CN112725261A - 多能干细胞分化培养内皮细胞的培养液及分化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多能干细胞分化培养内皮细胞的培养液及分化方法，其中分化方法包括：用内皮祖细胞诱导培养液对诱导多功能干细胞进行定向分化培养得到内皮祖细胞；将内皮祖细胞进行消化传代，用内皮细胞成熟培养液继续培养得到成熟的内皮细胞。本发明的分化方法取材方便，培养时间短，分化效率高，可由少量原材料获得大量产物，为内皮细胞的临床安全使用提供了有效的方法。

Description

多能干细胞分化培养内皮细胞的培养液及分化方法

技术领域

本发明属于干细胞治疗技术领域的干细胞分化技术，具体涉及一种多能干细胞分化培养内皮细胞的培养液及分化方法。

背景技术

内皮细胞，又称血管内皮细胞(Vascular Endothelial Cells，vEC)，是覆盖于血管内膜表面的单层扁平或多角形细胞，是维持血管内稳态、帮助血管内循环细胞和血管外临近细胞相互作用的细胞，更是形成心血管封闭管道系统的结构基础。内皮细胞可以调控多种生理过程，包括血栓形成和血小板粘附、免疫和炎症反应、血管舒张和血液流通等。内皮细胞失去功能后会引起许多血管疾病，包括高血压、冠状动脉疾病和糖尿病，以及非血管疾病，包括神经退行性病变和慢性炎症疾病，严重危害患者生命健康。因此，内皮细胞在血管再生(如替换功能受损的细胞)、组织工程(如通过移植手术替换受损组织)、疾病模型(单基因疾病如肺动脉高压和血友病)和相关疾病药物研发等方面具有重要作用。

作为缓解心血管疾病负担以及药物靶点研发的工具，内皮细胞具有巨大的潜力，尤其是病人来源的内皮细胞使个体化药物开发成为可能。来源于内皮活组织检测分离的原代内皮细胞(primary EC)在许多疾病模型中为EC功能病变的分子机制研究提供了有价值的信息，但其并不能应用于个体的细胞治疗，这主要受限于其获取困难、增殖次数有限以及异源性。因此，如何获得大量成熟的内皮细胞是目前基础研究甚至临床应用的前提。

研究发现，胚胎发育过程中细胞命运的决定由多种细胞因子和成形素共同完成，其中内皮细胞和造血细胞谱系存在共同的祖先细胞，即成血管祖细胞，它们共同来源于中胚层。中胚层极化会产生心血管系统的多种细胞，包括心肌细胞和心内膜、血管内皮细胞以及造血系统。这三种谱系细胞的分化受到谱系特异性的关键信号通路调控，包括血管内皮生长因子信号通路促进内皮细胞分化、WNT信号通路抑制剂促进心肌细胞分化。最初的研究也发现来源于胚胎小体的胚细胞集落形成细胞(BL-CFC)就是成血管细胞，在其中加入血管内皮细胞生长因子能产生胚细胞集落并表达某些内皮细胞和造血干细胞标志物(如VEGFR2、CD34和SCL)；而在这些胚细胞中进一步加入造血细胞或内皮细胞生长因子时就能产生原始的造血或内皮祖细胞。

而随着对细胞功能相关信号通路的研究，内皮细胞分化的方法逐渐被报道。最初Kaufman等人发现将hESCs共培养在滋养层上可以获得CD34+造血内皮祖细胞(HEPs)，分选后的HEPs在内皮细胞生长培养基中可以分化为内皮细胞。但由于分化效率低以及滋养层的使用使此种方法获得的细胞不适合于临床应用。因此，3D拟胚体(EB)和2D单层细胞诱导法被进一步报道。这两种方法都是通过激活WNT信号通路诱导中胚层细胞形成，再添加VEGF因子诱导向内皮细胞分化。

除WNT信号通路激活剂和VEGF外，还有一些信号通路如Hedgehog、bFGF和BMP对于血管发育起重要作用。研究发现，激活Hedgehog通路可以诱导中胚层细胞的形成；Hedgehog通路继而激活其下游的BMP蛋白，BMP蛋白可进一步有效地诱导中胚层细胞及内皮前体细胞的形成；其中，BMP信号通过识别VEGF受体(Flk-1，又称VEGFR2)，使下游VEGF信号激活，尤其是VEGFA与酪氨酸激酶受体VEGFR2的结合激活下游级联反应，促进内皮细胞的分化。另有研究发现，抑制MEK/ERK信号通路也可以提高内皮细胞分化的效率和产量。

