CN116789839A - 一种抗fgl1的单域抗体及其用途 - Google Patents
一种抗fgl1的单域抗体及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于免疫学领域,涉及一种抗FGL1的单域抗体及其用途。所述的单域抗体由重链构成,重链包括SEQ ID NO:40‑SEQ ID NO:48任意一条所示的重链CDR1、SEQ ID NO:49‑SEQ ID NO:53任意一条所示的重链CDR2和SEQ ID NO:54‑SEQ ID NO:61任意一条所示的重链CDR3。相对于现有技术,本发明的有益效果是:本发明使用生物基因工程技术筛选出特异性针对FGL1的单域抗体,抗体亲和力较好。
Description
技术领域
本发明涉及能够与FGL1特异性结合的单域抗体(以下,其缩写为“FGL1单域抗体”),以及含有该单域抗体作为有效成分的药物组合物,及其药物治疗用途。
背景技术
FGL1是一种约68KD大小的蛋白质,由二硫键连接的同型二聚体组成。其羧基末端包含β和γ亚单位,与纤维蛋白原高度同源。在正常生理条件下,FGL1主要由肝脏中的肝细胞分泌(其中一些可能也存在于胰腺中)。现在很清楚,FGL1是肝细胞再生的产物,参与肝细胞有丝分裂和肝能量利用(包括脂质代谢和血糖调节)。除了上述功能外,FGL1还可以作为急性反应物在血浆中检测到,这意味着肝脏分泌的FGL1不仅作用于肝细胞(自分泌),而且作用于其他组织,如肌肉和棕色脂肪组织。在代谢因素(高血糖、高血脂、激素等)的刺激下,肝脏分泌FGL1并通过血液循环作用于棕色脂肪组织,调节代谢并维持体温。此外,FGL1还作用于肌肉组织,影响成肌细胞对胰岛素的敏感性。
除了在肝脏和胰腺中相对较高的表达外,FGL1在肿瘤组织(包括肺、前列腺、黑色素瘤、结直肠、乳腺和脑肿瘤)中表达上调。因此,FGL1在临床实践中,特别是在非小细胞肺癌(NSCLC)的靶向治疗中,有可能成为另一个新的免疫检查点靶点。
最近,发现FGL1在人类癌细胞中高表达,并作为LAG3的抑制性配体发挥作用。在小鼠模型中,FGL1-LAG3相互作用的阻断可刺激肿瘤免疫力。另外,人类癌症患者中血浆FGL1的高水平与预后不良以及抗PD-1/PD-L1免疫疗法的耐药性有关。
发明内容
本专利的发明目的是提供一种能够与FGL1特异性结合的单域抗体及其用途。
本发明的第一方面提供了抗FGL1的单域抗体,所述的单域抗体由重链构成,重链包括SEQ ID NO:40-SEQ ID NO:48任意一条所示的重链CDR1、SEQ ID NO:49-SEQ ID NO:53任意一条所示的重链
CDR2和SEQ ID NO:54-SEQ ID NO:61任意一条所示的重链CDR3。
优选地,所述的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列为下述(1)-(10)的一种:
(1)SEQ ID NO:40所示的CDR1,SEQ ID NO:52所示的CDR2,SEQ ID NO:55所示的CDR3;
(2)SEQ ID NO:41所示的CDR1,SEQ ID NO:52所示的CDR2,SEQ ID NO:56所示的CDR3;
(3)SEQ ID NO:42所示的CDR1,SEQ ID NO:49所示的CDR2,SEQ ID NO:57所示的CDR3;
(4)SEQ ID NO:43所示的CDR1,SEQ ID NO:49所示的CDR2,SEQ ID NO:58所示的CDR3;
(5)SEQ ID NO:43所示的CDR1,SEQ ID NO:49所示的CDR2,SEQ ID NO:57所示的CDR3;
(6)SEQ ID NO:44所示的CDR1,SEQ ID NO:49所示的CDR2,SEQ ID NO:57所示的CDR3;
(7)SEQ ID NO:45所示的CDR1,SEQ ID NO:50所示的CDR2,SEQ ID NO:54所示的CDR3;
(8)SEQ ID NO:46所示的CDR1,SEQ ID NO:51所示的CDR2,SEQ ID NO:60所示的CDR3;
(9)SEQ ID NO:47所示的CDR1,SEQ ID NO:51所示的CDR2,SEQ ID NO:59所示的CDR3;
(10)SEQ ID NO:48所示的CDR1,SEQ ID NO:53所示的CDR2,SEQ ID NO:61所示的CDR3。
以上10种CDR组合(1)-(10)依次与单域抗体4F8,4A11,4G11,4H2,4H5,1H5,4E9,1B1,4E4,4B8对应。
上述所有序列,可以替换为与该序列具有“至少80%同源性”的序列或仅一个或少数几个氨基酸替换的序列;优选为“至少85%同源性”,更优选为“至少90%同源性”,更优选为“至少95%同源性”,最优选为“至少98%同源性”。
在一个实施方案中,其中所述重链CDR1、CDR2和CDR3的任何一个或多个CDR中,一个至五个任意氨基酸残基可以分别用其保守氨基酸取代。具体地,所述重链CDR1中,1至5个氨基酸残基可由其保守氨基酸替换;所述重链CDR2中,1至5个氨基酸残基可由其保守氨基酸替换;所述重链CDR3中,1至5个氨基酸残基可由其保守氨基酸替换。
如本文所用,术语“序列同源性”表示两个(核苷酸或氨基酸)序列在比对中在相同位置处具有相同残基的程度,并且通常表示为百分数。优选地,同源性在被比较的序列的整体长度上确定。因此,具有完全相同序列的两个拷贝具有100%同源性。
