CN116848135A - 新颖的抗gremlin1抗体 - Google Patents

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CN116848135A CN202280010207.XA CN202280010207A CN116848135A CN 116848135 A CN116848135 A CN 116848135A CN 202280010207 A CN202280010207 A CN 202280010207A CN 116848135 A CN116848135 A CN 116848135A
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李红俊
孙迪
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Abstract

本公开在本文中提供了抗gremlin1抗体或其抗原结合片段、编码其的分离的多核苷酸、包含其的药物组合物和其用途。

Description

新颖的抗GREMLIN1抗体
发明领域
本公开大体上涉及与人类gremlin1特异性结合的新颖的抗gremlin1(GREM1)抗体。
背景技术
Gremlin1(GREM1)为具有富含半胱氨酸的区域和半胱氨酸结的高度保守的分泌性蛋白质(Wordinger等人,《实验眼科研究(Exp Eye Res.)》2008年8月；87(2):78-79.)。其为成神经细胞瘤家族中差异筛选选择的基因异常(differential screening-selected geneaberrative in neuroblastoma；DAN)的成员，其充当骨形态生成蛋白(bonemorphogenetic protein；BMP)的拮抗剂(Wordinger等人,《实验眼科研究》2008年8月；87(2):78-79.)。GREM1可与BMP-2、BMP-4或BMP-7物理结合以形成异二聚体且防止BMP配体与其对应BMP受体相互作用，并且接着相继地抑制BMP信号传导路径的活化。
GREM1与肾脏、肺、肝脏和视网膜的纤维化病灶以及若干肿瘤类型，包括胰脏癌、结肠癌、肺癌、神经胶质瘤、胃癌和前列腺癌密切相关(Sneddon等人,《美国国家科学院院刊(PNAS)》2006年10月；103(40):14842-14847)。举例来说，异常gremlin1上调赋予干细胞生态位(stem cell niche)外部的结肠细胞具有致肿瘤性。还发现肿瘤干细胞高度表达且分泌gremlin1以维持其在神经胶质瘤中的干细胞性(Yan,K.等人,《基因发展(Genes Dev)》28,1085-1100(2014))。因此，gremlin1已在治疗gremlin相关疾病中用作治疗靶标。
然而，由于GREM1也在其它正常组织中表达，因此由于包括对正常组织的毒性的副作用，目前没有对GREM1相关疾病的有效治疗。因此，需要具有降低的副作用的新颖的抗gremlin1抗体。
发明内容
在整个本公开中，冠词“一(a/an)”和“所述”在本文中用于指一个(种)或多于一个(种)(即，至少一个(种))所述冠词的语法对象。举例来说，“抗体”意指一种抗体或多于一种抗体。
本公开尤其提供新颖的单克隆抗gremlin1(GREM1)抗体、编码此类抗体的核苷酸序列和其用途。当相较于现有抗GREM1抗体时，本文所提供的抗GREM1抗体与GREM1的不同区域结合并且对调节GREM1对骨形态发生蛋白质(BMP)结合的活性具有差异影响。确切地说，相对于非癌细胞，本文所提供的抗GREM1抗体能够选择性地降低癌细胞中GREM1介导的对BMP信号传导的抑制。这是出人意料的，并且解决了抗GREM1抗体由于gremlin在癌细胞以及非癌细胞中的普遍表达而引起的副作用这一长期存在的问题。
在一个方面中，本公开提供一种抗人类gremlin1(hGREM1)的分离抗体或其抗原结合片段，其具有以下特征中的至少一者：
a)相对于非癌细胞，能够选择性地降低癌细胞中hGREM1介导的对BMP信号传导的抑制；
b)在非癌细胞中展现hGREM1介导的对BMP信号传导的抑制降低不超过50％；
c)能够与包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的嵌合hGREM1结合；
d)能够与hGREM1结合而非与小鼠gremlin1特异性结合；
e)在包含残基Gln27和/或残基Asn33的表位处与hGREM1结合，其中残基编号是根据SEQ ID NO:69，或与包含残基Gln27和/或残基Asn33的hGREM1片段结合，任选地所述hGREM1片段具有至少3个(例如，4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸残基的长度；
f)能够以如通过Fortebio所测量的不超过1nM的KD与hGREM1结合；
h)能够以如通过ELISA所测量的大于50％的最大阻断百分比阻断hGREM1与BMP7的结合；
i)能够阻断GREM1与FGFR的相互作用；和/或
j)能够与hGREM1和DAN两者结合。
在某些实施方式中，表位为直链或构象表位。
在另一方面中，本公开提供一种抗人类gremlin1(hGREM1)的分离抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变(VH)区和/或轻链可变(VL)区，其中所述重链可变区包含：
a)HCDR1，其包含选自由以下组成的群组的序列：SEQ ID NO:1、11、21、31、114、119和123，
b)HCDR2，其包含选自由以下组成的群组的序列：SEQ ID NO:2、12、22、32和115，和
c)HCDR3，其包含选自由以下组成的群组的序列：SEQ ID NO:3、13、23、33、116、120和124，和/或
其中所述轻链可变区包含：
d)LCDR1，其包含选自由以下组成的群组的序列：SEQ ID NO:4、14、24、34、117、121、122和125，
e)LCDR2，其包含选自由以下组成的群组的序列：SEQ ID NO:5、15、25和35，和
f)LCDR3，其包含选自由以下组成的群组的序列：SEQ ID NO:6、16、26、36和118。
在某些实施方式中，本文所提供的抗hGREM1的抗体或其抗原结合片段的重链可变区选自由以下组成的群组：
a)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:1的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:2的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:3的序列的HCDR3；
b)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:11的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:12的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:13的序列的HCDR3；
c)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:21的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:22的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:23的序列的HCDR3；
d)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:31的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:32的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:33的序列的HCDR3；
e)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:114的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:115的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:116的序列的HCDR3；
f)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:119的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:115的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:120的序列的HCDR3；和
g)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:123的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:115的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:124的序列的HCDR3。
在某些实施方式中，本文所提供的抗hGREM1的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区可选自由以下组成的群组：
a)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:4的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:5的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:6的序列的LCDR3；
b)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:14的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:15的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:16的序列的LCDR3；
c)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:24的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:25的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:26的序列的LCDR3；
d)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:34的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:36的序列的LCDR3；
e)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:117的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:118的序列的LCDR3；
f)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:121的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:118的序列的LCDR3；
g)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:122的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:118的序列的LCDR3；和
h)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:125的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:118的序列的LCDR3。
在某些实施方式中，在本文所提供的抗体或其抗原结合片段中：
a)所述重链可变区包括包含SEQ ID NO:1的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:2的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:3的序列的HCDR3；并且所述轻链可变区包括包含SEQ ID NO:4的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:5的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:6的序列的LCDR3；
b)所述重链可变区包括包含SEQ ID NO:11的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:12的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:13的序列的HCDR3；并且所述轻链可变区包括包含SEQ IDNO:14的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:15的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:16的序列的LCDR3；
c)所述重链可变区包括包含SEQ ID NO:21的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:22的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:23的序列的HCDR3；并且所述轻链可变区包括包含SEQ IDNO:24的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:25的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:26的序列的LCDR3；
d)所述重链可变区包括包含SEQ ID NO:31的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:32的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:33的序列的HCDR3；并且所述轻链可变区包括包含SEQ IDNO:34的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:36的序列的LCDR3；
e)所述重链可变区包括包含SEQ ID NO:114的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:115的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:116的序列的HCDR3；并且所述轻链可变区包括包含SEQID NO:117的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:118的序列的LCDR3；
f)所述重链可变区包括包含SEQ ID NO:119的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:115的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:120的序列的HCDR3；并且所述轻链可变区包括包含SEQID NO:121的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:118的序列的LCDR3；
g)所述重链可变区包括包含SEQ ID NO:119的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:115的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:120的序列的HCDR3；并且所述轻链可变区包括包含SEQID NO:122的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:118的序列的LCDR3；或
h)所述重链可变区包括包含SEQ ID NO:123的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:115的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:124的序列的HCDR3；并且所述轻链可变区包括包含SEQID NO:125的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:118的序列的LCDR3。
在某些实施方式中，本文所提供的抗hGREM1的抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含选自由以下组成的群组的序列：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ IDNO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133和SEQ ID NO:134，和与其具有至少80％序列一致性但仍保持与hGREM1的特定结合特异性或亲和力的序列。
在某些实施方式中，本文所提供的抗hGREM1的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包含选自由以下组成的群组的序列：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:127、SEQID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136和SEQ ID NO:137，和与其具有至少80％序列一致性但仍保持与hGREM1的特定结合特异性或亲和力的序列。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段包含：
a)包含SEQ ID NO:7的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:8的序列的轻链可变区；或
b)包含SEQ ID NO:17的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:18的序列的轻链可变区；或
c)包含SEQ ID NO:27的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:28的序列的轻链可变区；或
d)包含SEQ ID NO:37的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:38的序列的轻链可变区；或
e)包含SEQ ID NO:126的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:127的序列的轻链可变区；或
f)包含SEQ ID NO:128的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:129的序列的轻链可变区；或
g)包含SEQ ID NO:128的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:130的序列的轻链可变区；或
h)包含选自由SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:45组成的群组的序列的重链可变区，和包含选自由SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:49组成的群组的序列的轻链可变区；或
i)选自由以下组成的群组的一对重链可变区和轻链可变区序列：SEQ ID NO:41/47、41/49、43/47、43/49、45/47和45/49；或
j)包含选自由SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:57组成的群组的序列的重链可变区，和包含选自由SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:61组成的群组的序列的轻链可变区；或
k)选自由以下组成的群组的一对重链可变区和轻链可变区序列：SEQ ID NO:51/59、51/61、53/59、53/61、55/59、55/61、57/59和57/61；或
l)包含选自由SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133和SEQ ID NO:134组成的群组的序列的重链可变区，和包含选自由SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136和SEQ IDNO:137组成的群组的序列的轻链可变区；或
m)选自由以下组成的群组的一对重链可变区和轻链可变区序列：SEQ ID NO:131/135、131/136、131/137、132/135、132/136、132/137、133/135、133/136、133/137、134/135、134/136和134/137。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段进一步包含一个或多个氨基酸残基取代或修饰，但仍保持与hGREM1的特定结合特异性或亲和力。
在某些实施方式中，取代或修饰中的至少一者在VH或VL序列的一个或多个CDR序列中，和/或在一个或多个非CDR区中。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段还包含免疫球蛋白恒定区，任选地人类Ig的恒定区，或任选地人类IgG的恒定区。
在某些实施方式中，恒定区包含人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区。
在某些实施方式中，恒定区包括包含SEQ ID NO:138的序列的重链恒定区和/或包含SEQ ID NO:139的序列的轻链恒定区。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段为人源化的。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段为双功能抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双功能抗体(ds双功能抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双功能抗体)、多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体和二价结构域抗体。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段是双特异性的。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段能够与hGREM1的第一和第二表位特异性结合，或能够与hGREM1和第二抗原两者特异性结合。
在某些实施方式中，本文所提供的第二抗原为免疫相关靶标。
在某些实施方式中，第二抗原包含PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、TIM-3、LAG3、A2AR、CD160、2B4、TGFβ、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、OX40、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD47、CD122、ICAM-1、IDO、NKG2C、SLAMF7、SIGLEC7、NKp80、CD160、B7-H3、LFA-1、1COS、4-1BB、GITR、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、CD3、CD16或CD83。
在某些实施方式中，第二抗原包含肿瘤抗原。
在某些实施方式中，肿瘤抗原包含肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原。
在某些实施方式中，肿瘤抗原包含前列腺特异性抗原(PSA)、CA-125、神经节苷脂G(D2)、G(M2)和G(D3)、CD20、CD52、CD33、Ep-CAM、CEA、铃蟾素样肽、HER2/neu、表皮生长因子受体(EGFR)、erbB2、erbB3/HER3、erbB4、CD44v6、Ki-67、癌症相关粘蛋白、VEGF、VEGFR(例如，VEGFR3)、雌激素受体、Lewis-Y抗原、TGFβ1、IGF-1受体、EGFα、c-Kit受体、转铁蛋白受体、紧密连接蛋白18.2、GPC-3、Nectin-4、ROR1、间皮素(methothelin)、PCMA、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5、BCR-ABL、E2APRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、IL-2R、CO17-1A、TROP2或LIV-1。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段对小鼠gremlin1不具有交叉反应性。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段对小鼠gremlin1具有交叉反应性。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段与一个或多个结合部分连接。
在某些实施方式中，结合部分包含清除调节剂、化学治疗剂、毒素、放射性同位素、镧系元素、发光标记、荧光标记、酶-底物标记、DNA烷基化剂、拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白结合剂或其它抗癌药物，例如雄激素受体抑制剂。
在另一方面中，本公开提供一种抗体或其抗原结合片段，其与本文所提供的抗体或其抗原结合片段竞争结合于hGREM1。
在另一方面中，本公开提供一种药物组合物或试剂盒，其包含本文所提供的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
在某些实施方式中，药物组合物或试剂盒进一步包含第二治疗剂。
在另一方面中，本公开提供一种分离的多核苷酸，其编码本文所提供的抗体或其抗原结合片段。
在另一方面中，本公开提供一种载体，其包含本文所提供的分离的多核苷酸。
在另一方面中，本公开提供一种宿主细胞，其包含本文所提供的载体。
在另一方面中，本公开提供一种表达本文所提供的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在可表达本文所提供的载体的条件下培养本文所提供的宿主细胞。
在另一方面中，本公开提供一种治疗受试者的GREM1相关疾病或病状的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所提供的抗体或其抗原结合片段，或本文所提供的药物组合物。
在另一方面中，本公开提供一种治疗有需要的受试者的GREM1相关疾病或病状的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的抗人类GREM1抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段：
a)能够在包含残基Gln27和/或残基Asn33的表位处与hGREM1结合，其中残基编号是根据SEQ ID NO:69，和/或
b)能够与包含残基Gln27和/或残基Asn33的hGREM1片段结合，任选地hGREM1片段具有至少3个(例如，4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸残基的长度；和/或
c)相对于非癌细胞，能够选择性地降低癌细胞中hGREM1介导的对BMP信号传导的抑制；和/或
d)在非癌细胞中展现hGREM1介导的对BMP信号传导的抑制降低不超过50％；和/或
e)能够与包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的嵌合hGREM1结合；和/或
f)能够以如通过Fortebio所测量的不超过1nM的KD与hGREM1结合；和/或
h)能够以如通过ELISA所测量的大于50％的最大阻断百分比阻断hGREM1与BMP7的结合；和/或
i)能够阻断GREM1与FGFR的相互作用。
在某些实施方式中，GREM1相关疾病或病状选自由以下组成的群组：癌症、纤维化疾病、血管生成、青光眼或视网膜疾病、肾病、肺动脉高血压或骨关节炎(OA)。
在某些实施方式中，癌症为表达GREM1的癌症。在某些实施方式中，表达GREM1的癌症也是表达PD-L1的癌症。在某些实施方式中，表达GREM1的癌症不是表达PD-L1的癌症。在某些实施方式中，表达GREM1的癌症对用PD-1/PD-L1轴抑制剂的治疗具有抗性或难治性。
在某些实施方式中，受试者鉴别为具有表达GREM1的癌细胞，或具有表达GREM1的癌症微环境。
在某些实施方式中，癌症为实体肿瘤或血液癌。
在某些实施方式中，实体肿瘤为肾上腺皮质癌瘤、肛门癌、星形细胞瘤、儿童小脑或大脑、基底细胞癌瘤、胆管癌、膀胱癌、骨骼肿瘤、脑癌、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、室管膜瘤、神经管胚细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视路和下丘脑神经胶质瘤、乳癌、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、子宫颈癌、结肠癌、肺气肿、子宫内膜癌、食道癌、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、成视网膜细胞瘤、胃癌(gastric/stomach cancer)、神经胶质瘤、头颈癌、心脏癌症、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、胰岛细胞癌瘤(内分泌胰腺)、卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、肝癌、肺癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、成视网膜细胞瘤、尤文氏家族肿瘤(Ewing family of tumors)、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、喉癌、甲状腺癌或阴道癌。
在某些实施方式中，血液癌为白血病(例如急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML))、淋巴瘤(例如霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)或非霍奇金氏淋巴瘤(例如，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia；WM)))或骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤(MM))。
在某些实施方式中，癌症为前列腺癌、胃-食道癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、肝癌、胰腺癌、乳癌、支气管癌、骨癌、肝脏和胆管癌、卵巢癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、脊柱癌、脑癌、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、肛门癌、胃肠癌、皮肤癌、垂体癌、胃癌、阴道癌、甲状腺癌、神经胶母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓发育不良综合症、肉瘤、畸胎瘤、神经胶质瘤或腺癌。
在某些实施方式中，癌症选自由以下组成的群组：前列腺癌、胃-食道癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、肝癌、结肠癌、结肠直肠癌、神经胶质瘤、胰腺癌、膀胱癌和乳癌。在某些实施方式中，癌症为三阴性乳癌。在某些实施方式中，癌症为多发性骨髓瘤。
在某些实施方式中，癌症为前列腺癌。
在某些实施方式中，纤维化疾病为肺、肝脏、肾脏、眼睛、皮肤、心脏、肠道或肌肉中的纤维化疾病。
在某些实施方式中，受试者为人类。
在某些实施方式中，所述施用是经由口、鼻、静脉内、皮下、舌下或肌肉内施用。
在某些实施方式中，本文所提供的方法进一步包括施用治疗有效量的第二治疗剂。
在某些实施方式中，第二治疗剂包含抗癌疗法，任选地所述抗癌疗法选自化学治疗剂(例如，顺铂(cisplatin))、抗癌药物、放射疗法、免疫治疗剂(例如免疫检查点调节剂，例如PD-1/PD-L1轴抑制剂和TGF-β抑制剂)、抗血管生成剂(例如，如VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3的VEGFR的拮抗剂)、靶向疗法药剂、细胞疗法药剂、基因疗法药剂、激素疗法药剂、细胞因子、姑息治疗(palliative care)、用于治疗癌症的手术(例如，肿瘤切除术)、一种或多种抗呕剂、由化学疗法引起的并发症的治疗、癌症患者的饮食补充剂(例如，吲哚-3-甲醇)、调节肿瘤微环境的药剂(例如，包含PD-L1结合部分和TGF-β受体的胞外结构域的双功能分子)或抗纤维化疗法(例如，BMP7治疗、ACE抑制剂(或ARB)、抗MASP2抗体、内皮素受体拮抗剂、NRF2抑制剂类固醇、CTLA4-IgG或TNF抑制剂)。在某些实施方式中，第二治疗剂包含顺铂。在某些实施方式中，第二治疗剂包含PD-1/PD-L1轴抑制剂。
在某些实施方式中，抗癌疗法包含抗前列腺癌药物。
在某些实施方式中，抗前列腺癌药物包含雄激素轴抑制剂；雄激素合成抑制剂；聚ADP-核糖聚合酶(PARP)抑制剂；或其组合。
在某些实施方式中，雄激素轴抑制剂选自由以下组成的群组：促黄体激素释放激素(Luteinizing hormone-releasing hormone；LHRH)激动剂、LHRH拮抗剂和雄激素受体拮抗剂。
在某些实施方式中，雄激素轴抑制剂为地加瑞克(degarelix)、比卡鲁胺(bicalutamide)、氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、阿帕鲁胺(apalutamide)、达洛鲁胺(darolutamide)、恩杂鲁胺(enzalutamide)或阿比特龙(abiraterone)。在某些实施方式中，雄激素合成抑制剂为乙酸阿比特龙(abiraterone acetate)或酮康唑(ketoconazole)。在某些实施方式中，PARP抑制剂为奥拉帕尼(olaparib)或卢卡帕尼(rucaparib)。
在某些实施方式中，抗前列腺癌药物选自由以下组成的群组：乙酸阿比特龙、阿帕鲁胺、比卡鲁胺、卡巴他赛(Cabazitaxel)、康士得(Casodex)(比卡鲁胺)、达洛鲁胺、地加瑞克、多西他赛(Docetaxel)、艾利加德(Eligard)(乙酸亮丙瑞林(Leuprolide Acetate))、恩杂鲁胺、艾利达(Erleada)(阿帕鲁胺)、费蒙格(Firmagon)(地加瑞克)、氟他胺、乙酸戈舍瑞林(Goserelin Acetate)、杰塔纳(Jevtana)(卡巴他赛)、乙酸亮丙瑞林、鲁普隆(Lupron)(乙酸亮丙瑞林)、鲁普隆贮存型(Lupron Depot)(乙酸亮丙瑞林)、利普卓(Lynparza)(奥拉帕尼)、盐酸米托蒽醌(Mitoxantrone Hydrochloride)、尼兰得隆(Nilandron)(尼鲁米特)、尼鲁米特、努贝卡(Nubeqa)(达洛鲁胺)、奥拉帕尼、普洛韦格(Provenge)(西普亮塞-T(Sipuleucel-T))、镭223二氯化物、鲁布拉卡(Rubraca)(樟脑磺酸卢卡帕尼(RucaparibCamsylate))、樟脑磺酸卢卡帕尼、西普亮塞-T、克癌易(Taxotere)(多西他赛)、多菲戈(Xofigo)(镭223二氯化物)、安可坦(Xtandi)(恩杂鲁胺)、诺雷德(Zoladex)(乙酸戈舍瑞林)和泽替加(Zytiga)(乙酸阿比特龙)。
在某些实施方式中，第二治疗剂包含吲哚-3-甲醇。
在另一方面中，本公开提供一种试剂盒，其包含本文所提供的抗体或抗原结合片段。
在另一方面中，本公开提供一种检测样品中GREM1的存在或量的方法，其包括使所述样品与本文所提供的抗体或其抗原结合片段接触，和测定所述样品中GREM1的存在或量。
在另一方面中，本公开提供本文所提供的抗体或其抗原结合片段在制造用于治疗受试者的GREM1相关疾病或病状的药剂中的用途。
在某些实施方式中，GREM1相关疾病或病状为癌症。
在某些实施方式中，GREM1相关疾病或病状为纤维化疾病、血管生成、青光眼、视网膜疾病、肾病、肺动脉高血压或骨关节炎(OA)。
附图说明
图1分别显示抗gremlin1抗体69H5、56C11、22F1和14E3与人类gremlin1(hGREM1)(图1A、图1C)和小鼠gremlin1(图1B、图1C)的结合，以及抗gremlin1抗体42B9、36F5和67G11与人类gremlin1(hGREM1)(图1D、图1F)和小鼠gremlin1(图1E、图1F)的结合，如通过ELISA所测量。
图2显示相对于gremlin-2、COCO和DAN-hFc，抗gremlin1抗体14E3与gremlin-1的结合特异性，如通过ELISA所测量。
图3显示gremlin1或XM5(gremlin 1-Dan融合蛋白)与BMP2/4/7的结合亲和力(图3A、图3D)、抗gremlin1抗体69H5、56C11、14E3或基准抗体6245P对gremlin1与BMP2(图3B)或BMP4(图3C)的结合的阻断活性，以及抗gremlin1抗体42B9、36F5、67G11和14E3 HaLa或基准抗体6245P对gremlin1与BMP2(图3E、图3H)或BMP4(图3F、图3H)或BMP7(图3G、图3H)的结合的阻断活性，如通过ELISA所测量。
图4显示抗gremlin1抗体69H5、56C11、22F1、14E3和基准抗体6245P阻断gremlin介导的对BMP4信号传导的抑制，如通过BMP诱导的报道子分析所测量。
图5显示相对于基准抗体6245P，抗gremlin1抗体14E3(图5A)、22F1(图5B)、56C11(图5C)和69H5(图5D)阻断gremlin介导的对BMP4信号传导的抑制，如通过BMP4诱导的ATDC-5细胞分化所测量。
图6显示gremlin1降低前列腺癌细胞(PC-3细胞)中BMP 4诱导的smad磷酸化的水平(图6A)，这通过前列腺癌细胞中的抗gremlin1抗体14E3、22F1、56C11和69H5恢复(图6B)，如通过蛋白质印迹(western blot)所测量。
图7显示在癌细胞和非癌细胞上抗gremlin1抗体14E3阻断gremlin介导的对BMP4信号传导的抑制。
图8显示如通过ELISA所测量的嵌合抗gremlin1抗体56C11-C和14E3-C与hGREM1的结合亲和力。
图9显示如通过Biacore所测量的嵌合抗gremlin1抗体14E3-C和22F1-C与hGREM1的结合动力学。
图10显示来自表位研究的结果，其中图10A至图10C显示如通过竞争ELISA分析所测量的抗gremlin1抗体14E3、22F1、56C11和69H5的表位分组(epitope binning)结果(图10A)、抗体14E3-C、22F1-C和基准抗体6245P的交叉竞争分析结果(图10B)以及如通过ELISA所测量的抗体14E3-C和基准抗体6245P与gremlin-DAN融合蛋白XM5的结合(图10C)，且图10D显示如通过生物膜干涉法(Biolayer Interferometry；BLI)分析所测量的14E3的表位定位，并且图10E和图10F显示如通过ELISA所测量的抗体42B9、36F5和67G11与人类gremlin或gremlin-DAN融合蛋白XM5的结合。
图11A和图11B显示如通过Fortebio所测量的本文所提供的抗gremlin1抗体14E3、56C11、22F1、69H5和基准抗体6245P的表位分析结果。结果显示相比于6245P的表位，14E3具有完全不重叠的表位，而56C11共有与6245P的表位类似的表位。
图12显示与基准抗体6245P相比，如通过ELISA(图12A至图12C)或Fortebio(图12D)所测量的人源化抗hGREM 1抗体14E3和22F1与hGREM1的结合亲和力。
图13显示抗GREM1抗体14E3降低PC3异种移植模型中前列腺癌的肿瘤体积(图13A)和肿瘤重量(图13B)。
图14显示抗GREM 1抗体56C11在CT-26结肠癌模型中的抗肿瘤作用。
图15A和图15B显示具有抗mGREM1抗体和免疫检查点抑制剂(例如，MPDL-3280A)的组合疗法在CT-26模型中的协同抗肿瘤作用。
图16显示利用抗GREM1抗体(14E3)或抗PD-L1抗体(22C3)对E7 PDX肿瘤样品中的GREM1或PD-L1的IHC染色。
图17A和图17B显示单独或与顺铂组合的人源化14E3(hzd 14E3)抑制gremlin阳性食道PDX模型中的肿瘤生长。单独的人源化14E3达成约43％肿瘤生长抑制(TGI)。单独的顺铂达成约60％ TGI。人源化14E3和顺铂的组合达成约64％ TGI。
图18显示Gremlin与FGFR1的结合(图18A)，以及gremlin分别与huIgG1、hIgG4、抗gremlin1抗体42B9、36F5、67G11、69H5-chi、36F5-chi、22F1-chi、56C11-chi和14E3HaLa以及基准抗体6245P的结合的阻断活性(图18B、图18C)，如通过ELISA所测量。
图19显示杂交瘤36F5(图19A)和嵌合36F5(36F5-chi)(图19B)与Gremlin-his和DAN-his的ELISA结合活性。
图20显示嵌合36F5(36F5-chi)阻断BMP4与DAN蛋白质的结合(图20A)和BMP2与DAN蛋白质的结合(图20B)。
图21显示杂交瘤36F5在EMT6/hPD-L1肿瘤模型中的抗肿瘤活性。图21A显示EMT6/hPD-L1肿瘤模型对抗PD-L1抗体AM4B6具有不良反应性。图21B显示杂交瘤36F5在EMT6/hPD-L1肿瘤模型中展现出抗肿瘤活性。
图22显示杂交瘤14E3或36F5在E7肿瘤模型中的抗肿瘤活性。图22A显示E7肿瘤模型对抗PD-L1抗体纳武单抗(Nivolumab)具有不良反应性，且杂交瘤14E3在E7肿瘤模型中展现出抗肿瘤活性。图22B显示E7肿瘤模型对抗PD-L1抗体纳武单抗具有不良反应性，且杂交瘤36F5在E7肿瘤模型中展现出抗肿瘤活性。
图23显示具有抗PDL1抗体的56C11组合疗法在MC38/hPD-L1肿瘤模型中的抗肿瘤活性。
具体实施方式
以下对本公开的描述仅打算说明本公开的各种实施方式。因此，所论述的具体修改不应被解释为对本公开的范围的限制。本领域的技术人员将显而易见的是，可在不脱离本公开的范围的情况下作出各种等效物、变化和修改，并且应理解，这些等效实施方式将包括在本文中。本文所引用的所有参考文献，包括出版物、专利和专利申请均以全文引用的方式并入本文中。
定义
如本文中所使用，除非本文中另外指示或与上下文明显矛盾，否则本发明的上下文中(尤其在权利要求书的上下文中)所使用的术语“一(a/an)”、“所述(the)”和类似术语应解释为涵盖单数和复数。
如本文中所使用的术语“抗体”包括与特异性抗原结合的任何免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多价抗体、二价抗体、单价抗体、多特异性抗体或双特异性抗体。天然完整抗体包含两条重(H)链和两条轻(L)链。哺乳动物重链分类为α、δ、ε、γ和μ，每条重链由一个可变区(VH)和第一、第二和第三恒定区(分别为CH1、CH2、CH3)组成；哺乳动物轻链分类为λ或κ，而每条轻链由一个可变区(VL)和一个恒定区组成。抗体呈“Y”形，其中Y的主干由经由二硫键结合在一起的两条重链的第二和第三恒定区组成。Y的每个臂包括与单条轻链的可变区和恒定区结合的单条重链的可变区和第一恒定区。轻链和重链的可变区负责抗原结合。两条链的可变区通常含有三个高度可变的环，称为互补决定区(CDR)(轻链CDR包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，重链CDR包括HCDR1、HCDR2、HCDR3)。本文所公开的抗体和抗原结合结构域的CDR边界可由Kabat、IMGT、AbM、Chothia或Al-Lazikani惯例来界定或鉴别(Al-Lazikani,B.,Chothia,C.,Lesk,A.M.,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》,273(4),927(1997)；Chothia,C.等人，《分子生物学杂志》12月5日；186(3):651-63(1985)；Chothia,C.和Lesk,A.M.,《分子生物学杂志》,196,901(1987)；N.R.Whitelegg等人，《蛋白质工程(Protein Engineering)》,v13(12),819-824(2000)；Chothia,C.等人，《自然(Nature)》.12月21-28日；342(6252):877-83(1989)；Kabat E.A.等人，马里兰州贝塞斯达美国国家卫生研究院(National Institutes of Health,Bethesda,Md.),(1991)；Marie-Paule Lefranc等人，《发展与比较免疫学(Developmental and Comparative Immunology)》,27:55-77(2003)；Marie-Paule Lefranc等人，《免疫组学研究(Immunome Research)》,1(3),(2005)；Marie-Paule Lefranc,《B细胞分子生物学(第二版)(Molecular Biology of B cells(second edition))》,第26章,481-514,(2015))。三个CDR插入于称为框架区(FR)的侧翼片段之间，所述框架区比CDR更高度保守且形成支撑高变环的支架。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但展现各种效应功能。基于抗体重链恒定区的氨基酸序列，将抗体分类。抗体的五种主要类别或同种型为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其特征在于分别存在α、δ、ε、γ和μ重链。将若干主要抗体类别划分为子类，如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链)或IgA2(α2重链)。在某些实施方式中，本文所提供的抗体涵盖其任何抗原结合片段。
