CN102167742B - 一种全人源抗her2单克隆抗体、其制备方法及用途 - Google Patents

一种全人源抗her2单克隆抗体、其制备方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种全人源抗HER2单克隆抗体、其制备方法及用途。本发明构建了大容量的天然人源噬菌体抗体库，从中筛选获得了一株全人源抗HER2抗体3E12，其重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：6所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：8所示。另外，本发明还公开了3E12抗体的制备方法以及编码3E12抗体的核苷酸序列、含该核酸序列的表达载体和宿主细胞。本发明的3E12抗体与人源化抗HER2抗体Trastuzumab相比，具有更高的抗体亲和力，更强的HER2高表达乳腺癌细胞增殖抑制作用、细胞凋亡诱导活性，可明显抑制肿瘤的增长，可用于制备抗肿瘤药物。

Description

一种全人源抗HER2单克隆抗体、其制备方法及用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种全人源单克隆抗体、其制备方法及用途。
背景技术
乳腺癌是女性最为常见的恶性肿瘤之一。全世界每年新增100万以上的乳腺癌病例，而且每年近40万人死于乳腺癌。近年来，乳腺癌的发病率在世界范围内呈明显的上升趋势。无论是在高流行区还是低流行区，乳腺癌发病率均已5～20％的速度上升。亚洲妇女的乳腺癌发病率的增长趋势已明显高于欧美国家。在中国，乳腺癌在一些城市已发展为女性恶性肿瘤发病的首位。乳腺癌通常的治疗手段有手术治疗，放化疗和内分泌治疗等等，这些常规治疗手段虽然在很大程度上延长了病人生存期，然而它们副作用很大，其疗效难以进一步提高。肿瘤靶向治疗是近年来兴起的一种新的肿瘤治疗方式，其中具有代表性的是抗肿瘤单克隆抗体。
HER2(人表皮生长因子受体2，human epidermal growth factor receptor 2)是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，分子量约为185KD。抗HER2人源化单克隆抗体可以特异性的和HER2结合，其抗肿瘤机制包括以下几点：特异结合于HER2受体胞外段从而阻断HER2同源二聚体的组成性激活并干扰HER2与其它ErbB家族成员形成异源二聚体。介导HER2受体的内吞和在溶酶体中的降解；活化PTEN(与tensin同源的磷酸酯酶)阻断PI3K(磷酸肌醇3-激酶)信号通路；调节细胞周期而抑制肿瘤细胞增殖；促进肿瘤细胞凋亡；抗肿瘤血管生成；ADCC(抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用)作用；抑制DNA修复；增加化疗药物的细胞毒性；逆转肿瘤细胞对宿主细胞因子杀伤作用的抵抗等(Pergram M，Ngo D，Application and potential limitations of animal modelsutilized in the development of trastuzumab
Figure GSA00000033588200011
A case study.Adv DrugDeliv Rev.2006；58：723-34.)。
抗HER2人源化单克隆抗体(Trastuzumab，商品名Herceptin)已被用于临床试验，作为单药治疗HER2过度表达的转移性乳腺癌，这些患者曾接受过针对其转移灶1个或1个以上化疗方案化疗而失败。本药在临床试验中还与紫杉醇或蒽环类药物(阿霉素或表阿霉素)加环磷酰胺合用作为一线药物，治疗HER2过度表达的转移性乳腺癌(Merlin JL，Barberi-Heyob M，Bachmann N，Invitro comparative evaluation of trastuzumab(Herceptin)combined with paclitaxel(Taxol)or docetaxel(Taxotere)in HER2-expressing human breast cancer cell lines.Ann Oncol.2002；13：1743-8.)。但Trastuzumab是一个人源化抗体，保留了鼠源CDR区和少量FR区鼠源残基，仍未能达到全人源化，且存在着亲和力不高的问题。
发明内容
本发明构建了大容量的天然人源噬菌体抗体库，从中筛选获得了一株全人源抗HER2抗体3E12。
更具体地，本发明公开的全人源抗HER2抗体，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：6所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：8所示；
本发明公开的上述全人源抗HER2抗体，重链氨基酸序列为SEQ ID NO：10所示，轻链氨基酸序列为SEQ ID NO：12所示；
本发明还公开了一种核苷酸序列，编码上述的全人源抗HER2抗体；
本发明公开的上述核苷酸序列，其中编码全人源抗HER2抗体重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：5所示，编码全人源抗HER2抗体轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：7所示；
本发明公开的上述核苷酸序列，其中编码全人源抗HER2抗体重链的核苷酸序列为SEQ ID NO：9所示，编码全人源抗HER2抗体轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO：11所示；
本发明还公开了一种表达载体，含有上述的核苷酸序列，为pcDNA3.1/ZEO(+)或pcDNA3.1(+)；
本发明还公开了上述表达载体转化的宿主细胞，为CHO-K1细胞；
本发明进一步公开的上述全人源抗体的制备方法，包括从噬菌体人源抗体库筛选获得高亲和力全人源抗HER2单链抗体；全人源抗HER2完整抗体分子真核表达载体的构建；全人源抗HER2完整抗体分子在CHO细胞中的表达；全人源抗HER2完整抗体分子的纯化。
本发明最后公开的上述的全人源抗体在制备治疗抗肿瘤药物中的用途，所述的肿瘤为HER2高表达肿瘤，更具体的为乳腺癌。
本发明利用得到的抗体进行了一系列实验，实验结果表明：与人源化抗体Trastuzumab(rhumAb 4D5)和中国专利申请号01132225.X申请日2001年11月16日发明名称为《人源化抗HER2单克隆抗体及其制法和药物组合物》中公开的人源化抗体hGH0/1相比，3E12具有更高的抗体亲和力，更强的HER2高表达乳腺癌细胞增殖抑制作用、细胞凋亡诱导活性；体内抗肿瘤实验结果表明，本发明得到的抗体可以明显抑制肿瘤的增长。
附图说明
图1.抗HER2抗体的凋亡实验结果(其中图1-1为SK-BR3细胞，图1-2为BT-474细胞，图1-3为MCF-7细胞)；
图2.抗HER2抗体的的生长抑制实验结果(其中图2-1为SK-BR3细胞，图2-2为BT-474细胞，图2-3为MCF-7细胞)；
图3.抗HER2抗体的体内抗肿瘤实验结果。
具体实施方式
以下实施例、实验例仅仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。
实施例抗体的制备
(1)人抗体轻、重链恒定区基因的克隆
用淋巴细胞分离液(鼎国生物技术发展公司产品)分离健康人淋巴细胞，用Trizol试剂(Invitrogen公司产品)提取总RNA，根据文献(Cell，1980，22：197-207)和文献(NucleicAcids Research，1982，10：4071-4079)报道的序列分别设计引物采用RT-PCR反应扩增抗体重链和轻链恒定区基因。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体(Promega公司产品)中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别显示了重链恒定区(CH)的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4分别显示了轻链恒定区(CL)的核苷酸序列和氨基酸序列。本例中的正确克隆记作pGEM-T/CH和pGEM-T/CL。
(2)cDNA的制备
收集50健康人的外周血各20ml，混合，用淋巴细胞分离液(医科院天津血研所生产)分离单个核细胞。用Trizol试剂(Invitrogen公司)从分离的人外周血淋巴细胞中提取细胞的总RNA。用cDNA反转录试剂盒(上海申能博彩生物科技有限公司)反转录出cDNA。以上步骤按照厂家提供的说明书进行。
