160

Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn 165 170 175

Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys 180 185 190

His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser 195 200 205

Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys 210 215 220

Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys 225 230 235 240

Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu 245 250 255

His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val 260 265 270

Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg 275 280 285

Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu 290 295 300

Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln 305 310 315 320

Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys 325 330 335

Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu 340 345 350

Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys 355 360 365

Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp 370

375

380

Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe 385 390 395 400

Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro 405 410 415

Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg 420 425 430

Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu 435 440 445

Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly 450 455 460

Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val 4 65 470 475 480

Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr 485 490 495

Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His 500 505 510

Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys 515 520 525

Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys 530 535 540

Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys 545 550 555 560

Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys 565 570 575

Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp 580 585 590

Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu 595 600 605

Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln 610 615 620 Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys 625 630 635 640

Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser 645 650 655

Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly 660 665 670

Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg 675 680 685

Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly 690 695 700

Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu 705 710 715 720

Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys 725 730 735

Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile 740 745 750

Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu 755 760 765

Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg 770 775 780

Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu 785 790 795 800

Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg 805 810 815

Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly 820 825 830

Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala 835 840 845

Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe 850 855 860 Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp 865 870 875 880

Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg 885 890 895

Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val

900 905 910

Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala 915 920 925

Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro 930 935 940

Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met 945 950 955 960

Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe 965 970 975

Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu 980 985 990

Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu 995 1000 1005

Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr 1010 1015 1020

Leu Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly 1025 1030 1035

Ala Gly Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg 1040 1045 1050

Ser Gly Gly Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu 1055 1060 1065

Glu Ala Pro Arg Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser 1070 1075 1080

Asp Val Phe Asp Gly Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu 1085 * 1090 1095 Gln Ser Leu Pro Thr His Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser 1100 1105 1110

Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val 1115 1120 1125

Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln Pro Glu Tyr Val Asn Gln Pro 1130 1135 114 0

Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro Arg Glu Gly Pro Leu Pro 1145 1150 1155

Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu Arg Pro Lys Thr Leu 1160 1165 1170

Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val Phe Ala Phe Gly 1175 1180 1185

Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln Gly Gly Ala 1190 1195 1200

Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala Phe Asp 1205 1210 1215

Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala Pro 1220 1225 1230

Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr 1235 1240 1245

Leu Gly Leu Asp Val Pro Val 1250 1255

<210> 46

<211> 1624

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<4 00> 46

gcgtgctgat caggactgca cacagagaac tcaccatgga atttgggctg cgctgggttt 60

tccttgttgc tattttaaaa gatgtccagt gtgacgtgca actggtggag tccgggggag 120

gcttagttca gcctgggggg tccctgagac tctcctgcgc agcctctaga ttcgcctaca 180

gtagtttttg gatgcactgg gtccgccaag ctccagggag gggtctggtg tgggtctcac 240

gtattaatcc tgatgggaga atcacagtct acgcggacgc cgtaaagggc cgattcacca 300

tctccagaga caacgccaag aacacgctct atctccaaat gaacaacctg agagccgagg 360 acacggctgt ttattactgt gcaagaggga cacgatttct ggagttgact tctaggggac 420

aaatggacca gtggggccag ggaaccctgg tcactgtctc ctcagcctcc accaagggcc 480

catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca gcggccctgg 540

gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc 600

tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca 660

gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga 720

atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct tgtgacaaaa 780

ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct 840

tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg 900

tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg 960

aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg 1020

tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg 1080

tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc 1140

cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg 1200

tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga 1260

gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct 1320

ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct 1380

tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc 1440

tgtctccggg taaatgagtg cgacggccgg caagcccccg ctccccgggc tctcgcggtc 1500

gcacgaggat gcttggcacg taccccgtgt acatacttcc cgggcgccca gcatggaaat 1560

aaagcaccca gcgctgccct ggaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620

aaaa 1624

<210> 47

<211> 938

<212> DNA

<213> Homo sapiens

< 4 00> 47

agtcaggaca cagcatggac atgagggtcc ccgctcagct cctggggctc ctgctactct 60

ggctccgagg tgccagatgt gacatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcag 120

ctgtaggaga cagagtcacc atcgcttgcc gggcaagtca gagcattgcc gactatttaa 180

attggtatca gcagaaacca gggaaagccc ctaaactcct gacctatggt tcatccagtt 240

tgcaaagcgg ggtcccatca aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctct 300 ccatcagcag tctacaacct ggagattttg caacttacta ctgtcaacag agtcacactt 360