实验数据表明，内皮细胞的分化受一些关键因子的调控：在3D培养的细胞球中加入TGF-β信号家族相关因子如激活素A(Activin A)或骨形成蛋白4(BMP4)以及DKK1(Dickkopf related protein 1)可以促进中胚层细胞的分化；在2D培养的细胞中加入BMP4可以提高WNT信号激活剂的作用。例如，通过添加BMP4调控WNT信号可以将内皮细胞诱导分化率从2～15％提高到25～40％。

另外，一些生长因子或小分子如蛋白激酶A激活剂可以促进VEGF的作用，研究发现通过添加小分子激活WNT信号的同时促进cAMP作用可以产生20～80％的内皮细胞分化率。还有研究发现TGF-β抑制剂在中胚层向内皮细胞分化过程中可以提高VEGF的作用，尤其是高浓度的VEGF可以提高动脉标志物的表达。但目前的诱导方法均存在一定的局限性，如EB培养法的EC诱导产率和纯度低(这可能是由于细胞球内部与培养液和生长因子接触不充分造成的)、细胞球需机械分离获得单细胞而造成细胞死亡；2D培养不适宜大批量生产。总之，已有方法存在分化周期长(2～3周)、分化效率低(20～80％)、分化过程操作繁琐、分化因子多或有动物源性、分化得到的内皮细胞不成熟等问题，造成其应用存在一定的困难。

除高效的分化方法外，内皮细胞的分化还需要考虑一个重要的问题：原材料的来源。多能干细胞(hPSC)是一种具有无限自我更新和分化为其它体细胞潜能的细胞，可作为产生EC的细胞来源。目前分化为EC的hPSC主要为胚胎干细胞(hESCs)和诱导多功能干细胞(hiPSCs)，由于hESCs的使用存在伦理限制，所以hiPSCs可以作为EC分化应用的合适来源，并且可以将病人自身来源hiPSCs分化得到的EC用于个体化治疗。然而hiPSCs的使用需考虑细胞培养代次的影响，早期代次细胞具有高活率和增殖特性却可能存在外源基因的残留，晚期代次细胞又会降低分化的效率。所以，选择合适的供体细胞和细胞代次对于EC分化至关重要。

介于原代内皮细胞取材受限、胚胎干细胞使用受伦理道德约束，目前内皮细胞的分化效率较低、功能不全等原因，使得体外分离或诱导分化的内皮细胞在心血管疾病机制研究、组织工程、药物或靶点筛选以及临床细胞治疗等方面受到很大的限制。

发明内容

针对现有技术中由多功能干细胞诱导分化内皮细胞的方法中存在制备周期长、获得产率和纯度低、以及功能不全的技术问题，本发明提供一种多能干细胞分化培养内皮细胞的培养液及分化方法，通过对已有方法的改进，以及去除培养液中功能重复的成分并添加有效用的新分子或蛋白，高效诱导多能干细胞分化为功能完善的内皮细胞。经本发明的分化方法及其培养液获得的内皮细胞具有高纯度、高活率以及高扩增率，而且培养液无动物源性成分、分化方法简单方便，可由少量原材料获得大量产物，为内皮细胞的临床安全使用提供了有效的方法。

内皮祖细胞诱导培养液，所述内皮祖细胞诱导培养液成分包括：DMEM/F12基础培养液、人血清白蛋白(HSA)、谷氨酰胺(GlutaMAX)、非必需氨基酸(NEAA)、L-抗坏血酸(L-AA)，β--巯基乙醇(β-Mercaptoethanol，β-ME)以及激活剂、DNA甲基转移酶(DNAMethyltransferase)抑制剂、GSK-3β抑制剂和血管内皮生长因子。

所述人血清白蛋白(HSA)的浓度为1-10mg/mL，优选5mg/mL；所述谷氨酰胺(GlutaMAX)的浓度为1％；所述非必需氨基酸(NEAA)的浓度为1％；所述L-抗坏血酸浓度为0.10～1mmol/L，优选0.2mmol/L；所述β-巯基乙醇的浓度为5-10μmol/L，优选7μmol/L；所述激活剂的浓度为0.1-1mmol/L，优选0.5mmol/L；所述DNA甲基转移酶抑制剂的浓度为0.1-1μmol/L，优选0.5μmol/L；所述GSK-3β抑制剂的浓度为1-3μmol/L，优选2μmol/L；所述血管内皮生长因子浓度为5-25ng/mL，优选20ng/mL。

所述激活剂为双丁酰环磷酸腺苷(dibutyryl cAMP)，所述DNA甲基转移酶抑制剂为SGI-1027，所述GSK-3β抑制剂为CHIR99021，所述血管内皮生长因子为VEGF。所述激活剂的浓度为0.1-1mmol/L；所述DNA甲基转移酶抑制剂的浓度为0.1-1μmol/L；所述GSK-3β抑制剂的浓度为1-3μmol/L；所述血管内皮生长因子浓度为5-25ng/mL。

本发明还提供一种内皮细胞成熟培养液，所述内皮细胞成熟培养液成分包括：DMEM/F12基础培养液、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺溶液(ITS-X)、谷氨酰胺(GlutaMAX)、非必需氨基酸(NEAA)，L-抗坏血酸(L-AA)、β--巯基乙醇(β-Mercaptoethanol，β-ME)和血清替代物KnockOut^TM SR-Multi-Species(KOSR)。

所述内皮细胞成熟培养液中所述ITS-X的浓度为1％；所述谷氨酰胺(GlutaMAX)的浓度为1％；所述非必需氨基酸(NEAA)的浓度为1％；所述L-抗坏血酸浓度为0.10～1mmol/L，优选0.2mmol/L；所述β-巯基乙醇的浓度为5-10μmol/L，优选7μmol/L；所述血清替代物KOSR的浓度为5-10％，优选7％。

所述内皮祖细胞诱导培养液中的各组分可协同诱导诱导多功能干细胞定向分化为内皮细胞。其中DMEM/F12含有体积比为1:1的DMEM培养基和F12培养基，并添加人血清白蛋白(HSA)、谷氨酰胺(GlutaMAX)、非必需氨基酸(NEAA)作为基础培养基，谷氨酰胺作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢；非必需氨基酸NEAA、β-Mercaptoethanol为培养细胞所需的营养物质。所述激活剂cAMP可以激活蛋白激酶A(PKA)，促进凝血和炎症相关因子如von willebrand因子(VWF)的分泌，而VWF作为Weibel Palade小体(血管内皮细胞中的囊泡)的重要组成成分，能够有效提高向内皮细胞转化的效率。所述DNA Methyltransferase抑制剂选用SGI-1027，DNA甲基转移酶(DNA MTase)是一类催化甲基转移到DNA的酶。DNA甲基化具有广泛的生物学功能。所有已知的DNA甲基转移酶均以s-腺苷蛋氨酸(SAM)为甲基供体。DNA Methyltransferase抑制剂抑制了DNAMethyltransferase的活性，从而终止了DNA的甲基化。SGI-1027可以明显增加血管粘附因子(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1)及细胞粘附分子(intercellular celladhesion molecule-1,ICAM-1)的基因表达水平，诱导内皮细胞的激活。所述GSK-3β抑制剂选用CHIR99021，CHIR99021通过有效地抑制GSK-3β的活性，避免β-catenin被GSK-3β磷酸化，增加胞内游离的β-catenin，随后积累的β-catenin转位到细胞核内并在TCF/LEF转录因子的相互作用下激活下游靶基因转录，此过程模仿Wnt/β-catenin信号通路。内皮祖细胞的分化依赖于β-catenin，因此CHIR99021可以促进内皮祖细胞的分化。所述血管内皮生长因子为VEGF，可促进向内皮祖细胞和内皮的分化，尤其是高浓度VEGF可以提高内皮细胞中动脉标志物的表达。

所述内皮细胞成熟培养液可促进内皮细胞进一步成熟，其中DMEM/F12含有体积比为1:1的DMEM培养基和F12培养基，并添加谷氨酰胺(GlutaMAX)、非必需氨基酸(NEAA)作为基础培养基，谷氨酰胺作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢；非必需氨基酸NEAA、β-Mercaptoethanol为培养细胞所需的营养物质；所述血清替代物KnockOut^TMSR-Multi-Species(KOSR)是一种成分更明确的、无FBS的培养基添加剂，更利于细胞的生长。

本发明还提供一种多能干细胞分化培养内皮细胞的分化方法，包括如下步骤：

步骤S1，用内皮祖细胞诱导培养液对诱导多功能干细胞进行定向分化培养得到内皮祖细胞；

步骤S2，将内皮祖细胞进行消化传代，用内皮细胞成熟培养液继续培养得到成熟的内皮细胞。

在本发明一较佳实施例中，

步骤S1，具体为，将贴壁培养的诱导多功能干细胞消化为单细胞，单细胞计数后，按照3～6万细胞/cm²优选4万细胞/cm²的密度接种于提前两小时经层粘连蛋白-521(Laminin-521)包被的培养板上，置于35～39℃优选37℃、3～7％优选5％CO₂条件下，用内皮祖细胞诱导培养液定向分化培养3天，定向分化培养期间每1～2天优选1天更换一次内皮祖细胞诱导培养液，在培养的前12～48小时，优选24小时添加ROCK抑制剂。

步骤S2，具体为，将步骤S1得到的内皮祖细胞消化后，按5～10万细胞/cm²优选7万细胞/cm²的密度的密度接种于提前两小时经经层粘连蛋白-521(Laminin-521)包被的培养板上，于35～39℃优选37℃、3～7％优选5％CO₂条件下，用内皮细胞成熟培养液继续培养4～6天，优选5天得到成熟的内皮细胞，继续培养期间每1～3天优选2天更换一次培养液。

步骤S1和步骤S2中对细胞消化时采用的消化酶可以使用Accutase或TrypLE，优选Accutase；

所述ROCK抑制剂使用Y27632，浓度为10μmol/L。

所述诱导多功能干细胞可以选择经外源质粒电化学转染或病毒转染而重编程获得的细胞，优选外源质粒电化学转染获得的细胞；

所述诱导多功能干细胞可以选择7～25代，优选8～15代，更优选12代无外源基因残留的细胞。

所述培养板使用无动物源性的层粘连蛋白(laminin)包被；

其中，laminin包被方法为使用平衡盐溶液(DPBS)稀释层粘连蛋白，按照1～3μg/cm²优选2μg/cm²的浓度于37℃条件包被1～3小时，优选2小时，经DPBS润洗1～3次，优选2次后用于细胞铺板。

由本发明的方法分化培养得到的内皮细胞经过细胞类型包括内皮细胞特征性蛋白表达，和细胞功能包括分化效率、细胞活率、增殖能力、体外血管形成实验和低密度脂蛋白摄取(Dil-ac-LDL uptake)鉴定后，即可超低温(液氮)储存或用于基础研究甚至临床使用。

本发明的积极进步效果在于：

首先，本发明培养液成分简单，配置方便，且不涉及动物源性成分，既能控制并减少成本，又对所分化内皮细胞的安全性有保证。

其次，培养方法高效可靠，通过改进的培养液，能够获得高产量、高纯度的成熟内皮细胞。

而且，本发明的分化方法与其它方法相比具有明显的优势，具体表现在：培养时间短(8天左右)，具有临床使用及时性；培养过程简单，只需更换两种分化培养基即可完成；培养效率高，可以获得30～40倍的分化效率；培养纯度高，具有95％以上的细胞纯度；功能完善，具有体外血管形成和低密度脂蛋白摄取能力；安全可靠，不仅所使用的原材料无外源基因残留，而且诱导过程清晰透明，以及诱导产物高纯度。

附图说明

图1为诱导多能干细胞的显微镜照片；

图2为实施例1～4所得的内皮祖细胞的显微镜照片；

图3为实施例1～4所得的内皮细胞的显微镜照片；

图4为实施例1～4所得的内皮细胞的特征性蛋白表达及纯度的鉴定结果对比图(流式细胞术)；

图5为实施例1得到的内皮细胞的特征性蛋白表达鉴定结果(免疫荧光染色)；

图6为实施例1得到的内皮细胞的特征性蛋白表达及纯度的鉴定结果(流式细胞术)；

图7为实施例1得到的内皮细胞的体外血管形成功能的鉴定显微镜照片；

图8为实施例1得到的内皮细胞的低密度脂蛋白摄取功能的鉴定显微镜照片。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1～4诱导多功能干细胞分化为内皮细胞

一、培养液

实施例1～4的培养液由细胞培养的两个阶段组成：内皮祖细胞诱导培养和内皮细胞成熟培养，培养基成分和比例如表1～2所示。

表1内皮祖细胞诱导培养液的成分及比例

表2内皮细胞成熟培养液的成分及比例

备注：上述培养基和各添加成分均可从市场购得

二、培养过程

实施例1～4分别使用表1和表2所示的对应的培养液按照以下步骤培养内皮细胞。

1.内皮祖细胞分化培养

细胞铺板前2～4小时进行培养板包被，具体步骤为：使用含钙镁离子的磷酸盐缓冲液(DPBS)稀释laminin，按照1～3μg/cm²优选2μg/cm²的浓度于37℃条件包被2小时，经无钙镁离子的磷酸盐缓冲液DPBS润洗3次后可用于细胞铺板。

单细胞铺板步骤为：弃掉培养于六孔板的诱导多功能干细胞(P12代)中的培养基，按照1～2mL/孔的体积使用DPBS洗涤，弃掉DPBS后加入0.5～1mL/孔的Accutase消化液，于37℃条件下放置2～4分钟。待细胞回缩成球或部分去贴壁，加入3～5倍体积的内皮祖细胞诱导培养液，并将其吹打成单细胞，收集于15mL离心管。使用200～300g转速离心3～5min，收集细胞沉淀。诱导多能干细胞的显微镜照片如图1所示。

细胞沉淀中加入3～5mL的内皮祖细胞诱导培养液，轻轻吹打混匀后吸取10μL进行单细胞计数。按照3～6万细胞/cm²优选4万细胞/cm²的密度，使用含有内皮祖细胞诱导培养液和ROCK抑制剂(10μmol/L)的混合物进行单细胞铺板。铺板后的细胞在37℃、5％CO₂条件下定向分化培养3天，得到内皮祖细胞。定向分化培养期间每天更换一次内皮祖细胞诱导培养液，只有在培养的前24小时添加ROCK抑制剂，在定向分化培养期间更换内皮祖细胞诱导培养液时，不再添加ROCK抑制剂。

2.内皮细胞成熟培养

细胞铺板前2～4小时进行培养板包被，具体步骤为：使用含钙镁离子的磷酸盐缓冲液(DPBS)稀释laminin，按照1～3μg/cm²优选2μg/cm²的浓度于37℃条件包被2小时，经无钙镁离子的磷酸盐缓冲液DPBS润洗2次后可用于细胞铺板。

传代步骤为：弃掉培养于6孔板的内皮祖细胞中的培养基，按照1～2mL/孔的体积使用DPBS洗涤，弃掉DPBS后加入0.5～1mL/孔的Accutase消化液，于37℃条件下放置2～4分钟。待细胞回缩成球或部分去贴壁，加入3～5倍体积的内皮细胞成熟培养液，并将其吹打成单细胞，收集于15mL离心管。使用300g转速离心3～5min，收集细胞沉淀。

细胞沉淀中加入3～5mL的内皮细胞成熟培养液，轻轻吹打混匀后吸取10μL进行单细胞计数。按照5～10万细胞/cm²优选7万细胞/cm²的密度，使用含有内皮细胞成熟培养液进行单细胞铺板。铺板后的细胞在37℃、5％CO₂条件下继续培养5天，得到成熟的内皮细胞。继续培养期间每1～3天优选2天更换一次培养液。

效果实施例1实施例1～4所得细胞的形态观察

在内皮祖细胞分化培养铺板前、和诱导分化后以及内皮细胞成熟阶段(5天)，将培养板置于显微镜下观察并拍照。

结果如图1、图2和图3所示：图1为诱导多功能干细胞，其具有典型的细胞形态，图2中A～D分别对应实施例1～4培养得到的内皮祖细胞的细胞形态图；图3中A～D分别对应实施例1～4培养得到的成熟内皮细胞的细胞形态图。由图1至图3可以看出实施例1诱导分化后的内皮祖细胞以及内皮细胞比实施例2～4诱导分化所得的细胞更均质。

效果实施例2实施例1～4所得的内皮细胞的特征性蛋白表达及纯度的鉴定结果对比图(流式细胞术)

实施例1～4所得内皮细胞流式细胞术检测。方法如下：

1)固定细胞

将培养于12孔板的内皮细胞使用1×DPBS(0.5mL/孔)润洗一次后加0.5～1mLAccutase消化液，置于37℃消化3～5分钟至细胞分离；然后加2～4倍量DPBS稀释消化液，200～300g转速离心并弃掉消化液和DPBS。细胞沉淀使用1mL 90％的冷甲醇固定。

2)一抗孵育

将细胞样本室温下300rcf离心2分钟，弃上清液。向细胞样本中加入5mL PBS，振荡混匀。300rcf离心3分钟，弃上清，加入FACS buffer，吹打混匀，使细胞浓度为2*107个/mL。向流式细胞仪专用管中分别加入50μL相应样本细胞。向样本细胞中加入50μL对应的一抗，吹打5次混匀，室温避光孵育30分钟(每10分钟震荡混匀一次)。向抗体孵育后的细胞中各加入2mL FACS buffer，使用漩涡混合器振荡混匀。一抗的种类及体积见表3。

表3抗体的种类及体积

备注：表3所述各物质均为市场上购得

3)二抗孵育

室温下300rcf离心2分钟。弃上清，向样本细胞中加入50μL对应的二抗，吹打5次混匀，室温避光孵育15分钟(根据一抗来源选择对应的二抗)。各加入300μL FACS buffer，使用漩涡混合器振荡混匀。选择对应的流式细胞仪通道检测每个标志物的阳性率。

图4为实施例1～4所得内皮细胞的CD31的流式细胞鉴定结果对比图，可知实施例1所得内皮细胞的特征性蛋白表达量在95％以上，表达量最高；实施例4所得内皮细胞的特征性蛋白表达量在1％左右，几乎不表达。

因此可以说明使用本发明的培养液，通过本发明的培养方法诱导分化所得的内皮细胞更均质，效率更高。

效果实施例3实施例1所得内皮细胞特征性蛋白表达的鉴定

实施例1所得内皮细胞进行免疫荧光染色和流式细胞术检测。

方法一：免疫荧光染色

1)固定细胞

取培养完成的12孔板，弃去培养液后，沿12孔板板壁缓缓加入1×PBS(pH7.4，下同，1mL/孔)，洗2次；然后沿板壁缓慢加入4％的PFA(多聚甲醛)(1mL/孔)，室温放置18分钟固定细胞，轻柔地吸去PFA，加入1×PBS洗3次(1mL/孔/次)。

2)一抗孵育

加入1％TritonX-100(0.5mL/孔)，于37℃孵育30分钟；吸去1％TritonX-100，然后加入5％的BSA(0.5mL/孔)封闭，于37℃孵育30分钟；吸去5％的BSA封闭液，然后直接向封闭液中加入一抗，于37℃孵育1小时，吸去一抗，加入1×PBS洗3次(1mL/孔/次)。一抗的种类及体积见表4。

3)二抗孵育

加入用1％BSA稀释(稀释比例1:200)后的二抗，37℃避光孵育30分钟后，吸去二抗，加入1×PBS洗3次(1mL/孔/次)，每次5分钟；然后加入用1×PBS配好的终浓度为1μg/mL的DAPI(0.5mL/孔)，染色3分钟，吸去DAPI，加入1×PBS洗2次(1mL/孔/次)；最后加入1×PBS(0.5mL/孔)，显微镜下观察并拍照处理。

表4抗体的种类及体积

备注：表4所述各物质均为市场上购得

图5为实施例1中CD144的免疫荧光鉴定图片，可知内皮细胞特征性蛋白表达量在90％以上。

方法二：流式细胞术

1)固定细胞

将培养于12孔板的多巴胺能祖细胞使用1×DPBS(0.5mL/孔)润洗一次后加0.5～1mL Accutase消化液，置于37℃消化3～5分钟至细胞分离；然后加2～4倍量DPBS稀释消化液，200～300g转速离心并弃掉消化液和DPBS。细胞沉淀使用1mL 90％的冷甲醇固定。

2)一抗孵育

将细胞样本室温下300rcf离心2分钟，弃上清液。向细胞样本中加入5mL PBS，振荡混匀。300rcf离心3分钟，弃上清，加入FACS buffer，吹打混匀，使细胞浓度为2*107个/mL。向流式细胞仪专用管中分别加入50μL相应样本细胞。向样本细胞中加入50μL对应的一抗，吹打5次混匀，室温避光孵育30分钟(每10分钟震荡混匀一次)。向抗体孵育后的细胞中各加入2mL FACS buffer，使用漩涡混合器振荡混匀。一抗的种类及体积见表5。

表5抗体的种类及体积

3)二抗孵育

室温下300rcf离心2分钟。弃上清，向样本细胞中加入50μL对应的二抗，吹打5次混匀，室温避光孵育15分钟(根据一抗来源选择对应的二抗)。各加入300μL FACS buffer，使用漩涡混合器振荡混匀。选择对应的流式细胞仪通道检测每个标志物的阳性率。

图6为实施例1中CD31和CD144的流式细胞鉴定结果，可知内皮细胞特征性蛋白表达量在95％以上。

上述结果表明：使用本发明的培养液，通过本发明的培养方法，由诱导多功能干细胞分化得到的细胞具有内皮细胞的特征性蛋白CD31和CD144的表达。dibutyryl cAMP、SGI-1027、CHIR99021、和VEGF的使用能够显著提高内皮细胞的分化效率。

效果实施例4实施例1所得内皮细胞的体外血管形成功能鉴定预先准备Matrigel包被的24孔板(0.3mL/孔)，于37℃包被1小时。

按照实施例1中传代扩增方法将内皮细胞分离成单细胞，以2～4万/孔的密度铺板在上述Matrigel包被的24孔板中，37℃、5％CO₂条件的孵箱培养1～2天，然后使用显微镜对细胞进行观察和拍照。

图7为实施例1所得内皮细胞的体外血管形成功能鉴定，图中可见所形成的血管样结构，表明使用本发明诱导培养基和分化方法可以获得具有血管形成功能的成熟内皮细胞。

效果实施例5实施例1所得内皮细胞的Dil-ac-LDL摄取功能鉴定

内皮细胞(P1代)铺板在laminin包被的12孔板中生长24小时，使第二天细胞密度达到60～80％。然后在培养液中加入终浓度为10μg/mL的Dil荧光标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL)，于37℃、5％CO₂条件培养箱孵育5小时。5小时后弃去培养液，DPBS润洗2～3次后加入4％PFA进行细胞固定，固定时间为18～30分钟。固定后的细胞使用DPBS覆盖，可以暂时保存于4℃冰箱或直接在荧光显微镜下进行拍照。

图8为实施例1所得内皮细胞的吸收LDL的结果，可以看到本发明的培养液和分化方法获得的内皮细胞具有LDL吸收能力，是内皮细胞成熟的功能标志。

以上实施例的数据结果表明：使用本发明的培养液和分化方法，可以在较短时间内获得由诱导多功能干细胞来源的成熟内皮细胞，此内皮细胞纯度好、活率高、功能完善，具有潜在的临床应用价值。

本方法可以看出，WNT信号通路和血管内皮生长因子可阶段性调控向内皮细胞的分化，而通过小分子化合物或信号通路激活剂/拮抗剂的联合使用更能增强上述分化进程。本发明的数据结果也证实添加物dibutyryl cAMP、SGI-1027、CHIR99021、和VEGF等的使用对内皮细胞分化效率的提升具有显著效果。

另外，本发明由诱导多功能干细胞诱导分化为内皮细胞，相比于其它方法，本技术还具有诸多优势。在原材料获取方面，诱导多功能干细胞可以无限复制，且没有像胚胎干细胞那样的伦理限制；而且体细胞可以从患者身上获取，分化为病人来源的内皮细胞用于个体化治疗。在分化方法方面，诱导过程耗时短、操作简单，可以快速获得所需细胞用于基础研究。在产物质量和功能方面，所获内皮细胞纯度和活率高，且具有成熟细胞的成管和LDL摄取能力，可以作为血管疾病研究很好地模型。除此之外，本发明培养液和分化方法所获内皮细胞产量高，能够满足药物或靶点筛选用途，且对于细胞临床转化应用具有很高的潜能。

Claims (10)

1.一种内皮祖细胞诱导培养液，其特征在于，所述内皮祖细胞诱导培养液成分包括：DMEM/F12基础培养液、人血清白蛋白、谷氨酰胺、非必需氨基酸、L-抗坏血酸，β--巯基乙醇以及激活剂、DNA甲基转移酶抑制剂、GSK-3β抑制剂和血管内皮生长因子。

2.如权利要求1所述内皮祖细胞诱导培养液，其特征在于，所述人血清白蛋白的浓度为1-10mg/mL，优选5mg/mL；所述谷氨酰胺的浓度为1％；所述非必需氨基酸的浓度为1％；所述L-抗坏血酸浓度为0.10～1mmol/L，优选0.2mmol/L；所述β-巯基乙醇的浓度为5-10μmol/L，优选7μmol/L；所述激活剂的浓度为0.1-1mmol/L，优选0.5mmol/L；所述DNA甲基转移酶抑制剂的浓度为0.1-1μmol/L，优选0.5μmol/L；所述GSK-3β抑制剂的浓度为1-3μmol/L，优选2μmol/L；所述血管内皮生长因子浓度为5-25ng/mL，优选20ng/mL。

3.如权利要求2所述内皮祖细胞诱导培养液，其特征在于，所述激活剂为双丁酰环磷酸腺苷，所述DNA甲基转移酶抑制剂为SGI-1027，所述GSK-3β抑制剂为CHIR99021，所述血管内皮生长因子为VEGF。

4.一种内皮细胞成熟培养液，其特征在于，所述内皮细胞成熟培养液成分包括：DMEM/F12基础培养液、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺溶液、谷氨酰胺、非必需氨基酸，L-抗坏血酸、β--巯基乙醇和血清替代物。

5.如权利要求4所述内皮细胞成熟培养液，其特征在于，所述内皮细胞成熟培养液中所述ITS-X的浓度为1％；所述谷氨酰胺的浓度为1％；所述非必需氨基酸的浓度为1％；所述L-抗坏血酸浓度为0.10～1mmol/L，优选0.2mmol/L；所述β-巯基乙醇的浓度为5-10μmol/L，优选7μmol/L；所述血清替代物KOSR的浓度为5-10％，优选7％。

6.一种多能干细胞分化培养内皮细胞的分化方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤S1，用权利要求1～3任一项所述的内皮祖细胞诱导培养液对诱导多功能干细胞进行定向分化培养得到内皮祖细胞；

步骤S2，将内皮祖细胞进行消化传代，用权利要求4～5任一项所述的内皮细胞成熟培养液继续培养得到成熟的内皮细胞。

7.如权利要求6所述的分化方法，其特征在于：

步骤S1，具体为，将贴壁培养的诱导多功能干细胞消化为单细胞，单细胞计数后，按照3～6万细胞/cm²优选4万细胞/cm²的密度接种于提前两小时经层粘连蛋白-521包被的培养板上，置于35～39℃优选37℃、3～7％优选5％CO₂条件下，用内皮祖细胞诱导培养液定向分化培养3天，定向分化培养期间每1～2天优选1天更换一次内皮祖细胞诱导培养液，在培养的前12～48小时，优选24小时添加ROCK抑制剂；

步骤S2，具体为，将步骤S1得到的内皮祖细胞消化后，按5～10万细胞/cm²优选7万细胞/cm²的密度的密度接种于提前两小时经经层粘连蛋白-521包被的培养板上，于35～39℃优选37℃、3～7％优选5％CO₂条件下，用内皮细胞成熟培养液继续培养4～6天，优选5天得到成熟的内皮细胞，继续培养期间每1～3天优选2天更换一次培养液。

8.如权利要求7所述的分化方法，其特征在于，步骤S1和步骤S2中对细胞消化时采用的消化酶使用Accutase或TrypLE，优选Accutase；

所述ROCK抑制剂使用Y27632，浓度为10μmol/L。

9.如权利要求6、7或8所述的分化方法，其特征在于，所述诱导多功能干细胞选择7～25代，优选8～15代，更优选12代细胞。

10.如权利要求9所述的分化方法，其特征在于，所述诱导多功能干细胞选择经外源质粒电化学转染或病毒转染而重编程获得的细胞，优选外源质粒电化学转染获得的细胞；

对细胞进行培养时的培养板使用层粘连蛋白包被，所述层粘连蛋白包被方法为：使用平衡盐溶液稀释层粘连蛋白，按照1～3μg/cm²优选2μg/cm²的浓度于37℃条件包被1～3小时，优选2小时，经平衡盐溶液润洗1～3次，优选2次后用于细胞铺板。

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