在一些实施例中,与前述序列相比仅仅替换一个或少数几个氨基酸的序列,例如,包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代,也可以实现发明目的。这些变异形式包括(但并不限于):一个或多个(通常为1-50个,较佳地1-30个,更佳地1-20个,最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代,以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内,较佳地为10个以内,更佳地为5个以内)氨基酸。实际上,在确定两个氨基酸序列之间的序列同源性程度或在确定单域抗体中的CDR1、CDR2和CDR3组合时,技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代,在取代情况下,所述取代将优选为保守氨基酸取代。所述保守氨基酸,其通常可以被描述为氨基酸残基被具有相似化学结构的另一个氨基酸残基替代的氨基酸取代,并且该取代对多肽的功能、活性或其它生物学性质几乎没有或基本上没有影响。所述保守氨基酸取代在本领域是通用的,例如保守氨基酸取代是以下(a)-(d)组内的一个或少数几个氨基酸被同一组内另一个或少数几个氨基酸所取代:(a)极性带负电残基及其不带电酰胺:Asp、Asn、Glu、Gln;(b)极性带正电残基:His、Arg、Lys;(c)芳香族残基:Phe、Trp、Tyr;(d)脂肪族非极性或弱极性残基:Ala、Ser、Thr、Gly、Pro、Met、Leu、Ile、Val、Cys。特别优选的保守氨基酸取代如下:Asp被Glu取代;Asn被Gln或His取代;Glu被Asp取代;Gln被Asn取代;His被Asn或Gln取代;Arg被Lys取代;Lys被Arg、Gln取代;Phe被Met、Leu、Tyr取代;Trp被Tyr取代;Tyr被Phe、Trp取代;Ala被Gly或Ser取代;Ser被Thr取代;Thr被Ser取代;Gly被Ala或Pro取代;Met被Leu、Tyr或Ile取代;Leu被Ile或Val取代;Ile被Leu或Val取代;Val被Ile或Leu取代;Cys被Ser取代。另外,本领域技术人员知晓,单域抗体的创造性体现在CDR1-3区,而框架区序列FR1-4并非是不可改变的,FR1-4的序列可以采取本发明公开的序列的保守序列变体。
本发明中的“抗FGL1的单域抗体”的含义,不仅包括完整的单域抗体,还包括所述抗FGL1的单域抗体的片段、衍生物和类似物。如本文所用,术语“片段”、“衍生物”和“类似物”含义相同,均是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽,而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的,或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽,或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物,例如聚乙二醇)融合所形成的多肽,或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列,或与Fc标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导,这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在一个优选实施方案中,所述的抗体序列还包括框架区FR;所述框架区FR包括FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列;框架区FR的氨基酸序列分别为:
SEQ ID NO:21-25中的任意一条所示的FR1或FR1的变体,所述FR1的变体在所述FR1中包含至多5个氨基酸的替换;
SEQ ID NO:26-31中的任意一条所示的FR2或FR2的变体,所述FR2的变体在所述FR2中包含至多5个氨基酸的替换;
SEQ ID NO:32-38中的任意一条所示的FR3或FR3的变体,所述FR3的变体在所述FR3中包含至多5个氨基酸的替换;
SEQ ID NO:39所示的FR4或FR4的变体,所述FR4的变体在所述FR4中包含至多5个氨基酸的替换。
本发明的第二方面是提供能结合FGL1的单域抗体的氨基酸序列,所述单域抗体的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-10所示,或者所述单域抗体与SEQ ID NO.1-10的氨基酸序列具有至少80%序列同源性,并且能够特异性结合FGL1蛋白,或者所述单域抗体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1-10中的任意一条相比,FR1、FR2、FR3或FR4序列中至少1个氨基酸残基被保守氨基酸取代。
在一个实施方案中,所述抗FGL1的单域抗体与选自SEQ ID NO:1-10的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%序列同源性,并且能够特异性结合FGL1蛋白。
本发明的第三个方面是提供前述任一的抗FGL1的单域抗体的Fc融合抗体或人源化抗体。
