CN103087916B

CN103087916B - 一种涂覆有Matrigel的细胞培养板及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103087916B
Application number: CN201310017530.2A
Authority: CN
Inventors: 李萌
Original assignee: Heilongjiang Province Zhongsheng Biological Science & Technology Co Ltd
Current assignee: Heilongjiang Province Zhongsheng Biological Science & Technology Co Ltd
Priority date: 2013-01-17
Filing date: 2013-01-17
Publication date: 2014-04-16
Anticipated expiration: 2033-01-17
Also published as: CN103087916A

Abstract

本发明公开了一种涂覆有Matrigel的细胞培养板及其制备方法和应用，本发明采用先进的等离子喷涂技术在细胞培养板表面形成羧基表面，然后采用化学铆钉技术将Matrigel通过共价键的形式连接到聚苯乙烯细胞培养板或培养皿表面，形成涂覆有Matrigel的细胞培养板或培养皿。由于该培养板的基材表面采用化学相结合的表面处理方式，其表面的Matrigel不会溶出。相该培养板比于通过物理包被的细胞培养板，该培养板的保存时间更长。该培养板（皿）适用于原代细胞及少数贴壁困难，易成团，易脱落，生长缓慢的细胞的培养，如神经元、LNCaP、PC-12等，可使细胞贴壁更加牢固，细胞伸展充分，获得更稳定生长状态。

Description

一种涂覆有Matrigel的细胞培养板及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种涂覆有Matrigel的细胞培养板及其制备方法和在细胞培养中的应用，属于细胞培养技术领域。

背景技术

细胞培养是生物学科学研究、细胞治疗以及组织工程发展的必要前提，细胞培养板（皿）是细胞培养的基本装置，目前用于细胞培养板主要由聚苯乙烯或聚乙烯加工而成，适合于多种细胞的粘附和生长。随着细胞生物学的发展，对细胞培养板的性能要求也越来越高，普通的细胞培养板对一些原代细胞及贴壁困难，易成团，易脱落，生长缓慢的细胞扩增的效果不佳。为了改善这些细胞的粘附和增殖情况，近年来，人们通过物理的方法将聚赖氨酸、胶原等生物相容性良好的材料涂覆在细胞板表面以促进细胞的粘附和增殖。例如：聚赖氨酸包被的表面可以改善细胞的贴附性和加快增殖，适用于无血清或低血清培养或神经元细胞培养、神经胶质细胞培养及转染细胞系培养（如HEK-293、PC12、L929、3T3细胞系）。胶原蛋白包被细胞培养板可以大幅度降低蛋白质的吸附。在该培养板上进行播种后，只要静置即可获得细胞的贴壁和增殖。可以抑制细胞的培养面因此，细胞的聚集的成型率高，所培养的细胞形态均一。近年来，Matrigel也被广泛的应用于细胞分化、血管形成和肿瘤生长有关的研究，美国专利US20030017589中采用matrigel涂覆的培养板用于培养胚胎干细胞。但是这些方法均存在操作复杂以及涂覆不均一的缺点。本发明旨在公开一种涂覆有Matrigel的细胞培养板及其制备方法，采用化学交联将Matrigel均一地固定在细胞培养板表面，用以多种细胞特别是神经类细胞的培养。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于细胞培养的涂覆有Matrigel的细胞培养板及其制备方法，以该方法制得细胞培养板表面涂覆有生物相容性良好的Matrigel。

本发明是通过下述技术方案加以实现，一种用于细胞培养的涂覆有Matrigel的细胞培养板，其特征在于，细胞培养板表面Matrigel的密度0.01-2mg/cm²。

在本发明中，Matrigel是通过共价键的方式与聚苯乙烯细胞培养板表面连接，相比于物理涂覆具有更好的稳定性和均一性。

上述的用于细胞培养的涂覆有Matrigel的细胞培养板的制备方法及由该方法制备得的细胞培养板，其特征在于包括以下过程：

(1)将聚苯乙烯细胞培养板或培养皿在无水乙醇中浸泡40min，用去离子水冲洗，真空干燥，备用；

(2)量取50ml去离子水，将0.05-0.2g羟基琥珀酰亚胺（NHS）以及0.5g2-吗啉乙磺酸水合物（MES）加入其中，混合搅拌30min-1h，过滤灭菌，并保存在4℃中备用；

(3)称取一定量的碳化二亚胺（EDC）溶于去离子水中，形成质量浓度为1-5%的碳化二亚胺溶液，过滤灭菌备用；

(4)将清洗好的培养板放入等离子发生器中，抽真空至0-1Pa，通入氧气至10-200Pa，调整放电功率在5-300W之间，进行射频放电0.5-10min；

(5)在真空状态下将步骤(2)配制的混合液加入到步骤(4)获得的培养板中，液面要完全覆盖培养板底部，10min后将一定体积的蛋白浓度为9-15mg/ml Matrigel溶液加入其中，混合均匀孵育30min；最后在混合液中加入步骤(3)获得的碳化二亚胺溶液，混合均匀后孵育30min以上；

(6)弃去步骤(5)获得的培养板中的混合液体，并用无菌去离子水冲洗3遍，干燥，封装，即得。

进一步的，本发明还提出了所述的涂覆有Matrigel的细胞培养板在细胞培养中的应用。

其中，优选的，所述的细胞为原代细胞及少数贴壁困难，易成团，易脱落，生长缓慢的细胞，如神经元、LNCaP、PC-12等。

本发明的有益效果：

本发明采用先进的等离子喷涂技术在细胞培养板表面形成羧基表面，然后采用化学铆钉技术将Matrigel通过共价键的形式连接到聚苯乙烯细胞培养板或培养皿表面，形成涂覆有Matrigel的细胞培养板或培养皿。由于该培养板的基材表面采用化学相结合的表面处理方式，其表面的Matrigel不会溶出。相该培养板比于通过物理包被的细胞培养板，该培养板的保存时间更长。该培养板（皿）适用于原代细胞及少数贴壁困难，易成团，易脱落，生长缓慢的细胞的培养，如神经元、LNCaP、PC-12等，可使细胞贴壁更加牢固，细胞伸展充分，获得更稳定生长状态。

用该方法获得的细胞培养板能够促进神经元的生长并形成突起。如图1所示，培养3天时，在Matrigel胶涂覆的细胞培养板上种植的神经元，生长良好表现出神经元特有的突起，而在普通培养板上生长的神经元则呈现球形，没有突起形成（如图2所示）。该方法过程简单且获得的培养板表面的Matrigel均一稳定，能够促进多种细胞的增殖（神经细胞、心肌细胞、干细胞等）。成本相对低廉，应用更加安全。

附图说明

图1为神经元在Matrigel涂覆的细胞培养板上培养3时的光镜照片；

图2为神经元在普通培养板上培养3时的光镜照片。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施所用的主要原料Matrigel为自制或购自BD公司（货号：354234），EDC、NHS以及MES等均为化学纯。

实施例1涂覆有Matrigel的细胞培养板的制备

(1)将聚苯乙烯6孔细胞培养板在无水乙醇中浸泡40min，用去离子水冲洗，真空干燥，备用。

(2)量取50ml去离子水，将0.2g羟基琥珀酰亚胺（NHS）以及0.5g2-吗啉乙磺酸水合物（MES）加入其中，混合搅拌半小时以上，过滤灭菌，并保存在4℃中备用。

(3)称取1g碳化二亚胺（EDC）溶于99ml去离子水中，形成质量浓度为1%的EDC溶液，过滤灭菌备用。

(4)将清洗好的培养板放入等离子发生器中，抽真空至1Pa，通入氧气至50Pa，调整放电功率在60W，进行射频放电1min。

(5)在真空状态下将步骤(4)获得的培养板中，每孔加入步骤(2)配制的混合液3ml，10min后将然后将3ml自制的蛋白浓度为15mg/ml的Matrigel溶液（按照实施例5的方法制备得到）加入其中，混合均匀孵育30min，再在每孔中加入2ml步骤(3)获得的EDC溶液，孵育30min。

