CN111333730A - 可特异性结合EpCAM的单域抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可特异性结合EpCAM的单域抗体及其应用，涉及抗体技术领域。本发明公开的单域抗体具有互补决定区：CDR1、CDR2和CDR3；CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.33‑48中的任意一种所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.49‑64中的任意一种所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.65‑80中的任意一种所示。本发明公开的单域抗体能够特异性结合EpCAM，且具有较高的亲和力，其具有广阔的应用前景。

Description

可特异性结合EpCAM的单域抗体及其应用
技术领域
本发明涉及抗体技术领域，具体而言，涉及可特异性结合EpCAM的单域抗体及其应用。
背景技术
上皮特异性黏附分子(Epithelial Cell Adhesion Molecule，EpCAM)属于黏附分子家族，是由肿瘤相关钙信号转导1(Tumor-Associated Calcium Signal Transducer 1,TACSTD1)基因编码的一个单次跨膜蛋白，参与调节细胞间黏附，介导信号转导，与细胞的迁移、增殖和分化等功能相关。EpCAM又被称为CD326，是表达于人部分正常细胞和大多数恶性上皮肿瘤细胞表面的糖蛋白，按照其生物学功能划分，EpCAM可以归类于黏附分子家族，但是其结构特征不属于任何一个家族。
EpCAM蛋白又名TACSTD1、KSA、EGP314等，是由人染色体2p21区的EpCAM基因表达，EpCAM最小的跨度为14kb，成熟的mRNA全长为1.5kb。EpCAM基因在进化中高度保守，人和鼠的核苷酸80％同源，氨基酸序列82％同源。EpCAM分子由胞内区、胞外区和跨膜区组成。胞外区含有两个上皮生长因子(EGF)重复序列，后经确认第二个EGF结构域是甲状腺球蛋白样重复序列。这些重复序列是同型分子间黏附的结构基础，可以使两个细胞相近，使分子扭曲形成四聚体。EpCAM在上皮组织中表达较为广泛，在人胚胎时期除了胸腺，几乎所有上皮组织均表达EpCAM基因。出生后，除了鳞状上皮和肝细胞外，其他上皮组织仍维持EpCAM基因的表达。EpCAM基因所编码的糖蛋白具有表皮细胞黏附分子功能，因此将它称作上皮特异性黏附分子。事实上，EpCAM蛋白还参与加快细胞周期、促进细胞增殖、分化、迁移以及免疫逃逸等多种生物学功能。荷兰的Litvinov等将EpCAM cDNA转染入细胞间无黏附功能的鼠成纤维细胞L细胞，细胞形态发生了变化，细胞获得黏附功能并形成细胞串。EpCAM的黏附作用较E钙黏蛋白松散，且为钙离子非依赖性，这种黏附作用仅发生在表达EpCAM分子的同型细胞之间，与亲本细胞无黏附作用。EpCAM对E钙黏蛋白介导的黏附有负性调节作用。细胞分化过程中，EpCAM的黏附作用取代了E钙黏蛋白保持细胞正常状态，增殖期过后EpCAM表达下降，E钙黏蛋白高表达介导细胞黏附引发细胞的分化。Munz等研究显示，EpCAM过表达可上调癌基因C-myc和周期素A、E，加快细胞周期，促进细胞增殖。Osta等研究显示，EpCAM过表达的肿瘤细胞增殖活性高，侵袭性强，通过RNA干扰技术下调EpCAM基因，可显著地抑制肿瘤细胞的增殖活性及侵袭性。EpCAM尚有促进Th2分化和肿瘤免疫逃逸功能，能够阻断树突状细胞主要组织相容性复合体Ⅱ限制性抗原呈递，产生功能缺陷的CD4+T细胞，从而逃逸CD4+T细胞依赖性免疫反应，促成肿瘤发生。近年来，EpCAM被认为是一种肿瘤干细胞标志物，以EpCAMhigh/CD44+为表型的结直肠癌干细胞被发现以后，它具有干细胞功能的特征已在多个方面得到证实。最近的研究表明，EpCAM蛋白在胚胎干细胞高度表达，在上皮性肿瘤细胞内，其多向分化潜能是通过抑制p53蛋白表达和提高小鼠胚胎成纤维细胞的分化能力实现的，表明EpCAM跨膜信号是通过抑制p53-p21信号途径实现程序重排的。
EpCAM和肿瘤之间的关系
“干细胞”学说认为肿瘤干细胞是肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞群的细胞，其与肿瘤的增殖、转移、复发和对放化疗不敏感关系密切。EpCAM作为肿瘤干细胞标志物，在消化系统肿瘤研究较多，特别是肝癌、直结肠癌、胃癌等，并已应用于临床治疗。Yamashita等通过基因表达谱方法研究活化Wnt-β-catenin信号转导途径是否调节EpCAM的表达，结果发现，由于β-catenin的下调或Tcf/β-catenin复合物形成的抑制作用，由β-catenin导致的核转录减少了EpCAM在成熟人肝细胞和肝细胞癌基因的表达，认为EpCAM是Wnt-β-catenin信号转导途径的靶基因，通过对照分组，预测Wnt-β-catenin信号通路拮抗剂对患者的药理学反应，预后较好，从而鉴定EpCAM可作为肝癌干细胞的标志物。在食管癌早期诊断研究中，EpCAM已作为癌前病变Barrett食管化生的敏感指标。最近的研究很好地解释了EpCAM在人肿瘤及肿瘤增殖细胞高水平表达与预后差密切相关，EpCAM本身有致瘤活性，在于其胞内结构域EPICD(含有短的26个氨基酸)，通过Wnt-β-catenin信号转导途径实现核转录。此途径的一些成分参与EpCAM信号转导和基因调节，结果发现正常及恶性干细胞具有统计学意义。EpCAM的这种干细胞特性已经由用siRNA基因剔除的鼠胚胎干细胞和强制性过表达实验所证实。
靶向EpCAM的单克隆抗体
Edrecolomab(ED)是一种来源于鼠的抗EpCAM的单克隆IgG2A抗体。此单抗已在德国上市，并在乳腺癌和结直肠癌使用，刚开始报道不管是单独使用或者结合其他辅助化疗在无复发及总体生存方面有显著的优势。但在后来的四个大宗的前瞻性随机临床试验中，不管是单独使用还是联合化疗，ED对术后Ⅱ、Ⅲ期结直肠癌都是无效的。在鼠源性抗体临床试验效果不佳的情况下，人源性抗EpCAM单克隆IgG1抗体Adecatumumab(MT201)的问世给肿瘤临床免疫导向治疗带来了新的希望。在体外实验中有比ED更强烈的抗体依赖细胞毒性反应，目前已在乳腺癌、子宫浆液性乳头状癌、卵巢癌、前列腺癌等治疗中显示出一定的效果，目前在乳腺癌治疗中研究较多。Schmidt等在其Ⅱ期临床研究中发现，接受高剂量和高表达EpCAM的患者肿瘤进展能力明显降低，与治疗相关的不良反应较低或轻微。结果表明，单剂型的MT201治疗进展期乳腺癌，尽管并不能客观的使肿瘤消退，但能减缓肿瘤进展，为下一步对过表达EpCAM和低瘤荷其他肿瘤的MT201治疗提供理论支持。目前其他肿瘤的Ⅱ、Ⅲ期临床研究还在进行中，前景令人瞩目，在胃肠肿瘤方面还未见报道，故其在治疗中的地位需要更深入地研究。
Brischwein等研制的EpCAM/CD3双特异性单链抗体MTl 10能够激活CD8+T细胞，分泌白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子引起肿瘤细胞溶解，实验中MTl 10成功地清除了鼠皮肤转移性卵巢癌。随后证实，MTl 10只有在靶抗原存在的情况下才会激活T细胞诱导细胞溶解。因此认为，MTl 10是一种安全、有效的双特异性抗体，可作为EpCAM过表达肿瘤治疗的一种选择。目前，MTl 10已应用于结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌等肿瘤体内外模型中，临床前期效果明显。在一个Ⅰ期临床研究中，研究人员使用MTl 10对进展期广泛表达EpCAM的胃癌、直结肠癌、肺癌进行治疗，然后对治疗的安全性、耐受性、药动学及抗肿瘤活性给予评估。实验结果显示，MTl 10耐受性良好，不良反应少或轻微，没有病例对MTl10产生抗体抵抗。结果表明，MTl 10在首次临床实验中表现出了良好的剂量耐受性，其生物学效应明显，更高剂量的耐受性也正在评估，其Ⅱ、Ⅲ期临床研究还在进行中。
Catumaxomab是一种能与EpCAM分子、CD3抗原以及FC受体特异性结合的三功能双特异性抗体。Catumaxomab与这些特异性位点结合后，刺激杀伤性T细胞、树突状细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞等多种免疫细胞通过穿孔素介导的细胞裂解、抗体介导的吞噬作用及抗体依赖性细胞毒作用等多种机制引起肿瘤细胞死亡。这些功能通过组织相容性复合物而不需要预激活或外部刺激信号就可以特异地杀死上皮肿瘤细胞的。目前，Catumaxomab应用于胃肠道肿瘤及上皮源性卵巢癌恶性腹水的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期临床研究已经完成，并已应用于胃癌、卵巢癌的术中、术后辅助化疗，其安全性、耐受性、药动学良好，抗肿瘤活性效果显著，明显延长肿瘤患者的生存期。同时，Catumaxomab应用于非小细胞肺癌及恶性胸腔积液的Ⅰ、Ⅱ期临床研究也已经完成。
EpCAM作为一种上皮源性肿瘤抗原，具有加快细胞周期、促进细胞增殖、分化、迁移以及免疫逃逸、干细胞特性等多种生物学功能。基于EpCAM特异性单抗(包括双特异三功能抗体)等新药物、新技术的研发，其临床上用于肿瘤的免疫靶向治疗，前景令人瞩目。而开发出对EpCAM具有更高亲和力的抗体，是其在临床上应用的基础和前提。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供可特异性结合EpCAM的单域抗体及其应用。本发明提供的单域抗体能够特异性结合EpCAM，且具有较高的亲和力，其具有广阔的应用前景。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供一种可特异性结合EpCAM的单域抗体，所述单域抗体具有如下互补决定区：CDR1、CDR2和CDR3；
其中，CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.33-48中的任意一种所示，CDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO.49-64中的任意一种所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.65-80中的任意一种所示。
本发明提供的单域抗体，其互补决定区的CDR1如SEQ ID NO.33-48中的任意一种所示，CDR2如SEQ ID NO.49-64中的任意一种所示，CDR3如SEQ ID NO.65-80中的任意一种所示，具有如此互补决定区结构的单域抗体对EpCAM具有结合活性，亲和力较高；其具有广阔的应用前景，如该单域抗体可以用于治疗与EpCAM相关的疾病，也可以基于抗原/抗体反应用于检测EpCAM蛋白、或者是作为药物的递送载体，往表达EpCAM的部位运输药物等。
需要说明的是，在本发明公开了上述互补决定区的结构基础上，本领域技术人员容易想到在其基础上进行一个或多个氨基酸的替换或删除，以获得对EpCAM的结合活性或亲和力大致相同的或者是提高的单域抗体突变体，这是本领域技术人员无需付出创造性劳动即可得到的，基于此，这类单域抗体突变体也是属于本发明的保护范围。
在可选的实施方式中，所述单域抗体的互补决定区如以下(1)-(16)中的任意一项所示：
(1)CDR1如SEQ ID NO.38所示，CDR2如SEQ ID NO.61所示，CDR3如SEQ ID NO.77所示；
(2)CDR1如SEQ ID NO.47所示，CDR2如SEQ ID NO.57所示，CDR3如SEQ ID NO.72所示；
(3)CDR1如SEQ ID NO.40所示，CDR2如SEQ ID NO.54所示，CDR3如SEQ ID NO.78所示；
(4)CDR1如SEQ ID NO.37所示，CDR2如SEQ ID NO.64所示，CDR3如SEQ ID NO.73所示；
(5)CDR1如SEQ ID NO.39所示，CDR2如SEQ ID NO.58所示，CDR3如SEQ ID NO.70所示；
(6)CDR1如SEQ ID NO.35所示，CDR2如SEQ ID NO.63所示，CDR3如SEQ ID NO.68所示；
(7)CDR1如SEQ ID NO.36所示，CDR2如SEQ ID NO.55所示，CDR3如SEQ ID NO.74所示；
(8)CDR1如SEQ ID NO.45所示，CDR2如SEQ ID NO.50所示，CDR3如SEQ ID NO.76所示；
(9)CDR1如SEQ ID NO.42所示，CDR2如SEQ ID NO.49所示，CDR3如SEQ ID NO.79所示；
(10)CDR1如SEQ ID NO.48所示，CDR2如SEQ ID NO.56所示，CDR3如SEQ ID NO.75所示；
(11)CDR1如SEQ ID NO.43所示，CDR2如SEQ ID NO.51所示，CDR3如SEQ ID NO.67所示；
(12)CDR1如SEQ ID NO.44所示，CDR2如SEQ ID NO.59所示，CDR3如SEQ ID NO.71所示；
(13)CDR1如SEQ ID NO.34所示，CDR2如SEQ ID NO.52所示，CDR3如SEQ ID NO.65所示；
(14)CDR1如SEQ ID NO.33所示，CDR2如SEQ ID NO.53所示，CDR3如SEQ ID NO.66所示；
(15)CDR1如SEQ ID NO.41所示，CDR2如SEQ ID NO.62所示，CDR3如SEQ ID NO.80所示；
(16)CDR1如SEQ ID NO.46所示，CDR2如SEQ ID NO.60所示，CDR3如SEQ ID NO.69所示。
