JP2009511061A - 膵臓表現型を有する細胞への非胚性幹細胞の分化 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国仮特許出願第60/726,750号(2005年10月14日出願)に対する優先権を主張する。この米国出願は、米国出願第11/084,256号(2005年3月21日出願)の一部継続出願であり、この出願は、米国出願第10/048,757号(現在発行されている米国特許第7,015,037号、2002年2月1日出願)の継続出願であり、この出願は、PCT/US00/21387(2000年8月4日出願、2001年2月15日にWO 01/11011として英語で公開)の米国国内段階の出願であり、この出願は、米国特許法第119条(e)の下で米国仮特許出願第60/147,324号(1999年8月5日出願)および同第60/164,650号(1999年11月10日出願)からの優先権を主張し、そしてこの出願は、米国特許出願第10/467,963号(2003年8月11日出願)の一部継続出願であり、この出願は、PCT/US02/04652(2002年2月14日出願、2002年8月22日にWO 02/064748として英語で公開)の米国国内段階の出願であり、この出願は、米国特許法第119条(e)の下で米国仮特許出願第60/268,786号(2001年2月14日出願);同第60/269,062号(2001年2月15日出願);同第60/310,625号(2001年8月7日出願)および同第60/343,836号(2001年10月25日出願)からの優先権を主張し、これらの出願、特許および公報の内容は、本明細書中でその全体が参考として援用される。
本発明は、the National Institutes of Healthからの米国助成金番号U19 DK61244の下で政府支援の補助によって行われた。米国政府は、本発明に対して一定の権利を有し得る。
本発明は非胚性多能性幹細胞の分野に関し、具体的には膵臓細胞を提供するための非胚性多能性幹細胞の使用、及びそれらを産生及び使用する方法に関する。
膵臓
膵臓は腹腔の左上の後ろにある横長で先細りの器管である。これは解剖学的には、膵頭部(十二指腸の近くの広い側)、膵体部、及び膵尾部(脾臓の近く先細りの側)の3つの主要部分から構成されているものとして説明されてきた。この器管には2つの主要な組織が存在する。1つが、腺房細胞と腺管細胞の両方からなる外分泌組織であり、もう1つが、血流に送達されるホルモン(即ち、インスリン)を産生する細胞を含有する内分泌組織である。膵臓の質量の約95%を占める外分泌膵臓は、消化酵素(即ち、アミラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、トリプシン、キモトリプシン、アミノペプチダーゼ、エラスターゼ及びその他の種々のタンパク質)を産生する錐体状の分泌細胞の群を含有する腺房(acini(腺房)と呼ばれる)である。これらの酵素は、同様に消化のための重炭酸塩も産生する立方腺管細胞から構築される管によって消化器系に送達される。分泌腺房と腺管の間には、腺房中心細胞と呼ばれる連結細胞成分がある。
内胚葉の指定、前腸及び中腸内胚葉の指定、並びにその後の膵臓の指定は、転写因子の補体によって調節される(図1)。具体的には、マウスにおける最初の内胚葉の指定は、Sox17(Kanai−Azuma,M.,et al.,2002)並びにGata−5及びGata−6(Weber,H.,et al.,2000;Bossard,P.,and Zaret,K.S.1998)及びMixer/Mix.3(Henry,G.L.,and Melton,D.A.1998)の発現を伴う。その後、幹細胞核因子であるHnf3β/Foxa2が、予定前腸及び後腸内胚葉の発達に必要とされる(Ang,S.L.,et al.,1993)。その他の転写因子は、前腸及び後腸内胚葉が肝臓、甲状腺、肺、胃、十二指腸及び膵臓の内胚葉に分化するのに関与する。
発達中に、内胚葉は、TGFβ及びWntファミリーのメンバーを含む因子の組み合わせにより指定を受ける。Wnt3は原始線条及び発達中の中胚葉に発現し、Wnt3欠失マウスは中胚葉も内胚葉も形成しない(Liu,P.,et al.,1999)。結節が外胚葉、及び原始線条の前領域に発現し(Zhou,X.,et al.,1993)、Wnt3欠失胚のように、結節が欠失している胚も、中胚葉及び内胚葉が発達しない。ツメガエルの外植体検定では、TGFファミリーの別のメンバーであるアクチビン−Aが、用量依存的に中胚葉及び内胚葉の両方の指定を誘導し、アクチビン−Aが高濃度であれば背側中胚葉及び内胚葉が、低濃度であれば腹側中胚葉が誘導されることが明らかにされている(McDowell,N.,et al.,1997)。
