CN115851724A - 一种基因增强型免疫细胞在治疗肝硬化中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基因增强型免疫细胞在治疗肝硬化中的应用，属于肝硬化治疗技术领域。本发明所提供的基因增强型免疫细胞为转染了LINC02106基因siRNA的NK细胞，该NK细胞具有的更好的增殖能力，IFN‑γ分泌能力，人肝星状细胞杀伤活性，因此可以利用该NK细胞治疗肝纤维化，进而治疗肝硬化。
Description
技术领域
本发明属于肝硬化治疗技术领域，尤其涉及一种基因增强型免疫细胞在治疗肝硬化中的应用。
背景技术
肝硬化是一种常见的消化系统疾病，严重危害着人类的健康，每年有上百万人死于肝硬化及其并发症。肝硬化的主要病理性特征是肝小叶结构破坏，残余肝组织样结节样增生以及肝纤维组织增生。
肝纤维化是肝组织在肝损伤因子作用下的一种自我修复过程，其是慢性肝病发展成为终末期肝病所必须经历的阶段。肝纤维化的产生的原因是由于在肝损伤因子的长期持续作用下，肝脏细胞外基质的产生速度超过了降解的速度，从而导致肝脏中细胞外基质的过度沉积，进而导致肝纤维化的发生。当肝纤维化发展到终末阶段的时候，肝纤维化会发展为肝硬化。因此，有效的抑制肝纤维化将有助于治疗肝硬化。
NK细胞是天然免疫系统的重要组成部分，具有免疫监视和防御的功能，其在外周血中的比例大约为10-20%。近年来NK细胞在肝纤维化中的作用越来越受到重视，NK细胞可以通过直接杀伤或者是通过分泌IFN-γ来抑制肝纤维化，因此增加NK细胞的杀伤活性和分泌IFN-γ的能力将有助于抑制肝纤维，从而有效治疗肝硬化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基因增强型免疫细胞在治疗肝硬化中的应用。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
第一方面， 本发明提供了靶向LINC02106基因的siRNA在增强NK细胞治疗肝硬化中的应用，其特征在于，所述LINC02106基因的转录本序列为SEQ ID NO.1。
优选地，所述siRNA的正义链序列为SEQ ID NO.2，所述siRNA的反义链序列为SEQID NO.3。
第二方面，本发明提供了靶向LINC02106基因的siRNA在制备促进NK细胞增殖的药物中的应用，其特征在于，所述LINC02106基因的转录本序列为SEQ ID NO.1。
优选地，所述siRNA的正义链序列为SEQ ID NO.2，所述siRNA的反义链序列为SEQID NO.3。
第三方面，本发明提供了靶向LINC02106基因的siRNA在制备促进NK细胞IFN-γ分泌的药物中的应用，其特征在于，所述LINC02106基因的转录本序列为SEQ ID NO.1。
优选地，所述siRNA的正义链序列为SEQ ID NO.2，所述siRNA的反义链序列为SEQID NO.3。
第四方面，本发明提供了靶向LINC02106基因的siRNA在制备促进NK细胞对于人肝星状细胞杀伤活性的药物中的应用，其特征在于，所述LINC02106基因的转录本序列为SEQID NO.1。
优选地，所述siRNA的正义链序列为SEQ ID NO.2，所述siRNA的反义链序列为SEQID NO.3。
本发明的有益效果是：
本发明筛选出NK细胞激活前后差异表达的lncRNA，即LINC02106；同时，本发明设计了一种可以有效的抑制NK细胞中LINC02106表达的siRNA ；其次，本发明通过实验发现抑制LINC02106可以有效的提高NK细胞的增殖活性，IFN-γ分泌，对于人肝星状细胞的杀伤活性，从而可以有效的防治肝星状细胞的纤维化，进一步防治肝硬化。
附图说明
图1为不同lncRNA在NK细胞激活前后的表达量差异的检测结果；
图2为si-LINC02106对于LINC02106的抑制效果的检测结果；
图3为转染si-LINC02106对于NK细胞增殖活性影响的检测结果；
图4为转染si-LINC02106对于NK细胞IFN-γ分泌影响的检测结果；
图5为转染si-LINC02106对于NK细胞杀伤活性影响的检测结果。
具体实施方式
本发明所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，而并非本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
筛选有效提高NK激活的lncRNA
1.将NK-92细胞从冰箱中取出，置于37℃快速溶解后，加入10% α/MEM完全培养基后，1200r/min离心8min，弃去上清，使用10% α/MEM完全培养基重悬后置于细胞培养箱中进行培养；
2.将NK-92细胞接种在6孔板中，使用IL-2对细胞进行激活，处理24h后，提取RNA，进行逆转录得到cDNA；
3. 设计LINC02114，LINC02106，LINC02308，LINC02436的引物，如表1：
表1 引物序列
| 基因名称 | 引物序列 |
| LINC02114 | ggaaagaaagccgacctgga（上游引物） |
| gcatcaacaaagcaatgcagc（下游引物） | |
| LINC02106 | tgtacaaatgaaagcgcgct（上游引物） |
| cgtgagctttcctctgggag（下游引物） | |
| LINC02308 | cggccaaggcatcagtatgt（上游引物） |
| acgtcccattgtcaccattct（下游引物） | |
| LINC02436 | cgcttcatccacaaggcaac（上游引物） |
| gctgcctccacgacttagat（下游引物） |
4.按照如下反应体系（表2）配制荧光定量PCR反应体系：
