CN117801109A - iPS诱导定向分化成内皮祖细胞的方法及应用 - Google Patents
iPS诱导定向分化成内皮祖细胞的方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117801109A CN117801109A CN202410231405.XA CN202410231405A CN117801109A CN 117801109 A CN117801109 A CN 117801109A CN 202410231405 A CN202410231405 A CN 202410231405A CN 117801109 A CN117801109 A CN 117801109A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cells
- differentiation
- monoclonal antibody
- reprogramming
- endothelial progenitor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title claims abstract description 37
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 30
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 title claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 51
- 102100038367 Gremlin-1 Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 101001032872 Homo sapiens Gremlin-1 Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 20
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 18
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 16
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 16
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 claims description 14
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 8
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims description 8
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 claims description 8
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000007747 plating Methods 0.000 claims description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 19
- AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N CT 99021 Chemical compound CC1=CNC(C=2C(=NC(NCCNC=3N=CC(=CC=3)C#N)=NC=2)C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)=N1 AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 9
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 31
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 21
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 10
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 10
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 8
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 6
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 229940072107 ascorbate Drugs 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 2
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 2
- 101001139134 Homo sapiens Krueppel-like factor 4 Proteins 0.000 description 2
- 101000984042 Homo sapiens Protein lin-28 homolog A Proteins 0.000 description 2
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 2