本发明的第四个方面是提供编码前述的抗FGL1的单域抗体或前述的Fc融合抗体或前述的人源化抗体的核苷酸分子,其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:11-20所示,或者所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:11-20中的任意一条所编码的氨基酸序列相同,或者与SEQ ID NO:11-20中的任意一条具有至少95%序列同源性。
在一个实施方案中,编码所述抗FGL1的单域抗体的核酸分子与选自SEQ ID NO:11-20的核苷酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%序列同源性,并且其编码的抗FGL1的单域抗体能够特异性结合FGL1蛋白。
本发明的第五个方面是提供一种表达载体,其包含编码抗FGL1的单域抗体或Fc融合抗体或人源化抗体的核苷酸分子,其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:11-20或所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:11-20中的任意一条所编码的氨基酸序列相同。
在一个优选的实施方案中,所使用的表达载体为RJK-V4-3(通过基因工程手段将编码抗FGL1的单域抗体或其Fc融合抗体或人源化抗体的核苷酸分子整合入RJK-V4-3中),根据需要还可以选择其他的通用型表达载体。
本发明的第六个方面是提供一种能够表达前述的抗FGL1的单域抗体、Fc融合抗体或人源化抗体的宿主细胞,或其包含前述的表达载体。优选宿主细胞为细菌细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
在另一个优选的实施方案中,所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞,包括细菌,真菌。
在另一个优选的实施方案中,所述的宿主细胞选自下组:大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞、噬菌体、或其组合。
在另一个优选的实施方案中,所述原核细胞选自下组:大肠杆菌、枯草杆菌、乳酸菌、链霉菌、奇异变形菌、或其组合。
在另一个优选的实施方案中,所述真核细胞选自下组:巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉、或其组合。
在另一个优选的实施方案中,所述真核细胞选自下组:草地粘虫等昆虫细胞、烟草等植物细胞、BHK细胞、CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞、或其组合。
在另一个优选的实施方案中,所述宿主细胞为悬浮ExpiCHO-S细胞。
在另一个优选的实施方案中,所述宿主细胞为悬浮293F细胞。
本发明的第七个方面是提供一种重组蛋白,包含前述的抗FGL1的单域抗体。所述的重组蛋白可以为前述的SEQ ID NO.1-10中所示的单域抗体,也可以为与SEQ ID NO.1-10中具有至少80%同源性的单域抗体,还可以是多表位抗体、多特异性抗体以及多价抗体;例如,所述的多表位抗体可由SEQ ID NO.1-10中的不止一条序列组成;所述的多价抗体可由SEQ ID NO.1-10中的其中一条序列重复排列若干次组成;所述的多特异性抗体包括但不限于前述的双特异性抗体,以及三特异性抗体;此外,重组蛋白可以为前述的抗体的片段、衍生物和类似物。
本发明的第八个方面是提供一种药物组合物,其包含前述的结合FGL1的单域抗体和药学上可接受的载体。通常,可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中,其中pH通常根据抗体的等电点确定(水性载体介质的pH需偏离该抗体的等电点,且与该抗体的等电点相差大约2)。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药,其中包括(但并不限于):静脉内、透皮(在患处直接涂抹或贴敷膏药)。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt%,较佳地0.01-90wt%,更佳地0.1-80wt%)的前述的单域抗体以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式,例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。
本发明的第九个方面是提供一种用于治疗疾病的药剂,其包含前述的用于结合FGL1蛋白的单域抗体作为活性成分。
本发明的第十个方面是提供一种检测FGL1水平的试剂盒,其含有前述的抗FGL1的单域抗体。在本发明的一个优选例中,所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。
在一个优选的实施方案中,该试剂盒包括识别FGL1蛋白的抗体,用于溶解样本的裂解介质,检测所需的通用试剂和缓冲液,如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
在一个优选的实施方案中,所述的试剂盒还含有第二抗体和用于检测的酶或荧光或放射标记物,以及缓冲液。
在一个优选的实施方案中,所述试剂盒的第二抗体可以为前述的抗FGL1的单域抗体的抗体(作为抗抗体),可以为单域抗体、单克隆抗体、多克隆抗体或抗体的其它任意形式。
本发明的第十一个方面,提供了一种产生抗FGL1的单域抗体的方法,包括步骤:
