CN116375875A - 一种抗lag3的单域抗体及其用途 - Google Patents
一种抗lag3的单域抗体及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116375875A CN116375875A CN202310548234.9A CN202310548234A CN116375875A CN 116375875 A CN116375875 A CN 116375875A CN 202310548234 A CN202310548234 A CN 202310548234A CN 116375875 A CN116375875 A CN 116375875A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- single domain
- amino acid
- domain antibody
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 title claims abstract description 111
- 101001137987 Homo sapiens Lymphocyte activation gene 3 protein Proteins 0.000 claims abstract description 64
- 102000017578 LAG3 Human genes 0.000 claims abstract description 63
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 70
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 53
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 32
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 17
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 16
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 15
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 13
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 11
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 claims description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000031671 Large B-Cell Diffuse Lymphoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 claims description 2
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 claims description 2
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000000102 Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck Diseases 0.000 claims description 2
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 210000003445 biliary tract Anatomy 0.000 claims description 2
- 206010012818 diffuse large B-cell lymphoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000000459 head and neck squamous cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000019691 hematopoietic and lymphoid cell neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 claims description 2
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 claims description 2
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 claims description 2
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 31
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 26
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 21
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 18
- 101000737793 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related antigen 1 Proteins 0.000 description 16
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 15
- 102100035361 Cerebellar degeneration-related protein 2 Human genes 0.000 description 15
- 101000737796 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related protein 2 Proteins 0.000 description 15
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 15
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 15
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 10
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 101100510618 Homo sapiens LAG3 gene Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 3
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 241000282838 Lama Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001416177 Vicugna pacos Species 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 2
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 2
