CN105886459A

CN105886459A - 用于细胞粘附、培养和分离的方法、表面改性培养板和组合物

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Publication number: CN105886459A
Application number: CN201610089917.2A
Authority: CN
Inventors: B.弗里耶; S.纳尔逊; V.尼尔森; T.布雷维; T.K.马伍德
Original assignee: Centocor Ortho Biotech Inc
Current assignee: Nunc AS
Priority date: 2008-02-21
Filing date: 2009-02-19
Publication date: 2016-08-24
Also published as: CN102046779A; KR102026622B1; BRPI0908033A2; CA2959401A1; KR20100125311A; RU2551772C2; KR20170129293A; KR20190057164A; MX2010009251A; WO2009105570A3; KR20170001727A; JP5733986B2; AU2009215516A1; JP2011512797A; RU2010138801A; AU2009215516B2; CA2715878C; BR122017025207B1; US20190249138A1; KR101731474B1

Abstract

本发明涉及哺乳动物细胞培养领域，并提供了用于使细胞粘附于固体基底表面、在固体基底表面上培养以及与固体基底表面分离的方法和组合物，所述表面含有至少约0.5%的N、O和N的总和大于或等于17.2%、接触角为至少约13.9度且不含饲养细胞层和吸附层。在本发明的一个实施例中，将所述细胞用能够抑制Rho激酶活性的化合物处理。在另一个实施例中，将所述细胞用能够抑制Rho活性的化合物处理。

Description

用于细胞粘附、培养和分离的方法、表面改性培养板和组合物

本申请是申请日为2009年2月19日，申请号为200980106108.6，发明名称为“用于细胞粘附、培养和分离的方法、表面改性培养板和组合物条”的发明专利的分案申请。

技术领域

本专利申请要求于2008年2月21日提交的临时申请No.61/030,544的优先权。

本发明涉及哺乳动物细胞培养领域，并且提供了用于细胞粘附于固体基底表面、在固体基底表面上培养以及从固体基底表面分离的方法和组合物，所述表面含有至少约0.5％的N，O和N的总数大于或等于17.2％，接触角为至少约13.9度，并且所述表面不含饲养细胞层和吸附层。在本发明的一个实施例中，用能够抑制Rho激酶活性的化合物处理细胞。在另一个实施例中，用能够抑制Rho活性的化合物处理细胞。

背景技术

哺乳动物细胞培养是生命与健康科学中许多进程之一。涉及贴壁依赖性细胞的哺乳动物细胞培养和分析用容器通常由玻璃或聚合物(例如聚苯乙烯)构成，其经常需要额外的表面处理以允许细胞粘附到容器表面。这样的处理可以包括在表面施加吸附层，例如，通过吸附、接枝或等离子体聚合技术。作为另外一种选择，表面处理可以借助于容器表面自身的化学改性，其可以通过(例如)大气华、射频真空等离子体、直流辉光放电和微波等离子体处理等实现。这些表面处理改变表面内的元素组成和化学基团。所得的具体化学组成取决于表面处理方法、能量和时间以及所用气体的组成。

例如，US5449383公开了一种基底，其包括本体聚合材料和适于支持细胞生长的聚合物薄层，该薄层包含耐再定位的聚合物，该聚合物包含等离子体聚合的酰胺单体，该单体具有用于细胞粘附的酰胺基团，其中所述酰胺单体选自二甲基甲酰胺和具有式R¹-CO-N(R²)R³的酰胺，其中R¹为脂族、脂环族或芳族基团，它们中每一个都可任选地由卤素原子或羟基取代，R²和R³各自独立地为氢或烷基，并且其中所述聚合物薄层促进所述细胞的粘附和增殖。

又如，EP0348969A1公开了一种用于聚合物表面内皮化的方法，包括：用由含有氮气的气态物质生成的等离子体接触聚合物表面，以此将所述聚合物表面改性成含有表面氨基，并将足够的内皮细胞施加到所述改性表面以在所述含氨基的表面上形成细胞的铺满层，而无需细胞增殖。

又如，EP0092302A2公开了一种用于影响在基底上的生长培养基中培养细胞的生长的方法，其特征在于通过对该基底的表面进行等离子体处理来改性该基底的表面化学，该等离子体由碳、氢、氧、氮、硫、磷、卤素或这些元素中任何一者的化合物产生。

又如，US 6,617,152B2公开了一种用于处理聚合物基底表面的设备，包括：(a)气体入口、微波能源和等离子混合室，该等离子混合室与气体入口和微波能源流体连通；(b)双室处理区，其具有包含在外处理室中的内处理室，所述内处理室有一个开口与所述外部腔室流体连通；(c)所述等离子混合室与所述外处理室通过小孔流体连通；(d)连接到所述外部腔室的真空出口线；以及(e)在此处将所述内处理室中的所述开口与所述小孔对齐，所述开口与所述小孔隔开预定的距离。

在一个例子中，US2003/0180903A1公开了一种聚合物基底，其具有可以在其上培养细胞的工作表面，其中表面氧含量为至少25％，这由用于化学分析的电子显微镜在约50埃的深度测得。

在一个例子中，WO2006114098公开了一种用于外科手术植入物和细胞引导组织培养表面的微结构生物相容性材料。选择生物材料表面的微结构以促进未分化的ES细胞的生长；促进ES细胞的神经元分化；或促进ES细胞的分化。

又如，Bigdeli等人(J.Biotechnol.133：146-153，2008(《生物技术》，第133卷第146-153页，2008年))描述了一种适应和/或选择待培养的人ES细胞的方法，使得人ES细胞在无饲养细胞条件下不分化并无需用胞外基质蛋白预处理固体基底表面，该方法涉及：(i)将培养基由人二倍体胚肺成纤维细胞条件培养基更换为新生软骨细胞条件培养基；(ii)然后将细胞从小鼠胚胎饲养细胞层通过酶法传代至经Matrigel^TM处理的培养板，然后传代至Costar^TM培养板，最后传代至Primaria^TM培养板；以及(iii)再次换回第一次使用的培养基。经此方法处理的很少人ES细胞会产生已建立细胞系，表明此方法涉及选择适于培养条件的人ES细胞。

改变表面自身元素组成和化学基团的表面处理已成功用于制备适于培养多种类型哺乳动物细胞的聚合物固体基底。然而，使用某些类型的哺乳动物细胞(例如，多能干细胞和人胚肾(HEK)293细胞)时，弱粘附和/或培养方面有明显的限制。

Graham等人(J.Gen.Virol.36：59-72，1977(《普通病毒学杂志》，第36卷第59-72页，1977年))公开了HEK293细胞系的生成。

可以在将HEK293细胞加入培养容器之前，通过使用(例如)胞外基质蛋白、聚赖氨酸、聚鸟氨酸或聚乙烯亚胺在固体基底表面制备吸附层来促进HEK293细胞粘附。然而，制备吸附层很耗时，并且通常得到非无菌的固体基底，其储存寿命比裸露固体基底更短。因此，明显需要用于促进HEK293细胞粘附到不含吸附层的固体基底的方法和材料。

目前培养多能干细胞、尤其是胚胎干(ES)细胞的方法要求复杂的培养条件，例如，在具有饲养细胞层的固体基底表面上或在具有胞外基质蛋白的吸附层的固体基底表面上培养胚胎干细胞。采用这些方法的培养体系通常使用饲养细胞或胞外基质蛋白，这些饲养细胞或胞外基质蛋白取自与培养中的干细胞的物种不同的物种(异种材料)。通过暴露于饲养细胞获得的培养基，即未分化ES细胞之外的细胞的条件培养基，可以用于培养ES细胞，并且可以在培养基中添加动物血清。

例如，Reubinoff等人(Nature Biotechnol.18：399-404，2000(《自然-生物技术》，第18卷第399-404页，2000年))和Thompson等人(Science 282：1145-1147，1998(《科学》，第282卷第1145-1147页，1998年))公开了使用小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞层来培养取自人囊胚的ES细胞系。

又如，Xu等人(Nature Biotechnology 19：971-974，2001(《自然-生物技术》，第19卷第971-974页，2001年))公开了在无分化无饲养细胞层的人ES细胞培养之前，使用Matrigel^TM和层粘连蛋白处理固体基底表面。

又如，Vallier等人(J.Cell Sci.118：4495-4509，2005(《细胞科学杂志》，第118卷第4495-4509页，2005年))公开了在无分化无饲养细胞层的人ES细胞培养之前，使用胎牛血清处理固体基底表面。

又如，WO2005014799公开了用于哺乳动物细胞维持、增殖和分化的条件培养基。WO2005014799描述了“根据本发明制备的培养基由鼠细胞、尤其是那些分化的和无限增殖化的转基因肝细胞(称为MMH(Met鼠肝细胞))的细胞分泌活性调整。”

又如，Wanatabe等人(Nature Biotechnol.35：681-686，2007(《自然-生物技术》，第35卷第681-686页，2007年))描述了“ROCK抑制剂允许分离的人胚胎干细胞成活”，并且证实减少了分离诱导的细胞凋亡，增加了克隆率(从大约1％增加到大约27％)，促进了基因转移后的亚克隆，该文献使用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养细胞，使用胶原和Matrigel^TM作为胞外基质蛋白，使用Y-27632或法舒地尔抑制ROCK。此外，用Y-27632处理的分离的人ES细胞可避免无血清悬浮培养中的细胞凋亡。

又如，Peerani等人(EMBO Journal 26：4744-4755，2007(《欧洲分子生物学组织杂志》，第26卷第4744-4755页，2007年))描述了“人胚胎干细胞(hESC)培养物中的空间结构的复杂性产生影响hESC命运的异质微环境(小生境(niche))。本研究证明可以通过改造hESC小生境特性来控制hESC的分化率和分化轨迹。小生境的大小和组成调节分化诱导因子和抑制因子之间的平衡。在机制上，Smadl信号的小生境大小依赖空间梯度是由于hESC和hESC来源的胚外内胚层(E×E)之间的拮抗相互作用产生。这些相互作用由骨形成蛋白2(BMP2)的E×E定位分泌及其拮抗剂生长分化因子3(GDF3)的hESC定位分泌介导。由GDF3、BMP2和Smadl的小干扰RNA(siRNA)以及Rho相关激酶(ROCK)抑制剂处理的hESC的缩微成像证明，对Smadl激活的独立控制可以挽救hESC的集落大小依赖分化。我们的结果首次示出了Smadl在整合空间信息和小生境大小依赖控制hESC自我更新和分化中的作用。”

又如，Koyanagi，M等人(J Neurosci Res.2007Sep 7[Epub ahead of print](《神经科学研究杂志》，2007年9月7日(先于印刷版的电子版)))描述了“已发现Rho-GTP酶参与包括神经元的多种细胞类型的细胞凋亡，但还未完全理解其作用机制。在此，我们研究了Rho和ROCK在胚胎干细胞来源的神经元前体细胞移植期间发生的细胞凋亡中的作用。我们发现神经元前体细胞的分离激活Rho并诱导细胞凋亡。用Rho抑制剂C3胞外酶和/或ROCK抑制剂Y-27632处理减少了20-30％的分离诱导的细胞凋亡(失巢凋亡)量。膜空泡化(其是细胞凋亡的早期形态标志)、半胱天冬酶3的切割和细胞色素c从线粒体的释放也因ROCK的抑制而减少。这些结果表明神经元前体细胞的分离诱发细胞死亡的内源性通路，其至少部分地由Rho/ROCK通路介导。此外，在一个动物移植模型中，Rho和/或ROCK的抑制可减少移植细胞的急性细胞凋亡。移植后，肿瘤坏死因子o和神经生长因子前体在移植物周围高表达。ROCK抑制也可减少由这些炎性细胞因子促进的细胞凋亡。综上所述，这些结果表明Rho/ROCK信号的抑制可以改善细胞替代疗法中移植细胞的存活。

又如，Yoneda等人(J.Cell Biol.170：443-453，August 3，2005(《细胞生物学杂志)》，第170卷第443-453页，2005年8月3日))描述了“据推定，同源哺乳动物rho激酶(ROCKI和II)是功能冗余的，主要依据是激酶构造过表达。作为Rho GTP酶的下游效应子，它们主要的底物为肌球蛋白轻链和肌球蛋白磷酸酶。这两个激酶都参与微丝束组装和平滑肌收缩。在此，成纤维细胞对纤粘蛋白的粘附性的分析揭示，虽然ROCK II丰度更高，但是其活性通常低于ROCK I。尽管存在持久性ROCK II和结合有鸟嘌呤核苷三磷酸的RhoA，由siRNA引起的ROCK I特异性减少会导致应力纤维和粘着斑的丧失。相反，微丝细胞骨架因ROCK II的下调而增强。对涂布有纤粘蛋白的小珠的吞噬摄取在清除ROCK II的细胞中强烈下调，但在缺少ROCK I的细胞中并不下调。这些效应部分源于ROCK pleckstrin同源结构域的不同脂质结合偏好。ROCK II连接磷脂酰肌醇3，4，5P₃，并对其水平敏感，而ROCK I无此性质。因此，内源ROCK被不同调控并继而涉及不同的肌球蛋白隔室。”

又如，Harb等人(PloS ONE 3(8)：e3001.oi：10.1371/journal.pone.0003001，August 2008(《公共科学图书馆·综合》，第3卷第8期第e3001页，数字对象唯一标识符(doi)：10.1371/journal.pone.0003001，2008年8月))公开了gho-Rock-肌球蛋白信号轴在小鼠和人ES细胞中调控基本细胞-细胞通讯中的重要作用，并将有助于人类多能干细胞在医学相容的无异质环境中的扩增[原文如此]。

使用异种材料可能不适用于采用多能干细胞的某些应用。可以使用可替代材料。例如，Stojkovic等人(Stem Cells 23：895-902，2005(《干细胞》，第23卷第895-902页，2005年))公开了在无分化无饲养细胞层的人ES细胞培养之前，使用人血清处理固体基底表面。

一种可替代的培养体系采用添加了能够促进ES细胞增殖的生长因子的无血清培养基。

例如，Cheon等人(BioReprod DOI：10.1095/biolreprod.105.046870；19Oct 2005(《生殖生物学》，数字对象唯一标识符：10.1095/biolreprod.105.046870，2005年10月19日))公开了一种无饲养细胞、无血清培养体系，其中ES细胞维持于添加有能够引发ES细胞自我更新的不同生长因子的非条件血清置换培养基中。

又如，Levenstein等人(Stem Cells 24：568-574，2006(《干细胞)》，第24卷第568-574页，2006年))公开了用于在不含成纤维细胞或条件培养基情况下使用添加有碱性成纤维细胞生长因子(FGF)的培养基长期培养人ES细胞的方法。

又如，US20050148070公开了一种在无血清和无成纤维细胞饲养细胞的限定培养基中培养人ES细胞的方法，此方法包括：在含有白蛋白、氨基酸、维生素、矿物质、至少一种转铁蛋白或转铁蛋白替代物、至少一种胰岛素或胰岛素替代物的培养基中培养干细胞，该培养基基本上不合哺乳动物胎血清，并且含有至少约100ng/ml能够激活FGF信号受体的FGF，其中提供该生长因子的来源不只是成纤维细胞饲养层，此培养基支持干细胞在无饲养细胞或条件培养基的情况下以未分化状态增殖。

又如，US20050233446公开了一种用于培养干细胞，包括未分化的灵长类原始干细胞的限定培养基。在溶液中，此培养基与培养中的干细胞相比基本上是等渗的。在给定培养物中，具体的培养基包含基本培养基以及各自一定量的碱性FGF、胰岛素和抗坏血酸，这些成分对于基本上支持原始干细胞的未分化生长是必需的。

又如，US6800480描述“在一个实施例中，提供了用于以基本上未分化状态生长灵长类来源的原始干细胞的细胞培养基，其包括低渗透压、低内毒素碱性培养基，此培养基对于支持灵长类来源的原始干细胞的生长是有效的。碱性培养基混合了有效支持灵长类来源的原始干细胞生长的营养血清和选自饲养细胞和衍生自饲养细胞的胞外基质组分的基质。该培养基还包括非必需氨基酸、抗氧化剂和选自核苷和丙酮酸盐的第一生长因子。”

又如，US20050244962描述：“在一个方面，本发明提供了一种培养灵长类胚胎干细胞的方法。在基本上不含哺乳动物胎血清(优选地也基本上不合任何动物血清)的培养物中，并在存在由不只是成纤维细胞饲养层的来源提供的成纤维细胞生长因子情况下培养干细胞。在一种优选的形式中，通过添加足够的成纤维细胞生长因子，此成纤维细胞饲养层(以前维持干细胞培养所需)变成了非必需的。”

又如，WO2005065354公开了一种基本上不含饲养层和血清的限定的等渗培养基，其包含：a.基本培养基；b.一定量的碱性成纤维细胞生长因子，其足以支持基本上未分化的哺乳动物干细胞的生长；c.一定量的胰岛素，其足以支持基本上未分化的哺乳动物干细胞的生长；以及d.一定量的抗坏血酸，其足以支持基本上未分化的哺乳动物干细胞的生长。