在可选的实施方式中，所述单域抗体具有如下骨架区：FR1、FR2、FR3和FR4；
在可选的实施方式中，FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.81-89中的任意一种所示；
在可选的实施方式中，FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.90-102中的任意一种所示；
在可选的实施方式中，FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.103-118中的任意一种所示；
在可选的实施方式中，FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.119-121中的任意一种所示。
在可选的实施方式中，所述单域抗体的骨架区如下(a)-(k)中的任意一项所示：
(a)4C9:FR1如SEQ ID NO.83所示，FR2如SEQ ID NO.94所示，FR3如SEQ ID NO.115所示，FR4如SEQ ID NO.119所示；
(b)FR1如SEQ ID NO.87所示，FR2如SEQ ID NO.94所示，FR3如SEQ ID NO.112所示，FR4如SEQ ID NO.119所示；
(c)FR1如SEQ ID NO.81所示，FR2如SEQ ID NO.93所示，FR3如SEQ ID NO.117所示，FR4如SEQ ID NO.119所示；
(d)FR1如SEQ ID NO.88所示，FR2如SEQ ID NO.97所示，FR3如SEQ ID NO.110所示，FR4如SEQ ID NO.119所示；
(e)FR1如SEQ ID NO.83所示，FR2如SEQ ID NO.100所示，FR3如SEQ ID NO.104所示，FR4如SEQ ID NO.119所示；
(f)FR1如SEQ ID NO.83所示，FR2如SEQ ID NO.97所示，FR3如SEQ ID NO.116所示，FR4如SEQ ID NO.119所示；
(g)FR1如SEQ ID NO.86所示，FR2如SEQ ID NO.95所示，FR3如SEQ ID NO.109所示，FR4如SEQ ID NO.121所示；
(i)FR1如SEQ ID NO.83所示，FR2如SEQ ID NO.92所示，FR3如SEQ ID NO.106所示，FR4如SEQ ID NO.119所示；
(j)FR1如SEQ ID NO.85所示，FR2如SEQ ID NO.98所示，FR3如SEQ ID NO.107所示，FR4如SEQ ID NO.119所示；
(k)FR1如SEQ ID NO.82所示，FR2如SEQ ID NO.101所示，FR3如SEQ ID NO.113所示，FR4如SEQ ID NO.119所示；
(l)FR1如SEQ ID NO.89所示，FR2如SEQ ID NO.96所示，FR3如SEQ ID NO.118所示，FR4如SEQ ID NO.119所示；
(m)FR1如SEQ ID NO.83所示，FR2如SEQ ID NO.90所示，FR3如SEQ ID NO.103所示，FR4如SEQ ID NO.119所示；
(n)FR1如SEQ ID NO.83所示，FR2如SEQ ID NO.102所示，FR3如SEQ ID NO.111所示，FR4如SEQ ID NO.120所示；
(o)FR1如SEQ ID NO.83所示，FR2如SEQ ID NO.102所示，FR3如SEQ ID NO.114所示，FR4如SEQ ID NO.119所示；
(p)FR1如SEQ ID NO.84所示，FR2如SEQ ID NO.99所示，FR3如SEQ ID NO.105所示，FR4如SEQ ID NO.119所示；
(k)FR1如SEQ ID NO.84所示，FR2如SEQ ID NO.91所示，FR3如SEQ ID NO.108所示，FR4如SEQ ID NO.119所示。
在可选的实施方式中，所述单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-16中的任一项所示。
SEQ ID NO.1-16中所示的单域抗体能够特异性结合EpCAM，具有较高的亲和力。
第二方面，本发明实施例提供一种融合蛋白，其含有前述实施方式任一项所述的单域抗体。
基于本发明第一方面提供的单域抗体，本领域技术人员容易想到在其基础上进行改造，例如根据实际应用的具体目的，在其两端融合其他物质包括：荧光蛋白、放射性元素、酶、其他类型的功能性蛋白等，无论基于何种目的，融合何种物质，其都是属于本发明的保护范围。
更特别的是，在一些实施方式中，本领域技术人员可以在本发明第一方面提供的单域抗体基础上，直接将该单域抗体作为传统抗体或重链抗体的重链可变区，如此改造后的传统抗体或重链抗体也具有特异性结合EpCAM的能力，这样的传统抗体或重链抗体也是属于本发明的保护范围。
传统抗体在结构上由两条相同的重链和两条相同的轻链组成，轻链具有轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)；重链具有重链可变区(VH)和重链恒定区(CH1，CH2，CH3和/或CH4)；铰链区位于CH1与CH2之间；轻链可变区和重链可变区各自都具有：3个互补决定区(CDR1-3)和4个骨架区(FR1-4)，轻链可变区和重链可变区各自的结构为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4；传统抗体的类型主要包括：IgG、IgA、IgD、IgM和IgE等，这类抗体在大部分的哺乳动物中均存在。
重链抗体与传统抗体结构稍有不同，其缺失传统抗体的轻链，也缺少重链恒定区的CH1区域，这类抗体主要存在于骆驼科动物中。
重链抗体其结合抗原的结构域为单一重链的可变区，称为VHH，将该结构域独立出来，即为最小单元抗原结合片段，也称为单域抗体(Single-domain antibodies，sbAbs)，或称为纳米抗体(Nanobody)。
基于此，在可选的实施方式中，所述融合蛋白为传统抗体或其功能性片段，或者所述融合蛋白为重链抗体；所述单域抗体作为所述融合蛋白的重链可变区。
在可选的实施方式中，所述功能性片段选自所述传统抗体的Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、scFv或sdFv。
第三方面，实施例提供一种分离的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子编码如前述实施方式任一项所述的单域抗体。
在可选的实施方式中，所述多核苷酸分子的碱基序列如SEQ ID NO.17-32中的任一种所示。
SEQ ID NO.17对应编码SEQ ID NO.1所示的单域抗体；
SEQ ID NO.18对应编码SEQ ID NO.2所示的单域抗体；
SEQ ID NO.19对应编码SEQ ID NO.3所示的单域抗体；
SEQ ID NO.20对应编码SEQ ID NO.4所示的单域抗体；
SEQ ID NO.21对应编码SEQ ID NO.5所示的单域抗体；
SEQ ID NO.22对应编码SEQ ID NO.6所示的单域抗体；
SEQ ID NO.23对应编码SEQ ID NO.7所示的单域抗体；
SEQ ID NO.24对应编码SEQ ID NO.8所示的单域抗体；
SEQ ID NO.25对应编码SEQ ID NO.9所示的单域抗体；
SEQ ID NO.26对应编码SEQ ID NO.10所示的单域抗体；
SEQ ID NO.27对应编码SEQ ID NO.11所示的单域抗体；
SEQ ID NO.28对应编码SEQ ID NO.12所示的单域抗体；
SEQ ID NO.29对应编码SEQ ID NO.13所示的单域抗体；
SEQ ID NO.30对应编码SEQ ID NO.14所示的单域抗体；
SEQ ID NO.31对应编码SEQ ID NO.15所示的单域抗体；
SEQ ID NO.32对应编码SEQ ID NO.16所示的单域抗体。
需要说明的是，基于本发明公开的内容，本领域技术人员通过本领域常规技术容易获得编码上述单域抗体以及融合蛋白的多核苷酸分子，并基于密码子的简并性，该多核酸分子是多变的，其具体的碱基序列存在多种可能性，基于此，无论其多核酸分子如何变化，只要其能够编码本发明的单域抗体或融合蛋白即属于本发明的保护范围。
第四方面，本发明实施例提供如上所述的单域抗体或者如上所述的融合蛋白在制备产品中的应用，所述产品为检测EpCAM蛋白的检测试剂、抗肿瘤药物、用于细胞免疫疗法的免疫细胞或往表达EpCAM蛋白的部位递送药物的载体。
用于细胞免疫疗法的免疫细胞是指经过改造后的具有嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞，该嵌合抗原受体的抗原结合结构域采用了如上所述的单域抗体，以靶向EpCAM。前述的免疫细胞可以是T细胞、NK细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节T细胞、记忆性T细胞、双特异性T细胞和CIK细胞等。无论免疫细胞的类型是什么，只要是使用了本发明提供的单域抗体进行改造的免疫细胞即属于本发明的保护范围。
需要说明的是，本发明第四方面所提供的应用仅仅上述单域抗体和融合蛋白应用的某些领域，除了在上述领域应用外，在其他的相关领域使用了本发明的单域抗体或融合蛋白，只要其是利用本发明了的单域抗体与EpCAM结合的性质实现对应的目的，即也是属于本发明的保护范围。
第五方面，本发明实施例提供一种产品，其含有前述实施方式任一项所述的单域抗体或者前述实施方式所述的融合蛋白，所述产品为检测EpCAM蛋白的检测试剂、抗肿瘤药物、用于细胞免疫疗法的免疫细胞或往表达EpCAM蛋白的部位递送药物的载体。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为pCAM重组蛋白纯化结果分析图，左侧为SDS-PAGE分析结果，右侧为WesternBlot分析结果。
图2为针对EpCAM重组蛋白的纳米抗体文库片段正确插入率分析结果，根据分析结果，正确插入率为90％。
图3为针对EpCAM重组蛋白的单域抗体文库筛选后的富集情况。
图4为镍柱进一步亲和层析后的单域抗体SDS-PAGE分析。
图5为纯化后单域抗体与EpCAM的初步亲和力ELISA检测结果。
图6为纯化后的单域抗体与EpCAM的亲和力EC50曲线。
图7为实施例中的单域抗体的CDR和FR的氨基酸序列。
图8为实施例中的pMECS质粒图谱。
图9为实施例11中的在Fc片段引入多克隆位点的示意图。
图10为实施例13中的各重组单域抗体对MDA-MB-453细胞ADCC效应检测结果。
图11为实施例14中的各重组单域抗体对KATO-III细胞CDC效应检测结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
人源EpCAM重组胞外结构域蛋白的制备：
本文实施例中用到的人源重组胞外结构域蛋白为公司自己表达纯化获得，人源重组EpCAM蛋白的制备方法如下：
(1)在NCBI中检索获得EpCAM的编码序列，其收录号为NM_002354.3，该序列编码产生的氨基酸序列登录号为NP_002345.2。
(2)分别通过TMHMM和SMART网站对NP_002345.2对应的氨基酸序列进行蛋白跨膜区和胞外端的分析。
(3)分析结果显示EpCAM蛋白的胞外端为1-265位氨基酸，其中1-23位为该蛋白的信号肽。
(4)利用序列特异性引物通过限制性内切酶XbaI和AgeI将编码EpCAM蛋白的1-265位氨基酸的核苷酸序列克隆到载体pcDNA3.4中，使用的引物可以在编码EpCAM蛋白的核苷酸序列5’端引入KOZAK序列，3’端引入6×His标签的编码序列，方便后期纯化。
(5)将构建好的载体进行Sanger测序，比对原始序列，确认无误后，将该重组质粒进行批量抽提，去除内毒素，转染悬浮293F进行目的蛋白的表达、纯化，纯化后EpCAM重组蛋白的SDS-PAGE分析结果如图1所示。
实施例2
针对EpCAM重组蛋白的单域抗体文库的构建：
(1)将1mg实施例1中纯化获得的EpCAM重组蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合，免疫一只内蒙古阿拉善双峰驼，每周免疫一次，共连续免疫7次，除首次免疫外，其余六次均是用1mg EpCAM重组蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混合进行动物免疫，该免疫过程是为了集中刺激骆驼使其产生针对EpCAM的抗体。
(2)动物免疫结束后，抽取骆驼外周血淋巴细胞150mL并提取细胞的RNA；
(3)利用提取的总RNA合成cDNA，并通过套式PCR反应以cDNA为模板扩增VHH(重链抗体可变区)；
(4)利用限制性内切酶分别酶切pMECS载体和VHH片段，然后将酶切后的片段和载体链接；
(5)将连接后的片段点转化至感受态细胞TG1中，构建针对EpCAM蛋白的噬菌体展示文库并测定库容，文库的库容大小约为1×109，同时，通过菌落PCR鉴定检测文库在目的片段的正确插入率，结果如图2所示，插入率达到90％。
实施例3
针对EpCAM蛋白的单域抗体筛选：
(1)取200μL重组TG1细胞至2×TY培养基中培养，期间加入40μL辅助噬菌体VCSM13侵染TG1细胞，并培养过夜以扩增噬菌体，次日利用PEG/NaCl沉淀噬菌体，离心收集扩增噬菌体；
(2)将稀释在100mM pH 8.3的NaHCO3中的EpCAM重组蛋白500μg偶联在酶标板上，4℃放置过夜，同时设立阴性对照孔；
(3)第二天加入200μL的3％的脱脂乳，室温封闭2h；
(4)封闭结束后，加入100μL扩增后噬菌体文库(大约2×1011个噬菌体颗粒)，室温作用1h；