- 101000851007 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 2 Proteins 0.000 description 2
- 102100020677 Krueppel-like factor 4 Human genes 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- 108010028554 LDL Cholesterol Proteins 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- -1 NANOG Proteins 0.000 description 2
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 2
- 102100025460 Protein lin-28 homolog A Human genes 0.000 description 2
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 2
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 2
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000008458 response to injury Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 210000004026 tunica intima Anatomy 0.000 description 2
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 2
- 230000004218 vascular function Effects 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 206010048554 Endothelial dysfunction Diseases 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 239000012098 Lipofectamine RNAiMAX Substances 0.000 description 1
- 101100445364 Mus musculus Eomes gene Proteins 0.000 description 1
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 1
- 102000008730 Nestin Human genes 0.000 description 1
- 108010088225 Nestin Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 208000031481 Pathologic Constriction Diseases 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000931888 Pyxis Species 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100445365 Xenopus laevis eomes gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002399 angioplasty Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000001168 carotid artery common Anatomy 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000003205 diastolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 230000004528 endothelial cell apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000008694 endothelial dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 150000002614 leucines Chemical class 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001806 memory b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 210000005055 nestin Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000006548 oncogenic transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011555 rabbit model Methods 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007651 self-proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000036262 stenosis Effects 0.000 description 1
- 208000037804 stenosis Diseases 0.000 description 1