(6)弃去步骤(5)获得的培养板中的混合液体，并用无菌去离子水冲洗3遍，干燥，封装，用于细胞培养。

实施例2涂覆有Matrigel的细胞培养板的制备

(2)量取50ml去离子水，将0.1g羟基琥珀酰亚胺（NHS）以及0.5g2-吗啉乙磺酸水合物（MES）加入其中，混合搅拌半小时以上，过滤灭菌，并保存在4℃中备用。

(3)称取5g碳化二亚胺（EDC）溶于95ml去离子水中，形成质量浓度为5%的EDC溶液，过滤灭菌备用。

(4)将清洗好的培养板放入等离子发生器中，抽真空至0.5Pa，通入氧气至100Pa，调整放电功率在100W，进行射频放电1min。

(5)在真空状态下将步骤(4)获得的培养板中，每孔加入步骤(2)配制的混合液3ml，10min后将然后将3ml的蛋白浓度为9mg/ml的Matrigel溶液（购自BD公司，货号：354234）加入其中，混合均匀孵育30min，再在每孔中加入2ml步骤(3)获得的EDC溶液加入培养板中，孵育30min。

实施例3涂覆有Matrigel的细胞培养板的制备

(1)将聚苯乙烯24孔细胞培养板在无水乙醇中浸泡40min，用去离子水冲洗，真空干燥，备用。

(2)量取50ml去离子水，将0.05g羟基琥珀酰亚胺（NHS）以及0.5g2-吗啉乙磺酸水合物（MES）加入其中，混合搅拌半小时以上，过滤灭菌，并保存在4℃中备用。

(3)称取3g碳化二亚胺（EDC）溶于97ml去离子水中，形成质量浓度为3%的EDC溶液，过滤灭菌备用。

(4)将清洗好的培养板放入等离子发生器中，抽真空至1Pa，通入氧气至200Pa，调整放电功率在10W，进行射频放电5min。

(5)在真空状态下将步骤(4)获得的培养板中，每孔加入步骤(2)配制的混合液0.5ml，10min后将2ml的蛋白浓度为9mg/ml的Matrigel溶液（按照实施例5的方法制备得到）加入其中，混合均匀孵育30min，再在每孔中加入0.2ml步骤(3)获得的EDC溶液加入其中，孵育30min。

实施例4涂覆有Matrigel的细胞培养板的制备

(4)将清洗好的培养板放入等离子发生器中，抽真空至0.5Pa，通入氧气至60Pa，调整放电功率在50W，进行射频放电10min。

(5)在真空状态下将步骤(4)获得的培养板中，每孔加入步骤(2)配制的混合液0.5ml，10min后将4ml的蛋白浓度为15mg/ml的Matrigel溶液（购自BD公司，货号：354234）加入其中，混合均匀孵育30min，再在每孔中加入0.2ml步骤(3)获得的EDC溶液加入培养板中，孵育30min。