(5)作用1小时后，用PBS+0.05％Tween-20洗5遍，以洗掉未结合的噬菌体；
(6)用终浓度为25mg/mL的胰蛋白酶将与EpCAM蛋白特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数生长期的大肠杆菌TG1细胞，37℃培养1h，产生并收集噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复1轮，逐步得到富集，当富集倍数达到10倍以上时，富集效果如图3所示。
图3为针对EpCAM重组蛋白的单域抗体文库筛选后的富集情况，其中P/N＝生物淘选中阳性孔洗脱下的噬菌体感染TG1细菌后生长的单克隆细菌数/阳性孔洗脱下的噬菌体感染TG1细菌后生长的单克隆细菌数，该参数在富集发生后会逐渐增大；I/E＝生物淘选中每轮加入阳性孔的噬菌体总量/生物淘选中每轮从阳性孔洗脱出的噬菌体总量，该参数在富集发生后会逐渐趋近于1，本次富集P/N＝200，I/E＝25。
实施例4
用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选针对EpCAM的特异性阳性克隆
(1)根据上述单域抗体筛选方法对EpCAM重组蛋白进行3轮筛选，筛选结束后，针对重组EpCAM蛋白的噬菌体富集因子达到10以上，从筛选获得的阳性克隆中挑选400个单菌落分别接种于含100μg/mL氨苄青霉素的TB培养基的96深孔板中，并设置空白对照，37℃培养至对数期后，加入终浓度为1mM的IPTG，28℃培养过夜；
(2)利用渗透涨破法获得粗提抗体；将EpCAM重组蛋白分别释至100mM pH 8.3的NaHCO3中并将100μg蛋白在酶标板中4℃包被过夜；
(3)将上述步骤中获得的抗体粗提液取100μL转移至加入抗原的ELISA板上，室温孵育1h；
(4)用PBST洗去未结合的抗体，加入100μL经1:2000稀释后的Mouse anti-HA tagantibody(鼠抗HA抗体，Thermo Fisher)，在室温孵育1h；
(5)用PBST洗去未结合的抗体，加入100μL经1:20000稀释后的Anti-Rabbit HRPconjμgate(山羊抗兔辣根过氧化物酶标记抗体，购自于Thermo Fisher)，在室温孵育1h；
(6)用PBST洗去未结合的抗体，加入辣根过氧化物酶显色液，37℃下反应15min后，加入中止液，于酶标仪上450nm波长处，读取吸收值；
(7)当样品孔OD值大于对照孔5倍以上时，判定为阳性克隆孔；
(8)将阳性克隆孔的菌转摇在含有100μg/μL氨苄青霉素的LB培养基中以便提取质粒并进行测序；
(9)根据序列比对软件Vector NTI分析各个克隆株的基因序列，把CDR1，CDR2，CDR3序列相同的株视为同一克隆株，而序列不同的株视为不同克隆株，最终获得特异性针对EpCAM蛋白的单域抗体。其抗体的氨基酸序列为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4结构，构成整个VHH。获得的单域抗体重组质粒可以在原核系统中进行表达，获得单域抗体重组蛋白。
得到的各单域抗体的编号及其氨基酸序列分析结果如图7所示，其对应的序列标识符(SEQ ID NO.)参见表1。
表1本实施例各单域抗体的CDR和FR对应的序列标识符(SEQ ID NO.)
Figure BDA0002407624090000081
实施例5
EpCAM蛋白的特异性单域抗体在宿主菌大肠杆菌中的纯化及表达
(1)将上述测序分析所获得不同克隆株的质粒(pMECS-VHH，pMECS图谱如图8所示)电转化到大肠杆菌HB2151中，并将其涂布在LB+amp+glucose即含有氨苄青霉素和葡萄糖的培养平板上，37℃培养过夜；
(2)挑选单个菌落接种在5mL含有岸边青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜；
(3)接种1mL的过夜培养菌种至330mL TB培养液中，37℃摇床培养，培养到OD600nm值达到0.6-0.9时，加入1M IPTG，28℃摇床培养过夜；
(4)离心，收集大肠杆菌，利用渗透胀破法，获得抗体粗提液；
(5)通过镍柱亲和层析法纯化出抗体，纯化后的单域抗体，如图4所示。
实施例6
EpCAM蛋白的特异性单域抗体的Fc融合抗体真核表达载体的构建
(1)将实施例3中获得的目标序列亚克隆至真核表达载体中：将实施例3中筛选出来的抗体经Sanger测序得到其核苷酸序列；
(2)通过序列合成的方式将密码子优化后的核苷酸序列合成至本公司设计改造的载体RJK-V4-hFC中，该载体的改造方法如实施例11所述；
(3)将公司构建好的重组真核表达载体转化至DH5α大肠杆菌中，培养进行质粒大提，去除内毒素；
(4)将大提后的质粒再进行序列测序鉴定；
(5)将确定无误后的重组载体准备后续真核细胞转染表达。
实施例7
EpCAM蛋白的特异性单域抗体的Fc融合抗体在悬浮ExpiCHO-S细胞中表达
(1)转染前3天以2.5×105个细胞/ml传代和扩大培养ExpiCHO-STM细胞，计算出的所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的120ml(终体积)的ExpiCHOTM表达培养基的500ml摇瓶中；使细胞浓度达到约4×106-6×106个活细胞/mL；
(2)在转染前一天，将ExpiCHO-STM细胞稀释浓度至3.5×106个活细胞/mL，使细胞过夜培养；
(3)转染当天，测定细胞密度和活细胞百分比。转染之前细胞密度应达到约7×106-10×106个活细胞/mL；
(4)用预热至37℃新鲜的ExpiCHOTM表达培养基将细胞稀释至6×106个活细胞/mL。计算出的所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的100ml(终体积)的ExpiCHOTM表达培养基的500ml摇瓶中；
(5)使轻轻颠倒混匀ExpiFectamineTMCHO试剂，用3.7ml OptiPROTM培养基稀释ExpiFectamineTMCHO试剂，回荡或混匀；
(6)用冷藏的4ml OptiPROTM培养基稀释质粒DNA，回荡混匀；
(7)将ExpiFectamine CHO/质粒DNA复合物室温孵育1-5分钟，然后轻轻加入制备的细胞悬液中，加入过程中轻轻回荡摇瓶；
(8)将细胞在37℃、8％CO2、加湿的空气中震荡培养；
(9)转染后第1天(18-22小时后)添加600μL ExpiFectamineTMCHO Enhancer和24mlExpiCHO feed。
(10)在转染后约8天(细胞活率低于70％)收集上清。
实施例8
EpCAM蛋白的特异性单域抗体的Fc融合抗体在悬浮293F细胞中的表达
重组单域抗体表达实验流程(以500ml摇瓶为例)：
(1)转染前3天以2.5×105个细胞/ml传代和扩大培养293F细胞，计算出的所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的120ml(终体积)的OPM-293CD05 Medium培养基的500ml摇瓶中。使细胞浓度达到约2×106-3×106个活细胞/mL。
(2)转染当天，测定细胞密度和活细胞百分比。转染之前细胞密度应达到约2×106-3×106个活细胞/mL。
(3)用预热的OPM-293CD05 Medium将细胞稀释至1×106个活细胞/mL。计算出所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的100ml(终体积)的培养基的500ml摇瓶中。
(4)用4ml Opti-MEM培养基稀释PEI(1mg/ml)试剂，回荡或吹打混匀；用4ml Opt-MEM培养基稀释质粒DNA，回荡混匀，并用0.22um的滤头过滤。室温孵育5min。
(5)将稀释的PEI试剂加入稀释的DNA中，颠倒混匀。将PEI/质粒DNA复合物室温孵育15-20分钟，然后轻轻加入制备的细胞悬液中，加入过程中轻轻回荡摇瓶。
(6)将细胞在37℃、5％CO2、120rpm震荡培养。
(7)转染后第24h、72h添加5ml OPM-CHO PFF05补料。
(8)在转染后约7天(细胞活率低于70％)收集上清。
实施例9
人源Fc重组单域抗体的纯化
(1)将实施例6或7中获得蛋白表达上清用0.45μm的一次性滤头过滤除掉不可溶杂质；
(2)将上述滤液使用蛋白纯化仪进行亲和层析纯化，利用人源Fc与Protein A结合的能力，使用偶联Protein A的琼脂糖填料进行纯化；
(3)将滤液通过1mL/分钟的流速流穿Protein A预装柱，该步骤中滤液中的目标蛋白会与填料结合；
(4)通过低盐和高盐缓冲液将柱上结合的杂质蛋白洗涤；
(5)用低pH缓冲液将柱上结合的目标蛋白进行系统；
(6)将洗脱液迅速加入pH9.0的Tris-HCl溶液，进行中和；
(7)将上述中和后的蛋白溶液透析后，进行SDS-PAGE分析，确定蛋白纯度在95％以上，且浓度在0.5mg/mL以上后，低温保存备用。
实施例10
特异性针对EpCAM蛋白的重组单域抗体与EpCAM亲和力的ELISA检测
(1)将50ng/50μL人源重组EpCAM样品包被到ELISA板材上，4℃包被过夜；
(2)使用5％脱脂奶粉对上述包被的板材进行封闭，封闭1小时，每孔脱脂奶粉200μL；
(3)加入实施例4或8中获得的重组单域抗体，该单域抗体带有HA或者人源Fc标签，孵育1小时；
(4)加入特异性针对HA标签蛋白或人源Fc的检测抗体(HRP标记)，孵育0.5小时；
(5)加入显色底物TMB，显色；
(6)加入终止液终止反应；
(7)测量OD450值，如图5所示。
根据图5结果可以看出，
不同的单域抗体与EpCAM的结合活性存在差异。有13株抗体的ELISA水平结合活性较好，其余三株抗体(1E5、4E11和4D11)结合活性一般。
实施例11
单域抗体真核表达载体RJK-V4-hFc的构建
所提及单域抗体通用的目标载体RJK-V4-hFC，为本公司在invitrogen商业化载体pCDNA3.4(载体资料链接：https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_4_topo_ta_cloning_kit_man.pdf)的基础上融合了人源IgG的重链编码序列(NCBIAccession No.AB776838.1)中的Fc区段后改造而来的，即该载体包含了IgG重链的铰链区(Hinge)CH2和CH3区。具体改造方案如下：
(1)选取pcDNA3.4上的限制性酶切位点XbaI和AgeI；
(2)在Fc片段编码序列的5’端和3’端通过重叠PCR的方式分别引入多克隆位点(MCS，Multiple Cloning Site)和6×His标签，如图9所示；
(3)使用分别带有XbaI和AgeI酶切位点的一对引物通过PCR的方式将上述片段扩增；
(4)使用限制性内切酶XbaI和AgeI分别酶切pcDNA3.4和(3)中的重组DNA片段；
(5)将酶切后的载体和插入片段在T4连接酶的作用下连接，然后将连接产物转化至大肠杆菌，扩增，测序核实，获得重组质粒。
实施例12
EpCAM蛋白的特异性单域抗体的结合量效曲线测定
将50μL浓度为1ng/μL的人源重组EpCAM样品包被到ELISA板材上，4℃过夜；洗板；加入200μL 5％牛奶，37℃封闭1h；将实施例2中P/N值较高的24株单域抗体分别稀释至2μg/mL，然后5倍梯度稀释抗体共8个浓度梯度；洗板；加入50μL抗体，两复孔，37℃孵育1h；洗板；加入50μL鼠抗HA标签HRP二抗，37℃孵育30min；洗板；加入50μL预先恢复常温的TMB，避光常温反应15min；加入50μL终止液(1N HCl)，酶标仪读数保存；绘制曲线，计算EC50，结果见图6和下表2。
表2各单域抗体结合目的蛋白的EC50
抗体编号 2C2 3A8 4C9 4E5 1D7 4C10 3D2 3G10
EC<sub>50</sub>(nM) 1.662 1.943 1.961 1.981 2.701 3.913 5.004 5.219
抗体编号 1H9 1E9 3C2 3C12 3C7 1E5 4E11 4D11
EC<sub>50</sub>(nM) 5.237 5.403 6.24 9.628 9.853 9.989 54.84 96.74
从图6和表2结果可以看出，
由实施例3筛选所获得的针对EpCAM重组蛋白的单域抗体，其与EpCAM的亲和力存在差异性，其中有6株抗体(2C2、3A8、4C9、4E5、1D7、4C10)与EpCAM的亲和力在5nM以下，表现优异；有8株抗体(3D2、3G10、1H9、1E9、3C2、3C12、3C7、1E5)与EpCAM的亲和力在5-10nM之间，表现良好，有2株抗体的亲和力不佳，只能达到0.1μM水平。
实施例13
EpCAM蛋白的特异性单域抗体的ADCC效应检测
本实施例的目的是对特异性针对EpCAM的Fc融合单域抗体进行ADCC效应检测，所涉的Fc融合单域抗体是从实施例9中纯化获得的，所用的细胞是MDA-MB-453细胞，ADCC是指抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用。实验步骤如下：
(1)离心收集细胞。
(2)用Assay buffer(RPMI-1640+1％FBS)重悬MDA-MB-453细胞，调整细胞密度至2×105细胞/毫升。
(3)向96孔板中每孔铺入50μl细胞悬液。
(4)将针对EpCAM(公司内部编号RT05)的阳性单克隆抗体MOC31(Tab2)、3-17I(Tab3)以及待测样品自4×10μg/ml起作10倍梯度稀释。
(5)将梯度稀释后的抗体溶液加入细胞悬液孵育0.5小时。
(6)离心收集PBMC，调整细胞密度至2.5×106细胞/毫升，每孔加入100μl PBMC细胞悬液。
(7)37℃,5％CO2条件下孵育15小时。
