CN110804613A - 一种靶向抑制lncRNA-00861基因表达的siRNA在肝癌治疗中的应用 - Google Patents

一种靶向抑制lncRNA-00861基因表达的siRNA在肝癌治疗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明一种靶向抑制lncRNA‑00861基因表达的siRNA在肝癌治疗中的应用，lncRNA‑00861的核苷酸序列如lncRNA‑00861‑seq所示，所述靶向抑制lncRNA‑00861的siRNA分子的正义链和反义链的序列如silncRNA‑00861‑1～6所示。本发明利用siRNA靶向调控lncRNA‑00861的表达，减少lncRNA‑00861的表达水平，lncRNA‑00861表达降低的肝癌细胞的增殖和克隆形成能力大大降低，同时侵袭能力也显著减弱。这说明lncRNA‑00861的表达对于肝癌细胞至关重要，为肝癌的临床治疗提供了新的靶点，具有显著的临床应用前景，siRNA能够抑制lncRNA‑00861在肝癌细胞中的表达，抑制率高达86%，siRNA能够抑制肝癌细胞的增殖与克隆形成能力，本发明所提供的siRNA能高效抑制肝癌细胞的侵袭能力。

Description

一种靶向抑制lncRNA-00861基因表达的siRNA在肝癌治疗中 的应用
技术领域
本发明属于生物学技术领域，具体涉及一种靶向抑制lncRNA-00861基因表达的siRNA在肝癌治疗中的应用。
背景技术
长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一种靶向抑制lncRNA-00861基因表达的siRNA在肝癌治疗中的应用长度通常超过200个核苷酸的具有信使RNA(mRNA)样结构的长链RNA。这种长链的RNA通常不具备蛋白质编码能力。lncRNAs与多种生理病理过程有关，能够在转录，翻译，染色质修饰，表观遗传等多种生物学水平调控人体的生理机能。而且，lncRNAs的表达具有组织和时空的特异性。越来越多的证据表明，lncRNAs在多种癌症的起始和发展过程中起着复杂而广泛的作用，包括肝癌。
肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一。其复杂的发病机制可能有多种原因，包括慢性乙型肝炎或丙型肝炎感染、暴露于黄曲霉毒素B1、酒精性和非酒精性脂肪疾病等。尽管最近的研究揭示了许多促进肝癌发展的基因和途径，但是治疗和患者的预后仍然不能令人满意。
长链非编码基因lncRNA-00861位于8染色体长臂2区4带1亚带3次亚带（8q24.13）。研究表明，在乳腺癌中，lncRNA-00861与受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2(HER 2)、雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)、乳腺癌1型易感蛋白、乳腺癌2型易感蛋白、细胞肿瘤抗原p53、磷酸酶和张力素同源物及肿瘤坏死因子相互作用。这些结果提示，lncRNA-00861可能调控基本的生物学过程，可作为临床诊断的生物标志物。但是，lncRNA-00861是否参与肝癌的发生发展以及在肝癌中的作用尚不明确。
发明内容
为解决上述背景技术中提出的问题。本发明提供了一种靶向抑制lncRNA-00861基因表达的siRNA在肝癌治疗中的应用。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种靶向抑制lncRNA-00861基因表达的siRNA在肝癌治疗中的应用，lncRNA-00861的核苷酸序列如lncRNA-00861-seq所示，所述靶向抑制lncRNA-00861的siRNA分子的正义链和反义链的序列如silncRNA-00861-1～6所示。
优选的，所述siRNA能够显著抑制肝癌细胞中长链RNA lncRNA-00861的表达水平。
优选的，长链非编码RNA lncRNA-00861上的siRNA 靶点个数为1-3个。
优选的，所述siRNA选自silncRNA-00861-1～6中的一种或多种。
优选的，所述silncRNA-00861通过抑制肝癌细胞的增殖和侵袭达到治疗肝癌的目的。
