CN116262786A

CN116262786A - 针对folr1的单域抗体及其衍生蛋白和应用

Info

Publication number: CN116262786A
Application number: CN202111515561.1A
Authority: CN
Inventors: 苏志鹏; 王乐飞; 张云; 孟巾果; 谢维
Original assignee: Nanjing Rongjiekang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Nanjing Rongjiekang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-12-13
Filing date: 2021-12-13
Publication date: 2023-06-16

Abstract

本发明属于免疫学领域，涉及针对FOLR1的单域抗体及其衍生蛋白和应用。所述的单域抗体由重链构成，重链包括重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3；所述的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列为（1）‑（7）的序列组合或与其同源性高的序列。本发明使用生物基因工程技术筛选出特异性针对FOLR1单域抗体，这些抗体初步亲和力明显，并且具有阻断特定细胞释放细胞因子，通过原核表达即具有良好的结合活性，具有一定的成药性。

Description

针对FOLR1的单域抗体及其衍生蛋白和应用

技术领域

本发明属于免疫学领域，涉及针对FOLR1的单域抗体及其衍生蛋白和应用。

背景技术

OLR是人叶酸受体蛋白家族成员之一，包括FOLR1、FOLR2、FOLR3三种亚型。其中FOLR1(Folate Binding Proteinl)是糖基化磷脂酰基醇偶联的糖蛋白，相对分子质量38～40kD，由FOLR1基因编码，完全暴露于细胞外膜，可通过细胞吞饮转移机制介导叶酸进入细胞内，参与DNA复制和损伤修复，对细胞分裂、增殖和组织生长有非常重要的作用。

近年来，许多文献报道FOLR1在正常组织表达较低，但在许多肿瘤细胞如卵巢癌、乳腺癌、肾癌、结肠癌、肺癌、睾丸癌、室鼓膜瘤和脉络膜瘤等存在过度表达，所以FOLR1可作为上述恶性肿瘤的诊断指标。研究发现FOLR1可从肿瘤脱落的游离受体通过自身孔道进入血液系统，提示血清FOLR1可成为早期肿瘤标志物。

近年来FOLR1在卵巢恶性肿瘤方面的研究是一个热点，卵巢恶性肿瘤的死亡率在全部女性恶性肿瘤中高居第四位并有逐渐上升的趋势，而上皮性卵巢癌(EOC)占卵巢恶性肿瘤的85-90％，是妇科癌症死亡的首要原因。由于早期筛查效果欠佳，因此预防和早期诊断难度大。目前一线治疗方式包括手术和化疗，但是往往因转移、手术残留灶、化疗耐药等原因，EOC的五年生存率始终难以提高，因此发展新的治疗方法和策略对EOC患者具有重要意义。而有研究表示，对于EOC，血清FOLR1可能是一个高度特异性的诊断标志物，并且有望成为上皮性卵巢癌诊断、靶向治疗及化疗疗效监测的一个参考指标。

CA125是最广泛使用的卵巢癌血清肿瘤标志物，FDA批准其用于监测化疗效果和对盆腔包块患者的鉴别诊断。但血清CA125水平升高常与其他病理情况有关，如子宫内膜异位症、子宫腺肌症、子宫肌瘤、盆腔炎性疾病、卵巢良性肿瘤等，且在早期卵巢癌患者中仅有一半血清CA125升高。因此，CA125对早期卵巢癌敏感性较差，对卵巢癌总体特异性较差。由于这些原因，CA125既没有作为卵巢癌的筛查的生物标志物，也没有作为早期诊断卵巢癌的生物标志物块患者中区分上皮性卵巢癌患者的检验效能优于CA125。研究者根据不同研究方法对卵巢恶性肿瘤患者的标本，均提出FOLR1可作为诊断早期卵巢恶性肿瘤标志物的观点。目前已有的研究结果表明FOLR1与卵巢恶性肿瘤患者临床关系紧密。目前，一些FOLR1靶向治疗药物正在进行临床试验，这可能对化疗疗效监测有用。

为了提高卵巢恶性肿瘤诊断的灵敏度，有人研究了EOC患者血清高迁移率族蛋白A2(HMGA2)、白细胞介素-22(IL-22)、叶酸受体1(FOLR1)水平与临床指标的相关性，研究结果表明，血清HMGA2、IL-22、FOLR1联合诊断具有更好的灵敏度(95％)、特异度(96.7％)。另外，对FOLR1与MSLN在EOC发病中相互作用以及联合检测两者来判断EOC患者的预后进行探索，结果发现，FOLR1高表达的EOC患者预后好，MSLN高表达的患者预后差。两种蛋白可能共同参与了EOC的进程，联合检测FOLR1和MSLN两种蛋白的表达，有助于EOC的预后判断，为卵巢癌的诊断、治疗和预后判断提供了新的思路。

紫杉醇是一种从短叶红豆杉中提取的具有体外抗肿瘤活性的药物，是一种抗微管解聚的细胞毒类药物。年经批准紫杉醇作为治疗卵巢癌的新药应用于临床。目前，大量研究证实紫杉醇可将肿瘤细胞阻滞于G2/M期。而此阶段肿瘤细胞对放疗敏感，可以到放疗增敏的作用。因此,紫杉醇应用于鼻咽癌的同期放化疗也越来越广泛，并已取得了理想疗效。但是，紫杉醇也和其它化疗药物一样长期使用将会导致肿瘤细胞耐药，从而导致化疗失败。有研究证明靶向FOLR1的脱氧核酶DRzE能明显增加鼻咽癌紫杉醇耐药细胞对紫杉醇的敏感性。在另一方面，最近的一项研究表明，FOLR1的高表达增加了卵巢癌细胞对顺铂治疗的敏感性，这有可能与改善患者预后相关。基于目前的TCGA大样本分析，结合最新报道的机制研究(FOLR1增加顺铂敏感性)，研究者认为FOLR1高表达是卵巢的有利预后因素，原因可能在于:FOLR1高表达的患者，化疗敏感性增加，从而预后得到改善。

近年来肿瘤免疫治疗的发展突飞猛进，PD-1(programmed death-1)、PD-L1(programmed death-ligan1)、CTLA-4(cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4)抗体的市场化应用，CAR-T技术在血液系统肿瘤取得巨大成功(如白血病中的CD19-CAR)。2017年被称为CAR-T元年，美国FDA批准了两款用于急性淋巴细胞白血病和淋巴瘤的CAR-T疗法，临床应用中的高缓解率加上商业化的推广使得过继细胞治疗(adoptive celltransfer therapy，ACT)备受瞩目。CAR-T疗法的最主要特点是直接赋予了T细胞靶向识别功能，是临床应用中“活的药物”。

国内已有人研究靶向叶酸受体α和间皮素串联型CAR-T的构建及其在上皮性卵巢癌的应用，他们构建了人源化的FOLR1-CAR慢病毒质粒，包含两个共刺激分子(CD28/4-1BB)和IL-12基因，包装慢病毒并感染CD3细胞。结果筛选并验证了其在EOC中高表达的TAA，成功构建了靶向FOLR1的第四代CAR-T，相较于单靶点CAR-T，它在体外的杀伤效能更强，能分泌高水平的细胞因子，B-NDG小鼠荷瘤模型表明FOLR1-CAR在体内仍有抗肿瘤能力。

目前全球CAR-T临床注册试验获批500多项，虽然CAR-T在实体瘤取得一定疗效，但完全缓解率(complete response,CR)和部分缓解(partial response,PR)仍较低，使得其大规模临床应用受限，其副作用细胞因子释放综合征给病人带来的伤害也不可小觑。

