CN116731175A - 一种抗cd47的纳米抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗CD47的纳米抗体及其制备方法和应用，涉及生物医药技术领域。本发明提供的抗CD47纳米抗体具有亲和力高、特异性强、增强巨噬细胞吞噬能力的技术优势。靶向BCMA且能够分泌抗CD47纳米抗体的通用型CAR‑T细胞在异种移植肿瘤模型中显著抑制了肿瘤细胞的生长并延长了生存期，通用型CAR‑T细胞分泌的抗CD47抗体能够通过阻断“别吃我”信号增强巨噬细胞的吞噬能力，并与CAR‑T细胞协同发挥抗肿瘤活性。

Description

一种抗CD47的纳米抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及一种抗CD47的纳米抗体及其制备方法和应用。
背景技术
多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)是一种以骨髓中浆细胞(plasma cells,PCs)异常增殖和产生大量病理性免疫球蛋白为特征的肿瘤性疾病，在血液系统恶性肿瘤中多发性骨髓瘤的发病率仅次于淋巴瘤，约占血液系统恶性肿瘤的10％，发病率约为4.5～6/10万人，大多数患者年龄大于40岁，全球每年约有10万患者死于该病。BCMA(B-cellmaturation antigen；CD269；TNFRSF17)属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，在正常人体组织中，BCMA蛋白几乎只发现在浆细胞上，并且在浆细胞恶性转化过程中选择性地过度表达，促进肿瘤细胞生长、存活和耐药性的发生。BCMA在多发性骨髓瘤细胞表面的一致性上调和唯一性，使得BCMA成为多发性骨髓瘤药物发现和开发的一个引人注目的靶点。
CD47是一种在多种组织和细胞上广泛表达的跨膜糖蛋白，但同时在多种肿瘤细胞上也过度表达，成为一种重要的肿瘤抗原。CD47属于免疫球蛋白超家族，与整合素、血小板反应蛋白-1和信号调节蛋白α(SIRPα)多种蛋白质结合。CD47通过与免疫细胞上SIRPα的N末端结合，发出“别吃我”的信号抑制巨噬细胞的吞噬作用，从而保护健康细胞不被免疫系统破坏。而在肿瘤的天然免疫中，肿瘤细胞通过在表面过表达CD47分子，使巨噬细胞将其识别为“正常细胞”，从而逃避巨噬细胞介导的吞噬作用。与非恶性浆细胞相比，多发性骨髓瘤细胞通过广泛上调CD47并利用上述机制从而逃避吞噬细胞的清除作用，利用抗CD47的单克隆抗体阻断CD47与SIRPα的相互作用后发现巨噬细胞吞噬能力增强并有效抑制了多发性骨髓瘤细胞的生长。
纳米抗体(Nanobody,Nb)是来源于驼类或鲨鱼中重链抗体(HcAbs)的一种新型单域抗体片段。Nb被认为是目前发现的最小的(15kDa)具有结合完整抗原功能的抗体分子，与其他小分子基因工程抗体相比，Nb具有高稳定性、高可溶性、高亲和力、特异性强、与不同蛋白分子偶联的灵活性和易改造以及优良的组织穿透性等特点，受到各领域的高度关注，在疾病治疗和检测等领域具有广阔的开发和应用价值。
在血液系统恶性肿瘤治疗中，嵌合抗原受体T(Chimeric antigen receptor,CAR-T)细胞免疫疗法显示出良好的抗肿瘤效果，极大的提高了多种血液瘤患者的生存率，使得血液系统恶性肿瘤的治疗方式发生了革命性变化，并推动了其他免疫细胞疗法的发展。但是自体CAR-T细胞疗法仍然受诸多不利因素的影响而限制了其应用，例如经过多线治疗的患者体内T细胞数量减少或T细胞功能受损导致质量下降，制备过程周期长、成本高等，使患者错过了最佳治疗窗口。对健康供者来源的T细胞的TCR、B2M和CD52等介导个体间免疫反应的基因敲除，从而最大程度的降低GvHD和HvGR，进而制备成“现货型”通用CAR-T细胞(UCAR-T)能够在一定程度上克服自体CAR-T细胞的局限性。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗CD47的纳米抗体及其制备方法和应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种抗CD47的纳米抗体，纳米抗体包括如下任一项所示的重链可变区，且每个重链可变区均包含CDR1、CDR2和CDR3：
(1)如SEQ ID No.1～3所示；
(2)如SEQ ID No.5～7所示；
(3)如SEQ ID No.9～11所示；
(4)如SEQ ID No.13～15所示；
(5)如SEQ ID No.17～19所示；
(6)如SEQ ID No.21～23所示；
(7)如SEQ ID No.25～27所示；
(8)如SEQ ID No.29～31所示；
和(9)如SEQ ID No.33～35所示。
第二方面，本发明还提供了一种抗体，其含有上述的抗CD47的纳米抗体或包括上述的抗CD47的纳米抗体的重链可变区。
第三方面，本发明还提供了一种核酸分子或包含核酸分子的重组载体，核酸分子编码上述的抗CD47的纳米抗体；或核酸分子编码上述的抗体。
第四方面，本发明还提供了一种宿主细胞，其含有上述的重组载体。
第五方面，本发明还提供了一种抗体的制备方法，其包括：培养上述的宿主细胞，以获得抗体。
第六方面，本发明还提供了一种免疫缀合物或药物组合物，其包括上述的抗CD47的纳米抗体或上述的抗体。
第七方面，本发明还提供了一种嵌合抗原受体，嵌合抗原受体的嵌合抗原受体上还包括上述的抗CD47的纳米抗体。
