TW201522637A - 非胚胎幹細胞之單離及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於自例如成體組織或器官之非胚胎組織單離例如成體幹細胞之非胚胎幹細胞的方法。如此自各種組織或器官單離之非胚胎幹細胞(例如成體幹細胞)能在試管內(in vitro)無限地自我更新或繁殖，為多能性，且能分化成單離出該等幹細胞之組織或器官中通常被發現之各種經分化細胞型。此外，經單離幹細胞可經由單一的經單離幹細胞之純系擴增而繁殖，以產生純系，該純系中至少約40%、70%、90%或更多的細胞能以源自單細胞之純系之形式而進一步繼代(passage)。

Description

非胚胎幹細胞之單離及其用途 相關申請案之參考資料
本申請案係根據35 U.S.C.§ 119(e)主張於2013年3月15日申請之美國臨時申請案第61/792,027號、及於2013年12月6日申請之美國臨時申請案第61/912,795號之申請日之優先權，該等申請案之全部內容係以參考資料之方式併入本文中。
序列表
本申請案含有序列表，其以ASCII格式電子呈送，並以其全部內容併入本文參考。該ASCII格式本於2014年5月30日建立，名為122854-00120_SL.txt且大小為223,850位元組。
本發明係關於自例如成年組織或器官之非胚胎組織，單離之例如成體幹細胞之非胚胎幹細胞及其方法。
胚胎幹細胞(ES細胞)為衍生自囊胚(早期胚胎)之內細胞團之多能性幹細胞。舉例而言，在人類中，胚 胎於受精後大約4至5日到達囊胚期，此時其係典型地由約50至150個細胞所組成。將胚細胞或內細胞團(ICM)予以單離會導致受精人類胚胎之破壞，其引發倫理議題及法律議題。
相對地，非胚胎幹細胞(諸如成體幹細胞) 係不屬胚胎源之幹細胞，且其單離不會涉及哺乳類胚胎之破壞。舉例而言，成體幹細胞，亦稱為體幹細胞，係可遍佈於幼年以及成年動物之體內及人體中之未經分化幹細胞。此等幹細胞，一方面能夠實際上無限地自我更新或自我再生，而另一方面能夠分化成各種成熟或經分化細胞型，因而補充死亡細胞並使受損組織再生。
至今已有許多成體幹細胞被鑑定出。
舉例而言，造血幹細胞係在骨髓中被發現且生成為所有血液細胞型。
乳腺幹細胞係在青春期及妊娠期間提供用於乳腺生長之細胞來源，且在乳房的癌化方面扮演重要的角色。乳腺幹細胞已自人類及小鼠組織、以及自衍生自乳腺之細胞系中單離出。此種幹細胞可生成為腺體之管腔細胞型及肌上皮細胞型兩者，且在小鼠中已顯示具有再生成完整器官之能力(Liu等人，Breast Cancer Research 7(3)：86-95,2005)。
腸幹細胞在整個生命期間持續不斷地分裂，且使用複雜遺傳程序來產生內襯於小腸及大腸表面之細胞(Van Der Flier及Clevers，Annual Review of Physiology 71：241-260,2009)。腸幹細胞鄰近於幹細胞區位(stem cell niche)之基部(稱為李氏腸腺隱窩(crypts of Lieberkuhn))而存在。腸幹細胞可能是小腸及結腸之大部分癌腫(cancer)之根源(Barker等人，Nature 457(7229)：608-611,2008)。
間葉幹細胞(MSC)係屬體源且可分化成多 種組織。MSC已自胎盤、脂肪組織、肺、骨髓及血液、來自臍帶之花頓氏膠(Wharton’s jelly)(Phinney及Prockop,Stem Cells 25(11)：2896-2902,2007)、及牙齒(牙髓及牙周韌帶之血管周圍區位)(Shi等人，Orthod.Craniofac.Res.8(3)：191-199,2005)中單離出。MSC係由於其分化、提供營養支持、及調控先天免疫反應之能力而於臨床治療上引人注目(Phinney及Prockop，同上)。
內皮幹細胞係在骨髓中被發現之三種類型多能性幹細胞之一。該等內皮幹細胞係具有分化成內皮細胞(內襯於血管之細胞)能力的稀少且受爭議之群組。
隨著在大鼠中神經生成(新神經元之產生)之過程係持續至成年期之發現，已假設幹細胞於成體腦部中存在(Altman及Das，The Journal of Comparative Neurology 124(3)：319-335,1965)。幹細胞於成熟靈長類腦部之存在係於1967年首次被報告(Lewis,Nature 217(5132)：974-975,1968)。已顯示新神經元係在成體小鼠、鳴禽類及靈長類(包括人類)中生成。通常，成體神經生成係限定於腦部之兩個區-腦室下區(其內襯於側腦室)、及海馬體結構之齒狀迴(Alvarez-Buylla等人，Brain Research Bulletin 57(6)：751-758, 2002)。儘管已確立新神經元在海馬體中之生成，但真實自我更新幹細胞之存在尚有爭論(Bull及Bartlett，The Journal of Neuroscience 25(47)：10815-10821,2005)。於某些情況下，諸如在局部缺血之組織損傷後，在其他腦部區域，包括新皮質，可誘發神經生成。
神經幹細胞一般係在試管內培養而呈所謂 的神經幹細胞球-細胞之漂浮非均質聚集體，其含有大比例的幹細胞(Reynolds及Weiss，Science 255(5052)：1707-1710,1992)。該等神經幹細胞可長時間繁殖且分化成神經元及神經膠細胞兩者，因而表現出幹細胞之行為。然而，某些近期研究提出此行為係受到前驅細胞(progenitor cell)(通常在活體內(in vivo)歷經嚴格限制次數之複製週期的幹細胞分裂後代)中之培養條件所誘發(Doetsch等人，Neuron 36(6)：1021-1034,2002)。再者，當移植回腦部時，神經幹細胞球所衍生之細胞不會表現出幹細胞之行為(Marshall等人，Stem Cells 24(3)：731-738,2006)。
神經幹細胞與造血幹細胞(HSC)具有許多 共同特性。值得注意地，當注射至血液中時，神經幹細胞球所衍生之細胞係分化成免疫系統之各種細胞型(Bjornson等人，Science 283(5401)：534-537,1999)。
嗅覺成體幹細胞已自人類嗅覺黏膜細胞中 成功地採集，該黏膜細胞係在鼻的內層中被發現且涉及嗅覺(Murrell等人，Developmental Dynamics 233(2)：496-515,2005)。若給予該等嗅覺成體幹細胞正確的化學環境，此等 細胞具有與胚胎幹細胞相同的能力而發育成許多不同細胞型。嗅覺幹細胞擁有治療性應用之潛力，且相對於神經幹細胞，可易於採集而不對患者造成傷害。此意味其可自所有個體中輕易地獲得，包括可能最需要幹細胞療法之年長患者。
毛囊含有兩種類型幹細胞，其中一者似乎 顯示為胚胎神經脊之幹細胞殘留物。類似細胞已在胃腸道、坐骨神經、心臟流出道、脊神經節及交感神經節中被發現。此等細胞可生成神經元、許旺氏細胞(Schwann cell)、肌纖維母細胞、軟骨細胞及黑色素細胞(Sieber-Blum及Hu，Stem Cells Rev.4(4)：256-260,2008；Kruger等人，Neuron 35(4)：657-669,2002)。
具有宣稱與胚胎幹細胞同等效力之多能性 幹細胞已由德國及美國科學家自實驗用小鼠之睪丸中所發現之精原前驅細胞中取得。來自德國及英國之研究人員已使用來自人類睪丸之細胞證實相同的潛能。所萃取之幹細胞係稱為人類成體生殖幹細胞(GSC)。多能性幹細胞亦已自人類睪丸中所發現之生殖細胞中取得。
由於成體幹細胞具有無限地分裂或自我更 新之能力、以及生成其所源自之器官之所有細胞型之能力，而可有潛力自少數細胞再生成完整器官，故成體幹細胞擁有用於個人化及再生醫學之巨大潛力。此外，不同於胚胎幹細胞，成體幹細胞在研討及治療上之用途並不會被認為有爭議，此乃由於此等成體幹細胞係衍生自成體組織 樣本，而並非受破壞之人類胚胎。
在一態樣中，本發明係提供一種自非胚胎組織(例如胎兒組織或成體組織)單離非胚胎幹細胞(例如胎兒幹細胞或成體幹細胞)之方法，該方法包含：(1)將來自非胚胎組織之分離上皮細胞在培養基中，於與第一群經致命性照射的飼養細胞及基底膜基質接觸下培養，以形成上皮細胞純系，該培養基包含：(a)Notch促效劑；(b)ROCK(Rho激酶)抑制劑；(c)骨形成蛋白(BMP)拮抗劑；(d)Wnt促效劑；(e)有絲分裂生長因子；以及(f)胰島素或IGF；該培養基視需要進一步包含下列者之至少一種：(g)TGF β傳訊路徑抑制劑(例如TGF β抑制劑或TGF β受體抑制劑)；以及(h)菸鹼醯胺、或其類似物、前驅物或模擬物；(2)自該上皮細胞純系單離單細胞；以及(3)將來自步驟(2)之經單離單細胞逐一在培養基中，於與第二群經致命性照射的飼養細胞及第二基底膜基質接觸下培養而形成單細胞純系；其中，該單細胞純系之各者代表該非胚胎幹細胞之純系擴增，藉此單離該非胚胎幹細胞。
在相關態樣中，本發明係提供一種自非胚胎組織(例如胎兒組織或成體組織)單離非胚胎幹細胞(例如胎兒幹細胞或成體幹細胞)之方法，該方法包含：(1)將來自非胚胎組織之分離上皮細胞在培養基中，於與第一群經致命性照射的飼養細胞及基底膜基質接觸下培養，以形成上皮細胞純系，該培養基包含：(a)Notch促效劑；(b) ROCK(Rho激酶)抑制劑；(c)TGF β傳訊路徑抑制劑，諸如TGF β抑制劑、或TGF β受體抑制劑；(d)Wnt促效劑；(e)菸鹼醯胺、或其類似物、前驅物或模擬物，(f)有絲分裂生長因子；以及(g)胰島素或IGF；該培養基視需要進一步包含(h)骨形成蛋白(BMP)拮抗劑，(2)自該上皮細胞純系單離單細胞；以及(3)將來自步驟(2)之經單離單細胞逐一在培養基中，於與第二群經致命性照射的飼養細胞及第二基底膜基質接觸下培養而形成單細胞純系；其中，該單細胞純系之各者代表該非胚胎幹細胞之純系擴增，藉此單離該非胚胎幹細胞。
在某些具體例中，該非胚胎組織為立方狀或柱狀上皮組織。在某些具體例中，該非胚胎組織為成體立方狀或柱狀上皮組織。在某些具體例中，該非胚胎組織並非為分層上皮組織，諸如皮膚或其他類似於皮膚之上皮組織。
在某些具體例中，該非胚胎幹細胞為實質上缺乏p63之表現、或不會可檢測地表現p63之成體幹細胞。在其他具體例中，該非胚胎幹細胞為不表現p63之成體幹細胞(例如某些來自肺、食道、或膀胱之成體幹細胞)。
於本文中使用時，“p63”係指腫瘤抑制劑p53家族之成員(綜述請參見Yang等人，Trends Genet.18：90-95,2002；及McKeon,Genes & Dev.18：465-469,2004)。
在某些具體例中，該非胚胎幹細胞為單離自成體肺組織之成體肺幹細胞。
在某些具體例中，該方法進一步包含自該單細胞純系單離單一非胚胎幹細胞。
在某些具體例中，該方法進一步包含培養該單細胞純系之其中一者，以生成該非胚胎幹細胞之家譜細胞系(pedigree cell line)。
在某些具體例中，該非胚胎組織為成體組織。
在其他具體例中，該非胚胎組織為胎兒組織。
在某些具體例中，該非胚胎組織為哺乳類組織(例如人類組織)。
在某些具體例中，該非胚胎組織係得自或源於肺、食道、胃、小腸、結腸、腸化生(intestinal metaplasia)、輸卵管、腎臟、胰臟、膀胱或肝臟、或其部分/片段。
在某些具體例中，該非胚胎組織為疾病組織、失調組織、異常狀況組織、或來自具有該疾病、失調、或異常狀況之患者之組織。
在某些具體例中，該疾病、失調、或異常狀況包含腺瘤、上皮癌、腺癌、癌腫、固體腫瘤、發炎性腸病(例如克隆氏症(Crohn’s disease)、潰瘍性結腸炎)、潰瘍、胃病、胃炎、食道炎、膀胱炎、絲球體腎炎、多囊性腎臟疾病、肝炎、胰臟炎、發炎性失調(例如第I型糖尿病、糖尿病性腎臟疾病)及自體免疫失調。
在某些具體例中，該癌腫為卵巢癌、胰臟癌(諸如胰臟管腺癌)、肺癌(諸如肺腺癌)、或胃癌(諸如胃腺癌)。在某些具體例中，該癌腫係來自人類患者(例如來自患者之經手術切除之癌腫、或來自患者之活體組織切片)、或來自使用人類癌細胞系或原發癌細胞而生長於免疫抑制動物(例如小鼠)中之異種移植瘤。
在某些具體例中，來自具有該疾病、失調、或異常狀況之患者之組織係受到該疾病、失調、或異常狀況傷害。
在某些具體例中，該非胚胎幹細胞為成體幹細胞。
在某些具體例中，在步驟(1)中，該(上皮)細胞係經由利用酶進行酶分解而自非胚胎組織中分離。舉例而言，該酶可包含膠原酶、蛋白酶、分散酶、鏈黴蛋白酶、彈性蛋白酶、透明質酸酶、細胞分離酶(accutase)或胰蛋白酶。
在某些具體例中，在步驟(1)中，該(上皮)細胞係經由溶解環繞該(上皮)細胞之細胞外基質而自該非胚胎組織中分離。
在某些具體例中，該飼養細胞包含3T3-J2細胞(例如彼等形成飼養細胞層者)。
在某些具體例中，該基底膜基質為含層黏蛋白之基底膜基質(例如MATRIGELTM基底膜基質(BD Biosciences))，較佳為生長因子減少型。
在某些具體例中，該基底膜基質不支持三次元生長，或不會形成支持三次元生長所需要之三次元基質。
在某些具體例中，該培養基進一步包含10% FBS，該FBS未受熱失活。
在某些具體例中，該Notch促效劑包含Jagged-1。
在某些具體例中，該ROCK抑制劑包含Rho激酶抑制劑VI(Y-27632，(R)-(+)-反式-N-(4-吡啶基)-4-(1-胺基乙基)-環己烷甲醯胺))、法舒地爾(Fasudil)或HA1071(5-(1,4-二氮雜環庚烷-1-基磺醯基)異喹啉)、或H1152((S)-(+)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-異喹啉基)磺醯基]-六氫-1H-1,4-二氮呯二鹽酸鹽)。
在某些具體例中，該BMP拮抗劑包含頭蛋白(Noggin)、DAN、包含DAN胱胺酸結節結構域(cystine-knot domain)之DAN樣蛋白質(例如賽伯洛斯蛋白(Cerberus)及格雷姆林蛋白(Gremlin))、索蛋白(Chordin)、包含索蛋白結構域之索蛋白樣蛋白質、卵泡抑素(Follistatin)、包含卵泡抑素結構域之卵泡抑素相關蛋白質、硬化蛋白(sclerostin)/SOST、核心蛋白聚醣(decorin)、或α-2巨球蛋白。
在某些具體例中，該Wnt促效劑包含R-底板反應蛋白1(R-spondin 1)、R-底板反應蛋白2、R-底板反應蛋白3、R-底板反應蛋白4、R-底板反應蛋白模擬物、 Wnt家族蛋白質(例如Wnt-3a、Wnt 5、Wnt-6a)、諾里蛋白(Norrin)、或GSK-抑制劑(例如CHIR99021)。
在某些具體例中，該有絲分裂生長因子包含EGF、角質細胞生長因子(KGF)、TGF α、BDNF、HGF、及/或bFGF(例如FGF7或FGF10)。
在某些具體例中，該TGF β受體抑制劑包含SB431542(4-(4-(苯并[d][1,3]二氧雜環戊烯-5-基)-5-(吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基)苯甲醯胺)、A83-01、SB-505124、SB-525334、LY 364947、SD-208、或SJN 2511。
在某些具體例中，該TGF β(傳訊)抑制劑結合至選自ALK5、ALK4、TGF β受體激酶1及ALK7所組成群組之一種或多種絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶並減少其活性。
在某些具體例中，該TGF β(傳訊)抑制劑係以在1nM與100μM之間、在10nM與100μM之間、在100nM與10μM之間、或大約1μM之濃度添加。
在某些具體例中，該培養基包含：在DMEM：F12為3：1之培養基中之5μg/mL胰島素；2nM之(3,3′,5-三碘-L-甲狀腺胺酸)；400ng/mL氫化皮質酮(hydrocortisone)；24.3μg/mL腺嘌呤；10ng/mL EGF；10%胎牛血清(未受熱失活)；1μM Jagged-1；100ng/mL頭蛋白；125ng/mL R-底板反應蛋白1；2.5μM Y-27632；以及1.35mM L-麩醯胺酸，視需要該培養基進一步包含0.1nM霍亂腸毒素。
在某些具體例中，該培養基進一步包含2μM SB431542。
在某些具體例中，該培養基進一步包含10mM菸鹼醯胺。
在某些具體例中，該培養基進一步包含2μM SB431542及10mM菸鹼醯胺。
在某些具體例中，該培養基包含：在DMEM：F12為3：1之培養基中之5μg/mL胰島素，2nM之(3,3′,5-三碘-L-甲狀腺胺酸)；400ng/mL氫化皮質酮；24.3μg/mL腺嘌呤；10ng/mL EGF；10%胎牛血清(未受熱失活)；1μM Jagged-1；125ng/mL R-底板反應蛋白1；2.5μM Y-27632；2μM SB431542；10mM菸鹼醯胺；以及1.35mM L-麩醯胺酸。視需要，該培養基進一步包含100ng/mL頭蛋白。視需要，該培養基進一步包含0.1nM霍亂腸毒素。
在某些具體例中，該非胚胎組織為成體小腸，且該培養基進一步包含10mM菸鹼醯胺。
在某些具體例中，該非胚胎組織為成體小腸，且該培養基進一步包含2μM SB431542及10mM菸鹼醯胺。
在某些具體例中，該非胚胎組織為成體小腸，且該培養基進一步包含(1)2μM SB431542，以及胃泌素(Gastrin)、PGE2、Wnt3a中之一者；或(2)10mM菸鹼醯胺、及GSK3抑制劑。
在某些具體例中，該非胚胎組織為胎兒小 腸，且該培養基進一步包含10mM菸鹼醯胺。
在某些具體例中，該非胚胎組織為胎兒小 腸，且該培養基進一步包含：FGF受體抑制劑；N-乙醯基-L-半胱胺酸；p38抑制劑(例如SB-202190、SB-203580、VX-702、VX-745、PD-169316、RO-4402257及BIRB-796)；胃泌素；PGE2；FGF受體抑制劑；Shh；TGF β；10mM菸鹼醯胺及TGF β；10mM菸鹼醯胺及Wnt3a；10mM菸鹼醯胺及GSK3抑制劑，或10mM菸鹼醯胺及2μM SB431542。
在某些具體例中，該培養基缺乏下列者中 之至少一者：Wnt3a、p38抑制劑(例如SB-202190、SB-203580、VX-702、VX-745、PD-169316、RO-4402257及BIRB-796)、N-乙醯基-L-半胱胺酸、胃泌素、HGF、睪固酮(例如(二氫)睪固酮)、及PGE2。
在某些具體例中，在該單細胞純系之各者 中，至少約40%、50%、60%、70%、80%、85%、或約90%之細胞，當以單細胞之形式予以單離時，能夠以單細胞純系之形式增殖。在某些具體例中，單細胞純系具有至少約300、400、450、500、550、600或更多細胞。在某些具體例中，該單細胞純系中之細胞具有實質上相同的形態或實質上同質。在某些具體例中，該單細胞純系實質上以扁平細胞層之形式生長(例如在飼養層及基底膜基質頂部的細胞層)。某些具體例中，該單細胞純系不會形成三次元結構，諸如胞器。
在某些具體例中，該非胚胎幹細胞，當以 單細胞之形式予以單離時，能夠自我更新超過約50代、70代、100代、150代、200代、250代、300代、350代、或約400或更多代。在某些具體例中，該非胚胎幹細胞能夠每隔約25小時、30小時、35小時分裂一次。
在某些具體例中，可將該純系化幹細胞冷 凍並短期保存在約-80℃(例如在乾冰上)、或長期保存在約-200℃(例如在液態氮中)，且隨後解凍以便使用標準組織培養方法進行培養。可根據本發明之方法將冷凍細胞解凍並進行培養，而不會喪失其作為幹細胞之特徵(例如長期更新能力、及分化之能力等)，且不會有顯著的細胞死亡。因此，於一具體例中，本發明係提供一種冷凍純系化幹細胞，其保存在低於-5℃、低於-10℃、低於-20℃、低於-40℃、低於-60℃、低於-80℃、低於-90℃、低於-100℃、低於-190℃、低於-200℃、低於-210℃、或低於-220℃。
在某些具體例中，該非胚胎幹細胞能夠分 化成該非胚胎組織之經分化細胞型。
在某些具體例中，該非胚胎幹細胞為小腸 幹細胞，且能夠分化成經分化小腸細胞，該經分化小腸細胞(1)表現選自MUC或PAS(杯形細胞標記)、CHGA(神經內分泌細胞標記)、LYZ(潘氏細胞標記)、MUC7、MUC13、及KRT20之標記，及/或(2)吸收水及養分(諸如經由經分化腸細胞)、分泌黏液(諸如經由經分化杯形細胞)、分泌腸激素(諸如經由經分化腸內分泌細胞)、或分泌抗菌物質(諸如 經由經分化潘氏細胞)。
於本文中使用時，“表現(某種)標記”包括 特定細胞或細胞型表現可使用該項技術領域中所公認用於RNA或蛋白質檢測之方法(諸如原位雜交或利用抗體之免疫染色)、或該項技術領域中已知或下文中所述之任何其他方法而迅速檢測及/或定量之基因產物(mRNA或蛋白質)之情況。該用語亦可包括該基因產物係優勢地表現，諸如以相較於相關對照細胞而言顯著較高的程度(例如2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、30倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或更多)進行表現之情況。
相反地，“不表現(某種)標記”包括特定細 胞或細胞型不表現可使用該項技術領域中所公認用於RNA或蛋白質檢測之方法而迅速檢測及/或定量之基因產物(mRNA或蛋白質)之情況。該用語亦可包括該基因產物係以相較於相關對照細胞而言顯著較低的程度(例如2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、30倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或更多)進行表現之情況。
舉例而言，未經分化幹細胞(諸如小腸幹細 胞)可能不會“表現”與自其所分化之細胞(例如杯形細胞)相關之標記，其可意指該未經分化幹細胞具有無法檢測程度的該標記之表現，或可意指標記在該未經分化幹細胞中之表現程度相較於在經分化細胞(例如杯形細胞)中而言係如此低，使得該表現程度在該未經分化幹細胞中係實際上可忽略不計。
在某些具體例中，該非胚胎幹細胞表現選 自：SOX9、KRT19、KRT7、LGR5、CA9、FXYD2、CDH6、CLDN18、TSPAN8、BPIFB1、OLFM4、CDH17、及PPARGC1A之一或多種幹細胞標記(marker)。
在某些具體例中，該非胚胎幹細胞為小腸 幹細胞，且表現選自：OLFM4、SOX9、LGR5、CLDN18、CA9、BPIFB1、KRT19、CDH17、及TSPAN8之一或多種標記。
在某些具體例中，該非胚胎幹細胞實質上 缺乏與在該非胚胎組織中經分化細胞型相關之標記之表現。
在某些具體例中，該非胚胎幹細胞為小腸 幹細胞，且缺乏與經分化小腸細胞相關之標記之表現，該標記係選自MUC或PAS(杯形細胞標記)、CHGA(神經內分泌細胞標記)、LYZ(潘氏細胞標記)、MUC7、MUC13、及KRT20。
在某些具體例中，該非胚胎幹細胞具有未 成熟、且未經分化形態，該形態之特徵為小圓細胞形狀且具有高的細胞核對細胞質比例。
在另一態樣中，本發明係提供一種根據本 發明之任一種方法所單離出之非胚胎幹細胞(例如胎兒幹細胞或成體幹細胞)、或其試管內培養物，諸如包含標的培養基者。
在某些具體例中，該非胚胎幹細胞係單離 自立方狀或柱狀上皮組織。在某些具體例中，該非胚胎幹細胞係單離自成體立方狀或柱狀上皮組織。在某些具體例中，該非胚胎幹細胞並非單離自分層上皮組織，諸如皮膚或其他類似於皮膚之組織。
在某些具體例中，該非胚胎幹細胞為實質 上缺乏p63之表現、或不會可檢測地表現p63之成體幹細胞。在其他具體例中，該非胚胎幹細胞為不表現p63之成體幹細胞(例如某些來自肺、食道、或膀胱之成體幹細胞)。
在某些具體例中，該非胚胎幹細胞係單離自成體肺組織(例如不同於上呼吸道組織之成體肺組織)。
在某些具體例中，該培養基不包含霍亂腸毒素。
在另一態樣中，本發明係提供一種非胚胎幹細胞之單細胞純系、或其試管內培養物，諸如包含標的培養基者，其中，在該單細胞純系中，至少約40%、50%、60%、70%、或約80%之細胞，當以單細胞之形式予以單離時，能夠增殖而產生單細胞純系。
在另一態樣中，本發明係提供一種非胚胎幹細胞之單細胞純系、或其試管內培養物，諸如包含標的培養基者，其中，該非胚胎幹細胞，當以單細胞之形式予以單離時，能夠自我更新超過約50代、70代、100代、150代、200代、250代、300代、350代、或約400或更多代。
在另一態樣中，本發明係提供一種非胚胎幹細胞之單細胞純系、或其試管內培養物，諸如包含標的 培養基者，其中，該非胚胎幹細胞能夠分化成非胚胎組織之經分化細胞型，該非胚胎組織係單離出該非胚胎幹細胞之非胚胎組織、或該非胚胎幹細胞所在之非胚胎組織。
在另一態樣中，本發明係提供一種非胚胎 幹細胞之單細胞純系、或其試管內培養物，諸如包含標的培養基者，其中，該非胚胎幹細胞表現選自：SOX9、KRT19、KRT7、LGR5、CA9、FXYD2、CDH6、CLDN18、TSPAN8、BPIFB1、OLFM4、CDH17、及PPARGC1A之一或多種幹細胞標記。
在另一態樣中，本發明係提供一種小腸幹 細胞之單細胞純系、或其試管內培養物，諸如包含標的培養基者，其表現選自：OLFM4、SOX9、LGR5、CLDN18、CA9、BPIFB1、KRT19、CDH17、及TSPAN8之一或多種標記。
在另一態樣中，本發明係提供一種非胚胎 幹細胞之單細胞純系、或其試管內培養物，諸如包含標的培養基者，其中，該非胚胎幹細胞實質上缺乏與在該非胚胎組織中經分化細胞型相關之標記之表現。
在另一態樣中，本發明係提供一種非胚胎 幹細胞之單細胞純系、或其試管內培養物，諸如包含標的培養基者，其中，該非胚胎幹細胞實質上缺乏p63之表現(或不會可檢測地表現p63)。在相關態樣中，本發明係提供一種非胚胎幹細胞之單細胞純系、或其試管內培養物，諸如包含標的培養基者，其中，該非胚胎幹細胞表現p63。
在另一態樣中，本發明係提供一種非胚胎 幹細胞之單細胞純系、或其試管內培養物，諸如包含標的培養基者，其中，該非胚胎幹細胞具有未成熟且未經分化形態，該形態之特徵為小圓細胞形狀且具有高的細胞核對細胞質比例。
在相關態樣中，本發明亦提供一種標的單 細胞純系、或其試管內培養物(諸如包含標的培養基者)之集合庫或收集群。在某些具體例中，該集合庫或收集群可包含來自相同組織/器官型之單細胞純系。在某些具體例中，該集合庫或收集群可包含單離自相同類型的組織/器官型，但來自群體的不同成員之單細胞純系。在某些具體例中，群體的一或多個(較佳為每個)成員係跨越至少一個組織分型位點(諸如HLA-A、HLA-B、及HLA-D)呈同型接合(homozygous)。在某些具體例中，至少一個組織分型位點(例如上述HLA位點)係經由例如TALEN或CRISPR技術(參見下文)建造於純系化幹細胞中，以生成缺乏由組織分型位點(例如HLA-A、HLA-B、及HLA-D等)所編碼之組織抗原之全適捐贈者細胞系(例如肝臟細胞)。參見Torikai等人(Blood,122(8)：1341-1349,2013，以參考資料之方式併入)。 在某些具體例中，該群體可藉由群體之種族、年齡、性別、疾病狀態、或任何一般特徵進行界定。該集合庫或收集群可具有至少約20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、180、200、250、300或更多個成員。
跨越群體之MHC單倍型數據之可得性已使 得自所使用之相對少數同型接合個體“儲存(banking)”或創立跨越群體之幹細胞(iPSC或成體幹細胞，諸如標的幹細胞)之集合庫或收集群能夠進行。舉例而言，在英國10,000名個體之分析中，確認只要10名具跨越在6號染色體上關鍵組織分型位點呈同型接合之個體就可對37.5%之英國群體在HLA-A、HLA-B、及HLA-DR提供配對。衍生自150名個體之幹細胞可提供跨越此等位點之更接近的配對，其將進一步增加移植之成功且可能摒除對免疫抑制療法之需求。因此，在患者之幹細胞可能因疾病或感染而有限之肝臟移植之例中，便可自捐贈者創立此等集合庫或收集群，而具有用於大部分群體之組織配對細胞之移植的無限來源。
在另一態樣中，本發明係提供一種用於單 離及/或培養非胚胎幹細胞之培養基，該培養基包含：(a)Notch促效劑；(b)ROCK(Rho激酶)抑制劑；(c)骨形成蛋白(BMP)拮抗劑；(d)Wnt促效劑；(e)有絲分裂生長因子；以及(f)胰島素或IGF。
在某些具體例中，該培養基進一步包含下 列者之至少一種：(g)TGF β傳訊路徑抑制劑(例如TGF β抑制劑或TGF β受體抑制劑)；以及(h)菸鹼醯胺、或其前驅物、類似物或模擬物。
在相關態樣中，本發明係提供一種用於單 離及/或培養非胚胎幹細胞之培養基，該培養基包含：(a)Notch促效劑；(b)ROCK(Rho激酶)抑制劑；(c)TGF β傳 訊路徑抑制劑(例如TGF β抑制劑或TGF β受體抑制劑)；(d)Wnt促效劑；(e)菸鹼醯胺、或其前驅物、類似物或模擬物；(f)有絲分裂生長因子；以及(g)胰島素或IGF。
在某些具體例中，該培養基進一步包含(h)骨形成蛋白(BMP)拮抗劑。
在另一態樣中，本發明係提供一種治療具有疾病、失調、或異常狀況且需要治療之對象之方法，其包含：(1)使用任一種標的方法，自與該對象中受該疾病、失調、或異常狀況所影響之組織相對應的組織中單離成體幹細胞；(2)視需要，在該成體幹細胞中改變至少一種基因之表現而產生經改變成體幹細胞；(3)將該經單離成體幹細胞或經改變成體幹細胞、或其純系擴增物再次引進至該對象中，其中，該對象中，該疾病、失調、或異常狀況之至少一種不良效應或症狀被減輕。
在某些具體例中，在該成體幹細胞中該至少一種基因之表現係被改變而產生經改變成體幹細胞。
在某些具體例中，該單離出成體幹細胞之組織係來自健康對象。
在某些具體例中，該單離出成體幹細胞之組織係來自該對象。
在某些具體例中，該單離出成體幹細胞之組織係受該疾病、失調、或異常狀況所影響之受影響組織。
在某些具體例中，該單離出成體幹細胞之組織係鄰近於受該疾病、失調、或異常狀況所影響之受影 響組織。
在某些具體例中，該至少一種基因在該對 象之受該疾病、失調、或異常狀況所影響之該組織中係表現不足，且該至少一種基因之表現在該經改變成體幹細胞中係增加。
在某些具體例中，該至少一種基因在該對 象之受該疾病、失調、或異常狀況所影響之該組織中係過度表現，且該至少一種基因之表現在該經改變成體幹細胞中係減少。
在某些具體例中，步驟(2)係藉由將外源 DNA或RNA引進至該成體幹細胞中而達成。
在又一態樣中，本發明係提供一種篩選化 合物之方法，該方法包含：(1)使用任一種本發明之方法，自對象單離成體幹細胞；(2)經由單細胞純系擴增產生該成體幹細胞之細胞系(cell line)；(3)使來自該細胞系之測試細胞與複數種候選化合物接觸；以及(4)鑑定出在該測試細胞中會產生預定表型改變之一或多種化合物。
可預期的是，本文中所述之任意具體例， 包括實施例及圖/圖式中所述之具體例、以及在本發明之不同態樣下所述之具體例，若適用時，可與任意一或多個其他具體例組合。
第1圖係圖示說明一般非胚胎(例如成體)上皮幹細胞純系化技術之示意圖。衍生自各種成體(人類) 上皮組織之單一幹細胞之家譜幹細胞系可使用本文中所述之方法建立。上皮幹細胞系可在試管內無限地培養。其亦可藉由數種精密的試管內分化試驗、使用“人源化”小鼠模型之活體內異種移植實驗、以及基因圖譜方法(諸如基因表現陣列、基因定序等)而予以定性。可將該細胞系凍存以便長期保存。經如此單離之幹細胞具有多種實際用途，範圍涵蓋從作為藥物篩選及生物標記發現之國際標準，至在最初單離出或衍生出該幹細胞之患者之再生醫學中之利用。
第2圖係顯示單離自來自人類之各種組織 型之各種柱狀上皮幹細胞純系的代表性未經分化形態，該組織型包括胃、小腸、結腸、腸化生、輸卵管(oviduct)、腎臟、胰臟、肝臟、氣管/上呼吸道(未顯示)、遠端呼吸道(未顯示)、膀胱(人類及小鼠兩者)、海馬體、及肺(人類及小鼠兩者)。應注意在所顯示之單細胞純系中之個別細胞均具有類似的小圓形態，其具有相對較大的細胞核以及高的細胞核對細胞質比例。
第3A圖係顯示來自純系化人類肝臟幹細胞 之家譜細胞系可在試管內繁殖超過100次(例如135次)分裂，同時仍保持未成熟細胞形態(參見第2圖)。應注意相同的小圓形態，及相對較大的細胞核以及高的細胞核對細胞質比例。第3B圖進一步顯示在400次細胞分裂後仍保持未成熟細胞形態。
第4圖係顯示經單離肝臟幹細胞可在試管 內分化且高度表現經分化肝臟細胞標記，諸如ALB(白蛋白)、HNF4 α(肝細胞核因子4 α)及AFP(α-胎蛋白)。倍數變化係比較標記基因在經分化肝臟細胞對未經分化幹細胞中之表現程度。所示之即時PCR數據係使用各個別基因之特定引子而獲得。
第5圖係顯示來自純系化人類腸幹細胞之 家譜細胞系可在試管內繁殖超過400次，同時仍保持未成熟細胞形態(參見第2圖)。
第6圖係顯示衍生自單一經單離人類腸幹 細胞之家譜細胞系可在空氣-液體交界面(ALI)細胞培養系統中分化成腸樣組織結構。一個單一腸幹細胞可分化成杯形細胞(PAS染色及5F4G1抗體染色陽性)；潘氏細胞(LYZ或溶菌酶陽性)及神經內分泌細胞(CHGA陽性)。5F4G1為專一地將杯形細胞染色之抗體。腸樣組織結構亦表現絨毛蛋白(Villin)，其使發生吸收作用之經微絨毛覆蓋之小腸道表面被染色。
第7圖係顯示分層上皮幹細胞(來自人類上 呼吸道)及柱狀上皮幹細胞(來自小腸)當在飼養系統中培養於SCM培養基中時於形態上看起來類似，但在空氣-液體交界面(ALI)培養系統中展現出不同的分化能力。在相同分化系統中，小腸幹細胞係分化成為成熟腸樣結構(上排圖)，而上呼吸道幹細胞則係分化成為成熟上呼吸道上皮(黏蛋白5AC染色杯形細胞呈分離型式；微管蛋白染色纖毛細胞呈圍繞被黏蛋白5AC染色之杯形細胞之相對連續型 式)。特定而言，上呼吸道幹細胞分化成由纖毛細胞及杯形細胞所組成之氣管樣上皮。此數據支持組織專一性上皮幹細胞係本質上定型的(committed)。長期培養並不會影響其對個別組織型之定型(commitment)。
第8圖係顯示在腸上皮幹細胞與上呼吸道 上皮幹細胞之間之基因表現比較。其顯示腸幹細胞高度表現諸如OLFM4、CD133、ALDH1A1、LGR5及LGR4之標記，而上呼吸道幹細胞高度表現諸如Krt14、Krt5、p63、Krt15及SOX2之不同組標記。
第9圖A係顯示純系化人類胃上皮幹細胞 展現出典型的未成熟形態(小圓細胞，其具有相對較大的細胞核及高的細胞核對細胞質比例)。該細胞係針對E-鈣黏蛋白(上皮細胞源)、SOX2及SOX9(胃上皮幹細胞之幹細胞標記)呈陽性染色。偶然地，在培養中有幾個細胞表現GKN1，其係典型的胃上皮分化標記，表明該細胞係衍生自胃。
第9圖B係顯示衍生自單一純系化人類胃 幹細胞之家譜細胞系可在試管內分化而形成柱狀上皮，其表現諸如GKN1、胃黏蛋白、H+K+ATP ase及Muc5Ac之成熟胃上皮標記。
第10圖係顯示位於胃食道連接部之純系化 腸化生幹細胞表現諸如SOX9之柱狀上皮幹細胞標記，且亦表現諸如CDH17之腸化生專一性標記。然而，其不表現食道扁平幹細胞標記p63或胃上皮幹細胞標記SOX2。衍生 自巴瑞特食道(Barrett’s esophagus)之一個單一幹細胞之家譜細胞系，腸化生可分化成模擬成熟腸化生之柱狀上皮，其表現諸如Cdx2及絨毛蛋白之標記。然而，其不表現諸如GKN1之胃上皮標記。
第11圖A係顯示自人類輸卵管中單離上皮 幹細胞之示意圖。特定而言，將組織進行酶分解並將細胞接種於飼養層以形成由數百個上皮幹細胞所組成之群落。
第11圖B係顯示經單離幹細胞可在試管內 分裂超過70次，而未進行分化或老化。該純系化細胞係呈PAX8陽性(輸卵管上皮幹細胞之典型標記)、E-鈣黏蛋白陽性(上皮細胞標記)、及Ki67陽性(增殖標記)。
第12圖A係顯示純系化人類胰臟幹細胞表 現諸如SOX9、Pdx1及ALDH1A1之推定幹細胞標記。
第12圖B係顯示經單離幹細胞可在試管內 分化成管狀結構。使用基因專一性引子之即時PCR數據係顯示當此等細胞分化時，Pdx1及SOX9之表現係急遽地向下調節。
第13圖係顯示由分化自肝臟幹細胞之細胞 所形成之組織化結構(左側)，以及數種肝臟細胞標記基因在經分化結構中之表現，諸如白蛋白、HNF1 α、及AFP。
第14圖係在左側顯示患有顯現卵巢及輸卵 管之雙側侵犯的高惡性度卵巢癌之患者的子宮切除，且在右圖顯示衍生自來自患有高惡性度卵巢癌之患者的腫瘤在經照射之3T3飼養細胞上之癌腫幹細胞(CSC)之純系。
第15圖係顯示如表3所述般將相等數目的 腫瘤細胞塗佈於不同培養基所衍生之CSC群落之若丹明(rodamine)染色。第2盤係由六因子培養基或SCM培養基所支持。
第16圖係顯示來自高惡性度卵巢癌之純系化CSC可無限地繼代。
第17圖係顯示衍生自高惡性度卵巢癌之CSC可用於在免疫抑制小鼠中生成腫瘤，且此種腫瘤與其所衍生自之腫瘤具有相同的組織學。
第18圖係顯示生長在3T3飼養細胞上之衍生自胰臟管腺癌(上排)及肺腺癌(下排)之CSC之實例，以及由此等CSC所生成之來自免疫抑制小鼠之腫瘤。
第19圖係顯示單離自胃腺癌之CSC之實例。
第20圖係顯示自首先生長於免疫抑制小鼠中之人類肺腺癌及卵巢癌中之CSC之純系化。
第21圖係用於鑑定出耐受標準化學療法劑的CSC之純系之概要圖。上排(左、中、及右)中，在3T3細胞上之30,000個CSC純系係經癌症藥物(諸如順鉑(cisplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、或其組合)處理，使得低於0.1%存活。接著對存活的純系(右)再次測試耐受性，且選擇穩定耐受型純系以用於擴增及分析。下排係顯示在來自相同患者之三個化學療法敏感型家譜(左)與三個耐受型CSC(右)間之基因表現差異的熱譜圖，其顯示具有顯著不 同的表現圖譜之100至200個基因。
第22圖之上圖係顯示在敏感型、順鉑耐受 型、及紫杉醇耐受型CSC間之基因表現差異的主成分分析。下圖係顯示順鉑耐受型及紫杉醇耐受型CSC之范氏圖(Venn diagram)，其顯示具有經改變之表現的基因之重疊。
第23圖A係顯示受GFP反轉錄病毒載體感 染之肝臟幹細胞之代表圖。應注意表現異種基因GFP之相對稀少地聚集的發亮細胞。第23圖B係顯示分選GFP表現型細胞之FACS圖譜。第23圖C係顯示生長於飼養體上之經分選GFP表現型肝臟幹細胞純系之圖。左圖係顯示具有相對一致高程度GFP表現之巨大發亮純系，緊鄰接於具有一致卻低程度GFP表現之稍微較小的第二代純系之相位對比圖。與第二代純系具有類似(相對較低)的GFP表現程度之第三代純系之部分圖像亦可見於左圖之右下角。右圖係顯示具有強烈GFP表現程度(細胞純系之發亮斑塊)之純系化肝臟幹細胞對比於代表不具有GFP表現之飼養體的幾乎黑色背景之暗視野視圖。
第24圖A及24圖B係顯示GFP標定之肝 臟幹細胞的脾內注射之結果。第24圖A係顯示建造成表現異種基因(GFP)之人類肝臟幹細胞之群落，以及經由小鼠宿主之腹膜的脾內細胞注射之方法。第24圖B係顯示注射GFP表現型純系化肝臟幹細胞7日後的NSG小鼠之切除肝臟。應注意朝向肝臟底側之已可見發亮GFP表現型組織斑塊。第24圖B之兩個右側影像係顯示在切除肝臟中之 發亮GPF訊號之放大圖。
1.概述
本發明係關於自非胚胎組織，例如成體組織或器官，將非胚胎幹細胞，例如成體幹細胞予以單離及/或保持於培養中之方法。如此自各種組織或器官單離之非胚胎幹細胞(例如成體幹細胞)能在試管內無限地自我更新或繁殖，為多能性，且能分化成該等幹細胞所單離自之組織或器官中通常被發現之各種經分化細胞型。包含經如此單離之非胚胎幹細胞(例如成體幹細胞)之培養物(包括試管內培養物)亦在本發明之範疇中。
此外，經單離幹細胞可經由單一的經單離幹細胞之純系擴增而繁殖，以產生一純系(例如呈試管內培養物)，該純系中至少約40%、70%、90%或更多的細胞能以源自單細胞之純系之形式而進一步繼代。如此，使用本發明之方法單離之幹細胞係獨特地能夠在試管內經由標準分子生物學技術(諸如經由感染或轉染引進外源遺傳物質)進行操作。
如此，在一態樣中，本發明係提供一種自非胚胎組織單離非胚胎幹細胞之方法，該方法包含：(1)將來自非胚胎組織之分離上皮細胞在培養基中，於與第一群經致命性照射的飼養細胞及基底膜基質接觸下培養，以形成上皮細胞純系，該培養基包含：(a)Notch促效劑；(b)ROCK(Rho激酶)抑制劑；(c)骨形成蛋白(BMP)拮抗劑；(d) Wnt促效劑；(e)有絲分裂生長因子；以及(f)胰島素或IGF；該培養基視需要進一步包含下列者之至少一種：(g)TGF β傳訊路徑抑制劑(諸如TGF β抑制劑或TGF β受體抑制劑)；以及(h)菸鹼醯胺、或其類似物、前驅物或模擬物；(2)自該上皮細胞純系單離單細胞；以及(3)將來自步驟(2)之經單離之單細胞逐一在培養基中，於與第二群經致命性照射的飼養細胞及第二基底膜基質接觸下培養而形成單細胞純系；其中，該單細胞純系之各者代表該非胚胎幹細胞之純系擴增，藉此單離該非胚胎幹細胞。