又如，WO2005086845公开了一种用于维持未分化干细胞的方法，所述方法包括：将干细胞暴露于一定量的转化生长因子β(TGFβ)蛋白家族中的一个成员、成纤维细胞生长因子(FGF)蛋白家族中的一个成员或烟酰胺(NIC)，使得足以在未分化的状态下维持细胞足够时间，从而获得所需结果。

多能干细胞为研究和药物筛选提供潜在资源。目前，人ES细胞系的大规模培养是困难的，并且带来了严峻挑战。针对这些挑战的可能解决方案是以单细胞形式传代和培养人ES细胞。单细胞更适合标准组织培养技术，例如，计数、转染等。

例如，Nicolas等人提供了一种用于从单细胞生产和扩增人ES细胞系的方法，此单细胞通过慢病毒载体进行遗传修饰，然后通过荧光激活细胞分选来分离(Stem CellsDev.16：109-118，2007(《干细胞与发育》，第16卷第109-118页，2007年))。

又如，美国专利申请US2005158852公开了一种“用于改善人胚胎干细胞单细胞生长和存活的方法。此方法包括以下步骤：获得未分化hES单细胞；将未分化单细胞与胞外基质混合以包围该细胞；以及在含有营养培养基的生长环境中，将该混合物接种到饲养细胞上”。

又如，Sidhu等人(Stem Cells Dev.15：61-69，2006(《干细胞与发育》，第15卷第61-69页，2006年))描述了通过流式细胞术进行单细胞制备物的分选，首次报道了三种衍生自亲本系hES3的人ES细胞克隆hES 3.1、3.2和3.3。

然而，人ES细胞作为单细胞的传代和培养导致遗传异常和多能性丧失。培养条件对于多能性和遗传稳定性的保持是重要的。通常，通过人工或用酶学试剂(例如胶原酶、释放酶(liberase)或分散酶(dispase))进行人ES细胞系的传代。

例如，Draper等人注意到“在三种独立的人胚胎干细胞系中，在五种独立的情形下，涉及17号染色体长臂的获得的核型改变”的存在(Nature Biotechnol.22：53-54，2004(《自然-生物技术》，第22卷第53-54页，2004年))。

又如，Buzzard等人描述，“我们曾经只检测到一个核型改变事件......考虑到我们的方法与大部分其他研究组所用的方法完全不同，所用的培养方法可能对我们的结果……有一些影响。通常我们在7天后通过首先用破碎的移液管边缘分离集落来传代人ES细胞……细胞分离的酶学或化学方法未并入该方法中。我们推测这可以解释我们拥有的hES(人ES)细胞的相对细胞遗传弹性(cytogenetic resilience)。”(NatureBiotechnol.22：381-382，2004(《自然-生物技术》，第22卷第381-382页，2004年))。

又如，Mitalipova等人.描述了“批量传代方法……能够在培养物的扩大传代后保持非整倍性细胞群，但可用于更短的周期(高达至少15次传代)，而无核型异常……可以在长期人工增殖条件下，随后在要求比人工传代方法单独能够提供的数量更多的hES细胞的实验中进行有限的批量传代后，保持hES细胞中的正常核型。”(Nature Biotechnol.23：19-20，2005(《自然-生物技术》，第23卷第19-20页，2005年))。

又如，Heng等人描述了“结果证明第二个方案(用轻轻抽吸进行胰蛋白酶化)比第一个方案(用划痕进行胶原酶处理)对细胞活力的危害更小。这继而转化为更高的冻融存活率。”(Biotechnology and Applied Biochemistry 47：33-37，2007(《生物技术与应用生物化学)》，第47卷第33-37页，2007年))。

又如，Hasegawa等人描述，“我们已经建立了耐完全分离的hEs细胞亚系。这些细胞显示具有高传代效率和高克隆效率，并且它们保持分化成三个胚层的能力。”(Stem Cells24：2649-2660，2006(《干细胞》，第24卷第2649-2660页，2006年))。

因此，明显需要用于培养哺乳动物细胞的方法和组合物，包括在不含饲养细胞和吸附层、同时保持细胞多能性的情况下培养多能干细胞。

发明内容

在一个实施例中，本发明提供了用于细胞粘附于固体基底表面、在固体基底表面上培养以及从固体基底表面分离的方法和组合物，所述表面含有至少约0.5％的N，O和N的总数大于或等于17.2％，接触角为至少约13.9度，并且所述表面不含饲养细胞层和吸附层。

在一个实施例中，本发明提供了一种促进细胞粘附于表面的方法，所述表面包含至少约0.5％的N，O和N的总数大于或等于17.2％，接触角为至少约13.9度，并且所述表面不合饲养细胞层和吸附层，所述方法包括以下步骤：

a.获得细胞悬浮液，

b.用至少一种选自以下物质的化合物处理该细胞悬浮液：能够抑制Rho激酶活性的化合物和能够抑制Rho活性的化合物，以及

c.将该细胞悬浮液添加到表面，并使细胞粘附。

在一个实施例中，在细胞粘附于表面后，对细胞进行培养。在一个替代实施例中，去除此至少一种化合物。

在一个实施例中，通过去除此至少一种化合物来从表面分离细胞。

在一个实施例中，细胞悬浮液为细胞群悬浮液。在一个替代实施例中，细胞悬浮液为单细胞悬浮液。

在一个实施例中，细胞为多能干细胞。在一个替代实施例中，细胞为干细胞。

在一个实施例中，本发明提供了一种促进细胞粘附于表面的方法，所述表面包含至少约0.9％的N，O和N的总数大于或等于22.3％，接触角为至少约13.9度，并且所述表面不合饲养细胞层和吸附层，所述方法包括以下步骤：

a.获得细胞悬浮液，以及

b.将该细胞悬浮液添加到表面，并使细胞粘附。

附图说明

图1示出了人ES细胞系H1的细胞相差显微图(4x)，这些细胞以用LIBERASE处理的细胞群形式在表面改性培养板2、3或4上传代两次。也示出了培养在用稀释比为1∶30的Matrigel^TM处理的培养板上、Nunclon Delta^TM培养板上的人ES细胞系H1的细胞图象。

图2示出了10μM Y-27632对人ES细胞粘附于表面改性培养板的影响。该图示出了人ES细胞系H1的细胞相差显微图(4x)，这些细胞以细胞群形式在表面改性培养板3和4上传代两次。然后在含有10μM Y-27632的MEF条件培养基中、于表面改性培养板2、3或4上传代细胞。在拍照之前培养细胞四天。将在不存在Y-27632的情况下培养的细胞作为对照。

图3示出了对培养在本发明表面改性培养板上的人ES细胞进行化合物处理的时间进程示意图。人ES细胞系H1细胞以用LIBERASE处理的细胞群形式在表面改性培养板3或4上传代四次，并培养于MEF条件培养基中。传代后的前两天用10μM的Rho激酶抑制剂Y-27632或0.5ng/ml的Rho抑制剂(胞外酶C3转移酶的细胞可渗透形式)处理细胞。用Rho激酶抑制剂Y-27632处理细胞，随后每次在表面改性培养板3上传代后的前两天用Y-27632处理细胞，经过这些处理的细胞称为“7s”。用Rho激酶抑制剂Y-27632处理细胞，随后每次在表面改性培养板4上传代后的前两天用Y-27632处理细胞，经过这些处理的细胞称为“3s”。每次传代后，用Rho抑制剂处理细胞两天，再用Rho激酶抑制剂Y-27632处理细胞两天，随后在表面改性培养板3上传代后的前两天用Y-27632处理细胞，经过这些处理的细胞称为“5s”。每次传代后，用Rho抑制剂处理细胞两天，再用Rho激酶抑制剂Y-27632处理细胞两天，随后在表面改性培养板4上传代后的前两天用Y-27632处理细胞，经过这些处理的细胞称为“1s”。

图4示出了在根据图6概括的方案处理的人ES细胞中，由qRT-PCR测定的多能性与分化相关标记物的表达。

图5示出了人ES细胞系H1细胞中的多能性标记物的表达，这由流式细胞术在第4代(p4)、第9代(p9)以及第10、11或12代(p10、p11、或p12)测定。

图6示出了人ES细胞系H1的细胞免疫荧光图象，这些细胞以用LIBERASE处理的细胞群形式在表面改性培养板4上连续传代，并培养于MEF条件培养基中。在表面改性培养板4上培养了传代11次的细胞中检测到多能性标记物相关蛋白的表达。每次传代后，用10μM的Y-27632处理细胞两天。

图7示出了人ES细胞在表面改性培养板上培养后形成定形内胚层的能力。人ES细胞系H1细胞以用LIBERASE处理的细胞群形式在表面改性培养板3或4上传代11次，并培养于MEF条件培养基中。在第8代(p8)和第10或11代(p10-11)，用含有0.5％FBS、100ng/ml激活素A和20ng/ml Wnt3a的DMEM：F12培养基处理细胞两天，然后用含有2％FBS和100ng/ml激活素A的DMEM：F12培养基再处理细胞三天。此图上的Y轴示出了由流式细胞术测得的阳性CXCR4细胞百分数。还可参见表5。

图8示出了人ES细胞在表面改性培养板上培养后形成胰内胚层的能力。人ES细胞系H1细胞以用LIBERASE处理的细胞群形式在表面改性培养板3或4上传代八次，并培养于MEF条件培养基中。在第8代(p8)，通过用含有0.5％FBS、100ng/ml激活素A和20ng/ml Wnt3a的DMEM：F12培养基处理细胞两天，然后用含有2％FBS和100ng/ml激活素A的DMEM：F12培养基再处理细胞三天，从而使细胞分化成定形内胚层。用含有2％FBS、100ng/ml FGF-10和1μM环巴胺-KAAD的DMEM：F12培养基处理四天后，细胞进一步分化成胚胎前肠。用含有1％B-27、100ng/ml FGF-10、1μM环巴胺-KAAD和2μM视黄酸的DMEM：F12培养基处理四天后，细胞分化成胰内胚层。对细胞进行免疫荧光染色，以检测PDX-1(绿色)和E-钙粘蛋白(红色)，并用Hoechst染料(蓝色)确定总细胞数目。

图9示出了在表面改性培养板上培养的人ES细胞形成胚状体的能力。

图10示出了在表面改性培养板4上培养的人ES细胞的核型。

图11示出了用Rho激酶抑制剂(得自EMD bioscierces的Y-27632、得自Sigma的Y-27632、法舒地尔和羟基法舒地尔)处理对人ES细胞粘附于表面改性培养板的影响。在含有所列浓度的所示化合物的培养基中培养细胞三天。用结晶紫为细胞染色并拍照。

图12示出了Y-27632对人ES细胞在表面改性培养板上的粘附性的剂量反应。第一天将在特定浓度(0、1、2、4或10μM的Y-27632)下的各种浓度的Rho激酶抑制剂Y-27632添加到培养物中。然后，从第二天开始在含有10μM Y-27632的培养基中维持细胞五天，并每天更换培养基。在第五天将培养基从培养板上去除，用0.5％的结晶紫为细胞染色并拍照。

图13示出了在含或不含10μM Y-27632的表面改性培养板2、3或4上传代四天后，人ES细胞集落的形成。

图14示出了在用含或不含10μM Y-27632的Matrigel^TM处理平板上传代四天后，人ES细胞集落的形成。

图15示出了用Y-27632连续和间歇处理人ES细胞对细胞在表面改性培养板上粘附性的差异。

图16描述了人ES细胞系H9的细胞图象，这些细胞以单细胞形式传代，并在含(B)或不合(A)10μM Y-27632的MEF条件培养基中、于表面改性培养板3上接种。接种24小时后拍照。

图17描述了来自人ES细胞系H9的细胞的多能性相关标记物的表达，使用TrypLE^TMExpress将这些细胞以单细胞形式传代5次，并接种到含或不含10μM Y-27632(Y)的表面改性培养板3和4上。X轴上列出了多能性标记物，Y轴上示出了阳性细胞的百分比。

图18描述了来自人ES细胞系H9的细胞的细胞总数，这些细胞以单细胞形式传代，并接种到表面改性培养板3和4上。检测10μM的Y-27632(Y)对在Matrigel^TM上传代的细胞(初始型N)和在表面改性培养板上传代10次的细胞(适应型，A)的细胞数目的影响。X轴上列出了不同的细胞条件，Y轴示出了除以10⁴后的细胞数目。

图19描述了来自人ES细胞系H9的细胞的生长速率，在此项研究之前，将这些细胞以单细胞形式在Matrigel^TM处理培养板上传代。将细胞以10⁴/cm²的密度接种，并在含或不含10μM Y-27632的MEF条件培养基中、于表面改性培养板3和4上培养。Y轴示出了在接种后2、3或4天收集的细胞数目(除以10⁴)。

图20描述了来自人ES细胞系H9的细胞的生长速率，在此项研究之前，将这些细胞以单细胞形式在表面改性培养板上传代10次。将细胞以10⁴/cm²的密度接种，并在含或不含10μM Y-27632的MEF条件培养基中、于表面改性培养板3和4上培养。Y轴示出了在接种后2、3或4天收集的细胞数目(除以10⁴)。

图21描述了来自人ES细胞系H9的细胞的图象，这些细胞以单细胞形式传代，并接种到96孔板格式的表面改性培养板2-4和13上。MEF条件培养基含有10μM的Y-27632。接种48小时后拍照。

图22示出了来自人ES细胞系H9的细胞的能力，这些细胞以单细胞形式传代，并接种到表面改性培养板3和4上以分化成定形内胚层。通过用流式细胞术测量CXCR的表达来确定定形内胚层形成的程度。研究了10μM Y-27632对定形内胚层形成的影响。在扩增期间用Y-27632处理细胞。将在Matrigel^TM上扩增和分化的细胞作为对照。Y轴示出了由流式细胞术测得的阳性CXCR4细胞的百分比。

图23示出了来自人ES细胞系H9的细胞的能力，这些细胞以单细胞形式传代，并接种到表面改性培养板3和4上以分化成胰内胚层。将细胞接种到表面改性培养板上，培养于含10μM Y-27632的MEF条件培养基中，并在分化前在表面改性培养板上传代8次。Y轴示出了通过q-PCR在后方前肠期(PF)和表达激素的内分泌细胞期(EN)测定的胰分化标记物(Ngn3、Pdx1、胰岛素)表达增加的倍数。

图24示出了人ES细胞在表面改性培养板上的粘附性。将第50代人H9ES细胞以1∶2的稀释比接种到表面3和4以及CellBIND^TM和Primaria^TM上。在接种24小时后将培养基从培养板去除，用0.5％的结晶紫为细胞染色并拍照。箭头指示的是集落。

图25示出了人ES细胞在表面改性培养板上的粘附性。将第50代人H9ES细胞以1∶2的稀释比接种到含各种浓度Y-27632(0、1、2、4、10和20微摩尔)的表面3和4以及CellBIND^TM和Primaria^TM上。在接种24小时后将培养基从培养板去除，用0.5％的结晶紫为细胞染色并拍照。集落在孔上是黑点。箭头用于突出显示未处理孔上的集落。

图26示出了人ES细胞在表面改性培养板上的粘附性。将第53代人H9ES细胞以1∶3的稀释比接种到含或不含Y-27632(0或20微摩尔)的表面2-4和13以及CellBIND^TM和Primaria^TM上。在接种48小时后将培养基从培养板去除，用0.5％的结晶紫为细胞染色并拍照。集落在孔上是黑点。箭头用于突出显示未处理孔上的集落。

图27示出了将人H9ES细胞粘附于表面改性培养板14和15上的第一次试验(10月)和第二次试验(12月)，以及将人H1ES细胞粘附于表面改性培养板14和15的试验。将第42代和第53代的人H9ES细胞、第57代的人H1ES细胞以1∶2或1∶3的稀释比接种到含20微摩尔Y-27632的改性表面上。在接种24-48小时后将培养基从培养板去除，用0.5％的结晶紫为细胞染色并拍照。集落在孔上是黑点。箭头用于突出显示培养板上的集落。

图28示出了人ES细胞在限定培养基mTeSR^TM中在表面改性培养板4上的粘附性。将第50代人H9ES细胞以1∶2的稀释比接种到在孔中含或不含Y-27632(0或20微摩尔)的改性表面上，孔用蛋白(0.1％明胶、2％BSA、0.34mg/ml大鼠I型胶原、稀释比为1∶1000的Matrigel^TM或稀释比为1∶5000的Matrigel^TM)处理或不处理。在接种48小时后将培养基从培养板去除，用0.5％的结晶紫为细胞染色并拍照。集落在孔上是黑点。

图29示出了用静滴法在11周内测量的表面改性培养板的水接触角。在表面处理和消毒一周后进行第一次测量。每个数据点代表平均接触角(每一滴测量一次，共7滴)。在与表面1-4和13相同的实验条件下测量在Nuclon Delta^TM和CellBIND^TM培养板上的接触角，但在第一次测量之前，进行表面处理和消毒12周以上(在第一次测量之前消毒NuclonDelta^TM*一周)。