实施例5Matrigel的制备

一、以一管EHS细胞样品为例（1.5ml）

1、材料准备：雌性C57BL/6小鼠，PBS，1ml（16G针头）

2、步骤：

1）冰上或4℃冰箱融化（选择4℃冰箱，温度可控）

2）麻醉小鼠：（通风橱内进行）将浸有饱和乙醚的纸巾至于大烧杯底部，放入小鼠。不要把乙醚直接洒到小鼠上。

3）每只小鼠注射0.5ml EHS细胞于于右后只外侧面。将针头远端插入主肌肉块，肉瘤应被注射进后肢肌肉内。

4）标记笼子，做好记录，清理实验用具及实验室。

5）3-4周后进行EHS传代。

二、EHS肉瘤传代与收集保存

（一）材料准备：

1.解剖用具-小剪刀，镊子（提前高压灭菌）

2.6ml/20-30ml注射器：16G针头

3.50ml离心管，烧杯，冰桶多个，干冰

4.PBS，70%乙醇，乙醚，4℃离心机，灭菌好的小烧杯

5.吸水纸，所料袋-保存肉瘤及处理小鼠用

（二）肉瘤传代的准备

注意事项

1.准备好大量的冰和预冷的PBS，操作时样品尽可能处于冰上

2.EHS肿瘤的传代的过程中一定要注意细菌感染

1）肿瘤区域内出现水状、发黄的区域和浓汁后丢弃

2）抗生素的运用

3）各个肿瘤在传代过程中分开操作

步骤：

1.干冰处死小鼠：小烧杯中加干冰，放入大烧杯：向干冰加几毫升水，将小鼠放入大烧杯中。

2.1L大烧杯中准备好70%乙醇，上盖保鲜膜，处死后的小鼠浸入其中，进行消毒可以防止把小鼠毛带到后面的实验中。

3.小心沿肉瘤周围剪破皮肤，掀开皮肤暴露肉瘤。

4.小剪刀和镊子小心将肉瘤取下，放入50ml离心管中，每只小鼠肉瘤单独存放，离心管上编号。

5各管中加入20-25ml预冷的PBS，震荡。

6将步骤5得到的混合物倒入20-30ml注射器中，随后分散肉瘤细胞

1）将混和物贴离心管内壁推压回50ml离心管中

2）将混合物再倒入注射器，并装上16G针头。

3）推压混合物回50ml离心管。

必要的话可重新操作一次

7加入PBS至总量为40ml，充分震荡分散组织。

8将离心管放入离心机，打开离心机，当转速上到1000rpm时立即断开

9倒掉上清，加入40ml PBS，充分震摇。

10重复步骤8

11每10ml混合物加入约1ml青链霉素并混合。注射前始终保持样品在冰上。可以加入5%DMSO冻存。

（三）收集肉瘤

注意事项

1.不要让肿瘤生长的太大，否则易发生坏死，组织坏死后Matrigel产量下降。

2.含有大量的血和黄色浓汁的肿瘤不能用。

3.一般情况下，大于4克的肿瘤容易坏死

步骤：

1.干冰处死小鼠-小烧杯中加干冰，放入大烧杯；向干冰加几毫升水，将小鼠放入大烧杯中

2.小鼠死亡后，将它们浸泡于70%乙醇内。

3.剪开皮肤，暴露肉瘤。

4.将肉瘤收于大烧杯中去除被摸，烧杯至于冰上。

5.所有肉瘤都被收集后，将之混合，立即制作Matrigel

制作M:100g肉瘤量

（一）材料准备：

1.50ml离心管，透析用的大烧杯：搅拌子：透析袋（预处理），大量的冰

2.溶液：3.4M NaCl溶液；2M urea缓冲液；Tris-saline；氯仿；1%高糖溶液

3.止血钳和剪刀提前高压灭菌

4.保存Matrigel的无菌容器

（二）注意事项

1.所有试剂、用品和仪器需要4℃预冷。整个制备过程中，组织至于冰上，低温处理。

2.Matrigel制备过程中应尽可能的快速，否则其活性降低，整个分离和透析要在4天内完成。

3.一旦分离出Matrigel，4℃保存，因为其一旦凝固，将不在液化

4.Matrigel的最终蛋白浓度不低于9mg/ml（9-15mg/ml）

5.Matrigel浓度过低时，可以运用硫酸铵沉淀的方法进行浓缩，然后透析。

（三）步骤：

1.（洗涤）肉瘤中加入3.4M NaCl溶液200ml，匀浆直至分散。

匀浆时间不能太长，以免温度过高使蛋白降解。

2.7000rpm4℃离心15min，弃粉红色上清。

3.重复步骤1、2两次。

4.肉瘤中加入2M urea缓冲液100ml混匀

5.4℃搅合过夜。

6.14000rpm4℃离心20min，保留上清于冰上。

7.加2M urea缓冲液50ml于肉瘤残余物中并混匀。

8.14000rpm4℃离心20min,保留上清于冰上。

9.混合步骤6和步骤8得到的上清，运用2L Tris透析，1L加5ml氯仿，消毒

10.透析4小时以上，在末端旋转袋子

11.单独加Tris不加氯仿处理2小时以上

12.重复步骤11

13.最后一次透析取消盐介质，换为：1%（w/w）高糖溶液

14.在超净台中，止血钳固定透析袋，用70%乙醇冲洗后，用剪刀将袋子剪开，将提取物转移到无菌容器中，必须是整块的，操作在冰上进行。

15.立即分装、冷却，-20℃保存一年

胶凝化作用：将提取物倾倒在所需容器中，复温30-120min铺薄层即可。

应用实施例1：本发明的细胞培养板在培养神经元细胞中的应用

（1）将神经元细胞以1×10⁴个/cm²密度种植在本发明的细胞培养板（按照实施例1方法制备），常规培养7天，隔天换液。

（2）当细胞铺满整个细胞培养板时，将其置于4℃，15min，加入少量的胰酶，离心收集细胞。

用本发明方法获得的细胞培养板能够促进神经元细胞的生长并形成突起。如图1所示，培养3天时，在Matrigel胶涂覆的细胞培养板上种植的神经元细胞，生长良好，表现出神经元特有的突起，而在普通培养板上生长的神经元则呈现球形，没有突起形成（如图2所示）。

应用实施例2：本发明的细胞培养板在培养前列腺癌细胞LNCaP中的应用

（1）将前列腺癌细胞LNCaP以1×10⁴个/cm²密度种植在本发明的细胞培养板上（按照实施例2方法制备），常规培养7天，隔天换液。

同时，按照以上相同的方法将前列腺癌细胞LNCaP以1×10⁴个/cm²密度种植在普通细胞生长板上作为对照组。显微镜下观察细胞生长情况，从显微镜观察结果可以看出在本发明的细胞培养板上表面生长4天时的前列腺癌细胞LNCaP表现出良好的生长状态，细胞贴壁牢固，细胞伸展充分，获得更稳定生长状态；而在普通细胞培养板上生长的前列腺癌细胞则出现成团，脱落现象，且生长缓慢。

应用实施例3：本发明的细胞培养板在培养神经细胞PC-12中的应用

（1）将神经细胞PC-12以1×10⁴个/cm²密度种植在本发明的细胞培养板（按照实施例3方法制备）上，常规培养7天，隔天换液。

（2）当细胞铺满整个细胞培养板时，将其置于4℃，15min，加入少量胰酶，离心收集细胞。

同时，按照以上相同的方法将神经细胞PC-12以1×10⁴个/cm²密度种植在普通细胞生长板上作为对照组。显微镜下观察细胞生长情况，从显微镜观察结果可以看出在本发明的细胞培养板表面上生长4天时的神经细胞PC-12表现出良好的生长状态，细胞贴壁牢固，细胞伸展充分，获得更稳定生长状态；而在普通细胞培养板上生长的神经细胞PC-12则出现成团，脱落现象，且生长缓慢。

Claims

1.一种涂覆有Matrigel的细胞培养板，其特征在于，在聚苯乙烯细胞培养板表面涂覆0.01-2mg/cm²的Matrigel，所述的细胞培养板按照以下方法制备得到：

(1)将聚苯乙烯细胞培养板在无水乙醇中浸泡40min，用去离子水冲洗，真空干燥，备用；

(4)将清洗好的培养板放入等离子发生器中，抽真空至0-1Pa，通入氧气至10-200Pa，调整放电功率在5-300W，进行射频放电0.5-10min；

2.一种制备权利要求1所述的涂覆有Matrigel的细胞培养板的方法，其特征在于包括以下过程：

3.权利要求1所述的涂覆有Matrigel的细胞培养板在细胞培养中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的细胞为原代细胞及少数贴壁困难，易成团，易脱落，生长缓慢的细胞。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的细胞为神经元、LNCaP或PC-12。