(8)将细胞板离心，2000转，3分钟，取50μl上清加入新的96孔板。
(9)每孔加入50μl LDH检测试剂，用FlexStation3检测OD492和OD650。
检测结果通过建立的标准曲线分析后结果如图10和下表3所示。
表3各重组单域抗体对MDA-MB-453细胞ADCC效应的EC50
Figure BDA0002407624090000111
结果显示抗体4E5、4A9、4C10、3G10和3C2与阳性抗体的ADCC效应基本相当，其余抗体具有一定的ADCC作用，但效应一般。
实施例14
EpCAM蛋白的特异性单域抗体的CDC效应检测
本实施例的目的是对特异性针对EpCAM的Fc融合单域抗体进行CDC效应检测，所涉的Fc融合单域抗体是从实施例9中纯化获得的，所用的细胞是KATO-III细胞，CDC是指补体依赖的细胞毒性作用。实验步骤如下：
(1)离心收集细胞。
(2)用Assay buffer重悬MDA-MB-453细胞，调整细胞密度至2×105细胞/毫升。
(3)向384孔板中每孔铺入20μl细胞悬液。
(4)将EpCAM(公司内部编号RT05)的阳性单克隆抗体MOC31(Tab2)、3-17I(Tab3)以及待测样品自4×10μg/ml起作3倍梯度稀释。
(5)将梯度稀释后的抗体溶液加入细胞悬液孵育0.5小时。
(6)制备40％的人血浆，每孔加入10μl。
(7)37℃,5％CO2条件下孵育4小时。
(8)每孔加入30μl CTG检测试剂，用FlexStation3检测Luminescence。
检测结果通过建立的标准曲线分析后结果如图11和下表4所示。
表4各重组单域抗体对KATO-III细胞CDC效应的EC50
Figure BDA0002407624090000121
结果显示，抗体4C9、4C10与阳性抗体的CDC效应基本相当，抗体4E5、2C2、3C2、3G10、3C7、1H9、3A8、3C12和1D7具有一定的CDC作用，但效应一般，抗体1E9、3D2基本无CDC效应。
综上，本发明使用生物基因工程技术筛选出特异性结合EpCAM的单域抗体，这些单域抗体的亲和力较好，具有广阔的应用前景。此外这些单域抗体既可以在原核系统中表达，也可以在酵母细胞或哺乳动物细胞的真核系统中表达，且其在原核表达系统中的表达成本低，可降低后期生产成本；另外，由于单域抗体为单结构域抗体，所以其抗体的多组合形式改造更为简单，通过基因工程的方式简单的串联即可以获得多价、多特异性的抗体，并且其免疫异质性很低，在不经过人源化改造的情况下也不会产生较强的免疫反应。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南京融捷康生物科技有限公司
<120> 可特异性结合EpCAM的单域抗体及其应用
<160> 121
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Thr Trp Ser Thr Thr Cys Met Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala Leu Tyr Thr
35 40 45
Arg Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser
65 70 75 80
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Pro Ser
85 90 95
Thr Asp Phe Ser Cys Asp Tyr Arg Arg Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Thr Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gln Tyr Thr Trp Ser Thr Thr Cys Met Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala Ile Tyr Thr
35 40 45
Arg Ala Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Arg Asp Asn Ala Ile Asp Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser
65 70 75 80
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Pro Ala
85 90 95
Gln Ser Phe Ser Cys Thr Thr Arg Glu Ser Arg Gly Tyr Ser Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ala Gly Ser Ala Met Ala Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser Cys Ile Thr Trp
35 40 45
Ala Gly Ile Ile Thr Tyr Tyr Glu Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Val Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asp Ser
65 70 75 80
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Thr Gly Arg Gly
85 90 95
Ala Met Met Ser Arg Cys Ala Pro Asn Gly Val Ser Ala Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Asp Tyr Thr Trp Arg Thr Thr Cys Met Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Thr Val Tyr Thr
35 40 45
Arg Asn Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ala Ser Val Asn Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asp Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
65 70 75 80
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Arg Gly
85 90 95
Tyr Gly Asp Cys Gly Phe Ser Gly Asp Gln Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 5
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Thr Trp Ser Thr Val Cys Met Ser Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Thr Ile Tyr Thr
35 40 45
Arg Thr Ala Ser Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asp Thr Val His Leu Gln Met Asn Ser
65 70 75 80
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Ala Ala Gly Gly Val
85 90 95
Ser Gln Ser Gly Ser Trp Tyr Pro Cys Gly Arg Arg Ala Ala Asp Phe
100 105 110
Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 6
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Ala Tyr Thr Trp Ser Thr Thr Leu Met Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Thr Met Leu Thr
35 40 45
Arg Asn Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Thr Val Tyr Leu Gln Met Asp Ser
65 70 75 80
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Glu Tyr
85 90 95
Asp Ala Tyr Val Ile Thr Ala Leu Gln Leu Asn Ser Arg Trp Tyr Lys
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 7
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Val Ala Ser Asp Tyr Ser Trp Ser Ile Thr Cys Met Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Asn Ile Tyr Arg
35 40 45
Arg Asn Gly Gly Thr Tyr Ile Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Gln Asp Ser Ala Lys Asp Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser
65 70 75 80
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Pro Ala
85 90 95
Arg Leu Ser Gly Asp Pro Cys Arg Glu Ala Asp Tyr Asn Val Trp Ser
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ala Thr Asn Tyr Met Ala Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Glu Ile Ile Thr
35 40 45
Ala Gly Thr Ser Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Gln Asp Glu Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser
65 70 75 80
Leu Asn Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Gly Arg Asp Arg
85 90 95
Thr Arg Gly Tyr Gly Thr Phe Leu Leu Arg Arg Asp Glu Tyr Asn Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 9
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Asp Ala Ser Gly Tyr Ala Ala Arg Trp Ser Cys Met Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Ile Ala Gly Ile Asp Ala
35 40 45
Glu Gly Gly Thr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Val Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Glu Phe Asp Leu Glu Met Asn Asp
65 70 75 80
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Val Val Gly Trp
85 90 95
Ser Tyr Asn Cys Glu Asp Leu Arg Pro Glu Arg Val Asn Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Asn
1 5 10 15
Cys Thr Ala Ser Thr Tyr Thr Phe Gly Leu Ser Lys Cys Thr Gly Trp
20 25 30
Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Arg Glu Gly Val Ala Ala Ile Tyr
35 40 45
Thr Asp Gly Ser Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
50 55 60
Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asn
65 70 75 80
Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Ala Ala Val Ser
85 90 95
Arg Thr Ser Arg Gly Thr Cys Asp Asp Leu Leu Ile His Arg Lys Tyr
100 105 110