图30示出了用带正电的结晶紫的表面反应性测量的表面改性培养板上的负电荷密度。检测每个表面的三个样品，对来自每个样品的解吸结晶紫的吸光度测量重复进行三次。给出了九次测量的平均值和标准偏差。

图31示出了固体基底表面和Y-27632对培养于化学成分限定的无血清Pro293a-CDM^TM培养基(A)或培养于添加有10％胎牛血清的EMEM培养基(B)中的HEK293细胞的粘附性和生长的影响。将HEK293细胞接种在具有CellBIND^TM表面、Nunclon Delta^TM表面或表面4的96孔板中。粘附于这些表面的HEK293细胞的数目作为培养条件和Y-27632浓度的函数显示。细胞受到：(i)在培养过程中用Y-27632连续处理96小时(Y-27632 96小时接触)；或(ii)在培养过程中用Y-27632连续处理48小时，随后更换培养基，然后在培养过程中在不含Y-27632情况下处理48小时(Y-2763248小时接触/48小时不接触)。在不合有Y-27632的培养基(不含Y-27632)中培养的HEK293细胞以与在含有Y-27632的培养基中培养的细胞同样的方式操作，也就是说，不更换培养基的情况下培养96小时，或处理48小时后更换培养基。当施加浓度为2.0和5.0μM时，Y-27632可促进HEK293细胞粘附于表面4和CellBIND^TM表面。孵育48小时后去除Y-27632导致大量细胞从表面4和CellBIND^TM表面分离。示出了三次测量的平均值和标准偏差。

图32示出了固体基底表面以及Rho激酶抑制剂Y-27632和H-1152对HEK293细胞在添加有10％胎牛血清的EMEM培养基中的生长的影响。将HEK293细胞接种到具有表面4(A)或未处理的(但用25kGy的γ射线照射过)聚苯乙烯表面(B)的Multidish 24孔培养板上。

图33示出了H-1152和表面4对HEK293细胞粘附性和形态的影响。将HEK293细胞接种到Multidish 12孔培养板中的添加有10％胎牛血清和H-1152的EMEM培养基中，并在自动的、位于培养箱内的显微镜内孵育67小时。A中的生长曲线和B中的显微照片示出了H-1152对HEK293细胞在表面4上的粘附性和生长的一般影响，以及更换培养基对HEK293细胞在含或不含H-1152的表面4上的粘附性和形态的影响。

图34示出了生长在含或不含2.5μM Y-27632的表面4和Nunclon Delta^TM表面上的HEK293细胞的3次传代的生长曲线。通过胰蛋白酶化将生长在添加有10％胎牛血清的EMEM培养基中的HEK293细胞传代3次。

图35示出了Rho激酶抑制对人胚胎干细胞系H1的细胞粘附于表面改性培养板4、18和19以及Primaria^TM上的影响。在所有表面上，孔A和B为对照孔。孔C和D含有10μM Y-27632。孔E和F含有3μM H1152甘氨酰(H1152-glycyl)。孔G和H含有10μM H1152甘氨酰。

图36示出了Rho激酶抑制对人胚胎干细胞系H1细胞粘附于表面改性培养板30上的影响。(--)＝未处理。(RI)＝3μM H1152甘氨酰。(MG)＝稀释比为1∶30的MATRIGEL的吸附层。(MG+RI)＝稀释比为1∶30的MATRIGEL+3μM H1152甘氨酰的吸附层。

图37示出了Rho激酶抑制对人胚胎干细胞系H1细胞粘附于表面改性培养板31上的影响。(--)＝未处理。(RI)＝3μM H1152甘氨酰。(MG)＝稀释比为1∶30的MATRIGEL的吸附层。(MG+RI)＝稀释比为1∶30的MATRIGEL+3μM H1152甘氨酰的吸附层。

图38示出了Rho激酶抑制对人胚胎干细胞系H1细胞粘附于表面改性培养板32上的影响。(--)＝未处理。(RI)＝3μM H1152甘氨酰。(MG)＝稀释比为1∶30的MATRIGEL的吸附层。(MG+RI)＝稀释比为1∶30的MATRIGEL+3μM H1152甘氨酰的吸附层。

图39示出了Rho激酶抑制对人胚胎干细胞系H1细胞粘附于表面改性培养板33上的影响。(--)＝未处理。(RI)＝3μM H1152甘氨酰。(MG)＝稀释比为1∶30的MATRIGEL的吸附层。(MG+RI)＝稀释比为1∶30的MATRIGEL+3μM H1152甘氨酰的吸附层。

图40示出了Rho激酶抑制对人胚胎干细胞系H1细胞粘附于表面改性培养板34上的影响。(--)＝未处理。(RI)＝3μM H1152甘氨酰。(MG)＝稀释比为1∶30的MATRIGEL的吸附层。(MG+RI)＝稀释比为1∶30的MATRIGEL+3μM H1152甘氨酰的吸附层。

图41示出了用静滴法在40周内测量的表面改性培养板的水接触角。

图42示出了用静滴法测量的表面改性培养板的水接触角。

图43示出了用带正电的结晶紫的表面反应性测量的表面改性培养板上的负电荷密度。

图44示出了用带正电的结晶紫的表面反应性测量的表面改性培养板4、22-24和29上的负电荷密度。检测每个表面的三个样品，对来自每个样品的解吸结晶紫的吸光度测量重复进行三次。将表面4、22-24和29的负电荷密度归一化到Nunclon Delta^TM表面的负电荷密度。给出了九次测量的平均值和标准偏差。

具体实施方式

为了以不受限制的方式清晰说明本公开，将本发明的具体实施方式分成下列描述或阐明本发明某些特征、实施例或应用的小节。

定义

如本文所用，“吸附层”是指在固体基底表面上通过共价键(也称为接枝)或非共价键(也称为吸附)将分子附着在表面上而形成的一层。用于制备吸附层的分子可以为(例如)蛋白质分子，其可包括(例如)胞外基质蛋白、氨基酸等，还可以为非生物分子，例如，聚乙烯亚胺。

“β细胞系”是指这样的细胞，其具有转录因子PDX-1和下列转录因子中的至少一种的阳性基因表达：NGN-3、Nkx2.2、Nkx6.1、NeuroD、Isl-1、HNF-3β、MAFA、Pax4和Pax6。表达β细胞系特征性标记物的细胞包括β细胞。

如本文所用，“表达定形内胚层系特征性标记物的细胞”是指表达下列标记物中的至少一种标记物的细胞：SOX-17、GATA-4、HNF-3β、GSC、Cerl、Nodal、FGF-8、短尾蛋白(Brachyury)、Mix样同源盒蛋白、FGF-4CD48、脱中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGF-17、GATA-6、CXCR4、C-Kit、CD99或OTX2。表达定形内胚层系特征性标记物的细胞包括原条前体细胞、原条细胞、中内胚层细胞和定形内胚层细胞。

如本文所用，“表达胰内胚层系特征性标记物的细胞”是指表达下列标记物中的至少一种标记物的细胞：PDX-1、HNF-1β、PTF-1α、HNF-6或HB9。表达胰内胚层系特征性标记物的细胞包括胰内胚层细胞。

如本文所用，“表达胰内分泌系特征性标记物的细胞”是指表达下列标记物中的至少一种标记物的细胞：NGN-3、NeuroD、Islet-1、PDX-1、NKX6.1、Pax-4、Ngn-3或PTF-1α。表达胰内分泌系特征性标记物的细胞包括胰内分泌细胞、表达胰激素的细胞、分泌胰激素的细胞和β细胞系的细胞。

如本文所用，“定形内胚层”是指具有以下特征的细胞：这些细胞来自原肠胚形成期间的外胚层并形成胃肠道及其衍生物。定形内胚层细胞表达下列标记物：CXCR4、HNF-3β、GATA-4、SOX-17、Cerberus、OTX2、鹅素(goosecoid)、c-Kit、CD99和Mixll。

“胞外基质蛋白”是指通常在体内或胎盘内的细胞间发现的蛋白质分子。胞外基质蛋白可以来自组织、体液(例如血液)或非重组细胞条件培养基或重组细胞条件培养基或细菌条件培养基。

如本文所用，“胚外内胚层”是指表达下列标记物中的至少一种标记物的细胞群：SOX-7、AFP和SPARC。

“HEK293细胞”是指由正常人胚肾细胞培养物转化而来的细胞系，如Graham等人(J.Gen.Virol.36：59-72，1977)所述，并且也指衍生自此亲本细胞系的任何细胞。

如本文所用，“标记物”是指在所关注细胞内差异表达的核酸或多肽分子。在上下文中，差异表达是指对于阳性标记物而言表达水平升高，对于阴性标记物而言表达水平下降。与其他细胞相比，所关注细胞中的核酸或多肽标记物的可检测水平足够高或足够低，使得可以使用本领域已知的多种方法识别所关注细胞，并将所关注细胞与其他细胞区分开。

如本文所用，“基质”是指细胞可粘附的三维支架。

如本文所用，“中内胚层细胞”是指表达下列标记物中的至少一种标记物的细胞：CD48、脱中胚蛋白(EOMES)、SOX-17、DKK4、HNF-3β、GSC、FGF-17、GATA-6。

如本文所用，“胰内分泌细胞”或“表达胰激素的细胞”是指能够表达下列激素中的至少一种激素的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。

如本文所用，“分泌胰激素的细胞”是指能够分泌下列激素中的至少一种激素的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。

如本文所用，“原条前体细胞”是指表达下列标记物中的至少一种标记物的细胞：Nodal或FGF-8。

如本文所用，“原条细胞”是指表达下列标记物中的至少一种标记物的细胞：短尾蛋白、Mix样同源盒蛋白或FGF-4。

如本文所用，“表面”是指旨在用于细胞培养或分析的固体基底容器或基质的分子最外层。可以分别用X射线光电子能谱(XPS)、原子力显微镜(AFM)和接触角测量来分析表面的元素组成、粗糙度和润湿性。

“表面改性培养板”是指含有在实例16、17和26中描述的表面1-34中的任何一种表面的容器，或含有以商品名为Nunclon Delta^TM、Costar^TM、Falcon^TM、CellBIND^TM和Primaria^TM出售的表面的培养板。容器可以(例如)由诸如聚苯乙烯(PS)、环烯烃共聚物(COC)、聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或苯乙烯丙烯腈共聚物(SAN)等聚合物制成。

干细胞为未分化细胞，可定义为其在单细胞水平具有自我更新和分化以产生后代细胞的能力，包括自我更新的祖细胞、非更新的祖细胞和最终分化的细胞。干细胞的特征还在于：其具有在体外由多种胚层(内胚层、中胚层和外胚层)分化成各种细胞系的功能细胞的能力、移植后产生多种胚层的组织的能力以及注射入囊胚后基本上有助于大部分(如果不是所有的话)组织形成的能力。

根据它们的发育潜能将干细胞分为：(i)全能干细胞，意指能够产生所有胚胎或胚外细胞类型；(ii)多能干细胞，意指能够产生所有胚胎细胞类型：(iii)专能干细胞，意指能够产生一个亚群的细胞系，但这些细胞系都位于特定的组织、器官或生理系统内(例如，造血干细胞(HSC)能够产生包括HSC(自我更新)、血细胞限制性寡能祖细胞和为血液正常组分的所有细胞类型和成分(如血小板)的后代；(iv)寡能干细胞，意指能够产生比专能干细胞更为限制的亚群的细胞系；以及(v)单能干细胞，意指能够产生单个细胞系(如精子发生干细胞)。

分化是这样一个过程，通过该过程，非特化的(“非定向的”)或少特化的细胞可获得特化细胞(例如，神经细胞或肌细胞)的特征。分化的细胞或诱导分化的细胞是已经在细胞谱系中占据更特化的(“定向的”)位置的细胞。当应用于分化过程时，术语“定向的”是指已经在分化通路中进行到一定程度的细胞，其中在正常情况下，该细胞将继续分化成特定的细胞类型或一个亚群的细胞类型，并且在正常情况下，不能分化成不同的细胞类型或回复至更少分化的细胞类型。去分化是指这样一个过程，通过该过程，细胞回复至细胞谱系内更少特化的(或定向的)位置。如本文所用，细胞谱系限定了细胞遗传性，也就是说，它来自哪种细胞和它能够产生什么细胞。细胞谱系将细胞定位于发育和分化的遗传计划内。谱系特异性标记物是指与所关注谱系的细胞表型特异性相关并能够用于评价非定向细胞向所关注谱系的分化的特征。

各种术语用于描述培养中的细胞。“维持”通常是指在促进细胞生长和/或分裂条件下，在生长培养基中接种细胞，这些条件可以或不可以产生更大的细胞群。“传代”是指在促进细胞生长和/或分裂条件下，从一个培养容器移去细胞并将它们接种到第二个培养容器的过程。

细胞或细胞系的特定群体有时是指或特征在于其已传代的次数。例如，一个已传代了十次的培养细胞群可以指P10培养物。原代培养，即，将细胞从组织分离后的第一次培养，指定为P0。第一次传代培养后，细胞被描述为第二培养物(P1或第1代)。第二次传代培养后，细胞成为第三培养物(P2或第2代)，以此类推。本领域的技术人员应当理解，在传代期间，可以有多次群体倍增；因此，培养物的群体倍增数大于传代数。细胞在传代间隔的时间内的扩增(即，群体倍增数)取决于多种因素，包括(但不限于)接种密度、基底、培养基、生长条件和传代间隔的时间。

在一个实施例中，本发明提供了一种促进细胞粘附于表面上的方法，该表面含有至少约0.9％的N，O和N的总数大于或等于22.3％，接触角为至少约13.9度，并且该表面不含饲养细胞层和吸附层，该方法包括以下步骤：

a.获得细胞悬浮液，以及

b.将细胞悬浮液添加到表面，并使细胞粘附。

在一个实施例中，本发明提供了一种促进细胞粘附于表面上的方法，该表面含有至少约0.5％的N，O和N的总数大于或等于17.2％，接触角为至少约13.9度，并且该表面不含饲养细胞层和吸附层，该方法包括以下步骤：

a.获得细胞悬浮液，

b.用选自下列物质的至少一种化合物处理细胞悬浮液：能够抑制Rho激酶活性的化合物和能够抑制Rho活性的化合物，以及

c.将细胞悬浮液添加到表面，并使细胞粘附。

在一个实施例中，该细胞悬浮液为细胞群悬浮液。在一个替代实施例中，该细胞悬浮液为单细胞悬浮液。

在一个实施例中，该细胞为多能干细胞。在一个替代实施例中，该细胞为干细胞。

在一个实施例中，该表面具有吸附层。在一个实施例中，该吸附层为胞外基质组分，例如，衍生自基底膜或可以形成一部分粘附分子受体-配体偶联物的胞外基质组分。在一个实施例中，该吸附层由MATRIGEL(Becton Dickenson)制成。MATRIGEL是由Engelbreth-Holm Swarm肿瘤细胞制备的可溶性制品，其在室温形成凝胶，从而形成重组基底膜。蛋白质吸附层也可以由层粘连蛋白、纤粘蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、硫酸乙酰肝素等单独或以各种组合形成。

在一个实施例中，细胞在粘附于表面后进行培养。在一个替代实施例中，在细胞粘附于表面后，去除此至少一种化合物。在一个实施例中，通过去除此至少一种化合物来从表面分离细胞。

在一个实施例中，用能够抑制Rho激酶活性的至少一种化合物处理该细胞悬浮液。在一个替代实施例中，用能够抑制Rho活性的至少一种化合物处理该细胞悬浮液。在一个替代实施例中，用能够抑制Rho激酶活性的至少一种化合物和能够抑制Rho活性的至少一种化合物处理该细胞悬浮液。

能够抑制Rho激酶活性的此至少一种化合物选自以下物质：Y-27632、法舒地尔和羟基法舒地尔。

在一个实施例中，能够抑制Rho激酶活性的此至少一种化合物为Y-27632。

能够抑制Rho激酶活性的此至少一种化合物可以在约0.1μM至约100μM的浓度下使用。在一个实施例中，能够抑制Rho激酶活性的此至少一种化合物在约10μM的浓度下使用。

在一个实施例中，能够抑制Rho活性的此至少一种化合物为Rho GTP酶抑制剂。

在一个实施例中，能够抑制Rho活性的此至少一种化合物为胞外酶C3转移酶。

能够抑制Rho活性的此至少一种化合物可以在约0.01μg/ml至约5μg/ml的浓度下使用。在一个实施例中，能够抑制Rho活性的此至少一种化合物在约0.5μg/ml的浓度下使用。

表面改性培养板

适用于本发明的表面改性培养板可以为其表面经过改性的容器，该表面包含至少约0.5％的N，O和N的总数大于或等于17.2％，并且接触角为至少约13.9度。作为另外一种选择，该表面可以为三维基质，例如，细胞可以粘附于其上的多孔支架。

在一个实施例中，表面改性培养板包括一种培养板，其表面包含至少约0.5％的N，O和N的总数大于或等于17.2％，并且接触角为至少约13.9度。在一个替代实施例中，表面改性培养板包括一种培养板，其表面包含至少约0.5％的N，O和N的总数大于或等于19.5％，并且接触角为至少约13.9度。

在一个实施例中，表面改性培养板包括一种培养板，其表面包含至少约1.3％的N，O和N的总数为至少约24.9％，并且接触角为至少约20.7度，该培养板在本文是指表面改性培养板1。

在一个实施例中，表面改性培养板包括一种培养板，其表面包含至少约1.7％的N，O和N的总数为至少约29.6％，并且接触角为至少约14.3度，该培养板在本文是指表面改性培养板2。

在一个实施例中，表面改性培养板包括一种培养板，其表面包含至少约2.0％的N，O和N的总数为至少约30.7％，并且接触角为至少约18.4度，该培养板在本文是指表面改性培养板3。

在一个实施例中，表面改性培养板包括一种培养板，其表面包含至少约2.1％的N，O和N的总数为至少约30.2％，并且接触角为至少约17.4度，该培养板在本文是指表面改性培养板4。

在一个实施例中，表面改性培养板包括一种培养板，其表面包含至少约1.8％的N，O和N的总数为至少约28.2％，并且接触角为至少约18.8度，该培养板在本文是指表面改性培养板13。

在一个实施例中，表面改性培养板包括一种培养板，其表面包含至少约1.0％的N，O和N的总数为至少约27.8％，并且接触角为至少约44.3度，该培养板以商品名CELLBIND出售。

在一个实施例中，表面改性培养板包括一种培养板，其表面包含至少约10.2％的N，O和N的总数为至少约23.0％，并且接触角为至少约39.5度，该培养板以商品名PRIMARIA出售。

表面改性培养板的特性描述

在一个实施例中，可以用X射线光电子能谱(XPS)来分析表面改性培养板表面的元素组成。XPS，也称为化学分析电子能谱(ESCA)，用作确定什么元素或原子存在于固体基底表面(可以检测浓度小于0.1原子百分数的除氢和氦以外的所有元素)并确定这些元素或原子的键合环境的方法。

作为一个例子，对聚笨乙烯(只含有碳和氢)固体样品的XPS分析通常将给出大于97％的碳、小于3％的氧和0％的氮(不能检测氢；由于聚苯乙烯链在表面的氧化，例如，由于辐射消毒，可以检测到不同水平的氧)(Brevig et al..，Biomaterials 26：3039-3053，2005；Shen and Horbett，J.Biomed.Mater.Res.57：336-345，2001(Brevig等人，《生物材料》，第26卷第3039-3053页，2005年；Shen和Horbett，《生物医学材料研究杂志》，第57卷第336-345页，2001年))。

在一个实施例中，可以用原子力显微镜(AFM)来分析表面改性培养板的表面粗糙度。可以用AFM以低于的水平分辨率和低于的垂直分辨率为表面原子或分子成像。

在一个实施例中，可以通过测量接触角来分析表面改性培养板的表面润湿性。例如，使用静滴法进行的接触角测量提供了固体基底表面和液体表面之间相互作用的信息。接触角描述停留在固体基底表面上的液滴的形状，其是固体基底表面上的液体接触角，并在液、固和气三相交界的接触线处的液体内测得。具有大于90°的水接触角的表面称为疏水的，具有小于90°的水接触角的表面称为亲水的。在极其亲水的表面，也就是说，对水具有高亲和力的表面，小水滴将完全铺展(有效接触角为0°。

在一个实施例中，通过测量结晶紫与表面的反应性来分析表面改性培养板表面的负电荷密度。结晶紫带有正电荷，使得其能够结合到带负电的分子和分子部分上，例如，聚合物表面上的带负电的官能团。如果表面具有相同的粗糙度和面积，则具有高结晶紫反应性的表面比具有低结晶紫反应性的表面具有更高密度的负电荷。

多能干细胞

多能干细胞的特性描述

多能干细胞可以表达一种或多种阶段特异性胚胎抗原(SSEA)3和4、以及可使用称为Tra-1-60和Tra-1-81的抗体检测的标记物(Thomson et al.，Science 282：11451998(Thomson等人，《科学》，第282卷第1145页，1998年))。多能干细胞在体外的分化导致SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81表达的丧失(如果存在的话)以及SSEA-1表达的增加。未分化的多能干细胞通常具有碱性磷酸酶活性，其可以通过用4％的多聚甲醛固定细胞，然后用VectorRed作为底物显影来检测，如制造商所述(Vector Laboratories(Burlingame Calif.))。未分化的多能干细胞通常也表达Oct-4和TERT，如由RT-PCR所检测。

增殖的多能干细胞的另一期望表型是有潜能分化成所有三个胚层的细胞：内胚层、中胚层和外胚层组织。可以通过如下方式来确定干细胞的多能性：例如，将细胞注射入重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠，使用4％的多聚甲醛固定形成的畸胎瘤，然后对其进行组织学检测，找出来自三个胚层的细胞类型的证据。作为另外一种选择，可以通过产生胚状体并评估胚状体中三个胚层相关的标记物的存在来确定多能性。

可以使用标准G带技术并比较已公布的相应灵长类物种的核型来分析增殖的多能干细胞系的核型。希望获得具有“正常核型”的细胞，其意指细胞为整倍体，其中所有人染色体都存在并且没有明显的改变。

多能干细胞的来源

可以使用的多能干细胞类型包括，衍生自妊娠后形成的组织的已建立多潜能细胞系，妊娠后形成的组织包括取自妊娠期间任何时期(通常但不一定在妊娠约10-12周之前)的胚前组织(例如，囊胚)、胚胎组织或胎儿组织。非限制性例子为已建立的人ES细胞系或人胚胎生殖细胞系，例如，人ES细胞系Hl、H7和H9(WiCell)。也可设想的是，在此类细胞的初始建立或稳定期间使用本公开的组合物，在此情况下，源细胞将是直接取自源组织的原代多能细胞。也适用的是，取自已经在不存在饲养细胞的情况下培养的多能干细胞群以及已经在存在饲养细胞的情况下培养的多能干细胞群的细胞。也适用的是，人ES细胞系的突变体，例如，BGOlv(BresaGen(Athens，GA))。也适用的是，来源于成人体细胞的细胞，例如，在Takahashi et alCell 131：1-12(2007)(Takahashi等人于《细胞》，第131卷第1-12页2007年)中公开的细胞。

在一个实施例中，按照Thomson等人(美国专利No.5,843,780；Science 282：1145，1998(《科学》，第282卷第1145页，1998年)；Curr.Top.Dev.Biol.38：133ff.，1998(《发育生物学当代论题》，第38卷第133页几段，1998年)；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：7844，1995(《美国科学院院刊)》，第92卷第7844页，1995年)所描述方法制备人ES细胞。

多能干细胞的培养

在一个实施例中，在按照本发明的方法培养之前，将多能干细胞培养在以多种方式支持多能干细胞的饲养细胞层或胞外基质蛋白上。例如，将多能干细胞培养在支持多能干细胞增殖而不进行大量分化的饲养细胞层上。使用以下物品支持多能干细胞在饲养细胞层上无分化的生长：(i)获得含有饲养细胞层的培养容器；以及(ii)通过预先与另一细胞类型共培养来调整的培养基或非条件培养基，例如，无血清或甚至化学成分限定的培养基。

又如，将多能干细胞培养在基本上不含饲养细胞、但支持多能干细胞增殖而不进行大量分化的培养体系中。使用以下物品支持多能干细胞在无饲养细胞培养中无分化的生长：(i)具有一种或多种胞外基质蛋白的固体基底表面上的吸附层；以及(ii)通过预先与另一细胞类型共培养来调整的培养基或非条件培养基，例如，无血清或甚至化学成分限定的培养基。

在一个替代实施例中，将多能干细胞培养在表面改性培养板上，该表面改性培养板包含至少约0.5％的N，O和N的总数大于或等于17.2％，并且接触角为至少约13.9度，并培养于通过预先与另一细胞类型共培养调整的培养基或非条件培养基中，例如，无血清或甚至化学成分限定的培养基。

培养基：可以在US20020072117中找到适用于本发明的细胞培养基的例子。可以在US6642048中找到适用于本发明的细胞培养基的另外一个例子。可以在WO2005014799中找到适用于本发明的细胞培养基的另外一个例子。可以在Xu等人(Stem Cells 22：972-980，2004(《干细胞》，第22卷第972-980页，2004年))中找到适用于本发明的细胞培养基的另外一个例子。可以在US20070010011中找到适用于本发明的细胞培养基的另外一个例子。可以在Cheon等人(BioReprod DOI：10.1095/biolreprod.105.046870；19Oct 2005(Cheon等人，《生殖生物学》，数字对象唯一标识符：10.1095/biolreprod.105.046870，2005年10月19日))中找到适用于本发明的细胞培养基的另外一个例子。可以在Levenstein等人(StemCells 24：568-574，2006(《干细胞》，第24卷第568-574页，2006年))中找到适用于本发明的细胞培养基的另外一个例子。可以在US20050148070中找到适用于本发明的细胞培养基的另外一个例子。可以在US20050233446中找到适用于本发明的细胞培养基的另外一个例子。可以在US6800480中找到适用于本发明的细胞培养基的另外一个例子。可以在US20050244962中找到适用于本发明的细胞培养基的另外一个例子。可以在WO2005065354中找到适用于本发明的细胞培养基的另外一个例子。可以在WO2005086845中找到适用于本发明的细胞培养基的另外一个例子。

合适的培养基也可以由下列组分制成，例如，Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)、Gibco#11965-092、Knockout Dulbecco改进的Eagle培养基(K0DMEM)、Gibco#10829-018、Ham′s F12/50％DMEM基本培养基、200mM L-谷氨酰胺、Gibco#15039-027、非必需氨基酸溶液、Gibco 11140-050、β-巯基乙醇、Sigma#M7522、人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、Gibco#13256-029。

多能干细胞的分化

在本发明的一个实施例中，使多能干细胞在培养过程中增殖，同时保持其多能性。可通过检测多能性相关标记物的表达水平的变化来测定细胞多能性随时间变化。作为另外一种选择，还可通过检测分化相关标记物或另一细胞类型相关标记物的表达水平的变化来监测多能性的变化。

在一个替代实施例中，使多能干细胞在培养过程中增殖，并以促进其分化为另一细胞类型的方式处理多能干细胞。其他细胞类型可为表达定形内胚层系特征性标记物的细胞。作为另外一种选择，细胞类型可为表达胰内胚层系特征性标记物的细胞。作为另外一种选择，细胞类型可为表达胰内分泌系特征性标记物的细胞。作为另外一种选择，细胞类型可为表达β细胞系特征性标记物的细胞。

根据本发明的方法处理的多能干细胞可通过本领域的任何合适方法分化为多种其他细胞类型。

例如，根据本发明的方法处理的多能干细胞可分化为神经细胞、心肌细胞、肝细胞等。

例如，根据WO2007030870中公开的方法，根据本发明的方法处理的多能干细胞可分化为神经祖细胞和心肌细胞。

又如，根据美国专利6,458,589中公开的方法，根据本发明的方法处理的多能干细胞可分化为肝细胞。

例如，根据D’Amour et al.，Nature Biotechnol.23：1534-1541，2005(D’Amour等人，《自然-生物技术》，第23卷第1534-1541页，2005年)中公开的方法，多能干细胞可分化为表达定形内胚层系特征性标记物的细胞。

例如，根据Shinozaki et al.，Development 131：1651-1662，2004(Shinozaki等人，《发育》，第131卷第1651-1662页，2004年)中公开的方法，多能干细胞可分化为表达定形内胚层系特征性标记物的细胞。

例如，根据McLean et al.，Stem Cells 25：29-38，2007(McLean等人，《干细胞》，第25卷第29-38页，2007年)中公开的方法，多能干细胞可分化为表达定形内胚层系特征性标记物的细胞。

例如，根据D’Amour et al.，Nature Biotechnol.24：1392-1401，2006(D’Amour等人，《自然-生物技术》，第24卷第1392-1401页，2006年)中公开的方法，多能干细胞可分化为表达定形内胚层系特征性标记物的细胞。

定形内胚层系特征性标记物选自SOX17、GATA4、Hnf-3β、GSC、Cerl、Nodal、FGF-8、短尾蛋白、Mix样同源盒蛋白、FGF-4CD48、脱中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGF-17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99以及OTX2。适用于本发明的细胞为表达至少一种定形内胚层系特征性标记物的细胞。在本发明的一个方面，表达定形内胚层系特征性标记物的细胞为原条前体细胞。在一个替代方面，表达定形内胚层系特征性标记物的细胞为中内胚层细胞。在一个替代方面，表达定形内胚层系特征性标记物的细胞为定形内胚层细胞。

例如，根据D’Amour et al.，Nature Biotechnol.24：1392-1401，2006(D’Amour等人，《(自然-生物技术》，第24卷第1392-1401页，2006年)中公开的方法，多能干细胞可分化为表达胰内胚层系特征性标记物的细胞。

胰内胚层系特征性标记物选自Pdx1、HNF-1β、PTFla、HNF-6、HB9和PROXl。适用于本发明的细胞为表达至少一种胰内胚层系特征性标记物的细胞。在本发明的一个方面，表达胰内胚层系特征性标记物的细胞为胰内胚层细胞。

根据本领域的任何方法可使多能干细胞分化为表达胰内分泌系特征性标记物的细胞。

例如，根据D’Amour et al.，Nature Biotechnol.24：1392-1401，2006(D’Amour等人，《自然-生物技术》，第24卷第1392-1401页，2006年)中公开的方法，多能干细胞可分化为表达胰内分泌系特征性标记物的细胞。

胰内分泌系特征性标记物选自NGN-3、神经源性分化蛋白(NeuroD)、Islet-1、Pdx-1、NKX6.1、Pax-4、Ngn-3以及PTF-1α。在一个实施例中，胰内分泌细胞能够表达至少一种以下激素：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。适用于本发明的细胞为表达至少一种胰内分泌系特征性标记物的细胞。在本发明的一个方面，表达胰内分泌系特征性标记物的细胞为胰内分泌细胞。胰内分泌细胞可为表达胰激素的细胞。作为另外一种选择，胰内分泌细胞可为分泌胰激素的细胞。

在本发明的一个方面，胰内分泌细胞为表达β细胞系特征性标记物的细胞。表达β细胞系特征性标记物的细胞表达Pdx1以及至少一种以下转录因子：NGN-3、Nkx2.2、Nkx6.1、神经源性分化蛋白、Is1-1、HNF-3β、MAFA、Pax4和Pax6。在本发明的一个方面，表达β细胞系特征性标记物的细胞为β细胞。

本发明通过(但不限于)以下实例进一步说明。

实例

实例1

细胞群形式的人胚胎干细胞的传代和维持

人ES细胞系H1和H9最初维持在经丝裂霉素C灭活的原代小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上。人ES细胞在重复传代过程中从MEF饲养层转移到Matrigel^TM(Becton-Dickinson(Bedford，MA))上。

用Matrigel^TM处理表面：低生长因子Matrigel^TM在4℃解冻后以1∶30的比例稀释于冷的DMEM/F12(Invitrogen(Carlsbad，CA))。将足以覆盖表面的体积加入每个6cm培养皿(2ml)或6孔板的每个孔(1ml)中，并在室温下孵育1小时。处理过的表面在数小时之内使用或在4℃下最多保存两周。

人ES细胞培养：通过在含有1mg/ml的胶原酶IV(Sigma-Aldrich(St.Louis，MO))的DMEM/F12中孵育10分钟，然后用移液管刮取，从而从饲养层获得未分化的人ES细胞集落(来自H9或H1细胞系)。细胞团通过600×g离心四分钟进行沉淀，用2ml移液管轻轻地分散该沉淀，以将集落破碎成小细胞群。将这些细胞群接种到Matrigel^TM处理的培养皿上的培养基中，该培养基经小鼠胚胎成纤维细胞(MEF-CM)调整，还添加了bFGF(8ng/ml；R&D Systems(Minneapolis，MN))，接种密度为每6cm培养皿5ml生长培养基中接种50-150个集落。每天更换培养基。MEF-CM中位于Matrigel^TM上的集落变大，并在其覆盖70-80％的表面积时(大约每3-4天)进行传代。与饲养层上维持的人ES细胞(图1)类似，集落中的人ES细胞具有较高的细胞核：细胞质的比率并且具有明显的核仁。分化细胞所占比例小于培养细胞总数的5％。

就Matrigel^TM上的MEF-CM中的细胞的常规传代而言，将细胞在含有1mg/ml胶原酶IV的DMEM/F12中孵育最多60分钟，并通过有力的DMEM/F12流冲洗伴以刮取将细胞从培养皿中移除。将细胞沉淀、分散并以1∶3或1∶4的比率接种。

实例2

单细胞形式的人胚胎干细胞的传代

根据转让给LifeScan Inc的美国专利申请LFS5163USPSP中公开的方法，以单细胞形式培养细胞系H9的人ES细胞。用TrypLE^TM Express在37℃下处理五分钟的方法进行细胞传代，并以10,000细胞/cm²基底表面的密度进行接种。

实例3

使用无胞外基质蛋白/组分和饲养细胞的表面改性培养板来进行的人胚胎干细胞的粘附、培养和多能性保持

细胞系H1的人ES细胞，至第49代时维持于Nunclon Delta^TM培养板上的MEF条件培养基中，在研究之前该培养板经低生长因子Matrigel^TM的1∶30稀释液处理。通过1mg/ml胶原酶分离或人工刮取，将细胞从表面分离以进行传代。

然后将这些细胞接种于表面改性培养板(6孔格式)的两个未处理孔上。另外，每个培养板的一个孔用0.1％无异源人明胶处理作为对照。还将细胞直接接种于Costar^TM(目录号3516；Corning(Corning，NY))、Falcon^TM(目录号351146；Becton Dickinson(FranklinLakes，NJ))以及Nunclon Delta^IM(目录号140675；Thermo Fisher Scientific(Roskilde，Denmark))6孔板的未处理和明胶处理孔上，以用作阴性对照，并且还接种于用低生长因子Matrigel^TM的1∶30稀释液处理的孔上，以用作阳性对照。在所有处理中，细胞均维持于MEF条件培养基中。

我们观察到两代之后，表面改性培养板2、3和4具有粘附的ES细胞集落，这些集落在酶分离后重新粘附于培养板并生长。表面改性培养板2、3或4上的明胶或未处理孔中，粘附率或生长率没有明显差异。

从用低生长因子Matrigel^TM的1∶30稀释液处理的培养板上机械分离的细胞较弱粘附于表面改性培养板2、3和4，而用1mg/ml胶原酶进行酶分离的细胞能较好粘附于表面改性培养板2、3或4的明胶或未处理孔中。

加入表面改性培养板1和5-12以及未处理或明胶处理的Nunclon Delta^TM培养板、Falcon^TM培养板以及Costar^TM培养板的H1p49ES细胞不粘附。相同的细胞粘附于用低生长因子Matrigel^TM的1∶30稀释液处理的培养板上，这表明该细胞能够粘附于基底表面。

对接种于低生长因子Matrigel^TM的1∶30稀释液上的H1细胞系ES细胞来说，其正常传代时间为3-4天，然而接种于表面改性培养板2、3和4上的细胞在准备传代之前需要培养7天。这可能是由于处理表面上的粘附率的下降，因为与表面2、3和4相比，在接种后更多初始集落立即明显存在于Matrigel^TM处理表面上。

将第50代(p50)细胞按1∶2的比率分离，并收集半数该样品，以用于RNA纯化和多能性标记物表达水平检测(表1)。每个样品的另一半重新接种于表面改性培养板。这一代(p51)形成的集落在其准备传代前仍需要培养7天，仅培养4天后长成的小集落示于图1中。这些集落维持典型ES细胞集落形态。

表面改性培养板2、3和4上的细胞在传代4次时停止培养，通过qRT-PCR分析样品的多能性标记物(表2)并且使样品分化为定形内胚层细胞(DE)的命运。传代4次的细胞保持以下典型多能性标记物的表达：Oct4、Nanog、Sox2和TERT。此外，该细胞具有能够在含有DMEM/F12、100ng/ml激活素A、20ng/ml Wnt3a和0.5-2.0％FBS(表3)的培养基中分化为定形内胚层细胞的命运，这表明到第4代细胞仍保持多能性。

实例4

使用无胞外基质蛋白/组分和饲养细胞的表面改性培养板来进行的人胚胎干细胞的粘附、培养和多能性保持：Rho抑制和Rho激酶抑制的效果

细胞系H1的人ES细胞，在第49代时维持于Nunclon Delta^TM培养板上的MEF条件培养基中，在研究之前该培养板经低生长因子Matrigel^TM的1∶30稀释液处理。通过1mg/ml胶原酶分离，将细胞从表面分离以进行传代。

然后将这些细胞接种于表面改性培养板(6孔格式)的未处理孔上。还将细胞直接接种于Costar^TM Falcon^TM和Nunclon Delta^TM 6孔板的未处理和明胶处理孔上以用作阴性对照，并接种于低生长因子Matrigel^TM的1∶30稀释液处理的孔上以用作阳性对照。在所有处理中，细胞均维持于MEF条件培养基中。

在第49代时加入表面改性培养板1和5-12以及加入未处理或明胶处理的NunclonDelta^TM培养板和Costar^TM培养板的H1细胞系的人ES细胞不粘附，然而，其却粘附于表面改性培养板2、3和4。相同的细胞粘附于低生长因子Matrigel^TM的1∶30稀释液处理的培养板，这表明该细胞能够粘附于基底表面。

对接种于低生长因子Matrigel^TM的1∶30稀释液上的H1 ES细胞来说，其正常传代时间为3-4天，然而接种于表面改性培养板2、3和4上的细胞在准备传代之前需要培养7天。这可能是由于表面改性培养板上的粘附率的下降，因为与表面改性培养板2、3和4相比，在接种后更多初始集落立即明显存在于Matrigel^TM处理表面。

由于传代的推迟，将该细胞以1∶2的比率分离，并将传代4次的半数样品接种于MEF条件培养基或添加有10μM浓度的Rho激酶(ROCK)抑制剂Y-27632的MEF条件培养基中，以用于改善细胞生长动力学。传代后将细胞保存于接种培养基中48小时，此时该培养基被更换成新鲜的不添加MEF的条件培养基。

添加10μM浓度的Y-27632可显著提高该细胞(p52)的接种效率并且在接种4天后集落生长明显改善(图2)。此外，在胶原酶分离之前，H1细胞系人ES细胞还经过0.5ng/ml细胞渗透形式的Rho抑制剂C3外转移酶处理，这也可提高细胞接种效率。

虽然接种于10μM Y-27632中的细胞可在接种后4天传代，但无ROCK抑制剂情况下接种的细胞在接种后4天仍不能分离。用Rho抑制剂C3外转移酶处理的细胞在接种后4天仍不能传代，并且细胞表现出更趋向于分化为类成纤维细胞形态。因此，在第4代时经Rho抑制剂处理的细胞的所有后代均用Y-27632进行处理(图3)。

细胞在表面改性培养板3和4上进一步传代至至少10代并检测多能性相关标记物的存在：qRT-PCR检测基因；流式细胞术检测细胞表面标记物的表达；以及免疫荧光法检测细胞表面和核蛋白(图4-6)。通过检测细胞分化为定形内胚层、胰内胚层以及形成由三胚层构成的胚状体的能力来确定细胞的多能性(图7-9)。还检测了细胞的核型稳定性，我们观察到细胞可保持正常核型(图10)。

实例5

Rho激酶抑制对人胚胎干细胞粘附和分离的影响

细胞系H9的人ES细胞，至第40代时维持于Nunclon Delta^TM培养板上的MEF条件培养基中，在研究之前该培养板经低生长因子Matrigel^TM的1∶30稀释液处理。通过1mg/ml胶原酶分离或人工刮取，将细胞从表面分离以进行传代。

然后将这些细胞接种于含有增加量的以下Rho激酶抑制剂之一的表面改性培养板2、3、4和13(12孔格式)上：Y-27632(得自Sigma(St.Louis，MO)或EMD(San Diego，CA))、法舒地尔(Sigma)或羟基法舒地尔(Sigma)，并维持3天，每天更换培养基和化合物。在第三天结束时，去除培养基并用结晶紫(0.5％的水溶液)染色培养板以观察集落。

我们观察到第三天，在含有增加量的Rho激酶抑制剂的表面改性培养板2、3、4和13上有粘附的ES细胞集落。通过使用Y-27632(10μM)能获得最佳结果，尽管某些集落在存在Rho激酶抑制剂、法舒地尔以及羟基法舒地尔情况下可观察到粘附和生长(图11)。

通过在培养第一天用一系列接种浓度的Y-27632处理细胞，我们试图检测Y-27632的最佳剂量以促进细胞结合。培养第一天后，在随后的时间里用10μM浓度的Y-27632处理细胞。我们观察到促进ES细胞粘附和生长的最大浓度为10μM(图12)，并且这种情况出现在表面改性培养板2、3、4、13和CellBIND^TM(Corning(Corning，NY))上。

还检测了使用单一剂量Y-27632连续处理细胞对粘附和生长的影响。该细胞分别用0、1、4或10μM的Y-27632处理4天。在未处理(0μM)的表面改性培养板上观察到一些结合，而在表面改性培养板2、3、4、13上，促进ES细胞粘附和生长的最佳浓度为10μM Y-27632(表4)。

因为相对于未处理的细胞(图13)来说，添加ROCK抑制剂在表面改性培养板2、3和4上显著增强接种和生长动力学，我们希望能确定这是由于恰当的细胞粘附的保持还是由于提高的细胞增殖而引起的。我们观察到Rho激酶抑制并不提高细胞增殖，因为用Y-27632处理的细胞同未处理细胞的生长密度相似(图14)。相反，Y-27632处理能保持细胞粘附于表面并允许其以正常增殖动力学生长(图15)。从ES细胞接种的含有Rho激酶抑制剂的生长培养基中去除Rho激酶抑制剂，可导致细胞从表面分离。通过在悬浮液中培养ES细胞来实现分化为3胚细胞系的胚状体形成。因此，虽然如预期一样随后重新使用Rho激酶抑制剂能恢复细胞的粘附(图15)，但在样品中观察到ES细胞培养物的大量分化，其中样品经过如下处理：将Rho激酶抑制剂去除后培养24小时，使细胞分离、生长于悬浮液中24小时，再重新使用Rho激酶抑制剂。

实例6

使用TrvpLE ^TM Express传代的H9人ES细胞在Y-27632处理时在表面改性培养板上呈现改善的粘附性

H9人ES细胞在表面改性培养板上的初始传代。使用10μM Y-27632连续处理可促进粘附。四种表面改性培养板：2、3、4和13是如此的。H9细胞接种于表面3上24小时后的图像示于图16中。

实例7

使用TrvpLE ^TM Express传代的H9人胚胎干细胞单细胞在表面改性培养板上保持多能性

人ES细胞是多能性的并能够分化为所有细胞系。细胞的多能状态必须由其上生长细胞的表面来保持。为了检测表面改性培养板是否能保持人ES细胞多能性，用胶原酶将人ES细胞传代38次以及用TrypLE^TM Express传代38次，然后在表面改性培养板3(表面3)、表面改性培养板4(表面4)或以1∶30稀释的Matrigel^TM上传代5次。将10μM的Y-27632加入指示样品的培养基。使用流式细胞术评估多能性标记物Tra-1-60、Tra-1-81、SSEA-3和SSEA-4的表达。结果示于图17中。阳性细胞的百分比示于y轴。生长于表面改性培养板3和4上的人ES细胞单细胞可保持其多能生。

实例8

Rho激酶抑制可促进来自人胚胎干细胞系H9的细胞的粘附和生长，这些细胞从 Matrigel ^TM 中转移到表面改性培养板上时以单细胞形式生长

研究了Y-27632在人ES细胞粘附和细胞生长方面的作用与表面改性培养板的相关性。用胶原酶将H9人ES细胞传代38次，并用TrypLE^TM Express传代50次，然后接种于表面改性培养板3或4上(初始细胞)。作为另外一种选择，用胶原酶将H9人ES细胞传代38次，并用Triple Express传代38次，然后在表面改性培养板3(表面3，适应细胞)，或表面改性培养板4(表面4，适应细胞)上传代9次。细胞以10⁴/cm²的密度，在含或不含10μM Y-27632的条件下接种于MEF条件培养基中并生长两天。结果示于图18中。Y-27632促进了初始细胞对表面改性培养板3和4的粘附。Y-27632不促进适应细胞对表面改性培养板3和4的粘附。表面改性培养板3促进了初始细胞的粘附和/或生长。表面改性培养板4促进了适应的人ES细胞的粘附和/或生长。这些细胞经过总共4天的跟踪观察(图19和20)。在用10μM的Y-27632于表面改性培养板3上培养时，初始单细胞呈现增加的生长率，显示出微弱优势(图19)。适应的单细胞呈现增加的生长率，不需10μM的Y-27632(图20)。

实例9

表面改性培养板可用于筛选化合物

96孔构型和分子生物筛选协会(SBS)标准形式的表面改性培养板可用于在存在10μM Y-27632的情况下培养单人胚胎干细胞。接种在96孔板的微孔中的H9单细胞的图像如图21中所示。这允许直接在96孔板中进行化合物的筛选而不会妨碍细胞或吸附层，例如分别为小鼠胚胎成纤维细胞或Matrigel^TM。

实例10

培养于表面改性培养板上的单胚胎干细胞能够分化成定形内胚层

一个目标是将人胚胎干细胞分化成不同的细胞系。为了确定表面改性培养板能否支持分化，将人胚胎干细胞用胶原酶传代38次以及用TrypLE^TMExpress传代38次，接下来在表面改性培养板3(表面3)或表面改性培养板4(表面4)上传代9次。作为阳性对照，让人胚胎干细胞在Matrigel^TM 1∶30稀释液中生长。在指明的细胞样品的扩增过程中向培养基中添加10μM Y-27632。细胞扩增后，评估培养的细胞形成定形内胚层的能力。简而言之，将70％汇合度的培养物用含有100ng/ml激活素A、10ng/ml Wnt3a以及0.5％FBS的DMEM-F12培养基处理两天。处理后用含有100ng/ml激活素A以及2％FBS的DMEM/F12处理3天。通过流式细胞术由CXCR4蛋白的表达水平鉴定分化成定形内胚层的细胞(图22)。阳性细胞的百分比在y轴上表示。以单细胞培养的人胚胎干细胞在存在或不存在Y-27632的情况下可在表面改性培养板3和4上分化成定形内胚层。

实例11

在表面改性培养板上培养的单胚胎干细胞能够分化成胰腺内胚层

在完成定形内胚层方案之后，将细胞在含有FGF-7(50ng/ml；R&D Systems)、音猬因子抑制剂、KAAD环巴胺(2.5μM；Sigma-Aldrich)以及2％FBS的DMEM-F12培养基中孵育3天。这时候，扩增过程中未用Y-27632处理的细胞与表面改性培养板3和4分离。将在扩增过程中用Y-27632处理过的细胞在含有FGF-7(50ng/ml)、KAAD环巴胺(2.5μM)、视黄酸(1μM；Sigma-Aldrich)以及1％B27(Invitrogen)的DMEM-F12中再孵育四天(后方前肠期，PF)。这段时间后，将细胞在含有Exendin 4(50ng/ml；Sigma-Aldrich)、DAPT(1μM；Calbiochem)以及1％B27的DMEM-F12中再孵育四天。分化持续至胰腺内胚层期(EN)。这需要使用含50ng/mlHGF、IGF(R&D Systems)以及Exendin 4(50ng/ml)和1％B27的CMRL培养基(Invitrogen)处理三天。在PF和EN期从表面改性培养板3和4的一个孔中采集RNA样本。然后，在此步骤，将这些样本通过实时PCR分析胰腺标记物Pdx1、Nkx6.1、Nkx2.2、Pax4、NeuroD、HNF3b、Ptfla、胰岛素以及AFP。在这段时期重复评估相同的胰腺内胚层标记物。将从相同细胞系未处理的人胚胎干细胞获得的RNA样本进行实时PCR分析，与处理过的样本作为平行对照。将处理过的样本归一化到设为1倍变化的未处理对照样本。监测Pdx1和胰岛素表达并在表面改性培养板之间进行比较。

从表面改性培养板3和4上处理的细胞中观察到了胰腺内胚层标记物的诱导，然而在表面改性培养板3上处理的细胞表达量更高(图23)。在扩增期间在存在Y-27632的情况下两种表面改性培养板均能支持单人胚胎干细胞向后方前肠和胰腺内胚层分化，而在扩增时间未用Y-27632处理的单细胞在后前肠分化前分离。

实例12

H1和H9人胚胎干细胞粘附到表面改性培养板上并通过用Y-27632处理细胞而增强粘附

将之前接种到用1∶30Matrigel^TM处理过的塑料器皿上并在添加了8ng/ml bFGF的MEF条件培养基中生长的第49代H9人胚胎干细胞用LIBERAsE处理，并接种到表面改性培养板上添加了8ng/ml bFGF的MEF条件培养基中，不进行其他处理或添加更高浓度的Y-27632。我们观察到，在将H9人胚胎干细胞接种到表面改性培养板后24小时和48小时，在表面2-4和13、CellBIND^TM以及Primaria^TM(目录号353846，Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)上通过结晶紫染色可观察到小型集落(图24-26)。此外，通过添加Y-27632改善了H9人胚胎干细胞集落的粘附，这一影响具有剂量反应关系(图25)。相对于未处理的人胚胎干细胞，在人胚胎干细胞粘附方面，低浓度的Y-27632(1至2微摩尔)显示出极微的改善(图25)，而较高浓度的Y-27632(4至20微摩尔)促进了人胚胎干细胞与表面改性培养板的粘附(通过结晶紫染色测量)(图25和26)。

除了通过向细胞培养基中添加Y-27632对人胚胎干细胞粘附进行动态调节外，我们还观察到在存在Y-27632的情况下人胚胎干细胞对各种表面改性塑料制品具有不同的粘附率。例如，即使在存在持续的Y-27632处理的情况下，细胞也较少粘附到CellBIND^TM培养板上并随着时间的推移极可能与CellBIND^TM培养板分离，而在用Rho激酶抑制剂Y-27632处理时，细胞更多地粘附到表面改性培养板3、4、13或Primaria^TM上且不大可能与之分离(图25和26)。

实例13

在存在Y-27632的情况下来自人胚胎干细胞系H1和H9的细胞以不同的比率在表面改性培养板上粘附并形成集落

将之前接种到用1∶30Matrigel^TM处理过的塑料器皿上并在添加了8ng/ml bFGF的MEF条件培养基中生长的H1和H9人胚胎干细胞用LIBERASE处理，并接种到表面改性培养板上添加了8ng/ml bFGF的MEF条件培养基中，不进行其他处理或添加20微摩尔的Y-27632。在将H9人胚胎干细胞接种到表面改性培养板14和15后48小时，在添加了20微摩尔Y-27632的培养基中观察到了小型集落(粘附和集落形成在各实验之间不同)(图27)。H1人胚胎干细胞还在表面14和15上添加了20微摩尔Y-27632的培养基中粘附并形成集落，并且这比对H9人胚胎干细胞观察到的结合更普遍。这些数据表明人胚胎干细胞在固体基底表面上的粘附和集落形成存在细胞系间变化性。

实例14

人胚胎干细胞粘附到使用限定培养基的表面改性培养板上

将第49代H9人胚胎干细胞在限定培养基mTeSR^TM中于Matrigel^TM处理过的塑料器皿上传代2次。然后将细胞用LIBERASE处理并接种到表面改性培养板Nunc4上mTeSR^TM培养基中。将细胞接种在含有或不含20微摩尔Y-27632的培养基中。在接种细胞之前还将微孔用各种蛋白处理30分钟(无处理、0.1％明胶、2％BSA、.34mg/ml大鼠I型胶原、1∶1000Matrigel^TM或1∶5000Matrigel^TM)，以测定这些蛋白是否可以促进人胚胎干细胞在含有或不含Y-27632的限定培养基中的粘附(图28)。我们观察到，在不存在Y-27632的情况下，接种到表面改性培养板的限定培养基中的人胚胎干细胞即使在存在细胞外基质蛋白(如I型胶原或1∶1000Matrigel^TM)的情况下仍不粘附。然而，向限定培养基mTeSR^TM中加入20微摩尔Y-27632时，人胚胎干细胞粘附到表面Nunc4上。此外，这种粘附在未处理的孔中以及用0.1％明胶、2％BSA和0.34mg/ml大鼠I型胶原处理过的孔中是相当的。在含有低浓度Matrigel^TM(1∶1000和1∶5000稀释比)的微孔中，人胚胎干细胞的粘附小幅增加，然而这些浓度的Matrigel^TM均不足以在不含Y-27632的情况下促进细胞粘附。这些结果表明在存在ROCK抑制剂Y-27632的情况下，人胚胎干细胞可在表面改性培养板上的限定培养基中培养，并且大约1∶1000或1∶5000的低浓度Matrigel^TM即可改善这种粘附。

实例15

培养瓶形式的表面改性培养板可促进人胚胎干细胞的粘附以及向定形内胚层和胰腺内胚层的分化

将之前接种到用1∶30Matrigel^TM处理过的塑料器皿上并在添加了8ng/ml bFGF的MEF条件培养基中生长的H1和H9人胚胎干细胞用LIBERASE处理，并按1∶2或1∶3的接种密度接种到具有改性表面的各种尺寸的培养瓶T25、T75、T150和T175上。将细胞接种到添加了8ng/ml bFGF和20微摩尔Y-27632的MEF条件培养基中。然后让人胚胎干细胞集落生长，每日更换添加了8ng/ml bFGF和20微摩尔Y-27632的MEF条件培养基，直到平板达到大约50％的汇合度。这时将培养基换成含有2％BSA、100ng/ml激活素A、20ng/ml Wnt3a以及20微摩尔Y-27632的DMEM/F12培养基，将细胞在这种培养基中保持2天并每日更换培养基。在第3天和第4天，将培养基换成含有2％BSA、100ng/ml激活素A以及20微摩尔Y-27632的DMEM/F12培养基。然后用TrypLE让细胞与表面分离，并通过流式细胞术分析定形内胚层(DE)表面标记物CXCR4的表达。我们观察到，在这些条件下，人胚胎干细胞分化成高CXCR4阳性群体，CXCR4+高达几乎90％，表明细胞大部分都分化成了定形内胚层(表5)。此外，由于从培养基中除去Y-27632导致了细胞与塑料表面分离，因此在细胞生长或分化期间细胞与培养表面的粘附依赖于ROCK抑制的维持。

我们希望确定：由从培养瓶形式的表面改性培养板上获得的定形内胚层能否形成胰腺内胚层。为此，我们用含有Y-27632(20微摩尔)、FGF-7(50ng/ml)、KAAD环巴胺(2.5微摩尔)以及1％B27(Invitrogen)的DMEM-F12培养基将细胞再孵育四天，然后在该培养基中添加视黄酸(1微摩尔，Sigma-Aldrich)继续孵育四天，将细胞分化到胰腺内胚层期。采集RNA样本并通过实时PCR分析胰腺标记物Pdxl。将处理过的样本归一化到设为1倍变化的未处理的对照样本。我们观察到相对于未分化的人胚胎干细胞，样本中PDXl的水平升高，分化细胞中的mRNA水平至少比未分化的人胚胎干细胞细胞中观察到的相应水平高256倍。

实例16

表面处理以及表面改性培养板

通过用电晕等离子体或微波等离子体处理注射成型件来制备表面改性培养板(表6)。用于注射成型的聚合材料为聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚碳酸酯与聚苯乙烯的共混物、以及环状烯烃共聚物。将表面改性培养板单个包装在塑料袋中，然后通过γ照射(25kGy)灭菌，最后保存在室温下直到用于细胞培养或表面表征实验。分别使用与表面改性培养板19、33和34相同的聚合材料模制表面改性培养板18、30和31-32，但不进行等离子体处理。表面14和31不进行γ照射处理。

电晕等离子体处理在仅有一个电极的金属真空室内进行，电极处于室内并与室内电绝缘(C-Lab Plasma；Vetaphone A/S，Denmark)。金属壁作为反电极(接地)。自调电晕发生器产生电场，提供充足的能量以在整个真空室内产生等离子体。将待处理的工件放置在真空室的底部。关闭真空室并排空至10^-2毫巴的压力。在此压力下，将通向真空泵的阀关闭，启用电晕发生器。设定发生器以产生2000W的输出功率。激励等离子体5至60秒。然后打开进气阀(空气)，将室内压力恢复至大气压。

微波等离子体处理在石英真空室(300-E型，用于表面改性培养板5-12；440型，用于表面改性培养板14和15；二者均得自Technics Plasma GmbH，Germany)中进行。生成等离子体的能量由室外的2.43GHz微波发生器提供。将待处理的工件放在室内的玻璃板上。关闭真空室并排空至0.3到0.5毫巴之间的压力。让通向真空泵的阀门保持打开，通过用进气阀调节气流(空气或氧气)使压力维持在所需值。然后启用微波发生器。没定发生器以产生500或600W的输出功率。然后关闭泵阀，打开进气阀，使室内压力升至大气压。

表6示出了通过电晕等离子体或微波等离子体制备表面改性培养板时使用的功率、时间、压力和气体。

实例17

本发明的表面改性培养板的表面表征

水接触角

将表面改性培养板1-4和13单个包装在塑料袋中、灭菌并在整个测试周期内保存在室温下。在表面处理和灭菌后一周进行第一次接触角测量，然后在如图29中给出的时间点再次进行测量。所有接触角测量均使用静止液滴法以及得自FIBRO Systems AB(Sweden)的PG-X测量头(由摄像机和计算机软件(v.3.1)组成的测角计)进行。使用正切倾斜(tangent leaning)法计算接触角。根据制造商说明，在静态模式下使用自动滴加程序滴加4.0μL MilliQ水滴。每滴的接触角测量一次(每个时间点向每个样本滴7滴)。对于每个时间点，使用新样本以避免前面的测量带来的任何影响。Nunclon Delta^TM和CellBIND^TM表面上的测量在与表面1-4和13上的测量相同的实验条件下进行，但表面处理和灭菌的完成时间在第一次测量前不止12周(Nunclon Delta^TM*在第一次测量前一周灭菌)。图29示出了表面改性培养板1-4和13具有相似的亲水性，且亲水性高于(较低的水接触角)Nunclon Delta^TM和CellBIND^TM表面。表面改性培养板1-4和13的亲水性在表面处理和灭菌后可稳定至少12周。

以前有文献提到CellBIND^TM具有13.4度的接触角(4度的标准偏差)(CorningTechnical Report(2005)，Surface：An Improved Surface forEnhanced Cell Attachment(CLS-AN-057REVl)(Corning技术报告(2005)，表面：一种用于增强细胞粘附的改良表面(CLS-AN-057REVl))，见于http：//catalog2.corning.com/Lifesciences/media/pdf/t_CellBIND_Improved_Surface_CLS_AN_057.pdf)。

负电荷密度

测定了表面改生培养板1-4和13、Nunclon Delta^TM表面、CellBIND^TM表面、Primaria^TM表面、Falcon^TM表面以及未经处理(但经过灭菌)的聚苯乙烯表面(全部为3cm培养皿的形式)上的负电荷密度。将3ml结晶紫水溶液(0.015％w/v)分配到每个培养皿中，然后将培养皿在室温和轻摇(50rpm)下孵育60分钟。为了去除未结合到表面上的结晶紫，将培养皿用3ml MilliQ水洗涤三次，然后在60℃下过夜干燥。通过加入1.5ml 0.1M的溶于乙醇溶液(99％)的HCl，并在室温和轻摇(50rpm)下将培养皿孵育2分钟，以解吸结合到表面上的结晶紫。使用EnVision 2100微板读数器(Perkin Elmer；Waltham，MA，USA)在590nm处测定含有解吸结晶紫的HCl∶EtOH溶液的吸光度。校正吸光度值，去除HCl∶EtOH溶液的背景吸光度。每种表面测量三个培养皿的负电荷密度，对每个培养皿重复测量三次吸光度。

表面改性培养板的负电荷密度如图30所示。表面1-4和13的负电荷密度相似，但较长的表面处理时间(以5-60秒的间隔)往往导致较低的表面负电荷密度。表面1-4和13相对于CellBIND^TM表面和2007年处理的Nunclon Delta^TM表面具有明显更低的负电荷密度。表面1-4和13具有与2005年处理的Nunclon Delta^TM表面相同水平的负电荷密度，而且其负电荷密度明显高于Primaria^TM表面、Falcon^TM表面和未处理(但经过灭菌)的聚苯乙烯表面。2005年处理的Nunclon Delta^TM表面的负电荷密度低于2007年处理的Nunclon Delta^TM表面，表明经表面处理的聚苯乙烯的负电荷随时间略有减少。CellBIND^TM的高水平负电荷密度不是由较高的表面粗糙度和表面积引起的(参见本实例中的AFM分析)。

X射线光电子能谱(XPS)

使用XPS对表面改性培养板1-4和13-15以及具有Nunclon Delta^TM、Costar^TM、Falcon^TM、CellBIND^TM和Primaria^TM表面的培养板进行分析。通过从培养板上切片并将其用弹簧夹固定在不锈钢样本夹持器上将样本置于X射线源下。使用Al kα辐射照射样本(1486eV)。样本与分析仪呈45°度角进行分析。使用由仪器供应商Physical Electronics提供的软件包对光谱进行曲线拟合。软件采用市售的Matlab^TM例程以用于数据处理。用于分析的仪器为Physical Electronics 5400型X射线光电子能谱仪。在每种表面的两个培养板的每一个中，对培养板的表面处理部分直径约1毫米的区域中最外层的2至5纳米深度进行分析。

以原子百分比为单位的表面元素组成如表7中所示。所有表面改性培养板的表面均含有碳、氧和氮(在XPS中不检测氢)。表面1-4、表面13以及CellBIND^TM表面比其他分析表面含有更多的氧。表面1-4和表面13-15比Primaria^TM含有更少的氮，但比Nunclon Delta^TM、Costar^TM、Falcon^TM以及CellBIND^TM培养板的表面含有更多的氮。氧和氮含量与较长的表面处理时间正相关(表面1-4和13)，使用30或60秒电晕等离子体处理(分别为表面3和表面4)得到了这两种元素的最高水平。表面3和4的元素组成相似。表面2和13的元素组成相似，并且相对于表面1的元素组成来说其更类似于表面3和4。

为了鉴定和定量表面中碳的键合环境，通过使用可在文献中找到的物质的峰宽和能级对Cls谱峰进行曲线拟合(最佳卡方拟合)(表8)。浓度以原子百分数为单位进行记录，其通过原子浓度与面积百分数相乘得到。表面2-4和13在碳键合环境方面相似。表面2-4和13中C*-C-O-C-C*键合环境的碳比例要低于其他分析表面。表面2-4和13中O-[C＝O]-O键合环境的碳比例要高于其他分析表面。还鉴定了表面2-4和13以及表面1、CellBIND^TM表面和/或Primaria^TM表面之间的相似性。表面1-4和13中C-O-C或C-NH3⁺键合环境(光谱中能级相同)的碳比例要高于其他分析表面。表面2-4、表面13以及Primaria^TM表面中C-O-C*＝O键合环境的碳比例要高于其他分析表面。表面2-4、表面13以及CellBIND^TM表面中CO₃键合环境的碳比例要高于其他分析表面。表面1-4、表面13以及CellBIND^TM表面中C＝O键合环境的碳比例要高于其他分析表面。表面1-4、表面13、CellBIND^TM表面以及Primaria^TM表面中C-[O]-C键合环境的碳比例要高于其他分析表面。能量损失峰由芳族∏→∏^*跃迁产生，是表面芳香性的指示。

Ols谱峰几乎为高斯型，不能进行曲线拟合。为了鉴定和定量表面中氮的键合环境，通过使用可在文献中找到的物质的峰宽和能级对Nls谱峰进行曲线拟合(最佳卡方拟合)(表9)。浓度以原子百分数为单位进行记录，其通过原子浓度与面积百分数相乘得到。从Nunclon Delta^TM、CellBIND^TM、Costar^TM以及Falcon^TM表面获得的Nls信号较弱，因此不可能对这些表面中的氮进行键合环境鉴定。表面改性培养板1-4和13的Nls光谱难以区别，示出了由两个代表性Nls光谱的曲线拟合产生的数据。表面1-4和13在-NH₃ ⁺键合环境中的氮比例要高于表面14、15和Primaria^TM表面。-NH₂键合环境中的氮仅在表面14和15以及Primaria^TM表面中检出。-NO₂键合环境中的氮仅在表面1-4和13中以及在表面15的一个样本中检出。-NO₃键合环境中的氮仅在表面15和Primaria^TM表面中检出。

CellBIND^TM之前被描述为通过ESCA分析具有70.4％碳、29.0％氧、0.6％氮和＜0.01％其他元素的元素组成，以及相对高浓度的C-[O]-C、C＝O和COOH/R基团(CorningTechnical Report(2005)， Surface：An Improved Surface forEnhanced Cell Attachment(CLS-AN-057REV1)(Corning技术报告(2005)，表面：一种用于增强细胞粘附的改良表面(CLS-AN-057REV1))，见于http：//catalog2.corning.com/Lifesciences/media/pdf/t_CellBIND_Improved_Surface_CLS_AN_057.pdf)。

Primaria^TM之前被描述为通过ESCA分析具有74.6％碳、14.1％氧、11.1％氮和0.2％其他元素的元素组成，主要具有腈(C≡N)和脲[HN(C＝O)NH]碳-氮键合环境。

原子力显微镜(AFM)

使用AFM对表面改性培养板1-4和13以及具有Nunclon Delta^TM和CellBIND^TM表面的培养板进行分析。使用Digital Instruments多模式原子力显微镜以轻敲模式对样本进行分析。所用探针为TESP7型轻敲模式探针。将样本用双面胶带粘附到样本盘上。分析培养板表面处理部分的10μm×10μm和500nm×500nm区域。以纳米为单位的表面平均粗糙度(Ra)和最大高度(Rmax)如表10中所示。像具有Nunclon Delta^TM和CellBIND^TM表面的培养板一样，表面改性培养板1-4和13相对光滑，并且在两种扫描的任一种中Ra和Rmax都不与表面处理时间相关。旨在用于细胞培养的未处理的聚苯乙烯和氧化聚苯乙烯表面以及Primaria^TM表面的分析已由Shen和Horbett进行过描述(J.Biomed.Mater.Res.57：336-345，2001)：所有三种表面的表面粗糙度约为4nm。

实例18

与人胚胎干细胞粘附和集落形成相关的表面元素组成和接触角

表面元素组成的XPS分析、表面接触角测量以及人胚胎干细胞粘附和集落形成实验的结果汇总在表11中给出。

在不存在能够抑制Rho或Rho激酶的化合物的情况下，仅在表面改性培养板2-4和13、CellBIND^TM培养板和Primaria^TM培养板上观察到了人胚胎干细胞粘附到固体基底表面上并在其上形成集落(每10cm²表面至少15个集落)(细胞以细胞群悬浮液的形式存在于表面上)。表面改性培养板2-4和13支持细胞粘附、集落形成和传代。经过大约三次传代后，人胚胎干细胞在表面改性培养板2-4和13上的生长速率自发下降(仅在不存在Rho抑制和Rho激酶抑制的情况下)，然而细胞形态表明细胞尚未分化。此外，对于在表面3上传代4次的细胞，保持了多能标记物的表达。CellBIND^TM培养板支持人胚胎干细胞的粘附和集落形成，但在第一次传代前观察到了细胞的分化。基于对细胞形态的观察，Primaria^TM培养板支持人胚胎干细胞的粘附和集落形成，无分化信号(未检测传代)。表面的氧(例如，表面2与表面14对比)和氮(例如，Primaria^TM与Costar^TM对比；以及表面2和表面13与CellBIND^TM对比)含量对于在不存在Rho抑制和Rho激酶抑制的情况下表面支持人胚胎干细胞粘附和集落形成的能力均有影响。含有至少约0.9％的氮、氮和氧含量的总和为至少约22.3％以及水接触角为至少约13.9度的表面在不存在Rho抑制和Rho激酶抑制的情况下支持人胚胎干细胞的粘附和集落形成。

在存在能够抑制Rho或Rho激酶的化合物的情况下，在表面改性培养板1-15、表面改性培养板19、表面改性培养板33、表面改性培养板34、CellBIND^TM和Primaria^TM上观察到了人胚胎干细胞粘附到固体基底表面上并在其上形成集落(每10cm²表面至少15个集落)(细胞以细胞群悬浮液的形式存在于表面上)。我们注意到，在促进人胚胎干细胞粘附和集落形成方面，表面2-4和13以及Primaria^TM要优于表面1、19、33和34以及CellBIND^TM，后者又优于表面5-12、14和15。在表面改性培养板3和4上，并在存在Rho激酶抑制剂的情况下，人胚胎干细胞粘附并形成扩增且可传代至少十次的集落，从而产生具有正常核型的多能细胞(仅对在表面4上生长的细胞检测了核型)。表面的氧(例如，CellBIND^TM与Nunclon Delta^TM对比)和氮(例如，Primaria^TM与Costar^TM对比；以及表面2和13与CellBIND^TM对比)含量对于在存在Rho激酶抑制的情况下表面支持人胚胎干细胞粘附和集落形成的能力均有影响。含有至少约0.5％的氮、氮和氧含量的总和为至少约17.2％以及水接触角为至少约13.9度的表面在存在Rho激酶抑制的情况下支持人胚胎干细胞的粘附和集落形成。含有至少约0.5％的氮、氮和氧含量的总和为至少约17.3％但低于19.9％以及水接触角为至少约9.4度的表面在存在Rho激酶抑制的情况下，一些支持人胚胎干细胞的粘附和集落形成(表面14)，另一些则不支持(表面22-24)。

我们注意到，将Rho激酶抑制剂从表面改性培养板4上培养的人胚胎干细胞培养物中除去导致了人胚胎干细胞与固体基底表面分离。细胞可通过采用Rho激酶抑制剂重新处理而重新粘附到表面上。假定人胚胎干细胞的酶消化法传代是一种潜在的应激源，并可导致核型不稳定，那么采用在人胚胎干细胞传代期间暂时移除Rho激酶抑制剂的方法，可消除酶消化法传代的应激。

还采用了无动物成分培养基、Rho激酶抑制和表面改性培养板4来说明人胚胎干细胞的粘附和集落形成。用细胞外基质蛋白对表面改性培养板4进行预处理得到了更多的集落，但仅仅是在存在Rho激酶抑制的情况下。

除了通过以集群传代细胞来保持集落式培养条件的酶方法来传代人胚胎干细胞外，人胚胎干细胞还可使用像TrypLE^TM或Accutase^TM的酶以单细胞传代。在存在或不存在Rho激酶抑制剂的情况下，使用粘附到表面改性培养板3和4上的TrypLE^TM将人胚胎干细胞集落解离成单细胞悬浮液，并形成可传代至少5次的集落，产生具有多能性标记物的细胞。

通过以单细胞悬浮液的形式传代细胞制备的人胚胎干细胞培养物，从中除去Rho激酶抑制剂不会导致人胚胎干细胞与固体基底表面分离，但会导致集落比未除去Rho激酶抑制剂时生长得更快。

实例19

用Y-27632处理促进HEK293细胞在表面改性培养板上的粘附

将人胚肾细胞293(HEK293，ECACC no.85120602)保持在含10％胎牛血清(FBS；Lonza)的Eagle最低必需培养基(EMEM；Lonza，Verviers，Belgium)中。让细胞适应于Pro293a-CDM培养基(Lonza)，这是一种针对贴壁细胞HEK293的培养进行了优化的化学成分确定的无血清培养基，适应方法是采用顺序比率为3∶1、1∶1、1∶3、1∶7及最终0∶1的含血清EMEM和Pro293a-CDM培养基进行逐步的数次传代。为了维持和适应，将HEK293细胞按2.0×10⁴个细胞/cm²的密度接种于75-cm²带Nunclon Delta^TM表面(Thermo Fisher Scientific，Roskilde，Denmark)的培养瓶中，在达到70-80％的汇合度时采用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸解离细胞以进行传代。

将按照1.0、4.0或10μM的浓度添加了Y-27632(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的Pro293a-CDM培养基(100μl)分配到带有表面4、Nunclon Delta^TM表面或CellBIND^TM表面的平底96孔板上。将另外的100μl具有HEK293细胞的Pro293a-CDM培养基加到孔中(4.0×10⁴个细胞/cm²)。然后将培养物在37℃下以及空气中含5％CO₂的潮湿气氛中孵育：

(i)96小时；或(ii)48小时，接下来采用200μl Dulbecco磷酸盐缓冲液(DPBS；Lonza)将培养物洗涤一次，然后添加200μl无Y-27632的Pro293a-CDM培养基，最后将培养物再孵育48小时。

然后，使用得自Roche(Switzerland)的乳酸脱氢酶(LDH)活性试剂盒测定孔中的活细胞数。简单地说，先用Pro293a-CDM培养基洗涤孔，然后将贴壁细胞在100μl含有2％(v/v)Triton X-100(Sigma Chemical Co)的DPBS中于37℃下孵育30分钟进行裂解。将裂解物、100μl催化剂和染料试剂混合物混合并在25℃暗处孵育30分钟。通过加入50μl 1.0M的HCl停止反应，然后采用微板读数器(Genios Pro；Tecan，Austria)在490nm处测量吸光度。采用从这些样品和标准品(含有得自已知数量的细胞的LDH)得到的A490值计算细胞数。

固体基底表面和Y-27632对Pro293a-CDM培养基中的HEK293细胞的粘附和生长的影响如图31a所示，其中持续暴露于Y-2763296小时被标记为“Y-2763296h接触”，而持续暴露于Y-2763248小时接下来改变培养基并在不含Y-27632的情况下孵育48小时被标记为“Y-2763248h接触/48h不接触”。在不存在Y-27632的情况下，HEK293细胞粘附到所有三种表面上。孵育48小时后改变培养基导致了在96小时的孵育后测得的培养物中的细胞数明显更少。当以2.0和5.0μM的浓度应用时，Y-27632促进了HEK293细胞在表面4和CellBIND^TM表面上的粘附。孵育48小时后除去Y-27632导致了细胞与所有三种表面明显分离。

进行了另一个类似的实验，但采用2.0×10⁴个未适应的HEK293细胞/cm²的接种密度，以及整个实验均采用添加了10％FBS的EMEM。固体基底表面和Y-27632对添加了10％FBS的EMEM中的HEK293细胞的粘附和生长的影响如图31b所示，其中持续暴露于Y-2763296小时被标记为“Y-2763296h接触”，而持续暴露于Y-2763248小时接下来改变培养基且在不含Y-27632的情况下孵育48小时被标记为“Y-2763248h接触/48h不接触”。在不存在Y-27632的情况下，HEK293细胞粘附到所有三种表面上。孵育48小时后改变培养基导致了在96小时的孵育后测得的培养物中的细胞数明显更少。当以2.0和5.0μM的浓度应用时，Y-27632促进了HEK293细胞在表面4和CellBIND^TM表面上的粘附。48小时的孵育后除去Y-27632导致了细胞与表面4和CellBIND^TM明显分离。

实例20

用Y-27632和H-1152处理促进HEK293细胞在表面改性培养板上的生长

将HEK293细胞保持在含10％FBS(Lonza)的EMEM(Lonza)中。在达到70-80％的汇合度时采用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸解离细胞以进行传代，按2.0×10⁴个细胞/cm²的接种密度接种到75-cm²带Nunclon Delta^TM表面(Thermo Fisher Scientific，Roskilde，Denmark)的培养瓶中。

将添加了10％FBS且含有1.0、5.0、10、15或20μM Y-27632(Sigma Chemical Co.)或者0.4、1.2、1.6、2.4或2.8μM H-1152(Calbiochem，EMD Chemicals Inc.，Darmstadt，Germany)的EMEM(500μl)分配到Multidish 24孔板中，它们要么带有表面4要么带有未处理的(但经γ辐照，25kGy)聚苯乙烯表面。将另外500μl添加了10％FBS且含有HEK293细胞的EMEM加到孔中(2.0×10⁴个细胞/cm²)。将培养物置于IncuCyte^TMPlus(Essen Instruments，Michigan，USA)中，然后在37℃下以及空气中含5％CO₂的潮湿气氛中孵育。IncuCyte^TMPlus是一种自动成像平台，被构造为安装在CO₂培养箱内，设计为提供动力学、非侵入性活细胞成像，方法是在用户定义的时间以及培养物中的位置采集细胞的相衬图像。仪器的主要度量指标是培养物汇合度，即被细胞覆盖的表面的分数。将HEK293细胞无操作孵育72小时，且每2小时在一式三份培养物的9个位置采集图像。使用IncuCyte^TMPlus软件(v.3.4.1.25966)确定培养物汇合度。

增加Y-27632和H-1152的浓度促进了HEK293细胞在表面4上的粘附和生长(图32a)。未处理的细胞培养表面和Y-27632或H-1152对HEK293粘附和生长的影响如图32b所示。在存在10μM Y-27632和0.6-1.2μM H-1152的情况下，对HEK293细胞的生长和粘附略有促进。然而，与表面4相比，在未处理的细胞培养表面上，对HEK293细胞的生长和粘附的促进不太显著。

实例21

用H-1152处理促进HEK293细胞的生长和对表面改性培养板的粘附

将HEK293细胞保持在含有10％FBS(Lonza)的EMEM(Lonza)中。在达到70-80％的汇合度时采用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸解离细胞以进行传代，并按2.0×10⁴个细胞/cm²的接种密度接种于75-cm²带Nunclon Delta^TM表面(Thermo Fisher Scientific，Roskilde，Denmark)的培养瓶中。

将添加了10％FBS且含有0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4或2.8μM H-1152的EMEM(1.0ml)分配到带有表面4的Multidish 12孔板中。将另外1.0ml添加了10％FBS且含有HEK293细胞的EMEM加到孔中(4.0×10⁴个细胞/cm²)。将培养物置于IncuCyte^TM Plus中，在37℃下以及空气中含5％CO₂的潮湿气氛中孵育42小时(每6小时采集一次图像)。然后通过移液移除1ml培养基，再加入1.0ml添加了10％FBS且含有0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4μM H-1152的EMEM。将培养物再次置于IncuCyte^TM Plus中，然后在随后的25小时内每小时采集一次图像。在一式三份培养物的9个位置采集图像，使用IncuCyte^TM Plus软件确定培养物汇合度。检索通过IncuCyte^TM Plus在HEK293细胞培养物(在存在或不存在H-1152(0.6μM)的情况下生长)的特定位置采集到的图像，并以相衬显微图示出，用于比较以下时间点的HEK293培养物形态：孵育开始时(0小时)，临近改变培养基前(42小时)，改变培养基后1小时(43小时)，以及最后为孵育52小时后。

在不存在H-1152以及存在0.2μM或0.4μM H-1152的情况下，孵育42小时后改变50％的培养基导致了培养物汇合度的显著降低(图33a)。在存在0.6μM、0.8μM或1.4μM H-1152的情况下，改变培养基造成的影响甚微。在存在H-1152的情况下生长在表面4上的HEK293细胞对固体基底表面的覆盖比在不存在H-1152的情况下生长在表面4上的HEK293细胞更均匀(图33b)。在不存在H-1152的情况下，HEK293细胞形成大型集群，而在存在H-1152的情况下，HEK293细胞形成具有较低细胞密度的较小集群。

实例22

用Y-27632处理促进HEK293细胞在表面改性培养板上生长三代

将添加了10％FBS且含有5.0μM Y-27632的EMEM(500μl)分配到带有表面4或Nunclon Delta^TM表面的Multidish 24孔板的孔中。将另外500μl添加了10％FBS且含有HEK293细胞的EMEM加到孔(2.0×10⁴个细胞/cm²)中，将培养物在37℃下以及空气中含5％CO₂的潮湿气氛中孵育3天。通过用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(Lonza，Verviers，Belgium)在37℃下处理2分钟让细胞传代，采用NucleoCount细胞计数器(Chemometec A/S，Denmark)测定总细胞数。对于连续传代，将HEK293细胞按2.0×10⁴个细胞/cm²的密度接种。HEK293细胞在表面4和Nunclon Delta^TM表面上的生长因存在2.5μM Y-27632而增强(图34)。

实例23

人胚胎干细胞的粘附、培养和维持，使用不含细胞外基质蛋白/成分和饲养细胞的表面改性培养板4、18和19

将保持在1∶30MATRIGEL包被的塑料器皿上添加了8ng/ml bFGF的MEF条件培养基中的第42代H1人胚胎干细胞通过LIBERASE^TM酶处理分离，然后按1∶2的稀释比按接种到表面改性96孔板上添加了8ng/ml bFGF的MEF条件培养基中。将细胞接种到改性表面4、18或19或者Primaria^TM上。为了确定Rho激酶抑制对细胞与改性表面结合的影响，我们采用10mM Rho激酶抑制剂Y-27632或者3或10mM Rho激酶抑制剂H-1152甘氨酰处理细胞。未经处理的细胞作为对照。培养24小时后吸出微孔中的液体，干燥细胞，然后用结晶紫对孔染色。

我们观察到，在培养24小时后，胚胎干细胞集落在用Rho激酶抑制剂处理时粘附到表面改性培养板4和19及Primaria^TM板上并展开，然而在表面改性培养板18上未观察到相同的效果(图35)。

实例24

人胚胎干细胞的粘附、培养和维持，使用不合细胞外基质蛋白/成分和饲养细胞的表面改性培养板30、31、32、33和34

将保持在1∶30MATRIGEL包被塑料器皿上添加了8ng/ml bFGF的MEF条件培养基中的第47代H1人胚胎干细胞通过TrypLE^TM酶处理分离，然后按1∶3的稀释比接种到表面改性96孔板上添加了8ng/ml bFGF的MEF条件培养基中。将细胞接种到改性表面30、31、32、33或34上。为了确定Rho激酶抑制对细胞与改性表面结合的影响，我们采用3mM Rho激酶抑制剂H-1152甘氨酰处理细胞。未经处理的细胞作为对照。另外，将细胞接种到用Matrigel^TM预处理过的表面改性培养板的孔中。在接种24小时后，将培养基用新鲜的添加了8ng/ml bFGF的MEF条件培养基更换，对于在存在Rho激酶抑制剂的情况下接种的细胞，向培养基添加3mMH-1152甘氨酰。培养48小时后吸出微孔中的液体，干燥细胞，然后用结晶紫对孔染色。

我们观察到，在培养48小时后，胚胎干细胞集落在用Rho激酶抑制剂处理时粘附到表面改性培养板33和34上并展开(分别为图39和40)，然而在表面改性培养板30、31或32上未观察到相同的效果(分别为图36-40)。

实例25

人胚胎干细胞的粘附、培养和维持，使用不含细胞外基质蛋白/成分和饲养细胞的表面改性培养板22、23、24或29

将保持在1∶30MATRIGEL包被塑料器皿上添加了8ng/ml bFGF的MEF条件培养基中的第46代H1人胚胎干细胞通过Liberase^TM酶处理分离，然后按1∶3的稀释比接种到表面改性60mm培养皿上添加了8ng/ml bFGF的MEF条件培养基中。将细胞接种到表面改性培养板3、4、22、23、24和29上。为了确定Rho激酶抑制对细胞与改性表面结合的影响，我们用3μM Rho激酶抑制剂H-1152甘氨酰处理细胞以接种细胞。在接种细胞24小时后，将培养基用新鲜的添加了8ng/ml bFGF和1mM Rho激酶抑制剂H-1152甘氨酰的MEF条件培养基更换。接种到改性表面3、4或matrigel^TM包被塑料上的细胞作为对照。接种24和48小时后，通过相衬显微镜观察培养板。我们观察到，培养48小时后，胚胎干细胞集落未粘附到表面改性培养板22、23、24或29上，无论是在存在还是不存在Rho激酶抑制剂的情况下接种，而在存在Rho激酶抑制剂的情况下接种到表面改性培养板3或4上的细胞则确实发生了粘附和展开。

实例26

对本发明表面改性培养板的表面的进一步表征

水接触角

将表面改性培养板1-4和13分别包装在塑料袋中、灭菌，在室温下保存40周的测试期。在表面处理和灭菌后一周首次测量接触角，然后在如图41给出的时间点再次测量。所有接触角测量均如实例17所述完成。对Nunclon Delta^TM和CellBIND^TM表面的测量在与对表面1-4和13的测量相同的实验条件下进行，但表面处理和灭菌的完成时间在第一次测量前不止12周(Nuclon Delta^TM*在第一次测量前一周灭菌)。图41表明表面改性培养板1-4和13具有相似的亲水性且亲水性高于(较低的水接触角)Nunclon Delta^TM和CellBIND^TM表面。表面改性培养板1-4和13的亲水性在表面处理和灭菌后可稳定至少41周。

还在表面改性培养板5-12、22-24、29、30和33上测量了接触角，这些培养板包装在塑料袋中并如实例16所述灭菌，然后在室温下保存了9周(保存了28周的表面改性培养板29例外)。表面改性培养板18、19、32和34为单个微孔的形式，因此不能用于测量接触角。表面改性培养板30和33为微孔板格式，其接触角测量在板的背后而非孔内进行。如实例17所述测量接触角(对于高亲水表面改性培养板29，施加一小滴2.5μl MilliQ水)，但分析一式三份样品，每个样品施加7滴。对具有Costar^TM、Falcon^TM、Primaria^TM和Nunclon Delta^TM表面的板的测量在同样的实验条件下进行，但表面处理和灭菌的完成时间在第一次测量前不止12周。图42示出了表面改性培养板5-12的亲水性高于(较低的水接触角)Nunclon Delta^TM、Costar^TM和Falcon^TM表面。表面5-12的亲水性与Primaria^TM表面的亲水性相当，并高于表面1-4和13的亲水性(如图41所示)。表面改性培养板22-24和33的亲水性与表面1-4和13的亲水性相当(如图41所示)，而表面30的亲水性与Nunclon Delta^TM、Costar^TM和Falcon^TM表面的亲水性相当。表面改性培养板29比其他被分析的表面亲水性明显更强。

负电荷密度

测定了表面改性培养板5-12(均为5cm培养皿形式)、18、19、30、32、33和34(均为微孔形式)、表面改性培养板22-24和29(均为6cm培养皿形式)、CellBIND^TM表面(3cm培养皿形式)、Primaria^TM表面(multidish 6孔培养板形式)以及Nunclon Delta^TM表面(3cm培养皿形式)上的负电荷密度。将过量的结晶紫水溶液(0.015％重量体积比)加入每种形式中(培养皿形式中加入0.34ml/cm²，微孔形式中加入0.13ml/cm²)，并在轻微摇动(50rpm)下于室温孵育60分钟。为了去除未与表面结合的结晶紫，用3ml MilliQ水冲洗培养皿形式的培养板3次，并用350μl MilliQ水冲洗微孔形式的培养板3次，然后在60℃下干燥过夜。通过加入0.17ml/cm²溶于EtOH溶液(99％)的0.1M HCl来解吸与表面结合的结晶紫，然后在轻微摇动(50rpm)下于室温孵育培养板2分钟。使用EnVision 2100微板读数器(Perkin Elmer；Waltham，MA，USA)在590nm测定含有解吸的结晶紫的HCl∶EtOH溶液的吸光度。校正吸光度值，去除HCl：EtOH溶液的背景吸光度。对于表面改性培养板5-12、22-24、29、CellBIND^TM、Primaria^TM和Nunclon Delta^TM，各测量三个板的负电荷密度，并且每个板的吸光度测量重复进行3次。对于表面改性培养板18、19、30、32、33和34而言，检测一个样品并重复测量3次。

表面改性培养板5-12的负电荷密度是类似的，并且这些表面的负电荷密度显著低于CellBIND^TM表面和Nunclon Delta^TM表面的负电荷密度，但显著高于Primaria^TM表面的负电荷密度(图43)。表面改性培养板19、33和34的负电荷密度显著高于表面改性培养板18、30和32的负电荷密度，后者各自为用相同的聚合材料制成的未处理表面。将表面改性培养板22-24和29的负电荷密度归一化到Nunclon Delta^TM表面的负电荷密度，图44示出了表面改性培养板22-24的负电荷密度高于Nunclon Delta^TM表面的负电荷密度，而表面改性培养板29的负电荷密度显著低于Nunclon Delta^TM表面(和表面4)的负电荷密度。

X射线光电子能谱(XPS)

按照实例17中所述的方法，使用XPS分析表面改性培养板5-12、18、19、22-24、29、30、31-34。以原子百分数为单位的表面元素组成示于表12中。除了表面改性培养板31和32(未进行等离子体处理)不含氮外，所有的表面都含有碳、氧和氮(XPS不能检测氢)。表面改性培养板5-12的氧含量低于表面改性培养板1-4和13，但显著高于Costar^TM、Falcon^TM和Nunclon Delta^TM表面(示于表7中)。表面改性培养板5-12通过微波等离子体处理制备，而表面改性培养板1-4和13通过电晕等离子体处理制备。表面改性培养板19、33和34通过电晕等离子体处理制备，但由其他非聚苯乙烯的聚合物注射成型(聚苯乙烯用于制备表面改性培养板1-4和13)，这些表面改性培养板的氧含量与表面改性培养板1-4和13的氧含量相当。表面改性培养板22-24的氧含量低于表面改性培养板1-4和13。表面改性培养板29的氧含量与表面改性培养板1-4和13的氧含量相当。表面改性培养板5-12、19、33和34的氮含量低于表面改性培养板1-4和13，但高于Costar^TM、Falcon^TM和Nunclon Delta^TM表面(示于表7中)。表面改性培养板29的氮含量明显高于其他被分析的表面，包括Primaria^TM表面。

通过使用可在文献中找到的物质的峰宽和能级，对Cls谱峰进行曲线拟合(最佳卡方拟合)，以确定和定量表面改性培养板中碳的键合环境(表13)。浓度以原子百分数为单位进行记录，可通过原子浓度与面积百分数相乘来得到。就碳键合环境而言，除表面10、22-24和29以外，所有等离子体处理的表面均类似。表面19、33和34中的C-[O]-C的碳比例显著高于表面5-12、18、30和32以及表面1-4和13中的水平(示于表8中)。表面5-12、19、33和34中的O-[C＝O]-O键合环境的碳比例低于表面1-4和13中的水平。表面5-9、11、12、19、33和34中的C*-C-O-C-C*的碳比例显著高于表面1-4和13中的水平，但与Nunclon Delta^TM和CellBIND^TM表面中的水平相当。表面5-12、19、33和34中的C-O-C或C-NH₃ ⁺键合环境(光谱中能级相同)的碳比例低于表面1-4和13中的水平，但高于Costar^TM、Falcon^TM、CellBIND^TM和Primaria^TM表面中的水平。表面19、33和34中的C-O-C*＝O键合环境的碳比例高于表面5-12中的水平，并与表面1-4和13中的水平相当。表面5-12中的C＝O键合环境的碳比例高于表面19、33和34中的水平，但低于表面1-4和13中的水平。表面5-12中的CO₃ ^-键合环境的碳比例高于表面19、33和34中的水平，并与表面1-4和13中的水平相当。就碳键合环境而言，表面22-24类似。表面22-24中的C-[O]-C、O-[C＝O]-O、C-O-C或C-NH₃ ⁺、C-O-C＝O*和C＝O中的碳比例显著低于表面1-4和13中的水平。表面22-24中的CO₃ ^-和C*-C-O-C-C*键合环境的碳比例高于表面1-4和13中的水平。表面29的碳键合环境不同于所有其他等离子体处理表面的碳键合环境。C-[O]-C中的碳比例与表面1-4和13中的水平相当。表面29中的O-[C＝O]-O、CO₃ ^-和C*-C-O-C-C*键合环境的碳比例低于表面1-4和13中的水平。表面29中的C-O-C或C-NH₃ ⁺、C-O-C*＝O和C＝O键合环境的碳比例高于表面1-4和13中的水平。能量损失峰由芳族∏→∏^*跃迁产成，是表面芳香性的指示。

Ols谱峰几乎为高斯型，不能进行曲线拟合。通过使用可在文献中找到的物质的峰宽和能级，对Nls谱峰进行曲线拟合(最佳卡方拟合)，以确定和定量表面中氮的键合环境(表14)。浓度以原子百分数为单位进行记录，可通过原子浓度与面积百分数相乘来得到。除表面9以外，所有表面中的-NH₃ ⁺键合环境的氮比例均低于表面1-4和13中的水平。表面5-12、19、33和34中的-NH₂键合环境的氮是变化的，但都高于表面1-4和13中的水平。表面5-12、19、33和34的-NO₂键合环境的氮是变化的，但都低于表面1-4和13中的水平。表面5-12、19、33和34的-NO₃键合环境的氮是变化的，但都高于表面1-4和13中的水平。表面22-24和29的氮键合环境不同于其他等离子体处理表面。表面22-24和29中的-NH₂键合环境的氮比例是变化的，但都显著高于表面1-4和13中的水平。表面22-24和29中的-NO₂键合环境的氮比例低于表面1-4和13中的水平。就O＝C-N-C＝O键合环境中的氮比例而言，表面22-24和29与表面1-4和13是相当的。

在整篇文档中引用的出版物据此全文以引用方式并入。尽管上文已结合实例和优选实施例描述了本发明的各个方面，但应当理解本发明的范围不受上述具体实施方式的限定，而受以下在专利法原则下合适解释的权利要求书的限定。

表格

表1：培养于本发明的表面改性培养板上的第50代人胚胎干细胞系H1细胞中多能标记物的表达

表2：培养于本发明的表面改性培养板上的第53代人胚胎干细胞系H1细胞中多能标记物的表达

表3：用激活素A处理后，培养于本发明的表面改性培养板上的第51代(p2)和第53 代(p4)人胚胎干细胞系H1细胞的定形内胚层谱系特征性标记物的表达

H1人胚胎干细胞分化为定形内胚层后，表面标记物CXCR4的表达％

表4：在本发明的表面改性培养板上传代一次后，汇合百分数(被培养物占据的采集区)以及在采集区内大于50K平方微米的人H9胚胎干细胞集落的总数

RI暴露量：用于96小时培养的Y-27632的μM浓度

表5：用激活素A处理后，培养于本发明的表面改性培养板上的第51代人胚胎干细胞系H1细胞的定形内胚层谱系特征性标记物的表达

表6：本发明的表面改性培养板的制备

*未经γ照射灭菌

表7：通过XPS测定的表面改性培养板的表面元素组成

*测得其他元素的浓度为0.4％

表8：通过Cls光谱曲线拟合得到的碳键合环境

*该官能团只在一个样品中鉴定到。

表9：通过Nls光谱曲线拟合得到的氮键合环境

*表面改性培养板1-4和13的Nls光谱不可区分，给出了由两个代表性Nls光谱的曲线拟合得到的数据。

**该官能团只在一个样品中鉴定到。

表10：通过AFM测定的本发明的表面改性培养板的表面粗糙度

表11：本发明的表面改性培养板上的表面元素组成的XPS分析以及人胚胎干细胞粘附和集落形成实验的结果汇总

“-”是指每10cm²形成少于15个集落

“+”、“++”和“+++”分别是指一些(每10cm² 15个或更多个集落)、较多和最多的人ES细胞粘附和集落形成

“RI”是指Rho激酶抑制剂；“ND”是指未进行实验

“PS”是指聚苯乙烯；“PC”是指聚碳酸酯；“PS/PC”是指聚苯乙烯和聚碳酸酯的共混物；“COC”是指环烯烃共聚物；“CP”是指电晕等离子体；“MP”是指微波等离子体

*人ES细胞粘附并生长成集落，这些集落可以传代约3次(然后生长速率自发下降)

**人ES细胞粘附并生长成集落，这些集落在第一次传代前便自发分化

***人ES细胞粘附并生长成集落(未检测传代)

****只有一个样品可供分析

表12：通过XPS测定的表面元素组成

*未经等离子体处理。

**测得其他元素的浓度为0.2-2.0％。

表13：通过Cls光谱曲线拟合得到的碳键合环境

*未经等离子体处理。

表14：通过Nls光谱曲线拟合得到的氮键合环境

*未经等离子体处理。

**ND：经分析，未检测到。

Claims

1.一种促进细胞粘附于表面的方法，所述表面含有至少约0.5%的N、O和N的总和大于或等于17.2%、接触角为至少约13.9度且不含饲养细胞层和吸附层，所述方法包括以下步骤：

a. 获得所述细胞的悬浮液，

b. 用至少一种选自以下物质的化合物处理所述细胞悬浮液：能够抑制Rho激酶活性的化合物和能够抑制Rho活性的化合物，以及

c. 将所述细胞悬浮液添加到所述表面，让所述细胞粘附。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述O和N的总和大于或等于19.5%。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述表面具有吸附层。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞在粘附于所述表面后进行培养。

5.根据权利要求4所述的方法，其中将至少一种化合物在所述细胞粘附于所述表面后去除。

6.根据权利要求1所述的方法，其中通过去除至少一种化合物将所述细胞与所述表面分离。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞悬浮液为细胞群悬浮液。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞悬浮液为单细胞悬浮液。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述表面为容器或基质的一部分。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述方法包括用至少一种能够抑制Rho激酶活性的化合物处理所述细胞悬浮液。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述能够抑制Rho激酶活性的化合物选自Y-27632、法舒地尔和羟基法舒地尔。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述能够抑制Rho激酶活性的化合物是Y-27632。

13. 根据权利要求10-12中任一项所述的方法，其中所述方法包括用约0.1µm-约100 µm的至少一种能够抑制Rho激酶活性的化合物处理所述细胞悬浮液。

14. 根据权利要求10-12中任一项所述的方法，其中所述方法包括用约10 µm的至少一种能够抑制Rho激酶活性的化合物处理所述细胞悬浮液。

15.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述方法包括用至少一种能够抑制Rho活性的化合物处理所述细胞悬浮液。

16. 根据权利要求15所述的方法，其中所述能够抑制Rho活性的化合物是Rho GTP酶抑制剂。

17.根据权利要求15所述的方法，其中所述能够抑制Rho活性的化合物是胞外酶C3转移酶。

18. 根据权利要求15-17中任一项所述的方法，其中所述方法包括用约0.01 µg/ml-约5 µg/ml的至少一种能够抑制Rho活性的化合物处理所述细胞悬浮液。

19. 根据权利要求15-17中任一项所述的方法，其中所述方法包括用约0.5 µg/ml的至少一种能够抑制Rho活性的化合物处理所述细胞悬浮液。

20. 一种组合物，包含

a. 表面，所述表面为旨在用于细胞培养或分析的容器或基质的一部分，其中所述表面含有至少约0.5%的N，O和N的总和大于或等于17.2%，接触角为至少约13.9度且不含饲养细胞层和吸附层，以及

b. 至少一种选自以下物质的化合物：能够抑制Rho激酶活性的化合物和能够抑制Rho活性的化合物。

21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述O和N的总和大于或等于19.5%。

22.根据权利要求20所述的组合物，其中所述表面具有吸附层。

23.根据权利要求20-22中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含能够抑制Rho激酶活性的化合物。

24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述能够抑制Rho激酶活性的化合物选自Y-27632、法舒地尔和羟基法舒地尔。

25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述能够抑制Rho激酶活性的化合物是Y-27632。

26.根据权利要求20-22中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含至少一种能够抑制Rho活性的化合物。

27. 根据权利要求26所述的组合物，其中所述能够抑制Rho活性的化合物是Rho GTP酶抑制剂。

28.根据权利要求26所述的组合物，其中所述能够抑制Rho活性的化合物是胞外酶C3转移酶。