(a)在适合产生单域抗体的条件下,培养本发明的第六个方面所述的宿主细胞,从而
获得含所述抗FGL1的单域抗体的培养物;以及
(b)从所述培养物中分离或回收所述的抗FGL1的单域抗体;以及
(c)任选地,纯化和/或修饰步骤(b)中获得的FGL1的单域抗体。
本发明的第十二个方面是提供前述的抗FGL1的单域抗体或前述药物组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
在一个优选的实施方案中,所述疾病包括但不限于肺癌、前列腺癌、黑色素瘤、结直肠癌、乳腺癌和脑肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肝癌、恶性胶质瘤、头颈癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌、宫颈癌、食道癌、肉瘤、细胞瘤、肾脏癌、骨髓瘤、神经胶质瘤、白血病、淋巴瘤或其它FGL1异常表达的病症。
有益效果
相对于现有技术,本发明的有益效果是:
(1)本发明单域抗体特异性针对具有正确空间结构的FGL1蛋白。
(2)本发明得到的单域抗体,表达体系选择灵活,既可以在原核系统中表达也可以在酵母细胞或哺乳动物细胞的真核系统中表达,且其在原核表达系统中的表达成本低,可降低后期生产成本。
(3)本发明得到的单域抗体,其抗体的多组合形式改造简单,通过基因工程的方式简单的串联即可以获得多价、多特异性的抗体,并且其免疫异质性很低,在不经过人源化改造的情况下也不会产生较强的免疫反应。
(4)本发明得到单域抗体,其亲和力范围更为宽泛,在未进行亲和力成熟之前,其亲和力范围可以从nM级别至pM级别,为后期不同用途的抗体提供多个选择。
附图说明
为了更清楚地说明本申请的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,对于本领域普通技术人员而言,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例3中靶向FGL1抗体筛选的文库富集情况;
图2为实施例11中的抗体抗原结合量效曲线测定图(4F8、4B8);
图3为实施例11中的抗体抗原结合量效曲线测定图(4A11、4G11);
图4为实施例11中的抗体抗原结合量效曲线测定图(4H2);
图5为实施例11中的抗体抗原结合量效曲线测定图(4H5);
图6为实施例11中的抗体抗原结合量效曲线测定图(1H5);
图7为实施例11中的抗体抗原结合量效曲线测定图(4E9);
图8为实施例11中的抗体抗原结合量效曲线测定图(1B1);
图9为实施例11中的抗体抗原结合量效曲线测定图(4E4)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
如本文所用,“单域抗体”(sdAb,也被研发者Ablynx称为纳米抗体或VHH)是本领域技术人员公知的。单域抗体为其互补决定区是单域多肽的一部分的抗体。因此,单域抗体包含单个互补决定区(单个CDR1、单个CDR2和单个CDR3)。单域抗体的实例为仅有重链的抗体(该抗体天然不包含轻链)、衍生自常规抗体的单域抗体和工程化抗体。
单域抗体可以衍生自任何物种,包括小鼠、人、骆驼、美洲驼、山羊、兔和牛。例如,天然存在的VHH分子可以衍生自骆驼科物种(例如骆驼、单峰骆驼、美洲驼和原驼)提供的抗体。像完整的抗体一样,单域抗体能够选择性地结合特定抗原。单域抗体可以仅含有免疫球蛋白链的可变结构域,该结构域具有CDR1、CDR2和CDR3以及框架区。
如本文所用,术语“序列同源性”表示两个(核苷酸或氨基酸)序列在比对中在相同位置处具有相同残基的程度,并且通常表示为百分数。优选地,同源性在被比较的序列的整体长度上确定。因此,具有完全相同序列的两个拷贝具有100%同源性。
如本文所用,术语“Fc融合抗体”指利用基因工程技术将目标抗体的Fc段与某种具有生物学活性的功能蛋白分子融合而产生的新型蛋白。
术语“人源化抗体”是指将目标抗体(如动物抗体)的重链可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体,或将目标抗体的互补决定区(CDR1~3序列)移植至人抗体的可变区内,得到的抗体,或将目标抗体根据人抗体骨架区(FR1~4)的特征进行氨基酸的突变后获得的抗体。人源化抗体可用合成法或定点突变法。
本发明中,与本发明公开的CDR1-3的序列同源性高的序列,也可以得到针对FGL1的单域抗体。在一些实施例中,与SEQ ID NO.1-10中的序列具有“至少80%同源性”的序列,或者“至少85%同源性”、“至少90%同源性”、“至少95%同源性”、“至少98%同源性”的序列都可以实现发明目的。
在一些实施例中,与SEQ ID NO:1-10中的序列相比仅仅替换一个或少数几个氨基酸的序列,例如,包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代,也可以实现发明目的。实际上,在确定两个氨基酸序列之间的序列同源性程度或在确定单域抗体中的CDR1、CDR2和CDR3组合时,技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代,在取代情况下,所述取代将优选为保守氨基酸取代,所述保守氨基酸,其通常可以被描述为氨基酸残基被具有相似化学结构的另一个氨基酸残基替代的氨基酸取代,并且该取代对多肽的功能、活性或其它生物学性质几乎没有或基本上没有影响。所述保守氨基酸取代在本领域是通用的,例如保守氨基酸取代是以下(a)-(d)组内的一个或少数几个氨基酸被同一组内另一个或少数几个氨基酸所取代:(a)极性带负电残基及其不带电酰胺:Asp、Asn、Glu、Gln;(b)极性带正电残基:His、Arg、Lys;(c)芳香族残基:Phe、Trp、Tyr;(d)脂肪族非极性或弱极性残基:Ala、Ser、Thr、Gly、Pro、Met、Leu、Ile、Val、Cys。特别优选的保守氨基酸取代如下:Asp被Glu取代;Asn被Gln或His取代;Glu被Asp取代;Gln被Asn取代;His被Asn或Gln取代;Arg被Lys取代;Lys被Arg、Gln取代;Phe被Met、Leu、Tyr取代;Trp被Tyr取代;Tyr被Phe、Trp取代;Ala被Gly或Ser取代;Ser被Thr取代;Thr被Ser取代;Gly被Ala或Pro取代;Met被Leu、Tyr或Ile取代;Leu被Ile或Val取代;Ile被Leu或Val取代;Val被Ile或Leu取代;Cys被Ser取代。另外,本领域技术人员知晓,单域抗体的创造性体现在CDR1-3区,而框架区序列FR1-4并非是不可改变的,FR1-4的序列可以采取本发明公开的序列的保守序列变体。
本发明的优选宿主细胞为细菌细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
本专利是通过基因工程技术制备目标蛋白以及目标蛋白的截短体形式,然后将获得的抗原蛋白免疫内蒙古阿拉善双峰驼,通过多次免疫后,获得骆驼的外周血淋巴细胞或者脾细胞,通过基因工程的方式,将驼源抗体可变区编码序列重组到噬菌体展示载体中,通过噬菌体展示技术筛选出针对抗原蛋白的特异性抗体,并进一步检测其与抗原结合的能力以及在包括自身免疫疾病治疗中的应用。
现将上述技术方案拆分详解,以具体实施例的方式描述:
实施例1:人源FGL1重组胞外结构域蛋白的制备:
本专利中用到的人源重组胞外结构域蛋白为公司自己表达纯化获得,人源重组FGL1蛋白的表达载体设计方案具体如下:
(1)本专利中用到的人源重组胞外结构域蛋白为公司自己表达纯化获得,人源重组FGL1蛋白的表达载体设计方案具体如下:
在NCBI中检索获得FGL1的编码序列,其收录号为NM_004467.3,该序列编码产生的氨基酸序列登录号为NP_004458.3。
(2)利用基因合成的方式将编码FGL1全长(第1~312位氨基酸)的核苷酸序列克隆到载体pcDNA3.4中。将构建好的载体进行Sanger测序,比对原始序列,确认无误后,将该重组质粒进行大量抽提,去除内毒素,转染悬浮293F细胞进行目的蛋白表达和纯化,纯度达到90%以上,满足动物免疫要求。
实施例2:针对FGL1蛋白的单域抗体文库的构建:
将1mg实施例1中纯化获得的人源重组FGL1蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合,免疫一只内蒙古阿拉善双峰驼,每周免疫一次,共连续免疫7次,除首次免疫外,其余六次均是用1mg FGL1蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混合进行动物免疫,该免疫过程是为了集中刺激骆驼使其产生针对FGL1蛋白的抗体。
动物免疫结束后,抽取骆驼外周血淋巴细胞150mL,并提取细胞的RNA。利用提取的总RNA合成cDNA,并通过套式PCR反应以cDNA为模板扩增VHH(抗体重链可变区)。
然后利用限制性内切酶分别酶切pMECS载体和VHH片段,然后将酶切后的片段和载体链接。将连接后的片段电转化至感受态细胞TG1中,构建FGL1蛋白的噬菌体展示文库并测定库容,文库的库容大小约为1×109,同时,通过菌落PCR鉴定检测文库在目的片段的正确插入率。
结果显示,从文库中随机挑选的30个菌落进行PCR扩增后,有28个克隆可以扩增出大小为预测大小的条带,有2个克隆扩增出条带不正确,故正确插入率为28÷30×100%≈93%。
实施例3:针对FGL1蛋白的单域抗体筛选:
取200μL实施例2中的重组TG1细胞至2×TY培养基中培养,期间加入40μL辅助噬菌体VCSM13侵染TG1细胞,并培养过夜以扩增噬菌体,次日利用PEG/NaCl沉淀噬菌体,离心收集扩增噬菌体。
将稀释在100mM pH8.3的NaHCO3中的FGL1蛋白500μg偶联在酶标板上,4℃放置过夜,同时设立阴性对照孔(培养基对照);第二天加入200μL的3%的脱脂乳,室温封闭2h;封闭结束后,加入100μl扩增后噬菌体文库(大约2×1011个噬菌体颗粒),室温作用1h;作用1小时后,用PBS+0.05%Tween-20洗15遍,以洗掉未结合的噬菌体。
用终浓度为25mg/mL的胰蛋白酶将与FGL1蛋白特异性结合的噬菌体解离下,并感染处于对数生长期的大肠杆菌TG1细胞,37℃培养1h,产生并收集噬菌体用于下一轮的筛选,相同筛选过程重复1轮,逐步得到富集。
当富集倍数达到10倍以上时,富集效果如图1所示。
图1中,P/N=生物淘选中阳性孔洗脱下的噬菌体感染TG1细菌后生长的单克隆细菌数/阳性孔洗脱下的噬菌体感染TG1细菌后生长的单克隆细菌数,该参数在富集发生后会逐渐增大;I/E=生物淘选中每轮加入阳性孔的噬菌体总量/生物淘选中每轮从阳性孔洗脱出的噬菌体总量,该参数在富集发生后会逐渐趋近于1。
实施例4:用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选针对FGL1的特异性阳性克隆:
根据上述实施例3中的筛选方法对抗FGL1蛋白的单域抗体进行2轮筛选,抗FGL1蛋白的噬菌体富集因子达到10以上,筛选结束后,从筛选获得的阳性克隆中挑选384个单菌落分别接种于含100μg/mL氨苄青霉素的2×TY培养基的96深孔板中,并设置空白对照,37℃培养至对数期后,加入终浓度为1mM的IPTG,28℃培养过夜。
利用渗透涨破法获得粗提抗体;将FGL1重组蛋白分别释至100mM pH8.3的NaHCO3中并将100μg蛋白在酶标板(ELISA板)中4℃包被过夜。将获得的抗体粗提液取100μL转移至加入抗原的ELISA板上,室温孵育1h;用PBST洗去未结合的抗体,加入100μl经1:2000稀释后的Mouse Anti-HA tag Antibody(HRP)(鼠抗HA辣根过氧化物酶标记抗体,ThermoFisher),在室温孵育1h;用PBST洗去未结合的抗体,加入辣根过氧化物酶显色液,37℃下反应15min后,加入终止液,于酶标仪上450nm波长处,读取吸收值。
当样品孔OD值大于对照孔5倍以上时,判定为阳性克隆孔;将阳性克隆孔的菌转摇在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中以便提取质粒并进行测序。
根据序列比对软件VectorNTI分析各个克隆株的基因序列,把CDR1,CDR2和CDR3序列相同的株视为同一克隆株,而序列不同的株视为不同克隆株,最终获得特异性针对FGL1蛋白的单域抗体。
其抗体的氨基酸序列为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4结构,构成整个VHH。获得的单域抗体重组质粒可以在原核系统中进行表达,最终获得单域抗体蛋白。
10种单域抗体的CDR、FR序列如表1-7所示,10种单域抗体的氨基酸序列和核苷酸序列分别如表8、表9所示。
表1 10种抗体的CDR1序列
表2 10种抗体的CDR2序列
表3 10种抗体的CDR3序列
表4 10种抗体的FR1序列
表5 10种抗体的FR2序列
表6 10种抗体的FR3序列
表7 10种抗体的FR4序列
表8 10种抗体的氨基酸序列
表9 10种抗体的核酸序列
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实施例5:FGL1蛋白的特异性单域抗体在宿主菌大肠杆菌中的纯化及表达
将实施例4中测序分析所获得不同克隆株的质粒(pMECS-VHH)电转化到大肠杆菌HB2151中,并将其涂布在LB+amp+glucose即含有氨苄青霉素和葡萄糖的培养平板上,37℃培养过夜;挑选单个菌落接种在5mL含有氨苄青霉素的LB培养液中,37℃摇床培养过夜。
接种1mL的过夜培养菌种至330mLTB培养液中,37℃摇床培养,培养到OD600nm值达到0.6-0.9时,加入1M IPTG,28℃摇床培养过夜;离心,收集大肠杆菌,利用渗透涨破法,获得抗体粗提液;
通过镍柱亲和层析法纯化出抗体。
实施例6:抗FGL1的单域抗体的Fc融合抗体真核表达载体的构建
(1)将实施例4中获得的目标序列亚克隆至真核表达载体中:将实施例4中筛选出来的抗体经Sanger测序得到其核苷酸序列;
(2)通过序列合成的方式将上述核苷酸序列合成至本公司设计改造的载体RJK-V4-3中得到重组真核表达载体,该载体的改造方法如实施例10所述;
(3)将步骤(2)构建好的重组真核表达载体转化至DH5α大肠杆菌中,培养进行质粒抽提,去除内毒素;
(4)将抽提后的质粒再进行序列测序鉴定;
(5)将确定无误后的重组载体准备后续真核细胞转染表达,通过实施例7或8的方法将VHH的Fc蛋白表达后并通过实施例9的方法纯化上述抗体。
实施例7:抗FGL1蛋白的单域抗体在悬浮ExpiCHO-S细胞中表达
(1)转染前3天以2.5×105/mL细胞传代和扩大培养ExpiCHO-STM细胞,计算出的所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的120mL(终体积)的ExpiCHOTM表达培养基的500mL摇瓶中;使细胞浓度达到约4×106-6×106活细胞/mL;
(2)在转染前一天,将ExpiCHO-STM细胞稀释浓度至3.5×106活细胞/mL,使细胞过夜培养;
(3)转染当天,测定细胞密度和活细胞百分比。转染之前细胞密度应达到约7×106-10×106活细胞/mL;
(4)用预热至37℃新鲜的ExpiCHOTM表达培养基将细胞稀释至6×106个活细胞/mL。计算出的所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的100mL(终体积)的ExpiCHOTM表达培养基的500mL摇瓶中;
(5)使轻轻颠倒混匀ExpiFectamineTMCHO试剂,用3.7mL OptiPROTM培养基稀释ExpiFectamineTMCHO试剂,回荡或混匀;
(6)用冷藏的4mL OptiPROTM培养基稀释质粒DNA,回荡混匀;
(7)将ExpiFectamine CHO/质粒DNA(质粒DNA为实施例6制得的抗FGL1的单域抗体的Fc融合抗体真核表达载体)复合物室温孵育1-5分钟,然后轻轻加入制备的细胞悬液中,加入过程中轻轻回荡摇瓶;
(8)将细胞在37℃、8%CO2、加湿的空气中震荡培养;
(9)转染后第1天(18-22小时后)添加600ul ExpiFectamineTMCHO Enhancer和24mLExpiCHO feed。
(10)在转染后约8天(细胞活率低于70%)收集上清。
实施例8:抗FGL1蛋白的单域抗体在悬浮293F细胞中的表达
重组单域抗体表达实验流程(以500mL摇瓶为例):
(1)转染前3天以2.5×105/mL细胞传代和扩大培养293F细胞,计算出的所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的120mL(终体积)的OPM-293CD05Medium培养基的500mL摇瓶中。使细胞浓度达到约2×106-3×106活细胞/mL。
(2)转染当天,测定细胞密度和活细胞百分比。转染之前细胞密度应达到约2×106-3×106活细胞/mL。
(3)用预热的OPM-293CD05Medium将细胞稀释至1×106个活细胞/mL。计算出所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的100mL(终体积)的培养基的500mL摇瓶中。
(4)用4mL Opti-MEM培养基稀释PEI(1mg/mL)试剂,回荡或吹打混匀;用4mL Opt-MEM培养基稀释质粒DNA(质粒DNA为实施例6制得的抗FGL1的单域抗体的Fc融合抗体真核表达载体),回荡混匀,并用0.22um的滤头过滤。室温孵育5min。
(5)将稀释的PEI试剂加入稀释的DNA中,颠倒混匀。将PEI/质粒DNA复合物室温孵育15-20分钟,然后轻轻加入制备的细胞悬液中,加入过程中轻轻回荡摇瓶。
(6)将细胞在37℃、5%CO2、120rpm震荡培养。
(7)转染后第24h、72h添加5mL OPM-CHO PFF05补料。
(8)在转染后约7天(细胞活率低于70%)收集上清。
实施例9:抗FGL1蛋白的单域抗体的纯化
(1)将实施例7或8中获得蛋白表达上清用0.45μm的一次性滤头过滤除掉不可溶杂质;
(2)将上述滤液使用蛋白纯化仪进行亲和层析纯化,利用人源Fc与Protein A结合的能力,使用偶联Protein A的琼脂糖填料进行纯化;
(3)将滤液通过1mL/分钟的流速流穿Protein A预装柱,该步骤中滤液中的目标蛋白会与填料结合;
(4)通过低盐和高盐缓冲液将柱上结合的杂质蛋白洗涤;
(5)用低pH缓冲液将柱上结合的目标蛋白进行系统;
(6)将洗脱液迅速加入pH9.0的Tris-HCl溶液,进行中和;
(7)将上述中和后的蛋白溶液透析后,进行SDS-PAGE分析,确定蛋白纯度在95%以上,且浓度在0.5mg/mL以上后,低温保存备用。
实施例10:单域抗体真核表达载体RJK-V4-3的构建
所提及纳米抗体通用的目标载体RJK-V4-3,为本公司在invitrogen商业化载体pCDNA3.4(载体资料链接:https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_4_topo_ta_cloning_kit_man.pdf)的基础上融合了人源IgG4的重链编码序列中的Fc区段后改造而来的,即该载体包含了IgG4重链的铰链区(Hinge)CH2和CH3区。具体改造方案如下:
(1)选取pcDNA3.4上的限制性酶切位点XbaI和AgeI;
(2)在Fc片段编码序列的5’端和3’端通过重叠PCR的方式分别引入多克隆位点(MCS,Multiple Cloning Site)和6×His标签;
(3)使用分别带有XbaI和AgeI酶切位点的一对引物通过PCR的方式将上述片段扩增;
(4)使用限制性内切酶XbaI和AgeI分别酶切pcDNA3.4和(3)中的重组DNA片段;
(5)将酶切后的载体和插入片段在T4连接酶的作用下连接,然后将连接产物转化至大肠杆菌,扩增,测序核实,获得重组质粒。
实施例11:抗体的抗原结合量效曲线测定
本实施例采用标准酶联免疫吸附测定(ELISA)操作流程进行。
(1)包被50μL 1μg/mL人FGL1蛋白,4℃过夜。
(2)洗板;加入200μL 5%牛奶,37℃封闭2h。
(3)将VHH稀释至2ug/mL,然后5倍梯度稀释抗体共8个浓度梯度。这里的VHH指通过实施例5原核表达所得的单域抗体。
(4)洗板;加入50μL经步骤(3)稀释得到的单域抗体,两复孔,37℃孵育1h。
(5)洗板;加入50μL HRP-Goat anti hIgG二抗,37℃孵育30min。
(6)洗板(多洗几次);加入50μL预先恢复常温的TMB,避光常温反应15min。
(7)加入50μL终止液(1N HCl),酶标仪读数保存。
(8)绘制曲线,计算EC50,如图2-图9所示,其中hIgG指同型对照,不与任何靶标结合的免疫球蛋白分子,通过商品化购买得到。其中单域抗体4B9、3G10、1C12、2B11、1A9、1H11、4A6、1F11、4F7、4B10、3C3、4C2、4G3、4C10、3C9、1H3、1D11、1A11、1H2、1D1、3H4、1G3、2A2、3G8、1C10、1E12、4G2、3H1、1B4、3B5、1C6、1F3、1E10、3F6、1E2、1D6、3F5、4F1的序列未示出。
从图2-图9可知,单域抗体4F8,4A11,4G11,4H2,4H5,1H5,4E9,1B1,4E4,4B8均对FGL1抗原具有较高的亲和力和较强的特异性。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解,上述实施例不以任何形式限制本发明,凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案,均落在本发明的保护范围内。
Claims (13)
