JPWO2008056779A1 - 霊長類動物胚性幹細胞の培養及び継代方法、並びにその分化誘導方法 - Google Patents
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Abstract
Description
ヒト胚性幹細胞は、生物及び医学分野における研究、並びに臨床の分野で極めて重要である。とりわけ再生医療や移植医療の分野における臓器作成における基礎的材料として安定的な供給が求められている。例えば、ヒト胚性幹細胞から作成された臓器および組織は移植・再生医療における使用のみならず、これまで実施が限られていたヒト臓器を用いた前臨床試験を可能にするものと期待されている。また、ヒト胚性幹細胞から様々な臓器を産生することができれば、その産生過程において薬理試験を実施することにより、胎児への薬剤の影響を推定することが可能となると考えられている。現在は、胎児(妊娠母体)に対する薬物等の毒性試験は倫理的観点から行われておらず、偶発例の蓄積のみが唯一のドラッグ・インフォメーションとなっているため、薬剤安全性に対する情報不足により危険な薬剤投与が見逃される恐れがある。しかしながら、ヒト胚性幹細胞から様々な臓器を産生することができれば、その産生過程において薬理試験を実施することにより、そのような危険性を回避することも可能となる。
このように、ヒト胚性幹細胞の樹立およびその安全な培養及び継代方法の確立は、臓器作成技術等の研究開発の進展を促し、移植・再生に関する医療の研究および応用、創薬等の医療産業並びに周産期医療の発展に大いに貢献することが期待される。
しかしながら、生体から得られた造血幹細胞(骨髄血、臍帯血など)は体外培養で増幅させることはほとんど不可能であるため、移植医療における使用量が限られており(一人のドナーからの検体は一人の患者にしか投与できないなど)、培養実験を含む基礎医学研究における使用は実質的に不可能である。また成熟血球に関しても、マウスなどの実験動物に比べて、大量検体の調製が難しい霊長類では基礎的研究が非常に遅れている。
そのようにして得られる赤血球等の血液細胞は、エイズやC型肝炎ウイルス等による汚染がなく、治療の安全性向上に有用である。さらに癌等における化学療法等により機能低下した免疫系の強化に、胚性幹細胞由来の好中球等を含む白血球を輸血することにより、院内感染等の問題を解決することもできる。また、血液細胞は、自然治癒力の強化にもつながるために、胚性幹細胞からの血液細胞の製造は医療に多大な利益を提供すると考えられる。
さらに、造血幹細胞は、それ自体移植に利用できるほか、血液細胞の生産にも利用可能である。しかしながら、無フィーダーにおける、ヒトを含む霊長類動物胚性幹細胞から血球細胞への分化誘導効率は充分に高くなく、産生される血球量も限られている。特に、造血幹細胞の産生効率は非常に低い(造血幹細胞の産生効率は5%程度)(非特許文献6)。しかも、充分量の血球細胞を確保するためには何十回、何百回という実験を繰り返して実施する必要があるが、従来の方法による分化誘導は一過性であり、これらの方法を、再生・移植医療に実際に応用することは不可能といってもよい。
本発明はまた、霊長類動物胚性幹細胞を効率よく、安全に血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、血液細胞、骨髄系細胞、造血幹細胞等に分化誘導する方法を提供することを目的としている。
さらに、本発明は、上記の方法で得られた血管内皮細胞、血液細胞、骨髄系細胞、造血幹細胞等を提供することを目的としている。
本発明のその他の目的は、明細書を通して明らかとなるであろう。
すなわち、本発明の要旨は、以下を含む。
〔1〕 霊長類動物胚性幹細胞の培養および継代方法であって、
(A)霊長類動物胚性幹細胞を、細胞外マトリックスでコートされた容器中、無フィーダーおよび無サイトカイン下、蛋白成分を含有する培地で培養するステップ、
(B)前記ステップ(A)で形成された胚性幹細胞のコロニーを細胞剥離剤の存在下、剥離するステップ、および
(C)前記ステップ(B)で得られた胚性幹細胞のコロニーを細胞外マトリックスでコートされた容器中、無フィーダーおよび無サイトカイン下、蛋白成分を含有する培地に播種するステップを含む方法。
〔2〕 ステップ(A)において、霊長類動物胚性幹細胞のコロニーの大きさが約2倍〜約4倍となるまで培養する、前記〔1〕記載の培養および継代方法。
〔3〕 ステップ(A)における蛋白成分が血清アルブミンである前記〔1〕又は〔2〕記載の培養および継代方法。
〔4〕 ステップ(B)における細胞剥離剤が、トリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼからなる群から選ばれた少なくとも1種類である、前記〔1〕〜〔3〕のいずれか1項記載の培養および継代方法。
〔5〕 ステップ(A)における細胞外マトリックスが、ヒトコラーゲン、ヒトラミニン、ヒトビトロネクチン、ヒトフィブロネクチンおよびヒト血清、並びにこれらの分解物およびこれら合成ペプチドからなる群から選ばれた1種類である、前記〔1〕〜〔4〕のいずれか1項記載の培養および継代方法。
〔6〕 (A)霊長類動物胚性幹細胞を、サイトカインの存在下、血清もしくは血清代替物を含むまたは無血清培地で浮遊培養し、胚葉体または胚葉体類似細胞凝集塊を製造するステップ、
(B)ステップ(A)で得られた胚葉体または胚葉体類似細胞凝集塊を、サイトカインの存在下、接着培養して浮遊細胞と接着細胞とを含む特定前駆細胞を製造するステップ、および
(C)ステップ(B)で得られた特定前駆細胞から浮遊細胞と接着細胞を分離するステップ、を含む霊長類動物胚性幹細胞からの血液細胞および/または血管内皮前駆細胞の製造方法。
〔7〕 ステップ(A)の培養を、胚葉体様細胞凝集体が形成されるまで行う、前記〔6〕に記載の霊長類動物胚性幹細胞からの血管内皮前駆細胞および/または血液細胞の製造方法。
〔8〕 サイトカインが、血管内皮成長因子(VEGF)、骨形成タンパク質4(BMP4)、幹細胞因子(SCF)、Flt3−リガンド(FL)、インターロイキン6(IL6)、インターロイキン3(IL3)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、巨核球増殖因子(TPO)、オンコスタチンM(OSM)、線維芽細胞成長因子2(FGF2)および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)からなる群より選ばれた少なくとも1種類である、前記〔6〕または〔7〕に記載の霊長類動物胚性幹細胞からの血管内皮前駆細胞および/または血液細胞の製造方法。
〔9〕 ステップ(C)において、特定細胞前駆細胞の接着細胞の分離に細胞剥離剤を用いる、前記〔6〕〜〔8〕のいずれか1項記載の霊長類動物胚性幹細胞からの血管内皮前駆細胞および/または血液細胞の製造方法。
〔10〕 細胞剥離剤がトリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼからなる群から選ばれた少なくとも1種類である、前記〔9〕記載の霊長類動物胚性幹細胞からの血管内皮前駆細胞および/または血液細胞の製造方法。
〔11〕 (A)霊長類動物胚性幹細胞を、サイトカインの存在下、血清もしくは血清代替物を含むまたは無血清培地で浮遊培養し、胚葉体または胚葉体類似細胞凝集塊を製造するステップ、
(B)ステップ(A)で得られた胚葉体または胚葉体類似細胞凝集塊を、サイトカインの存在下、接着培養して浮遊細胞と接着細胞を含む特定前駆細胞を製造するステップ、および
(C)ステップ(B)で得られた特定前駆細胞を、浮遊細胞を分離しながら培養するステップ、を含む霊長類動物胚性幹細胞からの血液細胞、骨髄系細胞、造血ストロマ細胞および/または造血幹細胞の製造方法。
〔12〕 ステップ(A)の培養を、胚葉体が形成されるまで行う、前記〔11〕に記載の霊長類動物胚性幹細胞からの血液細胞、骨髄系細胞、造血ストロマ細胞および/または造血幹細胞の製造方法。
〔13〕 サイトカインが、血管内皮成長因子(VEGF)、骨形成タンパク質4(BMP4)、幹細胞因子(SCF)、Flt3−リガンド(FL)、インターロイキン6(IL6)、インターロイキン3(IL3)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、巨核球増殖因子(TPO)、オンコスタチンM(OSM)、線維芽細胞成長因子2(FGF2)および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)からなる群より選ばれた少なくとも1種類である、前記〔11〕または〔12〕に記載の霊長類動物胚性幹細胞からの血液細胞、骨髄系細胞、造血ストロマ細胞および/または造血幹細胞の製造方法。
〔14〕 ステップ(C)において、特定細胞前駆細胞の接着細胞の分離に細胞剥離剤を用いる、前記〔11〕〜〔13〕のいずれか1項記載の霊長類動物胚性幹細胞からの血液細胞、骨髄系細胞、造血ストロマ細胞および/または造血幹細胞の製造方法。
〔15〕 細胞剥離剤がトリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼからなる群から選ばれた少なくとも1種類である、前記〔14〕記載の霊長類動物胚性幹細胞からの血液細胞、骨髄系細胞、造血ストロマ細胞および/または造血幹細胞の製造方法。
〔16〕 前記〔6〕〜〔10〕いずれか1項記載の製造方法により霊長類動物胚性幹細胞から分化誘導されてなる、実質的に単離された血管内皮前駆細胞。
〔17〕 前記〔6〕〜〔14〕いずれか1項記載の製造方法により霊長類動物胚性幹細胞から分化誘導されてなる、実質的に単離された血液細胞。
〔18〕 前記〔11〕〜〔14〕いずれか1項記載の製造方法により霊長類動物胚性幹細胞から分化誘導されてなる、実質的に単離された造血ストロマ細胞。
〔19〕 前記〔11〕〜〔14〕いずれか1項記載の製造方法により霊長類動物胚性幹細胞から分化誘導されてなる、実質的に単離された造血幹細胞。
〔20〕 前記〔11〕〜〔14〕いずれか1項記載の製造方法により霊長類動物胚性幹細胞から分化誘導されてなる、実質的に単離された骨髄系細胞。
〔21〕 前記〔16〕〜〔19〕いずれか1項記載の実質的に単離された血管内皮前駆細胞、血液細胞、造血ストロマ細胞または造血幹細胞を含有する組成物。
本発明によれば、血管内皮細胞、血液細胞等の「共通前駆細胞」としての「特定細胞前駆細胞」を安全かつ高効率で産生することができる。
また、本発明によれば、再生産性が高く安定した継代培養と凍結融解が可能である血管内皮細胞、血液細胞、造血幹細胞や骨髄系細胞等を大量生産することが可能となる。
さらに、本発明によれば、安全性の高い輸血用血液製剤(造血幹細胞移植、顆粒球輸血、骨髄系細胞投与などを含む)、血管損傷の治療や局所の血流の改善のための材料、他の様々な組織の再生促進を目的とした医療において臨床使用目的に適した材料としての各種細胞を容易に供給することができる。
さらに、本発明によれば、霊長類、特にヒト生体組織を正しく模倣(ミミック)した性質を持つ細胞群の大量提供を初めて可能するものである。これらの細胞は、薬剤効果判定試験や毒性試験にも適切に使用できるため、臨床医療のみならず医療産業の発展に大いに貢献しうる。
0102 造血幹細胞