糖尿病は、変動するものの持続する高い血糖値(高血糖症)を特徴とする疾患である。糖尿病は先進国及び発展途上国の両方で流行伝染病のような罹患率に達する重篤で破壊的な疾病である。1985年には、世界中で約3000万人が糖尿病に罹患しており、1995年にはその数が1億3500万人にまで増加し、2050年には更に50%近くの増加が予想されている。糖尿病は米国において5番目に多い死因となっている。American Diabetes Associationによれば、2002年の米国における糖尿病による経済的費用は1兆3200億ドルにのぼり、その内920億ドルが直接費となっている。この数字は、2020年までに1億9000億ドルを超えると予想されている。
胚性幹細胞(ES細胞)は、無制限に自己再生し、全ての組織に分化することができる。ES細胞は、着床後胚の胎盤胞又は原始生殖細胞の内部細胞塊に由来する(胚性生殖細胞又はEG細胞)。ES(及びEG)細胞は、SSEA1(マウス)及びSSEA4(ヒト)に対する抗体による陽性染色により同定することができる。分子レベルでは、ES及びEG細胞は、これらの未分化細胞に特異的な多数の転写因子を発現する。これには、Oct−4及びrex−1が含まれる。Rexの発現はOct−4に依存する。又、LIF−R(マウス)及び転写因子sox−2及びrox−1も認められる。Rox−1及びsox−2も非ES細胞で発現する。ES細胞の別の特徴は、これらの細胞にin vitroで無制限に自己再生する能力を提供するテロメラーゼの存在である。
Heller,R.S.,et al.,Dev.Dyn.2002,225:260−270 Hardikar,A.A.,et al.,Rroc Natl Acad Sci U.S.A.2003;100:7117−7122 Reyes,M.およびC.M.Verfaillie,Ann N Y Acad Sci.2001;938:231−235
一実施形態は、外胚葉、中胚葉及び内胚葉細胞型の少なくとも2つに分化することができる非胚性幹、非生殖、非胚性生殖細胞由来のインスリン発現細胞及びその前駆細胞を提供するための組成物及び方法を提供する。例えば、外胚葉、中胚葉及び内胚葉細胞型の少なくとも2つに分化することができる非胚性幹、非生殖、非胚性生殖細胞を、アクチビン−A及びSHH阻害剤に曝露すると、Pdx−1の発現が亢進した細胞が産生される。Pdx−1の発現が亢進したこれらの細胞を、EGF又はHGF(又は両方)に曝露すると、Ngn3の発現が亢進した細胞が産生される。Ngn3の発現が亢進したこれらの細胞を、ニコチンアミド又はエキセンディン(エキセンディン)又は両方に曝露すると、インスリンの発現が亢進した細胞が産生される。従って、本発明は以下の組成物及び方法を対象とする。
定義
本明細書で使用される以下の用語は、以下の意味によって定義される。
MAPCは、外胚葉、内胚葉及び中胚葉細胞型に分化することができる、非胚性幹細胞(非ES)、非生殖細胞及び非胚性生殖細胞(非EG)である。MAPCはテロメラーゼ陽性であってよい。又、Oct−3A(Oct−3/4)に対しても陽性であってよい。MAPCはin vivoで分化して、β細胞等の膵臓細胞を形成することができる。或いは、MAPCはex vivoで膵臓表現型の子孫細胞に分化することができる。MAPC又はその分化した子孫細胞は対象に投与することができる。
ヒト及びマウスのMAPCの単離方法は米国特許第7,015,037号(第PCT/US00/21387号(第WO 01/11011号として公表))に、ラットについては米国特許出願第10/467,963号(第PCT/US02/04652(第WO 02/064748号として公表))に記載があり、これらの方法並びにその中で開示されるMAPCの同定法は、本明細書で援用されている。
骨髄単核球を、当業者が使用可能な標準的な手段で得られた骨髄穿刺液から単離した(例えば、Muschler,G.F.,et al.,1997;Batinic,D.,et al.,1990を参照)。多能性成体幹細胞は骨髄(又は肝臓や脳等の他の臓器)内に存在するが、共通の白血球抗原CD45又は赤芽球特異的グリコフォリン−A(Gly−A)を発現しない。この細胞の混合集団にFicoll Hypaque分離法を適用する。その後、細胞を抗CD45及び抗Gly−A抗体を使用した陰性選択にかけ、CD45陽性及びGly−A陽性細胞集団を除去し、残りの約0.1%の骨髄単核球を回収した。細胞はフィブロネクチンでコーティングしたウェルに平板培養して、下記の要領で2〜4週間培養して、CD45陽性及びGly−A陽性細胞集団を除去することもできる。
FACSにより約22〜25回の細胞分裂後に得られたヒトMAPCの免疫表現型の解析を実施したところ、細胞はCD31、CD34、CD36、CD38、CD45、CD50、CD62E及びP、HLA−DR、Muc18、STRO−1、cKit、Tie/Tekを発現せず、CD44、HLA−1型及びβ2マイクログロブリンを低レベルで発現し、CD10、CD13、CD49b、CD49e、CDw90、Flk1を発現する(N>10)ことが示された。