第八方面，本发明还提供了一种CAR-T细胞，其包括上述的嵌合抗原受体；
在一种可选的实施方式中，CAR-T细胞包括通用型CAR-T细胞和自体CAR-T细胞中的至少一种。
第八方面，本发明还提供了上述的抗CD47的纳米抗体或上述的抗体或上述的分离的核酸或含分离的核酸的重组载体或上述的宿主细胞或上述的嵌合抗原受体或上述的CAR-T细胞在制备预防或治疗肿瘤的产品中的应用。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明以人的CD47为靶点，通过噬菌体展示技术制备可特异性结合CD47抗原的纳米抗体，纳米抗体亲和力在10-10～10-8M之间。
(2)抗CD47的纳米抗体除Nb471(重链可变区的CDR1～3的氨基酸序列如SEQ IDNo.29～31所示)外均未出现红细胞凝集现象，抗CD47纳米抗体均能够阻断CD47与SIRPα的结合，且Nb404(重链可变区的CDR1～3的氨基酸序列如SEQ ID No.5～7所示)阻断效率高于其他抗体并能够增强巨噬细胞的吞噬能力。
(3)提供了相应的重组载体、嵌合抗原受体以及CAR-T细胞。体内外实验证明靶向BCMA的UCAR-T细胞(BCBBz-UCART)和自分泌CD47-SIRPα阻断剂的UCAR-T细胞(BC404-UCART)在多发性骨髓瘤模型中均具有良好的抗肿瘤效果且BC404-UCART细胞治疗组未发生肿瘤复发现象，表明UCAR-T细胞分泌的抗CD47抗体能够通过阻断“别吃我”信号从而增强巨噬细胞的吞噬能力，并与UCAR-T细胞协同作用发挥抗肿瘤活性。
(4)本发明提供的抗CD47纳米抗体能够有效阻断CD47-SIRPα的结合并增强巨噬细胞的对肿瘤细胞的吞噬能力，可应用于制备诊断和治疗多发性骨髓瘤、非小细胞肺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺神经内分泌肿瘤、平滑肌肉瘤、乳腺癌、骨肉瘤、头颈部鳞状细胞癌、非霍奇金淋巴瘤、淋巴细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病和急性髓系白血病等中至少一种的药物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例中SDS-PAGE分析纯化后的重组蛋白CD47-mFc和CD47-His；其中M为Maker，1为还原，2为非还原；
图2是本发明实施例中利用间接ELISA分析抗CD47的纳米抗体与CD47蛋白的结合特异性；
图3是本发明实施例中利用间接ELISA比较抗CD47纳米抗体与CD47抗原的亲和力；
图4是本发明实施例中血凝试验检测抗CD47纳米抗体对人红细胞的凝集作用；
图5是本发明实施例中阻断试验检测抗CD47纳米抗体阻断CD47-SIRPα的作用；
图6是本发明实施例中CAR慢病毒载体结构示意图；
图7是本发明实施例中CAR在T细胞中表达效率检测；
图8是本发明实施例中BC404-UCART细胞分泌抗CD47纳米抗体的检测；
图9是本发明实施例中BC404-UCART细胞分泌的抗CD47纳米抗体对巨噬细胞活性影响；
图10是本发明实施例中BC404-UCART细胞对MM小鼠移植模型抗肿瘤生存期分析。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratoryManual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(Current Protocols inMolecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:ThePolymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(CurrentProtocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
第一方面，本发明提供了一种抗CD47的纳米抗体，纳米抗体包括如下任一项所示的重链可变区，且每个重链可变区均包含CDR1、CDR2和CDR3：
(1)如SEQ ID No.1～3所示；
(2)如SEQ ID No.5～7所示；
(3)如SEQ ID No.9～11所示；
(4)如SEQ ID No.13～15所示；
(5)如SEQ ID No.17～19所示；
(6)如SEQ ID No.21～23所示；
(7)如SEQ ID No.25～27所示；
(8)如SEQ ID No.29～31所示；
和(9)如SEQ ID No.33～35所示。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述纳米抗体还包括骨架区；其重链可变区的结构为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
在一种可选的实施方式中，纳米抗体为单价纳米抗体、多价纳米抗体、多特异性抗体和融合型纳米抗体中的至少一种。
名词解释：
单价纳米抗体：是用特异性的抗原从纳米抗体库中筛选得到的抗原特异性的纳米抗体，因其表面有大量的亲水残基，能保持严格的单体结构，且仅以这种单体形式就能高特异性、高亲和力地与其抗原相结合。
多价纳米抗体：多价抗体是识别同一种表位的单价抗体的聚合物，比对应的单价纳米抗体具有更高的抗原亲和力。多特异性抗体是识别不同表位的单价抗体的聚合物，能结合不同靶目标或同一靶目标的不同表位，比单价抗体具有更高的抗原识别能力。而纳米抗体结构简单，只有一个结构域，可通过短小的连接序列聚合在一起，从而转换成多价和多特异性的形式。