0103 樹状細胞
0104 Tリンパ球前駆細胞
0105 T細胞
0106 Bリンパ球前駆細胞
0107 B細胞
0108 形質細胞
0109 NK前駆細胞
0110 NK細胞
0111 樹状細胞系前駆細胞
0112 樹状細胞
0113 肥満細胞系前駆細胞
0114 肥満細胞
0115 好塩基球系前駆細胞
0116 好塩基球
0117 好酸球系前駆細胞
0118 好酸球
0119 顆粒球マクロファージ系前駆細胞
0120 マクロファージ前駆細胞
0121 単球
0122 マクロファージ
0123 破骨細胞前駆細胞
0124 破骨細胞
0125 好中球前駆細胞
0126 好中球
0127 巨核球系前駆細胞
0128 巨核球
0129 血小板
0130 前期赤芽球系前駆細胞
0131 後期赤芽球系前駆細胞
0132 赤血球
0133 リンパ系幹細胞
0134 骨髄系幹細胞
0135 樹状細胞前駆細胞
本発明の、第一の態様である霊長類動物胚性幹細胞を未分化状態に維持して培養、継代するための方法は、以下の工程からなる。
(A)霊長類動物胚性幹細胞を、細胞外マトリックスでコートされた容器中、無フィーダーおよび無サイトカイン下、蛋白成分を含有する培地で培養するステップ、
(B)前記ステップ(A)で形成された胚性幹細胞のコロニーを細胞剥離剤の存在下、剥離するステップ、および
(C)前記ステップ(B)で得られた胚性幹細胞のコロニーを細胞外マトリックスでコートされた容器中、無フィーダーおよび無サイトカイン下、蛋白成分を含有する培地に播種するステップ。
本発明の上記方法は、本発明者らが、実験的に霊長類動物胚性幹細胞は、外部からの特定因子(フィーダー細胞が分泌する因子、および合成サイトカイン等)の補充なしに、未分化状態に維持する能力を有するとの知見を得たことに基づいている。このような知見に基づいて、適切な培地を選択し適切な手技で培養、継代を行うことにより、従来困難または不可能であった霊長類動物胚性細胞を、無フィーダー、無サイトカイン下で未分化状態に維持し、染色体異常等を引き起こすことなく、数十回以上という長期間にわたって安定に継代し続けることが可能となった。
また、特記しない限り、本発明に関して「霊長類動物胚性幹細胞」という語句は、未分化状態の霊長類動物胚性幹細胞を意味する。
また、ピペッティング操作など、細胞傷害を惹起する危険性がある操作や処理は極力省くことが好ましい。
霊長類動物胚性幹細胞を培養容器に播種する際の細胞密度は、細胞へのストレスを最小限にするよう、選択する。細胞密度の制御は、霊長類動物胚性幹細胞のコロニーの大きさと数を適切に選択することにより達成される。
霊長類動物胚性幹細胞の培養容器に播種する際のコロニーの大きさは、顕微鏡(倒立型位相差顕微鏡など)を用いた観察により確認するのが簡便であり実効性も高いが、他の方法(肉眼的観察、側方散乱光量の測定、溶液濁度の測定など)で確認してもよい。コロニーの大きさの最適値は個々の霊長類動物胚性幹細胞ごとに決定するものであるが、例えば、カクニイザル胚性幹細胞やヒト胚性幹細胞の場合は、直径が約100μm〜約2000μm、好ましくは約300μm〜約1000μm、より好ましくは500μm程度である。
細胞の剥離は、細胞に対するストレスをできるだけ少なくするような条件下で行うことが好ましい。剥離剤としては、トリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼからなる群から選ばれた少なくとも1種類が好ましく、ディスパーゼ単独またはディスパーゼと他の剥離剤との組み合わせが好ましい。また、市販の細胞剥離剤(霊長類動物胚性幹細胞用細胞剥離液(リプロセル社))等を使用することもできる。
好適な剥離方法(時間、温度、剥離剤の種類等)は個々の霊長類動物胚性幹細胞ごとに決定されるものであるが、例えば、後述の実施例1に示した方法が推奨される。例えば、カニクイザル胚性幹細胞の無フィーダー培養において、継代時の細胞剥離においては、コラゲナーゼ液(細胞膜蛋白を分解する可能性がある)よりも、細胞外マトリックスのみを分解するディスパーゼを使用すると、細胞ストレスが大幅に抑制でき、好ましいが、必ずしもこれに限定されない。
霊長類動物胚性幹細胞の培養容器に播種する際のコロニーの数(密度)に関する最適値は、個々の霊長類動物胚性幹細胞ごとに決定するものであるが、培養期間中にコロニー同志が決して融合することがない密度以下にする必要がある。例えば、カクニイザル胚性幹細胞やヒト胚性幹細胞の場合は、後述の実施例(特に実施例1〜3)に示した方法が推奨される。
また、本発明方法によれば合成サイトカイン等の添加物が不要であるため培養系が簡素化(シンプリファイ)され、分子レベルでの解析が容易になり、基礎研究の発展にとって大きなメリットとなる。また、培養の費用も大幅に節減することができる。
また本発明方法における培養操作は至極簡便なものであり、特殊器具や特殊技能を要さないことから、世界中のあらゆる施設ですぐに実施が可能である。即ち、本発明による霊長類動物胚性幹細胞の未分化維持培養方法は、「臨床医療」、「医療産業」、「基礎医学生物学研究」という3つの分野において、広範に実施可能であり、それらの発展に大いに寄与し得る。
他の態様において、本発明は霊長類動物胚性幹細胞から、無フィーダーで血液細胞、骨髄系細胞、血管内皮前駆細胞、ストロマ細胞、造血幹細胞等を製造する方法に関する。
(1)本発明の無フィーダーで血液細胞および/または血管内皮前駆細胞を製造する方法は以下の工程からなる。
(A)霊長類動物胚性幹細胞を、サイトカインの存在下、血清もしくは血清代替物を含むまたは無血清培地で浮遊培養し、胚葉体または胚葉体類似細胞凝集塊を製造するステップ、
(B)ステップ(A)で得られた胚葉体または胚葉体類似細胞凝集塊を、サイトカインの存在下、接着培養して浮遊細胞と接着細胞とを含む特定前駆細胞を製造するステップ、および
(C)ステップ(B)で得られた特定前駆細胞から浮遊細胞と接着細胞を分離するステップ。
(2)また、本発明の無フィーダーで血液細胞、造血ストロマ細胞および/または造血幹細胞を製造する方法は、以下の工程からなる。
(A)霊長類動物胚性幹細胞を、サイトカインの存在下、血清もしくは血清代替物を含むまたは無血清培地で浮遊培養し、胚葉体または胚葉体類似細胞凝集塊を製造するステップ、
(B)ステップ(A)で得られた胚葉体または胚葉体類似細胞凝集塊を、サイトカインの存在下、接着培養して浮遊細胞と接着細胞を含む特定前駆細胞を製造するステップ、および
(C)ステップ(B)で得られた特定前駆細胞を、浮遊細胞を分離しながら培養するステップ。
本発明方法に関して、血液細胞とは、血液細胞全般を称する。前記血液細胞としては、具体的には、例えば、図11に示される胚性幹細胞から血液細胞への分化系統図中における造血幹細胞0102、リンパ球系幹細胞0133、リンパ球系樹状細胞前駆細胞0135、リンパ球系樹状細胞0103、Tリンパ球前駆細胞0104、T細胞0105、Bリンパ球前駆細胞0106、B細胞0107、形質細胞0108、NK前駆細胞0109、NK細胞0110、骨髄系幹細胞0134、骨髄系樹状細胞前駆細胞0111、骨髄系樹状細胞0112、肥満細胞系前駆細胞0113、肥満細胞0114、好塩基球系前駆細胞0115、好塩基球0116、好酸球系前駆細胞0117、好酸球0118、顆粒球マクロファージ系前駆細胞0119、マクロファージ前駆細胞0120、単球0121、マクロファージ0122、破骨細胞前駆細胞0123、破骨細胞0124、好中球前駆細胞0125、好中球0126、巨核球系前駆細胞0127、巨核球0128、血小板0129、前期赤芽球系前駆細胞0130、後期赤芽球系前駆細胞0131、赤血球0132等が挙げられる。
また、前記「血液細胞」には、造血幹細胞の前駆細胞;造血幹細胞から最終的に末梢血に分化するまでの全ての分化のプロセス上に存在する血液細胞の全ての形態が含まれる。
また、前記「骨髄系細胞」として、骨髄芽細胞、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球、好中球、単球、マクロファージなどが挙げられる。
出発物質である霊長類胚性幹細胞の起源は特に限定されておらず、上記Iに記載の方法に従って継代維持され、要すれば凍結保存されている霊長類動物胚性幹細胞も使用することができる。
胚葉体または胚葉体類似の細胞凝集塊を形成する方法としては、慣例のハンギング・ドロップ法、慣例の非接着性培養皿を用いた培養、慣例の半固形培地を用いた培養などが挙げられるが、胚葉体または胚葉体類似の細胞凝集塊が形成される限り、これらに限定されない。
本発明方法に従い、胚葉体細胞をくずさずに、「最適化された分化培地」を用いてそのまま接着培養を行うと、極めて高い効率(血管内皮細胞、血球ともにほぼ100%の効率)で目的系列への分化制御が達成される。これは、動物個体の発生過程における「制御された分化」の維持が達成されていることを示すものである。
霊長類動物胚性幹細胞の培養条件は、胚性幹細胞に培養に適した条件であればよく、例えば、37℃、5体積%CO2の条件等が挙げられるが、適宜、酸素濃度の変更を行ってもよい。
本発明の、前記「霊長類動物胚性幹細胞の無フィーダーでの分化誘導方法」における培養条件は、用いられる霊長類動物胚性幹細胞の種類により適宜設定することができるが、例えば、37℃、5体積%CO2の条件等が挙げられる。
「特定前駆細胞」とは、浮遊細胞(培養液中に浮遊する性質を有する球状または球状に近い形状の細胞)と接着細胞(培養容器に接着する細胞)を含む、胚葉体または胚葉体類似の細胞凝集塊から分化した前駆細胞を意味する。これは、浮遊細胞としての球状細胞集団と接着細胞を含む嚢状構造物(内部に球状細胞集団を含有する)を形成する場合があるが、嚢状構造物は必ずしも形成されない。後述の実施例に記載の通り、胚葉体または胚葉体類似の細胞凝集塊を血清の存在下または非存在下、適当な条件下で培養することにより、嚢状構造物を含む、又は含まない、特定前駆細胞を形成することができる。浮遊細胞(球状細胞)は嚢状構造物が形成される場合、該構造物中のみならず培養液中に放出されて存在する。また、嚢状構造物が形成されない場合は培養液中に浮遊した状態で存在する。従って、本明細書中、「球状細胞」または「浮遊細胞」という語句は、広義には、両形態の細胞を意味する。
特定前駆細胞の浮遊細胞(球状細胞)から、主として血液細胞(骨髄系細胞にコミットメントされた造血前駆細胞および成熟血球など)を誘導することができ、接着細胞から主として血管内皮前駆細胞および造血ストロマ細胞を誘導することができる。なお造血幹細胞は浮遊細胞と接着細胞の両者から誘導される。
顕微鏡下での観察に基づく前駆細胞集団の同定は、(1)細胞に侵襲を与えることなくリアルタイムで細胞分化の状況をチェックすることができる、(2)顕微鏡下でのマイクロピペット操作により、目的とする前駆細胞集団に傷を与えることなく取り出す(マニピュレーション)ことができるという利点に加えて、特殊な設備や高価な試薬を必要としないため、feasibilityが高く、多くの施設ですぐに実施可能であるという優れた点を有する。
培養液中の浮遊細胞および嚢状構造物中の球状細胞を遠心等で分離する。嚢状構造物からの球状細胞の分離は、適当な方法で該嚢状構造物に開口部を設けて球状細胞を浮遊させることで行う。この操作は、嚢状構造物中に細胞が完全に充満する前に行うことが好ましい。なお、通常、嚢状構造物の開口部は培養により再度閉鎖され、その内部には球状細胞が充満してくる。
