CN112921039A - 小分子RNA hsa-miR-451a在制备治疗缺血性脑卒药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
小分子RNAhsa‑miR‑451a在制备治疗缺血性脑卒药物中的应用,属于生物技术研究领域。本发明保护一种小分子RNAhsa‑miR‑451a在制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用。本发明提供的应用可有效保护细胞免受缺血诱导的死亡,减少梗死面积,有效提升制备治疗缺血性脑卒药物的治疗效果。
Description
技术领域
本发明属于生物技术研究领域,具体涉及一种小分子RNA hsa-miR-451a在制备治疗缺血性脑卒药物中的应用。
背景技术
脑卒中每年影响全世界数百万人,是导致死亡的主要原因之一[1-2]。缺血性脑卒中是最常见的中风类型,占所有中风病例的80%[3]。缺血性中风的发病机制源于受影响脑组织的血液供应不足,脑组织接受的氧气和葡萄糖少于所需的氧气和葡萄糖。结果,发生脑损伤,这可能导致永久性和不可逆转的细胞死亡。多年来,在缺血性中风的治疗中几乎没有治疗突破。因此,广泛的研究集中在鉴定有效的疗法以拯救受影响的细胞免于死亡。
在缺血性脑卒中药物研究中,近年来小分子RNA(microRNA或miRNA)逐渐被众多研究者所重视[4-7]。miRNA成为研究热点的主要原因是:1)可以调控成百上千个基因,能在系统水平上对细胞进行调控;2)只有21–23个核苷酸,可以作为易吸收的小分子药物;3)更加容易合成,作为药物的成本较低;4)细胞本身就具有的一种小分子,可以避免潜在的免疫(排斥)反应;5)可以由细胞释放入血液,更加易于血液检测和诊断。
miRNA是一种非编码RNA,由细胞核内的基因转录而来,最后在细胞质内形成大小约为22个核苷酸的单链RNA。miRNA可以和mRNA的3'端非翻译区(3'UTR)结合,从而达到减少蛋白翻译的作用[8-10]。目前已经探明miRNA在哺乳动物中调控超过60%的编码RNA(能最终翻译成蛋白)。这些蛋白参与细胞活动的各个环节,如发育、增殖、命运决定、生长控制、凋亡[11-12]。由于miRNA只能靠5'端约7个核苷酸(称为种子区)识别靶mRNA的3'UTR,理论上一个miRNA可以与几百个mRNA结合;一个mRNA的3'UTR上也可以有多个与miRNA种子区互补的序列。因此作为药物靶点,少量miRNA就可以在细胞的系统水平上控制细胞的多个信号通路及活动。
国内外的一些研究组已经开展miRNA与缺血性脑卒中的基础和应用研究,例如,通过靶向5-脂氧合酶以减少细胞死亡,发现miR-193b在缺血性脑卒中中具有潜在的神经保护作用[13]。miR-27b的下调可以增强缺血性脑卒中后AMPKα2介导的血管生成,从而可以促进长期恢复[14]。脑室内注射miR-3473b抑制剂可能通过在缺血性卒中期间靶向SOCS3来降低促炎蛋白的表达。上述事实表明:1)miRNA做为药物治疗缺血性脑卒中有着切实可行的应用基础和研究价值;2)miRNA已进入大医药公司的研发计划,开发新miRNA做为缺血性脑卒中的治疗药物具有良好的市场前景。
参考文献
1.Feigin VL,Nguyen G,Cercy K,Johnson CO,Alam T,Parmar PG,etal.Global,Regional,and Country-Specific Lifetime Risks of Stroke,1990 and2016.N Engl J Med.2018;379:2429-2437.
2.Feigin VL,Norrving B,Mensah GA.Global Burden of Stroke.CircRes.2017;120:439-448.
