CN111560376B - 一种特异抑制OLFM4基因表达的siRNA及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种特异抑制OLFM4基因表达的siRNA及其应用，特异抑制OLFM4基因表达的siRNA为由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示核苷酸序列组成的双链RNA；体外试验结果表明，本发明提供的RNA可以特异高效地抑制OLFM4基因表达，促进脂滴和甘油三酯的沉积，可构建NAFLD体外模型。本发明可以应用于非酒精性脂肪性肝病的发病机制和潜在治疗方法的研究。本发明具有重要价值。

Description

一种特异抑制OLFM4基因表达的siRNA及其应用
技术领域
本发明涉及一种特异抑制OLFM4基因表达的siRNA及其应用。
背景技术
小干扰RNA(Small interfering RNA；siRNA)又称短干扰RNA(short interferingRNA)或沉默RNA(silencing RNA)，是一种长20-25个核苷酸的双股RNA。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)现象是一种进化上保守的用于抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。与靶基因转录产物mRNA存在同源互补序列的内源性或外源性双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)在细胞内特异降解该mRNA，从而实现特异性基因封闭，是一种序列特异性的转录后基因沉默。RNAi技术已广泛应用于多种生物基因功能的研究。针对目的基因构建siRNA，利用RNAi技术封闭该基因的表达，根据现象的改变可以分析基因功能。相比于基因敲除技术的长实验周期及永久性基因关闭，RNAi技术则可在短期内可控性地关闭10个基因，因此RNAi技术可以较灵活、快速得用于生物实验研究。siRNA经过化学修饰可以使其免受酶解，具有更良好的靶基因沉默效率、细胞穿透能力、热力学稳定性以及药物代谢学特征。RNAi技术已经广泛运用于疾病发病机制的研究。
非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除外酒精和其他明确肝损因素所致的以肝细胞脂肪变性和脂质贮积为特征的临床病理综合征。近年来，随着人们生活习惯和饮食结构的改变，我国成人NAFLD患病率快速增长，已高达29.2％，西方一些发达国家更是高于30％，已成为临床最常见的慢性肝病。根据病理学改变及临床表现，可将NAFLD的自然病程分为单纯性NAFLD和非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)。单纯性脂肪肝是一种良性疾病，而NASH却可以逐渐向肝硬化、肝癌等终末期肝病进展。脂变肝脏对很多药物和毒物的敏感性增加，增加了临床用药风险；再者，NAFLD可通过加剧机体代谢紊乱与2型糖尿病、冠心病、慢性肾脏疾病、肝外恶性肿瘤等疾病的高发密切相关，可能导致严重的临床后果。NAFLD发生发展的分子机制至今尚未明确，其治疗也缺乏特别有效方法。因此，加强NAFLD的相关研究，尤其是NAFLD发病机制的研究对推动NAFLD的防治工作有着重要的意义。
嗅质蛋白4(olfactomedin4，OLFM4，又称GW112或hGC-1)是一种具有多种生物学功能的糖蛋白，属于嗅质蛋白家族，该家族在C端特异性存在一个含有约250个氨基酸的嗅质蛋白结构域。OLFM4最初是在人造血髓细胞中用粒细胞集落刺激因子处理克隆得到，位于13q14.3号染色体上，编码了一个510个氨基酸的糖蛋白，其分子量为72kDa。OLMF4可在细胞膜、细胞质、细胞核、线粒体和成熟的中性粒细胞颗粒中表达。OLFM4的表达具有组织器官特异性，在消化道中表达相对较高，在胃、骨髓中有中度表达，在其他组织中表达较弱或不表达。OLFM4在炎症性肠病肠黏膜上皮细胞及胃癌等消化系统肿瘤组织中表达进一步升高，参与自身免疫调节以及肿瘤细胞周期与凋亡调控。目前尚未有研究报道OLFM4与非酒精性脂肪肝关系，本技术方案首次提出OLFM4可能与NAFLD相关，并通过预实验发现OLFM4的表达水平在NAFLD的细胞模型中显著上调，提示了OLFM4在NAFLD中的潜在调节作用。采用RNAi技术进行OLFM4在NAFLD发病中机制的研究是对NAFLD发病机制的重要补充，对揭示OLFM4在NAFLD中的潜在发病机制有重要意义，有助于启发后续研究从全新的角度解决NAFLD的治疗难题，具有重要的临床、科研意义和巨大的社会经济效益。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种特异抑制OLFM4基因表达的siRNA及其应用。
为实现上述目标，本发明技术方案如下：
第一方面，涉及一种特异抑制OLFM4基因表达的siRNA，它是由SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示核苷酸序列组成的双链RNA。
进一步的，所述OLFM4基因序列如SEQ ID NO.1所示。
更进一步的，所述siRNA靶序列如SEQ ID NO.2所示。
再进一步的，所述siRNA在各链化学合成时添加dTdT悬垂修饰。
第二方面，涉及一种所述特异抑制OLFM4基因表达的siRNA在抑制OLFM4基因表达中的应用，所述特异抑制OLFM4基因表达的siRNA在制备抑制OLFM4基因表达药物中的应用。
进一步的，所述特异性抑制OLFM4基因表达的siRNA在非酒精性脂肪肝潜在治疗的应用。
进一步的，所述特异抑制OLFM4基因表达的siRNA在非酒精性脂肪性肝病发病机制研究中的应用，通过所述siRNA特异抑制肝原代细胞中OLFM4基因表达构建NAFLD体外模型用于非酒精性脂肪性肝病发病机制研究。
更进一步的，涉及一种肝细胞的脂变方法，将所述小干扰RNA导入肝细胞，得到脂滴增多，使目的细胞脂变。
所述的肝细胞包括L02人正常肝细胞、QSG-7701人正常肝细胞、HepG2肝癌细胞等细胞株以及人肝细胞。
本发明的有益效果是，本发明提供能够特异高效抑制OLFM4基因表达的siRNA。体外试验结果表明，本发明提供的RNA可以特异高效地抑制OLFM4基因表达，促进脂滴和抑制甘油三酯的沉积。可构建NAFLD体外模型，从而可以应用于非酒精性脂肪性肝病发病机制的研究，具有重大价值。
附图说明
图1为qPCR检测转染siRNA-01后HepG2细胞中OLFM4的表达水平图。
图2为qPCR检测转染siRNA-02和siRNA-03后HepG2细胞中OLFM4的表达水平图。
图3为转染siRNA-01后各组HepG2细胞脂变情况的油红O染色图。
图4为转染siRNA-01后各组HepG2细胞脂变情况的甘油三酯定量图。
具体实施方式
本发明特异抑制OLFM4基因表达的siRNA，它是由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示核苷酸序列组成的双链RNA。所述siRNA在抑制OLFM4基因表达中的应用也属于本发明的保护范围。所述OLFM4基因序列如SEQ ID NO.1所示。所述siRNA促进脂肪肝脂质沉积。所述siRNA可应用于非酒精性脂肪性肝病发病机制研究。
以下的实施例是便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。统计学方法：采用SPSS11.5统计分析软件分析，各样本均数的比较采用Student t test分析。
人肝细胞株HepG2，购于中国科学院上海细胞库。
油红O购自广州奥凯公司。甘油三酯测定试剂盒、RIPA裂解液购自普利莱公司。油酸钠和软脂酸钠购自美国Sigma公司。PBS购自HyClone公司。
实施例1、siRNA设计合成
一、OLFM4 siRNA的合成
通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库中获取人OLFM4 mRNA的序列全长(NM_006418.5；SEQ ID NO.1)，根据RNAi原理，结合设计软件，设计三条OLFM4siRNA，进行BLAST比对检查以保证和其他基因没有同源性。在实验的基础上，筛选出有效针对人OLFM4基因的siRNA。
(1)OLFM4 siRNA-01靶序列如下：
GTAACATGGTGATTAGTAA(SEQ ID NO.2)；
OLFM4 siRNA-01核心序列如下：
正义链：5’-GUAACAUGGUGAUUAGUAA-3’(SEQ ID NO.3)；
反义链：5’-CAUUGUACCACUAAUCAUU-3’(SEQ ID NO.4)。
(2)OLFM4 siRNA-02靶序列如下：
GTGGAACGCTTGGAATTCA(SEQ ID NO.5)；
OLFM4 siRNA-02核心序列如下：
正义链：5’-GUGGAACGCUUGGAAUUCA-3’(SEQ ID NO.6)；
反义链：5’-CACCUUGCGAACCUUAAGU-3’(SEQ ID NO.7)。
(3)OLFM4 siRNA-03靶序列如下：
GATCACCTATGGCCAAGGT(SEQ ID NO.8)；
OLFM4 siRNA-03核心序列如下：
正义链：5’-GAUCACCUAUGGCCAAGGU-3’(SEQ ID NO.9)；
反义链：5’-CUAGUGGAUACCGGUUCCA-3’(SEQ ID NO.10)。
二、阴性对照siRNA的合成
阴性对照siRNA核心序列如下:
正义链：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’(SEQ ID NO.11)；
反义链：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’(SEQ ID NO.12)。
上述各化学链由上海吉玛制药技术有限公司(厂址：浦东张江哈雷路1011号602，邮编：201203)进行化学合成：以NTP为原料，利用ABI3900核酸合成仪分别化学合成单链RNA，最后在退火缓冲液的条件下各单链RNA退火形成双链RNA。为提高siRNA在体内的稳定性，保护siRNA免受酶解，在各链化学合成时添加dTdT悬垂。
实施例2、OLFM4 siRNA在体外对HepG2细胞OLFM4基因表达的影响
一、分组转染
将HepG2细胞均匀铺在6孔板中，分为2组：
对照组：含有10％(体积百分含量)灭活的新生牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的DMEM培养基；转染200pmol实施例1的阴性对照siRNA。
转染组1：含有10％(体积百分含量)灭活的新生牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的DMEM培养基；转染200pmol实施例1的OLFM4 siRNA-01。
转染组2：含有10％(体积百分含量)灭活的新生牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的DMEM培养基；转染200pmol实施例1的OLFM4 siRNA-02。
转染组3：含有10％(体积百分含量)灭活的新生牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的DMEM培养基；转染200pmol实施例1的OLFM4 siRNA-03。
各组细胞先常规培养24h，根据组别按LipofectamineTM3000试剂说明书配制转染液，进行转染，转染后继续培养24h后换液一次，继续培养24h后提取RNA检测；培养条件：置于37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养。
二.qRT-PCR检测以鉴定敲低效率。
1.细胞RNA提取：根据RNA快速提取试剂盒(购自杭州奕衫生物科技有限公司)说明书提取细胞RNA，取1NA提取细胞溶液使用Nanodrop One紫外分光光度仪测定RNA浓度，A260/A280值介于1.9～2.1之间表示RNA纯度高，用DEPC水将各样本RNA浓度统一稀释至100ng/至8。
2.逆转录合成cDNA：按如下反应体系(终浓度：50ng/终浓；终体积：以50体积为例)混合：
试剂 体积(μ积)
PrimeScript RT Master Mix(5st 10
RNA模板(100 ng/μg) 25
DEPC水 15
总体积 50
使用PCR仪将RNA逆转录为cDNA，PCR反应程序为：37程序为：n分钟)钟程序为°钟(5s)为：ng/r维持)。
3.荧光定量PCR
反应体系：
试剂 体积(μ积)
TB Green Premix Ex Taq II 5
PCR上游引物(10物II 0.4
PCR下游引物(10物II 0.4
ROX Reference Dye II(50I 0.2
cDNA模板 1
DEPC水 3
总体积 10
按上述体系配置各样本反应液，将各组分充分混匀后，小心加入96孔PCR板中，注意避免孔间串染，贴PCR封板膜进行密封，PCR仪反应程序如下：(1)预变性：95性下，30s，1个循环；(2)PCR反应:95行密：5s95行°s：34，40个循环。
检测OLFM4基因qPCR引物序列如下：
上游：5’-GAGGGACCAAATCTCCAACT-3’(SEQ ID NO.13)
下游：5’-ATCTGCCACATACAAAGCAT-3’(SEQ ID NO.14)。
4数据分析：导出数据，对所得结果用Delta delta CT法进行分析。
结果如图1所示，与阴性对照组比较，转染OLFM4 siRNA-01后细胞中OLFM4基因表达显著下调，效率高于80％，有效敲低。但是转染OLFM4 siRNA-02和OLFM4 siRNA-03，细胞中OLFM4基因表达下调仅20％-40％，敲低效率不足50％即认为敲低无效(图2)。因此，仅OLFM4 siRNA-01为有效siRNA。
实施例3、OLFM4 siRNA在体外对HepG2细胞脂变的影响
一、分组转染
将HepG2细胞均匀铺在6孔板中，分为4组：
正常对照组(NC)：含有10％(体积百分含量)灭活的新生牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的DMEM培养基；转染200pmol实施例1的阴性对照siRNA。
高脂对照组(FFA)：含有10％(体积百分含量)灭活的新生牛血清、666μmol/L的油酸钠和333μmol/L的软脂酸钠的DMEM培养基；转染200pmol实施例1的阴性对照siRNA。
正常实验组(KO-olfm4)：含有10％(体积百分含量)灭活的新生牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的DMEM培养基；转染200pmol实施例1的OLFM4 siRNA-01。
高脂实验组(KO-olfm4+FFA)：含有10％(体积百分含量)灭活的新生牛血清、666μmol/L的油酸钠和333μmol/L的软脂酸钠的DMEM培养基；转染200pmol实施例1的OLFM4siRNA-01。
四组细胞先常规培养24h，根据组别按LipofectamineTM3000试剂说明书配制转染液，进行转染，转染后继续培养24h，根据组别换相应的培养基，继续培养24h后进行实验；培养条件：置于37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养。
二、OLFM4 siRNA在体外对HepG2细胞脂变的影响
分别将步骤一后的细胞进行如下1或2的实验。
1、油红染色
在6孔板中加入4％多聚甲醛在4℃固定30min，蒸馏水洗两次后加入油红O稀释液(油红O0.5g溶于异丙醇100ml配成的饱和液与蒸馏水按3：2稀释，静置5-10min后过滤使用)，避光染色10-15min，水洗一次后用60％乙醇镜下分化至间质清晰，水洗两次后Mayer氏苏木素复染核8s，水洗两次后在自来水中反蓝30min。对染色后的细胞显微照相。
油红O能够特异性地将脂滴染成鲜红色，直观地反应细胞中脂滴形成情况。结果如图3所示，油红O染色显示高脂实验组的脂滴明显多于高脂对照组，这表明：使用OLFM4siRNA有效敲低OLFM4能促进HepG2细胞的脂变。
2、甘油三酯测定
按照甘油三酯测定试剂盒说明书进行操作。具体如下：将6孔板细胞用冷PBS洗涤2次，每孔加入试剂盒裂解液200μl，振荡裂解细胞30min，取50μl裂解液采用BCA法蛋白定量试剂盒进行蛋白含量测定，其余50μl裂解液转移到600μl离心管，70℃加热30min，室温2000×g离心5min，上层清液用于酶学测定。96孔酶标版中将标准品和待测样品与工作液按说明书中列表所示体积混匀，37℃反应10min后用酶标仪在490nm波长下检测，用Excel作图分析数据，结合蛋白浓度以每mg蛋白浓度校正甘油三酯含量。
甘油三酯是脂变细胞中脂滴的主要成分，测定甘油三酯能够将细胞的脂变情况进一步量化。结果如图4所示，高脂实验组的甘油三酯高于高脂对照组，有显著性差异(P<0.05)。这表明：OLFM4 siRNA能促进HepG2细胞甘油三酯的沉积，与油红O染色结果相符。