- 210000004003 subcutaneous fat Anatomy 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 210000000106 sweat gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000014723 transformation of host cell by virus Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及iPS诱导定向分化成内皮祖细胞的方法及应用。更具体的，本发明开发了针对GREM1的单克隆抗体G‑3D8，该单克隆抗体能够通过抑制GREM1进而有效的促进ips细胞的分化，并且采用单抗替换CHIR99021，表现出了更好的特异性抑制作用，避免了CHIR99021由于多靶点作用的副作用进而影响相应的分化促效果。
Description
技术领域
本申请涉及生物领域，具体的涉及iPS诱导定向分化成内皮祖细胞的方法及应用。
背景技术
动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是心脑血管疾病的主要病理基础。其发病机理的研究以往主要围绕三种学说：脂质浸润学说、血栓形成学说和损伤反应学说。随着研究的逐步深入，在损伤反应学说的基础上，明确提出“AS是一种炎症性疾病”。内皮细胞损伤、内皮功能障碍是动脉粥样硬化的始动因素：内皮细胞凋亡、血小板黏附聚集血栓形成、巨噬细胞黏附和侵入、平滑肌细胞的迁移和增殖最终引起靶血管的狭窄。其中心环节是低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)沉积在血管壁，随之氧化修饰，炎症细胞聚集、侵入和激活，导致动脉粥样硬化的产生。
内皮祖细胞（EPCs）是指出生后机体中存在的能特异性归巢于血管新生组织并分化成内皮细胞的一群干／祖细胞，具有自我增殖、定向归巢等特性。内皮祖细胞是血管内皮细胞的前体细胞，在生理和病理条件下能够修复损伤的血管内皮细胞，对维持血管内皮细胞的完整性极其重要。从成人外周血液中分离出具有分化为血管内皮细胞(ECs)潜能的前体细胞，并将它命名为内皮祖细胞(EPCs)。研究发现，EPCs参与出生后新生血管的形成，并在血管内膜完整性的动态维持和生理性重建中起重要作用。有学者发现冠心病病人循环中EPCs数量下降了近50%，迁移能力受损。一个针对循环EPCs、血管功能和心血管危险因素的研究提示：较之传统的心血管危险因素，循环EPCs水平是血管功能的一个更好的预告指标。随后，在小鼠、兔模型上证实了EPCs移植有利于损伤动脉内膜的修复，减少新内膜形成，揭开了细胞移植修复动脉内膜损伤、防治动脉粥样硬化及血管成型术后再狭窄的研究序幕。最近，研究发现EPCs移植可促进内膜剥脱兔颈总动脉的再内皮化并提高其内皮依赖性舒张功能。这些都预示了EPCs在动脉粥样硬化、心脑血管病的防治上将有广阔的临床应用前景。
EPC的来源与识别EPC存在于各种成年动物和人的骨髓和外周血中，主要存在于骨髓。在某些生理、病理状态下，EPC可从骨髓释放，并在外周血中运行。近几年，人们从脐带血中分离出EPC，并成功地诱导其分化为血管内皮细胞。但是内皮祖细胞（iEPC）的制备及获得还有些困难。急需采用新的方法才能获得大批量的内皮祖细胞用于研究。
已有文献报道，从脐血单个核细胞中可诱导出内皮细胞，因此本实验采用的是脐血单个核细胞。由于在脐血采集过程中可能有来自脐静脉壁上的内皮细胞混入脐血或脐血中已经存在成熟的内皮细胞，为此我们将得到的脐血单个核细胞在培养瓶中培养24小时以去除这些成熟内皮细胞。有实验证明，从脐血中提取的CD133+干/祖细胞在48小时内不会贴壁，贴壁法可以去除单核巨噬细胞、人脐静脉内皮细胞。脐血单个核细胞包含许多细胞成分，既有造血的成体干细胞也有非造血的成体干细胞。据文献报道，有人从造血干细胞中诱导出内皮细胞，也有人从间充质干细胞中诱导出内皮细胞。培养板中贴壁的单个核细胞主要含有间充质干细胞，故推测内皮细胞可能由间充质干细胞诱导分化而成。此外，CN110438065A中公开了一种诱导人诱导性多能干细胞分化为内皮祖细胞的方法，第1阶段(分化的0-2天)敲低GREM1增加了hiPSCs向EPCs分化，其中敲低是采用siRNA的方法实现的，具体的是使用lipofectamine RNAi MAX转染试剂(Thermo Fisher Scientific)在mTeSR1培养基中转染相应的siRNA 7小时。该方法一方面受制于转染效率，另外一方面还依赖于siRNA的具体抑制效果，导致其抑制效果并不稳定，因此，开发稳定的抑制GREM1的抑制剂是重要的研究方向。
发明内容
本发明开发了一种新的GREM1抑制剂，所述抑制剂能够较好的抑制GREM1的活性，进而有效的与GREM1重组蛋白一起配合使用有效的促进IPS细胞诱导分化为内皮祖细胞。
一方面，本发明提供了一种特异性针对GREM1的单克隆抗体。
具体的，所述的特异性针对GREM1的单克隆抗体G-3D8，该单克隆抗体G-3D8通过测序，鉴定获得其重链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO:2所示。
具体的，通过亲和力测定，本发明的单克隆抗体G-3D8的亲和力为2.13×109M－1 ，亲和特性较好。
在一些实施方案中，本发明的重链可变区包含与选自 SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
( i ）包含选自 SEQIDNO :1的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成：或者