3.Go AS,Mozaffarian D,Roger VL,Benjamin EJ,Berry JD,Blaha MJ,etal.Heart Disease and Stroke Statistics-2014 Update A Report From the AmericanHeart Association.Circulation.2014;129:E28-E292.
4.Stanzione R,Cotugno M,Bianchi F,Marchitti S,Forte M,Volpe M,etal.Pathogenesis of Ischemic Stroke:Role of Epigenetic Mechanisms.Genes.2020;11:89.
5.Stamatovic SM,Phillips CM,Martinez-Revollar G,Keep RF,AndjelkovicAV.Involvement of Epigenetic Mechanisms and Non-coding RNAs in Blood-BrainBarrier and Neurovascular Unit Injury and Recovery After Stroke.FrontNeurosci.2019;13:15.
6.Xu WL,Gao LS,Zheng JW,Li T,Shao AW,Reis C,et al.The Roles ofMicroRNAs in Stroke:Possible Therapeutic Targets.Cell Transplant.2018;27:1778-1788.
7.Tiedt S,Dichgans M.Role of Non-Coding RNAs in Stroke.Stroke.2018;49:3098-3106.
8.Bartel DP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,andfunction.Cell.2004;116:281-297.
9.Ha M,Kim VN.Regulation of microRNA biogenesis.Nat Rev Mol CellBiol.2014;15:509-524.
10.周冬根,罗玉萍,李思光.MicroRNA的结构、生物合成及功能.生物技术通报.2005:20-26.
11.Friedman RC,Farh KK-H,Burge CB,Bartel DP.Most mammalian mRNAs areconserved targets of microRNAs.Genome Research.2009;19:92-105.
12.Lang M-F,Shi Y.Dynamic Roles of microRNAs inNeurogenesis.Frontiers in Neuroscience.2012;6.
13.Chen ZH,Yang JQ,Zhong JJ,Luo Y,Du WM,Hu CL,et al.MicroRNA-193b-3palleviates focal cerebral ischemia and reperfusion-induced injury in rats byinhibiting 5-lipoxygenase expression.Exp Neurol.2020;327:11.
14.Yuan Y,Zhang Z,Wang Z,Liu J.MiRNA-27b Regulates Angiogenesis byTargeting AMPK in Mouse Ischemic Stroke Model.Neuroscience.2019;398:12-22.
发明内容
针对上述不足本发明提供一种小分子RNA hsa-miR-451a在制备治疗缺血性脑卒药物中的应用。该应用有效保护细胞免受缺血诱导的死亡,减少梗死面积。
本发明解决技术问题采用的的小分子RNA hsa-miR-451a,其核苷酸序列如下:
5’-aaaccguuaccauuacugaguu-3’
其中5’-aaccguu-3’为小分子RNA hsa-miR-451a的种子区序列。
本发明保护一种小分子RNA hsa-miR-451a在制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用。