如本文中所使用，术语“抗原结合片段”是指由包含一个或多个CDR的抗体的片段，或与抗原结合但不包含完整的原生抗体结构的任何其它抗体部分形成的抗体片段。抗原结合片段的实例包括但不限于双功能抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双功能抗体(ds双功能抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双功能抗体)、多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体和二价结构域抗体。抗原结合片段能够与亲本抗体所结合的相同抗原结合。在某些实施方式中，抗原结合片段可包含一个或多个来自特定亲本抗体的CDR。
关于抗体的“Fab”是指抗体的单价抗原结合片段，其由单条轻链(可变区和恒定区)通过二硫键与单条重链的可变区和第一恒定区结合而成。可通过在接近铰链区的重链之间的二硫键的N端的残基处木瓜蛋白酶消化抗体来获得Fab。
“Fab'”是指包括铰链区的一部分的Fab片段，其可通过在接近铰链区的重链之间的二硫键的C端的残基处胃蛋白酶消化抗体而获得，且因此在铰链区中的少量残基(包括一个或多个半胱氨酸)上与Fab不同。
“F(ab')2”是指Fab'的二聚体，其包含两条轻链和两条重链的一部分。
关于抗体的“Fv”是指最小的带有完整抗原结合位点的抗体片段。Fv片段由结合于单条重链的可变区的单条轻链的可变区组成。“dsFv”是指二硫键稳定的Fv片段，其中在单条轻链的可变区与单条重链的可变区之间的键联是二硫键。
“单链Fv抗体”或“scFv”是指由轻链可变区和重链可变区直接或经由肽连接子序列彼此连接组成的工程改造抗体(Huston JS等人《美国国家科学院院刊(Proc Natl AcadSci USA)》,85:5879(1988))。“scFv二聚体”是指包含具有连接子的两个重链可变区和两个轻链可变区的单链。在某些实施方式中，“scFv二聚体”为二价双功能抗体或二价scFv(BsFv)，其包含VH-VL(由肽连接子连接)与另一个VH-VL部分二聚，使得一个部分的VH与另一个部分的VL配位且形成可靶向相同抗原(或表位)或不同抗原(或表位)的两个结合位点。在其它实施方式中，“scFv二聚体”为双特异性双功能抗体，其包含VH1-VL2(由肽连接子连接)与VL1-VH2(也由肽连接子连接)结合，使得VH1与VL1配位且VH2与VL2配位并且每个配位对具有不同的抗原特异性。
“单链Fv-Fc抗体”或“scFv-Fc”是指由连接到抗体的Fc区的scFv组成的工程改造抗体。
“骆驼化单结构域抗体”、“重链抗体”、“纳米抗体”或“HCAb”是指含有两个VH结构域且不含轻链的抗体(Riechmann L.和Muyldermans S.,《免疫学方法杂志(J ImmunolMethods)》.12月10日；231(1-2):25-38(1999)；Muyldermans S.,《生物技术杂志(JBiotechnol)》.6月；74(4):277-302(2001)；WO94/04678；WO94/25591；美国专利第6,005,079号)。重链抗体最初是从骆驼科(Camelidae)(骆驼、单峰驼和美洲驼)获得的。虽然不含轻链，但骆驼化抗体具有真实的抗原结合谱系(Hamers-Casterman C.等人,《自然》.6月3日；363(6428):446-8(1993)；Nguyen VK.等人,“骆驼科的重链抗体；进化创新的案例(Heavy-chain antibodies in Camelidae；a case of evolutionary innovation),”《免疫遗传学(Immunogenetics)》.4月；54(1):39-47(2002)；Nguyen VK.等人,《免疫学(Immunology)》.5月；109(1):93-101(2003))。重链抗体的可变结构域(VHH结构域)代表由适应性免疫反应产生的已知最小的抗原结合单元(Koch-Nolte F.等人,《美国实验生物学学会联合会杂志(FASEB J.)》11月；21(13):3490-8.电子版2007年6月15日(2007))。“双功能抗体”包括具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中所述片段包含在单一多肽链中连接到VL结构域的VH结构域(VH-VL或VL-VH)(参见例如Holliger P.等人,《美国国家科学院院刊》7月15日；90(14):6444-8(1993)；EP404097；WO93/11161)。因为连接子太短，所以同一条链上的两个结构域无法配对，因此，迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。抗原结合位点可靶向相同或不同的抗原(或表位)。
“结构域抗体”是指仅含有重链的可变区或轻链的可变区的抗体片段。在某些实施方式中，两个或更多个VH结构域通过肽连接子共价接合以形成二价或多价结构域抗体。二价结构域抗体的两个VH结构域可靶向相同或不同的抗原。
在某些实施方式中，“(dsFv)2”包含三条肽链：两个VH部分通过肽连接子连接，且通过二硫桥与两个VL部分结合。
在某些实施方式中，“双特异性ds双功能抗体”包含经由VH1与VL1之间的二硫桥与VL1-VH2(也由肽连接子连接)结合的VH1-VL2(由肽连接子连接)。
在某些实施方式中，“双特异性dsFv”或“dsFv-dsFv'”包含三条肽链：VH1-VH2部分，其中重链由肽连接子(例如，长柔性连接子)结合，并且经由二硫桥分别与VL1和VL2部分配对。每条二硫键配对的重链和轻链具有不同的抗原特异性。
如本文中所使用的术语“人源化”意指抗体或抗原结合片段包含来源于非人类动物的CDR、来源于人类的FR区，以及当适用时，来源于人类的恒定区。在某些实施方式中，人源化gremlin抗体的可变区框架的氨基酸残基被取代以用于序列优化。在某些实施方式中，人源化gremlin抗体链的可变区框架序列与对应人类可变区框架序列至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％一致。
如本文中所使用的术语“嵌合”是指重链和/或轻链的一部分来源于一个物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同物种的抗体或抗原结合片段。在一说明性实例中，嵌合抗体可包含来源于人类的恒定区和来源于非人类物种(如小鼠)的可变区。
术语“生殖系序列”是指编码可变区氨基酸序列或子序列的核酸序列，与所有其它已知的由生殖系免疫球蛋白可变区序列编码的可变区氨基酸序列相比，所述序列与参考可变区氨基酸序列或子序列具有最高的确定氨基酸序列一致性。生殖系序列也可以指与所有其它评估的可变区氨基酸序列相比，与参考可变区氨基酸序列或子序列具有最高的氨基酸序列一致性的可变区氨基酸序列或子序列。生殖系序列可以是仅框架区、仅互补决定区、框架区和互补决定区、可变区段(如上文所定义)或包含可变区的序列或子序列的其它组合。可使用本文所描述的方法，例如使用BLAST、ALIGN或本领域中已知的另一种比对算法比对两个序列来确定序列一致性。生殖系核酸或氨基酸序列可与参考可变区核酸或氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性。可以例如通过可公开获得的国际免疫遗传学数据库(international ImMunoGeneTicsdatabase；IMGT)和V-base确定生殖系序列。
“抗人类gremlin1抗体”、“抗hGREM1抗体”或“抗人类gremlin1的抗体”在本文中可互换使用且是指能够与具有足够特异性和/或亲和力的人类gremlin1特异性结合以例如提供治疗用途的抗体。
如本文中所使用的术语“亲和力”是指免疫球蛋白分子(即，抗体)或其片段与抗原之间的非共价相互作用的强度。
如本文中所使用的术语“特异性结合(specific binding/specifically binds)”是指两个分子之间，例如抗体与抗原之间的非随机结合反应。在某些实施方式中，本文所提供的抗体或抗原结合片段以≤10-6M(例如，≤5×10-7M、≤2×10-7M、≤10-7M、≤5×10-8M、≤2×10-8M、≤10-8M、≤5×10-9M、≤4×10-9M、≤3×10-9M、≤2×10-9M或≤10-9M的结合亲和力(KD)与人类和/或非人类gremlin1特异性结合。本文所使用的KD是指解离速率与缔合速率的比率(koff/kon)，其可通过使用本领域中已知的任何常规方法，包括但不限于表面等离子体共振方法、微尺度热泳法、HPLC-MS方法和流式细胞测量术(如FACS)方法来确定。在某些实施方式中，可通过使用流式细胞测量术方法适当地确定KD值。可以使用各种免疫分析格式来选择与特定蛋白质特异性免疫反应的抗体。举例来说，固相ELISA免疫分析常规地用于选择与蛋白质特异性免疫反应的抗体(关于可用于确定特异性免疫反应的免疫分析格式和条件的描述，参见例如Harlow和Lane,《使用抗体，实验指南(Using Antibodies,ALaboratory Manual)》(1998))。典型地，特异性或选择性结合反应将产生相对于背景信号至少两倍，且更典型地相对于背景信号至少10倍至100倍的信号。
如本文中所使用的术语“氨基酸”是指含有胺(-NH2)和羧基(-COOH)官能团以及每种氨基酸特有的侧链的有机化合物。氨基酸的名称在本公开中也以标准的单字母或三字母代码表示，其概述如下。
名称 三字母代码 单字母代码
丙氨酸 Ala A
精氨酸 Arg R
天冬酰胺 Asn N
天冬氨酸 Asp D
半胱氨酸 Cys C
谷氨酸 Glu E
谷氨酰胺 Gln Q
甘氨酸 Gly G
组氨酸 His H
异亮氨酸 Ile I
亮氨酸 Leu L
赖氨酸 Lys K
甲硫氨酸 Met M
苯丙氨酸 Phe F
脯氨酸 Pro P
丝氨酸 Ser S
苏氨酸 Thr T
色氨酸 Trp W
酪氨酸 Tyr Y
缬氨酸 Val V
关于氨基酸序列的“保守取代”是指用具有类似生理化学特性的侧链的不同氨基酸残基替换氨基酸残基。举例来说，可在具有疏水性侧链的氨基酸残基(例如，Met、Ala、Val、Leu和Ile)中、在具有中性亲水性侧链的残基(例如，Cys、Ser、Thr、Asn和Gln)中、在具有酸性侧链的残基(例如，Asp、Glu)中、在具有碱性侧链的氨基酸(例如，His、Lys和Arg)中或在具有芳香族侧链的残基(例如，Trp、Tyr和Phe)中进行保守取代。如本领域中所已知，保守取代通常不会引起蛋白质构象结构的显著变化，并且因此可保留蛋白质的生物活性。
关于氨基酸序列(或核酸序列)的“序列一致性百分比(％)”定义为在比对序列且在必要时引入空位以实现最大对应性之后，与参考序列中的氨基酸(或核酸)残基相同的候选序列中的氨基酸(或核酸)残基的百分比。出于确定氨基酸(或核酸)序列一致性％的目的进行的比对可例如使用可公开获得的工具，如BLASTN、BLASTp(可在美国国家生物技术信息中心(NCBI)的网站上获得，另参见Altschul S.F.等人,《分子生物学杂志》,215:403-410(1990)；Stephen F.等人,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》,25:3389-3402(1997))、ClustalW2(可在欧洲生物信息研究所(European Bioinformatics Institute)的网站上获得，另参见Higgins D.G.等人,《酶学方法(Methods in Enzymology)》,266:383-402(1996)；Larkin M.A.等人,《生物信息学(Bioinformatics)》(英格兰牛津(Oxford,England)),23(21):2947-8(2007))和ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件实现。本领域的技术人员可使用所述工具提供的默认参数，或可自定义适于比对的参数，例如通过选择合适算法进行。在某些实施方式中，不相同的残基位置可通过保守氨基酸取代而不同。“保守氨基酸取代”为其中氨基酸残基被具有类似化学特性(例如，电荷或疏水性)的侧链(R基团)的另一个氨基酸残基取代的保守氨基酸取代。一般来说，保守氨基酸取代基本上不会改变蛋白质的功能特性。在两个或更多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情况下，百分比或类似性程度可以向上调整以校正取代的保守性质。进行这种调整的方式为本领域的技术人员众所周知的。参见例如Pearson(1994)《分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)》24:307-331，其以引用的方式并入本文中。
如本文中所使用，“同源序列”是指与另一序列任选比对时具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的序列一致性的多核苷酸序列(或其互补链)或氨基酸序列。
“分离”的物质已通过人工方式从天然状态改变。如果“分离”的组合物或物质存在于自然界中，那么所述组合物或物质已经从其原始环境改变或从其原始环境去除，或这两种情况都有。举例来说，天然地存在于活动物体内的多核苷酸或多肽不是“分离”的，但如果相同的多核苷酸或多肽已与其天然状态的共存材料充分地分离从而以基本上纯的状态存在，那么所述多核苷酸或多肽是“分离”的。分离的“核酸”或“多核苷酸”可互换使用，且是指分离的核酸分子的序列。在某些实施方式中，“分离抗体或其抗原结合片段”是指如通过电泳法(如SDS-PAGE、等电聚焦、毛细管电泳)或色谱法(如离子交换色谱或反相HPLC)所测定，纯度为至少60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的抗体或抗原结合片段。
术语“受试者”包括人类和非人类动物。非人类动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人类灵长类动物、小鼠、大鼠、猫、兔、羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除注明外，术语“患者”或“受试者”在本文中可互换使用。
如本文中所使用的病状的“治疗(treating/treatment)”包括预防或减轻病状，减缓病状的发作或发展速率，降低罹患病状的风险，预防或延迟与病状相关的症状的发展，减少或结束与病状相关的症状，产生病状的完全或部分消退，治愈病状或其某一组合。
如本文中所使用的术语“载体”是指一种运载体(vehicle)，可将基因元件可操作地插入其中以便实现所述基因元件的表达，从而产生由所述基因元件编码的蛋白质、RNA或DNA，或复制所述基因元件。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，以使其携带的基因元件在宿主细胞内表达。载体的实例包括质粒；噬菌粒；粘粒；人工染色体，如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)；噬菌体，如λ噬菌体或M13噬菌体；和动物病毒。载体可含有多种用于控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、可选择元件和报道基因。另外，载体可含有复制起点。载体还可包括有助于其进入细胞的材料，包括但不限于病毒粒子、脂质体或蛋白质包衣。载体可为表达载体或克隆载体。本公开提供了含有本文所提供的编码抗体或其抗原结合片段的核酸序列、至少一个可操作地连接到所述核酸序列的启动子(例如，SV40、CMV、EF-1α)和至少一个选择标记的载体(例如表达载体)。
如本文中所使用的“宿主细胞”是指已将外源多核苷酸和/或载体引入其中的细胞。
术语“gremlin1”或“GREM1”是指gremlin的变体1，且涵盖不同物种中，例如人类、小鼠、猴等中的gremlin1。GREM1为进化上保守的且人类gremlin1基因(hGREM1)已定位到染色体15q13-q15(Topol L Z等人,(1997)《分子细胞生物学(Mol.Cell Biol.)》,17:4801-4810；Topol L Z等人,《细胞发生学细胞遗传学(Cytogenet Cell Genet.)》,89:79-84)。hGREM1的氨基酸序列可通过基因库数据库以寄存编号NP-037504或Uniprot数据库经由寄存编号O60565访问，且在本文中提供为SEQ ID NO:66。术语“人类gremlin1”和术语“hGREM1”在本公开中可互换使用。
如本文中所使用的“gremlin1相关”或“GREM1相关”疾病或病状是指由GREM1的表达或活性增加所引起、加剧或以其它方式与其有关的任何疾病或病状。在一些实施方式中，GREM1相关病状为例如青光眼、癌症、纤维化疾病、血管生成、视网膜疾病、肾病、肺动脉高血压或骨关节炎(OA)。
如本文中所使用的“癌症”是指特征在于恶性细胞生长或赘瘤、异常增殖、浸润或转移的任何医学病状，并且可为良性的或恶性的，且包括实体肿瘤和非实体癌症(例如恶性血液病)，如白血病。如本文中所使用，“实体肿瘤”是指赘生性和/或恶性细胞的实体块。
术语“药学上可接受的”指示指定的载体、媒剂、稀释剂、赋形剂和/或盐通常在化学上和/或物理上与包含调配物的其它成分相容，并且在生理上与其接受者相容。
本文中提及“约”一值或参数包括(并且描述)针对所述值或参数本身的实施方式。举例来说，提及“约X”的描述包括“X”的描述。数值范围包括定义所述范围的数字。一般来说，术语“约”是指变量的指示值和在指示值的实验误差内(例如，在平均值的95％置信区间内)或在指示值的10％内(以较大者为准)的所有变量值。当在时间段(年、月、周、日等)的情形内使用术语“约”时，术语“约”意指时间段加上或减去下一个下级时间段的一个量(例如，约1年意指11-13个月；约6个月意指6个月加上或减去1周；约1周意指6-8天等)，或在指示值的10％内，以较大者为准。
抗人类gremlin1抗体
本公开提供抗人类gremlin1(hGREM1)抗体和其抗原结合片段。本文所提供的抗hGREM1抗体和抗原结合片段与现有抗hGREM1抗体的唯一差别在于以下方面：a)相对于非癌细胞，能够选择性地降低癌细胞中hGREM1介导的对BMP信号传导的抑制；b)在非癌细胞中展现hGREM1介导的对BMP信号传导的抑制降低不超过50％；c)能够与包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的嵌合hGREM1结合；d)能够与hGREM1结合而非与小鼠gremlin1特异性结合；e)在包含残基Gln27和/或残基Asn33的表位处与hGREM1结合，其中残基编号是根据SEQ ID NO:69，或与包含残基Gln27和/或残基Asn33的hGREM1片段结合，任选地hGREM1片段具有至少3个(例如，4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸残基的长度；f)能够降低hGREM1介导的对MAPK信号传导的活化；g)能够以如通过Fortebio所测量的不超过1nM的Kd与hGREM1结合；h)能够以如通过ELISA所测量的至少50％的最大阻断百分比阻断hGREM1与BMP7的结合；i)能够阻断GREM1(例如，hGREM1或mGREM1)与FGFR(例如FGFR1，优选为人类FGFR1(hFGFR1)或小鼠FGFR1(mFGFR1))的相互作用和/或j)能够与hGREM1和DAN两者结合。
骨形态发生蛋白质(BMP)(如BMP 2、BMP 4和BMP 7)称为转化生长因子β(TGF-β)超家族的糖基化胞外基质(ECM)相关成员，且在形态发生、一般器官发生、软骨和肢体形成、细胞增殖、分化以及细胞凋亡期间具有关键作用。BMP信号传导是通过BMP配体(例如，BMP 2、BMP 4和BMP7)与BMP受体的结合而活化以触发受体磷酸化，从而引起R-Smad(例如，Smad1/5/9)的磷酸化和与co-Smad4的复合形成。所形成的Smad复合物接着易位到细胞核以调节BMP靶基因的表达。因此，可以通过例如测量smad的磷酸化水平和/或BMP靶基因的表达量分析BMP信号传导的活化。还可以通过测量分化标记物基因(例如碱性磷酸酶，其为成骨细胞分化的早期标记物)的表达量分析BMP信号传导的活化。
已知BMP信号传导由BMP拮抗剂，例如头蛋白(noggin)、脊索蛋白(chordin)、gremlin1和缠绕的原肠形成1抑制。GREM1可与BMP配体(例如BMP-2、BMP-4或BMP-7)物理结合以形成异二聚体且防止这些BMP配体与其对应BMP受体相互作用，由此抑制BMP信号传导路径的活化。因此，预期消除GREM1和/或降低GREM1的活性将逆转或降低对BMP信号传导的抑制。
i.结合亲和力
在某些实施方式中，本文所提供的抗GREM1抗体能够以如通过Fortebio所测量的不超过1nM的Kd与hGREM1结合。本文所提供的抗GREM1抗体和抗原结合片段的结合亲和力可由KD值表示，KD值表示当抗原与抗原结合分子之间的结合达到平衡时，解离速率与缔合速率的比率(koff/kon)。抗原结合亲和力(例如KD)可使用本领域中已知的任何合适方法，包括例如动力学排除分析(KinExA)、Biacore、Fortebio或流式细胞测量术来适当地确定。
在某些实施方式中，根据本公开的“KD”或“KD值”在一实施方式中是通过Biacore或Fortebio分析，如通过测量抗GREM1抗体的溶液结合亲和力的以下分析所描述使用抗GREM1抗体和GREM1执行来测量的。一般来说，Biacore的工作原理是将恒定量的一种结合伴侣(CBP)与不同浓度的另一种结合伴侣(滴定剂)进行平衡，且接着在较短的接触时间内通过荧光标记的二级抗体捕获一部分游离CBP，所述接触时间小于预先形成的CBP-滴定剂复合物解离所需的时间。由捕获的CBP产生的荧光信号与平衡样品中游离CBP的浓度成正比，并且用于生成一系列测量时的结合曲线(游离CBP百分比与总滴定剂浓度)。更多细节可从Schreiber,G.,Fersht,A.R.《自然·结构生物学(Nature Structural Biology.)》1996,3(5),427-431获得。当抗GREM1抗体以恒定量用作CBP时，则GREM1蛋白可用作滴定剂，反之亦然。Fortebio通常以与Biacore类似的方式，还通过将恒定量的CBP(例如，GREM 1蛋白)与不同浓度的滴定剂(例如，抗GREM1抗体)进行平衡而起作用。CBP与滴定剂之间的结合动力学(kon和koff)的信息可从由Fortebio所使用的生物传感器产生的干扰图案的变化获得。更多细节可从Charles Wartchow,Frank Podlaski,Shirley Li,Karen Rowan,Xiaolei Zhang,David Mark,Kuo-Sen Huang“利用生物膜干涉法的基于生物传感器的小分子片段筛选(Biosensor-based Small Molecule Fragment Screening with BiolayerInterferometry):《计算机辅助分子设计杂志(J Comput Aided Mol Des)》2011,25(7),669-76获得。
在某些实施方式中，本文所提供的抗GREM1抗体的KD是根据如本公开中的实施例14中所描述的方法测定。
在适用的情况下，也可以使用其它适合于测量KD的方法，例如放射性标记的抗原结合分析(参见例如Chen等人,(1999)《分子生物学杂志》293:865-881)，或除Biacore以外的表面等离子体共振分析。
在某些实施方式中，本文所提供的抗GREM1抗体和其抗原结合片段以如通过Biacore分析所测量的不超过100nM(或不超过90、80、70、60、50、40、30、29、27、20、19或18nM)的KD值与人类GREM1特异性结合。在某些实施方式中，本文所提供的抗GREM1抗体和其抗原结合片段以如通过Fortebio分析所测量的不超过10nM(或不超过9、8、7、6、5、4、3、2或1nM)的KD值与人类GREM1特异性结合。
或者，本文所提供的抗GREM1抗体和抗原结合片段与人类GREM1的结合亲和力也可以由“半数最大有效浓度”(EC50)值表示，所述值是指观测到其最大作用(例如结合)的50％的抗体的浓度。可通过本领域中已知的方法，例如夹心分析，如ELISA、蛋白质印迹、流式细胞测量术分析和其它结合分析来测量EC50值。在某些实施方式中，本文所提供的抗GREM1抗体和其片段以如通过ELISA所测量的不超过120ng/ml(或不超过100、90、80、60、40、30、20、14.5、14、13.5、13、12.5、12、11.5、11、10.5、10、9、8、7、6、5.5、5、4.5、4、3、2或1ng/ml)的EC50值与人类GREM1(例如，表达人类GREM1的细胞)特异性结合。
在某些实施方式中，本文所提供的一些抗体和其抗原结合片段能够以如通过ELISA所测量的不超过20ng/ml的EC50值与小鼠GREM1特异性结合。在某些实施方式中，抗体和其抗原结合片段以如通过ELISA所测量的4ng/ml至20ng/ml(例如，4ng/ml至9ng/ml、5ng/ml至8ng/ml、6ng/ml至7ng/ml、6ng/ml至14ng/ml、6ng/ml至12ng/ml、4.564ng/ml、7.713ng/ml、8.512ng/ml或17.2ng/ml)的EC50与小鼠GREM1结合。
在某些实施方式中，本文所提供的一些抗体和其抗原结合片段不与小鼠GREM1特异性结合。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体和其抗原结合片段不与GREM2特异性结合。
抗体序列
在一个方面中，本公开提供本文所提供的抗GREM1抗体或其抗原结合片段，其中重链可变区包含：
a)HCDR1，其包含选自以下的序列：SEQ ID NO:1、11、21、31、114、119和123，
b)HCDR2，其包含选自以下的序列：SEQ ID NO:2、12、22、32和115，和
c)HCDR3，其包含选自以下的序列：SEQ ID NO:3、13、23、33、116、120和124，和/或
轻链可变区包含：
d)LCDR1，其包含SEQ ID NO:4、14、24、34、117、121、122和125的序列，
e)LCDR2，其包含SEQ ID NO:5、15、25和35的序列，和
f)LCDR3，其包含选自以下的序列：SEQ ID NO:6、16、26、36和118。
在某些实施方式中，本文提供抗体或其抗原结合片段，其中重链可变区选自由以下组成的群组：
a)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:1的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:2的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:3的序列的HCDR3；
b)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:11的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:12的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:13的序列的HCDR3；
c)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:21的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:22的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:23的序列的HCDR3；
d)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:31的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:32的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:33的序列的HCDR3；
e)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:114的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:115的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:116的序列的HCDR3；
f)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:119的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:115的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:120的序列的HCDR3；和
g)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:123的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:115的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:124的序列的HCDR3。
在某些实施方式中，本文提供抗体或其抗原结合片段，其中轻链可变区选自由以下组成的群组：
a)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:4的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:5的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:6的序列的LCDR3；
b)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:14的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:15的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:16的序列的LCDR3；
c)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:24的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:25的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:26的序列的LCDR3；
d)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:34的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:36的序列的LCDR3；
e)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:117的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:118的序列的LCDR3；
f)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:121的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:118的序列的LCDR3；
g)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:122的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:118的序列的LCDR3；和
h)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:125的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:118的序列的LCDR3。
在某些实施方式中，本文提供抗体或其抗原结合片段，其中：
a)重链可变区包括包含SEQ ID NO:1的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:2的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:3的序列的HCDR3；并且轻链可变区包括包含SEQ ID NO:4的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:5的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:6的序列的LCDR3；
b)重链可变区包括包含SEQ ID NO:11的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:12的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:13的序列的HCDR3；并且轻链可变区包括包含SEQ ID NO:14的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:15的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:16的序列的LCDR3；
c)重链可变区包括包含SEQ ID NO:21的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:22的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:23的序列的HCDR3；并且轻链可变区包括包含SEQ ID NO:24的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:25的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:26的序列的LCDR3；
d)重链可变区包括包含SEQ ID NO:31的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:32的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:33的序列的HCDR3；并且轻链可变区包括包含SEQ ID NO:34的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:36的序列的LCDR3；
e)重链可变区包括包含SEQ ID NO:114的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:115的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:116的序列的HCDR3；并且轻链可变区包括包含SEQ ID NO:117的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:118的序列的LCDR3；
f)重链可变区包括包含SEQ ID NO:119的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:115的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:120的序列的HCDR3；并且轻链可变区包括包含SEQ ID NO:121的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:118的序列的LCDR3；
g)重链可变区包括包含SEQ ID NO:119的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:115的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:120的序列的HCDR3；并且轻链可变区包括包含SEQ ID NO:122的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:118的序列的LCDR3；和
h)重链可变区包括包含SEQ ID NO:123的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:115的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:124的序列的HCDR3；并且轻链可变区包括包含SEQ ID NO:125的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:118的序列的LCDR3。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体包含抗hGREM1抗体14E3、69H5、22F1、56C11、36F5、42B9和67G11的一个或多个(例如，1、2、3、4、5或6)CDR序列。
如本文中所使用的“14E3”是指具有SEQ ID NO:7的重链可变区和SEQ ID NO:8的轻链可变区的小鼠抗体。
如本文中所使用的“69H5”是指具有SEQ ID NO:27的重链可变区和SEQ ID NO:28的轻链可变区的小鼠抗体。
如本文中所使用的“22F1”是指具有SEQ ID NO:17的重链可变区和SEQ ID NO:18的轻链可变区的小鼠抗体。
如本文中所使用的“56C11”是指具有SEQ ID NO:37的重链可变区和SEQ ID NO:38的轻链可变区的小鼠抗体。
如本文中所使用的“36F5”是指具有SEQ ID NO:126的重链可变区和SEQ ID NO:127的轻链可变区的小鼠抗体。
如本文中所使用的“42B9”是指具有SEQ ID NO:128的重链可变区和SEQ ID NO:129的轻链可变区的小鼠抗体。
如本文中所使用的“67G11”是指具有SEQ ID NO:128的重链可变区和SEQ ID NO:130的轻链可变区的小鼠抗体。
表1显示这些抗hGREM1抗体的CDR序列。CDR是根据Kabat编号进行确定。技术人员将理解，用于CDR确定的其它已知方法还可应用于本文所提供的抗体，且那些CDR序列还涵盖于本公开内。重链和轻链可变区序列还提供于下表2中。
表1.抗hGREM1抗体的CDR区的序列
其中X32为S或Y；X27为A或G；X28为H或N；X29为H或N；X30为R或I；X31为L或V。
表2.小鼠抗体VH/VL的序列
本文所提供的抗hGREM1抗体或其抗原结合片段可为单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、双特异性抗体、标记抗体、二价抗体或抗个体基因型抗体。重组抗体为使用重组方法在体外而非在动物中制备的抗体。
已知CDR负责抗原结合，然而，已发现并非所有6个CDR都一定是必不可少的或不可改变的。换句话说，有可能替换或改变或修饰抗hGREM1抗体14E3、69H5、22F1、56C11、36F5、42B9或67G11(对应于SEQ ID NO:1至36和114至125中的任一者)中的1、2或3个CDR，但仍基本上保持与hGREM1的特定结合亲和力。
在某些实施方式中，本文所提供的抗hGREM1抗体和抗原结合片段包含抗hGREM1抗体14E3、69H5、22F1、56C11、36F5、42B9或67G11中的一者的重链CDR3序列。在某些实施方式中，本文所提供的抗hGREM1抗体和抗原结合片段包含SEQ ID NO:3、13、23、33、116、120和124的重链CDR3序列。重链CDR3区位于抗原结合位点的中心，且因此被认为与抗原接触最多，并且为抗体与抗原的亲和力提供最多的自由能。还认为通过多种多样化机制，重链CDR3在长度、氨基酸组成和构象方面是迄今为止抗原结合位点中最具多样性的CDR(TonegawaS.《自然》.302:575-81)。重链CDR3的多样性足以产生大多数抗体特异性(Xu JL,Davis MM.《免疫(Immunity.)》13:37-45)以及所需的抗原结合亲和力(Schier R等,《分子生物学杂志》263:551-67)。
在一些实施方式中，本文所提供的抗hGREM1抗体和抗原结合片段包含重链可变结构域的全部或一部分和/或轻链可变结构域的全部或一部分。在一个实施方式中，本文所提供的抗hGREM1抗体和抗原结合片段为由本文所提供的重链可变结构域的全部或一部分组成的单结构域抗体。这种单结构域抗体的更多信息可在本领域中获得(参见例如美国专利第6,248,516号)。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体和其抗原结合片段包含合适的构架区(FR)序列，只要抗体和其抗原结合片段可与GREM1特异性结合即可。表1中提供的CDR序列是从小鼠抗体获得的，但它们可使用本领域中已知的合适方法(如重组技术)移植到任何合适的物种(如小鼠、人类、大鼠、兔等)的任何合适的FR序列。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体和其抗原结合片段是嵌合的。将VH/VL移植到人类IgG1和人类κ序列。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体和其抗原结合片段是人源化的。人源化抗体或抗原结合片段在其降低人类的免疫原性方面是合乎需要的。人源化抗体在其可变区中是嵌合的，因为非人类CDR序列被移植到人类或基本上人类FR序列。抗体或抗原结合片段的人源化可基本上通过用人类免疫球蛋白基因中的对应人类CDR基因取代非人类(如鼠类)CDR基因来进行(参见例如Jones等人(1986)《自然》321:522-525；Riechmann等人(1988)《自然》332:323-327；Verhoeyen等人(1988)《科学(Science)》239:1534-1536)。可在这之前或之后对亲本非人类抗体的可变区或可变结构域的三维结构进行模拟。
可使用本领域中已知的方法选择合适的人类重链和轻链可变结构域以实现CDR移植。在一说明性实例中，可以使用“最佳拟合”方法，其中针对已知的人类可变结构域生殖系序列的数据库(例如蛋白质数据库，http://www.rcsb.org/)筛选或BLAST化非人类(例如啮齿动物)抗体可变结构域序列，并且鉴别最接近非人类查询序列的人类序列且将其用作移植非人类CDR序列的人类支架(参见例如Sims等人,(1993)《免疫学杂志(J.Immunol.)》151:2296；Chothia等人(1987)《分子生物学杂志》196:901)。或者，从所有人类抗体的共有序列衍生的构架可用于非人类CDR的移植(参见例如Carter等人(1992)《美国国家科学院院刊》,89:4285；Presta等人(1993)《免疫学杂志》,151:2623)。
在某些实施方式中，本文所提供的人源化抗体或抗原结合片段除CDR序列为非人类序列外，基本上全部由人类序列构成。在一些实施方式中，可变区FR和恒定区如果存在则完全或基本上来自人类免疫球蛋白序列。人类FR序列和人类恒定区序列可来源于不同的人类免疫球蛋白基因，例如FR序列来源于一种人类抗体，而恒定区来源于另一种人类抗体。在一些实施方式中，人源化抗体或抗原结合片段包含人类重链/轻链FR1-4。
下表3显示22F1、14E3和56C11的人源化抗体的HFR氨基酸序列。
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下表4显示22F1、14E3和56C11的人源化抗体的LFR氨基酸序列。
其中X1为V、I或A；X2为A或S；X3为V或L；X4为Y或S；X5为T或S；X6为V、L或M；X7为R或K；X8为Q或K；X9为E或T；X10为M或I；X11为V或A；X12为M或L；X13为R或V；X14为T或K；X15为S或R；X16为V或A；X17为M或L；X18为R或V；X19为T或K；X20为T、M或L；X21为L、F或Y；X22为R或L；X23为Y或S；X24为V或F；X25为G或Q；X26为V或L。
在一些实施方式中，来源于人类的FR区可包含与其所来源的人类免疫球蛋白相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，人类FR的一个或多个氨基酸残基被来自亲本非人类抗体的对应残基取代。在某些实施方式中，这可能是合乎需要的，以使得人源化抗体或其片段紧密地接近非人类亲本抗体结构，以降低或避免免疫原性和/或改善或保留结合活性或结合亲和力。
在某些实施方式中，本文所提供的人源化抗体或抗原结合片段在每个人类FR序列中包含不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基取代，或在重链或轻链可变结构域的所有FR中包含不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基取代。在一些实施方式中，这种氨基酸残基的变化可仅存在于重链FR区，仅存在于轻链FR区，或存在于两条链中。在某些实施方式中，使一个或多个氨基酸残基突变，例如CDR序列所来源的非人类亲本抗体(例如，在小鼠框架区)中发现的对应残基的回复突变。可由技术人员根据本领域中已知的原则选择合适的突变位置。举例来说，可选择突变位置：其中1)人类生殖系序列的框架中的残基是罕见的(例如在人类可变区序列中少于20％或少于10％)；2)所述位置紧邻人类生殖系链的一级序列中的3个CDR中的一个或多个，因为它有可能与CDR中的残基相互作用；或3)所述位置在3维模型中接近CDR，并且因此可以有很好的概率与CDR中的氨基酸相互作用。所选位置处的残基可回复突变为亲本抗体中的对应残基，或突变为既不是人类生殖系序列中的对应残基也不是亲本抗体中的对应残基的残基，但突变为人类序列的典型残基，即在与人类生殖系序列属于同一亚组的在已知人类序列中的所述位置处出现频率较高的残基(参见美国专利第5,693,762号)。在某些实施方式中，对于hu14E3，重链变体Ha、Hb和Hc是通过将三个CDR直接移植到其生殖系序列而获得，其中相应地对于重链变体Ha的回复突变为V37M，对于重链变体Hb的回复突变为V37M、V68A、V2I，且对于重链变体Hc的回复突变为V37M、V68A、V2I、Y27S、R38K、E46T，所有突变基于Kabat编号；轻链变体是通过将三个CDR直接移植到其生殖系序列而获得，其中相应地对于轻链变体La的回复突变为F36L且对于轻链变体Lb的回复突变为F36L、Y49S，所有突变基于Kabat编号。在某些实施方式中，对于hu22F1，重链变体Ha、Hb、Hc和Hd是通过将三个CDR直接移植到其生殖系序列而获得，相应地对于重链变体Ha不具有回复突变，对于重链变体Hb的回复突变为R72V、T74K、T28S、R98S，对于重链变体Hc的回复突变为R71V、T73K、T28S、R94S、S82AR、M69L、V2A，且对于重链变体Hd的回复突变为R71V、T73K、T28S、R94S、S82AR、M69L、V2A、V67A、M48I、V37L，所有突变基于Kabat编号；轻链变体是通过将三个CDR直接移植到其生殖系序列而获得，其中相应地对于轻链变体La的回复突变为F36L且对于轻链变体Lb的回复突变为F36L、V58F，所有突变基于Kabat编号。在某些实施方式中，对于hu56C11，重链(HC)变体1、2、3和4是通过将三个CDR直接移植到生殖系序列而获得，相应地对于重链变体H0不具有回复突变，对于重链变体Ha的回复突变为R71V、T73K，对于重链变体Hb的回复突变为R71V、T73K、M69L、M48I，且对于重链变体Hc的回复突变为R71V、T73K、M69L、M48I、Q43K、R38K，所有突变基于Kabat编号；轻链(LC)变体1、2和3是通过将三个CDR直接移植到生殖系序列而获得，相应地对于轻链变体L0不具有回复突变，对于轻链变体La的回复突变为R46L，且对于轻链变体Lb的回复突变为F36Y、R46L，所有突变基于Kabat编号。