cccctttcac ttttggcgga gggaccaagg tgcagatgaa gcgaactgtg gctgcaccat 420

ctgtcttcat cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt 480

gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc 540

tccaatcggg taactcccag gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca 600

gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct 660

gcgaagtcac ccatcagggc ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt 720

gttagaggga gaagtgcccc cacctgctcc tcagttccag cctgaccccc tcccatcctt 780

tggcctctga ccctttttcc acaggggacc tacccctatt gcggtcctcc agctcatctt 840

tcacctcacc cccctcctcc tccttggctt taattatgct aatgttggag gagaatgaat 900

aaataaagtg aatctttgca cctaaaaaaa aaaaaaaa 938

<210> 48

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 48

Gln Gln Tyr Ser Ser Pro Phe Thr 1 5

<210> 49

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 49

Gln Gln Tyr Tyr Ser Pro Phe Thr 1 5

<210> 50

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 50

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 25 30 Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Ile 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105

<210> 51 <211> 113 <212> PRT <213> Horno <400> 51

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser

25 30

Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95

Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile 100 105 110

Lys

<210> 52 <211> 112 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 52

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser 85 90 95

Ile Gln Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 53

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (100) . . (101)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorra naturalmente

<4 00> 53

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser

25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn ?rp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 40 45

Pro Arg Arg Leu Ilt 50

Tyr Lys Val Ser Asn Trp Asp Ser Gly Val 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly 85 90 95

Thr His Trp Xaa Xaa Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 110

<210> 54 <211> 121 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature <222> (99) .. (100)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorra naturalmente

<220>

<221> misc_feature <222> (106)..(106)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorra naturalmente

<4 00> 54

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 4 0 4 5

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Xaa Xaa Asp Gly Tyr Asn Tyr Xaa Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 55 <211> 121 <212> PRT <213> Homo <400> 55

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Ser Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ser Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Gly Tyr Asn Tyr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 56

<211> 123

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature <222> (98) .. (98)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorra naturalmente

<220>

<221> misc_feature <222> (103).. (104)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorra naturalmente

<4 00> 56

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30

Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45

Ser Ala Ile Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys 50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Arg Xaa Gly Tyr Ser Ser Xaa Xaa Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120

57

117

PRT

Homo sapiens

<210> <211> <212> <213>

<220>

<221> misc_feature <222> (98) . . (101)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorra naturalmente

<4 00> 57

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala 40

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 45

Val

Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr IOO 105 110

Val Thr Val Ser Ser 115

<210> 58 <211> 117 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature <222> (98) . . (99)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorra naturalmente

<4 00> 58

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 4 0 4 5

Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Xaa Xaa Arg Asp Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110

Val Thr Val Ser Ser 115

<210> 59 <211> 129 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature <222> (100)..(102)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorra naturalmente

<400> 59

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 25 30

Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 40 45

Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Ile Thr Met Val Arg Gly Val Tyr Tyr Tyr 100 105 110

Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 125

Ser

Claims (41)

1. Agente de ligação alvejado, caracterizado pelo fato de que especificamente se liga a ErbB2.

2. Agente de ligação alvejado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito agente de ligação alvejado possui pelo menos uma das seguintes propriedades: (a) liga-se às células humanas; (b) liga-se às células que expressam ErbB2 cinomolgo; (c) compete parcialmente com Herceptina® mas não compete com 2C4; (d) inibe a fosforilação de ErbB2 em células MCF7 com um EC50 de menos do que 50 ng/ml; (e) inibe a proliferação celular com um EC50 de menos do que 50 ng/ml em células SKBR3; (í) liga-se a ErbB2 com um KD de 13,5 nM ou menos; ou (g) tem uma índice de dissociação (Icoff) para ErbB2 de 2,14 χ IO"4 s"1 ou menor.

3. Agente de ligação alvejado de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o dito agente de ligação alvejado liga ErbB2 com um KD de 13,5 nM ou menos e inibe a ativação de ErbB2.

4. Agente de ligação alvejado de acordo com a reivindicação 1, cacterizado pelo fato de que o dito agente de ligação alvejado é um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consiste de um anticorpo quimérico, um anticorpo humano e um anticorpo humanizado.