Asp Trp Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 11
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Arg Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Arg Tyr Ser Arg Arg Cys Met Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ser Ile Asn Thr
35 40 45
Gly Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser
65 70 75 80
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Thr Asp
85 90 95
Arg Ser Tyr Gly Pro Gly Tyr Cys Ser Leu Ser Leu Gly Asn Glu Tyr
100 105 110
Asn Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 12
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Asp Val Asn Tyr Phe Ile Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val Ala Ala Ile Tyr Val
35 40 45
Ala Arg Gly Ile Pro Phe Tyr Ala Asp Ser Glu Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Gln Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Ser Ser
65 70 75 80
Leu Asn Ser Gln Asp Thr Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ala Gly Lys Arg
85 90 95
Ala Gly Thr Tyr Asp Arg Ser Trp Tyr Glu Tyr Pro Ala Leu Asn Pro
100 105 110
Ala Gly Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 13
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 13
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Ala Tyr Thr Arg Ser Asn Tyr Phe Val Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Thr Ile Ser Ala
35 40 45
Gly Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Gly Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser
65 70 75 80
Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Pro Ala
85 90 95
Cys Gly Ile Gly Asp Pro Leu Cys Ala Tyr Gly Tyr Val Phe Arg Gly
100 105 110
Gln Gly Tyr Asp Tyr Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 14
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 14
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Ala Tyr Thr Arg Ser Ile Gln Phe Val Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Thr Ile Ser Pro
35 40 45
Ala Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser
65 70 75 80
Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Pro Thr
85 90 95
Trp Arg Ile Gly Ala Pro Leu Ser Ala Tyr Gly Tyr Val Phe Arg Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 15
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 15
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Val Ser Gly Ile Ile Ala Arg Thr Cys Ala Met Gly Trp Tyr
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Leu Val Ser Arg Met Leu Lys
35 40 45
Asp Ser Thr Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Asn Leu Gln Met Asn Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Asn Ala Val Cys Arg Tyr
85 90 95
Pro Val Thr Gly Val Ser Arg Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 16
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 16
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Val Ser Gly Tyr Thr Tyr Arg Tyr Ser Ser Cys Leu Ala Trp
20 25 30
Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Gly Leu Asn
35 40 45
Pro Gly Ile Gly Arg Thr Tyr His Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
50 55 60
Thr Ile Ser Gln Asp Asn Thr Tyr Asn Thr Val Tyr Leu Glu Met Asn
65 70 75 80
Gly Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Phe
85 90 95
Ser Cys Ser Gly Ser Leu Leu Arg Ser Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 17
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gagagcggcg gcggcagcgt gcaggccggc ggcagcctga ggctgagctg cgccgccagc 60
gagtacacct ggagcaccac ctgcatgggc tggttcaggc aggcccccgg caaggagagg 120
gagggcgtgg ccgccctgta caccaggagg ggcagcacct actacgccga cagcgtgaag 180
ggcaggttca ccatcagcag ggacaacgcc gagaacaccg tgtacctgca gatgaacagc 240
ctgaagcccg aggacaccgc catgtactac tgcgccagcg gccccagcac cgacttcagc 300
tgcgactaca ggaggagcaa cggctacaac tactggggcc agggcaccca ggtgaccgtg 360
agcagc 366
<210> 18
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gagagcggcg gcggcagcgt gcaggccggc ggcagcctga ccctgagctg cgccgccagc 60
cagtacacct ggagcaccac ctgcatgggc tggttcaggc aggcccccgg caaggagagg 120
gagggcgtgg ccgccatcta caccagggcc ggcaccacct actacgccga cagcgtgaag 180
gacaggttca ccatcagcag ggacaacgcc atcgacaccg tgtacctgca gatgaacagc 240
ctgaagcccg aggacaccgc catgtactac tgcgccgccg gccccgccca gagcttcagc 300
tgcaccacca gggagagcag gggctacagc tactggggcc agggcaccca ggtgaccgtg 360
agcagc 366
<210> 19
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gagagcggcg gcggcctggt gcagcccggc ggcagcctga ggctgagctg caccgccagc 60
ggcttcgact tcgccggcag cgccatggcc tggttcaggc aggcccccgg caaggagagg 120
gagggcgtga gctgcatcac ctgggccggc atcatcacct actacgagga cagcgtgaag 180
ggcaggttca ccgtgagcaa ggacaacgcc aagaacaccc tgtacctgca gatggacagc 240
ctgaagcccg aggacaccgc catgtactac tgcgccaccg gcaggggcgc catgatgagc 300
aggtgcgccc ccaacggcgt gagcgcctgg ggccagggca cccaggtgac cgtgagcagc 360
<210> 20
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gagagcggcg gcggcagcgt gcagcccggc ggcagcctga ggctgagctg cgccgccagc 60
gactacacct ggaggaccac ctgcatgggc tggttcaggc aggcccccgg caaggagagg 120
gagggcgtgg ccaccgtgta caccaggaac ggcagcacct actacgccgc cagcgtgaac 180
ggcaggttca ccatcagcag ggacaacgcc gaggacaccc tgtacctgca gatgaacagc 240
ctgaagcccg aggacaccgc catgtactac tgcgccgccg gcaggggcta cggcgactgc 300
ggcttcagcg gcgaccagta caactactgg ggccagggca cccaggtgac cgtgagcagc 360
<210> 21
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gagagcggcg gcggcagcgt gcaggccggc ggcagcctga ggctgagctg cgccgccagc 60
gagtacacct ggagcaccgt gtgcatgagc tggttcaggc aggcccccgg caaggagagg 120
gagggcgtgg ccaccatcta caccaggacc gccagcacca tctacgccga cagcgtgaag 180
ggcaggttca ccatcagcag ggacaacgcc aacgacaccg tgcacctgca gatgaacagc 240
ctgaagcccg aggacaccgc catgtacttc tgcgccgccg gcggcgtgag ccagagcggc 300
agctggtacc cctgcggcag gagggccgcc gacttcggct actggggcca gggcacccag 360
gtgaccgtga gcagc 375
<210> 22
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gagagcggcg gcggcagcgt gcaggccggc ggcagcctga ggctgagctg cgccgccagc 60
gcctacacct ggagcaccac cctgatgggc tggttcaggc aggcccccgg caaggagagg 120
gagggcgtgg ccaccatgct gaccaggaac ggcatcacct actacgccga cagcgtgaag 180
ggcaggttca ccatcagcag ggacaacgcc aaggacaccg tgtacctgca gatggacagc 240