在某些实施方式中，本公开的人源化轻链和重链在人类中为基本上非免疫原性的，并且保留与亲本抗体对hGREM1的亲和力基本上相同的亲和力或甚至更高的亲和力。具体来说，预期本文所提供的人源化抗体(例如，Hu22F1和Hu56C11)和来源于69H5、36F5、42B9和67G11的人源化抗hGREM1抗体显示相比于其亲本抗体类似的特性(例如，与人类gremlin1和/或小鼠gremlin 1的高结合亲和力、对gremlin介导的对BMP4信号传导的抑制的高阻断作用、对gremlin 1与FGFR1的结合的高阻断活性和/或高抗肿瘤作用)或甚至更好。
在某些实施方式中，本文所提供的人源化抗体和其抗原结合片段在具有或不具有回复突变的情况下包含人类生殖系构架序列IGKV/2-30的一个或多个轻链FR序列，和/或人类生殖系构架序列IGHV/7-4或IGHV/1-46或IGHV1-2的一个或多个重链FR序列。必要时，可以将回复突变引入到人类生殖系构架序列中。
在某些实施方式中，本文所提供的人源化抗体或抗原结合片段包含重链可变区，其包含选自由以下组成的群组的序列：SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133和SEQ ID NO:134，和与其具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性但仍保持与hGREM1的特定结合特异性或亲和力的同源序列。
在某些实施方式中，本文所提供的人源化抗体或其抗原结合片段进一步包含轻链可变区，其包含选自由以下组成的群组的序列：SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136和SEQ ID NO:137，和与其具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性但仍保持与hGREM1的特定结合特异性或亲和力的同源序列。
在某些实施方式中，本文所提供的人源化抗体或抗原结合片段包含重链可变区，其包含选自由以下组成的群组的序列：SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:45，和与其具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性但仍保持与hGREM1的特定结合特异性或亲和力的同源序列；和轻链可变区，其包含选自由以下组成的群组的序列：SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:49，和与其具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性但仍保持与hGREM1的特定结合特异性或亲和力的同源序列。
在某些实施方式中，本文所提供的人源化抗体或其抗原结合片段进一步包含一对重链可变区和轻链可变区序列，其选自由以下组成的群组：SEQ ID NO:41/47、41/49、43/47、43/49、45/47和45/49，或与其具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性但仍保持与hGREM1的特定结合特异性或亲和力的一对序列。
在某些实施方式中，本文所提供的人源化抗体或抗原结合片段包含重链可变区，其包含选自由以下组成的群组的序列：SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55和SEQID NO:57，和与其具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性但仍保持与hGREM1的特定结合特异性或亲和力的同源序列；和轻链可变区，其包含选自由以下组成的群组的序列：SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:61，和与其具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性但仍保持与hGREM1的特定结合特异性或亲和力的同源序列。
在某些实施方式中，本文所提供的人源化抗体或其抗原结合片段进一步包含一对重链可变区和轻链可变区序列，其选自由以下组成的群组：SEQ ID NO:51/59、51/61、53/59、53/61、55/59、55/61、57/59和57/61，或与其具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性但仍保持与hGREM1的特定结合特异性或亲和力的一对序列。
在某些实施方式中，本文所提供的人源化抗体或抗原结合片段包含重链可变区，其包含选自由以下组成的群组的序列：SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133和SEQ ID NO:134，和与其具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性但仍保持与hGREM1的特定结合特异性或亲和力的同源序列；和轻链可变区，其包含选自由以下组成的群组的序列：SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136和SEQ ID NO:137，和与其具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性但仍保持与hGREM1的特定结合特异性或亲和力的同源序列。
在某些实施方式中，本文所提供的人源化抗体或其抗原结合片段进一步包含一对重链可变区和轻链可变区序列，其选自由以下组成的群组：SEQ ID NO:131/135、131/136、131/137、132/135、132/136、132/137、133/135、133/136、133/137、134/135、134/136和134/137，或与其具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性但仍保持与hGREM1的特定结合特异性或亲和力的一对序列。
表5.人源化14E3(Hu14E3)、人源化22F1(Hu22F1)和人源化56C11(Hu56C11)的序列
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本文所提供的人源化抗hGREM1抗体保持与hGREM1的特异性结合亲和力，并且在所述方面中至少与亲本抗体相当或甚至优于亲本抗体。在某些实施方式中，本文所提供的抗hGREM1抗体和其片段进一步包含免疫球蛋白恒定区，任选地人类Ig的恒定区，或任选地人类IgG的恒定区。在一些实施方式中，免疫球蛋白恒定区包含重链和/或轻链恒定区。重链恒定区包含CH1、铰链和/或CH2-CH3区。在某些实施方式中，重链恒定区包含Fc区。在某些实施方式中，轻链恒定区包含Cκ或Cλ。
在某些实施方式中，本文所提供的抗hGREM1抗体和其片段进一步包含人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区。在某些实施方式中，本文所提供的抗hGREM1抗体和其抗原结合片段包含IgG1同种型的恒定区。在某些实施方式中，本文所提供的抗hGREM1抗体和其抗原结合片段包含IgG2b同种型的恒定区。
在某些实施方式中，本文所提供的人源化抗体可包含与人类IgG1同种型的恒定区融合的重链可变区和与人类κ链的恒定区融合的轻链可变区。
抗体变体
本文所提供的抗hGREM1抗体和其抗原结合片段还涵盖本文所提供的抗体序列的各种类型的变体。
在某些实施方式中，变体包含如表1中提供的1、2或3个CDR序列、一个或多个FR序列、本文所提供的重链或轻链可变区序列和/或恒定区(例如Fc区)中的一个或多个修饰或取代。这类抗体变体保留其亲本抗体对hGREM1的特异性结合亲和力，但具有由修饰或取代所赋予的一种或多种所需特性。举例来说，抗体变体可具有提高的抗原结合亲和力、改善的糖基化模式、降低的糖基化风险、减少的脱氨基作用、降低或增加的效应功能、提高的FcRn受体结合、增加的药代动力学半衰期、pH敏感性和/或与结合物(例如，一个或多个引入的半胱氨酸残基)的相容性等等。
可使用本领域中已知的方法，例如“丙氨酸扫描突变诱发”(参见例如Cunningham和Wells(1989)《科学》,244:1081-1085)筛选亲本抗体序列，以鉴别合适的或优选的残基进行修饰或取代。简单来说，可鉴别靶标残基(例如带电荷的残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，且用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替换，且产生经修饰的抗体并且针对关注的特性进行筛选。如果在特定氨基酸位置的取代显示出关注的功能变化，则所述位置可鉴别为用于修饰或取代的潜在残基。可以通过用不同类型的残基(例如，半胱氨酸残基、带正电荷的残基等)取代来进一步评估潜在残基。
i.亲和力变体
亲和力变体保留亲本抗体对hGREM1的特异性结合亲和力，或甚至具有相对于亲本抗体提高的hGREM1特异性结合亲和力。本领域中已知的各种方法可用于实现此目的。举例来说，可产生抗体变体(如Fab或scFv变体)库并且用噬菌体呈现技术表达，且随后针对对人类GREM1的结合亲和力进行筛选。对于另一实例，可使用计算机软件以虚拟地模拟抗体与人类GREM1的结合，且鉴别形成结合界面的抗体上的氨基酸残基。这类残基可避免进行取代以便防止结合亲和力的降低，或作为取代的目标以实现较强结合。
在某些实施方式中，CDR序列、FR序列或可变区序列中的取代中的至少一者(或全部)包含保守取代。
在某些实施方式中，本文所提供的抗hGREM1抗体或抗原结合片段包含一个或多个CDR序列和/或一个或多个FR序列中的一个或多个氨基酸残基取代。在某些实施方式中，亲和力变体包含在一个或多个CDR序列和/或FR序列中总共不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代。
在某些实施方式中，抗hGREM1抗体和其抗原结合片段包含与表1中所列的序列(或那些序列)具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列一致性的1、2或3个CDR序列，且同时保留与其亲本抗体类似或甚至更高的水平的对hGREM1的结合亲和力。
ii.糖基化变体
本文所提供的抗hGREM1抗体和抗原结合片段还涵盖糖基化变体，其可被获得以增加或降低抗体或抗原结合片段的糖基化程度。如本文中所使用，术语“糖基化”是指将如岩藻糖、木糖、甘露糖或GlcNAc磷酸丝氨酸聚糖的聚糖连接到蛋白质、脂质或其它有机分子上的酶促过程。取决于与聚糖连接的碳，糖基化可分为五个类别，包括：N-连接的糖基化、O-连接的糖基化、磷酸糖基化、C-连接的糖基化和糖基磷脂酰肌醇化。
抗体的糖基化典型为N-连接的或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基(例如三肽序列，如天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸中的天冬酰胺残基，其中X为除脯氨酸外的任何氨基酸)的侧链的连接。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一者与羟基氨基酸的连接，最常见地为与丝氨酸或苏氨酸的连接。
在某些实施方式中，抗体糖基化变体可通过例如去除天然糖基化位点(例如，通过N297A取代)获得，使得用于N-连接的糖基化位点的三肽序列或用于O-连接的糖基化位点的丝氨酸或苏氨酸残基不再存在于抗体或Fc序列中。或者，在某些实施方式中，可通过在宿主细胞系中产生抗体来获得抗体糖基化变体，所述宿主细胞系在将所选择的糖基团添加到抗体的成熟核心碳水化合物结构中时是有缺陷的。
iii.半胱氨酸工程改造的变体
本文所提供的抗hGREM1抗体和抗原结合片段还涵盖半胱氨酸工程改造的变体，其包含一个或多个引入的游离半胱氨酸氨基酸残基。
游离半胱氨酸残基为不是二硫桥键的一部分的半胱氨酸残基。半胱氨酸工程改造的变体适用于通过例如顺丁烯二酰亚胺或卤乙酰基在工程改造的半胱氨酸的位点处与例如细胞毒性和/或成像化合物、标记或放射性同位素等结合。用于工程改造抗体或抗原结合片段以引入游离半胱氨酸残基的方法为本领域中已知的，参见例如WO2006/034488。
抗原结合片段
本文还提供抗hGREM1抗原结合片段。各种类型的抗原结合片段为本领域中已知的，并且可基于本文所提供的抗hGREM1抗体进行开发，包括例如其CDR序列显示于表1中的示例性抗体和其不同变体(如亲和力变体、糖基化变体、Fc变体、半胱氨酸工程改造的变体等)。
在某些实施方式中，本文所提供的抗hGREM1抗原结合片段为双功能抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双功能抗体(ds双功能抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双功能抗体)、多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体或二价结构域抗体。
各种技术可用于产生这类抗原结合片段。说明性方法包括完整抗体的酶促消化(参见例如Morimoto等人,《生物化学与生物物理学方法杂志(Journal of Biochemicaland Biophysical Methods)》24:107-117(1992)；和Brennan等人,《科学》,229:81(1985))、由宿主细胞，例如大肠杆菌(E.Coli)重组表达(例如对于Fab、Fv和scFv抗体片段)、如上文所论述从噬菌体展示库筛选(例如对于scFv)以及将两个Fab'-SH片段化学偶联以形成F(ab')2片段(Carter等人,《生物技术(Bio/Technology)》10:163-167(1992))。用于产生抗体片段的其它技术对于熟练的技术人员将是显而易见的。
在某些实施方式中，抗原结合片段为scFv。scFv的产生描述于例如WO 93/16185；美国专利第5,571,894号；和第5,587,458号中。scFv可在氨基或羧基端与效应蛋白融合以提供融合蛋白(参见例如《抗体工程(Antibody Engineering)》,Borrebaeck编)。
在某些实施方式中，本文所提供的抗hGREM1抗体和其抗原结合片段为二价、四价、六价或多价的。如本文中所使用的术语“价数”是指在给定分子中存在指定数量的抗原结合位点。因此，术语“二价”、“四价”和“六价”分别表示在抗原结合分子中存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。任何大于二价的分子被视为多价的，涵盖例如三价、四价、六价等。
如果两个结合位点都对与相同抗原或相同表位的结合具有特异性，那么二价分子可为单特异性的。在某些实施方式中，这提供了比单价对应物更强的与抗原或表位的结合。类似地，多价分子也可为单特异性的。在某些实施方式中，在二价或多价抗原结合部分中，结合位点的第一价和结合位点的第二价在结构上是相同的(即具有相同的序列)，或在结构上是不同的(即具有不同的序列，尽管具有相同的特异性)。
如果两个结合位点对不同的抗原或表位具有特异性，那么二价也可为双特异性的。这也适用于多价分子。举例来说，当两个结合位点对于第一抗原(或表位)为单特异性的且第三结合位点对第二抗原(或表位)具有特异性时，三价分子可为双特异性的。
表位
在另一方面中，本公开提供了与本文所提供的抗体或其抗原结合片段所结合的相同表位结合的抗体。在另一方面中，本公开提供了与本文所提供的抗体或其抗原结合片段竞争结合于hGREM1的抗体。
如本文中所使用的术语“表位”是指抗体所结合的抗原上特定的一组原子或氨基酸。表位可包括直接接触抗体的特定氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基。本领域的技术人员应认识到，有可能在无过度实验的情况下，通过确定抗体与本公开的抗体(例如，杂交瘤/嵌合或人源化抗体14E3、69H5、22F1、56C11、36F5、42B9和67G11以及其本文所提供的任何嵌合和人源化变体)是否竞争结合于GREM1抗原多肽，来确定二者是否结合相同或重叠或相邻的表位。
如本文中所使用，关于两种抗原结合蛋白(例如抗体)的术语“结合竞争”意指一种抗原结合蛋白阻断或降低另一种抗原结合蛋白与抗原(例如人类/小鼠GREM1)的结合，如通过竞争性结合分析所测定。竞争性结合分析是本领域中众所周知的，包括例如直接或间接放射免疫分析(RIA)、直接或间接酶免疫分析(EIA)、Fortebio、竞争性ELISA分析和夹心竞争分析(参见例如Stahli等人,1983,《酶学方法》9:242-253)。典型地，这种分析涉及使用结合到固体表面的纯化抗原或带有抗原的细胞、未经标记的测试抗体和经标记的参考抗体。通过测定在测试抗体的存在下结合到固体表面或细胞的标记的量来测量竞争性抑制。通常测试抗体过量存在。如果两种抗体竞争结合于hGREM1，那么两种抗体与相同或重叠的表位结合，或与另一种抗体结合的表位足够近的相邻表位结合，从而发生位阻。通常，当竞争性抗体过量存在时，其将使测试抗体与共同抗原的特异性结合抑制(例如降低)至少50％到55％、55％到60％、60％到65％、65％到70％、70％到75％、75％到80％、80％到85％、85％到90％或更多。
通过生物特性分类的抗体的群组
本文所提供的抗体具有某些独特的生物特性。共有某些独特的生物特性的抗体可因此分类成多个群组。
i)具有hGREM1介导的对BMP信号传导的抑制的癌细胞选择性降低的抗体
在某些实施方式中，相对于非癌细胞，本文所提供的抗体能够选择性地降低癌细胞中hGREM1介导的对BMP信号传导的抑制，且包含选自由以下组成的群组的抗体的重链CDR1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3以及轻链CDR1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3：14E3、22F1、56C11、69H5、42B9、36F5和67G11。这些抗体特别适用于治疗癌症的方法。
本公开意外地发现使用本文所提供的某些抗GREM1抗体中和GREM1选择性地抑制癌细胞中GREM1介导的对BMP信号传导的抑制，但不显示这种抑制或仅在非癌细胞中显示极有限的抑制。
消除GREM1和/或降低癌细胞中GREM1的活性是优选的，因为这将对癌细胞增殖和球体形成具有抑制性影响，并且还诱导癌细胞凋亡。然而，对GREM1的抑制一般可为非所要的，因为小鼠中的GREM1的常规基因敲除造成肠道和造血系统的病症的异常发展(Rowan,S.C.等人《体内的Gremlin 1耗竭造成严重肠病和骨髓衰竭(Gremlin 1depletion in vivocauses severe enteropathy and bone marrow failure)》.《病理学杂志(J Pathol)》251,117-122)。这表明GREM1的常规消除和/或其活性的降低将不可避免地造成对其它正常组织的不利影响。在这点上，GREM1介导的本文所提供的抗GREM1抗体对BMP信号传导的抑制的未预期的癌症特异性调节通过避免对正常组织的非所要副作用而为有利的。
在某些实施方式中，本文所提供的抗GREM1抗体在非癌细胞中展现GREM1介导的对BMP信号传导的抑制降低不超过50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。
如本文中所使用的短语“BMP信号传导”意指可由GREM1抑制的一个或多个BMP配体的信号传导。在某些实施方式中，BMP信号传导为BMP-2信号传导和/或BMP-4信号传导。
如本文中所使用的短语“非癌细胞”是指不为癌细胞的细胞。非癌细胞可为细胞系，一种从受试者分离的初级细胞。
可以通过在存在和不存在GREM1的情况下分别测量BMP配体的BMP信号传导来确定GREM1介导的对BMP信号传导的抑制，其中差异指示GREM1介导的抑制。然而，抗GREM1抗体可降低GREM1介导的对BMP信号传导的抑制，或换句话说，恢复BMP信号传导。GREM1介导的对BMP信号传导的抑制降低或恢复可计算为在抗GREM1抗体的存在下的BMP信号传导相对于不存在抗GREM1抗体的情况下的BMP信号传导的增加。这种降低或这种恢复的百分比可计算为GREM1介导的抑制的降低与总GREM1介导的抑制的比率。GREM1介导的对BMP信号传导的抑制的100％降低将意指BMP信号传导恢复到与不存在GREM1的情况下的水平基本上相同的水平，且0％降低将意指BMP信号传导并未恢复。
ii)与嵌合hGREM1(即，XM5)结合的抗体
在某些实施方式中，本文所提供的某些抗GREM1抗体在BMP结合环外部的表位处与GREM1结合。在某些实施方式中，BMP结合环包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文所提供的抗GREM1抗体能够与包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的嵌合GREM1(在本文中也称为“XM5”)结合。嵌合GREM1 XM5包含hGREM1的突变版本，其中BMP的结合环(即，hGREM1的第123至第143氨基酸残基(NSFYIPRHIRKEEGSFQSCSF，SEQID NO:63))用DAN的第63至第83氨基酸(FSYSVPNTFPQSTESLVHCDS，SEQ ID NO:64)替换，所述突变版本不与BMP结合。因此，这种嵌合hGREM1不与BMP结合。某些现有抗GREM1抗体不能与这种嵌合hGREM1结合，表明其与hGREM1的结合需要hGREM1中的BMP结合环。相反，本文所提供的抗GREM1抗体能够与这种嵌合hGREM1结合，表明其在这个BMP结合环外部的表位处与hGREM1结合。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体能够与包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的嵌合hGREM1结合，且包含选自由以下组成的群组的抗体的重链CDR1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3以及轻链CDR1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3：14E3、42B9、67G11、36F5、56C11、22F1和69H5。
基准抗体6245P不能够与X5结合。
ⅲ)与小鼠GREM1具有交叉反应性或不具有交叉反应性的抗体
在某些实施方式中，一些本文所提供的抗GREM1抗体能够与hGREM1结合而非与小鼠GREM1特异性结合。
hGREM1和小鼠GREM1共有98％的序列一致性，并且仅在hGREM1的N端部分中发现不同的氨基酸残基，包括hGREM1的Gln27和Asn33，其中残基编号是根据SEQ ID NO:69。因此，对于不与小鼠GREM1交叉反应的抗GREM1抗体，预期其可在包含hGREM1的Gln27和/或Asn33的表位处与hGREM1结合，其中残基编号是根据SEQ ID NO:69，或与包含残基Gln27和/或残基Asn33的hGREM1片段结合，任选地hGREM1片段具有至少3个(例如，4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸残基的长度。表位可为构象表位或线性表位。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体能够与hGREM1结合而非与小鼠gremlin1特异性结合，且包含选自由69H5、22F1和14E3组成的群组的抗体的重链CDR1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3以及轻链CDR1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3。
在某些实施方式中，本文所提供的抗hGREM1抗体对小鼠GREM1具有交叉反应性，且包含选自由以下组成的群组的抗体的重链CDR1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3以及轻链CDR1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3：56C11、42B9、36F5和67G11。
基准抗体6245P对小鼠GREM1具有交叉反应性。
iv)阻断hGREM1与BMP7的结合的抗体
在某些实施方式中，本文所提供的抗体能够以如通过ELISA所测量的至少50％的最大阻断百分比阻断hGREM1与BMP7的结合。
如本文中所使用，术语“阻断百分比”是指相对于在不存在阻断剂的情况下两种蛋白质之间的相互作用，在阻断剂(例如，抗gremlin 1抗体)的存在下两种蛋白质之间的相互作用降低(例如，人类gremlin 1与BMP7的结合降低)的百分比。
如本文中所使用，术语“最大阻断百分比”是指可通过阻断剂(例如，抗gremlin 1抗体)阻断两种蛋白质(例如，人类gremlin 1和BMP7)之间的相互作用达成的最高(即，平线区)阻断百分比。一般来说，阻断的百分比随着阻断剂(例如，抗gremlin 1抗体)的浓度增加而增加，然而，其可达到稳定期，其中尽管阻断剂(例如，抗gremlin 1抗体)的浓度进一步增加，但无法实现更多阻断。最大阻挡百分比越高，阻断更有效。最大阻断百分比可在一定程度上视不同分析，例如竞争性ELISA分析和竞争性FACS分析而变化。
在某些实施方式中，本文所提供的某些抗gremlin 1抗体对hGREM1-BMP7相互作用的最大阻断百分比为至少50％，如通过竞争性ELISA分析所测量。分析条件可类似于本公开的实施例6中所提供的那些条件(人类gremlin 1的浓度为1μg/ml，且BMP7的浓度为0.5μg/ml)。对于hGREM1-BMP7相互作用具有上文提及的阻断活性的示例性抗gremlin 1抗体包括14E3(例如，14E3HaLa)、42B9、36F5和67G11。
在某些实施方式中，本文所提供的某些抗gremlin 1抗体对hGREM1-BMP7相互作用的最大阻断百分比为至少60％、至少70％或至少75％，如通过竞争性ELISA分析所测量。分析条件可类似于本公开的实施例6中所提供的那些条件(人类gremlin 1的浓度为1μg/ml，且BMP7的浓度为0.5μg/ml)。对于hGREM1-BMP7相互作用具有上文提及的阻断活性的示例性抗gremlin 1抗体包括42B9、36F5和67G11。
BMP-7是具有半胱氨酸结的同源二聚体蛋白质，其仅在若干成年器官，包括肾脏中选择性表达(Rui等人,《肾纤维化中的骨形态生成蛋白-7的作用(Role of bonemorphogenetic protein-7in renal fibrosis)》,《生理学前沿(Front.Physiol.)》,2015年4月23日)。BMP-7在正常肾脏中的表达在成年器官中是最高的，且在患有局部缺血再灌注损伤、糖尿病性肾病变和高血压肾硬化的患者的肾脏中下调(Dudley等人,《在哺乳动物肾脏和眼睛的发育期间需要骨形态生成蛋白-7(A requirement for bone morphogeneticprotein-7during development of the mammalian kidney and eye)》.《基因发展》9,2795-2807,1995；Luo等人,《BMP-7是肾发生的诱导剂，且还是眼睛发育和骨骼模式化所需的(BMP-7is an inducer of nephrogenesis,and is also required for eyedevelopment and skeletal patterning)》.《基因发展》9,2808-2820.1995；Simon等人,《正常和缺血性成年大鼠肾脏中骨形态生成蛋白-7mRNA的表达(Expression of bonemorphogenetic protein-7mRNA in normal and ischemic adult rat kidney)》.《美国生理学杂志(Am.J.Physiol.)》276,F382-F389,1999；Wang等人,《糖尿病性肾病变中的管状骨形态生成蛋白-7的损失(Loss of tubular bone morphogenetic protein-7in diabeticnephropathy)》.《美国肾脏病学会杂志(J.Am.Soc.Nephrol.)》12,2392-2399,2001；Bramlage等人,《在人类高血压肾硬化中降低骨形态生成蛋白(BMP)-7表达(Bonemorphogenetic protein(BMP)-7expression is decreased in human hypertensivenephrosclerosis)》.《BMC肾病学(BMC Nephrol.)》11:31.,2010；Vukicevic等人,《成骨蛋白质-1(骨形态生成蛋白-7)在大鼠中降低缺血性急性肾衰竭之后的损伤的严重程度(Osteogenic protein-1(bone morphogenetic protein-7)reduces severity of injuryafter ischemic acute renal failure in rat)》.《临床研究杂志(J.Clin.Invest.)》102,202-214.,1998；Simon等人,《正常和缺血性成年大鼠肾脏中骨形态生成蛋白-7mRNA的表达》.《美国生理学杂志》276,F382-F389.,1999)。
作为TGFβ超家族中的关键细胞因子中的一者，BMP7在慢性肾病中通过平衡TGF-β信号传导路径起抗纤维化作用，这通过增加胞外基质(ECM)产生和减少其降解来介导肾纤维发生(Rui等人,《肾纤维化中的骨形态生成蛋白-7的作用》,《生理学前沿》,2015年4月23日)。据报道肾脏损伤的若干动物模型中的BMP7治疗逆转肾纤维化且恢复肾功能(Hruska等人,《成骨蛋白质-1防止与输尿管阻塞相关的肾纤维发生(Osteogenic protein-1preventsrenal fibrogenesis associated with ureteral obstruction)》.《美国生理学肾生理学杂志(Am.J.Physiol.Renal Physiol.)》279,F130-F143.(2000)；Jeremiah等人,《骨形态生成蛋白-7改善肾纤维化且加快肾功能的恢复(Bone morphogenetic protein-7improvesrenal fibrosis and accelerates the return of renal function)》,《美国肾脏病学会杂志》2002年1月；)。
然而，肾脏中BMP7的活性不仅通过BMP7自身的可用性确定，而且通过激动剂与拮抗剂(例如，gremlin)的平衡确定。当BMP7用于治疗肾纤维化和其它肾病(例如，急性和慢性肾损伤)时，BMP7拮抗剂(例如，gremlin)的存在必须考虑到其治疗功效(Michael等人,《通过BMP7逆转实验性肾纤维化提供慢性肾病的新颖治疗策略的深刻见解(Reversal ofexperimental renal fibrosis by BMP7 provides insights into novel therapeuticstrategies for chronic kidney disease)》,《小儿肾脏病杂志(Pediatr Nephrol.)》2008年9月；23(9):1395-8)。
本公开显示gremlin 1与BMP7结合，且与基准抗体相比，本文所提供的抗gremlin1抗体(例如，42B9、36F5、67G11和14E3HaLa)对于gremlin 1与BMP7的结合具有更有效的阻断活性。如本文中所使用，术语“基准抗体”是指任何现有抗GREM1抗体(如6245P)，其是根据WO2014159010中所公开的H4H6245P的序列产生，所述专利的公开内容以全文引用的方式并入本文中。换句话说，本文所提供的抗gremlin 1抗体(例如，42B9、36F5、67G11和14E3HaLa)能够在表达BMP7的器官(例如，肾脏)功能中恢复BMP7活性。因此，可以合理地预期本文所提供的抗gremlin 1抗体(例如，42B9、36F5、67G11和14E3HaLa)可提高对纤维化疾病和肾病(例如肾纤维化)的治疗的功效。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体能够以如通过ELISA所测量的至少50％的最大阻断百分比阻断hGREM1与BMP7的结合，且包含选自由42B9、36F5和67G11组成的群组的抗体的重链CDR1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3以及轻链CDR1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3。在某些实施方式中，本文所提供的抗体能够以如通过ELISA所测量的30％至50％的最大阻断百分比阻断hGREM1与BMP7的结合，且包含抗体14E3的重链CDR1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3以及轻链CDR1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3。
v)阻断FGFR与GREM1的结合的抗体
在某些实施方式中，本文所提供的抗体能够阻断GREM1(例如，hGREM1或mGREM1)与FGFR(例如FGFR1，优选为人类FGFR1(hFGFR1)或小鼠FGFR1(mFGFR1))的阻断相互作用的结合，且包含选自由以下组成的群组的抗体的重链CDR1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3以及轻链CDR1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3：14E3、42B9、67G11和36F5。这些抗体特别适用于治疗与GREM1结合FGFR或FGFR活性相关的病状或疾病的方法。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体不阻断GREM1(例如，hGREM1或mGREM1)与FGFR(例如FGFR1，优选为人类FGFR1(hFGFR1)或小鼠FGFR1(mFGFR1))的阻断相互作用的结合，且包含选自由56C11组成的群组的抗体的重链CDR1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3以及轻链CDR1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体部分地阻断(具有至少2nM、至少3nM、至少4nM、至少5nM、至少6nM、或至少7nM的IC50)GREM1(例如，hGREM1或mGREM1)与FGFR(例如，FGFR1，优选为人类FGFR1(hFGFR1)或小鼠FGFR1(mFGFR1))的阻断相互作用的结合，且包含抗体22F1或69H5的重链CDR1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3以及轻链CDR1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3。
vi)降低GREM1介导的对MAPK信号传导的活化的抗体
在某些实施方式中，本文所提供的抗GREM1抗体能够降低GREM1介导的对MAPK信号传导的活化。本领域中众所周知，MAPK信号传导是维持肿瘤细胞增殖、迁移、血管生成和上皮-间叶细胞转变(epithelial-mesenchymal transition；EMT)的关键信号路径。本领域中已知MAPK信号传导可经由表皮生长因子(EGF)受体被其称为EGF的配体活化，或经由成纤维细胞生长因子(FGF)受体被其称为FGF的配体活化。本公开意外地发现GREM1似乎在MAPK信号传导的活化中发挥作用，且可能充当FGFR的新颖配体。本公开进一步发现本文所提供的抗GREM1抗体能够降低GREM1介导的对MAPK信号传导的活化，尤其能够阻断GREM1与FGFR的相互作用。
vii)与hGREM1和DAN两者结合的抗体
本公开中提供的抗体可与包括GREM1的一个或多个(例如，1、2、3个或更多个)DAN家族成员特异性结合。在某些实施方式中，本文所提供的抗体能够与hGREM1和DAN两者结合。如本文中所使用，术语“DAN”是指DAN家族的初始成员(也称为NbI1和DAND1)，这是一种调节BMP信号的适度拮抗剂。DAN最初在成神经细胞瘤中作为肿瘤抑制基因。BMP信号传导和DAN抑制之间的平衡失调可导致多种病况，包括癌症、肾病和肺动脉高血压。Gremlin充当强效拮抗剂，DAN起中等强度拮抗剂的作用。尽管二者都能拮抗BMP2、BMP4和BMP7，但仅有约20％的一致性。
在某些实施方式中，本文所提供的抗hGREM1抗体能够与hGREM1和DAN两者结合，且包含选自由36F5、42B9和67G11组成的群组的抗体的重链CDR1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3以及轻链CDR1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3。这些抗体特别适用于治疗与GREM1和DAN两者相关的病状或疾病的方法。
在某些实施方式中，本文所提供的抗hGREM1抗体能够与hGREM1而非与DAN结合，且包含抗体14E3、22F1、56C11或69H5的重链CDR1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3以及轻链CDR1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3。
双特异性抗体
在某些实施方式中，本文所提供的抗体和其抗原结合片段为双特异性的。如本文中所使用的术语“双特异性”涵盖具有超过两种特异性的分子和具有超过两种特异性，即多特异性的分子。在某些实施方式中，本文所提供的双特异性抗体和其抗原结合片段能够与hGREM1的第一和第二表位特异性结合，或能够与hGREM1和第二抗原特异性结合。在某些实施方式中，hGREM1的第一表位和第二表位彼此不同或不重叠。在某些实施方式中，双特异性抗体和其抗原结合片段可同时与第一表位和第二表位两者结合。在某些实施方式中，第二抗原不同于hGREM1。
在某些实施方式中，第二抗原为免疫相关靶标。如本文中所使用，免疫相关靶标涵盖参与免疫反应(任选地，细胞免疫反应)的产生、抑制或调节的生物分子。免疫相关靶标的一实例为免疫检查点分子。
免疫检查点分子可介导共刺激信号以增强免疫反应，或可介导共抑制信号以抑制免疫反应。免疫检查点分子的实例包括例如PD-L1、PD-L2、PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG3、A2AR、CD160、2B4、TGFβ、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、OX40、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD47、CD122、ICAM-1、IDO、NKG2C、SLAMF7、SIGLEC7、NKp80、CD160、B7-H3、LFA-1、1COS、4-1BB、GITR、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、CD3、CD16和CD83。在某些实施方式中，第二抗原包含PD-1、PD-L1、CTLA-4或LAG-3。
在某些实施方式中，第二抗原包含肿瘤抗原。如本文中所使用的“肿瘤抗原”是指肿瘤特异性抗原(例如，肿瘤细胞特有的且通常在非肿瘤细胞上不存在的那些抗原)，以及肿瘤相关抗原(例如在肿瘤和非肿瘤细胞中都存在但在肿瘤细胞中不同地表达，或在肿瘤微环境中发现)。肿瘤特异性抗原还可包括肿瘤新抗原(例如，其由于改变蛋白质序列或在两个不相关序列之间产生融合蛋白的体细胞突变而在癌细胞中表达)。
肿瘤抗原的实例包括但不限于前列腺特异性抗原(PSA)、CA-125、神经节苷脂G(D2)、G(M2)和G(D3)、CD20、CD52、CD33、Ep-CAM、CEA、铃蟾素样肽、HER2/neu、表皮生长因子受体(EGFR)、erbB2、erbB3/HER3、erbB4、CD44v6、Ki-67、癌症相关粘蛋白、VEGF、VEGFR(例如，VEGFR3)、雌激素受体、Lewis-Y抗原、TGFβ1、IGF-1受体、EGFα、c-Kit受体、转铁蛋白受体、紧密连接蛋白18.2、GPC-3、Nectin-4、ROR1、间皮素、PCMA、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5、BCR-ABL、E2APRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、IL-2R、CO17-1A、TROP2或LIV-1。
在某些实施方式中，肿瘤抗原包含前列腺特异性抗原(PSA)、CA-125、神经节苷脂G(D2)、G(M2)和G(D3)、CD20、CD52、CD33、Ep-CAM、CEA、铃蟾素样肽、HER2/neu、表皮生长因子受体(EGFR)、erbB2、erbB3/HER3、erbB4、CD44v6、Ki-67、癌症相关粘蛋白、VEGF、VEGFR(例如，VEGFR3)、雌激素受体、Lewis-Y抗原、TGFβ1、IGF-1受体、EGFα、c-Kit受体、转铁蛋白受体、紧密连接蛋白18.2、GPC-3、Nectin-4、ROR1、间皮素、PCMA、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5、BCR-ABL、E2APRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、IL-2R、CO17-1A、TROP2或LIV-1。
本文所提供的双特异性抗体和其抗原结合片段可以是本领域中已知的合适格式。举例来说，示例性双特异性格式可为双特异性双功能抗体、基于scFv的双特异性格式、IgG-scFv融合物、双可变结构域(DVD)-Ig、四源杂交瘤、杵臼(knobs-into-holes)、共同轻链(例如，具有杵臼的共同轻链等)、BiTE、CrossMab、CrossFab、Duobody、SEEDbody、亮氨酸拉链、双作用Fab(DAF)-IgG和Mab2双特异性格式(参见例如Brinkmann等人2017,《单抗(Mabs)》,9(2):182-212)。双特异性分子可呈对称或不对称的架构。
本文所提供的双特异性抗体和抗原结合片段可以用本领域中已知的任何合适方法制备。
在一个实施方式中，将两个具有不同抗原特异性的免疫球蛋白重链-轻链对在宿主细胞中共表达，从而以重组方式产生双特异性抗体(参见例如Milstein和Cuello,《自然》,305:537(1983))，随后通过亲和色谱法纯化。
在另一实施方式中，编码针对两种特异性的抗体重链可变结构域的序列分别与免疫球蛋白恒定结构域序列融合，随后插入到一种或多种表达载体，所述表达载体与针对轻链序列的表达载体共转染到合适的宿主细胞中以重组表达双特异性抗体(参见例如WO 94/04690；Suresh等人,《酶学方法(Methods in Enzymology)》,121:210(1986))。类似地，scFv二聚体还可重组地构建并且由宿主细胞表达(参见例如，Gruber等人,《免疫学杂志》,152:5368(1994))。
在另一方法中，可以通过基因融合将来自Fos和Jun蛋白质的亮氨酸拉链肽连接到两种不同抗体的Fab'部分。所连接的抗体在铰链区还原为四种半抗体(即，单体)，并且接着再氧化以形成异源二聚体(Kostelny等人,《免疫学杂志》,148(5):1547-1553(1992))。
还可缀合或交联两个抗原结合结构域以形成双特异性抗体或抗原结合片段。举例来说，一种抗体可偶联到生物素，而另一种抗体偶联到抗生物素蛋白，并且生物素与抗生物素蛋白之间的强缔合将使两种抗体复合在一起以形成双特异性抗体(参见例如美国专利第4,676,980号；WO 91/00360、WO 92/00373和EP 03089)。对于另一实例，可通过本领域中已知的，例如如美国专利第4,676,980号中所公开的常规方法交联两种抗体或抗原结合片段。
双特异性抗原结合片段可例如通过蛋白水解裂解或通过化学连接由双特异性抗体产生。举例来说，可制备抗体的抗原结合片段(例如，Fab')并且将其转化为Fab'-硫醇衍生物，且接着与具有不同抗原特异性的另一种转化的Fab'衍生物混合并且反应以形成双特异性抗原结合片段(参见例如Brennan等人,《科学》,229:81(1985))。
在某些实施方式中，本文所提供的双特异性抗体或其抗原结合片段可在界面处工程改造以使得可形成杵臼缔合以促进两种不同的抗原结合位点的异源二聚体化。这可最大化从重组细胞培养物回收的异源二聚体的百分比。如本文中所使用，“杵臼”是指两种多肽(如Fc)之间的相互作用，其中一种多肽由于存在具有庞大侧链的氨基酸残基(例如，酪氨酸或色氨酸)而具有突起(即，“杵”)，且另一种多肽具有空腔(即，“臼”)，其中小侧链氨基酸残基驻留(例如，丙氨酸或苏氨酸)，且突起可定位于空腔中以便促进两种多肽的相互作用从而形成异源二聚体或复合物。产生具有杵臼的多肽的方法为本领域中已知的，例如如美国专利第5,731,168号中所描述。
缀合物
在一些实施方式中，将抗hGREM1抗体和其抗原结合片段连接到一个或多个结合部分。缀合物为可连接到抗体或其抗原结合片段的部分。可以想到，多种缀合物可连接到本文所提供的抗体或抗原结合片段(参见例如“缀合物疫苗(Conjugate Vaccines)”,《微生物学和免疫学的贡献(Contributions to Microbiology and Immunology)》,J.M.Cruse和R.E.Lewis,Jr.(编),Carger Press,New York,(1989))。这些缀合物可通过共价结合、亲和力结合、嵌入、配位结合、复合、缔合、掺合或添加等方法连接到抗体或抗原结合片段。在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段是通过连接子连接到一个或多个缀合物。在某些实施方式中，连接子为腙连接子、二硫键连接子、双官能连接子、二肽连接子、葡萄糖苷酸连接子、硫醚连接子。
在某些实施方式中，可以工程改造本文所公开的抗hGREM1抗体和抗原结合片段以在表位结合部分之外含有特异性位点，所述位点可用于与一个或多个缀合物结合。举例来说，这种位点可包括一个或多个反应性氨基酸残基，例如半胱氨酸或组氨酸残基，以有助于与缀合物的共价键联。