优选的，该生物制剂包括siRNA或其核酸序列修饰物及载体，所述合成的siRNA分子为被修饰的siRNA分子，并使用药学上接受的载体。
优选的，所述siRNA或其核酸序列修饰物抑制长链非编码RNA lncRNA-00861的表达。
优选的，所述的siRNA分子载体选自病毒和脂质体。
与现有技术相比，本发明利用特异性siRNA靶向调控lncRNA-00861的表达，减少lncRNA-00861的表达水平。lncRNA-00861表达降低的肝癌细胞的增殖和克隆形成能力大大降低，同时侵袭能力也显著减弱。这说明lncRNA-00861的表达对于肝癌细胞至关重要，为肝癌的临床治疗提供了新的靶点，具有显著的临床应用前景，siRNA能够抑制lncRNA-00861在肝癌细胞中的表达，抑制率高达86%，siRNA能够抑制肝癌细胞的增殖与克隆形成能力，本发明所提供的siRNA能高效抑制肝癌细胞的侵袭能力。
附图说明
图1 lncRNA-00861在人肝细胞癌细胞系HepG2、Hep3B2.1-7、Hep3B、HB611和SMMC7721及正常人肝细胞株L-O2中的表达；
其中：* p<0.05，表示差异具有统计学意义。
图2 silncRNA-00861显著降低SMMC7721肝癌细胞系中lncRNA-00861表达；
其中：* p<0.05，表示差异具有统计学意义。
图3 silncRNA-00861显著减少SMMC7721肝癌细胞增殖(A)和克隆形成(B)能力；其中：* p<0.05，表示差异具有统计学意义。
图4 silncRNA-00861显著降低肝癌细胞侵袭能力；
其中：* p<0.05，表示差异具有统计学意义。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种靶向抑制lncRNA-00861基因表达的siRNA在肝癌治疗中的应用，lncRNA-00861的核苷酸序列如lncRNA-00861-seq所示，靶向抑制lncRNA-00861的siRNA分子的正义链和反义链的序列如silncRNA-00861-1～6所示，siRNA能够显著抑制肝癌细胞中长链RNAlncRNA-00861的表达水平，长链非编码RNA lncRNA-00861上的siRNA 靶点个数为1-3个，siRNA选自silncRNA-00861-1～6中的一种或多种，silncRNA-00861通过抑制肝癌细胞的增殖和侵袭达到治疗肝癌的目的，该生物制剂包括siRNA或其核酸序列修饰物及载体，合成的siRNA分子为被修饰的siRNA分子，并使用药学上接受的载体，siRNA或其核酸序列修饰物抑制长链非编码RNA lncRNA-00861的表达，的siRNA分子载体选自病毒和脂质体。
本发明首先检测了lncRNA-00861在人肝细胞癌细胞系HepG2、Hep3B2.1-7、HB611和SMMC7721及正常人肝细胞株L-O2中的表达水平。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测发现，发现与正常人肝细胞中lncRNA-00861表达水平相比较，lncRNA-00861在肝癌细胞系中表达均显著增加，尤其以SMMC7721细胞中的增加最为显著。根据人lncRNA-00861基因序列设计合成了6条特异性靶向lncRNA-00861的siRNA。利用Lipofectine 3000脂质体转染法将6条siRNA的混合物导入肝癌细胞SMMC7721中，检测silncRNA-00861对lncRNA-00861表达，细胞增殖、集落形成、侵袭的影响。
实验1、lncRNA-00861在人肝细胞癌细胞系及正常肝细胞株肝细胞癌细胞株中的表达
1、材料
细胞：人肝细胞癌细胞系HepG2、Hep3B2.1-7、HB611和SMMC7721及正常人肝细胞株L-O2。
试剂：DMEM高糖型细胞培养液、青霉素、链霉素，胎牛血清，反转录试剂盒Primescript RT reagent kit和实时荧光定量PCR SYBR Premix Ex Taq II试剂盒。qRT-PCR特异性引物由上海生物工程有限公司合成。
2、方法
2.1、细胞培养
人肝细胞癌细胞系HepG2、Hep3B2.1-7、HB611和SMMC7721及正常人肝细胞株L-O2用完全培养（高糖型DMEM细胞培养基中加入10％胎牛血清、100U/mL青霉素链霉素双抗），置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。
2.2、肝细胞癌细胞系中总RNA的提取
利用Trizol试剂提取细胞中的总RNA。提取方法具体如下：
①从培养箱中拿出6孔板中培养的细胞，弃去培养基，用在冰上预冷的磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline，PBS)洗涤3次，弃去PBS。加入1mL Trizol试剂裂解细胞，并把细胞裂解液移至无DNA酶和RNA酶的EP管中。然后向装有细胞裂解液的EB管中加入200μL氯仿，充分震荡混匀20s，室温静置5min后置于4℃，12000rpm离心15min。③将上层含有RNA的水相转移到新的无RNA酶和DNA酶的EP管中。并向其中加入500μL异丙醇，振荡器上充分震荡混匀，置于4℃，12000rpm离心10min；小心弃上清，保留RNA沉淀。然后加入1mL 75％乙醇，振荡器上涡旋充分混匀，4℃，10000rpm离心5min。⑤弃上清，风干沉淀，加入30μL无酶水。利用NanoDrop™ 8000 分光光度计(Thermo Fisher Scientific，USA)和琼脂糖凝胶电泳评估RNA的浓度和纯度，标记好后置于-80℃超低温冰箱保存。
2.3反转录
采用TAKARA公司PrimeScript RT reagent Kit with gDNAEraser(PerfectRealTime)试剂盒，操作如下：去除提取的总RNA中的基因组DNA：
提取的总RNA 1μL (1μg)，
5×DNAEraserBuffer 2μL，
DNA Eraser 1μL，
无RNA酶的ddH2O 6μL。
置于PCR仪中42℃孵育2min，得反应液。
进行反转录反应，体系如下：
上步反应液 10μL，
5×Primescript Buffer 2(for Real Time) 4μL，
Primescript RT Enzyme Mix I 1μL，
RT Primer Mix 1μL，
ddH2O 4μL，总体积20μL，置于PCR仪中37℃孵育15min，85℃孵育5s灭活逆转录酶，得到cDNA。
2.4、qRT-PCR
利用TAKARA公司SYBR Premix Ex Taq II试剂盒，反应体系如下：
SYBR 10μL，
lncRNA-00861正向引物(5`-CATTGTCAGGAAATTCGAATAC-3`)0.4μL，
lncRNA-00861反向引物(5`-CAGAATAATTTTCCATGCTTTGTG-3`)0.4μL，
cDNA 2μL，ROX Reference Dye II 0.4μL，ddH2O 6.8μL，总体积20μL。
内参基因β-Actin的正向引物为：5`-TGGCACCCAGCACAATGAA-3`，反向引物为：5`-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3`。反应条件如下：95℃30s预变性；95℃，5s变性，60℃，34s退火并延伸，34个循环。熔解曲线分析：60-95℃，每0.4℃读1次。同时以内参β-Actin基因作为校对，使用ABI7500fast进行qRT-PCR和数据收集，采用2-ΔΔCt进行数据分析。
3、结果
lncRNA-00861在正常肝细胞系表达水平为3%-8%，而在肝癌细胞系中表达较高，并达到显著差异(p＜0.05、图1)。
实验2、silncRNA-00861对肝癌细胞功能的影响
1材料
细胞：人肝细胞癌细胞系SMMC7721，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。转染试剂Lipofectamine 3000购自Thermo Fisher Scientific公司，CCK-8检测试剂盒购自美国BD公司。
2、方法
2.1细胞培养
同实验1。
2.2靶向lncRNA-00861的siRNA序列的设计与合成
在NCBI获得lncRNA-00861基因序列(NR_038446.1)，然后利用BLOCK-iT RNAiDesigner软件(Thermo Fisher Scientific)设计特异靶向lncRNA-00861的siRNA(silncRNA-00861-1)，从结果中共选择6条进行合成并制成siRNA混合物(等摩尔比)，具体siRNA的序列参考以下lncRNA-00861 (NR_038446.1)上的靶点设计：
silncRNA-00861-1：5`-GCAGUAAUAAACAUCCCUAAU-3`
silncRNA-00861-2：5`-UAGGGAUGUUUAUUACUGCCC-3`
silncRNA-00861-3：5`-GUGUAAUACCUAAUACUGAUA-3`
silncRNA-00861-4：5`-UCAGUAUUAGGUAUUACACGG-3`
silncRNA-00861-5：5`-AGUAAUACCAUCUGGAGGCAU-3`
silncRNA-00861-6：5`-GCCUCCAGAUGGUAUUACUCC-3`
上述靶向lncRNA-00861的siRNA由上海生物工程股份有限公司合成。
实验用到的阴性对照序列(siNC，在人基因组上无作用靶点)购自上海生物工程股份有限公司。
2.3细胞转染
将人肝细胞癌细胞系SMMC7721接种于6孔板中，37℃、5％CO2 培养过夜，当生长至汇合度40～50％时进行转染实验。转染方法参照Lipofectamine 3000(Thermo FisherScientific)说明书进行。具体步骤如下：将5μL silncRNA-00861混合物/siNC(终浓度50nm)和3.75μL Lipofectamine3000转染试剂分别加入至125μL无血清DMEM培养液中，分别混匀后，将含有siRNA的DMEM培养液加入至含有Lipofectamine 3000转染试剂的DMEM培养液中，小心混匀，静置5min，得转染液；将上述转染液加入提前24小时植入6孔板(含有2mL培养液)的SMMC7721细胞中，置于37℃、5％CO 2 培养箱孵育；转染后收集细胞，采用qRT-PCR检测siRNA对lncRNA-00861的干扰效果，或进行后续细胞增殖、侵袭等功能验证实验。
2.4qRT-PCR检测siRNA对lncRNA-00861的干扰效果
转染48h后，收集转染后的实验组SMMC7721细胞(转染silncRNA-00861混合物的肝癌SMMC7721细胞)和对照组细胞(转染siNC的肝癌SMMC7721细胞)，进行细胞总RNA提取，反转录及qRT-PCR,方法同上。
2.5细胞增殖实验
采用CCK-8实验和克隆形成实验检测靶向干扰lncRNA-00861表达对细胞增殖活性的影响。CCK-8实验具体操作方法：收集转染siRNA 24h后的实验组和对照组SMMC7721肝癌细胞，加入完全培养基重悬，细胞计数，以3000个/孔密度接种于96孔板中，实验组和对照组各设置5行，每行5个复孔，放于37℃、5％CO2 培养箱培养。设置24h、48h、和72h 3个时间点，检测时每孔加入10μLCCK-8试剂并在37℃培养箱中孵育2小时后，通过酶标仪检测450nm处各孔的光密度(OD)。在无细胞孔中加入完全培养基作为调零孔。
2.6集落形成实验
收集转染siRNA 24h后的实验组和对照组SMMC7721肝癌细胞，并用完全培养基重悬。细胞计数，以600个/孔的密度接种于6孔板中。实验组和对照组各3孔，培养12天后吸去各孔培养基，PBS洗涤3次，每孔加1mL4％多聚甲醛固定30min，吸去多聚甲醛，PBS洗涤3次，每孔加入1mL结晶紫染色液，20min后吸去，自来水下冲洗6孔板，晾干后计算集落。
2.7细胞侵袭实验
收集转染siRNA 24h后的实验组和对照组SMMC7721肝癌细胞，加入完全培养液重悬，细胞计数，4×105/mL个细胞。在Transwell小室(Matrigel预包被)内加入100μL细胞悬液(含1％胎牛血清的DMEM高糖细胞培养基)，将小室放入24孔板细胞培养板内，在下层中加入600μL含20％胎牛血清的DMEM高糖细胞培养基，于37℃，5％CO2 孵箱中培养48h。取出小室，弃除24孔板内的培养基，加入500μL 90％乙醇固定10min，用无菌棉签轻轻拭去小室内部残留的乙醇和细胞，待风干后加入500μL0.1％结晶紫染液，染色10min。倒置显微镜低倍镜下，每个小室随机选取5-8个视野进行观察并拍照、计数。
3、结果
3.1肝癌细胞SMMC7721中 silncRNA-00861对lncRNA-00861的表达的影响
如图2所示，与转染siNC的对照组SMMC7721肝癌细胞相比，转染silncRNA-00861混合物的肝癌细胞中lncRNA-00861的表达水平下调，表明silncRNA-00861转染的肝癌细胞中lncRNA-00861的表达水平显著下调。
3.2 silncRNA-00861对SMMC7721肝癌细胞的增殖和克隆形成能力的影响
如图3A所示，与转染siNC的对照组SMMC7721肝癌细胞相比，转染silncRNA-00861混合物可明显抑制SMMC7721肝癌细胞的增殖能力。相似的，转染silncRNA-00861混合物后SMMC7721肝癌细胞的克隆形成能力显著减弱(图3B)，表明silncRNA-00861可以抑制肝癌细胞的增殖和克隆形成能力。
3.3 silncRNA-00861对肝癌细胞的侵袭的影响
如图4所示，与转染siNC的对照组SMMC7721肝癌细胞系相比，转染silncRNA-00861混合物的肝癌细胞系SMMC7721细胞中，发生侵袭的细胞数量显著减少，这些结果表明silncRNA-00861可显著抑制肝癌细胞的迁移与侵袭能力。
以上结果表明本发明中的特异靶向silncRNA-00861具有抑制lncRNA-00861表达的效果，能够显著抑制肝癌细胞的增殖、侵袭能力。
LINC00861-seq:
AACTTTCCACAGGTATCTTAAAAGCTTTGCTCACTCATCCCTTCTCTGACTTAGGATTTGAGCATCTTTCTGTTATGCTGTTGCCCCACTCCTATTGCAATACTCCCCTTCTTAAGAAAGTTTTTCTAGACTAATGTCTAGATTAAACTTCTTTTCTTTGACAATAATGATGCCATGACTTGGACAAAATGCCCATTGCCTCTGGGTCCTGCTTTCTTCACCCAGTGCTGCCTTATTGGACTCCTTGTGCCTCTCCTTGGCTGGGGAAATCAGAATACACAGTGGTATCCCACTTCTAAGATGCCTGATCTGAAGGACAGTAAAACAACTGACCTTTGCCAGCATGTAAAACACATGGTTTAACTAGTCCTCCAGGAACAACACTGAGCAATCCTGACCTGGGACTACTTTACTCGGCCATCTCCTACTTGAGATGCTCCTTGTCTCTCTGTTCAAGGACACCTTTTCTGAGCCTTTCTTGAACAAGAGTGGAGGACCGATAGGGCGATTAAACTGTCCTTGACACAACTTTAGGTTGGTTTGCCTAAACTACTAGGTTCTCAATCTATATGAACCTCCTCCAGCATTCTAATTTGTTTGCTCTGTCTTAGACCCAGAATCCCACCCCATGTGCCTAACCATAGACCAATCTTCCTGCCTTAACTTCTCTGCTACCAATTTTGATGTAGCCCAGTAAGTTTCAGCATCATCCCTCACCACCCCACAGTCCCTCACCCTGCCCCCACCCCCACCACACACACACATACCAGCTCTTAGCATCAAATCCCCTTCCATTTTCCATAAGCATCTCTTCCCAGGTCTCTGCATATAAAAGCTATGTTTGCTCACCCCATGCCTGAGACTTTCCTGGCTTAGATCTTGAGCATCTTTCTATTATAAGATTCTCCCTTAGTAATGATTTCCTCACTTAACTTCAGATTTGTACATTTTTTTTTCATTGACAGTGCAAAAGATACCATTTAGGATTTGATTTTCAGAAGGTAAAATATAAAACATTGTCAGGAAATTCGAATACTTAATTAAGTAGGATAATGGATTACTGAGAAATAGTACTTGGTTATCTATTTAATCAAATGATGTAAAATAATTTTAGAGTAGATATAGGAGGTAACATAATTGCAAAGAACTTCATCTCTTTTATATGAAGACTGTTCTCTTAAATAATCAAGGACTCGAAAAAGTCAGCACAAAGCATGGAAAATTATTCTGATGAGATTCTGAATGTTTATCTTCTAAGAAGATTACTCAGAAGGTAAAGAAAAATATTTTACAAGCTCTTACTAAGAGAATACACTAATCCAAAAAAATTATTTTAATAGAGAATAAAACAAATTCTAGTTTTGCATCTGCATATTTGATACTAATGCTTATATTAAACATTTTGTAAACAAACCCATTAAACTTCAGCCAGCTGTGACTACAAGAAATAAAATTTCCTATCCATGAACCTTCTACAGCTTTCTCTATCTAGTTAGGGTTTTGTAGGGTTTTGCCCTACACTTTCCCCTTTCTCATCCTGGAATAACTACTCATTTTACTTCAGAAAAAAATTACTCTTGTTTTCCTTAACAAAAAAATATCCTGCATACCTTGCACTCAAAATGTTCCTTTCTGCCACAGTCACTTCTACTAGAGTCTCATTCATCTTATTGACATATATTGATTATAACTTTTTTTTTTTTTTGAGACAGTCTCGCTCTATCACCCAGGCTGAGTGCAGTGGTGTAATTTTGGCTCACTGCAACCTCCGCCTCCCGGGTTCAAGCAGTTCTCCTGCCTCAGTCTCCTGAGTAGTTGGGATTACAGGCGTGCGCCACCATGCCCAGTTACTTTTTTTATTTTTAGTAGAGGCGGGGTTTCACCATTTTGGTCAGGCTGGTCTCAAACTCCTGACCTCATGATCCGCCCGCCTCGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGTGTTAGCCACCGTGCCCGGCCTTGATTATTTTTAACTACGGTAACTCCTATTGCATAGAGAAACTTTGGAGGTAGTATAAAAGAAAAGTTACTGGATATGTATTAAAACAGCCAGATAGATCTTATTCAAACTGCTGCAGTAGGAGAGAGAGGTTTCTGTATGGAACTGAGCTCAACTTCTAATACAGCAAAGACAGTTGTGGATTTATAGCCAAGGAGTAGAGCAAGGTGGTAAGCAGATGGAAATTTACTAAGAACTTACCTAGATATCAAAGGTAGAGGGATTCTTGCTAAACTGGCTTAATAAAATTATTTTAAATAATAAAACTGTTAATTAATAAAACTATTAATAATAAAACTACTTTCTAAAACTAAGATATCCAGAGTGGAGAGTGAGAAACTTGATCAAATATCCAGTAGTCTAATATCAAGAATTAGTAAATTCTTGATAAATTCGCTAAGCAGGAATCTTTACTAAAACTCGGCTGGGCAGGCCAAGGTCAAAGTCTACTTAGGAAGAATGCTCCAAGGAGCCTAACTCAAGTTTGGTCAAGGGAAGAGTCTTTTTCAGTGGATAATTGTGAACTATTTTCATACACACTATTTCGTAGCAGACTAATAGATCTTATGAATATACATCTCATTATTTTTGCAGTAATAAACATCCCTATAATAAAACTCACTGTAGCAAAAAATAAACATGCTCATTAACACACCCAAATATATAGGCTCTCCGTATTATATAAAAAATAAGCAGCAAAAAGTCTACAAGCAGAAAATTATACTTAGTAATTAATGCTTCAGTATTTTATTATAGTTAGATAATCTAGGTATCTAATGAATGCCCATTAATTAACCAAATTTAGCATCAGTCTAAAGTTTTATGTTATCAAAAGATCTTGGTCTTGAGCCAGGATGACACACTATAAAATGTAATTAGTTACTTTTGAATTAACATTTGTCAAAACAGTGATTCAATTTAACTAAATGCAAATTTATATTTTTATAATTATAAACATATAGTAACTAAAATGATAGATTATTAAACCAAGAAAGCTGTATAAGCTGAGGAAGAATGTGCATAAGTAGATTAAAATGTATGCTTGTGTAATACCTAATACTGAGAACTCAGAAGACATAACTGTTTTAATTAAACCAACAAAATAAAGCTAGTCTCATTTGCCAAAATTTACCTAAATTATGTAACTTAAATTCTTAGAATATTCAAGCTAGTATCTATAAGCATATTAAAAGTAGAAATGCAATTATCTTAATTTCCAGAAATTTTTGAATATTTTATTTATATAAGACTTTAGTTAGTTCTAAGTCAATCAGAAAATAGTACCTTTAAAAATTTTGATAATCTAATTTAGTAATACCATCTGGAGGCAGGAAAATATTACATACCCACAGACACATAAATATACATACAGATCTAGAGAACTTATCATTTTAATTCTAAAATCTCAGCCATAGACCAGGCATAACACAGAAATACATAACTCACTTGTTCCTATAAAAAGGGCTCTTTTCGTTCCACTGGGTAGAAATTCTTGATTGAGTTCAAAATAGAGAAAAAAATAGACGAACAAAAATAACAAACCCAATTTTCTGGCATCTTTCTGACGTAACAGAGACACAATATCTGCAAACCATTTAATTCATTTACAGAGATTACCAAGTGACCACATACACACACACACACACACACAAATCCAGCACTAGAGATCAACTGCATACTCAATGAAAATTAAATTCCTACCATGCTACCAACAGACAAGAGTCTGGAACATTGAATTAGGAATAGGGCTCACCTTTAGGTCCCTGTATTGCCAGTCACAAATGGAGCATGAAGGCTCCAAGTGTCCTTATTACCTGGGTGGAGCAGATGGAGATCTGAAGGCATGGTCCCATTTTGAGTCATGGCAGCAATCCTGTCAAAGAAACAGACAAGTTAAAAGATTGCTTTTATTTGGGCTATTGCAATAGGGAAACCACCCTTATCTGAAGATGATGGGAATGGCTCAGCCTCTTAGGCAGTTTGGCTTTTATAGGGAGGGGTAAACAAATGCAAATGATGTGGTTTAACACTGTGGTCAGTTGCAAACTGCAGATGTCACAGTTTGTTAACTTTCCAAAACATTTGGAGATGTTTTTCTCAGTAGTGGT
TGTGGTTTTTCTTAGTAAGCTTCGGAGAGCAGAGATTATCTCAGCTAATCAGCTATGAGACAAAGAACAGGATGTAGATTTTTTTGCTTTGTCAGCAGGTTTTGTCAGCAGATGAAAGGGGACAGTTTGTGGTAGGTCTTGTCACACTTGACCAAAGATCTTCTAGAATAGTTTCACACAGAGATAACATCAAACAGAAAAACCAGAAACAGGAAGGGGGCTGCGGTCATTCCCACCCCCACCCCCCACCCCAAGTAAAGCTAAGAGGCTGAGGCATACCTCCTTGCAGCCTAGCTCACTTACTTGCATGTGATGCACTTCCTTCCCATGCCTGCCTGTCCCAACCCCACCCCACCTTCTTACACATAGCCTTTCTTGCCCTGTGAATACCCATTTCTACACCTCTCTATTTGCACTGATGCTGACTCAATCAGTGTGTCACCTCATCCCTCCAAGGCTACTGTACTACCTTCCAAAATGGCTGCCTTCGTTCCACTCTTTTTTCTCACAATTTAGTTTCCACAGAGAAGCCAGAATGAACAAAAGTGAAAATCTGATTTTGTTACCAACCTGTTCAAAATTTTTCTGTCTCTCCCTATTGCCCTTCAAGGAAAGCCTATGCTACATAGCACAACATTCAAACCCTTCATGTTCCAAGTCACCCCCTTTTTTTGCCAGCCCTTAGCCAACTCTACATTCCAGCTGTGCAGAAGCTCCAGCTGCTTTCCTACACCCCCTGCAATTCTCTATGTCTAGGACTTTGCTTGTGCCTTTCCTTCACCCCCTGCAATTCTCCATGTCTAGGAATTTGCTTGTGCCTTTCCTTCCACCTCCAATGTCCTCCCTCCAACTGGCTAAGTCCCAATGTATGTATATAAGAATTTAGAGGATACCTCTTCTGGATTTATCCCAGGCCCCAACTTCAGCCCCCAGCCTTCCCCATCACCTTGAAGCTGAGTCTGGCTGAAATTCCTCTATTCCCTACCCTTTCCAGTCACAACACCTACCACACTGTTTAGCAAGTTCCTCCTTCTTTTTCTGTCTCAGCAGCTAGACCAGGAGCTCCCTGCAGGTCAAGACCATGTGTTCTCTGATGCTTTCTCATGGCAAGGGGAGACATAGGGTTGCAGTAGTGAGTGGGCATCTGTTCTCAGAAGGCAGTGCCTGGAGCACTATAAGTACTTAATAAACTCTTGTGAAATTAAAAA
本发明采用的siLINC00861序列：
siLINC00861-1：5`-GCAGUAAUAAACAUCCCUAAU-3`
siLINC00861-2：5`-UAGGGAUGUUUAUUACUGCCC-3`
siLINC00861-3：5`-GUGUAAUACCUAAUACUGAUA-3`
siLINC00861-4：5`-UCAGUAUUAGGUAUUACACGG-3`
siLINC00861-5：5`-AGUAAUACCAUCUGGAGGCAU-3`
siLINC00861-6：5`-GCCUCCAGAUGGUAUUACUCC-3`
本发明中的特异性靶向silncRNA-00861对lncRNA-00861具有较高的沉默效率，可显著抑制肝癌细胞的增殖、侵袭能力，所有这些结果均表明lncRNA-00861是肝癌的新的药物靶点，而silncRNA-00861可应用于肝癌的临床治疗，具有较广阔的应用前景。
最后应说明的是：以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种靶向抑制lncRNA-00861基因表达的siRNA在肝癌治疗中的应用，其特征在于：lncRNA-00861的核苷酸序列如lncRNA-00861-seq所示，所述靶向抑制lncRNA-00861的siRNA分子的正义链和反义链的序列如silncRNA-00861-1～6所示。
2.根据权利要求1所述的一种靶向抑制lncRNA-00861基因表达的siRNA在肝癌治疗中的应用，其特征在于：所述siRNA能够显著抑制肝癌细胞中长链RNA lncRNA-00861的表达水平。
3.根据权利要求1所述的一种靶向抑制lncRNA-00861基因表达的siRNA在肝癌治疗中的应用，其特征在于：长链非编码RNA lncRNA-00861上的siRNA 靶点个数为1-3个。
4.根据权利要求1所述的一种靶向抑制lncRNA-00861基因表达的siRNA在肝癌治疗中的应用，其特征在于：所述siRNA选自silncRNA-00861-1～6中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的一种靶向抑制lncRNA-00861基因表达的siRNA在肝癌治疗中的应用，其特征在于：所述silncRNA-00861通过抑制肝癌细胞的增殖和侵袭达到治疗肝癌的目的。
6.根据权利要求1所述的一种靶向抑制lncRNA-00861基因表达的siRNA在肝癌治疗中的应用，其特征在于：该生物制剂包括siRNA或其核酸序列修饰物及载体，所述合成的siRNA分子为被修饰的siRNA分子，并使用药学上接受的载体。
7.根据权利要求1所述的一种靶向抑制lncRNA-00861基因表达的siRNA在肝癌治疗中的应用，其特征在于：所述siRNA或其核酸序列修饰物抑制长链非编码RNA lncRNA-00861的表达。
8.根据权利要求1所述的一种靶向抑制lncRNA-00861基因表达的siRNA在肝癌治疗中的应用，其特征在于：所述的siRNA分子载体选自病毒和脂质体。
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