以上两个结果共同说明在体外HepG2细胞中，转染OLFM4 siRNA敲低OLFM4可促进脂滴和增加甘油三酯的沉积。由此可见，OLFM4在体外促进细胞脂肪变中的关键地位。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种特异抑制OLFM4基因表达的siRNA及其应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2843
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
agcggctcca gctaagagga caagatgagg cccggcctct catttctcct agcccttctg 60
ttcttccttg gccaagctgc aggggatttg ggggatgtgg gacctccaat tcccagcccc 120
ggcttcagct ctttcccagg tgttgactcc agctccagct tcagctccag ctccaggtcg 180
ggctccagct ccagccgcag cttaggcagc ggaggttctg tgtcccagtt gttttccaat 240
ttcaccggct ccgtggatga ccgtgggacc tgccagtgct ctgtttccct gccagacacc 300
acctttcccg tggacagagt ggaacgcttg gaattcacag ctcatgttct ttctcagaag 360
tttgagaaag aactttccaa agtgagggaa tatgtccaat taattagtgt gtatgaaaag 420
aaactgttaa acctaactgt ccgaattgac atcatggaga aggataccat ttcttacact 480
gaactggact tcgagctgat caaggtagaa gtgaaggaga tggaaaaact ggtcatacag 540
ctgaaggaga gttttggtgg aagctcagaa attgttgacc agctggaggt ggagataaga 600
aatatgactc tcttggtaga gaagcttgag acactagaca aaaacaatgt ccttgccatt 660
cgccgagaaa tcgtggctct gaagaccaag ctgaaagagt gtgaggcctc taaagatcaa 720
aacacccctg tcgtccaccc tcctcccact ccagggagct gtggtcatgg tggtgtggtg 780
aacatcagca aaccgtctgt ggttcagctc aactggagag ggttttctta tctatatggt 840
gcttggggta gggattactc tccccagcat ccaaacaaag gactgtattg ggtggcgcca 900
ttgaatacag atgggagact gttggagtat tatagactgt acaacacact ggatgatttg 960
ctattgtata taaatgctcg agagttgcgg atcacctatg gccaaggtag tggtacagca 1020
gtttacaaca acaacatgta cgtcaacatg tacaacaccg ggaatattgc cagagttaac 1080
ctgaccacca acacgattgc tgtgactcaa actctcccta atgctgccta taataaccgc 1140
ttttcatatg ctaatgttgc ttggcaagat attgactttg ctgtggatga gaatggattg 1200
tgggttattt attcaactga agccagcact ggtaacatgg tgattagtaa actcaatgac 1260
accacacttc aggtgctaaa cacttggtat accaagcagt ataaaccatc tgcttctaac 1320
gccttcatgg tatgtggggt tctgtatgcc acccgtacta tgaacaccag aacagaagag 1380
attttttact attatgacac aaacacaggg aaagagggca aactagacat tgtaatgcat 1440
aagatgcagg aaaaagtgca gagcattaac tataaccctt ttgaccagaa actttatgtc 1500
tataacgatg gttaccttct gaattatgat ctttctgtct tgcagaagcc ccagtaagct 1560
gtttaggagt tagggtgaaa gagaaaatgt ttgttgaaaa aatagtcttc tccacttact 1620
tagatatctg caggggtgtc taaaagtgtg ttcattttgc agcaatgttt aggtgcatag 1680
ttctaccaca ctagagatct aggacatttg tcttgatttg gtgagttctc ttgggaatca 1740
tctgcctctt caggcgcatt ttgcaataaa gtctgtctag ggtgggattg tcagaggtct 1800
aggggcactg tgggcctagt gaagcctact gtgaggaggc ttcactagaa gccttaaatt 1860
aggaattaag gaacttaaaa ctcagtatgg cgtctaggga ttctttgtac aggaaatatt 1920
gcccaatgac tagtcctcat ccatgtagca ccactaattc ttccatgcct ggaagaaacc 1980
tggggactta gttaggtaga ttaatatctg gagctcctcg agggaccaaa tctccaactt 2040
ttttttcccc tcactagcac ctggaatgat gctttgtatg tggcagataa gtaaatttgg 2100
catgcttata tattctacat ctgtaaagtg ctgagtttta tggagagagg cctttttatg 2160
cattaaattg tacatggcaa ataaatccca gaaggatctg tagatgaggc acctgctttt 2220
tcttttctct cattgtccac cttactaaaa gtcagtagaa tcttctacct cataacttcc 2280
ttccaaaggc agctcagaag attagaacca gacttactaa ccaattccac cccccaccaa 2340
cccccttcta ctgcctactt taaaaaaatt aatagttttc tatggaactg atctaagatt 2400
agaaaaatta attttcttta atttcattat gaacttttat ttacatgact ctaagactat 2460
aagaaaatct gatggcagtg acaaagtgct agcatttatt gttatctaat aaagaccttg 2520
gagcatatgt gcaacttatg agtgtatcag ttgttgcatg taatttttgc ctttgtttaa 2580
gcctggaact tgtaagaaaa tgaaaattta attttttttt ctaggacgag ctatagaaaa 2640
gctattgaga gtatctagtt aatcagtgca gtagttggaa accttgctgg tgtatgtgat 2700
gtgcttctgt gcttttgaat gactttatca tctagtcttt gtctattttt cctttgatgt 2760
tcaagtccta gtctatagga ttggcagttt aaatgcttta ctcccccttt taaaataaat 2820
gattaaaatg tgctttgaaa aaa 2843
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
gtaacatggt gattagtaa 19
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
guaacauggu gauuaguaa 19
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cauuguacca cuaaucauu 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
gtggaacgct tggaattca 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
guggaacgcu uggaauuca 19
<210> 7
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caccuugcga accuuaagu 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
gatcacctat ggccaaggt 19
<210> 9
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gaucaccuau ggccaaggu 19
<210> 10
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cuaguggaua ccgguucca 19
<210> 11
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
uucuccgaac gugucacgu 19
<210> 12
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
acgugacacg uucggagaa 19
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gagggaccaa atctccaact 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atctgccaca tacaaagcat 20

Claims (4)

1.一种特异抑制OLFM4基因表达的siRNA在非酒精性脂肪性肝病发病机制研究中的应用，其特征在于，通过所述siRNA特异抑制肝原代细胞中OLFM4基因表达构建NAFLD体外模型用于非酒精性脂肪性肝病发病机制研究； 所述特异抑制OLFM4基因表达的siRNA是由SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所示核苷酸序列组成的双链RNA。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述OLFM4基因序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述siRNA的靶序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述siRNA在各链化学合成时添加dTdT悬垂修饰。
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