1.一种抗FGL1的单域抗体,其特征在于:所述的单域抗体由重链构成,重链包括SEQ IDNO:40-SEQ ID NO:48任意一条所示的重链CDR1、SEQ ID NO:49-SEQ ID NO:53任意一条所示的重链CDR2和SEQ ID NO:54-SEQ ID NO:61任意一条所示的重链CDR3。
2.根据权利要求1所述的FGL1的单域抗体,其特征在于:所述的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列为下述(1)-(10)的一种:
(1)SEQ ID NO:40所示的CDR1,SEQ ID NO:52所示的CDR2,SEQ ID NO:55所示的CDR3;
(2)SEQ ID NO:41所示的CDR1,SEQ ID NO:52所示的CDR2,SEQ ID NO:56所示的CDR3;
(3)SEQ ID NO:42所示的CDR1,SEQ ID NO:49所示的CDR2,SEQ ID NO:57所示的CDR3;
(4)SEQ ID NO:43所示的CDR1,SEQ ID NO:49所示的CDR2,SEQ ID NO:58所示的CDR3;
(5)SEQ ID NO:43所示的CDR1,SEQ ID NO:49所示的CDR2,SEQ ID NO:57所示的CDR3;
(6)SEQ ID NO:44所示的CDR1,SEQ ID NO:49所示的CDR2,SEQ ID NO:57所示的CDR3;
(7)SEQ ID NO:45所示的CDR1,SEQ ID NO:50所示的CDR2,SEQ ID NO:54所示的CDR3;
(8)SEQ ID NO:46所示的CDR1,SEQ ID NO:51所示的CDR2,SEQ ID NO:60所示的CDR3;
(9)SEQ ID NO:47所示的CDR1,SEQ ID NO:51所示的CDR2,SEQ ID NO:59所示的CDR3;
(10)SEQ ID NO:48所示的CDR1,SEQ ID NO:53所示的CDR2,SEQ ID NO:61所示的CDR3。
3.根据权利要求1所述的抗FGL1的单域抗体,其特征在于:所述的单域抗体还包括框架区FR;所述框架区FR包括FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列;框架区FR的氨基酸序列分别为:
SEQ ID NO:21-25中的任意一条所示的FR1或FR1的变体,所述FR1的变体在所述FR1中包含至多5个氨基酸的替换;
SEQ ID NO:26-31中的任意一条所示的FR2或FR2的变体,所述FR2的变体在所述FR2中包含至多5个氨基酸的替换;
SEQ ID NO:32-38中的任意一条所示的FR3或FR3的变体,所述FR3的变体在所述FR3中包含至多5个氨基酸的替换;
SEQ ID NO:39所示的FR4或FR4的变体,所述FR4的变体在所述FR4中包含至多5个氨基酸的替换。
4.一种抗FGL1的单域抗体,其特征在于:所述单域抗体的氨基酸序列分别如SEQ IDNO:1-10中的任意一条所示,或者所述单域抗体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1-10中的任意一条相比,FR1、FR2、FR3或FR4序列中至少1个氨基酸残基被保守氨基酸取代。
5.权利要求1至4中任一项所述的抗FGL1的单域抗体的Fc融合抗体或人源化抗体。
6.一种重组蛋白,其特征在于,所述重组蛋白包含权利要求1至4中任一项所述的抗FGL1的单域抗体。
7.一种编码权利要求1至4中任一项所述的抗FGL1的单域抗体的核苷酸分子,其特征在于:其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:11-20中的任意一条所示,或者所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:11-20中的任意一条所编码的氨基酸序列相同。
8.一种表达载体,其特征在于:其包含编码权利要求1至4中任一项所述的抗FGL1的单域抗体或者权利要求5所述的Fc融合抗体或人源化抗体的核苷酸分子或者权利要求8所述的核苷酸分子。
9.一种宿主细胞,其特征在于:其可以表达出权利要求1至4中任一项所述的针对FGL1的单域抗体或权利要求5所述的Fc融合抗体或人源化抗体,或其包含权利要求8所述的表达载体。
10.一种药物组合物,其特征在于:所述的药物组合物包含选自权利要求1至4中任一项的抗FGL1的单域抗体,和药学上可接受的载体。
11.用于治疗疾病的药剂,其特征在于:其包含权利要求1至4中任一项的抗FGL1的单域抗体作为活性成分。
12.权利要求1至4中任一项所述的抗FGL1的单域抗体或权利要求10所述的药物组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
13.根据权利要求12所述的用途,其特征在于:所述疾病包括肺癌、前列腺癌、黑色素瘤、结直肠癌、乳腺癌和脑肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肝癌、恶性胶质瘤、头颈癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌、宫颈癌、食道癌、肉瘤、细胞瘤、肾脏癌、骨髓瘤、神经胶质瘤、白血病、淋巴瘤或其它FGL1异常表达的病症。
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