( ii ）包含与选自 SEQ ID NO :1的氨基酸序列相比具有1个或多个（优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个）的氨基酸改变（优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换）的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本发明的轻链可变区
i ）包含与选自 SEQ ID NO :2的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
ii )包含选自 SEQ ID NO :2的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
( ii ）包含与选自 SEQ ID NO :2的氨基酸序列相比具有1个或多个（优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个）的氨基酸改变（优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换）的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
保守性氨基酸置换是优选的，即，例如，作为极性酸性氨基酸的天冬氨酸/谷氨酸；作为极性碱性氨基酸的赖氨酸/精氨酸/组氨酸；作为非极性或疏水性氨基酸的亮氨酸/异亮氨酸/甲硫氨酸/缬氨酸/丙氨酸/甘氨酸/脯氨酸；作为极性或不带电的亲水性氨基酸的丝氨酸/苏氨酸。保守性氨基酸置换还包括基于侧链的分组。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。例如，可以合理预期：将亮氨酸替换为异亮氨酸或缬氨酸、将天冬氨酸替换为谷氨酸、将苏氨酸替换为丝氨酸、或类似地将氨基酸替换为结构上相关的氨基酸将不会对得到的多肽的性质产生大的影响。可以通过测定多肽的比活性容易地确定氨基酸替换是否产生功能性抗体。
本发明的单克隆抗体(mAb)可以通过多种技术进行制备，包括常规单克隆抗体方法学，例如Kohler和Milstein,Nature,1975；256:495中所述的标准体细胞杂交技术。虽然优选体细胞杂交规程，但是原则上也可以使用制备单克隆抗体的其它方法，例如B淋巴细胞的病毒或致癌转化。用于制备杂交瘤的优选动物系统为鼠科动物系统。在小鼠中制备杂交瘤是非常完善的规程。分离用于融合的经免疫的脾细胞的免疫方案和技术是本领域已知的。融合配偶体(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合规程也是已知的。为表达抗体或其抗体片段，可以通过标准分子生物学技术(例如PCR扩增或使用表达目标抗体的杂交瘤的cDNA克隆)获得编码部分或全长轻链和重链的DNA，并且可以将DNA插入到表达载体中，从而使得目的基因与转录和翻译调控序列可操作的连接，转染宿主细胞进行表达，表达宿主优选真核表达载体，更优选哺乳动物细胞，例如CHO及其衍生细胞系。抗体可通过公知的技术，例如使用蛋白A或蛋白G的亲和层析纯化。随后或备选地，可将特异性抗原或其表位固定在柱上以通过免疫亲和层析而纯化免疫特异性抗体。
进一步的，本发明中涉及的皮肤成纤维细胞制备ips细胞的方法是本公司已经较为成熟的技术。已经在此前的发明专利中公开。进一步的，所述的重编程可以采用本领域较为成熟的重编程试剂盒转染获得。
本发明进一步的，还提供了一种促进ips细胞分化为内皮祖细胞（iEPC）的方法，所述方法包括使用针对GREM1的单克隆抗体G-3D8促进相应的分化效果。
进一步的，本发明还提供了一种促进ips细胞分化为内皮祖细胞（iEPC）的培养基，其中所述的培养基中含有本发明的针对GREM1的单克隆抗体G-3D8。
具体的，所述的培养基可以是DMEM/F12细胞培养基或者mTeSR1培养基。所述培养基均为市售的成熟的培养基。
进一步的本发明的提供了一种促进ips细胞分化为内皮祖细胞（iEPC）的方法，人ips细胞在mTeSR1培养基中维持培养，以80-90％的密度在基质胶包覆的六孔板种板，mTeSR1培养液中加入10μM Y27632。种板后24hr开始诱导分化，Day0在培养液中加入含有1-10μM G-3D8单抗和50-100mg/ml抗坏血酸的DMEM/F12培养基。分化第2天抽吸培养基，加入50-100mg/ml抗坏血酸DMEM/F12培养基。然后每天更换DMEM/F12培养基来维持细胞。在分化第5-8天加入重组蛋白GREM1，GREM1的加入浓度为0.1-1μg/ml，分化后第9天即可收获相应的内皮祖细胞。
进一步的，本发明的ips细胞是通过已经成熟的方法制备获得。具体的，将分离培养的皮肤成纤维细胞调整细胞数，电转缓冲液中加入Epi5TM Episomal iPSC 重编程试剂盒中的重编程因子，采用常规电转染细胞按2ml/孔接种于基质胶包被的6孔板中，置于培养箱中培养。并使用ReproTeSRTM重编程培养基隔天换液，转染后第8天，将细胞消化后重新接种在5代小鼠成纤维细胞制作的饲养层上，第18天，观察iPSCs可见典型的克隆，采用试剂盒检测干细胞多能性基因OCT4、SOX2、NANOG、KLF4和LIN28表达情况，将阳性ips克隆进行筛选后重新接种于基质胶包被的6孔板中，置于培养箱中培养，使用mTeSRTM培养基继续培养，筛选纯化后备用。
有益效果
本发明开发了一种通过ips细胞分化为内皮祖细胞的方法。更具体的，本发明开发了针对GREM1的单克隆抗体G-3D8，该单克隆抗体能够通过抑制GREM1进而有效的促进ips细胞的分化，并且采用单抗替换CHIR99021，表现出了更好的特异性抑制作用，避免了CHIR99021由于多靶点作用的副作用进而影响相应的分化促效果。
附图说明
图1 G-3D8单克隆抗体特异性鉴定结果图
图2 分化后的内皮祖细胞的细胞因子鉴定结果图
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本发明的具体实施例。虽然附图中显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