进一步的,小分子RNA hsa-miR-451a在制备抑制治疗缺血性脑卒中凋亡药物中的应用。
进一步的,小分子RNA hsa-miR-451a种子区序列为核心构建的小分子RNA在制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用。
进一步的,小分子RNA hsa-miR-451a种子区序列为核心构建的小分子RNA在制备抑制治疗缺血性脑卒中凋亡药物中的应用。
本发明利用qRT-PCR技术检测缺血性脑卒中后的第一天、第三天、第七天hsa-miR-451a的表达,发现在所有三个时间点,小鼠大脑皮层的患侧均检测到更高的hsa-miR-451a表达,尤其在第三天表达最高。
本发明将hsa-miR-451a注入小鼠大脑后观察到了较高的hsa-miR-451a表达显着降低了梗死脑组织的体积,而hsa-miR-451a抑制剂增加了梗死组织的体积。
本发明在MCAO小鼠的大脑切片上进行了TUNEL染色。与对照组相比,从接受hsa-miR-451a模拟物(具有较低的Phd3和p53)的小鼠中观察到凋亡细胞的百分比更低。但是,当使用hsa-miR-451a抑制剂(具有更高的Phd3和p53)降低hsa-miR-451a水平时,可以看到更多的凋亡细胞。
本发明利用qRT-PCR技术检测在缺血性脑卒中发作后的第一天、第三天、第七天Phd3的表达,发现在所有三个时间点,小鼠大脑皮层的患侧均检测到更低的Phd3的表达,尤其在第三天表达最低,这与hsa-miR-451a的表达呈负相关。
本发明利用生物信息学方法确定了hsa-miR-451a的靶基因为Phd3,并构建了hsa-miR-451a靶基因Phd3的报告载体,命名为psiCheck-Phd3。双荧光检测结果表明Phd3的确是hsa-miR-451a的靶基因。
本发明体外转染hsa-miR-451a后,对靶基因进行RT-PCR和免疫荧光检测,其结果表明靶基因Phd3在mRNA和蛋白水平均表达下调。
本发明hsa-miR-451a注入小鼠大脑后(Phd3水平下调),p53水平显着降低,而施用hsa-miR-451a抑制剂(Phd3水平上调)显着提高p53水平。
因此,本发明hsa-miR-451a的过表达可能通过其靶基因Phd3,及其下游基因p53减少缺血性中风期间大脑凋亡细胞的数量,这可能是hsa-miR-451a减少梗死体积并保护细胞免于死亡的治疗效果的原因,这对hsa-miR-451a与缺血性脑卒中的关系意义重大。
原理:缺血性脑卒中模型MCAO中,小鼠大脑皮层内hsa-miR-451a的更高表达。脑室内注射hsa-miR-451a模拟物显着降低了MCAO小鼠的梗塞体积。在用hsa-miR-451a模拟物注射的小鼠中,通过TUNEL染色检测到hsa-miR-451a保护细胞免受缺血诱导的死亡。探索了hsa-miR-451a抗凋亡作用的机制,并在体外和体内均将Phd3(也称为Egln3)作为hsa-miR-451a的靶标。最后,p53被认为是介导hsa-miR-451a抗凋亡作用的Phd3的下游靶标。这项研究确定了hsa-miR-451a在缺血诱导的细胞凋亡中的新作用,并揭示了涉及hsa-miR-451a-Phd3-p53的新途径。目前关于hsa-miR-451a的研究还没有将其应用于缺血性脑卒中的治疗,因此可以根据hsa-miR-451a的差异表达设计针对缺血性脑卒中的治疗研究,这对于治疗缺血性脑卒中药物的研究具有重要意义。
有益效果:本发明提供的应用可有效保护细胞免受缺血诱导的死亡,减少梗死面积,有效提升制备治疗缺血性脑卒药物的治疗效果。
附图说明
图1为qRT-PCR检测MCAO后hsa-miR-451a的表达图。
图2为hsa-miR-451a降低MACO小鼠的梗死面积的图。
图3为hsa-miR-451a减少MCAO小鼠的细胞凋亡图。
图4为qRT-PCR检测MCAO后Phd3的表达图。
图5为hsa-miR-451a与其推测的靶基因Phd3的双荧光报告检测;hsa-miR-451a降低了MCAO小鼠中Phd3mRNA的表达图。
图6为hsa-miR-451a降低了MCAO小鼠中Phd3蛋白的表达图。
图7为qRT-PCR检测p53在MCAO小鼠中的表达图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1:hsa-miR-451a在缺血性脑卒中脑组织中表达水平的检测