缀合物可以是清除调节剂、治疗剂(例如，化学治疗剂)、毒素、放射性同位素、可检测标记(例如，镧系元素、发光标记、荧光标记或酶-底物标记)、药代动力学调节部分、DNA烷基化剂、拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白结合剂、称为例如雄激素受体抑制剂的其它抗癌药物。
可检测标记的实例可包括荧光标记(例如，荧光素、罗丹明(rhodamine)、丹酰(dansyl)、藻红蛋白(phycoerythrin)或德克萨斯红(Texas Red))、酶-底物标记(例如，辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶或β-D-半乳糖苷酶)、放射性同位素、其它镧系元素、发光标记、发色部分、地高辛(digoxigenin)、生物素/抗生物素蛋白、DNA分子或检测用金。
放射性同位素的实例可包括123I、124I、125I、131I、35S、3H、111In、112In、14C、64Cu、67Cu、86Y、88Y、90Y、177Lu、211At、186Re、188Re、153Sm、212Bi和32P。放射性同位素标记的抗体适用于受体靶向成像实验。
在某些实施方式中，缀合物可为药代动力学调节部分(如PEG)，其有助于增加抗体的半衰期。其它合适的聚合物包括例如羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇/丙二醇的共聚物等。
在某些实施方式中，缀合物可以是纯化部分，如磁珠或纳米粒子。
药物组合物
本公开提供药物组合物，其包含抗hGREM1抗体或其抗原结合片段和一种或多种药学上可接受的载体。
用于本文所公开的药物组合物中的药学上可接受的载体可包括例如药学上可接受的液体、凝胶或固体载体、水性媒剂、非水性媒剂、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、麻醉剂、悬浮剂/分散剂、螯合剂(sequestering/chelating agents)、稀释剂、佐剂、赋形剂或无毒辅助物质、本领域中已知的其它组分，或其各种组合。
合适的组分可包括例如抗氧化剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、润滑剂、调味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂或稳定剂，如糖和环糊精。合适的抗氧化剂可包括例如甲硫氨酸、抗坏血酸、EDTA、硫代硫酸钠、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、硫代甘油、巯基乙酸、硫代山梨糖醇、丁基化羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯和/或没食子酸丙酯。如本文所公开，在包含如本文所提供的抗体或抗原结合片段和缀合物的组合物中包括一种或多种抗氧化剂(如甲硫氨酸)减少抗体或抗原结合片段的氧化。此氧化的减少防止或减少结合亲和力的损失，由此提高抗体稳定性且使储存寿命最大化。因此，在某些实施方式中，提供了包含一种或多种如本文所公开的抗体或抗原结合片段和一种或多种抗氧化剂(如甲硫氨酸)的组合物。进一步提供了通过将抗体或抗原结合片段与一种或多种抗氧化剂(如甲硫氨酸)混合来防止如本文所提供的抗体或抗原结合片段的氧化、延长其保存期和/或提高其功效的方法。
为了进一步说明，药学上可接受的载体可包括例如水性媒剂，如氯化钠注射液、林格氏注射液(Ringer's injection)、等渗右旋糖注射液、无菌水注射液或右旋糖和乳酸林格氏注射液；非水性媒剂，如植物来源的非挥发性油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油；抑制细菌或抑制真菌浓度的抗微生物剂；等渗剂，如氯化钠或右旋糖；缓冲剂，如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂；抗氧化剂，如硫酸氢钠；局部麻醉剂，如盐酸普鲁卡因(procainehydrochloride)；悬浮剂和分散剂，如羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；乳化剂，如聚山梨醇酯80(TWEEN-80)；螯合剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇四乙酸(EGTA)、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。可将用作载体的抗微生物剂添加到多剂量容器中的药物组合物中，所述抗微生物剂包括苯酚或甲酚、汞剂、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵(benzalkoniumchloride)和苄索氯铵(benzethonium chloride)。合适的赋形剂可包括例如水、生理盐水、右旋糖、甘油或乙醇。合适的无毒辅助物质可包括例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、溶解度增强剂或如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或环糊精的试剂。
药物组合物可为液体溶液、悬浮液、乳液、丸剂、胶囊、片剂、持续释放调配物或散剂。口服调配物可包括标准载体，如药用级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
在某些实施方式中，药物组合物被调配成可注射组合物。可注射的药物组合物可以任何常规形式制备，例如液体溶液、悬浮液、乳液或适用于产生液体溶液、悬浮液或乳液的固体形式。注射用制剂可包括准备好用于注射的无菌和/或无热原质溶液；仅在使用之前准备与溶剂组合的无菌干燥可溶性产品，如冻干粉末，包括皮下片剂；准备好用于注射的无菌悬浮液；仅在使用之前准备与媒剂组合的无菌干燥不溶性产品；和无菌和/或无热原质乳液。溶液可以是水性或非水性的。
在某些实施方式中，单位剂量的肠胃外制剂被包装在安瓿、小瓶或带针头的注射器中。所有用于肠胃外施用的制剂都应该是无菌的且无热原质的，正如本领域中已知和实践的那样。
在某些实施方式中，无菌冻干粉末是通过将如本文中所公开的抗体或抗原结合片段溶解于合适溶剂中制备。溶剂可含有提高粉末或由粉末制备的复原溶液的稳定性或其它药理学组分的赋形剂。可使用的赋形剂包括但不限于水、右旋糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其它合适的试剂。溶剂可含有缓冲剂，如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾或本领域的技术人员已知的其它此类缓冲剂，在一个实施方式中，所述缓冲剂为约中性pH。随后无菌过滤溶液，接着在本领域的技术人员已知的标准条件下冻干，得到所需调配物。在一实施方式中，将所得溶液分配到小瓶中以冻干。每个小瓶可含有单剂量或多剂量的抗hGREM1抗体或其抗原结合片段或其组合物。使小瓶过量填充高于一个剂量或一组剂量所需的少量(例如约10％)是可接受的，以便有助于准确样品抽取和准确给药。冻干粉末可在适当条件下储存，例如在约4℃到室温下。
用注射用水复原冻干粉得到用于肠胃外施用的调配物。在一个实施方式中，为了复原，将无菌和/或无热原质水或其它合适的液体载体添加到冻干粉末中。精确量取决于所给定的所选疗法，并且可以凭经验确定。
在某些实施方式中，药物组合物进一步包含第二治疗剂。
在某些实施方式中，第二治疗剂可为用于治疗癌症的药剂，例如化学治疗剂、抗癌药物、放射疗法、免疫疗法、抗血管生成剂(例如，如VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3的VEGFR的拮抗剂)、靶向疗法、细胞疗法、基因疗法药剂、激素疗法药剂、细胞因子、姑息治疗、用于治疗癌症的手术(例如，肿瘤切除术)或一种或多种抗呕剂或由化学疗法引起的并发症的其它治疗。
在某些实施方式中，第二治疗剂包含抗血管生成剂，例如VEGFR或VEGF的拮抗剂。在某些实施方式中，第二治疗剂包含抗VEGFR抗体或抗VEGF抗体。在某些实施方式中，第二治疗剂包含抗VEGFR-2抗体。
在某些实施方式中，第二治疗剂可为用于治疗纤维化疾病的药剂。
在某些实施方式中，第二治疗剂管理或治疗至少一种与纤维化或癌症相关的并发症。
多核苷酸和重组方法
本公开提供编码抗hGREM1抗体和其抗原结合片段的分离的多核苷酸。如本文中所使用的术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)和其聚合物。除非另外指示，否则特定多核苷酸序列还隐含地涵盖其保守修饰变体(例如简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列，以及明确指示的序列。具体来说，简并密码子取代可通过产生其中一个或多个选定(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(参见Batzer等人,《核酸研究(Nucleic AcidRes.)》19:5081(1991)；Ohtsuka等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人,《分子细胞探针(Mol.Cell.Probes)》8:91-98(1994))。
在某些实施方式中，分离的多核苷酸包含如SEQ ID NO:9、10、19、20、29、30、39、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62和142至147中所示的一个或多个核苷酸序列，和/或与其具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的序列，和/或其仅具有简并取代的变体，并且编码本文所提供的示例性抗体的可变区。
编码单克隆抗体的DNA很容易使用常规程序(例如，通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)进行分离并且测序。还可通过合成方法获得编码DNA。
本公开提供了包含本文所提供的分离的多核苷酸的载体(例如表达载体)。在某些实施方式中，本文所提供的表达载体包含编码本文所提供的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸、至少一个可操作地连接到多核苷酸序列的启动子(例如，SV40、CMV、EF-1α)和至少一个选择标记。载体的实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳多空病毒(例如SV40)、λ噬菌体和M13噬菌体、质粒，如pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。
可将包含编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸序列的载体引入宿主细胞中以进行克隆或基因表达。用于克隆或表达本文载体中的DNA的合适宿主细胞为上文所描述的原核生物、酵母或更高等真核生物细胞。用于此目的的合适的原核生物包括真细菌，如革兰氏阴性生物体(Gram-negative organism)或革兰氏阳性生物体，例如肠内菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌；肠杆菌属(Enterobacter)；欧文氏菌属(Erwinia)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)；变形杆菌属(Proteus)；沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)，例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)；和志贺杆菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)；假单胞菌属(Pseudomonas)，如绿脓杆菌(P.aeruginosa)；和链霉菌属(Streptomyces)。
除原核生物以外，真核微生物，如丝状真菌或酵母是抗hGREM1抗体编码载体的合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常见的烘焙酵母是低级真核宿主微生物中最常用的。然而，多种其它属、物种和菌株在本文中是常用的且适用的，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、克鲁维雄酵母(K.waltii)(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(EP 402,226)；毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，如西方许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)；和丝状真菌，例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)宿主，如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
用于表达本文所提供的糖基化抗体或抗原片段的合适的宿主细胞来源于多细胞生物体，如无脊椎动物细胞，例如植物和昆虫细胞。已经鉴别多种杆状病毒株和变体以及来自如下宿主的对应容许的昆虫宿主细胞：草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫(caterpillar))、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子(mosquito))、白纹伊蚊(Aedesalbopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)。多种用于转染的病毒株是可公开获得的，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5菌株，并且这类病毒可以根据本发明用作本文中的病毒，特别是用于转染草地贪夜蛾细胞。棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物也可用作宿主。
然而，对脊椎动物细胞的兴趣最大，并且在培养物(组织培养物)中脊椎动物细胞的繁殖已成为常规程序。适用的哺乳动物宿主细胞系的实例为由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人类胚肾系(亚克隆以在悬浮培养物中生长的293或293细胞，Graham等人,《普通病毒学杂志(J.Gen Virol.)》36:59(1977))；幼小仓鼠肾细胞(BHK，ATCCCCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人,《美国国家科学院院刊》77:4216(1980))；小鼠支持细胞(TM4，Mather,《生殖生物学(Biol.Reprod.)》23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人类宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人类肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人类肝细胞(Hep G2，HB8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人,《纽约科学院年报(Annals N.Y.Acad.Sci.)》383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人类肝瘤系(HepG2)。在一些优选实施方式中，宿主细胞为哺乳动物培养细胞系，如CHO、BHK、NS0、293和其衍生物。
用上述用于产生抗hGREM1抗体的表达或克隆载体转化宿主细胞，并且在按需要改良的常规营养培养基中培养，以诱导启动子、选择转化子或扩增编码所需序列的基因。在另一实施方式中，可通过本领域中已知的同源重组产生抗体。
用于产生本文所提供的抗体或抗原结合片段的宿主细胞可以在各种培养基中培养。市售培养基，如Ham's F10(西格玛(Sigma))、最小必需培养基(MEM)(西格玛)、RPMI-1640(西格玛)和杜尔贝科氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle'sMedium；DMEM，西格玛)适用于培养宿主细胞。另外，Ham等人,《酶学方法(Meth.Enz.)》58:44(1979)；Barnes等人,《分析生物化学(Anal.Biochem.)》102:255(1980)；美国专利第4,767,704号、第4,657,866号、第4,927,762号、第4,560,655号或第5,122,469号；WO 90/03430；WO87/00195；或美国再颁专利第30,985号中所描述的任何培养基都可以用作宿主细胞的培养基。这些培养基中的任一者都可以视需要补充激素和/或其它生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙盐、镁盐和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围内的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能量源。也可以包括本领域的技术人员已知的适当浓度的任何其它必要的补充剂。培养条件(如温度、pH等)是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，并且对于本领域的一般技术人员将是显而易见的。
当使用重组技术时，抗体可以在细胞内、在周质空间中产生，或直接分泌到培养基中。如果在细胞内产生抗体，那么作为第一步骤，例如通过离心或超滤去除微粒碎片(宿主细胞或裂解片段)。Carter等人,《生物技术》10:163-167(1992)描述了一种用于分离分泌到大肠杆菌的周质空间的抗体的程序。简单来说，将细胞糊状物在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的存在下解冻约30分钟。细胞碎片可通过离心去除。在抗体分泌到培养基中的情况下，来自这类表达系统的上清液一般首先使用市售的蛋白质浓缩过滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤装置)进行浓缩。如PMSF的蛋白酶抑制剂可包括在任何前述步骤中，以抑制蛋白水解，并且可包括抗生素以防止外来污染物的生长。
由细胞制备的抗hGREM1抗体和其抗原结合片段可以使用例如羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析、DEAE-纤维素离子交换色谱法、硫酸铵沉淀、盐析和亲和色谱法纯化，其中亲和色谱法是优选的纯化技术。
在某些实施方式中，固定于固相上的蛋白质A用于抗体和其抗原结合片段的免疫亲和纯化。蛋白质A作为亲和配体的适合性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白质A可用于纯化基于人类γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等人,《免疫学方法杂志》62:1-13(1983))。推荐蛋白质G用于所有小鼠同种型和人类γ3(Guss等人,《欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)》5:1567 1575(1986))。亲和配体所附接的基质通常是琼脂糖，但也可以使用其它基质。如受控微孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯的机械稳定性基质允许相比于可用琼脂糖实现更快的流速和更短的处理时间。当抗体包含CH3结构域时，Bakerbond ABX.TM.树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)适用于纯化。视待回收的抗体而定，也可使用用于蛋白质纯化的其它技术，如离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅上的色谱法、肝素SEPHAROSETM上的色谱法、阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上的色谱法、色谱焦聚、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
在任何初步纯化步骤之后，可使用pH在约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液对包含所关注的抗体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用色谱，优选在低盐浓度(例如约0-0.25M盐)下进行。
使用的方法
在一个方面中，本公开提供本文所提供的抗体的治疗用途。
在某些实施方式中，本公开提供治疗或预防有需要的受试者的GREM1相关疾病或病状的方法，其包括：施用治疗有效量的如本文所提供的抗体或抗原结合片段和/或本文所提供的药物组合物，由此治疗或预防GREM1相关疾病或病状。
在另一方面中，本公开提供治疗有需要的受试者的GREM1相关疾病或病状的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的抗人类GREM1抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段：
a)能够在包含残基Gln27和/或残基Asn33的表位处与hGREM1结合，其中残基编号是根据SEQ ID NO:69，和/或
b)能够与包含残基Gln27和/或残基Asn33的hGREM1片段结合，任选地hGREM1片段具有至少3个(例如，4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸残基的长度；和/或
c)相对于非癌细胞，能够选择性地降低癌细胞中hGREM1介导的对BMP信号传导的抑制；和/或
d)在非癌细胞中展现hGREM1介导的对BMP信号传导的抑制降低不超过50％；和/或
e)能够与包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的嵌合hGREM1结合；和/或
g)能够以如通过Fortebio所测量的不超过1nM的KD与hGREM1结合；和/或
h)能够以如通过ELISA所测量的大于50％的最大阻断百分比阻断hGREM1与BMP7的结合；和/或
i)能够阻断GREM1(例如，hGREM1或mGREM1)与FGFR(例如FGFR1，优选为人类FGFR1(hFGFR1)或小鼠FGFR1(mFGFR1))的相互作用。
在另一方面中，本公开提供一种抑制有需要的受试者中的FGFR1活化的方法，或一种治疗与由GREM1介导的FGFR1活化相关的疾病或病状的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的抗人类GREM1抗体或其抗原结合片段，其中抗人类GREM1抗体或其抗原结合片段包含：
a)包含SEQ ID NO:1的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:2的序列的HCDR2和包含SEQID NO:3的序列的HCDR3；包含SEQ ID NO:4的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:5的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:6的序列的LCDR3；
b)包含SEQ ID NO:11的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:12的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:13的序列的HCDR3；包含SEQ ID NO:14的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:15的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:16的序列的LCDR3；
c)包含SEQ ID NO:21的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:22的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:23的序列的HCDR3；包含SEQ ID NO:24的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:25的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:26的序列的LCDR3；
d)包含SEQ ID NO:31的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:32的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:33的序列的HCDR3；包含SEQ ID NO:34的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:36的序列的LCDR3；
e)包含SEQ ID NO:114的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:115的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:116的序列的HCDR3；包含SEQ ID NO:117的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:118的序列的LCDR3；
f)包含SEQ ID NO:119的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:115的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:120的序列的HCDR3；包含SEQ ID NO:121的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:118的序列的LCDR3；或
g)包含SEQ ID NO:119的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:115的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:120的序列的HCDR3；包含SEQ ID NO:122的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:118的序列的LCDR3。
在另一方面中，本公开提供一种抑制有需要的受试者中的FGFR1活化的方法，或一种治疗与由GREM1介导的FGFR1活化相关的疾病或病状的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的抗人类GREM1抗体或其抗原结合片段，其中抗人类GREM1抗体或其抗原结合片段包含：
a)包含SEQ ID NO:123的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:115的序列的HCDR2、包含SEQ ID NO:124的序列的HCDR3；包含SEQ ID NO:125的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:118的序列的LCDR3，
b)包含SEQ ID NO:114的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:115的序列的HCDR2、包含SEQ ID NO:116的序列的HCDR3；包含SEQ ID NO:117的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:118的序列的LCDR3；
c)包含SEQ ID NO:119的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:115的序列的HCDR2、包含SEQ ID NO:120的序列的HCDR3；包含SEQ ID NO:121的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:118的序列的LCDR3；或
d)包含SEQ ID NO:119的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:115的序列的HCDR2、包含SEQ ID NO:120的序列的HCDR3；包含SEQ ID NO:122的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:118的序列的LCDR3。
GREM1相关疾病或病状可为受益于调节GREM1活性(例如，GREM1活性降低)的疾病或病状。在一些实施方式中，GREM1相关疾病或病状的特征在于GREM1表达或过度表达。
如本文中所使用的关于GREM1的术语“过度表达”是指相对于参考水平增加的表达水平。参考水平可为相同组织类型的正常细胞中发现的GREM1表达的水平，任选地标准化为另一种基因(例如，管家基因(house keeping gene))的表达水平。替代地，参考水平可为健康受试者中发现的GREM1表达的水平。在一些实施方式中，表达GREM1的癌症的GREM1表达水平比参考水平高至少10％(例如，至少15％、20％、30％、35％、40％、50％或1倍、2倍、3倍或甚至更高)。
可基于核酸水平或蛋白质水平确定GREM1的表达。可在核酸水平下通过本领域中已知的任何方法，例如但不限于扩增分析(如聚合酶链反应、定量实时PCR、滚环式复制、等温扩增等)、杂交分析(例如，RNA印迹法(Northern blotting)、微阵列、荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization；FISH)等)或测序分析(例如RNA测序)测量GREM1的表达水平。替代地，可在蛋白质水平下通过本领域中已知的任何方法，例如但不限于免疫分析(如蛋白质印迹法(Western blotting)、酶联免疫吸附分析(ELISA)、酶免疫分析(EIA)、放射免疫分析(RIA)、夹心分析、竞争性分析、免疫荧光染色和成像、免疫组织化学(IHC)和荧光活化细胞分选(FACS))测量GREM1的表达水平。
在某些实施方式中，受试者为人类。在某些实施方式中，受试者鉴别为具有GREM1表达或过度表达，任选地在从受试者获得的生物样品中。
在一些实施方式中，GREM1相关疾病或病状选自由以下组成的群组：癌症、纤维化疾病、血管生成、青光眼或视网膜疾病、肾病、肺动脉高血压和骨关节炎(OA)。GREM1水平的增加已与许多这些疾病和病状，如硬皮病、糖尿病性肾病变、神经胶质瘤、头颈癌、前列腺癌和结肠直肠癌相关。
i.癌症治疗
在某些实施方式中，本公开提供使用本文所提供的抗体治疗或预防癌症的方法。
在一些实施方式中，癌症为表达GREM1的癌症。如本文中所使用的短语“表达GREM1的癌症”是指特征在于具有表达GREM1的癌细胞，和/或在癌症微环境中具有GREM1表达的癌症。在一些实施方式中，表达GREM1的癌症在癌细胞和/或癌症微环境中具有GREM1过度表达。
GREM1可经由自分泌方式起作用以促进表达GREM1的肿瘤细胞的生长。GREM1还可由驻留于癌症微环境内或包围癌症微环境的非癌细胞分泌，以产生适用于癌细胞生长或存活的生态位，即使癌细胞本身可能不一定表达GREM1。
如本文中所使用，癌症微环境是指包围癌细胞的组织、细胞和环境。癌症微环境可包含基质细胞，如成纤维细胞、周细胞、内皮细胞、脂肪细胞和骨髓间充质基质细胞(MSC)。癌症微环境还可包含与癌细胞相关或与包围癌细胞的基质细胞相关的胞外基质。胞外基质主要由基质(ground substance)(主要由蛋白聚糖聚集物制成的多孔水合凝胶)和结缔组织纤维构成。可在例如基质细胞或胞外基质中观测到GREM1在癌症微环境中的表达。在某些实施方式中，表达GREM1的癌症在基质(如促结缔组织增生基质)或基质细胞中具有GREM1表达或过度表达。
在某些实施方式中，受试者鉴别为具有表达GREM1的癌细胞，或在癌症微环境中具有GREM1表达。癌细胞上或癌症微环境中的GREM1的存在和/或表达水平可通过本领域中已知或本文所提供的各种方法，使用从受试者获得的生物样品来确定。含有或疑似含有癌细胞或来自癌症微环境的生物样品可以获自或来源于受试者，例如福尔马林固定的石蜡包埋(formalin fixed paraffin embedded；FFPE)组织、新鲜活检体、血液(疑似含有循环肿瘤细胞)或其它体液。在一些实施方式中，癌细胞、基质细胞和/或胞外基质可以从生物样品中分离。在某些实施方式中，可进一步处理生物样品以例如分离如核酸或蛋白质的分析物。
表达GREM1的癌症可以是任何类型的癌症。在某些实施方式中，癌症选自实体肿瘤或血液肿瘤。在某些实施方式中，实体肿瘤为肾上腺皮质癌瘤、肛门癌、星形细胞瘤、儿童小脑或大脑、基底细胞癌瘤、胆管癌、膀胱癌、骨骼肿瘤、脑癌、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、室管膜瘤、神经管胚细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视路和下丘脑神经胶质瘤、乳癌、伯基特氏淋巴瘤、子宫颈癌、结肠癌、肺气肿、子宫内膜癌、食道癌、尤文氏肉瘤、成视网膜细胞瘤、胃癌(gastric/stomach cancer)、神经胶质瘤、头颈癌、心脏癌症、霍奇金淋巴瘤、胰岛细胞癌瘤(内分泌胰腺)、卡波西肉瘤、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、肝癌、肺癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、成视网膜细胞瘤、尤文氏家族肿瘤、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、喉癌、甲状腺癌或阴道癌。
在某些实施方式中，表达GREM1的癌症也是表达PD-L1的癌症。在某些实施方式中，表达GREM1的癌症不是表达PD-L1的癌症。如本文中所使用的关于癌症的术语“表达PD-L1”是指使用本领域中已知的任何检测方法(例如免疫组织化学(IHC)、流式细胞测量术(如FACS)等)对PD-L1表达呈阳性的癌症。举例来说，表达PD-L1的癌症可以指使用基于IHC数据的简单二进制阳性/阴性表征方法对PD-L1表达呈阳性的癌症，其中如果展现PD-L1的细胞表面膜染色的肿瘤组织部分中的癌细胞的百分比为总癌细胞的至少1％、2％、3％、4％或5％，那么定义阳性结果。详细描述可见于Thompson,R.H.等人,《美国国家科学院院刊》101(49)；17174-17179(2004)；Thompson,R.H.等人,《癌症研究(Cancer Res.)》66:3381-3385(2006)；Gadiot,J.等人,《癌症(Cancer)》117:2192-2201(2011)；Taube,J.M.等人,《科学·转化医学(Sci Transl Med)》4,127ra37(2012)；和Toplian,S.L.等人,《新英格兰医学杂志(New Eng.J Med.)》366(26):2443-2454(2012)中。表达PD-L1的癌症还可以指使用WO2014165422A1中所描述的评分方法对PD-L1表达呈阳性的癌症。在某些实施方式中，表达GREM1的癌症对用PD-1/PD-L1轴抑制剂的治疗具有抗性或难治性。
在某些实施方式中，血液肿瘤为白血病(例如急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML))、淋巴瘤(例如霍奇金氏淋巴瘤或非霍奇金氏淋巴瘤(例如，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)))或骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤(MM))。
在某些实施方式中，癌症为前列腺癌、胃-食道癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、肝癌、胰腺癌、乳癌、支气管癌、骨癌、肝脏和胆管癌症、卵巢癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、脊柱癌、脑癌、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、肛门癌、胃肠癌、皮肤癌、垂体癌、胃癌、阴道癌、甲状腺癌、神经胶母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓发育不良综合症、肉瘤、畸胎瘤、神经胶质瘤、腺癌、白血病(例如急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML))、淋巴瘤(例如霍奇金氏淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤(例如，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)))或骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤(MM))。
在某些实施方式中，癌症选自由以下组成的群组：前列腺癌、胃-食道癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、肝癌、结肠癌、结肠直肠癌、神经胶质瘤、胰腺癌、膀胱癌和乳癌。在某些实施方式中，癌症为三阴性乳癌。在某些实施方式中，癌症为多发性骨髓瘤。
在某些实施方式中，癌症为转移性的。在某些实施方式中，本公开进一步提供使用本文所提供的抗体治疗或预防癌症转移的方法。癌症转移为癌细胞从其原始部位扩散到身体内的另一部位的过程。
在某些实施方式中，癌症为前列腺癌、乳癌或肝癌。
在某些实施方式中，乳癌为三阴性乳癌。术语“三阴性乳癌”或“TNBC”是指对雌激素受体、孕酮受体和过量HER2蛋白质进行测试呈阴性的乳癌。TNBC可对激素疗法或靶向HER2的药物无反应性。
在某些实施方式中，癌症为多发性骨髓瘤(MM)。发现GREM1由骨髓(BM)间充质基质细胞的亚群大量分泌，并且被视为在MM疾病发展中起关键作用。通过定量型PCR对人类和小鼠BM基质样品的分析表明，相较于健康对照，GREM1/Grem1表达在携带MM肿瘤的队列中显著更高。抗GREM1抗体已显示减少小鼠中的MM肿瘤负荷(K.Clark等人,《癌症》2020,12,2149)。
ii.治疗纤维化疾病
在一些实施方式中，GREM1相关疾病或病状为纤维化疾病。纤维化疾病为涉及纤维化的疾病或病状。纤维化为作为慢性器官损伤的共同特征的疤痕过程，例如在肺、肝脏、肾脏、皮肤、心脏、肠道或肌肉中。纤维化的特征在于转化生长因子-β(TGF-β)的活性升高，引起胞外基质和其它纤维化相关蛋白质的沉积增加和改变。已在许多纤维化疾病中发现升高的GREM1表达，表明GREM1可为纤维化的重要标记物(Costello等人,2010,《美国呼吸系统细胞与分子生物学杂志(Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.)》42:517-523；Lappin等人,2002,《肾脏病与透析肾移植(Nephrol.Dial.Transplant.)》17:65-67；Boers等人,2006,《生物化学杂志》281:16289-16295)。
纤维化疾病可包括肺、肝脏、肾脏、眼睛、皮肤、心脏、肠道或肌肉中的纤维化疾病。肺中的纤维化疾病的实例包括肺纤维化、囊性纤维化、肺高血压、进行性块状纤维化、阻塞性细支气管炎、与慢性哮喘或特发性肺相关的气道重塑。肝脏中的纤维化疾病的实例包括肝硬化或非酒精性脂肪变性肝炎。肾脏中的纤维化疾病的实例包括例如肾纤维化、缺血性肾损伤、小管间质性纤维化、糖尿病性肾病变、肾硬化或肾毒性。眼睛中的纤维化疾病的实例包括例如角膜纤维化、视网膜下纤维化。皮肤中的纤维化疾病的实例包括例如肾源性系统性纤维化、瘢痕瘤或硬皮病。心脏中的纤维化疾病的实例包括心内膜心肌纤维化或陈旧性心肌梗塞。
在另一方面中，本公开还提供一种在治疗有需要的受试者的纤维化疾病(例如，肾纤维化)中提高BMP7治疗的功效的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文所提供的抗gremlin 1抗体。在某些实施方式中，受试者正经受BMP7治疗。在另一方面中，本公开还提供一种治疗有需要的受试者的纤维化疾病(例如，肾纤维化)的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文所提供的抗gremlin 1抗体与BMP7治疗的组合。如本文中所使用的术语“BMP7治疗”可为涉及增加有需要的受试者中BMP7的含量的任何治疗。举例来说，BMP7治疗可以施用重组BMP7或BMP7的肽模拟物。BMP7治疗还可涉及恢复内源性BMP7，如通过降低BMP7的拮抗剂(例如，头蛋白或子宫致敏相关基因-1(USAG-1))的水平和/或活性或通过增加(例如Kielin/chordin样蛋白(KCP)或BMP受体)BMP7的激动剂的水平和/或活性进行(Michael等人,《通过BMP7逆转实验性肾纤维化提供慢性肾病的新颖治疗策略的深刻见解》,《小儿肾脏病杂志》2008年9月；23(9):1395-8)。
在另一方面中，本公开还提供一种治疗疾病的方法，所述疾病可受益于增加BMP7活性或降低gremlin介导的对BMP7活性的抑制，其包括向受试者施用治疗有效量的本文所提供的抗gremlin 1抗体。在某些实施方式中，疾病为纤维化疾病和/或肾病。在某些实施方式中，疾病选自由以下组成的群组：局部缺血再灌注损伤、缺血性急性肾衰竭、糖尿病性肾病变和高血压肾硬化、肾纤维化、慢性肾病、急性肾病、高血压肾硬化、免疫球蛋白A肾病变(IgAN)和其它自身免疫疾病，如狼疮肾炎或全身性红斑狼疮(SLE)。
iii.治疗其它疾病
在一些实施方式中，GREM1相关疾病或病状为肺动脉高血压(PAH)。术语“肺动脉高血压”(“PAH”)是指特征在于肺动脉压力持续升高的进行性肺病症。已发现GREM1在低氧期间在小鼠的小肺内血管的壁中升高。已发现抗GREM1抗体缓解或改善与PAH相关的一种或多种症状，例如抑制肺动脉的增厚、增加心搏出量和/或心搏出量与收缩末期容积比(“SV/ESV”)、增加右心室心输出量和/或心脏指数(CI)、改善患有PAH的受试者中的其它血流动力学测量，例如右心房压力、肺动脉压力、在呼气末期压力(end expiratory pressure)的存在下的肺毛细血管楔压、全身动脉压力、心跳、肺血管阻力和/或全身血管阻力(对于细节，参见美国专利申请US20180057580A1)。
在一些实施方式中，GREM1相关疾病或病状为骨关节炎(OA)。据报道GREM1为软骨细胞中的机械负载诱导性因子，并且在循环应变或流体静压力负载后在软骨的中间层和深度层中检测到高含量的GREM1。据报道在骨关节炎中上调GREM1，且血清和滑液中的GREM1浓度与膝部OA的发作和严重程度相关(J.Yi等人,《医学科学监测(Med Sci Monit)》,2016；22:4062-4065)。GREM1活化核因子-κB信号传导，从而导致分解代谢酶的后续诱导。据报道小鼠中关节内施用GREM1抗体或GREM1的软骨细胞特异性缺失减缓骨关节炎发展(参见S.H.Chang等人,《自然通信(Nature Communications)》,(2019)10:1442)。
在一些实施方式中，GREM1相关疾病或病状为血管生成。GREM1为主要促血管生成受体血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)的激动剂。硫酸乙酰肝素(HS)和肝素(以其抗凝血剂作用闻名的葡糖胺聚糖(GAG))已被证明与GREM1结合。GREM1与肝素结合且以BMP非依赖性方式活化VEGFR-2(Chiodelli等人2011；《动脉硬化血栓、血管生物学杂志(Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.)》31:e116-e127)。已发现抗GREM1抗体缓解或改善与血管生成或肝素介导的血管生成相关的一种或多种症状(对于细节，参见美国专利申请US20200157194)。
在一些实施方式中，GREM1相关疾病或病状为青光眼。青光眼可由眼睛中的一种或多种BMP家族基因的表达改变所引起，这导致眼内压升高增加和/或青光眼视神经病变。已发现GREM1在青光眼小梁网细胞中具有增加的表达。已发现GREM1拮抗剂缓解或改善与血管生成或青光眼相关的一种或多种症状(对于细节，参见美国专利US7744873)。
在一些实施方式中，GREM1相关疾病或病状为视网膜疾病。在一些实施方式中，GREM1相关疾病或病状为肾病。
施用途径和剂量方案
如本文所提供的抗体或抗原结合片段可以治疗有效剂量施用。如本文所提供的抗体或抗原结合片段的治疗有效量将取决于本领域中已知的各种因素，例如受试者的体重、年龄、既往病史、目前的药物治疗、健康状况和交叉反应的可能性、过敏性、敏感性和不良副作用，以及施用途径和疾病发展的程度。如由这些和其它情况或要求所指示，本领域的一般技术人员(例如，医生或兽医)可按比例减少或增加剂量。
在某些实施方式中，如本文所提供的抗体或抗原结合片段可以约0.01mg/kg至约100mg/kg的治疗有效剂量施用。在某些实施方式中，可在治疗过程中改变施用剂量。在某些实施方式中，取决于受试者的反应，可在治疗过程中改变施用剂量。
可以调整剂量方案以提供最优的期望反应(例如治疗反应)。举例来说，可施用单次剂量，或可随时间推移施用若干分次剂量。
本文所公开的抗体和抗原结合片段可通过本领域中已知的任何途径施用，例如肠胃外(例如，皮下、腹膜内、静脉内(包括静脉内输注)、肌肉内或皮内注射)或非肠胃外(例如，口服、鼻内、眼内、舌下、经直肠或局部)途径。
组合疗法
在一些实施方式中，本文所公开的抗体或抗原结合片段可单独施用或与一种或多种额外的治疗手段或药剂组合施用，所述治疗手段或药剂可基于待治疗的疾病或病状来选择。
在一些实施方式中，本文所公开的抗体或抗原结合片段可与第二抗癌药物组合施用以治疗癌症，所述第二抗癌药物例如化学治疗剂、抗癌药物、放射疗法、免疫疗法、抗血管生成剂、靶向疗法、细胞疗法、基因疗法药剂、激素疗法药剂、细胞因子、姑息治疗、用于治疗癌症的手术(例如，肿瘤切除术)、一种或多种抗呕剂、由化学疗法引起的并发症的治疗或癌症患者的饮食补充剂或调节肿瘤微环境的药剂。