融合型纳米抗体：纳米抗体具有严格的单体特点且其相对分子质量很小，很容易通过基因工程技术与其他结构(如BSA、IgG-Fc等)结合形成新的融合分子，如能延长其半衰期的酶、抗菌肽或显影物质等。在新的融合分子中，纳米抗体与其靶抗原定向结合，与纳米抗体融合的部分就能发挥相应的功能。在临床，医生希望药物能在体内停留足够长的时间，然而纳米抗体的血液清除速度却很快，不利于它所携带的药物发挥作用。所以，通过基因技术将纳米抗体VHH和寿命较长的分子融合在一起，可以提高纳米抗体在血液中的存在时间即延长其半衰期，从而达到更好的治疗效果。
在一种可选的实施方式中，当纳米抗体为单价纳米抗体时，纳米抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4、8、12、16、20、24、28、32、36、37、38、39、40、41、42、43、44和45中任意一项所示。
SEQ ID No.37、38、39、40、41、42、43、44和45为人源化后的重链可变区的氨基酸序列。
在一种可选的实施方式中，纳米抗体为多价纳米抗体、多特异性抗体或融合型纳米抗体时，纳米抗体的重链可变区的氨基酸序列选自如SEQ ID No.4、8、12、16、20、24、28、32、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45所示。本发明还提供了一种抗BCMA的纳米抗体，所述纳米抗体包括：CDR1～3的氨基酸序列如以下任一项所示的重链可变区：(1)如SEQ IDNo.46～48所示；(2)如SEQ ID No.50～52所示；(3)如SEQ ID No.54～56所示。
第二方面，本发明还提供了一种抗体，其含有上述的抗CD47的纳米抗体或包括上述的抗CD47的纳米抗体的重链可变区。
在一些实施例中，抗体可以为全长抗体、重链抗体、嵌合抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体等等)、鼠源抗体、人源化抗体或抗原结合片段中的任意一种。抗原结合片段包括所述抗原结合片段选自抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种，只要它们展示出所期望的抗原结合活性。
本发明所述的“嵌合抗体”是将非人源性抗体的可变区与人抗体的恒定区或骨架区融合而成的抗体，可以减轻非人源性抗体诱发的免疫应答反应。
上述抗原结合片段也即抗体的功能性片段，通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能性片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本发明公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得上述的功能性片段。
上述抗原结合片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。
本发明还提供了一种抗体，其含有如前述的抗BCMA和CD47的纳米抗体或VHH链。
第三方面，本发明还提供了一种核酸分子或包含核酸分子的重组载体，核酸分子编码上述的抗CD47的纳米抗体；或核酸分子编码上述的抗体。
考虑到密码子的简并性，可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，编码上述抗体的基因序列可以进行修改，获得编码相同抗体的基因；也可以根据表达抗体宿主的密码子偏爱性，人工合成改造基因，以提高抗体的表达效率。
重组载体为表达载体或克隆载体，优选为表达载体，可以指任何重组的多核苷酸构建体，该构建体可通过转化，转染或转导的方式将目的DNA片段直接或间接(如包装成病毒)导入宿主细胞内，进行目的基因表达。
其中一种类型的载体是质粒，即环状双链DNA分子，可将目的DNA片段连接至质粒环中。另一种类型的载体为病毒载体，其可将目的DNA片段连接包装至病毒基因组中(如腺病毒，腺相关病毒，逆转录病毒，慢病毒，溶瘤病毒)。这些载体进入宿主细胞后，可以进行目的基因的表达。
在一种可选的实施方式中，病毒的基因组上还包括编码信号肽、铰链区、跨膜区和信号转导结构域的编码基因。
在一种可选的实施方式中，信号肽为CD8α信号肽、IL-2信号肽或GM-CSF信号肽；
在一种可选的实施方式中，信号转导结构域选自CD3ζ、4-1BB(CD137)、CD27、CD30、CD40、CD54、CD83、PD-1、ICOS(CD278)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、CD270、CD273、CD274、DAP10、CD223、CD134、CD150和CD152中的至少一种；
在一种可选的实施方式中，信号转导结构域包括CD3ζ和4-1BB胞内区；
在一种可选的实施方式中，跨膜区为CD28跨膜结构域、CD8跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的一种或多种；
在一种可选的实施方式中，铰链区为IgG1FC-CH2-CH3铰链区、IgG2FC-CH2-CH3铰链区、IgG4FC-CH2-CH3铰链区、CD28铰链区和CD8α铰链区中的一种或多种；
