CN117327176A - 一种抗tslp的单域抗体及其用途 - Google Patents

一种抗tslp的单域抗体及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于免疫学领域，涉及一种抗TSLP的单域抗体及其用途。所述的单域抗体由重链构成，重链包括SEQ ID NO:42‑SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:73中的任意一条所示的重链CDR1、SEQ ID NO:49‑SEQ ID NO:50中的任意一条所示的重链CDR2和SEQ ID NO:51‑SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:74‑SEQ ID NO:75中的任意一条所示的重链CDR3。相对于现有技术，本发明的有益效果是：本发明使用生物基因工程技术筛选出特异性针对TSLP的单域抗体，抗体亲和力较好。

Description

一种抗TSLP的单域抗体及其用途
技术领域
本发明涉及能够与TSLP特异性结合的单域抗体(以下，其缩写为“TSLP单域抗体”)，以及含有该单域抗体作为有效成分的药物组合物，及其药物治疗用途。
背景技术
胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)主要由非造血细胞如成纤维细胞、上皮细胞和不同类型的基质或基质样细胞产生。它主要影响骨髓细胞、诱导单核细胞释放T细胞虏获趋化因子和增强髓样(CD11c+)树突状细胞成熟。研究表明，TSLP还可激活位于表皮的特定树突状细胞亚群-朗格汉斯细胞的成熟。胸腺TSLP激活髓样和浆细胞样(CD123+)树突状细胞会导致调节性T细胞的产生。TSLP通过胸腺基质淋巴细胞受体CRLF2和IL-7Rα链组成的异源二聚体受体复合物产生信号。结合STAT5后就会诱导其发生磷酸化，进而导致上游转录因子的表达。研究表明，TSLP对淋巴细胞的发育、分化尤其对树突细胞的活化、分化起着重要的调控作用。
TSLP受体复合物是由TSLP受体(TSLPR)和IL-7受体α(IL-7Ra)组成的异源二聚体，主要在树突细胞、CD4+T细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞和2型先天性淋巴细胞(ILC2)上表达。TSLPR及IL-7Rα均最高表达的细胞为髓样树突状细胞。TSLP结合髓样树突状细胞表面受体后，树突状细胞分泌IL-8和eotaxin-2来募集嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞，分泌TARC和MDC来募集Th2细胞。另外，TSLP激活的DC细胞诱导CD4+T细胞向Th2细胞分化，Th2细胞能够产生IL4、IL-5、IL-13和TNF，这些细胞因子促进IgE，嗜酸性粒细胞和黏液的产生而启动变态反应，引发诸如哮喘、特应性皮炎等疾病。此外，TSLP在动物中诱导成纤维细胞的聚集及胶原蛋白的沉积，证实了其在增进纤维化病症的作用。
TSLP在变态反应性疾病的发展和维持中的作用在动物模型得到证实。TSLP信号传递缺陷的小鼠抵抗哮喘的发展，以抗体中和TSLP或其受体在鼠科或灵长类哮喘或鼻炎模型中是有效的。例如，在灵长类哮喘模型(对猪蛔虫(Ascarissuum)抗原天然敏感的食蟹猴)中以抗TSLPRmAb阻断TSLP降低了嗜酸性粒细胞气道阻力及IL13水平。
哮喘为常见的慢性疾病，在许多患者中可使用支气管扩张剂、吸入性或口服皮质类固醇来控制症状。然而，大多数中度和重度哮喘患者仍有症状或控制不当，影响生活质量且有明显的健康照护负担。特别是，许多患有严重哮喘的患者可能对高剂量的类固醇无反应或反应差。TSLP于哮喘患者肺部的上皮和固有层中过表达，即便是在采用高剂量吸入性皮质类固醇的患者中，TSLP也存在过表达。TSLP在哮喘中的重要性的有力支持数据来自抗TSLP单克隆抗体(AMG157/MEDI9929)在轻度哮喘患者的过敏原挑战研究：采用AMG157治疗6或12周(每月给药一次)后，在以FEV1及血液和痰中嗜酸性粒细胞计数和FeNO水平变化测量的早期和晚期反应中观察到显著的效用。
因此，制备能够特异性识别和结合TSLP的抗体在对涉及TSLP的疾病的诊断、治疗、预后等方面均具有重要意义。目前，现有技术中仍缺少亲和力强、具有药用价值的抗TSLP的单域抗体产品。
发明内容
本专利的发明目的是提供一种能够与TSLP特异性结合的单域抗体及其用途。
本发明的第一方面提供了抗TSLP的单域抗体，所述的单域抗体由重链构成，重链包括SEQ ID NO:42-SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:73中的任意一条所示的重链CDR1、SEQ IDNO:49-SEQ ID NO:50中的任意一条所示的重链CDR2和SEQ ID NO:51-SEQ ID NO:61或SEQID NO:74-SEQ ID NO:75中的任意一条所示的重链CDR3。抗TSLP的单域抗体即针对TSLP的单域抗体。
优选地，所述的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列为下述(1)-(15)的一种：
(1)SEQ ID NO:42所示的CDR1，SEQ ID NO:50所示的CDR2，SEQ ID NO:57所示的CDR3；
(2)SEQ ID NO:43所示的CDR1，SEQ ID NO:49所示的CDR2，SEQ ID NO:60所示的CDR3；
(3)SEQ ID NO:43所示的CDR1，SEQ ID NO:49所示的CDR2，SEQ ID NO:59所示的CDR3；
(4)SEQ ID NO:43所示的CDR1，SEQ ID NO:49所示的CDR2，SEQ ID NO:61所示的CDR3；
(5)SEQ ID NO:44所示的CDR1，SEQ ID NO:49所示的CDR2，SEQ ID NO:54所示的CDR3；
(6)SEQ ID NO:45所示的CDR1，SEQ ID NO:49所示的CDR2，SEQ ID NO:56所示的CDR3；
(7)SEQ ID NO:45所示的CDR1，SEQ ID NO:49所示的CDR2，SEQ ID NO:58所示的CDR3；
(8)SEQ ID NO:46所示的CDR1，SEQ ID NO:49所示的CDR2，SEQ ID NO:52所示的CDR3；
(9)SEQ ID NO:47所示的CDR1，SEQ ID NO:49所示的CDR2，SEQ ID NO:53所示的CDR3；
(10)SEQ ID NO:47所示的CDR1，SEQ ID NO:49所示的CDR2，SEQ ID NO:58所示的CDR3；
(11)SEQ ID NO:48所示的CDR1，SEQ ID NO:49所示的CDR2，SEQ ID NO:55所示的CDR3；
(12)SEQ ID NO:48所示的CDR1，SEQ ID NO:49所示的CDR2，SEQ ID NO:51所示的CDR3。
(13)SEQ ID NO:43所示的CDR1，SEQ ID NO:49所示的CDR2，SEQ ID NO:74所示的CDR3；
(14)SEQ ID NO:43所示的CDR1，SEQ ID NO:49所示的CDR2，SEQ ID NO:75所示的CDR3；
(15)SEQ ID NO:73所示的CDR1，SEQ ID NO:49所示的CDR2，SEQ ID NO:59所示的CDR3。
上述所有序列，可以替换为与该序列具有“至少80％同源性”的序列或仅一个或少数几个氨基酸替换的序列；优选为“至少85％同源性”，更优选为“至少90％同源性”，更优选为“至少95％同源性”，最优选为“至少98％同源性”。
在一个实施方案中，其中所述重链CDR1、CDR2和CDR3的任何一个或多个CDR中，一个至五个任意氨基酸残基可以分别用其保守氨基酸取代。具体地，所述重链CDR1中，1至5个氨基酸残基可由其保守氨基酸替换；所述重链CDR2中，1至5个氨基酸残基可由其保守氨基酸替换；所述重链CDR3中，1至5个氨基酸残基可由其保守氨基酸替换。
如本文所用，术语“序列同源性”表示两个(核苷酸或氨基酸)序列在比对中在相同位置处具有相同残基的程度，并且通常表示为百分数。优选地，同源性在被比较的序列的整体长度上确定。因此，具有完全相同序列的两个拷贝具有100％同源性。
在一些实施例中，与前述序列相比仅仅替换一个或少数几个氨基酸的序列，例如，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代，也可以实现发明目的。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。实际上，在确定两个氨基酸序列之间的序列同源性程度或在确定单域抗体中的CDR1、CDR2和CDR3组合时，技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，在取代情况下，所述取代将优选为保守氨基酸取代。所述保守氨基酸，其通常可以被描述为氨基酸残基被具有相似化学结构的另一个氨基酸残基替代的氨基酸取代，并且该取代对多肽的功能、活性或其它生物学性质几乎没有或基本上没有影响。所述保守氨基酸取代在本领域是通用的，例如保守氨基酸取代是以下(a)-(d)组内的一个或少数几个氨基酸被同一组内另一个或少数几个氨基酸所取代：(a)极性带负电残基及其不带电酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln；(b)极性带正电残基：His、Arg、Lys；(c)芳香族残基：Phe、Trp、Tyr；(d)脂肪族非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Gly、Pro、Met、Leu、Ile、Val、Cys。特别优选的保守氨基酸取代如下：Asp被Glu取代；Asn被Gln或His取代；Glu被Asp取代；Gln被Asn取代；His被Asn或Gln取代；Arg被Lys取代；Lys被Arg、Gln取代；Phe被Met、Leu、Tyr取代；Trp被Tyr取代；Tyr被Phe、Trp取代；Ala被Gly或Ser取代；Ser被Thr取代；Thr被Ser取代；Gly被Ala或Pro取代；Met被Leu、Tyr或Ile取代；Leu被Ile或Val取代；Ile被Leu或Val取代；Val被Ile或Leu取代；Cys被Ser取代。另外，本领域技术人员知晓，框架区序列FR1-4并非是不可改变的，FR1-4的序列可以采取本发明公开的序列的保守序列变体。
本发明中的“抗TSLP的单域抗体”的含义，不仅包括完整的单域抗体，还包括所述抗TSLP的单域抗体的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”含义相同，均是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与Fc标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在一个优选实施方案中，所述的抗体序列还包括框架区FR；所述框架区FR包括FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列；框架区FR的氨基酸序列分别为：
SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29-32中的任意一条所示的FR1或FR1的变体，所述FR1的变体在所述FR1中包含至多5个氨基酸的替换；
SEQ ID NO:33-36中的任意一条所示的FR2或FR2的变体，所述FR2的变体在所述FR2中包含至多5个氨基酸的替换；
SEQ ID NO:37-40中的任意一条所示的FR3或FR3的变体，所述FR3的变体在所述FR3中包含至多5个氨基酸的替换；
SEQ ID NO:41所示的FR4或FR4的变体，所述FR4的变体在所述FR4中包含至多5个氨基酸的替换。
在一个优选实施方案中，框架区FR的氨基酸序列分别为：
SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:30中的任意一条所示的FR1或FR1的变体，所述FR1的变体在所述FR1中包含至多5个氨基酸的替换；
SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:35中的任意一条所示的FR2或FR2的变体，所述FR2的变体在所述FR2中包含至多5个氨基酸的替换；
SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:39中的任意一条所示的FR3或FR3的变体，所述FR3的变体在所述FR3中包含至多5个氨基酸的替换；
SEQ ID NO:41所示的FR4或FR4的变体，所述FR4的变体在所述FR4中包含至多5个氨基酸的替换。
本发明的第二方面是提供能结合TSLP的单域抗体的氨基酸序列，所述单域抗体的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-13所示，或者所述单域抗体与SEQ ID NO.1-13的氨基酸序列具有至少80％序列同源性，并且能够特异性结合TSLP蛋白。
或，所述单域抗体的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.62-66中的任意一条所示，或者所述单域抗体与SEQ ID NO.62-66的氨基酸序列具有至少80％序列同源性，并且能够特异性结合TSLP蛋白。
在一个实施方案中，所述抗TSLP的单域抗体与选自SEQ ID NO：1-13或SEQ ID NO：62-66的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同源性，并且能够特异性结合TSLP蛋白。
本发明的第三个方面是提供前述任一的抗TSLP的单域抗体的Fc融合抗体或人源化抗体。
本发明的第四个方面是提供编码前述的抗TSLP的单域抗体或前述的Fc融合抗体或前述的人源化抗体的核苷酸分子，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：14-26所示，或者与SEQ ID NO：14-26中的任意一条具有至少95％序列同源性；或其核苷酸序列分别如SEQ IDNO：67-71所示，或者与SEQ ID NO：67-71中的任意一条具有至少95％序列同源性。
在一个实施方案中，编码所述抗TSLP的单域抗体的核酸分子与选自SEQ ID NO：14-26或选自SEQ ID NO：67-71核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同源性，并且其编码的抗TSLP的单域抗体能够特异性结合TSLP蛋白。
本发明的第五个方面是提供一种表达载体，其包含编码抗TSLP的单域抗体或Fc融合抗体或人源化抗体的核苷酸分子，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：14-26或SEQ ID NO：67-71所示。
在一个优选的实施方案中，所使用的表达载体为RJK-V4-hFC1(通过基因工程手段将编码抗TSLP的单域抗体或其Fc融合抗体或人源化抗体的核苷酸分子整合入RJK-V4-hFC1中)，根据需要还可以选择其他的通用型表达载体。
本发明的第六个方面是提供一种能够表达前述的抗TSLP的单域抗体、Fc融合抗体或人源化抗体的宿主细胞，或其包含前述的表达载体。优选宿主细胞为细菌细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
在另一个优选的实施方案中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞，包括细菌，真菌。
在另一个优选的实施方案中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞、噬菌体、或其组合。
在另一个优选的实施方案中，所述原核细胞选自下组：大肠杆菌、枯草杆菌、乳酸菌、链霉菌、奇异变形菌、或其组合。
在另一个优选的实施方案中，所述真核细胞选自下组：巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉、或其组合。
在另一个优选的实施方案中，所述真核细胞选自下组：草地粘虫等昆虫细胞、烟草等植物细胞、BHK细胞、CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞、或其组合。
在另一个优选的实施方案中，所述宿主细胞为悬浮ExpiCHO-S细胞。
在另一个优选的实施方案中，所述宿主细胞为悬浮293F细胞。
本发明的第七个方面是提供一种重组蛋白，包含前述的抗TSLP的单域抗体。所述的重组蛋白可以为前述的SEQ ID NO.1-13或SEQ ID NO.62-66中所示的单域抗体，也可以为与SEQ ID NO.1-13或SEQ ID NO.62-66中具有至少80％同源性的单域抗体，还可以是多表位抗体、多特异性抗体以及多价抗体；例如，所述的多表位抗体可由SEQ ID NO.1-13或SEQ ID NO.62-66中的不止一条序列组成；所述的多价抗体可由SEQ ID NO.1-13或SEQ IDNO.62-66中的其中一条序列重复排列若干次组成；所述的多特异性抗体包括但不限于前述的双特异性抗体，以及三特异性抗体；此外，重组蛋白可以为前述的抗体的片段、衍生物和类似物。
本发明的第八个方面是提供一种药物组合物，其包含前述的结合TSLP的单域抗体和药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常根据抗体的等电点确定(水性载体介质的pH需偏离该抗体的等电点，且与该抗体的等电点相差大约2)。
本发明的药物组合物可直接用于结合TSLP蛋白分子，因而可用于治疗哮喘等变态反应性疾病。此外，还可同时与其他哮喘治疗剂联合使用。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的前述的单域抗体以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。
本发明的第九个方面是提供一种用于治疗哮喘的药剂，其包含前述的用于结合TSLP蛋白的单域抗体作为活性成分。
本发明的第十个方面是提供一种检测TSLP水平的试剂盒，其含有前述的抗TSLP的单域抗体。在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。
在一个优选的实施方案中，该试剂盒包括识别TSLP蛋白的抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
在一个优选的实施方案中，所述的试剂盒还含有第二抗体和用于检测的酶或荧光或放射标记物，以及缓冲液。
在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的第二抗体可以为前述的抗TSLP的单域抗体的抗体(作为抗抗体)，可以为单域抗体、单克隆抗体、多克隆抗体或抗体的其它任意形式。
本发明的第十一个方面，提供了一种产生抗TSLP的单域抗体的方法，包括步骤：
(a)在适合产生单域抗体的条件下，培养本发明的第六个方面所述的宿主细胞，从而
获得含所述抗TSLP的单域抗体的培养物；以及
(b)从所述培养物中分离或回收所述的抗TSLP的单域抗体；以及
(c)任选地，纯化和/或修饰步骤(b)中获得的TSLP的单域抗体。
本发明的第十二个方面是提供前述的抗TSLP的单域抗体或前述药物组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
在一个优选的实施方案中，所述疾病为哮喘、过敏性哮喘、鼻息肉、鼻窦炎、慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉、慢性荨麻疹、慢性自发性荨麻疹、慢性阻塞性肺疾病、支气管疾病、超敏反应、速发型超敏反应、肺部疾病、阻塞性肺疾病、呼吸道过敏、嗜酸性粒细胞性食管炎或特应性皮炎。
有益效果
相对于现有技术，本发明的有益效果是：
(1)本发明单域抗体特异性针对具有正确空间结构的TSLP蛋白。
(2)本发明得到的单域抗体，表达体系选择灵活，既可以在原核系统中表达也可以在酵母细胞或哺乳动物细胞的真核系统中表达，且其在原核表达系统中的表达成本低，可降低后期生产成本。
(3)本发明得到的单域抗体，其抗体的多组合形式改造简单，通过基因工程的方式简单的串联即可以获得多价、多特异性的抗体，并且其免疫异质性很低，在不经过人源化改造的情况下也不会产生较强的免疫反应。
(4)本发明得到单域抗体，其亲和力范围更为宽泛，在未进行亲和力成熟之前，其亲和力范围可以从nM级别至pM级别，为后期不同用途的抗体提供多个选择。
附图说明
为了更清楚地说明本申请的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例3中靶向TSLP抗体筛选的文库富集情况；
图2、图3、图4、图5均为实施例12中的抗体抗原结合量效曲线测定图(一部分克隆)；
图6、图7、图8、图9均为实施例12中的抗体抗原结合量效曲线测定图(另一部分克隆、Tab、hIgG)；
图10、图11、图12、图13、图14、图15、图16、图17均为抗体(真核样品)中和诱导TSLPR-IL7R-BaF3细胞增殖的结果图(第一批样品、Tab、hIgG)；
图18、图19、图20、图21、图22、图23、图24均为抗体(真核样品)中和诱导TSLPR-IL7R-BaF3细胞增殖的结果图(第二批样品、Tab、hIgG)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
如本文所用，“单域抗体”(sdAb，也被研发者Ablynx称为纳米抗体或VHH)是本领域技术人员公知的。单域抗体为其互补决定区是单域多肽的一部分的抗体。因此，单域抗体包含单个互补决定区(单个CDR1、单个CDR2和单个CDR3)。单域抗体的实例为仅有重链的抗体(该抗体天然不包含轻链)、衍生自常规抗体的单域抗体和工程化抗体。
单域抗体可以衍生自任何物种，包括小鼠、人、骆驼、美洲驼、山羊、兔和牛。例如，天然存在的VHH分子可以衍生自骆驼科物种(例如骆驼、单峰骆驼、美洲驼和原驼)提供的抗体。像完整的抗体一样，单域抗体能够选择性地结合特定抗原。单域抗体可以仅含有免疫球蛋白链的可变结构域，该结构域具有CDR1、CDR2和CDR3以及框架区。
如本文所用，术语“Fc融合抗体”指利用基因工程技术将目标抗体的Fc段与某种具有生物学活性的功能蛋白分子融合而产生的新型蛋白。
术语“人源化抗体”是指将目标抗体(如动物抗体)的重链可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体，或将目标抗体的互补决定区(CDR1～3序列)移植至人抗体的可变区内，得到的抗体，或将目标抗体根据人抗体骨架区(FR1～4)的特征进行氨基酸的突变后获得的抗体。人源化抗体可用合成法或定点突变法。
本发明中，与本发明公开的CDR1-3的序列同源性高的序列，也可以得到针对TSLP的单域抗体。在一些实施例中，与SEQ ID NO：1-13、SEQ ID NO：62-66中的序列具有“至少80％同源性”的序列，或者“至少85％同源性”、“至少90％同源性”、“至少95％同源性”、“至少98％同源性”的序列都可以实现发明目的。
本发明的优选宿主细胞为细菌细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
本专利是通过基因工程技术制备目标蛋白以及目标蛋白的截短体形式，然后将获得的抗原蛋白免疫内蒙古阿拉善双峰驼，通过多次免疫后，获得骆驼的外周血淋巴细胞或者脾细胞，通过基因工程的方式，将驼源抗体可变区编码序列重组到噬菌体展示载体中，通过噬菌体展示技术筛选出针对抗原蛋白的特异性抗体，并进一步检测其与抗原结合的能力以及在包括变态反应性疾病治疗中的应用。
现将上述技术方案拆分详解，以具体实施例的方式描述：
实施例1：人源TSLP蛋白的制备：
本专利中用到的人源TSLP蛋白为公司自己表达纯化获得，人源TSLP蛋白表达载体设计方案具体如下：
(1)在NCBI中检索获得TSLP的编码序列，其收录号为NM_033035.4，该序列编码产生的氨基酸序列登录号为NP_149024.1。靶点全称Thymic stromal lymphopoietin，Uniprot收录号为Q969D9。
(2)利用基因合成的方式将编码TSLP蛋白的全长核苷酸序列克隆到载体pcDNA3.4中。
(3)将构建好的载体进行Sanger测序，比对原始序列，确认无误后，将该重组质粒进行批量抽提，去除内毒素，转染悬浮293F进行目的蛋白的表达、纯化，纯化后的蛋白纯度高达90％，满足动物免疫的需求。
实施例2：针对TSLP蛋白的单域抗体文库的构建：
将1mg实施例1中纯化获得的人源重组TSLP蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合，免疫一只内蒙古阿拉善双峰驼，每周免疫一次，共连续免疫7次，除首次免疫外，其余六次均是用1mg TSLP蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混合进行动物免疫，该免疫过程是为了集中刺激骆驼使其产生针对TSLP蛋白的抗体。
动物免疫结束后，抽取骆驼外周血淋巴细胞150mL，并提取细胞的RNA。利用提取的总RNA合成cDNA，并通过套式PCR反应以cDNA为模板扩增VHH(抗体重链可变区)。
然后利用限制性内切酶分别酶切pMECS载体和VHH片段，然后将酶切后的片段和载体链接。将连接后的片段电转化至感受态细胞TG1中，构建TSLP蛋白的噬菌体展示文库并测定库容，文库的库容大小约为1×109，同时，通过菌落PCR鉴定检测文库在目的片段的正确插入率。
结果显示，从文库中随机挑选的30个菌落进行PCR扩增后，有27个克隆可以扩增出大小为预测大小的条带，有3个克隆扩增出条带不正确，故正确插入率为27÷30×100％≈90％。
实施例3：针对TSLP蛋白的单域抗体筛选：
取200μL实施例2中的重组TG1细胞至2×TY培养基中培养，期间加入40μL辅助噬菌体VCSM13侵染TG1细胞，并培养过夜以扩增噬菌体，次日利用PEG/NaCl沉淀噬菌体，离心收集扩增噬菌体。
将稀释在100mM pH8.3的NaHCO3中的TSLP蛋白500μg偶联在酶标板上，4℃放置过夜，同时设立阴性对照孔(培养基对照)；第二天加入200μL的3％的脱脂乳，室温封闭2h；封闭结束后，加入100μl扩增后噬菌体文库(大约2×1011个噬菌体颗粒)，室温作用1h；作用1小时后，用PBS+0.05％Tween-20洗15遍，以洗掉未结合的噬菌体。
用终浓度为25mg/mL的胰蛋白酶将与TSLP蛋白特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数生长期的大肠杆菌TG1细胞，37℃培养1h，产生并收集噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复1轮，逐步得到富集。
当富集倍数达到10倍以上时，富集效果如图1所示。
图1中，P/N＝生物淘选中阳性孔洗脱下的噬菌体感染TG1细菌后生长的单克隆细菌数/阳性孔洗脱下的噬菌体感染TG1细菌后生长的单克隆细菌数，该参数在富集发生后会逐渐增大；I/E＝生物淘选中每轮加入阳性孔的噬菌体总量/生物淘选中每轮从阳性孔洗脱出的噬菌体总量，该参数在富集发生后会逐渐趋近于1。
实施例4：用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选针对TSLP的特异性阳性克隆:
根据上述实施例3中的筛选方法对抗TSLP蛋白的单域抗体进行3轮筛选，抗TSLP蛋白的噬菌体富集因子达到10以上，筛选结束后，从筛选获得的阳性克隆中挑选384个单菌落分别接种于含100μg/mL氨苄青霉素的2×TY培养基的96深孔板中，并设置空白对照，37℃培养至对数期后，加入终浓度为1mM的IPTG，28℃培养过夜。
利用渗透涨破法获得粗提抗体；将TSLP重组蛋白分别释至100mM pH8.3的NaHCO3中并将100μg蛋白在酶标板(ELISA板)中4℃包被过夜。将获得的抗体粗提液取100μL转移至加入抗原的ELISA板上，室温孵育1h；用PBST洗去未结合的抗体，加入100μl经1:2000稀释后的Mouse Anti-HA tag Antibody(HRP)(鼠抗HA辣根过氧化物酶标记抗体，ThermoFisher)，在室温孵育1h；用PBST洗去未结合的抗体，加入辣根过氧化物酶显色液，37℃下反应15min后，加入终止液，于酶标仪上450nm波长处，读取吸收值。
当样品孔OD值大于对照孔5倍以上时，判定为阳性克隆孔；将阳性克隆孔的菌转摇在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中以便提取质粒并进行测序。
根据序列比对软件VectorNTI分析各个克隆株的基因序列，把CDR1，CDR2和CDR3序列相同的株视为同一克隆株，而序列不同的株视为不同克隆株，最终获得特异性针对TSLP蛋白的单域抗体(包括1A6，1A7，1D1，1F3，1F9，1H5，2D10，2H3，4A1，4B2，4F3，1B7，2G5，214D11，21H6，212C7，27H4，23G12，以及未示出序列的抗体克隆1F2、1A4、1B10、1C5、1D8、1E3、1F7、1F11、2A9、2B8、2D1、23G1、26A7、26C1、27E2、27F5、29G1、211C3、212C10、212D1、21A12、21B7、21G3、23C10、211B5、21H10、213B6、22B5)。
其抗体的氨基酸序列为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4结构，构成整个VHH。获得的单域抗体重组质粒可以在原核系统中进行表达，最终获得单域抗体蛋白。
第一批次的单域抗体1A6，1A7，1B7，1D1，1F3，1F9，1H5，2D10，2G5，2H3，4A1，4B2，4F3的氨基酸序列依次为SEQ ID NO:1-13所示，其核苷酸序列依次为SEQ ID NO:14-26所示。第二批次的单域抗体212C7，214D11，21H6，23G12，27H4的氨基酸序列依次为SEQ ID NO:62-66所示，其核苷酸序列依次为SEQ ID NO:67-71所示。
18种单域抗体的CDR、FR序列如表1-7所示。由于将单域抗体样品分成第一批次和第二批次进行实验，且针对第一批次抗体、第二批次抗体分别列出其FR、CDR，故第一批次中的FR序列、CDR序列与第二批次的FR序列、CDR序列部分相同。
表1 18种单域抗体的CDR1序列
表2 18种单域抗体的CDR2序列
表3 18种单域抗体的CDR3序列
表4 18种单域抗体的FR1序列
表5 18种单域抗体的FR2序列
表6 18种单域抗体的FR3序列
表7 18种单域抗体的FR4序列
实施例5：TSLP蛋白的特异性单域抗体在宿主菌大肠杆菌中的纯化及表达
将实施例4中测序分析所获得不同克隆株的质粒(pMECS-VHH)电转化到大肠杆菌HB2151中，并将其涂布在LB+amp+glucose即含有氨苄青霉素和葡萄糖的培养平板上，37℃培养过夜；挑选单个菌落接种在5mL含有氨苄青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜。
接种1mL的过夜培养菌种至330mLTB培养液中，37℃摇床培养，培养到OD600nm值达到0.6-0.9时，加入1M IPTG，28℃摇床培养过夜；离心，收集大肠杆菌，利用渗透涨破法，获得抗体粗提液；
通过镍柱亲和层析法纯化出抗体。
实施例6：抗TSLP的单域抗体的Fc融合抗体真核表达载体的构建
(1)将实施例4中获得的目标序列亚克隆至真核表达载体中：将实施例4中筛选出来的抗体经Sanger测序得到其核苷酸序列；
(2)通过序列合成的方式将上述核苷酸序列(SEQ ID:14-26、SEQ ID:67-71以及其他未示出序列的抗体的核苷酸序列)克隆至本公司设计改造的载体RJK-V4-hFC1中得到重组真核表达载体，该载体的改造方法如实施例10所述；
(3)将步骤(2)构建好的重组真核表达载体转化至DH5α大肠杆菌中，培养进行质粒抽提，去除内毒素；
(4)将抽提后的质粒再进行序列测序鉴定；
(5)将确定无误后的重组载体准备后续真核细胞转染表达，通过实施例7或8的方法将VHH的Fc蛋白表达后并通过实施例9的方法纯化上述抗体。
实施例7：抗TSLP蛋白的单域抗体在悬浮ExpiCHO-S细胞中表达
(1)转染前3天以2.5×105/mL细胞传代和扩大培养ExpiCHO-STM细胞，计算出的所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的120mL(终体积)的ExpiCHOTM表达培养基的500mL摇瓶中；使细胞浓度达到约4×106-6×106活细胞/mL；
(2)在转染前一天，将ExpiCHO-STM细胞稀释浓度至3.5×106活细胞/mL，使细胞过夜培养；
(3)转染当天，测定细胞密度和活细胞百分比。转染之前细胞密度应达到约7×106-10×106活细胞/mL；
(4)用预热至37℃新鲜的ExpiCHOTM表达培养基将细胞稀释至6×106个活细胞/mL。计算出的所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的100mL(终体积)的ExpiCHOTM表达培养基的500mL摇瓶中；
(5)使轻轻颠倒混匀ExpiFectamineTMCHO试剂，用3.7mL OptiPROTM培养基稀释ExpiFectamineTMCHO试剂，回荡或混匀；
(6)用冷藏的4mL OptiPROTM培养基稀释质粒DNA，回荡混匀；
(7)将ExpiFectamine CHO/质粒DNA(质粒DNA为实施例6制得的抗TSLP的单域抗体的Fc融合抗体真核表达载体)复合物室温孵育1-5分钟，然后轻轻加入制备的细胞悬液中，加入过程中轻轻回荡摇瓶；
(8)将细胞在37℃、8％CO2、加湿的空气中震荡培养；
(9)转染后第1天(18-22小时后)添加600ul ExpiFectamineTMCHO Enhancer和24mLExpiCHO feed。
(10)在转染后约8天(细胞活率低于70％)收集上清。
实施例8：抗TSLP蛋白的单域抗体在悬浮293F细胞中的表达
重组单域抗体表达实验流程(以500mL摇瓶为例)：
(1)转染前3天以2.5×105/mL细胞传代和扩大培养293F细胞，计算出的所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的120mL(终体积)的OPM-293CD05 Medium培养基的500mL摇瓶中。使细胞浓度达到约2×106-3×106活细胞/mL。
(2)转染当天，测定细胞密度和活细胞百分比。转染之前细胞密度应达到约2×106-3×106活细胞/mL。
(3)用预热的OPM-293CD05 Medium将细胞稀释至1×106个活细胞/mL。计算出所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的100mL(终体积)的培养基的500mL摇瓶中。
(4)用4mL Opti-MEM培养基稀释PEI(1mg/mL)试剂，回荡或吹打混匀；用4mL Opt-MEM培养基稀释质粒DNA(质粒DNA为实施例6制得的抗TSLP的单域抗体的Fc融合抗体真核表达载体)，回荡混匀，并用0.22um的滤头过滤。室温孵育5min。
(5)将稀释的PEI试剂加入稀释的DNA中，颠倒混匀。将PEI/质粒DNA复合物室温孵育15-20分钟，然后轻轻加入制备的细胞悬液中，加入过程中轻轻回荡摇瓶。
(6)将细胞在37℃、5％CO2、120rpm震荡培养。
(7)转染后第24h、72h添加5mL OPM-CHO PFF05补料。
(8)在转染后约7天(细胞活率低于70％)收集上清。
实施例9：抗TSLP蛋白的单域抗体的纯化
(1)将实施例7或8中获得蛋白表达上清用0.45μm的一次性滤头过滤除掉不可溶杂质；
(2)将上述滤液使用蛋白纯化仪进行亲和层析纯化，利用人源Fc与Protein A结合的能力，使用偶联Protein A的琼脂糖填料进行纯化；
(3)将滤液通过1mL/分钟的流速流穿Protein A预装柱，该步骤中滤液中的目标蛋白会与填料结合；
(4)通过低盐和高盐缓冲液将柱上结合的杂质蛋白洗涤；
(5)用低pH缓冲液将柱上结合的目标蛋白进行系统；
(6)将洗脱液迅速加入pH9.0的Tris-HCl溶液，进行中和；
(7)将上述中和后的蛋白溶液透析后，进行SDS-PAGE分析，确定蛋白纯度在95％以上，且浓度在0.5mg/mL以上后，低温保存备用。
实施例10：单域抗体真核表达载体RJK-V4-hFC1的构建
所提及纳米抗体通用的目标载体RJK-V4-hFC1，为本公司在invitrogen商业化载体pCDNA3.4(载体资料链接：https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_4_topo_ta_cloning_kit_man.pdf)的基础上融合了人源IgG1的重链编码序列中的Fc区段后改造而来的，即该载体包含了IgG1重链的铰链区(Hinge)CH2和CH3区。具体改造方案如下：
(1)选取pcDNA3.4上的限制性酶切位点XbaI和AgeI；
(2)在Fc片段编码序列的5’端和3’端通过重叠PCR的方式分别引入多克隆位点(MCS，Multiple Cloning Site)和6×His标签；
(3)使用分别带有XbaI和AgeI酶切位点的一对引物通过PCR的方式将上述片段扩增；
(4)使用限制性内切酶XbaI和AgeI分别酶切pcDNA3.4和(3)中的重组DNA片段；
(5)将酶切后的载体和插入片段在T4连接酶的作用下连接，然后将连接产物转化至大肠杆菌，扩增，测序核实，获得重组质粒。
实施例11：靶向人源TSLP的工具抗体(Tool antibody,Tab)的表达和纯化
本文中，Tab1为tezepelumab，序列来自IMGT；Tab2(TSLP Fab1)按照US10000561B2中的方法合成。
将搜索到的序列委托通用生物系统(安徽)有限公司进行哺乳动物细胞表达系统密码子优化，并克隆至pcDNA3.1载体。经过抗性筛选，选择质粒阳性菌扩增，使用质粒中提试剂盒(Macherey Nagel,Cat#740412.50)抽提质粒。按照每100mL细胞加入100μg质粒(40μg重链+60μg轻链)，使用PEI在293F细胞(培养基：FreeStyle 293Expression medium，Thermo，Cat#12338026+F-68,Thermo,Cat#24040032)中瞬转表达；转染6～24h后加入5％体积的10％Peptone(Sigma,Cat#P0521-100G)，8％CO2 130rpm培养约7～8天；细胞活率降至50％时收取表达上清，使用ProteinA(GE，Cat#17-5438-02)重力柱纯化；PBS透析后，使用Nanodrop测定浓度，SEC鉴定纯度，间接ELISA验证结合能力；
通过本方法获得的Tab，浓度不小于2mg/ml，纯度大于95％。
实施例12：抗体的抗原结合量效曲线测定
本实施例采用标准酶联免疫吸附测定(ELISA)操作流程进行。
(1)包被50μL 1μg/mL TSLP蛋白，4℃过夜。
(2)洗板；加入200μL 5％牛奶，37℃封闭2h。
(3)将VHH-hFc稀释至2ug/mL，然后5倍梯度稀释抗体共8个浓度梯度。这里的VHH-hFc指实施例8制得的抗TSLP蛋白的单域抗体的Fc融合抗体(在293F细胞中表达)经实施例9纯化而得。此外，还分别设置hIgG、Tab对照；Tab1，Tab2由实施例11制得；
(4)洗板；加入50μL经步骤(3)稀释得到的单域抗体，两复孔，37℃孵育1h。
(5)洗板；加入50μL HRP-Goat anti hIgG二抗，37℃孵育30min。
(6)洗板(多洗几次)；加入50μL预先恢复常温的TMB，避光常温反应15min。
(7)加入50μL终止液(1N HCl)，酶标仪读数保存。
(8)绘制曲线，计算EC50，如图2-图9所示，其中hIgG指同型对照，不与任何靶标结合的免疫球蛋白分子，通过商品化购买得到。
其中，图2-图5为第一批次样品的结果(包含1A6，1A7，1D1，1F3，1F9，1H5，2D10，2H3，4A1，4B2，4F3，1B7，2G5以及未示出序列的抗体株)，图6-图9为第二批次样品的结果(包含214D11，21H6，212C7，27H4，23G12以及未示出序列的抗体克隆株)。
可见本发明的18种单域抗体均对TSLP蛋白结合效力和特异性优异。
实施例13：抗体(真核样品)中和诱导TSLPR-IL7R-BaF3细胞增殖
按照本领域技术人员通用的方法进行如下操作：
步骤如下：将复苏后传代3-4次的TSLPR-IL7R-BaF3 ce11细胞按10000个每孔铺入96孔板；将Tabl和Tab2以及实施例提供的单域抗体的Fc融合蛋白(VHH-hFc)配制为10μg/L的溶液(这里的VHH-hFc指实施例8制得的抗TSLP蛋白的单域抗体的Fc融合抗体(在293F细胞中表达)经实施例9纯化而得)，并进行5倍梯度稀释；分别将梯度稀释好的Tab、单域抗体与增殖实验中获得的EC80浓度(0.5ng/ml)的TSLP蛋白按1：1混合，制成混合液；将混合液按细泡培养液的等体积加入细胞培养孔；孵育72h后，用发光法细胞活力检测试剂盒检测细胞活力；根据检测结果计算Tab以及不同单域抗体中和TSLP诱导TSLPR-IL7R-BaF3cel1增殖的EC50浓度。由于第一批次样品和第二批次样品是分批检测的，故所有Tab也做了两次重复实验。TSLP Ab(AF1398)用于预估Tab可否在体系中正常使用。
其中，图10-图17为第一批次样品的结果(包含1A6，1A7，1D1，1F3，1F9，1H5，2D10，2H3，4A1，4B2，4F3，1B7，2G5以及未示出序列的抗体克隆株、Tab、hIgG)，图18-图24为第二批次样品的结果(包含214D11，21H6，212C7，27H4，23G12以及未示出序列的抗体克隆株、Tab、hIgG)。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南京融捷康生物科技有限公司
<120> 一种抗TSLP的单域抗体及其用途
<160> 75
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Thr Ser Arg Tyr Thr Tyr Gly Ser Ser Cys Met Ala Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gln Val Ala Gly Ile Ala Met
35 40 45
Gly Val Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser Gln Asp Asn Gly Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asp Asn Leu
65 70 75 80
Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Pro Pro His
85 90 95
Tyr Lys Cys Tyr Ser Val Ser Gly Gly Arg Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Thr Pro Arg Tyr Thr Tyr Gly Thr Ser Cys Met Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ser Pro Gly Tyr Gln Arg Glu Gln Val Ala Gly Ile Ala Met
35 40 45
Gly Val Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser Gln Asp Asn Gly Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asp Asn Leu
65 70 75 80
Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Pro Ala His
85 90 95
Tyr Lys Cys Tyr Ser Ala Ser Gly Gly Arg Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Thr Thr Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Asn Cys Ile Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Glu Ile Ala Thr Ile Ser Arg
35 40 45
Val Gly Glu Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Gln Asp Asn Thr Glu Thr Thr Val Phe Leu Gln Met Asn Ser
65 70 75 80
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Tyr Gly Gly Cys Pro Thr Arg Ser Arg Asp Tyr Asp Lys Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Val Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
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Cys Ala Thr Ser Arg Phe Thr Tyr Gly Ser Ala Cys Met Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gln Val Ala Gly Ile Ala Met
35 40 45
Gly Val Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser Gln Asp Asn Gly Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asp Asn Leu
65 70 75 80
Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Thr Gly Pro Ala His
85 90 95
Tyr Lys Cys Tyr Ser Ala Ser Gly Gly Arg Tyr Ser Asp Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 5
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Thr Ser Thr Ser Arg Phe Thr Tyr Gly Ser Ala Cys Met Gly
20 25 30
Trp Phe Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gln Val Ala Gly Ile
35 40 45
Ala Met Gly Val Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
50 55 60
Thr Ile Ser Gln Asp Asn Gly Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asp
65 70 75 80
Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Pro
85 90 95
Ala His Tyr Asn Cys Tyr Ser Ala Ser Gly Gly Arg Tyr Asn Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
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Cys Ala Thr Ser Arg Tyr Thr Tyr Asn Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln
20 25 30
Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gln Val Ala Gly Ile Ala Met Gly Val
35 40 45
Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln
50 55 60
Asp Asn Gly Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro
65 70 75 80
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85 90 95
Cys Tyr Ser Pro Ser Gly Gly Arg Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Thr Ser Arg Tyr Thr Tyr Asn Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln
20 25 30
Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gln Val Ala Gly Ile Ala Met Gly Val
35 40 45
Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln
50 55 60
Asp Asn Gly Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro
65 70 75 80
Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Pro Ala His Tyr Lys
85 90 95
Cys Tyr Ser Pro Ser Gly Gly Arg Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Thr Ser Arg Phe Thr Tyr Gly Ser Ala Cys Met Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gln Val Ala Gly Ile Ala Met
35 40 45
Gly Val Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser Gln Asp Asn Gly Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asp Asn Leu
65 70 75 80
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Tyr Lys Cys Tyr Ser Ala Ser Gly Gly Arg Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
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Cys Ala Thr Ser Arg Phe Thr Tyr Gly Ser Ala Cys Met Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gln Val Ala Gly Ile Ala Met
35 40 45
Gly Val Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser Gln Asp Asn Gly Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asp Asn Leu
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Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
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Cys Ala Thr Ser Thr Ser Arg Phe Thr Tyr Gly Ser Ala Cys Met Gly
20 25 30
Trp Phe Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gln Val Ala Gly Ile
35 40 45
Ala Met Gly Val Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
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Thr Ile Ser Gln Asp Asn Gly Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asp
65 70 75 80
Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Pro
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100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 11
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
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Cys Ala Thr Ser Arg Tyr Thr Tyr Asn Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln
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Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gln Val Ala Gly Ile Ala Met Gly Val
35 40 45
Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln
50 55 60
Asp Asn Gly Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
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Cys Ala Thr Ser Arg Tyr Thr Tyr Gly Ser Ala Cys Met Gly Trp Phe
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Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gln Val Ala Gly Ile Ala Met
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Gly Val Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
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Tyr Leu Cys Tyr Ser Ala Ser Gly Gly Arg Tyr Thr Ser Trp Gly Gln
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Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
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Cys Ala Thr Ser Arg Tyr Thr Tyr Gly Ser Ser Cys Met Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gln Val Ala Gly Ile Ala Met
35 40 45
Gly Val Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser Gln Asp Asn Asn Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asp Asn Leu
65 70 75 80
Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Pro Pro His
85 90 95
Tyr Lys Cys Tyr Ser Ala Ser Gly Gly Arg Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 14
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gagtctgggg gaggctcggt gcaggctgga gggtctctga gactatcctg tgcaacctct 60
agatacacct acggtagcag ctgcatggcc tggttccgcc agtctccagg aaaagagcgc 120
gagcaggtcg caggtattgc tatgggtgtt gtcacatact atgccgactc cgtgaagggc 180
cggttcacca tctcccaaga caacggcaag aacacggtgg atctgcaaat ggacaacctg 240
aaacctgagg acactgccat gtactactgt gcggcggggc ccccgcacta taagtgctat 300
tcagtgtccg gagggcggta taactactgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 360
<210> 15
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gagtctggag gaggctcggt gcaggctgga gggtctctga gactatcctg tgcaacccca 60
agatacacct acggtaccag ctgcatgggc tggttccgtc agtctccagg ataccagcgc 120
gagcaggtcg caggtattgc tatgggtgtt gtcacatact atgccgactc cgtgaagggc 180
cggttcacca tctcccaaga caacggcaag aacacggtgg atctgcaaat ggacaacctg 240
aaacctgagg acactgccat gtactactgt gcggcggggc ccgcgcacta taagtgctat 300
tcagcgtccg gagggcggta taactactgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 360
<210> 16
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gagtctggag gaggctcggt gcaggctgga ggctctctga gactctcctg tacgacctct 60
ggatacacct acagtagtaa ttgtatcggc tggttccgcc aggctccagg gaaggagcgc 120
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ggccgattca ccatctccca agacaacacc gagaccacgg tgtttctgca aatgaacagc 240
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tgccccactc ggtctcgaga ctatgacaaa tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 17
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gagtctggag gaggctcggt gcaggttgga gggtctctga gactatcctg tgcaacctct 60
agatttacct acggtagcgc ctgcatgggc tggttccgcc agtctccagg aaaggagcgc 120
gagcaggtcg caggtattgc tatgggtgtt gtcacatact atgccgactc cgtgaagggc 180
cggttcacca tctcccaaga caacggcaag aacacggtgg atctgcaaat ggacaacctg 240
aaacctgagg acactgccat gtactactgt gcgacggggc ccgcgcacta taagtgctat 300
tcagcgtccg gagggcggta tagcgactgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 360
<210> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gagtctgggg gaggctcggt gcaggctgga gggtctctga gactatcctg tgcaacctct 60
acctctagat tcacctacgg tagcgcctgc atgggctggt tccgccagtc tccaggaaag 120
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aagggccggt tcaccatctc ccaagacaac ggcaagaaca cggtggatct gcaaatggac 240
aacctgaaac ctgaggacac tgccatgtac tactgtgcgg cggggcccgc ccactataac 300
tgctattcag cgtccggagg gcggtataac tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 19
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gagtctgggg gaggctcggt acaggctgga gggtctctga gactatcctg tgcaacctct 60
agatacacct acaactgcat gggctggttc cgccagtctc caggaaagga gcgcgagcag 120
gtcgcaggta ttgctatggg tgttgtcaca tactatgccg actccgtgaa gggccggttc 180
accatctccc aagacaacgg caagaacacg gtggatctgc aaatggacaa cctgaaacct 240
gaggacactg ccatgtacta ctgtgcggcg gggcccgcac actataagtg ctattcaccg 300
tccggagggc ggtataacta ctggggccag gggacccagg tcaccgtctc ctca 354
<210> 20
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gagtctgggg gaggcttggt gcagcctggg gggtctctga gactatcctg tgcaacctct 60
agatacacct acaactgcat gggctggttc cgccagtctc caggaaagga gcgcgagcag 120
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gaggacactg ccatgtacta ctgtgcggcg gggcccgcac actataagtg ctattcaccg 300
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<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gagtctggag gaggctcggt gcaggctgga gggtctctga gactatcctg cgcaacctct 60
agatttacct acggtagcgc ctgcatgggc tggttccgcc agtctccagg aaaggagcgc 120
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<210> 22
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gagtctggag gaggctcggt gcaggctgga gggtctctga gactatcctg tgcaacctct 60
agattcacct acggtagcgc ctgcatgggc tggttccgcc agtctccagg aaaggagcgc 120
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gagtctggag gaggctcggt gcaggctgga gggtctctga gactatcctg tgcaacctct 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcagcgtccg gagggcggta tacgtcctgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 360
<210> 26
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gagtctgggg gaggctcggt gcaggctgga gggtctctga gactatcctg tgcaacctct 60
agatacacct acggtagttc ctgcatgggc tggttccgcc agtctccagg aaaggagcgc 120
gagcaggtcg cgggtattgc tatgggggtt gtcacatact atgccgactc cgtgaagggc 180
cggttcacca tctcccaaga caacaacaag aacacggtgg atctgcaaat ggacaacctg 240
aaacctgagg acactgccat gtactactgt gcgtcggggc ccccgcatta taagtgctat 300
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<212> PRT
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<400> 27
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
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Cys Ala Thr Ser
20
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Met Gly Trp Phe Arg His Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gln Val Ala
1 5 10 15
Gly
<210> 29
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Thr Pro
20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
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Cys Ala Thr Ser
20
<210> 31
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Thr Thr Ser
20
<210> 32
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Val Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Thr Ser
20
<210> 33
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Glu Ile Ala
1 5 10 15
Thr
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Met Ala Trp Phe Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gln Val Ala
1 5 10 15
Gly
<210> 35
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gln Val Ala
1 5 10 15
Gly
<210> 36
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ser Pro Gly Tyr Gln Arg Glu Gln Val Ala
1 5 10 15
Gly
<210> 37
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
1 5 10 15
Thr Glu Thr Thr Val Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 38
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
1 5 10 15
Gly Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro Asp Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 39
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
1 5 10 15
Gly Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 40
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
1 5 10 15
Asn Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 41
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 42
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Asn Cys
1 5
<210> 43
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
Arg Phe Thr Tyr Gly Ser Ala Cys
1 5
<210> 44
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
Arg Tyr Thr Tyr Gly Ser Ala Cys
1 5
<210> 45
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
Arg Tyr Thr Tyr Gly Ser Ser Cys
1 5
<210> 46
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
Arg Tyr Thr Tyr Gly Thr Ser Cys
1 5
<210> 47
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
Arg Tyr Thr Tyr Asn Cys
1 5
<210> 48
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
Thr Ser Arg Phe Thr Tyr Gly Ser Ala Cys
1 5 10
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
Ile Ala Met Gly Val Val Thr
1 5
<210> 50
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
Ile Ser Arg Val Gly Glu Ile Thr
1 5
<210> 51
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
Ala Ala Gly Pro Ala His Tyr Lys Cys Tyr Ser Ala Ser Gly Gly Arg
1 5 10 15
Tyr Asn Ile
<210> 52
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
Ala Ala Gly Pro Ala His Tyr Lys Cys Tyr Ser Ala Ser Gly Gly Arg
1 5 10 15
Tyr Asn Tyr
<210> 53
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
Ala Ala Gly Pro Ala His Tyr Lys Cys Tyr Ser Pro Ser Gly Gly Arg
1 5 10 15
Tyr Asn Tyr
<210> 54
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
Ala Ala Gly Pro Ala His Tyr Leu Cys Tyr Ser Ala Ser Gly Gly Arg
1 5 10 15
Tyr Thr Ser
<210> 55
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
Ala Ala Gly Pro Ala His Tyr Asn Cys Tyr Ser Ala Ser Gly Gly Arg
1 5 10 15
Tyr Asn Tyr
<210> 56
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
Ala Ala Gly Pro Pro His Tyr Lys Cys Tyr Ser Val Ser Gly Gly Arg
1 5 10 15
Tyr Asn Tyr
<210> 57
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
Ala Ala Ser Pro Pro Thr Tyr Gly Gly Cys Pro Thr Arg Ser Arg Asp
1 5 10 15
Tyr Asp Lys
<210> 58
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
Ala Ser Gly Pro Pro His Tyr Lys Cys Tyr Ser Ala Ser Gly Gly Arg
1 5 10 15
Tyr Asn Tyr
<210> 59
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
Ala Thr Gly Pro Ala His Tyr Lys Cys Tyr Ser Ala Ser Gly Gly Arg
1 5 10 15
Tyr Asn Tyr
<210> 60
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
Ala Thr Gly Pro Ala His Tyr Lys Cys Tyr Ser Ala Ser Gly Gly Arg
1 5 10 15
Tyr Ser Asp
<210> 61
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
Ala Thr Gly Pro Ala His Tyr Asn Cys Tyr Ser Ala Ser Gly Gly Arg
1 5 10 15
Tyr Asn Tyr
<210> 62
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Thr Ser Thr Ser Arg Phe Thr Tyr Gly Ser Ala Cys Met Gly
20 25 30
Trp Phe Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gln Val Ala Gly Ile
35 40 45
Ala Met Gly Val Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
50 55 60
Thr Ile Ser Gln Asp Asn Gly Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asp
65 70 75 80
Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Pro
85 90 95
Ala His Tyr Asn Cys Tyr Ser Ala Ser Gly Gly Arg Tyr Asn Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 63
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Thr Ser Arg Phe Thr Tyr Gly Ser Ala Cys Met Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gln Val Ala Gly Ile Ala Met
35 40 45
Gly Val Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser Gln Asp Asn Gly Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asp Asn Leu
65 70 75 80
Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Thr Gly Pro Ala His
85 90 95
Tyr Lys Cys Tyr Ser Ala Ser Gly Gly Arg Tyr Asp Ala Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 64
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Thr Ser Arg Trp Thr Tyr Gly Thr Ala Cys Met Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gln Val Ala Gly Ile Ala Met
35 40 45
Gly Val Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser Gln Asp Asn Glu Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asp Asn Leu
65 70 75 80
Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Thr Gly Pro Ala His
85 90 95
Tyr Lys Cys Tyr Ser Ala Ser Gly Gly Arg Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 65
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Thr Ser Arg Phe Thr Tyr Gly Ser Ala Cys Met Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gln Val Ala Gly Ile Ala Met
35 40 45
Gly Val Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser Gln Asp Asn Gly Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asp Asn Leu
65 70 75 80
Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Thr Gly Pro Ala His
85 90 95
Tyr Lys Cys Tyr Ser Ala Ser Gly Gly Arg Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 66
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Thr Ser Arg Phe Thr Tyr Gly Ser Ala Cys Met Gly Trp Phe
20 25 30
Arg His Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gln Val Ala Gly Ile Ala Met
35 40 45
Gly Val Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser Gln Asp Asn Gly Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asp Asn Leu
65 70 75 80
Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Thr Gly Pro Ala His
85 90 95
Tyr Lys Cys Tyr Ser Pro Ser Gly Gly Arg Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 67
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
gagtctggag gaggcttggt gcagcctggg gggtctctga gactatcctg tgcgacctct 60
acctctagat tcacctacgg tagcgcctgc atgggctggt tccgccagtc tccaggaaag 120
gagcgcgagc aggtcgcagg tattgctatg ggtgttgtca catactatgc cgactccgta 180
aagggccggt tcaccatctc ccaagacaac ggcaagaaca cggtggatct gcaaatggac 240
aacctgaaac ctgaggacac tgccatgtac tactgtgcgg cggggcccgc ccactataac 300
tgctattcag cgtccggagg gcggtataac tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 68
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
gagtctgggg gaggctcggt gcaggctgga gggtctctga gactatcctg tgcaacctct 60
agatttacct acggtagcgc ctgcatgggc tggttccgcc agtctccagg aaaggagcgc 120
gagcaggtcg caggtattgc tatgggtgtc gtcacatact atgccgactc cgtgaagggc 180
cggttcacca tctcccaaga caacggcaag aacacggtgg atctgcaaat ggacaacctg 240
aaacctgagg acactgccat gtactactgt gcgacggggc ccgcgcacta taagtgctat 300
tcagcgtccg gagggcggta tgacgcctgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 360
<210> 69
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
gagtctgggg gaggctcggt gcaggctgga gggtctctga gactgtcctg tgcaacctcg 60
agatggacct acggtaccgc ctgcatgggc tggttccggc agtctccagg aaaggagcgc 120
gagcaggtcg caggtatcgc tatgggtgtt gtcacatact atgccgactc cgtggagggc 180
cggttcacca tctcccaaga caacgagaag aacacggtgg atctgcaaat ggacaacctg 240
aaacctgagg acactgccat gtactactgt gcgacggggc ccgcgcacta taagtgctat 300
tcagcgtccg gagggcggta taactactgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 360
<210> 70
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
gagtctggag gaggctcggt gcaggctgga gggtctctga gactatcctg tgcaacctct 60
agattcacct acggtagcgc ctgcatgggc tggttccgcc agtctccagg aaaggagcgc 120
gagcaggtcg caggtattgc tatgggtgtt gtcacatact atgccgactc cgtgaagggc 180
cggttcacca tctcccaaga caacggcaag aacacggtgg atctgcaaat ggacaacctg 240
aaacctgagg acactgccat gtactactgt gcgacggggc ccgcgcacta taagtgctat 300
tcagcgtccg gcgggcggta taactactgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 360
<210> 71
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
gagtctgggg gaggctcggt gcaggctgga gggtctctga gactatcctg tgcaacctct 60
cgatttacct acggtagcgc ctgcatgggc tggttccgcc acgctcccgg aaaggagcgc 120
gagcaagtcg caggtattgc tatgggtgtt gtcacatact atgccgactc cgtgaagggc 180
cggttcacca tctcccaaga caacggcaag aacacagtgg atctgcaaat ggacaacctg 240
aaacctgagg acactgccat gtactactgt gcgacggggc ccgcgcacta taagtgctat 300
tcaccgtccg gagggcggta taactactgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 360
<210> 72
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
1 5 10 15
Glu Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 73
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
Arg Trp Thr Tyr Gly Thr Ala Cys
1 5
<210> 74
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
Ala Thr Gly Pro Ala His Tyr Lys Cys Tyr Ser Ala Ser Gly Gly Arg
1 5 10 15
Tyr Asp Ala
<210> 75
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
Ala Thr Gly Pro Ala His Tyr Lys Cys Tyr Ser Pro Ser Gly Gly Arg
1 5 10 15
Tyr Asn Tyr

Claims (15)

1.一种抗TSLP的单域抗体，其特征在于：所述的单域抗体由重链构成，重链包括SEQ IDNO: 42-SEQ ID NO:48或SEQ ID NO: 73中的任意一条所示的重链CDR1、SEQ ID NO:49-SEQID NO:50中的任意一条所示的重链CDR2和SEQ ID NO:51-SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:74-SEQ ID NO:75中的任意一条所示的重链CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗TSLP的单域抗体，其特征在于：所述的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列为下述（1）-（15）的一种：
（1）SEQ ID NO:42所示的CDR1，SEQ ID NO:50所示的CDR2，SEQ ID NO: 57所示的CDR3；
（2）SEQ ID NO:43所示的CDR1，SEQ ID NO:49所示的CDR2，SEQ ID NO:60所示的CDR3；
（3）SEQ ID NO:43所示的CDR1，SEQ ID NO:49所示的CDR2，SEQ ID NO:59所示的CDR3；
（4）SEQ ID NO:43所示的CDR1，SEQ ID NO:49所示的CDR2，SEQ ID NO:61所示的CDR3；
（5）SEQ ID NO: 44所示的CDR1，SEQ ID NO:49所示的CDR2，SEQ ID NO:54所示的CDR3；
（6）SEQ ID NO: 45所示的CDR1，SEQ ID NO:49所示的CDR2，SEQ ID NO:56所示的CDR3；
（7）SEQ ID NO:45所示的CDR1，SEQ ID NO:49所示的CDR2，SEQ ID NO:58所示的CDR3；
（8）SEQ ID NO:46所示的CDR1，SEQ ID NO:49所示的CDR2，SEQ ID NO:52所示的CDR3；
（9）SEQ ID NO:47所示的CDR1，SEQ ID NO:49所示的CDR2，SEQ ID NO:53所示的CDR3；
（10）SEQ ID NO:47所示的CDR1，SEQ ID NO:49所示的CDR2，SEQ ID NO:58所示的CDR3；
（11）SEQ ID NO:48所示的CDR1，SEQ ID NO:49所示的CDR2，SEQ ID NO:55所示的CDR3；
（12）SEQ ID NO:48所示的CDR1，SEQ ID NO:49所示的CDR2，SEQ ID NO:51所示的CDR3；
（13）SEQ ID NO:43所示的CDR1，SEQ ID NO:49所示的CDR2，SEQ ID NO:74所示的CDR3；
（14）SEQ ID NO:43所示的CDR1，SEQ ID NO:49所示的CDR2，SEQ ID NO:75所示的CDR3；
（15）SEQ ID NO:73所示的CDR1，SEQ ID NO:49所示的CDR2，SEQ ID NO:59所示的CDR3。
3.根据权利要求1所述的抗TSLP的单域抗体，其特征在于：所述的单域抗体还包括框架区FR；所述框架区FR包括FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列；框架区FR的氨基酸序列分别为：
SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29-32中的任意一条所示的FR1或FR1的变体，所述FR1的变体在所述FR1中包含至多5个氨基酸的替换；
SEQ ID NO:33-36中的任意一条所示的FR2或FR2的变体，所述FR2的变体在所述FR2中包含至多5个氨基酸的替换；
SEQ ID NO:37-40中的任意一条所示的FR3或FR3的变体，所述FR3的变体在所述FR3中包含至多5个氨基酸的替换；
SEQ ID NO:41所示的FR4或FR4的变体，所述FR4的变体在所述FR4中包含至多5个氨基酸的替换。
4.根据权利要求1所述的抗TSLP的单域抗体，其特征在于：所述的单域抗体还包括框架区FR；所述框架区FR包括FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列；框架区FR的氨基酸序列分别为：
SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:30所示的FR1或FR1的变体，所述FR1的变体在所述FR1中包含至多5个氨基酸的替换；
SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:35所示的FR2或FR2的变体，所述FR2的变体在所述FR2中包含至多5个氨基酸的替换；
SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:39所示的FR3或FR3的变体，所述FR3的变体在所述FR3中包含至多5个氨基酸的替换；
SEQ ID NO:41所示的FR4或FR4的变体，所述FR4的变体在所述FR4中包含至多5个氨基酸的替换。
5.一种抗TSLP的单域抗体，其特征在于：所述单域抗体的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.1-13中的任意一条所示，或者所述单域抗体的氨基酸序列分别如SEQ ID NO. 62-66中的任意一条所示。
6.权利要求1至5中任一项所述的抗TSLP的单域抗体的Fc融合抗体或人源化抗体。
7.一种重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白包含权利要求1至5中任一项所述的抗TSLP的单域抗体。
8.一种编码权利要求1至5中任一项所述的抗TSLP的单域抗体的核苷酸分子，其特征在于：其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：14-26中的任意一条所示，或者其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.67-71中的任意一条所示。
9.一种表达载体，其特征在于：其包含编码权利要求1至5中任一项所述的抗TSLP的单域抗体或者权利要求6所述的Fc融合抗体或人源化抗体的核苷酸分子或者权利要求8所述的核苷酸分子。
10.一种宿主细胞，其特征在于：其可以表达出权利要求1至5中任一项所述的针对TSLP的单域抗体或权利要求6所述的Fc融合抗体或人源化抗体，或其包含权利要求9所述的表达载体。
11.一种药物组合物，其特征在于：所述的药物组合物包含选自权利要求1至5中任一项的抗TSLP的单域抗体，和药学上可接受的载体。
12.用于治疗哮喘的药剂，其特征在于：其包含权利要求1至5中任一项的抗TSLP的单域抗体作为活性成分。
13.一种检测TSLP水平的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒含有权利要求1至5中任一项所述的抗TSLP的单域抗体。
14.权利要求1至5中任一项所述的抗TSLP的单域抗体或权利要求11所述的药物组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
15.根据权利要求14所述的用途，其特征在于：所述疾病为哮喘、过敏性哮喘、鼻息肉、鼻窦炎、慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉、慢性荨麻疹、慢性自发性荨麻疹、慢性阻塞性肺疾病、支气管疾病、超敏反应、速发型超敏反应、肺部疾病、阻塞性肺疾病、呼吸道过敏、嗜酸性粒细胞性食管炎或特应性皮炎。
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