术语“化学治疗药物”为可用于治疗癌症的生物(大分子)或化学(小分子)化合物。化学治疗药物的类型包括但不限于组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDACI)、烷基化剂、抗代谢物、生物碱、细胞毒性/抗癌抗生素、拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白抑制剂、蛋白质、抗体、激酶抑制剂等。化学治疗药物的实例包括埃罗替尼(erlotinib)、阿法替尼(afatinib)、多西他赛(docetaxel)、阿德力霉素(adriamycin)、5-FU(5-氟尿嘧啶)、帕比司他(panobinostat)、吉西他滨(gemcitabine)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、贝伐单抗(bevacizumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、二甲双胍(metformin)、替莫唑胺(temozolomide)、他莫昔芬(tamoxifen)、小红莓(doxorubicin)、雷帕霉素(rapamycin)、拉帕替尼(lapatinib)、羟基喜树碱(hydroxycamptothecin)、曲美替尼(trimetinib)。在某些实施方式中，化学治疗药物为顺铂。
如本文中所使用，术语“免疫疗法”是指一种刺激免疫系统对抗疾病，如癌症或以一般方式增强免疫系统的疗法。免疫疗法包括被动免疫疗法，其通过递送具有已建立的肿瘤免疫反应性的药剂(如效应细胞)，可以直接或间接介导抗肿瘤作用，并且不一定依赖于完整的宿主免疫系统(如抗体疗法或CAR-T细胞疗法)。免疫疗法可进一步包括主动免疫疗法，其中治疗依赖于体内刺激内源性宿主免疫系统以通过施用免疫反应调节剂对病变细胞作出反应。
免疫疗法的实例包括但不限于检查点调节剂、过继性细胞转移、细胞因子、溶瘤病毒和治疗性疫苗。
检查点调节剂可干扰癌细胞避免免疫系统攻击的能力，并且帮助免疫系统对肿瘤做出更强烈的反应。免疫检查点分子可介导共刺激信号以增强免疫反应，或可介导共抑制信号以抑制免疫反应。检查点调节剂的实例包括但不限于PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、TIM-3、LAG3、A2AR、CD160、2B4、TGFβ、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、OX40、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD47、CD122、ICAM-1、IDO、NKG2C、SLAMF7、SIGLEC7、NKp80、CD160、B7-H3、LFA-1、1COS、4-1BB、GITR、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、CD3、CD16和CD83的调节剂。在某些实施方式中，免疫检查点调节剂包含PD-1/PD-L1轴抑制剂。
过继性细胞转移，这是一种试图增强T细胞对抗癌症的天然能力的治疗。在这种治疗中，T细胞取自患者，并且在体外扩增和激活。在某些实施方式中，T细胞在体外被修饰为CAR-T细胞。在体外大批量培养抗癌最活跃的T细胞或CAR-T细胞持续2至8周。在此期间，患者将接受治疗，如化学疗法和放射疗法以降低身体的免疫力。在这些治疗之后，体外培养的T细胞或CAR-T细胞将被回给予患者。在某些实施方式中，免疫疗法为CAR-T疗法。
细胞因子疗法也可用于增强肿瘤抗原向免疫系统的呈递。用于治疗癌症的两种主要类型的细胞因子为干扰素和白细胞介素。细胞因子疗法的实例包括但不限于干扰素，如干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ、集落刺激因子，如巨噬细胞CSF、粒细胞巨噬细胞CSF和粒细胞CSF、胰岛素生长因子(IGF-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、白细胞介素，如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11和IL-12、肿瘤坏死因子，如TNF-α和TNF-β，或其任何组合。
溶瘤病毒为可以杀死癌细胞的基因修饰的病毒。溶瘤病毒可以特异性地感染肿瘤细胞，从而导致肿瘤细胞裂解，随后释放大量的肿瘤抗原，触发免疫系统靶向并且消除具有这类肿瘤抗原的癌细胞。溶瘤病毒的实例包括但不限于塔力拉赫(talimogenelaherparepvec)。
治疗性疫苗通过增强免疫系统对癌细胞的反应来对抗癌症。治疗性疫苗可包含非致病性微生物(例如牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)卡介苗，BCG)、靶向肿瘤细胞的基因修饰的病毒或一种或多种免疫原性组分。举例来说，BCG可利用导管直接插入膀胱中，并且可引起针对膀胱癌细胞的免疫反应。
抗血管生成剂可以阻断支持肿瘤生长的血管的生长。一些抗血管生成剂靶向VEGF或其受体VEGFR。抗血管生成剂的实例包括但不限于阿西替尼(Axitinib)、贝伐单抗、卡博替尼(Cabozantinib)、依维莫司(Everolimus)、来那度胺(Lenalidomide)、甲磺酸乐伐替尼(Lenvatinib mesylate)、帕唑帕尼(Pazopanib)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)、瑞格非尼(Regorafenib)、索拉非尼(Sorafenib)、舒尼替尼(Sunitinib)、沙立度胺(Thalidomide)、凡德他尼(Vandetanib)和阿柏西普(Ziv-aflibercept)。
“靶向疗法”是一种作用于与癌症相关的特定分子的疗法，所述特定分子例如存在于癌细胞而非正常细胞中或在癌细胞中更丰富的特定蛋白质，或癌症微环境中有助于癌症生长和存活的靶分子。靶向疗法使治疗剂靶向肿瘤，从而使正常组织免受治疗剂的影响。
靶向疗法可以靶向例如酪氨酸激酶受体和核受体。这类受体的实例包括erbB1(EGFR或HER1)、erbB2(HER2)、erbB3、erbB4、FGFR、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)和胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)、雌激素受体(ER)、核受体(NR)和PR。
靶向疗法可以靶向酪氨酸激酶或核受体信号级联中的分子，如Erk和PI3K/Akt、AP-2α、AP-2β、AP-2γ、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、PTEN、p53、p19ARF、Rb、Apaf-1、CD-95/Fas、TRAIL-R1/R2、胱天蛋白酶-8、叉头盒03A、MDM2、IAPs、NF-kB、Myc、P13K、Ras、FLIP、调节蛋白(HRG)(也称为gp30)、Bcl-2、Bcl-xL、Bax、Bak、Bad、Bok、Bik、Blk、Hrk、BNIP3、BimL、Bid和EGL-1。
靶向疗法还可以靶向肿瘤相关的配体，如雌激素(estrogen)、雌二醇(E2)、孕酮、雌激素(oestrogen)、雄激素、糖皮质激素、催乳素、甲状腺激素、胰岛素、P70 S6激酶蛋白(PS6)、存活素、成纤维细胞生长因子(FGF)、EGF、Neu分化因子(NDF)、转化生长因子α(TGF-α)、IL-1A、TGF-β、IGF-1、IGF-II、IGFBP、IGFBP蛋白酶和IL-10。
在某些实施方式中，第二治疗剂调节肿瘤微环境。在某些实施方式中，第二治疗剂为包含PD-L1结合部分和TGF-β受体的胞外结构域的双功能分子。
在一些实施方式中，本文所公开的抗体或抗原结合片段可与第二抗癌药物组合施用以治疗前列腺癌。在某些实施方式中，抗癌药物包含抗前列腺癌药物。在一些实施方式中，抗前列腺癌药物包含雄激素轴抑制剂；雄激素合成抑制剂；ADP-核糖聚合酶(PARP)抑制剂；或其组合。
在某些实施方式中，雄激素轴抑制剂选自由以下组成的群组：促黄体激素释放激素(LHRH)激动剂、LHRH拮抗剂和雄激素受体拮抗剂。
在某些实施方式中，雄激素轴抑制剂为地加瑞克、比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特、阿帕鲁胺、达洛鲁胺、恩杂鲁胺或阿比特龙。
在某些实施方式中，雄激素合成抑制剂为乙酸阿比特龙或酮康唑。
在某些实施方式中，PARP抑制剂为奥拉帕尼或卢卡帕尼。
在某些实施方式中，抗前列腺癌药物选自由以下组成的群组：乙酸阿比特龙、阿帕鲁胺、比卡鲁胺、卡巴他赛、康士得(比卡鲁胺)、达洛鲁胺、地加瑞克、多西他赛、艾利加德(乙酸亮丙瑞林)、恩杂鲁胺、艾利达(阿帕鲁胺)、费蒙格(地加瑞克)、氟他胺、乙酸戈舍瑞林、杰塔纳(卡巴他赛)、乙酸亮丙瑞林、鲁普隆(乙酸亮丙瑞林)、鲁普隆贮存型(乙酸亮丙瑞林)、利普卓(奥拉帕尼)、盐酸米托蒽醌、尼兰得隆(尼鲁米特)、尼鲁米特、努贝卡(达洛鲁胺)、奥拉帕尼、普洛韦格(西普亮塞-T)、镭223二氯化物、鲁布拉卡(樟脑磺酸卢卡帕尼)、樟脑磺酸卢卡帕尼、西普亮塞-T、克癌易(多西他赛)、多菲戈(镭223二氯化物)、安可坦(恩杂鲁胺)、诺雷德(乙酸戈舍瑞林)和泽替加(乙酸阿比特龙)。
在某些实施方式中，癌症患者的饮食补充剂可为具有针对癌症的保护作用的合适补充剂。在某些实施方式中，饮食补充剂包含吲哚-3-甲醇或包含其在摄入之后产生吲哚-3-甲醇的衍生物。吲哚-3-甲醇被认为具有针对癌症的保护作用并且还可对癌变前病状具有预防性。
在某些实施方式中，本文所公开的抗体或抗原结合片段可与吲哚-3-甲醇或其在摄入之后产生吲哚-3-甲醇的衍生物组合施用。在某些实施方式中，这种组合适用于治疗gremlin相关疾病。在某些实施方式中，这种组合适用于治疗癌症，例如乳癌、肝细胞癌和结肠直肠癌。在某些实施方式中，这种组合适用于治疗乳癌，例如三阴性乳癌。
在一些实施方式中，本文所公开的抗体或抗原结合片段可与第二治疗剂，例如第二抗纤维化剂(例如，重组BMP7或BMP7的肽模拟物)组合施用以治疗纤维化疾病。在某些实施方式中，第二抗纤维化剂为ACE抑制剂(或ARB)、抗MASP2抗体、内皮素受体拮抗剂、NRF2抑制剂类固醇、CTLA4-IgG或TNF抑制剂。
在另一实施方式中，第二治疗剂选自由以下组成的群组：如吡非尼酮(pirfenidone)的抗纤维化药剂、抗炎药物、NSAID、如泼尼松(prednisone)的皮质类固醇、营养补充剂、血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂[例如，“VEGF-捕获剂”，如阿柏西普(aflibercept)或如美国专利第7,087,411号中所阐述的其它VEGF-抑制融合蛋白，或抗VEGF抗体或其抗原结合片段(例如，贝伐单抗或兰比珠单抗(ranibizumab))]、针对细胞因子(如IL-1、IL-6、IL-13、IL-4、IL-17、IL-25、IL-33或TGF-β)的抗体、TGF-β/Smad信号传导路径的负调节子(重组BMP7或BMP7的肽模拟物)，和任何其它适用于减轻至少一种与纤维变性相关病状或癌症相关的症状的姑息性疗法。在某些实施方式中，第二治疗剂为抗整合素抑制剂。
在一些实施方式中，可以施用第二治疗剂以管理或治疗至少一种与纤维变性或癌症相关的并发症。
在这些实施方式中的某些实施方式中，与一种或多种额外治疗剂组合施用的如本文所公开的抗体或抗原结合片段可以与所述一种或多种额外治疗剂同时施用，并且在这些实施方式中的某些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段和所述额外治疗剂可以作为同一药物组合物的一部分施用。然而，与另一种治疗剂“组合”施用的抗体或抗原结合片段不必与所述药剂同时施用或以同一组合物施用。在另一种药剂之前或之后施用的抗体或抗原结合片段被认为与所述药剂“组合”施用，如本文中所使用的短语，即使抗体或抗原结合片段和第二药剂是通过不同途径施用的。当可能时，根据额外治疗剂的产品信息表单中列出的时间表或根据主治医师案头参考2003(Physicians'Desk Reference 2003)(主治医师案头参考(Physicians'Desk Reference),第57版；医学经济学公司(Medical EconomicsCompany)；ISBN:1563634457；第57版(2002年11月))或所属领域中熟知的方案，施用与本文中所公开的抗体或抗原结合片段组合施用的额外治疗剂。
在另一方面，本公开提供了试剂盒或药物组合物，其包含可以配制在一种组合物中或配制在不同组合物中的本文所提供的抗体或其抗原结合片段和第二治疗剂。可以进一步包括使用或适应症的说明书，以提供关于如何进行组合疗法的信息。
检测和/或诊断的方法
在一些实施方式中，本公开提供检测来源于受试者的样品中GREM1的存在或量的方法，其包括使所述样品与抗体或其抗原结合片段接触，和测定所述样品中GREM1的存在或量。
还可以通过使用包括但不限于以下技术测量GREM1的mRNA含量来检测样品中GREM1的存在或量：RNA测序(RNA-seq)和RNAscope(Wang,Z.,Gerstein,M.,&Snyder,M.(2009).RNA-seq：一种用于转录组学的革命性工具(RNA-seq:a revolutionary tool fortranscriptomics).《自然综述遗传学(Nature Reviews Genetics)》,10(1),57-63；Wang等人,RNAscope：一种用于福马林固定石蜡包埋组织的新型原位RNA分析平台(RNAscope:anovel in situ RNAanalysis platform for formalin-fixed,paraffin-embeddedtissues),《分子诊断性杂志(J Mol Diagn.)》2012年1月；14(1):22-9)。简单来说，RNA-seq包括将靶标mRNA逆转录至cDNA中，使cDNA片段化和测序并分析序列数据以进行mRNA定量；RNAscope包括使靶标mRNA与一种或多种与荧光探针结合的寡核苷酸原位杂交，并且通过测量荧光强度来检测mRNA的水平。
在某些实施方式中，生物样品包含癌细胞或来自肿瘤微环境的样品(例如，基质细胞或基质)。
在一些实施方式中，本公开提供检测样品中GREM1的存在或量，或诊断受试者的GREM1相关疾病或病状的方法，其包括：a)使从受试者获得的样品与本文所提供的抗体或其抗原结合片段接触；b)测定样品中GREM1的存在或量；和任选地c)使GREM1的存在或量与受试者的GREM1相关疾病或病状的存在或状态相关联。在某些实施方式中，生物样品包含癌细胞、基质细胞、基质或纤维化细胞。
在一些实施方式中，本公开提供包含本文所提供的任选地与可检测部分结合的抗体或其抗原结合片段的试剂盒。试剂盒可适用于检测生物样品中GREM1的存在或量，或可适用于本文所提供的诊断方法。
在一些实施方式中，本公开提供包含本文所提供的抗体或其抗原结合片段和第二治疗剂的试剂盒。试剂盒可适用于治疗、预防和/或改善GREM1相关疾病。
在一些实施方式中，本公开还提供本文所提供的抗体或其抗原结合片段在制造用于治疗或诊断受试者的GREM1相关疾病或病状的药剂中的用途。
实施例
虽然本公开已经参照特定实施方式(其中一些是优选实施方式)具体地显示和描述，但所述领域的技术人员应理解，可以在其中进行形式和细节上的各种改变而不背离如本文所公开的本公开的精神和范围。
实施例1：抗原的制备
HGREM1-His(R&D)：在NS-0细胞中表达重组HGREM1蛋白质(寄存编号O60565)。简单来说，来自C端具有10×his标签的Lys25-Asp184的hGREM1基因的编码区用于转染。使用His-标签亲和柱纯化上清液。使用SDS PAGE凝胶表征所得到的纯化蛋白质。所述蛋白质是购自安迪生物公司(R&D systems)(目录号5190-GR)。
Mouse Gremlin-His(R&D)：重组小鼠Gremlin(寄存编号O70326)Lys25-Asp184与C端的10×His标签融合并且产生于NS-0细胞中。使用His-标签亲和柱纯化转染上清液。使用SDS PAGE凝胶表征所得到的纯化蛋白质。所述蛋白质是购自安迪生物公司(目录号956-GR)。
HGREM1-His(ACRO)：重组hGREM1蛋白质Lys25-Asp184(寄存编号NP_037504)与C端的多组氨酸标签融合且产生于人类293细胞(HEK293)中。使用His-标签亲和柱纯化来自HEK293细胞的转染上清液。使用SDS page凝胶表征所得到的纯化蛋白质。此蛋白质是购自百普赛斯(ACRO Biosystems)(目录号GR1-H52H3)。
HGREM1-Fc(ACRO)：重组hGREM1蛋白质Lys25-Asp184(寄存编号NP_037504)与C端的hIgG1 Fc标签融合且产生于人类293细胞(HEK293)中。使用SDS PAGE凝胶表征所得到的纯化蛋白质。此蛋白质是购自百普赛斯(目录号GR1-H5254)。
将上述Gremlin蛋白质用于下述实验中。
实施例2：抗体产生
1.抗原结合和免疫接种
针对免疫接种，使重组hGremlin-His蛋白质与各种MabSpace免疫增强肽结合。简单来说，将2至8倍摩尔过量的肽与Sulfo-SMCC(4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-甲酸磺基琥珀酰亚胺酯，皮尔斯公司(Pierce)，目录号22322)活化的hGremlin蛋白质混合并且在室温下孵育一小时。停止反应并且使用SDS-PAGE凝胶分析结合蛋白质且进行QC。
使用完全弗氏佐剂(皮尔斯公司，目录号77140)以1:1比率分别乳化以上结合的hGremlin-His蛋白质，且接着皮下及腹膜内免疫接种至C57B/L6小鼠中。使用CpG和矾进行额外免疫以保持蛋白质的天然构形。至少每2周发生免疫，且在第1次免疫之后取得小鼠的抗血清以用于通过ELISA分析进行抗hGremlin效价分析。
为确定血清效价，从每只免疫小鼠中制备20μl的小鼠血清。用100微升/孔的含1μg/ml由hGREM1-His组成的溶液的高pH涂布缓冲液(0.16％ Na2CO3，0.3％NaHCO3，pH9.8)涂布高度结合透明的聚苯乙烯96孔板(Nunc)。将培养板在4℃下孵育过夜，且接着在自动板洗涤器上使用洗涤缓冲液PBS+0.1％ Tween 20(西格玛(Sigma))洗涤一次。将200μl阻断缓冲液(PBS+1％ BSA+1％山羊血清+0.05％ Tween 20)添加到每个孔中并且在室温下孵育2小时。接着抽吸阻断缓冲液，且将100μl于稀释缓冲液(PBS+1％BSA+1％山羊血清+0.01％Tween 20)中连续稀释的血清转移至ELISA板的每个孔中并将其在室温下孵育60min。接着使用上文所描述的方法洗涤培养板3次。接着将100微升/孔的于稀释缓冲液中稀释的HRP结合山羊抗小鼠Fc抗体溶液(艾博抗(Abcam)，目录号Ab98808)添加至培养板的每个孔中。之后，将ELISA培养板在室温下孵育60min，用250微升/孔洗涤缓冲液洗涤培养板3次。最后，将100微升/孔的TMB添加至每个孔中并且使用0.64M H2SO4终止反应。在Thermo Multiscan FC上在450nM下读取培养板。
2.融合
在融合前四天，每只小鼠用含未结合的hGremlin-His蛋白质的PBS溶液进行腹膜内增强。在融合当天，无菌地去除脾脏并且将器官加工成单细胞悬浮液。裂解红细胞，并且将脾细胞用DMEM(吉毕科公司(Gibco))洗涤。将活的对数生长期骨髓瘤细胞(SP2/0)与鼠类脾细胞以1:4比率混合。接着在融合之前用PEG洗涤细胞2次。融合后细胞用DMEM洗涤并悬浮于补充有10％ FBS+HFCS+OPI+1×HAT的细胞生长培养基中。将200微升/孔的此细胞悬浮液接种至96孔细胞培养板中并在37℃潮湿的10％ CO2培育箱中孵育过夜。将培养物孵育7天且接着从孔中抽吸出生长培养基并更换为新鲜生长培养基。在培养基更换后2至3天开始杂交瘤上清液的筛选。
3.通过ELISA分析进行的抗体筛选
使用以上确定血清效价的相同方案。简单来说，在4℃下涂布1μg/ml hGremlin-His过夜。洗涤之后，添加100μl杂交瘤上清液并使其完全结合。接着添加HRP结合的山羊抗小鼠Fc抗体以检测结合的Gremlin抗体。最后，在TMB反应及H2SO4终止之后，在ThermoMultiscan FC上在450nM下读取培养板。随后将来自ELISA阳性杂交瘤孔的细胞在细胞培养物中扩增以用于进一步表征研究。
实施例3：阳性杂交瘤克隆株的亚克隆和小规模抗体生产
1.阳性杂交瘤克隆株的亚克隆
选择来自具有所需结合特征和阻断活性的ELISA阳性杂交瘤孔的细胞并使用有限的稀释液将每一者接种于96孔板中。使这些细胞生长7天。一旦达到足够的细胞团，收集每个孔的上清液并且针对抗原结合能力进行再筛选(参见实例2中的筛检)。
根据每个96孔板，鉴别出具有最高抗原结合活性的克隆株，并用有限的稀释液进一步扩增至96孔板中，每孔具有200μl杂交瘤生长培养基。7天之后，测试来自96孔板的细胞的抗原结合。进行亚克隆多于2次。当超过90个孔显示阳性结合信号时，鉴别出具有最高抗原结合活性的两种克隆株并将其转移至具有培养基的24孔板中并使其再生长2天。汇合24孔板之后，将细胞转移至6孔板中。孵育5天之后，将一部分细胞冷冻。将其余细胞转移至烧瓶中并使其扩增。汇合烧瓶之后，将一半细胞冷冻(每克隆株3瓶)以用于额外备份。使另一半在具有用于抗体生产的培养基的烧瓶中进一步扩增。使用标准方法确定同种型。
2.小规模抗体生产
将杂交瘤细胞接种至滚瓶中并用200至300ml的杂交瘤培养基(英杰(Invitrogen))培养14天。如下从杂交瘤细胞培养物中纯化Gremlin单克隆抗体(mAb)。全部纯化过程是在室温下进行。使用一种纯化流程以纯化各种mAb并使用亲和色谱法。
将宿主细胞培养液(CCF)离心以去除细胞碎片。接着将CCF上清液过滤，稀释并且以柱、蛋白质G高效(伯乐(Bio-Rad))形式装载于蛋白质G色谱介质上且平衡。
装载之后，洗涤蛋白质G柱直到流过物在280nm下的吸光度返回至基线。接着使用甘氨酸pH 2.5从柱中洗脱Gremlin mAb并且立即通过添加50μL 1M Tris Base储备溶液/mL洗脱体积进行中和。监测洗脱物在280nm下的吸光度并且收集含有蛋白质的洗脱份以制成蛋白质A池。
纯化之后，使用10,000MWCO膜(皮尔斯Slide-A-Lyzer或透析管)通过透析将Gremlin mAb调配于PBS溶液中。调配之后，过滤Gremlin mAb。
实施例4：通过ELISA进行的纯化杂交瘤抗gremlin1抗体与捕获的人类及小鼠gremlin的结合分析
用100微升/孔的含0.5μg/ml hGREM1(ACRO)和小鼠gremlin(R&D)的高pH涂布缓冲液涂布透明聚苯乙烯培养板(BEAVER)4℃过夜。接着在自动培养板洗涤器上使用PBS+0.1％Tween 20(西格玛)洗涤培养板一次。将100μl的由PBS+1％ BSA+1％标准山羊血清+0.5％Tween 20(西格玛)组成的阻断溶液添加至每个孔中并在室温下孵育2小时。接着将100μl于含有PBS+1％ BSA+1％标准山羊血清+0.01％ Tween 20的抗体稀释缓冲液中的抗体(以2μg/ml开始并且连续稀释)添加至培养板的每个孔中并且在室温下孵育1小时。然后，用200μl的PBS+0.1％ Tween20洗涤培养板三次，接着添加100微升/孔的1:10000山羊抗小鼠IgG-HRP(艾博抗)，并且在室温下孵育1小时。接着用PBS+0.1％Tween20将其洗涤3次。最后，将100微升/孔的TMB(皮尔斯)添加至每个孔中，并且在若干分钟之后，向每个孔中添加50μl的停止溶液。在Multiscan FC微板读数仪(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific))上在450nM下读取培养板。如图1所示，56C11、42B9、36F5和67G11示出与hGREM1和小鼠gremlin两者的高结合亲和力(针对56C11，EC50值分别为13.42ng/ml和17.2ng/ml；针对42B9，EC50值分别为8.058ng/ml和8.512ng/ml；针对36F5，EC50值分别为5.869ng/ml和4.564ng/ml；以及针对67G11，EC50值分别为7.841ng/ml和7.713ng/ml)，而69H5、22F1和14E3显示相对于小鼠gremlin，选择性地与hGREM1的结合亲和力(EC50值分别为105.9ng/ml、14.13ng/ml和13.6ng/ml)。
本文中提供的人源化抗体(例如，Hu14E3、Hu22F1和Hu56C11)显示与hGREM1和/或mGREM1的类似高结合亲和力。
实施例5：通过ELISA表征杂交瘤抗体结合于捕获的hGREM1或相关家族蛋白质的结合特异性
另外，使用ELISA评定14E3和基准抗体的结合特异性。简单来说，用100微升/孔的含0.5μg/ml hGREM1(ACRO)或人类gremlin-2(R&D)、人类COCO(R&D)和人类DAN蛋白质(R&D)的高pH涂布缓冲液涂布透明聚苯乙烯培养板(BEAVER)4℃过夜。接着在自动培养板洗涤器上使用PBS+0.1％ Tween 20(西格玛)洗涤培养板一次。将100μl的由PBS+1％ BSA+1％标准山羊血清+0.5％ Tween 20(西格玛)组成的阻断溶液添加至每个孔中并在室温下孵育2小时。接着将100μl于含有PBS+1％ BSA+1％标准山羊血清+0.01％ Tween 20的抗体稀释缓冲液中的抗体(以2μg/ml开始且进行5倍连续稀释)添加至培养板的每个孔中并且在室温下孵育1小时。然后，用200μl的PBS+0.1％ Tween20洗涤培养板三次，接着添加100微升/孔的1:10000山羊抗小鼠IgG-HRP(艾博抗)，并且在室温下孵育1小时。接着用PBS+0.1％ Tween20将其洗涤3次。最后，将100微升/孔的TMB(皮尔斯)添加至每个孔中，并且在5分钟之后，向每个孔中添加50μl的停止溶液。在Multiscan FC微板读数仪(赛默飞世尔科技公司)上在450nM下读取培养板。结果显示14E3特异性结合于hGREM1而非在结构上共享高度同源性的人类gremlin-2、COCO和DAN蛋白质(图2)。
实施例6：阻断Gremlin结合于捕获BMP 2/4/7中的抗体活性的表征
已知Gremlin能够结合于BMP蛋白质并且通过本公开验证。简单来说，测试gremlin-Fc与固定于培养板上的BMP 2/4/7的结合能力。简单来说，用0.5μg/ml的重组人类BMP2、BMP4(hBMP4，派普泰克(Peprotech))或人类BMP7(R&D)涂布培养板过夜并且将野生型gremlin-1添加至涂布的培养板中且在室温下再孵育一小时。接着洗涤培养板并且用与HRP(赛默飞世尔)结合的中性抗生物素蛋白检测培养板结合的生物素-hGremlin。接着将培养板用TMB溶液显色，通过添加终止溶液使其终止。在板读数仪上在450nm下读取培养板。图3A和图3D显示野生型gremlin可结合于BMP 2、BMP 4和BMP 7，且与BMP 2和4的结合亲和力比与BMP7的结合亲和力更强。
另外测试gremlin XM5的突变型与BMP 2/4/7的结合能力，与gremlin头对头。通过Mabspace构建并表达XM5，其中gremlin的123-143氨基酸(NSFYIPRHIRKEEGSFQSCSF，SEQ IDNO:63)(其已知为BMP的结合环)被DAN的63-83氨基酸(FSYSVPNTFPQSTESLVHCDS，SEQ IDNO:64)(其不结合于BMP)置换。在蛋白质的C端构建His-标签或Fc-标签。针对XM5和gremlin的粘着性，将未纯化的上清液用于此分析。简单来说，涂布抗人类Fc抗体(1μg/ml)并且添加XM5-Fc或Gremlin-Fc的上清液(1:32稀释)。孵育之后，添加连续稀释的具有his-标签的BMP(BMP2/4/7)且接着使用二级抗体抗his-HRP以检测结合。
如图3A所示，与gremlin相反，BMP未结合于XM5，预测并且验证包含gremlin上的SEQ ID NO:63的BMP的结合环中的至少一个氨基酸对于其结合于BMP来说至关重要。经由ELISA检测抗体阻断Gremlin结合于人类骨形态生成蛋白2和4(hBMP2、hBMP4)的能力。用重组人类BMP 2和BMP 4(0.25μg/ml)(hBMP2、hBMP4，派普泰克)涂布培养板过夜且接着在室温下将抗体的连续稀释液与0.1μg/ml的经生物素标签修饰的hGREM1(派普泰克)一起孵育1h，之后将此复合物添加至涂布培养板中并将其在室温下再孵育一小时。接着洗涤培养板并且用与HRP(赛默飞世尔)结合的中性抗生物素蛋白检测培养板结合的生物素-hGremlin。接着将培养板用TMB溶液显色，通过添加终止溶液使其终止。在板读数仪上在450nm下读取培养板。结果如图3B和图3C中所示，表明本文中提供的抗gremlin 1抗体(例如14E3、56C11和69H5，以及根据WO2014159010中公开的H4H6245P序列产生的基准抗体6245P，其公开内容以全文引用的方式并入本文中)可以剂量依赖性方式不同程度地抑制gremlin与BMP2和BMP4的结合。
另外，还经由ELISA检测本文中提供的抗体的连续稀释液阻断Gremlin结合于人类BMP2/4/7的能力。用重组人类BMP2/4/7(0.5μg/ml)涂布培养板过夜且接着在室温下将抗体的连续稀释液与1μg/ml的修饰的人类Gremlin-his一起孵育1h，之后将此复合物添加至涂布培养板中并将其在室温下再孵育一小时。接着洗涤培养板并且添加抗his HRP(金斯瑞(GenScript))。接着将培养板用TMB溶液显色，通过添加终止溶液使其终止。在板读数仪上在450nm下读取培养板。结果如图3E至图3H中所示，表明本文中提供的抗gremlin 1抗体(例如，42B9、36F5、67G11和14E3 HaLa)以及基准抗体6245P可以抑制gremlin与BMP2(参见图3E)、BMP4(参见、图3F)和BMP 7(参见图3G)的结合。嵌合抗gremlin 1抗体(69H5-chi)还可以抑制gremlin与BMP2和BMP4的结合(参见图3E)。嵌合抗gremlin 1抗体(56C11-chi)可以抑制gremlin与BMP2的结合(参见图3F)。
具体地说，如图3G所示，本文中提供的抗gremlin 1抗体(42B9、36F5、67G11和14E3HaLa)可以显著地阻断gremlin与BMP7的结合，并且显示至少50％或甚至至少70％的最大阻断百分比。相反地，基准抗体6245P仅显示小于30％的对人类gremlin与BMP7的结合的最大阻断，从而表明6245P在阻断BMP7时不太有效。
实施例7：使用BMP反应性报道子分析表征阻断Gremlin介导的BMP信号传导中的抗体活性
在BRITER(BMP反应性成骨细胞报道子细胞系，Abmgood，T3105)中还使用BMP4诱导的荧光素酶报道子分析测试这些纯化杂交瘤抗体降低gremlin介导的BMP信号传导抑制的能力。简单来说，将BRITER细胞以10000个细胞/孔接种于96孔板中并且在37℃和5％CO2下孵育过夜。第二天，用对照培养基或具有30ng/ml BMP 4(BMP4 30)或30ng/ml BMP 4加Gremlin 200ng/ml(B 30+Gremlin 200)；或30ng/ml BMP 4加gremlin 200ng/ml以及不同浓度的本文所提供的抗体(B+G+0.096/0.048/0.24/1.2/6/30μg/ml)的培养基刺激细胞，如图4的x轴所示。在37℃和5％ CO2下孵育3小时后，使用板读数仪(Thermo ScientificVarioskan Flash)测量每个孔中的细胞的荧光素酶活性。
如图4中所示，与基准抗体相比，所述抗体显示在降低报道子细胞中的gremlin介导的BMP信号传导抑制中无活性，所述报道子细胞并非癌细胞来源，而基准抗体可以降低或逆转gremlin介导的BMP信号传导抑制。
实施例8：降低Gremlin介导的BMP信号传导抑制中的抗体活性的表征和细胞分化
还使用BMP4诱导的ATDC-5细胞分化测试纯化杂交瘤抗体降低gremlin介导的对BMP信号传导的抑制的能力。ATDC-5为软骨形成细胞系并且可响应于BMP4信号传导而分化。可以通过Gremlin(已知的BMP抑制剂)阻断软骨形成细胞系的分化。在此分析中，Gremlin的阻断引起BMP4抑制的逆转。可以通过使用检测碱性磷酸酶(ALP)(成骨细胞分化的早期标记)的内源性表达的基质在色度上测量分化。分化程度可以正面地反映BMP4信号传导的活性。
将ATDC-5细胞以3000个细胞/孔接种于96孔板中并在体积为100微升/孔的DMEM/F12、10％ FBS+1％ PS中生长，且在37℃和5％ CO2下孵育过夜。第二天，将hGREM1与连续稀释的抗体混合于无血清培养基中并在37℃下孵育30min。将于无血清培养基中稀释的人类BMP4(派普泰克)添加至Gremlin/抗体混合物中且接着在37℃下再孵育30min。孵育之后，将100ul混合物添加至接种于100ul完全培养基中的ATDC-5细胞中。每个孔中的细胞上的hBMP4和hGremlin的最终浓度分别为100ng/ml和400ng/ml。在37℃和5％CO2下生长3天之后，抽吸培养基并用冷的PBS洗涤两次。用M-PER缓冲液(赛默飞世尔)+蛋白质抑制剂(罗氏(Roche))裂解细胞。使用磷酸对硝基苯酯(PNPP)(西格玛)测量ALP。在Multiscan FC微板读数仪(赛默飞世尔科技公司)上测量OD405。
如图5所示，虽然基准抗体6245P可以降低细胞分化中的gremlin介导的对BMP信号传导的抑制，但抗体14E3(图5A)、22F1(图5B)、56C11(图5C)和69H5(图5D)没有显示此类作用。换句话说，本文中提供的抗体不能够恢复细胞分化中涉及的对BMP信号传导的gremlin抑制，所述细胞分化并非癌症来源。
实施例9：PC3前列腺癌细胞中gremlin介导的BMP信号传导抑制的表征和对本文所提供的抗体逆转PC3细胞中gremlin介导的BMP信号传导抑制的评估
将PC3前列腺癌细胞以100000个/孔接种于12孔板中的DMEM/10％ FBS、1％ PS(完全培养基)中并在37℃和5％ CO2下生长达至90％汇合。用无血清培养基使其饥饿过夜之后，用具有或不具有gremlin的BMP4刺激PC3细胞30min。将细胞在RIPA缓冲液(CST)中裂解以用于蛋白质印迹分析。使用4％-12％ SDS-PAGE(金斯瑞)分离细胞裂解物并将其转移至PVDF膜(密理博(Millipore))。将膜分别与对smad磷酸化(p-smad1/5/9)(1:1000，CST)(正面地反映BMP信号传导的活性)具有特异性的抗体和对β-肌动蛋白(1:5000，Abbkine)具有特异性的抗体作为对照在4℃下一起孵育过夜，接着与对应二级抗体一起孵育。使用皮尔斯ECL蛋白质印迹基质(赛默飞世尔科技公司)进行显色并使用Cheniluminescent成像仪(MiniChemi，赛智(Sagecreation))观测。
结果显示gremlin以剂量依赖性方式降低BMP诱导的p-smad1/5/9水平，从而表明gremlin确实会抑制BMP信号传导(图6A)。
进一步评估本文所提供的不同抗体阻断gremlin介导的对BMP诱导的p-smad1/5/9的抑制的能力。将Gremlin与本文所提供的不同浓度的抗体在37℃下一起孵育30min，并且将gremlin和抗体的混合物与BMP4在37℃下一起孵育30min，之后添加至接种的PC3细胞中。30min之后，将细胞在RIPA缓冲液(CST)中裂解以使用上述方案进行蛋白质印迹分析。
如图6B中所示，随着本文所提供的抗hGREM1抗体的浓度(例如，14E3、22F1、56C11、69H5)增加，从GREM1介导的抑制中回收的p-smad 1/5/9或pSMAD1/5/9的强度增加。此实验显示本文所提供的这些抗体可以剂量依赖性方式调节(例如，降低)gremlin介导的对BMP信号传导的抑制。
实施例10：不同细胞类型中本文所提供的抗gremlin1抗体差异性逆转gremlin介导的对BMP信号传导的抑制的表征
因为gremlin在多种生理组织中表达且对多种细胞类型具有影响，针对响应于gremlin介导的对BMP信号传导的抑制的不同细胞类型，我们评估了本文所提供的抗gremlin1抗体是否具有相似作用。简单来说，用BMP4或具有gremlin的BMP4刺激不同来源的多种细胞类型，包括成骨细胞ATDC-5、肾脏成纤维细胞NRK49F、肾脏上皮细胞HK2细胞以及肿瘤细胞PC3。用BMP4和gremlin两者刺激的细胞接着加入1或10μg/ml gremlin抗体或对照IgG。此处测试的抗体包括14E3和基准抗体6245P。如图7中所示，虽然在所有测试的细胞类型中，gremlin可以强效地抑制BMP4诱导的pSMAD1/5/9，且基准抗体6245P可以逆转gremlin介导的对BMP4诱导的pSMAD1/5/9的抑制，但14E3仅逆转如PC3细胞的肿瘤细胞中gremlin介导的对BMP4信号传导的抑制，而非其它细胞类型(例如，ATDC-5成骨细胞、NRK-49F肾脏成纤维细胞、HK-2-肾脏上皮细胞)中的所述抑制。此出人意料的结果表明本文所提供的抗gremlin1抗体(14E3、22F1、56C11、42B9、36F5、67G11和69H5、Hu14E3、Hu22F1和Hu56C11)在其生物活性方面与基准抗体极其不同，如实施例8中所描述在ATDC-5细胞中使用ALP分析符合其差异性活性。相对于非癌细胞，针对癌细胞中的BMP信号传导逆转的此选择性表明本文所提供的抗hGREM1抗体(例如，14E3、22F1、56C11、42B9、36F5、67G11和69H5、Hu14E3、Hu22F1和Hu56C11)可以选择性地影响癌细胞，同时对非癌细胞具有一点毒性。
实施例11：杂交瘤抗体的克隆和测序
四种显示所需特征的前导抗体被选择用于基因克隆。通过称为5'RACE(cDNA端的快速扩增)的聚合酶链反应(PCR)扩增技术获得鼠类抗hGREM1轻链和重链可变区的序列。使用试剂盒(英杰公司)分离产生杂交瘤细胞的gremlin抗体的总RNA并且使用具有寡聚(dT)12-18引子的Superscript第一链合成系统(英杰公司)合成cDNA。通过具有重链可变区的MuIgG VH3'-2和MuIg-5'前导引子和轻链可变区的MuIgK VL3'-1和MuIg-5"前导引子(诺杰公司(NOVAGEN))的PCR克隆小鼠IgG基因的可变区。将所得带克隆至TOPO TA克隆载体中并且将来自超过10个克隆株的DNA用于测序且使用ABI DNA测序仪器(珀金埃尔默)进行确定。使用Vector NTI Advance 10软件(英杰公司)确定共有序列。在测序分析和确认之后，将gremlin基因的可变区克隆至重组表达载体中(将VL克隆至pCP-mCK中；将VH克隆至pCP-mCg2a中)以用于抗体生产和纯化。这些杂交瘤抗体的序列如表10中所示。表10显示本申请中所使用的所有序列。
抗体与小鼠IgG2b为同种型。为促进抗体分泌，在抗体的N端融合信号肽(MGWSCIILFLVATGVHS(SEQ ID NO:65))。
实施例12：293E6细胞中重组抗体蛋白质的表达和纯化。
通过以下方法进行重组抗体蛋白质的表达和纯化：将在具有10％ Pluronic F-68的Freestyle 293表达培养基中培养的呈1×106个细胞/毫升的HEK293E细胞用最终浓度为0.5μg/ml的等量重链载体和轻链载体DNA和1.0μg/ml的PEI(聚乙烯亚胺-直链，Polyscience)转染。DNA比PEI比率为1:2。具有最佳MEM的DNA与PEI复合物形成时段在室温下应为15分钟。将转染的细胞在处于5％ CO2、37℃和125rpm振荡速度下的烧瓶中培养。在转染后22至26小时添加1％蛋白胨培养基。在第6天收集条件培养基并且将上清液在3,000rpm下离心30分钟。接着将澄清的条件培养基装载至nProteinA柱(GE医疗集团(G.E.Healthcare))上，用PBS加0.1％triton-X100洗涤，且最后用pH 3.5的含有0.1M甘氨酸的溶液洗脱结合的IgG。将洗脱的抗体蛋白质透析至PBS中并存储在-80℃下。为去除内毒素，通过Hitrap DEAE Sepharose F.F.柱来进一步加工纯化蛋白质并且使用尺寸排阻色谱法(Superdex 200 5/150GL，GE医疗集团)分析所得抗体以确定纯度水平。
根据上文所描述的方法制备的重组嵌合抗gremlin1抗体的结合分析如图8中所示，其中抗体56C11-C(即，56C11的嵌合抗体)和14E3-C(即，14E3的嵌合抗体)显示与基准抗体6245P(115.2ng/ml)相比明显更高的结合亲和力以及更低的EC50值(对于14E3-C为5.240ng/ml，且对于56C11-C为4.887ng/ml)。
实施例13：选用于活体内研究的抗体的大规模生产
这些克隆抗体中的每一种按比例扩大以生产大量的抗体用于肾衰竭模型中的活体内测试。
将杂交瘤细胞培养在具有活体外生产培养基的滚瓶中，接着对条件培养基中产生的单克隆抗体进行加工并通过蛋白质A亲和柱根据低内毒素程序进行纯化。
简单来说，回收且扩增杂交瘤细胞，并且使细胞适于在杂交瘤生产培养基(DMEM+2％低IgG FBS)中生长并将其接种至各自具有300ml培养基的滚瓶中。接着在滚瓶中培养细胞2至3周并在纯化之前收集和澄清培养基。接着通过蛋白质A亲和柱来纯化从培养基中产生的mAb，相对于PBS、pH 7.4透析，且在需要时浓缩至1.0mg/ml或更高。针对质量控制，测量以下参数：抗体产物纯度、内毒素水平、聚合水平以及与靶抗原的结合。
预期的产物规格：
a.缓冲液：磷酸盐缓冲盐水(PBS)、pH 7.2至7.4，无菌过滤且无防腐剂。
b.浓度：1.0mg/ml或更高
c.纯度：通过SDS-PAGE和HPLC为90％或更佳
d.聚合：通过HPLC小于10％
e.内毒素：3EU/mg或更小
实施例14：所选gremlin抗体与捕获hGREM1的结合亲和力测量的表征
在25℃下通过Biacore T200测量抗体的亲和力。将HGREM1(派普泰克)固定于Biacore传感器芯片上。使用HBS-EP+作为运行缓冲液和样品缓冲液进行动力学实验。通过在捕获hGREM1表面上注入不同浓度(在12.5至400nM范围内，2-倍稀释)的抗体测量抗体-抗原缔合速率。监测抗体-抗原缔合180s，同时监测缓冲液中的解离360s。使用Biacore T200评估软件进行动力学分析以确定Ka和Kd值。根据KD＝Kd/Ka由实验上确定的Ka和Kd值计算KD。如图9中所示，重组嵌合抗gremlin1抗体14E3(14E3-C)具有17.68nM的KD值并且嵌合抗gremlin1抗体22F1(22F1-C)具有27.28nM的KD值。
实施例15：表位研究
通过竞争ELISA分析进行的表位分组分析
使用竞争ELISA分析进行抗gremlin杂交瘤抗体的表位分组。用100微升/孔的含0.5μg/ml hGREM1(ACRO)的高pH涂布缓冲液涂布透明聚苯乙烯培养板(BEAVER)4℃过夜。接着在自动培养板洗涤器上使用PBS+0.1％ Tween 20(西格玛)洗涤培养板一次。将100μl的由PBS+1％ BSA+1％标准山羊血清+0.05％ Tween 20(西格玛)组成的阻断溶液添加至每个孔中并在室温下孵育2小时。接着将50微升/孔的含20μg/ml饱和抗体(杂交瘤抗体)的抗体稀释缓冲液(PBS+1％ BSA+1％标准山羊血清+0.01％ Tween 20)添加至培养板的每个孔中并孵育1小时。接着，将50微升/孔的40ng/ml竞争性抗体(嵌合抗体，例如14E3-C、22F1-C、56C11-C和69H5-C)添加至培养板的每个孔中并在室温下再孵育1小时。接着将其用PBS+0.1％ Tween20洗涤3次，接着添加100μl 1:10000山羊抗人类IgG-HRP(艾博抗)，且在室温下孵育1小时。最后，将100微升/孔TMB(皮尔斯)添加至每个孔中，5分钟之后，将50μl停止溶液添加至每个孔中。在板读数仪上在450nm下读取培养板。第二抗体在存在饱和量的第一抗体的情况下结合失败表明两种抗体均处于同一表位组(epitope bin)中；第二抗体在存在饱和量的第一抗体的情况下成功结合表明两种抗体处于不同的表位组中。基于完整的数据集，存在多个抗体组。数据实例如图10A中所示。
如图10A中所示，14E3和22F1彼此竞争并且其也可以阻断69H5-C结合，从而表明这三种抗体处于一个表位组中。在另一方面，56C11与gremlin的结合不与14E3、22F1或69H5竞争，从而表明56C11处于与14E3、22F1和69H5的表位组不同的表位组中。此结果与图1中所示的56C11能够结合于小鼠Gremlin而14E3、22F1和69H5却不能结合的数据相呼应。
为分析14E3/22F1是否结合于与基准抗体6245P不同的表位，还进行了交叉竞争实验。简单来说，添加固定量的嵌合抗体14E3-C/22F1-C或6245P，接着添加增加量的杂交瘤抗体14E3和22F1。确定结合于gremlin的嵌合抗体的量。如图10B中所示，14E3和22F1彼此竞争但甚至在100×倍过量下不可与6245P结合竞争，从而表明14E3-C和22F1-C结合于与6245P不同的表位。
14E3的表位定位
比对人类Gremlin和小鼠Gremlin的序列并且观测到仅2个不同的氨基酸：Q27(人类)-P27(小鼠)和N33(人类)-T33(小鼠)，其中编号分别参考SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70。14E3结合于人类Gremlin但不结合于小鼠Gremlin，因此我们推测这两个不同氨基酸可能是影响抗体结合的关键氨基酸。为验证对于14E3结合的两个关键残基，将具有信号肽(SEQ ID NO:71)和C端His-标签的4种变体(包括人类Gremlin_WT、人类Gremlin_Q27P、人类Gremlin N33T和人类Gremlin_Q27P/N33T)克隆至pcDNA3.1(+)载体中，并且通过DNA测序确认全部构建体。通过使用ExpiCHO转染试剂盒将通过使用QIAGEN Plasmid Midi试剂盒纯化的四种构建体的质粒以3ml级别转染至ExpiCHO细胞中。将经转染的细胞在8％ CO2和37℃培育箱中在125rpm下的摇瓶中培养。在第4天收集细胞培养物，并在8000rpm下离心30分钟，接着将上清液用于抗体结合分析。
不包括信号肽的人类Gremlin1序列：
不包括信号肽的小鼠Gremlin1序列：
应注意：人类Gremlin与小鼠Gremlin之间的两个不同氨基酸为加粗且带下划线的。人类Gremlin1的信号肽序列如SEQ ID NO:71所示，且小鼠Gremlin1的信号肽序列如SEQID NO:72所示。
生物层干涉测量法(BLI)分析
人类gremlin Ab、14E3和6245p用动力学缓冲液(PBS pH 7.4，0.1％ BSA+0.2％Tween-20)稀释，以在96孔半面积微量板(葛莱娜第一生化(Greiner Bio-one))的负载柱中得到浓度为100nM，每孔100微升。将待测试的Gremlin WT和突变体的上清液添加于培养板的缔合柱中，每孔100微升。培养基或KD缓冲液用作参考对照。将AHC传感器放置于第1个基线柱中60s以得到第1基线，接着放置于负载柱中300s以捕获Gremlin抗体。之后，将传感器放置于第2个基线柱中60s以得到第2基线。接着将其放置于缔合柱中300s以使Gremlin/Gremlin Ab完全缔合，将传感器放置于解离柱中300s。通过ForteBio(Octet96)分析群组数据。