嚢状構造物が形成されない場合には、浮遊細胞と接着細胞を適宜分離する。
浮遊細胞の分離は遠心等で行う。一方、嚢状構造物から球状細胞を分離することなく、浮遊細胞を適宜放出させながら、嚢状構造物を含む接着細胞集団と浮遊細胞集団とを混合した状態で持続的に培養することにより、血液細胞とストロマ細胞を得ることができる。さらに継代を継続すると造血系幹細胞が得られる。生成されたストロマ細胞または造血系幹細胞の形成は、それぞれの細胞マーカーの検出により確認することができる。そのようなマーカーは当業者にとって概ね既知である。
本発明は、「造血ストロマ細胞」の胚性幹細胞からの産生方法を初めて提供するものである。また本発明により産生された造血幹細胞は浮遊細胞としての性質だけでなく、接着細胞としての性質も併せ持つことも明らかとなった(図23を参照)。
従って、本発明による、「無フィーダーでの血管内皮細胞および血液細胞への分化誘導方法」は、非常に高い分化効率で、細胞損傷を伴わず、かつ高いfeasibilityを持つものであることから、世界中で速やかに実施され、その利益は甚大である。
(1)未分化維持培養液の調製
カニクイザル胚性幹細胞は、未分化維持培養液1−1(組成:DMEM/Ham’S F-12(コージンバイオ製〕、20体積% KNOCKOUT(登録商標)SR〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)製〕、1mM L−グルタミン〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)製〕、2mM 非必須アミノ酸液〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)製〕、1mM ピルビン酸ナトリウム〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)製〕、終濃度100U/ml ペニシリン〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)製〕、終濃度100μg/ml ストレプトマイシン〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)製〕)で、30倍希釈したマトリゲル(登録商標)マトリックス〔BD(BD Biosciences)社製〕を用いて室温で15分から30分程度コートした10 cm培養ディッシュ上、または78 cm2培養ディッシュ上で、CO2インキュベーターにおいて、37℃、5体積%CO2で培養した。
カニクイザル胚性幹細胞は、コロニーの大きさとしては直径500 μmの比較的均一の大きさの状態で、位相差顕微鏡の対物レンズ4倍(接眼レンズ10倍)の視野において1〜2個程度の密度で播種する。翌日には培地交換する。さらに翌日にはコロニーの大きさが1000 μm程度になるので、ディスパーゼ〔BD(BD Biosciences)製〕で剥離して、マトリゲル(登録商標)マトリックスでコートされた新しい培養容器に継代する。ディスパーゼ処理は、培養液を除去したカニクイザル胚性幹細胞にディスパーゼ液を浸し入れて、すぐにこれを吸引して37℃で5分間反応させたのち、DMEM/Ham's F-12を注ぎ入れ、ピペッティングを極力しないように注意しながら細胞を遠沈管に回収して、上清を遠心(1000 rpm、5分、4℃)して細胞を沈降させる。以上の操作により、カニクイザル胚性幹細胞のコロニーは直径500 μmの比較的均一の大きさに分散されている。以上、継代操作を2日毎に繰り返すことで、カニクイザル胚性幹細胞はコロニー同志が接合することなく、無フィーダー、かつ合成サイトカインを添加しない前記した培養液において、未分化状態を適切に保持したまま増幅培養することが可能である。
少なくとも43継代した後にも未分化維持状態は適切に保たれていた。具体的には、未分化状態として好ましい細胞形態(図1を参照)と、未分化維持マーカーであるSSEA-4, Oct-4, Nanog, Tra-1-60, Tra-1-81の高発現(図2および図3を参照)、免疫不全マウス(SCIDマウス)での腫瘍形成(図4、図5を参照)が確認された。
図2は、上記の方法で培養された培養された20継代めのカニクイザル胚性幹細胞における、未分化維持マーカーであるSSEA-4およびOct-4の発現をフローサイトメトリーで測定した結果である。両者において非常に高い発現(>95%)が確認される。
図3は、上記の方法で培養された培養された20継代めのカニクイザル胚性幹細胞における、未分化維持マーカーであるTra-1-60、 Tra-1-81、およびNanogの発現を免疫染色で示したものである。ほぼ全ての細胞でいずれのマーカーも発現が確認される。
図4は、上記の方法で培養された培養された21継代めのカニクイザル胚性幹細胞を3匹の免疫不全マウス(SCIDマウス)の精巣皮膜下に移植した2ヶ月後に精巣の写真である。3匹全てにおいてテラトマ形成を確認した。図5は上記の腫瘍の組織標本(ヘマトキシリン・エオジン染色)である。記載のごとく、神経上皮、歯、分泌腺、腸管様上皮、平滑筋などが認められる。
なお、実施例4−実施例7に示すように、本発明により未分化維持したカニクイザル胚性幹細胞から、血管内皮細胞の産生と、血球および造血ストロマ細胞の拡大再生産が可能である。
前記した未分化維持培養方法で継代培養されたカニクイザル胚性幹細胞は、凍結保存液1(2 M DMSO、1 M Acetamide, 3 M Propylene glycol/ヒトES細胞用培地)、または市販の霊長類動物胚性幹細胞用凍結保存液(リプロセル社)を用いて、液体窒素内での凍結保存が可能である。まず、以下の手順で細胞の凍結ストックを作成する。即ち、上記した方法でカニクイザル胚性幹細胞を沈降回収したのち、氷上で冷やした凍結保存液200 μl加え、穏やかに懸濁したのち、できる限り速やかに(15秒以内)、予め準備した凍結保存用チューブに移して、液体窒素につける。液体窒素中で、30秒から1分間凍結して、内部まで完全に凍らせた後に、液体窒素保存容器に移す。
凍結保存した細胞の解凍は以下の手順で行う。即ち、カニクイザル胚性幹細胞の凍結チューブに、あらかじめ37℃に温めた未分化維持用培地を1 ml加え、ピペッティングを行うことで急速解凍し、細胞懸濁液を15 mlコニカルチューブへ移して細胞を沈降回収する(1000 rpm、5分、4℃)。未分化維持用培地で細胞を懸濁させた後、顕微鏡で細胞の状態を確認し、マトリゲル(登録商標)マトリックスでコートされた培養容器にて、CO2インキュベーターにおいて、37℃、5体積%CO2で培養する。
以上の操作により、前記した未分化維持したカニクイザル胚性幹細胞は凍結融解後にも未分化維持状態を良好に保持したまま増殖している。
(1)未分化維持培養液の調製
ヒト胚性幹細胞は、未分化維持培養液1−2(組成:DMEM/Ham's F-12(コージンバイオ製)、20体積% KNOCKOUT(登録商標)SR〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)製〕、1mM L−グルタミン〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)製〕、2mM 非必須アミノ酸液〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)製〕、0.1 μM 2-mercaptethanol〔シグマ(Sigma Chemical Co.)製〕、終濃度100U/ml ペニシリン〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)製〕、終濃度100μg/ml ストレプトマイシン〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)製〕)で、30倍希釈したマトリゲル(登録商標)マトリックス〔BD(BD Biosciences)社製〕を用いて室温で15分から30分程度コートした10 cm培養ディッシュ上、または78 cm2培養ディッシュ上で、CO2インキュベーターにおいて、37℃、5体積%CO2で培養した。
ヒト胚性幹細胞は、コロニーの大きさとしては直径500 μmの比較的均一の大きさの状態で、位相差顕微鏡の対物レンズ4倍(接眼レンズ10倍)の視野において2〜3個程度の密度で播種し、以後は毎日培地交換を行う。3〜4日後にはコロニーの大きさが1000 μm程度になるので、剥離液1(組成:0.25% トリプシン液〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)製〕、1 mg/ml コラゲナーゼ IV〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)製〕、1 %KNOCKOUT(登録商標)SR〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)製〕、1 mM 塩化カルシウム〔シグマ(Sigma Chemical Co.)製〕をリン酸バッファーをベースに作成する)、または霊長類動物胚性幹細胞用細胞剥離液(リプロセル社)で剥離して、マトリゲル(登録商標)マトリックスでコートされた新しい培養容器に継代する。剥離の具体的手順は以下の通りである。培養液を除去したヒト胚性幹細胞に剥離液を浸し入れて37℃で5分間反応させたのち、剥離液を吸引してDMEM/Ham’S F-12を添加してさらに37℃で10分間反応させる。その後、培養容器をタッピングすることで細胞を剥離浮遊させてから1000 μlのピペットチップで2回サスペンドしながら細胞を遠沈管に回収し、遠心操作(1000 rpm、5分、4℃)により細胞を沈降させる。以上の操作により、ヒト胚性幹細胞のコロニーは直径500 μmの比較的均一の大きさに分散されている。以上の操作を毎週2回行うことで、ヒト胚性幹細胞は、無フィーダー、かつ合成サイトカインを添加しない、上記した培養液内で、未分化状態を適切に保持したまま継代維持が可能である。
(3)細胞形態
25回継代した後にも未分化維持状態は適切に保たれていた。具体的には、未分化状態として好ましい細胞形態、未分化維持マーカーであるSSEA-4, Oct-4, Nanogの高発現が確認された。また27継代後における染色体分析において、正常染色体核型の維持が確認された(図6、図7、図8、および図9を参照)。
図7は、上記の方法で培養された20継代めのヒト胚性幹細胞における未分化維持マーカーであるSSEA-4およびOct-4の発現をフローサイトメトリーで測定した結果である。両者において非常に高い発現(>95%)が確認される。
図8は、上記の方法で培養された25継代めのヒト胚性幹細胞における未分化維持マーカーであるOct-4(A)とNanog(B)の発現を免疫染色で示したものである。ほぼ全ての細胞において、両者の蛋白が発現していることが確認される。
図9は、ヒト胚性幹細胞の染色体分析図(Gバンド法)である。左は、樹立機関で推奨している従来の培養法(胎仔マウス線維芽細胞をフィーダー細胞とする共培養法)で維持している状況、右は本発明による「無フィーダー無サイトカインによる培養法」で20回継代した状況における結果である。全く染色体異常が起きていないことが確認された。