尽管本文使用了特定的术语，但它们仅用于一般性和描述性的意义，而不是为了限制的目的。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语 具有与本公开描述的主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
实施例1 GREM1的单克隆抗体的制备
将GREM1重组蛋白（H00026585-P01，Abnova）作为免疫原，免疫5周龄BALB/c小鼠（60μg/只）。初次免疫用同等剂量的弗式完全佐剂将蛋白充分乳化后，对小鼠进行腹腔注射。随后每次间隔2周后用不完全弗式佐剂乳化蛋白免疫小鼠。免疫4次后，用间接ELISA检测血清抗体效价，效价达到1:25600后进行冲击免疫50μg/只，3d后取脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，HAT培养基筛选。用ELISA方法筛选分泌抗GREM1蛋白特异性抗体的杂交瘤细胞株，并经3轮亚克隆最终获得阳性反应最强、稳定性最好的杂交瘤细胞G-3D8。
将建株的G-3D8杂交瘤细胞以106个细胞腹腔注射提前石蜡致敏的BALB/c小鼠制备单克隆抗体腹水，腹水12000rpm、离心6分钟，用1ml 移液枪将上清小心吸出，采用Protein G进行纯化，调整蛋白浓度为1mg/mL备用。用亚类鉴定试剂盒对单克隆抗体进行亚类鉴定，具体操作详见试剂盒说明书。
表1 单克隆抗体亚类鉴定
| 单克隆抗体 | IgA | IgM | IgG1 | IgG2a | IgG2b | IgG3 |
| G-3D8 | 0.034 | 0.040 | 0.773 | 0.051 | 0.028 | 0.012 |
亚类鉴定试剂盒检测结果显示：G-3D8单克隆抗体重链属于IgG1（见表1）。
实施例2 G-3D8单克隆抗体特异性鉴定
分别将GREM1重组蛋白和BSA蛋白对照进行SDS-PAGE,使用Pyxis ProteinTransfer Stack试剂盒快速转印NC膜,含5％脱脂奶的PBST室温封闭2h,PBST洗涤3次,分别加入1:4000稀释的G-3D8单抗,4℃过夜孵育,分别加入1:3000稀释的羊抗鼠-HRP、羊抗人IgG-HRP二抗,室温孵育2h,PBST洗涤6次,Beyo ECL Star显色液显色,超灵敏多功能成像仪观察并保存结果。结果如图1所示。
从图1可以看出，G-3D8单克隆抗体特异性的结合GREM1重组蛋白，而不结合对照的BSA蛋白，保持了较好的特异性。
实施例3 G-3D8单克隆抗体可变区序列鉴定以及亲和力分析
利用RNA提取试剂盒提取单克隆抗体杂交瘤细胞RNA，利用Oligo-dt或随机引物将其逆转录合成cDNA。抗体可变区基因采用套式PCR扩增。抗体可变区基因扩增的引物参照文献（Sequencing and cloning of antigen-specific antibodies from mouse memory Bcells）。以上述cDNA为模板，利用第一轮鼠源抗体IgG及κ轻链引物扩增抗体可变区基因，然后以第一轮产物为模板，利用第二轮鼠源抗体IgG及κ轻链引物扩增抗体可变区基因。PCR反应体系：PrimeSTAR Max Premix(2×)25 μL，P1和P2各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O补至50 μL。反应程序：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。
扩增完成后进行1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段。将回收的目的片段插入pMD-19 T载体中，进行序列测定。从杂交瘤细胞cDNA中扩增得到重链可变区(HV)和轻链可变区(LV)的PCR产物，与预期扩增产物大小一致；切胶回收后，克隆至pMD19-T载体测序。将测序结果与抗体基因库(IMGT)进行比对分析，单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区序列分别如SEQ ID NO：1和2所示。
利用间接ELISA方法测定纯化后抗体的亲和力,亲和力测定公式:K＝([Ag′]/[Ag]t-1)/2(n[Ab′]-[Ab]t),其中:[Ab′]表示抗原浓度为[Ag′]时OD＝1/2 ODmax对应的抗体摩尔浓度,[Ab]t表示抗原浓度为[Ag]t时OD＝1/2 ODmax对应的抗体摩尔浓度,n为抗原[Ag′]与[Ag]t间的稀释倍数。结果显示，单抗的亲和力为2.13×109M－1 。
实施例4 皮肤成纤维细胞制备ips细胞
本实施例所采用的方法是本公司已经成熟使用的技术，如在前专利公布的那样。取手术后分离的儿童包皮皮肤约0.3cm×0.3cm， 将其置于含有青霉素(100kU/L)和链霉素(100mg/L)的HBSS中反复漂洗后，去除皮下脂肪。在60mm培养皿中用眼科剪将皮肤剪成1mm2大小，置于含有青霉素(100kU/L)和链霉素(100mg/L)的DMEM/F12(1:1)液3ml 37℃下置于体积分数为5%的CO2、95%空气、饱和湿度孵箱中过夜。次日挑除汗腺腺体，待成纤维细胞生长明显时，吸弃旧培养液，用无Na+、Mg2+的HBSS洗2次，加入含有质量分数为0.25%胰酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)的D-Hank消化液约1ml 37℃下置于5%CO2、95%空气、饱和湿度条件下孵育2min，加入含10%胎牛血清的DMEM约2ml终止消化，1000r/min离心6min并收集细胞，用含胎牛血清(10%)、青霉素(100kU/L)和链霉素(100mg/L)的DMEM 分散细胞，细胞以1x104/ml接种4ml至25cm²的培养瓶中，在37℃、5%CO2、95%空气、饱和湿度条件下培养，经过连续5次传代培养后，可得到纯化的成纤维细胞。去少量细胞进行HE染色发现，细胞为长梭形，细胞核为淡蓝色，细胞浆为粉红色，通过染色体核型分析显示为46条染色体，鉴定制备获得了较为纯净的成纤维细胞。