图10D显示14E3仍可结合于Asn33被Thr取代(即，N33T)的人类gremlin 1变体，但结合显示部分降低。然而，人类gremlin 1中Gln27被Pro取代(即，Q27P)显著地降低14E3结合，在具有N33T和Q27P取代的人类gremlin 1变体中也观测到所述降低。相比之下，人类gremlin 1中的N33T或Q27P单一突变均未显著地降低6245P的结合，从而表明6245P结合于人类gremlin 1中不含N33或Q27的表位。此与在具有N33T和Q27P突变的人类gremlin 1变体中所观测的结合结果一致。这些数据表明14E3结合于包含SEQ ID NO:69的Q27的表位。14E3结合的表位可以在较小程度上包括SEQ ID NO:69的N33。
实施例16：与Gremlin-Dan融合蛋白XM5的结合
为进一步证实14E3结合于与6245P不同的表位，我们评估了这些抗体与如实施例6中所描述的野生型gremlin蛋白质或XM5的结合。
使用上文所提及的类似ELISA方案，测试嵌合抗体14E3与XM5或Gremlin的结合。简单来说，涂布14E3-C或6245P(1μg/ml)且添加连续稀释的XM5-his上清液或Gremlin-his(2μg/ml至0.49μg/ml)以用于结合。将二级抗体抗his-HRP用于检测。如图10C中所示，14E3-C和6245P均可结合于Gremlin。然而，仅14E3-C可结合于XM5，但6245P不可结合于XM5。此表明14E3-C和6245P结合于不同表位，与上文所提及的表位分组结果一致。
另外比较与hGREM1和XM5的结合亲和力。简单来说，涂布XM5-Fc或Gremlin-his(1μg/ml)。将100μl的由PBS+1％ BSA+1％标准山羊血清+0.5％ Tween 20(西格玛)组成的阻断溶液添加至每个孔中并在室温下孵育2小时。添加以2μg/ml开始的4-倍连续抗体稀释液。然后，用200μl的PBS+0.1％ Tween20洗涤培养板三次，接着添加100微升/孔的1:10000山羊抗小鼠IgG-HRP(艾博抗)，并且在室温下孵育1小时。接着用PBS+0.1％Tween20将其洗涤3次。最后，将100微升/孔的TMB(英创生物科技有限公司(InnoReagents))添加至每个孔中，并且在2分钟之后，向每个孔中添加50μl的停止溶液。在Multiscan FC微板读数仪(赛默飞世尔科技公司)上在450nM下读取培养板。EC50值如下表中所示。
如图10E和图10F中所示，42B9、36F5和67G11以0.012ng/ml至0.015ng/ml的EC50值结合于hGREM1，且以0.006ng/ml至0.008ng/ml的EC50值结合于XM5。
实施例17：通过Fortebio进行表位分析
通过Fortebio进一步执行对本文所提供的抗gremlin1抗体的表位分析。简单来说，将第一抗gremlin1抗体(第1Ab)稀释于微量板(葛莱娜第一生化)的负载柱中的动力学缓冲液(PBS)中，250微升/孔。将hGremlin-his加入培养板的缔合柱中的动力学缓冲液中，250微升/孔；将AHC传感器放置于第1基线柱中60s以得到第1基线，且接着放置于负载柱中300s以捕获第一抗gremlin1抗体。之后，将传感器放置于第2基线柱中180s以得到第2基线，且接着放置于缔合柱中300s以使gremlin与第一抗gremlin1抗体完全缔合。将传感器放置于第二抗gremlin1抗体(第2Ab)柱中300s以使第二抗gremlin1抗体与第一抗体竞争或不与第一抗体竞争。通过ForteBio(Octet96)分析数据。
如果第二抗gremlin1抗体不结合于gremlin，那么这表明其结合于与第一抗gremlin1抗体类似的表位；如果第二抗gremlin1抗体可以不受第一抗gremlin1抗体任何影响而结合，那么这表明其表位是不同的。如图11A中所示，作为第二抗gremlin1抗体的6245P仍可结合于gremlin，从而表明其不与14E3竞争且结合于不同表位；而22F1/69H5在存在14E3的情况下不结合于gremlin，从而表明22F1/69H5和14E3可以结合于类似的表位位点。相反地，作为第一抗gremlin1抗体的6245P不可阻断14E3/22F1结合于抗原，但完全阻断56C11/69H5与抗原的结合(图11B)。因此，根据表位类型，可能存在3个群组：一个群组包括14E3和22F1，一个群组包括56C11和69H5，其表位可与6245P的表位重叠(表6)。
表6
附注：+：竞争者；-：非竞争者；部分：部分竞争者。
实施例18：抗GREM 1抗体的人源化
人源化14E3
在以下方案中使用三维结构模拟和通过CDR移植进行人源化来设计14E3的人源化抗体。
抗体人源化的第一步骤是模拟14E3的可变结构域的三维结构。将鼠类抗体的每个可变结构域(Vk和Vh)的序列在PDB数据库(蛋白质数据库(Protein Data Bank)，http://www.rcsb.org/)中进行序列比对(blasted)以识别与已知高分辨率结构最同源的抗体序列。选用于建模14E3的结构模板具有与目标抗体最佳的类似性。我们人工地改变结构的每个残基以满足目标序列。调节某些侧链构形的同时保持主链构形。在母结构与模拟结构具有相同残基的位置中，侧链构形保持不变；如果一些位置中模板结构与建模结构之间的残基不同，那么侧链构形会根据模板结构和封装考虑因素而突变和优化。
我们也模拟CDR移植14E3的结构以便引导回复突变设计和评估人源化抗体的可发展性和稳定性。以类似方式进行结构模拟。
通过CDR移植进行人源化。在IMGT的人类免疫球蛋白基因数据库进行鼠类14E3序列的序列比对之后，将人类生殖系构架序列重链的IGHV/7-4和轻链的IGKV/2-30分别用于CDR移植，并且获得不具有回复突变的人源化14E3。为进一步保持人源化14E3的活性，我们对人源化抗体的构架序列和其对应鼠类抗体的构架序列进行比对。在鼠类抗体结构模型中对不同残基进行双重检查：如果其中任一者处于可能与CDR残基相互作用并影响CDR残基的位置中，那么其应回复突变为鼠类残基。本公开获得具有不同回复突变的三个人源化重链可变区，分别标记为Hu14E3_Ha VH、Hu14E3_Hb VH和Hu14E3_Hc VH，以及具有不同回复突变的两个人源化轻链可变区，标记为Hu14E3-La VL和Hu14E3-Lb VL(参见表5)。这些人源化重链和轻链可变区的cDNA融合至hIgG1和hKappa恒定区并插入至哺乳动物载体中。每个人源化重链与人源化轻链共表达以获得6个版本的人源化抗体，即，Hu14E3_HaLa、Hu14E3_HaLb、Hu14E3_HbLa、Hu14E3_HbLb、Hu14E3_HcLa和Hu14E3_HcLb。表达和纯化程序与嵌合抗体相同。
人源化22F1
以类似的方案设计22F1的人源化抗体。简单来说，将人类生殖系构架序列重链的IGHV/1-46和轻链的IGKV/2-30分别用于CDR移植，接着使用计算机建模以设计具有CDR移植和回复突变的人源化变体。本公开获得具有回复突变的四个人源化重链可变区，即，Hu22F1_Ha VH、Hu22F1_Hb VH、Hu22F1_Hc VH和Hu22F1_Hd VH，以及具有不同回复突变的两个轻链可变区，即，Hu22F1-La VL和Hu22F1-Lb VL(参见表5)。每个人源化重链与人源化轻链共表达以获得22F1的8个版本人源化抗体，即，Hu22F1_HaLa、Hu22F1_HaLb、Hu22F1_HbLa、Hu22F1_HbLb、Hu22F1_HcLa、Hu22F1_HcLb、Hu22F1_HdLa和Hu22F1_HdLb。表达和纯化程序与嵌合抗体相同。
通过一些步骤进行重组抗体蛋白质的表达和纯化：将ExpiCHO细胞以5至6×106个细胞/毫升接种于ExpiCHO表达培养基中。随后，使用ExpiCHO转染试剂盒用等量的重链载体和轻链载体DNA以1.0μg/ml的最终浓度转染ExpiCHO细胞。将经转染的细胞在补充有8％CO2的37℃培育箱中在125rpm下的摇瓶中培养。在转染后18至22小时之后添加ExpiCHO进料。在第10天收集细胞培养物。通过离心获得收集的细胞培养液(HCCF)。接着将HCCF装载于rProteinA柱(GE医疗集团)上并用PBS洗涤。用含有20mM柠檬酸的溶液，pH3.2洗脱最终IgG抗体。最后，将洗脱的抗体蛋白质中和并存储在-80℃下以便长期使用。分析所得抗体以使用SDS-PAGE和尺寸排阻色谱(TSKgel G3000SWXL，TOSOH)测定纯度水平。
人源化56C11
以类似的方案设计56C11的人源化抗体。简单来说，将人类生殖系构架序列重链的IGHV1-2*02和轻链的IGKV2-30*02分别用于CDR移植。
通过将三个CDR直接移植至生殖系序列来获得重链(HC)变体1、2、3和4。以上重链可变区和轻链可变区的组合产生以下人源化56C11抗体：56C11-H0L0、56C11-HaL0、56C11-HbL0、56C11-HcL0、56C11-H0La、56C11-HaLa、56C11-HbLa、56C11-HcLa、56C11-H0Lb、56C11-HaLb、56C11-HbLb、56C11-HcLb。
56C11的重链和轻链的人源化变体连接于人类IgG1重链恒定区和κ轻链恒定区，如下文所示：
人类IgG1重链恒定区(SEQ ID NO:138)：
人类κ轻链恒定区(SEQ ID NO:139)：
合成以上重链和轻链cDNA的可变区并使其与人类IgG1和人类κ的恒定区融合。将所选抗体基因的重链和轻链克隆至表达载体中并且使用来自Qiagen的Plasmid Maxiprep系统制备大规模DNA。使用来自英杰公司的ExpiFectamineTMCHO试剂根据制造商的方案进行转染。当细胞存活率为约60％时收集上清液。经由0.22μm过滤囊过滤细胞培养物上清液以去除细胞碎片。将上清液装载于预平衡的蛋白质-A亲和柱上。接着用平衡缓冲液(PBS)洗涤柱内的蛋白质A树脂，并且使用25mM柠檬酸盐(pH 3.5)洗脱抗体。用1M Tris-碱(pH 9.0)将pH调节至约6.0至7.0。将内毒素控制在低于1EU/mg。接着通过SDS-PAGE和SEC-HPLC表征纯化的抗体。
实施例19：ELISA和Fortebio中人源化抗体与hGremlin的结合
实施例4的相同方案。如图12A中所示，14E3的人源化变体保持与嵌合14E3(例如，14E3 hIgG1或14E3-C)类似的结合活性，从而表明生物活性可能不受人源化影响。然而，22F1的大多数人源化变体明显地丧失结合，并且仅22F1-HdLa和22F1-HdLb仍具有良好亲和力(图12B和图12C)。
还通过Fortebio测量人源化抗体的亲和力。人类gremlin蛋白质用动力学缓冲液稀释以得到2μg/ml的浓度。0nM用作参考对照。待测试的抗体用ForteBio动力学缓冲液(PBSpH 7.4，0.1％ BSA+0.002％ Tween-20)稀释至100nM、50nM和25nM的浓度。将人类gremlin-his固定于NTA生物传感器上。检测基线60秒，且接着检测抗gremlin抗体缔合120秒以得到Kon因子数据。接着在动力学缓冲液中解离90秒以得到Koff因子数据。如图12D中所示，人源化抗gremlin1抗体14E3具有小于1nM的KD值，远低于基准抗体的KD值。
实施例20：PC-3异种移植肿瘤模型中人源化抗体14E3的肿瘤生长抑制活性
简单来说，人前列腺癌PC3细胞在RPMI1640培养基(赛默飞世尔(Thermo Fisher))中进行体外单层培养，培养基补充有10％热灭活胎牛血清(依科赛生物(ExCellBiology))、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素(海克隆(Hyclone))和1ug/ml嘌呤霉素(吉毕科公司)，培养维持在37℃下、含有5％ CO2的空气的气体中。肿瘤细胞通过胰蛋白酶-EDTA处理剂(海克隆)，常规地每周传代培养两次。收获呈指数增长阶段的细胞并计数，用于肿瘤接种。SPF级雄性裸鼠皮下接种与50％基质凝胶混合的1*10^6PC3细胞。10天之后，对接种后的小鼠进行睾丸切除。当肿瘤大小达到200mm^3左右时，选择肿瘤携带小鼠并随机分为2组(n＝8)。用10mg/kg hIgG1对照和10mg/kg Hu14E3_HaLa腹腔注射动物，每4天注射一次，持续3周。每4天用测径规(INSIZE)在两个维度测量一次肿瘤大小，体积用mm^3表示，公式为：V＝0.5a*b^2，其中a和b分别为肿瘤的长直径和短直径。使用Prism GraphPad分析结果并表示为均值±S.E.M。通过T-测试进行两个组之间的比较，并且如果p为*<0.05和**<0.01，则认为差异显著。结果表明，Hu14E3_HaLa无论从体积还是重量评估上都能有效抑制肿瘤生长(图13A和图13B)。
实施例21：56C11在BALB/c的CT-26肿瘤模型(MSB-Pharm2018025)中的功效
因为gremlin1可以在肿瘤细胞和基质纤维母细胞两者中表达，所以我们评估gremlin1在调节肿瘤微环境中的贡献和其单独或与检查点抑制剂组合调节肿瘤生长的潜力。因此，我们评估56C11在CT-26模型(同基因型肿瘤模型)中的抗肿瘤活性。简单来说，向24只5至6周龄雌性Balb/c小鼠接种2×106个CT26肿瘤细胞。当肿瘤体积达到约100mm3时，将动物随机化并且分组如下：1)同种型对照20mg/kg和2)56C11，20mg/kg。腹膜内(IP)注射抗体，一周两次，持续2周。图14中所示的结果显示单独的抗GREM1抗体56C11(其对小鼠GREM1具有交叉反应性)可具有显著的抗肿瘤活性而对总体重无显著影响。预期本文所提供的人源化抗GREM1抗体(例如，Hu14E3、Hu14E3、Hu22F1和Hu56C11)在人类中显示与其嵌合对应物在展现出显著抗肿瘤活性而对总体重无显著影响方面类似的技术效果。
实施例22：MPDL-3820A和抗GREM 1抗体组合疗法在CT26肿瘤模型(MSB-Pharm2018004)中的功效
为进一步测试抗GREM 1抗体与免疫检查点抑制剂的组合的抗肿瘤功效，我们评估了组合MPDL-3280A和替代物抗小鼠GREM 1抗体(抗mGREM 1抗体)在CT26肿瘤模型中的抗肿瘤活性。简单来说，向5至6周龄雌性Balb/c小鼠接种5×105/小鼠CT26细胞。将动物随机化。当肿瘤体积达到约100mm3时，将小鼠分为以下四个处理组：1)单独的对照IgG1，10mpk，2)单独的MPDL3280A，3mpk，3)单独的抗mGREM 1抗体，10mpk，或4)3mpk的MPDL3280a和10mpk的抗mGREM 1抗体的组合，IP一周两次，持续2周。如图15A和图15B中所示，抗mGREM 1抗体与免疫检查点抑制剂(例如，针对PD-L1的抗体)的组合引起与单独的抗mGREM 1抗体或仅免疫检查点抑制剂相比明显更高的抗肿瘤活性(就肿瘤体积或肿瘤重量来说)。这表明抗mGREM 1抗体可以增强免疫检查点抑制剂的抗肿瘤活性。
实施例23：人源化14E3与顺铂的组合在食道癌PDX模型中的功效
人类gremlin IHC，具体地说阳性食道肿瘤组织(E7)是获自北京肿瘤医院(Beijing Cancer Hospital)传代的NOD/SCID小鼠和确立的PDX库。我们通过免疫组织化学使用抗GREM1抗体(14E3)或抗PD-L1抗体(22C3)测试了E7食道PDX模型中的GREM1表达和PD-L1表达。图16显示食道癌PDX模型E7在GREM1表达中为阳性但不具有PD-L1表达。
向每只小鼠皮下接种直径大致为3mm的小肿瘤组织块，从携带肿瘤小鼠的整体肿瘤剥离物中剪切所述小肿瘤组织块。接种之后18天，选择肿瘤大小为约70mm3的动物并将其随机分为4个组，每个组由8只小鼠组成。接着，用同种型对照+PBS、20mg/kg剂量的人源化14E3(hzd14E3)、3mg/kg剂量的顺铂以及hzd14E3和顺铂的组合处理小鼠。通过腹膜內注射和PBS施用同种型对照和hzd14E3，一周两次并持续4周，而通过静脉内注射施用顺铂，一周一次并持续4周。在结束研究时利用CO2吸入杀死动物。使用测径规(INSIZE)在两个维度测量肿瘤大小，一周两次或三次，并且使用下式以mm^3表示体积：V＝0.5a×b2，其中a和b分别为肿瘤的长直径和短直径。使用Prism GraphPad分析结果并表示为均值±S.E.M。通过T-测试进行两个组之间的比较，并且如果p为*<0.05和**<0.01，则认为差异显著。
图17A和图17B显示与具有42.92％ TGI的同种型对照相比，当此实验中使用单独的人源化14E3时显著增强肿瘤生长抑制。与单独的人源化14E3(63.97％ TGI对比42.92％TGI)或单独的顺铂(63.97％ TGI对比59.79％ TGI)相比时，人源化14E3和顺铂的组合进一步抑制肿瘤生长，从而表明人源化14E3和顺铂的组合治疗对食道癌的协同效应。
到目前为止，用于食道癌的一线疗法一般包括食管切除术、化学疗法、靶向疗法、免疫疗法(例如，靶向PD-1或PD-L1)，和/或其组合。用于食道癌的二线疗法和后续疗法可以涉及靶向疗法，如靶向血管内皮生长因子(VEGF)受体的雷莫芦单抗或用于转移性腺癌的过度表达HER2的曲妥珠单抗(NCCN肿瘤学临床实践指南(NCCN Clinical PracticeGuidelines in Oncology).食道和食管胃连接部癌症(Esophageal and EsophagogastricJunction Cancers).美国国家综合癌症网络(National Comprehensive CancerNetwork).V1.2020)。上文所描述的数据显示本文所提供的抗GREM1抗体可有效地治疗并不表达PD-L1的肿瘤，例如并不过度表达PD-L1的食道癌，并且在与化学疗法(例如顺铂)组合时可进一步达成协同效应。这表明本文所提供的抗GREM1抗体可以充当用于食道癌的一线疗法或二线疗法的新选择。
实施例24：hzd14E3(与DC101组合)和6245P在食道癌PDX模型中的功效
人类gremlin IHC，具体地说阳性食道肿瘤组织(E7)是获自北京肿瘤医院(Beijing Cancer Hospital)传代的NOD/SCID小鼠和确立的PDX库。向每只小鼠皮下接种直径大致为3mm的小肿瘤组织块，从携带肿瘤小鼠的整体肿瘤剥离物中剪切所述小肿瘤组织块。接种之后18天，选择肿瘤大小为约70mm3的动物并将其随机分为4个组，每个组由8只小鼠组成。接着，用同种型对照、20mg/kg剂量的hzd14E3和6245P、10mg/kg剂量的DC101以及hzd14E3和DC101的组合处理小鼠。DC101为与小鼠VEGFR-2反应的单克隆抗体且为可商购的(例如，来自BioXell的目录号BE0060)。通过腹膜內注射施用对照物和测试品，一周两次并持续4周。在结束研究时利用CO2吸入杀死动物。使用测径规(INSIZE)在两个维度测量肿瘤大小，一周两次或三次，并且使用下式以mm^3表示体积：V＝0.5a×b2，其中a和b分别为肿瘤的长直径和短直径。使用Prism GraphPad分析结果并表示为均值±S.E.M。通过T-测试进行两个组之间的比较，并且如果p为*<0.05和**<0.01，则认为差异显著。预期本文所提供的其它人源化抗GREM1抗体(例如，Hu22F1和Hu56C11)显示类似的技术效果。
实施例25：表征阻断Gremlin结合于捕获FGFR1中的抗体活性
测试gremlin-his与固定于培养板上的FGFR1的结合能力。简单来说，用重组人类2μg/ml的FGFR1-Fc(北京义翘神州科技股份有限公司(Sino-Biological))涂布培养板过夜且接着将以2μg/ml开始的gremlin-his的2倍连续稀释液(ACRO)添加至涂布培养板中并在室温(RT)下孵育1h。接着洗涤培养板并且用抗his HRP(金斯瑞)检测培养板结合的Gremlin-his。接着将培养板用TMB溶液显色，通过添加终止溶液使其终止。在板读数仪上在450nm下读取培养板。孵育时间为约20分钟。如图18A中所示，hGREM1可以结合于FGFR1。
接着，选择0.25μg/ml gremlin测试阻断活性。经由ELISA检测抗体阻断Gremlin结合于人类FGFR1-Fc的能力。用重组FGFR1-Fc(2μg/ml)涂布培养板过夜，接着在室温下将抗体的连续稀释液与0.25μg/ml的修饰的人类Gremlin-his一起孵育1h，之后将此复合物添加至涂布培养板中并将其在室温下再孵育一小时。接着洗涤培养板并添加抗his HRP(金斯瑞)。接着将培养板用TMB溶液显色，通过添加终止溶液使其终止。在板读数仪上在450nm下读取培养板。如图18B和18C中所示，本文所提供的抗gremlin 1抗体(例如42B9、36F5、67G11和14E3 HaLa、嵌合抗体69H5(69H5-chi)、嵌合抗体36F5(36F5-chi)、嵌合抗体22F1(22F1-chi))可以抑制或阻断hGREM1与FGFR1的结合，而基准抗体6245P并不阻断hGREM1与FGFR1的结合。36F5-chi可以阻断hGREM1与FGFR1的结合，IC50值为1.368nM。69H5-chi和22F1-chi具有部分阻断活性，其中69H5-chi可以阻断hGREM1与FGFR1的结合，IC50值为7.138nM，22F1-chi可以阻断hGREM1与FGFR1的结合，IC50值为5.117nM。预期本文所提供的人源化抗GREM1抗体(例如，Hu14E3、Hu22F1)在阻断hGREM1与FGFR1的结合中显示与其嵌合对应物有类似的技术效果。
实施例26：通过ELISA进行的纯化杂交瘤或嵌合抗gremlin抗体与捕获人类gremlin和DAN蛋白质的结合分析
在4℃下用100微升/孔的含0.5μg/ml人类gremlin(ACRO)和DAN(北京义翘神州科技股份有限公司)的高pH涂布缓冲液涂布透明聚苯乙烯培养板(BEAVER)过夜。接着在自动培养板洗涤器上使用PBS+0.1％ Tween 20(西格玛)洗涤培养板一次。将100μl的由PBS+1％BSA+1％标准山羊血清+0.5％ Tween 20(西格玛)组成的阻断溶液添加至每个孔中并在室温下孵育2小时。接着将100μl于含有PBS+1％ BSA+1％标准山羊血清+0.01％ Tween 20的抗体稀释缓冲液中的抗体(杂交瘤或嵌合抗体36F5、嵌合抗体67G11、嵌合抗体42B9)(以2μg/ml(13.33nM)开始且进行4倍连续稀释)添加至培养板的每个孔中并且在室温下孵育1小时。然后，用200μl的PBS+0.1％ Tween20洗涤培养板三次，接着添加100微升/孔的1:10000山羊抗小鼠IgG-HRP或小鼠抗人类IgG-HRP(艾博抗)，并且在室温下孵育1小时。接着用PBS+0.1％ Tween20将其洗涤3次。最后，将100微升/孔的TMB(英创生物科技有限公司)添加至每个孔中，并且在2分钟之后，向每个孔中添加50μl的停止溶液。在Multiscan FC微板读数仪(赛默飞世尔科技公司)上在450nm下读取培养板。EC50值也如下图19A、19B和19C中所示。因此，杂交瘤或嵌合抗体36F5、嵌合抗体67G11和嵌合抗体42B9具有类似的gremlin与DAN蛋白质的结合活性。
实施例27：表征阻断DAN蛋白质结合于捕获BMP2/4中的抗体活性
用重组人类BMP2/4(0.5μg/ml)涂布培养板过夜。接着在自动培养板洗涤器上使用PBS+0.1％ Tween 20(西格玛)洗涤培养板一次。将100μl的由PBS+1％ BSA+1％标准山羊血清+0.5％ Tween 20(西格玛)组成的阻断溶液添加至每个孔中并在室温下孵育2小时。接着将培养板洗涤三次。接着将分别于含有PBS+1％ BSA+1％标准山羊血清+0.01％Tween 20的稀释缓冲液中的55ul嵌合抗体36F5的连续稀释液和55ul的0.5μg/ml人类DAN-his混合并在室温下孵育1h，之后将100ul此复合物添加至涂布培养板中并将其在室温下再孵育一小时。接着洗涤培养板3次并添加100ul含抗his HRP(金斯瑞)的稀释缓冲液。接着将培养板用TMB溶液显色，通过添加终止溶液使其终止。用洗涤缓冲液洗涤三次之后，在板读数仪上在450nm下读取培养板。另外，与前述结果一致，除了阻断gremlin活性以外，36F5还可以阻断BMP2/4结合于DAN蛋白质。(图20A和20B)。
实施例28：杂交瘤36F5在EMT6/hPD-L1肿瘤模型中的功效
用筛检稳定表达人类PD-L1的人类PD-L1基因转染小鼠乳癌细胞系EMT6，命名为EMT6/hPD-L1。将EMT6/hPD-L1细胞以单层培养物形式维持于37℃下具有5％ CO2的空气压力下的试管内补充有10％热灭活胎牛血清(依科赛生物)、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素(海克隆)的DMEM培养基(海克隆)中。肿瘤细胞通过胰蛋白酶-EDTA处理(海克隆)常规地每周传代培养两次。收集在指数生长阶段中生长的细胞并且对其计数以用于肿瘤接种。雌性SPF级BABL/c小鼠接种有与50％基质胶混合的2*10^6EMT6/hPD-L1细胞。在第一研究中，当肿瘤大小为约80mm^3时，选择肿瘤携带小鼠并随机分成2个组(n＝10)。通过腹膜內注射用24.9mg/kg hIgG1对照和24.9mg/kg AM4B6处理动物，一周两次并持续4周。在第二研究中，当肿瘤大小为约70mm^3时，选择肿瘤携带小鼠并随机分成2个组(n＝8)。通过腹膜內注射用10mg/kg hIgG1对照和10mg/kg 36F5处理动物，一周两次并持续3周。使用测径规(INSIZE)在两个维度测量肿瘤大小，一周两次，并且使用下式以mm^3表示体积：V＝0.5a×b^2，其中a和b分别为肿瘤的长直径和短直径。使用Prism GraphPad分析结果并表示为均值±S.E.M。通过T-测试进行两个组之间的比较，并且如果p为*<0.05和**<0.01，则认为差异显著。表7和图21A为第一研究的结果。结果显示抗PD-L1抗体(AM4B6)在EMT6/hPD-L1肿瘤模型中不具有抗肿瘤活性。EMT6/hPD-L1肿瘤模型展现出对PD-L1抗体的不良反应。表8和图21B为第二研究的结果。结果显示抗Gemlin1抗体(36F5)在EMT6/hPD-L1肿瘤模型中具有希望的抗肿瘤活性，所述肿瘤模型展现出对PD-L1抗体的不良反应。
表7：第29天AM4B6在EMT6/hPD-L1肿瘤模型中的功效
表8：第24天36F5在EMT6/hPD-L1肿瘤模型中的功效
实施例29：杂交瘤14E3、杂交瘤36F5或纳武单抗在PBMC人源化小鼠的E7肿瘤模型中的功效
E7为具有人类Gremlin高表达的食道癌PDX，其获自北京肿瘤医院传代的NOD-SCID小鼠和确立的PDX库。NOG小鼠为购自维通利华(Vital River)的重度免疫缺陷小鼠。向每只小鼠皮下接种直径大致为3mm的小肿瘤组织块，从携带肿瘤小鼠的整体肿瘤剥离物中剪切所述小肿瘤组织块。接种之后27天，选择肿瘤大小为约50mm^3的动物并静脉内注射5*10^6/小鼠人类PBMC。一周后，针对重构特征筛选动物并随机分为6个组，每个组由8只小鼠组成。通过腹膜內注射用30mg/kg同种型对照、30mg/kg 14E3、30mg/kg 36F5、10mg/kg纳武单抗处理动物，一周两次并持续5周。使用测径规(INSIZE)在两个维度测量肿瘤大小，一周两次，并且使用下式以mm^3表示体积：V＝0.5a×b^2，其中a和b分别为肿瘤的长直径和短直径。使用Prism GraphPad分析结果并表示为均值±S.E.M。通过T-测试进行两个组之间的比较，并且如果p为*<0.05和**<0.01，则认为差异显著。表9、图22A和图22B为研究结果。结果显示抗PD-L1抗体(纳武单抗)在E7肿瘤模型中不具有抗肿瘤活性。抗Gemlin1抗体36F5和14E3在E7肿瘤模型中具有希望的抗肿瘤活性，所述肿瘤模型展现出对PD-1抗体的不良反应。
表9：第35天14E3或36F5相比于纳武单抗在PBMC人源化小鼠的E7肿瘤模型中的功效
实施例30：56C11与抗PDL1抗体的组合疗法在MC38/hPD-L1肿瘤模型中的功效
用筛检稳定表达人类PD-L1的人类PD-L1基因转染小鼠结肠癌细胞系MC38，命名为MC38/hPD-L1。将MC38/hPD-L1细胞以单层培养物形式维持于37℃下具有5％ CO2的空气压力下的试管内补充有10％热灭活胎牛血清(依科赛生物)、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素(海克隆)的1640培养基(海克隆)中。肿瘤细胞通过胰蛋白酶-EDTA处理(海克隆)常规地每周传代培养两次。收集在指数生长阶段中生长的细胞并且对其计数以用于肿瘤接种。雌性SPF级C57BL/6小鼠接种有与50％基质胶混合的2*10^6MC38/hPD-L1细胞。当肿瘤大小为约120mm^3时，选择肿瘤携带小鼠并随机分成4个组(n＝8)。通过腹膜內注射用3mg/kg hIgG1对照、20mg/kg 56C11、3mg/kg 23F11(抗PDL1抗体)和20mg/kg56C11与3mg/kg 23F11的组合处理动物，一周两次并持续3周。使用测径规(INSIZE)在两个维度测量肿瘤大小，一周两次，并且使用下式以mm^3表示体积：V＝0.5a×b^2，其中a和b分别为肿瘤的长直径和短直径。使用Prism GraphPad分析结果并表示为均值±S.E.M。通过T-测试进行两个组之间的比较，并且如果p为*<0.05和**<0.01，则认为差异显著。56C11与抗PDL1抗体的组合增强了在MC38/hPD-L1肿瘤模型中的抗肿瘤活性(表10和图23)。
表10：第22天56C11组合在MC38/hPD-L1肿瘤模型中的功效
表11.本申请中提及或使用的序列
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序列表
<110> 苏州创胜医药集团有限公司
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gctgatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttgaaaa cctctgccaa cactgcctat 240
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gaggcccagc tgcaacaatc tggacctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
tcctgtaagg cttctggata ctcgttcact gactactaca tgaactggct gaagcagagc 120
catggaaaga gccttgagtg gattggagat attaatccta aagatggtga tagtggttac 180
agccataagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240
atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagcggattt 300
accacggtag tagctagggg ggactactgg ggccaaggca ccactctcac agtctcctca 360
<210> 20
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 20
gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60
atctcttgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120
ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atttggtgtc taaactggac 180
tctggattcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336
<210> 21
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 21
Asp Asp Tyr Met His
1 5
<210> 22
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 22
Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Ser Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 23
Trp Ala Thr Val Pro Asp Phe Asp Tyr
1 5
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 24
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Arg Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 25
Phe Thr Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 26
Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr
1 5
<210> 27
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 27
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Asp
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Arg Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Ser Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Trp Ala Thr Val Pro Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 28
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 28
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly
1 5 10 15
Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Arg
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Val His Phe Thr Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Asn Leu Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 29
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 29
gaggtgcagc tgcaacagtc cggcgctgaa ctggtgaggc ctggagcctc cgtgaagctg 60
tcctgcaccg ccagcggctt caacatcaag gacgactaca tgcactgggt gaagaggagg 120
cctgagcagg gcctggagtg gatcggctgg atcgaccccg agaacggcga caccgagtac 180
gcctccaagt tccagggcaa ggccaccatc accgccgaca cctcctccaa caccgcctac 240
ctgcagctga gctccctgac ctccgaggac accgccgtgt actattgcac cacctgggcc 300
accgtgcccg acttcgacta ctggggacag ggcaccaccc tgaccgtgtc cagc 354
<210> 30
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 30
gatatcgtga tgacccagtc tccttcctct ctggctatgt cagtgggaca gaaagtgacc 60
atgtcttgca agtcctctca gtctctgctg aacaggtcca accagaagaa ctacctggct 120
tggtaccagc agaaaccagg acagtctcct aagctgctgg tgcattttac ctctaccagg 180
gaatccggag tgccagatag atttatcggc tctggctccg gcacagattt tacactgacc 240
atctccaatc tgcaggcaga agatctggct gactactttt gccagcagca ctactccacc 300
ccttttacct ttggctccgg caccaagctg gagatcaag 339
<210> 31
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 31
Asp Phe Tyr Met Asn
1 5
<210> 32
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 32
Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 33
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 33
Asp Pro Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Glu Val Ala Tyr
1 5 10
<210> 34
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 34
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 35
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 36
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Leu Thr
1 5
<210> 37
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 37
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 38
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 38
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 39
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 39
gaggtgcagc tgcagcagtc cggccctgag ctggtgaagc ctggagcctc cgtgaagatc 60
tcctgtaagg cctccggcta caccttcacc gacttctaca tgaactgggt gaagcagtcc 120
cacggcaagt ccctggagtg gatcggcgac atcaatccca acaacggcgg cacctcctac 180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccaccctg acagtggaca agtcctccag caccgcctac 240
atggagctga ggtccctgac ctccgaggac tccgccgtgt actactgcgc cagggacccc 300
atctactacg actacgacga ggtggcctac tggggccagg gaaccctggt gacagtgtcc 360
gcc 363
<210> 40
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 40
gatgtggtga tgacacagac acctctgtct ctgccagtgt ctctcggaga tcaggcttct 60
atctcttgca gatcctctca gtctctggtg cattccaacg gaaacaccta cctgcattgg 120
tacctgcaga aaccaggaca gtctcctaag ctgctgatct acaaggtgtc caacaggttc 180
tccggagtgc cagatagatt ttccggatct ggatctggca ccgattttac cctgaagatc 240
tctagagtgg aagcagagga tctgggagtg tacttttgta gccagtctac ccacgtgcct 300
ctgacatttg gagcaggaac aaagctggag ctgaag 336
<210> 41
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 41
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Leu Ser Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 42
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 42
caggtgcagc tggtgcagtc cggctccgag ctgaagaagc ctggcgcctc cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc acctacggca tggcctggat gaggcaggct 120
cctggccagg gactggagtg gatgggctgg atcaacaccc tgtccggcga acccacctac 180
gccgacgact tcaagggcag gttcgtgttc tccctggaca ccagcgtgtc caccgcctac 240
ctgcagatct cctccctgaa ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggagccc 300
atggactact ggggccaggg caccatggtg accgtgtcct cc 342
<210> 43
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 43
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Leu Ser Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 44
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 44
cagatccagc tggtgcagag cggcagcgag ctgaagaagc ccggcgctag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc acctacggca tggcctggat gaggcaggct 120
cctggacagg gcctggagtg gatgggctgg atcaacaccc tgtccggcga gcctacctac 180
gccgacgact tcaagggcag gttcgccttc tccctggaca cctccgtgag caccgcctac 240
ctgcagatct ccagcctgaa ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggagcct 300
atggactact ggggccaggg caccatggtg accgtgtcca gc 342
<210> 45
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 45
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Met Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Thr Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Leu Ser Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 46
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 46
cagatccagc tggtgcagtc cggcagcgag ctcaagaagc ccggagccag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggctc caccttcacc acatacggca tggcctggat gaagcaggct 120
cctggccagg gcctgacctg gatgggatgg atcaacaccc tgtccggcga gcctacctac 180
gccgatgact tcaagggcag gttcgccttc tccctggaca cctccgtgtc caccgcttac 240
ctgcagatct cctccctgaa ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggagccc 300
atggactact ggggccaggg caccatggtg accgtgtcct cc 342
<210> 47
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 47
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Ala His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 48
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 48
gatgtggtga tgacacagtc tcctctgtct ctgccagtga cactgggaca gccagcttct 60
atctcttgca agtcctctca gtctctgctg gattccgacg gaaagaccta tctgtcttgg 120
ctgcagcaga gaccaggaca gtctcctaga agactgatct acctggtgtc caagctggat 180
tctggagtgc cagatagatt ttccggctcc ggctctggca cagatttcac cctgaagatc 240
tctagagtgg aggcagaaga cgtgggagtg tactattgtt ggcagggagc tcacttccct 300
ctgacatttg gacagggaac aaagctggag atcaag 336
<210> 49
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 49