纳米抗体，基于骆驼重链抗体的VHH单域抗体的特殊结构，兼具了传统抗体与小分子药物的优势，几乎完美克服了传统抗体的开发周期长，稳定性较低，保存条件苛刻等缺陷。单域抗体(single domain antibody，sdAb)是指包含了抗体中单个可变域的片段，是抗体分子的最小抗原结合单元，大约12～15kD。虽然小但和完整的抗体相同，它可以选择性地和特定抗原结合。此外，它还有传统抗体所没有的优势，如改进的筛选，改进的分离技术，以及不需要动物牺牲。由于其分子量小，可穿透血脑屏障，在生物医药的开发方面有着天然的优势，这或许可以成为治疗卵巢癌等恶性肿瘤的最佳药物。本领域仍需要能够FOLR1高亲和力结合，能介导ADCC或发生内化，并具有较好成药性的抗FOLR1抗体，特别是抗FOLR1重链单域抗体。

发明内容

为了克服上述缺陷，本发明的目的是提供针对FOLR1的单域抗体及其衍生蛋白和应用，使用生物基因工程技术筛选出特异性针对FOLR1单域抗体，这些抗体初步亲和力明显，并且具有阻断特定细胞释放细胞因子，通过原核表达即具有良好的结合活性，具有一定的成药性。

本发明的第一方面，提供了针对FOLR1的单域抗体，所述的单域抗体由重链构成，重链包括重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3；

所述的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列为下述(1)-(7)的一种：

(1)SEQ ID NO:16所示的CDR1，SEQ ID NO:22所示的CDR2，SEQ ID NO:32所示的CDR3；

(2)SEQ ID NO:15所示的CDR1，SEQ ID NO:24所示的CDR2，SEQ ID NO:29所示的CDR3；

(3)SEQ ID NO:19所示的CDR1，SEQ ID NO:27所示的CDR2，SEQ ID NO:34所示的CDR3；

(4)SEQ ID NO:20所示的CDR1，SEQ ID NO:25所示的CDR2，SEQ ID NO:33所示的CDR3；

(5)SEQ ID NO:18所示的CDR1，SEQ ID NO:28所示的CDR2，SEQ ID NO:34所示的CDR3；

(6)SEQ ID NO:17所示的CDR1，SEQ ID NO:23所示的CDR2，SEQ ID NO:31所示的CDR3；

(7)SEQ ID NO:21所示的CDR1，SEQ ID NO:26所示的CDR2，SEQ ID NO:30所示的CDR3。

即，所述的重链包括互补决定区CDR；所述互补决定区CDR包括重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。以上CDR序列(1)-(7)依次与SEQ ID NO.1-7对应。上述所有序列，可以替换为与该序列具有“至少80％同源性”的序列或仅一个或少数几个氨基酸替换的序列；优选为“至少85％同源性”，更优选为“至少90％同源性”，更优选为“至少95％同源性”，最优选为“至少98％同源性”。

在优选实施例中，所述的单域抗体的序列还包括框架区FR；所述框架区FR包括FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列；

所述的单域抗体的框架区FR的序列为下述(a)-(g)中的一种；

(a)SEQ ID NO:36所示的FR1，SEQ ID NO:39所示的FR2，SEQ ID NO:49所示的FR3，SEQ ID NO:52所示的FR4，或其变体，所述变体在所述FR中包含至多3个氨基酸的替换；

(b)SEQ ID NO:36所示的FR1，SEQ ID NO:44所示的FR2，SEQ ID NO:51所示的FR3，SEQ ID NO:52所示的FR4，或其变体，所述变体在所述FR中包含至多3个氨基酸的替换；

(c)SEQ ID NO:36所示的FR1，SEQ ID NO:42所示的FR2，SEQ ID NO:48所示的FR3，SEQ ID NO:52所示的FR4，或其变体，所述变体在所述FR中包含至多3个氨基酸的替换；

(d)SEQ ID NO:36所示的FR1，SEQ ID NO:40所示的FR2，SEQ ID NO:50所示的FR3，SEQ ID NO:52所示的FR4，或其变体，所述变体在所述FR中包含至多3个氨基酸的替换；

(e)SEQ ID NO:38所示的FR1，SEQ ID NO:42所示的FR2，SEQ ID NO:47所示的FR3，SEQ ID NO:52所示的FR4，或其变体，所述变体在所述FR中包含至多3个氨基酸的替换；

(f)SEQ ID NO:35所示的FR1，SEQ ID NO:43所示的FR2，SEQ ID NO:45所示的FR3，SEQ ID NO:52所示的FR4，或其变体，所述变体在所述FR中包含至多3个氨基酸的替换；

(g)SEQ ID NO:37所示的FR1，SEQ ID NO:41所示的FR2，SEQ ID NO:46所示的FR3，SEQ ID NO:52所示的FR4，或其变体，所述变体在所述FR中包含至多3个氨基酸的替换。

在一个实施方案中，所述针对FOLR1的单域抗体与选自SEQ ID NO：1-7的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同源性，并且能够特异性结合FOLR1抗原。

在另一个优选实施例中，所述针对FOLR1的单域抗体与选自SEQ ID NO：1-7的氨基酸序列具有至少95％序列同源性，并且能够特异性结合FOLR1抗原。

本发明的第二方面是提供针对FOLR1的单域抗体，所述单域抗体分别如SEQ IDNO.1-7所示，或者所述单域抗体与SEQ ID NO.1-7的氨基酸序列具有至少95％序列同源性。

在一个实施方案中，编码所述针对FOLR1的单域抗体的核酸分子与选自SEQ IDNO：8-14的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同源性，并且其编码的针对FOLR1单域抗体能够特异性结合FOLR1抗原。

优选的，所述单域抗体的编码序列分别如SEQ ID NO.8-14所示，或者与SEQ IDNO.8-14具有至少95％序列同源性。

本发明的第三方面是提供前述的针对FOLR1的单域抗体的Fc融合抗体或人源化抗体。

本发明的第四个方面是提供编码前述的针对FOLR1单域抗体的核苷酸分子，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：8-14所示，或者与SEQ ID NO.8-14具有至少95％序列同源性。

本发明的第五个方面是提供一种表达载体，其包含编码前述的单域抗体或者前述的Fc融合抗体的核苷酸分子或者前述的核苷酸分子。

本发明的第六个方面是提供一种宿主细胞，其可以表达出前述的针对FOLR1的单域抗体，或其包含前述的表达载体。

本发明还提供一种产生针对FOLR1的单域抗体或其Fc融合抗体的方法，包括步骤：(a)在适合产生单域抗体或其Fc融合抗体的条件下，培养前述的宿主细胞，从而获得含所述针对FOLR1单域抗体或其Fc融合抗体的培养物；(b)从所述培养物中分离或回收所述的针对FOLR1单域抗体或其Fc融合抗体；以及(c)任选地，纯化和/或修饰步骤(b)中获得的针对FOLR1单域抗体或其Fc融合抗体。

本发明的第七个方面是提供一种药物组合物，所述药物组合物含有：(i)如前述的针对FOLR1的单域抗体、或前述的针对FOLR1的单域抗体的Fc融合抗体；以及(ii)一种或几种药学上可接受的赋型剂。

本发明还提供前述的针对FOLR1的单域抗体在制备抑制FOLR1基因表达的药物或抗肿瘤药物中的用途。抑制FOLR1基因表达的药物可适用于FOLR1基因高表达的任何病症。优选的，所述的肿瘤包括但不限于卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、宫颈癌。