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 17-β-hydroxy-5-α-Androstan-3-one Chemical compound C1C(=O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@H]21 NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101100510617 Caenorhabditis elegans sel-8 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282828 Camelus bactrianus Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 239000012739 FreeStyle 293 Expression medium Substances 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000037978 Immune checkpoint receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008028 Immune checkpoint receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000588770 Proteus mirabilis Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000010001 cellular homeostasis Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- -1 comprising 1 Chemical class 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 239000012145 high-salt buffer Substances 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000007160 ty medium Substances 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/567—Framework region [FR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明属于免疫学领域,涉及一种抗LAG3的单域抗体及其用途。所述的单域抗体由重链构成,重链包括SEQ ID NO:22‑SEQ ID NO:26任意一条所示的重链CDR1、SEQ ID NO:27‑SEQ ID NO:29任意一条所示的重链CDR2和SEQ ID NO:30‑SEQ ID NO:34任意一条所示的重链CDR3。相对于现有技术,本发明的有益效果是:本发明使用生物基因工程技术筛选出特异性针对LAG3的单域抗体,抗体亲和力较好。
Description
技术领域
本发明涉及能够与LAG3特异性结合的单域抗体(以下,其缩写为“LAG3单域抗体”),以及含有该单域抗体作为有效成分的药物组合物,及其药物治疗用途。
背景技术
LAG-3(淋巴细胞激活基因-3,又名CD223)是一种免疫检查点受体蛋白,主要表达在活化的T细胞、NK细胞、B细胞和浆细胞树突细胞,其主要功能是负调控T细胞的功能,属于免疫球蛋白超家族成员。其位于第12号染色体上的基因编码的膜蛋白并且在结构和遗传上与CD4相关。LAG3可通过和MHC II分子的结合,下调T细胞的活性。同时,LAG3也可增强调节性T细胞(Treg)的抑制活性。利用治疗性抗体抑制LAG3,可解除对T细胞的抑制,增强机体免疫应答。
已经提出LAG-3与MHC II类分子的直接结合在下调CD4+T淋巴细胞的抗原依赖性刺激作用中发挥作用(Huard等人(1994)Eur.J.Immunol.24:3216-3221)并且还已经显示LAG-3阻断使肿瘤或自身抗原模型(Gross等人(2007)J Clin Invest.117:3383-3392)和病毒模型(Blackburn等人(2009)Nat.Immunol.10:29-37)中的CD8淋巴细胞复生。另外,LAG-3的胞质内区域可以与LAP(LAG-3相关蛋白)相互作用,所述LAP是参与CD3/TCR活化途径下调的信号转导分子(Iouzalen等人(2001)Eur.J.Immunol.31:2885-2891))。另外,已经显示活化时CD4+CD25+调节型T细胞(Treg)表达LAG-3,这促成Treg细胞的阻抑活性(Huang,C.等人(2004)Immunity21:503-513)。LAG-3还可以通过Treg细胞以T细胞依赖性和非依赖性机制负向调节T细胞稳态(Workman,C.J.和Vignali,D.A.(2005)J.Immunol.174:688-695)。
纳米抗体是抗体界的新宠,由于分子量小,可以通过简单的分子克隆技术获得双价、三价或双特异性抗体。纳米抗体由于其分子小的特点,不论在原核表达系统(大肠杆菌),还是真核表达系统(CHO细胞、293细胞等)中表达都可以达到很高的产量。纳米抗体的迅速发展成为在抗体药物开发方面一股潜力无限的力量,代表着从今以后的抗体药物的重要发展方向。
发明内容
本专利的发明目的是提供一种能够与LAG3特异性结合的单域抗体及其用途。
本发明的第一方面提供了抗LAG3的单域抗体,所述的单域抗体由重链构成,重链包括SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:26任意一条所示的重链CDR1、SEQ ID NO:27-SEQ ID NO:29任意一条所示的重链
CDR2和SEQ ID NO:30-SEQ ID NO:34任意一条所示的重链CDR3。
优选地,所述的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列为下述(1)-(5)的一种:
(1)SEQ ID NO:22所示的CDR1,SEQ ID NO:27所示的CDR2,SEQ ID NO:32所示的CDR3;
(2)SEQ ID NO:23所示的CDR1,SEQ ID NO:27所示的CDR2,SEQ ID NO:33所示的CDR3;
(3)SEQ ID NO:24所示的CDR1,SEQ ID NO:27所示的CDR2,SEQ ID NO:31所示的CDR3;
(4)SEQ ID NO:25所示的CDR1,SEQ ID NO:29所示的CDR2,SEQ ID NO:34所示的CDR3;
(5)SEQ ID NO:26所示的CDR1,SEQ ID NO:28所示的CDR2,SEQ ID NO:30所示的CDR3。
以上5种CDR组合(1)-(5)依次与单域抗体4C10、2D4、4F1、4D9、4G12对应。
上述所有序列,可以替换为与该序列具有“至少80%同源性”的序列或仅一个或少数几个氨基酸替换的序列;优选为“至少85%同源性”,更优选为“至少90%同源性”,更优选为“至少95%同源性”,最优选为“至少98%同源性”。
在一个实施方案中,其中所述重链CDR1、CDR2和CDR3的任何一个或多个CDR中,一个至五个任意氨基酸残基可以分别用其保守氨基酸取代。具体地,所述重链CDR1中,1至5个氨基酸残基可由其保守氨基酸替换;所述重链CDR2中,1至5个氨基酸残基可由其保守氨基酸替换;所述重链CDR3中,1至5个氨基酸残基可由其保守氨基酸替换。
如本文所用,术语“序列同源性”表示两个(核苷酸或氨基酸)序列在比对中在相同位置处具有相同残基的程度,并且通常表示为百分数。优选地,同源性在被比较的序列的整体长度上确定。因此,具有完全相同序列的两个拷贝具有100%同源性。