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Ser Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Ala His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 50
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 50
gatgtggtga tgacacagtc tcctctgtct ctgccagtga cactgggaca gccagcttct 60
atctcttgca agtcctctca gtctctgctg gattccgacg gaaagaccta tctgtcttgg 120
ctgcagcaga gaccaggaca gtctcctaga agactgatct ccctggtgtc taagctggat 180
tccggagtgc cagatagatt ttccggatct ggatctggca ccgattttac cctgaagatc 240
tctagagtgg aggcagaaga cgtgggagtg tactattgtt ggcagggagc tcacttccct 300
ctgacatttg gacagggaac aaagctggag atcaag 336
<210> 51
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 51
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Lys Asp Gly Asp Ser Gly Tyr Ser His Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Phe Thr Thr Val Val Ala Arg Gly Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 52
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 52
caagttcagc tggtgcagtc cggagccgag gtgaagaagc ccggcgcttc cgtgaaggtg 60
tcttgtaagg cctccggcta ctccttcacc gattactaca tgaactgggt gaggcaagct 120
cccggtcaag gtctggagtg gatgggcgac atcaacccca aggacggcga ctccggctat 180
tcccacaagt tcaagggtcg tgtgaccatg accagggaca cgtccaccag caccgtgtac 240
atggagctgt cctctttaag gtccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagcggattc 300
accaccgtgg tggctagggg cgactattgg ggccaaggta ccaccgtgac agtgtccagc 360
<210> 53
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 53
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Lys Asp Gly Asp Ser Gly Tyr Ser His Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Phe Thr Thr Val Val Ala Arg Gly Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 54
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 54
caagttcagc tggtgcagtc cggagccgag gtgaagaagc ccggcgcttc cgtgaaggtg 60
tcttgtaagg cctccggcta ctccttcacc gattactaca tgaactgggt gaggcaagct 120
cccggtcaag gtctggagtg gatgggcgac atcaacccca aggacggcga ctccggctat 180
tcccacaagt tcaagggtcg tgtgaccatg accgtggaca agtccaccag caccgtgtac 240
atggagctgt cctctttaag gtccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagcggattc 300
accaccgtgg tggctagggg cgactattgg ggccaaggta ccaccgtgac agtgtccagc 360
<210> 55
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 55
Gln Ala Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Lys Asp Gly Asp Ser Gly Tyr Ser His Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Phe Thr Thr Val Val Ala Arg Gly Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 56
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 56
caagctcagc tggtgcagtc cggcgctgag gtgaaaaagc ccggcgccag cgtgaaggtg 60
tcttgtaagg cctccggcta ctccttcacc gactactaca tgaactgggt gaggcaagct 120
cccggtcaag gtctggagtg gatgggcgac atcaacccca aggacggcga cagcggctac 180
tcccacaagt tcaagggtcg tgtgacttta accgtggaca agtccacctc caccgtctac 240
atggagctga ggtctttaag gtccgaggat accgccgtgt actactgcgc tagcggcttc 300
accaccgtgg tggctcgtgg cgattactgg ggacaaggta ccaccgtgac cgtgtcctcc 360
<210> 57
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 57
Gln Ala Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Lys Asp Gly Asp Ser Gly Tyr Ser His Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Phe Thr Thr Val Val Ala Arg Gly Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 58
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 58
caagctcaac tggtgcagtc cggcgccgag gtgaaaaagc ccggtgcctc cgtgaaggtg 60
agctgcaagg cctccggcta ctcctttacc gactactaca tgaactggct gaggcaagct 120
cccggtcaag gtctggagtg gatcggcgat atcaacccca aggacggcga ctccggctac 180
agccataagt tcaagggtcg tgccacttta accgtggaca agtccaccag caccgtgtac 240
atggagctga ggtctttaag gtccgaggac accgccgtgt actactgcgc ctccggcttc 300
accacagtgg tggctcgtgg cgactattgg ggccaaggta ccaccgtgac cgtgagctcc 360
<210> 59
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 59
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 60
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 60
gatgtggtga tgacacagtc tcctctgtct ctgccagtga cactgggaca gccagcttct 60
atctcttgca agtcctctca gtctctgctg gattccgacg gaaagaccta cctgaattgg 120
ctgcagcaga gaccaggaca gtctcctaga agactgatct acctggtgtc caagctggat 180
tctggagtgc cagatagatt ttccggctcc ggctctggca cagatttcac cctgaagatc 240
tctagagtgg aggcagaaga cgtgggagtg tactattgtt ggcagggaac ccacttccct 300
tacacatttg gaggaggcac aaaggtggag atcaag 336
<210> 61
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 61
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Phe Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 62
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 62
gatgtggtga tgacacagtc tcctctgtct ctgccagtga cactgggaca gccagcttct 60
atctcttgca agtcctctca gtctctgctg gattccgacg gaaagaccta cctgaattgg 120
ctgcagcaga gaccaggaca gtctcctaga agactgatct acctggtgtc caagctggat 180
tctggattcc cagatagatt ttccggctcc ggctctggca cagatttcac cctgaagatc 240
tctagagtgg aggcagaaga cgtgggagtg tactattgtt ggcagggaac ccacttccct 300
tacacatttg gaggaggcac aaaggtggag atcaag 336
<210> 63
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 63
Asn Ser Phe Tyr Ile Pro Arg His Ile Arg Lys Glu Glu Gly Ser Phe
1 5 10 15
Gln Ser Cys Ser Phe
20
<210> 64
<211> 21
<212> PRT
<213> Pan troglodytes
<400> 64
Phe Ser Tyr Ser Val Pro Asn Thr Phe Pro Gln Ser Thr Glu Ser Leu
1 5 10 15
Val His Cys Asp Ser
20
<210> 65
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 65
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Gly Val His
1 5 10 15
Ser
<210> 66
<211> 184
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 66
Met Ser Arg Thr Ala Tyr Thr Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Thr Leu Leu Pro Ala Ala Glu Gly Lys Lys Lys Gly Ser Gln Gly Ala
20 25 30
Ile Pro Pro Pro Asp Lys Ala Gln His Asn Asp Ser Glu Gln Thr Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Gln Pro Gly Ser Arg Asn Arg Gly Arg Gly Gln Gly Arg
50 55 60
Gly Thr Ala Met Pro Gly Glu Glu Val Leu Glu Ser Ser Gln Glu Ala
65 70 75 80
Leu His Val Thr Glu Arg Lys Tyr Leu Lys Arg Asp Trp Cys Lys Thr
85 90 95
Gln Pro Leu Lys Gln Thr Ile His Glu Glu Gly Cys Asn Ser Arg Thr
100 105 110
Ile Ile Asn Arg Phe Cys Tyr Gly Gln Cys Asn Ser Phe Tyr Ile Pro
115 120 125
Arg His Ile Arg Lys Glu Glu Gly Ser Phe Gln Ser Cys Ser Phe Cys
130 135 140
Lys Pro Lys Lys Phe Thr Thr Met Met Val Thr Leu Asn Cys Pro Glu
145 150 155 160
Leu Gln Pro Pro Thr Lys Lys Lys Arg Val Thr Arg Val Lys Gln Cys
165 170 175
Arg Cys Ile Ser Ile Asp Leu Asp
180
<210> 67
<211> 184
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 67
Met Asn Arg Thr Ala Tyr Thr Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Thr Leu Leu Pro Thr Ala Glu Gly Lys Lys Lys Gly Ser Gln Gly Ala
20 25 30
Ile Pro Pro Pro Asp Lys Ala Gln His Asn Asp Ser Glu Gln Thr Gln
35 40 45
Ser Pro Pro Gln Pro Gly Ser Arg Thr Arg Gly Arg Gly Gln Gly Arg
50 55 60
Gly Thr Ala Met Pro Gly Glu Glu Val Leu Glu Ser Ser Gln Glu Ala
65 70 75 80
Leu His Val Thr Glu Arg Lys Tyr Leu Lys Arg Asp Trp Cys Lys Thr
85 90 95
Gln Pro Leu Lys Gln Thr Ile His Glu Glu Gly Cys Asn Ser Arg Thr
100 105 110
Ile Ile Asn Arg Phe Cys Tyr Gly Gln Cys Asn Ser Phe Tyr Ile Pro
115 120 125
Arg His Ile Arg Lys Glu Glu Gly Ser Phe Gln Ser Cys Ser Phe Cys
130 135 140
Lys Pro Lys Lys Phe Thr Thr Met Met Val Thr Leu Asn Cys Pro Glu
145 150 155 160
Leu Gln Pro Pro Thr Lys Lys Lys Arg Val Thr Arg Val Lys Gln Cys
165 170 175
Arg Cys Ile Ser Ile Asp Leu Asp
180
<210> 68
<211> 184
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 68
Met Ser Arg Thr Ala Tyr Thr Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Thr Leu Leu Pro Ala Ala Glu Gly Lys Lys Lys Gly Ser Gln Gly Ala
20 25 30
Ile Pro Pro Pro Asp Lys Ala Gln His Asn Asp Ser Glu Gln Thr Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Gln Pro Gly Ser Arg Asn Arg Gly Arg Gly Gln Gly Arg
50 55 60
Gly Thr Ala Met Pro Gly Glu Glu Val Leu Glu Ser Ser Gln Glu Ala
65 70 75 80
Leu His Val Thr Glu Arg Lys Tyr Leu Lys Arg Asp Trp Cys Lys Thr
85 90 95
Gln Pro Leu Lys Gln Thr Ile His Glu Glu Gly Cys Asn Ser Arg Thr
100 105 110
Ile Ile Asn Arg Phe Cys Tyr Gly Gln Cys Phe Ser Tyr Ser Val Pro
115 120 125
Asn Thr Phe Pro Gln Ser Thr Glu Ser Leu Val His Cys Asp Ser Cys
130 135 140
Lys Pro Lys Lys Phe Thr Thr Met Met Val Thr Leu Asn Cys Pro Glu
145 150 155 160
Leu Gln Pro Pro Thr Lys Lys Lys Arg Val Thr Arg Val Lys Gln Cys
165 170 175
Arg Cys Ile Ser Ile Asp Leu Asp
180
<210> 69
<211> 160
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 69
Lys Lys Lys Gly Ser Gln Gly Ala Ile Pro Pro Pro Asp Lys Ala Gln
1 5 10 15
His Asn Asp Ser Glu Gln Thr Gln Ser Pro Gln Gln Pro Gly Ser Arg
20 25 30
Asn Arg Gly Arg Gly Gln Gly Arg Gly Thr Ala Met Pro Gly Glu Glu
35 40 45
Val Leu Glu Ser Ser Gln Glu Ala Leu His Val Thr Glu Arg Lys Tyr
50 55 60
Leu Lys Arg Asp Trp Cys Lys Thr Gln Pro Leu Lys Gln Thr Ile His
65 70 75 80
Glu Glu Gly Cys Asn Ser Arg Thr Ile Ile Asn Arg Phe Cys Tyr Gly
85 90 95
Gln Cys Asn Ser Phe Tyr Ile Pro Arg His Ile Arg Lys Glu Glu Gly
100 105 110
Ser Phe Gln Ser Cys Ser Phe Cys Lys Pro Lys Lys Phe Thr Thr Met
115 120 125
Met Val Thr Leu Asn Cys Pro Glu Leu Gln Pro Pro Thr Lys Lys Lys
130 135 140
Arg Val Thr Arg Val Lys Gln Cys Arg Cys Ile Ser Ile Asp Leu Asp
145 150 155 160
<210> 70
<211> 160
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 70
Lys Lys Lys Gly Ser Gln Gly Ala Ile Pro Pro Pro Asp Lys Ala Gln
1 5 10 15
His Asn Asp Ser Glu Gln Thr Gln Ser Pro Pro Gln Pro Gly Ser Arg
20 25 30
Thr Arg Gly Arg Gly Gln Gly Arg Gly Thr Ala Met Pro Gly Glu Glu
35 40 45
Val Leu Glu Ser Ser Gln Glu Ala Leu His Val Thr Glu Arg Lys Tyr
50 55 60
Leu Lys Arg Asp Trp Cys Lys Thr Gln Pro Leu Lys Gln Thr Ile His
65 70 75 80
Glu Glu Gly Cys Asn Ser Arg Thr Ile Ile Asn Arg Phe Cys Tyr Gly
85 90 95
Gln Cys Asn Ser Phe Tyr Ile Pro Arg His Ile Arg Lys Glu Glu Gly
100 105 110
Ser Phe Gln Ser Cys Ser Phe Cys Lys Pro Lys Lys Phe Thr Thr Met
115 120 125
Met Val Thr Leu Asn Cys Pro Glu Leu Gln Pro Pro Thr Lys Lys Lys
130 135 140
Arg Val Thr Arg Val Lys Gln Cys Arg Cys Ile Ser Ile Asp Leu Asp
145 150 155 160
<210> 71
<211> 24
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 71
Met Ser Arg Thr Ala Tyr Thr Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Thr Leu Leu Pro Ala Ala Glu Gly
20
<210> 72
<211> 24
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 72
Met Asn Arg Thr Ala Tyr Thr Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Thr Leu Leu Pro Thr Ala Glu Gly
20
<210> 73
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 73
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr
20 25 30
<210> 74
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 74
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10
<210> 75
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 75
Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser
20 25 30
<210> 76
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 76
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 77
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 77
Gln Ala Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr
20 25 30
<210> 78
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 78
Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser
20 25 30
<210> 79
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 79
Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser
20 25 30
<210> 80
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 80
Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 81
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 81
Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser
20 25 30
<210> 82
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 82
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
<210> 83
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 83
Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10
<210> 84
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 84
Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 85
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 85
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 86
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 86
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
<210> 87
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 87
Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 88
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 88
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Thr Phe Thr
20 25 30
<210> 89
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 89
Trp Met Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Thr Trp Met Gly
1 5 10
<210> 90
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 90
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
<210> 91
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 91
Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 92
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 92
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 93
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 93
Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 94
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 94
Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 95
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 95
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 96
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 96
Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 97
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Val, Ile or Ala.
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa is Ala or Ser.
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa is Val or Leu.
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(28)
<223> Xaa at position 27 is Tyr or Ser, and Xaa at position 28 is Thr
or Ser.
<400> 97
Gln Xaa Gln Leu Val Gln Ser Gly Xaa Glu Xaa Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Xaa Xaa Phe Thr
20 25 30
<210> 98
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> Xaa at position 2 is Val, Leu or Met, and Xaa at position 3 is
Arg or Lys.
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa is Gln or Lys.
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa is Glu or Thr.
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Xaa is Met or Ile.
<400> 98
Trp Xaa Xaa Gln Ala Pro Gly Xaa Gly Leu Xaa Trp Xaa Gly
1 5 10
<210> 99
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Val or Ala.
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa is Met or Leu.
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa is Arg or Val.
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa is Thr or Lys.
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> Xaa is Ser or Arg.
<400> 99
Arg Xaa Thr Xaa Thr Xaa Asp Xaa Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Xaa Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser
20 25 30
<210> 100
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa is Thr, Met or Leu.
<400> 100
Trp Gly Gln Gly Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 101
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 101
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys
20
<210> 102
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 102
Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 103
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 103
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 104
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 104
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 105
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 105
Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 106
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 106
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 107
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 107
Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile Ser
1 5 10 15
<210> 108
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 108
Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 109
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 109
Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 110
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 110
Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 111
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Leu, Phe or Tyr.
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa is Arg or Leu.
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa is Tyr or Ser.
<400> 111
Trp Xaa Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Xaa Leu Ile Xaa
1 5 10 15
<210> 112
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Val or Phe.
<400> 112
Gly Xaa Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 113
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa is Gly or Gln.
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa is Val or Leu.
<400> 113
Phe Gly Xaa Gly Thr Lys Xaa Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 114
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 114
Ser Ser Gly Ile Gly
1 5
<210> 115
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 115
Glu Ile Tyr Pro Arg Ser Gly Asn Thr Tyr Asn Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 116
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 116
Glu Ala Tyr Ser His His Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 117
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 117
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 118
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 118
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr
1 5
<210> 119
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 119
Ser Tyr Gly Ile Gly
1 5
<210> 120
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 120
Glu Gly Tyr Ser Asn Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 121
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 121
Ile Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 122
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 122
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 123
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Ser or Tyr.
<400> 123
Ser Xaa Gly Ile Gly
1 5
<210> 124
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Ala or Gly.
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(6)
<223> Xaa at position 5 is His or Asn, and Xaa at position 6 is His or
Asn.
<400> 124
Glu Xaa Tyr Ser Xaa Xaa Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 125
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa is Arg or Ile.
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa is Leu or Val.
<400> 125
Xaa Ser Ser Gln Ser Leu Xaa His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 126
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 126
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Gly Ile Gly Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Arg Ser Gly Asn Thr Tyr Asn Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Val Arg Glu Ala Tyr Ser His His Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Phe Ser
115 120
<210> 127
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 127
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gly Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Leu Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn
100 105 110
<210> 128
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 128
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Gly Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Arg Ser Gly Asn Thr Tyr Asn Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Arg Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Ile Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Asn Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Phe Ser
115 120
<210> 129
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 129
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Ile Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Leu Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Leu Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 130
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 130
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Leu Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 131
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 131
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 132
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 132
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 133
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 133
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 134
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 134
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 135
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 135
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 136
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 136
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 137
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 137