5. Agente de ligação alvejado que se liga especificamente a ErbB2 humano e o inibe, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação alvejado tem pelo menos uma propriedade selecionada do grupo que consiste de um anticorpo que: (a) compete quanto a ligação a ErbB2 com um anticorpo selecionado do grupo que consiste de: 1.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.31.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1,1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.3; (b) compete quanto a ligação ao ErbB2 com um anticorpo selecionado do grupo que consiste de: 1.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1,1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.31.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.3; (c) liga-se ao mesmo epítopo de ErbB2 como um anticorpo selecionado do grupo que consiste de: 1.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1,1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.31.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.3; (d) liga-se ao ErbB2 com substancialmente o mesmo KD como um anticorpo selecionado do grupo que consiste de: 1.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.31.44.1, 1.140, 1.43,15 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.3; e (e) liga-se ao ErbB2 com substancialmente o mesmo índice de dissociação como um anticorpo selecionado do grupo que consiste de: 1.44.1,1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.31.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.3.

6. Agente de ligação alvejado que especificamente se liga a ErbB2, caracterizado pelo fato de que: (a) o agente de ligação alvejado compreende as seqüências de aminoácido das CDRl, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada de um anticorpo selecionado do grupo que consiste de: 1.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1,1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.31.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.3; e/ou (b) o agente de ligação alvejado compreende as seqüências de aminoácido das CDRl, CDR2 e CDR3 de cadeia leve de um anticorpo selecionado do grupo que consiste de 1.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, .1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.31.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.3.

7. Agente de ligação alvejado de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o dito agente de ligação alvejado é selecionado do grupo que consiste de um anticorpo quimérico, anticorpo humano e anticorpo humanizado

8. Anticorpo monoclonal ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo como definido na reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é selecionado do grupo que consiste de: (a) um anticorpo que compreende a seqüência de aminoácido da cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 2, a seqüência de aminoácido da cadeia leve apresentada na SEQ ID NO: 4, ou ambas; (b) um anticorpo que compreende a seqüência de aminoácido da cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 6 e a seqüência de aminoácido da cadeia leve apresentada na SEQ ID NO: 8, ou ambas; (c) um anticorpo que compreende a seqüência de aminoácido da cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: IOea seqüência de aminoácido da cadeia leve apresentada na SEQ ID NO: 12, ou ambas; (d) um anticorpo que compreende a seqüência de aminoácido da cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 14 e a seqüência de aminoácido da cadeia leve apresentada na SEQ ID NO: 16, ou ambas; (e) um anticorpo que compreende a seqüência de aminoácido da cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 18 e a seqüência de aminoácido da cadeia leve apresentada na SEQ ID NO: 20, ou ambas; (f) um anticorpo que compreende a seqüência de aminoácido da cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 22 e a seqüência de aminoácido da cadeia leve apresentada na SEQ ID NO: 24, ou ambas; (g) um anticorpo que compreende a seqüência de aminoácido da cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 26 e a seqüência de aminoácido da cadeia leve apresentada na SEQ ID NO: 28, ou ambas; (h) um anticorpo que compreende a seqüência de aminoácido da cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 30 e a seqüência de aminoácido da cadeia leve apresentada na SEQ ID NO: 32, ou ambas; (i) um anticorpo que compreende a seqüência de aminoácido da cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 34 e a seqüência de aminoácido da cadeia leve apresentada na SEQ ID NO: 36, ou ambas; (j) um anticorpo que compreende a seqüência de aminoácido da cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 38 e a seqüência de aminoácido da cadeia leve apresentada na SEQ ID NO: 40, ou ambas; e (k) um anticorpo que compreende a seqüência de aminoácido da cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 42 e a seqüência de aminoácido da cadeia leve apresentada na SEQ ID NO: 44, ou ambas.

9. Anticorpo monoclonal ou um porção de ligação de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende ainda a seqüência de aminoácido da cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 46, a seqüência de aminoácido da cadeia leve apresentada na SEQ ID NO: 47, ou ambas.

10. Anticorpo monoclonal ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo pode ser de qualquer isótipo.

11. Anticorpo monoclonal humano ou porção de ligação de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo ou porção compreendem uma cadeia pesada que utiliza um gene VH 3-21 humano, um gene VH 3-7 humano, um gene VH 4-31 humano, ou um gene VH 3-13 humano.

12. Anticorpo monoclonal humano ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo como definido na reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo ou porção compreendem uma cadeia leve que utiliza um gene VK B3 humano, um gene VK L1 humano, um gene VK A2 humano, ou um gene VK Al humano.