在一些实施例中,与前述序列相比仅仅替换一个或少数几个氨基酸的序列,例如,包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代,也可以实现发明目的。这些变异形式包括(但并不限于):一个或多个(通常为1-50个,较佳地1-30个,更佳地1-20个,最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代,以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内,较佳地为10个以内,更佳地为5个以内)氨基酸。实际上,在确定两个氨基酸序列之间的序列同源性程度或在确定单域抗体中的CDR1、CDR2和CDR3组合时,技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代,在取代情况下,所述取代将优选为保守氨基酸取代。所述保守氨基酸,其通常可以被描述为氨基酸残基被具有相似化学结构的另一个氨基酸残基替代的氨基酸取代,并且该取代对多肽的功能、活性或其它生物学性质几乎没有或基本上没有影响。所述保守氨基酸取代在本领域是通用的,例如保守氨基酸取代是以下(a)-(d)组内的一个或少数几个氨基酸被同一组内另一个或少数几个氨基酸所取代:(a)极性带负电残基及其不带电酰胺:Asp、Asn、Glu、Gln;(b)极性带正电残基:His、Arg、Lys;(c)芳香族残基:Phe、Trp、Tyr;(d)脂肪族非极性或弱极性残基:Ala、Ser、Thr、Gly、Pro、Met、Leu、Ile、Val、Cys。特别优选的保守氨基酸取代如下:Asp被Glu取代;Asn被Gln或His取代;Glu被Asp取代;Gln被Asn取代;His被Asn或Gln取代;Arg被Lys取代;Lys被Arg、Gln取代;Phe被Met、Leu、Tyr取代;Trp被Tyr取代;Tyr被Phe、Trp取代;Ala被Gly或Ser取代;Ser被Thr取代;Thr被Ser取代;Gly被Ala或Pro取代;Met被Leu、Tyr或Ile取代;Leu被Ile或Val取代;Ile被Leu或Val取代;Val被Ile或Leu取代;Cys被Ser取代。另外,本领域技术人员知晓,单域抗体的创造性体现在CDR1-3区,而框架区序列FR1-4并非是不可改变的,FR1-4的序列可以采取本发明公开的序列的保守序列变体。
本发明中的“抗LAG3的单域抗体”的含义,不仅包括完整的单域抗体,还包括所述抗LAG3的单域抗体的片段、衍生物和类似物。如本文所用,术语“片段”、“衍生物”和“类似物”含义相同,均是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽,而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的,或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽,或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物,例如聚乙二醇)融合所形成的多肽,或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列,或与Fc标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导,这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在一个优选实施方案中,所述的抗体序列还包括框架区FR;所述框架区FR包括FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列;框架区FR的氨基酸序列分别为:
SEQ ID NO:11-13中的任意一条所示的FR1或FR1的变体,所述FR1的变体在所述FR1中包含至多5个氨基酸的替换;
SEQ ID NO:14-16中的任意一条所示的FR2或FR2的变体,所述FR2的变体在所述FR2中包含至多5个氨基酸的替换;
SEQ ID NO:17-20中的任意一条所示的FR3或FR3的变体,所述FR3的变体在所述FR3中包含至多5个氨基酸的替换;
SEQ ID NO:21所示的FR4或FR4的变体,所述FR4的变体在所述FR4中包含至多5个氨基酸的替换。
本发明的第二方面是提供能结合LAG3的单域抗体的氨基酸序列,所述单域抗体的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-5所示,或者所述单域抗体与SEQ ID NO.1-5的氨基酸序列具有至少80%序列同源性,并且能够特异性结合LAG3蛋白,或者所述单域抗体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1-5中的任意一条相比,FR1、FR2、FR3或FR4序列中至少1个氨基酸残基被保守氨基酸取代。
在一个实施方案中,所述抗LAG3的单域抗体与选自SEQ ID NO:1-5的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%序列同源性,并且能够特异性结合LAG3蛋白。
本发明的第三个方面是提供前述任一的抗LAG3的单域抗体的Fc融合抗体或人源化抗体。
本发明的第四个方面是提供编码前述的抗LAG3的单域抗体或前述的Fc融合抗体或前述的人源化抗体的核苷酸分子,其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:6-10所示,或者所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:6-10中的任意一条所编码的氨基酸序列相同,或者与SEQ ID NO:6-10中的任意一条具有至少95%序列同源性。
在一个实施方案中,编码所述抗LAG3的单域抗体的核酸分子与选自SEQ ID NO:6-10的核苷酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%序列同源性,并且其编码的抗LAG3的单域抗体能够特异性结合LAG3蛋白。
本发明的第五个方面是提供一种表达载体,其包含编码抗LAG3的单域抗体或Fc融合抗体或人源化抗体的核苷酸分子,其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:6-10或所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:6-10中的任意一条所编码的氨基酸序列相同。
在一个优选的实施方案中,所使用的表达载体为RJK-V4-3(通过基因工程手段将编码抗LAG3的单域抗体或其Fc融合抗体或人源化抗体的核苷酸分子整合入RJK-V4-3中),根据需要还可以选择其他的通用型表达载体。
本发明的第六个方面是提供一种能够表达前述的抗LAG3的单域抗体、Fc融合抗体或人源化抗体的宿主细胞,或其包含前述的表达载体。优选宿主细胞为细菌细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
在另一个优选的实施方案中,所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞,包括细菌,真菌。
在另一个优选的实施方案中,所述的宿主细胞选自下组:大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞、噬菌体、或其组合。
在另一个优选的实施方案中,所述原核细胞选自下组:大肠杆菌、枯草杆菌、乳酸菌、链霉菌、奇异变形菌、或其组合。
在另一个优选的实施方案中,所述真核细胞选自下组:巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉、或其组合。
在另一个优选的实施方案中,所述真核细胞选自下组:草地粘虫等昆虫细胞、烟草等植物细胞、BHK细胞、CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞、或其组合。
在另一个优选的实施方案中,所述宿主细胞为悬浮ExpiCHO-S细胞。
在另一个优选的实施方案中,所述宿主细胞为悬浮293F细胞。
本发明的第七个方面是提供一种重组蛋白,包含前述的抗LAG3的单域抗体。所述的重组蛋白可以为前述的SEQ ID NO.1-5中所示的单域抗体,也可以为与SEQ ID NO.1-5中具有至少80%同源性的单域抗体,还可以是多表位抗体、多特异性抗体以及多价抗体;例如,所述的多表位抗体可由SEQ ID NO.1-5中的不止一条序列组成;所述的多价抗体可由SEQ ID NO.1-5中的其中一条序列重复排列若干次组成;所述的多特异性抗体包括但不限于前述的双特异性抗体,以及三特异性抗体;此外,重组蛋白可以为前述的抗体的片段、衍生物和类似物。
本发明的第八个方面是提供一种药物组合物,其包含前述的结合LAG3的单域抗体和药学上可接受的载体。通常,可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中,其中pH通常根据抗体的等电点确定(水性载体介质的pH需偏离该抗体的等电点,且与该抗体的等电点相差大约2)。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药,其中包括(但并不限于):静脉内、透皮(在患处直接涂抹或贴敷膏药)。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt%,较佳地0.01-90wt%,更佳地0.1-80wt%)的前述的单域抗体以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式,例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。
本发明的第九个方面是提供一种用于治疗疾病的药剂,其包含前述的用于结合LAG3蛋白的单域抗体作为活性成分。
本发明的第十个方面是提供一种检测LAG3水平的试剂盒,其含有前述的抗LAG3的单域抗体。在本发明的一个优选例中,所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。
在一个优选的实施方案中,该试剂盒包括识别LAG3蛋白的抗体,用于溶解样本的裂解介质,检测所需的通用试剂和缓冲液,如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
在一个优选的实施方案中,所述的试剂盒还含有第二抗体和用于检测的酶或荧光或放射标记物,以及缓冲液。
在一个优选的实施方案中,所述试剂盒的第二抗体可以为前述的抗LAG3的单域抗体的抗体(作为抗抗体),可以为单域抗体、单克隆抗体、多克隆抗体或抗体的其它任意形式。
本发明的第十一个方面,提供了一种产生抗LAG3的单域抗体的方法,包括步骤:
(a)在适合产生单域抗体的条件下,培养本发明的第六个方面所述的宿主细胞,从而
获得含所述抗LAG3的单域抗体的培养物;以及
(b)从所述培养物中分离或回收所述的抗LAG3的单域抗体;以及
(c)任选地,纯化和/或修饰步骤(b)中获得的LAG3的单域抗体。
本发明的第十二个方面是提供前述的抗LAG3的单域抗体或前述药物组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
在一个优选的实施方案中,所述疾病包括但不限于实体瘤、黑色素瘤、结直肠癌、转移性微卫星稳定结直肠癌、食管癌、胃癌、胶质母细胞瘤、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肾肿瘤、肝癌、霍奇金淋巴瘤、肝细胞癌、血液肿瘤、子宫内膜癌、胆道肿瘤、乳腺癌、肿瘤转移、弥漫性大B细胞淋巴瘤、卵巢癌、晚期头颈部鳞状细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌。
有益效果
相对于现有技术,本发明的有益效果是:
(1)本发明单域抗体特异性针对具有正确空间结构的LAG3蛋白。
(2)本发明得到的单域抗体,表达体系选择灵活,既可以在原核系统中表达也可以在酵母细胞或哺乳动物细胞的真核系统中表达,且其在原核表达系统中的表达成本低,可降低后期生产成本。
(3)本发明得到的单域抗体,其抗体的多组合形式改造简单,通过基因工程的方式简单的串联即可以获得多价、多特异性的抗体,并且其免疫异质性很低,在不经过人源化改造的情况下也不会产生较强的免疫反应。
(4)本发明得到单域抗体,其亲和力范围更为宽泛,在未进行亲和力成熟之前,其亲和力范围可以从nM级别至pM级别,为后期不同用途的抗体提供多个选择。
附图说明
为了更清楚地说明本申请的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,对于本领域普通技术人员而言,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例3中靶向LAG3抗体筛选的文库富集情况;
图2为实施例12中的抗体抗原结合量效曲线测定图(4C10);
图3为实施例12中的抗体抗原结合量效曲线测定图(4D9、4F1);
图4为实施例12中的抗体抗原结合量效曲线测定图(4G12);
图5为实施例12中的抗体抗原结合量效曲线测定图(2D4);
图6是LAG3单域抗体的受体配体结合阻断检测图(4C10);
图7是LAG3单域抗体的受体配体结合阻断检测图(4D9、4F1);
图8是LAG3单域抗体的受体配体结合阻断检测图(4G12);
图9是LAG3单域抗体的受体配体结合阻断检测图(2D4);
图10是LAG3单域抗体的受体配体结合阻断检测图(Tab6、Tab7、hIgG);
图11是LAG3单域抗体的ADCC试验测定图(2D4);
图12是LAG3单域抗体的ADCC试验测定图(4C10);
图13是LAG3单域抗体的ADCC试验测定图(4F1,4D9);
图14是LAG3单域抗体的ADCC试验测定图(4G12)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
如本文所用,“单域抗体”(sdAb,也被研发者Ablynx称为纳米抗体或VHH)是本领域技术人员公知的。单域抗体为其互补决定区是单域多肽的一部分的抗体。因此,单域抗体包含单个互补决定区(单个CDR1、单个CDR2和单个CDR3)。单域抗体的实例为仅有重链的抗体(该抗体天然不包含轻链)、衍生自常规抗体的单域抗体和工程化抗体。
单域抗体可以衍生自任何物种,包括小鼠、人、骆驼、美洲驼、山羊、兔和牛。例如,天然存在的VHH分子可以衍生自骆驼科物种(例如骆驼、单峰骆驼、美洲驼和原驼)提供的抗体。像完整的抗体一样,单域抗体能够选择性地结合特定抗原。单域抗体可以仅含有免疫球蛋白链的可变结构域,该结构域具有CDR1、CDR2和CDR3以及框架区。
如本文所用,术语“序列同源性”表示两个(核苷酸或氨基酸)序列在比对中在相同位置处具有相同残基的程度,并且通常表示为百分数。优选地,同源性在被比较的序列的整体长度上确定。因此,具有完全相同序列的两个拷贝具有100%同源性。
如本文所用,术语“Fc融合抗体”指利用基因工程技术将目标抗体的Fc段与某种具有生物学活性的功能蛋白分子融合而产生的新型蛋白。
术语“人源化抗体”是指将目标抗体(如动物抗体)的重链可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体,或将目标抗体的互补决定区(CDR1~3序列)移植至人抗体的可变区内,得到的抗体,或将目标抗体根据人抗体骨架区(FR1~4)的特征进行氨基酸的突变后获得的抗体。人源化抗体可用合成法或定点突变法。