(3)引物设计
参考文献(Immunotechnology，1998，3：271-278)设计并合成克隆人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因的VHBack，VHFor，VLBack和VLFor引物。VHBack，VHFor，VLBack和VLFor的序列见Immunotechnology，1998，3：271-278。其中在VHBack引物的5’端加上含有Sfi I位点的序列atg gcc cag ccg gcc atg gcc，在VHFor引物的5’端加上序列gcc aga acc acc gcc gcc gga gcc acc acc gcc，在VLBack引物的5’端加上序列tcc ggc ggc ggt ggt tct ggc gga ggc gga tct，在VLFor引物的5’端加上含有Not I位点的序列atg cgg ccg c。
(4)噬菌体抗体库的构建及筛选
采用(2)中的cDNA和(3)中的引物，利用recombinant Phage antibodysystem试剂盒(Amersham Biosciences公司)构建噬菌体单链抗体库，然后用特异性抗原对文库进行淘选。抗体库构建和淘选方法参照recombinant Phageantibody system试剂盒说明书进行，用于淘选的特异性抗原“人HER2膜外区蛋白”按照参考文献(Proc Natl Acad Sci USA，1992，89：4285-4289)的方法制备。经多次淘选抗体库后获得了一株抗人HER2单链抗体3E12ScFv，测序后获得其基因序列。SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6分别显示了3E12ScFv重链可变区VH的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8分别显示了3E12ScFv轻链可变区VL的核苷酸序列和氨基酸序列。
(5)全人源抗体在真核细胞中的表达
以3E12ScFv基因和pGEM-T/CH为模版，通过重叠PCR合成全人源抗体重链基因，反应条件为：95℃15分钟；94℃50秒，58℃50秒，72℃50秒，30个循环；72℃10分钟。并使此全人源抗体重链基因的5′端含有限制酶位点HindIII和信号肽基因序列，3′端含有翻译终止密码TAA和限制酶位点EcoR I。信号肽基因序列为(ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATATCCAGAGGA)。最后琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，回收目的条带并克隆到pGEM-T载体(Promega公司产品)中，筛选阳性克隆测序。挑选测序正确的克隆用HindIII和EcoR I酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收全人源抗体重链片段3E12VHCH，与用HindIII和EcoR I酶切的质粒pcDNA3.1(+)(Invitrogen公司)进行连接，构建成全人源重链真核表达载体pcDNA3.1(+)(3E12VHCH)。
以3E12ScFv基因和pGEM-T/CL载体为模板，通过重叠PCR合成全人源化抗体轻链基因，反应条件为：95℃15分钟；94℃50秒，58℃50秒，72℃50秒，30个循环；72℃10分钟，得到PCR产物，其5′端含有限制酶位点HindIII和信号肽基因序列，3′端含有翻译终止密码TAA和限制酶位点EcoR I。信号肽基因序列为(ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATATCCAGAGGA)。挑选测序正确的克隆用HindIII和EcoR I酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收全人源抗体轻链片段3E 12VLCL，与用HindIII和EcoR I酶切的质粒pcDNA3.1/ZEO(+)(Invitrogen公司)载体进行连接，构建成全人源轻链真核表达载体pcDNA3.1/ZEO(+)(3E12VLCL)。
于3.5cm组织培养皿中接种3×105CHO-K1细胞(ATCC CRL-9618)，细胞培养至90％-95％融合时进行转染：取质粒10μg(质粒pcDNA3.1(+)(3E 12VHCH)4μg，质粒pcDNA3.1/ZEO(+)(3E 12VLCL)6μg)和20μlLipofectamine2000Reagent(Invitrogen公司产品)按Lipofectamine2000Reagent试剂盒说明书进行转染。转染进行24h后细胞换含600μg/ml G418(Invitrogen公司产品)和250μg/ml Zeocin(Invitrogen公司产品)的DMEM培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆：羊抗人IgG(Fc)(KPL公司)包被于ELISA板，4℃过夜，用2％BSA-PBS于37℃封闭2h，加入待测的抗性克隆培养上清或标准品Human myeloma IgG1，κ(Sigma)，37℃温育2h，加入HRP-羊抗人IgG(κ)((Southern Biotechnology Associates公司)进行结合反应，37℃温育1h，加入TMB显色液于37℃作用5min，最后用H2SO4终止反应，测A450值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱(GE公司产品)分离纯化全人源抗体3E12。将纯化抗体用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量。SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10分别显示了全人源抗体3E12的重链核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12分别显示了全人源抗体3E12的轻链核苷酸序列和氨基酸序列。
实验例
hGH0/1按中国专利申请号01132225.X申请日2001年11月16日发明名称为《人源化抗HER2单克隆抗体及其制法和药物组合物》中公开的方法制备得到。
抗HER2抗体的凋亡实验
将人乳腺癌细胞SK-BR-3(HER2高表达，ATCC号：HTB-30)、BT-474(HER2中表达，ATCC号：HTB-20)及MCF-7(HER2低表达，ATCC号：HTB-22)分别与不同稀释度的抗HER2抗体(包括Trastuzumab，hGH0/1，3E12)在37℃培养20小时，洗细胞后用AnnexinV/PI试剂盒(BD公司产品)按照产品说明书检测早期凋亡细胞百分率。抗凋亡实验如图1所示：3E12抗体杀伤SK-BR3细胞的能力明显强于Trastuzumab抗体和hGH0/1(在抗体浓度≥0.025nM的浓度的时候，P＜0.05，t检验，同样的结果也在BT-474细胞中得到证实(在抗体浓度≥0.025nM的浓度的时候，P＜0.05，t检验。然而，在HER2低表达的MCF-7细胞中，3E12抗体杀伤能力与Trastuzumab抗体和hGH0/1抗体差不多。这些结果显示了3E12抗体杀伤细胞的HER2特异性，且其杀伤HER2中高表达的细胞的能力要强于Trastuzumab抗体和hGH0/1抗体。
抗HER2抗体的的细胞生长抑制实验
将人乳腺癌细胞SK-BR-3、BT-474及MCF-7细胞分别与不同稀释度的抗HER2抗体在37℃进行孵育，第五日用MTT染色法染色读数后计算生长抑制率。生长抑制实验如图2所示：3E12抗体对SK-BR3细胞的生长抑制能力明显强于Trastuzumab抗体和hGH0/1(在抗体浓度≥0.1nM的浓度的时候，P＜0.05，t检验)，同样的结果也在BT-474细胞中得到证实(在抗体浓度≥0.1nM的浓度的时候，P＜0.05，t检验)。然而，在HER2低表达的MCF-7细胞中，3E12抗体对细胞的抑制能力与Trastuzumab抗体和hGH0/1抗体差不多。这些结果显示了3E12抗体对细胞生长抑制的的HER2特异性，且其抑制HER2中高表达的细胞的能力要强于Trastuzumab抗体和hGH0/1抗体。
抗HER2抗体的体内抗肿瘤实验
SCID小鼠(购自上海斯莱克公司)于0天时分别皮下接种高度表达表达HER2的人乳腺癌细胞BT-474，待肿瘤长至0.3cm3时给荷瘤小鼠分别腹腔注射0.5，5mg/kg的各种抗HER2抗体，每周2次，连续治疗3周。定期观测各组小鼠体重和肿瘤大小的变化，共观察120天。评价抗HER2抗体的抗肿瘤治疗效果。体内抗肿瘤实验如图3所示：3E12抗体对高表达HER2的BT-474乳腺癌的的生长抑制能力明显强于Trastuzumab抗体和hGH0/1(在25mg/kg的剂量时，第50、60、70、80、90、100、110、120天的时候，P＜0.05，Mann-Whitney检验)。