A.MAPCは、CD31、CD36、CD62E、CD62P、CD44−H、cKit、Tie;IL1、IL3、IL6、IL11、G CSF、GM−CSF、Epo、Flt3−L又はCNTFの受容体のmRNAを発現せず、HLA1型、CD44−E及びMuc−18のmRNAを低レベルで発現した。
B.MAPCは、サイトカインであるBMP1、BMP5、VEGF、HGF、KGF、MCP1;サイトカイン受容体であるFlk1、EGF−R、PDGF−R1α、gp130、LIF−R、アクチビン−R1及びR2、TGFR−2、BMP−R1A;接着受容体であるCD49c、CD49d、CD29及びCD10のmRNAを発現した。
C.MAPCは、hTRT及びTRF1;POUドメイン転写因子Oct−4、sox−2(ES/ECの未分化状態を維持する上でOct−4と共に必要とされる;Uwanogho D.1995)、sox−11(神経発生)、sox−9(軟骨形成)(Lefebvre V.1998);ホメオドメイン転写因子であるHoxa4及びa5(頚部及び胸部骨格の指定;気道の臓器形成)(Packer,A.I.2000)、Hox−a9(骨髄造血)(Lawrence,H.1997)、Dlx4(前脳及び頭部周辺構造の指定)(Akimenko,M.A.1994)、MSX1(胚中胚葉、成体心及び筋肉、軟骨−骨の形成)(Foerst−Potts,L.1997)、PDX1(膵臓)(Offield,M.F.1996)のmRNAを発現した。
D.Oct−4、LIF−R及びhTRTのmRNAの存在が、RT−PCRによって確認された。
E.更に、RT−PCRにより、Rex−1のmRNA及びRox−1のmRNAがMAPCで発現することが明らかになった。
本明細書に記載の通り単離したMAPCは、本明細書で援用する米国特許第7,015,037号に記載の方法を使用して培養することができる。
MAPC及びMAPCから分化した膵臓前駆細胞は、膵臓細胞の供給源として有用である。アクチビン−A(又はTGFβファミリーの他のメンバー)、BMP4(又はBMPファミリーの他のメンバー)、sonic hedgehog活性を阻害する物質(シクロパミン及び抗SHH抗体を含むがこれらに限定されない)、EGF又はHGF(又はその他の細胞分裂誘起タンパク質)、ニコチンアミド(及び場合によりニコチン酸)、エキセンディン(エキセンディン4及びexenatide(エキセンディン−4に極めて似た39個のアミノ酸ペプチド)を含めたがこれらに限定されない)、GDF11(又は骨形態形成タンパク質/トランスフォーミング成長因子β(BMP/TGFβ)スーパーファミリーの他のメンバー)、ベータセルリンを含むがこれらに限定されない適切な因子又は幹細胞の再生、拘束及び分化において役割を果たす因子を分泌する間質細胞又はその他の細胞と共にMAPCを培養することによって、MAPCの成熟、増殖及び分化を行うことができる。
MAPCの培養密度は、約100個/cm2又は約150個/cm2〜約10,000個/cm2、例えば約200個/cm2〜約1500個/cm2又は約2,000個/cm2であってよい。この密度は種によって異なる。又、至適な密度は、培養条件及び細胞の供給源によって極めて異なる。任意の培養条件及び細胞での至適密度を決定することは当業者の技術の範囲内である。
本発明の膵臓前駆細胞又はβ細胞及び/又はMAPCを使用して、損傷部位への直接的な導入又は全身投与の何れかにより、細胞を損傷部位にホーミングさせて膵臓を再構築(repopulate)することができる。従って、本発明は、対象に本発明の膵臓前駆細胞又はMAPCの有効量を投与することを含む、膵臓細胞を必要とする対象の処置方法を提供する。
MAPC又はそこから分化した子孫細胞は、局所注射、カテーテル投与、全身投与、腹腔内注射、非経口投与、動脈内注射、静脈内注射、経血管投与、筋肉内注射、手術による所定の組織への外科的注射(例えば、膵臓への注射)又は組織表面への直接的な塗布(例えば、手術中又は創傷上)を含めたがこれらに限定されない当業界で使用可能な種々の方法で対象に投与することができる。
幾つかの実施形態において、移植細胞に対する宿主の免疫反応を刺激するリスクを抑制するため、移植/投与前にMPAC(又は分化した子孫細胞)を処理するか、別の方法で変化させることが望ましい。宿主の免疫反応を刺激するリスクを抑制する当該技術分野で既知のあらゆる方法を使用することができる。以下に幾つかの例を示す。
MAPCを遺伝子操作して万能ドナー細胞とすることができる。未分化状態のMAPCはMHC−I又はII抗原を発現しないが、幾つかの分化した子孫細胞はこれらの抗原の一方又は両方を発現することがある。MAPCを改変して、MHC−I又はMHC−II抗原を除去し、場合によっては予定レシピエントからMHC−抗原を導入して、細胞がNKが媒介するKilling活性の容易な標的にならないようにするか、無制限のウイルス複製又は悪性転化を起こしやすくならないようにすることにより、万能ドナー細胞とすることができる。MHC−抗原の除去は、例えば相同組換え又はプロモーター領域での点変異の導入又は抗原の最初のエクソンに点変異を導入することによるキメラプラスト等の終止コドンの導入によって達成することができる。宿主MHC−抗原の移入は、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ関連ウイルス又はその他のウイルスによる形質導入又は標的細胞をMHC−抗原cDNAでトランスフェクションすることにより達成可能である。
MAPCを使用して遺伝的異常を修正するか、免疫系の発達前の宿主によって忍容される細胞を導入する子宮内移植を行うことができる。これにより大量のヒト細胞を動物中で作製するか、正しいタンパク質又は酵素を作製する細胞を移植することによってヒト胚の遺伝的異常を修正することができる。
移植片対宿主反応のリスクをもたらさない免疫系を再構築できる幹細胞を使用することにより、利益が得られる。移植片対宿主反応は、骨髄移植片に内在する汚染T細胞に起因する。骨髄由来の造血幹細胞の精製は日常的に行われているが、患者におけるその生着にはアクセサリーT細胞の付随が必要である。このため、T細胞の生着による利益と、移植片対宿主反応による悪影響の間で決定的な均衡を保つ必要がある。
NK細胞を細胞集団から除去する等といったNK細胞の機能を阻害する物質等のあらゆる手段も、免疫拒絶反応を予防し、生着を促進し、免疫耐性を促進するために投与することができる。このような物質には、抗NK細胞抗体、照射又はNK細胞機能を阻害するあらゆる他の方法が含まれる。NK機能の阻害は、in vivoにおける幹細胞の持続性を介助するためのNK細胞の阻害方法の教示に関して、本明細書で援用するPCT出願第PCT/US2005/015740号(出願日2005年5月5日)に更に記載がある。
MAPCは身体から抽出及び単離して、未分化状態で培養物で増殖するか、培養物で分化を誘導し、一般的には種々の技術、特にウイルスの形質導入により遺伝学的に変化させることができる。遺伝材料の取り込み及び発現は証明することができ、外来DNAの発現は発達期間を通じて安定である。外来DNAを幹細胞に挿入するためのレトロウイルス及びその他のベクターは、当業者は使用可能である(Mochizuki,H.,et al.,1998;Robbins,P.,et al.,1997;Bierhuizen,M.,et al.,1997;Douglas,J.,et al.,1999;Zhang,G.,et al.,1996)。レトロウイルスベクターを使用して形質導入を行うと、増強された緑色蛍光タンパク質(eGFP)の発現は最終分化した筋細胞、内皮細胞及び単離MAPCに由来するc−Kit陽性細胞でも持続し、MAPCに導入されたレトロウイルスベクターの発現が分化期間にわたって持続することを示した。前もってレトロウイルスベクターを形質導入し、初期のMAPC培養期間の数週間で選別した約10個のeGFP陽性細胞から開始した培養物から最終分化を誘導した。
移植後、投与したMAPC又は子孫細胞の増殖又は分化又はMAPC又は子孫細胞の治療効果をモニターすることができる。例えば、血液、糖、血糖及び/又は血中インスリンをモニターすることができる。
MAPC又はそこから分化した子孫細胞はex vivoで遺伝的に変化させ、遺伝子治療で最も重大な障壁の一つを除去することができる。例えば、対象の骨髄穿刺液を入手し、その穿刺液からMAPCを単離する。その後、MAPCを遺伝的に変化させ、1つ以上の所望の遺伝子産物を発現させる(例えば、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン又は膵臓が産生する消化酵素をコードする種々の遺伝子の何れかを含むがこれらに限定されない膵臓遺伝子)。その後、MAPCをex vivoでスクリーニング又は選択して、変化が成功した細胞を同定し、局所投与又は全身投与の何れかで、これらの細胞を対象に導入するか、分化させてから対象に導入することができる。或いは、MAPCを分化させてから、その分化細胞を遺伝的に変化させて投与することができる。何れの場合も、細胞は、所望の遺伝子産物を発現することのできる安定にトランスフェクトされた細胞の供給源を提供する。特に、患者自身の組織、例えば骨髄はMAPCの供給源であり、この方法は移植用の細胞を産生する免疫学的に安定した方法を提供する。
本明細書に記載の方法によって単離された細胞又はその分化した子孫細胞は、当業者が使用可能な種々の方法を使用して、DNA又はRNAを細胞に導入することにより遺伝的に改変することができる。これらの方法は一般的に4つに大別される。(1)例えばレンチウイルス(Mochizuki,H.,et al.,1998;Martin,F.,et al.,1999;Robbins,et al.,1997;Salmons,B.and Gunzburg,W.H.,1993;Sutton,R.,et al.,1998;Kafri,T.,et al.,1999;Dull,T.,et al.,1998)、シミアンウイルス40(SV40)、アデノウイルス(例えば、Davidson,B.L.,et al.,1993;Wagner,E.,et al.,1992;Wold,W.,Adenovirus Methods and Protocols,Humana Methods in Molecular Medicine (1998),Blackwell Science,Ltd.;Molin,M.,et al.,1998;Douglas,J.,et al.,1999;Hofmann,C.,et al.,1999;Schwarzenberger,P.,et al.,1997を参照)、Sindbisウイルスを含めた、アルファウイルス(米国特許第5,843,723号;Xiong,C.,et al.,1989;Bredenbeek,P.J.,et al.,1993;Frolov,I.,et al.,1996)、ヘルペスウイルス(Laquerre,S.,et al.,1998)及びウシパピローマウイルスを含めたレトロウイルス等のDNA又はRNAウイルスベクター;(2)リン酸カルシウムトランスフェクション及びDEAEデキストラントランスフェクション法を含めた化学的移入;(3)リポソーム(Loeffler,J.and Behr,J.,1993)、赤血球ゴースト及び原形質等のDNA負荷膜小胞体を使用した膜融合による移入;及び(4)マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイル J.Wolff in “Gene Therapeutics” (1994) at page 195(J.Wolff in “Gene Therapeutics” (1994) at page 194;Johnston,S.A.,et al.,1993;Williams,R.S.,et al.,1991;Yang,N.S.,et al.,1990を参照)、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション又は直接の「裸」DNAの移入等の物理的移入技術である。
細胞膜を自由且つ迅速に通過することのできる小さなカチオン性ペプチドドメインであるタンパク質形質導入ドメイン(PTD)に結合している場合、そのタンパク質は細胞へ直接移入することができる。ポリ−アルギニン(ポリ−アルギニン介在性タンパク質形質導入)及びHIV由来Tat等の幾つかのPTDが同定されてきており、融合タンパク質が効率よく細胞膜を通過できるようになった。タンパク質の形質導入の明白な利点とは、形質導入されたタンパク質が細胞内に一過性にしか存在しないという、発現したタンパク質の内因性代謝回転に左右されるという特性を有することである。又、形質導入されたタンパク質の細胞内濃度は、添加するタンパク質の量を変化させることによって制御することができる。
MAPC並びにインスリン1陽性細胞から中間前駆細胞を同定するには、トランスジェニックマウス由来のMAPC細胞系を、Pdx−1、Ngn3、Pax4等の膵臓プロモーター及びインスリンプロモーターの制御下で、蛍光色素等のマーカーを発現するように操作することができ、種々の交雑を産生することができる(例えばPDX1−GFP、Ngn3−YFP、Pax4−RFP及びMIP−GFPを有するマウス並びにNkx6.1−GFP及びPDX−1×Ngn3マウスの骨髄(BM)からMAPCを単離することができる)。クローン集団を単離し、その多能性、表現型、細胞遺伝及びβ細胞様細胞への分化(経時的によるPdx1、Ngn3、NeuroD1、Pax4、Nkx6.1及びインスリンの発現を評価)に関して試験することができる。これらの細胞株により、分化プロセスを追跡し、分化培養物から中間前駆細胞を選択することができる。
MAPCからβ細胞へのin vivoでの分化
Jiang,Y.,et al.(2002)が記載している通り、マウスMAPC細胞系を、eGFPトランスジェニックC57B1/6 Thy1.1マウス骨髄から樹立した。ヒトフィブロネクチン(Sigma)10ng/cm2をコーティングした皿(Nunc)に、約5%二酸化酸素及び約5%酸素下で、60% DMEM−LG (Gibco BRL),40% MCDB−201 (Sigma)に1x SITE (Sigma)、1xレノレイン酸ウシ血清アルブミン(LA−BSA)(Sigma)、0.1mM アスコルビン酸2−リン酸塩(Sigma)、1x Chemically Defined Lipid Concentrate (Gibco)、0.05μM デキサメタゾン、0.1mM β−メルカプトエタノール(Sigma)、100U ペニシリン(Gibco)、1000U ストレプトマイシン(Gibco)、1000U/mL LIF (Chemicon)、10ng/mL mEGF (Sigma)、10ng/mL hPDGF−BB (R&D systems)、2%ウシ胎児血清 (FCS)(Hyclone Laboratories)を入れ、そこでMAPCを培養した。平板培養した細胞密度は約100個/cm2で、細胞は2日毎に分割した。
げっ歯類MAPCのβ細胞前駆体及びβ細胞へのin vitroにおける分化
内分泌膵臓系統へのMAPCの拘束
低酸素、高Oct−4(図2;一実施形態において、高Oct−4はラット胚性幹細胞又は万能mRNA(universal mRNA)で認められるそれの約5〜25%であり、低Oct−4は一般的に約4桁少ない)を発現するマウスMAPC及びラットMAPC(本明細書に記載の通り単離し培養)を使用して、内胚葉→膵臓→内分泌膵臓→β細胞拘束及び分化において役割を果たすことが既知である転写因子は、インスリン1mRNAを発現する最終分化細胞集団を回収できる正しい配列において活性化することができることが明らかになった。例えば、MAPCを誘導してβ細胞の転写プログラムを発現させ、転写因子(TF)Hnf3β、Hnf6、Pdx−1、Ngn3、NeuroD1、Pax4、Nkx61並びにインスリン−1、インスリン−2、グルカゴン及びソマトスタチンmRNA、アクチビン−A及びBMP4 d0−9と培養する場合は、抗SHH d3−d9、EGF d9−15;ニコチンアミド(又はエキセンディン 4)、βセルリン及びGDF11 d15−21を連続的に発現した。
サイトカインが介在する分化が、内胚葉、前腸、膵臓及び内分泌膵臓の指定及び分化において役割を果たすことが既知である種々のサイトカイン又は細胞外マトリックス(ECM)構成要素の作用を多因子解析することによって達成された。Q−RT−PCRを使用して、未分化のラットMAPCが著明なレベルのPdx−1、Ngn3、NeuroD1、Nkx6.1、Ins−1及びIns−2(35周期未満)の転写産物を発現せず、低レベルのHng1、Hnf3β(30〜35周期)の転写産物を発現し、検出可能なレベルのNkx2.2及びGlut2(30周期未満)の転写産物を発現することを明らかにした。
近年の発表により、ES細胞(Miyazaki,et al.,2004)又は成体組織(腸類上皮細胞;Yoshida,et al.,2002)における外来の膵臓系統転写因子Pdx−1の発現又は、ES細胞(Dominguez−Bendala,et al.,2005)又は成体組織(膵管細胞;Heremans,et al.,2002)における外来の二次転写因子ニューロゲニン−3の発現は、これらの細胞でインスリンを上方調節することができることが明らかにされている。
内分泌膵臓に分化したMAPCによるCペプチドの分泌
このデータは、連続的なサイトカイン添加及びPdx−1及びNgn−3のアデノウイルスベクターによる形質導入を行い産生された細胞が、20mMのグルコースに反応してCペプチドを分泌することを示している。1fmolのC−ペプチドが0.003325ngのCペプチドを含有すると仮定すれば、約150.97fmolのCペプチド/ウェル(0.6mLの培地/ウェル)が検出された。このため、これらの試験は、Ins1 mRNA及びPdx1 mRNAを発現させるように誘導したMAPCが、グルコースに反応してインスリンを分泌するという機能的β細胞の顕著な特性を有することを示している。
高グルコースの影響下でのMAPC子孫細胞によるインスリン産生量を測定した。インスリン1mRNAを高レベルで発現した試料は、20mMグルコースの影響下で培地にてインスリンを分泌し、MAPCが内分泌膵臓の特性を有する細胞に分化できることを更に示した。
膵臓β細胞は、糖レベルの上昇に反応してインスリンを分泌する。β細胞は、この機能に役立つ糖トランスポーター、ATP感受性カリウムチャネル及び電圧活性化(L型)カルシウムチャネルを備える。画像化及び全細胞パッチクランプ試験を使用して、幹細胞由来の膵臓β様細胞が、細胞外の糖の上昇(3〜30mM)に反応するため同様のものを備えているかどうかを決定することができる。
MAPCからin vitroで分化したβ細胞が成体マウスから単離したβ細胞と機能的に等価であるという証拠が、SZOで処理したヌードマウスの腎臓被膜下に移植した細胞から得られた。ストレプトゾトシン(200〜240mg/kg)を尾静脈を介して単回静脈内注射することにより、マウスを糖尿病状態にした。糖尿病は2日間連続血糖値が>400mg/dLであることにより確認した。レシピエントマウスに0.015mL/gのアベルチンを使用して麻酔をかけた。左腎又は右腎を側腹部切開から曝露し、腎臓の上極で腎臓切開を行い、腎臓実質から微細なガラスのプローブを使用して腎臓の下方の前外側へと腎臓被膜を分離することによってパウチを作製し、MAPC由来細胞を緩徐にこのパウチの中に入れた。細胞を全く入れなかったマウスを陰性対照とし、300個の成体島細胞を移植したマウスを陽性対照とした(高血糖症が1日以内に回復)。