13. Anticorpo monoclonal humano ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo ou porção compreendem ainda uma cadeia leve que utiliza um gene VK B3 humano, um gene VK Ll humano, um gene VK A2 humano, ou um gene VK Al humano.

14. Anticorpo monoclonal humano ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o domínio VL, o domínio VH, ou ambos são pelo menos 90 % idênticos na seqüência de aminoácido ao domínio VL, domínio VH ou ambos, respectivamente, dos anticorpos monoclonais 1.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1,1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.31.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1,1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.3.

15. Anticorpo monoclonal ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, que especificamente se liga a ErbB2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um ou mais de uma seqüência de aminoácido de FRl, FR2, FR3 ou FR4 de um anticorpo selecionado do grupo que consiste de: 1.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39,1.24 e 1.71.31.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.3.

16. Anticorpo monoclonal humano ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende: (a) uma seqüência de aminoácido da cadeia pesada que é pelo menos 90 % idêntica à seqüência de aminoácido da cadeia pesada de anticorpo monoclonal 1.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.31.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.3; (b) uma seqüência de aminoácido da cadeia leve que é pelo menos 90 % idêntica à seqüência de aminoácido da cadeia leve de anticorpo monoclonal 1.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.31.44.1, 1.140, 1.43, 1.14.1, 1.100.1, 1.96, 1.18.1, 1.20, 1.39, 1.24 e 1.71.3; ou tanto (a) quanto (b).

17. Anticorpo monoclonal humano ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a dita porção de ligação de antígeno é selecionada do grupo que consiste de: Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, e fragmentos da região determinadora de complementaridade (CDR), anticorpos de cadeia única (scFv ou scFv2), anticorpos quiméricos, diacorpos, anticorpos biespecíficos, e polipeptídeos que contenham pelo menos uma porção de um anticorpo que seja suficiente para conferir ligação de antígeno específica ao polipeptídeo.

18. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o agente de ligação alvejado como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 18 e um carreador farmaceuticamente aceitável.

19. Composição de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que compreende um agente terapêutico ou de diagnóstico adicional.

20. Composição de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um anticorpo que especificamente liga ErbB2 em que o dito anticorpo não compete quanto à ligação a ErbB2 com um anticorpo selecionado do grupo que consiste de: 1.14.1, 1.18.1, 1.20.1, 1.24.3, 1.39.1, 1.71.3, 1.96.2, 1.100.1, e 1.140.1.

21. Linhagem de célula isolada, caracterizada pelo fato de que produz o agente de ligação alvejado como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 18.

22. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fato de que compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica a cadeia pesada ou uma porção de ligação de antígeno desta, a cadeia leve ou uma porção de ligação de antígeno desta, ou ambas, de um anticorpo como definido na reivindicação 4.

23. Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que compreende uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo que consiste de: (a) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 1; (b) a seqüência de nucleotídeo que codifica a SEQ ID NO: 2; (c) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 3; (d) a seqüência de nucleotídeo que codifica a SEQ ID NO: 4; (e) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 5; (f) a seqüência de nucleotídeo que codifica a SEQ ID NO: 6; (g) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 7; (h) a seqüência de nucleotídeo que codifica a SEQ ID NO: 8; (i) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 9; (j) a seqüência de nucleotídeo que codifica a SEQ ID NO: 10; (k) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 11; (1) a seqüência de nucleotídeo que codifica a SEQ ID NO: 12; (m) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 13; (n) a seqüência de nucleotídeo que codifica a SEQ ID NO: 14; (o) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 15; (p) a seqüência de nucleotídeo que codifica a SEQ ID NO: 16; (q) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 17; (r) a seqüência de nucleotídeo que codifica a SEQ ID NO: 18; (s) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 19; (t) a seqüência de nucleotídeo que codifica a SEQ ID NO: 20; (u) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 21; (v) a seqüência de nucleotídeo que codifica a SEQ ID NO: 22; (w) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 23; χ) a seqüência de nucleotídeo que codifica a SEQ ID NO: 24; y) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 25; z) a seqüência de nucleotídeo que codifica a SEQ ID NO: 26; aa) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 27; bb) a seqüência de nucleotídeo que codifica a SEQ ID NO: cc) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 29; dd) a seqüência de nucleotídeo que codifica a SEQ ID NO: ee) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 31; ff) a seqüência de nucleotídeo que codifica a SEQ ID NO: 32; gg) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 33; hh) a seqüência de nucleotídeo que codifica a SEQ ID NO: ii) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 35; jj) a seqüência de nucleotídeo que codifica a SEQ ID NO: 36; kk) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 37; 11) a seqüência de nucleotídeo que codifica a SEQ ID NO: 38; mm) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 39; nn) a seqüência de nucleotídeo que codifica a SEQ ID NO: oo) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 41; pp) a seqüência de nucleotídeo que codificam, SEQ ID NO: qq) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 43; e (rr) a seqüência de nucleotídeo que codifica a SEQ ID NO: 44.

24. Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma seqüência de controle de expressão.

25. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 22, em que o vetor opcionalmente compreende uma seqüência de controle de expressão operavelmente ligada à molécula de ácido nucleico.

26. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor como definido na reivindicação 25 ou a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 22.

27. Método para produzir um agente de ligação alvejado, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar uma célula hospedeira como definida na reivindicação 26 sob condições adequadas e recuperar o dito agente de ligação alvejado.

28. Animal transgênico não humano ou planta transgênica, caracterizados pelo fato de que compreendem o ácido nucleico como definido na reivindicação 22, em que o animal transgênico não humano ou a planta transgênica expressam o dito ácido nucleico.

29. Método para isolar um anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo que especificamente liga-se ao ErbB2 humano, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de isolar o anticorpo do animal transgênico não humano ou a planta transgênica como definido na reivindicação 28.

30. Método para fabricar um anticorpo monoclonal humano que especificamente liga-se ao ErbB2, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: i) imunizar um animal transgênico não humano que seja capaz de produzir anticorpos humanos com ErbB2, uma porção imunogênica de ErbB2 ou uma célula ou tecido que expressem ErbB2; ii) permitir que o animal transgênico monte uma resposta imune ao ErbB2; e iii) recuperar o anticorpo.

31. Anticorpo isolado, caracterizado pelo fato de que é produzido pelo método como definido na reivindicação 30.

32. Método para tratar, prevenir ou aliviar os sintomas de um distúrbio mediado pelo ErbB2 em um paciente em necessidade deste, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de administrar ao dito paciente um agente de ligação alvejado como definido na reivindicação 1, em que o dito agente de ligação alvejado inibe ErbB2.

33. Método para tratar, prevenir ou aliviar os sintomas de um distúrbio mediado pelo ErbB2 em um paciente em necessidade deste com um anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo que especificamente liga-se ao ErbB2, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de (a) administrar uma quantidade eficaz de uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica a cadeia pesada ou a porção de ligação de antígeno desta, uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica a cadeia leve ou a porção de ligação de antígeno desta, ou ambas as moléculas de ácido nucleico que codificam a cadeia leve e a cadeia pesada ou porções de ligação de antígeno destas; e (b) expressar a molécula de ácido nucleico.

34. Método de acordo com as reivindicações 32 ou 33, caracterizado pelo fato de que o distúrbio mediado pelo ErbB2 é câncer.

35. Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo que consiste de câncer da mama, bexiga, pulmão, cabeça, pescoço, próstata, estômago, endométrio, glândula salivar, pulmão, rim, cólon, tireóide, câncer pancreático, e glioblastomas.

36. Método para inibir a proliferação de uma célula cancerosa que expressa ErbB2 em um paciente em necessidade deste, o método caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de administrar ao dito paciente o agente de ligação alvejado como definido na reivindicação 1.

37. Método para inibir uma atividade de ErbB2 em uma célula que expressa ErbB2, caracterizado pelo fato de que compreende Contatar a célula com o agente de ligação alvejado como definido na reivindicação 1 ? em que a atividade de ErbB2 na célula é selecionada do grupo que consiste - (a) fosforilação de ErbB2; (b) ativação do caminho MAPK; (c) ativação do caminho PI3K; (d) inibição de CDC2; e (e) combinações destes.

38. Método para modular uma atividade de ErbB2 em Virria célula que expressa ErbB2, caracterizado pelo fato de que compreeI1^e contatar a célula com um agente de ligação alvejado como definida 1^a reivindicação 1, em que a atividade de ErbB2 na célula é a ativação c^a caminho p38-TSP-l.

39. Método de acordo com a reivindicação 37, caracteríg^jbíá^ pelo fato de que a célula está em um indivíduo.

40. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizjsj^í^ pelo fato de que a célula é uma célula cancerosa.

41. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizguá^ pelo fato de que a fosforilação de ErbB2 é inibida em 48 horas.