一种全人源抗HER2单克隆抗体、其制备方法及用途
SEQUENCE LISTING
<110>百迈博药业有限公司
<120>一种全人源抗HER2单克隆抗体、其制备方法及用途
<160>12
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<212>DNA
<213>人抗体重链恒定区(CH)的核苷酸序列
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Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
    130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
                165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
            180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
        195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
    210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225                 230                 235                 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
                245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
            260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
        275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
    290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
            325                 330
<210>3
<211>318
<212>DNA
<213>人抗体轻链恒定区(CL)的核苷酸序列
<400>3
actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga    60
actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg    120
aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc    180
aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa    240
cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc    300
ttcaacaggg gagagtgt                                                  318
<210>4
<211>106
<212>PRT
<213>人抗体轻链恒定区(CL)的氨基酸序列
<400>4
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1               5                   10                  15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
            20                  25                  30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
        35                  40                  45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
    50                  55                  60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65                  70                  75                  80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
                85                  90                  95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
            100                 105
<210>5
<211>366
<212>DNA
<213>全人源抗体3E12重链可变区核苷酸序列
<400>5
gaggtgcatc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctgggggggc cctgagactc     60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aactacgaca tgcactgggt ccgccaagct    120
acaggaaaag gtctggagtg ggtctcagcc aatggtactg ctggtgacac atactatcca    180
ggctccgtga aggggcgatt caccatctcc agagaaaatg ccaagaactc cttgtatctt    240
caaatgaaca gcctgagagc cggggacacg gctgtgtatt actgtgcaag agacgtggat    300
atagtggcta cgattacgga ctactttgac tactggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc    360
tcctca                                                               366
<210>6
<211>122
<212>PRT
<213>全人源抗体3E12重链可变区氨基酸序列
<400>6
Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ala Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Asn Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Asp Val Asp Ile Val Ala Thr Ile Thr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>7
<211>345
<212>DNA
<213>全人源抗体3E12轻链可变区核苷酸序列
<400>7
gatattgtga tgacccagac tccactctcc tcacctgtca cccttggaca gccggcctcc     60
atctcctgca ggtctagtca aagcctcgta cacagtgatg gaaacaccta cttgagttgg    120
cttcagcaga ggccaggcca gcctccaaga ctcctaattt ataagatttc taaccggttc    180
tctggggtcc cagacagatt cagtggcagt ggggcaggga cagatttcac actgaaaatc    240
agcagggtgg aagctgagga tgtcggggtt tattactgca tgcaagctac acaatttcct    300
caccagtgga cgttcggcca agggaccaag gtggaaatca aacgt                    345
<210>8
<211>115
<212>PRT
<213>全人源抗体3E12轻链可变区氨基酸序列
<400>8
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
            20                  25                  30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro
        35                  40                  45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
                85                  90                  95
Thr Gln Phe Pro His Gln Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
            100                 105                 110
Ile Lys Arg
        115
<210>9
<211>1356
<212>DNA
<213>全人源抗体3E12的重链核苷酸序列
<400>9
gaggtgcatc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctgggggggc cctgagactc   60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aactacgaca tgcactgggt ccgccaagct  120
acaggaaaag gtctggagtg ggtctcagcc aatggtactg ctggtgacac atactatcca  180
ggctccgtga aggggcgatt caccatctcc agagaaaatg ccaagaactc cttgtatctt  240
caaatgaaca gcctgagagc cggggacacg gctgtgtatt actgtgcaag agacgtggat  300
atagtggcta cgattacgga ctactttgac tactggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc  360
tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc  420
tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg  480
gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag  540
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc  600
cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt  660
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg  720
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg  780
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc  840
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag  900
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat  960
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1020
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1080
gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1140
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1200
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc 1260
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1320
tacacgcaga agagcctctc cctgtccccg ggtaaa                           1356
<210>10
<211>452
<212>PRT
<213>全人源抗体3E12的重链氨基酸序列
<400>10
Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ala Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Asn Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Asp Val Asp Ile Val Ala Thr Ile Thr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
        115                 120                 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
    130                 135                 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145                 150                 155                 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
                165                 170                 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
            180                 185                 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
        195                 200                 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
    210                 215                 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225                 230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
                245                 250                 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
            260                 265                 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
        275                 280                 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
    290                 295                 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305                 310                 315                 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
                325                 330                 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
            340                 345                 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
        355                 360                 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
    370                 375                 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385                 390                 395                 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp GIy Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
                405                 410                 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
            420                 425                 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
        435                 440                 445
Ser Pro Gly Lys
    450
<210>11
<2ll>663
<212>DNA
<213>全人源抗体3E12的轻链核苷酸序列
<400>11
gatattgtga tgacccagac tccactctcc tcacctgtca cccttggaca gccggcctcc   60
atctcctgca ggtctagtca aagcctcgta cacagtgatg gaaacaccta cttgagttgg  120
cttcagcaga ggccaggcca gcctccaaga ctcctaattt ataagatttc taaccggttc  180
tctggggtcc cagacagatt cagtggcagt ggggcaggga cagatttcac actgaaaatc  240
agcagggtgg aagctgagga tgtcggggtt tattactgca tgcaagctac acaatttcct  300
caccagtgga cgttcggcca agggaccaag gtggaaatca aacgtactgt ggctgcacca  360
tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg  420
tgcctgctga ataacttcta tcccagagag gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc  480
ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc acagagcagg acagcaagga cagcacctac  540
agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc  600
tgcgaagtca cccatcaggg cctgagctcg cccgtcacaa agagcttcaa caggggagag  660
tgt                                                                663
<210>12
<211>221
<212>PRT
<213>全人源抗体3E12的轻链氨基酸序列
<400>12
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
            20                  25                  30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro
        35                  40                  45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
                85                  90                  95
Thr Gln Phe Pro His Gln Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
            100                 105                 110
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
        115                 120                 125
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
    130                 135                 140
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
145                 150                 155                 160
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
                165                 170                 175
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
            180                 185                 190
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
        195                 200                 205
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210                 215                 220

Claims (9)

1.一种全人源抗HER2抗体，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
2.权利要求1所述的全人源抗HER2抗体，其重链氨基酸序列如SEQ IDNO:10所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
3.一种核苷酸序列，编码权利要求1～2任一所述的全人源抗HER2抗体。
4.权利要求3所述的核苷酸序列，其中编码全人源抗HER2抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，编码全人源抗HER2抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
5.权利要求4所述的核苷酸序列，其中编码全人源抗HER2抗体重链的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，编码全人源抗HER2抗体轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
6.一种含有权利要求3～5任一所述的核苷酸序列的表达载体，为pcDNA3.1/ZEO(+)(3E12VLCL)或pcDNA3.1(+)(3E12VHCH)。
7.一种转化权利要求6所述的表达载体的宿主细胞，为CHO-K1细胞。
8.权利要求1～2任一所述的全人源抗HER2抗体制备治疗抗肿瘤药物中的用途，所述肿瘤为HER2高表达肿瘤。
9.权利要求8所述的用途，其中HER2高表达肿瘤为乳腺瘤。
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