本发明还提供针对FOLR1的单域抗体在制备介导细胞内化、ADCC或CDC作用的制剂中的应用。

本发明还提供前述的针对FOLR1的单域抗体、或前述的针对FOLR1的单域抗体的Fc融合抗体的用途，用于制备试剂、检测板或试剂盒；其中，所述试剂、检测板或试剂盒用于：检测样品中FOLR1蛋白的存在和/或含量。

所述的单域抗体为VHH，其仅包含抗体重链，不包含抗体轻链。

相对于现有技术，本发明使用生物基因工程技术筛选出特异性针对FOLR1的单域抗体，这些抗体初步亲和力明显，并且具有阻断特定细胞释放细胞因子，通过原核表达即具有良好的结合活性，具有一定的成药性，这些单域抗体具有以下优势：

(1)这些单域抗体的表达体系选择灵活，既可以在原核系统中表达也可以在酵母细胞或哺乳动物细胞的真核系统中表达，且其在原核表达系统中的表达成本低，可降低后期生产成本。

(2)由于单域抗体为单结构域抗体，所以其抗体的多组合形式改造更为简单，通过基因工程的方式简单的串联即可以获得多价、多特异性的抗体，并且其免疫异质性很低，在不经过人源化改造的情况下也不会产生较强的免疫反应。

(3)正如多篇文献报道的那样，单域抗体的亲和力范围更为宽泛，在未进行亲和力成熟之前，其亲和力范围可以从nM级别至pM级别，为后期不同用途的抗体提供多个选择。

附图说明

图1人源重组FOLR1蛋白SDS-PAGE分析图；

图2VHH序列插入率分析；

图3靶向FOLR1淘选的文库富集情况；

图4FOLR1靶点部分原核表达抗体SDS-PAGE；

图5FOLR1靶点部分真核表达抗体SDS-PAGE；

图6FOLR1靶点抗体抗原结合活性；

图7FOLR1靶点工具抗体抗原结合活性；

图8FOLR1靶点抗体种属交叉反应抗原结合活性；

图9FOLR1靶点抗体ADCC活性；

图10FOLR1靶点抗体CDC活性；

图11FOLR1靶点抗体内化活性。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

单域抗体(sdAb，也被研发者Ablynx称为纳米抗体或VHH)是本领域技术人员公知的。单域抗体为其互补决定区是单域多肽的一部分的抗体。因此，单域抗体包含单个互补决定区(单个CDR1、单个CDR2和单个CDR3)。单域抗体的实例为仅有重链的抗体(该抗体天然不包含轻链)、衍生自常规抗体的单域抗体和工程化抗体。

单域抗体可以衍生自任何物种，包括小鼠、人、骆驼、美洲驼、山羊、兔和牛。例如，天然存在的VHH分子可以衍生自骆驼科物种(例如骆驼、单峰骆驼、美洲驼和原驼)提供的抗体。像完整的抗体一样，单域抗体能够选择性地结合特定抗原。单域抗体可以仅含有免疫球蛋白链的可变结构域，该结构域具有CDR1、CDR2和CDR3以及框架区。

如本文所用，术语“序列同源性”表示两个(核苷酸或氨基酸)序列在比对中在相同位置处具有相同残基的程度，并且通常表示为百分数。优选地，同源性在被比较的序列的整体长度上确定。因此，具有完全相同序列的两个拷贝具有100％同源性。

本发明中，与本发明公开的CDR1-3的序列同源性高的序列，也可以得到针对FOLR1的纳米抗体。在一些实施例中，与(1)-(7)中的序列具有“至少80％同源性”的序列，或者“至少85％同源性”、“至少90％同源性”、“至少95％同源性”、“至少98％同源性”的序列都可以实现发明目的(即衍生蛋白)。

在一些实施例中，与(1)-(7)中的序列相比仅仅替换一个或少数几个氨基酸的序列，例如，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代，也可以实现发明目的。实际上，在确定两个氨基酸序列之间的序列同源性程度或在确定单域抗体中的CDR1、CDR2和CDR3组合时，技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，在取代情况下，所述取代将优选为保守氨基酸取代，所述保守氨基酸，其通常可以被描述为氨基酸残基被具有相似化学结构的另一个氨基酸残基替代的氨基酸取代，并且该取代对多肽的功能、活性或其它生物学性质几乎没有或基本上没有影响。所述保守氨基酸取代在本领域是通用的，例如保守氨基酸取代是以下(a)-(d)组内的一个或少数几个氨基酸被同一组内另一个或少数几个氨基酸所取代：(a)极性带负电残基及其不带电酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln；(b)极性带正电残基：His、Arg、Lys；(c)芳香族残基：Phe、Trp、Tyr；(d)脂肪族非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Gly、Pro、Met、Leu、Ile、Val、Cys。特别优选的保守氨基酸取代如下：Asp被Glu取代；Asn被Gln或His取代；Glu被Asp取代；Gln被Asn取代；His被Asn或Gln取代；Arg被Lys取代；Lys被Arg、Gln取代；Phe被Met、Leu、Tyr取代；Trp被Tyr取代；Tyr被Phe、Trp取代；Ala被Gly或Ser取代；Ser被Thr取代；Thr被Ser取代；Gly被Ala或Pro取代；Met被Leu、Tyr或Ile取代；Leu被Ile或Val取代；Ile被Leu或Val取代；Val被Ile或Leu取代；Cys被Ser取代。另外，本领域技术人员知晓，单域抗体的创造性体现在CDR1-3区，而框架区序列FR1-4并非是不可改变的，FR1-4的序列可以采取本发明公开的序列的保守序列变体。

本发明的优选宿主细胞为细菌细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。

本专利是通过基因工程技术制备目标蛋白以及目标蛋白的截短体形式，然后将获得的抗原蛋白免疫内蒙古阿拉善双峰驼，通过多次免疫后，获得骆驼的外周血淋巴细胞或者脾细胞，通过基因工程的方式，将驼源抗体可变区编码序列重组到噬菌体展示载体中，通过噬菌体展示技术筛选出针对抗原蛋白的特异性抗体，并进一步检测其与抗原结合的能力以及在包括自身免疫疾病治疗中的应用。

现将上述技术方案拆分详解，以具体实施例的方式描述：

实施例1：人源FOLR1重组胞外结构域蛋白的制备：

本专利中用到的人源重组胞外结构域蛋白为公司自己表达纯化获得，人源重组FOLR1蛋白的表达载体设计方案具体如下：

(1)在NCBI中检索获得FOLR1的编码序列，其收录号为NM_000802.3，该序列编码产生的氨基酸序列登录号为NP_000793.1，Uniprot ID为P15328。

(2)分别通过TMHMM和SMART网站对NP_000793.1对应的氨基酸序列进行蛋白跨膜区和胞外端的分析。

(3)分析结果显示FOLR1蛋白的胞外端为1-233位氨基酸，其中1-24位为该蛋白的信号肽。

(4)利用基因合成的方式将编码FOLR1蛋白的1-233位氨基酸的核苷酸序列克隆到载体pcDNA3.4中。

(5)将构建好的载体进行Sanger测序，比对原始序列，确认无误后，将该重组质粒进行批量抽提，去除内毒素，转染悬浮293F进行目的蛋白的表达、纯化，纯化后FOLR1重组蛋白的SDS-PAGE分析结果如图1所示，纯化后的蛋白纯度高达90％，满足动物免疫的需求。

实施例2：针对FOLR1蛋白的单域抗体文库的构建：

将1mg步骤1中纯化获得的人源重组FOLR1蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合，免疫一只内蒙古阿拉善双峰驼，每周免疫一次，共连续免疫7次，除首次免疫外，其余六次均是用1mg FOLR1蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混合进行动物免疫，该免疫过程是为了集中刺激骆驼使其产生针对FOLR1蛋白的抗体。