表2 荧光定量PCR反应体系
| 反应物 | 体积 |
| Template | 3ul |
| Forward Primer（10uM） | 0.4ul |
| Reverse Primer（10uM） | 0.4ul |
| 2 x TransStart Tip Green qPCR SuperMix | 10ul |
| Passive Reference Dye（50x） | 0.4ul |
| Nuclease-free Water | 5.8ul |
5.配制完成后，瞬时离心放入仪器中参照如下条件进行荧光定量PCR反应：
| 反应阶段 | 温度 | 持续时间 |
| PCR反应（40个循环） | 95℃ | 5s |
| 60℃ | 30s | |
| 溶解阶段 | 95℃ | 5s |
| 65℃ | 60s | |
| 97℃ | 1s |
6.反应结束后，读取Tm和Ct值后，采用ΔΔ法进行计算,得到的结果展示于图1中。
从图1中，我们可以看出LINC02106的相对表达量相较于未激活时明显下降，因此我们猜测LINC02106表达量的下调与NK细胞的激活有关。
实施例2
检测降低LINC02106表达量对于NK细胞增殖活性的影响
（1）根据LINC02106的转录本序列SEQ ID NO.1设计siRNA，设计的siRNA的序列如下:
正义链：AUUAGAGAAGCCUUGUUCCCC，SEQ ID NO.2；
反义链：GGAACAAGGCUUCUCUAAUCA，SEQ ID NO.3；
（2）将生长状态良好的NK-92细胞使用完全培养基重悬和计数，将细胞接种于96孔板和6孔板中，对照组转染si-NC，实验组转染si-LINC02106，转染结束后，置于细胞培养箱中培养48h；
（3）培养结束后，6孔板的细胞提取RNA检测si-LINC02106的抑制效果,实验结果展示于图2中；
96孔板中，加入MTT溶液，继续培养4h后加入10%SDS-HCL溶液，待紫色结晶完全溶解后，测定570nm的OD值，实验结果展示于图3中。
从图2中，我们可以看出本发明所设计的si-LINC02106可以十分有效的降低LINC02106基因的mRNA表达量；
从图3中，我们可以看出，本发明所设计的si-LINC02106能够促进NK细胞的增殖。
实施例3
检测降低LINC02106表达量对于NK细胞分泌IFN-γ的影响
（1）将LX-2细胞按照5000个/孔接种在96孔板中，待细胞贴壁后，37℃，5% CO2培养24h；
（2）按照效靶比5:1加入转染si-NC和si-LINC02106的NK细胞混合均匀，将细胞培养板置于细胞培养箱中培养48h；
（3）培养结束后，收集上清，使用ELISA试剂盒检测IFN-γ的浓度，实验结果展示于图4中。
从图4中，我们可以看出抑制了LINC02106的NK细胞分泌的IFN-γ的浓度明显高于对照组，说明抑制LINC02106可以促进NK细胞分泌IFN-γ。
实施例4
检测降低LINC02106表达量对于NK细胞对于人肝星状细胞(LX-2)杀伤活性的影响
（1）将LX-2细胞按照1000个/孔接种在96孔板中，待细胞贴壁后，37℃，5% CO2培养24h；
（2）按照效靶比5:1加入转染si-NC和si-LINC02106的NK细胞混合均匀，同时设置效应细胞对照孔和靶细胞对照孔，将细胞培养板置于细胞培养箱中培养48h；
（3）吸弃上清，加入MTT溶液，继续培养4h后加入10%SDS-HCL溶液，待紫色结晶完全溶解后，测定570nm的OD值，根据如下公式计算杀伤活性：
杀伤活性（%）=（1-（效应细胞OD+靶细胞OD值）-效应细胞OD值）/靶细胞OD值）×100%。
从图5中，我们可以看出抑制了LINC02106的NK细胞的杀伤活性明显高于对照组，说明抑制LINC02106可以促进NK细胞的杀伤活性。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (8)
1.靶向LINC02106基因的siRNA在增强NK细胞治疗肝硬化中的应用，其特征在于，所述LINC02106基因的转录本序列为SEQ ID NO.1。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述siRNA的正义链序列为SEQ ID NO.2，所述siRNA的反义链序列为SEQ ID NO.3。
3.靶向LINC02106基因的siRNA在制备促进NK细胞增殖的药物中的应用，其特征在于，所述LINC02106基因的转录本序列为SEQ ID NO.1。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述siRNA的正义链序列为SEQ ID NO.2，所述siRNA的反义链序列为SEQ ID NO.3。
5.靶向LINC02106基因的siRNA在制备促进NK细胞IFN-γ分泌的药物中的应用，其特征在于，所述LINC02106基因的转录本序列为SEQ ID NO.1。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述siRNA的正义链序列为SEQ ID NO.2，所述siRNA的反义链序列为SEQ ID NO.3。
7.靶向LINC02106基因的siRNA在制备促进NK细胞对于人肝星状细胞杀伤活性的药物中的应用，其特征在于，所述LINC02106基因的转录本序列为SEQ ID NO.1。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述siRNA的正义链序列为SEQ ID NO.2，所述siRNA的反义链序列为SEQ ID NO.3。
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