或者，本發明係提供一種自非胚胎組織單 離非胚胎幹細胞之方法，該方法包含：(1)將來自非胚胎組織之分離上皮細胞在培養基中，於與第一群經致命性照射的飼養細胞及基底膜基質接觸下培養，以形成上皮細胞純系，該培養基包含：(a)Notch促效劑；(b)ROCK(Rho激酶)抑制劑；(c)TGF β傳訊路徑抑制劑，諸如TGF β抑制劑、或TGF β受體抑制劑)；(d)Wnt促效劑；(e)菸鹼醯胺、或其類似物、前驅物或模擬物；(f)有絲分裂生長因子；以及(g)胰島素或IGF；該培養基視需要進一步包含(h)骨形成蛋白(BMP)拮抗劑；(2)自該上皮細胞純系單離單細胞；以及(3)將來自步驟(2)之經單離之單細胞逐一在培養基中，於與第二群經致命性照射的飼養細胞及第二基底膜基質接觸下培養而形成單細胞純系；其中，該單細胞純系之各者代表該非胚胎幹細胞之純系擴增，藉此單離該非胚胎幹細胞。
在相關態樣中，本發明係提供一種將使用 本發明之單離方法獲得之非胚胎幹細胞進行培養之方法，其包含將經單離之單細胞或單細胞純系在標的培養基中，於與經致命性照射的飼養細胞及基底膜基質之群體接觸下培養，該標的培養基係諸如包含下列者之培養基：(a)Notch促效劑；(b)ROCK(Rho激酶)抑制劑；(c)骨形成蛋白(BMP)拮抗劑；(d)Wnt促效劑；(e)有絲分裂生長因子；以及(f)胰島素或IGF；該培養基視需要進一步包含下列者之至少一種：(g)TGF β傳訊路徑抑制劑(諸如TGF β抑制劑或TGF β受體抑制劑)；以及(h)菸鹼醯胺、或其類似物、前驅物或模擬物。
或者，本發明係提供一種將使用本發明之 單離方法獲得之非胚胎幹細胞進行培養之方法，其包含將經單離之單細胞或單細胞純系在標的培養基中，於與經致命性照射的飼養細胞及基底膜基質之群體接觸下培養，該標的培養基係諸如包含下列者之培養基：(a)Notch促效劑；(b)ROCK(Rho激酶)抑制劑；(c)TGF β傳訊路徑抑制劑(諸如TGF β抑制劑或TGF β受體抑制劑)；(d)Wnt促效劑；(e)菸鹼醯胺、或其類似物、前驅物或模擬物；(f)有絲分裂生長因子；以及(g)胰島素或IGF；該培養基視需要進一步包含(h)骨形成蛋白(BMP)拮抗劑。
在又一相關態樣中，本發明係提供一種使 用本發明之單離方法獲得之非胚胎幹細胞之試管內培養物。在某些具體例中，該試管內培養物包含在標的培養基中，於與經致命性照射的飼養細胞及基底膜基質之群體接 觸下之經單離之單細胞或單細胞純系，該標的培養基係諸如包含下列者之培養基：(a)Notch促效劑；(b)ROCK(Rho激酶)抑制劑；(c)骨形成蛋白(BMP)拮抗劑；(d)Wnt促效劑；(e)有絲分裂生長因子；以及(f)胰島素或IGF；該培養基視需要進一步包含下列者之至少一種：(g)TGF β傳訊路徑抑制劑(諸如TGF β抑制劑或TGF β受體抑制劑)；以及(h)菸鹼醯胺、或其類似物、前驅物或模擬物。
或者，本發明係提供一種使用本發明之單 離方法獲得之非胚胎幹細胞之試管內培養物。在某些具體例中，該試管內培養物包含在標的培養基中，於與經致命性照射的飼養細胞及基底膜基質之群體接觸下之經單離之單細胞或單細胞純系，該標的培養基係諸如包含下列者之培養基：(a)Notch促效劑；(b)ROCK(Rho激酶)抑制劑；(c)TGF β傳訊路徑抑制劑(諸如TGF β抑制劑或TGF β受體抑制劑)；(d)Wnt促效劑；(e)菸鹼醯胺、或其類似物、前驅物或模擬物；(f)有絲分裂生長因子；以及(g)胰島素或IGF；該培養基視需要進一步包含(h)骨形成蛋白(BMP)拮抗劑。
在某些具體例中，該非胚胎組織為立方狀 或柱狀上皮組織。在某些具體例中，該非胚胎組織並非為分層上皮組織，諸如皮膚。在某些具體例中，該非胚胎組織係來自成體肺臟。
本發明之單離及培養非胚胎幹細胞之方法係於以下第2章節(獲得及/或培養幹細胞之方法)中進一步 詳述。
於本文中使用時，“非胚胎幹細胞”包括單離自成體組織或器官之成體幹細胞、以及單離自產前組織或器官之胎兒幹細胞。
在某些具體例中，本文中所述本發明之方法係自成體組織或器官單離成體幹細胞。
在相關具體例中，本文中所述本發明之方法係自胎兒或產前組織或器官單離胎兒幹細胞。在某些具體例中，當胎兒組織或器官為幹細胞之來源時，本發明之方法並不會破壞胚胎或以其他方式損害胚胎的正常發育，尤其是當胚胎為人類胚胎時。在其他具體例中，胎兒組織之來源係得自流產胚胎、死亡胚胎、浸軟胎兒物質、或自該等切除之細胞、組織或器官。
獲得胎兒組織之方法係該項技術領域中所熟知者。舉例而言，在人類中，已在數種人類失調中嘗試進行人類胎兒組織移植，該等人類失調包括帕金森氏症(Parkinson’s disease)、糖尿病、嚴重合併性免疫缺失疾病、狄喬治症候群(DiGeorge syndrome)、再生不良性貧血、白血病、地中海貧血、法布瑞氏症(Fabry’s disease)、及高雪氏症(Gaucher’s disease)。就免疫缺失失調而言，已達成免疫功能之修復及長期患者存活率(參見Joint Report of the Council on Ethical and Judicial Affairs and the Council on Scientific Affairs,A-89,Medical Applications of Fetal Tissue Transplantation)。
本發明之方法可應用於含有非胚胎幹細胞之任何動物組織，包括來自人類、非人類哺乳類、非人類靈長類、齧齒類(包括但不限於小鼠、大鼠、雪貂、倉鼠、天竺鼠、兔)、家畜動物(包括但不限於豬、牛、綿羊、山羊、馬、駱駝)、鳥類、爬蟲類、魚類、寵物或其他陪伴動物(例如貓、狗、鳥)、或其他脊椎動物等之組織。
該非胚胎組織可得自或源於動物之任何部分，包括但不限於胃、小腸、結腸、腸化生、輸卵管、腎臟、胰臟、膀胱、食道、或肝臟、或其部分/片段。
在某些具體例中，該非胚胎組織係得自包含上皮組織之組織。在某些具體例中，該非胚胎組織係得自胃腸道。
在某些具體例中，該非胚胎組織係得自組織或器官之一部分。舉例而言，該非胚胎組織可單離自小腸之十二指腸部分、或小腸之空腸部分、或小腸之迴腸部分。該非胚胎組織亦可單離自大腸之盲腸部分、或大腸之結腸部分、或大腸之乙狀結腸、或大腸之直腸部分。該非胚胎組織可單離自胃之大彎部、小彎部、胃角切跡、賁門、主體、底部、幽門、幽門竇、或幽門管。該非胚胎組織可進一步單離自肺之上呼吸道、或遠端呼吸道。
在某些具體例中，該非胚胎組織係單離自健康或正常個體。
在某些具體例中，該非胚胎組織係單離自疾病組織(例如受疾病所影響之組織)、失調組織(例如受失 調所影響之組織)、或在其他方面具有異常狀況之組織。
於本文中使用時，用語“疾病”包括影響 組織主體之異常或醫療狀況，且經常與特定症狀及徵象相關。疾病可由外部因子(諸如感染性疾病)、或由內部功能異常(諸如自體免疫疾病)所引起。在廣義上，“疾病”亦可包括對承受的個人引起疼痛、功能異常、心理痛苦、社交問題、或死亡，或對與該個人接觸者引起類似問題之任何狀況。在此廣義中，其可包括結構及功能之損害、失能、失調、症候群、感染、單獨症狀、偏差行為、及非典型變異，而在其他場合中及為了其他目的，可將此等視為可區別的種類。
用語“失調”包括功能異常或錯亂，諸如 精神失調、身體失調、遺傳失調、情緒及行為失調、以及功能失調、或並非由感染性有機物所引起之身體失調，諸如代謝失調。如此，疾病、失調、及其他異常狀況之概念並不一定互相排斥。
在某些具體例中，該非胚胎組織係單離自 具有疾病、失調、或在其他方面之異常狀況之個體，儘管該非胚胎組織本身可能並未受到該疾病、失調、或異常狀況傷害。舉例而言，該非胚胎組織可單離自具有肺癌之患者，但來自並非已受到肺癌傷害之肺的健康部分。在某些具體例中，該非胚胎組織可鄰近或遠離疾病、失調、或異常組織。
在某些具體例中，該非胚胎組織係單離自 依據例如個體之基因組成、家族史、生活方式選擇(例如抽煙、節食、運動習慣)，而預先傾向於會發展出疾病、失調、或在其他方面之異常狀況、或具有發展出該疾病、失調、或在其他方面之異常狀況之高風險之個體，儘管該個體尚未發展出該疾病、失調、或在其他方面之異常狀況，或顯現該疾病、失調、或在其他方面之異常狀況之可檢測的症狀。
本發明之方法可用於自具有任何疾病、失 調、或異常狀況之對象之組織或器官單離非胚胎幹細胞，無論該疾病、失調、或異常狀況之類型、嚴重度、級別或階段。疾病、失調、或異常狀況之代表清單包含但不限於感染性疾病、接觸傳染性疾病、食源性疾病、食源性疾病或食物中毒、由病原細菌、毒素、病毒、病原性蛋白顆粒(prion)或寄生生物所引起之疾病、傳染性疾病、非傳染性疾病、空氣傳染性疾病、生活方式疾病、精神失調、器官性疾病、腺瘤、上皮癌、腺癌、癌腫、固體腫瘤、血液疾病、發炎性腸病(例如克隆氏症、潰瘍性結腸炎)、潰瘍、胃病、胃炎、食道炎、膀胱炎、絲球體腎炎、多囊性腎臟疾病、胰臟炎、肝炎、發炎性失調(例如第I型糖尿病、糖尿病性腎臟病變)、囊腫纖維化、及自體免疫失調。
在某些具體例中，該癌腫為卵巢癌、胰臟 癌(諸如胰臟管腺癌)、肺癌(諸如肺腺癌)、或胃癌(諸如胃腺癌)。在某些具體例中，該癌腫係來自人類患者(例如來自患者之經手術切除之癌腫、或來自患者之活體組織切 片)、或來自使用人類癌細胞系或原發癌細胞之生長於免疫抑制動物(例如小鼠)中之異種移植瘤。
本發明之另一態樣係提供一種根據任一種 本發明之方法而單離出之非胚胎幹細胞、或其試管內培養物。
舉例而言，該非胚胎幹細胞可為成體或胎 兒幹細胞。該非胚胎幹細胞可單離自人類，或來自上述非人類動物、哺乳類、脊椎動物之任一者。該非胚胎幹細胞可單離自動物之任何部位，包括但不限於胃、小腸、結腸、腸化生、輸卵管、腎臟、胰臟、膀胱、食道、或肝臟、或其部分/片段，包括上述者。該非胚胎幹細胞可單離自健康個體、或者受到疾病、失調、或在其他方面之異常狀況傷害或預先傾向於會演變成發展出疾病、失調、或在其他方面之異常狀況之高風險之個體。
在又一態樣中，本發明係進一步提供一種 純系化非胚胎幹細胞之單細胞純系、或其試管內培養物，其中，在該單細胞純系中，至少約40%、50%、60%、70%、或約80%之細胞，當以單細胞之形式予以單離時，能夠增殖而產生單細胞純系。
各單細胞純系，依生長階段及其他生長條 件，可包含至少約10、100、103、104、105、106或更多細胞。
在相關態樣中，本發明係提供一種經單離 非胚胎幹細胞之單細胞純系、或其試管內培養物，其中， 該非胚胎幹細胞，當以單細胞之形式予以單離時，能夠自我更新超過約50代、70代、100代、150代、200代、250代、300代、350代、或約400或更多代。
在相關態樣中，本發明係提供一種經單離 非胚胎幹細胞之單細胞純系、或其試管內培養物，其中，該非胚胎幹細胞能夠分化成非胚胎組織之經分化細胞型，該非胚胎組織係單離出該非胚胎幹細胞之非胚胎組織、或該非胚胎幹細胞所在之非胚胎組織。
在相關態樣中，本發明係提供一種經單離 非胚胎幹細胞之單細胞純系、或其試管內培養物，其中，該非胚胎幹細胞表現選自：SOX9、KRT19、KRT7、LGR5、CA9、FXYD2、CDH6、CLDN18、TSPAN8、BPIFB1、OLFM4、CDH17、及PPARGC1A之一或多種幹細胞標記。
在相關態樣中，本發明係提供一種小腸幹 細胞之單細胞純系、或其試管內培養物，其表現選自：OLFM4、SOX9、LGR5、CLDN18、CA9、BPIFB1、KRT19、CDH17、及TSPAN8之一或多種標記。
在相關態樣中，本發明係提供一種胃幹細 胞之單細胞純系、或其試管內培養物，其表現選自：SOX9、SOX2、CLDN18、TSPAN8、KRT7、KRT19、BPIFB1、及PPARGC1A之一或多種標記。
在相關態樣中，本發明係提供一種結腸幹 細胞之單細胞純系、或其試管內培養物，其表現選自：SOX9、OLFM4、LGR5、CLDN18、CA9、BPIFB1、KRT19、 及PPARGC1A之一或多種標記。
在相關態樣中，本發明係提供一種腸化生 幹細胞之單細胞純系、或其試管內培養物，其表現選自：SOX9、CDH17、HEPH及RAB3B之一或多種標記。
在相關態樣中，本發明係提供一種肝臟幹 細胞之單細胞純系、或其試管內培養物，其表現選自：SOX9、KRT19、KRT7、FXYD2、及TSPAN8之一或多種標記。
在相關態樣中，本發明係提供一種胰臟幹 細胞之單細胞純系、或其試管內培養物，其表現選自：SOX9、KRT19、KRT7、FXYD2、CA9、CDH6、PDX1及ALDH1A1之一或多種標記。
在相關態樣中，本發明係提供一種腎臟幹 細胞之單細胞純系、或其試管內培養物，其表現選自：KRT19、KRT7、FXYD2、及CDH6之一或多種標記。
在相關態樣中，本發明係提供一種輸卵管 幹細胞之單細胞純系、或其試管內培養物，其表現選自：ZFPM2、CLDN10、及PAX8之一或多種標記。
在某些具體例中，該試管內培養物包含本發明之培養基(例如，如下述之本發明之經改良培養基)。參見記載本發明之培養基之以下章節，其中所述之各培養基係以參考資料之方式併入本文中。
在某些具體例中，該非胚胎幹細胞能夠分化成該非胚胎組織之經分化細胞型。舉例而言，本發明之 經單離小腸幹細胞可分化成在小腸中通常被發現之一或多種細胞型，諸如腸細胞(最豐富的細胞型，吸收水及養分)、杯形細胞(次要的細胞型並分泌黏液)、腸內分泌細胞(分泌腸激素)、及潘氏細胞(分泌抗菌物質)。本發明之經單離上呼吸道幹細胞可分化成在肺之上呼吸道中通常被發現之一或多種細胞型，諸如纖毛細胞及杯形細胞。本發明之經單離肺幹細胞可分化成在肺上皮中通常被發現之一或多種細胞型，諸如第I型及第II型肺泡壁細胞。
在某些具體例中，該非胚胎幹細胞能夠分 化成類似於在此種非胚胎幹細胞所源自之組織中被發現之結構或次結構的組織化結構。舉例而言，本發明之經單離小腸幹細胞可分化成類似於小腸道之經微絨毛覆蓋之表面的腸樣組織結構。腸樣組織結構之一種特徵功能為此等經分化小腸細胞可形成表現絨毛蛋白及涉及吸收功能之多種酶(包括蔗糖酶-異麥芽糖酶、乳糖酶、麥牙糖酶-葡萄糖澱粉酶、丙胺醯基胺基肽酶)之刷狀緣。
在某些具體例中，該非胚胎幹細胞實質上 缺乏與在該非胚胎組織中經分化細胞型相關之標記之表現。舉例而言，在某些具體例中，該非胚胎幹細胞為小腸幹細胞，且缺乏與經分化小腸細胞相關之某些蛋白質標記之表現，該蛋白質標記係選自黏蛋白/MUC或PAS(杯形細胞標記)、染色顆粒素A/CHGA(神經內分泌細胞標記)、溶菌酶/LYZ(潘氏細胞標記)、MUC7、MUC13、及KRT20。
在某些具體例中，該非胚胎幹細胞具有未 成熟且未經分化形態，該形態之特徵為小圓細胞形狀且具有高的細胞核對細胞質比例。參見例如在培養中顯現出類似形態之各種經單離成體幹細胞純系。
在再一態樣中，本發明係提供一種用於單 離及/或培養非胚胎幹細胞之培養基，該培養基包含：(a)Notch促效劑；(b)ROCK(Rho激酶)抑制劑；(c)骨形成蛋白(BMP)拮抗劑；(d)Wnt促效劑；(e)有絲分裂生長因子；以及(f)胰島素或IGF。
在某些具體例中，該培養基進一步包含下 列者之至少一種：(g)TGF β傳訊路徑抑制劑，諸如TGF β抑制劑或TGF β受體抑制劑；以及(h)菸鹼醯胺、或其前驅物、類似物、或模擬物。
在相關態樣中，本發明係提供一種用於單 離及/或培養非胚胎幹細胞之培養基，該培養基包含：(a)Notch促效劑；(b)ROCK(Rho激酶)抑制劑；(c)TGF β傳訊路徑抑制劑(例如TGF β抑制劑或TGF β受體抑制劑)；(d)Wnt促效劑；(e)菸鹼醯胺、或其前驅物、類似物、或模擬物；(f)有絲分裂生長因子；以及(g)胰島素或IGF。
在某些具體例中，該培養基進一步包含(h)骨形成蛋白(BMP)拮抗劑。
本發明之各種培養基及其成分係記載於第3章節(培養基)及相關第4章節(代表性培養基因子之蛋白質序列)。特定而言，本發明之培養基之各種具體例包括詳述於此等章節及說明書其他部分之任何具體例。
本發明之進一步態樣係提供一種治療具有 疾病、失調、或異常狀況且需要治療之對象之方法，其包含：(1)使用任一種本發明之方法，自該對象中與受該疾病、失調、或異常狀況所影響之組織相對應的組織中單離非胚胎(例如成體)幹細胞；(2)在該成體幹細胞中改變至少一基因之表現而產生經改變成體幹細胞；(3)將該經改變成體幹細胞或其純系擴增物再次引進至該對象中，其中，該對象中，該疾病、失調、或異常狀況之至少一種不良效應或症狀被減輕。
舉例而言，該方法之步驟(2)可藉由將增加 或減少在經單離成體幹細胞中之目標基因之表現的外源DNA或RNA引進至成體幹細胞中而達成。可使用任何該項技術領域中所公認的分子生物學技術，例如在試管內或在活體外(ex vivo)改變細胞中之基因表現。此等方法可包括但不限於藉由以病毒或非病毒為基礎之載體的轉染或感染，該載體可編碼在目標細胞中功能異常或缺失之蛋白質或其功能片段之編碼序列、或可編碼使目標基因之功能中斷之RNA(反義RNA、siRNA、miRNA、shRNA、核糖酶等)。
在近期研究中，Marvilio等人(Nature Medicine 12(12)：1397-1402,2006)報告在患者中之交界水疱型表皮溶解症(非致命性皮膚失調)係藉由單離自相同患者之經基因修飾成體表皮幹細胞的移植而進行治療。該成體幹細胞係(使用不同方法)單離自患者之相對健康區域(即手掌)，於該處仍可重新取得成體幹細胞。該基因修飾 涉及利用外源性地表現患者中缺失之基因之反轉錄病毒載體將經單離成體幹細胞進行感染。接著將如此製備之經基因修正培養之表皮植片移植至患者身體之手術準備區。觀察到正常程度的功能性轉殖基因之合成及適宜的聚集，連同牢固黏附的表皮之發展，其在起泡、感染、發炎或免疫反應不存在下於後續期間(1年)保持穩定。
在某些具體例中，單離出該成體幹細胞之 組織係來自健康對象。較佳地，該健康對象係與需要治療之對象呈HLA型配對。
在某些具體例中，單離出該成體幹細胞之 組織係來自該對象，且該經單離成體幹細胞相對於該對象而言為自體性(autologous)。
在某些具體例中，單離出該成體幹細胞之組織係受該疾病、失調、或異常狀況所影響之受影響組織。
在某些具體例中，單離出該成體幹細胞之組織係鄰近於受該疾病、失調、或異常狀況所影響之受影響組織。
在某些具體例中，至少一基因在該對象中之受該疾病、失調、或異常狀況所影響之組織中係表現不足，且該至少一基因之表現在該經改變成體幹細胞中係增加。
在某些具體例中，至少一基因在該對象中之受該疾病、失調、或異常狀況所影響之組織係過度表現，且該至少一基因之表現在該經改變成體幹細胞中係減少。
在另一態樣中，本發明亦提供一種篩選化合物之方法，該方法包含：(1)使用任一種本發明之方法，自對象單離成體幹細胞(包括癌幹細胞)；(2)經由單細胞純系擴增產生該成體幹細胞之細胞系；(3)使來自該細胞系之測試細胞與複數種候選化合物接觸；以及(4)鑑定出在該測試細胞中會產生預定表型改變之一或多種化合物。
本發明之此篩選方法可用於目標鑑定及驗證。舉例而言，自需要治療之患者單離的成體幹細胞中之可能目標基因可功能異常地(過度表現或表現不足)而造成與疾病、失調、或異常狀況相關之表型。可將使用本發明之方法單離之成體幹細胞之純系擴增依循本發明之篩選方法來測試一連串可能的化合物(小分子化合物等)，以鑑定出可修正、減輕、或反轉該表型之一或多種化合物。
在另一具體例中，成體幹細胞可單離自需要治療之患者，諸如來自受疾病、失調、或異常狀況影響之組織。可將使用本發明之方法單離之成體幹細胞之純系擴增依循本發明之篩選方法來測試一連串可能的化合物(小分子化合物、或任何以RNA為基礎之拮抗劑，諸如siRNA之集合庫等)，以鑑定出可修正、減輕、或反轉該表型之一或多種化合物。受到有效化合物影響之目標基因可進一步藉由例如微陣列、RNA定序、或以PCR為基礎之表現圖譜分析進行鑑定。
使用本發明之方法單離之成體幹細胞及其純系擴增可進一步用於毒理學篩選或研究，使得任何毒理 學分析及測試可配合設定成接受某種藥物或醫學干預之個體患者。
使用本發明之方法單離之成體幹細胞及其 純系擴增亦可用於再生醫學，其中自體幹細胞或單離自HLA型配對健康捐贈者之幹細胞可在試管內、在活體外、或在活體內被誘發而分化成組織或器官，以治療現有的狀況或預防/延遲此種狀況發展。此種幹細胞可在誘發分化前進行遺傳操作。
使用本發明之方法單離之成體幹細胞及其 純系擴增可用於試管內或活體內疾病模型。舉例而言，經單離上呼吸道幹細胞可在空氣-液體交界面(ALI)被誘發分化以產生上呼吸道上皮樣結構，其可用於本文中所述之任何篩選方法。經單離成體幹細胞(例如來自人類者)亦可引進至SCID或裸小鼠或大鼠以建立適於在活體內進行之方法(如本發明之篩選方法)之人源化疾病模型。
參見第1圖之標的幹細胞之代表性數種用途。
2.獲得及/或培養幹細胞之方法
本發明之一態樣係關於一種自非胚胎組織單離非胚胎幹細胞之方法，大致如上所述。
特定而言，該方法之一步驟包含將來自該非胚胎組織之分離細胞(諸如分離立方狀上皮細胞)，於與第一群經致命性照射的飼養細胞及細胞外基質(例如基底膜基質)接觸下培養，以形成上皮細胞純系。
在某些具體例中，該(上皮)細胞係經由利用酶進行酶分解而自該非胚胎組織分離，該酶包括但不限於膠原酶、蛋白酶、分散酶、鏈黴蛋白酶、彈性蛋白酶、透明質酸酶、細胞分離酶及/或胰蛋白酶之任一種或多種。
此等酶或功能等效物係該項技術領域中所熟知者，且在幾乎所有例子中皆為市售可得。
在其他具體例中，該(上皮)細胞可經由溶解環繞該(上皮)細胞之細胞外基質而自該非胚胎組織分離。一種適於本發明之此具體例之試劑包括由BD Biosciences(聖荷西，美國加利福尼亞州)以BDTM細胞回收溶液(BD型號354253)銷售之非酶性專有溶液，其容許培養於BD MATRIGELTM基底膜基質之細胞的回收，以用於後續生物化學分析。
在某些具體例中，該飼養細胞可包含某些經致命性照射的纖維母細胞，諸如鼠3T3-J2細胞。飼養細胞可在基底膜基質之上形成飼養細胞層。
適合的3T3-J2細胞純系係該項技術領域中所熟知者(參見例如Todaro及Green，“Quantitative studies of the growth of mouse embryo cells in culture and their development into established lines.”J.Cell.Biol.17：299-313,1963)，且已可公開取得。舉例而言，Waisman Biomanufacturing(麥迪遜，美國威斯康辛州)販售根據cGMP準則產生及測試之經照射之3T3-J2飼養細胞。此等細胞係在材料轉移協議下最初得自Howard Green博士實驗 室，並根據供應者，具備足以支持例如皮膚基因療法及傷口癒合臨床試驗之品質。亦根據供應者，各瓶3T3細胞含有在完全符合規定的無塵室中製造之最少3×106個細胞，且經認證不含黴漿菌且具低內毒素。此外，該細胞集合庫已針對外來劑(包括鼠病毒)而被完整測試。此等細胞已針對角質細胞培養支持體進行篩選且不含絲裂黴素C。
本發明之方法係提供一種飼養細胞之用途，諸如鼠纖維母細胞之3T3-J2純系。一般而言，不限定於任何特定表型，飼養細胞層常用於支持幹細胞之培養，及/或抑制其分化。飼養細胞層係一般為與感興趣的細胞共同培養，且提供適於感興趣的細胞生長之表面的單層細胞。飼養細胞層提供感興趣的細胞可在其中生長之環境。飼養細胞常為有絲分裂失活(例如藉由(致命)照射或利用絲裂黴素C之處理)，以防止其增殖。
在某些具體例中，該飼養細胞係被適當地篩選且為GMP等級人類飼養細胞，例如足以支持本發明之臨床等級幹細胞者。參見Crook等人(Cell Stem Cell 1(5)：490-494,2007，以參考資料之方式併入)，在含有GMP品質FBS的培養基中生長之GMP等級人類飼養細胞。
在某些具體例中，該飼養細胞可由幹細胞中缺乏的標記所標定，使得幹細胞可輕易地自飼養細胞中進行區別並單離。舉例而言，飼養細胞可被建造成表現螢光標記，諸如GFP或其他類似螢光標記。經螢光標定之飼養細胞可使用例如FACS分選而自幹細胞中單離。
可使用該項技術領域中已知的數種物理分離方法中之任一者將本發明之幹細胞自飼養細胞中分離。此種物理方法，除了FACS，可包括基於專一性地表現標記之各種免疫親和方法。舉例而言，本發明之幹細胞可依據其所表現之特定幹細胞標記，使用對此種標記具專一性之抗體而進行單離。
於一具體例中，本發明之幹細胞可藉由利用抗體(例如抗此等標記之一者)之FACS而進行單離。螢光活化細胞分選(FACS)可用於檢測具有特定細胞型或族系之特徵的標記。如熟習該項技術領域者所清楚瞭解，此可經由經螢光標定之抗體、或經由對初級抗體具有結合專一性的經螢光標定之二級抗體而達成。適當螢光標定之實例包括但不限於FITC、Alexa Fluor® 488、GFP、CFSE、CFDA-SE、DyLight 488、PE、PerCP、PE-Alexa Fluor® 700、PE-Cy5(TRI-COLOR®)、PE-Cy5.5、PI、PE-Alexa Fluor® 750、及PE-Cy7。該螢光標記清單僅提供作為實例，並非意圖構成侷限。
熟習該項技術領域者將清楚瞭解，使用例如對幹細胞具專一性之抗體的FACS分析將提供經純化幹細胞群體。然而，在某些具體例中，較佳可藉由執行再一回合的使用一或多種其他可識別標記(諸如選擇抗飼養體者)之FACS分析來進一步純化細胞群體。
飼養細胞之使用對於某些競爭性方法而言係被視為不必要的，此乃由於飼養體之存在可能使彼等競 爭性方法中之細胞繼代複雜化。舉例而言，細胞必須在各繼代自飼養細胞中分離，且在各繼代需要新飼養細胞。此外，飼養細胞之使用可能導致由飼養細胞所造成之所欲細胞的污染。
然而，飼養層之使用並非必然為本發明之 缺點，原因在於本發明之經單離幹細胞能夠以單細胞之形式進行繼代，且事實上係較佳地以單細胞純系之形式進行繼代。如此，即使未消除，在繼代期間由飼養體所造成之污染的潛在風險係被最小化。
在某些具體例中，該基底膜基質為含層黏 蛋白之基底膜基質(例如MATRIGELTM基底膜基質(BD Biosciences))，較佳為生長因子減少型。
在某些具體例中，該基底膜基質不支持三 次元生長，或不會形成支持三次元生長所需要之三次元基質。如此，當塗佈基底膜基質時，經常不需要將基底膜基質以特定形狀或形式置於支持體上，諸如形成圓頂形狀或形式並在固化後保持此種形狀或形式，該形狀或形式可為支持三次元生長所需。在某些具體例中，該基底膜基質係均勻地分佈或分散於平坦表面或支持結構(諸如平坦底部組織培養盤或孔)。
在某些具體例中，首先將該基底膜基質解 凍並稀釋於冷(例如約0至4℃)飼養細胞生長培養基至適宜濃度(例如10%)，並在平坦表面進行塗佈及固化，諸如藉由在具有適當CO2含量(例如約5%)之組織培養保溫箱中 加溫至37℃。接著將經致命性照射的飼養細胞以適宜密度塗佈於固化基底膜基質之上，使得經固著之飼養細胞在基底膜基質之上形成次融合性或融合性飼養細胞層一整夜。 將飼養細胞培養於飼養細胞培養基，諸如包含下列者之培養基(例如3T3-J2生長培養基)：基礎組織培養基，其較佳具有高葡萄糖(例如約4.5g/L)、無L-麩醯胺酸、且無丙酮酸鈉(例如DMEM(Invitrogen型號11960；高葡萄糖(4.5g/L)、無L-麩醯胺酸、無丙酮酸鈉)、10%小牛血清(未受熱失活)、一或多種抗生素(例如1%青黴素-鏈黴素)、及L-麩醯胺酸(例如約1.5mM、或1至2mM、或0.5至5mM、或0.2至10mM、或0.1至20mM)。
在某些具體例中，首先將來自非胚胎組織 之分離細胞，於與經致命性照射的飼養細胞及基底膜基質接觸下，塗佈於促進非胚胎幹細胞之生長的本發明之培養基(簡稱為“經改良生長培養基”或“經改良培養基”)。 在某些具體例中，本發明之經改良培養基在基礎培養基中包含Notch促效劑、ROCK(Rho激酶)抑制劑、骨形成蛋白(BMP)拮抗劑、Wnt促效劑、有絲分裂生長因子；以及胰島素或IGF；且視需要，該培養基進一步包含下列者中之至少一者(一或二者)：TGF β傳訊路徑抑制劑(例如TGF β抑制劑或TGF β受體抑制劑)；以及菸鹼醯胺、或其類似物、前驅物(諸如菸鹼酸)、或模擬物。或者，在其他具體例中，本發明之經改良培養基在基礎培養基中包含Notch促效劑；ROCK(Rho激酶)抑制劑；Wnt促效劑；TGF β傳訊路 徑抑制劑(例如TGF β抑制劑或TGF β受體抑制劑)；菸鹼醯胺、或其類似物、前驅物(諸如菸鹼酸)、或模擬物；有絲分裂生長因子；以及胰島素或IGF，且視需要，該培養基進一步包含骨形成蛋白(BMP)拮抗劑。
例示性(非限制性)基礎及經改良培養基，包 括其中之成分或因子、其濃度範圍、因子之特定組合、或其變體，係於以下第3章節中進一步詳述。
根據本發明之方法，在標的經改良培養基 中培養來自來源組織之分離細胞數日(例如3至4日、或約10日)後，上皮細胞群落變得可被檢測到。
在某些具體例中，單細胞可藉由例如酶分 解而單離自此等上皮細胞群落。用於此目的適合的酶包括胰蛋白酶，諸如溫熱的0.25%胰蛋白酶(Invitrogen，型號25200056)。在某些具體例中，該酶分解係實質上完全，使得本質上在上皮細胞純系中之所有細胞變得自其他細胞中分離且變成單細胞。
在某些具體例中，該方法包含將經單離單 細胞(較佳在洗滌及再懸浮單細胞後)在經改良生長培養基中，於與經改良生長培養基中之第二群經致命性照射的飼養細胞及第二基底膜基質接觸下培養。視需要，在將單細胞塗佈於飼養細胞及基底膜基質前，可使經單離單細胞通過適宜尺寸(例如40微米)之細胞過濾器。
在某些具體例中，經改良生長培養基係定 期改變(例如每日一次，每2、3、或4日一次等)，直到經 單離單一幹細胞之單細胞純系或純系擴增形成。
在某些具體例中，可使用例如純系複製環 (cloning ring)單離單一群落之幹細胞。可將經單離幹細胞純系進行擴增而發展成家譜細胞系，即衍生自單一幹細胞之細胞系。
在某些具體例中，單一幹細胞可單離自單 一幹細胞之純系擴增，且可再次以單一幹細胞之形式進行繼代。
已顯示超過70%或甚至90%之培養中之經 單離腸幹細胞保持群落形成能力，暗示其為幹細胞。再者，在超過400次細胞分裂後，此等腸上皮幹細胞保持其多能性分化之能力，且可在空氣-液體交界面試驗中形成腸樣結構。
單離非胚胎幹細胞之方法的更詳細記載已於以下例示性實施例1至5中進一步詳述。此等實例之細節亦構成相關於標的單離方法之概論的本章節之一部分。
3.培養基
本發明係提供用於標的幹細胞之單離、培養、及/或分化之各種細胞培養基，包含對其添加數種因子以產生經改良培養基之基礎培養基。首先於以下記載可添加至基礎培養基或經改良培養基中之因子。接著進一步詳述本發明之數種示範性基礎培養基及經改良培養基，以說明本發明之特定非限制性具體例。
BMP抑制劑
骨形成蛋白(BMP)呈二聚物配體結合至受 體複合物，該受體複合物係由兩個不同受體絲胺酸/蘇胺酸激酶，第I型及第II型受體所組成。第II型受體使第I型受體磷酸化，促成此受體激酶之活化。第I型受體隨後使特定受體受質(諸如SMAD)磷酸化，促成導致轉錄活性之訊息傳遞路徑。
於本文中使用時，BMP抑制劑包括經由其 受體抑制BMP傳訊之製劑。於一具體例中，BMP抑制劑結合至BMP分子以形成複合物，使得BMP活性藉由例如防止或抑制BMP分子結合至BMP受體而被抵銷(neutralized)。此種BMP抑制劑之實例可包括對於BMP配體具專一性之抗體、或其抗原結合部分。此種BMP抑制劑之其他實例包括BMP受體之顯性負突變體，諸如結合BMP配體並防止配體結合至在細胞表面的天然BMP受體之可溶性BMP受體。
或者，BMP抑制劑可包括作用為拮抗劑或 反轉促效劑之製劑。此類型之抑制劑與BMP受體結合並防止BMP結合至受體。此種製劑之實例為專一性地結合BMP受體並防止BMP結合至抗體結合型BMP受體之抗體。
在某些具體例中，相對於在抑制劑不存在 下之BMP活性之程度，BMP抑制劑抑制細胞中之BMP依賴型活性到達至多90%、至多80%、至多70%、至多50%、至多30%、至多10%、或約0%(接近完全抑制)。如熟習該項技術領域者所知，BMP活性可藉由例如Zilberberg等人 (“A rapid and sensitive bioassay to measure bone morphogenetic protein activity”BMC Cell Biology 8：41,2007，以參考資料之方式併入本文中)所例示般量測BMP之轉錄活性而予以測定。
已知有數種類別之天然BMP結合型蛋白 質，包括頭蛋白(Peprotech)、索蛋白、及包含索蛋白結構域之索蛋白樣蛋白質(R&D systems)、卵泡抑素及包含卵泡抑素結構域之卵泡抑素相關蛋白質(R&D systems)、DAN及包含DAN胱胺酸結節結構域之DAN樣蛋白質(例如賽伯洛斯蛋白及格雷姆林蛋白)(R&D systems)、硬化蛋白/SOST(R&D systems)、核心蛋白聚醣(R&D systems)、及α-2巨球蛋白(R&D systems)、或如美國專利第8,383,349號中所述者。
用於本發明之方法之示範性BMP抑制劑係 選自頭蛋白、DAN、及DAN樣蛋白質(包括賽伯洛斯蛋白及格雷姆林蛋白(R&D systems))。此等可擴散型蛋白質能夠利用各種不同程度的親和性結合BMP配體，並抑制BMP接近傳訊受體。
若有需要，可將任何上述BMP抑制劑單獨或組合添加至標的培養基(culture medium)中。
在某些具體例中，BMP抑制劑為頭蛋白。頭蛋白可以至少約10ng/mL、或至少約20ng/mL、或至少約50ng/mL、或至少約100ng/mL(例如100ng/mL)之濃度添加至個別培養基中。
在某些具體例中，本文中所提及之任何特 定BMP抑制劑，諸如頭蛋白、索蛋白、卵泡抑素、DAN、賽伯洛斯蛋白、格雷姆林蛋白、硬化蛋白/SOST、核心蛋白聚醣、及α-2巨球蛋白，可被天然、合成、或重組產生之保留至少約80%、85%、90%、95%、99%之個別BMP抑制活性之同源物或其片段、及/或藉由依據全球比對技術(例如Needleman-Wunsch演算法)或地區比對技術(例如Smith-Waterman演算法)之任何該項技術領域中所公認的序列比對軟體量測時共有至少約60%、70%、80%、90%、95%、97%、99%胺基酸序列相同度之同源物或其片段所置換。
本文中所提及之代表性BMP抑制劑之序列係示於SEQ ID NO.1至9。
在標的幹細胞之培養期間，BMP抑制劑可每日、每2日、每3日、或每4日添加至培養基中，而培養基係在適當時每日、每2日、每3日、或每4日更新。
Wnt促效劑
Wnt傳訊路徑係藉由當Wnt蛋白質配體結合至Frizzled受體家族成員之細胞表面受體時發生之一系列事件所界定。此促成抑制包括體軸抑制蛋白(axin)、GSK-3、及蛋白質APC之蛋白質複合物降解細胞內β-鏈蛋白的Dishevelled(Dsh)家族蛋白質之活化。所得富含之核β-鏈蛋白係藉由TCF/LEF家族轉錄因子增進轉錄作用。
於本文中使用時，“Wnt促效劑”包括在細 胞中直接或間接活化TCF/LEF媒介的轉錄作用之製劑，諸如經由調控在Wnt傳訊級聯反應中之任一蛋白質/基因的活性(例如增進Wnt傳訊路徑之正向調節子的活性、或抑制Wnt傳訊路徑之負向調節子的活性)。
Wnt促效劑係選自結合並活化Frizzled受體家族成員之真實Wnt促效劑，包括任何及所有Wnt家族蛋白質、細胞內β-鏈蛋白降解抑制劑、及TCF/LEF活化劑。相對於在Wnt促效劑不存在下之Wnt活性之程度，Wnt促效劑可刺激細胞中Wnt活性至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約50%、至少約70%、至少約90%、至少約100%、至少約2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、或1000倍、或更多。如熟習該項技術領域者所知，Wnt活性可藉由量測Wnt之轉錄活性而予以測定，例如藉由pTOPFLASH及pFOPFLASH Tcf螢光素酶報告子構築體(參見Korinek等人，Science 275：1784-1787,1997，以參考資料之方式併入本文中)。
代表性Wnt促效劑可包含分泌型醣蛋白，包括Wntl/Int-1、Wnt-2/Irp(Int-1相關蛋白質)、Wnt-2b/13、Wnt-3/Int-4、Wnt-3a(R&D systems)、Wnt-4、Wnt-5a、Wnt-5b、Wnt-6(Kirikoshi等人，Biochem.Biophys.Res.Com.,283：798-805,2001)、Wnt-7a(R&D systems)、Wnt-7b、Wnt-8a/8d、Wnt-8b、Wnt-9a/14、Wnt-9b/14b/15、Wnt-10a、Wnt-10b/12、Wnt-11、及Wnt-16。人類Wnt蛋白質之概述係呈供於“The Wnt Family of Secreted Proteins,”R&D Systems Catalog,2004(以參考資料之方式併入本文中)。
另外的Wnt促效劑包括分泌型蛋白質之R-底板反應蛋白家族，其係牽涉於Wnt傳訊路徑之活化及調節，且其包含至少4個成員，即R-底板反應蛋白1(NU206，Nuvelo，聖卡洛斯，美國加利福尼亞州)、R-底板反應蛋白2(R&D systems)、R-底板反應蛋白3、及R-底板反應蛋白4。Wnt促效劑亦包括諾里蛋白(亦稱為諾里病蛋白質(Norrie Disease Protein)蛋白質或NDP)(R&D systems)，其係以高親和性結合至Frizzled-4受體並誘發Wnt傳訊路徑之活化而發揮與Wnt蛋白質相似的作用之分泌型調節蛋白質(Kestutis Planutis等人，BMC Cell Biol.8：12,2007)。
Wnt促效劑進一步包括Wnt傳訊路徑之小分子促效劑，下述結構之胺基嘧啶衍生物(N4-(苯并[d][1,3]二氧雜環戊烯-5-基甲基)-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶-2,4-二胺)，如Liu等人(Angew Chem.Int.Ed.Engl.44(13)：1987-1990,2005，以參考資料之方式併入本文中)所述。
GSK-抑制劑包含小干擾RNA(siRNA，細胞傳訊)、鋰(Sigma)、肯保羅酮(kenpaullone)(Biomol International，Leost等人，Eur.J.Biochem.267：5983-5994,2000)、6-溴靛玉紅-30-丙酮肟(Meyer等人，Chem.Biol. 10：1255-1266,2003)、SB 216763、及SB 415286(Sigma-Aldrich)、以及預防GSK-3與體軸抑制蛋白的交互作用之FRAT家族成員及FRAT衍生胜肽。概述係呈供於Meijer等人(Trends in Pharmacological Sciences 25：471-480,2004，以參考資料之方式併入本文中)。用於測定GSK-3抑制程度之方法及試驗係該項技術領域中已知者，且可包含例如，如Liao等人(Endocrinology 145(6)：2941-2949,2004，以參考資料之方式併入本文中)所述之方法及試驗。
在某些具體例中，Wnt促效劑係選自：Wnt 家族成員、R-底板反應蛋白1至4(諸如R-底板反應蛋白1)、諾里蛋白、Wnt3a、Wnt-6、及GSK-抑制劑中之一或多者。
在某些具體例中，該Wnt促效劑包含或由 R-底板反應蛋白1所組成。R-底板反應蛋白1可以至少約50ng/mL、至少約75ng/mL、至少約100ng/mL、至少約125ng/mL、至少約150ng/mL、至少約175ng/mL、至少約200ng/mL、至少約300ng/mL、至少約500ng/mL之濃度添加至標的培養基中。在某些具體例中，R-底板反應蛋白1係約125ng/mL。
在某些具體例中，本文中所提及之任何以 特定蛋白質為基礎之Wnt促效劑，諸如R-底板反應蛋白1至R-底板反應蛋白4、任何Wnt家族成員等，可被天然、合成、或重組產生之保留至少約80%、85%、90%、95%、99%之個別Wnt促效劑活性之同源物或其片段、及/或藉由 依據全球比對技術(例如Needleman-Wunsch演算法)或地區比對技術(例如Smith-Waterman演算法)之任何該項技術領域中所公認的序列比對軟體量測時共有至少約60%、70%、80%、90%、95%、97%、99%胺基酸序列相同度之同源物或其片段所置換。
本文中所提及之代表性Wnt促效劑之序列係示於SEQ ID NO.10至17。
在標的幹細胞之培養期間，Wnt家族成員可每日、每2日、每3日添加至培養基中，而培養基係例如每1、2、3、4、5、或更多日更新。
在某些具體例中，Wnt促效劑係選自下列者所組成之群組：R-底板反應蛋白、Wnt-3a及Wnt-6、或其組合。在某些具體例中，R-底板反應蛋白及Wnt-3a係共同使用作為Wnt促效劑。在某些具體例中，R-底板反應蛋白濃度為約125ng/mL，而Wnt3a濃度為約100ng/mL。
有絲分裂生長因子
適於本發明之有絲分裂生長因子可包括包含下列者之生長因子家族：表皮生長因子(EGF)(Peprotech)、轉形生長因子-α(TGF α，Peprotech)、基礎纖維母細胞生長因子(bFGF，Peprotech)、腦源性神經滋養因子(BDNF，R&D Systems)、及角質細胞生長因子(KGF，Peprotech)。
EGF為多種培養外胚層及中胚層細胞之強效有絲分裂因子，且在活體內及試管內對特定細胞、及在 細胞培養中對某些纖維母細胞之分化具有深遠的影響。EGF前驅物係以膜結合型分子之形式存在，其係經蛋白水解分裂而生成刺激細胞之53個胺基酸胜肽激素。EGF可以在1至500ng/mL之間之濃度添加至標的培養基中。在某些具體例中，在培養基中之最終EGF濃度為至少約1、2、5、10、20、25、30、40、45、或50ng/mL，且不高於約500、450、400、350、300、250、200、150、100、50、30、20ng/mL。在某些具體例中，最終EGF濃度為約1至50ng/mL、或約2至50ng/mL、或約5至30ng/mL、或約5至20ng/mL、或約10ng/mL。
相同濃度可用於FGF，諸如FGF10或FGF7。若使用超過一種FGF，例如FGF7及FGF10，上述FGF濃度可意指在培養基中使用之FGF的總濃度。
在某些具體例中，本文中所提及之任何特定有絲分裂生長因子，諸如EGF、TGF α、bFGF、BDNF、KGF等，可被天然、合成、或重組產生之保留至少約80%、85%、90%、95%、99%之個別有絲分裂生長因子活性之同源物或其片段、及/或藉由依據全球比對技術(例如Needleman-Wunsch演算法)或地區比對技術(例如Smith-Waterman演算法)之任何該項技術領域中所公認的序列比對軟體量測時共有至少約60%、70%、80%、90%、95%、97%、99%胺基酸序列相同度之同源物或其片段所置換。
本文中所提及之代表性有絲分裂生長因子 之序列係示於SEQ ID NO.18至27。
在標的幹細胞之培養期間，有絲分裂生長因子可每日、每2日添加至培養基中，而培養基係例如每1、2、3、4或5日更新。
可使用bFGF家族之任何成員。在某些具體例中，係使用FGF7及/或FGF10。FGF7亦稱為KGF(角質細胞生長因子)。在某些具體例中，係將有絲分裂生長因子之組合，諸如EGF與KGF、或EGF與BDNF，添加至標的培養基中。在某些具體例中，係將有絲分裂生長因子之組合，諸如EGF與KGF、或EGF與FGF10，添加至標的培養基中。
Rock(Rho-激酶)抑制劑
雖不希望受到任何特定理論所侷限，但Rock抑制劑之添加可預防失巢凋亡(anoikis)，尤其當培養單一幹細胞時。Rock抑制劑可為(R)-(+)-反式-4-(1-胺基乙基)-N-(4-吡啶基)環己烷甲醯胺二鹽酸鹽單水合物(Y-27632，Sigma-Aldrich)、5-(1,4-二氮雜環庚烷-1-基磺醯基)異喹啉(法舒地爾或HA1077，Cayman Chemical)、(S)-(+)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-異喹啉基)磺醯基]-六氫-1H-1,4-二氮呼二鹽酸鹽(H-1152，Tocris Bioscience)、及N-(6-氟-1H-吲唑-5-基)-2-甲基-6-側氧基-4-(4-(三氟甲基)苯基)-1,4,5,6-四氫吡啶-3-甲醯胺(GSK429286A，Stemgent)。
在某些具體例中，Y27632之最終濃度為約1至5μM、或2.5μM。
Rho-激酶抑制劑，例如Y-27632，可在培養幹細胞之首七日期間，每1、2、3、4、5、6、或7日添加至培養基中。
Notch促效劑
已顯示Notch訊息傳遞在細胞命運決定、以及細胞存活及增殖方面扮演重要的角色。Notch受體蛋白質可與數種表面結合型或分泌型配體進行交互作用，包括但不限於Jagged-1、Jagged-2、Delta-1或Delta樣1、Delta樣3、Delta樣4等。緊接在配體結合後，Notch受體係受到涉及ADAM蛋白酶家族之成員的一系列裂解事件、以及由γ-分泌酶早老素(gamma secretase presinilin)所調節之膜內裂解所活化。結果為Notch之細胞內結構域轉位(translocation)至細胞核，於該處其轉錄活化下游基因。
於本文中使用時，“Notch促效劑”包括相對於在Notch促效劑不存在下之Notch活性程度，在細胞中刺激Notch活性至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約50%、至少約70%、至少約90%、至少約100%、至少約3倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或更多之分子。如該項技術領域中所知，Notch活性可藉由例如經由Hsieh等人(Mol.Cell.Biol.16：952-959,1996，以參考資料之方式併入本文中)所述之4xwtCBF1-螢光素酶報告子構築體量測Notch之轉錄活性而予以測定。
在某些具體例中，該Notch促效劑係選自： Jagged-1、Delta-1及Delta樣4、或其活性片段或衍生物。在某些具體例中，該Notch促效劑為DSL胜肽(Dontu等人，Breast Cancer Res.,6：R605-R615,2004)，其具有胺基酸序列CDDYYYGFGCNKFCRPR(SEQ ID NO：30)。DSL胜肽(ANA spec)可以在10μM與100nM之間、或至少10μM且不高於100nM之濃度使用。在某些具體例中，Jagged-1之最終濃度為約0.1至10μM；或約0.2至5μM；或約0.5至2μM；或約1μM。
在某些具體例中，本文中所提及之任何特定Notch促效劑，諸如Jagged-1、Jagged-2、Delta-1及Delta樣4，可被天然、合成、或重組產生之保留至少約80%、85%、90%、95%、99%之個別Notch促效劑活性之同源物或其片段、及/或藉由依據全球比對技術(例如Needleman-Wunsch演算法)或地區比對技術(例如Smith-Waterman演算法)之任何該項技術領域中所公認的序列比對軟體量測時共有至少約60%、70%、80%、90%、95%、97%、99%胺基酸序列相同度之同源物或其片段所置換。
本文中所提及之代表性Notch促效劑之序列係示於SEQ ID NO.28至35。
在培養幹細胞之首1至2週，Notch促效劑可每1、2、3、或4日添加至培養基中。
菸鹼醯胺
本發明之培養基可另外補充有菸鹼醯胺、 或其類似物、前驅物或模擬物，諸如甲基-菸鹼醯胺、苯甲醯胺、吡 醯胺、胸腺嘧碇、或菸鹼酸。可將菸鹼醯胺添加至培養基中以達在1與100mM之間、在5與50mM之間、或較佳在5與20mM之間之最終濃度。舉例而言，可將菸鹼醯胺添加至培養基中以達大約10mM之最終濃度。亦可單獨或組合使用類似濃度之菸鹼醯胺類似物、前驅物、或模擬物。
在某些幹細胞培養中，添加TGF β受體抑制劑(參見下文)及/或菸鹼醯胺(單獨或組合)大大地增加培養中之幹細胞的自我更新能力。在菸鹼醯胺及/或TGF β受體抑制劑存在下，各群落中之細胞數目可顯著地增加，且細胞尺寸急遽地減小。
THG-β或TGF-β受體抑制劑
TGF-β訊息傳遞係涉及許多細胞功能，包括細胞生長、細胞命運及凋亡。訊息傳遞典型地以TGF-β超家族配體結合至第II型受體開始，第II型受體召集第I型受體並將其磷酸化。接著，第I型受體將SMAD磷酸化，SMAD係在細胞核中作用為轉錄因子並調節目標基因表現。或者，TGF-β訊息傳遞可例如經由p38 MAP激酶而活化MAP激酶傳訊路徑。
TGF-β超家族配體包含骨形成蛋白(BMP)、生長及分化因子(GDF)、抗穆勒氏激素(anti-Mullerian hormone，AMH)、活化素(activin)、諾達蛋白(nodal)及TGF-β。
於本文中使用時，TGF-β抑制劑包括減少 TGF-β傳訊路徑活性之製劑。已有許多該項技術領域中已知用於中斷TGF-β傳訊路徑的不同方式，可配合標的發明而使用其中任一者。舉例而言，TGF-β訊息傳遞可藉由下列方式中斷：藉由小干擾RNA策略抑制TGF-β表現；抑制弗林蛋白(furin)(TGF-β活化蛋白酶)；藉由生理抑制劑抑制該路徑，諸如藉由頭蛋白、DAN或DAN樣蛋白質抑制BMP；利用單株抗體中和TGF-β；利用TGF-β受體激酶1(亦稱為活化素受體樣激酶，ALK5)、ALK4、ALK6、ALK7或其他TGF-β相關受體激酶之小分子抑制劑進行抑制；藉由過度表現其生理抑制劑Smad 7、或藉由使用硫醇氧化還原蛋白(thioredoxin)作為Smad錨定子使Smad失去活化能力而抑制Smad 2及Smad 3訊息傳遞(Fuchs,Inhibition of TGF-β Singaling for the Treatment of Tumor Metastasis and Fibrotic Diseases.Current Signal Transduction Therapy 6(1)：29-43(15),2011)。
舉例而言，TGF-β抑制劑可以絲胺酸/蘇胺 酸蛋白質激酶作為標靶，該絲胺酸/蘇胺酸蛋白質係選自下列者：TGF-β受體激酶1、ALK4、ALK5、ALK7、或p38。 ALK4、ALK5及ALK7皆為TGF-β超家族之密切相關的受體。ALK4具有GI號碼(GI number)91；ALK5(亦稱為TGF-β受體激酶1)具有GI號碼7046；及ALK7具有GI號碼658。任一種此等激酶之抑制劑係有效減少任一種(或更多種)此等激酶之酶活性者。先前已顯示ALK及p38激酶之 抑制係關連到B細胞淋巴瘤(Bakkebo等人，“TGF-β-induced growth inhibition in B-cell lymphoma correlates with Smad 1/5 Signaling and constitutively active p38 MAPK,”BMC Immunol.11：57,2010)。
在某些具體例中，TGF-β抑制劑可結合至 Smad蛋白質並抑制其活性，該Smad蛋白質諸如R-SMAD或SMAD1至5(即SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD4或SMAD5)。
在某些具體例中，TGF-β抑制劑可結合至 Ser/Thr蛋白質激酶並減少其活性，該Ser/Thr蛋白質激酶係選自下列者：TGF-β受體激酶1、ALK4、ALK5、ALK7、或p38。
在某些具體例中，本發明之培養基包含 ALK5之抑制劑。
在某些具體例中，TGF-β抑制劑或TGF-β 受體抑制劑不包括BMP拮抗劑(即，係非為BMP拮抗劑之製劑)。
用於測定物質是否為TGF-β抑制劑之各種 方法係已知。舉例而言，可使用其中細胞係經驅動螢光素酶報告子基因之包含人類PAI-1啟動子或Smad結合位置的報告子構築體穩定轉染之細胞試驗。可使用螢光素酶活性相對於對照組之抑制度作為化合物活性之量測(De Gouville等人，Br.J.Pharmacol.145(2)：166-177,2005，以參考資料之方式併入本文中)。另一實例為用於量測激酶活 性之ALPHASCREEN®磷酸化感應子試驗(Drew等人，J.Biomol.Screen.16(2)：164-173,2011，以參考資料之方式併入本文中)。
用於本發明之TGF-β抑制劑可為蛋白質、 胜肽、小分子、小干擾RNA、反義寡核苷酸、適體(aptamer)、抗體或其抗原結合部分。抑制劑可為天然存在的或合成的。可用於本發明內容中之小分子TGF-β抑制劑之實例包括但不限於列於下表1之小分子抑制劑：
可將列於上表1之一或多種任意抑制劑、 或其組合用作標的發明中之TGF-β抑制劑。在某些具體例中，該組合可包括：SB-525334與SD-208與A83-01；SD-208與A83-01；或SD-208與A83-01。
熟習該項技術領域者將瞭解，存在有數種 其他小分子抑制劑，其主要被設計成以其他激酶作為標靶，但在高濃度下亦可抑制TGF-β受體激酶。舉例而言，SB-203580為p38 MAP激酶抑制劑，其在高濃度下(舉例而言，大約10μM或更多)可抑制ALK5。任何抑制TGF-β傳訊路徑之此等抑制劑亦可用於本發明中。
在某些具體例中，A83-01可以在10nM與 10μM之間、或在20nM與5μM之間、或在50nM與1μM之間之濃度添加至培養基中。在某些具體例中，A83-01可以約500nM添加至培養基中。在某些具體例中，A83-01可以在350至650nM之間、在450至550nM之間、或約500nM之濃度添加至培養基中。在某些具體例中，A83-01可以在25至75nM之間、在40至60nM之間、或約50nM之濃度添加至培養基中。
SB-431542可以在80nM與80μM之間、 或在100nM與40μM之間、或在500nM與10μM之間、或在1至5μM之間之濃度添加至培養基中。舉例而言，SB-431542可以約2μM添加至培養基中。
SB-505124可以在40nM與40μM之間、 或在80nM與20μM之間、或在200nM與1μM之間之 濃度添加至培養基中。舉例而言，SB-505124可以約500nM添加至培養基中。
SB-525334可以在10nM與10μM之間、或在20nM與5μM之間、或在50nM與1μM之間之濃度添加至培養基中。舉例而言，SB-525334可以約100nM添加至培養基中。
LY 364947可以在40nM與40μM之間、或在80nM與20μM之間、或在200nM與1μM之間之濃度添加至培養基中。舉例而言，LY 364947可以約500nM添加至培養基中。
SD-208可以在40nM與40μM之間、或在80nM與20μM之間、或在200nM與1μM之間之濃度添加至培養基中。舉例而言，SD-208可以約500nM添加至培養基中。
SJN 2511可以在20nM與20μM之間、或在40nM與10μM之間、或在100nM與1μM之間之濃度添加至培養基中。舉例而言，A83-01可以大約200nM添加至培養基中。
p38抑制劑
“p38抑制劑”可包括直接或間接負向地調節p38訊息傳遞之抑制劑，諸如結合至至少一種p38同型異構物並減少其活性之製劑。p38蛋白質激酶(參見GI號碼1432)為有絲分裂原活化蛋白質激酶(MAPK)家族之一部分。MAPK為對細胞外刺激(諸如環境壓力及發炎性細胞 激素)產生反應，並調節各種細胞活性(諸如基因表現、分化、有絲分裂、增殖、及細胞存活/凋亡)之絲胺酸/蘇胺酸專一性蛋白質激酶。p38 MAPK係以α、β、β 2、γ及δ同型異構物之形式存在。
用於測定物質是否為p38抑制劑之各種方 法係已知，諸如：在Thr180/Tyr182磷酸化之磷酸化專一性抗體檢測，其提供經確立的細胞p38活化或抑制之量測；生物化學重組激酶試驗；腫瘤壞死因子α(TNF α)分泌試驗；及針對p38抑制劑之DiscoverRx高通量篩選平台。亦存在有數種p38活性試驗套組(例如Millipore，Sigma-Aldrich)。
在某些具體例中，高濃度(例如超過100 nM、或超過1μM、超過10μM、或超過100μM)之p38抑制劑可具有抑制TGF-β之效果。在其他具體例中，p38抑制劑不會抑制TGF-β訊息傳遞。
各種p38抑制劑係該項技術領域中已知者 (例如參見表1)。在某些具體例中，直接或間接負向地調節p38訊息傳遞之抑制劑係選自SB-202190、SB-203580、VX-702、VX-745、PD-169316、RO-4402257及BIRB-796所組成之群組。
在某些具體例中，該培養基包含下列二 者：a)結合至選自ALK4、ALK5及ALK7所組成之群組之一或多種激酶並減少其活性之抑制劑；以及b)結合至p38並減少其活性之抑制劑。
在某些具體例中，該培養基包含結合至 ALK5並減少其活性之抑制劑、及結合至p38並減少其活性之抑制劑。
於一具體例中，藉由細胞試驗進行評估 時，相較於對照組，抑制劑結合至其標靶(例如TGF-β及/或p38)並減少其活性超過10%；超過30%；超過60%；超過80%；超過90%；超過95%；或超過99%。如上所述，用於量測標靶抑制度之細胞試驗之實例係該項技術領域中所熟知者。
TGF-β及/或p38之抑制劑可具有等於或低 於2000nM；低於1000nM；低於100nM；低於50nM；低於30nM；低於20nM或低於10mM之IC50值。IC50值係指抑制劑在抑制其標靶之生物學或生物化學功能上之效用。IC50表明需要多少特定抑制劑以抑制激酶達50%。IC50值可依照以上所列之試驗方法予以計算。
TGF-β及/或p38之抑制劑可以各種形式存 在，包括天然或經改良的受質、酶、受體、小有機分子(諸如至多2000Da，較佳800Da或更低之小天然或合成有機分子)、擬肽物、無機分子、胜肽、多肽、反義寡核苷酸、適體、及此等之結構或功能模擬物，包括小分子。
在某些具體例中，TGF-β及/或p38之抑制 劑亦可為適體。於本文中使用時，用語“適體”係指可接受高度專一性三次元構形之寡核苷酸(DNA或RNA)鏈。適體被設計成對某些目標分子(包括細胞外及細胞內蛋白質) 具有高度結合親和性及專一性。適體可使用例如藉由指數富集之配體系統進化(SELEX)過程而產生(參見例如Tuerk及Gold，Systematic evolution of ligands by exponential enrichment：RNA ligands to bacteriophage T4 DNA Polymerase.Science 249：505-510,1990，以參考資料之方式併入本文中)。
在某些具體例中，TGF-β及/或p38抑制劑 可為具有在50與800Da之間、在80與700Da之間、在100與600Da之間、或在150與500Da之間之分子量的小合成分子。
在某些具體例中，TGF-β及/或p38抑制劑 包含吡啶基咪唑或2,4-二經取代之喋啶或喹唑啉，例如包含：
可依照本發明使用之TGF-β及/或p38抑制劑之具體實例包括但不限於：SB-202190、SB-203580、SB-206718、SB-227931、VX-702、VX-745、PD-169316、RO-4402257、BIRB-796、A83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY 364947、SD-208、SJ 2511(參見表2)。
本發明之培養基可包含列於表2之一或多種任意抑制劑。本發明之培養基可包含所列之一抑制劑與另一抑制劑之任意組合。舉例而言，本發明之培養基可包 含SB-202190或SB-203580或A83-01；或SB-202190與A83-01；或SB-203580與A83-01。熟習該項技術領域者將瞭解，結合至標靶(例如TGF-β及/或p38)並減少其活性之其他抑制劑及抑制劑之組合可含括於依照本發明之培養基或培養基補充物中。
可將根據本發明之抑制劑添加至培養基中以達考慮到抑制劑之IC50值之下適當的最終濃度。
舉例而言，SB-202190可以在50nM與100μM之間、或在100nM與50μM之間、或在1μM與50μM之間之濃度添加至培養基中。舉例而言，SB-202190可以大約10μM添加至培養基中。
SB-203580可以在50nM與100μM之間、或在100nM與50μM之間、或在1μM與50μM之間之濃度添加至培養基中。舉例而言，SB-203580可以大約10μM添加至培養基中。
VX-702可以在50nM與100μM之間、或在100nM與50μM之間、或在1μM與25μM之間之濃度添加至培養基中。舉例而言，VX-702可以大約5μM添加至培養基中。
VX-745可以在10nM與50μM之間、或在50nM與50μM之間、或在250nM與10μM之間之濃度添加至培養基中。舉例而言，VX-745可以大約1μM添加至培養基中。
PD-169316可以在100nM與200μM之間、 或在200nM與100μM之間、或在1μM與50μM之間之濃度添加至培養基中。舉例而言，PD-169316可以大約20μM添加至培養基中。
RO-4402257可以在10nM與50μM之間、或在50nM與50μM之間、或在500nM與10μM之間之濃度添加至培養基中。舉例而言，RO-4402257可以大約1μM添加至培養基中。
BIRB-796可以在10nM與50μM之間、或在50nM與50μM之間、或在500nM與10μM之間之濃度添加至培養基中。舉例而言，BIRB-796可以大約1μM添加至培養基中。
針對表2中之其他因子之可應用濃度，參見表1及以上相關內容。
如此，在某些具體例中，將直接或間接負向地調節TGF-β及/或p38訊息傳遞之抑制劑以在1nM與 100μM之間、在10nM與100μM之間、在100nM與10μM之間、或約1μM之濃度添加至培養基中。舉例而言，其中，一或多種抑制劑之總濃度係在10nM與100μM之間、在100nM與10μM之間、或約1μM。
細胞外基質(ECM)
細胞外基質(ECM)，在本文中可與“基底膜基質”交換使用，係由結締組織細胞所分泌，且包含多種多醣、水、彈力蛋白、及可包含蛋白多醣、膠原蛋白、內功素(巢蛋白)、纖連蛋白、纖維蛋白原、小纖維蛋白、層黏蛋白、及玻尿酸之蛋白質。ECM可提供有助於選擇及培養標的幹細胞之適合的受質及微環境。
在某些具體例中，該標的幹細胞係附著至ECM或與ECM接觸。不同類型的ECM係該項技術領域中已知者，且可包含不同成分，包括不同類型的蛋白多醣及/或不同組合的蛋白多醣。ECM可藉由培養ECM產生細胞(諸如某些纖維母細胞)而提供。細胞外基質產生細胞之實例包括主要產生膠原蛋白及蛋白多醣之軟骨細胞；主要產生第IV型膠原蛋白、層黏蛋白、間質膠原蛋白原、及纖連蛋白之纖維母細胞；以及主要產生膠原蛋白(第I、III、及V型)、硫酸軟骨素蛋白多醣、玻尿酸、纖連蛋白、及韌黏素-C(tenascin-C)之結腸肌纖維母細胞。
在某些具體例中，至少某些ECM係由鼠3T3-J2純系所產生，其可生長於作為飼養細胞層之MATRIGELTM基底膜基質(BD Biosciences)之上。
或者，ECM可由市售提供。市售可得的細 胞外基質之實例為細胞外基質蛋白質(Invitrogen)及MATRIGELTM基底膜基質(BD Biosciences)。對於培養幹細胞而言ECM之使用可增加幹細胞之長期存活率及/或未經分化幹細胞之持續存在。另一可供選用者為纖維蛋白受質或纖維蛋白凝膠或支架，諸如原始細胞耗乏的甘油化同種異體植片。
在某些具體例中，用於本發明之方法之 ECM包含至少二種截然不同的醣蛋白，諸如二種不同類型的膠原蛋白、或膠原蛋白及層黏蛋白。ECM可為合成的水凝膠細胞外基質、或天然存在的ECM。在某些具體例中，ECM係由MATRIGELTM基底膜基質(BD Biosciences)所提供，其包含層黏蛋白、內功素、及膠原蛋白IV。
培養基
用於本發明之方法之細胞培養基可包含任何細胞培養基，諸如利用以碳酸鹽為基礎之緩衝劑緩衝於約pH 7.4(例如在約pH 7.2至7.6之間)之培養基。許多市售可得的組織培養基係可潛在地適於本發明之方法，包括但不限於Dulbecco之經改良Eagle培養基(DMEM，例如不含L-麩醯胺酸但含有高葡萄糖之DMEM)、最低要素培養基(MEM)、剔除-DMEM(KO-DMEM)、Glasgow最低要素培養基(G-MEM)、基礎Eagle培養基(BME)、DMEM/Ham之F12、進階DMEM/Ham之F12、Iscove之經改良Dulbecco培養基及最低要素培養基(MEM)、Ham之F-10、Ham之F-12、培 養基199、及RPMI 1640培養基。
可將細胞培養在包含在5至10%之間之CO2(例如至少約5%但不超過10% CO2、或約5% CO2)之環境。
在某些具體例中，細胞培養基為DMEM/F12(例如3：1混合物)或RPMI 1640，其補充有L-麩醯胺酸、胰島素、青黴素/鏈黴素、及/或運鐵蛋白。在某些具體例中，係使用進階DMEM/F12或進階RPMI，其係針對無血清培養進行最佳化且已包括胰島素。進階DMEM/F12或進階RPMI培養基可進一步補充有L-麩醯胺酸及青黴素/鏈黴素。在某些具體例中，細胞培養基係補充有本文中所述之一或多種經純化天然、半合成及/或合成因子。在某些具體例中，細胞培養基係補充約10%胎牛血清(FBS)，該胎牛血清在使用前未受熱失活。另外的補充物，舉例而言，諸如B-27®無血清補充物(Invitrogen)、N-乙醯基半胱胺酸(Sigma)及/或N2無血清補充物(Invitrogen)、或Neurobasal(Gibco)、TeSR(StemGent)亦可添加至培養基中。
在某些具體例中，培養基可含有一或多種抗生素以預防污染(諸如青黴素/鏈黴素)。在某些具體例中，培養基可具有每mL低於0.1內毒素單位之內毒素含量，或可具有每mL低於0.05內毒素單位之內毒素含量。用於測定培養基之內毒素含量之方法係該項技術領域中已知者。
根據本發明之細胞培養基係容許在細胞外基質上之上皮幹細胞存活及/或增殖及/或分化。於本文中 使用時，用語“細胞培養基”係與“培養基(medium)”、“培養基(culture medium)”或“細胞培養基(cell medium)”同義。
本發明之經改良(生長)培養基在基礎培養 基中包含(a)Notch促效劑；(b)ROCK(Rho激酶)抑制劑；(c)骨形成蛋白(BMP)拮抗劑；(d)Wnt促效劑；(e)有絲分裂生長因子；以及(f)胰島素或IGF；且該培養基視需要進一步包含下列者之至少一種：(g)TGF β傳訊路徑抑制劑，諸如TGF β抑制劑、或TGF β受體抑制劑；以及(h)菸鹼醯胺、或其類似物、前驅物或模擬物。
或者，本發明之經改良(生長)培養基在基礎 培養基中包含(a)Notch促效劑；(b)ROCK(Rho激酶)抑制劑；(c)TGF β傳訊路徑抑制劑，諸如TGF β抑制劑、或TGF β受體抑制劑；(d)Wnt促效劑；(e)菸鹼醯胺、或其類似物、前驅物或模擬物；(f)有絲分裂生長因子；以及(g)胰島素或IGF；該培養基視需要進一步包含(h)骨形成蛋白(BMP)拮抗劑。
本發明之培養基可藉由將上述一或多種因子添加至基礎培養基中而製備。
如此，在一態樣中，本發明係提供一種基礎培養基(Base Medium)，其在補充有L-麩醯胺酸之DMEM：F12 3：1培養基中包含：胰島素或胰島素樣生長因子；T3(3,3′,5-三碘-L-甲狀腺胺酸)；氫化皮質酮；腺嘌呤；EGF；及10%胎牛血清(未受熱失活)。
在某些具體例中，該基礎培養基在補充有 1.35mM L-麩醯胺酸之DMEM：F12 3：1培養基中包含約5μg/mL胰島素；2×10-9M T3(3,3′,5-三碘-L-甲狀腺胺酸)；400ng/mL氫化皮質酮；24.3μg/mL腺嘌呤；10ng/mL EGF；及10%胎牛血清(未受熱失活)。
在某些具體例中，在緊接於前之段落中所 提及之各培養基成分之濃度係獨立地2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%、95%高於或低於個別所載之值，或2倍、3倍、5倍、10倍、20倍高於個別所載之值。舉例而言，在例示性培養基中，胰島素濃度可為6μg/mL(20%高於所載之5μg/mL)，EGF濃度可為5ng/mL(50%低於所載之10ng/mL)，而剩餘成分各具有以上所載之相同濃度。
在相關態樣中，本發明係提供一種基礎培 養基，其另外含有1×10-10M霍亂腸毒素。在其他具體例中，該基礎培養基不含霍亂腸毒素。
該基礎培養基可進一步包含一或多種抗生素，諸如青黴素/鏈黴素、及/或健他黴素(gentamicin)。
該基礎培養基可藉由添加上述一或多種因子而用於產生經改良生長培養基(或簡稱為經改良培養基)。
數種特定經改良生長培養基係以經改良生長培養基1至5(或簡稱為經改良培養基1至5)詳述於下。
如此，在一態樣中，本發明係提供一種第 一經改良培養基(經改良培養基1)，其在基礎培養基中包含：作為Notch促效劑之Jagged-1、作為ROCK抑制劑之Y-27632、作為BMP拮抗劑之頭蛋白、作為Wnt促效劑之R-底板反應蛋白1、作為有絲分裂生長因子之EGF、及胰島素。
在某些具體例中，經改良培養基1在基礎 培養基中包含：1μM Jagged-1(188-204)；100ng/mL頭蛋白；125ng/mL R-底板反應蛋白1；及2.5μM ROCK抑制劑(R)-(+)-反式-N-(4-吡啶基)-4-(1-胺基乙基)-環己烷甲醯胺(Y-27632)。
在某些具體例中，在緊接於前之段落中所 提及之各培養基成分之濃度係獨立地2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%、95%高於或低於個別所載之值，或2倍、3倍、5倍、10倍、20倍高於個別所載之值。
在相關態樣中，本發明係提供一種第二經 改良培養基(經改良培養基2)，其在基礎培養基中包含：作為Notch促效劑之Jagged-1、作為ROCK抑制劑之Y-27632、作為BMP拮抗劑之頭蛋白、作為Wnt促效劑之R-底板反應蛋白1、作為TGF-β受體抑制劑之SB431542、作為有絲分裂生長因子之EGF、菸鹼醯胺、及胰島素。
在某些具體例中，經改良培養基2在基礎 培養基中包含：1μM Jagged-1(188-204)；100ng/mL頭蛋白；125ng/mL R-底板反應蛋白1；2.5μM ROCK抑制劑 (R)-(+)-反式-N-(4-吡啶基)-4-(1-胺基乙基)-環己烷甲醯胺(Y-27632)；2μM SB431542：4-(4-(苯并[d][1,3]二氧雜環戊烯-5-基)-5-(吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基)苯甲醯胺，及10mM菸鹼醯胺。
在某些具體例中，在緊接於前之段落中所 提及之各培養基成分之濃度係獨立地2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%、95%高於或低於個別所載之值，或2倍、3倍、5倍、10倍、20倍高於個別所載之值。
在另一相關態樣中，本發明係提供一種第 三經改良培養基(經改良培養基3)，其在基礎培養基中包含：作為Notch促效劑之Jagged-1、作為ROCK抑制劑之Y-27632、作為BMP拮抗劑之頭蛋白、作為Wnt促效劑之R-底板反應蛋白1、作為TGF-β受體抑制劑之SB431542、作為有絲分裂生長因子之EGF、及胰島素。
在某些具體例中，該經改良培養基3在基 礎培養基中包含：1μM Jagged-1(188-204)；100ng/mL頭蛋白；125ng/mL R-底板反應蛋白1；2.5μM ROCK抑制劑(R)-(+)-反式-N-(4-吡啶基)-4-(1-胺基乙基)-環己烷甲醯胺(Y-27632)；及2μM SB431542：4-(4-(苯并[d][1,3]二氧雜環戊烯-5-基)-5-(吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基)苯甲醯胺。
在某些具體例中，在緊接於前之段落中所 提及之各培養基成分之濃度係獨立地2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、 90%、95%高於或低於個別所載之值，或2倍、3倍、5倍、10倍、20倍高於個別所載之值。
在又一相關態樣中，本發明係提供一種第 四經改良培養基(經改良培養基4)，其在基礎培養基中包含：作為Notch促效劑之Jagged-1、作為ROCK抑制劑之Y-27632、作為BMP拮抗劑之頭蛋白、作為Wnt促效劑之R-底板反應蛋白1、作為有絲分裂生長因子之EGF、菸鹼醯胺、及胰島素。
在某些具體例中，該經改良培養基4在基 礎培養基中包含：1μM Jagged-1(188-204)；100ng/mL頭蛋白；125ng/mL R-底板反應蛋白1；2.5μM ROCK抑制劑(R)-(+)-反式-N-(4-吡啶基)-4-(1-胺基乙基)-環己烷甲醯胺(Y-27632)；及10mM菸鹼醯胺。
在某些具體例中，在緊接於前之段落中所 提及之各培養基成分之濃度係獨立地2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%、95%高於或低於個別所載之值，或2倍、3倍、5倍、10倍、20倍高於個別所載之值。
在相關態樣中，本發明係提供一種第五經 改良培養基(經改良培養基5)，其在基礎培養基中包含：作為Notch促效劑之Jagged-1、作為ROCK抑制劑之Y-27632、作為Wnt促效劑之R-底板反應蛋白1、作為TGF-β受體抑制劑之SB431542、作為有絲分裂生長因子之EGF、菸鹼醯胺、及胰島素。
在某些具體例中，該經改良培養基2在基 礎培養基中包含：1μM Jagged-1(188-204)；125ng/mL R-底板反應蛋白1；2.5μM ROCK抑制劑(R)-(+)-反式-N-(4-吡啶基)-4-(1-胺基乙基)-環己烷甲醯胺(Y-27632)；2μM SB431542：4-(4-(苯并[d][1,3]二氧雜環戊烯-5-基)-5-(吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基)苯甲醯胺；及10mM菸鹼醯胺。
在某些具體例中，在緊接於前之段落中所 提及之各培養基成分之濃度係獨立地2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%、95%高於或低於個別所載之值，或2倍、3倍、5倍、10倍、20倍高於個別所載之值。
當根據本發明之方法使用時，本發明之培 養基(例如經改良培養基1至5)在適當條件下能夠以單細胞純系之形式擴增經單離幹細胞之群體達至少3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或更多繼代。
在某些具體例中，可使用任何下列培養基及培養基條件自胎兒或成體小腸組織單離及培養幹細胞。特定而言，經改良培養基之上述經改良培養基1可另外包括一或多種下列因子：FGF受體抑制劑、N-乙醯基-L-半胱胺酸、p38抑制劑、胃泌素、PGE2、或TGF β。經改良培養基之上述經改良培養基4可另外包括一或多種下列因子：FGF受體抑制劑、hedgeHog蛋白質(例如Shh)、TGF β、Wnt3a、或GSK3抑制劑。較佳係使用此種培養基條件連同 經改良培養基2而自胎兒小腸組織單離小腸幹細胞。
在某些具體例中，經改良培養基之上述經 改良培養基3可另外包括一或多種下列因子：胃泌素、PGE2、或Wnt3a。經改良培養基之上述經改良培養基1可包括菸鹼醯胺及GSK3抑制劑。較佳係使用此種培養基條件連同經改良培養基3而自成體小腸組織單離小腸幹細胞。
在某些具體例中，經改良培養基之上述經 改良培養基3可另外包括一或多種下列因子：胃泌素、PGE2、或Wnt3a。經改良培養基之上述經改良培養基1可包括菸鹼醯胺及GSK3抑制劑。較佳係使用此種培養基條件連同經改良培養基3而自成體小腸組織單離小腸幹細胞。
於本文中使用時，“良好”條件意指於該 條件下至少約40%細胞在培養中具有未成熟幹細胞之形態，且可在保有自我更新及分化能力之同時進行繼代，“更佳”條件意指於該條件下至少約70%細胞在培養中具有未成熟幹細胞之形態，且可在保有自我更新及分化能力之同時進行繼代，“最佳”條件意指於該條件下約90%培養中之細胞在培養中具有未成熟幹細胞之形態，且可在試管內無限地保有自我更新及分化能力之同時進行繼代。
在某些具體例中，當使用經改良培養基4 時，可達成針對胎兒小腸幹細胞之更佳條件，當使用經改良培養基1、補充有FGF受體抑制劑、或p38抑制劑、或 PGE2、或N-乙醯基-L-半胱胺酸、或胃泌素、或TGF β之經改良培養基1、或補充有TGF β、或音蝟因子(sonic hedgehog，shh)、或Wnt3a、或GSK3抑制劑之經改良培養基4、或使用經改良培養基2時，可達成良好條件。
在某些具體例中，當使用經改良培養基2 時，可達成針對成年小腸幹細胞之更佳條件，當使用經改良培養基3、補充有PGE2、或胃泌素、或Wnt3a之經改良培養基3、或使用經改良培養基4時，可達成良好條件。
在某些具體例中，本發明之培養基不包括 下列條件或因子組合，其經實驗測試顯示該等條件或因子組合不支持幹細胞單離及培養(例如無法達成至少“良好”評分等級)。
針對胎兒小腸幹細胞：補充有FGF1之經改 良培養基1；補充有FGF1及Wnt3a之經改良培養基1；補充有Wnt5a之經改良培養基1；補充有Wnt3a之經改良培養基3；補充有Notch抑制劑之經改良培養基1；補充有Wnt抑制劑(DKK1)之經改良培養基1；R-底板反應蛋白1不足之經改良培養基1；不含R-底板反應蛋白1但補充有Wnt3a之經改良培養基1；缺乏R-底板反應蛋白1但補充有Wnt5a之經改良培養基1；補充有GDC-0449(Vismodegib；2-氯-N-(4-氯-3-吡啶-2-基苯基)-4-甲基磺醯基苯甲醯胺；hedgeHog傳訊路徑抑制劑)之經改良培養基4；補充有XAV939(2-(4-(三氟甲基)苯基)-7,8-二氫-5H-噻喃并[4,3-d]嘧啶-4-酮；Wnt抑制劑)之經改良培養基4。
針對成體小腸幹細胞：經改良培養基1；含 有FGF1之經改良培養基1；含有FGF受體抑制劑之經改良培養基1；含有FGF1及Wnt3a之經改良培養基1；含有Wnt3a之經改良培養基1；含有Wnt5a之經改良培養基1；含有p38抑制劑(例如SB202190)之經改良培養基1；含有PGE2之經改良培養基1；含有N-乙醯基-L-Cys之經改良培養基1；含有胃泌素之經改良培養基1；不含R-底板反應蛋白1之經改良培養基1；不含R-底板反應蛋白1之經改良培養基3；不含R-底板反應蛋白1但外加Wnt3a之經改良培養基1；不含R-底板反應蛋白1但含有Wnt5a之經改良培養基1。
4.代表性培養基因子之蛋白質序列
用於本發明之培養基及方法之數種代表性(非限制性)蛋白質因子係提供如下。對於所列各因子而言，數種同源物或功能等效物係該項技術領域中已知者，且可自公開資料庫(諸如GenBank、EMBL、及/或NCBI RefSeq，僅列舉數例)輕易地檢索而得。另外的蛋白質或其胜肽片段、或編碼該蛋白質之多核苷酸，包括來自人類或非人類哺乳類之功能同源物，均可經由例如以序列為基礎之搜尋(諸如NCBI BLASTp或BLASTn或兩者)輕易地自公開來源檢索而得。
BMP抑制劑 頭蛋白(Noggin)：(GenBank：AAA83259.1)，智人(Homo sapiens)：
索蛋白(Chordin)(GenBank：AAG35767.1)，智人：
卵泡抑素(Follistatin)(GenBank：AAH04107.1)智人：
DAN(GenBank：BAA92265.1)智人：
賽伯洛斯蛋白(Cerberus)(NCBI參考序列：NP_005445.1)智人：
格雷姆林蛋白(Gremlin)(GenBank：AAF06677.1)智人：
硬化蛋白(Sclerostin)/SOST(GenBank：AAK13451.1)智人：
核心蛋白聚醣(Decorin)(GenBank：AAB60901.1)智人：
α-2巨球蛋白(GenBank：EAW88590.1)智人：
Wnt促效劑
R-底板反應蛋白1(GenBank：ABC54570.1)智人：
R-底板反應蛋白2(NCBI參考序列：NP_848660.3)智人：
R-底板反應蛋白3(NCBI參考序列：NP_116173.2)智人：
R-底板反應蛋白4(NCBI參考序列：NP_001025042.2)智 人：同型異構物1
R-底板反應蛋白4(NCBI參考序列：NP_001035096.1)智人：同型異構物2
諾里蛋白(Norrin)
諾里蛋白前驅物[智人]
NCBI參考序列：NP_000257.1
WNT3A[智人]
GenBank：BAB61052.1
WNT6[智人]
GenBank：AAG45154.1
有絲分裂因子
FGF-2=bFGF(niProtKB/Swiss-Prot：P09038.3)智人：
FGF7(GenBank：CAG46799.1)智人：
FGF10(GenBank：CAG46489.1)智人：
EGF(GenBank：EAX06257.1)智人：
TGF α智人：
前轉形生長因子α同型異構物1前原蛋白[智人]
NCBI參考序列：NP_003227.1
前轉形生長因子α同型異構物2前原蛋白[智人]
NCBI參考序列：NP_001093161.1
轉形生長因子α[合成構築體]
GenBank：AAX43291.1
TGF α，含有：
BDNF(UniProtKB/Swiss-Prot：P23560.1)智人：
KGF(GenBank：AAB21431.1)智人：
Notch促效劑
Jagged-1(GenBank：ACJ68517.1)智人：
Jagged-1胜肽
Jagged-1胜肽
CDDYYYGFGCNKFCRPR(SEQ ID NO：30)
Jagged2[智人]
GenBank：AAD15562.1
Delta 1=delta樣蛋白質1(NCBI參考序列：NP_005609.3；GenBank：AF196571.1)智人：
Delta-4=delta樣蛋白質4前驅物[智人]
NCBI參考序列：NP_061947.1
delta樣蛋白質3同型異構物1前驅物[智人]
NCBI參考序列：NP_058637.1
Delta樣蛋白質3同型異構物2前驅物[智人]
NCBI參考序列：NP_982353.1
5.使幹細胞分化之方法
可誘發經單離幹細胞(例如成體幹細胞)以分化成通常位於該幹細胞所源自或單離自之組織或器官的經分化細胞。經分化細胞可表現經分化細胞所特有的標記，且可輕易地自不表現此等經分化細胞標記之幹細胞中進行區分。
在成體幹細胞中表現之代表性標記清單包括：SOX9、KRT19、KRT7、LGR5、CA9、FXYD2、CDH6、CLDN18、TSPAN8、BPIFB1、OLFM4、CDH17、及PPARGC1A。
在某些具體例中，成體幹細胞不會或可忽略不計地表現任何本文中所述之經分化標記。
在成體小腸幹細胞中表現之代表性標記清單包括：OLFM4、SOX9、LGR5、CLDN18、CA9、BPIFB1、KRT19、CDH17、及TSPAN8。
在經分化小腸細胞中表現之代表性標記清單包括：MUC或PAS(杯形細胞標記)、CHGA(神經內分泌細胞標記)、LYZ(潘氏細胞標記)、MUC7、MUC13、及KRT20。
在成體肝臟幹細胞中表現之代表性標記清單包括：SOX9、KRT19、KRT7、FXYD2、及TSPAN8。
在經分化肝臟細胞中表現之代表性標記清 單包括：白蛋白、HNF1 α、HNF4 α、及AFP。
在成體胰臟幹細胞中表現之代表性標記清單包括：SOX9、KRT19、KRT7、FXYD2、CA9、及CDH6。
在成體胃幹細胞中表現之代表性標記清單包括：SOX9、SOX2、CLDN18、TSPAN8、KRT7、KRT19、BPIFB1、及PPARGC1A。
在成體結腸幹細胞中表現之代表性標記清單包括：SOX9、OLFM4、LGR5、CLDN18、CA9、BPIFB1、KRT19、及PPARGC1A。
在成體腸化生幹細胞中表現之代表性標記清單包括：SOX9、CDH17、HEPH及RAB3B。
腸化生幹細胞可分化成模擬成熟腸化生之柱狀上皮，其表現諸如Cdx2及絨毛蛋白之標記，但不表現諸如GKN1之胃上皮標記。
在成體腎臟幹細胞中表現之代表性標記清單包括：KRT19、KRT7、FXYD2、及CDH6。
在成體上呼吸道幹細胞中表現之代表性標記清單括：KRT14、KRT5、P63、KRT15及SOX2。
在輸卵管幹細胞中表現之代表性標記清單包括：ZFPM2、CLDN10、及PAX8。
在經分化輸卵管細胞中表現之代表性標記清單包括：FOXJ1及PAX2。
上述任何標記係該項技術領域中所熟知者，且其表現可藉由許多該項技術領域中所公認的方法中 之任一者予以證實，該等方法係諸如西方墨點轉漬法(Western blot)、北方墨點轉漬法(Northern blot)、免疫組織化學法、免疫螢光染色、原位RNA雜交等。
在某些具體例中，可使用定量方法(諸如即 時PCR)評估任何特定標記基因之表現程度，並在幹細胞與經分化細胞之間進行比較。參見第4圖及實施例7。
在某些具體例中，可藉由檢測經分化細胞 之功能而評估分化作用，該等功能係諸如經由胰臟細胞之胰島素分泌，該胰臟細胞係分化自不分泌胰島素之胰臟幹細胞。
用於經單離幹細胞之誘發分化之條件係該 項技術領域中所熟知者。
舉例而言，設計成促進或誘發胰臟幹細胞 之分化的分化培養基能夠在將胰臟幹細胞在該培養基中培養約2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多日後，誘發至少一種胰臟分化標記之表現。
可使用胰臟分化標記神經元素-3 (Neurogenin-3)評估分化作用之開端及/或程度。標記表現程度可藉由RT-PCR或藉由免疫組織化學法予以檢測。
代表性胰臟分化培養基(例如最低分化培養 基)包含表皮生長因子、作為Wnt促效劑之R-底板反應蛋白1，補充有B27、N2、及N-乙醯基半胱胺酸，且不含FGF或KGF或FGF10。
另一代表性胰臟分化培養基(例如經改良分 化培養基)包含作為BMP抑制劑之頭蛋白、作為有絲分裂生長因子之表皮生長因子及角質細胞生長因子兩者、及作為Wnt促效劑之R-底板反應蛋白1，補充有B27、N2、及N-乙醯基半胱胺酸(KGF可由FGF、或由FGF10所置換)，且補充有[Leu15]-胃泌素I及/或艾塞那肽(Exendin)。
另外的分化培養基係設計成使細胞朝向胃 族系分化，且包含作為有絲分裂生長因子之表皮生長因子、作為Wnt促效劑之R-底板反應蛋白1、作為Wnt促效劑之Wnt-3a，作為BMP抑制劑之頭蛋白、及FGF10，補充有B27、N2、N-乙醯基半胱胺酸及胃泌素。胃泌素較佳係以1nM之濃度使用。
該培養基在培養至少2、3、4、5、6、7、8、 9、10日或更久之期間誘發或促進細胞之特定分化作用以成為胃族系。分化作用可藉由檢測與胃族系相關之特定標記之存在而予以量測，該等標記係諸如MUC5AC(隱窩細胞標記)、GASTRIN及/或SOMATOSTATIN(兩者皆為內分泌細胞標記)。至少一種該標記之存在可使用RT-PCR及/或免疫組織化學法或免疫螢光法進行。至少一種此等標記之存在可在分化條件下至少6日、或至少10日後被檢測。
又一分化培養基包含進階DMEM/F12，其補 充有L-丙胺醯-L麩醯胺酸(Glutamax)、青黴素/鏈黴素、10mM Hepes、B27、N2、200ng/ml N-乙醯基半胱胺酸、10nM[Leu15]-胃泌素I、100nM艾塞那肽4(Exendin4)、50ng/ml EGF、1μg/ml R-底板反應蛋白1、100ng/ml頭蛋白。
其他更多分化培養基係記載於WO 2010/090513、WO 2012/014076、WO 2012/168930、及WO 2012/044992中，全部皆以參考資料之方式併入本文中。
另外的分化培養基係詳述於以下實施例中(參見實施例7至10、13、及14)，其條件及變體係構成此章節之一部分。
6.標記
此章節係記載可用於自不同組織或器官、或自其所分化之細胞中鑑定出經單離幹細胞之代表性標記基因。一般而言，針對下述所有標記，可依RNA層級量測基因表現。此外，亦可使用例如對由標記基因所編碼之蛋白質具專一性之抗體而藉由蛋白質表現來檢測某些標記之表現。
成體小腸幹細胞
在其未經分化狀態，成體人類小腸幹細胞表現一或多種下列生物標記：OLFM4、SOX9、LGR5、CLDN18、CA9、BPIFB1、KRT19、CDH17、TSPAN8。針對所有此等標記，可依RNA層級量測基因表現，或者針對SOX9、CLDN18、CA9、KRT19、CDH17、及TSPAN8，可依蛋白質層級量測基因表現。
成體結腸幹細胞
在其未經分化狀態，成體人類結腸幹細胞表現至少一種下列生物標記：OLFM4、SOX9、LGR5、 CLDN18、CA9、BPIFB1、KRT19及PPARGC1A。針對所有此等標記，可依RNA層級量測基因表現，或者針對SOX9、CLDN18、CA9、及KRT19，可依蛋白質層級量測基因表現。
成體胃幹細胞
在其未經分化狀態，成體人類胃幹細胞表現至少一種下列生物標記：SOX9、SOX2、CLDN18、TSPAN8、KRT7、KRT19、BPIFB1、PPARGC1A。針對所有此等標記，可依RNA層級量測基因表現，或者針對SOX9、SOX2、CLDN18、TSPAN8、KRT7、及KRT19，可依蛋白質層級量測基因表現。
成體肝臟幹細胞
在其未經分化狀態，成體人類肝臟幹細胞表現至少一種下列生物標記：SOX9、KRT7、KRT19、FXYD2及TSPAN8。針對所有此等標記，可依RNA層級量測基因表現，或者針對SOX9、KRT7、KRT19、及TSPAN8，可依蛋白質層級量測基因表現。
成體胰臟幹細胞
在其未經分化狀態，成體人類胰臟幹細胞表現至少一種下列生物標記：SOX9、KRT7、KRT19、FXYD2、CA9及CDH6。針對所有此等標記，可依RNA層級量測基因表現，或者針對SOX9、KRT7、KRT19及CA9，可依蛋白質層級量測基因表現。
成體腎臟幹細胞
在其未經分化狀態，成體人類腎臟幹細胞 表現至少一種下列生物標記：KRT7、KRT19、FXYD2、及CDH6。針對所有此等標記，可依RNA層級量測基因表現，或者針對KRT7及KRT19，可依蛋白質層級量測基因表現。
輸卵管幹細胞
在其未經分化狀態，成體人類腎臟幹細胞表現至少一種下列生物標記：ZFPM2、CLDN10及PAX8。針對所有此等標記，可依RNA層級量測基因表現。
成體腸化生幹細胞
在其未經分化狀態，成體人類腸化生幹細胞表現至少一種下列生物標記：SOX9、CDH17、HEPH及RAB3B。針對所有此等標記，可依RNA或蛋白質層級量測基因表現。
特定標記基因及其序列係一併提供於此。
BPIFB1
含BPI折疊家族B，成員1(BPIFB1)為BPI/LBP/PLUNC蛋白質超家族之成員。BPIFB1亦稱為LPLUNC1或C20orf114。已在小腸幹細胞、結腸幹細胞、及胃幹細胞中檢測到BPIFB1表現。RNA表現可藉由例如RT-PCR、RT-qPCR、RNA定序、微陣列手段或RNA原位雜交予以量測。
原位探針可得自例如Advanced Cell Diagnostics RNAscope。qPCR引子可得自OriGene Technologies(羅克維爾，馬里蘭州，美國)及QIAGEN(日耳曼鎮，美國馬里蘭州)、以及其他供應商。RT-PCR引子 及原位探針可使用該項技術領域中已知的方法進行設計。
人類cDNA序列係列示於下(NCBI參考序列：NM_033197.2)：
CA9
碳酸酐酶IX(CA9)，亦稱為MN或CAIX，為跨膜蛋白質且屬於鋅金屬酶之大家族。
已在小腸幹細胞、結腸幹細胞、及胰臟幹細胞中檢測到CA9表現。RNA表現可藉由例如RT-PCR、RT-qPCR、RNA定序、微陣列手段或RNA原位雜交予以量測。可使用CA9之蛋白質表現特徵化幹細胞，該蛋白質表現係可藉由例如免疫螢光法、免疫組織化學法、FACS、流 動式細胞計數法、西方墨點轉漬法或ELISA進行量測。
原位探針可得自例如Advanced Cell Diagnostics RNAscope(型號559341)。qPCR引子可得自OriGene Technologies(羅克維爾，馬里蘭州，美國)及QIAGEN(日耳曼鎮，美國馬里蘭州)、以及其他供應商。RT-PCR引子及原位探針可使用該項技術領域中已知的方法進行設計。抗體可得自例如R&D Systems(明尼亞波利，美國明尼蘇達州)、EMD Millipore(比勒利卡，麻薩諸塞州，美國)、Novus Biologicals(利特頓，科羅拉多州，美國)；OriGene Technologies,Inc.(羅克維爾，馬里蘭州，美國)或Abnova(內湖區，台北市，台灣)。
人類cDNA序列係列示於下(NCBI參考序列：NM_001216)：
CDH17
鈣黏蛋白17(CDH17)，亦稱為LI鈣黏蛋白(肝臟-小腸)、人類胜肽轉運子1(HPT1或HPT-1)、或CDH16，為鈣黏蛋白超家族之成員。已在小腸幹細胞、及腸化生幹細胞中檢測到CDH17表現。RNA表現可藉由例如RT-PCR、RT-qPCR、RNA定序、微陣列手段或RNA原位雜交予以量測。可使用CDH17之蛋白質表現特徵化幹細胞，該蛋白質表現係可藉由例如免疫螢光法、免疫組織化學法、FACS、流動式細胞計數法、西方墨點轉漬法或ELISA進行量測。
原位探針可得自例如Advanced Cell Diagnostics RNAscope。qPCR引子可得自OriGene Technologies(羅克維爾，馬里蘭州，美國)及QIAGEN(日耳曼鎮，美國馬里蘭州)、以及其他供應商。RT-PCR引子及原位探針可使用該項技術領域中已知的方法進行設計。抗體可得自例如R&D Systems(明尼亞波利，美國明尼蘇達州)、EMD Millipore(比勒利卡，麻薩諸塞州，美國)、Novus Biologicals(利特頓，科羅拉多州，美國)；OriGene Technologies,Inc.(羅克維爾，馬里蘭州，美國)或Abnova(內湖區，台北市，台灣)。
人類cDNA序列係列示於下(NCBI參考序列：NM_004063.3；轉錄變體1及NM_001144663.1；轉錄 變體2)：NCBI參考序列：NM_004063.3；轉錄變體1
NCBI參考序列：NM_001144663.1；轉錄變體2
CDH6
鈣黏蛋白6，第2型，K-鈣黏蛋白(胎兒腎臟)(CDH6)，亦稱為CAD6 pr KCAD，為鈣黏蛋白超家族之成員，在出血性方式中媒介細胞-細胞結合之鈣依賴型細胞-細胞黏附分子。全長CDH6 cDNA係由Shimoyama等人，1995(Cancer Res.55：2206-2211)予以純系化。已在胰臟幹細胞、及腎臟幹細胞中檢測到CDH6表現。RNA表現可藉由例如RT-PCR、RT-qPCR、RNA定序、微陣列手段或RNA原位雜交予以量測。
原位探針可得自例如Advanced Cell Diagnostics RNAscope。qPCR引子可得自OriGene Technologies(羅克維爾，馬里蘭州，美國)及QIAGEN(日耳曼鎮，美國馬里蘭州)、以及其他供應商。RT-PCR引子及原位探針可使用該項技術領域中已知的方法進行設計。
人類cDNA序列係列示於下(NCBI參考序 列：NM_004932.3)：
CLDN18
水閘蛋白18(Claudin 18，CLDN18)，亦稱為界面活性劑相關蛋白質5(SFTA5)、界面活性劑相關蛋白質J或SFTPJ，為水閘蛋白家族之成員。水閘蛋白為嵌膜蛋白質且為緊密連接鏈之成分。已在小腸幹細胞、結腸幹細胞、及胃幹細胞中檢測到CLDN18表現。RNA表現可藉由例如RT-PCR、RT-qPCR、RNA定序、微陣列手段或RNA原位雜交予以量測。可使用CLDN18之蛋白質表現特徵化幹細胞，該蛋白質表現係可藉由例如免疫螢光法、免疫組織化學法、FACS、流動式細胞計數法、西方墨點轉漬法或ELISA進行量測。
原位探針可得自例如Advanced Cell Diagnostics RNAscope。qPCR引子可得自OriGene Technologies(羅克維爾，馬里蘭州，美國)及QIAGEN(日耳曼鎮，美國馬里蘭州)、以及其他供應商。RT-PCR引子及原位探針可使用該項技術領域中已知的方法進行設計。抗體可得自例如R&D Systems(明尼亞波利，美國明尼蘇達州)、EMD Millipore(比勒利卡，麻薩諸塞州，美國)、Novus Biologicals(利特頓，科羅拉多州，美國)；OriGene Technologies,Inc.(羅克維爾，馬里蘭州，美國)或Abnova(內湖區，台北市，台灣)。舉例而言，Niimi等人(Mol.Cell Biol.2001,21(21)：7380-90)記載RT-PCR引子及CLDN18專一性抗體之生成，以及兩種同型異構物之間之差異，同型異構物2係普遍存在於胃中。
人類cDNA序列係列示於下(NM_016369.3水閘蛋白-18同型異構物1前驅物及NM_001002026.水閘蛋白-18同型異構物2)：NCBI參考序列：NM_016369.3水閘蛋白-18同型異構物1前驅物
NCBI參考序列：NM_001002026.2水閘蛋白-18同型異構物2
FXYD2
含FXYD結構域之離子轉運調節子2(FXYD2)，亦稱為HOMG2或ATP1G1，為跨膜蛋白質之FXYD家族之成員。此特定蛋白質係編碼鈉/鉀轉運ATP酶次單元γ。
已在肝臟幹細胞、胰臟幹細胞、及腎臟幹細胞中檢測到FXYD2表現。RNA表現可藉由例如RT-PCR、RT-qPCR、RNASeq、微陣列手段或RNA原位雜交予以量測。原位探針可得自例如Advanced Cell Diagnostics RNAscope。qPCR引子可得自OriGene Technologies(羅克維爾，馬里蘭州，美國)及QIAGEN(日耳曼鎮，美國馬里蘭州)、以及其他供應商。RT-PCR引子及原位探針可使用該項技術領域中已知的方法進行設計。
人類cDNA序列係列示於下(NM_001680.4鈉/鉀轉運ATP酶次單元γ同型異構物1及NM_021603.3鈉/鉀轉運ATP酶次單元γ同型異構物2)：NCBI參考序列：NM_001680.4鈉/鉀轉運ATP酶次單元γ同型異構物1
NCBI參考序列：NM_021603.3鈉/鉀轉運ATP酶次單元γ同型異構物2
HEPH
希菲斯特蛋白(hephaestin，HEPH)，亦稱為CPL，係類似於鐵轉運蛋白質。已記載有編碼不同的同型異構物之三種轉錄變體。
已在腸化生幹細胞中檢測到HEPH表現。RNA表現可藉由例如RT-PCR、RT-qPCR、RNA定序、微陣列手段或RNA原位雜交予以量測。蛋白質表現可藉由例如免疫螢光法、免疫組織化學法、FACS、流動式細胞計數法、西方墨點轉漬法或ELISA予以檢測。原位探針可得自例如Advanced Cell Diagnostics RNAscope。qPCR引子可得自OriGene Technologies(羅克維爾，馬里蘭州，美國)及QIAGEN(日耳曼鎮，美國馬里蘭州)、以及其他供應商。RT-PCR引子及原位探針可使用該項技術領域中已知的方法進行設計。抗體可得自例如R&D Systems(明尼亞波利，美國明尼蘇達州)、EMD Millipore(比勒利卡，麻薩諸塞州，美國)、Novus Biologicals(利特頓，科羅拉多州，美國)；OriGene Technologies,Inc.(羅克維爾，馬里蘭州，美國)；Abnova(內湖區，台北市，台灣)；或Santa Cruz Biotechnology,Inc.(達拉斯，德克薩斯州，美國)。
人類cDNA序列係列示於下(NM_138737.3希菲斯特蛋白同型異構物；NM_014799.2希菲斯特蛋白同 型異構物b及NM_001130860.2希菲斯特蛋白同型異構物c前驅物)：NCBI參考序列：NM_138737.3希菲斯特蛋白同型異構物a
NCBI參考序列：NM_014799.2希菲斯特蛋白同型異構物b
NCBI參考序列：NM_001130860.2希菲斯特蛋白同型異構物c前驅物
KRT19
角質蛋白19(KRT19)，亦稱為K19；CK19；K1CS，為角質蛋白家族之成員。KRT19為最小的已知(40kD)酸性角質蛋白且已顯示在培養中表現於上皮細胞(Savtchenko等人，1988,Am.J.Hum.Genet.43：630-637；Bader等人，1988,Europ.J.Cell Biol.47：300-319)。已在小腸幹細胞、結腸幹細胞、胃幹細胞、肝臟幹細胞、胰臟幹細胞及腎臟幹細胞中檢測到KRT19表現。RNA表現可藉由例如RT-PCR、RT-qPCR、RNA定序、微陣列手段或RNA原位雜交予以量測。蛋白質表現可藉由例如免疫螢光法、免疫組織化學法、FACS、流動式細胞計數法、西方墨點轉漬法或ELISA予以檢測。原位探針可得自例如Advanced Cell Diagnostics RNAscope。qPCR引子可得自OriGene Technologies(羅克維爾，馬里蘭州，美國)及QIAGEN(日耳曼鎮，美國馬里蘭州)、以及其他供應商。RT-PCR引子及原位探針可使用該項技術領域中已知的方法進行設計。抗體可得自例如R&D Systems(明尼亞波利，美國明尼蘇達州)、EMD Millipore(比勒利卡，麻薩諸塞州，美國)、Novus Biologicals(利特頓，科羅拉多州，美國)；OriGene Technologies,Inc.(羅克維爾，馬里蘭州，美國)；Abnova(內湖區，台北市，台灣)；或Santa Cruz Biotechnology,Inc.(達拉斯，德克薩斯州，美國)。
人類cDNA序列係列示於下(NCBI參考序列：NM_002276.4)：
KRT7
角質蛋白7(KRT7)，亦稱為K7；CK7；SCL；或K2C7，為角質蛋白家族之成員。KRT7為單層非角質蛋白化上皮之第II型角質蛋白(Glass等人，1985,J.Cell Biol.101：2366-237)。已在胃幹細胞、肝臟幹細胞、胰臟幹細胞及腎臟幹細胞中檢測到KRT7表現。可依RNA層級或蛋白 質層級檢測表現。RNA表現可藉由例如RT-PCR、RTqPCR、RNA定序、微陣列手段或RNA原位雜交予以量測。蛋白質表現可藉由例如免疫螢光法、免疫組織化學法、FACS、流動式細胞計數法、西方墨點轉漬法或ELISA予以檢測。原位探針可得自例如Advanced Cell Diagnostics RNAscope。 qPCR引子可得自OriGene Technologies(羅克維爾，馬里蘭州，美國)及QIAGEN(日耳曼鎮，美國馬里蘭州)、以及其他供應商。RT-PCR引子及原位探針可使用該項技術領域中已知的方法進行設計。抗體可得自例如R&D Systems(明尼亞波利，美國明尼蘇達州)、EMD Millipore(比勒利卡，麻薩諸塞州，美國)、Novus Biologicals(利特頓，科羅拉多州，美國)；OriGene Technologies,Inc.(羅克維爾，馬里蘭州，美國)；Abnova(內湖區，台北市，台灣)；或Santa Cruz Biotechnology,Inc.(達拉斯，德克薩斯州，美國)。
人類cDNA序列係列示於下(NCBI參考序列：NM_005556.3角質蛋白，第II型細胞骨架7)：
LGR5
LGR5(含白胺酸富集重複之G-蛋白偶聯受體5)，亦稱為GRP49、FEX、HG38、或GPR67，為小腸及結腸中之幹細胞之標記(Barker,N等人，2007；Nature 449：1003-1007)。已在小腸幹細胞、及結腸幹細胞中檢測到LGR5 RNA表現。RNA表現可藉由例如RT-PCR、RT-qPCR、RNA定序、微陣列手段或RNA原位雜交予以量測。舉例而言，包含小鼠Lgr5之1kb N端片段的原位探針可由Image Clone 30873333生成。原位探針可得自例如Advanced Cell Diagnostics RNAscope(型號311021)。qPCR引子可得自OriGene Technologies(Rockville,MD)及QIAGEN(日耳曼鎮，美國馬里蘭州)、以及其他供應商。RT-PCR引子及原位探針可使用該項技術領域中已知的方法進行設計。
人類cDNA序列係列示於下(NCBI參考序列：NM_003667.2)：
OLFM4
OLFM4(嗅質蛋白4)，亦稱為抗凋亡蛋白質GW112；G-CSF刺激型純系1蛋白質；GC1；OLM4；OlfD；hGC-1；hOLfD；UNQ362；bA209J19.1，係最初自人類骨髓母細胞中予以純系化且被發現在發炎結腸上皮中選擇性地表現(Shinozaki等人，2001,Gut 48：623-239)。OLFM4已被 van der Flier等人，2009(Gastroenterology 137(1)：15-7)記載為強力可靠的幹細胞標記。已在小腸幹細胞、及結腸幹細胞中檢測到BPIFB1 RNA表現。RNA表現可藉由例如RT-PCR、RT-qPCR、RNA定序、微陣列手段或RNA原位雜交予以量測。原位探針可得自例如Advanced Cell Diagnostics RNAscope。qPCR引子可得自OriGene Technologies(羅克維爾，馬里蘭州，美國)及QIAGEN(日耳曼鎮，美國馬里蘭州)、以及其他供應商。RT-PCR引子及原位探針可使用該項技術領域中已知的方法進行設計。
人類cDNA(NCBI參考序列：NM_006418.4)係列示於下：
PPARGC1A
過氧化體增殖物活化受體γ，共活化子1 α(PPARGC1A)，亦稱為LEM6；PGC1；PGC1A；PGC-1v；PPARGC1；或PGC-1(α)，為調節涉及能量代謝之基因的轉錄共活化子。此蛋白質與PPAR γ產生交互作用，其容許此蛋白質與多種轉錄因子之交互作用。已在結腸幹細胞、及胃幹細胞中檢測到PPARGC1A RNA表現。RNA表現可藉由例如RT-PCR、RTqPCR、RNA定序、微陣列手段或RNA原位雜交予以量測。原位探針可得自例如Advanced Cell Diagnostics RNAscope。qPCR引子可得自OriGene Technologies(羅克維爾，馬里蘭州，美國)及QIAGEN(日耳曼鎮，美國馬里蘭州)、以及其他供應商。RT-PCR引子及原位探針可使用該項技術領域中已知的方法進行設計。
人類cDNA(NCBI參考序列：NM_013261.3)係列示於下：
RAB3B
RAB3B，RAS致癌基因家族成員(RAB3B)，為聚合性免疫球蛋白受體，在上皮細胞中表現(Van IJzendoorn等人，2002,Dev.Cell 2：219-228)。吾等藉由免 疫染色檢測在腸化生幹細胞中之RAB3B蛋白質表現。可依RNA層級或蛋白質層級檢測表現。RNA表現可藉由例如RT-PCR、RNA原位雜交或RNA定序或微陣列予以量測。蛋白質表現可藉由例如免疫螢光法、免疫組織化學法、FACS、流動式細胞計數法、西方墨點轉漬法或ELISA予以檢測。
原位探針可得自例如Advanced Cell Diagnostics RNAscope。qPCR引子可得自OriGene Technologies(羅克維爾，馬里蘭州，美國)及QIAGEN(日耳曼鎮，美國馬里蘭州)、以及其他供應商。RT-PCR引子及原位探針可使用該項技術領域中已知的方法進行設計。抗體可得自例如R&D Systems(明尼亞波利，美國明尼蘇達州)、EMD Millipore(比勒利卡，麻薩諸塞州，美國)、Novus Biologicals(利特頓，科羅拉多州，美國)；OriGene Technologies,Inc.(羅克維爾，馬里蘭州，美國)；Abnova(內湖區，台北市，台灣)；或Santa Cruz Biotechnology,Inc.(達拉斯，德克薩斯州，美國)；Abcam(例如抗RAB3B抗體；型號ab55655)(劍橋，麻薩諸塞州，美國)。
人類cDNA(NCBI參考序列：NM_002867.3)係列示於下：
SOX2
SRY(性別決定區Y)匣2(SOX2)，亦稱為ANOP3；MCOPS3，轉錄因子之SRY相關性HMG匣(SOX)家族之成員。已顯示SOX2對於胚胎幹細胞多能性而言係至關重要且在重整(reprogramming)方面扮演重要的角色(Takahashi及Yamanaka，2006,Cell 126：663-676)。已在胃幹細胞中觀察到SOX2表現之檢測。可依RNA層級或蛋白質層級檢測表現。RNA表現可藉由例如RT-PCR、RNA原位雜交或RNA定序或微陣列予以量測。蛋白質表現可藉由例如免疫螢光法、免疫組織化學法、FACS、流動式細胞計數法、西方墨點轉漬法或ELISA予以檢測。
原位探針可得自例如Advanced Cell Diagnostics RNAscope。qPCR引子可得自OriGene Technologies(羅克維爾，馬里蘭州，美國)及QIAGEN(日耳曼鎮，美國馬里蘭州)、以及其他供應商。RT-PCR引子及原位探針可使用該項技術領域中已知的方法進行設計。抗體可得自例如R&D Systems(明尼亞波利，美國明尼蘇達州)、EMD Millipore(比勒利卡，麻薩諸塞州，美國)、Novus Biologicals(利特頓，科羅拉多州，美國)；OriGene Technologies,Inc.(羅克維爾，馬里蘭州，美國)；Abnova(內湖區，台北市，台灣)；或Santa Cruz Biotechnology,Inc.(達拉斯，德克薩斯州，美國)。
人類cDNA(NCBI參考序列：NM_003106.3)係列示於下：
SOX9
SRY(性別決定區Y)匣9(SOX9)，亦稱為CMD1；SRA1；CMPD1，為轉錄因子之SRY相關性HMG匣(SOX)家族之成員。SOX9係首先被記載其在軟骨生成及性別決定方面之功能，但更近期正在探討其在上皮細胞中之角色(Furuyama等人，2011,Nature Genet.43：34-41)。已在腸幹細胞、胃幹細胞、結腸幹細胞、肝臟幹細胞、胰臟幹細胞及腸化生幹細胞中觀察到SOX9表現之檢測。可依RNA層級或蛋白質層級檢測表現。RNA表現可藉由例如RT-PCR、RNA原位雜交或RNA定序或微陣列予以量測。蛋白質表現可藉由例如免疫螢光法、免疫組織化學法、FACS、流動式細胞計數法、西方墨點轉漬法或ELISA予以檢測。
原位探針可得自例如Advanced Cell Diagnostics RNAscope。qPCR引子可得自OriGene Technologies(羅克維爾，馬里蘭州，美國)及QIAGEN(日耳曼鎮，美國馬里蘭州)、以及其他供應商。RT-PCR引子 及原位探針可使用該項技術領域中已知的方法進行設計。抗體可得自例如R&D Systems(明尼亞波利，美國明尼蘇達州)、EMD Millipore(比勒利卡，麻薩諸塞州，美國)、Novus Biologicals(利特頓，科羅拉多州，美國)；OriGene Technologies,Inc.(羅克維爾，馬里蘭州，美國)；Abnova(內湖區，台北市，台灣)；或Santa Cruz Biotechnology,Inc.(達拉斯，德克薩斯州，美國)。
人類cDNA(NCBI參考序列：NM_000346.3)係列示於下：
TSPAN8
四穿膜蛋白8(TSPAN8)，亦稱為CO-029；TM4SF3，為跨膜4超家族(亦稱為四穿膜蛋白家族)之成員。已在小腸幹細胞、胃幹細胞、及肝臟幹細胞中檢測到TSPAN8表現。可依RNA層級或蛋白質層級檢測表現。RNA表現可藉由例如RT-PCR、RNA原位雜交或RNA定序或微陣列予以量測。蛋白質表現可藉由例如免疫螢光法、免疫組織化學法、FACS、流動式細胞計數法、西方墨點轉漬法或ELISA予以檢測。
原位探針可得自例如Advanced Cell Diagnostics RNAscope。qPCR引子可得自OriGene Technologies(羅克維爾，馬里蘭州，美國)及QIAGEN(日耳曼鎮，美國馬里蘭州)、以及其他供應商。RT-PCR引子及原位探針可使用該項技術領域中已知的方法進行設計。抗體可得自例如R&D Systems(明尼亞波利，美國明尼蘇達州)、EMD Millipore(比勒利卡，麻薩諸塞州，美國)、Novus Biologicals(利特頓，科羅拉多州，美國)；OriGene Technologies,Inc.(羅克維爾，馬里蘭州，美國)；Abnova(內湖區，台北市，台灣)；或Santa Cruz Biotechnology,Inc.(達拉斯，德克薩斯州，美國)。
人類cDNA(NCBI參考序列：NM_004616.2)係列示於下：
7.使用方法
在另外的態樣中，本發明係提供一種單離 自各種非胚胎培養物之標的幹細胞之用途，其係用於藥物研發篩選、毒性試驗、以動物為基礎之疾病模型、或於醫學，諸如再生醫學。
純系化幹細胞之遺傳操作
舉例而言，藉由本發明之方法單離之幹細胞係適於數種類型的遺傳操作，包括引進可調控一或多種感興趣的目標基因之表現的外源遺傳物質。舉例而言，在目的為修復受損或患病組織之方法中，可使用此種基因療法。簡言之，任何合適的載體，包括腺病毒、慢病毒、或反轉錄病毒基因輸送載具(參見下文)，均可用於輸送遺傳訊息，如DNA及/或RNA至任何標的幹細胞。熟習該項技術領域者可置換或修復基因療法中作為標靶之特定基因。舉例而言，可將正常基因插入患病細胞之基因體中之非特定位置以置換非功能性基因。在另一實例中，可經由同源性重組將異常基因序列置換成正常基因序列。或者，選擇性回復突變可將基因回復至其正常功能。另外的實例為改變特定基因之調節(將基因開啟或關閉所達之等級)。較佳地，幹細胞係在活體外藉由基因療法手段處理且隨後轉移至哺乳類，較佳為需要治療之人類。
可將任何該項技術領域中所公認的遺傳操作方法應用至經如此單離之幹細胞，包括轉染及感染(例如藉由病毒載體)藉由各種類型的核酸構築體。
舉例而言，可使用化學物質或生物載體(病毒)，藉由物理處理(例如電穿孔、聲穿孔、光學轉染、原 生質體融合、刺穿轉染、流體動力輸送、奈米粒子、磁性轉染)之方式，將異種核酸(例如DNA)引進至標的幹細胞中。化學基礎型轉染可以下列者為基礎：磷酸鈣、環糊精、聚合物(例如陽離子性聚合物，諸如DEAE-葡聚糖或聚乙烯亞胺)、高度分枝有機化合物(諸如樹枝狀聚合物)、脂質體(諸如陽離子性脂質體、脂轉染(諸如使用Lipofectamine之脂轉染)等)、或奈米粒子(具有或不具有化學或病毒功能化)。
核酸構築體包含感興趣的核酸分子，且一般能夠在其所引進至之細胞中引導感興趣的核酸分子之表現。
在某些具體例中，該核酸構築體為表現載體，其中，編碼基因產物(諸如多肽或拮抗多肽之表現的核酸(例如siRNA、miRNA、shRNA、反義序列、適體、核酶(rybozyme)等))之核酸分子係可操作地連結至能夠在目標細胞(例如經單離幹細胞)中引導核酸分子之表現的啟動子。
用語“表現載體”一般係指能夠在與此種序列相容之細胞中達成其所含之基因/核酸分子之表現的核酸分子。此等表現載體典型地包括至少合適的啟動子序列、以及視需要，轉錄終止訊息。在本發明之方法中進行鑑定時，編碼多肽之核酸或DNA或核苷酸序列係併入至能夠引進至試管內細胞培養物中且在其中表現之DNA/核酸構築體中。
製備成用於引進至特定細胞中之DNA構築 體典型地包括受到細胞辨識之複製系統、編碼所欲多肽之預期DNA片段、及可操作地連結至編碼多肽之片段的轉錄及轉譯起始及終止調節序列。當將DNA片段置入與另一DNA片段之功能關係中時，該DNA片段係被“可操作地連結”。舉例而言，若其刺激序列之轉錄，則將啟動子或增強子可操作地連結至編碼序列。若其係以參與多肽之分泌的前蛋白之形式表現，則將訊息序列之DNA可操作地連結至編碼多肽之DNA。一般而言，可操作地連結之DNA序列係連續的，且在訊息序列之例中，係連續的且處於閱讀相(reading phase)。然而，增強子並不需要與其轉錄受到該增強子所控制之編碼序列呈連續。連結係藉由在合宜的酶切位點或在插入代替其之銜接子(adapter)或連結子(linker)處進行接合(ligation)而實現。
適當啟動子序列之選擇一般係取決於所選 擇用於表現DNA片段之宿主細胞。合適的啟動子序列之實例包括該項技術領域中所熟知之真核細胞啟動子(參見例如Sambrook及Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，2001)。轉錄調節序列典型地包括受到細胞辨識之異種增強子或啟動子。合適的啟動子包括CMV啟動子。表現載體包括複製系統、以及轉錄及轉譯調節序列，連同可採用之編碼多肽之片段的插入位點。細胞系及表現載體之可行的組合之實例係記載於Sambrook及Russell(2001，同上)及Metzger等人(1988)Nature 334：31-36 中。
本發明之某些態樣係關於包含上述核苷酸 序列之核酸構築體或表現載體之用途，其中，該載體為適於基因療法之載體。適於基因療法之載體係該項技術領域中已知者，諸如下列文獻中所記載者：Anderson(Nature 392：25-30,1998)；Walther and Stein(Drugs 60：249-71,2000)；Kay等人(Nat.Med.7：33-40,2001)；Russell(J.Gen.Virol.81：2573-604,2000)；Amado及Chen(Science 285：674-6,1999)；Federico(Curr.Opin.Biotechnol.10：448-53,1999)；Vigna及Naldini(J.Gene Med.2：308-16,2000)；Marin等人(Mol.Med.Today 3：396-403,1997)；Peng及Russell(Curr.Opin.Biotechnol.10：454-7,1999)；Sommerfelt(J.Gen.Virol.80：3049-64,1999)；Reiser(Gene Ther.7：910-3,2000)；以及該等中所載之參考資料(全部皆以參考資料之方式併入)。實例包括整合及非整合載體，諸如以反轉錄病毒、腺病毒(AdV)、腺病毒相關病毒(AAV)、慢病毒、痘病毒、α病毒、及疱疹病毒為基礎者。
尤其合適的基因療法載體包括腺病毒(Ad) 及腺病毒相關病毒(AAV)載體。此等載體感染廣數的分裂及非分裂細胞型。此外，腺病毒載體能夠達到高程度的轉基因表現。然而，由於腺病毒及AAV載體在細胞侵入後之游離基因天性(episomal nature)，此等病毒載體最適於僅需短暫表現轉殖基因之治療性應用(Russell,J.Gen.Virol.81：2573-2604,2000；Goncalves,Virol J.2(1)：43,2005)，如 上所載明。較佳的腺病毒載體係經改良以減少宿主反應，如Russell(2000，同上)所綜述。AAV基因轉移之安全性及功效已隨著在肝臟、肌肉、CNS、及視網膜中鼓舞人心的結果而在人類中被深入研究(Manno等人，Nat.Medicine 2006；Stroes等人，ATVB 2008；Kaplitt、Feigin，Lancet 2009；Maguire、Simonelli等人，NEJM 2008；Bainbridge等人，NEJM 2008)。
AAV2係對於在人類及實驗模型兩者之基因轉移研究而言定性最完整的血清型。AAV2係呈現朝向骨骼肌、神經元、血管平滑肌細胞及肝細胞之自然趨性。以腺病毒相關病毒為基礎之非整合載體之其他實例包括AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11及假型AAV。非人類血清型(如AAV8及AAV9)之使用或許可用於在對象中克服此等免疫反應，且正開始進行臨床試驗(ClinicalTrials dot gov Identifier：NCT00979238)。對於基因轉移至肝臟細胞，已顯示腺病毒血清型5或AAV血清型2、7或8為有效載體，故為較佳的Ad或AAV血清型(Gao,Molecular Therapy 13：77-87,2006)。
應用於本發明之示範性反轉錄病毒載體為以慢病毒為基礎之表現構築體。慢病毒載體具有感染非分裂細胞之獨特能力(Amado及Chen，Science 285：674-676,1999)。以慢病毒為基礎之表現構築體之構築及使用方法係記載於美國專利第6,165,782、6,207,455、6,218,181、 6,277,633、及6,323,031號、以及Federico(Curr.Opin.Biotechnol.10：448-53,1999)及Vigna等人(J.Gene Med.2：308-16,2000)。
一般而言，在其包含編碼所欲表現的本發 明之基因產物(例如多肽)之核苷酸序列之意義上而言，基因療法載體將作為上述表現載體，藉以使核苷酸序列可操作地連結至適當調節序列，如上所載明。此種調節序列將至少包含啟動子序列。用於自基因療法載體表現編碼多肽之核苷酸序列之合適的啟動子包括例如巨細胞病毒(CMV)中介早期啟動子、病毒長終端重複啟動子(LTR)，諸如來自莫洛尼氏鼠白血病病毒(murine Moloney leukaemia virus，MMLV)、勞斯氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)、或HTLV-1者、猿猴病毒40(SV 40)早期啟動子及疱疹單純型病毒胸腺核苷激酶啟動子。另外合適的啟動子係記載如下。
已記載數種可誘發型啟動子系統可藉由投 予小有機或無機化合物而被誘發。此種可誘發型啟動子包括受到重金屬所控制者，諸如金屬硫蛋白啟動子(Brinster等人，Nature 296：39-42,1982；Mayo等人，Cell 29：99-108,1982)、RU-486(黃體素拮抗劑)(Wang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：8180-8184,1994)、類固醇(Mader及White，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5603-5607,1993)、四環黴素(Gossen 及Bujard，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551,1992；美國專利第5,464,758號；Furth等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：9302-9306,1994；Howe等人，J.Biol.Chem. 270：14168-14174,1995；Resnitzky等人，Mol.Cell.Biol.14：1669-1679,1994；Shockett等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：6522-6526,1995)及tTAER系統，其係基於由tetR多肽所構成之多重嵌合轉活化子，作為VP 16之活化結構域、及雌激素受體之配體結合結構域(Yee等人，2002，美國專利第6,432,705號)。
針對編碼藉由RNA干擾(參見下文)而剔減 (knock down)特定基因的小RNA之核苷酸序列而言合適的啟動子，除了上述者外，尚包括聚合酶II啟動子、聚合酶III啟動子。RNA聚合酶III(pol III)可對眾多小細胞核及細胞質非編碼RNA(包括5S、U6、腺病毒VA1、Vault、端粒酶RNA、及tRNA)之合成產生反應。已確定大量編碼此等RNA之基因的啟動子結構且已發現RNA pol III啟動子分成三種類型結構(綜述請參見Geiduschek及Tocchini-Valentini，Annu.Rev.Biochem.57：873-914,1988；Willis,Eur.J.Biochem.212：1-11,1993；Hernandez，J.Biol.Chem.276：26733-36,2001)。尤其適於siRNA之表現為第3型RNA pol III啟動子，藉以使轉錄由僅在5’-旁側區(即轉錄起點之上游)發現之順式作用元素所驅動。上游序列元件包括慣有的TATA盒(Mattaj等人，Cell 55：435-442,1988)、近端序列元件及遠端序列元件(DSE；Gupta及Reddy，Nucleic Acids Res.19：2073-2075,1991)。在第3型pol III啟動子控制下之基因之實例為U6小細胞核RNA(U6 snRNA)、7SK、Y、MRP、HI及端粒酶RNA基因(參見例如 Myslinski等人，Nucl.Acids.Res.21：2502-09,2001)。
基因療法載體可視需要包含編碼出第二種或更多種多肽之第二種或一或多種之更多種核苷酸序列。第二種或更多種多肽可為容許含有表現構築體之細胞的鑑定、汰選及/或篩選之(選擇性)標記多肽。針對此目的而言合適的標記蛋白質係例如螢光蛋白質GFP、及選擇性標記基因HSV胸腺核苷激酶(用於對HAT培養基進行汰選)、細菌潮黴素B磷酸轉移酶(用於對潮黴素B進行汰選)、Tn5胺基醣苷磷酸轉移酶(用於對G418進行汰選)、及二氫葉酸還原酶(DHFR)(用於對胺甲喋呤進行汰選)、CD20、低親和性神經生長因子基因。用於獲得此等標記基因之來源及其使用方法係提供於Sambrook及Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第3版)，冷泉港實驗室，冷泉港實驗室出版社，美國紐約，2001。
或者，若認為有必要時，第二種或更多種核苷酸序列可編碼提供用作故障防護機制之多肽，該故障防護機制係使來自轉基因細胞之對象被消除。此種核苷酸序列，常稱為自殺基因，係編碼能夠將前驅藥轉化成有毒物質之多肽，該有毒物質能夠殺死該多肽在其中表現之基因轉殖細胞。此種自殺基因之合適的實例包括例如大腸桿菌胞嘧啶脫胺酶基因、或來自疱疹單純型病毒、巨細胞病毒及水痘帶狀疱疹病毒之其中一種胸腺核苷激酶基因，在該例中，可使用更昔洛韋(ganciclovir)作為前驅藥以在對象中殺死IL-10基因轉殖細胞(參見例如Clair等人， Antimicrob.Agents Chemother.31：844-849,1987)。
為了剔減特定多肽之表現，係使用基因療 法載體或其他表現構築體以便進行所欲核苷酸序列之表現，該所欲核苷酸序列較佳係編碼RNAi製劑，即能夠進行RNA干擾之RNA分子、或屬於能夠進行RNA干擾之RNA分子之一部分者。此種RNA分子稱為siRNA(短干擾RNA，包括例如短髮夾RNA)。
所欲核苷酸序列包含編碼出對準目標基因mRNA區之反義RNA的反義密碼DNA及/或編碼出對準目標基因mRNA相同區之有義RNA的有義密碼DNA。在本發明之DNA構築體中，反義及有義密碼DNA係可操作地連結至如本文中以上所定義之一或多種啟動子，其能夠表現反義及有義RNA。“siRNA”包括小干擾RNA，其係在哺乳類細胞中無毒的短長度雙股RNA(Elbashir等人，Nature 411：494-98,2001；Caplen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：9742-47,2001)。長度並不一定限定於21至23個核苷酸。只要其不顯現毒性，siRNA之長度並無特別限定。“siRNA”可為例如至少約15、18或21個核苷酸且至多25、30、35或49個核苷酸長。或者，所欲表現之siRNA的最終轉錄產物之雙股RNA部分可為例如至少約15、18或21個核苷酸，且至多25、30、35或49個核苷酸長。
“反義RNA”較佳為具有互補於目標基因mRNA之序列的RNA鏈，且被認為藉由結合至目標基因mRNA而誘發RNAi。
“有義RNA”具有互補於反義RNA之序列，且黏合(anneal)至其互補型反義RNA以形成siRNA。
在本文中，用語“目標基因”包括欲使其表現由於本系統所欲表現出之siRNA而被靜默化之基因，且可任意選擇。作為此目標基因，舉例而言，較佳係選擇其序列已知但其功能仍待釐清之基因、以及其表現被認為是疾病的成因之基因。目標基因可為其基因體序列尚未完全釐清者，只要具有至少15個核苷酸或更多(其係能夠結合至siRNA之其中一股(反義RNA鏈)之長度)的該基因之mRNA部分序列已被確定即可。因此，已釐清其某些序列(較佳為至少15個核苷酸)之基因、所表現序列標籤(EST)及部分之mRNA可被選為“目標基因”，即便其全長序列尚未確定。
兩個RNA鏈於其中進行配對之siRNA的雙股RNA部分並不限定於完全配對者，且可含有由於錯誤配對(mismatch)(相對應的核苷酸並非互補型)、凸起(bulge)(在一股缺乏相對應的互補型核苷酸)、及類似者所造成之未配對部分。可含有未配對部分達到其不會干擾siRNA形成之程度。
本文中使用之“凸起”可包含1至2個未配對核苷酸，且兩個RNA鏈於其中進行配對之siRNA的雙股RNA區較佳係含有1至7個，更佳1至5個凸起。
於本文中使用時，用語“錯誤配對”可在數目上較佳以1至7個，更佳以1至5個含於兩個RNA鏈 於其中進行配對之siRNA的雙股RNA區中。在某些錯誤配對中，其中一個核苷酸為鳥嘌呤，而另一個為脲嘧啶。此種錯誤配對係由於在編碼出有義RNA之DNA中從C至T、從G至A之突變、或其混合物所造成，但並不特別限定於該等。再者，在本發明中，兩個RNA鏈於其中進行配對之siRNA的雙股RNA區可含有凸起及錯誤配對兩者，其在數目上總計達較佳1至7個，更佳1至5個。此種未配對部分(錯誤配對或凸起等)可抑制下述在反義與有義密碼DNA之間之重組且使如下述之siRNA表現系統呈現穩定。再者，儘管難以對在兩個RNA鏈於其中進行配對之siRNA的雙股RNA區中不含未配對部分之莖環DNA(stem loop DNA)進行定序，但定序可藉由引進如上所述之錯誤配對或凸起而達成。另外，在配對雙股RNA區含有錯誤配對或凸起之siRNA具有在大腸桿菌或動物細胞中呈現穩定之優點。
只要siRNA能夠由於其RNAi效果使目標基 因表現靜默，則siRNA之終端結構可呈鈍性(blunt)或黏性(cohesive)(突出)。只要其能夠誘發RNAi效果，黏性(突出)端結構並不僅限定於3’突出，且可包括5’突出結構。此外，突出核苷酸之數目並不限定於已被報告之2或3個，而是只要突出能夠誘發RNAi效果，則可為任何數目。舉例而言，突出係由1至8個，較佳2至4個核苷酸所組成。 本文中，具有黏性端結構之siRNA總長度係以配對雙股部分的長度以及在兩端包含突出單股之配對的長度之總和表 示。舉例而言，在兩端具有4個核苷酸突出之19bp雙股RNA部分之例中，總長度係表示為23bp。再者，由於此突出序列對目標基因具有低專一性，故其並無必要對目標基因序列呈現互補(反義)或相同(有義)。再者，只要siRNA能夠對目標基因保持其基因靜默效果，則siRNA可例如在其一端之突出部分中含有低分子量RNA(其可為天然RNA分子，諸如tRNA、rRNA或病毒RNA，或人工合成RNA分子)。
此外，“siRNA”之終端結構必定如上所述 在兩端呈切斷結構，且可具有莖環結構，其中，一側雙股RNA之末端係由連結子RNA所連接(“shRNA”)。雙股RNA區(莖環部分)之長度可為例如至少15、18或21個核苷酸且至多25、30、35或49個核苷酸長。或者，屬於所欲表現之siRNA的最終轉錄產物之雙股RNA區之長度係例如至少15、18或21個核苷酸且至多25、30、35或49個核苷酸長。再者，只要其具有的長度不致妨礙莖部分之配對，連結子之長度並無特別限定。舉例而言，為了莖部分之穩定配對以及在編碼出該部分之DNA間的重組之抑制，連結子部分可具有苜蓿葉狀tRNA結構。即便連結子具有妨礙莖部分之配對的長度，仍有可能例如將連結子部分構築成包括內含子(intron)，使得該內含子在處理前驅RNA成為成熟RNA之期間被切除，藉此容許莖部分之配對。在莖環siRNA之例中，不具環結構之RNA之其中一端(頭或尾)可具有低分子量RNA。如上所述，此低分子量RNA 可為天然RNA分子，諸如tRNA、rRNA、snRNA或病毒RNA，或人工合成RNA分子。
為了由反義及有義密碼DNA分別表現反義 及有義RNA，本發明之DNA構築體包含如上述所定義之啟動子。只要其能夠表現反義及有義密碼DNA，啟動子在構築體中之數目及位置基本上可任意選擇。作為本發明之DNA構築體之簡單實例，可形成串連表現系統(tandem expression system)，其中，啟動子係位在反義及有義密碼DNA兩者之上游。此串連表現系統能夠產生在兩端具有上述切斷結構之siRNA。在莖環siRNA表現系統(莖環表現系統)中，反義及有義密碼DNA係配置於相反方向，且此等DNA係經由連結子DNA連接以構築單元。啟動子係連結至此單元之一側以構築莖環siRNA表現系統。本文中，連結子DNA之長度及序列並無特別限定，只要其序列並非終止序列，且如上所述其長度及序列在成熟RNA產生期間不會妨礙莖部分配對，則其可具有任何長度及序列。作為實例，編碼出上述tRNA及此類物之DNA可用作連結子DNA。
在串連及莖環表現系統兩者之例中，5’端 可具有能夠促進自啟動子之轉錄的序列。更特定而言，在串連siRNA之例中，siRNA產生效率可藉由在反義及有義密碼DNA之5’端添加能夠促進自啟動子之轉錄的序列而增進。在莖環siRNA之例中，可將此種序列添加在上述單元之5’端。只要不妨礙由siRNA所進行之目標基因靜默，則自此種序列之轉錄可在附加至siRNA之狀態下使用。若 此狀態妨礙基因靜默，較佳係使用修剪手段(舉例而言，如該項技術領域中已知的核糖酶)執行轉錄修剪。熟習該項技術領域者將清楚瞭解，反義及有義RNA可在相同載體或在不同載體中表現。為了避免在有義及反義RNA下游添加過量序列，較佳將轉錄終止子放置在個別鏈(編碼出反義及有義RNA之鏈)之3’端。終止子可為四個或更多個連續腺嘌呤(A)核苷酸之序列。
基因體編輯
基因體編輯可藉由引進異種轉基因或藉由抑制目標內源基因之表現而用於改變標的純系化幹細胞(包括純系化癌腫(或其他疾病)幹細胞)之基因體序列。此種遺傳工程建造幹細胞可用於再生醫學(參見下文)或傷口癒合。如此，在某些具體例中，標的再生醫學方法(參見下文)包含使用其基因體序列已藉由基因體編輯而經修飾之標的幹細胞。
基因體編輯可使用任何該項技術領域中所公認的技術執行，諸如ZFN/TALEN或CRISPR技術(綜述請參見Gaj等人，Trends in Biotech.31(7)：397-405,2013，其全部內容及所有記載參考資料皆以參考資料之方式併入本文中)。此種技術能夠實際操作在不同範圍的細胞型及有機體中之任何基因，如此便能夠藉由誘發在特定基因體位置刺激易錯非同源性末端接合(NHEJ)或同源介導型修復(HDR)之DNA雙股(DSB)斷裂而達成廣範圍的基因修飾。
鋅指核酸酶(ZFN)及轉錄活化子樣效應子 核酸酶(TALEN)係由連結至非專一性DNA切割結構域之可程序化序列專一性DNA結合模組所構成之嵌合核酸酶。該等為藉由將鋅指或TAL效應子DNA結合結構域融合至DNA切割結構域而生成之人工合成限制酶(RE)。鋅指(ZF)或轉錄活化子樣效應子(TALE)可被建造成結合任何所欲目標DNA序列，且融合至RE之DNA切割結構域，如此而創造出對所欲目標DNA序列具專一性之工程建造限制酶(ZFN或TALEN)。當將ZFN/TALEN引進至細胞中時，其可用於原位基因體編輯。事實上，ZFN及TALEN之多功能性可擴增至除核酸酶外之效應子結構域，諸如轉錄活化子及抑制子、重組酶、易位酶、DNA及組蛋白甲基轉移酶、以及組蛋白乙醯基轉移酶，而影響基因體結構及功能。
Cys2-His2鋅指結構域係屬於在真核細胞 中被發現之最常見類型的DNA結合基序，且代表在人類基因體中第二頻繁被編碼之蛋白質結構域。個別鋅指在保留性β β α組態中具有約30個胺基酸。將鋅指蛋白質應用於特定DNA辨識之關鍵為研發出含有超過三個鋅指結構域之非天然配列。此進展係由高度保留性連結子序列以結構為主之發現所促進，其能夠達成辨識長度9至18bp之DNA序列的合成鋅指蛋白質之構築。已證明此設計為用於構築辨識在複雜基因體中具專一性之連續DNA序列的鋅指蛋白質之最理想策略。合適的鋅指可藉由模組裝配手段(例如使用藉由龐大組合庫之挑選或藉由合理設計而生成之鋅指模組的預選集合庫)而獲得。鋅指結構域已被研發出辨識近 乎所有64個可能的核苷酸三連體，預選鋅指模組可共同串聯連結至含有一系列此等DNA三連體之目標DNA序列。 或者，可使用以選擇為基礎之手段，諸如寡聚物化集中工程(oligomerized pool engineering，OPEN)，自考慮到在鄰近的指之間之情境相關交互作用之隨機集合庫中選擇新的鋅指配列。亦使用兩種手段之組合。
工程建造鋅指係市售可得者。Sangamo Biosciences(里奇蒙，加利福尼亞州，美國)已與Sigma-Aldrich(聖路易，密蘇里州，美國)合作研發出用於鋅指構築之專屬平台(CompoZr)，該平台係容許調查人員完全避開鋅指構築及驗證，且已可取得數千種蛋白質。廣泛而言，鋅指蛋白質技術能夠達成以實際上任何序列作為標靶。
TAL效應子係由植物病原黃原菌(Xanthomonas bacteria)所分泌之蛋白質，其具有含有重複的高度保留性33至34個胺基酸序列之DNA結合結構域，除了第12個及第13個胺基酸之外。此二個位置呈高度變異性(重複變異性二殘基(Repeat Variable Diresidue)，或RVD)且與特定核苷酸辨識顯示強烈關聯。胺基酸序列與DNA辨識之間之此種簡單關已容許藉由選擇含有適當RVD之重複片段之組合而建造特定DNA結合結構域。如同鋅指，共同連結模組TALE重複以辨識連續DNA序列。數種效應子結構域已可用以融合至用於目標之基因修飾的TALE重複，包括核酸酶、轉錄活化子、及位點專一性重 組酶。常規TALE配列之快速組裝可藉由使用包括“Golden Gate”分子純系化、高通量固態組裝、及不依賴於接合反應之純系化(ligation-independent cloning)技術之策略而達成，該等皆可在本發明中用於純系化幹細胞之基因體編輯。
TALE重複可使用該項技術領域中可取得 之數種工具而輕易地進行組裝，諸如以18,740個編碼出人類蛋白質之基因作為標靶之TALEN集合庫(Kim等人，Nat.Biotechnol.31,251-258,2013)。客製設計TALE配列亦為市售可得者，例如經由Cellectis Bioresearch(巴黎，法國)、Transposagen Biopharmaceuticals(列星頓，肯塔基州，美國)、及Life Technologies(格蘭島，紐約州，美國)。
來自RE末端之非專一性DNA切割結構 域，諸如FokI內核酸酶(或FokI切割結構域變體，諸如Sharkey，其具有設計成增進切割專一性及/或切割活性之突變)，可用於構築在酵母菌試驗中活化之雜合核酸酶(亦在植物細胞及在動物細胞中活化)。為了增進ZFN活性，可使用短暫低溫培養基條件來增加核酸酶表現程度；亦可使用位點專一性核酸酶與DNA末端加工酶之共輸送，以及容許經ZFN修飾及經TALEN修飾細胞之富集化之螢光擬似報告子載體之使用。ZFN媒介基因體編輯之專一性亦可藉由使用鋅指切口酶(ZFNickase)而予以改善，其係利用誘發帶切口DNA會刺激HDR而不會活化易錯NHEJ修復路徑之發現。
TALE結合結構域之胺基酸序列與DNA辨 識之間之簡單關係容許有可設計的蛋白質。可使用公開可得的軟體程式(DNAWorks)來計算適於在二步驟PCR中組裝之寡核苷酸。亦已報告有用於生成工程建造TALE構築體之數種模組裝配方案且為該項技術領域中已知者。兩種方法係提供用以建造DNA結合結構域之系統化手段，其係概念上類似於用於生成鋅指DNA辨識結構域之模組裝配方法。
一旦已組裝TALEN基因，便在載體上使用 任何該項技術領域中所公認的方法(諸如電穿孔或轉染 使用陽離子性脂質基礎型試劑、使用質體載體、各種病毒載體，諸如腺病毒、AAV、及整合酶缺失型慢病毒載體(IDLV))將其引進至目標細胞中。或者，可將TALEN以mRNA之形式輸送至細胞，其移除TALEN表現蛋白質的基因體整合之可能性。其亦可在基因編輯期間急遽地增加同源介導型修復(HDR)之程度及基因移入(introgression)之成功率。最後，亦可使用經純化ZFN/TALEN蛋白質至細胞之直接輸送。此手段不帶有插入型誘變之風險，且相較於依賴來自核酸之表現的輸送系統而言導致較低的偏離目標效果，因而可最理想地使用於在細胞(諸如瞬時幹細胞)中需要精確基因體工程的研究。
TALEN可藉由誘發雙股斷裂(DSB)而使用 於編輯基因體，細胞係以修復機制對雙股斷裂(DSB)產生反應。非同源性末端接合(NHEJ)自具有極少或不具有用於黏合之序列重疊的雙股斷裂之其中一側重新連接DNA。可舉 行簡單的異質雙鏈切割試驗，其係檢測藉由PCR所增量之兩個對偶基因之間之任何差異。切割產物可顯現於簡單的瓊脂糖凝膠或平板凝膠系統上。或者，可在外源雙股DNA片段存在下將DNA經由NHEJ引進至基因體中。在所轉染之雙股序列係用作修復酶之模板時，同源介導型修復亦可在DSB引進外來DNA。已使用TALEN來穩定生成經修飾之人類胚胎幹細胞及經誘發之多能性幹細胞(iPSC)純系以生成基因剔除隱桿線蟲(C.elegans)、大鼠、及斑馬魚。
對於以幹細胞為基礎之療法而言，ZFN及 TALEN能夠修正疾病之根本成因，因而以精確的基因體修飾永久消除症狀。舉例而言，已使用ZFN誘發型HDR藉由修復缺失的目標基因、或藉由剔除目標基因而直接校正與X染色體連鎖重度合併免疫缺失(SCID)、血友病B、鐮形血球細胞疾病、α 1-抗胰蛋白酶缺失及數種其他遺傳疾病相關之致病突變。此外，亦可使用此等位點專一性核酸酶將治療性轉基因在人類基因體中之特定“安全收容處”位置安全地插入至標的幹細胞中。可將此種技術配合本發明之幹細胞使用於基因療法，包括基於自體幹細胞移植之治療，其中，操作純系化(患病或正常)幹細胞之一或多個基因以增加或減少/消除目標基因表現。
或者，亦可使用CRISPR/Cas系統以有效地 誘發目標基因改變至標的幹細胞中。CRISPR/Cas(CRISPR相關)系統或“成簇規律間隔短迴重複(Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats)”係含有 多個短正向重複之位置，且對細菌及古生菌提供後天免疫性。CRISPR系統係依賴用於侵入的外來DNA之序列專一性靜默之crRNA及tracrRNA。用語“tracrRNA”意味著反式活化型嵌合RNA，其係促進crRNA加工之非編碼RNA，且為藉由Cas9活化RNA引導型切割所需者。CRISPR RNA或crRNA鹼基與tracrRNA進行配對以形成二RNA結構，其引導Cas9內核酸酶至用於切割之互補型DNA位點。
有三種類型的CRISPR/Cas系統存在：在第 II型系統中，Cas9係作用為RNA引導型DNA內核酸酶，其在crRNA-tracrRNA標靶辨識後切割DNA。在細菌中，CRISPR系統係經由RNA引導型DNA切割而提供抵抗侵入的外來DNA之後天免疫性。CRISPR/Cas系統可藉由重新設計crRNA而重定目標以切割實際上任何DNA序列。事實上，已顯示CRISPR/Cas系統係藉由表現Cas9內核酸酶之質體及必需crRNA成分之共輸送而可直接移用至人類細胞。此等可程序化RNA引導型DNA內核酸酶已在iPS細胞中證實多樣基因中斷潛能及靶向整合，因而可同樣地用於標的幹細胞中。
癌腫幹細胞
本發明之方法及試劑亦可培養及單離癌腫所衍生之癌腫幹細胞(CSC)，其進而可用於部分起因於無法大量且以單細胞純系之形式獲得此等CSC之先前不可能或無法實際進行的許多應用。
舉例而言，使用本發明之方法自單一患者 建立之CSC集合庫能夠進行在患者相配對敏感型及耐受型純系之間之比較，以供定向藥物研發之努力。相較於敏感型純系，在耐受型純系中，某些基因可能經向上調節或向下調節。經向上調節之基因的抑制劑可進一步藉由例如在耐受型純系中測試目標基因之向下調節能力，並測定其對藥物耐受性之效果而作為藥物目標基因生效。相反地，在耐受型純系中恢復或過度表現向下調節基因亦可克服藥物耐受性。
如此，在一態樣中，本發明係提供一種藥 物發現方法，其係使用利用標的方法及培養基所單離之CSC，用以鑑定出在藥物耐受型CSC純系中經向上或向下調節之基因，該方法包含：(1)使用本發明之方法，自癌腫組織(諸如來自癌腫患者者)獲得複數種細胞純系；(2)在小比例(例如不超過1%、0.5%、0.2%、0.1%、0.05%、0.01%或更少)之藥物耐受型純系存活之條件下，使該複數種細胞純系與一或多種化學化合物(例如癌腫藥物)接觸；(3)比較藥物耐受型純系之基因表現圖譜與敏感型純系(例如一或多種經隨機挑選之在步驟(2)前之複數種細胞純系，其假定對藥物處理敏感)之基因表現圖譜，因而鑑定出在存活的藥物耐受型純系中經向上或向下調節之基因。
在某些具體例中，該方法進一步包含在存 活的藥物耐受型純系中抑制經向上調節之基因之表現。舉例而言，經向上調節之基因一般可能在二或更多個存活的藥物耐受型純系中經向上調節，該藥物耐受型純系係來自 相同類型的腫瘤或不同類型的腫瘤，該腫瘤係來自相同患者、或來自不同患者。在某些具體例中，該經向上調節之基因可對CSC所單離自之患者具專一性。此可有助於針對患者設計個人化醫學或治療方案。
在某些具體例中，該方法進一步包含在存 活的藥物耐受型純系中恢復或增加經向下調節之基因之表現。舉例而言，經向下調節之基因一般可能在二或更多個存活的藥物耐受型純系中經向下調節，該藥物耐受型純系係來自相同類型的腫瘤或不同類型的腫瘤，該腫瘤係來自相同患者、或來自不同患者。在某些具體例中，該經向下調節之基因可對CSC所單離自之患者具專一性。此亦可有助於針對患者設計個人化醫學或治療方案。
在相關態樣中，本發明係提供一種藥物發 現方法，其係使用利用標的方法及培養基所單離之CSC，用以鑑定出抑制藥物耐受型CSC之生長或促進殺死藥物耐受型CSC之候選化合物，該方法包含：(1)使用本發明之方法，自癌腫組織(諸如來自癌腫患者者)獲得複數種細胞純系；(2)在小比例(例如不超過1%、0.5%、0.2%、0.1%、0.05%、0.01%或更少)之藥物耐受型純系存活之條件下，使該複數種細胞純系與一或多種化學化合物(例如癌腫藥物)接觸；(3)使存活的藥物耐受型純系與複數種候選化合物接觸；以及(4)鑑定出抑制存活的藥物耐受型純系之生長或促進殺死存活的藥物耐受型純系之一或多種候選化合物。在某些具體例中，針對以耐受型細胞作為標靶之候選藥物，該方 法係使用高通量篩選形式執行。
在某些具體例中，該方法進一步包含測試 所鑑定出之候選化合物對來自CSC所單離自之相同患者之相配對敏感型純系(例如一或多種經隨機挑選之在步驟(2)前之複數種細胞純系，其假定對藥物處理敏感)、及/或相配對健康細胞的一般毒性。較佳地，相較於相配對敏感型純系及/或相配對健康細胞，任何所鑑定出之候選化合物係專一性地或優勢地抑制藥物耐受型CSC之生長或促進殺死藥物耐受型CSC。
在某些具體例中，該健康細胞為使用本發 明之方法及試劑同樣地進行單離之患者相配對正常幹細胞。
以上具體例係部分依據下述發現：在許多例中，相較於藥物敏感型純系，藥物耐受型CSC生長較慢。雖不希望受到任何特定理論所侷限，但申請人相信緩慢生長可能是在藥物耐受型CSC中為了迴避化學療法之基因表現改變的後果。如此，預期某些製劑可優勢地抑制生長或殺死藥物耐受型細胞，同時相較於原先用於治療癌腫之標準化學療法藥物(諸如順鉑或紫杉醇)而言呈較低毒性。
在另一態樣中，本發明係提供一種鑑定出對需要治療疾病之患者而言合適或有效的治療之方法，該方法包含：(1)使用本發明之方法，自來自患者之疾病組織(諸如癌腫組織)中獲得複數種幹細胞純系；(2)使該複數種細胞純系接受一或多種候選治療；(3)測定該一或多種候選 治療之各者的效用；藉此鑑定出對需要治療疾病之患者而言合適或有效的治療。此可有用於例如，當患者具有數種可能的治療選項，各者可能會或可能不會對患者而言合適或有效時。
在相關態樣中，本發明係提供一種在複數 種候選治療中篩選出最合適或有效的治療以用於治療需要治療疾病之患者之方法，該方法包含：(1)使用本發明之方法，自來自患者之疾病組織(諸如癌腫組織)中獲得複數種幹細胞純系；(2)使該複數種細胞純系接受該候選治療；(3)比較該一或多種候選治療之相對效用；藉此鑑定出對患者而言最合適或有效的治療。此可有用於例如，當患者具有數種可供選用的治療選項，其各者可能對特定患者群體有效，但對其他不一定有效時。
在某些具體例中，該疾病為癌腫，諸如可 自其單離出癌腫幹細胞之任何癌腫。
在某些具體例中，該治療為化學療法方 案，諸如利用一或多種化學療法劑者。在某些具體例中，該治療為放射療法。在某些具體例中，該治療為免疫療法，諸如使用專一性地結合至癌腫細胞之表面配體(例如表面抗原)的細胞結合劑(例如抗體)者。在某些具體例中，該治療為手術、化學療法、放射治療、及/或免疫療法之組合療法。
在某些具體例中，該疾病為發炎性疾病、 可自其單離出疾病相關幹細胞之疾病、或本文中所提及之 任何疾病。
在某些具體例中，該方法進一步包含使用一或多種所鑑定出對疾病合適或有效的治療來治療患者。
在某些具體例中，該方法進一步包含產生提供該候選治療之各者的效用之報告，諸如經個別或組合(包括依序地或同時地)測試之候選化學療法劑之各者的效用。
在某些具體例中，該方法進一步包含對於最有效的治療提供建議。
在相關態樣中，本發明係提供一種用於實行本發明之方法的套組及試劑。
在某些具體例中，本發明之一般篩選方法(並不一定限於癌腫幹細胞)係以高通量/自動方式實行。為達高通量目的，可將經擴增幹細胞群體培養在多孔盤中，諸如，舉例而言，96孔盤或384孔盤。使用分子集合庫以鑑定出影響所塗佈幹細胞之分子。較佳的集合庫包括(不構成侷限)抗體片段集合庫、胜肽噬菌體展示集合庫、胜肽集合庫(例如LOPAPTM，Sigma Aldrich)、脂質集合庫(BioMol)、合成化合物集合庫(例如LOP ACTM，Sigma Aldrich)或天然化合物集合庫(Specs，TimTec)。再者，可使用基因集合庫，其係在幹細胞後代中誘發或抑制一或多個基因之表現。此等基因集合庫包含cDNA集合庫、反義集合庫、及siRNA或其他非編碼RNA集合庫。
幹細胞較佳係暴露於多種濃度之測試/候選 製劑一段時間。在暴露期結束時，對培養物評估預定效果，諸如細胞中之任何變化，包括但不限於增殖之減少或喪失、形態變化、及細胞死亡。
經擴增幹細胞群體亦可用於鑑定出專一性地以上皮癌細胞或自其所單離出之幹細胞，而並非經擴增幹細胞群體本身作為標靶之藥物。
癌腫幹細胞之迅速純系化亦能夠實現針對腫瘤破壞之免疫學手段。本文中所述之技術能夠實現CSC高效率純系化，因而可潛在地提供有助於經由免疫活化根絕此等細胞的手段之資訊。
舉例而言，在單離CSC(藥物敏感型或藥物耐受型)後，可立即使用此種CSC之一或多個抗原決定區，較佳為相較於健康對照組(例如在CSC細胞表面或分泌蛋白體之抗原決定區)而言之CSC專一性抗原決定區，接種抗原呈現細胞(APC)，以引導淋巴球以此等CSC作為標靶。如同對黑色素瘤所進行者，免疫學手段可包括在CSC細胞表面或分泌蛋白體之抑制免疫監控的分子之鑑定及靶向。
再生醫學
單離自各種來源的組織(包括非胚胎人類組織)之標的幹細胞係有用於再生醫學，例如於各種受損組織或器官之創傷後、放射後、及/或手術後修復。舉例而言，經單離腸幹細胞，諸如自患者之健康組織或自健康捐贈者所單離出者，可用於在患有發炎性腸病(IBD)(諸如克隆氏症及潰瘍性結腸炎(UC))之患者之腸上皮修復中、以及在患 有短腸症候群之患者之腸上皮修復中生成腸上皮。
另外的用途可在具有小腸/結腸遺傳疾病之 患者之腸上皮修復中發現。包含胰臟幹細胞之培養物可用於再生醫學，例如在切除胰臟或其一部分後作為移植物、以及用於治療糖尿病(諸如第I型糖尿病及第II型糖尿病)。
在可替代的具體例中，經擴增上皮幹細胞 (例如胰臟幹細胞)係分化成胰臟β-細胞。舉例而言，可將本發明之人類胰臟幹細胞移植至小鼠中之腎周圍囊狀物之下，以使此等細胞分化形成分泌胰島素之成熟β細胞。如此，即便本發明之幹細胞群體不會以可檢測的程度分泌胰島素，仍可將幹細胞在試管內培養以便分化成胰臟β-細胞，且此等細胞可用於移植至患者以用於治療胰島素缺失型失調(諸如糖尿病)。
在又一具體例中，可自成體捐贈者中採取 小活體組織切片或組織樣本，且單離並擴增其中之幹細胞，並視需要使其進行分化，以生成用於再生目的之可移植上皮。可將標的幹細胞冷凍並解凍且放回培養物中而不會喪失幹細胞特性且沒有顯著的細胞死亡之事實進一步增加標的幹細胞用於移植目的之可應用性。
如此，本發明係提供一種用於移植至哺乳 類中，較佳為移植至人類中之幹細胞或其經擴增純系或其分化產物(或於再生醫學用途之記載內容中總稱為“幹細胞”)。本發明亦提供一種治療需要移植之患者之方法，其包含將本發明之幹細胞群體移植至患者中，其中，該患者 為哺乳類，較佳為人類。
在另一具體例中，經擴增上皮幹細胞係分 化成相關的組織命運，諸如，舉例而言，胰臟細胞(包括胰臟β-細胞)、及肝臟細胞。
如此，本發明之另一態樣係提供一種經由 細胞療法治療人類或非人類動物患者之方法。此種細胞療法涵蓋經由任何適當手段將本發明之幹細胞(諸如組織相配對的本發明之幹細胞)應用或投予至患者。特定而言，此種治療方法涉及受損組織之再生或傷口癒合。
依照本發明，可利用同種異體或自體幹細 胞或其純系擴增治療患者。“自體”細胞係源自於相同有機體且為了進行細胞療法(例如為了容許組織再生)而欲再次被引進至該相同有機體之細胞。然而，該細胞並不一定單離自與其所欲引進至之組織相同的組織。自體細胞並不需要為了克服排斥的問題而對患者進行配對。“同種異體”細胞係源自於與為了進行細胞療法(例如為了容許組織再生)而欲被引進至之個體不同的個體(儘管屬於相同物種)之細胞。為了預防排斥的問題，可能仍需要某種程度的患者配對。
一般而言，本發明之幹細胞係藉由注射或植入而被引進至患者體內。一般而言，將細胞直接注射至其意圖作用之組織中。或者，將細胞經由門靜脈進行注射。含有本發明之細胞及醫藥上可接受之載劑的注射器係含括於本發明之範疇中。附接至含有本發明之細胞及醫藥上可 接受之載劑的注射器之導管亦含括於本發明之範疇中。
本發明之幹細胞亦可用於組織之再生。為了達成此功能，可將細胞直接注射或植入至受損組織，於該處細胞可依照其在體內的位置、及/或在返回至其來源組織後進行倍增且最後分化成所需的細胞型。或者，可將標的幹細胞直接注射或植入至受損組織。可受到治療之組織包括所有受損組織，特定而言，包括可能由於疾病、外傷、創傷、自體免疫反應、或由於病毒或細菌感染而受損者。在本發明之某些具體例中，本發明之幹細胞係用於使肺、食道、胃、小腸、結腸、腸化生、輸卵管、腎臟、胰臟、膀胱、肝臟、或胃系統、或其部分/片段再生。
在某些具體例中，該患者為人類，但可替代地為非人類哺乳類，諸如貓、狗、馬、牛、豬、綿羊、兔或小鼠。
在某些具體例中，本發明之幹細胞係使用注射器，諸如漢密爾頓注射器(Hamilton syringe)注射至患者中。
熟習該項技術領域者將理解，針對所欲治療之特定狀況而言，何謂適當劑量之本發明之幹細胞。
在某些具體例中，本發明之幹細胞，無論是呈溶液、微球、或多種成分之微粒，係被投予至灌流需要再生之受損器官的組織或一部分之動脈。一般而言，此種投予將使用導管執行。導管可為用於血管成形術及/或細胞輸送之眾多氣球導管、或設計成將細胞輸送至體內特定 位置的特定目的之導管中之一者。
針對某些用途，可將幹細胞包覆成由數種 不同的可生物降解化合物所製成之微球，且具有約15μm之直徑。此方法可容許將幹細胞進行血管內投予以保持在受損位點，且在第一繼代不通過毛細管網絡而進入全身性循環。在毛細管網絡動脈側之滯留亦可促進其轉位至血管外空間。
在某些具體例中，可將幹細胞逆行注射至 血管樹，經由靜脈將其輸送至全身或局部至流入幹細胞所導向的組織或身體部位之特定靜脈。
在另一具體例中，可將本發明之幹細胞植 入至受損組織，其係黏附至可生物相容移植物。在此具體例中，可在植入至患者前，在試管內將細胞黏附至可生物相容移植物。如熟習該項技術領域者所清楚瞭解，可在植入前，使用多種黏附物之任一者將細胞黏附至移植物。僅作為實例，此種黏附物可包括纖維蛋白、整合蛋白家族中之一或多個成員、鈣黏蛋白家族中之一或多個成員、選擇蛋白(selectin)家族中之一或多個成員、一或多種細胞黏附分子(CAM)、免疫球蛋白家族中之一或多種及一或多種人工合成黏附物。此清單僅提供作為例示，並非意圖構成侷限。熟習該項技術領域者將清楚瞭解，一或多種黏附物之任何組合均可使用。
在另一具體例中，可在將基質植入至患者 前，將本發明之幹細胞包埋於基質中。一般而言，基質將 被植入至患者之受損組織。基質之實例包括以膠原蛋白為基礎之基質、以纖維蛋白為基礎之基質、以層黏蛋白為基礎之基質、以纖連蛋白為基礎之基質及人工合成基質。此清單僅提供作為例示，並非意圖構成侷限。
在另外的具體例中，可將本發明之幹細胞 連同基質形成成分植入或注射至患者。此可容許細胞在注射或植入後形成基質，確保幹細胞保持在患者內適當位置。基質形成成分之實例包括纖維蛋白膠液烷基氰基丙烯酸酯單體、增塑劑、多醣(諸如葡聚糖)、含有氧化伸乙基之寡聚物、嵌段共聚物(諸如波洛沙姆(poloxamer)及Pluronics)、非離子性界面活性劑(諸如Tween及Triton 8)、及人工合成基質形成成分。此清單僅提供作為例示，並非意圖構成侷限。熟習該項技術領域者將清楚瞭解，一或多種基質形成成分之任何組合均可使用。
在另外的具體例中，本發明之幹細胞可含於微球內。在此具體例中，可將細胞包覆於微球之中心內。亦在此具體例中，可將細胞埋置於微球之基質材料中。基質材料可包括任何合適的可生物降解聚合物，包括但不限於海藻酸鹽、聚乙二醇(PLGA)、及聚胺酯。此清單僅提供作為例示，並非意圖構成侷限。
在另外的具體例中，可將本發明之幹細胞黏附至意圖用於植入之醫學裝置。此種醫學裝置之實例包括支架、插針、縫線、分隔片、心律調整器、人工關節、人工合成皮膚、及棒桿。此清單僅提供作為例示，並非意 圖構成侷限。熟習該項技術領域者將清楚瞭解，可藉由多種方法將細胞黏附至醫學裝置。舉例而言，可使用纖維蛋白、整合蛋白家族中之一或多個成員、鈣黏蛋白家族中之一或多個成員、選擇蛋白家族之中之一或多個成員、一或多種細胞黏附分子(CAM)、免疫球蛋白家族中之一或多種及一或多種人工合成黏附物將幹細胞黏附至醫學裝置。此清單僅提供作為例示，並非意圖構成侷限。熟習該項技術領域者將清楚瞭解，一或多種黏附物之任何組合均可使用。
可使用標的幹細胞以再生醫學之形式治療 數種疾病或組織損傷。非限制性實例包括：傷口癒合、糖尿病性潰瘍、皮膚植補或再生、第1型糖尿病、心血管修復(諸如在心肌梗塞及心臟衰竭後所進行者)、CNS外傷修復(諸如在中風、腦部創傷、腦性麻痺及其他形式之腦部外傷後所進行者)、脊髓外傷、帕金森氏症、亨汀頓氏症(Huntington’s disease)、阿滋海默氏症(Alzheimer’s disease)、乳糜瀉(Celiac disease)、植片對抗宿主疾病、克隆氏症及潰瘍性結腸炎、失明及視覺障礙(例如由黃斑部病變所造成)、ALS、不孕症等。標的幹細胞之各種獸醫學用途亦在本發明之範疇中，包括但不限於在大型動物中之心肌梗塞、中風、肌腱及韌帶受損、骨關節炎、骨軟骨炎及肌肉萎縮症。
舉例而言，標的肝臟幹細胞可有用於在肝 臟上皮之放射後及/或手術後修復、或在患有慢性或急性肝臟衰竭或疾病之患者中之上皮修復之再生醫學。可治療之 肝臟疾病包括但不限於肝細胞上皮癌、阿拉吉歐症候群(Alagille Syndrome)、α 1-抗胰蛋白酶缺失、自體免疫肝炎、膽道閉鎖、慢性肝炎、肝臟之癌腫、肝硬化、肝臟囊腫、脂肪肝、半乳糖血症、捷倍耳氏症候群(Gilbert’s Syndrome)、原發性膽汁性肝硬化、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、原發性硬化性膽管炎、雷氏症候群(Reye’s Syndrome)、類肉瘤病、酪胺酸血症、第I型肝醣儲積症、威爾森氏症(Wilson’s Disease)、新生兒肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、吡咯紫質症(Porphyria)、及血色素沉積症。
導致肝臟衰竭之遺傳狀況亦可受益於使用 根據本發明之培養基及/或方法所培養的幹細胞而呈現部分或完全細胞置換形式之以細胞為基礎之療法。導致肝臟衰竭之遺傳狀況之非限制性清單包括：進行性家族性肝內膽汁滯留症、第III型肝醣儲積症、酪胺酸血症、去氧鳥苷激酶缺失、丙酮酸羧酶缺失、先天性紅細胞生成異常性貧血、多囊性肝臟疾病、多囊性腎臟疾病、α 1-抗胰蛋白酶缺失、尿素循環缺陷、有機酸血症、溶素體儲積症、及脂肪酸氧化失調。亦可受益於以細胞為基礎之療法之其他狀況包括威爾森氏症及遺傳性類澱粉變性(FAP)。
需要完整肝臟移植以達完整治療效果之肝 臟衰竭之其他非肝細胞相關成因仍可受益於利用使用根據本發明之培養基及/或方法所培養的細胞之以細胞為基礎之療法的某些功能之暫時性修復。此種狀況之實例之非限制性清單包括：原發性膽汁性肝硬化、原發性硬化性膽管 炎、阿拉吉歐症候群、同型接合家族性高膽固醇血症、具肝硬化之B型肝炎、具肝硬化之C型肝炎、布加氏症候群(Budd-Chiari syndrome)、原發性高草酸鹽尿症、自體免疫肝炎、及酒精性肝臟疾病。
本發明之肝臟幹細胞可用於治療涉及使肝 細胞功能失常之遺傳疾病之方法。此種疾病可為早發性或晚發性。早發性疾病包括代謝物相關器官衰竭(例如α 1-抗胰蛋白酶缺失)、肝醣儲積症(例如GSD II、龐培氏症(Pompe’s disease))、酪胺酸血症、輕度DGUOK、第I型CDA、尿素循環缺陷(例如OTC缺失)、有機酸血症及脂肪酸氧化失調。晚發性疾病包括原發性高草酸鹽尿症、家族性高膽固醇血症、威爾森氏症、遺傳性類澱粉變性及多囊性肝臟疾病。利用起源於本發明之肝臟幹細胞的健康肝細胞之部分或完全置換可用於恢復肝臟功能或延緩肝臟衰竭。
本發明之肝臟幹細胞亦可用於治療由遺傳 性代謝疾病所引起或起因於肝細胞感染之慢性肝臟衰竭之方法。遺傳性代謝疾病之治療可能涉及本發明之經基因修飾自體肝臟幹細胞之投予。肝細胞感染之治療可能涉及本發明之同種異體肝臟幹細胞之投予。在某些具體例中，肝臟幹細胞係在2至3個月之期間進行投予。
本發明之肝臟幹細胞可用於治療急性肝臟 衰竭，其係例如起因於可能由於使用乙醯胺苯酚、藥物或酒精所造成之肝臟中毒。在某些具體例中，恢復肝臟功能 之療法將包含注射來自冷凍且立即可用的得自本發明之幹細胞的同種異體肝細胞之肝細胞懸浮液。將合適的本發明之幹細胞予以冷凍之能力意指該幹細胞可利用於立即輸送，故其不需要等待輸血。
在置換或校正缺失的肝臟功能之例中，可 由根據本發明所生成之一或多個肝臟幹細胞構築細胞-基質結構。一般認為僅需要約10%之肝臟細胞團來達成足夠的功能。此使得由於相對有限可利用的捐贈者及較小尺寸的幼年器官，相對於整個器官移植，將幹細胞成分植入至幼童係尤其較佳。舉例而言，8個月大幼童具有重約250g之正常肝臟。該幼童將因而需要約25g之組織。成年肝臟重約1500g；因此，所需之移植物將僅為約1.5%之成年肝臟。當植入根據本發明之肝臟幹細胞，且視需要附接至聚合物支架時，在新的宿主細胞中將發生增殖，且所得肝臟細胞團將置換缺失的宿主功能。因此，本發明係提供一種用於缺失肝臟功能之肝臟再生、置換或校正之新的肝細胞來源。
本發明人亦已證實藉由本發明之方法生長 的經遺傳操作之本發明之幹細胞成功移植至免疫缺失小鼠中(參見實施例15)，經移植幹細胞所衍生之細胞返回至肝臟並在活體內生成肝細胞。因此，在本發明之一具體例中係提供一種用於移植至人類或動物之本發明之幹細胞。
因此，經由細胞療法治療人類或動物患者 之方法係含括於本發明之範疇中。在本文中，用語“動物” 意指所有哺乳類動物，較佳為人類患者。其亦包括在所有發展階段之個體動物，包括胚胎及胎兒階段。舉例而言，該患者可為成年，或該療法可用於小兒科用途(例如新生兒、幼童或青少年)。此種細胞療法涵蓋經由任何適當手段將根據本發明所生成之幹細胞投予至患者。特定而言，此種治療方法涉及受損組織之再生或傷口癒合。於本文中使用時，用語“投予”係指公認的投予形式，諸如靜脈內或注射，以及藉由移植之投予，例如藉由手術之移植、植補或根據本發明之幹細胞所衍生之經組織建造肝臟之移植。 在細胞之例中，對個體進行全身性投予可藉由例如下述方式而變得可能：經由胸管輸注至上腸繫膜動脈、腹腔動脈、鎖骨下靜脈、經由上大靜脈輸注至心臟、或經由膈下淋巴管輸注至具後續細胞遷移的腹膜腔、或經由輸注至肝臟動脈血供應或輸注至門靜脈而直接投予至肝臟部位。
每100kg的人每輸注可投予在104與1013 個之間之細胞。較佳地，每100kg的人可靜脈內輸注在約1×104至5×104與1×107至5×107個之間之細胞。更佳地，每100kg的人可靜脈內輸注在約1×104與10×106個之間之細胞。在某些具體例中，係提供標的幹細胞之單一投予。在其他具體例中，係使用多次投予。可在例如3至7個連續日數之最初治療方案期間內提供多次投予，然後在其他時間進行重複。
在某些具體例中，較宜利用起源於本發明 之肝臟幹細胞的健康肝細胞重建/置換10至20%之患者肝 臟。
在某些具體例中，用於再生醫學用途之肝 臟幹細胞為單一肝臟幹細胞之純系擴增。此單細胞可藉由引進如本文中所定義之核酸構築體而予以改良，用以例如校正遺傳缺失或突變。若有必要，亦能夠例如使用siRNA而專一性地消除表現。所欲表現之可能的多肽可為在代謝性肝臟疾病中任者有缺失之多肽，包括例如AAT(α-抗胰蛋白酶)。為了釐清肝臟生理學，較宜亦可使牽涉於Wnt、EGF、FGF、BMP或notch路徑之基因表現或失活。並且，為了篩選藥物毒性，負責肝臟藥物代謝之基因(例如在CYP家族中之基因)之表現或失活將具高度興趣。
熟習該項技術領域者將清楚瞭解，基因療 法可另外用於目的為修復受損或患病組織之方法。用途可例如為由腺病毒或反轉錄病毒基因輸送載具所製成以輸送遺傳訊息(如DNA及/或RNA)至幹細胞。熟習該項技術領域者可置換或修復在基因療法中作為標靶之特定基因。舉例而言，可將正常基因插入至在基因體內之非特定位置以置換非功能性基因。在另一實例中，可經由同源性重組將異常基因序列置換成正常基因序列。或者，選擇性回復突變可將基因回復至其正常功能。其他實例為改變特定基因之調節(將基因開啟或關閉所達之等級)。較佳地，幹細胞係在活體外藉由基因療法手段處理且隨後轉移至哺乳類，較佳為需要治療之人類。舉例而言，幹細胞所衍生之細胞可在移植至患者前在培養中進行基因修飾。
毒性試驗
經擴增幹細胞群體可進一步替代諸如Caco-2細胞之細胞系在可能的新穎藥物或已知藥物或新穎食物營養補充品之毒性試驗中之用途。此種毒性試驗可使用患者相配對或組織/器官相配對幹細胞實施，其可有用於個人化醫學。
此種毒性試驗可在試管內使用衍生自例如肝臟幹細胞或其經分化結構(諸如在ALI分化自肝臟幹細胞之結構，在毒性試驗之記載內容中總稱為“(肝臟)幹細胞”)之細胞進行試驗。此種肝臟幹細胞及其經分化後代係易於培養，且相較於例如目前用於毒性試驗之上皮細胞系，諸如Caco-2(ATCC HTB 37)、I-407(ATCC CCL6)、及XBF(ATCC CRL 8808)，其更接近地類似初代上皮細胞。利用此種肝臟幹細胞(尤其是患者相配對肝臟幹細胞)所獲得之毒性結果，係更接近地類似在患者中所獲得之結果。
以細胞為基礎之毒性測試係用於測定器官專一性細胞毒性。可測試之化合物包含癌腫化學預防劑、環境化學物、食物營養補充品、及可能的毒素。細胞係暴露於多種濃度之測試製劑一段時間。在試驗中之測試製劑之濃度範圍係在採用暴露五日及自最高可溶濃度進行對數稀釋之初步試驗中測定。在暴露期結束時，針對生長抑制率評估培養物。分析數據以測定抑制終點達50%之濃度(TC50)。
舉例而言，在肝臟肝細胞誘發細胞色素 P450酶為決定藥物功效及毒性之關鍵因子。詳言之，誘發P450為繁雜的藥物-藥物交互作用之重要機制，且其亦為限制藥物功效及管理藥物毒性之重要因子。細胞色素P450誘發試驗仍難以研發，此乃由於其需要完整的正常人類肝細胞。已證明此等細胞難以應付以足夠維持高通量試驗的大量生產之數量進行生產。
舉例而言，根據本發明之此態樣，可將候 選化合物與如本文中所述之幹細胞接觸，並可監測針對細胞或針對細胞活性之任何變化。本發明之幹細胞的其他非治療性用途之實例包括肝臟胚胎學、肝臟細胞族系、及分化路徑之研討；基因表現研究，包括重組基因表現；涉及肝臟外傷及修復之機制；肝臟之發炎性及感染性疾病之研討；致病機制之研究；以及肝臟細胞轉形機制及肝臟癌腫病原學之研究。
為達高通量目的，可將肝臟幹細胞培養在 多孔盤中，諸如，舉例而言，96孔盤或384孔盤。使用分子集合庫以鑑定出影響幹細胞之分子。較佳的集合庫包括抗體片段集合庫、胜肽噬菌體展示集合庫、胜肽集合庫(例如LOPAPTM，Sigma Aldrich)、脂質集合庫(BioMol)、合成化合物集合庫(例如LOP ACTM，Sigma Aldrich)或天然化合物集合庫(Specs，TimTec)。再者，可使用基因集合庫，其係在腺瘤細胞後代中誘發或抑制一或多個基因之表現。此等基因集合庫包含cDNA集合庫、反義集合庫、及siRNA或其他非編碼RNA集合庫。細胞較佳係暴露於多種濃度之 測試製劑一段時間。在暴露期結束時，評估培養物。用語“影響”係用於涵蓋細胞中之任何變化，包括但不限於增殖之減少或喪失、形態變化、及細胞死亡。肝臟幹細胞亦可用於鑑定出專一性地以上皮癌細胞，而並非肝臟幹細胞作為標靶之藥物。
動物模型
再者，經擴增幹細胞群體亦可用於目前缺乏合適的組織培養、或動物模型之病原體(諸如諾羅病毒)之培養。
如此，本發明之一態樣係提供一種動物模型，其包含標的幹細胞，諸如標的癌腫幹細胞。
在某些具體例中，該動物為免疫缺失非人類動物(諸如齧齒類，例如小鼠或大鼠)，此乃由於此種動物較少可能引起排斥反應。作為免疫缺失動物，較佳係使用在功能性T細胞有缺失之非人類動物，諸如裸小鼠及大鼠，以及在功能性T及B細胞有缺失之非人類動物，諸如SCID小鼠及NOD-SCID小鼠。詳細而言，較佳係使用在T、B、及NK細胞有缺失之小鼠(舉例而言，藉由將SCID、RAG2KO、或RAG1KO小鼠與IL-2Rgnull小鼠雜交而獲得之重度免疫缺失小鼠，該IL-2Rgnull小鼠包括NOD/SCID/gammacnull小鼠、NOD-scid、IL-2Rgnull小鼠、及BALB/c-Rag2null、IL-2Rgnull小鼠)，其顯示優異的可移植性。
有關非人類動物之年齡，當使用無胸腺裸小鼠、SCID小鼠、NOD/SCID小鼠、或NOG小鼠時，較佳 係使用4至100週大者。
NOG小鼠可藉由例如WO 2002/043477(以參考資料之方式併入)中所述之方法而產生，或可得自實驗動物中央協會(Central Institute for Experimental Animals)或美國傑克森實驗室(Jackson Laboratory)(NSG小鼠)。
欲進行移植之細胞可為任何類型的細胞，包括幹細胞團/純系、分化自標的幹細胞之組織切片、經單獨分散之幹細胞、在單離或冷凍/解凍後進行培養之幹細胞、及移植至另一種動物並再次單離自該動物之幹細胞。欲進行移植之細胞數目可為106個或更少，但可移植更大數目之細胞。
在某些具體例中，由於其簡易的移植技術，皮下移植係較佳。然而，移植位點並無特別限定且較佳係取決於所使用之動物而適當地選擇。用於移植NOG建立之癌細胞系之程序並無特別限定，且可使用任何慣用移植程序。
此種動物模型可用於例如搜尋藥物靶向分子及評估藥物。藥物之評估方法包括篩選藥物及篩選抗癌劑。搜尋靶向分子之方法包括但不限於使用基因晶片分析鑑定出在癌腫幹細胞中高度表現之諸如DNA及RNA之基因(例如癌腫幹細胞標記)之方法、以及使用蛋白質體學鑑定出在癌腫幹細胞中高度表現之蛋白質、胜肽、或代謝物之方法。
用於搜尋靶向分子之篩選方法包括使用細 胞生長抑制試驗自小分子集合庫、抗體集合庫、微型RNA集合庫、或RNAi集合庫等篩選出抑制癌腫幹細胞之生長的物質之方法。在獲得抑制劑後，可揭露出其標靶。
如此，本發明亦提供一種鑑定出藥物之靶 向分子之方法，該方法包含：(1)藉由將本發明之癌腫幹細胞移植至非人類動物(例如免疫功能不全小鼠或大鼠)而產生非人類動物模型；(2)在投予藥物之前後，收集顯示出以該癌腫幹細胞群體之癌腫發展過程為特徵的組織結構或顯示出其生物特性之組織切片；(3)針對DNA、RNA、蛋白質、胜肽、或代謝物之表現，檢驗/比較(2)中所收集之組織切片(投予前對投予後)；以及(4)鑑定出在組織切片中依據由癌腫幹細胞所形成之結構、源自於癌腫幹細胞之癌腫發展過程、或癌腫幹細胞之生物特性而有所差異之DNA、RNA、蛋白質、胜肽或代謝物。
本發明亦提供一種評估藥物之方法，該方 法包含：(1)藉由將本發明之癌腫幹細胞移植至非人類動物(例如免疫功能不全小鼠或大鼠)而產生非人類動物模型；(2)對(1)之非人類動物模型投予測試物質；(3)收集顯示出以源自於癌腫幹細胞之癌腫發展過程為特徵的組織結構或顯示出其生物特性之組織切片；(4)觀察在組織切片中之癌腫幹細胞經時變化、癌腫發展過程、或其生物特性；以及(5)鑑定出受到測試物質所抑制之由癌腫幹細胞所形成之結構的形成、源自於癌腫幹細胞之癌腫發展過程、或癌腫幹細胞之生物特性。
本發明亦提供一種篩選藥物之方法，該方 法包含：(1)藉由將本發明之癌腫幹細胞移植至非人類動物(例如免疫功能不全小鼠或大鼠)而產生非人類動物模型；(2)對(1)之非人類動物模型投予測試物質；(3)收集顯示出以源自於癌腫幹細胞之癌腫發展過程為特徵的組織結構或顯示出其生物特性之組織切片；(4)觀察在組織切片中之癌腫幹細胞經時變化、癌腫發展過程、或其生物特性；以及(5)鑑定出抑制由特定癌腫幹細胞所形成之結構的形成、源自於癌腫幹細胞之癌腫發展過程、或癌腫幹細胞之生物特性之測試物質。
本說明書所記載之所有專利及文獻參考資料之全部內容係特此以參考資料之方式併入。
以下實施例係僅為了例示性目的而提供，並非意圖以任何方式限制本發明之範疇。
實施例 實施例1：人類腸上皮幹細胞之單離、純系化及培養
簡言之，將人類成體或胎兒腸活體組織切片進行酶分解並在經改良生長培養基存在下接種於經照射之3T3-J2飼養體(最初得自在哈佛醫學院，波士頓，麻薩諸塞州，美國之Howard Green教授實驗室)。幹細胞在此等條件下選擇性地生長且可在試管內無限地進行繼代。
在收取人類組織之前一日，將經照射之3T3-J2細胞接種於塗佈有Matrigel之盤(BD MatrigelTM，基 底膜基質，生長因子減少(GFR)，型號354230)。為此將Matrigel在冰上解凍並以10%之濃度稀釋於冷的3T3-J2培養基中。3T3-J2生長培養基含有DMEM(Invitrogen型號11960；高葡萄糖(4.5g/L)、無L-麩醯胺酸、無丙酮酸鈉)、10%小牛血清(未受熱失活)、1%青黴素-鏈黴素及1%L-麩醯胺酸。將組織培養盤在-20℃預先冷卻15分鐘，然後將經稀釋Matrigel添加至該冷盤，並將該盤旋轉以均勻地散佈經稀釋Matrigel，然後移除多餘的Matrigel。隨後將該盤在37℃保溫箱中保溫培養15分鐘以使Matrigel層固化。
將冷凍的經照射之3T3-J2細胞解凍並在 3T3-J2生長培養基存在下塗佈於Matrigel之上。隔日早晨，在使用為人類細胞之飼養層前，以基礎生長培養基置換3T3-J2培養基。1L之基礎生長培養基含有675ml DMEM(Invitrogen型號11960；高葡萄糖(4.5g/L)、無L-麩醯胺酸、無丙酮酸鈉)、225ml F12(F-12營養物質混合物(HAM)，Invitrogen型號11765；含有L-麩醯胺酸)、100ml FBS(Hyclone型號SV30014.03；未受熱失活)、6.75ml之200mM L-麩醯胺酸(GIBCO型號25030)、10ml腺嘌呤(Calbiochem型號1152；針對儲備原液，係在過濾除菌前，將243mg之腺嘌呤添加至100ml之0.05M HCl並在室溫攪拌約一小時直到該溶液溶解。該溶液可保存在-20℃直到使用前)、1ml之5mg/ml胰島素儲備溶液(Sigma型號I-5500)、1ml之2×10-6M T3(3,3′,5-三碘-L-甲狀腺胺酸)溶液(Sigma型號T-2752；針對儲備溶液，將13.6mg T3溶解於15ml之0.02N NaOH，並利用磷酸鹽緩衝液(PBS)調整至100ml，而得2×10-4M之濃縮儲備液，其可保存在-20℃。將0.1ml之濃縮儲備液利用PBS稀釋至10ml以製造2×10-6M之工作儲備液)、2ml之200μg/ml氫化皮質酮(Sigma型號H-0888)、1ml之10μg/ml EGF(Upstate Biotechnology型號01-107)、及每ml含有10,000單位之青黴素及10,000μg之鏈黴素的10ml青黴素-鏈黴素(GIBCO型號15140)。
將人類腸活體組織切片(在冰上於冷的洗滌 緩衝劑中自醫院轉移)使用30ml冷的洗滌緩衝劑(F12：DMEM 1：1；1.0%青黴素鏈黴素；0.1%防治黴(fungizone)及2.5ml之100μg/ml健他黴素)劇烈地洗滌三次並隨後以冷的PBS洗滌一次。將活體組織切片切碎並浸泡於分解培養基(BD細胞回收溶液型號354253)中且在4℃保溫培養8至12小時，伴隨著溫和搖晃。或者，可將該組織使用2mg/mL第IV型膠原酶(Gibco，型號17104-109)進行分解且在37℃保溫培養1至2小時並同時溫和搖晃。將經分解組織製成丸塊並各自利用30mL冷的洗滌緩衝劑洗滌五次。 在最終洗滌後，將樣本短暫離心並再懸浮於經改良生長培養基中且接種於飼養體。用於人類成體腸上皮幹細胞之經改良生長培養基係由基礎生長培養基及下列因子所組成：ROCK抑制劑(R)-(+)-反式-N-(4-吡啶基)-4-(1-胺基乙基)-環己烷甲醯胺(Y-27632，Rho激酶抑制劑VI，Calbiochem，型號688000)，呈2.5μM之工作濃度；重組R-底板反應蛋白1蛋白質(R&D，型號4645-RS)，呈125ng/ml之工作濃度； 重組頭蛋白蛋白質(Peprotech，型號120-10c)，呈100ng/ml之工作濃度；Jagged-1胜肽(188-204)(AnaSpec Inc.，型號61298)，呈1μM之工作濃度；SB431542：4-(4-(苯并[d][1,3]二氧雜環戊烯-5-基)-5-(吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基)苯甲醯胺(Cayman chemical company，型號13031)，呈2μM之工作濃度；菸鹼醯胺(Sigma，型號N0636-100G)，呈10mM之工作濃度。用於人類胎兒腸上皮幹細胞之經改良生長培養基係由基礎生長培養基及下列因子所組成：ROCK抑制劑(R)-(+)-反式-N-(4-吡啶基)-4-(1-胺基乙基)-環己烷甲醯胺(Y-27632，Rho激酶抑制劑VI，Calbiochem，型號688000)，呈2.5μM之工作濃度；重組R-底板反應蛋白1蛋白質(R&D，型號4645-RS)，呈125ng/ml之工作濃度；重組頭蛋白蛋白質(Peprotech，型號120-10c)，呈100ng/ml之工作濃度；Jagged-1胜肽(188-204)(AnaSpec Inc.，型號61298)，呈1μM之工作濃度；菸鹼醯胺(Sigma，型號N0636-100G)，呈10mM之工作濃度。在三至四日後，可檢測到最初的上皮細胞群落。然後利用溫熱的0.25%胰蛋白酶(Invitrogen，型號25200056)使細胞經胰蛋白酶作用10分鐘，予以中和，再懸浮於經改良生長培養基，通過40微米細胞過濾器並以單細胞之形式接種於含有3T3-J2飼養層之新盤。每二日更換培養基。3日後，觀察成體人類上皮幹細胞之個別純系。針對胎兒腸上皮幹細胞，亦可在本實施例中使用實施例16中之SCM培養基。
使用純系複製環挑選單一群落並進行擴增 以發展成家譜細胞系，即衍生自單細胞之細胞系。
或者，可將來自由此等群落所衍生之分離 單細胞懸浮液之單細胞在顯微鏡下使用玻璃吸量管進行選擇並逐一轉移至先前塗覆有10% Matrigel且接種有飼養細胞之96孔盤。一旦該單細胞在96孔盤中形成群落，可將群落進行擴增以發展成家譜細胞系。
超過70%之腸上皮細胞在培養中保持群落 形成能力係暗示其為幹細胞。此證據支持此處所呈示之培養系統能夠保持人類腸上皮幹細胞之自我更新能力。再者，在超過400次細胞分裂後，此等腸上皮幹細胞保持其多能性分化之能力且在空氣-液體交界面試驗中形成腸樣結構。
實施例2：人類腸化生幹細胞之單離、純系化及培養
簡言之，將人類腸化生活體組織切片進行酶分解並在經改良生長培養基存在下接種於經照射之3T3-J2飼養體(最初得自在哈佛醫學院之Howard Green教授實驗室)。幹細胞在此等條件下選擇性地生長且可在試管內無限地進行繼代。
在收取人類組織之前一日，將經照射之3T3-J2細胞接種於塗佈有Matrigel之盤(BD MatrigelTM，基底膜基質，生長因子減少(GFR)，型號354230)。為此將Matrigel在冰上解凍並以10%之濃度稀釋於冷的3T3-J2培養基中。3T3-J2生長培養基含有DMEM(Invitrogen型號 11960；高葡萄糖(4.5g/L)、無L-麩醯胺酸、無丙酮酸鈉)、10%小牛血清(未受熱失活)、1%青黴素-鏈黴素及1%L-麩醯胺酸。將組織培養盤在-20℃預先冷卻15分鐘，然後將經稀釋Matrigel添加至該冷盤，並將該盤旋轉以均勻地散佈經稀釋Matrigel，然後移除多餘的Matrigel。隨後將該盤在37℃保溫箱中保溫培養15分鐘以使Matrigel層固化。
將冷凍的經照射之3T3-J2細胞解凍並在 3T3-J2生長培養基存在下塗佈於Matrigel之上。隔日早晨，在使用為人類細胞之飼養層前，以基礎生長培養基置換3T3-J2培養基。1L之基礎生長培養基含有675ml DMEM(Invitrogen型號11960；高葡萄糖(4.5g/L)、無L-麩醯胺酸、無丙酮酸鈉)、225ml F12(F-12營養物質混合物(HAM)，Invitrogen型號11765；含有L-麩醯胺酸)、100ml FBS(Hyclone型號SV30014.03；未受熱失活)、6.75ml之200mM L-麩醯胺酸(GIBCO型號25030)、10ml腺嘌呤(Calbiochem型號1152；2.43mg/ml)、1ml之5mg/ml胰島素儲備溶液(Sigma型號I-5500)、1ml之2×10-6M T3(3,3′,5-三碘-L-甲狀腺胺酸)溶液(Sigma型號T-2752；針對儲備溶液，將13.6mg T3溶解於15ml之0.02N NaOH，並利用磷酸鹽緩衝液(PBS)調整至100ml，而得2×10-4M之濃縮儲備液，其可保存在-20℃。將0.1ml之濃縮儲備液利用PBS稀釋至10ml以製造2×10-6M之工作儲備液)、2ml之200μg/ml氫化皮質酮(Sigma型號H-0888)、1ml之1mg/ml EGF(Upstate Biotechnology型號01-107)在0.1%牛血清白蛋白(Sigma型 號A-2058)、及每ml含有10,000單位之青黴素及10,000μg之鏈黴素的10ml青黴素-鏈黴素(GIBCO型號15140)。
將人類腸化生活體組織切片(在冰上於冷的 洗滌緩衝劑中自醫院轉移)使用30ml冷的洗滌緩衝劑(F12：DMEM 1：1；1.0%青黴素-鏈黴素；0.1%防治黴及2.5ml之100μg/ml健他黴素)劇烈地洗滌三次並隨後以冷的PBS洗滌一次。將活體組織切片切碎並浸泡於分解培養基(DMEM：F12 1：1；1.0%青黴素-鏈黴素；100μg/ml健他黴素；2mg/ml膠原酶(Roche，型號11088793001))中且在37℃保溫培養1至2小時並同時溫和搖晃。將經分解組織製成丸塊並各自利用30mL冷的洗滌緩衝劑洗滌五次。在最終洗滌後，將樣本短暫離心並再懸浮於經改良生長培養基中且接種於飼養體。經改良生長培養基係由基礎生長培養基及下列因子所組成：2.5μM ROCK抑制劑(R)-(+)-反式-N-(4-吡啶基)-4-(1-胺基乙基)-環己烷甲醯胺(Y-27632，Rho激酶抑制劑VI，Calbiochem，型號688000)；125ng/ml重組R-底板反應蛋白1蛋白質(R&D，型號4645-RS)；100ng/ml重組頭蛋白蛋白質(Peprotech，型號120-10c)；1μM Jagged-1胜肽(188-204)(AnaSpec Inc.，型號61298)；及2μM SB431542：4-(4-(苯并[d][1,3]二氧雜環戊烯-5-基)-5-(吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基)苯甲醯胺(Cayman chemical company，型號13031)；菸鹼醯胺(Sigma，型號N0636-100G)，呈10mM之工作濃度。
在三至四日後，可檢測到最初的上皮細胞 群落。然後利用溫熱的0.25%胰蛋白酶(Invitrogen，型號25200056)使細胞受到胰蛋白酶作用10分鐘，予以中和，再懸浮於經改良生長培養基，通過40微米細胞過濾器並以單細胞之形式接種於含有3T3-J2飼養層之新盤。每二日更換培養基。4至5日後，觀察成體人類上皮幹細胞之個別純系。
可使用純系複製環挑選單一群落並進行擴 增以發展成家譜細胞系，即衍生自單細胞之細胞系。或者，可將來自由此等群落所衍生之分離單細胞懸浮液之單細胞在顯微鏡下使用玻璃吸量管進行選擇並逐一轉移至先前塗覆有10% Matrigel且接種有飼養細胞之96孔盤。一旦該單細胞在96孔盤中形成群落，可將群落進行擴增以發展成家譜細胞系。
實施例3：人類胃上皮幹細胞之單離、純系化及培養
簡言之，將人類胃上皮活體組織切片進行酶分解並在經改良生長培養基存在下接種於經照射之3T3-J2飼養體。幹細胞在此等條件下選擇性地生長且可在試管內無限地進行繼代。
在收取人類組織之前一日，將經照射之3T3-J2細胞接種於塗佈有Matrigel之盤(BD MatrigelTM，基底膜基質，生長因子減少(GFR)，型號354230)。為此將Matrigel在冰上解凍並以10%之濃度稀釋於冷的3T3-J2培養基中。3T3-J2生長培養基含有DMEM(Invitrogen型號 11960；高葡萄糖(4.5g/L)、無L-麩醯胺酸、無丙酮酸鈉)、10%小牛血清(未受熱失活)、1%青黴素-鏈黴素及1%L-麩醯胺酸。將組織培養盤在-20℃預先冷卻15分鐘，然後將經稀釋Matrigel添加至該冷盤，並將該盤旋轉以均勻地散佈經稀釋Matrigel，然後移除多餘的Matrigel。隨後將該盤在37℃保溫箱中保溫培養15分鐘以使Matrigel層固化。
將冷凍的經照射之3T3-J2細胞解凍並在 3T3-J2生長培養基存在下塗佈於Matrigel之上。隔日早晨，在使用為人類細胞之飼養層前，以基礎生長培養基置換3T3-J2培養基。1L之基礎生長培養基含有675ml DMEM(Invitrogen型號11960；高葡萄糖(4.5g/L)、無L-麩醯胺酸、無丙酮酸鈉)、225ml F12(F-12營養物質混合物(HAM)，Invitrogen型號11765；含有L-麩醯胺酸)、100ml FBS(Hyclone型號SV30014.03；未受熱失活)、6.75ml之200mM L-麩醯胺酸(GIBCO型號25030)、10ml腺嘌呤(Calbiochem型號1152；2.43mg/ml)、1ml之5mg/ml胰島素儲備溶液(Sigma型號I-5500)、1ml之2×10-6M T3(3,3′,5-三碘-L-甲狀腺胺酸)溶液(Sigma型號T-2752；針對儲備溶液，將13.6mg T3溶解於15ml之0.02N NaOH，並利用磷酸鹽緩衝液(PBS)調整至100ml，而得2×10-4M之濃縮儲備液，其可保存在-20℃。將0.1ml之濃縮儲備液利用PBS稀釋至10ml以製造2×10-6M之工作儲備液)、2ml之200μg/ml氫化皮質酮(Sigma型號H-0888)、1ml之1mg/ml EGF(Upstate Biotechnology型號01-107)在0.1%牛血清白蛋白(Sigma型 號A-2058)、及每ml含有10,000單位之青黴素及10,000μg之鏈黴素的10ml青黴素-鏈黴素(GIBCO型號15140)。
將人類胃上皮組織活體組織切片(在冰上於 冷的洗滌緩衝劑中自醫院轉移)使用30ml冷的洗滌緩衝劑(F12：DMEM 1：1；1.0%青黴素-鏈黴素；0.1%防治黴及2.5ml之100μg/ml健他黴素)劇烈地洗滌三次並隨後以冷的PBS洗滌一次。將活體組織切片切碎並浸泡於分解培養基(DMEM：F12 1：1；1.0%青黴素-鏈黴素；100μg/ml健他黴素；2mg/ml膠原酶(Roche，型號11088793001))中且在37℃保溫培養1至2小時並同時溫和搖晃。將經分解組織製成丸塊並各自利用30mL冷的洗滌緩衝劑洗滌五次。在最終洗滌後，將樣本短暫離心並再懸浮於經改良生長培養基中且接種於飼養體。經改良生長培養基係由基礎生長培養基及下列因子所組成：2.5μM ROCK抑制劑(Y-27632，Rho激酶抑制劑VI，Calbiochem，型號688000)；125ng/ml重組R-底板反應蛋白1蛋白質(R&D，型號4645-RS)；100ng/ml重組頭蛋白蛋白質(Peprotech，型號120-10c)；1μM Jagged-1胜肽(188-204)(AnaSpec Inc.，型號61298)；及2μM SB431542(Cayman chemical company，型號13031)及10mM菸鹼醯胺(Sigma，型號N0636-100G)。
在三至四日後，可檢測到最初的胃上皮細 胞群落。然後利用溫熱的0.25%胰蛋白酶(Invitrogen，型號25200056)使細胞受到胰蛋白酶作用10分鐘，予以中和，再懸浮於經改良生長培養基，通過40微米細胞過濾器並以 單細胞之形式接種於含有3T3-J2飼養層之新盤。每二日更換培養基。3至4日後，可檢測到個別的胃上皮幹細胞。
可使用純系複製環挑選單一群落並進行擴 增以發展成家譜細胞系，即衍生自單細胞之細胞系。或者，可將來自由此等群落所衍生之分離單細胞懸浮液之單細胞在顯微鏡下使用玻璃吸量管進行選擇並逐一轉移至先前塗覆有10% Matrigel且接種有飼養細胞之96孔盤。一旦該單細胞在96孔盤中形成群落，可將群落進行擴增以發展成家譜細胞系。
超過70%之胃上皮細胞在培養中保持群落 形成能力係暗示其為幹細胞。此證據支持此處所呈示之培養系統能夠保持人類胃上皮幹細胞之自我更新能力。再者，在400次細胞分裂後，此等胃上皮幹細胞保持其多能性分化之能力且在Matrigel試驗中形成胃樣結構。
使用實質上相同的方法，在胃(包括賁門、 底部、主體、竇部等)中之區域專一性幹細胞(參見實施例21)亦已自胃的彼等區中純系化，其各自代表在胃中之不同幹細胞。
實施例4：人類肝臟上皮幹細胞之單離、純系化及培養
慢性肝臟受損及所造成之纖維化每年殺死25,000個美國人，並導致在保健負擔上超過30億美元。由A、B、及C型肝炎病毒感染、酒精濫用、或非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)所造成之末期肝臟受損為纖維化，需要同 種異體移植，儘管免疫抑制之併發症、病毒重複傳染、及再犯會限制此種療法之效用。
人類成體肝臟幹細胞之領域已陷入受爭議 且多變的進展中(Koike及Taniguchi，J Hepatobiliary Pancreat Sci.19,587-93,2012)。近期的報告顯示含有某種程度(儘管為少量)數量之幹細胞的某些小鼠肝臟“胞器”可用於肝臟細胞群集之活體外分化以在急性肝臟受損後重建小鼠肝臟(Huch等人，Nature 494,247-50,2013)。然而，有鑑於此等胞器在試管內之有限的擴增、以及其所含有之少數幹細胞，其並不會將該等幹細胞本身藉由任何新興的技術供予基因修飾。
誘發型多能性(iPS)幹細胞能夠潛在地產生 患者專一性肝細胞，且可藉由某些遺傳工程技術進行修飾(Yagi等人，Crit Rev Biomed Eng.37,377-98,2009)。然而，由於iPS細胞一般並未顯示會產生其他組織之成體幹細胞，故並不清楚是否可誘發iPS細胞以形成用於肝臟之成體幹細胞。
如今申請人已研發出自成體及胎兒組織中 以保持其未成熟狀態之方式將人類肝臟幹細胞純系化之技術，其具有高增殖率及無限擴增能力。本實施例係提供自成體及胎兒人類組織中將人類肝細胞之幹細胞純系化之示範性方法。純系化肝臟幹細胞可在試管內被誘發而分化成高度表現白蛋白之肝細胞樣細胞；且可經基因修飾(例如經由使用任何該項技術領域中所公認的方法引進異種遺傳材 料，該等方法係諸如藉由病毒載體(諸如反轉錄病毒或慢病毒載體等)之轉染、或感染)。此種經單離之經純系擴增、及/或經基因修飾肝臟幹細胞可用於多種用途，包括(不構成侷限)組織再生、傷口癒合、或用以修正遺傳缺陷(諸如以上所提及之肝臟疾病)之基因療法。
簡言之，將人類肝臟活體組織切片進行酶 分解並在經改良生長培養基存在下接種於經照射之3T3-J2飼養體。肝臟上皮幹細胞係在此等條件下選擇性地生長且可在試管內進行多次繼代。
在收取人類組織之前一日，將經照射之 3T3-J2細胞接種於塗佈有Matrigel之盤(BD MatrigelTM，基底膜基質，生長因子減少(GFR)，型號354230)。為此將Matrigel在冰上解凍並以10%之濃度稀釋於冷的3T3-J2培養基中。3T3-J2生長培養基含有DMEM(Invitrogen型號11960；高葡萄糖(4.5g/L)、無L-麩醯胺酸、無丙酮酸鈉)、10%小牛血清(未受熱失活)、1%青黴素-鏈黴素及1%L-麩醯胺酸。將組織培養盤在-20℃預先冷卻15分鐘，然後將經稀釋Matrigel添加至該冷盤，並將該盤旋轉以均勻地散佈經稀釋Matrigel，然後移除多餘的Matrigel。隨後將該盤在37℃保溫箱中保溫培養15分鐘以使Matrigel層固化。
將冷凍的經照射之3T3-J2細胞解凍並在 3T3-J2生長培養基存在下塗佈於Matrigel之上。隔日早晨，在使用為人類細胞之飼養層前，以基礎生長培養基置換3T3-J2培養基。1L之基礎生長培養基含有675ml DMEM (Invitrogen型號11960；高葡萄糖(4.5g/L)、無L-麩醯胺酸、無丙酮酸鈉)、225ml F12(F-12營養物質混合物(HAM)，Invitrogen型號11765；含有L-麩醯胺酸)、100ml FBS(Hyclone型號SV30014.03；未受熱失活)、6.75ml之200mM L-麩醯胺酸(GIBCO型號25030)、10ml腺嘌呤(Calbiochem型號1152；2.43mg/ml)、1ml之5mg/ml胰島素儲備溶液(Sigma型號I-5500)、1ml之2×10-6M T3(3,3′,5-三碘-L-甲狀腺胺酸)溶液(Sigma型號T-2752；針對儲備溶液，將13.6mg T3溶解於15ml之0.02N NaOH，並利用磷酸鹽緩衝液(PBS)調整至100ml，而得2×10-4M之濃縮儲備液，其可保存在-20℃。將0.1ml之濃縮儲備液利用PBS稀釋至10ml以製造2×10-6M之工作儲備液)、2ml之200μg/ml氫化皮質酮(Sigma型號H-0888)、1ml之1mg/ml EGF(Upstate Biotechnology型號01-107)在0.1%牛血清白蛋白(Sigma型號A-2058)、及每ml含有10,000單位之青黴素及10,000μg之鏈黴素的10ml青黴素-鏈黴素(GIBCO型號15140)。
將人類肝臟活體組織切片(在冰上於冷的洗 滌緩衝劑中自醫院轉移)使用30ml冷的洗滌緩衝劑(F12：DMEM 1：1；1.0%青黴素-鏈黴素；0.1%防治黴及2.5ml之100μg/ml健他黴素)劇烈地洗滌三次並隨後以冷的PBS洗滌一次。將活體組織切片切碎並浸泡於分解培養基(F12：DMEM 1：1；1u/ml青黴素-鏈黴素；1μg/ml健他黴素及2mg/ml膠原酶A)中且在37℃保溫培養1至2小時並同時溫和搖晃。將經分解組織製成丸塊並各自利用30 mL冷的洗滌緩衝劑洗滌五次。在最終洗滌後，將樣本短暫離心並再懸浮於經改良生長培養基中且接種於飼養體。經改良生長培養基係由基礎生長培養基及下列因子所組成：2.5μM ROCK抑制劑(Y-27632，Rho激酶抑制劑VI，Calbiochem，型號688000)；125ng/ml重組R-底板反應蛋白1蛋白質(R&D，型號4645-RS)；100ng/ml重組頭蛋白蛋白質(Peprotech，型號120-10c)；1μM Jagged-1胜肽(188-204)(AnaSpec Inc.，型號61298)；及2μM SB431542(Cayman Chemical Company，型號13031)及10mM菸鹼醯胺(Sigma，型號N0636-100G)。
在三至四日後，可檢測到最初的肝臟上皮 細胞群落。然後利用溫熱的0.25%胰蛋白酶(Invitrogen，型號25200056)使細胞受到胰蛋白酶作用10分鐘，予以中和，再懸浮於經改良生長培養基，通過40微米細胞過濾器並以單細胞之形式接種於含有3T3-J2飼養層之新盤。每二日更換培養基。3至4日後，可檢測到個別的肝臟上皮幹細胞。
可使用純系複製環挑選單一群落並進行擴 增以發展成家譜細胞系，即衍生自單細胞之細胞系。或者，可將來自由此等群落所衍生之分離單細胞懸浮液之單細胞在顯微鏡下使用玻璃吸量管進行選擇並逐一轉移至先前塗覆有10% Matrigel且接種有飼養細胞之96孔盤。一旦該單細胞在96孔盤中形成群落，可將群落進行擴增以發展成家譜細胞系。
使用本文中所述之實質上相同的程序，已 自單一純系化肝臟幹細胞中獲得肝臟幹細胞及純系擴增。此等細胞係可高度增殖且可在試管內無限地進行繼代(未顯示之數據)。
來自早期繼代中之純系化肝臟幹細胞家譜之未成熟群落，即便在約400次細胞分裂後，仍顯現出在培養中實質上相同的形態及外觀(結果未顯示)，其證實純系化肝臟幹細胞於長期培養在試管內後，仍保持其未成熟狀態，且具有高增殖率及無限擴增能力。
實施例5：人類胰臟上皮幹細胞之單離、純系化及培養
簡言之，將人類胰臟組織進行酶分解並在經改良生長培養基存在下接種於經照射之3T3-J2飼養體。胰臟上皮幹細胞係在此等條件下選擇性地生長且可在試管內進行多次繼代。
在收取人類組織之前一日，將經照射之3T3-J2細胞接種於塗佈有Matrigel之盤(BD MatrigelTM，基底膜基質，生長因子減少(GFR)，型號354230)。為此將Matrigel在冰上解凍並以10%之濃度稀釋於冷的3T3-J2培養基中。3T3-J2生長培養基含有DMEM(Invitrogen型號11960；高葡萄糖(4.5g/L)、無L-麩醯胺酸、無丙酮酸鈉)、10%小牛血清(未受熱失活)、1%青黴素-鏈黴素及1%L-麩醯胺酸。將組織培養盤在-20℃預先冷卻15分鐘，然後將經稀釋Matrigel添加至該冷盤，並將該盤旋轉以均勻地散佈經稀釋Matrigel，然後移除多餘的Matrigel。隨後將該盤在 37℃保溫箱中保溫培養15分鐘以使Matrigel層固化。
將冷凍的經照射之3T3-J2細胞解凍並在 3T3-J2生長培養基存在下塗佈於Matrigel之上。隔日早晨，在使用為人類細胞之飼養層前，以基礎生長培養基置換3T3-J2培養基。1L之基礎生長培養基含有675ml DMEM(Invitrogen型號11960；高葡萄糖(4.5g/L)、無L-麩醯胺酸、無丙酮酸鈉)、225ml F12(F-12營養物質混合物(HAM)，Invitrogen型號11765；含有L-麩醯胺酸)、100ml FBS(Hyclone型號SV30014.03；未受熱失活)、6.75ml之200mM L-麩醯胺酸(GIBCO型號25030)、10ml腺嘌呤(Calbiochem型號1152；2.43mg/ml)、1ml之5mg/ml胰島素儲備溶液(Sigma型號I-5500)、1ml之2×10-6M T3(3,3′,5-三碘-L-甲狀腺胺酸)溶液(Sigma型號T-2752；針對儲備溶液，將13.6mg T3溶解於15ml之0.02N NaOH，並利用磷酸鹽緩衝液(PBS)調整至100ml，而得2×10-4M之濃縮儲備液，其可保存在-20℃。將0.1ml之濃縮儲備液利用PBS稀釋至10ml以製造2×10-6M之工作儲備液)、2ml之200μg/ml氫化皮質酮(Sigma型號H-0888)、1ml之1mg/ml EGF(Upstate Biotechnology型號01-107)在0.1%牛血清白蛋白(Sigma型號A-2058)、及每ml含有10,000單位之青黴素及10,000μg之鏈黴素的10ml青黴素-鏈黴素(GIBCO型號15140)。
將人類胰臟組織(在冰上於冷的洗滌緩衝劑中自醫院轉移)使用30ml冷的洗滌緩衝劑(F12：DMEM 1：1；1.0%青黴素鏈黴素；0.1%防治黴及2.5ml之100μg/ml 健他黴素)劇烈地洗滌三次並隨後以冷的PBS洗滌一次。將活體組織切片切碎並浸泡於分解培養基(F12：DMEM 1：1；1u/ml青黴素-鏈黴素；1μg/ml健他黴素及2mg/ml膠原酶A)中且在37℃保溫培養1至2小時並同時溫和搖晃。 將經分解組織製成丸塊並各自利用30mL冷的洗滌緩衝劑洗滌五次。在最終洗滌後，將樣本短暫離心並再懸浮於經改良生長培養基中且接種於飼養體。經改良生長培養基係由基礎生長培養基及下列因子所組成：2.5μM ROCK抑制劑(Y-27632，Rho激酶抑制劑VI，Calbiochem，型號688000)；125ng/ml重組R-底板反應蛋白1蛋白質(R&D，型號4645-RS)；100ng/ml重組頭蛋白蛋白質(Peprotech，型號120-10c)；1μM Jagged-1胜肽(188-204)(AnaSpec Inc.，型號61298)；及2μM SB431542(Cayman chemical company，型號13031)及10mM菸鹼醯胺(Sigma，型號N0636-100G)。
在三至四日後，可檢測到最初的胰臟上皮 細胞群落。然後利用溫熱的0.25%胰蛋白酶(Invitrogen，型號25200056)使細胞受到胰蛋白酶作用10分鐘，予以中和，再懸浮於經改良生長培養基，通過40微米細胞過濾器並以單細胞之形式接種於含有3T3-J2飼養層之新盤。每二日更換培養基。3至4日後，可檢測到個別的胰臟上皮幹細胞。
可使用純系複製環挑選單一群落並進行擴 增以發展成家譜細胞系，即衍生自單細胞之細胞系。或者，可將來自由此等群落所衍生之分離單細胞懸浮液之單細胞 在顯微鏡下使用玻璃吸量管進行選擇並逐一轉移至先前塗覆有10% Matrigel且接種有飼養細胞之96孔盤。一旦該單細胞在96孔盤中形成群落，可將群落進行擴增以發展成家譜細胞系。
實施例6：純系化幹細胞在培養中保持自我更新潛能
藉由根據與實施例4所述實質上相同的程序進行單一純系化人類肝臟幹細胞之純系擴增而建立家譜細胞系。該程序係重複使用於自經擴增家譜細胞系單離單細胞，以測定在試管內進行繁殖的同時，經重複單離之細胞在多代細胞分裂期間內是否保持幹細胞之特徵，例如自我更新潛能。
第3A圖係顯示使用本發明之方法單離之成體肝臟幹細胞可在試管內繁殖超過100次(例如135次)分裂，同時仍保持未成熟細胞形態(參見第2圖)。應注意在純系內之細胞之相同的小圓形態，其具有相對較大的細胞核以及高的細胞核對細胞質比例。第3B圖係顯示即便在試管內培養中在400次細胞分裂後仍保持未成熟細胞形態。
在類似實驗中，藉由根據與實施例2所述實質上相同的程序進行單一純系化人類腸幹細胞之純系擴增而建立家譜細胞系。第5圖係顯示重複擴增自純系化人類腸幹細胞之家譜細胞系可在試管內繁殖超過400代，同時仍保持未成熟細胞形態(參見第2圖)。
在另一實驗中，將來自第4繼代及第40繼 代之純系化腸幹細胞之相等數量細胞接種於如先前所述之飼養層。相當數目之觀察到的群落表明小腸幹細胞之群落形成能力不會受到繼代所影響，分化能力之程度亦不會受到繼代所影響。
實施例7：肝臟幹細胞在MATRIGEL TM 之分化
純系化未成熟肝臟幹細胞(包括自胎兒組織中純系化者)係表現增殖標記，諸如Ki67(藉由對抗此種標記蛋白質之抗體進行檢測時，結果未顯示)、以及肝臟幹細胞標記，諸如Sox9及Krt7(結果未顯示)。Sox9係被認為會標示出在肝臟中之推定幹細胞的轉錄因子，參見Huch及Clevers(Nature Genetics 43,9-10,2011)。
同時，純系化未成熟肝臟幹細胞係缺乏白蛋白、α胎蛋白(AFP)、HNF4a、FOXA2、及其他肝細胞標記(參見第4圖、及未顯示之數據)之表現。然而，此等標記之表現可在於二維及三維分化系統中活化後立即被誘發。本實施例係證實純系化未成熟肝臟幹細胞可在MATRIGELTM基底膜基質(BD)之存在下立即進行分化，且在分化後即表現各種肝細胞標記。
將肝臟幹細胞藉由0.05%胰蛋白酶分解30至60秒。自經照射之3T3-J2纖維母細胞飼養體中分離上皮幹細胞，且藉由含有血清之培養基中和胰蛋白酶。
然後，將肝臟上皮幹細胞塗佈於經 MATRIGELTM基底膜基質(BD)塗覆之組織培養盤，並在生長培養基(CFAD+1μM Jagged-1+100ng/mL頭蛋白+125ng/mL R-底板反應蛋白-1+2.5μM ROCK抑制劑+2μM SB431542+10mM菸鹼醯胺)之存在下生長。
在3至5日後，將生長培養基更換成分化 培養基(HBM基礎培養基(Lonza，型號CC-3199)及肝細胞培養基HCMTM SingleQuotsTM Kit(Lonza，型號CC-4182)。每2日更換分化培養基日。在約10日後，採集分化結構，以便進行切片、IHC(免疫組織化學法)、IF(免疫螢光)染色、及/或RNA收集。
經單離肝臟幹細胞在(第13圖)所述之條件下在MATRIGELTM基底膜基質(BD)中分化成組織化結構。經單離肝臟幹細胞亦使用與以下實施例14中實質上相同的條件在空氣-液體交界面(ALI)分化成組織化結構。
經分化結構之IF(免疫螢光)染色顯示經分化細胞表現標識性肝臟標記基因，諸如 白蛋白、HNF-1 α(肝細胞核因子1 α)、FOXA2、及α-胎蛋白(AFP)，證實肝臟幹細胞已分化成成熟肝臟細胞(參見第4及13圖，結果未顯示)。在另一實驗中，利用SOX9、AFP及白蛋白之特定引子，使用萃取自肝臟幹細胞及在試管內分化之幹細胞之RNA，執行定量RT-PCR，以量測及比較個別標記基因之表現程度。數據係與IF實驗中之觀察一致。
同時，當比較在肝臟幹細胞與在空氣-液體交界面(ALI)分化之肝細胞之表現程度時，肝臟幹細胞標記 Sox9之表現(藉由qRT-PCR進行量測時)係被向下調節約5倍(結果未顯示)。
產生肝臟幹細胞、在試管內分化之幹細 胞、及成熟肝細胞培養物之基因表現的熱圖譜(未顯示之數據)，以進一步探討此等細胞中之基因表現差異。此等在試管內分化之幹細胞產生與成熟肝細胞某種程度重疊之整體基因體表現模式。另外，基因表現微陣列分析揭露在試管內分化之幹細胞中，調節特定肝臟功能的路徑之富集，包括專一性調節肝臟功能(諸如藉由細胞色素P450之藥物代謝及異生物質代謝)之路徑(未顯示之數據)。
實施例8：純系化小腸幹細胞可在試管內進行分化
根據與實施例2所述實質上相同的程序以單一經單離人類腸幹細胞為基礎建立家譜細胞系。然後，來自小腸幹細胞家譜細胞系之細胞係在空氣-液體交界面(ALI)細胞培養系統中分化成腸樣組織結構，實質上如實施例14所述。
使用對各種經分化細胞標記具專一性之抗體，對經分化細胞執行免疫螢光染色。第6圖係顯示純系擴增自一個單一經單離腸幹細胞之細胞可分化成：杯形細胞，其係依據PAS染色及5F4G1抗體染色(其對經分化杯形細胞具專一性)；潘氏細胞，其係依據LYZ(溶菌酶)染色；以及神經內分泌細胞，其係依據CHGA染色。此外，腸樣組織結構亦表現絨毛蛋白，其使發生吸收作用之經微 絨毛覆蓋之小腸道表面被染色。
然而，依據類似的免疫螢光染色(未顯示之 數據)，用於生成此等經分化細胞之腸幹細胞不會可檢測地表現任何此等經分化細胞標記。特定而言，純系化腸上皮幹細胞係就E-CAD(上皮細胞源之標記)及SOX9(腸幹細胞標記)而言呈陽性染色，但不會表現經分化細胞標記，諸如MUC(杯形細胞標記)、CHGA(神經內分泌細胞標記)及LYZ(潘氏細胞標記)。
再者，經單離之小腸幹細胞及經分化之結 構之基因表現陣列顯示幹細胞群體高度表現幹細胞標記，諸如Bmi1、LGR4、OLFM4及LGR5(未顯示之數據)。同時，經分化結構表現諸如MUC13之標記、神經內分泌細胞標記(CHGA、CHGB)、分泌細胞標記(MUC7)、其他分化標記，諸如Krt 20等，該等為在未成熟小腸幹細胞中不會表現之經分化小腸細胞的典型標記。此外，PCA圖譜依據基因表現模式顯示截然不同的幹細胞及經分化結構。
實施例9：純系化胃幹細胞可在試管內進行分化
根據與實施例3所述實質上相同的程序單離人類胃幹細胞。免疫螢光染色係顯示純系化人類胃上皮幹細胞展現出典型的未成熟形態(小圓細胞，其具有相對較大的細胞核以及高的細胞核對細胞質比)(第9圖A)。此外，該細胞係針對E-鈣黏蛋白(上皮細胞源)、SOX2及SOX9(胃上皮幹細胞之幹細胞標記)呈陽性染色。第9圖A。偶 然地，在培養中之一對細胞表現GKN1，其係典型的胃上皮分化標記，表明該細胞係衍生自胃。第9圖A。
自單一純系化人類胃幹細胞建立家譜細胞 系，其係在試管內進行分化以形成表現成熟胃上皮標記之柱狀上皮，該等標記係諸如GKN1、胃黏蛋白、H+K+ATPase及Muc5Ac。該結果證實純系化胃幹細胞可進行純系擴增，並同時保持在試管內分化成各種經分化胃上皮細胞型之能力。
實施例10：不同成體幹細胞分化成不同的組織/結構
將分層上皮幹細胞(來自人類上呼吸道)及柱狀上皮幹細胞(來自小腸)根據本發明之方法進行單離(參見實施例1及2)。此等幹細胞在培養中於形態上看起來類似(參見第7圖，兩個左側影像)，但其在空氣-液體交界面(ALI)培養系統中展現出不同的分化能力(參見實施例14)。
特定而言，小腸幹細胞係分化成為成熟腸樣結構(第7圖，右側，上排)，而上呼吸道幹細胞則係在相同分化系統中分化成為成熟上呼吸道上皮(第7圖，右側，下排)。此處，黏蛋白5AC係呈分離圖案對所分化之上呼吸道杯形細胞進行染色，而微管蛋白則係呈圍繞經黏蛋白5AC染色之杯形細胞的相對連續圖案對所分化之上呼吸道纖毛細胞進行染色。
在腸上皮幹細胞與上呼吸道上皮幹細胞之 間之基因表現比較(第8圖)係顯示腸幹細胞高度表現諸如OLFM4、CD133、ALDH1A1、LGR5及LGR4之標記，而上呼吸道幹細胞高度表現諸如Krt14、Krt5、p63、Krt15及SOX2之標記。
在小腸幹細胞與上呼吸道幹細胞之間之另外的基因表現比較(未顯示之數據)係顯示小腸幹細胞高度表現調節重要訊息傳遞路徑之數種受體，諸如Wnt(FZD4、FZD3、LRP6、LGR4、LGR5、FZD7及FZD5)以及TGF β-BMP(TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、ACVR1B、ACVR2A、BMPR1A)。然而，相較於上呼吸道幹細胞，小腸幹細胞幾乎不表現用於HedgeHog、Notch、Wnt及TGF β-BMP路徑之配體。此可能牽涉潘氏細胞作用為小腸幹細胞之支持子的理由。然而，上呼吸道幹細胞可能具有自體分泌訊息傳遞機制，故其自我更新並不需要潘氏細胞樣細胞型之存在。
總言之，此種基因表現模式之差異表明在經單離幹細胞中有保持未成熟之可替代的機制。
同樣地，相較於純系化人類腸幹細胞，純系化人類結腸幹細胞展現出不同的基因表現模式(未顯示之數據)。依據遍佈整個群落之陽性Ki67染色，純系化結腸幹細胞及小腸幹細胞兩者皆可高度增殖(未顯示之數據)。令人感興趣地，小腸幹細胞係分化成呈溶菌酶(Lyozyme，LYZ)陽性之潘氏細胞，但結腸幹細胞在相同條件下並不會分化成潘氏細胞。此觀察係與人類結腸組織不 含潘氏細胞之事實一致。
純系化結腸幹細胞可用於在因發炎而遭受極度侵蝕之患者中使結腸上皮再生。
實施例11：來自輸卵管之純系化成體幹細胞
根據本發明之方法(參見例如實施例1)，將人類輸卵管組織進行酶分解並接種於飼養層以形成由數百個上皮幹細胞所組成之群落(第11圖A)，並自輸卵管中單離成體幹細胞。
經單離幹細胞可在試管內分裂超過70次，而未進行分化或老化(第11圖B)。該純系化細胞係因PAX8標記(輸卵管上皮之典型標記)而染色，且呈E-鈣黏蛋白陽性(上皮細胞標記)及Ki67陽性(增殖標記)。
實施例12：來自胰臟之純系化成體幹細胞
根據本發明之方法(參見實施例1及5)，單離人類胰臟幹細胞。純系化人類胰臟幹細胞表現諸如SOX9、Pdx1及ALDH1A1之推定幹細胞標記(第12圖A)。該細胞亦可在試管內分化成管狀結構(第12圖B)。使用基因專一性引子所獲得之即時PCR結果係顯示當此等細胞分化時，Pdx1及SOX9標記之基因表現係急遽地向下調節。
實施例13：巴瑞特食道幹細胞及胃賁門幹細胞之分化
將巴瑞特食道及胃賁門細胞以0.05%胰蛋 白酶分解30至60秒。藉由手動搖晃將上皮幹細胞自經照射之(3T3-J2)纖維母細胞飼養體中分離，並藉由以吸量管上下吸吐數次而移出幹細胞純系。藉由含有血清之培養基中和胰蛋白酶，並將幹細胞純系群集懸浮於matrigel培養基(進階F12/DMEM減少型血清培養基1：1、Hepes 10mM、青黴素100單位/mL/鏈黴素100μg/ml、L-麩醯胺酸2mM、N-2補充物1×、B-27補充物1×、EGF 50ng/mL、FGF10 100ng/mL、Wnt3a 100ng/mL、R-底板反應蛋白1 100ng/mL、頭蛋白100ng/mL、SB431542 2μM、SB203580 10μM、菸鹼醯胺10mM、Y27632 2.5μM)且塗佈於經MATRIGELTM基底膜基質(BD)塗覆之組織培養盤。
在3至5日後，將matrigel培養基更換成分 化培養基(進階F12/DMEM減少型血清培養基1：1、Hepes 10mM、青黴素100單位/mL/鏈黴素100μg/mL、L-麩醯胺酸2mM、N-2補充物1×、B-27補充物1×、EGF 50ng/mL、FGF10 100ng/mL、Wnt3a 100ng/mL、R-底板反應蛋白1 100ng/mL、頭蛋白100ng/mL、Y27632 2.5μM、DBZ 10μM)。 每2日更換分化培養基。在2週後，採集分化結構，以便進行切片、免疫組織化學法(IHC)、免疫螢光法(IF)染色及RNA收集。
用於本實驗之培養基之成分係列示於下： 巴瑞特食道matrigel培養基
巴瑞特食道分化培養基
實施例14：在空氣液體交界面之小腸幹細胞之分化
經單離小腸幹細胞可根據實施例中所述之方法在具有膠原蛋白及3T3-J2插入物之空氣-液體交界面(ALI)進行分化。
首先將約1×105個3T3-J2細胞塗佈於 Transwell-COL盤(經膠原蛋白塗覆之穿孔，24孔盤，型號3495，Corning Inc.)之各孔中。將約700μL之3T3生長培養基添加至各孔之外部腔室，並將約200μL之3T3生長培養基(DMEM Invitrogen型號11960，高葡萄糖(4.5g/L)、無L-麩醯胺酸、無丙酮酸鈉；10%小牛血清，未受熱失活；1%青黴素-鏈黴素及1%L-麩醯胺酸)添加至各孔之內部腔室。
隔日，將3T3細胞以CFAD培養基(或基礎 培養基)洗滌一次，然後將腸幹細胞純系轉移至穿孔。將穿孔盤之各外部腔室以約700μL之幹細胞生長培養基(CFAD+1μM Jagged-1+100ng/mL頭蛋白+125ng/mL R-底板反應蛋白-1+2.5μM ROCK抑制劑)填滿，且將穿孔之各內部腔室以200μL之幹細胞生長培養基填滿。
每約1至2日更換幹細胞生長培養基，各 穿孔插入物之內部及外部均同。在到達融合後(針對腸幹細胞，大體上為8至10日)，將培養基更換成分化培養基(幹細胞生長培養基加上2μM GSK3抑制劑)，在各穿孔之外部腔室中含有約700μL之分化培養基，但在內部腔室中不含培養基。在約一個月內形成經分化結構。
使用能夠在廣範圍之上皮細胞中觸發分化 之此方法，純系化腸幹細胞係在空氣-液體交界面(ALI)分化成腸隱窩結構。不同於形成纖毛及杯形細胞齊備之上呼吸道上皮的上呼吸道幹細胞家譜，小腸家譜係在10日期間內形成在許多方面與小腸絨毛類似之蜿蜒柱狀上皮。使用 對小腸具專一性之特定細胞型之標記，申請人顯示小腸幹細胞係衍生出杯形細胞、潘氏細胞、神經內分泌細胞、及含有絨毛蛋白之腸細胞刷狀緣。值得注意的是，此等空氣液體交界面培養物係以高導電性為特徵，表明其形成一連串連續之緊密連接，且因而具有針對障壁功能、轉運，甚至可想見地，針對微生物組圍堵試驗(microbiome containment assay)而功能化之潛能。使用β-Ala-Lys(AMCA)(螢光二肽衍生物)之試驗，亦表明在試管內分化之腸結構具有如同人類腸功能之寡胜肽轉運功能。
完整基因體轉錄體分析係顯示某些分化標 記之表現，該分化標記係諸如刷狀緣酶，其係在ALI結構中受到向上調節。此種分析亦顯示腸幹細胞及上呼吸道上皮幹細胞僅在約300至400個基因之表現上有所不同。然而，在試管內誘發該等幹細胞進行分化後，其展現出數千種基因表現差異。此數據表明組織專一性幹細胞係定型的(committed)。此定型(commitment)係由少數基因所保持，且由於所有細胞皆培養在相同條件及相同培養基中，故為區位非依賴型。
以上數據支持下列見解：可使用標的方法 將未成熟腸幹細胞純系化並在試管內培養，且在誘發後，此等幹細胞可分化成經分化上皮，包括在活體內存在之所有細胞型。由於分化試驗係使用家譜細胞系執行，故該數據支持幹細胞之多能性能力。該數據亦說明在人類小腸中之潘氏細胞、杯形細胞、及神經內分泌細胞皆衍生自一個 單一幹細胞。
同樣地，使人類成體家譜結腸幹細胞亦在 空氣-液體交界面細胞培養系統中進行分化。單一幹細胞可分化成杯形細胞(黏蛋白2陽性)及神經內分泌細胞(CHGA陽性)。所形成之結構具極性(例如在頂端區呈絨毛蛋白染色陽性)。該結構亦表現其他分化標記，諸如Krt20。該結構中之某些細胞仍進行增殖且經Ki67標定。相較於經分化小腸幹細胞，經分化結腸幹細胞係展現出更高比例之杯形細胞。此不同的特徵係與人體中之小腸及結腸外觀一致。
使人類胎兒家譜結腸幹細胞亦在ALI進行 分化，而經分化細胞係顯示與人類成體結腸幹細胞相同的表型，其具有顯著數量之杯形細胞(黏蛋白2陽性)及一些神經內分泌細胞(CHGA陽性)。在頂端區呈絨毛蛋白染色陽性，且Ki67對進行增殖之細胞染色。
衍生自具有克隆氏症之患者之結腸幹細胞 (參見實施例21)亦可在空氣-液體交界面細胞培養系統中分化成結腸樣上皮。一個單一幹細胞可生成家譜細胞系且分化成杯形細胞(黏蛋白2陽性)或神經內分泌細胞(CHGA陽性)兩者。
實施例15：利用經分化成體幹細胞之小鼠模型中之肝臟重新組成
肝臟上皮幹細胞係使用該項技術領域中已知以及例如Cai等人(Hepatology 2007,45：1229-1239)；Hay 等人，26：894-902,2008；Kheolamai及Dickson,BMC Molecular Biology.2009；Kajiwara等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2012；109(31)：12538-12543所述之方法朝向肝臟細胞分化，成為例如肝臟前驅細胞。
細胞之植入潛能可藉由將此等移植至合適 的動物模型中而予以評估。此種模型包括 免疫缺失小鼠模型，諸如重度合併免疫缺失(SCID)、RAG缺失、NOD-SCID裸鼠、NODSCID/FAH小鼠、NOD scid γ(NSG；NOD.Cg-Prkdc<scid>Il2rg<tm1Wjl>/SzJ)、NOD Rag γ(NRG；NOD.Cg-Prkdc<tm1Mom>Il2rg<tm1Wjl>/SzJ)；免疫缺失性反丁烯二醯基乙醯乙酸水解酶(Fah)缺失小鼠、NSG/FAH(NSG,Fah-/-)、NRG/FAH(NRG,Fah-/-)、SCID-Alb-uPA(表現由白蛋白(Alb)啟動子/增強子所驅動之尿激酶型血纖維蛋白溶酶原活化劑(uPA)基因之SCID小鼠)；Alb-rtTA2S-M2/SCID/bg小鼠；Alb-HB-EGF前驅小鼠(Saito等人2001,Nature Biotechnol.,19：746-750)或如Rhim等人，1994 Science,263：1149-1152；Grompe等人，1995,Nat Genet.,10：453-460；Braun等人，2000,Nat Med.,6：320-326；Mignon等人，1998,Nat Med.,4：1185-1188；Song等人，2009,Am.J.Pathol.,175：1975-1983所述之模型。
舉例而言，可將細胞移植至NRG/FAH小鼠 中。在Fah-/-小鼠因反丁烯二醯基乙醯乙酸水解酶缺失影響肝臟及腎臟且不治療將死於肝臟衰竭而具有或依賴利用NTBC之連續藥物治療時，使Fab-/-小鼠保持飲用含有2-(2- 硝基-4-三氟甲基苯甲醯基)-1,3-環己烷二酮(NTBC)7.5g/mL之水(Overturf等人，1996)。此動物模型係例如由Grompe等人1995,Nature Genetics 10：453至460；Overturf等人1996,Nat.Genet.12(3)：266-73所記載。在細胞移植後，NTBC治療係中斷。在細胞移植後6及10週採集肝臟樣本並進行組織學檢驗。犧牲小鼠，或在僅獲得活體組織切片之例中將小鼠麻醉。或者，可藉由ELISA對小鼠之血清試驗人類肝臟專一性蛋白質，諸如白蛋白、α 1-抗胰蛋白酶、及α-胎蛋白之存在。
為了進行細胞移植，將細胞再懸浮於注射 緩衝劑(例如50% Matrigel BD Biosciences #356234、50% DMEM)中並置於冰上直到進行注射。可將細胞注射至四至八週齡新生小鼠，並在6至10週後功能性地評估肝臟。
作為特定實例，在將經修飾肝臟幹細胞引 進至NOD scid γ(NSG)小鼠宿主前，將經單離人類肝臟幹細胞進行基因修飾(例如藉由使用慢病毒或反轉錄病毒載體之病毒感染)以表現異種基因。此處之實例係顯示在分化成肝臟組織前，純系化人類肝臟幹細胞能夠表現異種基因GFP。
特定而言，將經單離肝臟幹細胞利用GFP修飾，並藉由FACS分選將GFP陽性細胞自GFP陰性細胞中分離(參見第23圖A及23圖B)。在沒有觀察到此等細胞之增殖或分化能力方面之任何異常之情況下，達成GFP陽性肝臟幹細胞在標的培養系統之連續培養(第23圖C)。經GFP標定(異種基因表現型)之肝臟幹細胞係保持未成 熟，且可迅速擴增成大群體，並同時保持此未成熟表型。再者，此等GFP表現型細胞可在試管內分化成表現白蛋白之肝細胞樣細胞(未顯示之數據)。
為了證實異種基因表現型肝臟幹細胞可在活體內分化成肝臟組織，因而重新組成肝臟，係經由將經GFP標定之幹細胞注射至NSG小鼠之脾臟而將經GFP標定之人類肝臟幹細胞引進至免疫功能不全小鼠(在本實施例中，諸如NSG小鼠)中。在注射後7日輕易地觀察到此等細胞朝向肝管發光(第24圖A及24圖B)。
本實施例證實可在培養中將經純系化/經單離肝臟幹細胞建造成表現異種基因而不會喪失其幹細胞特徵；工程建造幹細胞可根據本發明之方法在正常培養條件下在試管內擴增成大量；工程建造肝臟幹細胞可返回至幹細胞最初所單離自之正確組織(即肝臟)(儘管來自不同物種)；以及工程建造肝臟幹細胞可適宜地分化成正確組織。如此，經單離/純系化成體幹細胞可用於再生醫學，例如使受損或患病組織/器官修復或再生。
此外，本實施例亦證實可建立異種移植動物模型來研究疾病，諸如用於研究肝臟受損之異種移植小鼠模型。事實上，已顯示免疫功能不全小鼠模型在誘發初始肝臟衰竭後，係提供容許藉由人類肝細胞以及較低程度上之在試管內衍生之細胞有效重建的環境區位(Liu等人，2011)。在此實驗中，異種移植小鼠模型係提供同等或更佳的替代方案，以用於研究組織修復、傷口癒合、及/或與人 類疾病相關遺傳缺陷之校正。
舉例而言，可將純系化肝臟幹細胞建造成能夠防禦肝炎病毒、修正牽涉肝臟疾病之基因缺陷、或研發具有“人類化”肝臟之小鼠，以用於測試移植、分化、以及抗病毒及基因修正技術之概念驗證。
實施例16：癌腫幹細胞(CSC)自人類腫瘤之純系化以及來自該等之化學療法耐受型細胞
本實施例係證實標的成體幹細胞純系化方法亦可用於自癌腫組織/細胞將癌腫幹細胞(CSC)、以及其前驅病灶之幹細胞純系化。本實施例係顯示本發明之方法可用於自數種高惡性度卵巢癌之各者將大量CSC純系化。此外，使用此種CSC“集合庫”鑑定出耐受典型地用於治療具有高惡性度卵巢癌之患者的化學療法藥物之先前已存在的CSC。
高惡性度卵巢癌(HGOC)係所有婦科癌腫中最致命的。不同於其他影響女性之癌腫，高惡性度卵巢癌之五年存活率在最近30年均未改變。全世界每年有225,000個卵巢癌之新案例被診斷出，且估計有140,000個與疾病相關的死亡。此疾病之致死率係部分歸因於轉移性腫瘤細胞在腹膜中未被檢測地繁殖成大數量之能力、以及該疾病在相對較晚的第III及IV期之經常較晚之診斷。
減積手術(debulking surgery)及順鉑/紫杉醇化學療法之初步結果典型地可說是驚人的，有許多案例在 六個月的治療內顯示出可忽略不計或無法檢測的腫瘤。然而，儘管是此種對治療初步良好的反應，約70至80%之此等患者最後仍在一年後顯現腫瘤復發，且不幸地，大部分此等復發的腫瘤將耐受利用順鉑及紫杉醇之進一步治療。
如此，一般相信此等致命性復發係在初步 回合之化學療法中存活的極少數腫瘤細胞(“癌腫幹細胞”)之產物，該腫瘤細胞最終係在此六個月至兩年內或在初步療法後擴增其數量。如此，現有的卵巢癌治療之問題並非如何消除腫瘤細胞之堆積(其係輕易地由初步化學療法所殺死)，而可能是如何根絕潛伏在原初腫瘤細胞群體中之少數耐受型癌腫幹細胞。
不幸地，在本發明之前，並沒有用於自癌 腫腫瘤組織中將腫瘤細胞高效率純系化，以便測試先前已存在的化學療法耐受型細胞的見解，或更重要地，以便評估以逃避照護標準方案的此小群體之細胞作為標靶之療法的已知方法。
本文中所呈示之數據係證實本發明之方法 可用於自單一高惡性度卵巢癌患者中將多種腫瘤細胞快速純系化(第14圖)。亦即，本發明之方法能夠自每立方公分(cm3)之經切除腫瘤組織中將約5,000至10,000個獨立分開的腫瘤細胞群落快速純系化(第14圖)。支持高惡性度卵巢癌之最理想純系化之培養基條件係與顯示出支持來自一連串再生組織的人類體幹細胞之“六因子”培養基相同，而其他變更則被認為較不有效(第15圖；表3)。
*SBM係以H.Green及共事者之cFAD培養 基(活性成分EGF)為基礎之經改良培養基；SCM係SBM加上本發明所述之“六因子”(例如補充有作為Notch促效劑之Jagged-1、作為ROCK抑制劑之Y-27632、作為BMP拮抗劑之頭蛋白、作為Wnt促效劑之R-底板反應蛋白1、作為TGF-β受體抑制劑之SB431542、作為有絲分裂生長因子之EGF、菸鹼醯胺、及胰島素之基礎培養基)；SB-431542：TGF β訊息傳遞抑制劑；GSK3i：GSK3抑制劑；ROCKi：Rho相關蛋白質激酶p160ROCK之抑制劑；Nico：菸鹼醯胺。
簡言之，將一塊人類腫瘤組織進行酶分解 並在經改良生長培養基存在下接種於經照射之3T3-J2飼養體(最初得自在哈佛醫學院，波士頓，麻薩諸塞州，美國之Howard Green教授實驗室)。幹細胞在此等條件下選擇性地生長且可在試管內無限地進行繼代。
在收取人類組織之前一日，將經照射之 3T3-J2細胞接種於塗佈有Matrigel之盤(BD MatrigelTM，基 底膜基質，生長因子減少(GFR)，型號354230)。為此將Matrigel在冰上解凍並以10%之濃度稀釋於冷的3T3-J2培養基中。3T3-J2生長培養基含有DMEM(Invitrogen型號11960；高葡萄糖(4.5g/L)、無L-麩醯胺酸、無丙酮酸鈉)、10%小牛血清(未受熱失活)、1%青黴素-鏈黴素及1%L-麩醯胺酸。將組織培養盤在-20℃預先冷卻15分鐘，然後將經稀釋Matrigel添加至該冷盤，並將該盤旋轉以均勻地散佈經稀釋Matrigel，然後移除多餘的Matrigel。隨後將該盤在37℃保溫箱中保溫培養15分鐘以使Matrigel層固化。
將冷凍的經照射之3T3-J2細胞解凍並在 3T3-J2生長培養基存在下塗佈於Matrigel之上。隔日早晨，在使用為人類細胞之飼養層前，以基礎生長培養基置換3T3-J2培養基。1L之基礎生長培養基含有675ml DMEM(Invitrogen型號11960；高葡萄糖(4.5g/L)、無L-麩醯胺酸、無丙酮酸鈉)、225ml F12(F-12營養物質混合物(HAM)，Invitrogen型號11765；含有L-麩醯胺酸)、100ml FBS(Hyclone型號SV30014.03；未受熱失活)、6.75ml之200mM L-麩醯胺酸(GIBCO型號25030)、10ml腺嘌呤(Calbiochem型號1152；針對儲備溶液，係在過濾除菌前，將243mg之腺嘌呤添加至100ml之0.05M HCl並在室溫攪拌約一小時直到該溶液溶解。該溶液可保存在-20℃直到使用前)、1ml之5mg/ml胰島素儲備溶液(Sigma型號I-5500)、1ml之2×10-6M T3(3,3′,5-三碘-L-甲狀腺胺酸)溶液(Sigma型號T-2752；針對儲備溶液，將13.6mg T3溶解於15ml之0.02N NaOH，並利用磷酸鹽緩衝液(PBS)調整至100ml，而得2×10-4M之濃縮儲備液，其可保存在-20℃。將0.1ml之濃縮儲備液利用PBS稀釋至10ml以製造2×10-6M之工作儲備液)、2ml之200μg/ml氫化皮質酮(Sigma型號H-0888)、1ml之10μg/ml EGF(Upstate Biotechnology型號01-107)、及每ml含有10,000單位之青黴素及10,000μg之鏈黴素的10ml青黴素-鏈黴素(GIBCO型號15140)。
將人類腫瘤組織(在冰上於冷的洗滌緩衝劑 中自醫院轉移)使用30ml冷的洗滌緩衝劑(F12：DMEM 1：1；1.0%青黴素鏈黴素；0.1%防治黴及2.5ml之100μg/ml健他黴素)劇烈地洗滌兩次，切碎並使用2mg/mL第IV型膠原醇(Gibco，型號17104-109)進行分解且在37℃保溫培養1至2小時並同時溫和搖晃。將經分解組織製成丸塊並各自利用30mL冷的洗滌緩衝劑洗滌五次。在最終洗滌後，將樣本短暫離心並再懸浮於經改良生長培養基中且接種於飼養體。用於人類癌腫幹細胞之經改良生長培養基SCM係由基礎生長培養基及下列因子所組成：ROCK抑制劑(R)-(+)-反式-N-(4-吡啶基)-4-(1-胺基乙基)-環己烷甲醯胺(Y-27632，Rho激酶抑制劑VI，Calbiochem，型號688000)，呈2.5μM之工作濃度；重組R-底板反應蛋白1蛋白質(R&D，型號4645-RS)，呈125ng/ml之工作濃度；重組頭蛋白蛋白質(Peprotech，型號120-10c)，呈100ng/ml之工作濃度；Jagged-1胜肽(188-204)(AnaSpec Inc.，型號61298)，呈1μM之工作濃度；SB431542：4-(4-(苯并[d][1,3] 二氧雜環戊烯-5-基)-5-(吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基)苯甲醯胺(Cayman chemical company，型號13031)，呈2μM之工作濃度；菸鹼醯胺(Sigma，型號N0636-100G)，呈10mM之工作濃度。在三至四日後，可檢測到最初的癌腫幹細胞群落。然後利用溫熱的0.25%胰蛋白酶(Invitrogen，型號25200056)使細胞受到胰蛋白酶作用10分鐘，予以中和，再懸浮於經改良生長培養基，通過40微米細胞過濾器並以單細胞之形式接種於含有3T3-J2飼養層之新盤。每二日更換培養基。3日後，觀察到人類癌腫幹細胞之個別純系。
使用純系複製環挑選單一群落並進行擴增 以發展成家譜細胞系，即衍生自單細胞之細胞系。
或者，可將來自由此等群落所衍生之分離 單細胞懸浮液之單細胞在顯微鏡下使用玻璃吸量管進行選擇並逐一轉移至先前塗覆有10% Matrigel且接種有飼養細胞之96孔盤。一旦該單細胞在96孔盤中形成群落，可將群落進行擴增以發展成家譜細胞系。
再者，本文中所呈示之數據係顯示此等獨 立的腫瘤細胞群落之各者，其可分開繁殖成大數量(第16圖)，能夠在高度免疫抑制小鼠中支持腫瘤發展。生長於小鼠中之此等腫瘤的組織學係與自相同患者手術切除之腫瘤的組織學難以區別(第17圖)。
簡言之，將10,000至1000,000個之間之源 自單一腫瘤幹細胞之腫瘤幹細胞皮下注射至免疫缺失小鼠。在大約三週至八週內，對可觸摸到的腫瘤進行檢測、 解剖、固定及切片，以用於組織學分析。
有鑑於此等群落係衍生自單一腫瘤細胞， 並可獨立地且無限地繁殖，以及各家譜可支持生長於小鼠中之高惡性度卵巢癌樣腫瘤之事實，依照該項領域中對癌腫幹細胞公認的定義，此等腫瘤細胞純系係表現出癌腫幹細胞之行為。
使用相同的方法及實質上相同的條件，自 其他初期切除之癌腫(包括胰臟、肺、乳房、食道及胃之癌腫)(第18圖、第19圖及未顯示之數據)、以及在PDX(患者衍生之異種移植物)模型中自最初生長於高度免疫抑制小鼠之人類腫瘤(例如肺癌、卵巢癌及乳癌)(第20圖及未顯示之數據)獲得癌腫幹細胞純系。
實施例17：腫瘤細胞藉以耐受化學療法劑之機制的鑑定
使用本發明之方法自單一患者所建立之CSC集合庫能夠達成對先前無法觸及的問題(諸如腫瘤細胞異質性)提出疑問，以及更重要地，達成篩選及汰選以鑑定出構成致命性復發之臨床發展的基礎之化學療法耐受型變體。
本文中所述者為使用患者專一性CSC集合庫進行利用照護標準化學療法劑之選擇，以單離及擴增不僅耐受利用化學療法劑之初步挑戰且由於此等藥物亦對後續挑戰穩定地保持此耐受性之CSC(第21圖)。最後，第22圖係顯示吾等在對順鉑及紫杉醇敏感的CSC、與耐受順鉑、紫杉醇、或兩者的CSC之間之基因表現差異的初步分析。
依據來自患者腫瘤樣本之耐受型細胞的初 步分析，出現兩種總體趨勢。其中一者係呈現出反駁許多早期研究所預期之構成癌腫耐受性的基礎之假設關鍵機制。特定而言，早期研究表明過度表現多種藥物耐受性(MDR)基因係構成癌腫耐受性的基礎之關鍵機制。然而，在更多近期研究中累積的證據似乎反駁此理論。就純系化癌腫幹細胞中並未觀察到MDR基因過度表現而言，本文中所呈示之數據係支持後者發現。
另一發現係呈現出闡明經由癌腫細胞對抗 在其機制上具有明顯差異之不同的藥物所達成之耐受性機制，其中，此等藥物被認為藉由其機制而發揮作用。特定而言，在順鉑及紫杉醇耐受型CSC純系中過度再現的基因集之間係呈現出相當多的重疊，與此等藥物被認為藉以發揮作用之不同的殺死癌腫之機制無關。參見第22圖。
實施例18：海馬體幹細胞之純系化
在成體有機體中之成體神經生成、或新神經元之創造係取決於神經幹細胞之功能。成體海馬體之顆粒細胞下區(subgranular zone)係海馬體神經幹細胞生成功能性地併入現有的神經迴路的新神經元之一個區域。海馬體在學習及記憶固化中扮演角色，且容易受到神經性疾病及狀況(諸如阿滋海默氏症)所傷害。
本實施例係顯示標的方法可用於自海馬體將神經幹細胞純系化(第2圖)。此等細胞可在試管內培養 數代，且可在誘發後分化成神經元。該細胞係可高度增殖，且表現幹細胞標記，諸如SOX2及PAX6(未顯示之數據)。在經誘發分化後，其表現更多分化標記，諸如Nestin(未顯示之數據)。控制海馬體神經幹細胞之自我更新及分化之此方法係在研發新穎疾病治療方法之首要步驟。
特定而言，在下列程序之前一夜，將經照射之3T3細胞接種於經10至20% MATRIGEL®塗覆之盤。隔日早晨，將培養基更換成新鮮3T3培養基。在接種海馬體細胞前一小時，再次將培養基更換成SBM培養基(參見以上內容)。然後，實行下列步驟：
1.在解剖顯微鏡下，自小鼠(B1/6)或大鼠中單離含有海馬體之皮質之兩側。將該組織置於冷的洗滌緩衝劑中並在解剖後立即保持在冰上。
2.在組織培養通風櫥中，於培養皿上，利用無菌及可拋棄式刀片將組織切碎成細小塊。
3.藉由在37℃溫和搖動約30至60分鐘而利用酶(諸如木瓜蛋白酶或膠原酶)分解該組織。
4.藉由以吸量管溫和地上下吸吐約20次而將組織打破成為單細胞；
5.以1000rpm短暫離心約5分鐘；
6.在不妨礙丸塊之情況下小心地移除上清液，並以約40ml之洗滌緩衝劑(與其他細胞型相同)潤洗細胞。然後短暫離心以移除緩衝劑。若有必要，重複此步驟共4次。在最後步驟試著小心地移除所有洗滌培養基。
7.藉由以吸量管溫和地吸吐而利用約10ml之SCM(經預先溫熱)使細胞丸塊再懸浮。
8.經由100微米細胞過濾器過濾經分解組織。
9.將細胞接種於經MATRIGEL®及3T3纖維母細胞塗覆之盤。
10.每2至3日更換培養基。
用於繼代及再塗佈細胞：a.以經預先溫熱的PBS或DMEM溫和地洗滌細胞兩次；b.添加入經預先溫熱的0.05%至0.25%胰蛋白酶，當細胞自表面剝離時，在37℃保溫培養不超過10分鐘；c.藉由添加5ml之SBM而終止經胰蛋白酶作用，以吸量管上下吸吐細胞，以1000rpm短暫離心約5分鐘；d.小心地移除上清液，並將細胞再懸浮於SCM培養基中，轉移至新的經3T3及MATRIGEL®塗覆之盤。
用於細胞分化：在SBM培養基存在下，將細胞接種於經50% MATRIGEL®塗覆之組織培養盤。
實施例19：膀胱幹細胞之純系化
膀胱的內部內襯非常獨特。多層內襯(稱為尿道上皮)係防止在壓力下洩漏，利用獨特的蛋白質障壁抵禦病原體，且保護下方的神經元、肌肉、及血管免於遭受到尿液中之毒素。
障壁中之細胞極少分裂，但起於尿道感染 或暴露至毒素之急性受損係誘發迅速再生。尿道上皮之上層脫落，且膀胱中之幹細胞形成新的上層。
多回合的外傷可能會損害外層之再生，造成永久性結瘢、膀胱功能異常、及慢性疼痛。在慢性狀況，諸如膀胱疼痛症候群(亦稱為間質性膀胱炎)，其係主要影響女性之疾病，下方的組織(包括神經末梢)係暴露出來，其被認為是慢性疼痛之成因。在最嚴重的案例中，用於膀胱疼痛症候群及其他慢性疾病之治療法為切除膀胱。
切除膀胱的另一個原因為手術切除膀胱中之癌腫。
使用上述之標的方法，申請人已自小鼠及人類中將膀胱幹細胞純系化。膀胱幹細胞係負責製造及再生器官的內部內襯。純系化患者衍生之膀胱幹細胞係創造出治療慢性膀胱疼痛的新方式，諸如藉由產生用於具有受損膀胱之患者的新組織。
自人類及小鼠膀胱中純系化之幹細胞具有無限增殖能力，且表現諸如p63、Krt5、及Agr2之標記(未顯示之數據)。
此等純系化幹細胞可用於例如組織工程建造以修復或再生患者中之受損膀胱，或用於在試管內分化成為成熟尿道上皮以作為用於鑑定出治療感染之新醫療決策的探索工具。
實施例20：小腸之群落形成幹細胞係在遺傳上穩定
具有所建立之多種經界定之人類腸群落家譜，申請人係測試幹細胞純系之“幹細胞性(stemness)”。在本實施例中，申請人係使用獨立的家譜細胞系(或簡稱為“家譜”)在五個月期間進行系列轉移及繁殖。此等家譜係在已知會觸發來自某一範圍之來源的上皮細胞之分化的“空氣-液體”交界面生長及分化(參見實施例14)。此三種家譜之系列轉移及繁殖係在五個月後停止，所衍生之群落保持完全未成熟，儘管已完成估計400次分裂。
雖然已確立鼠細胞係歷經“永生化(immortalization)”且甚至在培養中長期增殖後仍進行轉形，但人類細胞係呈現出抵抗此等過程。申請人並未在小腸之標的幹細胞家譜中觀察到典型地伴隨永生化或轉形過程之形態變化，儘管在連續培養中生長數個月。
為了進一步測試此等腸幹細胞家譜之遺傳穩定性，申請人係在連續培養中其數個月長的擴增期間，在多個時間點執行此等家譜之套數變異(copy number variation)及外顯子定序(exome sequencing)分析。顯然地，如藉由CNV分析沒有明顯的染色體重複或擴大、以及在基因中獲得平均少於五個的非同義突變且對細胞生長沒有明顯影響所證明，此等幹細胞家譜被證明係明顯地穩定(未顯示之數據)。舉例而言，外顯子定序係顯示在20次繼代或70次細胞分裂後，僅獲得一個非同義突變，其支持經培養之小腸幹細胞係在基因體上相當穩定之見解。相同的實驗進一步顯示在晚期繼代中並沒有獲得更多結構變異，其進 一步支持此等細胞之基因體穩定性。
如此，在極度廣義中，此等腸幹細胞純系可在培養中長期繁殖，並同時保持外觀上正常的基因型及表型。
實施例21：小腸及結腸幹細胞之純系化及其區域專一性之界定
有鑑於某些疾病(諸如發炎性腸病(IBD))之許多特徵係呈現出侷限於胃腸道之特定區域，申請人係以胃腸道幹細胞之層級尋求界定此“區域專一性”。
為達此目的，在IRB核准下，申請人已自22週大胚胎(來源自妊娠失敗)中取得整個胃腸道。切除十二指腸、空腸、迴腸、升結腸、橫結腸、及降結腸以及直腸之多個區域以用於評估區域組織學以及用於相對應的幹細胞純系化。在22週，胃腸道之組織學係良好分化成個別區域，且可能使用來自各區域之組織成功地建立幹細胞群落及後續家譜。特定而言，自十二指腸、迴腸、空腸、降結腸、升結腸、及橫結腸將幹細胞純系化，並在SCM培養基及飼養層存在下培養。幹細胞純系之形態看起來明顯類似-細胞看起來皆極度未成熟，具有小尺寸及高的細胞核/細胞質比(未顯示之數據)。
如該等幹細胞所衍生自之22週大的小腸之相對應組織學所預期，表現微陣列係顯示來自小腸不同區域之幹細胞事實上係在大約100個基因中有所不同。完整 基因體轉錄體分析亦顯示衍生自小腸不同部位之幹細胞係不同於彼此且亦不同於衍生自結腸之幹細胞。舉例而言，小腸幹細胞係表現較高程度之CLDN18及MSMD，而結腸幹細胞係表現較高程度之HOXB9。
雖然結腸不同區域之幹細胞被證明更類似於另一者(衍生自結腸不同部位之幹細胞係展現出其由低於60個基因所組成之獨特的基因表現識別標誌)，結腸不同區域之熱圖譜比較係顯示此等確實可與另一者進行區別。
與此等發現一致，胃腸道的不同區域係在空氣-液體交界面培養物中分化成具有不同於幹細胞源典型的特性之結構。舉例而言，當結腸幹細胞係在三維培養中進行分化時，其係產生明顯不同於來自小腸幹細胞之與幹細胞相關之模式化絨毛的成熟上皮，且以令人聯想到結腸上皮之寬廣的杯形細胞作為特點。
使用本發明之方法，亦自具有克隆氏症之患者取得區域專一性結腸幹細胞。特定而言，在IRB核准下並經過知情同意，申請人已自小兒科克隆氏症的多個案例、功能性對照案例、及在治療後之各種階段的緩解之案例的大腸鏡檢查中取得一系列1mm活體組織切片。針對各案例，自迴腸以及升結腸、橫結腸、及降結腸取得一或多個1mm活體組織切片(未顯示之數據)。自各者衍生出多個單一幹細胞家譜，且將此等家譜進行擴增以用於分化試驗、套數變異分析、及外顯子定序。
迴腸及結腸的三個區域之幹細胞之完整基 因體表現分析係已在小兒科克隆氏症之初步案例、在一個不具有黏膜症狀之“功能性”潰瘍性結腸炎案例(對照案例)、及在一個患者已針對其接受標準治療之克隆氏症案例中完成。所有進行分析之幹細胞係已在連續培養中至少六週，且已獲得克隆氏症患者之幹細胞的基因表現圖譜及功能性對照患者之幹細胞的基因表現圖譜。
此等克隆氏症患者之幹細胞係在試管內看起來未成熟，且展現出與衍生自健康個體或胎兒組織之結腸幹細胞相同的形態(未顯示之數據)。
實施例22：人類膽道系統幹細胞之單離、純系化及培養
膽道系統係由肝內及肝外膽管所構成，其內襯被稱為膽管上皮細胞(cholangiocyte)之成熟上皮細胞，且含有深入管壁之膽管周圍腺體。在分枝點(諸如膽囊管、肺門周圍及壺腹周圍區域)之膽管周圍腺體係含有多能性幹細胞，其可自我複製且可取決於微環境而分化成肝細胞、膽管上皮細胞或胰島。
使用本文中所述之標的方法，自含有膽管之胎兒組織將幹細胞純系化。純系化膽管幹細胞係表現多能性標記，諸如SOX2；增殖標記，諸如Ki67；以及早期肝胰標記，諸如SOX9、SOX17、PDX1。膽道系統衍生之細胞係在此培養系統中表現出幹細胞之行為，其可無限地分裂且於形態上保持未成熟(未顯示之數據)。所共有的共通幹細胞特徵係指出肝臟、膽道系統及胰臟之共通胚胎學起 源，其牽涉再生醫學以及中腸器官之病理生理學及致癌作用。
實施例23：使用p63 + /Krt5 + 遠端呼吸道幹細胞(DASC)之肺再生
肺再生的可能性係由於慢性肺疾病之不可逆特性而被長久懷疑。然而，在急性感染期間承受肺組織大量流失之患者常會恢復完整的肺功能。本實施例係證實在小鼠中在H1N1流行性感冒感染後之肺再生，且在此過程中牽涉p63+Krt5+遠端呼吸道幹細胞(DASCp63/K5)。特定而言，其係顯示極少數先前已存在的DASCp63/K5細胞在對H1N1流行性感冒感染反應時歷經增殖性擴增，且可進行族系追蹤至聚集在間質性壞死之位置的初生肺泡。在活體內切除DASCp63/K5係阻止在H1N1流行性感冒感染後之肺組織再生。此外，單細胞衍生之DASCp63/K5家譜可在培養中無限地擴增，且在移植至受H1N1流行性感冒感染之鼠的肺後(例如在引進至並隨後返回至受損肺後)，可使受損肺再生。如此，此等外源幹細胞係迅速地促成肺再生，且可具有減緩急性及慢性肺疾病之顯著可能。
使用此方法，人類遠端呼吸道上皮幹細胞可以強力可靠的方式純系化，且可在試管內試驗中形成肺泡結構。此外，本文中所述之培養系統係容許自得自支氣管鏡之約1mm活體組織切片將肺上皮幹細胞純系化並將其擴增至無限細胞數以用於移植目的。
背景技術
肺再生長久以來是困難的，部分由在具有 慢性阻塞性肺部疾病(COPD)及肺部纖維化之患者中，肺功能無法阻擋且逐漸的下降所證明。然而，急性肺受損，尤其是壞死性肺炎之小兒科案例之臨床報告，係詳述在數個月內於功能上及放射學上完全解決之肺組織大規模液化事件。同樣地，急性呼吸道窘迫症候群(ARDS)之存活者，其亦可能涉及肺組織之大規模破壞，常會在液體排出的六個月內恢復正常肺功能。
類似現象亦存在於經半致命劑量之鼠適配 型H1N1流行性感冒A病毒感染之小鼠。如同在H1N1或H5N1流行性感冒感染或ARDS之其他觸發劑期間之人類肺，此等小鼠的肺發展出廣大區域的間質性白血球浸潤，其係以遠端呼吸道上皮細胞，包括肺泡中之第I型及第II型肺泡壁細胞以及在細支氣管中之克氏細胞(Clara cell)的大批流失作為特點。然而，在下一個六至八週內，此等肺回到其感染前狀態，並沒有此種間質性病灶之跡象。與此戲劇性的再生過程並行者為在細支氣管中之大量p63+Krt5+細胞在七日感染後(7dpi)之外觀、以及其在11dpi突然遷移至容有密集白血球浸潤之間質區域。一旦至此，此等p63+Krt5+細胞係組裝成最終顯出肺泡之尺寸、外觀、及基因表現圖譜之莢樣結構。此種在肺中由p63+Krt5+細胞之肺泡組裝係與純系化p63+Krt5+細胞在試管內分化成肺泡結構並行。
純系化p63+Krt5+細胞係高度未分化，能夠 長期自我更新並分化成克氏細胞及肺泡細胞型兩者，因而在本文中被稱為p63+Krt5+遠端呼吸道幹細胞(DASCp63/K5)。
此處係提供證實在H1N1流行性感冒感染 前DASCp63/K5之存在、以及此等預先存在的細胞對肺受損進行反應而歷經增殖性擴增並隨後遷移至其分化成肺泡之受損位置的遺傳族系追蹤數據。此處亦記載能夠有條件切除活化DASCp63/K5並證實DASCp63/K5係在重大急性肺外傷後進行肺再生所需者之新穎小鼠模型。最後，其證實純系化同系DASCp63/K5可在受損肺中於移植後迅速地組裝成初生肺泡。
感染前DASC p63/Krt5 至再生肺之族系追蹤
申請人先前已顯示半致命劑量之PR8 H1N1流行性感冒A病毒誘發白血球肺浸潤循環，其在9至15日感染後(dpi)之間達到高峰，且隨後在肺再生過程之下一個數週內由新的肺泡進行逐步清除及置換。為了闡明受白血球浸潤之肺組織的命運，藉由全標本包埋及系列切片檢驗在15dpi之經感染及經假性感染之對照肺。在粗略層面，H1N1流行性感冒病毒係以自呼吸道管道發出之模式觸發白血球浸潤及肺受損。在經清除之全標本包埋肺組織中，對照肺係顯示出高度有序模式之具相關肺泡的遠端細支氣管，而經感染肺則顯示出甚至延伸至支氣管肺泡網絡之最遠端的明顯中斷區域(未顯示之數據)。經由此等相同反常區域之組織學切片係顯示針對CD45呈染色陽性之密集堆擠的細胞、一般的白血球標記，包括嗜中性白血球、及牽 涉ARDS相關肺受損之巨噬細胞(未顯示之數據)。顯然不存在於此等區域之白血球浸潤者為見於相同肺之未受影響區域的肺泡之結構特徵或甚至第I型(PDPN+)及第II型(SPC+)肺泡壁細胞之標記(未顯示之數據)。此等數據係與在ARDS患者之肺中的病理學發現一致，其中，肺組織係歷經內皮肺泡障壁之破裂並造成水腫，隨後為涉及經由白血球之組織溶解的全身性壞死期。
儘管在此等區域之白血球浸潤的肺泡之局 部破壞，在15dpi前，此等相同區域係顯示出大量共同表現p63及Krt5之獨立分開的上皮細胞群集，似乎代表重生肺泡形成之早期(未顯示之數據)。15dpi肺之系列切片中Krt5染色的三維重新構築係揭露出於再生過程期間廣大的細支氣管周圍模式之所謂的p63/Krt5“莢”，表明其沿著細支氣管主軸延伸(未顯示之數據)。
類似過程係發生在病死於H1N1流行性感 冒之患者的肺中。儘管大部分此等患者係在感染一週內死亡，且如同在10dpi前進行檢驗之小鼠，並未顯示出間質性p63/Krt5莢，但兩位存活超過兩週之患者係顯示出與鼠模型緊密相符之此等細支氣管周圍p63/Krt5莢之模式。詳言之，雷射擷取顯微解剖及表現微陣列分析揭露此等細支氣管周圍莢係不同於扁平腸化生及受損肺且具有與肺泡緊密相符之表現圖譜(未顯示之數據)。
執行Krt5+細胞之遺傳族系追蹤，於感染前 開始並追蹤此等細胞在流行性感冒誘發之肺受損及再生的 循環整個期間之命運。在於感染後各種時間氣管內輸送25pfu之H1N1流行性感冒病毒並針對lacZ(大腸桿菌β-半乳糖酶)活性進行加工前9、6、及3日，利用他莫昔芬(Tamoxifen)處理在Krt5啟動子控制下表現他莫昔芬(Tamoxifen)依賴型Cre重組酶並具有Cre依賴型lacZ表現[Tg(KRT5-Cre/ERT2)ROSA26-stop-lacZ]之小鼠(未顯示之數據)。自9dpi至60dpi，全標本包埋lacZ活性從微細且限定於傳導呼吸道(未顯示之數據)，而變成沿著傳導呼吸道及包圍間質區域更廣泛地分佈，表明從15dpi進行至60dpi之過程(未顯示之數據)。重要的是，在H1N1流行性感冒感染不存下，在經他莫昔芬(tamoxifen)處理之小鼠的肺中並未檢測到lacZ活性，表明在經感染之肺中所觀察到之強力訊號係對伴隨此感染之肺受損進行回應(未顯示之數據)。來自經感染之小鼠的肺之lacZ陽性區域的組織學分析係顯示廣大間質區域之染色，其係與含有第I型及第II型肺泡壁細胞之肺泡相對應(未顯示之數據)。同時，該數據表明極少數預先存在的Krt5+幹細胞係促成對流行性感冒誘發之肺受損進行回應而產生重生肺泡之的上皮成分。
考慮到此點，使用免疫螢光法檢驗在正常 未經感染的肺中之Krt5+p63+細胞。此等細胞在正常肺中確實極少(大約總細胞之0.003%)，並以單一或小群集細胞之形式存在於細支氣管區域，且與較常見的表現CC10之克氏細胞不同且更基部地座落(未顯示之數據)。
使用本發明之方法，獲得具有長期自我更 新能力之單一純系型，並利用抗p63及Krt5之抗體共同標定所有此等純系(未顯示之數據)。最後，在鼠肺部中，在感染前Krt5+細胞之族系追蹤後，除了第I型及第II型肺泡壁細胞，LacZ+Krt5+細胞亦衍生出CC10細支氣管細胞(未顯示之數據)，表明DASCp63/Krt5細胞衍生出克氏細胞。該數據表明p63+Krt5+細胞為肺中預先存在的DASC，其歷經增殖性反應，並在急性肺受損期間促成重生肺泡。
活化DASC p63/Krt5 之有條件切除
本實驗證實DASCp63/Krt5細胞之選擇性切除抑制或消除肺中之再生回應。
吾等先前的研究係揭露正好在其遷移至肺受損之間質區域的最初數日前及整個期間，對急性肺外傷進行反應之DASCp63/Krt5開始表現角質蛋白6(Krt6)，其係對外傷進行反應之表皮幹細胞標記。如此，申請人在胚胎幹細胞中建造Krt6a位置，以生成自Krt6a對偶基因中之一者連續表現DTR之小鼠品種(未顯示之數據)。在此等細胞顯出表現Krt6基因的同時，對流行性感冒感染進行反應之DASCp63/Krt5細胞確實表現DTR轉基因(未顯示之數據)。然後，在15dpi(此時表現Krt6)發現來自Krt6-DTR小鼠之純系化DASCp63/Krt5細胞因白喉毒素在四日內死亡，而對照純系係持續增殖並在尺寸上擴增(未顯示之數據)。為了進行此小鼠模型之活體內分析，利用半致命劑量(25pfu)之H1N1流行性感冒病毒感染Krt-DTR小鼠，並在8dpi利用白喉毒素感染該Krt-DTR小鼠。白喉毒素在15dpi 內造成Krt5+Krt6+細胞之間質性群集的快速流失(未顯示之數據)，表明為高度有效的切除模型。如預期，在細支氣管上皮內之Krt5+Krt6-細胞係在白喉毒素處理中存活(未顯示之數據)。相較於野生型對照組，在白喉毒素處理後，Krt-DTR小鼠喪失90%之Krt5+細胞及高於99%之Krt6+細胞(未顯示之數據)。
申請人亦追蹤在H1N1流行性感冒感染 後，經白喉毒素處理之小鼠之命運。在30dpi，此時野生型小鼠顯示出肺受損之顯著恢復(由間質性密集體之減少所證明)，Krt-DTR小鼠的肺係顯示出更多且更廣區域之未溶解的受損，其係類似於在15dpi(未顯示之數據)所呈現之受損。在持久性肺受損中之此差異係由野生型與KRT-DTR肺之完整基因體表現分析之比較獲得更多證明，其揭露在野生型動物中朝向肺泡基因表現之強烈傾向(未顯示之數據)。此傾向之基礎係由持久性密集體之組織學比較所揭露，其顯示即便為30dpi野生型肺仍具有約30%之在15dpi所呈現之受損，近乎所有剩餘的密集體係由缺乏SPC+第II型肺泡壁細胞之第I型肺泡壁細胞網絡所組成(未顯示之數據)。
由於Krt5細胞之族系追蹤係以二個月標定 在再生區域之第I型及第II型細胞兩者，吾等預期在一至二個月之間的事件會造成成熟的肺泡(包括第II型 肺泡壁細胞)之網絡。有鑑於在切除DASCp63Krt5/Krt6後在30dpi肺中並沒有再生事件，吾等提出此等肺是否顯示出慢性退化的證據之疑問。在相同的30dpi時間點，在Krt-DTR肺 中之密集體係完全缺乏此等第I型肺泡壁細胞網絡(未顯示之數據)。事實上，在30dpi野生型小鼠中之持久性密集體係起因於新肺組織的組裝而並非是已被溶解之濃縮白血球，而30dpi Krt-DTR小鼠之密集體係反映出持續存在的CD45+白血球(未顯示之數據)。
有鑑於在切除DASCp63Krt5/Krt6後在30dpi 肺中並沒有再生事件，吾等提出此等肺是否顯示出慢性退化的證據之疑問。顯然地，持久性密集體在30dpi係顯示出針對平滑肌肌動蛋白(α SMA)之染色，該平滑肌肌動蛋白(α SMA)係先前牽涉肺的纖維化前狀態之肌纖維母細胞之標記。此等相同的間質區域係顯示出微弱但可檢測的利用Masson的三色藍(Trichrome blue)之染色，該Masson的三色藍係纖維化之標記(未顯示之數據)。一致地，野生型與DASC切除型肺在30dpi之基因表現圖譜之比較係揭露肺纖維化基因識別標誌，包括中間絲蛋白、FSP129、及膠原蛋白基因(未顯示之數據)。亦可在Krt-DTR肺中觀察到纖維化相關基因(包括膠原蛋白及中間絲蛋白)之表現(未顯示之數據)。另外的組織學檢驗係顯示出表現α-平滑肌肌動蛋白(纖維化之早期標記)之大量肌纖維母細胞。此種細胞並不存在於30dpi野生型肺之密集區域中。同時，此等數據證實切除對急性肺外傷進行反應之期間產生之DASCp63/Krt5/Krt6係導致再生過程的失敗及在肺受損部位之纖維化前事件的發展。
將外源幹細胞家譜併入至再生肺
本實驗係證實預先存在的DASCp63/Krt5在 試管內純系化、擴增、及移植後確實可參與再生過程。
使用以表現自廣佈的ROSA26位置之lacZ (ROSA26-lacZ19)作為特點之同系品種之小鼠，將來自上呼吸道(氣管細支氣管幹細胞；TBSClacZ)及肺(DASClacZ)兩者之呼吸道幹細胞純系化(未顯示之數據)。然後，使用本發明之方法，自單細胞生成TBSClacZ及DASClacZ兩者之家譜以用於進行擴增及平行分析。
在其未成熟幹細胞狀態，TBSClacZ及 DASClacZ家譜皆針對Krt5及p63呈陽性，而針對已知分化標記呈陰性。該等係在轉錄體層級上高度類似，但即便在長期系列繼代(>6個月；未顯示之數據)後仍可由識別標誌基因組進行區別。在三維培養中進行分化後，TBSClacZ及DASClacZ係分別衍生出上呼吸道上皮及肺泡結構(未顯示之數據)，並相對應地表現相異之基因組(未顯示之數據)。
為了測試此等細胞在移植後之命運，將一 百萬個衍生自TBSClacZ或DASClacZ家譜之未成熟細胞氣管內輸送至經25pfu H1N1流行性感冒病毒感染五日前及整個期間內之小鼠(未顯示之數據)。在未經感染對照組中，在90日內之任何時間，TBSClacZ及DASClacZ均未顯示出被併入至肺(未顯示之數據)。然而，在40dpi(輸送後35日)，TBSClacZ係以在90dpi不會改變且與其氣管細支氣管源一致之模式被局部化於主要呼吸道(未顯示之數據)。相對地，DASClacZ係顯示廣大分佈之lacZ活性，其係涉及 40dpi肺之較小呼吸道及間質區域(未顯示之數據)。在90dpi，DASClacZ係顯示相較於在40dpi所試驗者於間質空間更同源的模式(未顯示之數據)。
接種有DASClacZ之肺的組織學切片係揭露呈現代表肺泡之間質性肺的模式之lacZ染色，且此等相同區域係針對第I型及第II型肺泡標記呈現共同染色(未顯示之數據)。使用雷射擷取顯微解剖之此等肺之lacZ-陽性區域的基因表現分析係顯示典型的肺泡基因識別標誌，其與受損肺極為不同(未顯示之數據)。最後，亦可由所移植之DASClacZ生成克氏細胞，如CC10+細支氣管中之lacZ染色所顯示(未顯示之數據)。
同時，此等發現證實衍生自單細胞之遠端呼吸道幹細胞家譜系可藉由在試管內無限地增殖而進行擴增，並可迅速地併入至受損肺中以促成肺組織之再生。
材料與方法
將Krt5-CRE/Rosa26-LacZ小鼠用於族系追蹤。將他莫昔芬(Tam)溶解於玉米油中並經由腹腔內注射以200mg/Kg施加至小鼠中。為了進行感染後追蹤，在5、6、7dpi施加Tam。為了進行感染前追蹤，在-9、-6、-3dpi施加Tam。H1N1病毒劑量為50pfu。
在指定dpi收集小鼠肺，並供予x-gal全標本包埋染色一整夜。藉由BABB使代表性葉狀物清晰可見而顯現出清楚的藍色訊號。藉由Nuclear Red及IF將FFPE切片染色。藍色訊號指出經LacZ標定之細胞。x-gal染色 之專一性係由細菌專一性β-gal抗體染色所證實。
為了進行感染後追蹤，在施加Tam後一日 (8dpi)，在細支氣管中成功地標定某些基底細胞。在2至3個月後，藉由經LacZ標定之細胞觀察到顯著的呼吸道結構再生。彼等藍色細胞包括在細支氣管中之CC10+分泌細胞、1H8/11D6+肺泡上皮細胞(包括SPC+第II型肺泡細胞)。
為了進行感染前追蹤，觀察到與感染後追 蹤類似的模式。彼等藍色細胞包括在主支氣管中之CC10+分泌細胞及乙烯基-微管蛋白+纖毛細胞、在細支氣管中之CC10+分泌細胞、1H8+肺泡上皮細胞(包括SPC+第II型肺泡細胞)。
非感染對照小鼠僅在施加他莫昔芬3個月 後顯示出微量之藍色訊號，其可能係起因於肺細胞之正常轉移。
為了單離呼吸道幹細胞、自一隻成體 C57/B6小鼠中收集類氣管及肺並利用分散酶及胰蛋白酶進行分解，然後接種於含有3T3飼養細胞之經matrigel塗覆之盤。在4次連續繼代後，藉由純系複製環挑選單一群落並進行培養。TASC及DASC群落形態係看起來類似，且皆為Krt5及p63陽性。所有族系標記(Pdpn、CC10及SPC)皆為陰性(未顯示之數據)。目前為止，此等群落已進行繼代長達一年，且不具有可被觀察到的特性變化。
如先前報告(Kumar等人，2011)所述執行 Matrigel分化試驗。使FGF10(50ng/mL)含括於培養基中以 偏向遠端呼吸道分化。在此條件下，DASC係發生群集並生長成球樣結構。該球係內部中空且在表面具有一或二層細胞。TASC亦發生群集但顯示出較少的生長且形成不規則結構。IF染色係顯示DASC(非TASC)matrigel結構表現某些肺泡標記，諸如Aqp5及SPC。代表圖係在第9日拍攝。
再者，執行對DASC、TASC及其matrigel 結構之微陣列分析。藉由PCA分析，發現就轉錄體而言，DASC(非TASC)matrigel結構係類似於小鼠胚胎肺。並且，“幹細胞至matrigel結構”之分化過程係重演小鼠胚胎之發展過程。
為了比較matrigel結構與真實小鼠類氣管 及肺，使用LCM來解剖小鼠類氣管、細支氣管及肺泡並執行微陣列分析。藉由實施此等，而分別發展出小鼠類氣管、細支氣管及肺泡基因表現識別標誌。進一步的分析係顯示TASC matrigel結構具有較高的類氣管識別標誌，而DASC matrigel結構具有較高的細支氣管及肺泡識別標誌。
為了進行ALI分化，排除FGF10並使視黃 酸含括於培養基中以偏向近端呼吸道分化。在ALI條件下，TASC形成分層結構，而DASC形成單層結構。IF染色係顯示TASC ALI結構具有Krt5+基底細胞層以及管腔纖毛及分泌細胞層。
為了執行幹細胞之原位移植，申請人研發 出氣管內輸送系統並首先使用經retro-GFP標定之DASC進行測試。以75pfu H1N1病毒感染C57/B6小鼠，並在5dpi 執行移植(1×107個細胞)。移植後24小時，發現GFP+細胞被併入至多個肺區域，包括細支氣管、BADJ及受損間質區域。某些細胞保持類似於內源性Krt5+幹細胞之強烈的Krt5表現。由於其管樣形狀幾乎無法保留住外源細胞，故並未在類氣管中發現GFP+細胞。
在移植後1週(12dpi)，GFP+細胞形成類似 內源性Krt5莢但並不表現族系標記之群集(未顯示之數據)。在移植後2週(20dpi)，GFP+細胞形成表現Pdpn之類似更大的Krt5莢之群集。
將經LacZ標定之細胞使用於長期移植實 驗。將來自成體K5-CRE/Rosa26-LacZ小鼠之幹細胞純系化。在試管內以4OH-Tmx處理細胞4日，以誘發CRE活性。LacZ表現係由利用細菌專一性β-gal抗體之IF染色所證實，其顯示>90%幹細胞呈LacZ陽性。在移植後1個月(40dpi)，全標本包埋lacZ染色係顯示出藉由移植DASC(非TASC)所達成之呼吸道結構之再生。在進行切片後，發現在40dpi所移植之42% DASC形成細支氣管，而19%形成肺泡結構。在移植後3個月，全標本包埋LacZ染色係顯示出藉由移植DASC(非TASC)所達成之呼吸道結構之顯著再生。5% DASC形成細支氣管且83% DASC形成肺泡(針對健康肺，肺泡細胞呈大數量)。IF染色係顯示所移植之DASC形成1H8+肺泡壁細胞(包括SPC+第II型及Hop+第I型肺泡細胞)。相對地，TASC僅形成稍微類似肺腫瘤之少量不規則結構。
為了證實Krt-DTR小鼠模型，12dpi肺中之 DTR表現，係證實在其顯示出良好的DTR及Krt6之共同表現。然後，顯示出DT能夠在試管內殺死Krt-DTR細胞。 在以DT處理(0.02ug/mL)後，自感染後(23dpi)野生型及Krt-DTR小鼠肺中單離幹細胞。Krt-DTR群落在4日後死亡，而野生型群落看起來正常，即便增加DT劑量至10倍。 單離自Krt-DTR小鼠之Krt6陰性內皮細胞亦對DT敏感。
亦在活體內測試DT效果。在8dpi，經由腹腔內(50ug)及氣管內(100ug)方式給予DT。在12dpi收集小鼠肺。計算Krt6及Krt5細胞數。IF染色結果係顯示相較於野生型，在經DT處理之Krt6-DT小鼠中，Krt6+細胞數係減少近乎90%，且Krt5+細胞數亦減少70%。
針對12dpi肺執行群落形成試驗，相較於具有DT之野生型小鼠，在Krt6-DT小鼠中發現減少70至80%之群落形成細胞數減少。此數量係與藉由IF染色所得之Krt5/Krt6細胞流失性一致。
收集12及30dpi肺以用於H&E染色。量測肺的受損區域(喪失呼吸道結構、具有密集的免疫細胞浸潤)。結果顯示在12dpi野生型及Krt6至DT肺係同樣地受損(大約30%)；30dpi野生型肺係被修復一半，而Krt6-DT肺則未被修復。小鼠體重曲線係大部分與組織學一致。
<110> 杰克森實驗室(THE JACKSON LABORATORY)
<120> 非胚胎幹細胞之單離及其用途
<130> 122854-00120
<140> 103109383
<141> 2014-03-14
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<150> 61/792,027
<151> 2013-03-15
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<170> PatentIn version 3.5
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<213> 人工序列
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<223> 對人工序列的描述：合成多肽
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Claims (71)

  1. 一種自非胚胎組織單離非胚胎幹細胞之方法，該方法包含：(1)將來自非胚胎組織之分離上皮細胞在培養基中，於與第一群經致命性照射的飼養細胞及基底膜基質接觸下培養，以形成上皮細胞純系，該培養基包含：(a)Notch促效劑；(b)ROCK(Rho激酶)抑制劑；(c)骨形成蛋白(BMP)拮抗劑；(d)Wnt促效劑；(e)有絲分裂生長因子；以及(f)胰島素或IGF；該培養基視需要進一步包含下列者之至少一種：(g)TGF β受體抑制劑；以及(h)菸鹼醯胺或其類似物；(2)自該上皮細胞純系單離單細胞；以及(3)將來自步驟(2)之經單離單細胞逐一在該培養基中，於與第二群經致命性照射的飼養細胞及第二基底膜基質接觸下培養而形成單細胞純系；其中，該單細胞純系之各者代表該非胚胎幹細胞之純系擴增，藉此單離該非胚胎幹細胞。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該非胚胎組織為立方狀或柱狀上皮組織(較佳為成體立方狀或柱 狀上皮組織)。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該非胚胎幹細胞為不表現p63之成體幹細胞。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該非胚胎幹細胞為單離自成體肺組織之成體肺幹細胞。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其進一步包含自該單細胞純系單離單一非胚胎幹細胞。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其進一步包含培養該單細胞純系之其中一者，以生成該非胚胎幹細胞之家譜細胞系。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該非胚胎組織為成體組織。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該非胚胎組織為胎兒組織。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該非胚胎組織為哺乳類組織(例如人類組織)。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該非胚胎組織係得自或源於肺、食道、胃、小腸、結腸、腸化生、輸卵管、腎臟、胰臟、膀胱或肝臟、或其部分/片段。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該非胚胎組織為疾病組織、失調組織、異常狀況組織、或來自具有該疾病、失調、或異常狀況之患者之組織。
  12. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中，該疾病、 失調、或異常狀況包含腺瘤、上皮癌、腺癌、癌腫、固體腫瘤、發炎性腸病(例如克隆氏症、潰瘍性結腸炎)、潰瘍、胃病、胃炎、食道炎、膀胱炎、絲球體腎炎、多囊性腎臟疾病、肝炎、胰臟炎、發炎性失調(例如第I型糖尿病、糖尿病性腎臟疾病)及自體免疫失調。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之方法，其中，來自具有該疾病、失調、或異常狀況之患者之組織係受到該疾病、失調、或異常狀況傷害。
  14. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該非胚胎幹細胞為成體幹細胞。
  15. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，在步驟(1)中，該(上皮)細胞係經由利用酶進行酶分解而自非胚胎組織中分離。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之方法，其中，該酶包含膠原酶、蛋白酶、分散酶、鏈黴蛋白酶、彈性蛋白酶、透明質酸酶、細胞分離酶及/或胰蛋白酶。
  17. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，在步驟(1)中，該(上皮)細胞係經由溶解環繞該(上皮)細胞之細胞外基質而自該非胚胎組織分離。
  18. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該飼養細胞包含3T3-J2細胞(形成飼養細胞層)。
  19. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該基底膜基質為含層黏蛋白之基底膜基質(例如MATRIGELTM基底膜基質(BD Biosciences))，較佳為生長因子減少型。
  20. 如申請專利範圍第19項所述之方法，其中，該基底膜基質不支持三次元生長，或不會形成支持三次元生長所需要之三次元基質。
  21. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該培養基進一步包含10% FBS，該FBS未受熱失活。
  22. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該Notch促效劑包含Jagged-1。
  23. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該ROCK抑制劑包含Rho激酶抑制劑VI(Y-27632，(R)-(+)-反式-N-(4-吡啶基)-4-(1-胺基乙基)-環己烷甲醯胺))、法舒地爾或HA1071(5-(1,4-二氮雜環庚烷-1-基磺醯基)異喹啉)、或H1152((S)-(+)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-異喹啉基)磺醯基]-六氫-1H-1,4-二氮呯二鹽酸鹽)。
  24. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該BMP拮抗劑包含頭蛋白、DAN、包含DAN胱胺酸結節結構域之DAN樣蛋白質(例如賽伯洛斯蛋白及格雷姆林蛋白)、索蛋白、包含索蛋白結構域之索蛋白樣蛋白質、卵泡抑素(Follistatin)、包含卵泡抑素結構域之卵泡抑素相關蛋白質、硬化蛋白/SOST、核心蛋白聚醣、或α-2巨球蛋白。
  25. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該Wnt促效劑包含R-底板反應蛋白1、R-底板反應蛋白2、R-底板反應蛋白3、R-底板反應蛋白4、R-底板反應蛋白模擬物、Wnt家族蛋白質(例如Wnt-3a、Wnt5、Wnt-6a)、 諾里蛋白、或GSK-抑制劑(例如CHIR99021)。
  26. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該有絲分裂生長因子包含EGF(及/或角質細胞生長因子、TGF α、BDNF、HGF、bFGF)。
  27. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該TGF β受體抑制劑包含SB431542(4-(4-(苯并[d][1,3]二氧雜環戊烯-5-基)-5-(吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基)苯甲醯胺)、A83-01、SB-505124、SB-525334、LY 364947、SD-208、或SJN 2511。
  28. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該TGF β(傳訊)抑制劑結合至選自ALK5、ALK4、TGF β受體激酶1及ALK7所組成群組之一種或多種絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶並減少其活性。
  29. 如申請專利範圍第28項所述之方法，其中，該TGF β(傳訊)抑制劑係以在1nM與100μM之間、在10nM與100μM之間、在100nM與10μM之間、或大約1μM之濃度添加。
  30. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該培養基包含：在DMEM：F12為3：1之培養基中之5μg/mL胰島素；2nM之(3,3′,5-三碘-L-甲狀腺胺酸)；400ng/mL氫化皮質酮；24.3μg/mL腺嘌呤；10ng/mL EGF；10%胎牛血清(未受熱失活)；1μM Jagged-1；100ng/mL頭蛋白；125ng/mL R-底板反應蛋白1；2.5μM Y-27632；以及1.35mM L-麩醯胺酸，視需要進一步包含0.1nM 霍亂腸毒素。
  31. 如申請專利範圍第30項所述之方法，其進一步包含2μM SB431542。
  32. 如申請專利範圍第30項所述之方法，其進一步包含10mM菸鹼醯胺。
  33. 如申請專利範圍第30項所述之方法，其進一步包含2μM SB431542及10mM菸鹼醯胺。
  34. 如申請專利範圍第30項所述之方法，其中，該非胚胎組織為成體小腸，且該培養基進一步包含10mM菸鹼醯胺。
  35. 如申請專利範圍第30項所述之方法，其中，該非胚胎組織為成體小腸，且該培養基進一步包含2μM SB431542及10mM菸鹼醯胺。
  36. 如申請專利範圍第30項所述之方法，其中，該非胚胎組織為成體小腸，且該培養基進一步包含(1)2μM SB431542，以及胃泌素、PGE2、Wnt3a中之一者；或(2)10mM菸鹼醯胺、及GSK3抑制劑。
  37. 如申請專利範圍第30項所述之方法，其中，該非胚胎組織為胎兒小腸，且該培養基進一步包含10mM菸鹼醯胺。
  38. 如申請專利範圍第30項所述之方法，其中，該非胚胎組織為胎兒小腸，且該培養基進一步包含：FGF受體抑制劑；N-乙醯基-L-半胱胺酸；p38抑制劑(例如SB-202190、SB-203580、VX-702、VX-745、PD-169316、 RO-4402257及BIRB-796)；胃泌素；PGE2；FGF受體抑制劑；Shh；TGF β；10mM菸鹼醯胺及TGF β；10mM菸鹼醯胺及Wnt3a；10mM菸鹼醯胺及GSK3抑制劑；或10mM菸鹼醯胺及2μM SB431542。
  39. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該培養基缺乏下列者中之至少一者：Wnt3a、p38抑制劑(例如SB-202190、SB-203580、VX-702、VX-745、PD-169316、RO-4402257及BIRB-796)、N-乙醯基-L-半胱胺酸、胃泌素、HGF、睪固酮(例如(二氫)睪固酮)、N2、B27、及PGE2。
  40. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，在該單細胞純系之各者中，至少約40%、50%、60%、70%、或約80%之細胞，當以單細胞之形式予以單離時，能夠增殖而成為單細胞純系。
  41. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該非胚胎幹細胞，當以單細胞之形式予以單離時，能夠自我更新超過約50代、70代、100代、150代、200代、250代、300代、350代、或約400或更多代。
  42. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該非胚胎幹細胞能夠分化成該非胚胎組織之經分化細胞型。
  43. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該非胚胎幹細胞為小腸幹細胞，且能夠分化成經分化小腸細胞，該經分化小腸細胞(1)表現選自MUC或PAS(杯形細胞標記)、CHGA(神經內分泌細胞標記)、LYZ(潘氏 細胞標記)、MUC7、MUC13、及KRT20之標記；及/或(2)吸收水及養分(諸如經由經分化腸細胞)、分泌黏液(諸如經由經分化杯形細胞)、分泌腸激素(諸如經由經分化腸內分泌細胞)、或分泌抗菌物質(諸如經由經分化潘氏細胞)。
  44. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該非胚胎幹細胞表現選自：SOX9、KRT19、KRT7、LGR5、CA9、FXYD2、CDH6、CLDN18、TSPAN8、BPIFB1、OLFM4、CDH17、及PPARGC1A之一或多種幹細胞標記。
  45. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該非胚胎幹細胞為小腸幹細胞，且表現選自：OLFM4、SOX9、LGR5、CLDN18、CA9、BPIFB1、KRT19、CDH17、及TSPAN8之一或多種標記。
  46. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該非胚胎幹細胞在該非胚胎組織中實質上缺乏與經分化細胞型相關之標記之表現。
  47. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該非胚胎幹細胞為小腸幹細胞，且缺乏與經分化小腸細胞相關之標記之表現，該標記係選自：MUC或PAS(杯形細胞標記)、CHGA(神經內分泌細胞標記)、LYZ(潘氏細胞標記)、MUC7、MUC13、及KRT20。
  48. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該非胚胎幹細胞具有未成熟且未經分化形態，該形態之特徵為小圓細胞形狀且具有高的細胞核對細胞質比例。
  49. 一種非胚胎幹細胞，其係根據申請專利範圍第1項所述之方法而單離出。
  50. 如申請專利範圍第49項所述之非胚胎幹細胞，其係單離自立方狀或柱狀上皮組織(較佳為成體立方狀或柱狀上皮組織)。
  51. 如申請專利範圍第49項所述之非胚胎幹細胞，其係不表現p63之成體幹細胞。
  52. 如申請專利範圍第49項所述之非胚胎幹細胞，其係單離自成體肺組織。
  53. 一種非胚胎幹細胞之單細胞純系，其中，在該單細胞純系中至少約40%、50%、60%、70%、或約80%之細胞，當以單細胞之形式予以單離時，能夠增殖而產生單細胞純系。
  54. 一種非胚胎幹細胞之單細胞純系，其中，該非胚胎幹細胞，當以單細胞之形式予以單離時，能夠自我更新超過約50代、70代、100代、150代、200代、250代、300代、350代、或約400或更多代。
  55. 一種非胚胎幹細胞之單細胞純系，其中，該非胚胎幹細胞能夠分化成非胚胎組織之經分化細胞型，該非胚胎組織係單離出該非胚胎幹細胞之非胚胎組織、或該非胚胎幹細胞所在之非胚胎組織。
  56. 一種非胚胎幹細胞之單細胞純系，其中，該非胚胎幹細胞表現選自SOX9、KRT19、KRT7、LGR5、CA9、FXYD2、CDH6、CLDN18、TSPAN8、BPIFB1、OLFM4、 CDH17、及PPARGC1A之一或多種幹細胞標記。
  57. 一種小腸幹細胞之單細胞純系，其表現選自：OLFM4、SOX9、LGR5、CLDN18、CA9、BPIFB1、KRT19、CDH17、及TSPAN8之一或多種標記。
  58. 一種非胚胎幹細胞之單細胞純系，其中，該非胚胎幹細胞實質上缺乏與在該非胚胎組織中經分化細胞型相關之標記之表現。
  59. 一種非胚胎幹細胞之單細胞純系，其中，該非胚胎幹細胞實質上缺乏p63之表現(或不表現p63)。
  60. 一種非胚胎幹細胞之單細胞純系，其中，該非胚胎幹細胞具有未成熟且未經分化形態，該形態之特徵為小圓細胞形狀且具有高的細胞核對細胞質比例。
  61. 一種用於單離及/或培養非胚胎幹細胞之培養基，該培養基包含：(a)Notch促效劑；(b)ROCK(Rho激酶)抑制劑；(c)骨形成蛋白(BMP)拮抗劑；(d)Wnt促效劑；(e)有絲分裂生長因子；以及(f)胰島素或IGF。
  62. 如申請專利範圍第61項所述之培養基，其進一步包含下列者之至少一種：(g)TGF β受器抑制劑；以及(h)菸鹼醯胺或其前驅物。
  63. 一種治療具有疾病、失調、或異常狀況且需要治療之對象之方法，其包含：(1)使用申請專利範圍第1項所述之方法，自與該對象中受該疾病、失調、或異常狀況所影響之組織相對應的組織中單離成體幹細胞；(2)在該成體幹細胞中改變至少一種基因之表現而產生經改變成體幹細胞；(3)將該經改變成體幹細胞或其純系擴增物再次引進至該對象中，其中，在該對象中，該疾病、失調、或異常狀況之至少一種不良效應或症狀被減輕。
  64. 如申請專利範圍第63項所述之方法，其中，該單離出成體幹細胞之組織係來自健康對象。
  65. 如申請專利範圍第63項所述之方法，其中，該單離出成體幹細胞之組織係來自該對象。
  66. 如申請專利範圍第65項所述之方法，其中，該單離出成體幹細胞之組織係受該疾病、失調、或異常狀況所影響之受影響組織。
  67. 如申請專利範圍第65項所述之方法，其中，該單離出成體幹細胞之組織係鄰近於受該疾病、失調、或異常狀況所影響之受影響組織。
  68. 如申請專利範圍第63項所述之方法，其中，該至少一種基因在該對象之受該疾病、失調、或異常狀況所影響之該組織中係表現不足，且該至少一種基因之表現在該經改變成體幹細胞中係增加。
  69. 如申請專利範圍第63項所述之方法，其中，該至少一種基因在該對象之受該疾病、失調、或異常狀況所影響之該組織中係過度表現，且該至少一種基因之表現在該經改變成體幹細胞中係減少。
  70. 如申請專利範圍第63項所述之方法，其中，步驟(2)係藉由將外源DNA或RNA引進至該成體幹細胞中而達成。
  71. 一種篩選化合物之方法，該方法包含：(1)使用申請專利範圍第1項所述之方法，自對象單離成體幹細胞；(2)經由單細胞純系擴增產生該成體幹細胞之細胞系；(3)使來自該細胞系之測試細胞與複數種候選化合物接觸；以及(4)鑑定出在該測試細胞中會產生預定表型改變之一或多種化合物。
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