前記した未分化維持培養方法で継代培養されたヒト胚性幹細胞は、凍結保存液1、または市販の霊長類動物胚性幹細胞用凍結保存液(リプロセル社)を用いて、前記実施例1に記載した方法により、液体窒素内での凍結保存および解凍が可能である。以上の操作により、実施例2で未分化維持したヒト胚性幹細胞は凍結融解後にも未分化維持状態を良好に保持したまま増殖している。
(1)未分化維持培養液の調製
実施例2に記載した培地を使用した。
ヒト胚性幹細胞は、コロニーの大きさとしては直径500 μmの比較的均一の大きさの状態で、位相差顕微鏡の対物レンズ4倍(接眼レンズ10倍)の視野において2〜3個程度の密度で播種し、以後は毎日培地交換を行う。3〜4日後にはコロニーの大きさが1000 μm程度になるので、剥離液1(組成:0.25% トリプシン液〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)製〕、1 mg/ml コラゲナーゼ IV〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)製〕、1 %KNOCKOUT(登録商標)SR〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)製〕、1 mM 塩化カルシウム〔シグマ(Sigma Chemical Co.)製〕をリン酸バッファーをベースに作成する)、または霊長類動物胚性幹細胞用細胞剥離液(リプロセル社)で剥離して、ヒト血漿から得られたフィブロネクチン(BD社製)を5 μg/cm2でコートした新しい培養容器、ヒトAB型血清を用いてコートした新しい培養容器、ヒト胎盤から得られたラミニン(シグマ社製)を5 μg/cm2でコートした新しい培養容器、ヒト血漿から得られたビトロネクチン(BD社製)を0.2 μg/cm2でコートした新しい培養容器、またはヒト胎盤から得られたIV型コラーゲン(BD社製)を5 μg/cm2でコートした新しい培養容器、に継代する。剥離の具体的手順は以下の通りである。培養液を除去したヒト胚性幹細胞に剥離液を浸し入れて37℃で5分間反応させたのち、剥離液を吸引してDMEM/Ham's F-12を添加してさらに37℃で10分間反応させる。その後、培養容器をタッピングすることで細胞を剥離浮遊させてから1000 μlのピペットチップで2回サスペンドしながら胞を遠沈管に回収し、遠心操作(1000 rpm、5分、4℃)により細胞を沈降させる。以上の操作により、ヒト胚性幹細胞のコロニーは直径500 μmの比較的均一の大きさに分散されている。以上の操作を毎週2回行うことで、ヒト胚性幹細胞は、無フィーダー、かつ合成サイトカインを添加しない、実施例2に記載した培養液内で、未分化状態を適切に保持したまま継代維持が可能である。
図10は、上記の方法により、ヒト由来フィブロネクチン(5 μg/cm2)のみでコートされた培養皿(A)、ヒトAB型血清のみでコートされた培養皿(C)、を用いて培養された4継代めでのヒト胚性幹細胞の位相差顕微鏡写真である。いずれも未分化な形態を保持していることが解る。またこれらの細胞において未分化維持マーカーであるSSEA-4 とOct-4の発現をフローサイトメトリーで測定したところ、いずれにおいても両マーカーの高発現が確認された(B、D)。
(1)分化培地の調製
カニクイザル胚性幹細胞は、分化培地1−1{組成:イスコフ改変ダルベッコ培地(Iscove’s modified Dulbecco’s medium;IMDM)〔シグマケミカル(Sigma Chemical Co.)製〕、15重量% 熱不活化ウシ胎仔血清〔ピーエーエーラボラトリーズゲーエムベーハー(PAA Laboratories GmbH)〕、1mM β−メルカプトエタノール〔シグマケミカル(Sigma Chemical Co.)製〕、2mM L−グルタミン〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)製〕}に、終濃度20ng/ml 血管内皮成長因子(VEGF)、終濃度20ng/ml 骨形成タンパク質−4(BMP−4)、20ng 幹細胞因子(SCF)、終濃度10ng/ml Flt3−リガンド、終濃度20ng/ml インターロイキン3(IL3)、終濃度10ng/ml インターロイキン6(IL6)}のサイトカインを添加した。
分化培地1−1(サイトカイン添加済)用いたハンギング・ドロップ法により、胚葉体類似の細胞凝集塊細胞を作成する。具体的には、カニクイザル胚性幹細胞を剥離液で回収したのち、さらに0.25 %トリプシン液〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)製〕)で37℃、5分反応させることで1個の細胞レベルに分散させる。3000個のカニクイザル胚性幹細胞を30 μlの分化培地1−1(サイトカイン添加済)に懸濁させて、マイクロピペットを用いて、直径10 cmの培養皿の蓋の裏面にスポットしていく(1枚の培養皿において2030個程度のスポッティングが可能である)。乾燥を防ぐために、培養さらに滅菌水を満たして、CO2インキュベーターにおいて、37℃、5体積%CO2で3日間浮遊培養した。3日後には肉眼的に細胞凝集塊の形成が確認できるので、培養皿の蓋面を洗うようにしてこれを回収し、0.1 %ゼラチン〔シグマケミカル(Sigma Chemical Co.)製〕でコートした培養皿(直径10 cmまたは6 cm)の上で、分化培地1−1(サイトカイン添加済)を用いて、CO2インキュベーターにおいて、37℃、5体積%CO2で接着培養した。以後は3〜4日ごとに培地を交換した。カニクイザル胚性幹細胞の凝集塊は平面上に広がりながら生長を続け、約2週間後には、もと凝集塊のあった領域の中央付近から、特定前駆細胞(嚢状構造物と球状細胞集団からなる構造物)が形成された(各凝集塊につき1個形成された)(図12参照)。図12は、無フィーダーでの血管内皮細胞・血球の分化誘導と拡大再生産の技術による、カニクイザル胚性幹細胞から牛胎児血清存在下で作成した、血管内皮前駆細胞と血液細胞に共通の特定前駆細胞(嚢状構造物と球状細胞集団からなる構造物)を示す。
図14は、上記『特定前駆細胞』から産生された血管内皮細胞の、血管内皮細胞特異的マーカーであるVE-cadherinと、血管内皮細胞マーカーの一つであるN-cadherinの発現を免疫染色検査で調べた結果である。図14に示すように、2継代後から血管内皮細胞特異的マーカーであるVE-cadherinの発現がほぼ全ての細胞で確認された。さらにこの図で示すように、血管内皮細胞において発現していることが知られる接着因子であるN-cadherinも、免疫染色にてほぼ全ての細胞において発現しており、かつ明瞭な細胞膜局在を認めることが示された。これは図31に示すように、生体から得られた初代血管内皮細胞が喪失してしまっている性質であり、非常に興味深い知見である(図14と図31を比較参照のこと)。
図31は、3種類の市販のヒト初代培養血管内皮細胞(ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)、ヒト微小血管内皮細胞(HMVEC)およびヒト大動脈内皮細胞(HAEC))におけるN-cadherinの細胞内発現様式を免疫染色で調べた結果である。図31から、市販のヒト初代培養血管内皮細胞ではすでにN-cadherinの細胞膜局在が消失してしまっていることが分かる。一方、本発明方法によって産生された血管内皮細胞は、明瞭な細胞膜局在を示し、生体における血管内皮細胞の性質を正しく反映している。(図14中)。
図16は、上記『特定前駆細胞』から産生された血管内皮細胞の成熟機能の確認のために、コード形成能(A)とアセチル化低比重リポ蛋白の取込能(B)を調べたものである。いずれにおいても高い効率で成熟機能の獲得が確認される。以上から、8回の継代の後にもVE-cadherinとPECAM1の発現は保持され、かつ図16に示すように、コード形成能、アセチル化低比重リポプロテイン取込能などの、血管内皮細胞の機能的成熟も確認された。
(1)分化培地の調製
カニクイザル胚性幹細胞は、分化培地1−2{組成:イスコフ改変ダルベッコ培地(Iscove’s modified Dulbecco’s medium;IMDM)〔シグマケミカル(Sigma Chemical Co.)製〕、15重量% KNOCKOUT(登録商標)SR〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)製〕、1mM β−メルカプトエタノール〔シグマケミカル(Sigma Chemical Co.)製〕、2mM L−グルタミン〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)製〕}に、終濃度20ng/ml 血管内皮成長因子(VEGF)、終濃度20ng/ml 骨形成タンパク質−4(BMP−4)、20ng 幹細胞因子(SCF)、終濃度10ng/ml Flt3−リガンド、終濃度20ng/ml インターロイキン3(IL3)、終濃度10ng/ml インターロイキン6(IL6)}のサイトカインを添加した培地を用いて分化誘導を行った。
分化培地1−2(サイトカイン添加済)を用いたハンギング・ドロップ法により、胚葉体類似の細胞凝集塊細胞を作成する。具体的には、カニクイザル胚性幹細胞を剥離液で回収したのち、さらに0.25 %トリプシン液〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)製〕)で37℃、5分反応させることで1個の細胞レベルに分散させる。3000個のカニクイザル胚性幹細胞を30 μlの分化培地1−2(サイトカイン添加済)に懸濁させて、マイクロピペットを用いて、直径10 cmの培養皿の蓋の裏面にスポットしていく(1枚の培養皿において2030個程度のスポッティングが可能である)。乾燥を防ぐために、培養さらに滅菌水を満たして、CO2インキュベーターにおいて、37℃、5体積%CO2で3日間浮遊培養した。3日後には肉眼的に細胞凝集塊の形成が確認できるので、培養皿の蓋面を洗うようにしてこれを回収し、0.1 %ゼラチン〔シグマケミカル(Sigma Chemical Co.)製〕でコートした培養皿(直径10 cmまたは6 cm)の上で、分化培地1−2(サイトカイン添加済)を用いて、CO2インキュベーターにおいて、37℃、5体積%CO2で接着培養した。以後は3〜4日ごとに培地を交換した。カニクイザル胚性幹細胞の凝集塊は平面上に広がりながら生長を続けた。牛胎児血清存在下での実験(実施例4)と異なり嚢状構造物の形成は見られなかったが、約2週間後に接着細胞の増殖と浮遊細胞(球状細胞)の産生が確認された。培養上清を回収して遠心することで浮遊細胞(球状細胞)を沈降回収する一方、接着細胞はトリプシン/EDTA液〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)製〕)を用いて37℃、5分反応させることで剥離回収した。
(1)培地調製