Trizol法分别提取缺血性脑卒中(MCAO)脑组织中的总RNA。用PBS将细胞洗涤2遍,每瓶加入1mL Trizol,吹打混匀,室温孵育5min;将细胞液转移入DEPC处理过的1.5mL离心管中,每管加入0.2mL氯仿,剧烈振荡15s混匀,冰上静置3~5min使分层;4℃,12000rpm,离心15min;小心吸取上层液体,转移到另一个DEPC处理过的1.5mL离心管中,加入等体积已在4℃预冷的异丙醇,上下颠倒轻轻混匀15~30s,冰上(室温)静置5~10min;4℃,12000rpm,离心15min;弃上清,加入1mL 75%乙醇,轻轻洗涤沉淀2次;4℃,7500rpm离心10min,弃上清,离心管倒置晾干,加入DEPC水30μL溶解RNA。紫外吸收测定法和琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的浓度和纯度。
利用Takara的逆转录试剂盒将上述所提总RNA进行cDNA的合成。反应体系(20μL)如下:总RNA 0.1-lμg,5×逆转录反应缓冲液4μL,逆转录酶1μL,EDPC水补足到20μL。将上述体系混匀,PCR仪上进行逆转录,反应条件:37℃15min,85℃5s,4℃保存。
再以cDNA为模板,利用特异性hsa-miR-451a TaqMan引物,在实时定量PCR仪上进行Real-time PCR。反应体系(20μL)如下:20×TaqMan MicroRNA Assays 1μL,Universal Master Mix 10ul,cDNA 5ng,加DEPC水至20μL。反应条件:95℃30s;95℃10s,60℃30s,40个循环。以Cel-39小RNA为内参对照,采用2-ΔΔCt相对定量法处理数据。
Real-timePCR结果表明,相对于正常脑组织,在MCAO后第1天,第3天和第7天hsa-miR-451a在小鼠大脑皮层的患侧均检测到更高的hsa-miR-451a表达,在第3天hsa-miR-451a表达最高(图1)。
实施例2:hsa-miR-451a降低了MACO小鼠的梗塞面积
将3.5μL hsa-miR-451a模拟物或hsa-miR-451a抑制剂与3.5μL siRNA-Mate转染试剂混合,制备体内转染溶液。将转染溶液注射到C57BL/6小鼠的患侧(MCAO的一侧)的脑室,位置为前囟:-2.5mm,腹侧:1mm,侧开:1.5mm)。脑室内注射后一天,进行MCAO,48h后将小鼠脑组织行冰冻切片,将脑切片浸入Nissl染色溶液中15分钟,用蒸馏水洗涤,并用95%乙醇孵化5s。将脑部的Nissl染色图像加载到Adobe PhotoShop中以进行梗死体积测量(图2)。
实施例3:hsa-miR-451a减少了MCAO小鼠的细胞凋亡
hsa-miR-451a模拟物、hsa-miR-451a抑制剂体外转染到C57BL/6小鼠的患侧中,方法如实施例2,将小鼠脑组织行冰冻切片上用4%多聚甲醛固定20min,在冰上将细胞用渗透液中浸泡2min,用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体,立即在切片上加20μLTunnel反应液,置湿盒中于37C反应1h,在荧光显微镜下观察细胞染色可见经hsa-miR-451a抑制剂转染的小鼠脑组织中的凋亡细胞更多,经hsa-miR-451a模拟物转染的小鼠脑组织中的凋亡细胞减少(图3)。
实施例4:Phd3在缺血性脑卒中脑组织中表达水平的检测
利用Trizol法提取脑组织中的总RNA。提取方法同实施例1,紫外吸收测定法和琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的浓度和纯度后,利用试剂盒将所提总RNA进行cDNA的合成。
利用Takara的逆转录试剂盒将上述所提总RNA进行cDNA的合成。反应体系(20μL)如下:总RNA 0.1μg–lμg,5×逆转录反应缓冲液4μL,逆转录酶1μL,EDPC水补足到20μL。将上述体系混匀,PCR仪上进行逆转录,反应条件:37℃15min,85℃5s,4℃保存。
再以cDNA为模板,对靶基因进行RT-PCR。反应体系(20μL)如下:2×反应缓冲液10μL,10μM上游引物0.4μL,10μM下游引物0.4μL,cDNA 1μL,DEPC水8.2μL。反应条件:95℃30s;95℃10s,60℃30s,40个循环,4℃保存。以β-actin为靶基因的内参对照。
RT-PCR结果表明,与对照相比,MCAO后第一天、第三天及第七天Phd3的表达均降低,其中第三天表达最低(图4)。
实施例5:hsa-miR-451a靶基因的预测
通过生物信息学方法,利用网上数据库(TargetScan:http://www.targetscan.org/;miRWalk:mirwalk.umm.uni-heidelberg.de;and MiRtaget2:mirdb.org)预测hsa-miR-451a相关的靶基因,暂确定hsa-miR-451a的靶基因为Phd3。
实施例6:hsa-miR-451a靶基因报告载体的构建
依据GenBank中Phd3基因的序列,选取包含与hsa-miR-451a匹配的一段序列设计引物,(Phd3-F和Phd3-R),并在Phd3-F的5′端悬垂内切酶XhoI的酶切位点和保护碱基,在Phd3-R5′端悬垂另一内切酶NotI的酶切位点和保护碱基。然后进行PCR扩增,,PCR反应体系(20μL)如下:5×反应缓冲液4μL,10μM上游引物1μL,10μM下游引物1μL,DNA 0.9μL(小于1μg),10mM dNTPs 1.6μL,Phusion DNA Polymerase 0.2μL,ddH2O 11.3μL。反应条件:98℃30s;98℃7s,67.3℃20s,72℃45s,30个循环;72℃延伸7min;4℃保存。扩增后对PCR产物进行双酶切,酶切体系为(30μL):10×T Buffer 3μL,XhoI 1μL,Not I 1μL,PCR产物25μL。酶切反应在37℃水浴中进行,3h后利用凝胶回收试剂盒回收酶切产物,产物最终溶于10μLBuffer EB中。
再对载体psiCheck control进行双酶切,酶切体系为(10μL):10×T Buffer 1μL,XhoI 1μL,Not I 1μL,psiCheck control 4μL,ddH2O 3μL。酶切反应在37℃水浴中进行,3h后利用凝胶回收试剂盒回收酶切产物,产物最终溶于10μL Buffer EB中。
将上述酶切产物进行连接,连接体系为(12μL):10×连接Buffe 1.2μL,载体片段4.6μL,目的基因片段2.3μL,T4DNA连接酶1μL,ddH2O 2.9μL。连接反应室温(10min)进行,16~20h后,70℃水浴10min灭活连接酶,终止连接反应。
连接产物转化大肠杆菌DH5α,涂菌平皿于37℃孵箱内培养12~16h。然后挑选阳性克隆,分别进行PCR扩增,酶切和测序验证,获得正确的hsa-miR-451a表达载体,命名为psiCheck-Phd3。
实施例7:hsa-miR-451a靶基因报告载体的体外转染
用Invitrogen公司的Lipofectamine 2000转染试剂将psiCheck-Phd3及从Invitrogen公司购买用于转染的psiCheck-mut-Phd3转染至KEK293A细胞,转染步骤简述如下:转染前一天,以每孔4×105个细胞的浓度接种于6孔板;常规培养20h后,细胞生长至对数增殖期,稀释适当体积的psiCheck-Phd3/psiCheck-mut-Phd3分别和hsa-miR-451a/hsa-miR-451a-control于100ulOPTI-MEM培养基中,轻柔混合,使其终浓度为20ug/ml;Lipofectamine 2000:psiCheck-Phd3+hsa-miR-451a/psiCheck-mut-Phd3+hsa-miR-451a-control按4∶2的比例在96孔板中配制转染混合物,剧烈震荡5-10s;静置15min后,将转染混合物缓慢加到含KEK293A细胞和OPTI-MEM培养基的培养孔中,轻摇30s;在37℃5%的CO2孵育6h后,更换成含KEK293A细胞培养基,继续培养48-72h后检测转染水平以及后续实验。
实施例8:体内、体外检测hsa-miR-451a直接靶向抑制Phd3
(1)双荧光报告的检测
KEK293A细胞接种24h后进行转染。转染方法同实例7,然后进行双荧光报告的检测。双荧光素酶报告系统的检测,采用Promega的Dual-luciferase荧光素酶报告基因检测系统,按试剂盒说明操作,简要过程如下:转染KEK293A细胞48h后用PBS洗一遍细胞,然后每孔用被动裂解液100μL裂解细胞,取15μL裂解产物加入50μL Luciferase反应底物,然后用荧光测量仪测定Firefly荧光,再加入StopGlo试剂50μL,马上测量Renilla荧光。分析检查得到Firefly荧光素酶和Renilla荧光素酶的荧光值,用Renilla荧光素酶荧光值对Firefly荧光素酶荧光值进行归一化。每组实验至少重复3次,取平均值。
双荧光报告检测结果显示,当hsa-miR-451a靶基因报告载体Phd3-WT-3'UTR与hsa-miR-451a共转染KEK293A细胞后,荧光素酶的荧光值显著降低,表明Phd3的确是hsa-miR-451a的靶基因(图5)。
(2)RT-PCR检测靶基因在mRNA水平上的表达差异
hsa-miR-451a模拟物、hsa-miR-451a抑制剂体外转染到C57BL/6小鼠的患侧中,方法如实施例2,利用Trizol法提取细胞的总RNA。提取方法同实施例1,紫外吸收测定法和琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的浓度和纯度后,利用试剂盒将所提总RNA进行cDNA的合成。
利用Takara的逆转录试剂盒将上述所提总RNA进行cDNA的合成。反应体系(20μL)如下:总RNA0.1μg–1μg,5×逆转录反应缓冲液4μL,逆转录酶1μL,EDPC水补足到20μL。将上述体系混匀,PCR仪上进行逆转录,反应条件:37℃15min,85℃5s,4℃保存。
再以cDNA为模板,对靶基因进行RT-PCR。反应体系(20ul)如下:2×反应缓冲液10μL,10μM上游引物0.4μL,10μM下游引物0.4μL,cDNA 1μL,DEPC水8.2μL。反应条件:95℃30s;95℃10s,60℃30s,40个循环,4℃保存。以β-actin为靶基因的内参对照。
RT-PCR结果表明,与对照相比,转染了hsa-miR-451a的靶基因Phd3在mRNA水平表达降低(图5)。
实施例9:免疫荧光检测靶基因在蛋白水平上的表达差异
利用免疫荧光检测靶基因在蛋白水平上的表达差异,检测步骤简述如下:
将3.5μL hsa-miR-451a模拟物或hsa-miR-451a抑制剂与3.5μL siRNA-Mate转染试剂混合,制备体内转染溶液。将转染溶液注射到C57BL/6小鼠的患侧(MCAO的一侧)的脑室,制备冰冻切片,方法同实施例2。将小鼠脑的冷冻切片与PBS中的0.3%TritonX-100和5%山羊血清孵育30min,然后与一抗孵育过夜,然后将二抗在室温孵育4h。一抗是兔抗Phd3(1:200),二抗是与Cy3缀合的山羊抗兔IgG(1:400)。细胞核用DAPI染色。
免疫荧光结果表明,与对照相比,转染了hsa-miR-451a的靶基因Phd3在蛋白水平表达明显降低(图6)。
实施例10:p53在脑组织中表达水平的检测
hsa-miR-451a模拟物、hsa-miR-451a抑制剂体外转染到C57BL/6小鼠的患侧中,方法如实施例2,利用Trizol法提取细胞的总RNA。提取方法同实施例1,紫外吸收测定法和琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的浓度和纯度后,利用试剂盒将所提总RNA进行cDNA的合成。
反应体系(20μL)如下:总RNA 100pg-lug,5×逆转录反应缓冲液4μL,10×SuperScript逆转录酶2μL,EDPC水补足到20μL。将上述体系混匀,PCR仪上进行逆转录,反应条件:42℃30min,95℃5min,4℃保存。
再以cDNA为模板,对靶基因进行RT-PCR。反应体系(20ul)如下:2×反应缓冲液10μL,10μM上游引物0.4μL,10μM下游引物0.4μL,cDNA 1μL,DEPC水8.2μL。反应条件:95℃30s;95℃10s,60℃30s,40个循环,4℃保存。以β-actin为靶基因的内参对照。
RT-PCR结果表明,与对照相比,hsa-miR-451a注入小鼠大脑后(Phd3水平下调)时,p53水平显着降低,而施用hsa-miR-451a抑制剂(Phd3水平上调)显着提高p53水平(图7)。
上述实施例只是用于对本发明的举例和说明,而非意在将本发明限制于所描述的实施例范围内。此外本领域技术人员可以理解的是,本发明不局限于上述实施例,根据本发明的教导还可以做出更多种的变型和修改,这些变型和修改均落在本发明所要求保护的范围内。
Claims (6)
1.一种小分子RNAhsa-miR-451a,其特征在于,其核苷酸序列如下:
5’-aaaccguuaccauuacugaguu-3’。
2.根据权利要求1所述的一种小分子RNA hsa-miR-451a,其特征在于,其中5’-aaccguu-3’为小分子RNAhsa-miR-451a的种子区序列。
3.根据权利要求1所述的一种小分子RNAhsa-miR-451a的应用,其特征在于,小分子RNAhsa-miR-451a在制备治疗缺血性脑卒药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的一种小分子RNAhsa-miR-451a在制备治疗缺血性脑卒药物中的应用,其特征在于,小分子RNAhsa-miR-451a在制备抑制治疗缺血性脑卒中凋亡药物中的应用。
5.根据权利要求3所述的一种小分子RNAhsa-miR-451a在制备治疗缺血性脑卒药物中的应用,其特征在于,小分子RNAhsa-miR-451a种子区序列为核心构建的小分子RNA在制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用。
6.根据权利要求3或5所述的一种小分子RNA hsa-miR-451a在制备治疗缺血性脑卒药物中的应用,其特征在于,小分子RNAhsa-miR-451a种子区序列为核心构建的小分子RNA在制备抑制治疗缺血性脑卒中凋亡药物中的应用。
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---|---|---|---|---|
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Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013032962A2 (en) * | 2011-08-28 | 2013-03-07 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Micro rnas to treat stroke, ischemic brain injury, traumatic brain injury, and neurodegenerative disease |
CN103667445A (zh) * | 2013-10-16 | 2014-03-26 | 石磊 | 一种脑梗塞早期诊断标志物及其应用 |
CN107683341A (zh) * | 2015-05-08 | 2018-02-09 | 新加坡科技研究局 | 用于慢性心力衰竭的诊断和预后的方法 |
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013032962A2 (en) * | 2011-08-28 | 2013-03-07 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Micro rnas to treat stroke, ischemic brain injury, traumatic brain injury, and neurodegenerative disease |
CN103667445A (zh) * | 2013-10-16 | 2014-03-26 | 石磊 | 一种脑梗塞早期诊断标志物及其应用 |
CN107683341A (zh) * | 2015-05-08 | 2018-02-09 | 新加坡科技研究局 | 用于慢性心力衰竭的诊断和预后的方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
MAURO GIORDANO等: "Circulating MiRNA-195-5p and -451a in Transient and Acute Ischemic Stroke Patients in an Emergency Department", 《JOURNAL OF CLINICAL MEDICINE》 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115040531A (zh) * | 2022-04-20 | 2022-09-13 | 大连大学 | 一种针对细胞周期的抗肿瘤药物及其在针对细胞周期抗肿瘤药物中的应用 |
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