将分离培养的皮肤成纤维细胞调整细胞数为1×106个，100μl电转缓冲液中加入3μl Epi5TM Episomal iPSC 重编程试剂盒中的重编程因子，采用常规电转染细胞按2ml/孔接种于基质胶包被的6孔板中，置于培养箱中培养。并使用ReproTeSRTM重编程培养基隔天换液，转染后第8天，将细胞消化后重新接种在5代小鼠成纤维细胞制作的饲养层上，第18天，观察iPSCs可见典型的克隆，采用试剂盒检测干细胞多能性基因发现OCT4、SOX2、NANOG、KLF4和LIN28均阳性表达，表明制备获得了ips细胞。将阳性ips克隆进行筛选后重新接种于基质胶包被的6孔板中，置于培养箱中培养，使用mTeSRTM培养基继续培养，筛选纯化后备用。
进一步的，为了检验ips细胞的活性，将制备的ips细胞体外悬浮培养形成EB，裂解细胞提取RNA，用于RT-PCR检测EB细胞基因表达量，结果显示，EB细胞的胚层分化基因外胚层Nestin、中胚层Eomes、内胚层AFP的表达水平均显著高于对照组ips细胞5倍以上（P<0.01），实验结果表明所建立的人ips细胞具有体外分化能力。
实施例5 ips细胞向内皮祖细胞（iEPC）的分化
CHIR99021对照组：实施例4制备的经鉴定的人ips细胞在mTeSRTM培养基中维持培养，以80-90％的密度在基质胶包覆的六孔板种板，mTeSRTM培养基中加入10μM Y27632。种板后24hr开始诱导分化，Day0在培养液中加入含有6μM CHIR99021和60mg/ml抗坏血酸的DMEM/F12培养基。分化第2天抽吸培养基，加入60mg/ml抗坏血酸DMEM/F12培养基。然后每天更换DMEM/F12培养基来维持细胞。在分化第5-8天加入重组蛋白GREM1，GREM1的加入浓度为0.25μg/ml，分化后第9天即可收获相应的内皮祖细胞。
单抗实验组：实施例4制备的经鉴定的人ips细胞在mTeSRTM培养基中维持培养，以80-90％的密度在基质胶包覆的六孔板种板，mTeSRTM培养基中加入10μM Y27632。种板后24hr开始诱导分化，Day0在培养液中加入含有6μM G-3D8单抗和60mg/ml抗坏血酸的DMEM/F12培养基。分化第2天抽吸培养基，加入60mg/ml抗坏血酸DMEM/F12培养基。然后每天更换DMEM/F12培养基来维持细胞。在分化第5-8天加入重组蛋白GREM1，GREM1的加入浓度为0.25μg/ml，分化后第9天即可收获相应的内皮祖细胞。
利用流式细胞仪鉴定分化后的内皮祖细胞中CD31/CD34和CD144/VEGFR2的双阳性率，结果如图2所示。
从图2可以看出，单抗实验组相比于CHIR99021对照组，其CD34/CD31双阳性细胞从(33.87±0.45)％提升到了(39.31±0.59)％；其CD144/VEGFR2双阳性细胞从(36.53±0.79)％提升到了(41.25±0.93)％。这也充分的说明，采用单抗替换CHIR99021，表现出了更好的特异性抑制作用，避免了CHIR99021由于多靶点作用的副作用进而影响相应的分化促效果。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (3)
1.一种特异性抑制GREM1的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体其重链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于促进ips细胞分化为内皮祖细胞的培养基中的用途，其特征在于：其中所述的ips细胞是从人皮肤成纤维细胞重编程后制备获得的；所述的重编程是采用Epi5TM Episomal iPSC 重编程试剂盒实现。
3.一种将ips细胞分化为内皮祖细胞的方法，其特征在于：所述方法包括将人ips细胞在mTeSRTM培养基中维持培养，以80-90％的密度在基质胶包覆的六孔板种板，mTeSRTM培养基中加入10μM Y27632；种板后24hr开始诱导分化，Day0在培养液中加入含有6μM G-3D8单抗和60mg/ml抗坏血酸的DMEM/F12培养基；分化第2天抽吸培养基，加入60mg/ml抗坏血酸DMEM/F12培养基；然后每天更换DMEM/F12培养基来维持细胞，在分化第5-8天加入重组蛋白GREM1，GREM1的加入浓度为0.25μg/ml，分化后第9天即可收获相应的内皮祖细胞；其中所述的单克隆抗体是权利要求1中所述的抗体，所述的ips细胞是是从人皮肤成纤维细胞重编程后制备获得的；所述的重编程是采用Epi5TM Episomal iPSC 重编程试剂盒实现。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410231405.XA CN117801109B (zh) | 2024-03-01 | 2024-03-01 | iPS诱导定向分化成内皮祖细胞的方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410231405.XA CN117801109B (zh) | 2024-03-01 | 2024-03-01 | iPS诱导定向分化成内皮祖细胞的方法及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117801109A true CN117801109A (zh) | 2024-04-02 |
| CN117801109B CN117801109B (zh) | 2024-05-03 |
Family
ID=90428497
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410231405.XA Active CN117801109B (zh) | 2024-03-01 | 2024-03-01 | iPS诱导定向分化成内皮祖细胞的方法及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117801109B (zh) |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101199550A (zh) * | 2007-11-16 | 2008-06-18 | 中国医学科学院血液学研究所 | 利用脐带或胎盘制备含有内皮祖细胞制剂的方法及其用途 |
| CN105189548A (zh) * | 2013-03-14 | 2015-12-23 | 瑞泽恩制药公司 | Grem1的人抗体 |
| US20180057580A1 (en) * | 2016-08-29 | 2018-03-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-gremlin-1 (grem1) antibodies and methods of use thereof for treating pulmonary arterial hypertension |
| CN110438065A (zh) * | 2019-07-25 | 2019-11-12 | 中山大学 | 一种诱导人诱导性多能干细胞分化为内皮祖细胞的方法 |
| WO2020179380A1 (ja) * | 2019-03-06 | 2020-09-10 | 公立大学法人名古屋市立大学 | 血管内皮前駆細胞の調製及び拡大培養 |
| CN112725261A (zh) * | 2021-01-19 | 2021-04-30 | 上海爱萨尔生物科技有限公司 | 多能干细胞分化培养内皮细胞的培养液及分化方法 |
| CN116848135A (zh) * | 2021-01-18 | 2023-10-03 | 苏州创胜医药集团有限公司 | 新颖的抗gremlin1抗体 |
| WO2023194584A1 (en) * | 2022-04-08 | 2023-10-12 | UCB Biopharma SRL | Combination of a gremlin-1 antagonist with a cytidine analogue or deoxycytidine analogue |
| CN116940380A (zh) * | 2021-03-11 | 2023-10-24 | 上海交通大学 | 使用grem1拮抗剂治疗疾病的方法 |
-
2024
- 2024-03-01 CN CN202410231405.XA patent/CN117801109B/zh active Active
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101199550A (zh) * | 2007-11-16 | 2008-06-18 | 中国医学科学院血液学研究所 | 利用脐带或胎盘制备含有内皮祖细胞制剂的方法及其用途 |
| CN105189548A (zh) * | 2013-03-14 | 2015-12-23 | 瑞泽恩制药公司 | Grem1的人抗体 |
| US20180057580A1 (en) * | 2016-08-29 | 2018-03-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-gremlin-1 (grem1) antibodies and methods of use thereof for treating pulmonary arterial hypertension |
| CN109641954A (zh) * | 2016-08-29 | 2019-04-16 | 里珍纳龙药品有限公司 | 抗-gremlin-1(grem1)抗体及其用于治疗肺动脉高血压的使用方法 |
| WO2020179380A1 (ja) * | 2019-03-06 | 2020-09-10 | 公立大学法人名古屋市立大学 | 血管内皮前駆細胞の調製及び拡大培養 |
| CN110438065A (zh) * | 2019-07-25 | 2019-11-12 | 中山大学 | 一种诱导人诱导性多能干细胞分化为内皮祖细胞的方法 |
| CN116848135A (zh) * | 2021-01-18 | 2023-10-03 | 苏州创胜医药集团有限公司 | 新颖的抗gremlin1抗体 |
| CN112725261A (zh) * | 2021-01-19 | 2021-04-30 | 上海爱萨尔生物科技有限公司 | 多能干细胞分化培养内皮细胞的培养液及分化方法 |
| CN116940380A (zh) * | 2021-03-11 | 2023-10-24 | 上海交通大学 | 使用grem1拮抗剂治疗疾病的方法 |
| WO2023194584A1 (en) * | 2022-04-08 | 2023-10-12 | UCB Biopharma SRL | Combination of a gremlin-1 antagonist with a cytidine analogue or deoxycytidine analogue |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| HAIXUAN CHEN等: "Stage-specific regulation of Gremlin1 on the differentiation and expansion of human urinary induced pluripotent stem cells into endothelial progenitors", 《JOURNAL OF CELLULAR AND MOLECULAR MEDICINE》, vol. 24, no. 4, 31 July 2020 (2020-07-31), pages 8018 - 8030 * |
| 张雪芳: "抗gremlin 1单克隆抗体的制备和初步鉴定——一种有望成为检测子宫内膜异位症的新标记物", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》, no. 05, 15 May 2014 (2014-05-15), pages 059 - 54 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117801109B (zh) | 2024-05-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Astaldi et al. | Human endothelial culture supernatant (HECS): a growth factor for hybridomas. | |
| Sallustio et al. | TLR2 plays a role in the activation of human resident renal stem/progenitor cells | |
| WO2006078034A1 (ja) | 心筋細胞への分化能を有する細胞 | |
| CA2212150C (en) | Monoclonal antibodies for human osteogenic cell surface antigens | |
| CA2323681C (en) | Development of human monoclonal antibodies and uses thereof | |
| CN113331176B (zh) | 一种脐带间充质干细胞冻存液 | |
| CN113331177B (zh) | 一种干细胞冻存液 | |
| CN106591372B (zh) | 延缓人源骨髓间充质干细胞体外培养导致衰老的方法 | |
| WO1996024848A9 (en) | Monoclonal antibodies for human osteogenic cell surface antigens | |
| CN111676187B (zh) | 分离的间充质干细胞群及其应用 | |
| Chang et al. | Umbilical cord Wharton’s jelly repeated culture system: a new device and method for obtaining abundant mesenchymal stem cells for bone tissue engineering | |
| CN117801109B (zh) | iPS诱导定向分化成内皮祖细胞的方法及应用 | |
| CN112126620B (zh) | 基因编辑提高脂肪干细胞分化效率的方法 | |
| Rebelatto et al. | Expression of cardiac function genes in adult stem cells is increased by treatment with nitric oxide agents | |
| JP2005507240A (ja) | 造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖または生存を支持し得るポリペプチドおよびそれをコードするｄｎａ | |
| JP2006523446A (ja) | 臍帯血由来内皮細胞におけるタンパク質発現 | |
| Orlik et al. | Modifications of hybridoma technology which improve the yield of monoclonal antibody producing cells | |
| Tani et al. | Focal adhesion kinase pp125 FAK is associated with both intercellular junctions and matrix adhesion sites in vivo | |
| CN113717929B (zh) | 含有基因编辑的脂肪干细胞的药物组合物 | |
| CN116375864A (zh) | 一种抗大熊猫amh单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用 | |
| Zhang et al. | Effects of RPE‑conditioned medium on the differentiation of hADSCs into RPE cells, and their proliferation and migration | |
| KR20130022691A (ko) | 줄기세포의 혈관계 또는 근육계 세포로의 분화유도 방법 | |
| CN113215197A (zh) | 基因编辑的干细胞在治疗疾病中的用途 | |
| CN112553156B (zh) | 一种有效提高骨髓间充质干细胞细胞因子生产的方法 | |
| CN117343190B (zh) | iPS诱导定向分化成心肌细胞的方法及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant |