CN110862989A - lncRNA-YIYA siRNA的设计及其在肝癌治疗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明lncRNA‑YIYA siRNA的设计及其在肝癌治疗中的应用，siRNA抑制长链非编码RNA lncRNA‑YIYA的表达，所述siRNA能够显著抑制肝癌细胞中长链RNA lncRNA‑YIYA的表达水平，所述抑制剂siRNA分子的正义链的序列lncRNA‑YIYA siRNA1,siRNA3和siRNA5所示，所述siRNA分子的反义链的序列如lncRNA‑YIYA siRNA2,siRNA4和siRNA6所示。本发明通过siRNA靶向调控长链非编码lncRNA‑YIYA的表达水平，能够有效抑制肝癌细胞的增殖、克隆形成和侵袭能力，为肝癌治疗提供了新的靶点，对提高肝癌治疗效果具有重要意义，因此具有显著的应用前景和经济价值，siRNA能够高效抑制肝癌细胞中lncRNA‑YIYA的表达，抑制率高达82%，siRNA能高效抑制肝癌细胞的克隆形成和侵袭能力，抑制率分别为78%和66%。

Description

lncRNA-YIYA siRNA的设计及其在肝癌治疗中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及lncRNA-YIYA siRNA的设计及其在肝癌治疗中的应用。
背景技术
肝癌是常见的恶性肿瘤之一。在全球范围内，肝癌的发病率都呈现逐年上升的趋势。由于目前缺乏早期诊断肝癌的有效手段，加上肝癌治疗后复发率高和预后差是导致肝癌死亡率高的重要原因。目前，手术切除仍然是最主要的治疗手段。但是，由于肝癌早期诊断的困难性，导致大部分实施手术的患者都已处于中晚期，这就极大的限制了手术治疗的疗效。加上，手术后的中晚期患者复发率也很高，直接导致手术治疗患者的总体生存率很低。除了手术治疗，虽然放疗，化疗，介入治疗等治疗方法有一定的疗效，但是考虑到肝癌患者有众多的禁忌症，所以也难以有效治疗肝癌。
肿瘤生物分子靶向治疗是近些年来兴起的一种新型的肿瘤疗法。肿瘤靶向治疗是依赖肿瘤患者个体基因组，蛋白等准确的信息而设计研发的特异性的治疗方法。主要是通过设计促癌基因相关的特异性干扰分子，从而阻断起关键作用的一种或者多种促癌基因及其下游信号通路的功能来达抑制肿瘤细胞生长，浸润，转移等的治疗效果。靶向治疗因其个体性强，特异性高，副作用小，不容易产生耐药性等优势已经逐步成为临床肿瘤治疗的重要手段。虽然肿瘤靶向治疗具有广阔的前景，但是目前已经应用到临床的肿瘤靶向治疗的生物分子制剂非常少。这就需要我们深入研究和发现更多更明确更有效的肿瘤分子靶点，也更迫切的需要研发更多的肿瘤分子靶点的有效抑制分子。
长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一类长度超过200个核苷酸的RNA分子,顾名思义这类长链RNA并不具备蛋白编码能力，但可以在表观遗传，转录以及转录后等多个层面调控多种基因的表达，从而参与肌体多种生理和病理过程的调控，包括神经退行性疾病，自身免疫性疾病，肿瘤等。YIYA是一种lncRNA。lncRNA-YIYA位于1号染色体长臂4区1带（1q41），研究表明这个区域是肿瘤敏感性区域，而lncRNA-YIYA在多种肿瘤组织中表达均上调，而且这种上调与肿瘤细胞增殖和细胞周期调控密切相关。但是，目前还没有关于lncRNA-YIYA是否与肝癌的发生发展有关的实验证据。
发明内容
为解决上述背景技术中提出的问题。本发明提供了lncRNA-YIYA siRNA的设计及其在肝癌治疗中的应用。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：lncRNA-YIYA siRNA的设计及其在肝癌治疗中的应用，siRNA抑制长链非编码RNA lncRNA-YIYA的表达，所述siRNA能够显著抑制肝癌细胞中长链RNA lncRNA-YIYA的表达水平，所述抑制剂siRNA分子的正义链的序列如lncRNA-YIYA siRNA1,siRNA3和siRNA5所示，所述siRNA分子的反义链的序列如lncRNA-YIYA siRNA2,siRNA4和siRNA6所示。
优选的，lncRNA-YIYA上的siRNA 靶点个数为1-3个。
优选的，所述siRNA分子为被修饰的siRNA分子及药学上接受的载体，所述被修饰的siRNA分子使所述lncRNA-YIYA的表达沉默。
优选的，靶向长链非编码RNA lncRNA-YIYA的siRNA及其在肝癌治疗中的应用，所述siRNA选自lncRNA-YIYA siRNA1～6中的一种或多种。
优选的，所述靶向长链非编码RNA lncRNA-YIYA的siRNA通过抑制肝癌细胞的增殖达到治疗肝癌的目的。
优选的，该生物制剂包括siRNA或其核酸序列修饰物及载体。
与现有技术相比，本发明通过siRNA靶向调控长链非编码lncRNA-YIYA的表达水平，能够有效抑制肝癌细胞的增殖、克隆形成和侵袭能力，为肝癌治疗提供了新的靶点，对提高肝癌治疗效果具有重要意义，因此具有显著的应用前景和经济价值，siRNA能够高效抑制肝癌细胞中lncRNA-YIYA的表达，抑制率高达82%，siRNA能高效抑制肝癌细胞的克隆形成和侵袭能力，抑制率分别为78%和66%。
附图说明
图1为lncRNA-YIYA在不同种类人肝细胞癌细胞系及正常肝细胞株中的表达，其中：*p<0.05，差异具有统计学意义。
图2为靶向lncRNA-YIYA的siRNA对肝癌细胞中lncRNA-YIYA的干扰效率；其中：*p<0.05，差异具有统计学意义。
图3为靶向lncRNA-YIYA的siRNA对肝癌细胞增殖(A)和克隆形成(B)的影响；
其中：*p<0.05，差异具有统计学意义。
图4为靶向lncRNA-YIYA的siRNA对肝癌细胞凋亡的影响；
其中：*p<0.05，差异具有统计学意义。
图5为靶向lncRNA-YIYA的siRNA对肝癌细胞侵袭的影响；
其中：*p<0.05，差异具有统计学意义。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供以下技术方案：lncRNA-YIYA siRNA的设计及其在肝癌治疗中的应用，siRNA抑制长链非编码RNA lncRNA-YIYA的表达，siRNA能够显著抑制肝癌细胞中长链RNAlncRNA-YIYA的表达水平，抑制剂siRNA分子的正义链的序列如lncRNA-YIYA siRNA1,siRNA3和siRNA5 所示，siRNA分子的反义链的序列如lncRNA-YIYA siRNA2,siRNA4和siRNA6所示。
本发明通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法对不同肝癌细胞系中lncRNA-YIYA的表达水平进行检测，发现与正常肝细胞对比，lncRNA-YIYA在肝癌细胞系中均表达上调，尤其是HepG2细胞。根据lncRNA-YIYA基因序列设计并合成6条特异靶向lncRNA-YIYA的siRNA。利用Lipofectine 3000脂质体介导的方法将6条siRNA的混合物转染肝癌细胞HepG2中以敲低其lncRNA-YIYA的表达，并观察敲低lncRNA-YIYA的表达对HepG2细胞增殖、凋亡、侵袭的影响。
实验1、LNCRNA-YIYA在人肝细胞癌细胞系及正常肝细胞株肝细胞癌细胞株中的表达。
1、材料
细胞：人肝细胞癌细胞系HepG2、MHCC97H、MHCC97L、SMMC7721和Hep3B及正常肝细胞株L-O2。试剂：DMEM高糖型细胞培养液、青霉素、链霉素，胎牛血清，反转录试剂盒PrimescriptRT reagent kit和实时荧光定量PCR SYBR Premix Ex Taq II试剂盒，qRT-PCR特异性引物由上海生物工程有限公司合成。
2、方法
2.1、细胞培养
人肝细胞癌细胞系HepG2、MHCC97H、MHCC97L、SMMC7721和Hep3B及正常肝细胞株L-O2用完全培养（高糖型DMEM细胞培养基中加入10％胎牛血清、100U/mL青霉素链霉素双抗），置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。
2.2、肝细胞癌细胞系中总RNA的提取
利用Trizol试剂提取细胞中的总RNA，提取方法具体如下：
①从培养箱中拿出6孔板中培养的细胞，弃去培养基，用在冰上预冷的磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline，PBS)洗涤3次，弃去PBS。加入1mL Trizol试剂裂解细胞，并把细胞裂解液移至无DNA酶和RNA酶的离心管中，然后向装有细胞裂解液的离心管中加入200μL氯仿，充分震荡混匀20s，室温静置5min后置于4℃，12000rpm离心15min。③将上层含有RNA的水相转移到新的无RNA酶和DNA酶的离心管中，并向其中加入500μL异丙醇，振荡器上充分震荡混匀，置于4℃，12000rpm离心10min；小心弃上清，保留RNA沉淀，然后加入1mL75％乙醇，振荡器上涡旋充分混匀，4℃，10000rpm离心5min，⑤弃上清，风干沉淀，加入30μL无酶水，利用NanoDrop™ 8000 分光光度计(Thermo Fisher Scientific，USA)和琼脂糖凝胶电泳评估RNA的浓度和纯度，标记好后置于-80℃超低温冰箱保存。
2.3反转录
采用TAKARA公司
PrimeScript RT reagent Kit with gDNAEraser(PerfectReal Time)试剂盒，操作如下：去除提取的总RNA中的基因组DNA：
提取的总RNA 1μL (1μg)，5×DNAEraserBuffer 2μL，DNA Eraser 1μL，无RNA酶的ddH2O 6μL，置于PCR仪中42℃孵育2min，得反应液。
进行反转录反应，体系如下：
上步反应液10μL，5×Primescript Buffer 2(for Real Time)4μL，Primescript RTEnzyme Mix I1μL，RT Primer Mix 1μL，ddH 2 O 4μL，总体积20μL，置于PCR仪中37℃孵育15min，85℃孵育5s灭活逆转录酶，得到cDNA。
2.4、qRT-PCR
利用TAKARA公司SYBR Premix Ex Taq II试剂盒，反应体系如下：
SYBR 10μL，lncRNA-YIYA正向引物
(5`-GCTCTCTCCCAGTAAATTGTAAG-3`)0.4μL，
lncRNA-YIYA反向引物(5`-GTAAGGGTAACATTCCTTCC-3`)0.4μL，cDNA 2μL，ROXReference Dye II 0.4μL，ddH2O 6.8μL，总体积20μL。
内参基因β-Actin的正向引物为：5`-TGGCACCCAGCACAATGAA-3`，反向引物为：5`-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3`，反应条件如下：95℃30s预变性；95℃5s变性，57℃34s退火并延伸，35个循环，熔解曲线分析：60-95℃，每0.4℃读1次，同时以内参β-Actin基因作为校对，使用ABI7500fast进行qRT-PCR和数据收集，采用2 -ΔΔCt 进行数据分析。
3、结果
lncRNA-YIYA在正常肝细胞系表达水平很低，而在肝癌细胞系中高表达，并达到显著差异(p＜0.05、图1)。这些结果表明lncRNA-YIYA在HCC细胞中异常表达可能具有促癌作用。
实验2、siRNA抑制lncRNA-YIYA表达后对肝癌细胞功能的影响
1材料
细胞：人肝细胞癌细胞系HepG2，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，转染试剂Lipofectamine 3000购自Thermo Fisher Scientific公司，CCK-8和Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司。
2、方法
2.1细胞培养同实验1。
2靶向lncRNA-YIYA的siRNA序列的设计与合成在NCBI获得lncRNA-YIYA基因序列(NR_046189.1)；
然后利用BLOCK-iT RNAi Designer软件(Thermo Fisher Scientific)设计特异靶向lncRNA-YIYA的siRNA(silncRNA-YIYA-AS1)，从结果中共选择6条进行合成并制成siRNA混合物(等摩尔比)，具体siRNA的序列参考以下lncRNA-YIYA (NR_046189.1)上的靶点设计：
siRNA1：5`-GUAAGUAAUUAUAGGUGCAUU-3`
siRNA2：5`-UGCACCUAUAAUUACUUACCC-3`
siRNA3：5`-CAUUCAGGCAUUUUAGGGAUU-3`
siRNA4：5`-UCCCUAAAAUGCCUGAAUGCC-3`
siRNA5：5`-UAGUAACAGAUAGGCAAAAUU-3`
siRNA6：5`-UUUUGCCUAUCUGUUACUACC-3`
上述靶向lncRNA-YIYA的siRNA由上海生物工程股份有限公司合成。
实验用到的阴性对照序列(siNC，在人基因组上无作用靶点)购自上海生物工程股份有限公司合成。
2.3细胞转染
将人肝细胞癌细胞系HepG2接种于6孔板中，37℃、5％CO2 培养过夜，当生长至汇合度40～50％时进行转染实验。转染方法参照Lipofectamine 3000(Thermo FisherScientific)说明书进行，具体步骤如下：将5μL lncRNA-YIYA siRNA混合物/siNC(终浓度50nm)和3.75μL lipo3000转染试剂分别加入至125μL无血清DMEM培养液中，分别混匀后，将含有siRNA的DMEM培养液加入至含有Lipofectamine3000转染试剂的DMEM培养液中，小心混匀，静置5min，得转染液；将上述转染液加入提前24小时植入6孔板(含有2mL培养液)的HepG2细胞中，置于37℃、5％CO2 培养箱孵育；转染后收集细胞，采用qRT-PCR检测siRNA对lncRNA-YIYA的干扰效果，或进行后续细胞增殖、凋亡、侵袭等功能验证实验。
2.4qRT-PCR检测siRNA对lncRNA-YIYA的干扰效果
转染48h后，收集转染后的实验组HepG2细胞(转染lncRNA-YIYA siRNA混合物的肝癌HepG2细胞)和对照组细胞(转染siNC的肝癌HepG2细胞)，进行细胞总RNA提取，反转录及qRT-PCR,方法同上。
2.5细胞增殖实验
采用CCK-8实验和克隆形成实验检测靶向干扰lncRNA-YIYA表达对细胞增殖活性的影响。CCK-8实验具体操作方法：收集转染siRNA 24h后的实验组和对照组HepG2肝癌细胞，加入完全培养基重悬，细胞计数，以3000个/孔密度接种于96孔板中，实验组和对照组各设置5行，每行5个复孔，放于37℃、5％CO2 培养箱培养。设置24h、48h、和72h 3个时间点，检测时每孔加入10μLCCK-8试剂并在37℃培养箱中孵育2小时后，通过酶标仪检测450nm处各孔的光密度(OD)。在无细胞孔中加入完全培养基作为调零孔。
2.6集落形成实验
收集转染siRNA 24h后的实验组和对照组HepG2肝癌细胞，并用完全培养基重悬，细胞计数，以600个/孔的密度接种于6孔板中，实验组和对照组各3孔，培养12天后吸去各孔培养基，PBS洗涤3次，每孔加1mL 4％多聚甲醛固定30min，吸去多聚甲醛，PBS洗涤3次，每孔加入1mL结晶紫染色液，20min后吸去，自来水下冲洗6孔板，晾干后计算集落。
2.7细胞凋亡实验
收集转染siRNA 24h后的实验组和对照组HepG2肝癌细胞，用冰上预冷的PBS洗涤细胞3次，加入100μL 1×Binding Buffer重悬细胞，加入5μL Annexin V-FITC和5μL PIStaining Solution，轻轻震荡混匀，避光、室温反应15min，加入400μL1×Binding Buffer，混匀后放置于冰上，1h内进行流式检测。
2.8细胞侵袭实验
收集转染siRNA 24h后的实验组和对照组HepG2肝癌细胞，加入完全培养液重悬，细胞计数，4×105/mL个细胞。在Transwell上室(Matrigel预包被)内加入100μL细胞悬液(含1％胎牛血清的DMEM高糖细胞培养基)，将小室放入24孔板细胞培养板内，在下层中加入600μL含20％胎牛血清的DMEM高糖细胞培养基，于37℃，5％CO2 孵箱中培养48h。取出小室，弃除24孔板内的培养基，加入500μL 90％乙醇固定10min，用无菌棉签轻轻拭去小室内部残留的乙醇和细胞，待风干后加入500μL 0.1％结晶紫染液，染色10min。倒置显微镜低倍镜下，每个小室随机选取5-8个视野进行观察并拍照、计数。
3.结果
3.l ncRNA-YIYA siRNA对肝癌细胞HepG2中lncRNA-YIYA的干扰效率
如图2所示，与转染siNC的对照组相比，肝癌细胞系HepG2转染lncRNA-YIYA siRNA混合物后，干扰效果显著，细胞中lncRNA-YIYA的表达水平下调了82％，表明siRNA转染的肝癌细胞中lncRNA-YIYA的表达水平显著下调。
3.2 lncRNA-YIYA siRNA对肝癌细胞的增殖和克隆形成能力的影响
如图3A所示，与siNC对照组相比，转染lncRNA-YIYA siRNA混合物可明显抑制肝癌细胞的增殖能力（60.4%±2.1%），克隆形成实验结果与增殖实验结果一致，转染lncRNA-YIYAsiRNA混合物后肝癌细胞的克隆形成能力显著减弱（78%±3.6%）(图3B)，表明lncRNA-YIYAsiRNA可抑制肝癌细胞的增殖和克隆形成能力。
3.3 lncRNA-YIYA siRNA对肝癌细胞凋亡的作用
如图4所示，与转染siNC的对照组相比，肝癌细胞系HepG2中转染siRNA(lncRNA-YIYAsiRNA混合物后，细胞凋亡数显著增加，表明lncRNA-YIYA siRNA可诱导肝癌细胞凋亡。
3.4 lncRNA-YIYA siRNA对肝癌细胞侵袭能力的影响
如图5所示，与转染siNC的对照组相比，肝癌细胞系HepG2细胞中转染siRNA(lncRNA-YIYA siRNA混合物后，发生侵袭的细胞数量显著减少，这些结果表明lncRNA-YIYA siRNA可显著抑制肝癌细胞的侵袭能力。
实验结果表明本发明中的特异靶向lncRNA-YIYA的siRNA，具有抑制lncRNA-YIYA表达的效果，能够显著抑制肝癌细胞的增殖、侵袭能力，同时可诱导肝癌细胞发生凋亡。
本发明首次揭示了lncRNA-YIYA对lncRNA-YIYA具有较高的沉默效率，可显著抑制肝癌细胞的增殖和侵袭，为肝癌的治疗提供了新的药物靶点，lncRNA-YIYA siRNA可用于开发新的肝癌治疗药物，具有良好的应用前景
最后应说明的是：以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.lncRNA-YIYA的siRNA，其特征在于：siRNA抑制长链非编码RNA lncRNA-YIYA的表达，所述siRNA能够显著抑制肝癌细胞中长链RNA lncRNA-YIYA的表达水平，所述抑制剂siRNA分子的正义链的序列如lncRNA-YIYA siRNA1, siRNA3和siRNA5 所示，所述siRNA分子的反义链的序列如lncRNA-YIYA siRNA2,siRNA4和siRNA6所示。
2.根据权利要求1所述的lncRNA-YIYA的siRNA，其特征在于：lncRNA-YIYA上的siRNA靶点个数为1-3个。
3.根据权利要求1所述的lncRNA-YIYA的siRNA，其特征在于：所述siRNA分子为被修饰的siRNA分子及药学上接受的载体，所述被修饰的siRNA分子使所述lncRNA-YIYA的表达沉默。
4.根据权利要求1所述的lncRNA-YIYA siRNA的设计及其在肝癌治疗中的应用，其特征在于：所述siRNA选自lncRNA-YIYA siRNA1～6中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的lncRNA-YIYA siRNA的设计及其在肝癌治疗中的应用，其特征在于：所述靶向长链非编码RNA lncRNA-YIYA的siRNA通过抑制肝癌细胞的增殖达到治疗肝癌的目的。
6.根据权利要求1所述的lncRNA-YIYA siRNA的设计及其在肝癌治疗中的应用，其特征在于：该生物制剂包括siRNA或其核酸序列修饰物及载体。
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