分化培地1−3{組成:ノックアウトD-MEM(Knockout D-MEM〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)、20重量% 熱不活化ウシ胎仔血清〔ピーエーエーラボラトリーズゲーエムベーハー(PAA Laboratories GmbH)〕、0.1mM β−メルカプトエタノール〔シグマケミカル(Sigma Chemical Co.)製〕、1% 非必須アミノ酸液〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)製〕、1mM L−グルタミン〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)製〕〕に、終濃度50ng/ml 骨形成タンパク質−4(BMP−4)、300ng/ml 幹細胞因子(SCF)、終濃度300ng/ml Flt3−リガンド、終濃度10ng/ml インターロイキン3(IL3)、終濃度10ng/ml インターロイキン6(IL6)、濃度50ng/ml 顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF))のサイトカインを添加した。
実施例1により未分化維持されたカニクイザル胚性幹細胞を、コラゲナーゼIV処理(室温、20分)および、それに引き続いてキレート剤処理(non-enzymatic cell dissociation buffer〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)製〕で室温にて20分反応)を行い、マトリゲル(登録商標)マトリックスコートした培養容器から剥離した。この操作によりカニクイザル胚性幹細胞は個々の細胞レベルに近い状態でほぐれた。これを回収して、分化培地1−3用いて、ポリヒドロキエチルメタクリレート(poly (2-hydoxyethyl methacrylate)、シグマ社製)でコートした非接着性培養容器(直径6 cm培養皿等)、またはHydrocell(CellSeed社製)を用いて、一昼夜浮遊培養した。翌日、上記サイトカインを添加した分化培地1−3(サイトカイン非添加)に培地を交換し、さらに2週間ほど浮遊培養を行うことで、胚葉体(または胚葉体類似の細胞凝集塊)が作成された(図19Aを参照)。なお2週間の培養期間中は3〜4毎に培地交換を行った。この際に、培地中に浮遊している胚葉体(または胚葉体類似の細胞凝集塊)は培養上清を回収して細胞成分を遠心沈降させ、これを新しく調製した分化培地1−3(サイトカイン非添加)に懸濁し、新しく用意した非接着性培養容器に移し入れて浮遊培養を続行した。
上記で形成された胚葉体を遠心沈降により培養上清から回収して、0.1 %ゼラチン〔シグマケミカル(Sigma Chemical Co.)製〕でコートした培養皿(24穴マルチウェル皿)の上で、分化培地1−3(サイトカイン添加済み)を用いて、CO2インキュベーター内で、37℃、5体積%CO2で接着培養した。以後は3〜4日ごとに培地を交換した。カニクイザル胚性幹細胞の凝集塊は平面上に広がりながら生長を続け、約2週間後には、もと凝集塊のあった領域の中央付近から、図19Bに示すように『特定前駆細胞』(嚢状構造物とそれに含有される球状細胞集団からなる構造物)が形成された(各凝集塊につき1個形成された)。図19は、上記の「無フィーダーでの血管内皮細胞および血液細胞への分化誘導方法」による、カニクイザル胚性幹細胞から牛胎児血清存在下で作成した胚葉体細胞の位相差顕微鏡写真(A)と、胚葉体を接着培養して得られる血管内皮前駆細胞と血液細胞に共通の『特定前駆細胞』(嚢状構造物と球状細胞集団からなる構造物)(B)を示す。
上記手技2で形成された『特定前駆細胞』を含む培養皿を、トリプシン/EDTA液〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)製〕)での処理を行うことで、培養皿にある細胞を全て剥離回収し、ゼラチンをコートした新しい培養皿(直径6 cm)の上で、分化培地1−3(サイトカイン添加済み)を用いて接着培養を続行した。接着細胞は活発に増殖し、2日後にはコンフルエントに達した。さらに2日後には図20に示すように、浮遊細胞の産生が明らかとなった。図20は、血液細胞の拡大再生産がなされている状況を示す位相差顕微鏡写真である。造血ストロマ細胞(接着細胞)とそこから産生された血球(浮遊細胞)の両者が確認される。
以後は週2回のペースで、培地交換をしながら細胞培養を続行した。なお培地交換の際には浮遊細胞を遠心回収して培養皿に戻した。また接着細胞は週1回のペースで、トリプシン/EDTA液〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)製〕)を用いて剥離し、培養上清中の浮遊培養と混合した上で、1/2〜1/3に希釈しながら継代培養を行った。
上記した血球の拡大再生産過程において回収された血球細胞(浮遊細胞)のWright-Giemsa染色像(A)と、特殊染色(ミエロペルオキシダーゼ染色(B)、エステラーゼ二重染色(C)、好中球性アルカリホスファターゼ染色(D))を示す。様々な骨髄系細胞、即ち、骨髄芽球から成熟血球(好中球およびマクロファージ)に至る各分化段階の細胞が観察される。さらに、これらの血球細胞(浮遊細胞)における造血幹細胞マーカーであるCD34(E)と汎血球細胞マーカーであるCD45(F)の発現をフローサイトメトリーで確認した結果を示す。
図21から、骨髄系細胞の様々な分化段階にある細胞(骨髄芽細胞、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球、好中球、単球、マクロファージなどを含む)の産生が確認された。また汎血球細胞マーカーであるCD45抗原の発現はほぼ100%であり(図21Fを参照)、血球分化効率は非常に高く、ほぼ血球細胞のみからなるほぼ純粋な集団が得られていることが確認された。またCD34陽性(即ち、CD34陽性CD45陽性の二重陽性細胞)も数%存在しており(図21E参照)、造血幹細胞(または造血幹細胞と同等の造血前駆細胞)が産生されていることが確認された。
図22は、上記した方法で産生された、継代可能な「造血ストロマ細胞」の位相差顕微鏡写真(A)と、CD34、CD45の発現をフローサイトメトリーで調べた結果(B)、である。汎血球マーカーであるCD45、造血幹細胞のマーカーであるCD34はともにほぼ陰性であり、非血球系細胞であることが確認された(少量の陽性細胞は造血ストロマ細胞に接着している造血幹細胞の混入と考えられる)。
上記手技3で形成された接着細胞は、汎血球マーカーであるCD45抗原はほとんど発現しておらず(図22を参照)、非血球系細胞であることが確認された。細胞形態は、どれも比較的扁平ではあるが、星型であったり、細長かったり、中には短い偽足をもつものや多核大型細胞も含まれており不均質であった。この状態は、骨髄血を培養して得られる接着細胞である「造血ストロマ」と呼ばれる、不均質な細胞集団に形態的に酷似していた。これらの細胞が存在する限り、上記手技3に記載したように、骨髄系の様々な分化段階にある血球が持続的に産生されること、また後述のように、この細胞が消失すると、産生された血球は造血幹細胞(または造血幹細胞と同等の造血前駆細胞)に限定される傾向を増すことから、機能的にも造血ストロマ細胞であると判断される。なおこの接着細胞は、上記したように、約80継代(約3ヶ月の培養)までは形態および機能が安定に保持され、拡大再生産が可能であった。
今後、この接着細胞を様々な角度から解析することで、今もって実体がほぼわかっていない造血ストロマ細胞についての理解が大いに深まることが期待され、移植医療や造血機構に関する基礎研究において甚大な効果がある。
図23は、上記した方法で産生された、継代可能な「造血幹/前駆細胞」の長期間培養(>100日)により作成された「CD34陽性かつCD45陽性細胞」の位相差顕微鏡写真である(A)。浮遊細胞と接着細胞が混在しているが、両者は互いに移行可能であり、同等な細胞集団(即ち、造血幹細胞と対等物)と考えられる。図23Bに浮遊細胞、および接着細胞に関する、CD34、CD45の発現をフローサイトメトリーで確認した結果を示す。なお、ヒトでは造血幹細胞は「CD34陽性かつCD45陽性細胞」であるとされ、造血幹細胞の移植医療では骨髄血や臍帯血から該細胞を分離精製して移植される。
前記手技4で形成された接着細胞は、前述したように、約80継代(約3ヶ月の培養)までは、その殆どが造血ストロマ細胞であった。しかし、それ以後の約10継代の期間中に徐々に造血ストロマ細胞は減少し、総計約100継代めには、接着細胞は「厚みのある紡錘形で、均一な細胞集団」に置換された(図23Aを参照)。この細胞はフローサイトメトリーによる細胞表面マーカーの解析から、CD34陽性かつCD45陽性であり(図23B、下段の2つのパネルを参照)、造血幹細胞(または造血幹細胞と同等の造血前駆細胞)であった。同時に、この段階では浮遊細胞のほとんどがCD34陽性かつCD45陽性の造血幹細胞(または造血幹細胞と同等の造血前駆細胞)になっていた(図23B、上段の2つのパネルを参照)。即ち、この段階では浮遊細胞と接着細胞はどちらもが造血幹細胞(または造血幹細胞と同等の造血前駆細胞)という同一の細胞系列になっており、造血幹細胞(または造血幹細胞と同等の造血前駆細胞)が浮遊細胞としての性質だけではなく接着細胞としての性質も併せ持つことが明らかとなった。
(1)培地調製
分化培地1−3{組成:ノックアウトD-MEM(Knockout D-MEM〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)、20重量% KNOCKOUT(登録商標)SR〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)製〕、0.1mM β−メルカプトエタノール〔シグマケミカル(Sigma Chemical Co.)製〕、1% 非必須アミノ酸液〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)製〕、1mM L−グルタミン〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)製〕〕に、終濃度50ng/ml 骨形成タンパク質−4(BMP−4)、300ng/ml 幹細胞因子(SCF)、終濃度300ng/ml Flt3−リガンド、終濃度10ng/ml インターロイキン3(IL3)、終濃度10ng/ml インターロイキン6(IL6)、濃度50ng/ml 顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF))のサイトカインを添加した。
実施例1により未分化維持されたカニクイザル胚性幹細胞を、実施例6に記載した方法に則ってマトリゲル(登録商標)マトリックスコートした培養容器から剥離したのち、分化培地1−4用いて、ポリヒドロキエチルメタクリレート(poly (2-hydoxyethyl methacrylate)、シグマ社製)でコートした非接着性培養容器(直径6 cm培養皿等)、またはHydrocell(CellSeed社製)を用いて、一昼夜浮遊培養した。翌日、上記したサイトカインを添加した分化培地1−4(サイトカイン非添加)に培地を交換し、さらに2週間ほど浮遊培養を行うことで、胚葉体(または胚葉体類似の細胞凝集塊)が作成された。なお2週間の培養期間中は3〜4毎に培地交換を行った。この際に、培地中に浮遊している胚葉体(または胚葉体類似の細胞凝集塊)は培養上清を回収して細胞成分を遠心沈降させ、これを新しく調製した分化培地1−3(サイトカイン非添加)に懸濁し、新しく用意した非接着性培養容器に移し入れて培養を続行した。
前記手技1で形成された胚葉体を遠心沈降により培養上清から回収して、0.1 %ゼラチン〔シグマケミカル(Sigma Chemical Co.)製〕でコートした培養皿(24穴マルチウェル皿)の上で、分化培地1−4(サイトカイン添加済み)を用いて、CO2インキュベーター内で、37℃、5体積%CO2で接着培養した。以後は3〜4日ごとに培地を交換した。カニクイザル胚性幹細胞の凝集塊は平面上に広がりながら生長を続け、約2週間後には、もと凝集塊のあった領域の中央付近から、実施例6で示したものと同様の『特定前駆細胞』(嚢状構造物とそれに含有される球状細胞集団からなる構造物)が形成された。
前記手技2で形成された『特定前駆細胞』を含む培養皿を、トリプシン/EDTA液〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)製〕)での処理を行うことで、培養皿にある細胞を全て剥離回収し、ゼラチンをコートした新しい培養皿(直径6 cm)の上で、分化培地1−4(サイトカイン添加済み)を用いて培養を続行した。接着細胞は徐々に増殖し、数日後にはコンフルエントに達した。さらに培養を続けると浮遊細胞の産生が明らかとなった。図25は、上記の方法でカニクイザル胚性幹細胞から無血清条件下に作成された血球細胞のWright-Giemsa染色像(A)と、特殊染色(ミエロペルオキシダーゼ染色(B)、エステラーゼ二重染色(C)を示す。様々な骨髄系細胞が観察される。図25から、浮遊細胞は、Wright-Giemsa染色、ミエロペルオキシダーゼ染色(POX染色)、エステラーゼ二重染色等により、骨髄系細胞の様々な分化段階にある細胞(骨髄芽細胞、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球、好中球、単球、マクロファージなどを含む)であることが確認された。
(1)分化用培地の調製
分化培地1−1{組成:イスコフ改変ダルベッコ培地(Iscove’s modified Dulbecco’s medium;IMDM)〔シグマケミカル(Sigma Chemical Co.)製〕、15重量% 熱不活化ウシ胎仔血清〔ピーエーエーラボラトリーズゲーエムベーハー(PAA Laboratories GmbH)〕、1mM β−メルカプトエタノール〔シグマケミカル(Sigma Chemical Co.)製〕、2mM L−グルタミン〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)製〕}に、終濃度20ng/ml 血管内皮成長因子(VEGF)、終濃度20ng/ml インスリン様増殖因子2(IGF2)、終濃度10ng/ml 骨形成タンパク質−4(BMP−4)、終濃度5ng/ml オンコスタチンM(OSM)、終濃度5ng/ml 線維芽細胞増殖因子(FGF2)、50ng 幹細胞因子(SCF)、終濃度50ng/ml Flt3−リガンド、濃度50ng/ml 顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF))}のサイトカインを添加した。
ヒト胚性幹細胞のコロニーを剥離液で回収したのち、ポリヒドロキシエチルメタクリレート(poly (2-hydoxyethyl methacrylate)、シグマ社製)でコートした非接着性培養容器(直径6 cm培養皿等)、またはHydrocell(CellSeed社製)を用いて、上記した分化培地(サイトカイン添加済)を用いて、浮遊培養を行った。3日〜8日後には胚葉体(または胚葉体類似の細胞凝集塊)が形成された。
前記手技1で形成された胚葉体(または胚葉体類似の細胞凝集塊)を遠心沈降により培養上清から回収して、0.1 %ゼラチン〔シグマケミカル(Sigma Chemical Co.)製〕でコートした培養皿(直径6cmまたは10cmの培養皿)の上で、上記した分化培地(サイトカイン添加済)を用いて、CO2インキュベーター内で、37℃、5体積%CO2で接着培養した。以後は3〜4日ごとに培地を交換した。ヒト胚性幹細胞の凝集塊は平面上に広がりながら生長を続け、約2週間後には、もと凝集塊のあった領域の中央付近から、図26に示すように『特定前駆細胞』(嚢状構造物と球状細胞集団からなる構造物)が形成された(各凝集塊につき1個形成された)。図26は、上記の方法による、ヒト胚性幹細胞からの血管内皮前駆細胞および血液細胞の『特定前駆細胞』(嚢状構造物と球状細胞集団からなる構造物)の産生を示す。
前記手技3で形成された『嚢状構造物』の中に球状細胞が完全に充満する前に、マイクロナイフ(Stem cell knife(Swemed社製)等)を用いて、嚢状構造物そのもの構造を破壊することなく、嚢状構造物の底面付近に少量の切れ込みを入れることで、内部の球状細胞を培養液中に緩除に放出させた。嚢状構造物内に球状細胞が完全に充満すると球状細胞の生存性が低下する。培養上清を遠心沈降することで球状細胞を回収しつつ、3〜4日毎に培地交換を行いながら培養を続けた。培養上清から回収された浮遊細胞については、適宜、(1)造血コロニーアッセイ(Methocult(登録商標)GF+H4535 (Stemcell Technologies Inc.)を使用)によるコロニー形成能、(2)Wright-Giemsa染色による形態観察、(3)ミエロペルオキシダーゼ染色(POX染色)、エステラーゼ二重染色、好中球性アルカリホスファターゼ染色(NAP染色)等の特殊染色による特異的酵素活性の有無、(4)フローサイトメトリーによる各種マーカー(CD34,CD45等)の細胞表面での発現の確認することで、血液細胞としての評価を行った。結果を図27,28に示す。
図28は、上記の方法で、ヒト胚性幹細胞から牛胎児血清存在下で作成された、浮遊細胞のCD34、CD45の発現をフローサイトメトリーで確認した結果である。ほぼ全ての細胞で汎血球マーカーであるCD45が発現しており、非常に高い効率で血球細胞分化が誘導されていることが解る。また1割程度のCD34陽性細胞が検出されることから、造血幹細胞も存在していることが確認された。
即ち、骨髄系細胞の様々な分化段階にある細胞(骨髄芽細胞、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球、好中球、単球、マクロファージなどを含む)の産生が確認された(図27参照)。また汎血球細胞マーカーであるCD45抗原の発現はほぼ100%であり(図28を参照)、血球分化効率は非常に高く、ほぼ血球細胞のみからなるほぼ純粋な集団が得られていることが確認された。またCD34陽性(即ち、CD34陽性CD45陽性の二重陽性細胞)も1割弱存在しており(図28参照)、造血幹細胞(または造血幹細胞と同等の造血前駆細胞)が産生されていることが確認された。
前記手技3に記載した方法により産生された血球細胞から、リンホプレップ(登録商標)(第一化学薬品株式会社製)を用いた密度勾配遠心法により好中球を濃縮した。好中球性アルカリホスファターゼ染色により好中球を青紫色に発色させて顕微鏡下で観察したところ、図29に示すように、濃縮前(A)に比べて、濃縮後(B)では、ほぼ全ての細胞が好中球からなることが確認された。
図29は、上記の方法で産生された血球細胞から、リンホプレップ(登録商標)(第一化学薬品株式会社製)を用いた密度勾配遠心法により好中球を濃縮した結果である。ここでは好中球性アルカリホスファターゼ染色により好中球が青紫色に染色されているが、濃縮前(A)に比べて、濃縮後(B)ではほぼ全ての細胞が好中球となっている。
(1)分化用培地の調製
ヒト胚性幹細胞は、分化培地1−2{組成:イスコフ改変ダルベッコ培地(Iscove’s modified Dulbecco’s medium;IMDM)〔シグマケミカル(Sigma Chemical Co.)製〕、15重量% KNOCKOUT(登録商標)SR〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)製〕、1mM β−メルカプトエタノール〔シグマケミカル(Sigma Chemical Co.)製〕、2mM L−グルタミン〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)製〕}に、終濃度20ng/ml 血管内皮成長因子(VEGF)、終濃度20ng/ml インスリン様増殖因子2(IGF2)、終濃度10ng/ml 骨形成タンパク質−4(BMP−4)、終濃度 5ng/ml オンコスタチンM(OSM)、終濃度5ng/ml 線維芽細胞増殖因子(FGF2)、50ng 幹細胞因子(SCF)、終濃度50ng/ml Flt3−リガンド、濃度50ng/ml 顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF))}のサイトカインを添加した。
ヒト胚性幹細胞のコロニーを剥離液で回収したのち、ポリヒドロキエチルメタクリレート(poly (2-hydoxyethyl methacrylate)、シグマ社製)でコートした非接着性培養容器(直径6 cm培養皿等)、またはHydrocell(CellSeed社製)を用いて、上記した分化培地(サイトカイン添加済)を用いて、浮遊培養を行った。3日〜8日後には胚葉体(または胚葉体類似の細胞凝集塊)が形成された。
前記手技1で形成された胚葉体(または胚葉体類似の細胞凝集塊)を遠心沈降により培養上清から回収して、0.1 %ゼラチン〔シグマケミカル(Sigma Chemical Co.)製〕でコートした培養皿(直径6cmまたは10cmの培養皿)の上で、上記した分化培地(サイトカイン添加済)を用いて、CO2インキュベーター内で、37℃、5体積%CO2で接着培養した。以後は3〜4日ごとに培地を交換した。ヒト胚性幹細胞の凝集塊は平面上に広がりながら生長を続け、約2週間後には、もと凝集塊のあった領域の中央付近から、『特定前駆細胞』(嚢状構造物と球状細胞集団からなる構造物)が形成された。
前記手技2で形成された『嚢状構造物』の中に球状細胞が完全に充満する前に、マイクロナイフ(Stem cell knife(Swemed社製)等)を用いて、嚢状構造物の底面に少量の切れ込みを入れ、内部の球状細胞を培養上清中に放出させた。嚢状構造物内に球状細胞が完全に充満すると球状細胞の生存性が低下する。培養上清を遠心沈降することで球状細胞を回収しつつ、3〜4日毎に培地交換を行いながら培養を続けた。培養上清から回収された浮遊細胞については、(1)造血コロニーアッセイ(Methocult(登録商標)GF+H4535 (Stemcell Technologies Inc.)を使用)によるコロニー形成能、(2)Wright-Giemsa染色による形態観察、(3)ミエロペルオキシダーゼ染色(POX染色)、エステラーゼ二重染色、好中球性アルカリホスファターゼ染色(NAP染色)等の特殊染色による特異的酵素活性の有無、(4)フローサイトメトリーによる各種マーカー(CD34,CD45等)の細胞表面での発現の確認することで、血液細胞としての評価を行った。結果を図30に示す。