本发明中,与本发明公开的CDR1-3的序列同源性高的序列,也可以得到针对LAG3的单域抗体。在一些实施例中,与SEQ ID NO.1-5中的序列具有“至少80%同源性”的序列,或者“至少85%同源性”、“至少90%同源性”、“至少95%同源性”、“至少98%同源性”的序列都可以实现发明目的。
在一些实施例中,与SEQ ID NO:1-5中的序列相比仅仅替换一个或少数几个氨基酸的序列,例如,包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代,也可以实现发明目的。实际上,在确定两个氨基酸序列之间的序列同源性程度或在确定单域抗体中的CDR1、CDR2和CDR3组合时,技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代,在取代情况下,所述取代将优选为保守氨基酸取代,所述保守氨基酸,其通常可以被描述为氨基酸残基被具有相似化学结构的另一个氨基酸残基替代的氨基酸取代,并且该取代对多肽的功能、活性或其它生物学性质几乎没有或基本上没有影响。所述保守氨基酸取代在本领域是通用的,例如保守氨基酸取代是以下(a)-(d)组内的一个或少数几个氨基酸被同一组内另一个或少数几个氨基酸所取代:(a)极性带负电残基及其不带电酰胺:Asp、Asn、Glu、Gln;(b)极性带正电残基:His、Arg、Lys;(c)芳香族残基:Phe、Trp、Tyr;(d)脂肪族非极性或弱极性残基:Ala、Ser、Thr、Gly、Pro、Met、Leu、Ile、Val、Cys。特别优选的保守氨基酸取代如下:Asp被Glu取代;Asn被Gln或His取代;Glu被Asp取代;Gln被Asn取代;His被Asn或Gln取代;Arg被Lys取代;Lys被Arg、Gln取代;Phe被Met、Leu、Tyr取代;Trp被Tyr取代;Tyr被Phe、Trp取代;Ala被Gly或Ser取代;Ser被Thr取代;Thr被Ser取代;Gly被Ala或Pro取代;Met被Leu、Tyr或Ile取代;Leu被Ile或Val取代;Ile被Leu或Val取代;Val被Ile或Leu取代;Cys被Ser取代。另外,本领域技术人员知晓,单域抗体的创造性体现在CDR1-3区,而框架区序列FR1-4并非是不可改变的,FR1-4的序列可以采取本发明公开的序列的保守序列变体。
本发明的优选宿主细胞为细菌细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
本专利是通过基因工程技术制备目标蛋白以及目标蛋白的截短体形式,然后将获得的抗原蛋白免疫内蒙古阿拉善双峰驼,通过多次免疫后,获得骆驼的外周血淋巴细胞或者脾细胞,通过基因工程的方式,将驼源抗体可变区编码序列重组到噬菌体展示载体中,通过噬菌体展示技术筛选出针对抗原蛋白的特异性抗体,并进一步检测其与抗原结合的能力以及在包括自身免疫疾病治疗中的应用。
现将上述技术方案拆分详解,以具体实施例的方式描述:
实施例1:人源LAG3重组胞外结构域蛋白的制备:
本专利中用到的人源重组胞外结构域蛋白为公司自己表达纯化获得,人源重组LAG3蛋白的表达载体设计方案具体如下:
(1)在NCBI中检索获得LAG3的编码序列,其收录号为NM_002286.5,该序列编码产生的氨基酸序列登录号为NP_002277.4。
(2)利用基因合成的方式将编码LAG3胞外端(即LAG3蛋白的第23~450位氨基酸)的核苷酸序列克隆到载体pcDNA3.4中。将构建好的载体进行Sanger测序,比对原始序列,确认无误后,将该重组质粒进行大量抽提,去除内毒素,转染悬浮293F细胞进行目的蛋白表达和纯化,纯度达到90%以上,满足动物免疫要求。
实施例2:针对LAG3蛋白的单域抗体文库的构建:
将1mg实施例1中纯化获得的人源重组LAG3蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合,免疫一只内蒙古阿拉善双峰驼,每周免疫一次,共连续免疫7次,除首次免疫外,其余六次均是用1mg LAG3蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混合进行动物免疫,该免疫过程是为了集中刺激骆驼使其产生针对LAG3蛋白的抗体。
动物免疫结束后,抽取骆驼外周血淋巴细胞150mL,并提取细胞的RNA。利用提取的总RNA合成cDNA,并通过套式PCR反应以cDNA为模板扩增VHH(抗体重链可变区)。
然后利用限制性内切酶分别酶切pMECS载体和VHH片段,然后将酶切后的片段和载体链接。将连接后的片段电转化至感受态细胞TG1中,构建LAG3蛋白的噬菌体展示文库并测定库容,文库的库容大小约为1×109,同时,通过菌落PCR鉴定检测文库在目的片段的正确插入率。
结果显示,从文库中随机挑选的30个菌落进行PCR扩增后,有28个克隆可以扩增出大小为预测大小的条带,有2个克隆扩增出条带不正确,故正确插入率为28÷30×100%≈93%。
实施例3:针对LAG3蛋白的单域抗体筛选:
取200μL实施例2中的重组TG1细胞至2×TY培养基中培养,期间加入40μL辅助噬菌体VCSM13侵染TG1细胞,并培养过夜以扩增噬菌体,次日利用PEG/NaCl沉淀噬菌体,离心收集扩增噬菌体。
将稀释在100mM pH8.3的NaHCO3中的LAG3蛋白500μg偶联在酶标板上,4℃放置过夜,同时设立阴性对照孔(培养基对照);第二天加入200μL的3%的脱脂乳,室温封闭2h;封闭结束后,加入100μl扩增后噬菌体文库(大约2×1011个噬菌体颗粒),室温作用1h;作用1小时后,用PBS+0.05%Tween-20洗15遍,以洗掉未结合的噬菌体。
用终浓度为25mg/mL的胰蛋白酶将与LAG3蛋白特异性结合的噬菌体解离下,并感染处于对数生长期的大肠杆菌TG1细胞,37℃培养1h,产生并收集噬菌体用于下一轮的筛选,相同筛选过程重复1轮,逐步得到富集。
当富集倍数达到10倍以上时,富集效果如图1所示。
图1中,P/N=生物淘选中阳性孔洗脱下的噬菌体感染TG1细菌后生长的单克隆细菌数/阳性孔洗脱下的噬菌体感染TG1细菌后生长的单克隆细菌数,该参数在富集发生后会逐渐增大;I/E=生物淘选中每轮加入阳性孔的噬菌体总量/生物淘选中每轮从阳性孔洗脱出的噬菌体总量,该参数在富集发生后会逐渐趋近于1。
实施例4:用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选针对LAG3的特异性阳性克隆:
根据上述实施例3中的筛选方法对抗LAG3蛋白的单域抗体进行2轮筛选,抗LAG3蛋白的噬菌体富集因子达到10以上,筛选结束后,从筛选获得的阳性克隆中挑选384个单菌落分别接种于含100μg/mL氨苄青霉素的2×TY培养基的96深孔板中,并设置空白对照,37℃培养至对数期后,加入终浓度为1mM的IPTG,28℃培养过夜。
利用渗透涨破法获得粗提抗体;将LAG3重组蛋白分别释至100mM pH8.3的NaHCO3中并将100μg蛋白在酶标板(ELISA板)中4℃包被过夜。将获得的抗体粗提液取100μL转移至加入抗原的ELISA板上,室温孵育1h;用PBST洗去未结合的抗体,加入100μl经1:2000稀释后的Mouse Anti-HA tag Antibody(HRP)(鼠抗HA辣根过氧化物酶标记抗体,ThermoFisher),在室温孵育1h;用PBST洗去未结合的抗体,加入辣根过氧化物酶显色液,37℃下反应15min后,加入终止液,于酶标仪上450nm波长处,读取吸收值。
当样品孔OD值大于对照孔5倍以上时,判定为阳性克隆孔;将阳性克隆孔的菌转摇在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中以便提取质粒并进行测序。
根据序列比对软件VectorNTI分析各个克隆株的基因序列,把CDR1,CDR2和CDR3序列相同的株视为同一克隆株,而序列不同的株视为不同克隆株,最终获得特异性针对LAG3蛋白的单域抗体。
其抗体的氨基酸序列为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4结构,构成整个VHH。获得的单域抗体重组质粒可以在原核系统中进行表达,最终获得单域抗体蛋白。
5种单域抗体的CDR、FR序列如表1-7所示,5种单域抗体的氨基酸序列和核苷酸序列分别如表8、表9所示。
表1 5种抗体的CDR1序列
实际克隆编号 | CDR1 | SEQ ID |
4C10 | GCSYSSYC | SEQ ID NO:22 |
2D4 | GYSYRSYC | SEQ ID NO:23 |
4F1 | GYSYSSYC | SEQ ID NO:24 |
4D9 | GYTYSSGC | SEQ ID NO:25 |
4G12 | GYTYSSYC | SEQ ID NO:26 |
表2 5种抗体的CDR2序列
表3 5种抗体的CDR3序列
实际克隆编号 | CDR3 | SEQ ID |
4G12 | AAGQIYGGNCQYETNN | SEQ ID NO:30 |
4F1 | AAGQKYGDNCQYDTNN | SEQ ID NO:31 |
4C10 | AAGQKYGGNCQYETAN | SEQ ID NO:32 |
2D4 | AAGQQYGGNCQYEVNN | SEQ ID NO:33 |
4D9 | AAGVDYGGSCQWDTGT | SEQ ID NO:34 |
表4 5种抗体的FR1序列
表5 5种抗体的FR2序列
表6 5种抗体的FR3序列
表7 5种抗体的FR4序列
表8 5种抗体的氨基酸序列
表9 5种抗体的核酸序列
实施例5:LAG3蛋白的特异性单域抗体在宿主菌大肠杆菌中的纯化及表达
将实施例4中测序分析所获得不同克隆株的质粒(pMECS-VHH)电转化到大肠杆菌HB2151中,并将其涂布在LB+amp+glucose即含有氨苄青霉素和葡萄糖的培养平板上,37℃培养过夜;挑选单个菌落接种在5mL含有氨苄青霉素的LB培养液中,37℃摇床培养过夜。
接种1mL的过夜培养菌种至330mLTB培养液中,37℃摇床培养,培养到OD600nm值达到0.6-0.9时,加入1M IPTG,28℃摇床培养过夜;离心,收集大肠杆菌,利用渗透涨破法,获得抗体粗提液;
通过镍柱亲和层析法纯化出抗体,纯化后部分的单域抗体,包括4C10、2D4、4F1、4D9、4G12。
实施例6:抗LAG3的单域抗体的Fc融合抗体真核表达载体的构建
(1)将实施例4中获得的目标序列亚克隆至真核表达载体中:将实施例4中筛选出来的抗体经Sanger测序得到其核苷酸序列;
(2)通过序列合成的方式将上述核苷酸序列合成至本公司设计改造的载体RJK-V4-3中得到重组真核表达载体,该载体的改造方法如实施例10所述;
(3)将步骤(2)构建好的重组真核表达载体转化至DH5α大肠杆菌中,培养进行质粒抽提,去除内毒素;
(4)将抽提后的质粒再进行序列测序鉴定;
(5)将确定无误后的重组载体准备后续真核细胞转染表达,通过实施例7或8的方法将VHH的Fc蛋白表达后并通过实施例9的方法纯化上述抗体。
实施例7:抗LAG3蛋白的单域抗体在悬浮ExpiCHO-S细胞中表达
(1)转染前3天以2.5×105/mL细胞传代和扩大培养ExpiCHO-STM细胞,计算出的所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的120mL(终体积)的ExpiCHOTM表达培养基的500mL摇瓶中;使细胞浓度达到约4×106-6×106活细胞/mL;
(2)在转染前一天,将ExpiCHO-STM细胞稀释浓度至3.5×106活细胞/mL,使细胞过夜培养;
(3)转染当天,测定细胞密度和活细胞百分比。转染之前细胞密度应达到约7×106-10×106活细胞/mL;
(4)用预热至37℃新鲜的ExpiCHOTM表达培养基将细胞稀释至6×106个活细胞/mL。计算出的所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的100mL(终体积)的ExpiCHOTM表达培养基的500mL摇瓶中;
(5)使轻轻颠倒混匀ExpiFectamineTMCHO试剂,用3.7mL OptiPROTM培养基稀释ExpiFectamineTMCHO试剂,回荡或混匀;
(6)用冷藏的4mL OptiPROTM培养基稀释质粒DNA,回荡混匀;
(7)将ExpiFectamine CHO/质粒DNA(质粒DNA为实施例6制得的抗LAG3的单域抗体的Fc融合抗体真核表达载体)复合物室温孵育1-5分钟,然后轻轻加入制备的细胞悬液中,加入过程中轻轻回荡摇瓶;
(8)将细胞在37℃、8%CO2、加湿的空气中震荡培养;
(9)转染后第1天(18-22小时后)添加600ul ExpiFectamineTMCHO Enhancer和24mLExpiCHO feed。
(10)在转染后约8天(细胞活率低于70%)收集上清。
实施例8:抗LAG3蛋白的单域抗体在悬浮293F细胞中的表达
重组单域抗体表达实验流程(以500mL摇瓶为例):
(1)转染前3天以2.5×105/mL细胞传代和扩大培养293F细胞,计算出的所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的120mL(终体积)的OPM-293 CD05 Medium培养基的500mL摇瓶中。使细胞浓度达到约2×106-3×106活细胞/mL。
(2)转染当天,测定细胞密度和活细胞百分比。转染之前细胞密度应达到约2×106-3×106活细胞/mL。
(3)用预热的OPM-293CD05 Medium将细胞稀释至1×106个活细胞/mL。计算出所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的100mL(终体积)的培养基的500mL摇瓶中。
(4)用4mL Opti-MEM培养基稀释PEI(1mg/mL)试剂,回荡或吹打混匀;用4mL Opt-MEM培养基稀释质粒DNA(质粒DNA为实施例6制得的抗LAG3的单域抗体的Fc融合抗体真核表达载体),回荡混匀,并用0.22um的滤头过滤。室温孵育5min。
(5)将稀释的PEI试剂加入稀释的DNA中,颠倒混匀。将PEI/质粒DNA复合物室温孵育15-20分钟,然后轻轻加入制备的细胞悬液中,加入过程中轻轻回荡摇瓶。
(6)将细胞在37℃、5%CO2、120rpm震荡培养。
(7)转染后第24h、72h添加5mL OPM-CHO PFF05补料。
(8)在转染后约7天(细胞活率低于70%)收集上清。
实施例9:抗LAG3蛋白的单域抗体的纯化
(1)将实施例7或8中获得蛋白表达上清用0.45μm的一次性滤头过滤除掉不可溶杂质;
(2)将上述滤液使用蛋白纯化仪进行亲和层析纯化,利用人源Fc与Protein A结合的能力,使用偶联Protein A的琼脂糖填料进行纯化;
(3)将滤液通过1mL/分钟的流速流穿Protein A预装柱,该步骤中滤液中的目标蛋白会与填料结合;
(4)通过低盐和高盐缓冲液将柱上结合的杂质蛋白洗涤;
(5)用低pH缓冲液将柱上结合的目标蛋白进行系统;
(6)将洗脱液迅速加入pH9.0的Tris-HCl溶液,进行中和;
(7)将上述中和后的蛋白溶液透析后,进行SDS-PAGE分析,确定蛋白纯度在95%以上,且浓度在0.5mg/mL以上后,低温保存备用。
实施例10:单域抗体真核表达载体RJK-V4-3的构建
所提及纳米抗体通用的目标载体RJK-V4-3,为本公司在invitrogen商业化载体pCDNA3.4(载体资料链接:https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_4_topo_ta_cloning_kit_man.pdf)的基础上融合了人源IgG4的重链编码序列中的Fc区段后改造而来的,即该载体包含了IgG4重链的铰链区(Hinge)CH2和CH3区。具体改造方案如下:
(1)选取pcDNA3.4上的限制性酶切位点XbaI和AgeI;
(2)在Fc片段编码序列的5’端和3’端通过重叠PCR的方式分别引入多克隆位点(MCS,Multiple Cloning Site)和6×His标签;
(3)使用分别带有XbaI和AgeI酶切位点的一对引物通过PCR的方式将上述片段扩增;
(4)使用限制性内切酶XbaI和AgeI分别酶切pcDNA3.4和(3)中的重组DNA片段;
(5)将酶切后的载体和插入片段在T4连接酶的作用下连接,然后将连接产物转化至大肠杆菌,扩增,测序核实,获得重组质粒。
实施例11:靶向人源LAG3的工具抗体(Tool antibody,Tab)的表达和纯化
本文中,Tab6为3.40.19-uAb(CN110204614 A),Tab7为JY-001(CN2020100755045)。将搜索到的序列委托通用生物系统(安徽)有限公司进行哺乳动物细胞表达系统密码子优化,并克隆至pcDNA3.1载体。经过抗性筛选,选择质粒阳性菌扩增,使用质粒中提试剂盒(Macherey Nagel,Cat#740412.50)抽提质粒。按照每100mL细胞加入100μg质粒(40μg重链+60μg轻链),使用PEI在293F细胞(培养基:FreeStyle 293Expressionmedium,Thermo,Cat#12338026+F-68,Thermo,Cat#24040032)中瞬转表达;转染6~24h后加入5%体积的10% Peptone(Sigma,Cat#P0521-100G),8%CO2 130rpm培养约7~8天;细胞活率降至50%时收取表达上清,使用ProteinA(GE,Cat#17-5438-02)重力柱纯化;PBS透析后,使用Nanodrop测定浓度,SEC鉴定纯度,间接ELISA验证结合能力;
通过本方法获得的Tab,浓度不小于2mg/ml,纯度大于95%。
实施例12:抗体的抗原结合量效曲线测定
本实施例采用标准酶联免疫吸附测定(ELISA)操作流程进行。
(1)包被50μL 1μg/mLLAG3蛋白,4℃过夜。
(2)洗板;加入200μL 5%牛奶,37℃封闭2h。
(3)将VHH-hFc稀释至2ug/mL,然后5倍梯度稀释抗体共8个浓度梯度。这里的VHH-hFc指实施例8制得的抗LAG3蛋白的单域抗体的Fc融合抗体(在293F细胞中表达)经实施例9纯化而得。此外,还分别设置hIgG、Tab对照;Tab6,Tab7由实施例11制得;
(4)洗板;加入50μL经步骤(3)稀释得到的单域抗体,两复孔,37℃孵育1h。
(5)洗板;加入50μL HRP-Goat anti hIgG二抗,37℃孵育30min。
(6)洗板(多洗几次);加入50μL预先恢复常温的TMB,避光常温反应15min。
(7)加入50μL终止液(1N HCl),酶标仪读数保存。
(8)绘制曲线,计算EC50,如图2-图5所示,其中hIgG指同型对照,不与任何靶标结合的免疫球蛋白分子,通过商品化购买得到。
其中,图2-图5为样品的抗原结合量效曲线测定结果(包含4C10,4F1,4D9,4G12,2D4,以及未示出序列的抗体株:3G12、3H3、3H4、3H9、4C5、4C12、4D2、4D11、4E8、4F7、4F12、4G10、4H8、2C8、2D1、2D7、2D11、2E7)。
实施例13:LAG3单域抗体的受体配体结合阻断检测
(1)用蛋白稀释液稀释受体蛋白(人LAG3蛋白)至1μg/ml,4℃包被过夜。
(2)洗板,用5%脱脂牛奶37℃封闭。
(3)将偶联生物素的配体蛋白(FGL-1蛋白)稀释至2倍的EC80浓度,将抗体VHH-hFc、Tab以及hIgG分别稀释至2倍起始浓度,5倍梯度稀释,将配体蛋白分别和稀释后的抗体、Tab以及hIgG按1:1转至新的配药板混匀。
(4)洗板,将稀释后的配体蛋白/抗体混合物转至ELISA板,两复孔,37℃孵育。
(5)洗板,加入稀释后的Streptavidin[HRP],37℃孵育。
(6)洗板,加入单组分TMB,室温避光显色。
(7)加入终止液,立刻用酶标仪读取OD450,作图计算EC50,结果分别如图6-图10所示(包含4C10,4F1,4D9,4G12,2D4,以及未示出序列的抗体株:3G12、3H3、3H4、3H9、4C5、4C12、4D2、4D11、4E8、4F7、4F12、4G10、4H8、2C8、2D1、2D7、2D11、2E7)。
实施例14:LAG3蛋白的特异性单域抗体的ADCC效应检测
步骤如下:
(1)将复苏后传代3-4代的细胞(CHO-K1-LAG3)收集后分别按10000个细胞/孔铺入96孔板;CHO-K1-LAG3细胞的构建过程见实施例14。
(2)将hIgG和VHH-hFc样品配置最高浓度为10μg/mL的溶液,并进行10倍梯度稀释,最终得到7个浓度;这里的VHH-hFc由实施例8制得的抗LAG3蛋白的单域抗体的Fc融合抗体(在293F细胞中表达),并经实施例9的方法纯化而得。
(3)将梯度稀释好的抗体溶液按细胞悬液的等体积加入细胞培养孔;
(4)对于样品孔和E/T孔(抗体浓度为0),收集Jurkat-NFAT-luc-FcγRIIIa细胞(苏州瑞安生物,货号RA-CK01),将该细胞作为ADCC Bioassay效应细胞,按每孔30000个细胞加入细胞培养孔;
(5)孵育6小时后,用One-Glo试剂盒检测细胞杀伤,读取luminescence;
(6)计算诱导倍数(Fold of Induction)=(样品-BG)/(E/T-BG);
根据靶细胞杀伤率和浓度,进行四参数拟合,计算各抗体介导的ADCC作用的EC50浓度。结果如图11-图14所示(包括单域抗体4C10,2D4,4F1,4D9,4G12,以及未示出序列的2C8、2D1、2D7、4C5、4C12、4D2)。可见,相比hIgG和Tab对照,单域抗体4C10,2D4具有较佳的ADCC效应。
CHO-K1-LAG3细胞株的构建
从NCBI数据库中获得LAG3(NCBI登记号:NM_002286.6)的CDS区序列信息,选择通过基因合成DNA序列,克隆到PHB-Puro表达载体上,构建PHB-LAG3-Puro慢病毒载体质粒,慢病毒包装,使用慢病毒感染方法向CHO-K1基因组中导入CMV-LAG3-EF1a-Puromycin基因,并通过Puromycin抗性筛选和单克隆筛选得到稳定表达LAG3膜蛋白的CHO-K1-LAG3稳定细胞系。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解,上述实施例不以任何形式限制本发明,凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案,均落在本发明的保护范围内。
Claims (13)
1.一种抗LAG3的单域抗体,其特征在于:所述的单域抗体由重链构成,重链包括SEQ IDNO:
22-SEQ ID NO:26任意一条所示的重链CDR1、SEQ ID NO:27-SEQ ID NO:29任意一条所示的重链
CDR2和SEQ ID NO:30-SEQ ID NO:34任意一条所示的重链CDR3。
2.根据权利要求1所述的LAG3的单域抗体,其特征在于:所述的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列为下述(1)-(5)的一种:
(1)SEQ ID NO:22所示的CDR1,SEQ ID NO:27所示的CDR2,SEQ ID NO:32所示的CDR3;
(2)SEQ ID NO:23所示的CDR1,SEQ ID NO:27所示的CDR2,SEQ ID NO:33所示的CDR3;
(3)SEQ ID NO:24所示的CDR1,SEQ ID NO:27所示的CDR2,SEQ ID NO:31所示的CDR3;
(4)SEQ ID NO:25所示的CDR1,SEQ ID NO:29所示的CDR2,SEQ ID NO:34所示的CDR3;
(5)SEQ ID NO:26所示的CDR1,SEQ ID NO:28所示的CDR2,SEQ ID NO:30所示的CDR3。
3.根据权利要求1所述的抗LAG3的单域抗体,其特征在于:所述的单域抗体还包括框架区FR;所述框架区FR包括FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列;框架区FR的氨基酸序列分别为:
SEQ ID NO:11-13中的任意一条所示的FR1或FR1的变体,所述FR1的变体在所述FR1中包含至多5个氨基酸的替换;
SEQ ID NO:14-16中的任意一条所示的FR2或FR2的变体,所述FR2的变体在所述FR2中包含至多5个氨基酸的替换;
SEQ ID NO:17-20中的任意一条所示的FR3或FR3的变体,所述FR3的变体在所述FR3中包含至多5个氨基酸的替换;
SEQ ID NO:21所示的FR4或FR4的变体,所述FR4的变体在所述FR4中包含至多5个氨基酸的替换。
4.一种抗LAG3的单域抗体,其特征在于:所述单域抗体的氨基酸序列分别如SEQ IDNO:1-5中的任意一条所示,或者所述单域抗体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1-5中的任意一条相比,FR1、FR2、FR3或FR4序列中至少1个氨基酸残基被保守氨基酸取代。
5.权利要求1至4中任一项所述的抗LAG3的单域抗体的Fc融合抗体或人源化抗体。
6.一种重组蛋白,其特征在于,所述重组蛋白包含权利要求1至4中任一项所述的抗LAG3的单域抗体。
7.一种编码权利要求1至4中任一项所述的抗LAG3的单域抗体的核苷酸分子,其特征在于:其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:6-10中的任意一条所示,或者所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:6-10中的任意一条所编码的氨基酸序列相同。
8.一种表达载体,其特征在于:其包含编码权利要求1至4中任一项所述的抗LAG3的单域抗体或者权利要求7所述的Fc融合抗体或人源化抗体的核苷酸分子或者权利要求8所述的核苷酸分子。
9.一种宿主细胞,其特征在于:其可以表达出权利要求1至4中任一项所述的针对LAG3的单域抗体或权利要求5所述的Fc融合抗体或人源化抗体,或其包含权利要求8所述的表达载体。
10.一种药物组合物,其特征在于:所述的药物组合物包含选自权利要求1至4中任一项的抗LAG3的单域抗体,和药学上可接受的载体。
11.用于治疗疾病的药剂,其特征在于:其包含权利要求1至4中任一项的抗LAG3的单域抗体作为活性成分。
12.权利要求1至4中任一项所述的抗LAG3的单域抗体或权利要求10所述的药物组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
13.根据权利要求12所述的用途,其特征在于:所述疾病包括实体瘤、黑色素瘤、结直肠癌、转移性微卫星稳定结直肠癌、食管癌、胃癌、胶质母细胞瘤、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肾肿瘤、肝癌、霍奇金淋巴瘤、肝细胞癌、血液肿瘤、子宫内膜癌、胆道肿瘤、乳腺癌、肿瘤转移、弥漫性大B细胞淋巴瘤、卵巢癌、晚期头颈部鳞状细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310548234.9A CN116375875A (zh) | 2023-05-16 | 2023-05-16 | 一种抗lag3的单域抗体及其用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310548234.9A CN116375875A (zh) | 2023-05-16 | 2023-05-16 | 一种抗lag3的单域抗体及其用途 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116375875A true CN116375875A (zh) | 2023-07-04 |
Family
ID=86969602
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202310548234.9A Pending CN116375875A (zh) | 2023-05-16 | 2023-05-16 | 一种抗lag3的单域抗体及其用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN116375875A (zh) |
-
2023
- 2023-05-16 CN CN202310548234.9A patent/CN116375875A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
TWI718206B (zh) | Pd-l1抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途 | |
CN116162160A (zh) | 一种抗il-6的单域抗体及其用途 | |
CN110922482B (zh) | 可结合cd19的多肽及其应用 | |
CN114920838B (zh) | 一种抗il-17a的单域抗体及其用途 | |
CN115181182B (zh) | 一种人源化的抗cd25的单域抗体及其应用 | |
CN116162161A (zh) | 一种抗il-6r的单域抗体及其用途 | |
CN115181181B (zh) | 一种抗cd25的单域抗体及其应用 | |
CN113831411B (zh) | 针对l1cam的单域抗体及其衍生蛋白和应用 | |
CN114075282B (zh) | Il-5的结合分子及其制备方法和应用 | |
CN116262786A (zh) | 针对folr1的单域抗体及其衍生蛋白和应用 | |
CN111057154B (zh) | 基于驼源Fc片段的免疫原的制备及应用 | |
CN116375875A (zh) | 一种抗lag3的单域抗体及其用途 | |
CN114591432B (zh) | 抗TNFα的单域抗体及其用途 | |
CN118221817A (zh) | 一种抗cd155的单域抗体及其用途 | |
CN116063497A (zh) | 一种抗vegfr2的单域抗体及其用途 | |
CN114478777B (zh) | 针对gpa33的单域抗体及其衍生蛋白和应用 | |
CN117624360A (zh) | 一种抗trem2的单域抗体及其用途 | |
CN116789839A (zh) | 一种抗fgl1的单域抗体及其用途 | |
CN114380917B (zh) | 针对IL-17A和TNFα的双特异性单域抗体及其用途 | |
CN116715770A (zh) | 一种抗ephA2的单域抗体及其用途 | |
CN116143926A (zh) | 一种抗IL1RAcP的单域抗体及其用途 | |
CN114044826B (zh) | 针对EGFRvIII的单域抗体及其衍生蛋白和应用 | |
CN117659188A (zh) | 一种il-12的单域抗体及其用途 | |
CN117327176A (zh) | 一种抗tslp的单域抗体及其用途 | |
CN118290587A (zh) | 一种维生素d免疫检测抗体及其制备方法和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |