CN113480657B - 针对her2的单域抗体及其衍生蛋白和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术或免疫学技术领域，涉及针对HER2的单域抗体及其衍生蛋白和应用。所述的单域抗体的序列包括互补决定区CDR；所述互补决定区CDR包括CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；所述的单域抗体的互补决定区CDR的序列为（1）‑（15）中的一种。本发明的单域抗体能够与HER2高亲和力结合，能介导ADCC且发生内化，并具有较好成药性，本发明的单域抗体为抗HER2重链单域抗体。

Description

针对HER2的单域抗体及其衍生蛋白和应用
技术领域
本发明涉及生物技术或免疫学技术领域，涉及针对HER2的单域抗体及其衍生蛋白和应用。
背景技术
人表皮生长因子受体2(HER2)是一种膜糖蛋白，属于表皮生长因子受体(EGF)家族。HER2在发育、细胞增殖和分化中发挥关键作用。在正常情况下HER2基因处于非激活状态，当机体收到外界某些因素的作用后，HER2基因表达调控失常而被激活，且HER2基因编码的产物在无配体的情况下也能持续激活，使细胞生长失控，肿瘤发生。HER2与多种肿瘤的恶化和预后差有关，包括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌等。
HER家族蛋白是I型跨膜生长因子受体，在胞外信号刺激下激活胞内信号通路，包括4种受体：HER1，HER2，HER3和HER4。这些受体的结构包括胞外配体结合域，跨膜域，以及胞内的酪氨酸激酶域。此家族的功能在秀丽线虫中最简单，信号转导由一个单一配体和一个受体介导；在果蝇中稍复杂，四个配体通过一个受体传递信号；而在哺乳动物中，该系统更加复杂，通过至少12个配体和4个受体发挥功能。尽管尚未知晓此系统具有如此多样性的背后原因，其信号转导的潜在分子机制已被广为知晓。配体结合到胞外域后，HER蛋白的胞内域发生二聚化和磷酸化，磷酸化的酪氨酸残基锚定大量的胞内信号分子，从而激活大量下游第二信使信号通路，并与其它跨膜信号通路交叉，导致多种生物学效应，如细胞增殖，血管生成，凋亡，粘附和移动等。结晶数据表明，HER蛋白的胞外域可以关闭抑制态和开放激活态两种形式存在。胞外配体结合诱导其构象发生变化，使其变成激活态，诱导其二聚化以及随后的磷酸化。HER家族的搭档选择在信号转导中可能起着决定作用，异二聚体优先于同二聚体。HER2具有最强的催化激酶活性，包含HER2在内的的异二聚体具有最强的信号转导功能。不像HER家族的其他成员，HER2的胞外域不在激活和失活两种构象间切换，而是持续地处于激活态(Mark M.Moasser,Oncogene,6469-6487,2007)。因此，HER2缺乏配体结合活性，其异二聚体搭档，如HER3结合配体后参与其信号转导。而且，HER2抗内化和降解，激活后在细胞表面长时间地传递信号。HER2在特定的突出于细胞表面的质膜区与伴侣分子HSP90和钙泵PMCA2相结合，从而避免内化。
HER2的过表达，要么通过基因扩增，要么通过转录失常，发现于25％-30％的乳腺癌和卵巢癌中，在乳腺癌的发病过程中扮演重要角色。乳腺癌中HER2的基因拷贝数可高达25-50倍，HER2蛋白的表达可增加到40-100倍，导致肿瘤细胞表面表达高达200万个该受体。有证据表明HER2基因的扩增是人类乳腺肿瘤发生的早期事件，近一半的原位导管癌在无任何浸润迹象时发生了HER2基因扩增，且HER2基因在疾病向浸润、淋巴结转移、远端转移的阶段发展的全过程中维持该状态。因此尽管HER2扩增的乳腺癌与非扩增的乳腺癌相比似乎倾向于恶化和预后差，该扩增是一个早期过程。HER2扩增型乳腺癌与其它类型乳腺癌相比，其生物学特征具有显著差异，包括对某种特定细胞毒性化疗药物敏感性增加，对某种特定激素具有抗性，以及增加向大脑转移的倾向性等。此外，HER2过表达和扩增也见于胃癌、食管癌、子宫内膜癌，且与更严重的疾病相关，罕见于口咽癌、肺癌和膀胱癌。
尽管在人类肿瘤中没有发现HER2跨膜域的体细胞突变，但是HER2跨膜域存在基因多态性。尤其，HER2的I665V变体增加了二聚化和信号转导的潜能。因此有人提议该变体可能增加乳腺癌的易感性。尽管早期大量研究确实表明这种关联的存在，后续一些研究得到了与先前大多数研究相反的结论，即不存在与I665V基因型相关的风险。当前处于优势的证据似乎不支持HER2多态性与乳腺癌之间的关联，需要进一步探讨。
赫赛汀(曲妥珠单抗，即Herceptin)是抗HER2的人源化抗体，与HER2胞外段的结构域IV结合后，抑制其二聚化，导致细胞停滞在G1期。也有些治疗效果可能归功于HER2的下调。这些机制导致受体二聚化的中断，进而减少信号转导，导致细胞周期停滞。药效学研究表明，曲妥珠单抗具有诱导ADCC效应的作用以及与毒素偶联后可通过内化杀伤靶细胞。曲妥珠单抗在治疗HER2过表达淋巴结阳性乳腺癌方面有重要影响。联合使用曲妥珠单抗和化疗(紫杉醇，盐酸阿霉素和环磷酰胺)已被证实比单独使用曲妥珠单抗提高生存率和响应率。使用曲妥珠单抗最常见的副反应是发烧，恶心、呕吐、腹泻、感染、咳嗽、头痛、疲劳、呼吸困难、皮疹、中性粒细胞减少症、贫血和肌痛。曲妥珠单抗最严重的并发症是对心脏的影响，与2％-7％的心脏功能障碍有关。由于曲妥珠单抗高昂的价格，以及其在很多国家无报销，仍有很大一部分病人无法享有使用曲妥珠单抗的机会。因此开发具有相同药效和安全性的Herceptin生物类似物可以使更多的病人得到曲妥珠单抗的治疗，进而也帮助降低治疗成本。
发明内容
为了克服上述缺陷，本发明的目的是提供针对HER2的单域抗体及其衍生蛋白和应用,使用生物基因工程技术筛选出特异性针对HER2的单域抗体，这些抗体初步亲和力明显，并且具有阻断特定细胞释放细胞因子，通过原核表达即具有良好的结合活性，具有一定的成药性。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：针对HER2的单域抗体，其特征在于，所述的单域抗体的序列包括互补决定区CDR；所述互补决定区CDR包括CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；
所述的单域抗体的互补决定区CDR的序列为下述(1)-(15)中的一种：
(1)SEQ ID NO:37所示的CDR1，SEQ ID NO:51所示的CDR2，SEQ ID NO:61所示的CDR3；
(2)SEQ ID NO:33所示的CDR1，SEQ ID NO:53所示的CDR2，SEQ ID NO:72所示的CDR3；
(3)SEQ ID NO:34所示的CDR1，SEQ ID NO:54所示的CDR2，SEQ ID NO:67所示的CDR3；
(4)SEQ ID NO:36所示的CDR1，SEQ ID NO:56所示的CDR2，SEQ ID NO:58所示的CDR3；
(5)SEQ ID NO:39所示的CDR1，SEQ ID NO:46所示的CDR2，SEQ ID NO:59所示的CDR3；
(6)SEQ ID NO:31所示的CDR1，SEQ ID NO:57所示的CDR2，SEQ ID NO:69所示的CDR3；
(7)SEQ ID NO:43所示的CDR1，SEQ ID NO:47所示的CDR2，SEQ ID NO:71所示的CDR3；
(8)SEQ ID NO:37所示的CDR1，SEQ ID NO:50所示的CDR2，SEQ ID NO:60所示的CDR3；
(9)SEQ ID NO:35所示的CDR1，SEQ ID NO:44所示的CDR2，SEQ ID NO:68所示的CDR3；
(10)SEQ ID NO:37所示的CDR1，SEQ ID NO:52所示的CDR2，SEQ ID NO:62所示的CDR3；
(11)SEQ ID NO:41所示的CDR1，SEQ ID NO:48所示的CDR2，SEQ ID NO:65所示的CDR3；
(12)SEQ ID NO:32所示的CDR1，SEQ ID NO:57所示的CDR2，SEQ ID NO:70所示的CDR3；
(13)SEQ ID NO:40所示的CDR1，SEQ ID NO:55所示的CDR2，SEQ ID NO:66所示的CDR3；
(14)SEQ ID NO:42所示的CDR1，SEQ ID NO:49所示的CDR2，SEQ ID NO:63所示的CDR3；
(15)SEQ ID NO:38所示的CDR1，SEQ ID NO:45所示的CDR2，SEQ ID NO:64所示的CDR3。
以上CDR序列(1)-(15)依次与SEQ ID NO.1-15对应。
上述所有序列，可以替换为与该序列具有“至少80％同源性”的序列或仅一个或少数几个氨基酸替换的序列；优选为“至少85％同源性”，更优选为“至少90％同源性”，更优选为“至少95％同源性”，最优选为“至少98％同源性”。
优选地，针对HER2的单域抗体，所述单域抗体分别如SEQ ID NO.1-15所示。所述单域抗体的编码序列分别如SEQ ID NO.16-30所示。
所述的单域抗体的序列还包括框架区FR；所述框架区FR包括FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列；框架区FR的氨基酸序列分别为：
SEQ ID NO:73-81任意一条所示的FR1；SEQ ID NO:82-94任意一条所示的FR2；SEQID NO:95-108任意一条所示的FR3；SEQ ID NO:109-111任意一条所示的FR4。
所述的单域抗体为VHH，其仅包含抗体重链，不包含抗体轻链。
本发明的又一个目的是提供一种核苷酸分子，该核苷酸分子编码所述的针对HER2的单域抗体，其核苷酸序列如SEQ ID NO：16-30(依次与编号为1A2、1B10、1D4、1G3、2B5、2H7、3E6、3E9、3F1、3G8、4A4、4B9、4C8、4E10、4H10的单域抗体一一对应)中的任意一条所示。
本发明还提供一种表达载体，其包含所述核苷酸分子。
本发明还涉及一种宿主细胞，其可以表达出所述的针对HER2的单域抗体，或其包含所述的表达载体。
本发明还提供针对HER2的单域抗体的Fc融合抗体。
本发明还提供针对HER2的单域抗体在制备针对人乳腺腺癌细胞诱导ADCC的生物制品或制备针对人乳腺导管癌细胞进行内化的生物制品中的应用。这里的生物制品均指针对HER2的单域抗体，其可作为药物使用。
本发明提供与针对HER2的单域抗体在制备HER2蛋白特异性结合的生物制品中的应用。生物制品即针对HER2的单域抗体。
本发明的又一个目的是提供针对HER2的单域抗体在制备抑制人HER2基因表达的药物或抗肿瘤药物中的应用。肿瘤指乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌，尤其是HER2过表达的乳腺癌。
本发明的针对HER2的单域抗体，可作用于目的细胞(例如人乳腺腺癌细胞SK-BR-3、人乳腺导管癌细胞BT-474)，且与HER2蛋白的亲和力强。
本发明使用生物基因工程技术筛选出特异性针对HER2的单域抗体，这些抗体初步亲和力明显，并且具有阻断特定细胞释放细胞因子，通过原核表达即具有良好的结合活性，具有一定的成药性，这些单域抗体具有以下优势：
这些单域抗体的表达体系选择灵活，既可以再原核系统中表达也可以在酵母细胞或哺乳动物细胞的真核系统中表达，且其在原核表达系统中的表达成本低，可降低后期生产成本。
由于单域抗体为单结构域抗体，所以其抗体的多组合形式改造更为简单，通过基因工程的方式简单的串联即可以获得多价、多特异性的抗体，并且其免疫异质性很低，在不经过人源化改造的情况下也不会产生较强的免疫反应。
正如多篇文献报道的那样，单域抗体的亲和力范围更为宽泛，在未进行亲和力成熟之前，其亲和力范围可以从nM级别至pM级别，为后期不同用途的抗体提供多个选择。
本发明的单域抗体能够与HER2高亲和力结合，能介导ADCC且发生内化，并具有较好成药性，本发明的单域抗体为抗HER2重链单域抗体。
附图说明
图1人源重组HER2蛋白SDS-PAGE分析图；
图2 VHH序列插入率分析图，这里的VHH1-30是从构建的针对HER2单域抗体文库中随机挑取的不同克隆的PCR产物；
图3靶向HER2淘选的文库富集情况；
图4 HER2靶点部分原核表达抗体SDS-PAGE；
图5 HER2蛋白的特异性单域抗体的结合量效曲线；
图6 Herceptin与HER2蛋白的结合量效曲线；
图7靶向HER2的纳米抗体ADCC效应检测；
图8 Herceptin的ADCC效应检测；
图9靶向HER2的纳米抗体内化效应检测；
图10靶向HER2的纳米抗体的亲和力数据；
图11靶向HER2的纳米抗体部分克隆的亲和力检测拟合曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
针对HER2的单域抗体
单域抗体(sdAb，也被研发者Ablynx称为纳米抗体或VHH)是本领域技术人员公知的。单域抗体为其互补决定区是单域多肽的一部分的抗体。因此，单域抗体包含单个互补决定区(单个CDR1、单个CDR2和单个CDR3)。单域抗体的实例为仅有重链的抗体(该抗体天然不包含轻链)、衍生自常规抗体的单域抗体和工程化抗体。
单域抗体可以衍生自任何物种，包括小鼠、人、骆驼、美洲驼、山羊、兔和牛。例如，天然存在的VHH分子可以衍生自骆驼科物种(例如骆驼、单峰骆驼、美洲驼和原驼)提供的抗体。像完整的抗体一样，单域抗体能够选择性地结合特定抗原。单域抗体可以仅含有免疫球蛋白链的可变结构域，该结构域具有CDR1、CDR2和CDR3以及框架区。
值得一提的是，本发明中，与本发明公开的CDR1-3的序列同源性高的序列，也可以得到针对HER2的纳米抗体。在一些实施例中，与(1)-(15)中的序列具有“至少80％同源性”的序列，或者“至少85％同源性”、“至少90％同源性”、“至少95％同源性”、“至少98％同源性”的序列都可以实现发明目的(即衍生蛋白)。
在一些实施例中，与(1)-(15)中的序列相比仅仅替换一个或少数几个氨基酸的序列，例如，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代，也可以实现发明目的。实际上，在确定两个氨基酸序列之间的序列同一性程度或在确定单域抗体中的CDR1、CDR2和CDR3组合时，技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，在取代情况下，所述取代将优选为保守氨基酸取代，所述保守氨基酸，其通常可以被描述为氨基酸残基被具有相似化学结构的另一个氨基酸残基替代的氨基酸取代，并且该取代对多肽的功能、活性或其它生物学性质几乎没有或基本上没有影响。所述保守氨基酸取代在本领域是通用的，例如保守氨基酸取代是以下(a)-(d)组内的一个或少数几个氨基酸被同一组内另一个或少数几个氨基酸所取代：(a)极性带负电残基及其不带电酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln；(b)极性带正电残基：His、Arg、Lys；(c)芳香族残基：Phe、Trp、Tyr；(d)脂肪族非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Gly、Pro、Met、Leu、Ile、Val、Cys。特别优选的保守氨基酸取代如下：Asp被Glu取代；Asn被Gln或His取代；Glu被Asp取代；Gln被Asn取代；His被Asn或Gln取代；Arg被Lys取代；Lys被Arg、Gln取代；Phe被Met、Leu、Tyr取代；Trp被Tyr取代；Tyr被Phe、Trp取代；Ala被Gly或Ser取代；Ser被Thr取代；Thr被Ser取代；Gly被Ala或Pro取代；Met被Leu、Tyr或Ile取代；Leu被Ile或Val取代；Ile被Leu或Val取代；Val被Ile或Leu取代；Cys被Ser取代。另外，本领域技术人员知晓，单域抗体的创造性体现在CDR1-3区，而框架区序列FR1-4并非是不可改变的，FR1-4的序列可以采取本发明公开的序列的保守序列变体。
本发明是通过基因工程技术制备目标蛋白以及目标蛋白的截短体形式，然后将获得的抗原蛋白免疫内蒙古阿拉善双峰驼，通过多次免疫后，获得骆驼的外周血淋巴细胞或者脾细胞，通过基因工程的方式，将驼源抗体可变区编码序列重组到噬菌体展示载体中，通过噬菌体展示技术筛选出针对抗原蛋白的特异性抗体，并进一步检测其与抗原结合的能力以及在包括自身免疫疾病治疗中的应用。
现将上述技术方案拆分详解，以具体实施例的方式描述：
实施例1：人源HER2重组胞外结构域蛋白的制备：
本发明中用到的人源HER2重组胞外结构域蛋白为公司自己表达纯化获得，人源重组HER2蛋白的表达载体设计方案具体如下：
(1)在NCBI中检索获得HER2的编码序列，其收录号为NM_004448.3，该序列编码产生的氨基酸序列登录号为NP_004439.2。
(2)分别通过TMHMM和SMART网站对NP_004439.2对应的氨基酸序列进行蛋白跨膜区和胞外端的分析。
(3)分析结果显示HER2蛋白的胞外端为23-652位氨基酸。
(4)利用基因合成的方式将编码HER2蛋白的1-650位氨基酸的核苷酸序列克隆到载体pcDNA3.4中。
(5)将构建好的载体进行Sanger测序，比对原始序列，确认无误后，将该重组质粒进行批量抽提，去除内毒素，转染悬浮293F进行目的蛋白的表达、纯化，纯化后HER2重组蛋白的SDS-PAGE结果如图1所示。
实施例2：针对HER2蛋白的单域抗体文库的构建：
(1)将200μg实施例1中纯化获得的HER2重组蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合，免疫一只内蒙古阿拉善双峰驼，每周免疫一次，共连续免疫7次，除首次免疫外，其余六次均是用1mg HER2重组蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混合进行动物免疫，该免疫过程是为了集中刺激骆驼使其产生针对HER2的抗体。
(2)动物免疫结束后，抽取骆驼外周血淋巴细胞100mL并提取细胞的RNA；
(3)利用提取的总RNA合成cDNA，并通过套式PCR反应以cDNA为模板扩增VHH(重链抗体可变区)；
(4)利用限制性内切酶分别酶切pMECS载体和VHH片段，然后将酶切后的片段和载体链接；
(5)将连接后的片段点转化至感受态细胞TG1中，构建HER2蛋白的噬菌体展示文库并测定库容，文库的库容大小约为1×109，文库插入率检测结果如图2所示。
实施例3：针对HER2蛋白的单域抗体筛选：
(1)取200μL重组TG1细胞至2×TY培养基中培养，期间加入40μL辅助噬菌体VCSM13侵染TG1细胞，并培养过夜以扩增噬菌体，次日利用PEG/NaCl沉淀噬菌体，离心收集扩增噬菌体；
(2)将稀释在100mM pH 8.3的NaHCO3中的HER2蛋白500μg偶联在酶标板上，4℃放置过夜，同时设立阴性对照孔；
(3)第二天加入200μL的3％的脱脂乳，室温封闭2h；
(4)封闭结束后，加入100μL扩增后噬菌体文库(大约2×1011个噬菌体颗粒)，室温作用1h；
(5)作用1小时后，用PBS+0.05％Tween-20洗5遍，以洗掉未结合的噬菌体；
(6)用终浓度为2.5mg/mL的胰蛋白酶将与HER2蛋白特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数生长期的大肠杆菌TG1细胞，37℃培养1h，产生并收集噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复1轮，逐步得到富集，当富集倍数达到10倍以上时，富集效果如图3所示。
实施例4：用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选针对HER2的特异性阳性克隆:
(1)根据上述单域抗体筛选方法对HER2蛋白进行3轮筛选，筛选结束后，针对重组HER2蛋白的噬菌体富集因子达到10以上，从筛选获得的阳性克隆中挑选400个单菌落分别接种于含100μg/mL氨苄青霉素的TB培养基的96深孔板中，并设置空白对照，37℃培养至对数期后，加入终浓度为1mM的IPTG，28℃培养过夜；
(2)利用渗透涨破法获得粗提抗体；将HER2重组蛋白分别释至100mM pH 8.3的NaHCO3中并将100μg蛋白在酶标板中4℃包被过夜；
(3)将上述步骤中获得的抗体粗提液取100μL转移至加入抗原的ELISA板上，室温孵育1h；
(4)用PBST洗去未结合的抗体，加入100μl经1:2000稀释后的Mouse anti-HAtagantibody(鼠抗HA抗体，Thermo Fisher)，在室温孵育1h；
(5)用PBST洗去未结合的抗体，加入100ul经1:20000稀释后的Anti-Rabbit HRPconjugate(山羊抗兔辣根过氧化物酶标记抗体，购自于Thermo Fisher)，在室温孵育1h；
(6)用PBST洗去未结合的抗体，加入辣根过氧化物酶显色液，37℃下反应15min后，加入中止液，于酶标仪上450nm波长处，读取吸收值；
(7)当样品孔OD值大于对照孔5倍以上时，判定为阳性克隆孔；
(8)将阳性克隆孔的菌转摇在含有100μg/μL氨苄青霉素的LB培养基中以便提取质粒并进行测序；
(9)根据序列比对软件Vector NTI分析各个克隆株的基因序列，把CDR1，CDR2，CDR3序列相同的株视为同一克隆株，而序列不同的株视为不同克隆株，最终获得特异性针对HER2蛋白的单域抗体(SEQ ID NO.1-15，以及未示出序列的单域抗体1E12、2A1、4F7)。其抗体的氨基酸序列为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4结构，构成整个VHH。获得的单域抗体重组质粒可以在原核系统中进行表达，最终获得单域抗体蛋白。
其中SEQ ID NO.1-15如表1所示。
15种单域抗体序列的CDR1-3的序列分别如表2-4所示，15种单域抗体的FR1-4序列分别如表5-8所示。
Figure BDA0003199387670000071
Figure BDA0003199387670000081
表1 15个单域抗体的序列
Figure BDA0003199387670000082
Figure BDA0003199387670000091
表2 CDR1序列
Figure BDA0003199387670000092
表3 CDR2序列
Figure BDA0003199387670000093
表4 CDR3序列
Figure BDA0003199387670000094
Figure BDA0003199387670000101
表5 FR1序列
Figure BDA0003199387670000102
表6 FR2序列
Figure BDA0003199387670000103
Figure BDA0003199387670000111
表7 FR3序列
Figure BDA0003199387670000112
表8 FR4序列
实施例5：HER2蛋白的特异性单域抗体在宿主菌大肠杆菌中的纯化及表达
(1)将上述测序分析所获得不同克隆株的质粒(pMECS-VHH)电转化到大肠杆菌HB2151中，并将其涂布在LB+amp+glucose即含有氨苄青霉素和葡萄糖的培养平板上，37℃培养过夜；
(2)挑选单个菌落接种在5mL含有岸边青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜；
(3)接种1mL的过夜培养菌种至330mL TB培养液中，37℃摇床培养，培养到OD600nm值达到0.6-0.9时，加入1M IPTG，28℃摇床培养过夜；
(4)离心，收集大肠杆菌，利用渗透胀破法，获得抗体粗提液；
(5)通过镍柱亲和层析法纯化出抗体，纯化后的单域抗体，部分克隆表达结果如图4所示。图4中VHH1-18分别对应3E6、4A4、1D4、4H10、1B10、1G3、2B5、2H7、3F1、4B9、4E10、3E9、4C8、1A2、3G8、1E12、2A1、4F7，其中1E12、2A1、4F7的序列未示出，其为技术效果不够好的单域抗体。
实施例6：HER2蛋白的特异性单域抗体的Fc融合抗体真核表达载体的构建
(1)将实施例4中获得的目标序列亚克隆至真核表达载体中：将实施例4中筛选出来的抗体经Sanger测序得到其核苷酸序列；
(2)通过序列合成的方式将密码子优化后的上述核苷酸序列(SEQ ID NO.16-30，以及1E12、2A1、4F7的核苷酸序列)分别合成至本公司设计改造的载体RJK-V4-hFC中，该载体的改造方法如实施例10所述；
(3)将公司构建好的重组真核表达载体转化至DH5α大肠杆菌中，培养进行质粒大提，去除内毒素；
(4)将大提后的质粒再进行序列测序鉴定；
(5)将确定无误后的重组载体准备后续真核细胞转染表达。
实施例7：HER2蛋白的特异性单域抗体的Fc融合抗体在悬浮ExpiCHO-S细胞中表达
(1)转染前3天以2.5×105/mL细胞传代和扩大培养ExpiCHO-STM细胞，计算出的所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的120mL(终体积)的ExpiCHOTM表达培养基的500mL摇瓶中；使细胞浓度达到约4×106-6×106活细胞/mL；
(2)在转染前一天，将ExpiCHO-STM细胞稀释浓度至3.5×106活细胞/mL，使细胞过夜培养；
(3)转染当天，测定细胞密度和活细胞百分比。转染之前细胞密度应达到约7×106-10×106活细胞/mL；
(4)用预热至37℃新鲜的ExpiCHOTM表达培养基将细胞稀释至6×106个活细胞/mL。计算出的所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的100mL(终体积)的ExpiCHOTM表达培养基的500mL摇瓶中；
(5)使轻轻颠倒混匀ExpiFectamineTMCHO试剂，用3.7mL OptiPROTM培养基稀释ExpiFectamineTMCHO试剂，回荡或混匀；
(6)用冷藏的4mL OptiPROTM培养基稀释质粒DNA，回荡混匀；所述的质粒DNA为实施例6制得的HER2蛋白的特异性单域抗体的Fc融合抗体真核表达载体；
(7)将ExpiFectamine CHO/质粒DNA复合物室温孵育1-5分钟，然后轻轻加入制备的细胞悬液中，加入过程中轻轻回荡摇瓶；
(8)将细胞在37℃、8％CO2、加湿的空气中震荡培养；
(9)转染后第1天(18-22小时后)添加600ul ExpiFectamineTMCHO Enhancer和24mLExpiCHO feed。
(10)在转染后约8天(细胞活率低于70％)收集上清。
实施例8：HER2蛋白的特异性单域抗体的Fc融合抗体在悬浮293F细胞中的表达
重组单域抗体表达实验流程(以500mL摇瓶为例)：
(1)转染前3天以2.5×105/mL细胞传代和扩大培养293F细胞，计算出的所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的120mL(终体积)的OPM-293CD05 Medium培养基的500mL摇瓶中。使细胞浓度达到约2×106-3×106活细胞/mL。
(2)转染当天，测定细胞密度和活细胞百分比。转染之前细胞密度应达到约2×106-3×106活细胞/mL。
(3)用预热的OPM-293CD05 Medium将细胞稀释至1×106个活细胞/mL。计算出所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的100mL(终体积)的培养基的500mL摇瓶中。
(4)用4mL Opti-MEM培养基稀释PEI(1mg/mL)试剂，回荡或吹打混匀；用4mL Opt-MEM培养基稀释质粒DNA，回荡混匀，并用0.22um的滤头过滤。室温孵育5min。
(5)将稀释的PEI试剂加入稀释的DNA中，颠倒混匀。将PEI/质粒DNA复合物室温孵育15-20分钟，然后轻轻加入制备的细胞悬液中，加入过程中轻轻回荡摇瓶。
(6)将细胞在37℃、5％CO2、120rpm震荡培养。
(7)转染后第24h、72h添加5mL OPM-CHO PFF05补料。
(8)在转染后约7天(细胞活率低于70％)收集上清。
实施例9：人源Fc重组单域抗体的纯化
(1)将实施例7或8中获得的蛋白表达上清用0.45μm的一次性滤头过滤除掉不可溶杂质；
(2)将上述滤液使用蛋白纯化仪进行亲和层析纯化，利用人源Fc与Protein A结合的能力，使用偶联Protein A的琼脂糖填料进行纯化；
(3)将滤液通过1mL/分钟的流速流穿Protein A预装柱，该步骤中滤液中的目标蛋白会与填料结合；
(4)通过低盐和高盐缓冲液将柱上结合的杂质蛋白洗涤；
(5)用低pH缓冲液将柱上结合的目标蛋白进行系统；
(6)将洗脱液迅速加入pH9.0的Tris-HCl溶液，进行中和；
(7)将上述中和后的蛋白溶液透析后，进行SDS-PAGE分析，确定蛋白纯度在95％以上，且浓度在0.5mg/mL以上后，低温保存备用。
实施例10：纳米抗体真核表达载体RJK-V4-hFc的构建
所提及纳米抗体通用的目标载体RJK-V4-hFC，为本公司在invitrogen商业化载体pCDNA3.4(载体资料链接：https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_4_topo_ta_cloning_kit_man.pdf)的基础上融合了人源IgG的重链编码序列(NCBIAccession No.:AB776838.1)中的Fc区段后改造而来的，即该载体包含了IgG重链的铰链区(Hinge)CH2和CH3区。具体改造方案如下：
(1)选取pcDNA3.4上的限制性酶切位点XbaI和AgeI；
(2)在Fc片段编码序列的5’端和3’端通过重叠PCR的方式分别引入多克隆位点(MCS，Multiple Cloning Site)和6×His标签；
(3)使用分别带有XbaI和AgeI酶切位点的一对引物通过PCR的方式将上述片段扩增；
(4)使用限制性内切酶XbaI和AgeI分别酶切pcDNA3.4和(3)中的重组DNA片段；
(5)将酶切后的载体和插入片段在T4连接酶的作用下连接，然后将连接产物转化至大肠杆菌，扩增，测序核实，获得重组质粒。
实施例11：HER2蛋白的特异性单域抗体的结合量效曲线测定
(1)包被50μL 1μg/mL HER2，4℃过夜。
(2)洗板；加入200μL5％牛奶，37℃封闭1h。
(3)将VHH(实施例5中经原核表达制得的HER2蛋白的特异性单域抗体)稀释至2ug/mL，然后5倍梯度稀释抗体共8个浓度梯度。
(4)洗板；加入50μL经步骤(3)稀释的抗体，两复孔，37℃孵育1h。
(5)洗板；加入50μL鼠抗HA标签HRP二抗，37℃孵育30min。
(6)洗板(多洗几次)；加入50μL预先恢复常温的TMB，避光常温反应15min。
(7)加入50μL终止液(1N HCl)，酶标仪读数保存。
(8)绘制曲线，计算EC50，如图5和表9所示。
表9单域抗体的EC50
RT80-3E6 RT80-4A4 RT80-1D4 RT80-4H10 RT80-1B10 RT80-1G3
EC50 3.385 5.598 2.524 3.068 15.55 7.757
RT80-2B5 RT80-2H7 RT80-3F1 RT80-4B9 RT80-4E10 RT80-3E9
EC50 1.761 2.81 3.339 5.527 4.913 7.461
RT80-4C8 RT80-1A2 RT80-3G8 RT80-1E12 RT80-2A1 RT80-4F7
EC50 3.698 9.113 7.073 5.519 3.616 7.818
以上分别示出了单域抗体3E6、4A4、1D4、4H10、1B10、1G3、2B5、2H7、3F1、4B9、4E10、3E9、4C8、1A2、3G8、1E12、2A1、4F7的EC50值。
实施例12：靶向人源HER2的工具抗体(Tool antibody，Tab)的表达和纯化
Tab1(trastuzumab)序列来自IMGT。
(1)将搜索到的序列委托通用生物系统(安徽)有限公司进行哺乳动物细胞表达系统密码子优化，并克隆至pcDNA3.1载体。
(2)经过抗性筛选，选择质粒阳性菌扩增，使用质粒中提试剂盒(Macherey Nagel，Cat#740412.50)抽提质粒。
(3)按照每100mL细胞加入100μg质粒(40μg重链+60μg轻链)，使用PEI在293F细胞(培养基：FreeStyle 293 Expression medium，Thermo，Cat#12338026+F-68，Thermo，Cat#24040032)中瞬转表达；
(4)转染6～24h后加入5％体积的10％Peptone(Sigma，Cat#P0521-100G)，8％CO2130rpm培养约7～8天；
(5)细胞活率降至50％时收取表达上清，使用ProteinA(GE，Cat#17-5438-02)重力柱纯化；
(6)PBS透析后，使用Nanodrop测定浓度，SEC鉴定纯度，间接ELISA验证结合能力；
(7)通过本方法获得的Tab(即Herceptin抗体)，浓度不小于2mg/ml，纯度大于94％，与HER2(Novoprotein，Cat#CP69)结合EC50约为0.056nM，如图6所示。
实施例13：人特异性针对HER2的单域抗体以及工具抗体诱导的ADCC作用：
(1)将复苏后传代3-4代的SK-BR-3细胞收集后按10000个每孔铺入96孔板；
(2)将Herceptin、hIgG和单域抗体样品配置最高浓度为10μg/mL的溶液，并进行10倍梯度稀释，最终得到7个浓度；hIgG指同型对照，不与任何靶标结合的免疫球蛋白分子，通过商品化购买得到，以下同。这里的单域抗体为实施例8制得的HER2蛋白的特异性单域抗体的Fc融合抗体经实施例9纯化而得。Herceptin由实施例12制得，以下同。
(3)将梯度稀释好的上述抗体溶液按细胞悬液的等体积加入细胞培养孔；
(4)对于样品孔和E/T孔(抗体浓度为0)，收集PBMC细胞，按每孔250000个细胞，两倍于靶细胞悬液体积加入细胞培养孔；对于MAX孔，每孔加入两倍于靶细胞悬液体积的裂解液；对于MIN孔，每孔加入两倍于靶细胞悬液体积的试验缓冲液；
(5)孵育6h后，用LDH试剂盒检测细胞杀伤，读取吸光度；
(6)按照公式靶细胞杀伤率％＝(样品-E/T)/(MAX-MIN)
根据靶细胞杀伤率和浓度，进行四参数拟合，计算各抗体介导的ADCC作用的EC50浓度，结果如图7、8所示。
表10各单域抗体介导的ADCC作用的EC50浓度
3E6-hFc 4A4-hFc 1D4-hFc 4H10-hFc 1B10-hFc hIgG
EC50 0.1867 0.04196 ～0.1137 0.06643 0.01232 ～0.1026
4E10-hFc 3E9-hFc 4C8-hFc 1A2-hFc 3G8-hFc hIgG
EC50 ～0.01262 ～0.1106 ～0.7895 0.002477 0.01775 ～0.1044
1G3-hFc 2B5-hFc 2H7-hFc 3F1-hFc 4B9-hFc hIgG
EC50 ～0.01091 0.02620 0.005188 0.1102 ～0.01555 ～0.1044
实施例14：特异性针对HER2的单域抗体在BT-474细胞上的内化作用
(1)将复苏后传代3-4代的BT-474细胞用PBS洗后用Hoechst染色，再按500000个每孔铺入96孔板；
(2)将Phrodo标记的Herceptin、hIgG和单域抗体配制为10μg/mL的溶液；这里的单域抗体为实施例5中经原核表达制得的HER2蛋白的特异性单域抗体；
(3)将BT-474细胞悬液离心后用上述配制好的抗体溶液重悬，设置冰上组和37℃组，在各自温度下孵育24h；
(4)将上步骤中的混合液进行10倍稀释后用高内涵进行拍照分析；
(5)用高内涵仪器的图像分析软件计算每种抗体视野下的荧光强度；
(6)根据荧光强度分析结果，计算37℃样品/冰上样品，比值越大，内化程度越高，结果如图9所示。
实施例15：靶向HER2的单域抗体的亲和力测定
SD缓冲液配制：取适量HER2蛋白(实施例1制得)和吐温20以1×PBS(pH7.4)溶解，使得HER2蛋白和吐温20质量(或体积)分数分别为0.1％和0.02％；将HER2结合分子用SD缓冲液配制成10μg/mL的浓度；HER2结合分子包括Herceptin和单域抗体，其中单域抗体为实施例8制得的HER2蛋白的特异性单域抗体的Fc融合抗体经实施例9纯化而得。
抗原工作液配制：抗原先以SD缓冲液配制成200nM，再按2倍梯度稀释，共设置5个浓度梯度，除此之外再设置一个SD缓冲液的空白对照；
再生液的配制：取适量浓度为0.1M的甘氨酸储备液，用去离子水稀释10倍，混匀，获得再生液；
实验步骤：开启Octet 96及其配套电脑中Data Acquisiton软件，用擦镜纸取适量75％的乙醇清洁采集探头的底面和侧面，仪器预热15min以上；Sensor预湿：Sensor在实验开始前置于SD缓冲液中浸泡10分钟以上，待用，然后设定机器程序按照：基线→抗体→基线→结合抗原→解离抗原→再生传感器的步骤进行实验操作，实验结果如图10、11所示。可见，本发明所制备的针对HER2的单域抗体对HER2抗原的亲和力较佳。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
序列表
<110> 南京融捷康生物科技有限公司
<120> 针对HER2的单域抗体及其衍生蛋白和应用
<130> GY-21-03-01
<141> 2021-08-06
<160> 111
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ser Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Gly Trp Tyr Cys Met Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ser Ile Gly Gly
35 40 45
Ser Ser Ile Thr Lys Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ala Leu
65 70 75 80
Lys Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Pro Glu Tyr
85 90 95
Asp Cys Asp Ser Leu Arg Glu Ala Gly Trp Arg Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr Ala Met Ser Trp Val
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Asn Trp
35 40 45
Ser Gly Ser Asn Thr Asp Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Leu Ile Ser
65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Lys
85 90 95
Gly Ala Asp Leu Thr Arg Pro Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 3
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Ser Asp Met Gly Trp Tyr
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Asn Glu Cys Glu Leu Val Ser Thr Ile Ser Ser
35 40 45
Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
65 70 75 80
Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Asp Asp Arg Phe Gln
85 90 95
Tyr Glu Leu Gly Thr Cys Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Arg Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala
20 25 30
Lys Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val Ala Ser Ser Asp Val Arg Phe Gly
35 40 45
Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Phe Ser Gln
50 55 60
Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro
65 70 75 80
Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Arg Val Tyr Cys Ser
85 90 95
Ser Asn Tyr Arg Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Gly Thr Phe Ala Cys Met Ala Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Arg Glu Gly Val Ala Ser Ile Cys Ser
35 40 45
Val Gly Ser Thr Thr Leu Ala Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
50 55 60
Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Ala Leu Tyr Leu Gln Met
65 70 75 80
Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly
85 90 95
Ser Arg Ser Trp Tyr Thr Arg Tyr Asp Glu Arg Arg Tyr Thr Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 6
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gly Phe Ser Asn Ser Asp Met Asn Trp Val
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Asn Thr Asn Ser
35 40 45
Gly Asp Ser Arg Gln Tyr Tyr Ala Asp Ala Val Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
65 70 75 80
Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Pro Gly Thr Leu
85 90 95
Asp Leu Ala Lys Leu Tyr Thr Ser Asn Leu Pro Arg Gly Pro Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 7
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Ile Tyr Thr Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro
20 25 30
Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala Ile Asp Ile Asp Gly Val Thr
35 40 45
Thr Tyr Ala Asp Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn
50 55 60
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
65 70 75 80
Thr Gly Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Asn Gly Asn Arg Leu Ile Asn
85 90 95
Pro Leu Arg Gly Thr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ser Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Gly Trp Tyr Cys Met Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ser Ile Gly Phe
35 40 45
Ser Ser Ile Thr Lys Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser Arg Asp Ile Asp Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Ala Leu
65 70 75 80
Lys Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Pro Glu Ser
85 90 95
Asp Cys Asp Ser Leu Arg Glu Ala Gly Trp Arg Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Asp Tyr Ala Met Thr Trp Val
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Leu Asp Leu Val Ser Val Ile Ala Pro
35 40 45
Asp Gly Ser Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Ser Gly Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Leu Asn Ser Leu
65 70 75 80
Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Lys Pro Lys Gly Ser
85 90 95
Arg Tyr Ile Asp Tyr Ile Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 10
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Glu Ser Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Gly Trp Tyr Cys Met Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ser Ile Gly Gly
35 40 45
Thr Ser Thr Arg Lys Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ala Leu
65 70 75 80
Lys Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Pro Glu Tyr
85 90 95
Asp Cys Gly Ser Leu Arg Glu Ala Gly Trp Arg Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 11
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ser Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Val Ser Arg Arg Phe Met Ala Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ser Ile Asp Ser
35 40 45
Asp Gly His Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser Gln Asp Asp Gly Lys Arg Gln Glu Gln Thr Leu Tyr Leu Gln Met
65 70 75 80
Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Thr
85 90 95
Ala Asn Tyr Arg Arg Val Tyr Tyr Pro Leu Ser Lys Asp Trp Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 12
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gly Phe Ser Arg Ser Asp Met Asn Trp Val
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Asn Thr Asn Ser
35 40 45
Gly Asp Ser Arg Gln Tyr Tyr Ala Asp Ala Val Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Pro Gly Thr Leu
85 90 95
Thr Leu Ala Lys Met Tyr Thr Val Asn Leu Pro Arg Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 13
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Arg Ser Cys Ile Thr Gly Trp His
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ser Arg Met Gly Ser
35 40 45
Asp Val Thr Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
65 70 75 80
Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Tyr Cys Ser Pro
85 90 95
Arg Trp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 14
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Val Thr Tyr Tyr Ser Met Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Val Ile Asp Ser
35 40 45
Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
65 70 75 80
Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Pro Ser Asp
85 90 95
Tyr Thr Leu Thr Leu Thr Asp Arg Trp Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 15
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Asp Thr Phe Lys Cys Met Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Arg Glu Gly Val Ala Ser Ile Cys Ser
35 40 45
Ile Gly Ser Thr Thr Leu Ala Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
50 55 60
Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Ala Leu Tyr Leu Gln Met
65 70 75 80
Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Lys Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser
85 90 95
Gly Gln Ser Trp Tyr Thr Trp Asn Asp Glu Arg Arg Tyr Thr Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 16
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gagagcggcg gcggcagcgt gcagagcggc ggcagcctga gactgagctg tgccgccagc 60
ggctacaact tcggctggta ctgcatgggc tggttcagac aggcccccgg caaggagaga 120
gagggcgtgg ccagcatcgg cggcagcagc atcaccaagt acagcgacag cgtgaagggc 180
agattcacca tcagcagaga caacgccaag aacaccctgt acctgcagat gaacgccctg 240
aagcccgagg acgccgccac ctactactgc gctgccagac ccgagtacga ctgcgacagc 300
ctgagagagg ccggctggag atactggggc cagggcaccc aggtgaccgt gagcagc 357
<210> 17
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gagagcggcg gcggcctggt gcagcccggc ggcagcctga gactgagctg cgccgccagc 60
ggcttcatct tcagcaacta cgccatgagc tgggtgagac aggcccccgg caagggcctg 120
gagtgggtga gcagcatcaa ctggagcggc agcaacaccg actacgccga gagcgtgaag 180
ggcagattca ccatcagcag agacaacgcc aagaacaccc tgtacctgca gctgatcagc 240
ctgaagaccg aggacaccgc catgtactac tgcgccagag gctacaaggg cgccgacctg 300
accagacccg gccagggcac ccaggtgacc gtgagcagc 339
<210> 18
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gagagcggcg gcggcagcgt gcagaccggc ggcagcctga gactgagctg caccgccagc 60
ggcttcacct tcgacgacag cgacatgggc tggtacagac aggcccccgg caacgagtgc 120
gagctggtga gcaccatcag cagcgacggc agcacctact acgccgacag cgtgaagggc 180
agattcacca tcagccagga caacgccaag aacaccgtgt acctgcagat gaacagcctg 240
aagcccgagg acaccgccgt gtactactgc gccgacgaca gattccagta cgagctgggc 300
acctgcagca gcctggacta ctggggcaga ggcacccagg tgaccgtgag cagc 354
<210> 19
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gagagcggcg gcggcagcgt gcagaccggc ggcagcctga gactgagctg cgccgccagc 60
ggcagcatca gatgcatggg ctggttcaga caggccaagg gcaaggagag agaggccgtg 120
gccagcagcg acgtgagatt cggcagcacc tactacgccg acagcgtgga gggcagattc 180
accttcagcc aggacaacgc caagaacacc gtgtacctgc agatgaacag cctgaagccc 240
gaggacaccg ccatgtacta ctgcgccgcc ggcagagtgt actgcagcag caactacaga 300
gactacgact actggggcca gggcacccag gtgaccgtga gcagc 345
<210> 20
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gagagcggcg gcggcagcgt gcaggccggc agaagcctga gactgagctg cgccgccagc 60
ggctacagcg gcaccttcgc ctgcatggcc tggttcagac aggcccccgg caaggccaga 120
gagggcgtgg ccagcatctg cagcgtgggc agcaccaccc tggccagcta cgccgacagc 180
gtgaagggca gattcaccat cagccaggac aacgccaaga acgccctgta cctgcagatg 240
aacagcctgg agcccgagga caccgccatg tactactgcg ccgccggcag cagaagctgg 300
tacaccagat acgacgagag aagatacacc tactggggcc agggcaccca ggtgaccgtg 360
agcagc 366
<210> 21
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gagagcggcg gcggcctggt gcagcccggc ggcagcctga gactgagctg cgccgccagc 60
ggcttcggct tcagcaacag cgacatgaac tgggtgagac aggcccccgg caagggcctg 120
gagtgggtga gcaacaccaa cagcggcgac agcagacagt actacgccga cgccgtgaag 180
ggcagattca ccatcagcag agacaacgcc aagaacaccc tgtacctgca gatgaacagc 240
ctgagaaccg aggacaccgc cgtgtactac tgcgcccccg gcaccctgga cctggccaag 300
ctgtacacca gcaacctgcc cagaggcccc ggcacccagg tgaccgtgag cagc 354
<210> 22
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gagagcggcg gcggcagcgt gcaggccggc ggcagcctga gactgagctg cgccgccagc 60
atctacacct acatgggctg gttcagacag gcccccggca aggagagaga gggcgtggcc 120
gccatcgaca tcgacggcgt gaccacctac gccgacagcg ccaagggcag attcaccatc 180
agcaaggaca acgccaagaa caccctgtac ctgcagatga acagcctgaa gcccgaggac 240
accggcatgt actactgcgc cagagccaac ggcaacagac tgatcaaccc cctgagaggc 300
accgagtacg actactgggg ccagggcacc caggtgaccg tgagcagc 348
<210> 23
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gagagcggcg gcggcagcgt gcagagcggc ggcagcctga gactgagctg tgccgccagc 60
ggctacaact tcggctggta ctgcatgggc tggttcagac aggcccccgg caaggagaga 120
gagggcgtgg ccagcatcgg cttcagcagc atcaccaagt acagcgacag cgtgaagggc 180
agattcacca tcagcagaga catcgacaag aacaccctgt tcctgcagat gaacgccctg 240
aagcccgagg acgccgccac ctactactgc gctgccagac ccgagagcga ctgcgacagc 300
ctgagagagg ccggctggag atactggggc cagggcaccc aggtgaccgt gagcagc 357
<210> 24
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gagagcggcg gcggcagcgt gcagcccggc ggcagcctga gactgagctg cgccgccagc 60
ggcttcacct tcaaggacta cgccatgacc tgggtgagac aggcccccgg caaggagctg 120
gacctggtga gcgtgatcgc ccccgacggc agcaccgtgt acgccgacag cgtgagcggc 180
agattcacca tcagcagaga caacgccaag aacaccctgt acctgcagct gaacagcctg 240
aagagcgagg acaccgccat gtactactgc gccaagccca agggcagcag atacatcgac 300
tacatcagag gccagggcac ccaggtgacc gtgagcagc 339
<210> 25
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gagagcggcg gcggcagcgt ggagagcggt ggctccctga gactgagttg tgccgcgtct 60
ggctacaact tcggctggta ctgcatgggc tggttcagaa gagcccccgg caaggagaga 120
gagggcgtgg ccagcatcgg cggcaccagc accagaaagt acagcgacag cgtgaagggc 180
agattcacca tcagcagaga caacgccaag aacaccctgt acctgcagat gaacgccctg 240
aaacccgaag atgccgccac ctactactgc gccgcacgcc cggaatacga ctgcggcagc 300
ctgagagagg cgggctggag atactggggc cagggcaccc aggtgaccgt gagcagc 357
<210> 26
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gagagcggcg gcggcagcgt gcagagcggc ggcagcctga gactgagctg cgccgccagc 60
ggctacaccg tgagcagaag attcatggcc tggttcagac aggcccccgg caaggagaga 120
gagggcgtgg ccagcatcga cagcgacggc cacaccacct acgccgacag cgtgaagggc 180
agattcacca tcagccagga cgacggcaag agacaggagc agaccctgta cctgcagatg 240
aacagcctga agcccgagga caccgccatg tactactgcg ccgccaccgc caactacaga 300
agagtgtact accccctgag caaggactgg tacgactact ggggccaggg cacccaggtg 360
accgtgagca gc 372
<210> 27
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gagagcggcg gcggcctggt gcagcccggc ggcagcctga gactgagctg cgccgccagc 60
ggcttcggct tcagcagaag cgacatgaac tgggtgagac aggcccccgg caagggcctg 120
gagtgggtga gcaacaccaa cagcggcgac agcagacagt actacgccga cgccgtgaag 180
ggcagattca ccatcagcag agacaacgcc aagaacaccc tgtacctgca gatgaacagc 240
ctgaagaccg aggacaccgg cgtgtactac tgcgcccccg gcaccctgac cctggccaag 300
atgtacaccg tgaacctgcc cagaggccag ggcacccagg tgaccgtgag cagc 354
<210> 28
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gagagcggcg gcggcagcgt gcaggccggc ggcagcctga agctgagctg cgccgccagc 60
ggctacacct tcagaagctg catcaccggc tggcacagac aggcccccgg caaggagaga 120
gagctggtga gcagaatggg cagcgacgtg accacctact acaccgacag cgtgaagggc 180
agattcacca tcagccagga caacgccaag aacaccctgt acctgcagat gaacagcctg 240
aagaccgagg acaccgccgt gtactactgc gccgcctact gcagccccag atggtactgg 300
ggccagggca cccaggtgac cgtgagcagc 330
<210> 29
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gagagcggcg gcggcctggt gcagcccggc ggcagcctga gactgagctg tgccgccagc 60
ggctacaccg tgacctacta cagcatgggc tggttcagac aggcccccgg caaggagaga 120
gagggcgtgg ccgtgatcga cagcgacggc agcaccagct acgtggacag cgtgaagggc 180
agattcacca tcagcaagga caacgccaag aacaccctgt acctgcagat gaacagcctg 240
aagcccgagg acaccgccat gtactactgc gctgccagac ccagcgacta caccctgacc 300
ctgaccgaca gatggtacaa ctactggggc cagggcaccc aggtgaccgt gagcagc 357
<210> 30
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gagagcggcg gcggcagcgt gcaggccggc agaagcctga gactgagctg tgcggcctca 60
ggatacagtg acaccttcaa gtgcatgggc tggttcagac aggcccccgg caaggccaga 120
gagggcgtgg ccagcatctg cagcatcggc agcaccaccc tggccagcta cgccgacagc 180
gtgaagggca gattcaccat cagccaggac aacgccaaga acgccctgta cctgcagatg 240
aacagcctgg agcccgagga caccgccaag tactactgcg ccgcctcagg tcaatcctgg 300
tacacctgga acgacgagag aagatacacc tactggggcc agggcaccca ggtgaccgtg 360
agcagc 366
<210> 31
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Gly Phe Gly Phe Ser Asn Ser Asp
1 5
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Gly Phe Gly Phe Ser Arg Ser Asp
1 5
<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr Ala
1 5
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Gly Phe Thr Phe Asp Asp Ser Asp
1 5
<210> 35
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Gly Phe Thr Phe Lys Asp Tyr Ala
1 5
<210> 36
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Gly Ser Ile Arg Cys
1 5
<210> 37
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
Gly Tyr Asn Phe Gly Trp Tyr Cys
1 5
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
Gly Tyr Ser Asp Thr Phe Lys Cys
1 5
<210> 39
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
Gly Tyr Ser Gly Thr Phe Ala Cys
1 5
<210> 40
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
Gly Tyr Thr Phe Arg Ser Cys Ile
1 5
<210> 41
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
Gly Tyr Thr Val Ser Arg Arg Phe
1 5
<210> 42
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
Gly Tyr Thr Val Thr Tyr Tyr Ser
1 5
<210> 43
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
Ile Tyr Thr Tyr
1
<210> 74
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
Ile Ala Pro Asp Gly Ser Thr
1 5
<210> 45
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
Ile Cys Ser Ile Gly Ser Thr Thr Leu Ala
1 5 10
<210> 46
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
Ile Cys Ser Val Gly Ser Thr Thr Leu Ala
1 5 10
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
Ile Asp Ile Asp Gly Val Thr
1 5
<210> 48
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
Ile Asp Ser Asp Gly His Thr
1 5
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
Ile Asp Ser Asp Gly Ser Thr
1 5
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
Ile Gly Phe Ser Ser Ile Thr
1 5
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
Ile Gly Gly Ser Ser Ile Thr
1 5
<210> 52
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
Ile Gly Gly Thr Ser Thr Arg
1 5
<210> 53
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
Ile Asn Trp Ser Gly Ser Asn Thr
1 5
<210> 54
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
Ile Ser Ser Asp Gly Ser Thr
1 5
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
Met Gly Ser Asp Val Thr Thr
1 5
<210> 56
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
Ser Asp Val Arg Phe Gly Ser Thr
1 5
<210> 57
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
Thr Asn Ser Gly Asp Ser Arg Gln
1 5
<210> 58
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
Ala Ala Gly Arg Val Tyr Cys Ser Ser Asn Tyr Arg Asp Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
Trp
<210> 59
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
Ala Ala Gly Ser Arg Ser Trp Tyr Thr Arg Tyr Asp Glu Arg Arg Tyr
1 5 10 15
Thr Tyr Trp
<210> 60
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
Ala Ala Arg Pro Glu Ser Asp Cys Asp Ser Leu Arg Glu Ala Gly Trp
1 5 10 15
Arg Tyr Trp
<210> 61
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
Ala Ala Arg Pro Glu Tyr Asp Cys Asp Ser Leu Arg Glu Ala Gly Trp
1 5 10 15
Arg Tyr Trp
<210> 62
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
Ala Ala Arg Pro Glu Tyr Asp Cys Gly Ser Leu Arg Glu Ala Gly Trp
1 5 10 15
Arg Tyr Trp
<210> 63
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
Ala Ala Arg Pro Ser Asp Tyr Thr Leu Thr Leu Thr Asp Arg Trp Tyr
1 5 10 15
Asn Tyr Trp
<210> 64
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
Ala Ala Ser Gly Gln Ser Trp Tyr Thr Trp Asn Asp Glu Arg Arg Tyr
1 5 10 15
Thr Tyr Trp
<210> 65
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
Ala Ala Thr Ala Asn Tyr Arg Arg Val Tyr Tyr Pro Leu Ser Lys Asp
1 5 10 15
Trp Tyr Asp Tyr Trp
20
<210> 66
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
Ala Ala Tyr Cys Ser Pro Arg Trp Tyr Trp
1 5 10
<210> 67
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
Ala Asp Asp Arg Phe Gln Tyr Glu Leu Gly Thr Cys Ser Ser Leu Asp
1 5 10 15
Tyr Trp
<210> 68
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
Ala Lys Pro Lys Gly Ser Arg Tyr Ile Asp Tyr Ile Arg
1 5 10
<210> 69
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
Ala Pro Gly Thr Leu Asp Leu Ala Lys Leu Tyr Thr Ser Asn Leu Pro
1 5 10 15
Arg
<210> 70
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
Ala Pro Gly Thr Leu Thr Leu Ala Lys Met Tyr Thr Val Asn Leu Pro
1 5 10 15
Arg
<210> 71
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
Ala Arg Ala Asn Gly Asn Arg Leu Ile Asn Pro Leu Arg Gly Thr Glu
1 5 10 15
Tyr Asp Tyr Trp
20
<210> 72
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
Ala Arg Gly Tyr Lys Gly Ala Asp Leu Thr Arg Pro
1 5 10
<210> 73
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser
20
<210> 74
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Glu Ser Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser
20
<210> 75
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser
20
<210> 76
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser
20
<210> 77
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser
20
<210> 78
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser
20
<210> 79
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ser Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser
20
<210> 80
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser
20
<210> 81
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Thr Ala Ser
20
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Arg Glu Gly Val Ala
1 5 10 15
Ser
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<211> 17
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala
1 5 10 15
Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Lys Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val Ala
1 5 10 15
Ser
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Arg Glu Gly Val Ala
1 5 10 15
Ser
<210> 86
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala
1 5 10 15
Ala
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala
1 5 10 15
Ser
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala
1 5 10 15
Val
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala
1 5 10 15
Ser
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Asn Glu Cys Glu Leu Val Ser
1 5 10 15
Thr
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10 15
Asn
<210> 92
<211> 17
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10 15
Ser
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<211> 17
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Leu Asp Leu Val Ser
1 5 10 15
Val
<210> 94
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
Thr Gly Trp His Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ser
1 5 10 15
Arg
<210> 95
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
Asp Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Leu Ile Ser Leu Lys Thr Glu Asp
20 25 30
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35
<210> 96
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
Lys Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile
1 5 10 15
Asp Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Ala Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 97
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
Lys Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ala Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 98
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Ala Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Lys Tyr Tyr Cys
35
<210> 99
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Ala Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 100
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
Ser Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 101
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
Thr Tyr Ala Asp Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Gly Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 102
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asp
1 5 10 15
Gly Lys Arg Gln Glu Gln Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys
20 25 30
Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35 40
<210> 103
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
Val Tyr Ala Asp Ser Val Ser Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 104
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
Tyr Tyr Ala Asp Ala Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp
20 25 30
Thr Gly Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 105
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
Tyr Tyr Ala Asp Ala Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 106
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Phe Ser Gln Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 107
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 108
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 109
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
Gly Pro Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 110
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 111
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
Gly Arg Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10

Claims (9)

1.针对HER2的单域抗体，其特征在于，所述的单域抗体的序列包括互补决定区CDR；所述互补决定区CDR包括CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；
所述的单域抗体的互补决定区CDR的序列为下述（1）-（3）中的一种：
（1）SEQ ID NO:37所示的CDR1，SEQ ID NO:51所示的CDR2，SEQ ID NO:61所示的CDR3；
（2）SEQ ID NO:31所示的CDR1，SEQ ID NO:57所示的CDR2，SEQ ID NO:69所示的CDR3；
（3）SEQ ID NO:37所示的CDR1，SEQ ID NO:50所示的CDR2，SEQ ID NO:60所示的CDR3。
2.针对HER2的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8所示。
3.根据权利要求2所述的针对HER2的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体的编码序列如SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.21或SEQ ID NO.23所示。
4.一种核苷酸分子，其特征在于，该核苷酸分子编码权利要求1-3任意一项所述的针对HER2的单域抗体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.21或SEQ ID NO.23所示。
5.一种表达载体，其特征在于，其包含权利要求4所述核苷酸分子。
6.一种宿主细胞，其特征在于，其可以表达出权利要求1-3任意一项所述的针对HER2的单域抗体，或其包含权利要求5所述的表达载体。
7.权利要求1-3任意一项所述的针对HER2的单域抗体的Fc融合抗体。
8.权利要求1-3任意一项所述的针对HER2的单域抗体在制备与HER2蛋白特异性结合的生物制品、制备针对人乳腺腺癌细胞诱导ADCC的生物制品或制备针对人乳腺导管癌细胞进行内化的生物制品中的应用。
9.权利要求1-3任意一项所述的针对HER2的单域抗体在制备抑制HER2基因表达的药物或抗肿瘤药物中的应用。
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