実施例1の未分化維持培養方法にて、22回継代したカニクイザル胚性幹細胞(1X106個)を免疫不全マウス(SICDマウス)の精巣皮膜下に移植した。8週後に移植を行った全てのマウスの精巣内で肉眼的な腫瘍形成が確認された。これらの腫瘍を取り出し、ホルマリン固定したのち、薄切切片を作成してヘマトキシリン・エオジン染色(HE染色)を施した後、組織学的検査を行った。
その結果、図32に示す通り、外胚葉成分(神経上皮細胞;図a、歯エナメル上皮;図d)、中胚葉成分(平滑筋;図b、歯象牙質;図d)、内胚葉成分(腸管上皮;図b、分泌腺組織;図c)の三胚葉成分を持つことから、精巣内で形成された腫瘍はテラトマであることが確認された。
したがって、実施例1の未分化維持培養方法にて継代維持したカニクイザル胚性幹細胞は、テラトマ形成能を持つことが確認され、多能性分化能が保持されていることが実証された。
実施例2の未分化維持培養方法にて20回継代したヒト胚性幹細胞(khES-1)(3X106個)を免疫不全マウス(SICDマウス)の大腿四頭筋中に移植した。8週後に移植を行った全てのマウスの大腿四頭筋内で肉眼的な腫瘍形成が確認された。これらの腫瘍を取り出してホルマリン固定したのち、薄切切片を作成してヘマトキシリン・エオジン染色(HE染色)を施した後、組織学的検査を行った。
その結果、図33に示す通り、外胚葉成分(神経上皮細胞;図a、色素上皮;図b、皮脂腺:図h)、中胚葉成分(骨;図d、脂肪細胞;図e、軟骨;図f)、内胚葉成分(分泌腺;図cおよび図g)の三胚葉成分を持つことから、大腿四頭筋内で形成された腫瘍はテラトマであることが確認された。
したがって、実施例2の未分化維持培養方法にて継代維持したヒト胚性幹細胞がテラトマ形成能と持つことが確認され、多能性分化能が保持されていることが実証された。
実施例4の分化培地を用いた分化培地1−1(サイトカイン添加済)用いたハンギング・ドロップ法により、胚葉体類似の細胞凝集塊を作成する。具体的には、カニクイザル胚性幹細胞を剥離液で回収したのち、さらに0.25 %トリプシン液〔インビトロジェン(Invitrogen Corp.)製〕)で37℃、5分反応させることで1個の細胞レベルに分散させる。3000個のカニクイザル胚性幹細胞を30 μlの分化培地1−1(サイトカイン添加済)に懸濁させて、マイクロピペットを用いて、直径10 cmの培養皿の蓋の裏面にスポットしていく(1枚の培養皿において2030個程度のスポッティングが可能である)。乾燥を防ぐために、培養さらに滅菌水を満たして、CO2インキュベーターにおいて、37℃、5体積%CO2で3日間浮遊培養した。3日後には肉眼的に細胞凝集塊の形成が確認できるので、培養皿の蓋面を洗うようにしてこれを回収し、0.1 %ゼラチン〔シグマケミカル(Sigma Chemical Co.)製〕でコートした培養皿(直径10 cmまたは6 cm)の上で、分化培地1−1(サイトカイン添加済)を用いて、CO2インキュベーターにおいて、37℃、5体積%CO2で接着培養した。以後は3〜4日ごとに培地を交換した。カニクイザル胚性幹細胞の凝集塊は平面上に広がりながら生長を続け、約2週間後には、図12と同様に、もと凝集塊のあった領域の中央付近から、特定前駆細胞(嚢状構造物と球状細胞集団からなる構造物)が形成された(各凝集塊につき1個形成された)。
継代初期にVE-cadherin陽性細胞をセルソーターで回収することで、継代初期より高純度で血管内皮細胞を濃縮することが可能である。図39および図40は、嚢状構造物を1回継代した後に、FACSAria(BD Biosciences社)によりVE-cadherin陽性細胞をソーティングした結果を示す。図39に示すように、VE-cadherin陽性分画の細胞は継代を繰り返しても安定に細胞膜にVE-cadherinを発現し続け、5回の継代後には約160倍にVE-cadherin陽性細胞が増幅されることが確認された(図39B)。また免疫染色により、全ての細胞において、細胞間接着部でのVE-cadherin蛋白の局在も確認された(図39C)。
C6 rat glioma cellsとカニクイザル胚性幹細胞由来血管内皮細胞(5継代目)とを1X106個ずつ混合して一昼夜培養した。得られた混合細胞を免疫不全マウス(SICDマウス)の背部皮下に移植し、またコントロールとしてC6 rat glioma cellsのみの移植を行った。その結果、下記表1の通り、3週間後に移植を行った全てのマウスの皮下で肉眼的な腫瘍形成が確認された。これらの腫瘍を取り出し、腫瘍の計測(大きさ、重量)と外見の観察(図41a)を行ったのち、ホルマリン固定したのち、薄切切片を作成してヘマトキシリン・エオジン染色(HE染色)を施した後、組織学的検査(図41b)を行った。
従って、カニクイザル胚性幹細胞から作成された血管内皮細胞は、マウスへの移植実験において腫瘍血管新生に寄与することが実証された。
実施例2の方法により、無フィーダーおよび無サイトカイン下で未分化維持培養中のヒト胚性幹細胞(khES-3)(10 cm 培養皿1枚分)を、実施例2に記載した剥離液1または霊長類動物胚性幹細胞用細胞剥離液(リプロセル社)により剥離回収した。これを実施例4の分化培地を用いた分化培地1−1(サイトカイン添加済)の中で、汎用の低吸着培養皿( 6 cm培養皿1枚)を用いて浮遊培養を行うことで胚葉体類似の細胞凝集塊を作成した。この細胞凝集塊を、実施例4に記載した方法により、接着培養(10 cm 培養皿2枚に培養)、およびその後の継代培養を行うことで、血管内皮細胞の分化誘導を行った。実施例4および実施例12に記載したカニクイザル胚性幹細胞を用いた例と同様に、ヒト胚性幹細胞からも従来法よりも圧倒的に高効率に血管内皮細胞が産生されること(2−7割)、および継代に伴いVE-cadherin/PECAM1二重陽性細胞の割合が増加することが確認された(図42a参照)。また、カニクイザル胚性幹細胞由来血管内皮細と同様に、ヒト胚性幹細胞由来血管内皮細胞も8−10回程度の継代培養が可能であった。またコード形成能、アセチル化低比重リポ蛋白取込能などの、血管内皮細胞の機能的成熟も確認された(図42b参照)。次にこうして作成されたヒト胚性幹細胞由来血管内皮細胞のin vivoでの機能の評価を行った。即ち、ヒト胚性幹細胞由来血管内皮細胞(4継代目)の浮遊液中にて数片の約1 mm 角の蜂巣状コラーゲンスポンジを複数回の圧縮弛緩を繰り返すことで、コラーゲンスポンジ内にヒト胚性幹細胞由来血管内皮細胞を充満させた。この細胞を2日間培養した後、免疫不全マウス(SICDマウス)の腹腔に移植した(数片程度/匹)。約1ヶ月後にFITCラベルした高分子デキストランを尾静脈より注射し、数分後に腹腔内からコラーゲンスポンジを回収した。ホルマリン固定したのち抗ヒトHLA-A, B, C抗体(クローンW6/32, BioLegend社)および抗ヒトPECAM1抗体(Santa Cruz社、sc-8306)を用いて免疫染色を行った。
従って、新規血管内皮細胞分化誘導法によりヒト胚性幹細胞から作成された血管内皮細胞は、in vivoにおいて「体循環と繋がった機能的な新生血管」の形成に直接的に関与する(新生血管に取り込まれる)ことが確認された。
実施例8の方法により、ヒト胚性幹細胞を分化誘導し、30日目に培地中に浮遊する細胞を回収し、フローサイトメトリーにより好中球を中心とする血球マーカーの発現を解析した。
その結果、図43に示す通り、造血幹/前駆細胞マーカーであるCD34の発現は少なく、汎血球マーカーであるCD45および汎白血球マーカーであるCD33、好中球/単球系細胞マーカーであるCD11bの発現は非常に高かった(>9割)。また、顆粒球マーカーであるCD66bやGPI-80も6〜8割程度であり、好中球特異的マーカーであるCD16bの発現も3割以上であった。またさらに、好中球の三次顆粒中に含まれるlactoferrinが陽性の細胞も検出された。
従って、ヒト胚性幹細胞から作成された造血細胞は、好中球マーカーを高率に発現している。
実施例8の方法により、ヒト胚性幹細胞を分化誘導し、30日目に培地中に浮遊する血球(CD66b陽性率は6〜8割程度)を回収した。約1X106個の細胞を、あらかじめ皮下に滅菌空気を注入することで空気嚢を作成しておいたNOD/SCID/γcnull ( NOG)マウスに静注した。その直後に空気嚢内にzymosan A(1 mg/ml)とヒトIL-1β (10 ng/ml)を投与し、16時間後に空気嚢内から細胞を回収し、抗ヒトCD66b抗体(注:ヒト好中球とのみ反応し、マウス好中球とは反応しないことを確認済)を用いたフローサイトメトリーによりヒト由来好中球の陽性率を測定した。
その結果、図44に示す通り、非移植群ではヒトCD66b陽性細胞は検出されなかったが、ヒトES細胞由来血球の移植群ではヒトCD66b陽性率は0.42 ± 0.13%であった。この値は、「ヒト臍帯血CD34陽性細胞(造血幹細胞)をマウスOP9と共培養することで作成した白血球(CD66b=65%)」を用いて行った同様の実験における値(0.41 %)と同等(またはそれ以上)であった。
従って、ヒト胚性幹細胞から作成された好中球は、in vivoにおいて遊走能を持つことが確認された。
Claims (21)
- 霊長類動物胚性幹細胞の培養および継代方法であって、
(A)霊長類動物胚性幹細胞を、細胞外マトリックスでコートされた容器中、無フィーダーおよび無サイトカイン下、蛋白成分を含有する培地で培養するステップ、
(B)前記ステップ(A)で形成された胚性幹細胞のコロニーを細胞剥離剤の存在下、剥離するステップ、および
(C)前記ステップ(B)で得られた胚性幹細胞のコロニーを細胞外マトリックスでコートされた容器中、無フィーダーおよび無サイトカイン下、蛋白成分を含有する培地に播種するステップを含む方法。 - ステップ(A)において、霊長類動物胚性幹細胞のコロニーの大きさが約2倍〜約4倍となるまで培養する、請求項1記載の培養および継代方法。
- ステップ(A)における蛋白成分が血清アルブミンである請求項1または2記載の培養および継代方法。
- ステップ(B)における細胞剥離剤が、トリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼからなる群から選ばれた少なくとも1種類である、請求項1〜3のいずれか1項記載の培養および継代方法。
- ステップ(A)における細胞外マトリックスが、ヒトコラーゲン、ヒトラミニン、ヒトビトロネクチン、ヒトフィブロネクチンおよびヒト血清、並びにこれらの分解物およびこれら合成ペプチドからなる群から選ばれた1種類である、請求項1〜4のいずれか1項記載の培養および継代方法。
- (A)霊長類動物胚性幹細胞を、サイトカインの存在下、血清もしくは血清代替物を含むまたは無血清培地で、浮遊培養し、胚葉体または胚葉体類似細胞凝集塊を製造するステップ、
(B)ステップ(A)で得られた胚葉体または胚葉体類似細胞凝集塊を、サイトカインの存在下、接着培養して特定前駆細胞を製造するステップ、および
(C)ステップ(B)で得られた特定前駆細胞から浮遊細胞と接着細胞を分離するステップ、を含む霊長類動物胚性幹細胞からの血液細胞および/または血管内皮前駆細胞の製造方法。 - ステップ(A)の培養を、胚葉体様細胞凝集体が形成されるまで行う、請求項6記載の霊長類動物胚性幹細胞からの血管内皮前駆細胞および/または血液細胞の製造方法。
- サイトカインが、血管内皮成長因子(VEGF)、骨形成タンパク質4(BMP4)、幹細胞因子(SCF)、Flt3−リガンド(FL)、インターロイキン6(IL6)、インターロイキン3(IL3)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、巨核球増殖因子(TPO)、オンコスタチンM(OSM)、線維芽細胞成長因子2(FGF2)および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)からなる群より選ばれた少なくとも1種類である、請求項6または7に記載の霊長類動物胚性幹細胞からの血管内皮前駆細胞および/または血液細胞の製造方法。
- ステップ(C)において、特定細胞前駆細胞の接着細胞の分離に細胞剥離剤を用いる、請求項6〜8のいずれか1項記載の霊長類動物胚性幹細胞からの血管内皮前駆細胞および/または血液細胞の製造方法。
- 細胞剥離剤がトリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼからなる群から選ばれた少なくとも1種類である、請求項9記載の霊長類動物胚性幹細胞からの血管内皮前駆細胞および/または血液細胞の製造方法。
- (A)霊長類動物胚性幹細胞を、サイトカインの存在下、血清もしくは血清代替物を含むまたは無血清培地で浮遊培養し、胚葉体または胚葉体類似細胞凝集塊を製造するステップ、
(B)ステップ(A)で得られた胚葉体または胚葉体類似細胞凝集塊を、サイトカインの存在下、接着培養して浮遊細胞と接着細胞を含む特定前駆細胞を製造するステップ、および
(C)ステップ(B)で得られた特定前駆細胞を、浮遊細胞を分離しながら培養するステップ、を含む霊長類動物胚性幹細胞からの血液細胞、骨髄系細胞、造血ストロマ細胞および/または造血幹細胞の製造方法。 - ステップ(A)の培養を、胚葉体が形成されるまで行う、請求項11記載の霊長類動物胚性幹細胞からの血液細胞、骨髄系細胞、造血ストロマ細胞および/または造血幹細胞の製造方法。
- サイトカインが、血管内皮成長因子(VEGF)、骨形成タンパク質4(BMP4)、幹細胞因子(SCF)、Flt3−リガンド(FL)、インターロイキン6(IL6)、インターロイキン3(IL3)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、巨核球増殖因子(TPO)、オンコスタチンM(OSM)、線維芽細胞成長因子2(FGF2)および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)からなる群より選ばれた少なくとも1種類である、請求項11または12記載の霊長類動物胚性幹細胞からの血液細胞、骨髄系細胞、造血ストロマ細胞および/または造血幹細胞の製造方法。
- ステップ(C)において、特定細胞前駆細胞の接着細胞の分離に細胞剥離剤を用いる、請求項11〜13のいずれか1項記載の霊長類動物胚性幹細胞からの血液細胞、骨髄系細胞、造血ストロマ細胞および/または造血幹細胞の製造方法。
- 細胞剥離剤がトリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼからなる群から選ばれた少なくとも1種類である、請求項14記載の霊長類動物胚性幹細胞からの血液細胞、骨髄系細胞、造血ストロマ細胞および/または造血幹細胞の製造方法。
- 請求項6〜10のいずれか1項記載の製造方法により霊長類動物胚性幹細胞から分化誘導されてなる、実質的に単離された血管内皮前駆細胞。
- 請求項6〜14いずれか1項記載の製造方法により霊長類動物胚性幹細胞から分化誘導されてなる、実質的に単離された血液細胞。
- 請求項11〜14いずれか1項記載の製造方法により霊長類動物胚性幹細胞から分化誘導されてなる、実質的に単離された造血ストロマ細胞。
- 請求項11〜14いずれか1項記載の製造方法により霊長類動物胚性幹細胞から分化誘導されてなる、実質的に単離された造血幹細胞。
- 請求項11〜14いずれか1項記載の製造方法により霊長類動物胚性幹細胞から分化誘導されてなる、実質的に単離された骨髄系細胞。
- 請求項16〜19いずれか1項記載の実質的に単離された血管内皮前駆細胞、血液細胞、造血ストロマ細胞または造血幹細胞を含有する組成物。
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WO2010110596A2 (en) * | 2009-03-24 | 2010-09-30 | Korea Institute Of Science And Technology | Method for differentiation of stem cells into vascular cells and the induction of angiogenesis using the same |
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KR101947588B1 (ko) * | 2009-12-04 | 2019-02-14 | 스템 셀 앤드 리제너러티브 메디신 인터내셔날, 인크. | 인간 배아줄기세포 유래된 혈액모세포로부터 자연 살해 세포 및 수지상 세포를 생성하는 방법 |
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US10370644B2 (en) | 2012-12-31 | 2019-08-06 | Janssen Biotech, Inc. | Method for making human pluripotent suspension cultures and cells derived therefrom |
CA2896750A1 (en) | 2012-12-31 | 2014-07-03 | Janssen Biotech, Inc. | Suspension and clustering of human pluripotent cells for differentiation into pancreatic endocrine cells |
RU2658488C2 (ru) | 2012-12-31 | 2018-06-21 | Янссен Байотек, Инк. | Способ получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток |
KR101942769B1 (ko) | 2012-12-31 | 2019-01-28 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | Hb9 조절제를 사용하는 인간 배아 줄기세포의 췌장 내분비 세포로의 분화 |
KR20180128529A (ko) * | 2013-11-01 | 2018-12-03 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 췌장 내분비 세포로의 분화를 위한 인간 만능 줄기세포의 현탁 및 클러스터링 |
MX2016015004A (es) | 2014-05-16 | 2017-06-27 | Janssen Biotech Inc | Uso de moleculas pequeñas para mejorar la expresion de mafa en celulas endocrinas pancreaticas. |
KR20170084495A (ko) * | 2016-01-12 | 2017-07-20 | 건국대학교 글로컬산학협력단 | 줄기세포 유래 혈관세포 및 혈액모세포 비정제 동시 분화 방법 |
MA45479A (fr) | 2016-04-14 | 2019-02-20 | Janssen Biotech Inc | Différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules de l'endoderme de l'intestin moyen |
CN107182610A (zh) * | 2017-05-25 | 2017-09-22 | 兰溪市沉默生物科技有限公司 | 一种提高杜鹃花成苗率栽培基质及其制备方法 |
US11047849B2 (en) * | 2018-10-17 | 2021-06-29 | Mandom Corporation | Method for observing sebaceous gland and use thereof |
KR20210110570A (ko) * | 2018-10-24 | 2021-09-08 | 헤베셀 코포레이션 | 조혈 계통 세포를 제조하기 위한 방법 및 시스템 |
SG11202106642YA (en) | 2018-12-20 | 2021-07-29 | Sumitomo Chemical Co | Embryonic erythroblast-containing cell population and method for producing same, cell culture composition, and compound test method |
CN116688233A (zh) * | 2022-02-25 | 2023-09-05 | 上海软馨生物科技有限公司 | 一种组织工程软骨颗粒移植物及其制备方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005065354A2 (en) * | 2003-12-31 | 2005-07-21 | The Burnham Institute | Defined media for pluripotent stem cell culture |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU729377B2 (en) | 1997-10-23 | 2001-02-01 | Asterias Biotherapeutics, Inc. | Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells in feeder-free culture |
WO2005085426A1 (ja) * | 2004-03-04 | 2005-09-15 | Tanabe Seiyaku Co., Ltd. | 無フィ−ダ−分化用培地及び霊長類動物胚性幹細胞からの無フィ−ダ−分化方法 |
-
2007
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Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005065354A2 (en) * | 2003-12-31 | 2005-07-21 | The Burnham Institute | Defined media for pluripotent stem cell culture |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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