Claims (55)
- 外胚葉、中胚葉及び内胚葉細胞型の少なくとも2つに分化することができる非胚性幹、非生殖、非胚性生殖細胞を、アクチビンAである第一の物質、及びsonic hedgehog(SHH)の活性を阻害する第二の物質と接触させて、Pdx−1の発現が亢進した細胞を産生することを含む、方法。
- 前記非胚性幹、非生殖、非胚性生殖細胞をBMP4と接触させることを更に含む、請求項1に記載の方法。
- Pdx−1の発現が亢進した前記細胞をEGF又はHGFと接触させて、Ngn3の発現が亢進した細胞を産生することを更に含む、請求項1又は2に記載の方法。
- Ngn3の発現が亢進した前記細胞で、NeuroDの発現も亢進している、請求項3に記載の方法。
- Ngn3の発現が亢進した前記細胞をニコチンアミド又はエキセンディン4の一方又は両方と接触させて、インスリンを発現する細胞を産生することを更に含む、請求項3又は4に記載の方法。
- インスリンの前記発現が、Ngn3を発現する前記細胞によって発現される量よりも亢進される、請求項5に記載の方法。
- Ngn3の発現が亢進した前記細胞をGDF11又はベータセルリンの一方又は両方と接触させることを更に含む、請求項5又は6に記載の方法。
- 外胚葉、中胚葉及び内胚葉細胞型の少なくとも2つに分化することができる非胚性幹、非生殖、非胚性生殖細胞を分化させる方法であって、
a)該非胚性幹、非生殖かつ非胚性生殖細胞を、アクチビンAである第一の物質と接触させ;
b)手順a)で得られた該細胞を、アクチビンAと、並びにsonic hedgehog活性を阻害する第二の物質と接触させ;
c)手順b)で得られた該細胞をEGF又はHGFと接触させ;
d)手順c)で得られた該細胞をニコチンアミド又はエキセンディン4の一方又は両方と接触させて、
インスリンを発現する細胞を産生する、方法。 - 手順a)、手順b)又はそれらの両方が、前記細胞をBMP4と接触させることを含む、請求項8に記載の方法。
- 手順d)が、前記細胞をGDF11又はベータセルリンの一方又は両方と接触させることを更に含む、請求項8又は9に記載の方法。
- 前記第二の物質がシクロパミン又は抗SHH抗体である、請求項1又は8に記載の方法。
- インスリンを発現する又はインスリンの発現が亢進した前記細胞が、インスリン、c−ペプチド又はそれらの組み合わせを分泌する、請求項5又は6に記載の方法。
- 前記インスリンがインスリン−1である、請求項12に記載の方法。
- 前記非胚性幹、非生殖、非胚性生殖細胞が哺乳動物細胞である、請求項1〜13の何れか1項に記載の方法。
- 前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項14に記載の方法。
- 前記非胚性幹、非生殖、非胚性生殖細胞に膵臓転写因子を形質導入する、請求項1〜15の何れか1項に記載の方法。
- 前記膵臓転写因子がNgn3、NeuroD1、Pdx−1、Pax4、Ptfla/p48、Pax6、Nkx6.1、Nkx2.2又はそれらの組み合わせを含む、請求項16に記載の方法。
- 前記膵臓転写因子がPdx−1、Ngn3又はそれらの組み合わせを含む、請求項16に記載の方法。
- 前記接触がin vitroで行われる、請求項1〜18の何れか1項に記載の方法。
- アクチビン−Aである第一の物質、及びsonic hedgehogを阻害する第二の物質、並びに外胚葉、中胚葉及び内胚葉細胞型の少なくとも2つに分化することができる非胚性幹、非生殖、非胚性生殖細胞を含む、組成物。
- 更にBMP4を含む、請求項20に記載の組成物。
- EGF又はHGF、及び請求項1に記載の方法により調製されるPdx−1の発現が亢進した前記細胞を含む、組成物。
- ニコチンアミド又はエキセンディン4の一方又は両方、及び請求項3に記載の方法により調製されるNgn3の発現が亢進した前記細胞を含む、組成物。
- 更にGFD11又はベータセルリンの一方又は両方を含む、請求項23に記載の組成物。
- 更に細胞培地又は薬学的に許容される担体を含む、請求項20〜24の何れか1項に記載の組成物。
- 前記第二の物質がシクロパミン又は抗SHH抗体である、請求項20に記載の組成物。
- 請求項1又は3に記載の方法により調製される細胞及び細胞培地又は薬学的に許容される担体を含む、組成物。
- 請求項5又は6に記載の方法により調製されるインスリンを発現する又はインスリンの発現が亢進した前記細胞、及び細胞培地又は薬学的に許容される担体を含む、組成物。
- 組成物を調製する方法であって、アクチビン−Aである第一の物質、及びsonic hedgehogを阻害する第二の物質を、外胚葉、中胚葉及び内胚葉細胞型の少なくとも2つに分化することができる非胚性幹、非生殖、非胚性生殖細胞と結合させることを含む、方法。
- BMP4を結合させることを更に含む、請求項29に記載の方法。
- 組成物を調製する方法であって、EGF又はHGFを、請求項1に記載の方法により調製されるPdx−1の発現が亢進した前記細胞と結合させることを含む、方法。
- 組成物を調製する方法であって、ニコチンアミド又はエキセンディン4の一方又は両方を、請求項3に記載の方法により調製されるNgn3の発現が亢進した前記細胞と結合させることを含む、方法。
- GFD11又はベータセルリンの一方又は両方を結合させることを更に含む、請求項32に記載の方法。
- 細胞培地又は薬学的に許容される担体を結合させることを更に含む、請求項29〜33の何れか1項に記載の方法。
- 組成物を調製する方法であって、請求項5、6又は8に記載の方法により調製されるインスリンを発現する又はインスリンの発現が亢進した前記細胞を、細胞培地又は薬学的に許容される担体と結合させることを含む、方法。
- 前記第二の物質がシクロパミン又は抗SHH抗体である、請求項29に記載の方法。
- 処置を必要とする対象に膵臓細胞を提供する方法であって、
a)外胚葉、中胚葉及び内胚葉細胞型の少なくとも2つに分化することができる非胚性幹、非生殖、非胚性生殖細胞を、アクチビンAである第一の物質と、並びにsonic hedgehog(SHH)の活性を阻害する第二の物質と接触させて、Pdx−1の発現が亢進した細胞を産生し;
b)Pdx−1の発現が亢進した該細胞を投与して、膵臓細胞を該対象に提供する、
ことを含む、方法。 - 前記非胚性幹、非生殖、非胚性生殖細胞をBMP4と接触させることを更に含む、請求項37に記載の方法。
- 前記対象に投与する前に、Pdx−1の発現が亢進した前記細胞を、EGF又はHGFと接触させて、Ngn3の発現が亢進した細胞を産生することを含む、請求項37又は38に記載の方法。
- 前記対象に投与する前に、Ngn3の発現が亢進した前記細胞を、ニコチンアミド又はエキセンディン4の一方又は両方と接触させて、インスリンを発現する又はインスリンの発現が亢進した細胞を産生することを更に含む、請求項39に記載の方法。
- Ngn3の発現が亢進した前記細胞をGFD11又はベータセルリンの一方又は両方と接触させることを更に含む、請求項40に記載の方法。
- インスリンを発現する細胞を処置を必要とする対象に提供する方法であって、
a)外胚葉、中胚葉及び内胚葉細胞型の少なくとも2つに分化することができる非胚性幹、非生殖、非胚性生殖細胞を、アクチビンAである第一の物質と接触させ;
b)手順a)で得られた細胞を、アクチビンAと、並びにsonic hedgehog活性を阻害する第二の物質と接触させ;
c)手順b)で得られた細胞をEGF又はHGFと接触させ;
d)手順c)で得られた細胞をニコチンアミド又はエキセンディン4の一方又は両方と接触させて、インスリンを発現する又はインスリンの発現が亢進した細胞を産生し;
e)インスリンを発現する又はインスリンの発現が亢進した該細胞を該対象に投与する、
ことを含む、方法。 - 手順a)、手順b)又はそれらの両方が更にBMP4を含む、請求項42に記載の方法。
- 手順d)がGDF11又はベータセルリンの一方又は両方を更に含む、請求項42又は43に記載の方法。
- 前記対象が哺乳動物である、請求項37〜44の何れか1項に記載の方法。
- 前記哺乳動物がヒトである、請求項45に記載の方法。
- 前記対象が膵臓障害又は膵臓損傷を有する、請求項37〜46の何れか1項に記載の方法。
- 前記障害が、糖尿病、肥満、膵管閉鎖、膵炎、α1アンチトリプシン欠失症、遺伝性膵炎、膵臓癌、膵酵素欠失症又は高インスリン症を含む、請求項47に記載の方法。
- 前記糖尿病がI型又はII型糖尿病である、請求項48に記載の方法。
- 前記損傷が肉体的外傷、化学薬品、放射線、加齢、疾患又はそれらの組み合わせにより生じる、請求項47に記載の方法。
- 前記膵臓障害又は膵臓損傷を処置する医薬品を調製するための、請求項1〜17の何れか1項に記載の方法により調製される細胞の使用。
- 膵臓障害が、糖尿病、肥満、膵管閉鎖、膵炎、α1アンチトリプシン欠失症、遺伝性膵炎、膵臓癌、膵酵素欠失症又は高インスリン症を含む、請求項51に記載の使用。
- 前記糖尿病がI型又はII型糖尿病である、請求項52に記載の使用。
- 前記損傷が肉体的外傷、化学薬品、放射線、加齢、疾患又はそれらの組み合わせにより生じる、請求項51に記載の使用。
- 前記医薬品が更に生理学的に許容される担体を含む、請求項51〜54の何れか1項
に記載の使用。
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