ctgaagcccg aggacaccgc catgtactac tgcgccgccg gcgagtacga cgcctacgtg 300
atcaccgccc tgcagctgaa cagcaggtgg tacaagtact ggggccaggg cacccaggtg 360
accgtgagca gc 372
<210> 23
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gagagcggcg gcggcagcgt gcaggccggc ggcagcctga ggctgagctg cgtggccagc 60
gactacagct ggagcatcac ctgcatgggc tggttcaggc aggcccccgg caaggagagg 120
gagggcgtgg ccaacatcta caggaggaac ggcggcacct acatcgccga gagcgtgaag 180
ggcaggttca ccatcagcca ggacagcgcc aaggacaccg tgtacctgca gatgaacagc 240
ctgaagcccg aggacaccgc cctgtactac tgcgccgcca ggcccgccag gctgagcggc 300
gacccctgca gggaggccga ctacaacgtg tggagccagg gcacccaggt gaccgtgagc 360
agc 363
<210> 24
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gagagcggcg gcggcagcgt gcaggccggc ggcagcctga ggctgagctg cgccgccagc 60
ggctacacct acgccaccaa ctacatggcc tggttcaggc aggcccccgg caaggagagg 120
gagggcgtgg ccgagatcat caccgccggc accagcacca ggtacgccga cagcgtgaag 180
ggcaggttca ccatcagcca ggacgaggcc aagaacaccg tgtacctgca gatgaacagc 240
ctgaaccccg aggacaccgc catgtactac tgcgccggca gggacaggac caggggctac 300
ggcaccttcc tgctgaggag ggacgagtac aactactggg gccagggcac ccaggtgacc 360
gtgagcagc 369
<210> 25
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gagagcggcg gcggcagcgt gcaggccggc ggcagcctga ggctgagctg cgacgccagc 60
ggctacgccg ccaggtggag ctgcatgggc tggttcaggc aggcccccgg caagggcagg 120
gagggcatcg ccggcatcga cgccgagggc ggcaccacca ggtacgccga cagcgtgaag 180
ggcaggttca ccgtgagcag ggacaacacc aagaacgagt tcgacctgga gatgaacgac 240
ctgaagcccg aggacaccgc catgtactac tgcgccgtgg tgggctggag ctacaactgc 300
gaggacctga ggcccgagag ggtgaacagc tggggccagg gcacccaggt gaccgtgagc 360
agc 363
<210> 26
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
gagagcggcg gcggcagcgt gcaggccggc ggcagcctga ggctgaactg caccgccagc 60
acctacacct tcggcctgag caagtgcacc ggctggttca ggcaggcccc cggcaaggac 120
agggagggcg tggccgccat ctacaccgac ggcagcagcc cctactacgc cgacagcgtg 180
aagggcaggt tcaccatcag ccaggacaac gccaagaaca ccgtggacct gcagatgaac 240
agcctgaagc ccgaggacac cgccatgtac ttctgcgccg ccgtgagcag gaccagcagg 300
ggcacctgcg acgacctgct gatccacagg aagtacgact ggtggggcca gggcacccag 360
gtgaccgtga gcagc 375
<210> 27
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
gagagcggcg gcggcagcgt gagggccggc ggcagcctga ggctgagctg cgccgccagc 60
ggctacaggt acagcaggag gtgcatgggc tggttcaggc aggcccccgg caaggagagg 120
gagggcgtgg ccagcatcaa caccggcgac ggcagcacct actacggcga cagcgtgaag 180
ggcaggttca ccatcagcca ggacaacgcc aagaacaccg tgtacctgca gatgaacagc 240
ctgaagcccg aggacaccgc catgtactac tgcgccgccg acaccgacag gagctacggc 300
cccggctact gcagcctgag cctgggcaac gagtacaaca gctggggcca gggcacccag 360
gtgaccgtga gcagc 375
<210> 28
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
gagagcggcg gcggcagcgt gcaggccggc ggcagcctga ggctgagctg cgccgccagc 60
ggctacaccg acgtgaacta cttcatcggc tggttcaggc aggtgcccgg caaggagagg 120
gaggccgtgg ccgccatcta cgtggccagg ggcatcccct tctacgccga cagcgagaag 180
ggcaggttca ccatcagcca ggacaacacc aagaacaccg tgtacctgca gatgagcagc 240
ctgaacagcc aggacaccgc catgtacctg tgcgccgccg gcaagagggc cggcacctac 300
gacaggagct ggtacgagta ccccgccctg aaccccgccg gctacgacta ctggggccag 360
ggcacccagg tgaccgtgag cagc 384
<210> 29
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
gagagcggcg gcggcagcgt gcaggccggc ggcagcctga ggctgagctg cgccgccagc 60
gcctacacca ggagcaacta cttcgtgggc tggttcaggc aggcccccgg caaggagagg 120
gagggcgtgg ccaccatcag cgccggcggc ggcaccacct actacgccga cagcggcaag 180
ggcaggttca ccatcagcca ggacaacgcc aagaacaccg tgtacctgca gatgaacagc 240
ctgaagagcg aggacaccgc catgtactac tgcgccgccg cccccgcctg cggcatcggc 300
gaccccctgt gcgcctacgg ctacgtgttc aggggccagg gctacgacta caccgtgagc 360
agc 363
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<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
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gagagcggcg gcggcagcgt gcaggccggc ggcagcctga ggctgagctg cgccgccagc 60
gcctacacca ggagcatcca gttcgtgggc tggttcaggc aggcccccgg caaggagagg 120
gagggcgtgg ccaccatcag ccccgccgac ggcaccacct actacgccga cagcgtgaag 180
ggcaggttca ccatcagcca ggacaacgcc aagaacaccg tgtacctgca gatgaacagc 240
ctgaagcccg acgacaccgc catgtactac tgcgccgccg cccccacctg gaggatcggc 300
gcccccctga gcgcctacgg ctacgtgttc aggggccagg gcacccaggt gaccgtgagc 360
agc 363
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
gagagcggcg gcggcagcgt gcaggccggc ggcagcctga ggctgagctg cgccgtgagc 60
ggcatcatcg ccaggacctg cgccatgggc tggtacaggc aggcccccgg caaggagagg 120
gacctggtga gcaggatgct gaaggacagc accaccctgt acgccgacag cgtgaagggc 180
aggttcacca tcagccagga caacgccaag aacaccatga acctgcagat gaacagcctg 240
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<212> DNA
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<400> 32
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ggctacacct acaggtacag cagctgcctg gcctggttca ggcaggcccc cggcaaggag 120
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aagggcaggt tcaccatcag ccaggacaac acctacaaca ccgtgtacct ggagatgaac 240
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Gly Ile Ile Ala Arg Thr Cys Ala
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Tyr Val Phe Arg
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Ala Ala Ala Pro Thr Trp Arg Ile Gly Ala Pro Leu Ser Ala Tyr Gly
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Tyr Val Phe Arg
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Ala Ala Asp Thr Asp Arg Ser Tyr Gly Pro Gly Tyr Cys Ser Leu Ser
1 5 10 15
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<213> 人工序列
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Ala Ala Gly Glu Tyr Asp Ala Tyr Val Ile Thr Ala Leu Gln Leu Asn
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<213> 人工序列
<400> 70
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<213> 人工序列
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Ala Ala Gly Lys Arg Ala Gly Thr Tyr Asp Arg Ser Trp Tyr Glu Tyr
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<213> 人工序列
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Ala Ala Gly Pro Ala Gln Ser Phe Ser Cys Thr Thr Arg Glu Ser Arg
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Gly Tyr Ser Tyr Trp
20
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<213> 人工序列
<400> 73
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<213> 人工序列
<400> 74
Ala Ala Arg Pro Ala Arg Leu Ser Gly Asp Pro Cys Arg Glu Ala Asp
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Tyr Asn Val Trp
20
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<213> 人工序列
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Ala Ala Val Ser Arg Thr Ser Arg Gly Thr Cys Asp Asp Leu Leu Ile
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20
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<400> 77
Ala Ser Gly Pro Ser Thr Asp Phe Ser Cys Asp Tyr Arg Arg Ser Asn
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Gly Tyr Asn Tyr Trp
20
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<213> 人工序列
<400> 78
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<213> 人工序列
<400> 79
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<213> 人工序列
<400> 80
Asn Ala Val Cys Arg Tyr Pro Val Thr Gly Val Ser Arg Ser Tyr Trp
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<213> 人工序列
<400> 81
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Thr Ala Ser
20
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<211> 20
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<213> 人工序列
<400> 82
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Asn
1 5 10 15
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20
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<211> 20
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<213> 人工序列
<400> 83
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser
20
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 84
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
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Cys Ala Val Ser
20
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
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Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
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Cys Asp Ala Ser
20
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<213> 人工序列
<400> 86
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
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Cys Val Ala Ser
20
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 87
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Thr Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser
20
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<213> 人工序列
<400> 88
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser
20
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 89
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Arg Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser
20
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<213> 人工序列
<400> 90
Ile Gly Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val Ala
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Ala
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<213> 人工序列
<400> 91
Leu Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala
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Gly
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<213> 人工序列
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Glu
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<213> 人工序列
<400> 93
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1 5 10 15
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<213> 人工序列
<400> 94
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Ala
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<213> 人工序列
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Asn
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<400> 97
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1 5 10 15
Thr
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<213> 人工序列
<400> 98
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Gly
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<213> 人工序列
<400> 99
Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Leu Val Ser
1 5 10 15
Arg
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<211> 17
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<213> 人工序列
<400> 100
Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala
1 5 10 15
Thr
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<211> 17
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<213> 人工序列
<400> 101
Thr Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Arg Glu Gly Val Ala
1 5 10 15
Ala
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 102
Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala
1 5 10 15
Thr
<210> 103
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 103
Phe Tyr Ala Asp Ser Glu Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
1 5 10 15
Thr Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Asn Ser Gln Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Leu Cys
35
<210> 104
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 104
Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Asn Asp Thr Val His Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Phe Cys
35
<210> 105
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 105
Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Met Asn Leu Gln Met Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 106
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 106
Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Glu
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Asn Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 107
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 107
Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Thr Lys Asn Glu Phe Asp Leu Glu Met Asn Asp Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 108
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 108
Tyr His Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
1 5 10 15
Thr Tyr Asn Thr Val Tyr Leu Glu Met Asn Gly Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
35
<210> 109
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 109
Tyr Ile Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Ser
1 5 10 15
Ala Lys Asp Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
35
<210> 110
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 110
Tyr Tyr Ala Ala Ser Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Glu Asp Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 111
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 111
Tyr Tyr Ala Asp Ser Gly Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 112
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 112
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Ile Asp Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 113
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 113
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Phe Cys
35
<210> 114
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 114
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 115
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 115
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Glu Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 116
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 116
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asp Thr Val Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 117
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 117
Tyr Tyr Glu Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Lys Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 118
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 118
Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 119
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 119
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 120
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 120
Gly Gln Gly Tyr Asp Tyr Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 121
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 121
Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10

Claims (10)

1.一种可特异性结合EpCAM的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体具有如下互补决定区：CDR1、CDR2和CDR3；
其中，CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.33-48中的任意一种所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.49-64中的任意一种所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.65-80中的任意一种所示。
2.根据权利要求1所述的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体的互补决定区如以下(1)-(16)中的任意一项所示：
(1)CDR1如SEQ ID NO.38所示，CDR2如SEQ ID NO.61所示，CDR3如SEQ ID NO.77所示；
(2)CDR1如SEQ ID NO.47所示，CDR2如SEQ ID NO.57所示，CDR3如SEQ ID NO.72所示；
(3)CDR1如SEQ ID NO.40所示，CDR2如SEQ ID NO.54所示，CDR3如SEQ ID NO.78所示；
(4)CDR1如SEQ ID NO.37所示，CDR2如SEQ ID NO.64所示，CDR3如SEQ ID NO.73所示；
(5)CDR1如SEQ ID NO.39所示，CDR2如SEQ ID NO.58所示，CDR3如SEQ ID NO.70所示；
(6)CDR1如SEQ ID NO.35所示，CDR2如SEQ ID NO.63所示，CDR3如SEQ ID NO.68所示；
(7)CDR1如SEQ ID NO.36所示，CDR2如SEQ ID NO.55所示，CDR3如SEQ ID NO.74所示；
(8)CDR1如SEQ ID NO.45所示，CDR2如SEQ ID NO.50所示，CDR3如SEQ ID NO.76所示；
(9)CDR1如SEQ ID NO.42所示，CDR2如SEQ ID NO.49所示，CDR3如SEQ ID NO.79所示；
(10)CDR1如SEQ ID NO.48所示，CDR2如SEQ ID NO.56所示，CDR3如SEQ ID NO.75所示；
(11)CDR1如SEQ ID NO.43所示，CDR2如SEQ ID NO.51所示，CDR3如SEQ ID NO.67所示；
(12)CDR1如SEQ ID NO.44所示，CDR2如SEQ ID NO.59所示，CDR3如SEQ ID NO.71所示；
(13)CDR1如SEQ ID NO.34所示，CDR2如SEQ ID NO.52所示，CDR3如SEQ ID NO.65所示；
(14)CDR1如SEQ ID NO.33所示，CDR2如SEQ ID NO.53所示，CDR3如SEQ ID NO.66所示；
(15)CDR1如SEQ ID NO.41所示，CDR2如SEQ ID NO.62所示，CDR3如SEQ ID NO.80所示；
(16)CDR1如SEQ ID NO.46所示，CDR2如SEQ ID NO.60所示，CDR3如SEQ ID NO.69所示。
3.根据权利要求1或2所述的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体具有如下骨架区：FR1、FR2、FR3和FR4；
其中，FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.81-89中的任意一种所示；
优选地，FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.90-102中的任意一种所示；
优选地，FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.103-118中的任意一种所示；
优选地，FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.119-121中的任意一种所示。
4.根据权利要求3所述的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体的骨架区如下(a)-(k)中的任意一项所示：
(a)FR1如SEQ ID NO.83所示，FR2如SEQ ID NO.94所示，FR3如SEQ ID NO.115所示，FR4如SEQ ID NO.119所示；
(b)FR1如SEQ ID NO.87所示，FR2如SEQ ID NO.94所示，FR3如SEQ ID NO.112所示，FR4如SEQ ID NO.119所示；
(c)FR1如SEQ ID NO.81所示，FR2如SEQ ID NO.93所示，FR3如SEQ ID NO.117所示，FR4如SEQ ID NO.119所示；
(d)FR1如SEQ ID NO.88所示，FR2如SEQ ID NO.97所示，FR3如SEQ ID NO.110所示，FR4如SEQ ID NO.119所示；
(e)FR1如SEQ ID NO.83所示，FR2如SEQ ID NO.100所示，FR3如SEQ ID NO.104所示，FR4如SEQ ID NO.119所示；
(f)FR1如SEQ ID NO.83所示，FR2如SEQ ID NO.97所示，FR3如SEQ ID NO.116所示，FR4如SEQ ID NO.119所示；
(g)FR1如SEQ ID NO.86所示，FR2如SEQ ID NO.95所示，FR3如SEQ ID NO.109所示，FR4如SEQ ID NO.121所示；
(i)FR1如SEQ ID NO.83所示，FR2如SEQ ID NO.92所示，FR3如SEQ ID NO.106所示，FR4如SEQ ID NO.119所示；
(j)FR1如SEQ ID NO.85所示，FR2如SEQ ID NO.98所示，FR3如SEQ ID NO.107所示，FR4如SEQ ID NO.119所示；
(k)FR1如SEQ ID NO.82所示，FR2如SEQ ID NO.101所示，FR3如SEQ ID NO.113所示，FR4如SEQ ID NO.119所示；
(l)FR1如SEQ ID NO.89所示，FR2如SEQ ID NO.96所示，FR3如SEQ ID NO.118所示，FR4如SEQ ID NO.119所示；
(m)FR1如SEQ ID NO.83所示，FR2如SEQ ID NO.90所示，FR3如SEQ ID NO.103所示，FR4如SEQ ID NO.119所示；
(n)FR1如SEQ ID NO.83所示，FR2如SEQ ID NO.102所示，FR3如SEQ ID NO.111所示，FR4如SEQ ID NO.120所示；
(o)FR1如SEQ ID NO.83所示，FR2如SEQ ID NO.102所示，FR3如SEQ ID NO.114所示，FR4如SEQ ID NO.119所示；
(p)FR1如SEQ ID NO.84所示，FR2如SEQ ID NO.99所示，FR3如SEQ ID NO.105所示，FR4如SEQ ID NO.119所示；
(k)FR1如SEQ ID NO.84所示，FR2如SEQ ID NO.91所示，FR3如SEQ ID NO.108所示，FR4如SEQ ID NO.119所示。
5.根据权利要求4所述的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO.1-16中的任一项所示。
6.一种融合蛋白，其特征在于，其含有权利要求1-5任一项所述的单域抗体。
7.根据权利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为传统抗体或其功能性片段，或者所述融合蛋白为重链抗体；所述单域抗体作为所述融合蛋白的重链可变区；
优选地，所述功能性片段选自所述传统抗体的Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、scFv或sdFv。
8.一种分离的多核苷酸分子，其特征在于，所述多核苷酸分子编码如权利要求1-5任一项所述的单域抗体；
优选地，所述多核苷酸分子的碱基序列如SEQ ID NO.17-32中的任一种所示。
9.权利要求1-5任一项所述的单域抗体或者权利要求6或7所述的融合蛋白在制备产品中的应用，其特征在于，所述产品为：检测EpCAM蛋白的检测试剂、抗肿瘤药物、用于细胞免疫疗法的免疫细胞或往表达EpCAM蛋白的部位递送药物的载体。
10.一种产品，其特征在于，其含有权利要求1-5任一项所述的单域抗体或者权利要求6或7所述的融合蛋白，所述产品为检测EpCAM蛋白的检测试剂、抗肿瘤药物、用于细胞免疫疗法的免疫细胞或往表达EpCAM蛋白的部位递送药物的载体。
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