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 138
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 138
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 139
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 139
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 140
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa is Val or Ala.
<400> 140
Arg Phe Xaa Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 141
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa is Met or Leu.
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa is Arg or Val.
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa is Thr or Lys.
<400> 141
Arg Val Thr Xaa Thr Xaa Asp Xaa Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 142
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 142
caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctggcgaggc ctggggcttc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cttctggcta ctccttcaca agctctggta taggctgggt gaagcagaga 120
tctggacagg gccttgagtg gattggagag atttatccta gaagtggtaa tacttacaac 180
aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cacagtgtac 240
atggaactcc gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct atttttgtgt aagagaggcc 300
tatagtcacc attactatgc tatggactat tggggtcaag gaacctcagt caccgtcttc 360
tca 363
<210> 143
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 143
gatgttttga tgacccaaac tcctctctcc ctgcctgtca gtcttggagg tcaagcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gagccttcta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120
tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggct cagtggcagt ggatcaggga cagattttac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttcca 300
ttcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaat 336
<210> 144
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 144
caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctggcgaggc ctggggcttc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcaca agctatggta taggctgggt gaagcagaga 120
actggacagg gccttgagtg gattggagag atttatccta gaagtggtaa tacttacaac 180
aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag aacagtgtac 240
atggagctcc gcagtctgat atctgaggac tctgcggtct acttttgtgc aagagagggc 300
tatagtaaca attactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtcttc 360
tca 363
<210> 145
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 145
gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca tatctagtca gagccttgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120
tacctgcaga aaccaggcct gtctccaaaa ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggct cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaggatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttcca 300
ttcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaa 336
<210> 146
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 146
caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctggcgaggc ctggggcttc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcaca agttatggta taggctgggt gaagcagaga 120
actggacagg gccttgagtg gattggagag atttatccta gaagtggtaa tacttacaac 180
aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcggaca aatcctccag aacagtgtac 240
atggagctcc gcagtctgat atctgaggac tctgcggtct acttttgtgc aagagagggc 300
tatagtaaca attactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtcttc 360
tca 363
<210> 147
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 147
gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gagccttgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120
tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggct cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttcca 300
ttcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaa 336
<210> 148
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 148
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Ala Glu Thr Leu Tyr Asn His Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Val Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Lys Trp Gly Asp Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 149
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 149
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ala Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Val Ser Asp Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 150
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 150
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ile Gln Pro Asn Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Lys Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Gly Thr Val Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Ser Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 151
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 151
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ile Tyr
20 25 30
Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Gln Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Thr
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215

Claims (63)

1.一种抗人类gremlin1(hGREM1)的分离抗体或其抗原结合片段，其具有以下特征中的至少一者：
a)相对于非癌细胞，能够选择性地降低癌细胞中hGREM1介导的对BMP信号传导的抑制；
b)在非癌细胞中展现hGREM1介导的对BMP信号传导的抑制降低不超过50％；
c)能够与包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的嵌合hGREM1结合；
d)能够与hGREM1结合而非与小鼠gremlin1特异性结合，或替代地对小鼠gremlin1具有交叉反应性；
e)在包含残基Gln27和/或残基Asn33的表位处与hGREM1结合，其中残基编号是根据SEQID NO:69，或与包含残基Gln27和/或残基Asn33的hGREM1片段结合，任选地所述hGREM1片段具有至少3个(例如，4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸残基的长度；
f)能够以如通过Fortebio所测量的不超过1nM的KD与hGREM1结合；
h)能够以如通过ELISA所测量的大于50％的最大阻断百分比阻断hGREM1与BMP7的结合；
i)能够阻断GREM1与FGFR的相互作用；和/或
j)能够与hGREM1和DAN两者结合。
2.根据权利要求1所述的抗hGREM1的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述表位为线性表位或构象表位。
3.一种抗人类gremlin1(hGREM1)的分离抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变(VH)区和/或轻链可变(VL)区，其中所述重链可变区包含：
a)HCDR1，其包含选自由以下组成的群组的序列：SEQ ID NO:1、11、21、31、114、119和123，
b)HCDR2，其包含选自由以下组成的群组的序列：SEQ ID NO:2、12、22、32和115，和
c)HCDR3，其包含选自由以下组成的群组的序列：SEQ ID NO:3、13、23、33、116、120和124，和/或
其中所述轻链可变区包含：
d)LCDR1，其包含选自由以下组成的群组的序列：SEQ ID NO:4、14、24、34、117、121、122和125，
e)LCDR2，其包含选自由以下组成的群组的序列：SEQ ID NO:5、15、25和35，和
f)LCDR3，其包含选自由以下组成的群组的序列：SEQ ID NO:6、16、26、36和118。
4.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区选自由以下组成的群组：
a)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:1的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:2的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:3的序列的HCDR3；
b)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:11的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:12的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:13的序列的HCDR3；
c)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:21的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:22的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:23的序列的HCDR3；
d)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:31的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:32的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:33的序列的HCDR3；
e)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:114的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:115的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:116的序列的HCDR3；和
f)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:119的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:115的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:120的序列的HCDR3；和
g)重链可变区，其包括包含SEQ ID NO:123的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:115的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:124的序列的HCDR3。
5.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区选自由以下组成的群组：
a)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:4的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:5的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:6的序列的LCDR3；
b)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:14的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:15的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:16的序列的LCDR3；
c)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:24的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:25的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:26的序列的LCDR3；
d)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:34的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:36的序列的LCDR3；
e)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:117的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:118的序列的LCDR3；
f)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:121的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:118的序列的LCDR3；
i)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:122的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:118的序列的LCDR3；和
j)轻链可变区，其包括包含SEQ ID NO:125的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:118的序列的LCDR3。
6.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中：
a)所述重链可变区包括包含SEQ ID NO:1的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:2的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:3的序列的HCDR3；并且所述轻链可变区包括包含SEQ ID NO:4的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:5的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:6的序列的LCDR3；
b)所述重链可变区包括包含SEQ ID NO:11的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:12的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:13的序列的HCDR3；并且所述轻链可变区包括包含SEQ ID NO:14的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:15的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:16的序列的LCDR3；
c)所述重链可变区包括包含SEQ ID NO:21的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:22的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:23的序列的HCDR3；并且所述轻链可变区包括包含SEQ ID NO:24的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:25的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:26的序列的LCDR3；
d)所述重链可变区包括包含SEQ ID NO:31的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:32的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:33的序列的HCDR3；并且所述轻链可变区包括包含SEQ ID NO:34的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:36的序列的LCDR3；
e)所述重链可变区包括包含SEQ ID NO:114的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:115的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:116的序列的HCDR3；并且所述轻链可变区包括包含SEQ IDNO:117的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:118的序列的LCDR3；
f)所述重链可变区包括包含SEQ ID NO:119的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:115的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:120的序列的HCDR3；并且所述轻链可变区包括包含SEQ IDNO:121的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:118的序列的LCDR3；
g)所述重链可变区包括包含SEQ ID NO:119的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:115的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:120的序列的HCDR3；并且所述轻链可变区包括包含SEQ IDNO:122的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:118的序列的LCDR3；
h)所述重链可变区包括包含SEQ ID NO:123的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:115的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:124的序列的HCDR3；并且所述轻链可变区包括包含SEQ IDNO:125的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:118的序列的LCDR3；
i)所述重链可变区包括包含SEQ ID NO:114的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:115的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:116的序列的HCDR3；并且所述轻链可变区包括包含SEQ IDNO:117的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:118的序列的LCDR3；
j)所述重链可变区包括包含SEQ ID NO:119的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:
115的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:120的序列的HCDR3；并且所述轻链可变区包括包含SEQ ID NO:121的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:118的序列的LCDR3；或
k)所述重链可变区包括包含SEQ ID NO:119的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:115的序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:120的序列的HCDR3；并且所述轻链可变区包括包含SEQ IDNO:122的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:118的序列的LCDR3。
7.根据前述权利要求中任一权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含选自由以下组成的群组的序列：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:27、SEQID NO:37、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133和SEQ ID NO:134，和与其具有至少80％序列一致性但仍保持与gremlin的特定结合特异性或亲和力的同源序列。
8.根据前述权利要求中任一权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含选自由以下组成的群组的序列：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:28、SEQID NO:38、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136和SEQ ID NO:137，和与其具有至少80％序列一致性但仍保持与gremlin的特定结合特异性或亲和力的同源序列。
9.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：
a)包含SEQ ID NO:7的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:8的序列的轻链可变区；或
b)包含SEQ ID NO:17的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:18的序列的轻链可变区；或
c)包含SEQ ID NO:27的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:28的序列的轻链可变区；或
d)包含SEQ ID NO:37的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:38的序列的轻链可变区；或
e)包含SEQ ID NO:126的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:127的序列的轻链可变区；或
f)包含SEQ ID NO:128的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:129的序列的轻链可变区；或
g)包含SEQ ID NO:128的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:130的序列的轻链可变区；或
h)包含选自由SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:45组成的群组的序列的重链可变区，和包含选自由SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:49组成的群组的序列的轻链可变区；或
i)选自由以下组成的群组的一对重链可变区和轻链可变区序列：SEQ ID NO:41/47、41/49、43/47、43/49、45/47和45/49；或
j)包含选自由SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:57组成的群组的序列的重链可变区，和包含选自由SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:61组成的群组的序列的轻链可变区；或
k)选自由以下组成的群组的一对重链可变区和轻链可变区序列：SEQ ID NO:51/59、51/61、53/59、53/61、55/59、55/61、57/59和57/61；或
l)包含选自由SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133和SEQ ID NO:134组成的群组的序列的重链可变区，和包含选自由SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136和SEQ ID NO:137组成的群组的序列的轻链可变区；或
m)选自由以下组成的群组的一对重链可变区和轻链可变区序列：SEQ ID NO:131/135、131/136、131/137、132/135、132/136、132/137、133/135、133/136、133/137、134/135、134/136和134/137。
10.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含一个或多个氨基酸残基取代或修饰，但仍保持与hGREM1的特定结合特异性或亲和力。
11.根据权利要求10所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述取代或修饰中的至少一者在所述VH或VL序列的一个或多个CDR序列中，和/或在一个或多个非CDR区中。
12.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含免疫球蛋白恒定区，任选地人类IgG的恒定区。
13.根据权利要求12所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述恒定区包含人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区，并且任选地所述恒定区包括包含SEQ ID NO:138的序列的重链恒定区和/或包含SEQ ID NO:139的序列的轻链恒定区。
14.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其为人源化的或嵌合的。
15.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其为双功能抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双功能抗体(ds双功能抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双功能抗体)、多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体和二价结构域抗体。
16.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其为双特异性的。
17.根据权利要求16所述的抗体或其抗原结合片段，其能够与gremlin的第一和第二表位特异性结合，或能够与hGREM1和第二抗原两者特异性结合。
18.根据权利要求17所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗原包含免疫相关靶标。
19.根据权利要求18所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗原包含PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、TIM-3、LAG3、A2AR、CD160、2B4、TGFβ、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、OX40、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD47、CD122、ICAM-1、IDO、NKG2C、SLAMF7、SIGLEC7、NKp80、CD160、B7-H3、LFA-1、1COS、4-1BB、GITR、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、CD3、CD16或CD83。
20.根据权利要求17所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗原包含肿瘤抗原。
21.根据权利要求20所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述肿瘤抗原包含肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原。
22.根据权利要求20所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述肿瘤抗原包含前列腺特异性抗原(PSA)、CA-125、神经节苷脂G(D2)、G(M2)和G(D3)、CD20、CD52、CD33、Ep-CAM、CEA、铃蟾素样肽、HER2/neu、表皮生长因子受体(EGFR)、erbB2、erbB3/HER3、erbB4、CD44v6、Ki-67、癌症相关粘蛋白、VEGF、VEGFR(例如，VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3)、雌激素受体、Lewis-Y抗原、TGFβ1、IGF-1受体、EGFα、c-Kit受体、转铁蛋白受体、紧密连接蛋白18.2、GPC-3、Nectin-4、ROR1、间皮素、PCMA、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5、BCR-ABL、E2APRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、IL-2R、CO17-1A、TROP2或LIV-1。
23.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其对小鼠gremlin1不具有交叉反应性。
24.根据权利要求1至22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其对小鼠gremlin1具有交叉反应性。
25.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其与一个或多个结合部分连接。
26.根据权利要求25所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述结合部分包含清除调节剂(clearance-modifying agent)、化学治疗剂、毒素、放射性同位素、镧系元素、发光标记、荧光标记、酶-底物标记、DNA烷基化剂、拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白结合剂或其它抗癌药物，例如雄激素受体抑制剂。
27.一种抗体或其抗原结合片段，其与根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段竞争结合于hGREM1。
28.一种药物组合物或试剂盒，其包含根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的载体。
29.根据权利要求28所述的药物组合物或试剂盒，其进一步包含第二治疗剂。
30.一种分离的多核苷酸，其编码根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
31.一种载体，其包含根据权利要求30所述的分离的多核苷酸。
32.一种宿主细胞，其包含根据权利要求31所述的载体。
33.一种表达根据权利要求1至27中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在表达根据权利要求31所述的载体的条件下培养根据权利要求32所述的宿主细胞。
34.一种治疗受试者的GREM1相关疾病或病状的方法，或一种抑制有需要的受试者的FGFR1活化的方法，或一种治疗由GREM1介导的与FGFR1活化相关的疾病或病状的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至27中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求28至29中任一项所述的药物组合物。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述GREM1相关疾病或病状选自由以下组成的群组：癌症、纤维化疾病、血管生成、青光眼或视网膜疾病、肾病、肺动脉高血压或骨关节炎(OA)，或所述GREM1相关疾病或病状与GREM1的含量增加相关，其选自由以下组成的群组：硬皮病、特发性肺纤维化、糖尿病性肾病变、IgAN、狼疮肾炎、奥尔波特综合症、神经胶质瘤、头颈癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、食道癌、膀胱癌、乳癌和结肠直肠癌。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述癌症为表达GREM1的癌症，任选为表达PD-L1的癌症或不为表达PD-L1的癌症，且进一步任选地对用PD-1/PD-L1轴抑制剂的治疗具有抗性或难治性。
37.根据权利要求34所述的方法，其中所述受试者鉴别为具有表达GREM1的癌细胞，或在癌症微环境中具有GREM1表达。
38.根据权利要求34至37中任一项所述的方法，其中所述癌症为实体肿瘤或血液癌。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述癌症为前列腺癌、胃-食道癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、肝癌、胰腺癌、乳癌、支气管癌、骨癌、肝脏和胆管癌症、卵巢癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、脊柱癌、脑癌、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、肛门癌、胃肠癌、皮肤癌、垂体癌、胃癌、阴道癌、甲状腺癌、神经胶母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓发育不良综合症、肉瘤、畸胎瘤、神经胶质瘤、腺癌、白血病(例如急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML))、淋巴瘤(例如霍奇金氏淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤(例如，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia；WM)))或骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤(MM))。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的群组：前列腺癌、胃癌、食道癌、胃食管结合部癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、肝癌、结肠癌、结肠直肠癌、神经胶质瘤、胰腺癌、膀胱癌、乳癌和多发性骨髓瘤。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述癌症为前列腺癌、乳癌或肝癌。
42.根据权利要求40所述的方法，其中所述乳癌为三阴性乳癌。
43.根据权利要求40所述的方法，其中所述癌症为食道癌，任选地对用PD-1/PD-L1轴抑制剂的治疗具有抗性或难治性，并且进一步任选地对用抗PD-1抗体(例如，纳武利尤单抗)的治疗具有抗性或难治性。
44.根据权利要求35所述的方法，其中所述纤维化疾病为肺、肝脏、肾脏、眼睛、皮肤、心脏、肠道或肌肉中的纤维化疾病。
45.根据权利要求34所述的方法，其中所述受试者为人类。
46.根据权利要求34所述的方法，其中所述施用是经由口、鼻、静脉内、皮下、舌下或肌肉内施用。
47.根据权利要求34至46中任一项所述的方法，其进一步包括施用治疗有效量的第二治疗剂。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述第二治疗剂包含抗癌疗法，任选地所述抗癌疗法选自化学治疗剂(例如，顺铂)、放射疗法、免疫治疗剂(例如免疫检查点调节剂，例如PD-1/PD-L1轴抑制剂、TGF-β抑制剂)、抗血管生成剂(例如，如VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3的VEGFR的拮抗剂)、靶向疗法药剂、细胞疗法药剂、基因疗法药剂、激素疗法药剂、细胞因子、姑息治疗、用于治疗癌症的手术(例如，肿瘤切除术)、一种或多种抗呕剂、由化学疗法引起的并发症的治疗、癌症患者的饮食补充剂(例如，吲哚-3-甲醇)、调节肿瘤微环境的药剂(例如，包含PD-L1结合部分和TGF-β受体的胞外结构域的双功能分子)或抗纤维化疗法(例如，BMP7治疗、ACE抑制剂(或ARB)、抗MASP2抗体、内皮素受体拮抗剂、NRF2抑制剂类固醇、CTLA4-IgG或TNF抑制剂)。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述抗癌疗法包含抗前列腺癌药物。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述抗前列腺癌药物包含雄激素轴抑制剂；雄激素合成抑制剂；PARP抑制剂；或其组合。
51.根据权利要求50所述的方法，所述雄激素轴抑制剂选自由以下组成的群组：促黄体激素释放激素(LHRH)激动剂、LHRH拮抗剂和雄激素受体拮抗剂。
52.根据权利要求50所述的方法，其中所述雄激素轴抑制剂为地加瑞克、比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特、阿帕鲁胺、达洛鲁胺、恩杂鲁胺或阿比特龙。
53.根据权利要求50所述的方法，其中所述抗前列腺癌药物选自由以下组成的群组：乙酸阿比特龙、阿帕鲁胺、比卡鲁胺、卡巴他赛、康士得(比卡鲁胺)、达洛鲁胺、地加瑞克、多西他赛、艾利加德(乙酸亮丙瑞林)、恩杂鲁胺、艾利达(阿帕鲁胺)、费蒙格(地加瑞克)、氟他胺、乙酸戈舍瑞林、杰塔纳(卡巴他赛)、乙酸亮丙瑞林、鲁普隆(乙酸亮丙瑞林)、鲁普隆贮存型(乙酸亮丙瑞林)、利普卓(奥拉帕尼)、盐酸米托蒽醌、尼兰得隆(尼鲁米特)、尼鲁米特、努贝卡(达洛鲁胺)、奥拉帕尼、普洛韦格(西普亮塞-T)、镭223二氯化物、鲁布拉卡(樟脑磺酸卢卡帕尼)、樟脑磺酸卢卡帕尼、西普亮塞-T、克癌易(多西他赛)、多菲戈(镭223二氯化物)、安可坦(恩杂鲁胺)、诺雷德(乙酸戈舍瑞林)和泽替加(乙酸阿比特龙)。
54.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至27中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
55.一种检测样品中gremlin的存在或量的方法，其包括使所述样品与根据权利要求1至27中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触，和测定所述样品中gremlin的存在或量。
56.根据权利要求1至27中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制造用于治疗受试者的GREM1相关疾病或病状的药剂中的用途。
57.根据权利要求56所述的用途，其中所述GREM1相关疾病或病状为癌症。
58.根据权利要求56所述的用途，其中所述GREM1相关疾病或病状为纤维化疾病、血管生成、青光眼、视网膜疾病、肾病、肺动脉高血压或骨关节炎(OA)。
59.一种治疗可受益于增加BMP7活性或降低gremlin介导的对BMP7活性的抑制的疾病的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至27中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求28至29中任一项所述的药物组合物。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述疾病为纤维化疾病和/或肾病。
61.根据权利要求59所述的方法，其中所述疾病选自由以下组成的群组：局部缺血再灌注损伤、缺血性急性肾衰竭、免疫球蛋白A肾病变、狼疮肾炎、奥尔波特综合症、糖尿病性肾病变和高血压肾硬化、肾纤维化、慢性肾病、急性肾病和高血压肾硬化。
62.一种增加有需要的受试者的BMP7治疗的功效的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至27中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求28至29中任一项所述的药物组合物。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述受试者被诊断患有纤维化疾病和/或肾病且正经受BMP7治疗。
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