在一种可选的实施方式中，病毒上还包括编码BCMA抗原结合域的编码基因。通过在病毒基因组上插入编码BCMA抗原结合域的编码基因，有助于提升UCAR-T细胞在多发性骨髓瘤模型中的抗肿瘤效果。
在一种可选的实施方式中，BCMA抗原结合域的重链可变区的氨基酸序列选自SEQID NO.49、SEQ ID NO.53或SEQ ID NO.57。
第四方面，本发明还提供了一种宿主细胞，其含有上述的重组载体。
在一种可选的实施方式中，宿主细胞选自原核宿主细胞、真核宿主细胞和噬菌体中的至少一种；
在一种可选的实施方式中，原核宿主细胞为大肠杆菌、链霉菌、枯草杆菌或分枝杆菌；
在一种可选的实施方式中，真核宿主细胞为动物细胞、植物细胞或真菌；
在一种可选的实施方式中，动物细胞选自哺乳动物细胞、昆虫细胞或秀丽隐杆线虫；
哺乳动物细胞选自293细胞、293T细胞、293FT细胞、CHO细胞、COS细胞、小鼠L细胞、LNCaP细胞、633细胞、Vero、BHK细胞、CV1细胞、Hela细胞、MDCK细胞、Hep-2细胞和Per6细胞中的任一种。其中的293系列细胞、Per6细胞和CHO细胞是用于生产制备抗体或重组蛋白的常用哺乳动物细胞，为本领域普通技术人员所熟知。
在一种可选的实施方式中，真菌选自酿酒酵母、毕赤酵母、汉森酵母、假丝酵母、乳克鲁维酵母、构巢曲霉、粟酒裂殖酵母和解脂耶罗酵母中的任一种。假丝酵母例如选自白色假丝酵母或光滑假丝酵母。
第五方面，本发明还提供了一种抗体的制备方法，其包括：培养上述的宿主细胞，以获得抗体。具体地，本发明对宿主细胞的培养条件没有具体地限定，基于常规技术知识可获得能够使得宿主细胞表达产生所述抗体的培养条件。
第六方面，本发明还提供了一种免疫缀合物或药物组合物，其包括上述的抗CD47的纳米抗体或上述的抗体。
在一种可选的实施方式中，免疫缀合物还包括治疗剂；
在一种可选的实施方式中，治疗剂包括：免疫检查点相关制剂、毒素、因子、化疗药物、放射性核素、激酶抑制剂和细胞毒性剂中的至少一种。
免疫检查点相关制剂包括不限于：抑制性第二信号分子的抗体、PD-L1抑制剂、PD-1/PD-L1单抗药物。抑制性第二信号分子可以是PD-1；CTLA-4；PD-1和CTLA-4。
免疫检查点抑制剂治疗的相关生物标志物包括PD-L1、MSI/bMSI、TMB/bTMB、TNB及EGFR突变、ALK融合、TP53突变、KRAS突变。
在本发明应用较佳的实施方式中，PD-1/PD-L1单抗药物选自如下组中的至少一种：纳武单抗(Nivolumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)、皮地利珠单抗(Pidilizumab)、兰伯丽珠单抗(Lambrolizumab)、BMS-936559、阿特珠单抗(Atezolizumab)、AMP-224、AMP224、AUNP12、BGB108、MCLA134、MEDI0680、PDROOl、REGN2810、SHR1210、STIAllOX、STIAlllO、TSR042，BMS-936558、BGB-A317、BCD-100和JS001。
在一种可选的实施方式中，上述化疗药物选自紫杉烷类、长春花生物碱类，蒽环霉素类，表鬼臼毒素类，酪氨酸激酶抑制剂，夫拉平度、伊利替康及其代谢物SN-38、拓扑替康、替尼泊苷、依托泊苷、伊马替尼、吉非替尼、达努塞替、多柔吡星、柔红霉素、米托蒽醌、甲氨蝶呤、喜树碱和沙奎那韦中的任意一种或多种。
本发明所述的“药物组合物”表示组合在一起以实现某种特定目的的至少一种药物以及任选地可药用载体或辅料的组合。在某些实施方案中，所述药物组合物包括在时间和/或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本发明的目的。一些药物组合物是通过联合施用一些可药用成分或化合物，达到增强本发明的生物功效或减小药物副作用(例如，可以和其他抗肿瘤药物联合使用，增强抗肿瘤效果)。另一些药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收，增强稳定性或靶向性，延长半衰期，进而更好的发挥本发明的生物功效。
在一种可选的实施方式中，药物组合物包括药用赋形剂、载体和稀释剂中的至少一种。
本发明的优选技术方案中，上述载体为药学上可接受的载体，药学上可接受的载体包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮及其衍生物、聚乙烯醇及其衍生物、甲基纤维素及其衍生物、乙基纤维素及其衍生物、羟丙基纤维素及其衍生物、淀粉及其衍生物、聚乙二醇及其衍生物、乳糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖、山梨糖醇、糊精、微晶纤维素、丙烯酸树脂、磷酸氢钙、硬脂酸钙、硬脂酰富马酸钠、二氧化硅、二氧化钛、滑石粉、色靛中的一种或其组合。
赋形剂包括至少一种极性有机溶剂和至少一种增稠剂。
稀释剂例如选自药学上可接受的水或盐。
本发明的优选技术方案中，上述药物为注射剂。
第七方面，本发明还提供了一种嵌合抗原受体，嵌合抗原受体的抗原结合结构域包括如上述的抗CD47的纳米抗体或上述的抗体。
在一种可选的实施方式中，嵌合抗原受体还包括信号肽、铰链区、跨膜区和信号转导结构域；
在一种可选的实施方式中，单独含有CD47纳米抗体的CAR结构为：5’-信号肽-CD47抗原结合域-铰链区-跨膜区-信号转导结构域-3’。
信号肽为CD8α信号肽、IL-2信号肽或GM-CSF信号肽；
信号转导结构域选自CD3ζ、4-1BB(CD137)、CD27、CD30、CD40、CD54、CD83、PD-1、ICOS(CD278)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、CD270、CD273、CD274、DAP10、CD223、CD134、CD150和CD152中的至少一种。
在一种可选的实施方式中，信号转导结构域包括CD3ζ和4-1BB胞内区；
跨膜区为CD28跨膜结构域、CD8跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的一种或多种。
铰链区为IgG1FC-CH2-CH3铰链区、IgG2FC-CH2-CH3铰链区、IgG4FC-CH2-CH3铰链区、CD28铰链区和CD8α铰链区中的一种或多种。
在一种可选的实施方式中，嵌合抗原受体上还包括BCMA抗原结合域。嵌合抗原受体例如包括如下结构：5’-信号肽-BCMA抗原结合域-铰链区-跨膜区-信号转导结构域-P2A-信号肽-抗CD47的纳米抗体-3’。
在一种可选的实施方式中，BCMA抗原结合域的重链可变区的氨基酸序列选自SEQID NO.49、SEQ ID NO.53或SEQ ID NO.57。
第八方面，本发明还提供了一种CAR-T细胞，其包括上述的嵌合抗原受体。
在一种可选的实施方式中，CAR-T细胞包括通用型CAR-T细胞和自体CAR-T细胞中的至少一种。
第八方面，本发明还提供了上述的抗CD47的纳米抗体或上述的抗体或上述的分离的核酸或含分离的核酸的重组载体或上述的宿主细胞或上述的嵌合抗原受体或上述的CAR-T细胞在制备预防或治疗肿瘤的产品中的应用。
尤其是抗BCMA和CD47的纳米抗体、编码上述纳米抗体的核酸、宿主细胞或上述的嵌合抗原受体或上述的CAR-T细胞在制备预防或治疗肿瘤的产品中的应用。
本发明所述的“治疗”包括治愈、改善、降低患者的病情或病理特征，或抑制病情的恶化。
在一种可选的实施方式中，产品包括：免疫细胞、试剂、试剂盒、药物和药物组合物中的至少一种；
在一种可选的实施方式中，治疗肿瘤的产品包括靶向CD47以治疗或辅助治疗肿瘤的药物；
在一种可选的实施方式中，治疗肿瘤的产品包括靶向CD47和BCMA以治疗或辅助治疗肿瘤的药物；
在一种可选的实施方式中，肿瘤包括多发性骨髓瘤、非小细胞肺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺神经内分泌肿瘤、平滑肌肉瘤、乳腺癌、骨肉瘤、头颈部鳞状细胞癌、非霍奇金淋巴瘤、淋巴细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病和急性髓系白血病等中的至少一种。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1CD47蛋白真核表达载体的构建及CD47蛋白的表达、纯化
1.载体构建
以含有CD47全长基因的质粒为模板，设计引物扩增获得CD47胞外区基因，并利用同源重组的方式将其连接至经限制性内切酶PstⅠ和XbaⅠ双酶切后的pVax-MCS-His和pVax-MCS-mFc载体中，转化至DH5α感受态中涂布卡那抗性平板置于37℃温箱培养过夜，挑取单克隆测序鉴定。
2.重组蛋白的表达及纯化
将构建成功的含有CD47胞外区基因的重组质粒pVax-CD47(ECD)-mFc和pVax-CD47(ECD)-His分别转染至HEK293T细胞中，表达5天后收集培养上清，利用NTA-Ni柱通过亲和层析的方式纯化获得高纯度的重组蛋白CD47-mFc和CD47-His，结果如图1所示，成功获得高纯度的重组蛋白CD47-mFc和CD47-His。
实施例2抗CD47蛋白纳米抗体的筛选与制备
1.蛋白乳化与动物免疫
将纯化的CD47-mFc或CD47-His重组蛋白(1mg)与等体积的铝佐剂混匀后对双峰驼经颈部和背部皮下连续进行3次免疫，采集外周血测定抗体效价，冲击免疫后第7天采集外周抗凝血。
2.VHH噬菌体抗体文库的构建及淘选
(1)外周血淋巴细胞的分离
从骆驼颈部静脉无菌采集200mL外周抗凝血，先用等体积的RPMI-1640培养基稀释。再用Ficoll-Paque Plus淋巴细胞分离液分离获得外周血淋巴细胞，得到的淋巴细胞直接提取总mRNA。
(2)VHH基因扩增
按照RNeasy Plus Mini Kit说明书提取获得的淋巴细胞总mRNA，利用反转录试剂盒SuperScript III First-Strand Synthesis System以RNA为模板反转录获得cDNA，并利用巢式PCR扩增VHH基因，第一轮PCR所用引物为(CALL001；CALL002)，利用琼脂糖凝胶电泳分离并回收约700bp产物；以回收的700bp产物为模板进行第二轮PCR扩增，第二轮PCR所用引物为(VHH-FOR；VHH-REV)，利用琼脂糖凝胶电泳分离并回收400bp产物。
表1扩增VHH基因引物序列
(3)VHH噬菌体展示载体构建
将(2)中回收的400bp产物和噬菌体展示载体pMECS均用Pst I和Not I双酶切并回收，然后利用T4 DNA连接酶连接。
(4)噬菌体抗体文库的制备
将(3)中连接产物加入大肠杆菌TG1感受态细胞中通过电转的方式转化至TG1中，电转完成后立即加入SOC培养基并于37℃、200rpm培养1h，涂布于LB/Amp-Glu平板，37℃培养过夜后收集菌苔，加入15％甘油即为制备的噬菌体文库。
(5)噬菌体文库多样性和库容的测定
将电转化产物连续10倍稀释后涂布于LB/Amp-Glu平板，37℃过夜培养，计算转化子数量，最终得到库容量为2.77×109的噬菌体抗体文库。
(6)抗CD47蛋白特异性纳米抗体的筛选
以制备的噬菌体文库为抗体来源，利用噬菌体展示技术进行3轮亲和筛选，筛选过程采用红细胞反筛方法获得抗CD47的纳米抗体。从筛选的平板中随机挑选96个克隆扩大培养，利用单克隆ELISA鉴定其中能够特异性结合CD47蛋白的纳米抗体，结果表明共有94个为阳性克隆(P/N≥3.0，P代表CD47孔OD450数值，N代表对照孔OD450数值)；对阳性克隆测序结果比对分析，共获得9株抗CD47的特异性纳米抗体。
(7)抗CD47蛋白纳米抗体的特异性分析
以(6)中筛选获得的9株特异性纳米抗体的重组上清为一抗，与包被于酶标板中的CD47重组蛋白及其他无关抗原(CD22-mFc、CD123-mFc、CD5-His、CD7-His、CD276-mFc和mFc)共孵育，利用HRP anti-M13抗体检测，结果如图2所示，获得的9株纳米抗体与CD47蛋白均特异性结合，且不与其他无关抗原反应，表明上述纳米抗体均具有良好的特异结合活性。
实施例3抗CD47蛋白的特异性纳米抗体的制备
以含有纳米抗体基因的pMECS质粒为模板扩增VHH基因并通过同源重组的方式构建至真核表达载体pcDNA3.1-MCS-hFc中，经测序无误后提取质粒并利用PEI转染试剂将其转染至HEK293T细胞中，表达5天后收集上清，利用NTA-Ni柱纯化获得重组纳米抗体。
实施例4抗CD47蛋白的纳米抗体亲和力比较
以实施例3中制备获得的9株特异性纳米抗体为一抗，与包被于酶标板中的CD47重组蛋白(400ng/孔、200ng/孔、100ng/孔和50ng/孔)共孵育，利用HRP anti-human IgG抗体检测结合，结果如图3所示，上述纳米抗体与CD47蛋白均具有良好的结合活性。
实施例5Biacore检测纳米抗体与CD47蛋白的亲和力
根据实施例4结果，将重组纳米抗体和CD47配体SIRPα分别与包被于CM5芯片上的抗原CD47-mFc利用Biacore 8k仪器检测结合亲和力，结果如表2所示，抗CD47纳米抗体及其人源化纳米抗体的亲和力介于1.78×10-10M至2.87×10-8M之间，极显著的高于配体SIRPα与CD47蛋白的亲和力(121nM,P<0.001)。
表2抗CD47纳米抗体与CD47蛋白体外结合亲和力和动力学分析
实施例6血凝试验
为进一步检测筛选获得的抗CD47纳米抗体是否会引起红细胞凝集从而导致机体出现贫血现象，采集健康供者及肿瘤患者外周血于抗凝管中(n＝17)，并用PBS制备为2％红细胞悬液，将制备的红细胞悬液加入一次性U型血凝板中(100μL/孔)，加入纯化的抗CD47纳米抗体重组蛋白和阳性对照抗体CC2C6(100μg/mL)，然后4倍梯度稀释，同时将只加入红细胞悬液的孔设为Blank组，37℃静置孵育1h后观察并记录试验结果。结果如图4显示，抗CD47阳性对照抗体CC2C6对不同供者的红细胞在100～0.0244μg/mL时均具有强烈的凝集作用，抗CD47纳米抗体中Nb471对红细胞在100～6.25μg/mL时具有微弱凝集作用，其余纳米抗体均未出现红细胞凝集现象。
实施例7阻断试验
为验证本发明获得的抗CD47纳米抗体是否能够阻断CD47与SIRPα的结合，通过阻断ELISA检测：将CD47-His重组蛋白包被于酶标板，封闭后每孔加入0.25μg/mL抗CD47纳米抗体，37℃孵育1h，PBST洗涤3次后，每孔加入0.25μg/mL SIRPα-mFc，37℃孵育1h；孵育结束后利用HRP goat anti-mouse IgG抗体进行检测并计算不同抗体的阻断率。结果如图5所示，hu404的阻断率为80.76％，显著高于其他纳米抗体(P<0.05)，本发明将hu404作为候选抗体进一步研究。
实施例8UCAR-T细胞制备
(1)B2M和TRAC基因的敲除
采集健康供者外周血并分离淋巴细胞，利用CD3/CD28磁珠刺激活化增殖获得高纯度的T细胞，将靶向B2M和TRAC的sgRNA(表3)及Cas9蛋白复合物电转至T细胞中，通过流式细胞术检测基因敲除效率，并利用含有抗β2m和HLA抗体的磁珠纯化获得高纯度的B2M-/TRAC-T细胞。
表3敲除B2M和TRAC基因的sgRNA序列
(2)CAR慢病毒载体构建
以本实验室前期制备的抗BCMA人源化纳米抗体(hu388)和本发明中抗CD47人源化纳米抗体(hu404)质粒为模板扩增靶向BCMA和CD47的抗体基因并利用同源重组的方式克隆至pSLCAR-BBz质粒中，构建获得一种二代CAR，该CAR主要包含以下元件：CD8α信号肽、抗原结合域、CD8铰链区、CD28跨膜域、4-1BB胞内信号转导结构域和CD3ζ信号转导结构域；将构建的重组载体分别命名为BCBBz-CAR和BC404-CAR，其中BC404-CAR为在BCBBz-CAR的基础上通过P2A信号肽将抗CD47纳米抗体克隆至CD3ζ信号转导结构域之后(图6)。
(3)慢病毒感染制备UCAR-T细胞
将本发明中制备的CAR慢病毒质粒与包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染HEK293T细胞收集细胞上清超速离心浓缩后获得CAR慢病毒，再将其加入B2M-/TRAC-T细胞中制备成UCAR-T细胞。流式检测结果如图7所示，本发明中制备的BCBBz-UCART和BC404-UCART细胞中CAR的阳性率分别为90.0％和93.4％，表明UCAR-T细胞制备成功。
实施例9BC404-UCART细胞分泌抗CD47抗体的检测
为检测BC404-UCART细胞分泌抗体的能力，本发明利用SPR技术进行验证。将浓度为4.0×106/mL、2.0×106/mL、1.0×106/mL和5.0×105/mL的BC404-UCART细胞培养上清与固定于CM5芯片中的CD47蛋白孵育，通过Biacore 8k仪器进行检测。结果如图8所示，随着细胞培养密度的增加，响应值RU升高，表明本发明制备的BC404-UCART细胞能够分泌抗CD47的抗体hu404。
实施例10BC404-UCART细胞分泌的抗CD47抗体对巨噬细胞活性的影响
为研究BC404-UCART细胞自分泌的抗CD47纳米抗体hu404-hFc对THP-1极化的巨噬细胞功能的影响，本实施例将UCAR-T细胞(1.0×107/mL)上清与THP-1极化的巨噬细胞和RPMI-8226细胞共培养评价不同UCAR-T细胞分泌上清对巨噬细胞吞噬作用的影响。结果如图9所示，BC404-UCART细胞培养上清中抗CD47纳米抗体hu404-hFc极显著地增强了THP-1极化的巨噬细胞对骨髓瘤细胞的吞噬作用(P<0.001)。
实施例11体内检测UCAR-T细胞在MM小鼠移植模型中的抗肿瘤活性
将人多发性骨髓瘤细胞MM.1S-luciferase和RPMI-8226-luciferase细胞分别按照每只2×106个细胞通过尾静脉接种至6～10周龄的NCG小鼠中，接种10天后在活体成像仪中检测成瘤后将其随机分为4组，每组5只。分别给予PBS、Mock T、BCBBz-UCART和BC404-UCART处理，观察统计实验组和对照组每只小鼠的生存状态，观察统计时间长度为治疗后100天。利用Kaplan-Meier法绘制小鼠生存曲线并通过log-rank(Mantel-Cox)检验统计比较各组小鼠生存期的差异性。结果如图10所示，与PBS和Mock T组相比，靶向BCMA的BCBBz-UCART细胞和能够分泌CD47-SIRPα阻断剂的BC404-UCART细胞在多发性骨髓瘤模型中均具有良好的抗肿瘤效果，BC404-UCART细胞治疗组小鼠生存期显著优于BCBBz-UCART组，表明BC404-UCART细胞分泌的抗CD47抗体能够通过阻断“别吃我”信号从而增强巨噬细胞的吞噬能力，并与UCAR-T细胞协同作用发挥抗肿瘤活性。
前述实施例中所涉及的抗体序列及根据IMGT数据库分析比对汇总的CDR序列如下：
表4抗体的序列信息
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以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗CD47的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括如下任一项所示的重链可变区，且每个所述重链可变区均包含CDR1、CDR2和CDR3：
(1)如SEQ ID No.1～3所示；
(2)如SEQ ID No.5～7所示；
(3)如SEQ ID No.9～11所示；
(4)如SEQ ID No.13～15所示；
(5)如SEQ ID No.17～19所示；
(6)如SEQ ID No.21～23所示；
(7)如SEQ ID No.25～27所示；
(8)如SEQ ID No.29～31所示；
和(9)如SEQ ID No.33～35所示。
2.根据权利要求1所述的抗CD47的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体还包括骨架区；
优选地，所述纳米抗体为单价纳米抗体、多价纳米抗体、多特异性抗体和融合型纳米抗体中的至少一种；
优选地，当所述纳米抗体为单价纳米抗体时，所述纳米抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4、8、12、16、20、24、28、32、36、37、38、39、40、41、42、43、44和45中任意一项所示；
优选地，所述纳米抗体为多价纳米抗体、多特异性抗体或融合型纳米抗体时，所述纳米抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4、8、12、16、20、24、28、32、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45所示。
3.一种抗体，其特征在于，其含有权利要求1或2所述的抗CD47的纳米抗体或包括权利要求1或2所述的抗CD47的纳米抗体的重链可变区。
4.一种核酸分子或包含所述核酸分子的重组载体，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1或2所述的抗CD47的纳米抗体；或所述核酸分子编码权利要求3所述的抗体；
优选地，所述重组载体为质粒或病毒；
优选地，所述质粒为真核表达载体，所述病毒为慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒或溶瘤病毒；
优选地，所述慢病毒包括编码信号肽、铰链区、跨膜区和信号转导结构域的编码基因；
优选地，所述信号肽为CD8α信号肽、IL-2信号肽或GM-CSF信号肽；
优选地，所述信号转导结构域选自CD3ζ、4-1BB(CD137)、CD27、CD30、CD40、CD54、CD83、PD-1、ICOS(CD278)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、CD270、CD273、CD274、DAP10、CD223、CD134、CD150和CD152中的至少一种；
优选地，所述信号转导结构域包括CD3ζ和4-1BB胞内区；
优选地，所述跨膜区为CD28跨膜结构域、CD8跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的一种或多种；
优选地，所述铰链区为IgG1FC-CH2-CH3铰链区、IgG2FC-CH2-CH3铰链区、IgG4FC-CH2-CH3铰链区、CD28铰链区和CD8α铰链区中的一种或多种；
优选地，所述病毒的基因组上还包括编码BCMA抗原结合域的编码基因；
优选地，所述BCMA抗原结合域的重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO.49、SEQ IDNO.53或SEQ ID NO.57。
5.一种宿主细胞，其特征在于，其含有权利要求4所述的重组载体；
优选地，所述宿主细胞选自原核宿主细胞、真核宿主细胞和噬菌体中的至少一种；
优选地，所述原核宿主细胞为大肠杆菌、链霉菌、枯草杆菌或分枝杆菌；
优选地，所述真核宿主细胞为动物细胞、植物细胞或真菌；
优选地，所述动物细胞选自哺乳动物细胞、昆虫细胞或秀丽隐杆线虫；
所述哺乳动物细胞选自293细胞、293T细胞、293FT细胞、CHO细胞、COS细胞、小鼠L细胞、LNCaP细胞、633细胞、Vero、BHK细胞、CV1细胞、Hela细胞、MDCK细胞、Hep-2细胞和Per6细胞中的任一种；
优选地，所述真菌选自酿酒酵母、毕赤酵母、汉森酵母、假丝酵母、乳克鲁维酵母、构巢曲霉、粟酒裂殖酵母和解脂耶罗酵母中的任一种。
6.一种抗体的制备方法，其特征在于，其包括：培养权利要求5所述的宿主细胞，以获得抗体。
7.一种免疫缀合物或药物组合物，其特征在于，其包括权利要求1或2所述的抗CD47的纳米抗体或权利要求3所述的抗体；
优选地，所述免疫缀合物还包括治疗剂；
优选地，所述治疗剂包括：免疫检查点相关制剂、毒素、因子、化疗药物、放射性核素、激酶抑制剂和细胞毒性剂中的至少一种；
优选地，所述药物组合物包括药用赋形剂、载体和稀释剂中的至少一种。
8.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体上还包括权利要求1或2所述的抗CD47的纳米抗体；
优选地，所述嵌合抗原受体还包括信号肽、铰链区、跨膜区和信号转导结构域；
优选地，单独含有CD47纳米抗体的嵌合抗原受体结构为：5’-信号肽-CD47抗原结合域-铰链区-跨膜区-信号转导结构域-3’；
所述信号肽为CD8α信号肽、IL-2信号肽或GM-CSF信号肽；
所述信号转导结构域选自CD3ζ、4-1BB(CD137)、CD27、CD30、CD40、CD54、CD83、PD-1、ICOS(CD278)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、CD270、CD273、CD274、DAP10、CD223、CD134、CD150和CD152中的至少一种；
优选地，所述信号转导结构域包括CD3ζ和4-1BB胞内区；
所述跨膜区为CD28跨膜结构域、CD8跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的一种或多种；
所述铰链区为IgG1FC-CH2-CH3铰链区、IgG2FC-CH2-CH3铰链区、IgG4FC-CH2-CH3铰链区、CD28铰链区和CD8α铰链区中的一种或多种；
优选地，所述嵌合抗原受体还包括BCMA抗原结合域；
优选地，所述BCMA抗原结合域的重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO.49、SEQ IDNO.53或SEQ ID NO.57；
优选地，所述嵌合抗原受体包括如下结构：5’-信号肽-BCMA抗原结合域-铰链区-跨膜区-信号转导结构域-信号肽-抗CD47纳米抗体-3’。
9.一种CAR-T细胞，其特征在于，其包括如权利要求8所述的嵌合抗原受体；
优选地，所述CAR-T细胞包括通用型CAR-T细胞和自体CAR-T细胞中的至少一种。
10.如权利要求1或2所述的抗CD47的纳米抗体或权利要求3所述的抗体或如权利要求4所述的分离的核酸或含所述分离的核酸的重组载体或如权利要求5所述的宿主细胞或如权利要求8所述的嵌合抗原受体或如权利要求9所述的CAR-T细胞在制备预防或治疗肿瘤的产品中的应用；
优选地，所述产品包括：免疫细胞、试剂、试剂盒、药物和药物组合物中的至少一种；
优选地，所述治疗肿瘤的产品包括靶向CD47以治疗或辅助治疗肿瘤的药物；
优选地，所述治疗肿瘤的产品包括靶向CD47和BCMA以治疗或辅助治疗肿瘤的药物；
优选地，所述肿瘤包括多发性骨髓瘤、非小细胞肺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺神经内分泌肿瘤、平滑肌肉瘤、乳腺癌、骨肉瘤、头颈部鳞状细胞癌、非霍奇金淋巴瘤、淋巴细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病和急性髓系白血病中的至少一种。
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