动物免疫结束后，抽取骆驼外周血淋巴细胞150mL，并提取细胞的RNA。利用提取的总RNA合成cDNA，并通过套式PCR反应以cDNA为模板扩增VHH(抗体重链可变区)。

然后利用限制性内切酶分别酶切pMECS载体和VHH片段，然后将酶切后的片段和载体链接。将连接后的片段电转化至感受态细胞TG1中，构建FOLR1蛋白的噬菌体展示文库并测定库容，文库的库容大小约为1×10⁹，同时，通过菌落PCR鉴定检测文库在目的片段的正确插入率，结果如图2所示。

结果显示，从文库中随机挑选的30个菌落进行PCR扩增后，有28个克隆可以扩增出大小为600bp(预测大小)的条带，有2个克隆扩增出条带不正确，故正确插入率为28÷30×100％≈86.6％。

实施例3：针对FOLR1蛋白的单域抗体筛选：

取200μL步骤2中的重组TG1细胞至2×TY培养基中培养，期间加入40μL辅助噬菌体VCSM13侵染TG1细胞，并培养过夜以扩增噬菌体，次日利用PEG/NaCl沉淀噬菌体，离心收集扩增噬菌体。

将稀释在100mM pH8.3的NaHCO₃中的FOLR1蛋白500μg偶联在酶标板上，4℃放置过夜，同时设立阴性对照孔；第二天加入200μL的3％的脱脂乳，室温封闭2h；封闭结束后，加入100μl扩增后噬菌体文库(大约2×10¹¹个噬菌体颗粒)，室温作用1h；作用1小时后，用PBS+0.05％Tween-20洗15遍，以洗掉未结合的噬菌体。

用终浓度为25mg/mL的胰蛋白酶将与FOLR1蛋白特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数生长期的大肠杆菌TG1细胞，37℃培养1h，产生并收集噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复1轮，逐步得到富集，当富集倍数达到10倍以上时，富集效果如图3所示。

图3中，P/N＝生物淘选中阳性孔洗脱下的噬菌体感染TG1细菌后生长的单克隆细菌数/阳性孔洗脱下的噬菌体感染TG1细菌后生长的单克隆细菌数，该参数在富集发生后会逐渐增大；I/E＝生物淘选中每轮加入阳性孔的噬菌体总量/生物淘选中每轮从阳性孔洗脱出的噬菌体总量，该参数在富集发生后会逐渐趋近于1。

实施例4：用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选针对FOLR1的特异性阳性克隆:

根据上述实施例3中的筛选方法对抗FOLR1蛋白的单域抗体进行3轮筛选，抗FOLR1蛋白的噬菌体富集因子达到10以上，筛选结束后，从筛选获得的阳性克隆中挑选384个单菌落分别接种于含100μg/mL氨苄青霉素的2×TY培养基的96深孔板中，并设置空白对照，37℃培养至对数期后，加入终浓度为1 mM的IPTG，28℃培养过夜。

利用渗透涨破法获得粗提抗体；将FOLR1重组蛋白分别释至100 mM pH8.3的NaHCO₃中并将100μg蛋白在酶标板(ELISA板)中4℃包被过夜。将获得的抗体粗提液取100uL转移至加入抗原的ELISA板上，室温孵育1h；用PBST洗去未结合的抗体，加入100μl经1:2000稀释后的Mouse Anti-HA tag Antibody(HRP)(鼠抗HA辣根过氧化物酶标记抗体，ThermoFisher)，在室温孵育1h；用PBST洗去未结合的抗体，加入辣根过氧化物酶显色液，37℃下反应15min后，加入终止液，于酶标仪上450nm波长处，读取吸收值。

当样品孔OD值大于对照孔5倍以上时，判定为阳性克隆孔；将阳性克隆孔的菌转摇在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中以便提取质粒并进行测序。

根据序列比对软件VectorNTI分析各个克隆株的基因序列，把CDR1，CDR2和CDR3序列相同的株视为同一克隆株，而序列不同的株视为不同克隆株，最终获得特异性针对FOLR1蛋白的单域抗体(分别为单域抗体1D11、2D8、2E5、3B3、3H11、4B10、4E11的SEQ ID NO.1-7，以及未示出序列的单域抗体1C9、1D4、1E5、1E9、2D11、2D9、2E3、2E7、3H9、4C8、4D10)。

其抗体的氨基酸序列为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4结构，构成整个VHH。获得的单域抗体重组质粒可以在原核系统中进行表达，最终获得单域抗体蛋白。

7种单域抗体的CDR序列、FR序列、氨基酸序列分别如表1、表2、表3所示。

表1 7种单域抗体的CDR序列

实际克隆编号	CDR1	SEQ ID	实际克隆编号	CDR2	SEQ ID
						2D8-hFC1	DYTYRRYC	SEQ ID NO:15	1D11-hFC1	ISSGGST	SEQ ID NO:22
1D11-hFC1	GDTYSSAC	SEQ ID NO:16	4B10-hFC1	ISWNGGST	SEQ ID NO:23
						4B10-hFC1	GFTFDDYA	SEQ ID NO:17	2D8-hFC1	IYLGDGTT	SEQ ID NO:24
3H11-hFC1	GHTYSRLS	SEQ ID NO:18	3B3-hFC1	IYTGESMT	SEQ ID NO:25
						2E5-hFC1	GYPYHRVS	SEQ ID NO:19	4E11-hFC1	IYTGGGST	SEQ ID NO:26
3B3-hFC1	GYTYRRLS	SEQ ID NO:20	2E5-hFC1	IYTGGLYTGGSMT	SEQ ID NO:27
						4E11-hFC1	GYTYSSNS	SEQ ID NO:21	3H11-hFC1	IYTGGPSGPMT	SEQ ID NO:28

表2 7种单域抗体的FR序列

实际克隆编号	FR3	SEQ ID
			4B10-hFC1	FYADSVKGRFTIVRDNAKNTVYLEMNSLKPEDTAMYYC	SEQ ID NO:45
4E11-hFC1	YYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYC	SEQ ID NO:46
			3H11-hFC1	YYADSVKGRFTISQDNAQRTVYLQMNSLKPEDTAMYYC	SEQ ID NO:47
2E5-hFC1	YYADSVKGRFTISQDNARNTVYLQMNSLKPEDTAMYYC	SEQ ID NO:48
			1D11-hFC1	YYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYC	SEQ ID NO:49
3B3-hFC1	YYADSVRGRFTISQDNAQNTVYLQMNSLKPEDTATYYC	SEQ ID NO:50
			2D8-hFC1	YYTDSVKGRFTISQENAKNTIYLQMNNLKPEDTAMYYC	SEQ ID NO:51

表3 7种单域抗体的氨基酸序列

实施例5：FOLR1蛋白的特异性单域抗体在宿主菌大肠杆菌中的纯化及表达

将实施例4中测序分析所获得不同克隆株的质粒(pMECS-VHH)电转化到大肠杆菌HB2151中，并将其涂布在LB+amp+glucose即含有氨苄青霉素和葡萄糖的培养平板上，37℃培养过夜；挑选单个菌落接种在5mL含有岸边青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜。

接种1mL的过夜培养菌种至330mLTB培养液中，37℃摇床培养，培养到OD600nm值达到0.6-0.9时，加入1M IPTG，28℃摇床培养过夜；离心，收集大肠杆菌，利用渗透涨破法，获得抗体粗提液；

通过镍柱亲和层析法纯化出抗体，纯化后的单域抗体，如图4所示，包括VHH1～18。图4中VHH1-18分别对应单域抗体1C9、1D11、1D4、3B3、1E5、1E9、2D11、2D8、2D9、2E3、2E5、2E7、3H9、4B10、3H11、4C8、4D10、4E11，其中1D11、2D8、2E5、3B3、3H11、4B10、4E11的序列分别如SEQ ID NO:1-7所示，其余单域抗体的序列未示出(为技术效果不够好或者无需在本发明申请中予以保护的单域抗体)。

实施例6：FOLR1蛋白的特异性单域抗体的Fc融合抗体真核表达载体的构建

(1)将实施例4中获得的目标序列亚克隆至真核表达载体中：将实施例4中筛选出来的抗体经Sanger测序得到其核苷酸序列；

(2)通过序列合成的方式将密码子优化后的上述核苷酸序列(SEQ ID NO.8-14)合成至本公司设计改造的载体RJK-V4-hFC中，该载体的改造方法如实施例10所述；

(3)将公司构建好的重组真核表达载体转化至DH5α大肠杆菌中，培养进行质粒大提，去除内毒素；

(4)将大提后的质粒再进行序列测序鉴定；

(5)将确定无误后的重组载体准备后续真核细胞转染表达，通过实施例7或8的方法将VHH的Fc蛋白表达后并通过实施例9的方法纯化上述抗体。

实施例7：FOLR1蛋白的特异性单域抗体的Fc融合抗体在悬浮ExpiCHO-S细胞中表达

(1)转染前3天以2.5×10⁵/mL细胞传代和扩大培养ExpiCHO-S^TM细胞，计算出的所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的120mL(终体积)的ExpiCHO^TM表达培养基的500mL摇瓶中；使细胞浓度达到约4×10⁶-6×10⁶活细胞/mL；

(2)在转染前一天，将ExpiCHO-S^TM细胞稀释浓度至3.5×10⁶活细胞/mL，使细胞过夜培养；

(3)转染当天，测定细胞密度和活细胞百分比。转染之前细胞密度应达到约7×10⁶-10×10⁶活细胞/mL；

(4)用预热至37℃新鲜的ExpiCHO^TM表达培养基将细胞稀释至6×10⁶个活细胞/mL。计算出的所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的100mL(终体积)的ExpiCHO^TM表达培养基的500mL摇瓶中；

(5)使轻轻颠倒混匀ExpiFectamine^TMCHO试剂，用3.7mL OptiPRO^TM培养基稀释ExpiFectamine^TMCHO试剂，回荡或混匀；

(6)用冷藏的4mL OptiPRO^TM培养基稀释质粒DNA，回荡混匀；所述的质粒DNA为实施例6制得的FOLR1蛋白的特异性单域抗体的Fc融合抗体真核表达载体；

(7)将ExpiFectamine CHO/质粒DNA复合物室温孵育1-5分钟，然后轻轻加入制备的细胞悬液中，加入过程中轻轻回荡摇瓶；

(8)将细胞在37℃、8％CO₂、加湿的空气中震荡培养；

(9)转染后第1天(18-22小时后)添加600ul ExpiFectamine^TMCHO Enhancer和24mLExpiCHO feed。

(10)在转染后约8天(细胞活率低于70％)收集上清。

实施例8：FOLR1蛋白的特异性单域抗体的Fc融合抗体在悬浮293F细胞中的表达

重组单域抗体表达实验流程(以500mL摇瓶为例)：

(1)转染前3天以2.5×10⁵/mL细胞传代和扩大培养293F细胞，计算出的所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的120mL(终体积)的OPM-293CD05 Medium培养基的500mL摇瓶中。使细胞浓度达到约2×10⁶-3×10⁶活细胞/mL。

(2)转染当天，测定细胞密度和活细胞百分比。转染之前细胞密度应达到约2×10⁶-3×10⁶活细胞/mL。

(3)用预热的OPM-293CD05 Medium将细胞稀释至1×10⁶个活细胞/mL。计算出所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的100mL(终体积)的培养基的500mL摇瓶中。

(4)用4mL Opti-MEM培养基稀释PEI(1mg/mL)试剂，回荡或吹打混匀；用4mL Opt-MEM培养基稀释质粒DNA，回荡混匀，并用0.22um的滤头过滤。室温孵育5min。

(5)将稀释的PEI试剂加入稀释的DNA中，颠倒混匀。将PEI/质粒DNA复合物室温孵育15-20分钟，然后轻轻加入制备的细胞悬液中，加入过程中轻轻回荡摇瓶。

(6)将细胞在37℃、5％CO₂、120rpm震荡培养。

(7)转染后第24h、72h添加5mL OPM-CHO PFF05补料。

(8)在转染后约7天(细胞活率低于70％)收集上清。

实施例9：人源Fc重组单域抗体的纯化

(1)将实施例7或8中获得蛋白表达上清用0.45μm的一次性滤头过滤除掉不可溶杂质；

(2)将上述滤液使用蛋白纯化仪进行亲和层析纯化，利用人源Fc与Protein A结合的能力，使用偶联Protein A的琼脂糖填料进行纯化；

(3)将滤液通过1mL/分钟的流速流穿Protein A预装柱，该步骤中滤液中的目标蛋白会与填料结合；

(4)通过低盐和高盐缓冲液将柱上结合的杂质蛋白洗涤；

(5)用低pH缓冲液将柱上结合的目标蛋白进行系统；

(6)将洗脱液迅速加入pH9.0的Tris-HCl溶液，进行中和；

(7)将上述中和后的蛋白溶液透析后，进行SDS-PAGE分析，如图5所示，图5中1-7分别指单域抗体1D11、2D8、2E5、3B3、3H11、4B10、4E11，确定蛋白纯度在95％以上，且浓度在0.5mg/mL以上后，低温保存备用。

实施例10：纳米抗体真核表达载体RJK-V4-hFc的构建

所提及纳米抗体通用的目标载体RJK-V4-hFC，为本公司在invitrogen商业化载体pCDNA3.4(载体资料链接：https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_4_topo_ta_cloning_kit_man.pdf)的基础上融合了人源IgG的重链编码序列(NCBIAccession No.:AB776838.1)中的Fc区段后改造而来的，即该载体包含了IgG重链的铰链区(Hinge)CH2和CH3区。具体改造方案如下：

(1)选取pcDNA3.4上的限制性酶切位点XbaI和AgeI；

(2)在Fc片段编码序列的5’端和3’端通过重叠PCR的方式分别引入多克隆位点(MCS，Multiple Cloning Site)和6×His标签；

(3)使用分别带有XbaI和AgeI酶切位点的一对引物通过PCR的方式将上述片段扩增；

(4)使用限制性内切酶XbaI和AgeI分别酶切pcDNA3.4和(3)中的重组DNA片段；

(5)将酶切后的载体和插入片段在T4连接酶的作用下连接，然后将连接产物转化至大肠杆菌，扩增，测序核实，获得重组质粒。

实施例11：针对FOLR1的单域抗体的人源化

人源化方法采用本公司自主开发的基于噬菌体展示技术的纳米抗体人源化平台完成。

人源化步骤为：

(1)分别建立人源抗体及驼源抗体重链可变区氨基酸序列数据库；

(2)综合比较人源抗体及驼源抗体FR区各氨基酸位点的差异性，并在各FR区的各不同氨基酸位点做氨基酸种类及比例的统计；

(3)根据各位点氨基酸的种类及比例差异，插入该序列的CDR区进行文库的合成或者计算机模拟同源建模；

(4)针对该序列的合成文库和同源建模数据进行筛选，挑选出人源化位点最多且亲和力和功能较优的克隆，即为最优人源化VHH。

实施例12：FOLR1蛋白的特异性单域抗体(原核)的结合量效曲线测定

(1)包被50μL 1μg/mL FOLR1，4℃过夜。

(2)洗板；加入200μL5％牛奶，37℃封闭1h。

(3)将VHH稀释至2μg/mL，然后5倍梯度稀释抗体共8个浓度梯度。这里的VHH即实施例5中经原核表达制得的FOLR1蛋白的特异性单域抗体。

(4)洗板；加入50μL经步骤(3)稀释的单域抗体，两复孔，37℃孵育1h。

(5)洗板；加入50μL鼠抗HA标签-HRP二抗，37℃孵育30min。

(6)洗板(多洗几次)；加入50μL预先恢复常温的TMB，避光常温反应15min。

(7)加入50μL终止液(1N HCl)，酶标仪读数保存。

(8)绘制曲线，计算EC50，如图6所示，可见本发明的针对FOLR1的单域抗体2D8、1D11、4B10、3H11、2E5、3B3、4E11对FOLR1蛋白的结合效力和特异性优异。

实施例13：靶向人源FOLR1的工具抗体(Tool antibody,Tab)的表达和纯化

Tab(farletuzumab，即法妥组单抗)序列来自IMGT。

将搜索到的序列委托通用生物系统(安徽)有限公司进行哺乳动物细胞表达系统密码子优化，并克隆至pcDNA3.1载体。

经过抗性筛选，选择质粒阳性菌扩增，使用质粒中提试剂盒(Macherey Nagel,Cat#740412.50)抽提质粒。

按照每100mL细胞加入100μg质粒(40μg重链+60μg轻链)，使用PEI在293F细胞(培养基：FreeStyle 293Expression medium,Thermo,Cat#12338026+F-68,Thermo,Cat#24040032)中瞬转表达；

转染6～24h后加入5％体积的10％Peptone(Sigma,Cat#P0521-100G)，8％CO2130rpm培养约7～8天；

细胞活率降至50％时收取表达上清，使用ProteinA(GE，Cat#17-5438-02)重力柱纯化；

PBS透析后，使用Nanodrop测定浓度，SEC鉴定纯度，间接ELISA验证结合能力；

通过本方法获得的Tab，浓度不小于2mg/ml，纯度大于94％，与FOLR1(ACRO，Cat#FO1-H52H1)结合EC50约为0.04-0.9nM，结果如图7所示。

实施例14：FOLR1蛋白的特异性单域抗体的种属交叉结合量效曲线测定

(1)分别包被50μL，1μg/mL人、食蟹猴、小鼠、大鼠、犬种FOLR1，4℃过夜。

(2)洗板；加入200μL5％牛奶，37℃封闭1h。

(3)将VHH-hFc稀释至2μg/mL，然后5倍梯度稀释抗体共8个浓度梯度。VHH-hFc由实施例8制得的FOLR1蛋白的特异性单域抗体的Fc融合抗体经实施例9纯化而得，包括单域抗体2D8、1D11、4B10、3H11、2E5、3B3、4E11。

(4)洗板；加入50μL经步骤(3)稀释的抗体，两复孔，37℃孵育1h。

(5)洗板；加入50μL羊抗人IgG-HRP二抗，37℃孵育30min。

(7)加入50μL终止液(1N HCl)，酶标仪读数保存。

(8)绘制曲线，计算EC50；其中hIgG指同型对照，不与任何靶标结合的免疫球蛋白分子，通过商品化购买得到；Tab由实施例13制得；结果如图8所示。可见本发明的针对FOLR1的单域抗体2D8、1D11、4B10、3H11、2E5、3B3、4E11对FOLR1蛋白的种属交叉结合效力优异。

实施例15：人特异性针对FOLR1的单域抗体以及工具抗体诱导的ADCC作用(抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用)：

将复苏后传代3-4代的OVCAR-3和SK-OV-3细胞收集后分别按20000个每孔铺入96孔板；

将Tab、hIgG和VHH-hFc样品配置最高浓度为10μg/mL的溶液，并进行10倍梯度稀释，最终得到7个浓度；VHH-hFc由实施例8制得的FOLR1蛋白的特异性单域抗体的Fc融合抗体经实施例9纯化而得，包括单域抗体2D8、1D11、4B10、3H11、2E5、3B3、4E11；Tab由实施例13制得；

将梯度稀释好的上述抗体溶液按细胞悬液的等体积加入细胞培养孔；

对于样品孔和E/T孔(抗体浓度为0)，收集Jurkat-NFAT-luc-FcγRIIIa细胞，按每孔20000个细胞加入细胞培养孔；

孵育6h后，用One-Glo试剂盒检测细胞杀伤，读取luminescence；

计算诱导倍数(Fold of Induction)＝(样品-BG)/(E/T-BG)

根据靶细胞杀伤率和浓度，进行四参数拟合，计算各抗体介导的ADCC作用的EC50浓度，结果如图9所示。可见本发明的7种单域抗体能介导ADCC作用。

实施例16：人特异性针对FOLR1的单域抗体以及工具抗体诱导的CDC(补体依赖的细胞毒性)作用：

CHO-K1-FOLR1是由慢病毒法构建的FOLR1高表达稳定细胞系。

将复苏后传代3-4代的CHO-K1-FOLR1细胞收集后按5000个每孔铺入96孔板；

将Tab、hIgG和VHH-hFc样品配置最高浓度为10μg/mL的溶液，并进行3倍梯度稀释，最终得到7个浓度；VHH-hFc由实施例8制得的FOLR1蛋白的特异性单域抗体的Fc融合抗体经实施例9纯化而得，包括单域抗体2D8、1D11、4B10、3H11、2E5、3B3、4E11；

将上述梯度稀释的抗体加入CHO-K1-FOLR1细胞中，孵育半小时；

将血清加入上述混合液，终浓度为10％；

孵育4小时后，用细胞活力检测试剂盒和多功能酶标仪检测细胞活力；

对抗体浓度和发光强度进行4参数拟合，建立量效曲线，结果如图10所示。可见本发明的7种单域抗体能介导CDC作用。

实施例17：特异性针对FOLR1的单域抗体在CHO-K1-FOLR1细胞上的内化作用

将复苏后传代3-4代的CHO-K1-FOLR1细胞用PBS洗后分别按500000个每孔铺入96孔板；

将Phrodo标记的Tab、hIgG和单域抗体配制为10μg/mL的溶液；这里的单域抗体由实施例8制得的FOLR1蛋白的特异性单域抗体的Fc融合抗体经实施例9纯化而得，包括单域抗体2D8、1D11、4B10、3H11、2E5、3B3、4E11；

将CHO-K1-FOLR1细胞悬液离心后用上述配制好的抗体溶液重悬，设置冰上组和37℃组，在各自温度下孵育4h；

将上步骤中的混合液用流式细胞仪读取荧光值；

根据荧光强度分析结果，计算37℃样品/冰上样品，比值越大，内化程度越高，结果如图11所示。可见，特异性针对FOLR1的单域抗体可实现CHO-K1-FOLR1细胞的内化。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

序列表

<110> 南京融捷康生物科技有限公司

<120> 针对FOLR1的单域抗体及其衍生蛋白和应用

<130> GY-03-2021-29

<141> 2021-12-13

<160> 52

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Thr Tyr Ser Ser Ala

20 25 30

Cys Met Asp Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Arg Arg Val Gly Arg Ile Pro Cys Arg Thr Met Leu Pro Gly Leu

100 105 110

Gln Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 2

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Tyr Thr Tyr Arg Arg Tyr

20 25 30

Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Lys Val

35 40 45

Ala Ala Ile Tyr Leu Gly Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Glu Asn Ala Lys Asn Thr Ile Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Arg Ser Gly Cys Ser Val Thr Trp Ser Tyr Ser Ala Phe

100 105 110

Glu Asp Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 3

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Tyr His Arg Val

20 25 30

Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Gly Ile Tyr Thr Gly Gly Leu Tyr Thr Gly Gly Ser Met Thr Tyr

50 55 60

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala

65 70 75 80

Arg Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Thr Pro Gln Phe Leu Ile Gly Ser Gly

100 105 110

Leu Leu Arg Pro Asp Lys Tyr Asn Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val

115 120 125

Thr Val Ser Ser

130

<210> 4

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Arg Arg Leu

20 25 30

Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val

35 40 45

Gly Gly Ile Tyr Thr Gly Glu Ser Met Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Gln Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Thr Pro Gln Phe Leu Ile Gly Ser Gly Leu Leu Arg Pro Asp

100 105 110

Lys Tyr Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 5

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly

1 5 10 15

Ser Pro Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly His Thr Tyr Ser Arg Leu

20 25 30

Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Gly Ile Tyr Thr Gly Gly Pro Ser Gly Pro Met Thr Tyr Tyr Ala

50 55 60

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Gln Arg

65 70 75 80

Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met

85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Ala Thr Pro Gln Phe Leu Ile Gly Ser Gly Leu Leu

100 105 110

Arg Pro Asp Lys Tyr Asn Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val

115 120 125

Ser Ser

130

<210> 6

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ser Cys Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Val Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Leu Ala Tyr Cys Ser Gly Gly His Trp Ser Pro Gly Asp Leu

100 105 110

Ser Gly Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 7

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Asn

20 25 30

Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Ala Ile Tyr Thr Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Gly Gly Pro Thr Trp Tyr Asp Gly Ser Trp Ser Arg Gly Asp

100 105 110

Glu Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 8

<211> 378

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

caagtgcaac tcgtggaatc cggcggcggg agcgtccaag ccggcggctc cctgagactg 60

agctgcgctg ctagcgggga cacctacagc agcgcctgca tggactggtt cagacaagcc 120

cctggcaagg agagagaggg cgtggccggc atcagcagcg gcggcagcac ctactacgcc 180

gacagcgtga agggcagatt caccatcagc agagacaacg ccaagaacac cctgtacctg 240

cagatgaaca gcctgaagcc cgaggacacc gccatgtact actgcgctgc ccggagagtg 300

ggcagaatcc cctgcagaac catgctgccc ggcctgcaag actactgggg ccaaggcacc 360

caagtgaccg tgagcagc 378

<210> 9

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caagtgcaac tggtcgagag cgggggcggg agcgtgcaag ccgggggcag cctgagactg 60

agctgcgccg ctagcgacta cacctacaga agatactgca tgggctggtt cagacaagcc 120

cccggcaagg agagagagaa ggtggccgcc atctacctgg gcgacggcac cacctactac 180

accgacagcg tgaagggcag attcaccatc agccaagaga acgccaagaa caccatctac 240

ctgcagatga acaacctgaa gcccgaggac accgccatgt actactgcgc cgccgacaga 300

agcggctgca gcgtgacctg gagctacagc gccttcgagg actggggcca aggcacccaa 360

gtgaccgtga gcagc 375

<210> 10

<211> 396

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

caagtgcaac tggtcgaaag cgggggcggc agcgtgcaag ctggggggtc cctcagactg 60

agctgcgccg ctagcggcta cccctaccac agagtgagca tgggctggtt cagacaagcc 120

cccggcaagg agagagaggg cgtggccggc atctacaccg gcggcctcta taccgggggc 180

agcatgacct actacgccga cagcgtgaag ggcagattca ccatcagcca agacaacgct 240

agaaacaccg tgtacctgca gatgaacagc ctgaagcccg aggacaccgc catgtactac 300

tgcgccgcca cccctcagtt cctgatcggc agcggcctgc tgagacccga caagtacaac 360

agctggggcc aaggcaccca agtgaccgtg agcagc 396

<210> 11

<211> 381

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

caagtgcagc tcgtggaaag cggcggcggg tccgtgcaag ccggggggag cctgagactg 60

agctgcgccg ctagcggcta cacctacaga agactgagca tgggctggtt cagacaagcc 120

cccggcaagg agagagaggc cgtgggcggc atctacaccg gcgagagcat gacctactac 180

gccgacagcg tgagaggcag attcaccatc agccaagaca acgctcagaa caccgtgtac 240

ctgcagatga acagcctgaa gcccgaggac accgccacct actactgcgc cgccacccct 300

cagttcctga tcggcagcgg cctgctgaga cccgacaagt acgacagctg gggccaaggc 360

acccaagtga ccgtgagcag c 381

<210> 12

<211> 390

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

caagtgcagc tggtggaatc cggcgggggc agcgtgcaaa ccggggggag ccctagactg 60

agctgcgccg tgagcggcca cacctacagc agactcagca tggggtggtt tcggcaagcc 120

cccggcaagg aaagagaggg cgtggccggc atctacaccg gcggccctag cggccccatg 180

acctactacg ccgacagcgt gaagggcaga ttcaccatca gccaagacaa cgctcagaga 240

accgtgtacc tgcagatgaa cagcctgaag cccgaggaca ccgccatgta ctactgcgcc 300

gccacccctc agttcctgat cggcagcggc ctgctgagac ccgacaagta caacagctgg 360

ggccaaggca cccaagtgac cgtgagcagc 390

<210> 13

<211> 381

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

caagtgcaac tcgtcgaatc cggcgggggc ctcgtccaag ctggggggtc cctgagactg 60

agctgcaccg ctagcggctt caccttcgac gactacgcca tgggctggtt cagacaagcc 120

cccggcaagg agagagaggg cgtgagctgc atcagctgga acggcggcag caccttctac 180

gccgacagcg tgaagggcag attcaccatc gtgagagaca acgccaagaa caccgtgtac 240

ctggagatga acagcctgaa gcccgaggac accgccatgt actattgcgc cgctctcgct 300

tactgtagcg gcgggcactg gagccccggg gatctcagcg gcggctactg gggccaaggc 360

acccaagtga ccgtgagcag c 381

<210> 14

<211> 381

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

caagtgcaac tggtggagag cggcggcggg agcgtccaag ctgggggcag cctgagactg 60

agctgcgccg tgagcggcta cacctacagc agcaacagca tggggtggtt cagacaagcc 120

cccggcaagg agagagaggg ggtcgccgct atctacaccg gcggcgggag cacctactac 180

gccgacagcg tgaagggcag attcaccatc agccaagaca acgccaagaa caccgtgtac 240

ctgcagatga acagcctgaa gcccgaggac accgccatgt actactgcgc cgccggcggc 300

cccacatggt acgacggcag ctggagcaga ggcgacgagt acacctactg gggccaaggc 360

acccaagtga ccgtgagcag c 381

<210> 15

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Asp Tyr Thr Tyr Arg Arg Tyr Cys

1 5

<210> 16

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Gly Asp Thr Tyr Ser Ser Ala Cys

1 5

<210> 17

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala

1 5

<210> 18

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Gly His Thr Tyr Ser Arg Leu Ser

1 5

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Gly Tyr Pro Tyr His Arg Val Ser

1 5

<210> 20

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Gly Tyr Thr Tyr Arg Arg Leu Ser

1 5

<210> 21

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Asn Ser

1 5

<210> 22

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr

1 5

<210> 23

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr

1 5

<210> 24

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

Ile Tyr Leu Gly Asp Gly Thr Thr

1 5

<210> 25

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

Ile Tyr Thr Gly Glu Ser Met Thr

1 5

<210> 26

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

Ile Tyr Thr Gly Gly Gly Ser Thr

1 5

<210> 27

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

Ile Tyr Thr Gly Gly Leu Tyr Thr Gly Gly Ser Met Thr

1 5 10

<210> 28

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

Ile Tyr Thr Gly Gly Pro Ser Gly Pro Met Thr

1 5 10

<210> 29

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

Ala Ala Asp Arg Ser Gly Cys Ser Val Thr Trp Ser Tyr Ser Ala Phe

1 5 10 15

Glu Asp

<210> 30

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

Ala Ala Gly Gly Pro Thr Trp Tyr Asp Gly Ser Trp Ser Arg Gly Asp

1 5 10 15

Glu Tyr Thr Tyr

20

<210> 31

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

Ala Ala Leu Ala Tyr Cys Ser Gly Gly His Trp Ser Pro Gly Asp Leu

1 5 10 15

Ser Gly Gly Tyr

20

<210> 32

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

Ala Ala Arg Arg Val Gly Arg Ile Pro Cys Arg Thr Met Leu Pro Gly

1 5 10 15

Leu Gln Asp Tyr

20

<210> 33

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

Ala Ala Thr Pro Gln Phe Leu Ile Gly Ser Gly Leu Leu Arg Pro Asp

1 5 10 15

Lys Tyr Asp Ser

20

<210> 34

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

Ala Ala Thr Pro Gln Phe Leu Ile Gly Ser Gly Leu Leu Arg Pro Asp

1 5 10 15

Lys Tyr Asn Ser

20

<210> 35

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser

20 25

<210> 36

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 37

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser

20 25

<210> 38

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly

1 5 10 15

Ser Pro Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser

20 25

<210> 39

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

Met Asp Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala

1 5 10 15

Gly

<210> 40

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly

<210> 41

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala

1 5 10 15

Ala

<210> 42

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala

1 5 10 15

Gly

<210> 43

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser

1 5 10 15

Cys

<210> 44

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Lys Val Ala

1 5 10 15

Ala

<210> 45

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Val Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

35

<210> 46

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

35

<210> 47

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn

1 5 10 15

Ala Gln Arg Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

35

<210> 48

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn

1 5 10 15

Ala Arg Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

35

<210> 49

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

35

<210> 50

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn

1 5 10 15

Ala Gln Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

35

<210> 51

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Glu Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

35

<210> 52

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

Claims

1.针对FOLR1的单域抗体，其特征在于：所述的单域抗体由重链构成，重链包括重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3；

所述的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列为下述（1）-（7）的一种：

（1）SEQ ID NO:16所示的CDR1，SEQ ID NO:22所示的CDR2，SEQ ID NO:32所示的CDR3；

（2）SEQ ID NO:15所示的CDR1，SEQ ID NO:24所示的CDR2，SEQ ID NO:29所示的CDR3；

（3）SEQ ID NO:19所示的CDR1，SEQ ID NO:27所示的CDR2，SEQ ID NO:34所示的CDR3；

（4）SEQ ID NO:20所示的CDR1，SEQ ID NO:25所示的CDR2，SEQ ID NO:33所示的CDR3；

（5）SEQ ID NO:18所示的CDR1，SEQ ID NO:28所示的CDR2，SEQ ID NO:34所示的CDR3；

（6）SEQ ID NO:17所示的CDR1，SEQ ID NO:23所示的CDR2，SEQ ID NO:31所示的CDR3；

（7）SEQ ID NO:21所示的CDR1，SEQ ID NO:26所示的CDR2，SEQ ID NO:30所示的CDR3。

2. 根据权利要求1所述的针对FOLR1的单域抗体，其特征在于：所述针对FOLR1的单域抗体与选自SEQ ID NO：1-7的氨基酸序列具有至少95％序列同源性，并且能够特异性结合FOLR1抗原。

3.根据权利要求1所述的针对FOLR1的单域抗体，其特征在于：所述的单域抗体的框架区FR的序列为下述（a）-（g）中的一种；

（a）SEQ ID NO:36所示的FR1，SEQ ID NO:39所示的FR2，SEQ ID NO:49所示的FR3，SEQID NO:52所示的FR4，或其变体，所述变体在所述FR中包含至多3个氨基酸的替换；

（b）SEQ ID NO:36所示的FR1，SEQ ID NO:44所示的FR2，SEQ ID NO:51所示的FR3，SEQID NO:52所示的FR4，或其变体，所述变体在所述FR中包含至多3个氨基酸的替换；

（c）SEQ ID NO:36所示的FR1，SEQ ID NO:42所示的FR2，SEQ ID NO:48所示的FR3，SEQID NO:52所示的FR4，或其变体，所述变体在所述FR中包含至多3个氨基酸的替换；

（d）SEQ ID NO:36所示的FR1，SEQ ID NO:40所示的FR2，SEQ ID NO:50所示的FR3，SEQID NO:52所示的FR4，或其变体，所述变体在所述FR中包含至多3个氨基酸的替换；

（e）SEQ ID NO:38所示的FR1，SEQ ID NO:42所示的FR2，SEQ ID NO:47所示的FR3，SEQID NO:52所示的FR4，或其变体，所述变体在所述FR中包含至多3个氨基酸的替换；

（f）SEQ ID NO:35所示的FR1，SEQ ID NO:43所示的FR2，SEQ ID NO:45所示的FR3，SEQID NO:52所示的FR4，或其变体，所述变体在所述FR中包含至多3个氨基酸的替换；

（g）SEQ ID NO:37所示的FR1，SEQ ID NO:41所示的FR2，SEQ ID NO:46所示的FR3，SEQID NO:52所示的FR4，或其变体，所述变体在所述FR中包含至多3个氨基酸的替换。

4. 针对FOLR1的单域抗体，其特征在于：所述单域抗体分别如SEQ ID NO.1-7所示，或者所述单域抗体与SEQ ID NO.1-7的氨基酸序列具有至少95％序列同源性。

5. 根据权利要求4所述的针对FOLR1的单域抗体，其特征在于：所述单域抗体的编码序列分别如SEQ ID NO.8-14所示，或者与SEQ ID NO.8-14具有至少95％序列同源性。

6.权利要求1-5任意一项所述的针对FOLR1的单域抗体的Fc融合抗体或人源化抗体。

7. 一种编码权利要求1-5任意一项所述的针对FOLR1单域抗体的核苷酸分子，其特征在于：其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：8-14所示，或者与SEQ ID NO.8-14具有至少95％序列同源性。

8.一种表达载体，其特征在于，其包含编码权利要求1-5任意一项所述的单域抗体或者权利要求6所述的Fc融合抗体的核苷酸分子或者权利要求7所述的核苷酸分子。

9.一种宿主细胞，其特征在于，其可以表达出权利要求1-5任意一项所述的针对FOLR1的单域抗体，或其包含权利要求8所述的表达载体。

10.权利要求1-5任意一项所述的针对FOLR1的单域抗体在制备抑制FOLR1基因表达的药物或抗肿瘤药物中的用途，或者权利要求1-5任意一项所述的针对FOLR1的单域抗体在制备介导细胞内化、ADCC或CDC作用的制剂中的应用。